CN107858364A - 一种适于甲醇酵母表达的耐高温高比活细菌植酸酶基因 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种能够在毕赤酵母中高效分泌表达的耐高温高比活植酸酶基因获取方法，具体过程是：将来自耶尔森菌属的9个植酸酶基因先优化改造成适合毕赤酵母表达的基因，然后经过基因家族体外改造，构建植酸酶基因突变体库，通过酿酒酵母文库表达和高通量筛选，获得耐高温的植酸酶基因YAPPA102，将耐高温植酸酶基因YAPPA102构建到毕赤酵母表达载体，实现了植酸酶的高效表达。表达的植酸酶具有耐高温性，结构稳定。

Description

一种适于甲醇酵母表达的耐高温高比活细菌植酸酶基因

技术领域

本发明属于微生物基因工程领域，具体地说利用化学合成方法及基因家族改组技术，改造来源耶尔森菌的酸性植酸酶基因，使之能在毕赤酵母中高效表达，表达的植酸酶具有耐高温性，结构稳定。

背景技术

禾谷类、豆科类及油料作物是人的食品和动物饲料中的主要原料。这些原料中虽含有大量的磷，但其中50%-70%是以植酸磷（六磷酸肌醇）的形式存在（Salunkhe 1982，食品研究进展）。植酸酶能将植酸磷水解成肌醇和磷酸。单胃动物缺乏分解植酸磷所必需的酶，磷的利用率很低。在饲料中添加植酸酶可以提高植物性饲料中磷的利用率。开发植酸酶的直接原因来源于植酸带来的磷污染。一方面，植酸中螯合的磷无法吸收利用，另一方面则是必须在饲料和食品中添加大量无机磷，造成磷源浪费和环境污染（Cromwell1991，生物技术在食品工业中的应用进展）。随着养殖业的发展，无机磷的排泄量大幅度上升，磷污染遍及河流、山川和平原耕作地，直接威胁人类自身的生存。自80年代中期，欧洲就致力于寻找全面解决无机磷污染的方案 (CouncilDirective91/676/EEC)中，着重强调限制养殖业的磷排泄量。植酸酶是目前所有使用的添加剂中，具有最直接、最显著环保社会效益的酶制剂。由于磷是动物生长过程中的基本元素，为了弥补新陈代谢中磷的消耗，常常需要在食品和饲料中添加无机磷（Common 1989，自然杂志）。植酸酶将植酸中鳌合的磷释放出来，从而减少了饲料中磷酸氢钙等无机磷的使用量，降低幅度达50%-70%。

植酸酶广泛存在于植物﹑动物和微生物中。不同的物种产生的植酸酶在比活、最适反应pH、耐热性等性质上存在很大差异。许多微生物都能产生高比活的植酸酶。1968年Shien等从68个土样中对2000个菌株进行考察发现，在所有22株黑霉菌中有21株能产生植酸酶。第一个被分离纯化的植酸酶来源于曲霉Aspergillus terreus NO.9A-1,其最适pH为4.5，最适反应温度为70℃, pH在1.2~9.0范围内，该酶均能稳定维持一定活性。到目前为止，发现200多种真菌、细菌、酵母、各种各样的植物和动物组织能够产生植酸酶，其中真菌植酸酶产量最高，活性高，是商品植酸酶最主要的生产菌。来源于黑曲霉（Aspergillus niger var. awamori)的植酸酶PHYA对植酸钠有很高的底物特异性，酶的特异比活性为100U/mg酶蛋白，是真菌中发现的比活性最高的植酸酶之一，它降解植酸磷形成的终产物是单磷酸肌醇和无机正磷酸。由于天然菌种的植酸酶产量较低，直接用其生产出的植酸酶成本较高，从而影响了植酸酶的推广应用。1991年，荷兰人将来源于无花果曲霉的 PhyA 基因克隆后，转入黑曲霉中，诞生了世界上第一个植酸酶基因工程菌；后来丹麦将来源于隔孢伏霉菌的PhyA 基因克隆后，转入米曲霉中；1998年，中国农科院姚斌等对黑曲霉963 的植酸酶基因进行改造，转化到毕赤酵母中，经发酵罐高密度发酵培养，植酸酶的产量达到1.5×102 U/mL，比原菌株的产量高3000 倍，这是中国饲料工业中构建的第1 株具有实用价值的生产饲料添加剂的基因工程菌。

Vats和Banerjee(2004)发现在所有植酸酶中，绝大多数真菌产生的植酸酶为酸性植酸酶的最适pH值在2.5-5.5，有些耐高温真菌如schwanniomyces occidentalis， Myceliophthora thermophila和thermomyces lanuginosus，Aspergillus fumigatus产生的植酸酶最适pH值达到6.0，虽然具有很好的耐温性，但它在37℃下的酶活性极低，在饲料中没有使用价值。细菌产生的植酸酶有两种，一种为酸性植酸酶，如E. coli植酸酶在pH2.0-3.5区域活性很强，其蛋白的结构和催化机理与真菌酸性植酸酶相似，具有保守的催化基元RHGXRXP和HD。另一种为碱性植酸酶，最适pH为7.0，如来源于枯草杆菌（Bacillus subtilis）的植酸酶，这种植酸酶结构为β-螺旋浆，由β折叠组成的六叶螺旋浆。碱性植酸酶的热稳定性更强，某些酶能耐受80-95℃的高温, 如Park从Bacillus amyloliquefaciens中分离到的植酸酶最适作用温度是70℃，在90℃下处理10 min 也能保持活性，该类植酸酶催化活性和热稳定性均依赖Ca2+。目前对细菌来源的植酸酶的开发非常重视，市场中至少存在3种细菌植酸酶产品，主要因为细菌来源酸性植酸酶的比活性高，大肠杆菌appA的比活比黑曲霉中的phyA高近30倍。因此目前的细菌植酸酶大多从E. coli植酸酶开发出来的，如大肠杆菌的植酸酶基因appA 的毕赤酵母生产菌株，大肠杆菌的植酸酶基因PhyQ毕赤酵母菌株等等。

来源于耶尔森菌属植酸酶比活性比大肠杆菌高，但是耐高温性不强，本专利针对9个按毕赤酵母密码子合成的耶尔森菌属(Yersinia)植酸酶基因，利用创新的植酸酶基因家族改组及高通量筛选技术体系，对这些植酸酶基因进行改良，解决植酸酶的高比活和耐高温的矛盾，同时实现新型植酸酶在甲醇酵母中高效表达，完成植酸酶工程菌株发酵工艺的优化，并解决新型植酸酶的制剂工艺，研发植酸酶的保护剂和增效剂，实现植酸酶工程菌的工业化生产。

发明内容

本发明采用基因化学合成和基因家族体外重组方法，筛选一种在酵母菌中高效表达的耐高温高比活植酸酶基因。

本发明通过载体构建、酵母电击转化、高活性菌株筛选等步骤来制备生产耐高温高比活植酸酶甲醇酵母菌株。

本发明为了提高植酸酶的在酵母中的表达。将所有耶尔森菌属植酸酶基因进行化学合成，设计寡核苷酸引物长度为60碱基，引物之间连接通过20 bp重叠序列，Tm值为60-66将所有引物加入反应体系，进行PCR扩增，共进行35个循环，合成酸性植酸酶基因。

本发明按照酵母表达需要，优化所有植酸酶基因。优化的原则包括：消除基因内部的常用限制性内切酶的识别位点，便于表达盒构建；消除逆向重复序列、茎环结构和转录终止信号，使基因内部的GC/AT均衡，提高RNA的稳定性；避免2、3位用CG和TA双寡核苷酸（CG在植物中易造成甲基化）；使基因编码蛋白符合N端原则，以提高翻译蛋白的稳定性；优化mRNA二级结构自由能，以提高基因表达效率。

以合成的9个来自耶尔森菌属植酸酶基因克隆载体为模板，以载体上的通用引物PBSKZ18：GCGATTAAGTTGGGTAACGCC； PBSKF18：GGAAA GCGGGCAGTGAGCGCAACG，扩增植酸酶基因，将所有基因片段用DNaseI酶切成10-50bp小片段，利用taq DNA聚合酶进行DNA分子重排，电击入大肠肝菌，构建突变基因库。

酶切所有重排DNA分子，将片段插入大肠杆菌-酿酒酵母穿梭的酵母表达载体PVT102U/α(专利201510230599.8)，转化酿酒酵母，通过硝酸纤维素膜影印和40孔细胞培养板筛选，大规模筛选高活性的植酸酶基因，最终获得耐高温高比活的植酸酶基因YAPPA102，完成突变基因序列测定。

按突变基因的两端序列设计出引物，在基因5`端加入Χhol切点和信号态切割序列，引物为YmAPPA1Z，在基因3`端加入Not I切点，引物为YmAPPA1F，扩增片段克隆后，Χhol和 Not I双酶切，定向插入毕赤酵母分泌表达载体pPYPX88（GenBank: AY178633），构建成突变植酸酶基因YAPPA102的酵母表达载体（图1），挑选植酸酶高表达重组酵母P.Pastoris菌种，进行高密度发酵，表达的植酸酶具有较高的酶活性，1ml发酵液含有相当于13200单位酶活性，90℃高温处理后30 分钟后植酸酶残存活性达到68%。

本发明有益效果如下：

通过偏爱密码改造及基因家族重排获得的植酸酶基因具有以下优点：

1. 新的植酸酶基因YAPPA102适合在毕赤酵母中高效表达，小罐发酵植酸酶后每毫升含量达13200单位。

2. 基因表达产物具有很高的高温耐受性，90℃高温处理后30 分钟后植酸酶残存活性达到68%。

附图说明：

图1构建成植酸酶毕赤酵母表达载体pYAPPA102。

图2重组菌株高密度发酵时间与植酸酶表达量的关系。

图3不同pH值条件下植酸酶酶活性。

图4 90℃高温处理后植酸酶残存活性分析

具体实施方式

实施例1：植酸酶基因的化学合成

利用连续延伸PCR合成植酸酶基因。设计引物长度为60 bp，基因两端引入BamHI和SacI酶切位点。引物与引物之间连接通过20 bp重叠序列，Tm值为60-66。将所有引物加入反应体系，中间引物量为10-20 ng，两侧的引物量为100-200ng。PCR 反应体系为100μL。PCR扩增条件为94℃，30s；65℃，30s；72℃，2min。共进行35个循环。PCR扩增用酶为高保真Taq DNA 聚合酶。将PCR扩增片段通过TA克隆方法克隆到常规载体pUC18中。DNA序列测定确定合成基因序列正确性。

合成基因序列为：

1）YaAPPA来源阿氏耶尔森氏菌Yersinia aldovae ATCC 35236（SEQ ID NO.1所示）

gcaccacaac ctgctggtta caccttggag agagtcgtca tcttgtccag acatggtgtt 60

agatccccaa ccaaacagac tcagttgatg aatgacgtca ctcctgacaa gtggcctcaa 120

tggcctgtca aggctggtta cttgactcct agaggtgcac agttggtcac tctgatgggt 180

cagttctacg gtgactactt cagatccaag ggtttgctgc ttgctggttg tcctgctgag 240

ggtgtcatct acgcacaggc tgacatcgac cagagaacca gactgactgg tcaggcattc 300

ctggatggtg tcgctcctga ctgtggtctg aaggtccact accaggctga cctgaagaag 360

accgatccac tgttccatcc tgtcgaagct ggtgtctgca agttggatgc tgtccagact 420

cagaaggctg tcgaagagca tctgggtggt ccattgtctt ctcttggtga gagatacacc 480

aagccattcg ctcagatggg tgaggtcctg aacttcgcaa agtctccata ctgcaagacc 540

agacaacaga acgacaagac ctgcgacttc gcacacttcg ctgctaacga gatcaaggtc 600

aacaaagagg gttccaaagt ctccctgaac ggtccactgg ccttgtcctc caccttgggt 660

gaaatcttcc tgctccagaa tgctcagaac atgcctaatg ttgcctggaa cagactgtct 720

ggtactgaga actgggcatc tcttctgtct cttcacaacg tccagttcga cttgatggcc 780

aagactccat acattgccag acacaagggt actccactgt tgcaacagat cgatgctgcc 840

ttgactctgc aacctgatgc actgggtcag accttgccac tgtctccaca gtccagagtc 900

ctcttcatcg gtggtcatga caccaacatc gcaaacattg ctggtatgtt gggtgcctct 960

tggcaacttc cacagcaacc tgacaacact ccacctggtg gtggtttggt cttcgagttg 1020

tggcagaacc ctgacaacca tcagagatac gttgctgtca agatgttcta ccaaactatg 1080

gatcagttga gaaaggcaga gatgctggac ttgaagaaca accctgctgg tatgatctcc 1140

gtcgctgtcg agggttgtga gaactctggt gatgacaaac tgtgccagct tgacaccttc 1200

cagaagaagg tcgctcaggt catcgagcct gcttgccaca tctaa 1245

2）YbAPPA来源伯氏耶尔森氏菌 Yersinia bercovieri ATCC 43970（SEQ ID NO.2所示）

catggtgtta gaagtccaac taagcaaacc cagttgatga acgacgtcac tcctgacaag 120

tggcctcaat ggcctgttca agctggttat ctgactccta gaggtgcaca gttggtcact 180

ctgatgggtg gtttctacgg tgactacttc agatcccaag gtttgctccc agctggttgt 240

cctgctgatg gtgccatcta cgcacaagct gatgttgatc agagaaccag attgactggt 300

caagcattcc ttgatggtat tgcacctggt tgtggtctga aggtccacta ccaggctgat 360

ctgaagaagg tcgatccact gttccatcct gtcgaagctg gtgtctgcaa gttggactct 420

gcacaatccc aacaggcaat cgaggctaga ctgggtggtc cattgtctga actgtctcag 480

agatacgcta agccattcgc acagatgggt gagatcctga acttcgctgc ttctccatac 540

tgcaactccc ttcagcagca aggtaagact tgcgacttcg caaccttcgc tgctaacgaa 600

gtcaaggtca acaagcaggg tactaaggtc tccctgtctg gtccactggc attgtcttcc 660

accttgggtg aaatcttctt gctccagaac tcccaaggta tgcctgacgt tgcttggaac 720

agattgtctg gtgctgagaa ctgggtctcc ttgttgtctc tgcacaacgc tcagttcgac 780

ttgatggcta agactcctta catcgccaga cacaagggta ctccattgtt gcaacagatc 840

gatactgctc tggtcctcca gagagatggt caaggtcaga ccctgccatt gtctgctcag 900

accaagctgc tgttccttgg tggtcatgac accaacattg ccaacgtcgc tggtatgctg 960

ggtgctaact ggcaacttcc acaacagcct gacaacactc cacctggtgg tggtctggtc 1020

ttcgagctgt ggcagaaccc tgacaaccac cagcagtacg tcgctgtcaa gatgttctac 1080

caaactatgg accagttgag aaactccgag aagttggacc tgaagatcca ccctgctggt 1140

attgtcgcaa tcgagatcgc tggttgtgag aacaatggtg ctgacaagct gtgccagctt 1200

gacaccttcc agaagagagt cgctcagatc atcgaacctg cctgccacat ctaa 1254

3）YeAPPA来源结肠炎耶尔森杆菌 Yersinia enterocolitica（SEQ ID NO.3所示）

gctcctatcg ctactgctcc tgctggttac actctggaga gagtcgtcat cctgtccaga 60

cacggtatca gaagtcctac taagcagact cagctgatga acgacatcac tcctgacaag 120

tggccacagt ggcctgtcaa ggctggttat ctgactccta gaggtgctga gctggtcact 180

ctgatgggtg gtttctacgg tgactacttc agatcccagg gtctgctgtc tgctggttgc 240

cctgttgacg gttctgtcta cgctcaggct gacgttgacc agagaactag actgactggt 300

caggctttcc tggacggtat cgctcctgac tgcggtctga aggtccacta ccaggctgac 360

ctgaagaagg ttgaccctct gttccacact gtcgaggctg gtgtctgcaa gctggactct 420

gctaagactc accaggctgt cgaggagaga ctgggtggtc ctctgtctga cctgtctcag 480

agatacgcta agcctttcgc tcagatggac gaggtcctga acttcgctgc ttctccttac 540

tgcaagtctc tccagcagaa cggtaagact tgcgacttcg ctactttcgc tgctaacgag 600

atcaaggtca acgaggaggg tactaaggtc tctctgtctg gtcctctggc tctgtcttct 660

actctgggtg aaatcttcct gctccagaac tctcaggcta tgcctgacgt cgcttggcac 720

agactgtctg gtgaggagaa ctgggtctct ctgctgtctc tgcacaacgc tcagttcgac 780

ctgatggcta agactcctta catcgctaga cacaagggta ctcctctgct ccagcagatc 840

gacactgctc tggtcctcca gagaaacgct cagggtcaga ctctgcctct gtctcctcag 900

actaagctgc tgttcctggg tggtcacgac actaacatcg ctaacatcgc tggtatgctg 960

ggtgtcaact ggcagctgcc tcagcagcct gacaacactc ctcctggtgg tggtctggtc 1020

ttcgagctgt ggcagaaccc tgacaaccac cagagatacg tcgctgtcaa gatgttctac 1080

cagactatgg accagctgag aaacgctgag aagctggaca tgaagaacaa ccctgctaag 1140

atcgtcccta tcactatcga gggttgcgag aacgagggtg acaacaagct gtgccagctg 1200

gagactttcc agaagaaggt cgctcaggtc atcgagcctg cttgccacat ctaa 1254

4）YfAPPA来源弗氏耶尔森氏菌 Yersinia frederiksenii（SEQ ID NO.4所示）

gagcagaacg acggtctcca gctccagtct gtcgtcatcg tctccagaca cggtgttaga 60

gcaccaacta agctgactcc actgatgcag aacgtcactc ctgacacttg gccacagtgg 120

tctgtcccac tgggttggct gactcctaga ggtggtgagc tgatctctct gctgggtgac 180

taccagagac agagactgat ctctgagggt ctgatcaatg ctgctcagtg tccttctgct 240

aagcaggtcg ctgtcatcgc tgacactgac gagagaacta gaaagactgg tgaggctttc 300

atctctgctc tggctccaca ctgcgctctg cctgtccacg tccagcagaa cctgagacag 360

actgaccctc tgttcaaccc actgaagact ggtcactgcc agctggacaa gccaactgtc 420

agagctgcta tcctgaagca ggctggtggt tctatcgagg ctctgaacaa gcagtaccag 480

cctgctttca ctactctggc tgacgtcctg aacttcagag agtctccact gtgccagcag 540

gagaagagat gcactctgcc tgaggctctg ccatctgagc tggaggtctc taagagaaac 600

gtctctttct ctggtgcttg gggtctggct tctactgtct ctgaaatctt cctgctccag 660

caggctcagg gtatggctga tcctggttgg ggtagaatca agaactctga gcagtggcag 720

cagctgctgt ctctgcacaa cgctcagttc gacctgctcc agagaactcc agaggtcgct 780

tcttccagag ctactccact gctggacctg atcatcgcta ctctgactcc tggacacgct 840

ggtaagcaga tggctggtat ctctctgcca acttctctgc tgttcatcgc tggtcacgac 900

actaacctgg ctaacctggg tggtgctctg ggtatgtctt ggactctgcc tgaccagcct 960

gacaacactc cacctggtgg tgagctggtc ttcgagagat ggcacagagc tactgacaac 1020

actgactgga ttcaggtctc tctggtctac cagactctcc agcagatgag aaacgtcact 1080

agactgtcta tgactactcc tcctggtaag gtcccactga ctgtcaacgg ttgccaggag 1140

actaactctc agggtatgtg ctctctgaag tctttcactg ctgtcatcaa cactatcaga 1200

aaccctgctt gcgctctgta a 1221

5）YiAPPA来源中间耶尔森菌Yersinia intermedia（SEQ ID NO.5所示）

gctgaggctg cacatcctgt cagacatctg gagagagtcg tcatcgtctc cagacatggt 60

gttagagcac caaccaagat gcctgcactg atcagagagg tcactcctga tggttggcct 120

gtctggcctg ttccacttgg tgatctgact cctagaggtg cttctctggt tactctgctt 180

ggtgcctact acagacagca gttgtccaga gagggtctgc ttcctgcaca gggttgtcct 240

cctgctggtt gggtctatgc atggactgat gtcgatcaga gaaccagaaa gactggtgct 300

gctttcctcc agggtttggc acctggttgt gctgttgcta tccatcacag acctgatgtt 360

tcccagagag atccactgtt ccatcctgtc aaggctggtc tgtgtagact ggacaaggcc 420

agaaccagaa gagccatcga agcacaggct ggtatgccac ttgctgcact gaatcacaga 480

tacggtactg ctcttgcaca gatggctaga gtcctgcact tcgcatcctc tccatactgt 540

cagagaagat ccggtgatgg tgtctgcacc ctcgctagaa ccatgccaac tagactgcac 600

atggatgctc atggtgctat cgctctgaga ggtgctcttg gtctgtctgc tactctggct 660

gagatgttcc tgttgcagca ggctcagggt atggctcagc ctgcttgggg tagaatcgct 720

actcctgctc agtggagatc cttgctccag ctgcacaacc ttcagttcga tctgctgtcc 780

agaaccgact acatcgctag acacagaggt actccactga tgtacactgt tcttcaggca 840

ctgcatggtc agactcctag actgcctggt ttgactgcac agaacagact gctgctgctg 900

gttggtcatg acaccaacct tgccaatctg tccggtctgc tgcaaactcc ttggtctctt 960

cctggtcagc ctgacaacac tccacctggt ggtgaactga gattcgagag atggagagac 1020

tctactggta gagcatgggt cagagtctct gttgtctacc agtctctggc acaactgaga 1080

agacagtcca gactgactct tccacttcca ccacatcaga tgactcttgc attgcctggt 1140

tgcagaggtg agatggctga tggtctgtgt ccactggatg cattctctca gtggctttct 1200

tccagactga tccctgcttg tctgcctgtt cctgatggtg ctaccaacgc aatggagtaa 1260

6）YkAPPA来源克氏耶尔森氏菌 Yersinia kristensenii ATCC 33638（SEQ ID NO.6所示）

gcaccacttg ctgcacagtc cactggttac actttggaga gagtcgtcat cttgtccaga 60

catggtgtta gaagtccaac caagcagacc cagttgatga acgacgtcac tcctgacaag 120

tggcctcaat ggcctgtcaa ggctggttac ttgactccta gaggtgctgg tttggtcact 180

ttgatgggtg gtttctacgg tgactacttc agatcctacg gtttgttgcc tgctggttgt 240

cctgctgacg aatccatcta cgtccaagct gatgtcgatc agagaaccag actgactggt 300

caggcattcc tggatggtat cgcacctgac tgtggtctga aggtccacta ccaagctgac 360

ctgaagaaga tcgacccact gttccacact gttgaggctg gtgtctgcaa actggaccct 420

gagaagaccc accaggctgt cgagaagaga ctgggtggtc cactgaacga actgtcccag 480

agatacgcta agccattcgc tctgatgggt gaggtcctga acttctctgc atctccatac 540

tgcaactccc tgcaacagaa gggtaagacc tgtgacttcg caaccttcgc tgccaacgag 600

atcgaggtca acaaagaagg tactaaggtc tccctgtctg gtccactggc actgtcttcc 660

accttaggtg aaatcttcct gttgcagaac tctcaggcaa tgcctgatgt tgcttggaac 720

agactgtctg gtgaagagaa ctggatctcc ttgttgtccc tgcacaacgc acagttcgac 780

ttgatggcta agacccctta tatcgcccgg cataaaggaa ctccgttgtt gcaacaaatt 840

gatacggcat tagtgttgca acgtgatgct cagggtcaga ccctgccact gtctccacag 900

accaagctgc tgttccttgg tggtcatgac accaacattg ccaacatcgc tggtatgttg 960

ggtgccaact ggcaactgcc acagcaacct gacaacactc cacctggtgg tggtctggtc 1020

ttcgagctgt ggcagaaccc tgacaaccat cagagatacg ttgctgtcaa gatgttctac 1080

cagactatgg agcagttgag aaacgctgac aagttggacc tgaagaacaa ccctgcaaga 1140

atcgtcccaa tcgctatcga aggttgcgag aacgagggtg acaacaagct gtgtcagctg 1200

gagaccttcc agaagaaggt cgctcaagtc atcgaaccaa cctgccacat ctaa 1254

7）YmAPPA来源莫氏耶尔森氏菌 Yersinia mollaretii （SEQ ID NO.7所示）

gctcctgtcg ctgctcctgt cactggttac actctggaga gagtcgtcat cctgtccaga 60

cacggtgtta gaagtcctac taagcagact gagctgatga acgacgtcac tcctgacaag 120

tggccacagt ggcctgttcc tgctggttat ctgactccta gaggtgctca gctggtcact 180

ctgatgggtg gtttctacgg tgactacttc agaaaccagg gtctgctgcc tgctggttgt 240

cctgctgacg gtactctgta cgctcaggct gacatcgacc agagaactag actgactggt 300

caggctttcc tggatggtat cgctcctggt tgtggtctga aggtccacta ccaggctgac 360

ctgaagaagg ttgatcctct gttccaccct gtcgaggctg gtgtctgtca gctggactct 420

actcagactc acagagctat cgaggctcag ctgggtgctc ctctgtctga gctgtctcag 480

agatacgcta agcctttcgc tcagatgggt gagatcctga acttcactgc ttctccttac 540

tgcaagtctc tccagcagca gggtaagtct tgcgacttcg ctactttcgc tgctaacgag 600

gtcaaggtca accagcaggg tactaaggtc tctctgtctg gtcctctggc tctgtcttct 660

actctgggtg aaatcttcct gctccagaac tctcagggta tgcctgacgt cgcttggcac 720

agactgtctg gtgctgagaa ctgggtctct ctgctgtctc tgcacaacgc tcagttcgac 780

ctgatggcta agactcctta catcgctaga cacaagggta ctcctctgct ccagcagatc 840

gtcactgctc tggtcctcca gagaaagggt cagggtcaga ctctgcctct gtctgagcag 900

actaagctgc tgttcctggg tggtcacgac actaacatcg ctaacatcgg tggtatgctg 960

ggtgctaact ggcagctgcc tcagcagcct gacaacactc ctcctggtgg tggtctggtc 1020

ttcgagctgt ggcagaaccc tgacaaccac cagcagtacg tcgctgtcaa gatgttctac 1080

cagactatgg accagctgag aaactctgag aagctggatc tgaagtctca ccctgctggt 1140

atcgtcccta tcgagatcga gggttgcgag aacatcggta ctgacaagct gtgccagctg 1200

gacactttcc agaagagagt cgctcaggtc atcgagcctg cttgccacat ctaa 1254

8）YpAPPA来源假结核耶尔森氏菌 Yersinia pseudotuberculosis（SEQ ID NO.8所示）

gagccatctg gttacacctt ggagagagtc gtcatcttgt ccagacatgg tgttagaagt 60

cctaccaagc agacccagct gatgaacgac gtcactcctg acaagtggcc tcaatggcct 120

gtcaaggctg gttacttgac tccaagaggt gctgagttgg tcactctgat gggtggtttc 180

tacggtgact acttcagatc ccttggtctg ttggctgctg gttgtcctgc tgagggtgtc 240

gtctatgcac aggctgacat cgatcagaga accagattga ctggtcaggc attcctggat 300

ggtgttgctc ctggttgtgg tttgaccgtc cacaaccagg ctgacctgaa gaagaccgat 360

ccactgttcc atcctgtcga ggctggtgtc tgcaagttgg atgctgccca gaccgacaag 420

gctatcgaag aacagctggg tggtccattg gacactgtct ctcagagata cgctaagcca 480

ttcgcacaga tgggtgacgt cctgaacttc gctgcatctc catactgcaa gtctctgcaa 540

cagcaaggta agacctgcga cttcgctcac ttcgctgcta acgaagtcaa cgtcaacaag 600

gaaggtacta aggtcactct gtctggtcca ctggcattgt cctccacctt gggtgaaatc 660

ttcttgttgc agaacgcaca agctatgcct gaggttgcat ggcagagact gaagggtgct 720

gagaactggg tctccttgtt gtccttgcac aacgctcagt tcaacttgat ggccaagact 780

ccatacatcg ctagacacaa gggtactcca ttgttgcagc agatcgacac tgctctgacc 840

ctgcaactgg atgctcaggg tcagaagctg ccaatctctg cacagaacag agtcttgttc 900

cttggtggtc atgacaccaa cattgccaac atcgctggta tgctgggtgc tgactggcag 960

cttcctgagc aacctgacaa cactccacct ggtggtggtc tggtcttcga actctggcag 1020

aaccctgaca accaccagag atacgttgct gtcaagatgt tctaccagac tatggatcag 1080

ttgagaaacg ctgagaagtt ggacctgaag aacaaccctg ctggtatcat ctctgtcgct 1140

gttgctggtt gtgagaacaa cggtgacgac aagctgtgcg agcttgacac cttccagaag 1200

aaggtcgcta aggtcatcga acctgcttgc cacatctaa 1239

9）YrAPPA来源罗德耶尔森菌 Yersinia rohdei ATCC 43380（SEQ ID NO.9所示）

gctgcacctg tcatcactgc acctgctggt tacactctgg agagagtcgt catcctgtcc 60

agacatggtg ttcgttctcc aaccaaacag acccagttga tgaacgaggt cactcctgac 120

aagtggcctc aatggcctgt caaggctggt tacttgactc ctagaggtgc acaactcgtc 180

actctgctgg gtgccttcta cggtgagtac ttcagatccc agggtttgct gcctgctggt 240

tgtcctcctg aaggtactgt ctacgcacaa gctgacatcg accagagaac cagactcact 300

ggtcaggcat tcctggatgg tgttgcacct ggttgtggtc tggaggtcca ctaccaggct 360

gacctgaaga agactgatcc actgttccat cctgtcgaag ctggtgtctg caaggttgac 420

ttggcacaga ccagacaggc tgttgagcag agattgggtg gtccactgac caccctgtcc 480

cagagatacg ccaagccatt cgctcagatg ggtgaagtcc tgaacttcgc tgagtctcca 540

ttctgcaagt ccctccaaca gaagggtaag acctgtgact tcgctacctt cgctgccaac 600

gagatcgacg tcaacaagga cggtactaaa atctctctga ctggtcctct ggctctgtcc 660

tccactctgg ctgaaatctt cctgttgcag aactctcagg caatgcctga tgtcgcatgg 720

cacagactgt ctggtgctga gaactgggtc tccttgctgt ctctgcacaa cgcacagttc 780

gacttgatgg ctaagactcc atacatcgcc agacacaagg gtactccact gctgcaacag 840

atcaacactg cactggtcct ccagagagat gctcagggtc agactctgcc actgtctcca 900

cagaccaagg tcctgttcct gggtggtcac gacaccaaca ttgccaacat cgctggtatg 960

ctcggtgcaa actggcaact gcctcaacaa cctgacaaca ctccacctgg tggtggtctg 1020

gtcttcgagc tgtggcaaca tcctgacaac catcagagat acgtcgctgt caagatgttc 1080

taccagacta tggatcagct gagaaacgtc gagaagttga acctgaccac caaccctgct 1140

ggtatcatcc ctatcgctgt cgaaggttgc gagaacatgg gtgacgacaa gctctgtcag 1200

ctcgaaacct tcgagaagaa gatcgcacaa gtcgtcgaac ctgcatgtca catctaa 1257

实施例2：植酸酶基因的家族改组文库构建

2.1 PCR扩增植酸酶基因及回收

在pUC18克隆载体两端设计通用引物，扩增植酸酶基因为模板，引物序列为：PBSKZ18：GCGATTAAGTTGGGTAACGCC（SEQ ID NO.10所示）； PBSKF18：GGAAAGCGGGCAGTGAGCGCAACG（SEQID NO.11所示），反应条件为：94℃ 10min 预变性， 94℃变性30s，50℃退火30s和72℃延伸90s，共 30个循环，1% Agrose 电泳，透吸袋法回收1.3kp的基因片段。

2.2 DNase I降解DNA及回收小片段

回收所有9个基因片段以DNase I 缓冲液 (50mmol/L Tris-Cl pH7.4+1mmol/L MgCl₂)100μl溶解；加入0.1U DNase I，25℃处理15分钟。70℃处理10分钟。10%丙烯酰胺电泳，透吸袋法回收10-50bp的小片段。用10μl 10×无引物PCR缓冲液(Primerless PCR Buffer)（50mmol/L KCl+10mmol/LTris-Cl pH9.0+1% Triton ）溶解沉淀。

2.3无引物PCR(Primerless PCR)

将所有9个基因的DNase I降解片段按等比例混合，进行Primerless PCR 扩增。反应体系：5μl小片段DNA+4μl 2.5mmol/L dNTPs+4.5μl 25mmol/LMgCl₂+ Taq2U +ddH₂O to 50μl；反应程序为：94℃ 30s，40℃30s，72℃ 30s，共45个循环），2%Agrose电泳检测PCR扩增结果。

2.4 有引物PCR(Primer PCR)

进行PrimerPCR扩增反应。反应体系：5μlPrimerless PCR产物+phyiZ1 0.2 ng+phyiF10.2ng+10×PCR Buffer 5μl +2.5mmol/L dNTPs 4μl+Taq2U+ ddH₂O to 50μl。反应程序为：94℃ 30s，70℃ 30s，72℃2.0min，共35个循环，1%Agrose电泳检测，回收1.3kp基因片段。

回收1.3kb的重排植酸酶基因片段，TA克隆连接到pUC18克隆载体，该载体带有氨苄青霉素抗性基因。电击法转化大肠杆菌菌株DH5α获得突变体文库，库容达到10⁸。

将大肠杆菌克隆质粒库上的植酸酶突变基因库双酶切消化，回收突变植酸酶基因的酶切片段在大肠杆菌-酿酒酵母穿梭的酵母表达载体PVT102U/α(专利201510230599.8)的基础上构建突变植酸酶基因的酵母分泌表达质粒库。

实施例3：耐高温高比活植酸酶基因的筛选

将突变文库转化到酿酒酵母，然后突变植酸酶基因的酿酒酵母转化子影印至硝酸纤维素膜上，并分别在原先的固体培养皿和膜上做对应标记。

将带有转化菌落的膜先置于不含组氨酸的固体培养上，28℃下培养24个小时。在培养皿内放三层湿润的无菌滤纸，再将培养后的带菌膜置于滤纸之上，90℃下加热30 min个小时，将带有酵母菌落的硝酸纤维素膜置于浸有钼黄试剂的无菌滤纸上进行显色。

选择显色深的菌落区域（存在几百个酵母转化子），该阳性菌落区域被认为含有高温耐受性的突变体。

找出原始固体培养皿上对应的阳性菌落区域，将全部菌落挖下，置培养液中稀释后进行涂板，在固体培养基上进行第二次培养、影印、高温处理和筛选，获得阳性酵母单菌落。

将阳性酵母单菌落分别点于40孔板中进行液体培养（在每块板上的不同部位设3个对照），培养后将板置于90℃下加热30 min并进行酶的活性测定，选择高温处理后活性较对照植酸酶基因提高的菌株。具体步骤如下:取150μlSD培养液，每一个孔等量加入40孔培养板，待酵母菌生长到OD₆₀₀=0.4-0.6，将板置于90℃下加热30 min。从培养板的孔中取出10μl菌液转移到新40孔培养板，加入植酸钾钠底物，37℃反应30分钟，加入钼蓝显色剂（钼酸胺，硫酸亚铁，浓硫酸）显色。挑取单菌落进行活性比较，获得耐高温高比活的植酸酶基因YPPA102。

抽提获得的耐高温高比活植酸酶酵母菌株DNA，将DNA转化到大肠杆菌，抽提质粒，进行突变基因序列测定，获得的植酸酶基因序列如SEQ ID NO.12所示。

实施例4：酵母表达植酸酶载体构建

按突变基因的两端序列设计引物，在基因5’端加入Xho I切点和信号态切割序列，引物为： YmAPPA1Z (5’-AACTCGAGAAAAGAGAacctccggaGC TCCTGTCGCTGCTCCTGTCACTG-3’) （SEQID NO.13所示），在基因3’端加入Not I切点：引物为：YmAPPA1 F(5’-AACGCGGCCGCTTAGATGTG GCAAGCAGGCTCGATGACCTG -3’) （SEQ ID NO.14所示）。扩增片段克隆后, Xho I和Not I双酶切,定向插入pPYPX88（GenBank: AY178633）, 该载体对分泌信号肽进行了改造，在MF4I启始密码子ATG后增加了毕氏酵母AOX1基因ATG后的三个氨基酸，分别为A、I和P，此外在MF4I信号肽的中间增加了EEAEAEAEPK 10个氨基酸。构建成植酸酶的酵母表达载体pYAPPA102（图1）。

实施例5：植酸酶高表达重组酵母筛选

将活化的酵母菌株Pichia Pastoris于500 ml YPD中30℃培养18 hr,至OD₆₀₀=1.7，5000 r/min离心收集菌体，先后用500 ，250 ml预冷的无菌水洗菌体，离心去上清夜，用20ml 预冷的1 mol/L 山梨醇悬浮菌体。离心后菌体再用0.5 ml预冷的山梨醇悬浮，用于电击感受态。

大量抽提酵母表达载体pYAPPA102, BglII酶切回收小片段,取2μg线性化片段加入50μL感受态细胞，冰浴5 min，用Bio-Red GenePulser电击仪电击，参数为2.5Kv，25μF。电击结束后立即加入1.0 ml预冷的1 mol/L山梨醇，取200μL 涂布于固体选择培养基平板(18.6%山梨醇，2%葡萄糖,1.34%YNB,0.005%谷氨酸，0.005%甲硫氨酸，0.005%赖氨酸，0.005%亮氨酸，0.005%异亮氨酸，2%琼脂糖)，30℃培养直至转化子出现。用牙签将转化子对应点种到MM（ 1.34%YNB，0.00004%生物素，0.5%甲醇，1.5%琼脂糖）和MD（1.34%YNB，0.00004%生物素，2%葡萄糖，1.5%琼脂糖）平板上， 30℃培养 2d，在MD上生长正常而在MM上生长不正常或不生长的转化子为阳性克隆。

将重组酵母接种于20ml BMGY(1%酵母提取物，2%蛋白胨，1.34%YNB 0.000004%生物素，1%甘油)， 30℃培养，离心收集菌体，加入20ml诱导培养基BMMY（用0.5%甲醇代替BMGY中的甘油），30℃下继续诱导培养36 hr。

以甲醇为唯一碳源的MM培养基和以葡萄糖为碳源的MD培养基进行对应培养，进一步筛选定点整合的重组转化子。

将所有的阳性克隆单独接种三角瓶中, 30℃培养至OD600=4-5, 利用甲醇诱导培养36 hr,每个诱导菌株取5 μl上清液进行SDS-PAGE检测，另取10μl上清液稀释100倍，以植酸钾钠为底物进行酶活性测定。植酸酶酶活性测定方法采取钼黄法（BASF Company）。取2ml标准酶制剂溶液、样品、空白和对照溶液的玻璃试管按顺序以10秒的间隔时间置于37.0℃的水浴锅中。精确定时5分钟。然后按相同的顺序，相同的间隔时间，向每支试管中加入4.00ml 37.0℃植酸钠溶液,并将离心管放入水浴中,精确培养60分钟后,再按相同的顺序以相同的间隔时间加入4.00 ml显色/终止缓冲液（在250 ml容量瓶中依次加入62.5 ml钼酸铵溶液，62.5 ml钒酸铵溶液，在缓慢加入41.25 ml硝酸（70％），冷却至室温后加入重蒸水定容至刻度。该溶液每日随用随配）。摇匀后终止反应，放置10分钟后,将溶液在4000r/min离心15min。用分光光度计在415 nm测定吸收峰，以空气作为仪器零点。

植酸酶酶活性单位（U）定义为：在37℃下，每分钟分解植酸盐释放出1 nmol/L无机磷酸所需要的酶量为1 U。结合电泳条带和酶活力单位，筛选到4株高效表达植酸酶基因的重组子P.pastoris YAPPA2，P.pastoris YAPPA9、P.pastorisYAPPA43、P.pastorisYAPPA52。

实施例6：重组菌株的高密度发酵

挑取植酸酶高表达重组酵母P.pastoris YAPPA9菌株接种200 ml YPED培养基，30℃培养至OD₆₀₀=3.0，转入B.Braun 5L发酵罐中进行高密度发酵，以YPED培养重组酵母，利用氨水控制pH值为5.5，发酵过程中氧含量控制在20%，培养90 hr,甘油耗尽，加入0.5%甲醇，30℃诱导培养。

30℃培养6 hr后，重组酵母进入对数生长期，氧消耗加快，须充入纯氧，氧含量控制在20%，在发酵过程中，持续加入氨水调节pH值恒定在5.5，发酵90 hr后，OD₆₀₀=110,加入0.5% 甲醇诱导培养，诱导不同时间后取3ul无菌体的诱导培养液进行SDS-PAGE检测。随着诱导时间的增加，植酸酶的表达量不断提高，120 h后，上清液中的表达量保持稳定。重组子P.pastoris YAPPA9诱导120 hr后，植酸酶表达量高达2.5 mg/ml。表达的植酸酶分子量大小约为52 kD（图2）。

在37℃ pH5.5 的条件下对含表达产物的培养液进行植酸酶活性测定，重组酵母P.pastoris YAPPA9培养120hr后，酶活力为13200 u/ml，增加诱导表达时间，植酸酶的表达量仅缓慢增加。

实施例7：植酸酶性质测定

将底物分别配制成pH=1.5;2.5;3.5;4.5;5.5;6.5,以pH =4.5时的酶活单位为100%，以高密度发酵上清液测定不同pH条件下植酸酶的相对活力。结果表明该植酸酶在pH2.5-6.5之间均有酶活力，pH值为4.5时，植酸酶活性最高 (图3)。

将上清液用90℃处理不同时间，放置冰上冷却，加入酶反应底物，37℃反应30min，以未经高温处理的发酵液为参比，测定上清液中的残存酶活性。酶液经过90℃高温处理30 min处理，植酸酶的活性仍保持68% (图4)。

序列表

<110> 上海市农业科学院

<120> 一种适于甲醇酵母表达的耐高温高比活细菌植酸酶基因

<130> 2017

<160> 15

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1245

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

gcaccacaac ctgctggtta caccttggag agagtcgtca tcttgtccag acatggtgtt 60

agatccccaa ccaaacagac tcagttgatg aatgacgtca ctcctgacaa gtggcctcaa 120

tggcctgtca aggctggtta cttgactcct agaggtgcac agttggtcac tctgatgggt 180

cagttctacg gtgactactt cagatccaag ggtttgctgc ttgctggttg tcctgctgag 240

ggtgtcatct acgcacaggc tgacatcgac cagagaacca gactgactgg tcaggcattc 300

ctggatggtg tcgctcctga ctgtggtctg aaggtccact accaggctga cctgaagaag 360

accgatccac tgttccatcc tgtcgaagct ggtgtctgca agttggatgc tgtccagact 420

cagaaggctg tcgaagagca tctgggtggt ccattgtctt ctcttggtga gagatacacc 480

aagccattcg ctcagatggg tgaggtcctg aacttcgcaa agtctccata ctgcaagacc 540

agacaacaga acgacaagac ctgcgacttc gcacacttcg ctgctaacga gatcaaggtc 600

aacaaagagg gttccaaagt ctccctgaac ggtccactgg ccttgtcctc caccttgggt 660

gaaatcttcc tgctccagaa tgctcagaac atgcctaatg ttgcctggaa cagactgtct 720

ggtactgaga actgggcatc tcttctgtct cttcacaacg tccagttcga cttgatggcc 780

aagactccat acattgccag acacaagggt actccactgt tgcaacagat cgatgctgcc 840

ttgactctgc aacctgatgc actgggtcag accttgccac tgtctccaca gtccagagtc 900

ctcttcatcg gtggtcatga caccaacatc gcaaacattg ctggtatgtt gggtgcctct 960

tggcaacttc cacagcaacc tgacaacact ccacctggtg gtggtttggt cttcgagttg 1020

tggcagaacc ctgacaacca tcagagatac gttgctgtca agatgttcta ccaaactatg 1080

gatcagttga gaaaggcaga gatgctggac ttgaagaaca accctgctgg tatgatctcc 1140

gtcgctgtcg agggttgtga gaactctggt gatgacaaac tgtgccagct tgacaccttc 1200

cagaagaagg tcgctcaggt catcgagcct gcttgccaca tctaa 1245

<210> 2

<211> 1194

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

catggtgtta gaagtccaac taagcaaacc cagttgatga acgacgtcac tcctgacaag 60

tggcctcaat ggcctgttca agctggttat ctgactccta gaggtgcaca gttggtcact 120

ctgatgggtg gtttctacgg tgactacttc agatcccaag gtttgctccc agctggttgt 180

cctgctgatg gtgccatcta cgcacaagct gatgttgatc agagaaccag attgactggt 240

caagcattcc ttgatggtat tgcacctggt tgtggtctga aggtccacta ccaggctgat 300

ctgaagaagg tcgatccact gttccatcct gtcgaagctg gtgtctgcaa gttggactct 360

gcacaatccc aacaggcaat cgaggctaga ctgggtggtc cattgtctga actgtctcag 420

agatacgcta agccattcgc acagatgggt gagatcctga acttcgctgc ttctccatac 480

tgcaactccc ttcagcagca aggtaagact tgcgacttcg caaccttcgc tgctaacgaa 540

gtcaaggtca acaagcaggg tactaaggtc tccctgtctg gtccactggc attgtcttcc 600

accttgggtg aaatcttctt gctccagaac tcccaaggta tgcctgacgt tgcttggaac 660

agattgtctg gtgctgagaa ctgggtctcc ttgttgtctc tgcacaacgc tcagttcgac 720

ttgatggcta agactcctta catcgccaga cacaagggta ctccattgtt gcaacagatc 780

gatactgctc tggtcctcca gagagatggt caaggtcaga ccctgccatt gtctgctcag 840

accaagctgc tgttccttgg tggtcatgac accaacattg ccaacgtcgc tggtatgctg 900

ggtgctaact ggcaacttcc acaacagcct gacaacactc cacctggtgg tggtctggtc 960

ttcgagctgt ggcagaaccc tgacaaccac cagcagtacg tcgctgtcaa gatgttctac 1020

caaactatgg accagttgag aaactccgag aagttggacc tgaagatcca ccctgctggt 1080

attgtcgcaa tcgagatcgc tggttgtgag aacaatggtg ctgacaagct gtgccagctt 1140

gacaccttcc agaagagagt cgctcagatc atcgaacctg cctgccacat ctaa 1194

<210> 3

<211> 1254

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gctcctatcg ctactgctcc tgctggttac actctggaga gagtcgtcat cctgtccaga 60

cacggtatca gaagtcctac taagcagact cagctgatga acgacatcac tcctgacaag 120

tggccacagt ggcctgtcaa ggctggttat ctgactccta gaggtgctga gctggtcact 180

ctgatgggtg gtttctacgg tgactacttc agatcccagg gtctgctgtc tgctggttgc 240

cctgttgacg gttctgtcta cgctcaggct gacgttgacc agagaactag actgactggt 300

caggctttcc tggacggtat cgctcctgac tgcggtctga aggtccacta ccaggctgac 360

ctgaagaagg ttgaccctct gttccacact gtcgaggctg gtgtctgcaa gctggactct 420

gctaagactc accaggctgt cgaggagaga ctgggtggtc ctctgtctga cctgtctcag 480

agatacgcta agcctttcgc tcagatggac gaggtcctga acttcgctgc ttctccttac 540

tgcaagtctc tccagcagaa cggtaagact tgcgacttcg ctactttcgc tgctaacgag 600

atcaaggtca acgaggaggg tactaaggtc tctctgtctg gtcctctggc tctgtcttct 660

actctgggtg aaatcttcct gctccagaac tctcaggcta tgcctgacgt cgcttggcac 720

agactgtctg gtgaggagaa ctgggtctct ctgctgtctc tgcacaacgc tcagttcgac 780

ctgatggcta agactcctta catcgctaga cacaagggta ctcctctgct ccagcagatc 840

gacactgctc tggtcctcca gagaaacgct cagggtcaga ctctgcctct gtctcctcag 900

actaagctgc tgttcctggg tggtcacgac actaacatcg ctaacatcgc tggtatgctg 960

ggtgtcaact ggcagctgcc tcagcagcct gacaacactc ctcctggtgg tggtctggtc 1020

ttcgagctgt ggcagaaccc tgacaaccac cagagatacg tcgctgtcaa gatgttctac 1080

cagactatgg accagctgag aaacgctgag aagctggaca tgaagaacaa ccctgctaag 1140

atcgtcccta tcactatcga gggttgcgag aacgagggtg acaacaagct gtgccagctg 1200

gagactttcc agaagaaggt cgctcaggtc atcgagcctg cttgccacat ctaa 1254

<210> 4

<211> 1221

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gagcagaacg acggtctcca gctccagtct gtcgtcatcg tctccagaca cggtgttaga 60

gcaccaacta agctgactcc actgatgcag aacgtcactc ctgacacttg gccacagtgg 120

tctgtcccac tgggttggct gactcctaga ggtggtgagc tgatctctct gctgggtgac 180

taccagagac agagactgat ctctgagggt ctgatcaatg ctgctcagtg tccttctgct 240

aagcaggtcg ctgtcatcgc tgacactgac gagagaacta gaaagactgg tgaggctttc 300

atctctgctc tggctccaca ctgcgctctg cctgtccacg tccagcagaa cctgagacag 360

actgaccctc tgttcaaccc actgaagact ggtcactgcc agctggacaa gccaactgtc 420

agagctgcta tcctgaagca ggctggtggt tctatcgagg ctctgaacaa gcagtaccag 480

cctgctttca ctactctggc tgacgtcctg aacttcagag agtctccact gtgccagcag 540

gagaagagat gcactctgcc tgaggctctg ccatctgagc tggaggtctc taagagaaac 600

gtctctttct ctggtgcttg gggtctggct tctactgtct ctgaaatctt cctgctccag 660

caggctcagg gtatggctga tcctggttgg ggtagaatca agaactctga gcagtggcag 720

cagctgctgt ctctgcacaa cgctcagttc gacctgctcc agagaactcc agaggtcgct 780

tcttccagag ctactccact gctggacctg atcatcgcta ctctgactcc tggacacgct 840

ggtaagcaga tggctggtat ctctctgcca acttctctgc tgttcatcgc tggtcacgac 900

actaacctgg ctaacctggg tggtgctctg ggtatgtctt ggactctgcc tgaccagcct 960

gacaacactc cacctggtgg tgagctggtc ttcgagagat ggcacagagc tactgacaac 1020

actgactgga ttcaggtctc tctggtctac cagactctcc agcagatgag aaacgtcact 1080

agactgtcta tgactactcc tcctggtaag gtcccactga ctgtcaacgg ttgccaggag 1140

actaactctc agggtatgtg ctctctgaag tctttcactg ctgtcatcaa cactatcaga 1200

aaccctgctt gcgctctgta a 1221

<210> 5

<211> 1260

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gctgaggctg cacatcctgt cagacatctg gagagagtcg tcatcgtctc cagacatggt 60

gttagagcac caaccaagat gcctgcactg atcagagagg tcactcctga tggttggcct 120

gtctggcctg ttccacttgg tgatctgact cctagaggtg cttctctggt tactctgctt 180

ggtgcctact acagacagca gttgtccaga gagggtctgc ttcctgcaca gggttgtcct 240

cctgctggtt gggtctatgc atggactgat gtcgatcaga gaaccagaaa gactggtgct 300

gctttcctcc agggtttggc acctggttgt gctgttgcta tccatcacag acctgatgtt 360

tcccagagag atccactgtt ccatcctgtc aaggctggtc tgtgtagact ggacaaggcc 420

agaaccagaa gagccatcga agcacaggct ggtatgccac ttgctgcact gaatcacaga 480

tacggtactg ctcttgcaca gatggctaga gtcctgcact tcgcatcctc tccatactgt 540

cagagaagat ccggtgatgg tgtctgcacc ctcgctagaa ccatgccaac tagactgcac 600

atggatgctc atggtgctat cgctctgaga ggtgctcttg gtctgtctgc tactctggct 660

gagatgttcc tgttgcagca ggctcagggt atggctcagc ctgcttgggg tagaatcgct 720

actcctgctc agtggagatc cttgctccag ctgcacaacc ttcagttcga tctgctgtcc 780

agaaccgact acatcgctag acacagaggt actccactga tgtacactgt tcttcaggca 840

ctgcatggtc agactcctag actgcctggt ttgactgcac agaacagact gctgctgctg 900

gttggtcatg acaccaacct tgccaatctg tccggtctgc tgcaaactcc ttggtctctt 960

cctggtcagc ctgacaacac tccacctggt ggtgaactga gattcgagag atggagagac 1020

tctactggta gagcatgggt cagagtctct gttgtctacc agtctctggc acaactgaga 1080

agacagtcca gactgactct tccacttcca ccacatcaga tgactcttgc attgcctggt 1140

tgcagaggtg agatggctga tggtctgtgt ccactggatg cattctctca gtggctttct 1200

tccagactga tccctgcttg tctgcctgtt cctgatggtg ctaccaacgc aatggagtaa 1260

<210> 6

<211> 1254

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

gcaccacttg ctgcacagtc cactggttac actttggaga gagtcgtcat cttgtccaga 60

catggtgtta gaagtccaac caagcagacc cagttgatga acgacgtcac tcctgacaag 120

tggcctcaat ggcctgtcaa ggctggttac ttgactccta gaggtgctgg tttggtcact 180

ttgatgggtg gtttctacgg tgactacttc agatcctacg gtttgttgcc tgctggttgt 240

cctgctgacg aatccatcta cgtccaagct gatgtcgatc agagaaccag actgactggt 300

caggcattcc tggatggtat cgcacctgac tgtggtctga aggtccacta ccaagctgac 360

ctgaagaaga tcgacccact gttccacact gttgaggctg gtgtctgcaa actggaccct 420

gagaagaccc accaggctgt cgagaagaga ctgggtggtc cactgaacga actgtcccag 480

agatacgcta agccattcgc tctgatgggt gaggtcctga acttctctgc atctccatac 540

tgcaactccc tgcaacagaa gggtaagacc tgtgacttcg caaccttcgc tgccaacgag 600

atcgaggtca acaaagaagg tactaaggtc tccctgtctg gtccactggc actgtcttcc 660

accttaggtg aaatcttcct gttgcagaac tctcaggcaa tgcctgatgt tgcttggaac 720

agactgtctg gtgaagagaa ctggatctcc ttgttgtccc tgcacaacgc acagttcgac 780

ttgatggcta agacccctta tatcgcccgg cataaaggaa ctccgttgtt gcaacaaatt 840

gatacggcat tagtgttgca acgtgatgct cagggtcaga ccctgccact gtctccacag 900

accaagctgc tgttccttgg tggtcatgac accaacattg ccaacatcgc tggtatgttg 960

ggtgccaact ggcaactgcc acagcaacct gacaacactc cacctggtgg tggtctggtc 1020

ttcgagctgt ggcagaaccc tgacaaccat cagagatacg ttgctgtcaa gatgttctac 1080

cagactatgg agcagttgag aaacgctgac aagttggacc tgaagaacaa ccctgcaaga 1140

atcgtcccaa tcgctatcga aggttgcgag aacgagggtg acaacaagct gtgtcagctg 1200

gagaccttcc agaagaaggt cgctcaagtc atcgaaccaa cctgccacat ctaa 1254

<210> 7

<211> 1254

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

gctcctgtcg ctgctcctgt cactggttac actctggaga gagtcgtcat cctgtccaga 60

cacggtgtta gaagtcctac taagcagact gagctgatga acgacgtcac tcctgacaag 120

tggccacagt ggcctgttcc tgctggttat ctgactccta gaggtgctca gctggtcact 180

ctgatgggtg gtttctacgg tgactacttc agaaaccagg gtctgctgcc tgctggttgt 240

cctgctgacg gtactctgta cgctcaggct gacatcgacc agagaactag actgactggt 300

caggctttcc tggatggtat cgctcctggt tgtggtctga aggtccacta ccaggctgac 360

ctgaagaagg ttgatcctct gttccaccct gtcgaggctg gtgtctgtca gctggactct 420

actcagactc acagagctat cgaggctcag ctgggtgctc ctctgtctga gctgtctcag 480

agatacgcta agcctttcgc tcagatgggt gagatcctga acttcactgc ttctccttac 540

tgcaagtctc tccagcagca gggtaagtct tgcgacttcg ctactttcgc tgctaacgag 600

gtcaaggtca accagcaggg tactaaggtc tctctgtctg gtcctctggc tctgtcttct 660

actctgggtg aaatcttcct gctccagaac tctcagggta tgcctgacgt cgcttggcac 720

agactgtctg gtgctgagaa ctgggtctct ctgctgtctc tgcacaacgc tcagttcgac 780

ctgatggcta agactcctta catcgctaga cacaagggta ctcctctgct ccagcagatc 840

gtcactgctc tggtcctcca gagaaagggt cagggtcaga ctctgcctct gtctgagcag 900

actaagctgc tgttcctggg tggtcacgac actaacatcg ctaacatcgg tggtatgctg 960

ggtgctaact ggcagctgcc tcagcagcct gacaacactc ctcctggtgg tggtctggtc 1020

ttcgagctgt ggcagaaccc tgacaaccac cagcagtacg tcgctgtcaa gatgttctac 1080

cagactatgg accagctgag aaactctgag aagctggatc tgaagtctca ccctgctggt 1140

atcgtcccta tcgagatcga gggttgcgag aacatcggta ctgacaagct gtgccagctg 1200

gacactttcc agaagagagt cgctcaggtc atcgagcctg cttgccacat ctaa 1254

<210> 8

<211> 1239

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

gagccatctg gttacacctt ggagagagtc gtcatcttgt ccagacatgg tgttagaagt 60

cctaccaagc agacccagct gatgaacgac gtcactcctg acaagtggcc tcaatggcct 120

gtcaaggctg gttacttgac tccaagaggt gctgagttgg tcactctgat gggtggtttc 180

tacggtgact acttcagatc ccttggtctg ttggctgctg gttgtcctgc tgagggtgtc 240

gtctatgcac aggctgacat cgatcagaga accagattga ctggtcaggc attcctggat 300

ggtgttgctc ctggttgtgg tttgaccgtc cacaaccagg ctgacctgaa gaagaccgat 360

ccactgttcc atcctgtcga ggctggtgtc tgcaagttgg atgctgccca gaccgacaag 420

gctatcgaag aacagctggg tggtccattg gacactgtct ctcagagata cgctaagcca 480

ttcgcacaga tgggtgacgt cctgaacttc gctgcatctc catactgcaa gtctctgcaa 540

cagcaaggta agacctgcga cttcgctcac ttcgctgcta acgaagtcaa cgtcaacaag 600

gaaggtacta aggtcactct gtctggtcca ctggcattgt cctccacctt gggtgaaatc 660

ttcttgttgc agaacgcaca agctatgcct gaggttgcat ggcagagact gaagggtgct 720

gagaactggg tctccttgtt gtccttgcac aacgctcagt tcaacttgat ggccaagact 780

ccatacatcg ctagacacaa gggtactcca ttgttgcagc agatcgacac tgctctgacc 840

ctgcaactgg atgctcaggg tcagaagctg ccaatctctg cacagaacag agtcttgttc 900

cttggtggtc atgacaccaa cattgccaac atcgctggta tgctgggtgc tgactggcag 960

cttcctgagc aacctgacaa cactccacct ggtggtggtc tggtcttcga actctggcag 1020

aaccctgaca accaccagag atacgttgct gtcaagatgt tctaccagac tatggatcag 1080

ttgagaaacg ctgagaagtt ggacctgaag aacaaccctg ctggtatcat ctctgtcgct 1140

gttgctggtt gtgagaacaa cggtgacgac aagctgtgcg agcttgacac cttccagaag 1200

aaggtcgcta aggtcatcga acctgcttgc cacatctaa 1239

<210> 9

<211> 1257

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

gctgcacctg tcatcactgc acctgctggt tacactctgg agagagtcgt catcctgtcc 60

agacatggtg ttcgttctcc aaccaaacag acccagttga tgaacgaggt cactcctgac 120

aagtggcctc aatggcctgt caaggctggt tacttgactc ctagaggtgc acaactcgtc 180

actctgctgg gtgccttcta cggtgagtac ttcagatccc agggtttgct gcctgctggt 240

tgtcctcctg aaggtactgt ctacgcacaa gctgacatcg accagagaac cagactcact 300

ggtcaggcat tcctggatgg tgttgcacct ggttgtggtc tggaggtcca ctaccaggct 360

gacctgaaga agactgatcc actgttccat cctgtcgaag ctggtgtctg caaggttgac 420

ttggcacaga ccagacaggc tgttgagcag agattgggtg gtccactgac caccctgtcc 480

cagagatacg ccaagccatt cgctcagatg ggtgaagtcc tgaacttcgc tgagtctcca 540

ttctgcaagt ccctccaaca gaagggtaag acctgtgact tcgctacctt cgctgccaac 600

gagatcgacg tcaacaagga cggtactaaa atctctctga ctggtcctct ggctctgtcc 660

tccactctgg ctgaaatctt cctgttgcag aactctcagg caatgcctga tgtcgcatgg 720

cacagactgt ctggtgctga gaactgggtc tccttgctgt ctctgcacaa cgcacagttc 780

gacttgatgg ctaagactcc atacatcgcc agacacaagg gtactccact gctgcaacag 840

atcaacactg cactggtcct ccagagagat gctcagggtc agactctgcc actgtctcca 900

cagaccaagg tcctgttcct gggtggtcac gacaccaaca ttgccaacat cgctggtatg 960

ctcggtgcaa actggcaact gcctcaacaa cctgacaaca ctccacctgg tggtggtctg 1020

gtcttcgagc tgtggcaaca tcctgacaac catcagagat acgtcgctgt caagatgttc 1080

taccagacta tggatcagct gagaaacgtc gagaagttga acctgaccac caaccctgct 1140

ggtatcatcc ctatcgctgt cgaaggttgc gagaacatgg gtgacgacaa gctctgtcag 1200

ctcgaaacct tcgagaagaa gatcgcacaa gtcgtcgaac ctgcatgtca catctaa 1257

<210> 10

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

gcgattaagt tgggtaacgc c 21

<210> 11

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

ggaaagcggg cagtgagcgc aacg 24

<210> 12

<211> 1254

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

gctcctgtcg ctgctcctgt cactggttac actctggaga gagtcgtcat cctgtccaga 60

cacggtgtta gaagtcctac taagcagact gagctgatga acgacgtcac tcctgacaag 120

tggccacagt ggcctgttcc tgctggttat ctgactccta gaggtgctca gctggtcact 180

ctgatgggtg gtttctacgg tgactacttc agaaaccagg gtctgctgcc tgctggttgt 240

cctgctgacg gtactctgta cgctcaggct gacatcgacc agagaactag actgactggt 300

caggctttcc tggatggtat cgctcctggt tgtggtctga aggtccacta ccaggctgac 360

ctgaagaaga atgatcctct gttccaccct gtcgaggctg gtgtctgtca gctggactct 420

actcagactc acagagctat cgaggctcag tgcggtgctc ctctgtctga gctgtctcag 480

agatacgcta agcctttcgc tcagatgggt gagatcctga acttcactgc ttctccttac 540

tgcaagtctc tccagcagca gggtaagtct tgcgacttcg ctactttcgc tgctaacgag 600

gtctgtgtca accagggggg tactaaggtc tctctgtctg gtcctctggc tctgtcttct 660

actctgggtg aaatcttcct gctccagaac tctcagggta tgcctgacgt cgcttggcac 720

agactgtctg gtgctgagaa ctgggtctct ctgctgtctc tgcacaacgc tcagttcgac 780

ctgatggcta agactcctta catcgctaga cacaagggta ctcctctgct ccagcagatc 840

gtcactgctc tggtcctcca gagaaagggt cagggtcaga ctctgcctct gtctgagcag 900

actaagctgc tgttcctggg tggtcacgac actaacatcg ctaacatcgg tggtatgctg 960

ggtgctaact ggcagctgcc tcagcagcct gacaacactc ctcctggtgg tggtctggtc 1020

ttcgagctgt ggcagaaccc tgacaaccac cagcagtacg tcgctgtcaa gatgttctac 1080

cagactatgg accagctgag aaactctgag aagctggatc tgaagtctca ccctgctggt 1140

atcgtcccta tcgagatcga gggttgcgag aacatcggta ctgacaagct gtgccagctg 1200

gacactttcc agaagagagt cgctcaggtc atcgagcctg cttgccacat ctaa 1254

<210> 13

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

aactcgagaa aagagaacct ccggagctcc tgtcgctgct cctgtcactg 50

<210> 14

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

aacgcggccg cttagatgtg gcaagcaggc tcgatgacct g 41

<210> 15

<211> 417

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

Ala Pro Val Ala Ala Pro Val Thr Gly Tyr Thr Leu Glu Arg Val Val

1 5 10 15

Ile Leu Ser Arg His Gly Val Arg Ser Pro Thr Lys Gln Thr Glu Leu

20 25 30

Met Asn Asp Val Thr Pro Asp Lys Trp Pro Gln Trp Pro Val Pro Ala

35 40 45

Gly Tyr Leu Thr Pro Arg Gly Ala Gln Leu Val Thr Leu Met Gly Gly

50 55 60

Phe Tyr Gly Asp Tyr Phe Arg Asn Gln Gly Leu Leu Pro Ala Gly Cys

65 70 75 80

Pro Ala Asp Gly Thr Leu Tyr Ala Gln Ala Asp Ile Asp Gln Arg Thr

85 90 95

Arg Leu Thr Gly Gln Ala Phe Leu Asp Gly Ile Ala Pro Gly Cys Gly

100 105 110

Leu Lys Val His Tyr Gln Ala Asp Leu Lys Lys Asn Asp Pro Leu Phe

115 120 125

His Pro Val Glu Ala Gly Val Cys Gln Leu Asp Ser Thr Gln Thr His

130 135 140

Arg Ala Ile Glu Ala Gln Cys Gly Ala Pro Leu Ser Glu Leu Ser Gln

145 150 155 160

Arg Tyr Ala Lys Pro Phe Ala Gln Met Gly Glu Ile Leu Asn Phe Thr

165 170 175

Ala Ser Pro Tyr Cys Lys Ser Leu Gln Gln Gln Gly Lys Ser Cys Asp

180 185 190

Phe Ala Thr Phe Ala Ala Asn Glu Val Cys Val Asn Gln Gly Gly Thr

195 200 205

Lys Val Ser Leu Ser Gly Pro Leu Ala Leu Ser Ser Thr Leu Gly Glu

210 215 220

Ile Phe Leu Leu Gln Asn Ser Gln Gly Met Pro Asp Val Ala Trp His

225 230 235 240

Arg Leu Ser Gly Ala Glu Asn Trp Val Ser Leu Leu Ser Leu His Asn

245 250 255

Ala Gln Phe Asp Leu Met Ala Lys Thr Pro Tyr Ile Ala Arg His Lys

260 265 270

Gly Thr Pro Leu Leu Gln Gln Ile Val Thr Ala Leu Val Leu Gln Arg

275 280 285

Lys Gly Gln Gly Gln Thr Leu Pro Leu Ser Glu Gln Thr Lys Leu Leu

290 295 300

Phe Leu Gly Gly His Asp Thr Asn Ile Ala Asn Ile Gly Gly Met Leu

305 310 315 320

Gly Ala Asn Trp Gln Leu Pro Gln Gln Pro Asp Asn Thr Pro Pro Gly

325 330 335

Gly Gly Leu Val Phe Glu Leu Trp Gln Asn Pro Asp Asn His Gln Gln

340 345 350

Tyr Val Ala Val Lys Met Phe Tyr Gln Thr Met Asp Gln Leu Arg Asn

355 360 365

Ser Glu Lys Leu Asp Leu Lys Ser His Pro Ala Gly Ile Val Pro Ile

370 375 380

Glu Ile Glu Gly Cys Glu Asn Ile Gly Thr Asp Lys Leu Cys Gln Leu

385 390 395 400

Asp Thr Phe Gln Lys Arg Val Ala Gln Val Ile Glu Pro Ala Cys His

405 410 415

Ile

Claims (5)

1.一种编码如下的耐高温高比活植酸酶基因序列，SEQ ID NO.12所示，

gctcctgtcg ctgctcctgt cactggttac actctggaga gagtcgtcat cctgtccaga 60

cacggtgtta gaagtcctac taagcagact gagctgatga acgacgtcac tcctgacaag 120

tggccacagt ggcctgttcc tgctggttat ctgactccta gaggtgctca gctggtcact 180

ctgatgggtg gtttctacgg tgactacttc agaaaccagg gtctgctgcc tgctggttgt 240

cctgctgacg gtactctgta cgctcaggct gacatcgacc agagaactag actgactggt 300

caggctttcc tggatggtat cgctcctggt tgtggtctga aggtccacta ccaggctgac 360

ctgaagaaga atgatcctct gttccaccct gtcgaggctg gtgtctgtca gctggactct 420

actcagactc acagagctat cgaggctcag tgcggtgctc ctctgtctga gctgtctcag 480

agatacgcta agcctttcgc tcagatgggt gagatcctga acttcactgc ttctccttac 540

tgcaagtctc tccagcagca gggtaagtct tgcgacttcg ctactttcgc tgctaacgag 600

gtctgtgtca accagggggg tactaaggtc tctctgtctg gtcctctggc tctgtcttct 660

actctgggtg aaatcttcct gctccagaac tctcagggta tgcctgacgt cgcttggcac 720

agactgtctg gtgctgagaa ctgggtctct ctgctgtctc tgcacaacgc tcagttcgac 780

ctgatggcta agactcctta catcgctaga cacaagggta ctcctctgct ccagcagatc 840

gtcactgctc tggtcctcca gagaaagggt cagggtcaga ctctgcctct gtctgagcag 900

actaagctgc tgttcctggg tggtcacgac actaacatcg ctaacatcgg tggtatgctg 960

ggtgctaact ggcagctgcc tcagcagcct gacaacactc ctcctggtgg tggtctggtc 1020

ttcgagctgt ggcagaaccc tgacaaccac cagcagtacg tcgctgtcaa gatgttctac 1080

cagactatgg accagctgag aaactctgag aagctggatc tgaagtctca ccctgctggt 1140

atcgtcccta tcgagatcga gggttgcgag aacatcggta ctgacaagct gtgccagctg 1200

gacactttcc agaagagagt cgctcaggtc atcgagcctg cttgccacat ctaa 1254。

2.根据权利要求1所述的植酸酶基因，其特征是来源于耶尔森菌属植酸酶基因，其编码的氨基酸如SEQ ID NO.15所示，在124位为天冬酰胺；151位为半胱氨酸；202位为半胱氨酸；206位分甘氨酸。

3.根据权利要求1所述的植酸酶基因，其特征在于植酸酶基因获得的方法包括：

、采用化学合成和结构优化来源于耶尔森菌属植酸酶基因；

b、以上述合成植酸酶基因为模板，利用基因家族改组进行DNA分子重排，利用酿酒酵母对重排基因进行定向筛选，获得耐高温植酸酶基因。

4.根椐权利要求1所述的植酸酶基因，其特征在于组装到酵母表达载体中构建成酵母表达载体pYAPPA102，整合到毕赤酵母染色体上后，能够筛选高效表达植酸酶的基因工程菌株。

5.根椐权利要求4所述的植酸酶基因工程菌种，表达的植酸酶具有高温耐受性。