CN110029120A

CN110029120A - 一种植酸酶高产菌株及其应用

Info

Publication number: CN110029120A
Application number: CN201910205910.6A
Authority: CN
Inventors: 程斯达; 康丽华; 李宾; 黄亦钧
Original assignee: Qingdao Vland Biotech Group Co Ltd
Current assignee: Qingdao Vland Biotech Group Co Ltd
Priority date: 2019-03-19
Filing date: 2019-03-19
Publication date: 2019-07-19
Anticipated expiration: 2039-03-19
Also published as: CN110029120B

Abstract

本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种植酸酶高产菌株及其应用。所述突变菌株的保藏编号为CCTCC NO:M2019124。所述突变菌株摇瓶发酵上清液中植酸酶酶活高达4680U/ml，比出发菌提高了101.6%，取得了意料不到的技术效果。所述突变菌株可广泛应用于植酸酶的生产，有利于显著降低该酶的生产成本，进而促进该酶在饲料等领域中的广泛应用。

Description

一种植酸酶高产菌株及其应用

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种植酸酶高产菌株及其应用。

背景技术

磷是动物生长必要的元素，存在于动物体所有细胞中，几乎参与所有生理上的化学反应，其含量超过动物机体矿物质总量的1/4。磷在动物体内以磷酸盐形式存在，其中80%以羟磷存在于骨骼和牙齿中，另外20%则存在于肌肉、血液及软骨中。长期磷缺乏会导致动物生长组织受到抑制，骨骼变软变脆，诱发生长动物的佝偻病和成年动物的骨质疏松症，从而影响动物的生长性能。为满足动物对磷的需求，目前大多在动物饲料中添加无机磷，如磷酸氢钙。而以植物性饲料为主的动物日粮中本身就含有丰富的磷源，但它们主要以动物不能直接吸收的植酸或植酸盐形式存在。有些谷物、油料作物中的植酸含量甚至高达1％～3％。

由于单胃动物消化道中缺乏分解植酸的酶系，因此植酸不能被单胃动物分解生成无机磷，而是随着粪便被排出体外，进入到环境中。这样既造成磷元素的大量浪费，需要人们在饲料中额外添加磷元素，同时大量的磷元素被排放到环境中，加剧了环境污染。此外，植酸还是强抗营养因子，能螯合Ca2+、Fe2+、Zn2+等金属离子形成难溶性植酸盐络合物，能与带正电荷的蛋白质、维生素等形成难溶复合物，影响蛋白质、维生素的吸收并降低了饲料的营养价值。

作为单胃动物的饲料添加剂，植酸酶的饲喂效果已经得到充分的确证：它可使植物性饲料中磷的利用率提高60％，减少了饲料中无机磷的添加量，动物粪便中无机磷排出量减少40％，减轻了环境的磷污染量；植酸酶还能解除植酸对金属离子和蛋白质的螯合作用，提高单胃动物对金属离子尤其是微量金属离子的吸收，提高蛋白质的利用率。

随着饲料工业的发展，植酸酶已经成为饲料添加剂和酶制剂研究的热点。重点的研究方向之一就是解决在天然微生物中植酸酶的表达量太低，不能大量获得廉价的植酸酶产品，难以满足饲料工业发展的需求。为解决这一问题大致有两条途径：一、通过传统的遗传学方法对已有的菌株进行改良以获得性能更优良的菌株；二、通过基因工程的手段克隆性能优良的植酸酶基因并将其导入到合适的宿主体内得到优良的重组菌。

本发明即提供一株菌株，可实现大幅度提高植酸酶产量、降低生产成本的目的。

发明内容

本发明为解决现有技术问题，提供了一种毕赤酵母突变菌株。申请人首先使用新的启动子ATX构建得到重组表达植酸酶的毕赤酵母工程菌，然后进一步通过紫外诱变获得一株能大幅度提高植酸酶的表达量的突变菌，有利于降低植酸酶的生产成本，应用前景广阔。

本发明一方面提供了一种重组质粒，所述重组质粒携带有启动子ATX和植酸酶基因。

所述启动子ATX的核苷酸序列为SEQ ID NO:1。

所述植酸酶的氨基酸序列为SEQ ID NO:2，其编码核苷酸序列为SEQ ID NO:3。

本发明一方面提供了一种毕赤酵母工程菌株，其携带上述重组质粒。

本发明还提供了一种突变菌株毕赤酵母ATX-2（Pichia pastoris ATX-2），是以上述的毕赤酵母工程菌为出发菌株通过紫外诱变获得的。

所述突变菌株已于2019年3月6日保藏于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M2019124。

本发明还提供了所述毕赤酵母突变菌株在生产植酸酶中的应用。

申请人首先利用新型的启动子ATX构建得到重组表达植酸酶的毕赤酵母工程菌ATX-MIP-2，其摇瓶发酵上清液中植酸酶酶活达到2321U/ml，比使用启动子AOX1的对照组菌株提高了136%，取得了意料不到的技术效果。

为了提高植酸酶的产量，申请人以毕赤酵母ATX-MIP-2为出发菌株，进一步通过紫外诱变的方法筛选获得一株突变菌株ATX-2。所述突变菌株摇瓶发酵上清液中植酸酶酶活高达4680U/ml，比出发菌提高了101.6%，取得了意料不到的技术效果。所述突变菌株可广泛应用于植酸酶的生产，有利于显著降低该酶的生产成本，进而促进该酶在饲料等领域中的广泛应用。

具体实施方式

下面结合实例对本发明的方法做进一步说明，实施例中未注明具体条件的实验方法，通常可按常规条件，如J.萨姆布鲁克（Sambrook）等编写的《分子克隆实验指南》中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件运行。本领域相关的技术人员可以借助实施例更好地理解和掌握本发明。但是，实现本发明的方法不应限于本发明实施例所记载的具体方法步骤。

菌株与载体：大肠杆菌DH5α、毕赤酵母GS115、载体pPIC9k、pPICZA、Amp、G418、Zeocin购自Invitrogen公司。

酶与试剂盒：DNA聚合酶购买自Takara公司，T4连接酶、限制性内切酶购自Fermentas公司，质粒提取试剂盒及胶纯化回收试剂盒购自Omega公司，GeneMorph II随机诱变试剂盒购自北京博迈斯生物科技有限公司。

培养基配方：

大肠杆菌培养基（LB培养基）：0.5%酵母提取物，1%蛋白胨，1%NaCl，pH7.0；

LB+Amp培养基：LB培养基加100μg/mL氨苄青霉素；

酵母培养基（YPD培养基）：1%酵母提取物，2%蛋白胨，2%葡萄糖；

YPD+Zeocin培养基：YPD培养基加100μg/ml Zeocin；

酵母筛选培养基（MD培养基）：1.34% YNB，4×10^-5生物素，1%甘油、2%琼脂糖；

BMGY培养基：2%蛋白胨，1%酵母提取物，100 mM磷酸钾缓冲液(pH6.0)，1.34% YNB，4×10^-5生物素，1%甘油；

BMMY培养基：2%蛋白胨，1%酵母提取物，100 mM磷酸钾缓冲液(pH6.0)，1.34% YNB，4×10^-5生物素，0.5%甲醇。

实施例1、新启动子ATX的设计、克隆与表达质粒的构建

1、新启动子ATX的设计与克隆

申请人以毕赤酵母的醇氧化酶启动子AOX1的基因序列为基础，去除基因序列中的TATAbox序列，改造后的新启动子序列为SEQ ID NO:1，命名为ATX。新启动子ATX由华大基因公司全基因合成。

用PCR反应克隆新启动子ATX，引物和反应条件如下：

引物1(F)：ATCAGATCTAACATCCAAAGACGAAAGGTTGAA

引物1(R)：CGTTTGGATCCTTCGAATAATTAGTTGTTTTTTG

PCR条件为：94℃变性5min；然后94℃变性30s，56℃复性30s，72℃延伸1min，35个循环后，72℃保温10min。新启动子ATX基因全长941bp。

2、新表达载体pATX9K构建

将克隆得到的新启动子ATX基因用限制性内切酶BglⅡ和BamHⅠ进行双酶切，50 μl酶切体系如下：新启动子ATX基因的 PCR产物43 μl、10×FastDigest Buffer 5 μl、BglⅡ1μl和BamHⅠ1 μl。37℃酶切2h后，琼脂糖凝胶电泳回收。

表达载体pPIC9K的50 μl酶切体系如下：表达载体pPIC9K 43μl、10×FastDigestBuffer 5 μl、BglⅡ1μl和BamHⅠ1 μl。37℃酶切2h后，琼脂糖凝胶电泳回收。

将经BglⅡ和BamHⅠ双酶切的新启动子ATX基因片段与表达载体pPIC9K连接，构建得到新的表达质粒pATX9K。连接体系如下：表达载体pPIC9K双酶切产物5 μl、新启动子ATX基因双酶切产物3 μl、10×T₄ ligase buffer 1 μl、T₄ ligase 1 μl。22 ℃连接过夜，转化到大肠杆菌DH5α，挑取转化子测序验证。测序验证正确的转化子转接到LB+Amp液体培养基中，37℃过夜培养，提质粒，即为新的表达质粒pATX9K。

实施例2、中性植酸酶基因MIP的克隆和密码子优化

申请人以中性植酸酶基因MIP（GenBank号为MF150912.1）的氨基酸序列SEQ ID NO:2为基础，根据毕赤酵母的密码子偏好性，对其进行密码子优化。优化后的新基因序列为SEQ IDNO:3，命名为MIP-2，由华大基因公司合成该序列。

采用PCR反应克隆中性植酸酶基因MIP-2片段，引物和反应条件如下：

引物2(F)：GCGCGAATTCTTGCCAAACTCTTTGCAAGGTTTGC；

引物2(R)：TAAAGCGGCCGCTTACATACCCCAGAATCTCTTTTTT；

PCR条件为：94℃变性5min；然后94℃变性30s，56℃复性30s，72℃延伸1min40s，35个循环后，72℃保温10min。MIP-2基因长度与MIP基因相同，全长1515bp。

实施例3、毕赤酵母工程菌的构建

1、重组质粒的构建

将克隆得到的中性植酸酶基因MIP-2用限制性内切酶EcoR I和Not I进行双酶切，100μl酶切体系如下：中性植酸酶基因MIP-2的 PCR产物40 μl、10×H buffer 10 μl、10×BSA10 μl、EcoR I 5 μl、Not I 5 μl、ddH₂O 30 μl。37℃酶切4 h后，琼脂糖凝胶电泳回收。

将实施例1构建得到的表达载体pATX9K先用限制性内切酶EcoR I进行单酶切，100μl酶切体系如下：表达载体pATX9K 20 μl、10×H buffer 10 μl、EcoR I 5 μl、ddH₂O 65 μl。37℃酶切4 h后，琼脂糖凝胶电泳回收。将回收片段再用限制性内切酶Not I进行单酶切，100 μl酶切体系如下：pATX9K回收片段 20 μl、10×H buffer 10 μl、10×BSA 10 μl、10×Triton 10 μl、Not I 5 μl、ddH₂O 45 μl。37℃酶切4 h后，琼脂糖凝胶电泳回收。

将经EcoR I和Not I双酶切的MIP-2片段与表达载体pATX9K连接，构建表达载体pATX9K-MIP-2。连接体系如下：表达载体pATX9K双酶切产物5 μl、MIP-2基因双酶切产物3 μl、10×T₄ ligase buffer 1 μl、T₄ ligase 1 μl。22 ℃连接过夜，转化到大肠杆菌DH5α，挑取转化子测序验证。测序验证正确的转化子转接到LB+Amp液体培养基中，37℃过夜培养，提质粒，即为重组酵母表达质粒pATX9K-MIP-2。

2、转化与筛选

将重组酵母表达质粒pATX9K-MIP-2用Sal I进行线性化，线性化产物用柱纯化试剂盒纯化后，通过电穿孔法转化毕赤酵母GS115，涂布MD平板。在MD平板上生长出的菌落即为毕赤酵母工程菌株，然后涂布含不同浓度遗传霉素G418的YPD平板上筛选多拷贝的转化子。

3、摇瓶发酵验证

挑取单个多拷贝转化子分别接入BMGY培养基中，30℃、220rpm振荡培养24小时后，再转入BMMY培养基中，30℃、220rpm振荡培养，每24小时添加0.5%的甲醇。诱导表达4d后，离心去除菌体，将上清液进行植酸酶活力测定。

结果显示，使用新启动子ATX构建得到的转化子摇瓶发酵培养液中植酸酶酶活最高达到2321U/ml，将该转化子命名为毕赤酵母ATX-MIP-2（Pichia pastoris ATX-MIP-2）。

作为对照组，申请人参照实施例1-3同样的操作，将启动子AOX1基因片段与表达载体pPIC9K连接，构建得到表达质粒pAOX9K；然后将植酸酶MIP-2基因与表达质粒pAOX9K进行连接，构建得到重组酵母表达质粒pAOX9K-MIP-2，然后经转化获得导入质粒pAOX9K-MIP-2的转化子，摇瓶发酵酶活最高达到985U/ml，将该转化子命名为毕赤酵母AOX-MIP-2（Pichia pastoris AOX-MIP-2）。

上述结果表明，本发明提供的新启动子ATX能显著提高毕赤酵母对植酸酶MIP-2的表达量，与使用启动子AOX1的对照组相比，植酸酶MIP-2的表达量提高了136%，取得了意料不到的技术效果。

（1）植酸酶酶活单位的定义

在温度为37℃、pH为5.5的条件下，每分钟从浓度为5.0mmol/L植酸钠中释放1μmol无机磷，即为一个植酸酶活性单位，以U表示。

（2）植酸酶酶活测定方法

取甲、乙两支25mL比色管，各加入1.8mL乙酸缓冲液（PH 5.0）、0.2mL样品反应液，混匀，37℃预热5min。在甲管中加入4mL底物溶液，乙管中加入4mL终止液，混匀，37℃反应30min，反应结束后甲管中加入4mL终止液，乙管中加入4mL底物溶液，混匀。静置10min，分别在415nm波长处测定吸光值。每种样品作3个平行，取吸光值的平均值，通过标准曲线用回归直线方程计算植酸酶活性。

酶活X＝F×C/(m×30)

其中:X——酶活力单位，U/g(mL);

F——试样溶液反应前的总稀释倍数;

C——根据实际样液的吸光值由直线回归方程计算出的酶活性，U;

m——试样质量或体积，g/mL;

30——反应时间。

实施例4、紫外诱变与筛选

紫外诱变导致的突变随机性很强，突变产生的效果也是随机的，难以预测。因此，为了获得有效的正突变，技术人员通常需要进行多轮紫外诱变，筛选的工作量较大，而且存在无法获得有效正突变的可能性。但因为紫外诱变所需设备简单、费用少，并且可在短时间内获得大量突变体，因此，它现在仍是一种常用的诱变选育方法。

申请人以毕赤酵母ATX-MIP-2为出发菌株，通过紫外诱变方法对其进行遗传学改造，进一步提高其植酸酶的产量。

将毕赤酵母ATX-MIP-2接种于YPD平板，30℃培养2-3d，使用无菌水洗菌体，制成悬浮液，稀释至1×10⁶个/mL，紫外灯（40W）照射2-10min，距离约22cm，致死率达到90%以上，涂布平板。30℃培养48h。

第一轮紫外诱变共获得了约408个突变菌单菌落，将各个单菌落分别接种于装有200ul BMGY液体培养基的96孔板，30℃ 250rpm振荡培养1 d后，离心去掉上层培养基，再加入200ul BMM培养基，30℃、250rpm振荡培养2 d，每天添加0.5%的甲醇。诱导表达2 d后，离心去除菌体，得到含植酸酶的上清液，测定植酸酶的活力，以出发菌ATX-MIP-2为对照，筛选出发酵酶活力得到显著提高的突变菌株。

结果显示，第一轮紫外诱变筛选获得的突变菌中，没有一株突变菌发酵上清液中植酸酶的酶活高于出发菌。申请人又按照上述方法继续进行了24轮诱变筛选，最终获得3株植酸酶产量显著高于出发菌的突变菌株，分别命名毕赤酵母ATX-1，ATX-2，ATX-3。

将上述筛选获得的3株突变菌ATX-1，ATX-2，ATX-3分别转接于BMGY培养基中，30℃，250rpm振荡培养1 d后，再转入BMM培养基中，30℃，250rpm振荡培养，每天添加0.5%的甲醇；诱导表达4 d后，离心去除菌体，得到发酵上清液；将发酵上清液进行植酸酶酶活检测。结果显示，上述突变菌株中毕赤酵母ATX-2发酵上清液酶活最高，达到4680U/ml，比出发菌毕赤酵母ATX-MIP-2提高了101.6%，取得了意料不到的技术效果。

申请人已于2019年3月6日将突变菌株毕赤酵母ATX-2（Pichia pastoris ATX-2）保藏于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M2019124。

序列表

<110> 青岛蔚蓝生物集团有限公司

<120> 一种植酸酶高产菌株及其应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 941

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

agatctaaca tccaaagacg aaaggttgaa tgaaaccttt ttgccatccg acatccacag 60

gtccattctc acacataagt gccaaacgca acaggagggg atacactagc agcagaccgt 120

tgcaaacgca ggacctccac tcctcttctc ctcaacaccc acttttgcca tcgaaaaacc 180

agcccagtta ttgggcttga ttggagctcg ctcattccaa ttccttctat taggctacta 240

acaccatgac tttattagcc tgtctatcct ggcccccctg gcgaggttca tgtttgttta 300

tttccgaatg caacaagctc cgcattacac ccgaacatca ctccagatga gggctttctg 360

agtgtggggt caaatagttt catgttcccc aaatggccca aaactgacag tttaaacgct 420

gtcttggaac ctaatatgac aaaagcgtga tctcatccaa gatgaactaa gtttggttcg 480

ttgaaatgct aacggccagt tggtcaaaaa gaaacttcca aaagtcgcca taccgtttgt 540

cttgtttggt attgattgac gaatgctcaa aaataatctc attaatgctt agcgcagtct 600

ctctatcgct tctgaacccc ggtgcacctg tgccgaaacg caaatgggga aacacccgct 660

ttttggatga ttatgcattg tctccacatt gtatgcttcc aagattctgg tgggaatact 720

gctgatagcc taacgttcat gatcaaaatt taactgttct aacccctact tgacagcaaa 780

cagaaggaag ctgccctgtc ttaaaccttt ttttttatca tcattattag cttactttca 840

taattgcgac tggttccaat tgacaagctt ttgattttaa cgacttttaa cgacaacttg 900

agaagatcaa aaaacaacta attattcgaa ggatccaaac g 941

<210> 2

<211> 504

<212> PRT

<213> 梯棱羊肚菌(Morchella importuna)

<400> 2

Leu Pro Asn Ser Leu Gln Gly Leu Gln Ala Ala Leu Pro Ser Tyr Leu

1 5 10 15

Gln Ile His His Gly Gly Trp Trp Ser Gly Glu Pro Asp Tyr Gln Ala

20 25 30

Ala Ser Gly His Thr Val Asp Lys Asp Glu Trp Asn Leu Leu Tyr His

35 40 45

Leu Gly Gly Asn Gly Pro Trp Val Glu Lys Val Asp Gly Val Val Glu

50 55 60

Gly Gly Ile Gln Val Pro Asp Gly Cys Glu Val Asp Met Val His Met

65 70 75 80

Met Ser Arg His Gly Glu Arg Phe Pro Thr Gln Lys Ala Gly Asn Arg

85 90 95

Met Ile Ser Leu Leu Glu Arg Ile Ser Glu Val Lys Ser Thr Gly Lys

100 105 110

Glu Leu Lys Gly Ala Leu Glu Phe Leu Asn Asp Trp Glu Tyr Phe Thr

115 120 125

Asn Ser Pro Gly Glu His Phe Glu Gln Leu Thr Thr Thr Gly Pro Tyr

130 135 140

Ala Gly Val Leu Glu Ala Phe Thr Thr Gly Val Lys Leu His Thr Arg

145 150 155 160

Tyr Gly His Leu Trp Asn Glu Thr Leu His Gly Arg Thr Thr Val Trp

165 170 175

Ala Ser Glu Cys Asp Arg Val Ile Asp Thr Ala Arg Tyr Phe Ser Ala

180 185 190

Gly Phe Phe Gly Leu Asp Pro Lys Ala Ser Lys Leu Glu Ile Val Ser

195 200 205

Glu Ala Ala Asn Lys Gly Gly Asp Thr Leu Thr Pro Gly Asp Thr Cys

210 215 220

Ile Lys Tyr Ala Gln Asp Glu Glu Glu Gly His Asp Tyr Gly Tyr Glu

225 230 235 240

Met Leu Tyr Lys Tyr Arg Ala Thr Tyr Leu Ser Asp Ile Ser Lys Arg

245 250 255

Leu Ala Asn Asp Asn Glu Gly Phe Asp Phe Thr Asp Ser Glu Ile Tyr

260 265 270

Ser Met Gln Glu Met Cys Gly Phe Glu Thr Thr Val Arg Gly Ser Ser

275 280 285

Lys Trp Cys Asp Val Phe Thr Lys Glu Glu Trp Leu Ser Phe Glu Tyr

290 295 300

Ala Arg Asp Val Ile His Tyr Tyr Arg Ala Gly Pro Gly Asn Lys Tyr

305 310 315 320

Ala Lys Ser Met Gly Trp Leu Trp Leu Asn Ala Thr Ala Asn Leu Ile

325 330 335

Ala Glu Gly Pro Asp Thr Ala Gly Ser Leu Tyr Phe Ser Phe Val His

340 345 350

Asp Gly Asp Ile Val Pro Met Leu Ala Ala Leu Gly Leu Phe Glu Asp

355 360 365

Ala Glu Gln Leu Pro Val Asp Arg Ile Ala Lys Asp Arg Lys Trp Lys

370 375 380

Thr Ser Gln Ile Thr Pro Met Gly Gly Arg Ile Ile Phe Glu Arg Met

385 390 395 400

Asn Cys Ala Val Lys Gly Ser Gly Glu Gly Asp Ile Tyr Ile Arg Leu

405 410 415

Asn Val Asn Asp Gly Ile Val Ala Leu Glu Gly Cys Asn Asp Gly Pro

420 425 430

Gly Lys Ser Cys Pro Leu Asn Ser Phe Leu Lys His Val Lys Thr Arg

435 440 445

Gly Glu Ile Gly Gly Asp Phe Arg Lys Thr Cys Gly Leu Ala Glu Asp

450 455 460

Ala Ala Asp Arg Leu Thr Phe Leu Arg Gln Pro Met Gly Lys Met Glu

465 470 475 480

Glu Val Glu Val Val Ala Val Glu Ala Val Lys Glu Lys Glu Lys Glu

485 490 495

Lys Lys Lys Arg Phe Trp Gly Met

500

<210> 3

<211> 1515

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ttgccaaact ctttgcaagg tttgcaagct gctttgccat cctacttgca gattcaccac 60

ggtggatggt ggtctggtga gccagactat caagccgcct ccggtcacac tgtcgataaa 120

gatgagtgga atttgttgta ccacttgggt ggtaatggtc catgggttga gaaggtcgat 180

ggtgttgttg agggtggtat ccaagttccc gatggttgcg aggtcgacat ggtccacatg 240

atgtcccgtc acggagaaag attcccaacc cagaaggccg gtaacagaat gatctctttg 300

ttggagagaa tttccgaggt taaatctact ggtaaggagt tgaagggtgc cttggagttc 360

ttgaacgact gggagtactt cactaactcc cccggtgagc acttcgagca acttaccacc 420

actggtccat atgctggtgt tttggaggct ttcaccaccg gtgtcaagtt gcatactcgt 480

tacggacact tgtggaacga aaccttgcac ggtagaacta ccgtttgggc ttccgagtgt 540

gaccgtgtca tcgacaccgc tagatacttc tctgctggtt tctttggttt ggacccaaag 600

gcctccaagt tggaaatcgt ttccgaggcc gctaacaagg gtggagacac cttgactccc 660

ggtgacactt gtatcaagta cgctcaagac gaagaggagg gacatgacta cggttacgaa 720

atgctttaca aatacagagc cacctacttg tccgatatct ccaagcgttt ggccaacgac 780

aacgagggtt ttgacttcac tgactccgaa atttactcca tgcaagaaat gtgcggtttt 840

gagaccaccg ttcgtggttc ctccaagtgg tgcgacgtct tcactaagga agagtggttg 900

tccttcgagt acgcccgtga cgtcatccac tactacagag ctggacccgg taacaagtac 960

gctaagtcca tgggttggtt gtggttgaac gccactgcca atttgattgc tgagggtcca 1020

gacactgctg gttccttgta cttctccttc gtccacgatg gtgacattgt ccctatgctt 1080

gctgccttgg gtttgttcga agatgctgag cagcttcccg ttgacagaat tgccaaggat 1140

agaaagtgga agacctctca gattacccca atgggaggta gaatcatctt tgagcgtatg 1200

aactgcgccg tcaagggttc tggtgaagga gatatttaca ttagattgaa tgttaatgat 1260

ggtatcgttg ccttggaagg ttgtaacgac ggtcccggta aatcttgtcc attgaactcc 1320

ttccttaagc acgtcaagac tcgtggagag atcggtggtg atttccgtaa gacttgtggt 1380

cttgccgagg acgctgccga cagattgacc ttcttgagac agccaatggg taagatggag 1440

gaggttgagg ttgttgccgt cgaagccgtc aaggaaaagg aaaaagaaaa aaaaaagaga 1500

ttctggggta tgtaa 1515

Claims

1.一种重组质粒，其特征在于，所述的重组质粒携带有启动子ATX和植酸酶基因。

2.如权利要求1所述的重组质粒，其特征在于，所述的启动子ATX的核苷酸序列为SEQID NO:1。

3.如权利要求1或2所述的重组质粒，其特征在于，所述的植酸酶的氨基酸序列为SEQID NO:2，其编码核苷酸序列为SEQ ID NO:3。

4.一种毕赤酵母工程菌，其特征在于，所述的毕赤酵母工程菌携带有权利要求1-3任一所述的重组质粒。

5.一种毕赤酵母突变菌株，其特征在于，所述突变菌株是以权利要求4所述的毕赤酵母工程菌为出发菌株通过紫外诱变获得的。

6.一种毕赤酵母突变菌株，其特征在于，所述突变菌株的保藏编号为CCTCC NO:M2019124。

7.权利要求6所述的毕赤酵母突变菌株在生产植酸酶中的应用。