CN109957520A - 外源基因表达用毕赤酵母菌株 - Google Patents

Abstract

本发明提供外源基因表达用毕赤酵母菌株(Pichia pastoris)，其保藏编号为CGMCC NO.15017。所述毕赤酵母菌株可作为基础菌株，构建表达感兴趣蛋白的表达菌株。

Description

外源基因表达用毕赤酵母菌株

技术领域

本发明涉及外源基因表达用毕赤酵母菌株。

背景技术

磷脂酶是在生物体内存在的可以水解甘油磷脂的一类酶，其中主要包括磷脂酶A1、A2、B、C和D，它们特异地作用于磷脂分子内部的各个酯键，形成不同的产物，被广泛用于医药研制、饲料改良和油脂脱胶等方面。其中磷脂酶 C在食用油脱胶中的既可以将杂质磷脂转变为甘油酯，又可以降低磷脂脱胶过程中夹带的甘油酯，能够显著提高食用油精炼得率。世界年消费植物油将近19000万吨，中国年消费精炼植物油近6000万吨。如果这些植物油的精炼都是用磷脂酶C脱胶，将需要12000吨-38000吨磷脂酶C，市场极为巨大。

中国法规GB2760规定脱胶用磷脂酶C只能使用巴斯德毕赤酵母异源表达，此外还有来源于米曲霉的β-半乳糖苷酶也可以使用巴斯德毕赤酵母异源表达来生产。巴斯德毕赤酵母属单细胞真核细胞，具有类似原核生物的生长特性和遗传操作便利性，能够大规模高密度地发酵而且蛋白分泌良好；毕赤酵母利用甲醇作为唯一碳源生长时，其醇氧化酶AOX1能占细胞总蛋白的30％，因此利用AOX1启动子可以实现非常有效的异源蛋白生产。食品用酶中，中国GB2760 只允许毕赤酵母发酵生产制定基因来源的这两种磷脂酶C和β-半乳糖苷酶，但医用原料、饲料、化工、纺织、洗涤用酶等非食品用酶不限定表达用宿主，因此毕赤酵母宿主具有很广阔的应用前景。但当前国内外具有商业生产价值的巴斯德毕赤酵母仅有美国Research Corporation Technologies(RCT公司)一家的系列菌株GS115、SMD1168及SMD1163、KM71等。RCT公司的基础菌株 GS115来自化学法诱变原始菌NRRL-Y 11430(ATCC76273)，使之成为组氨酸营养缺陷型宿主(His-)，便于进行克隆筛选，在此过程中引入35处突变其中32处为非同义突变，且生长性能有所提高[Comparative genomics andtranscriptomics of Pichia pastoris,Love et al.BMC Genomics(2016)17:550.DOI10.1186/s12864-016-2876-y]。在GS115的基础上改造的另一个方向是失活宿主蛋白酶。敲除敲除毕赤酵母中的液泡天冬氨酸蛋白酶(proteinase A,PEP4)得到SMD1168(his4pep4)，该蛋白酶用于激活其他液泡蛋白酶，包括羧肽酶Y (carboxypeptidase Y)和蛋白酶B，从而避免对蛋白酶敏感的酶制剂的表达。 RCT公司对商业化利用他的菌株要求缴纳每年4％左右的营业提成。开发新的毕赤酵母发酵用宿主菌株市场价值很大。本领域研究者熟知的，目前用于毕赤酵母表达的核酸载体主要利用商品毕赤酵母宿主菌株的组氨醇脱氢酶(his4)代谢缺陷作为营养选择标记，因此本发明也首先赋予本发明的毕赤酵母菌株相同的营养缺陷特征。

由于脱胶用磷脂酶C具有较大的市场需求前景，本发明通过诱变得到了显著提高磷脂酶C发酵性能的毕赤酵母菌株H8。

发明内容

本发明通过化学诱变和紫外诱变改造毕赤酵母CICC32806，使之成为异源表达用宿主H8，并且特殊地能显著提高食品加工用磷脂酶C表达物的比活力。

本发明提供了异源基因表达用毕赤酵母菌株，优选地，所述菌株的保藏编号为CGMCC NO.15017。

本发明还提供一种表达异源基因的毕赤酵母菌株，所述菌株为含有或转入了异源基因或基因组中整合了外源基因的保藏编号为CGMCC NO.15017的毕赤酵母菌株。

在一个或多个实施方案中，所述异源基因编码工业、饲料或食品领域中用到的蛋白。

在一个或多个实施方案中，所述异源基因编码脂肪酶、蛋白酶、纤维素酶、淀粉酶、植酸酶、酯酶、果胶酶、半乳糖苷酶或磷脂酶。

在一个或多个实施方案中，所述异源基因为SEQ ID NO:2或7所示的磷脂酶C的编码序列。

在一个或多个实施方案中，所示异源基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1 或6所示。

本发明提供一种细胞培养物，所述细胞培养物含有本文所述的毕赤酵母菌株和任选的培养基。

在一个或多个实施方案中，所述培养基为种子培养基或发酵培养基。

在一个或多个实施方案中，所述培养基为YPD培养基或BMMY培养基。

本发明提供一种酶液，所述酶液为本文所述的含有或转入了异源基因或基因组中整合了外源基因的保藏编号为CGMCC NO.15017的毕赤酵母菌株的发酵液或其细胞裂解液。

在一个或多个实施方案中，所述异源基因编码磷脂酶C，所述酶液含有磷脂酶C。

在一个或多个实施方案中，所述酶液还含有甘油和防腐剂。

本发明还提供一种酶制剂，其由本文所述酶液制备得到。

本发明还提供本发明所述酶液或酶制剂在油脂脱胶中的应用。

本发明还提供一种制备用于异源基因表达的毕赤酵母菌株的方法，所述方法包括：

(1)对毕赤酵母进行化学诱变，在缺乏营养的培养基中培养化学诱变得到的毕赤酵母，以消耗胞内储存的营养素，接着在缺乏组氨酸的培养基，筛选获得组氨酸营养缺陷型突变体；

(2)在步骤(1)获得的突变体中转入表达异源基因的表达载体，培养转入了所述表达载体的转化子，并筛选得到相对而言异源基因表达量较高或其表达产物活性较高、且转入的用于表达所述异源基因的核酸序列未发生突变的突变体；

(3)对步骤(2)获得的突变体实施物理诱变，培养并筛选得到相对而言异源基因表达量较高或其表达产物活性较高、且转入的用于表达所述异源基因的核酸序列未发生突变的突变体；和

(4)将步骤(3)获得的突变体中先前转入的外源基因敲除，筛选获得敲除了外源基因的突变体；

从而制备得到所述用于异源基因表达的毕赤酵母菌株。

在一个或多个实施方案中，所述异源基因编码磷脂酶C。

附图说明

图1：摇瓶发酵PLC蛋白电泳图。泳道1：H8-PLC；泳道2：H7-PLC；泳道3：SMD1168-PLC；M：分子量标记。

图2：pNPPC法测PLC比酶活。

图3：摇瓶所得PLC酶液脱胶试验。

图4：PAGE分析摇瓶培养物的蛋白情况。泳道1-2：H8-DSMPLC；泳道 2-4：SMD1168-DSMPLC

图5：更换PLC基因验证H8菌株对PLC比活力提高的效果。

具体实施方式

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成优选的技术方案。

本发明通过对毕赤酵母进行诱变，然后筛选出组氨酸营养缺陷型突变体，从而制备得到用于外源基因表达的毕赤酵母菌株。诱变可以是物理诱变或化学诱变。物理诱变包括紫外诱变，如将毕赤酵母菌株置于紫外光下一段时间，例如60～120秒。化学诱变包括使毕赤酵母菌株与化学诱变剂如亚硝基胍接触一段时间，例如15～60分钟。利用不含组氨酸的培养基培养经诱变的毕赤酵母菌株，培养一段时间后，给予抗生素如制霉菌素，杀死能在不含组氨酸的培养基中正常生长的毕赤酵母菌株，从而获得本文的组氨酸营养缺陷型毕赤酵母。这种诱变在基因组内随机发生。

在某些实施方案中，组氨酸营养缺陷型突变体的获得方法参考US4875231 中实施例1进行。具体而言，所述方法包括：

(1)对毕赤酵母进行化学诱变；

(2)在缺乏营养的培养基中培养化学诱变得到的毕赤酵母，以消耗胞内储存的营养素；

(3)在缺乏组氨酸的培养基中培养步骤(2)获得的毕赤酵母；和

(4)在步骤(3)的培养物中加入制霉菌素，杀死正常繁殖的毕赤酵母，从而获得组氨酸营养缺陷型突变体。

在这些实施方案中，可使用亚硝基胍作为化学诱变剂，其加入量通常使得终浓度在每毫升毕赤酵母培养物300～1000μg化学诱变剂的范围内，如300～600μg/mL。缺乏营养的培养基可以是添加了1～3wt％的葡萄糖和3～10μg的生物素的基本(MM)培养基。缺乏组氨酸的培养基可以基本培养基为基础，添加有1～3wt％的葡萄糖以及不含组氨酸的氨基酸混合液。

在某些实施方案中，诱变后，通常可先在YPD培养基中培养经诱变的菌株数天，例如1～5天，然后再在缺乏营养的培养基中预培养。培养18～32h 小时后，将菌液转移至缺乏组氨酸的培养基中培养。培养数日后，加入制霉菌素，杀死正常繁殖的毕赤酵母，从而获得组氨酸营养缺陷型突变体。

在某些实施方案中，本发明以保藏编号为CICC32806的毕赤酵母为初始菌株进行诱变。因此，在这些实施方案中，所述组氨酸营养缺陷型突变体是保藏编号为CICC32806的毕赤酵母经诱变和组氨酸营养缺陷型筛选后获得的菌株。

在本发明的某些实施方案中，经诱变和组氨酸营养缺陷型筛选后获得的菌株，转入了表达PLC的表达载体，并筛选得到磷脂平板上培养时水解圈较大、且转入的用于表达PLC的核酸序列(如AOX启动子、信号肽、PLC基因、转录终止子等)未发生突变的突变子A。

在进一步的实施方案中，可对该突变子A实施进一步的物理诱变，如紫外照射，筛选出磷脂平板培养中水解圈较大、且转入该用于表达PLC的核酸序列(如AOX启动子、信号肽、PLC基因、转录终止子等)未发生突变的突变子B。

可利用常规的技术敲除该突变子B中所先前转入的外源基因，包括PLC 基因和标记基因如His基因。例如，构建AOX-His基因片段，电转突变子B，在含组氨酸的磷脂酶筛选平板上培养，挑选出没有水解圈的转化子分别在不含组氨酸和含有组氨酸的平板上划线，选择表型正确(在含有组氨酸的平板上生长，而在不含组氨酸的平板上不生长)的转化子，可获得本发明的菌株C。应理解的是，在构建此菌株过程中所获得的各种突变子，如前文所述的突变子也包括在本发明的保护范围之内。

本发明的菌株C与商品菌株相比存在近2000个基因突变位点，其中pep4 基因缺失593个碱基。该菌株已于2017年12月4日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC，北京市朝阳区北辰西路1号院3号，100101)，分类命名为巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)，保藏编号为CGMCC NO.15017。

本发明的组氨酸营养缺陷型毕赤酵母，尤其是菌株C，可作为基础菌株，用做构建表达异源基因的宿主菌株。本文中，异源基因指从外部转入宿主菌株的基因，不论该基因是来自其它物种还是本身存在于该宿主基因组中。异源基因可以是编码任何感兴趣蛋白的基因。所述感兴趣蛋白包括但不限于工业、饲料或食品等领域中用到的各种蛋白，包括但不限于各种脂肪酶、蛋白酶、纤维素酶、淀粉酶、植酸酶、酯酶、果胶酶、半乳糖苷酶和磷脂酶。尤其是，在某些实施方案中，可利用本文所述的组氨酸营养缺陷型毕赤酵母构建表达外源磷脂酶C的菌株。在某些实施方案中，所述磷脂酶C的氨基酸序列如SEQ ID NO:2 或7所示，优选地，其编码序列如SEQ ID NO:1或6所示。或者，在某些实施方案中，可用本发明的菌株表达其氨基酸序列与SEQ ID NO:2或7相比具有一个或多个(例如10个以内)氨基酸残基突变的磷脂酶C，包括氨基酸残基的取代、插入或缺失。

本发明发现，利用本文所述的组氨酸营养缺陷型毕赤酵母构建得到的表达外源磷脂酶C的菌株，其发酵产生的酶液的比酶活明显高于利用转入了相同表达载体的现有毕赤酵母如SMD1168发酵产生的酶液的比酶活。

可利用本领域常规的用于在毕赤酵母中表达异源基因的骨架载体构建适用于本发明的表达载体，用于转化本文所述的组氨酸营养缺陷型毕赤酵母。这类骨架载体包括但不限于pPIC3、pPIC9、pPIC9k、pHIL-D1、pAO804、pAO815 和pPSC3K等。典型的毕赤酵母表达载体包含醇氧化酶-1(AOX1)基因的启动子和转录终止子(5'AOX1和AOXTT)，它们被多克隆位点(MCS)分开，外源基因可以在此插入。这类载体还可包含组氨醇脱氢酶基因(HIS4)选择标记及3'AOX1区。当将这类载体转化毕赤酵母时，载体的5'AOX1、AOXTT、 3'AOX1以及HIS4能单独或一起与染色体上的同源基因重组，从而使整个载体连同待表达的外源基因插入到受体菌染色体上，外源基因在5'AOX1启动子控制下表达。本领域研究者熟知的，AOX1启动子可被替代，包括但不限于诱导型、组成型启动子。

载体的构建方法为本领域所熟知。例如，PCR扩增获得目的基因后，对 PCR产物以及骨架载体进行相应的限制性内切酶酶切，利用DNA连接酶将 PCR产物的酶切片段与载体的酶切片段连接，将连接物转入大肠杆菌中，在合适的培养基中培养后，利用市售的质粒提取试剂盒提取获得用于转化本文所述组氨酸营养缺陷型毕赤酵母的质粒。

毕赤酵母的转化方法也为本领域所熟知。例如，用限制性内切酶酶切构建得到的表达载体，获得线性化的载体。然后，可按照标准的转化方法(Shixuan Wu&Geoffrey JLetchworth，2004)，电击转化毕赤酵母的感受态细胞，然后涂布到合适的平板(如MDS筛选平板)上培养数日。之后再挑取转化子至合适的平板上，根据其所表达的外源蛋白的生物学活性来挑选所需的重组菌株。例如，在某些实施方案中，所述外源蛋白是磷脂酶(如磷脂酶C)，则将在磷脂平板上培养转化子。通常，磷脂平板含有1～3％YNB、1～3％磷脂和1～3 ％琼脂。由于磷脂酶能水解磷脂，因此，可依据水解圈的大小确定转化子表达的磷脂酶的活性。挑取水解圈相对较大的转化子，即可获得性能优异的组氨酸营养缺陷型毕赤酵母。

因此，在某些实施方案中，本发明还包括包含待表达的异源基因的组氨酸营养缺陷型毕赤酵母。该异源基因通常整合到该毕赤酵母的基因组中。含有该外源基因的组氨酸营养缺陷型毕赤酵母能稳定地表达所述外源基因。在某些实施方案中，所述外源基因是磷脂酶的编码序列。在某些实施方案中，所述外源基因是磷脂酶C的编码序列。在某些实施方案中，所述组氨酸营养缺陷型毕赤酵母转入了利用pPIC9构建的含外源基因的表达载体。在某些实施方案中，利用pPIC9构建的含外源基因的表达载体含有SEQ ID NO:1或6所示的核苷酸序列。

可采用本领域常规的培养基和方法培养本文的组氨酸营养缺陷型毕赤酵母。例如，培养基可以是常规的BMGY培养基。可在28～32℃、180～300rpm 条件下培养。诱导外源基因表达时，可在培养液中加入一定量的甲醇，用于诱导表达。诱导表达结束后，离心发酵液，过滤上清液，即可获得含有外源基因表达的目的蛋白的发酵液。可采用常规的方法进一步浓缩该发酵液。

在某些实施方案中，发酵时，上罐初始培养基可以是基础发酵培养基，其含有硫酸钙、磷酸二氢钾、无水硫酸镁、硫酸铵、乳化硅油消泡剂和甘油，并添加有PTM，即五水硫酸铜、碘化钠、一水硫酸锰、二水钼酸钠、六水氯化钴、五水氯化锌、七水硫酸亚铁、硼酸、浓硫酸和生物素。基础发酵培养基中的成分浓度或含量为本领域所熟知。例如，硫酸钙的浓度可以是0.5～1.5g/L，磷酸二氢钾的浓度可以是30～40g/L，无水硫酸镁的浓度可以是10～13g/L，硫酸铵的浓度可以是6～12g/L，乳化硅油消泡剂的浓度可以是0.1～0.5ml/L，甘油的浓度可以是30～70g/L。PTM中，五水硫酸铜的浓度可以是5～6.5g/L，碘化钠的浓度可以是60～100mg/L，一水硫酸锰的浓度可以是2.0～4.0g/L，二水钼酸钠的浓度可以是0.2～0.4g/L，六水氯化钴的浓度可以是0.4～0.6g/L，五水氯化锌的浓度可以是18～22g/L，七水硫酸亚铁的浓度可以是60～70g/L，硼酸的浓度可以是0.01～0.03g/L，浓硫酸的浓度可以是19.0～19.5ml/L，生物素的浓度可以是0.3～0.5g/L。

菌体生长阶段流加甘油、PTM、消泡剂和氨水。当发酵至一定阶段时，例如菌体生长湿重达200～220g/L时，停止甘油补料并经过一段时间的饥饿期后，加入甲醇发酵。加入甲醇发酵诱导外源基因表达可根据需要，调控发酵过程的 pH、温度、溶氧和甲醇流加速率等参数。本领域研究者熟知的，毕赤酵母还可以使用组成型启动子，如GAP启动子，TEF启动子等，使用相应的启动子并使用对应的发酵条件。

可对发酵液进行离心处理或板框过滤处理去除菌体，上清进行微滤、超滤处理，并使用缓冲液置换并浓缩。进一步的，可加入适当的保护剂待完全溶解后作为酶制剂置于4℃保存。

因此，本申请也提供一种含有磷脂酶C的酶液与酶制剂。酶液可以是所述发酵液，或者是发酵所得细胞的裂解液。发酵液可适当浓缩。酶制剂可获自所述酶液。在某些实施方案中，该酶液和酶制剂还可含有甘油和防腐剂。防腐剂可以是常规的防腐剂，如山梨酸钾。甘油和防腐剂的量可为本领域的常规用量。例如，可加入占该酶液重量40－70％的甘油和0.1－0.8％的山梨酸钾。

本文所述的酶液或酶制剂可用于油脂脱胶。脱胶可采用常规的方法实施，包括将待脱胶油脂与本文所述的发酵液或酶制剂接触的步骤。例如，取毛油加热至一定的温度(如50±5℃)，加入一定量的纯水和酶液，高速剪切(如 10000r/min)，然后在一定温度下搅拌(如750r/min)，反应1～5小时。最后可将反应混合物升温至80－90℃并维持一段时间，将酶灭活，离心即可获得脱胶油。

因此，本申请还提供一种脱胶方法，该方法包括将待脱胶油脂与本文所述的酶液或酶制剂接触的步骤；以及本文所述的酶液或酶制剂在油脂脱胶中的应用。

下文将以具体实施例的方式阐述本发明。应理解，这些实施例仅仅是阐述性的，并非限制本发明的保护范围。实施例中所用到的方法和材料，除非另有说明，否则均为本领域常规的方法和材料。

实施例1：组氨酸缺陷型毕赤酵母32806-H7菌株的获得

将CICC-32806菌种接种至100mL的YPD(2％蛋白胨，1％酵母粉，1％甘油)培养基中，30℃培养过夜，取40mL 2000rpm离心5min，收集菌体；用 40mL柠檬酸缓冲液(0.1M，pH5.5)洗两次，重悬至36mL水中，加4mL亚硝基胍(5mg/L，终浓度500μg/mL)，室温静置30min；离心收集后用40mL 水清洗两次，用100mL YPD培养基重悬，30℃培养2天；取40mL菌液离心，用水洗两次后加40mL MM培养基(1％葡萄糖、5μg生物素)，30℃培养1 天；取5mL菌液至100mL缺陷型培养基中(MM培养基、1％葡萄糖、缺少组氨酸的氨基酸混合液)，30℃培养2天；加1mL制霉菌素(终浓度25U/mL)， 30℃静置90min；取40mL菌液离心，用水清洗两次，稀释至合适浓度(100-150 个菌落/板)涂布在平板上(MM培养基、1％葡萄糖、5μg生物素、组氨酸)，挑取表型正确的菌株，获得组氨酸缺陷型毕赤酵母32806-H7菌株。该32806-H7 菌株在相同培养条件下，生物量是商品菌株GS115的85-95％。

实施例2：产磷脂酶菌株H7-PLC的构建

经过优化并经生工生物工程(上海)股份有限公司合成的PLC核苷酸序列为：

ATGAGATTTCCTTCAATTTTTACTGCAGTTTTATTCGCAGCATCCTCCGCATTAGCTGCTCCAGTCAACACTACAACAGAAGATGAAACGGCACAAATTCCGGCTGAAGCTGTCATCGGTTACTCAGATTTAGAAGGGGATTTCGATGTTGCTGTTTTGCCATTTTCCAACAGCACAAATAACGGGTTATTGTTTATAAATACTACTATTGCCAGCATTGCTGCTAAAGAAGAAGGGGTATCTCTTGAGAAAAGAGAGGCTGAAGCTTGGTCAGCTGAGGACAAGCATAAGGAAGGTGTGAATAGTCACTTATGGATCGTGAACCGTGCCATTGATATAATGTCTAGGAATACAACTCTGGTTAAGCAAGATAGAGTTGCTCAATTGAATGAATGGCGTACAGAGCTAGAGAATGGCATCTACGCTGCTGATTATGAAAACCCCTATTACGATAACAGTACCTTCGCTTCTCACTTTTACGATCCAGACAACGGAAAGACATATATCCCATTCGCCAAGCAAGCTAAGGAGACTGGAGCTAAGTACTTCAAGTTGGCTGGAGAGTCATACAAGAATAAAGACATGAAGCAGGCCTTCTTTTATCTTGGGTTGTCATTGCATTATTTGGGCGATGTCAACCAACCTATGCATGCCGCAAACTTTACGAACCTGTCCTATCCACAGGGTTTTCACTCCAAGTACGAGAACTTTGTCGATACTATTAAAGACAACTACAAAGTTACCGATGGGAACGGATATTGGAATTGGAAAGGCACCAACCCTGAAGAATGGATTCACGGTGCAGCAGTAGTTGCAAAACAGGACTACTCTGGAATTGTCAATGACAATACCAAAGATTGGTTTGTGAAAGCCGCAGTCTCCCAGGAATATGCAGATAAATGGAGAGCTGAAGTTACACCTATGACTGGTAAACGACTAATGGATGCCCAAAGAGTTACTGCTGGTTACATTCAATTA TGGTTCGACACTTACGGTGACAGGTAA(SEQ ID NO:1)

该PLC的氨基酸序列为：

MRFPSIFTAVLFAASSALAAPVNTTTEDETAQIPAEAVIGYSDLEGDFDVAVLPFSNSTNNGLLFINTTIASIAAKEEGVSLEKREAEAWSAEDKHKEGVNSHLWIVNRAIDIMSRNTTLVKQDRVAQLNEWRTELENGIYAADYENPYYDNSTFASHFYDPDNGKTYIPFAKQAKETGAKYFKLAGESYKNKDMKQAFFYLGLSLHYLGDVNQPMHAANFTNLSYPQGFHSKYENFVDTIKDNYKVTDGNGYWNWKGTNPEEWIHGAAVVAKQDYSGIVNDNTKDWFVKAAVSQEYADKWRAEVTPMTGKRLMDAQRVTAGYIQLWFDTYGDR(SEQ ID NO:2)

使用引物PLC_F：TACGTATGGTCAGCTGAGGACAAGC(SEQ ID NO:3) 及PLC_R：CCTAGGTTACCTGTCACCGTAAGTGTCGAAC(SEQ ID NO:4)，扩增PLC的成熟肽部分，PCR使用Takara公司PrimeSTAR HS(DRR010A) DNA聚合酶进行，反应体系为：水33μl，5×PrimeSTAR缓冲液10μl，dNTP 混合物(各2.5mM)4μl，引物各1μl，质粒模板0.5μl，PrimeSTAR酶0.5μl。PCR反应程序为30个循环的98℃10秒，68℃1min。

PCR产物经Axygen公司PCR产物纯化试剂盒纯化(AP-PCR-50)，使用 NEB公司SnaB和AvrII限制性内切酶酶切，并再次经过Axygen公司PCR产物纯化试剂盒纯化。同时使用相同的限制性内切酶酶切pPIC9K质粒，酶切物同样进行纯化。使用Fermentas公司T4DNA连接酶，按照产品说明，将PCR 产物酶切片段和pPIC9k载体酶切片段进行连接，连接物热激法转入大肠杆菌 DH5α中，在含氨苄的LB平板上过夜培养。次日挑取单克隆在LB液体培养基中培养，使用Axygen公司质粒提取试剂盒提取质粒并送交上海生工测序。

将测序正确的重组表达载体用Bgl II限制性内切酶酶切线性化后，按照毕赤酵母的标准转化方法(Shixuan Wu&Geoffrey J Letchworth,2004)，电击转化毕赤酵母SMD1168、32806-H7感受态细胞，涂布到选择培养基MDS筛选平板，于28℃培养三天。挑取转化子至磷脂平板(1％YNB，2％磷脂，2％琼脂糖)上，30℃培养2天，挑取水解圈最大的转化子，得到H7-PLC和 SMD1168-PLC重组菌株。

实施例3：紫外诱变法获得H8-PLC菌株

挑取H7-PLC菌落至5mL YPD培养基中，于30℃，240rpm摇床震荡培养过夜，检测菌液OD600数值；吸取重量200OD的菌液，室温4000rpm离心后去除三清，使用无菌水洗涤细胞2次，最后重悬菌液浓度至20OD/mL，取 2mL菌液均匀分散在培养皿表层，置于超净工作台紫外灯下照射90s，取100μL 涂布于磷脂平板上，30℃培养箱避光培养(全过程在红光下操作，防止回复突变)4天。挑取水解圈较大的突变子，使用KOD-FX酶和毕赤酵母表达测序通用5’AOX及3’AOX引物，对该突变子菌落进行PCR扩增，按照该酶的使用说明进行PCR，PCR产物送上海生工进行测序，发现人为转入酵母中的核酸序列：AOX启动子、信号肽、PLC基因、转录终止子等都未发生突变，因此该突变子的改变为菌株自身基因组上的突变，该突变菌株命名为H8-PLC。

实施例4：H7-PLC、SMD1168-PLC和H8-PLC摇瓶发酵

根据实施例2和实施例3可知，H7-PLC、H8-PLC和SMD1168-PLC三个菌中所含PLC基因的氨基酸序列完全一样。接种这三个菌至50mL的BMGY 培养基中，30℃，220rpm培养过夜，取200OD菌体离心收集。用无菌水重悬洗涤菌体2次，然后用BMMY培养基重悬菌体。向BMMY培养基中添加 2％的甲醇，30℃，240rpm诱导表达。每隔12h向50mL培养基中补加0.5mL 甲醇。诱导3天后，8000rpm、4℃离心发酵液，使用0.22um滤膜过滤处理上清液，将等量上清液使用Milipore 10Kda超滤浓缩罐浓缩到相同体积后，取相同体积的浓缩酶液进行聚丙烯酰胺凝胶电泳分析。

电泳结果如图1所示，3个泳道都有明显的目标条带，位于35-40KDa条带之间。1号泳道的目标蛋白含量与2号泳道的基础菌株较少。

实施例5：pNPPC法检测H7-PLC、SMD1168-PLC和H8-PLC的比酶活

脂肪酶酶活单位的定义：在温度为37℃，pH值7.6的条件下，1min催化底物释放出1μmol磷酸胆碱的酶量为1个磷脂酶活力单位(U)。

测定试剂：对硝基苯酚(pNP)标准溶液配制：称取0.01391g PNP，溶于 100mL蒸馏水中配成1mM工作液；硼酸缓冲液：称取6.183g硼酸溶于1L水中，用0.5N的氢氧化钠调节其pH为7.6，即得到0.1M硼酸-硼酸钠缓冲液；CaCl₂溶液：称取111g CaCl₂溶于1L水中即得1M的CaCl₂溶液；氢氧化钠溶液：称取20g氢氧化钠溶于1L水中，即得到0.5N的氢氧化钠溶液；反应缓冲液的配制：0.1M硼酸-硼酸钠缓冲液(pH7.6)，20mM pNPPC，1％Triton-X-100， 1mMCaCl₂。

测定方法：取两支干净的试管，其中一个做样品管，一个做空白对照管。每个试管中加入600μL反应缓冲液，样品管加入25μl、200μg/ml的待测酶液，空白管不加，两管同时放在37℃恒温水浴锅中反应15min，立即加入500μL、 0.5M的氢氧化钠溶液终止反应，空白管加入25μL待测酶液，405nm测定吸光度，用空白管校正零点。

测得的数据用Origin 8.0处理，结果如图2所示。结果显示，H8-PLC的比酶活均值2.5U/mg，显著高于H7-PLC和SMD1168-PLC(p<0.01)约1.0U/mg。

实施例6：H7-PLC、SMD1168-PLC和H8-PLC脱胶试验

将H7-PLC、SMD1168-PLC和H8-PLC的酶液均稀释至200ppm和100ppm 两个浓度。

自制样取大豆毛油(美国)各50g，加热至50℃；分别加入0.5mL纯水、 1mL PLC样品，高速剪切(10000r/min)1min。在一定温度下搅拌(750r/min) 反应2小时取样。升温至85℃维持5min。12000rpm离心10min，收集上层油样，气相色谱分析DG含量。

测得的数据用Origin 8.0处理，结果如图3所示。结果显示，在等蛋白添加量(100ppm和200ppm)时H8-PLC的比酶活显著高于H7-PLC和 SMD1168-PLC的比酶活。

实施例7：SMD1168-PLC和H8-PLC的发酵性能比较

将上述菌株进行发酵罐发酵测试并与商品生产菌株SMD1168比较。用 100ml种子培养基YPD将菌种培养18h至OD约15，接入NBS 7.5L发酵罐。上罐初始培养基为3L基础发酵培养基(硫酸钙0.9g/L，磷酸二氢钾33.37g/L，无水硫酸镁11.67g/L，硫酸铵9g/L，乳化硅油消泡剂0.3ml/L，甘油50g/L)+ PTM(五水硫酸铜5.99g/L，碘化钠80mg/L，一水硫酸锰3.0g/L，二水钼酸钠 0.3g/L，六水氯化钴0.5g/L，五水氯化锌20.04g/L，七水硫酸亚铁65.05g/L，硼酸0.02g/L，浓硫酸19.2ml/L，生物素0.4g/L)，菌体生长阶段使用补充培养基流加(80％(W/W)甘油+12ml/L PTM；消泡剂30％；氨水；PTM：灭菌，接种前打入发酵罐)。菌体生长到湿重200-220g/L，停止甘油补料并经过1h 饥饿期后，控制在28℃、pH5.8下进行甲醇补料发酵发酵137h。

发酵液在8000rpm离心10min后，上清进行微滤、超滤处理，并使用20mM 醋酸钠缓冲液(pH5.5)置换并浓缩至120ml左右。分别加入成品总重量的50％甘油、0.3％山梨酸钾，待完全溶解后置于4℃保存。

使用上海生工蛋白含量检测试剂盒检测所得成品的蛋白含量、酶活和比酶活，结果如下表1所示。比酶活的检测参照实施例5进行。

表1：成品指标

成品	蛋白(g/L)	酶活(U/ml)	比酶活(U/mg)
				SMD1168‐PLC	8.39	6.66	0.79
H8‐PLC	4.91	21.67	‐4.41

由上表可以看出，放大培养后，H8对PLC的提高效果比摇瓶水平更加显著。可以经过发酵工艺优化，获得更佳的效果。

所得酶液进行毛油脱胶检测。将酶液稀释一定倍数；取数份大豆毛油(美国)各50g，加热至50℃(DSM酶55℃)；分别加入0.5ml纯水、1ml PLC 样品；经高速剪切(10000r/min)1min；然后在一定温度下搅拌(750r/min) 反应2小时取样；升温至85℃维持5min；12000rpm离心10min，收集上层油样，待分析。

表2：脱胶结果

将DSM商品酶对照(商品菌株SMD1168表达的PLC)、自主酶(自主菌株H8表达的PLC)分别进行两个梯度进行脱胶，从脱胶结果看(表2)，随着200ppm到100ppm用量减少，对照的脱胶能力下降最快， DSM商品酶次之，自主PLC下降最缓，在以相同蛋白量的情况下进行200ppm 用量脱胶，自主PLC的脱胶性能要远远优于对照PLC和DSM商品酶，而对照PLC略优于DSM商品酶，在以相同蛋白量的情况下进行100ppm用量脱胶，自主PLC的脱胶性仍要远远优于对照PLC和DSM商品酶，而对照PLC则开始劣于DSM商品酶，甚至自主PLC在58ppm下脱胶能力仍要略优于对照PLC 和DSM商品酶。

实施例8：H8-PLC菌株中PLC基因和His4基因的敲除

用于敲除PLC基因的核苷酸序列(AOX-His4)如下所示：

CTCGAGATTCAGGTGAACCCACCTAACTATTTTTAACTGGGATCCAGTGAGCTCGCTGGGTGAAAGCCAACCATCTTTTGTTTCGGGGAACCGTGCTCGCCCCGTAAAGTTAATTTTTTTTTCCCGCGCAGCTTTAATCTTTCGGCAGAGAAGGCGTTTTCATCGTAGCGTGGGAACAGAATAATCAGTTCATGTGCTATACAGGCACATGGCAGCAGTCACTATTTTGCTTTTTAACCTTAAAGTCGTTCATCAATCATTAACTGACCAATCAGATTTTTTGCATTTGCCACTTATCTAAAAATACTTTTGTATCTCGCAGATACGTTCAGTGGTTTCCAGGACAACACCCAAAAAAAGGTATCAATGCCACTAGGCAGTCGGTTTTATTTTTGGTCACCCACGCAAAGAAGCACCCACCTCTTTTAGGTTTTAAGTTGTGGGAACAGTAACACCGCCTAGAGCTTCAGGAAAAACCAGTACCTGTGACCGCAATTCACCATGATGCAGAATGTTAATTTAAACGAGTGCCAAATCAAGATTTCAACAGACAAATCAATCGATCCATAGTTACCCATTCCAGCCTTTTCGTCGTCGAGCCTGCTTCATTCCTGCCTCAGGTGCATAACTTTGCATGAAAAGTCCAGATTAGGGCAGATTTTGAGTTTAAAATAGGAAATATAAACAAATATACCGCGAAAAAGGTTTGTTTATAGCTTTTCGCCTGGTGCCGTACGGTATAAATACATACTCTCCTCCCCCCCCTGGTTCTCTTTTTCTTTTGTTACTTACATTTTACCGTTCCGTCACTCGCTTCACTCAACAACAAAATAAACTAGTGGTACCGTCAGCCACCAAAGTAGTGAATAGACCATCGGGGCGGTCAGTAGTCAAAGACGCCAACAAAATTTCACTGACAGGGAACTTTTTGACATCTTCAGAAAGTTCGTATTCAGTAGTCAATTGCCGAGCATCAATAATGGGGATTATACCAGAAGCAACAGTGGAAGTCACATCTACCAACTTTGCGGTCTCAGAAAAAGCATAAACAGTTCTACTACCGCCATTAGTGAAACTTTTCAAATCGCCCAGTGGAGAAGAAAAAGGCACAGCGATACTAGCATTAGCGGGCAAGGATGCAACTTTATCAACCAGGGTCCTATAGATAACCCTAGCGCCTGGGATCATCCTTTGGACAACTCTTTCTGCCAAATCTAGGTCCAAAATCACTTCATTGATACCATTATTGTACAACTTGAGCAAGTTGTCGATCAGCTCCTCAAATTGGTCCTCTGTAACGGATGACTCAACTTGCACATTAACTTGAAGCTCAGTCGATTGAGTGAACTTGATCAGGTTGTGCAGCTGGTCAGCAGCATAGGGAAACACGGCTTTTCCTACCAAACTCAAGGAATTATCAAACTCTGCAACACTTGCGTATGCAGGTAGCAAGGGAAATGTCATACTTGAAGTCGGACAGTGAGTGTAGTCTTGAGAAATTCTGAAGCCGTATTTTTATTATCAGTGAGTCAGTCATCAGGAGATCCTCTACGCCGGACGCATCGTGGCCGGCATCACCGGCGCCACAGGTGCGGTTGCTGGCGCCTATATCGCCGACATCACCGATGGGGAAGATCGGGCTCGCCACTTCGGGCTCATGAGCGCTTGTTTCGGCGTGGGTATGGTGGCAGGCCCCGTGGCCGGGGGACTGTTGGGCGCCATCTCCTTGCATGCACCATTCCTTGCGGCGGCGGTGCTCAACGGCCTCAACCTACTACTGGGCTGCTTCCTAATGCAGGAGTCGCATAAGGGAATTC(SEQ ID NO:5)。

PCR法扩增出AOX-His基因片段，电击转化H8-PLC菌株，涂布在含有组氨酸(20ug/mL)的磷脂酶筛选平板上。挑选出没有水解圈的转化子分别在不含组氨酸和含有组氨酸的平板上划线，选择表型正确(在含有组氨酸的平板上生长，而在不含组氨酸的平板上不生长)的转化子，命名为H8。经测序分析，H8菌株与商品菌株存在近2000个基因突变位点，其中非同义SNV 176 处，终止子变化相关7处。存在插入/缺失830处，其中引起读码框变化的有82处，最多的为pep4基因缺失593个碱基。

该H8菌株已于2017年12月4日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC，北京市朝阳区北辰西路1号院3号，100101)，保藏编号为CGMCC NO.15017。

实施例9：以DSMPLC基因为报告基因评估H8菌株

通过另一个PLC序列来评估H8菌株对PLC表达的增强作用，所用 DSMPLC核苷酸序列为：

AAGCTTGGTCTGCTGAAGATAAGCACAACGAAGGTATCAACTCTCATCTGTGGATTGTCAACAGAGCTATTGACATCATGTCCCGTAACACTACCATTGTCAATCCTAACGAGACTGCCTTGCTGAACGAGTGGAGAGCTGACTTGGAGAATGGTATCTACTCCGCTGACTACGAGAACCCATATTACGACGATTCTACCTATGCATCTCACTTCTACGACCCTGATACTGGTACTACCTACATTCCATTTGCTAAGCATGCCAAGGAGACTGGAGCTAAGTACTTCAACTTGGCTGGTCAGGCTTACCAGAACCAAGACATGCAGCAAGCCTTCTTCTACCTTGGATTGTCCCTTCACTACTTGGGTGATGTCAATCAACCAATGCATGCAGCCTCCTTTACCGACTTGTCCTACCCAATGGGTTTCCATTCTAAGTACGAGAACTTCGTTGACACTATCAAGAATAACTACATTGTTTCTGATTCCAATGGTTACTGGAACTGGAAAGGTGCTAACCCTGAAGATTGGATCGAAGGAGCCGCTGTTGCTGCCAAGCAAGACTATCCAGGAGTCGTTAACGACACCACTAAGGATTGGTTCGTCAAAGCTGCCGTGTCTCAAGAGTATGCTGACAAGTGGAGAGCTGAGGTTACTCCAGTTACTGGTAAGAGACTTATGGAAGCTCAACGTGTTACCGCAGGATACATTCACTTGTGGTTCGACACTTACGTCA ACAGATAA(SEQ ID NO:6)；

DSMPLC氨基酸序列为：

WSAEDKHNEGINSHLWIVNRAIDIMSRNTTIVNPNETALLNEWRADLENGIYSADYENPYYDDSTYASHFYDPDTGTTYIPFAKHAKETGAKYFNLAGQAYQNQDMQQAFFYLGLSLHYLGDVNQPMHAASFTDLSYPMGFHSKYENFVDTIKNNYIVSDSNGYWNWKGANPEDWIEGAAVAAKQDYPGVVNDTTKDWFVKAAVSQEYADKWRAEVTPVTGKRLMEAQRVTAGYIHLWFDTYVNR (SEQ ID NO:7)。

根据DSMPLC基因序列设计引物，构建pPIC9K-DSMPLC表达载体，经限制性内切酶BglII线性化后分别电击转化H8和SMD1168菌株，经磷脂酶平板筛选后选择水解圈最大的转化子进行摇瓶发酵。发酵液经超滤浓缩后取用相同体积的浓缩酶液进行聚丙烯酰胺凝胶电泳分析。结果如图4所示：H8-DSMPLC和SMD1168-DSMPLC均有明显的目的条带，位于35-40KDa之间，且H8-DSMPLC的表达量低于SMD1168-DSMPLC。

用pNPPC法进行比酶活测定。结果如图5所示：H8菌株表达DSMPLC 的比酶活高于SMD1168。

序列表

<110> 丰益（上海）生物技术研发中心有限公司

<120> 外源基因表达用毕赤酵母菌株

<130> 178076

<160> 7

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1005

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atgagatttc cttcaatttt tactgcagtt ttattcgcag catcctccgc attagctgct 60

ccagtcaaca ctacaacaga agatgaaacg gcacaaattc cggctgaagc tgtcatcggt 120

tactcagatt tagaagggga tttcgatgtt gctgttttgc cattttccaa cagcacaaat 180

aacgggttat tgtttataaa tactactatt gccagcattg ctgctaaaga agaaggggta 240

tctcttgaga aaagagaggc tgaagcttgg tcagctgagg acaagcataa ggaaggtgtg 300

aatagtcact tatggatcgt gaaccgtgcc attgatataa tgtctaggaa tacaactctg 360

gttaagcaag atagagttgc tcaattgaat gaatggcgta cagagctaga gaatggcatc 420

tacgctgctg attatgaaaa cccctattac gataacagta ccttcgcttc tcacttttac 480

gatccagaca acggaaagac atatatccca ttcgccaagc aagctaagga gactggagct 540

aagtacttca agttggctgg agagtcatac aagaataaag acatgaagca ggccttcttt 600

tatcttgggt tgtcattgca ttatttgggc gatgtcaacc aacctatgca tgccgcaaac 660

tttacgaacc tgtcctatcc acagggtttt cactccaagt acgagaactt tgtcgatact 720

attaaagaca actacaaagt taccgatggg aacggatatt ggaattggaa aggcaccaac 780

cctgaagaat ggattcacgg tgcagcagta gttgcaaaac aggactactc tggaattgtc 840

aatgacaata ccaaagattg gtttgtgaaa gccgcagtct cccaggaata tgcagataaa 900

tggagagctg aagttacacc tatgactggt aaacgactaa tggatgccca aagagttact 960

gctggttaca ttcaattatg gttcgacact tacggtgaca ggtaa 1005

<210> 2

<211> 334

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Met Arg Phe Pro Ser Ile Phe Thr Ala Val Leu Phe Ala Ala Ser Ser

1 5 10 15

Ala Leu Ala Ala Pro Val Asn Thr Thr Thr Glu Asp Glu Thr Ala Gln

20 25 30

Ile Pro Ala Glu Ala Val Ile Gly Tyr Ser Asp Leu Glu Gly Asp Phe

35 40 45

Asp Val Ala Val Leu Pro Phe Ser Asn Ser Thr Asn Asn Gly Leu Leu

50 55 60

Phe Ile Asn Thr Thr Ile Ala Ser Ile Ala Ala Lys Glu Glu Gly Val

65 70 75 80

Ser Leu Glu Lys Arg Glu Ala Glu Ala Trp Ser Ala Glu Asp Lys His

85 90 95

Lys Glu Gly Val Asn Ser His Leu Trp Ile Val Asn Arg Ala Ile Asp

100 105 110

Ile Met Ser Arg Asn Thr Thr Leu Val Lys Gln Asp Arg Val Ala Gln

115 120 125

Leu Asn Glu Trp Arg Thr Glu Leu Glu Asn Gly Ile Tyr Ala Ala Asp

130 135 140

Tyr Glu Asn Pro Tyr Tyr Asp Asn Ser Thr Phe Ala Ser His Phe Tyr

145 150 155 160

Asp Pro Asp Asn Gly Lys Thr Tyr Ile Pro Phe Ala Lys Gln Ala Lys

165 170 175

Glu Thr Gly Ala Lys Tyr Phe Lys Leu Ala Gly Glu Ser Tyr Lys Asn

180 185 190

Lys Asp Met Lys Gln Ala Phe Phe Tyr Leu Gly Leu Ser Leu His Tyr

195 200 205

Leu Gly Asp Val Asn Gln Pro Met His Ala Ala Asn Phe Thr Asn Leu

210 215 220

Ser Tyr Pro Gln Gly Phe His Ser Lys Tyr Glu Asn Phe Val Asp Thr

225 230 235 240

Ile Lys Asp Asn Tyr Lys Val Thr Asp Gly Asn Gly Tyr Trp Asn Trp

245 250 255

Lys Gly Thr Asn Pro Glu Glu Trp Ile His Gly Ala Ala Val Val Ala

260 265 270

Lys Gln Asp Tyr Ser Gly Ile Val Asn Asp Asn Thr Lys Asp Trp Phe

275 280 285

Val Lys Ala Ala Val Ser Gln Glu Tyr Ala Asp Lys Trp Arg Ala Glu

290 295 300

Val Thr Pro Met Thr Gly Lys Arg Leu Met Asp Ala Gln Arg Val Thr

305 310 315 320

Ala Gly Tyr Ile Gln Leu Trp Phe Asp Thr Tyr Gly Asp Arg

325 330

<210> 3

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tacgtatggt cagctgagga caagc 25

<210> 4

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

cctaggttac ctgtcaccgt aagtgtcgaa c 31

<210> 5

<211> 1817

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ctcgagattc aggtgaaccc acctaactat ttttaactgg gatccagtga gctcgctggg 60

tgaaagccaa ccatcttttg tttcggggaa ccgtgctcgc cccgtaaagt taattttttt 120

ttcccgcgca gctttaatct ttcggcagag aaggcgtttt catcgtagcg tgggaacaga 180

ataatcagtt catgtgctat acaggcacat ggcagcagtc actattttgc tttttaacct 240

taaagtcgtt catcaatcat taactgacca atcagatttt ttgcatttgc cacttatcta 300

aaaatacttt tgtatctcgc agatacgttc agtggtttcc aggacaacac ccaaaaaaag 360

gtatcaatgc cactaggcag tcggttttat ttttggtcac ccacgcaaag aagcacccac 420

ctcttttagg ttttaagttg tgggaacagt aacaccgcct agagcttcag gaaaaaccag 480

tacctgtgac cgcaattcac catgatgcag aatgttaatt taaacgagtg ccaaatcaag 540

atttcaacag acaaatcaat cgatccatag ttacccattc cagccttttc gtcgtcgagc 600

ctgcttcatt cctgcctcag gtgcataact ttgcatgaaa agtccagatt agggcagatt 660

ttgagtttaa aataggaaat ataaacaaat ataccgcgaa aaaggtttgt ttatagcttt 720

tcgcctggtg ccgtacggta taaatacata ctctcctccc ccccctggtt ctctttttct 780

tttgttactt acattttacc gttccgtcac tcgcttcact caacaacaaa ataaactagt 840

ggtaccgtca gccaccaaag tagtgaatag accatcgggg cggtcagtag tcaaagacgc 900

caacaaaatt tcactgacag ggaacttttt gacatcttca gaaagttcgt attcagtagt 960

caattgccga gcatcaataa tggggattat accagaagca acagtggaag tcacatctac 1020

caactttgcg gtctcagaaa aagcataaac agttctacta ccgccattag tgaaactttt 1080

caaatcgccc agtggagaag aaaaaggcac agcgatacta gcattagcgg gcaaggatgc 1140

aactttatca accagggtcc tatagataac cctagcgcct gggatcatcc tttggacaac 1200

tctttctgcc aaatctaggt ccaaaatcac ttcattgata ccattattgt acaacttgag 1260

caagttgtcg atcagctcct caaattggtc ctctgtaacg gatgactcaa cttgcacatt 1320

aacttgaagc tcagtcgatt gagtgaactt gatcaggttg tgcagctggt cagcagcata 1380

gggaaacacg gcttttccta ccaaactcaa ggaattatca aactctgcaa cacttgcgta 1440

tgcaggtagc aagggaaatg tcatacttga agtcggacag tgagtgtagt cttgagaaat 1500

tctgaagccg tatttttatt atcagtgagt cagtcatcag gagatcctct acgccggacg 1560

catcgtggcc ggcatcaccg gcgccacagg tgcggttgct ggcgcctata tcgccgacat 1620

caccgatggg gaagatcggg ctcgccactt cgggctcatg agcgcttgtt tcggcgtggg 1680

tatggtggca ggccccgtgg ccgggggact gttgggcgcc atctccttgc atgcaccatt 1740

ccttgcggcg gcggtgctca acggcctcaa cctactactg ggctgcttcc taatgcagga 1800

gtcgcataag ggaattc 1817

<210> 6

<211> 743

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

aagcttggtc tgctgaagat aagcacaacg aaggtatcaa ctctcatctg tggattgtca 60

acagagctat tgacatcatg tcccgtaaca ctaccattgt caatcctaac gagactgcct 120

tgctgaacga gtggagagct gacttggaga atggtatcta ctccgctgac tacgagaacc 180

catattacga cgattctacc tatgcatctc acttctacga ccctgatact ggtactacct 240

acattccatt tgctaagcat gccaaggaga ctggagctaa gtacttcaac ttggctggtc 300

aggcttacca gaaccaagac atgcagcaag ccttcttcta ccttggattg tcccttcact 360

acttgggtga tgtcaatcaa ccaatgcatg cagcctcctt taccgacttg tcctacccaa 420

tgggtttcca ttctaagtac gagaacttcg ttgacactat caagaataac tacattgttt 480

ctgattccaa tggttactgg aactggaaag gtgctaaccc tgaagattgg atcgaaggag 540

ccgctgttgc tgccaagcaa gactatccag gagtcgttaa cgacaccact aaggattggt 600

tcgtcaaagc tgccgtgtct caagagtatg ctgacaagtg gagagctgag gttactccag 660

ttactggtaa gagacttatg gaagctcaac gtgttaccgc aggatacatt cacttgtggt 720

tcgacactta cgtcaacaga taa 743

<210> 7

<211> 245

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

Trp Ser Ala Glu Asp Lys His Asn Glu Gly Ile Asn Ser His Leu Trp

1 5 10 15

Ile Val Asn Arg Ala Ile Asp Ile Met Ser Arg Asn Thr Thr Ile Val

20 25 30

Asn Pro Asn Glu Thr Ala Leu Leu Asn Glu Trp Arg Ala Asp Leu Glu

35 40 45

Asn Gly Ile Tyr Ser Ala Asp Tyr Glu Asn Pro Tyr Tyr Asp Asp Ser

50 55 60

Thr Tyr Ala Ser His Phe Tyr Asp Pro Asp Thr Gly Thr Thr Tyr Ile

65 70 75 80

Pro Phe Ala Lys His Ala Lys Glu Thr Gly Ala Lys Tyr Phe Asn Leu

85 90 95

Ala Gly Gln Ala Tyr Gln Asn Gln Asp Met Gln Gln Ala Phe Phe Tyr

100 105 110

Leu Gly Leu Ser Leu His Tyr Leu Gly Asp Val Asn Gln Pro Met His

115 120 125

Ala Ala Ser Phe Thr Asp Leu Ser Tyr Pro Met Gly Phe His Ser Lys

130 135 140

Tyr Glu Asn Phe Val Asp Thr Ile Lys Asn Asn Tyr Ile Val Ser Asp

145 150 155 160

Ser Asn Gly Tyr Trp Asn Trp Lys Gly Ala Asn Pro Glu Asp Trp Ile

165 170 175

Glu Gly Ala Ala Val Ala Ala Lys Gln Asp Tyr Pro Gly Val Val Asn

180 185 190

Asp Thr Thr Lys Asp Trp Phe Val Lys Ala Ala Val Ser Gln Glu Tyr

195 200 205

Ala Asp Lys Trp Arg Ala Glu Val Thr Pro Val Thr Gly Lys Arg Leu

210 215 220

Met Glu Ala Gln Arg Val Thr Ala Gly Tyr Ile His Leu Trp Phe Asp

225 230 235 240

Thr Tyr Val Asn Arg

245

Claims (10)

1.保藏编号为CGMCC NO.15017的毕赤酵母菌株(Pichia pastoris)。

2.一种表达异源基因的毕赤酵母菌株，其特征在于，所述菌株为含有异源基因的保藏编号为CGMCC NO.15017的毕赤酵母菌株，优选地，所述菌株的基因组中整合了所述外源基因。

3.如权利要求2所述的毕赤酵母菌株，其特征在于，所述异源基因编码工业、饲料或食品领域中用到的蛋白；优选地，所述异源基因编码脂肪酶、蛋白酶、纤维素酶、淀粉酶、植酸酶、酯酶、果胶酶、半乳糖苷酶或磷脂酶。

4.如权利要求3所述的毕赤酵母菌株，其特征在于，所述异源基因为SEQ ID NO:2或7所示的磷脂酶C的编码序列，或为与SEQ ID NO:2或7所示的序列相比具有一个或多个氨基酸突变的磷脂酶C序列的编码序列；优选地，所述异源基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1或6所示。

5.一种细胞培养物，所述细胞培养物含有权利要求1－4中任一项所述的毕赤酵母菌株和任选的培养基；

优选地，所述培养基为种子培养基或发酵培养基；更优选地，所述培养基为YPD培养基或BMMY培养基。

6.一种酶液，所述酶液为权利要求2－4中任一项所述的毕赤酵母菌株的发酵液或为其细胞裂解液；优选地，所述异源基因编码磷脂酶C，所述发酵液含有磷脂酶C。

7.一种酶制剂，其由权利要求6所述的酶液制备得到。

8.权利要求4所述的毕赤酵母菌株、权利要求6所述的酶液或权利要求7所述的酶制剂在油脂脱胶中的应用。

9.一种制备用于异源基因表达的毕赤酵母菌株的方法，所述方法包括：

(1)对毕赤酵母进行化学诱变，在缺乏营养的培养基中培养化学诱变得到的毕赤酵母，接着在缺乏组氨酸的培养基中培养所述毕赤酵母，筛选获得组氨酸营养缺陷型突变体；

(2)在步骤(1)获得的突变体中转入表达异源基因的表达载体，培养转入了所述表达载体的转化子，并筛选得到相对而言异源基因表达量较高或其表达产物活性较高、且转入的用于表达所述异源基因的核酸序列未发生突变的突变体；

(3)对步骤(2)获得的突变体实施物理诱变，培养并筛选得到相对而言异源基因表达量较高或其表达产物活性较高、且转入的用于表达所述异源基因的核酸序列未发生突变的突变体；和

(4)将步骤(3)获得的突变体中先前转入的外源基因敲除，筛选获得敲除了外源基因的突变体；

从而制备得到所述用于异源基因表达的毕赤酵母菌株；

优选地，所述异源基因编码磷脂酶C。

10.一种脱胶方法，所述方法包括：在50±5℃，使用权利要求6所述的酶液或权利要求7所述的酶制剂作为脱胶介质与待脱胶油进行脱胶的步骤。