CN108640983A

CN108640983A - FvCPC2蛋白及其编码基因在调控多种食用菌菌丝生长和子实体发育中的应用

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Publication number: CN108640983A
Application number: CN201810473514.7A
Authority: CN
Inventors: 李少杰; 吴塔菊; 孙宪昀; 张振颖
Original assignee: Institute of Microbiology of CAS
Current assignee: Institute of Microbiology of CAS
Priority date: 2018-05-17
Filing date: 2018-05-17
Publication date: 2018-10-12
Anticipated expiration: 2038-05-17
Also published as: CN108640983B

Abstract

本发明公开了FvCPC2蛋白及其编码基因在调控多种食用菌菌丝生长和子实体发育中的应用。本发明通过对金针菇中Fvcpc2的过表达和敲低表达实验发现，Fvcpc2影响金针菇菌丝在平板和栽培料中的生长，同时决定着金针菇原基的形成及子实体的发育，可将Fvcpc2应用到金针菇优良菌种的选育中。同时，通过对粗糙脉孢菌的回补实验发现，Fvcpc2能够取代粗糙脉孢菌中cpc‑2菌丝生长和子实体发育的调控功能，这说明Fvcpc2在担子菌和子囊菌中不仅普遍存在，而且其对子实体发育的调控功能具有普适性，能够应用到不同的食用菌的育种中。本发明的Fvcpc2是在食用菌中的首次发现，更是在食用菌基因工程育种中的首次应用。

Description

FvCPC2蛋白及其编码基因在调控多种食用菌菌丝生长和子实体发育中的应用

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及FvCPC2蛋白在调控多种食用菌(包括真姬菇、双孢菇、灵芝、香菇、金针菇和草菇)菌丝生长和子实体发育中的应用，以及一株具有出菇周期短、产量高的金针菇Fvcpc2过表达突变菌株(Fvcpc2^OE#5)。

背景技术

食用菌是指能形成大型子实体或菌核类组织，并能供人们食用或药用的菌类(张维东等，园艺特产，2017)，目前我国约有1000多种食用菌(戴玉成等，菌物学报，2010.29:p.625-628.)，大部分属于担子菌，小部分属于子囊菌。食用菌含有丰富的多糖、蛋白质、三萜类、多肽、膳食纤维、牛磺酸、甘露醇、不饱和脂肪酸、腺嘌呤核苷、内脂、矿物质和维生素等(Mattila,P.,et al.,.Journal of agricultural and food chemistry,2001.49(5):p.2343-2348；Gao,Y.,et al.,JOURNAL OF MEDICINAL FOOD,2005.8(2)；Agrahar-Murugkar,D.and G.Subbulakshmi,Food Chemistry,2005.89(4):p.599-603；Barros,L.,et al.,Journal of agricultural and food chemistry,2008.56(10):p.3856-3862；Ouzouni,P.K.,et al.,Food Chemistry,2009.115(4):p.1575-1580；周素娟等，中国食用菌,2015.3(1):p.4-6)，同时具有低盐、低脂、低糖和高蛋白质的特点，被营养学家推荐为十大健康食品之一，具有巨大的市场前景和开发潜力(杨文建等，食药用菌，2011.19(1):p.15-18.)。其中金针菇(Flammulina velutipes)是典型的食用菌，在全世界尤其是亚洲国家广泛栽培(Chang,S.T.and J.A，World Journal of Microbiology&Biotechnology,1996.12:p.473-476)。金针菇含有丰富营养物质，同时因为其生长周期短，出菇条件简单而成为研究食用菌发育的代表菌株。

随着我国食用菌产值比重的上升以及在国际市场占有率的提高(李哲敏等，中国食物与营养，2005.5(10):p.15-17；卢敏等，中国食用菌学报，2006.13(1):p.1-5)，对于食用菌增产技术的需求越来越迫切。目前的增产方式主要包括优化营养条件和遗传育种。营养条件的优化包括添加促增产物质、优化栽培料配方以及改良栽培方式。比如在香菇栽培中添加食用菌增产剂，在金针菇栽培中添加三十烷醇等促增产物质；或选用更合适的碳源、氮源促进菌丝在栽培料上的生长；或者通过采用定位出菇、红光诱导出菇等栽培方式促进子实体生长(夏志兰，湖南农业大学学报，2002.01；潘继红等，食用菌学报，1992.06；金群力等，浙江农业学报，2016.11；邓春海等，食用菌，2013.03；张金红，河北科技报.2017)。这些改进方法主要针对菌株生长的环境进行改变从而更有利于菌株生长，但是增产空间有限且成本高。而遗传育种是通过改变菌株的性状以适应不同的生长环境，目前应用于食用菌遗传育种的方式主要包括人工选择育种、诱变育种、杂交育种、原生质体融合育种和基因工程育种。例如通过人工选育而得到的优良香菇品种广香5号，⁶⁰Co诱变选育姬松茸氨基酸高产菌株J3，经过不同亲本交配得到的早熟金针菇“农金六号”(吴学谦，香菇生产全书，2005；江枝和等，西北农业学报，2003.12(3):p.129-132；刘新锐等，园艺学报，2014.02)。以上三种育种方法在分子生物学发展初期较为常用，虽然能选育出性状优良的菌株，但是筛选较为盲目，而且耗费人工和时间。另外两种是原生质体融合育种和基因工程育种，其中已经有关于杏鲍菇和秀珍菇(张鹏，福建农林大学，2012)以及金针菇和巨大口蘑(郑锦荣，华南农业大学，2016)在原生质体融合育种方法层面的研究，但是融合子增强的性状仅限于两个亲本已经具有的性状，难以获得新的性状。而基因工程育种是在基因水平上的遗传操作，可以将任意一个有功能的基因导入受体细胞中复制表达，从而选育出新品种。

基因工程育种为选育更优良性状的食用菌菌种带来了曙光，这一技术需要基于对子实体发育调控基因的深入研究。随着分子生物学在食用菌中的应用，逐渐有一些关于调控食用菌子实体发育基因的报道。如草菇的漆酶基因lac1、lac4，香菇的疏水蛋白基因Le.hyd1、Le.hyd2，金针菇的腺苷脱氨酶编码基因Fv-ada和交配型基因等(Chen,S.,etal.,European Journal of Biochemistry,2004.271(2):p.318-328；Chen,S.,et al.,FEMS Microbiology Letters,2004.230(2):p.170-176；Ng,W.L.,et al.,FEMS MicrobiolLett,2000.185(2):p.139-145；Wang,W.,et al.,G3(Bethesda),2016)。这些研究目前局限于对单个物种的研究，在不同食用菌中还不具有普遍适用性。

发明内容

本发明要解决的技术问题是如何调控食用菌菌丝生长和子实体发育，培育出产量高、出菇周期短的食用菌。

为了解决上述技术问题，本发明首先提供了来源于金针菇的FvCPC2蛋白质的新用途。

本发明提供了FvCPC2蛋白质在如下任一中的应用：

(a1)调控食用菌菌丝生长；

(a2)调控食用菌子实体发育；

(a3)调控食用菌生物量和/或产量；

(a4)调控食用菌出菇周期；

(a5)调控真菌菌丝生长；

(a6)调控真菌子实体发育；

(a7)调控真菌产孢水平。

所述FvCPC2蛋白质是由7个WD40重复序列构成的Gβ类蛋白，为如下a)或b)或c)或d)的蛋白质：

a)氨基酸序列是序列2所示的蛋白质；

b)在序列2所示的蛋白质的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白质；

c)将序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白质；

d)与序列2所示的氨基酸序列具有75％或75％以上的同源性且具有相同功能的蛋白质。

为了使a)中的蛋白质便于纯化，可在序列表中序列2所示的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。

表1、标签的序列

标签	残基	序列
			Poly-Arg	5-6(通常为5个)	RRRRR
Poly-His	2-10(通常为6个)	HHHHHH
			FLAG	8	DYKDDDDK
Strep-tag II	8	WSHPQFEK
			c-myc	10	EQKLISEEDL

上述c)中的蛋白质，所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加为不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。

上述c)中的蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。

上述c)中的蛋白质的编码基因可通过将序列1所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。

上述d)中，“同源性”包括与本发明的序列2所示的氨基酸序列具有75％或更高，或80％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同源性的氨基酸序列。

为了解决上述技术问题，本发明又提供了与FvCPC2蛋白质相关的生物材料的新用途。

本发明提供了与FvCPC2蛋白质相关的生物材料在如下任一中的应用：

(a1)调控食用菌菌丝生长；

(a2)调控食用菌子实体发育；

(a3)调控食用菌生物量和/或产量；

(a4)调控食用菌出菇周期；

(a5)调控真菌菌丝生长；

(a6)调控真菌子实体发育；

(a7)调控真菌产孢水平。

所述与FvCPC2蛋白质相关的生物材料为下述A1)至A8)中的任一种：

A1)编码FvCPC2蛋白质的核酸分子；

A2)含有A1)所述核酸分子的表达盒；

A3)含有A1)所述核酸分子的重组载体；

A4)含有A2)所述表达盒的重组载体；

A5)含有A1)所述核酸分子的重组微生物；

A6)含有A2)所述表达盒的重组微生物；

A7)含有A3)所述重组载体的重组微生物；

A8)含有A4)所述重组载体的重组微生物。

上述应用中，A1)所述核酸分子为如下1)或2)或3)所示的基因：

1)其编码序列是序列1所示的cDNA分子或基因组DNA分子；

2)与1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码FvCPC2蛋白质的cDNA分子或基因组DNA分子；

3)在严格条件下与1)或2)限定的核苷酸序列杂交，且编码FvCPC2蛋白质的cDNA分子或基因组DNA分子。

其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。

本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的编码FvCPC2蛋白质的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有编码FvCPC2蛋白质的核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要编码FvCPC2蛋白质且具有相同功能，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。

这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的编码序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的核苷酸序列具有75％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。

上述75％或75％以上同一性，可为80％、85％、90％或95％以上的同一性。

上述应用中，A2)所述的含有编码FvCPC2蛋白质的核酸分子的表达盒是指能够在宿主细胞中表达FvCPC2的DNA，该DNA不但可包括启动FvCPC2转录的启动子，还可包括终止FvCPC2转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。在本发明的具体实施例中，所述启动子具体为gpd启动子片段，所述终止子具体为trpC终止子片段。可用现有的表达载体构建含有所述FvCPC2基因表达盒的重组载体。

上述应用中，所述载体可为质粒、黏粒、噬菌体或病毒载体。

上述应用中，所述微生物可为酵母、细菌、藻或真菌，如农杆菌。

上述应用中，所述调控为促进或提高；所述调控食用菌生物量和/或产量体现在如下(c1)-(c3)中任一种：

(c1)提高食用菌子实体数量；

(c2)提高食用菌子实体高度；

(c3)提高食用菌子实体湿重；

所述调控食用菌出菇周期体现在促进金针菇的原基期和/或成熟期提前。

为了研究FvCPC2在食用菌中的功能，本发明以金针菇为例，在金针菇野生型菌株中进行Fvcpc2过表达和敲低表达实验，分别得到过表达突变菌株和Fvcpc2敲低表达突变菌株。对金针菇野生型、Fvcpc2过表达突变菌株和Fvcpc2敲低表达突变菌株进行菌丝生长实验，并对它们进行表型分析，发现Fvcpc2敲低后在合成培养基和栽培料上菌丝生长都慢于野生型。而Fvcpc2过表达后在栽培料上菌丝生长快于野生型，从而缩短了菌丝生长周期。说明Fvcpc2对金针菇菌丝生长有正向的调控作用。本发明同时对金针菇野生型、Fvcpc2过表达突变菌株和Fvcpc2敲低表达突变菌株进行出菇实验，并在不同的时间段进行观察和拍照。对所有菌株的出菇表型进行分析，野生型在刺激出菇处理后第7天产生原基(金针菇的最初级子实体)，而Fvcpc2过表达突变菌株比野生型提前1天产生更大面积的原基。继续进行出菇培养，发现Fvcpc2过表达突变菌株比野生型提前3天进入成熟收获期，而在Fvcpc2敲低表达突变菌株中，在与野生型相同出菇时间内无原基产生，延长出菇时间后也不见原基产生。

上述结果说明Fvcpc2的表达水平显著影响了金针菇原基的产生以及子实体的发育，Fvcpc2是金针菇子实体发育过程中必需的调控基因。

上述应用中，所述食用菌可为真姬菇、双孢菇、灵芝、香菇、金针菇或草菇。在本发明中，所述食用菌具体为金针菇。所述真菌具体为粗糙脉孢菌。

为了解决上述技术问题，本发明还提供了一种培育产量高和/或出菇周期短的转基因食用菌的方法。

本发明提供的培育产量高和/或出菇周期短的转基因食用菌的方法包括提高受体食用菌中FvCPC2蛋白质的表达量和/或活性，得到转基因食用菌的步骤；所述转基因食用菌的产量高于所述受体食用菌和/或所述转基因食用菌的出菇周期短于所述受体食用菌。

上述方法中，所述转基因食用菌的产量高于所述受体食用菌体现在如下(d1)-(d3)中任一种：

(d1)转基因食用菌的子实体数量多于所述受体食用菌；

(d2)转基因食用菌的子实体高度高于所述受体食用菌；

(d3)转基因食用菌的子实体湿重大于所述受体食用菌；

所述转基因食用菌的出菇周期短于所述受体食用菌体现在转基因食用菌的原基期和/或成熟期早于所述受体食用菌。

进一步的，所述提高受体食用菌中FvCPC2蛋白质的表达量和/或活性的方法为在受体食用菌中过表达FvCPC2蛋白质；

所述过表达的方法为将FvCPC2蛋白质的编码基因导入受体食用菌；

所述FvCPC2蛋白质的编码基因通过重组载体导入受体食用菌；所述重组载体为将gpd启动子片段、FvCPC2蛋白质的编码基因和trpC终止子片段用重组试剂盒在XmnI酶切位点与质粒pBHg-BCA1融合后得到的大小为12005bp的载体。

所述FvCPC2蛋白质的编码基因是序列1所示的DNA分子。

更进一步的，所述受体食用菌为金针菇；所述金针菇具体为金针菇菌株FL19(黄色)。

本发明培育的转基因金针菇相比于野生型金针菇，提前1天产生原基并提前3天进入成熟期，同时总生物量增加，子实体高度增加15.86±1.59％，总湿重增加62.47±8.88％，是一株良好的增产菌株，结合提前进入成熟期的优势，在生产应用中可以缩短生产周期，减少能耗和人工成本，是一株很好的低能耗高产量的生产菌株。

本发明还提供了一种培育菌丝生长缓慢和/或子实体发育缺陷的转基因食用菌的方法。

本发明提供的培育菌丝生长缓慢和/或子实体发育缺陷的转基因食用菌的方法包括降低受体食用菌中FvCPC2蛋白质的表达量和/或活性，得到转基因食用菌的步骤；所述转基因食用菌菌丝生长缓慢和/或子实体发育缺陷。

上述方法中，所述降低受体食用菌中FvCPC2蛋白质的表达量和/或活性的方法是通过对所述受体食用菌中FvCPC2蛋白质的编码基因进行敲除或抑制表达来实现。

进一步的，对所述受体食用菌中FvCPC2蛋白质的编码基因进行敲除或抑制表达时可将采用的基因编辑工具导入所述受体食用菌，具体可为：通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。

更进一步的，本发明将用于对所述受体食用菌中FvCPC2蛋白质的编码基因进行RNA干扰的物质导入所述受体食用菌中，所述物质为含有Fvcpc2-antisense片段和Fvcpc2-sense片段的表达载体。在本发明中，含有Fvcpc2-antisense片段和Fvcpc2-sense片段的表达载体为将gpd启动子片段、Fvcpc2-antisense片段、Fvcpc2-sense片段和trpC终止子片段用重组试剂盒在XmnI酶切位点与质粒pBHg-BCA1融合后得到的大小为11462bp的载体。

本发明最后还提供了一种培育菌丝生长速率提高和/或产孢水平提高的真菌的方法。

本发明提供的培育菌丝生长速率提高和/或产孢水平提高的真菌的方法包括提高受体菌中FvCPC2蛋白质的表达量和/或活性的步骤；

所述受体菌为缺失cpc-2的粗糙脉孢菌。粗糙脉孢菌中cpc-2缺失后导致菌丝生长弱化、产孢量降低、不能产生在子实体，而本发明的金针菇来源的FvCPC2与粗糙脉孢菌CPC-2同源性较高，将金针菇来源的Fvcpc2转化到粗糙脉孢菌cpc-2的缺失突变株(Δcpc-2)中，发现转化子(Fvcpc2；Δcpc-2)能够和野生型一样产生正常的原子囊壳和子囊壳，恢复了子实体的正常发育。本发明同时用粗糙脉孢菌来源的cpc-2对Δcpc-2同时进行回补，作为阳性对照。该阳性对照回补菌株(cpc-2；Δcpc-2)的有性发育也能恢复到野生型水平。说明金针菇的FvCPC2和粗糙脉孢菌的CPC-2在子实体发育过程中发挥类似的功能。粗糙脉孢菌中cpc-2的缺失突变株(Δcpc-2)不仅有性发育受到阻断，而且菌丝的无性发育也受到影响，表现为菌丝生长相对于野生型减弱，生长速率变慢，无性分生孢子产量减少。用Fvcpc2进行回补转化形成的转化子(Fvcpc2；Δcpc-2)其菌丝生长和无性产孢都能恢复到野生型水平。上述结果说明，金针菇的FvCPC2和粗糙脉孢菌的CPC-2在无性菌丝生长过程中发挥相似的功能。

上述方法中，所述提高受体菌中FvCPC2蛋白质的表达量和/或活性的方法为在受体菌中过表达FvCPC2蛋白质。

进一步的，所述过表达的方法为将FvCPC2蛋白质的编码基因导入受体菌。在本发明中，所述FvCPC2蛋白质的编码基因通过重组载体导入受体菌；所述重组载体为将Pcpc-2、Fvcpc2-CDS和Tcpc-2用重组试剂盒在SpeI和SalI酶切位点与质粒pCB1532融合后得到的载体。

本发明提供了FvCPC2及其编码基因在调控多种食用菌菌丝生长和子实体发育中的应用，该基因序列及功能首次在金针菇乃至食用菌里报道。本发明在金针菇中对Fvcpc2分别进行过表达和敲低表达实验，发现Fvcpc2过表达后，菌丝生长加快，原基形成期和子实体成熟期提前，而且子实体生物量增加。相反，敲低Fvcpc2后，菌丝生长减弱且在出菇诱导过程中无原基产生。实验结果说明，Fvcpc2不仅是金针菇菌丝生长的重要调控基因，而且是子实体形成的关键基因，过表达能够促进菌丝生长及子实体的形成和成熟。同时，通过对数据库中基因组和转录组信息进行比对分析，发现FvCPC2在多种丝状真菌和多种食用菌中都有同源蛋白的存在，且都在子实体发育时期上调表达，但是在食用菌中并没有功能报道。本发明以模式真菌粗糙脉孢菌为例，用Fvcpc2构建的回补菌株Fvcpc2；Δcpc-2能够将Δcpc-2菌丝和分生孢子弱化生长、母本不育的表型恢复到菌丝和分子孢子正常生长、母本可育的野生型表型。说明Fvcpc2不仅结构保守而且在子实体发育中的功能保守。结合Fvcpc2在金针菇和粗糙脉孢菌子实体发育中的功能与FvCPC2在多种丝状真菌和食用菌中子实体发育时期上调表达的数据，证明该基因对多种真菌的子实体发育调控具有广谱适用性，在基因改造多种食用菌制备短周期高产菌株中具有广阔的应用前景。

附图说明

图1是蛋白FvCPC2的结构图。

图2是FvCPC2编码基因在金针菇菌丝和原基期的转录水平图。

图3是Fvcpc2在野生型、Fvcpc2过表达突变菌株和Fvcpc2敲低表达突变菌株中转录水平分析结果图。

图4是野生型、Fvcpc2过表达突变菌株和Fvcpc2敲低表达突变菌株在CYM平板上的菌丝生长结果图。

图5是野生型、Fvcpc2过表达突变菌株和Fvcpc2敲低表达突变菌株在栽培料上的菌丝生长结果图。

图6是野生型、Fvcpc2过表达突变菌株和Fvcpc2敲低表达突变菌株在栽培料上的出菇结果图。

图7是野生型、Fvcpc2过表达突变菌株和Fvcpc2敲低表达突变菌株出菇的生物量统计结果图。

图8是蛋白FvCPC2在不同真菌中同源蛋白的进化关系图。

图9是Fvcpc2回补粗糙脉孢菌cpc-2敲除突变菌株(△cpc-2)后原子囊壳和子囊壳(子实体)结果图。

图10是Fvcpc2回补粗糙脉孢菌cpc-2敲除突变菌株(△cpc-2)后无性菌丝生长、产孢结果图。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

下述实施例中所用的培养基及配方如下：

LB培养基：1％胰蛋白胨，0.5％酵母浸膏，1％NaCl，加适量蒸馏水溶解，pH7.0，定容，高压蒸汽灭菌。

CYM培养基：1％麦芽糖，2％葡萄糖，0.2％胰蛋白胨，0.2％酵母提取物，加适量蒸馏水溶解，自然pH定容，高压蒸汽灭菌。

出菇栽培料培养基：30％木屑，43.5％棉籽壳，25％麸皮，1％轻质碳酸钙，0.5％石灰，60％水，加水后充分混匀并浸润4-5个小时后，分装到容积为350mL的组培瓶中，每瓶装325g栽培料，高压蒸气灭菌3个小时。

农杆菌转化诱导培养基(IM)：2.05g K₂HPO₄，0.15g NaCl，0.5g MgSO₄·7H₂O，0.067g CaCl₂·2H₂O，0.0025g FeSO₄·7H₂O，0.5g(NH₄)₂SO₄，1.8g葡萄糖，5mL甘油，8.53g2-(N-Morpholino)ethanesulfonic Acid(pH5.3，过滤除菌)，200μM乙酰丁香酮(过滤除菌，铺平板时加入)。

2×CTAB buffer：2％CTAB，100mM Tris-HCl pH8.0，20mM EDTA pH8.0，1.4MNaCl，1％PVP(polyvinyl pyrrolidone)。

Soil DNA extraction buffer(SDEB)：100mM NaCl，50mM EDTA，0.25M Tris-HCl，5％SDS。

SC培养基(杂交培养基)：1g KNO₃，5g KH₂PO₄，0.5g MgSO₄·7H₂O，0.1g NaCl，0.1gCaCl₂，0.1mL Trace metals，50μL 0.1mg/ml生物素，2g蔗糖，15g琼脂，加适量蒸馏水溶解，pH6.5，定容至1L，高压蒸汽灭菌锅灭菌。

Trace metals：5g ZnSO₄·7H₂O，5g H₃C₆H₅O₇·1H₂O，1g Fe(NH₄)₂(SO₄)₂·6H₂O，0.25g CuSO₄·5H₂O，0.05g MnSO₄·1H₂O，0.05g H₃BO₃，0.05g Na₂MoO₄·2H₂O，蒸馏水溶解定容至100mL，加1mL氯仿(抑菌)，室温储存。

50×Vogel’s：125g Na₃C₆H₅O₇·2H₂O，250g KH₂PO₄，100g NH₄NO₃，10g MgSO₄·7H₂O，5g CaCl₂·2H₂O，5mL Trace metals，2.5mL 0.1mg/mL Biotin，蒸馏水溶解定容至1L，加2mL氯仿(抑菌)。

Vogel’s培养基：1×Vogel’s，2％蔗糖，1.5％琼脂，加适量蒸馏水溶解，定容，高压蒸汽灭菌。

粗糙脉孢菌电转培养基：20g L-山梨糖，0.5g果糖，0.5g葡萄糖，20mL50×Vogel’s，15g琼脂，蒸馏水溶解定容至1L，高压蒸汽灭菌锅灭菌。

下述实施例中的质粒pBHg-BCA1来源于福建农林大学菌物研究中心，记载于文献“Lu,Y.P.,et al.,A Jacalin-Related Lectin Regulated the Formation of AerialMycelium and Fruiting Body in Flammulina velutipes.Int J Mol Sci,2016.17(12).”中。

下述实施例中的质粒pCSN44来源于美国真菌遗传资源中心(Fungal GeneticsStock Center)，记载于文献“Chen,X.,et al.,De-repression of CSP-1 activatesadaptive responses to antifungal azoles.Sci Rep,2016.6:p.19447.”中。

下述实施例中的质粒pCB1532来源于美国真菌遗传资源中心(Fungal GeneticsStock Center)，记载于文献“Fungal Genetics Stock Center)，文献：J.A.Sweigard,F.Chumley,A.Carroll,L.Farrall，B.Valent.A series of vectors for fungaltransformation[J].Fungal Genetics Reports,1997,44(1):52-53)”中。

下述实施例中的金针菇野生型均为金针菇菌株FL19(黄色)，来源于福建农林大学菌物研究中心。

下述实施例中的粗糙脉孢菌cpc-2缺失突变株(Δcpc-2)是将来源于美国真菌遗传资源中心(Fungal Genetics Stock Center)的原始异核体菌株NCU05810(FGSC#13695)通过单孢子分离的方法分离得到的单核体菌株Δcpc-2。单孢子分离的方法参见文献“Ebbole D,Sachs M S.A rapid and simple method for isolation of Neurosporacrassa homokaryons using microconidia[J].Fungal Genetics Reports,1990,37(1):7”，具体步骤如下：(1)将活化后的FGSC#13695菌株孢子用接种针接于单孢分离斜面上，接种前加入终浓度为1mM的碘乙酸。(2)将斜面放在25℃培养7-10天，12小时光照/黑暗交替。(3)加入无菌水洗涤，涡旋震荡30-60sec洗下孢子，通过滤膜(Millipore品牌，货号SLSV025LS)过滤得到单核的小孢子。(4)将得到的小孢子悬液涂布平板(培养基同粗糙脉孢菌电转培养基)，培养2-3天后挑出单菌落，提基因组并用PCR检测cpc-2基因片段和hph^R片段，检测到hph^R片段同时检测不到cpc-2基因片段的单菌落为纯合体△cpc-2。引物序列如下：cpc-2-F：5’-GCTGGTGGGTGGGCTAAGGA-3’，cpc-2-R：5’-ATGACACCCCAGGCACGGAT-3’；hph^R-F：5’-CTGGAGCTAGTGGAGGTCAACAC-3’，hph^R-R：5’-CGGTCGGCATCTACTCTATTCC-3’)。

实施例1、Fvcpc2过表达突变菌株和Fvcpc2敲低表达突变菌株的构建

一、Fvcpc2基因的核苷酸序列和FvCPC2蛋白质的氨基酸序列及Fvcpc2在不同时期的表达水平

1、Fvcpc2基因的核苷酸序列和FvCPC2蛋白质的氨基酸序列

本发明在对多种丝状真菌(包括粗糙脉孢菌、曲霉、镰刀菌、裂褶菌和灰盖鬼伞)和多种食用菌(包括真姬菇、双孢菇、灵芝、香菇、金针菇和草菇)的基因组和子实体发育时期表达谱数据分析过程中，得到一个来源于金针菇的共同保守的功能蛋白编码基因，将其命名为Fvcpc2，该基因虽然在多种真菌中保守存在，但是在食用菌中未见其功能报道。本发明的Fvcpc2基因从起始密码子到终止密码子全长为1273bp，其核苷酸序列如序列1所示，包含4个内含子，内含子大小分别为50bp、50bp、177bp和48bp，其核苷酸序列分别为序列1第113-162位、第503-552位、第629-805位和第1072-1119位。Fvcpc2基因编码的FvCPC2蛋白质的氨基酸序列如序列2所示。

用SMART(http://smart.embl-heidelberg.de/)对FvCPC2蛋白质的氨基酸序列进行分析，结果显示蛋白质FvCPC2编码一个具有7个WD40重复序列的蛋白，结构如图1所示。用软件DNAMAN(Woffelman,C.,DNAMAN for Windows,Version 5.2.10:Lynon Biosoft.2004,Institute of Molecular Plant Sciences,Netherlands:Leiden University.)对FvCPC2蛋白质的分子量和等电点进行分析。FvCPC2蛋白质的分子量为35078.0Da，等电点为5.82。

2、Fvcpc2在不同时期的表达水平

采用实时荧光定量PCR检测Fvcpc2在金针菇原基(初期的子实体)和菌丝时期的表达水平(Q-Fvcpc2-F：5’-CGATACTGGCTCTGTGCAGCTA-3’，Q-Fvcpc2-R：5’-ACACTCGGGTTGCCTTCCTT-3’)。结果表明，Fvcpc2在原基期上调表达(图2)。

二、Fvcpc2过表达突变菌株和Fvcpc2敲低表达突变菌株的构建

1、Fvcpc2过表达载体的构建

(1)用引物Pgpd-F和Pgpd-OE-R2以金针菇基因组DNA为模板进行PCR扩增，得到金针菇gpd启动子片段(Pgpd-OE2)，该gpd启动子包含gpd基因第一个内含子和外显子，靶序列大小为920bp。引物序列如下：

Pgpd-F:5’-CAGATCCCCCGAATTATTCGAGCTCGGTACAGTCGTG-3’；

Pgpd-OE-R2:5’-TCCAGCCACCGACCTGTAAAATGGTGAGCAAGAC-3’。

PCR反应程序为：98℃30s；98℃10s，55℃90s，72℃60s(25cycles)；72℃10min；4℃。

(2)用引物Fvcpc2-F和Fvcpc2-R以金针菇基因组DNA为模板进行PCR扩增，得到Fvcpc2OE片段，靶序列大小为1237bp。引物序列如下：

Fvcpc2-F:5’-TTTACAGGTCGGTGGCTGGAAGCGTGACATC-3’；

Fvcpc2-R:5’-AAGTGGATCCTTATGAGGTGACAGTCCAGACACG-3’。

PCR反应程序为：98℃30s；98℃10s，67℃90s，72℃60s(25cycles)；72℃10min；4℃。

(3)用引物TtrpC-OE-F2和TtrpC-R以pCSN44质粒为模板进行PCR扩增，得到trpC终止子片段(TtrpC-OE2)，靶序列大小为720bp。引物序列如下：

TtrpC-OE-F2:5’-CACCTCATAAGGATCCACTTAACGTTACTGAAATCA-3’；

TtrpC-R:5’-AATTAACGCCGAATTCATGCCTGCAGGTCGAGAAAG-3’。

PCR反应程序为：98℃30s；98℃10s，58℃90s，72℃60s(25cycles)；72℃10min；4℃。

(4)用普通质粒小提试剂盒提取pBHg-BCA1质粒，并用限制性内切酶XmnI酶切消化该质粒，同时用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收酶切产物。

(5)用片段重组试剂盒(南京诺唯赞生物科技有限公司，货号：C113-01)将步骤(1)-(3)制备的Pgpd-OE2、Fvcpc2OE和TtrpC-OE2片段连入步骤(4)酶切回收后的pBHg-BCA1，得到重组载体。

(6)将步骤(5)制备的重组载体转化大肠杆菌DH5α感受态，然后挑单菌落，用验证引物Pgpd-detect-F和TtrpC-detect-R对单菌落进行菌落PCR验证(靶序列大小为1595bp)，得到阳性质粒，并将其命名为pBHg-BCA1-Fvcpc2OE。引物序列如下：

Pgpd-detect-F:5’-AACCGCCATCTTCCACACTT-3’；

TtrpC-detect-R:5’-AACACCATTTGTCTCAACTCCG-3’。

PCR反应程序为：94℃5min；94℃30s，58℃90s，72℃90s(25cycles)；72℃10min；4℃。

Fvcpc2过表达载体pBHg-BCA1-Fvcpc2OE为将gpd启动子片段(Pgpd-OE2)、Fvcpc2OE片段和trpC终止子片段(TtrpC-OE2)用重组试剂盒在XmnI酶切位点与质粒pBHg-BCA1融合后得到的大小为12005bp的载体。

2、Fvcpc2敲低表达载体的构建

本发明采用发夹结构的RNAi技术构建Fvcpc2敲低表达载体。具体步骤如下：

(1)用引物Pgpd-F和Pgpd-RNAi-R2以金针菇基因组DNA为模板进行PCR扩增，得到金针菇gpd启动子片段(Pgpd-RNAi2)，靶序列大小为920bp。引物序列如下：

Pgpd-F:5’-CAGATCCCCCGAATTATTCGAGCTCGGTACAGTCGTG-3’；

Pgpd-RNAi-R2:5’-GATGAGTGTCACACCGAATGGACCTGTAAAATGGTGAGCAAGAC-3’。

PCR反应程序为：98℃30s；98℃10s，60℃90s，72℃60s(25cycles)；72℃10min；4℃。

(2)用引物Fvcpc2-antisense-F和Fvcpc2-antisense-R以金针菇基因组DNA为模板进行PCR扩增，得到Fvcpc2-antisense片段，靶序列大小为340bp。引物序列如下：

Fvcpc2-antisense-F:5’-ACCATTTTACAGGTCCATTCGGTGTGACACTCATCTTTG-3’；

Fvcpc2-antisense-R:5’-TCGGCGCGATGATACACAAAACTATCATTGTGTGGCAGC-3’。

PCR反应程序为：98℃30s；98℃10s，62℃90s，72℃60s(25cycles)；72℃10min；4℃。

(3)用引物Fvcpc2-sense-F和Fvcpc2-sense-R以金针菇基因组DNA为模板进行PCR扩增，得到Fvcpc2-sense片段，靶序列大小为390bp。引物序列如下：

Fvcpc2-sense-F:5’-CAATGATAGTTTTGTGTATCATCGCGCCGACTTTTC-3’；

Fvcpc2-sense-R:5’-ACGTTAAGTGGATCCCATTCGGTGTGACACTCATCTTTG-3’。

(4)用引物TtrpC-RNAi-F2和TtrpC-R以质粒pCSN44为模板进行PCR扩增，得到trpC终止子片段(TtrpC-RNAi2)，靶序列大小为720bp。引物序列如下：

TtrpC-RNAi-F2:5’-GTGTCACACCGAATGGGATCCACTTAACGTTACTGAAATCAT-3’；

TtrpC-R:5’-AATTAACGCCGAATTCATGCCTGCAGGTCGAGAAAG-3’。

(5)用普通质粒小提试剂盒提取pBHg-BCA1质粒，并用限制性内切酶XmnI酶切消化该质粒，同时用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收酶切产物。

(6)用片段重组试剂盒(南京诺唯赞生物科技有限公司，货号：C113-01)将步骤(1)-(4)制备的Pgpd-RNAi2、Fvcpc2-antisense、Fvcpc2-sense和TtrpC-RNAi2片段连入步骤(5)酶切回收后的pBHg-BCA1，得到重组载体。

(7)将步骤(6)制备的重组载体转化大肠杆菌DH5α感受态，然后挑单菌落，用验证引物Pgpd-detect-F和TtrpC-detect-R对单菌落进行菌落PCR验证(靶序列大小为943bp)，得到阳性质粒，并将其命名为pBHg-BCA1-Fvcpc2-antisens。引物序列如下：

Pgpd-detect-F:5’-AACCGCCATCTTCCACACTT-3’；

TtrpC-detect-R:5’-AACACCATTTGTCTCAACTCCG-3’。

PCR反应程序为：94℃5min；94℃30s，58℃90s，72℃60s(25cycles)；72℃10min；4℃。

Fvcpc2敲低表达载体pBHg-BCA1-Fvcpc2RNAi为将gpd启动子片段(Pgpd-RNAi2)、Fvcpc2-antisense片段、Fvcpc2-sense片段和trpC终止子片段(TtrpC-RNAi2)用重组试剂盒在XmnI酶切位点与质粒pBHg-BCA1融合后得到的大小为11462bp的载体。

三、质粒pBHg-BCA1-Fvcpc2OE和pBHg-BCA1-Fvcpc2RNAi转化农杆菌

分别将步骤二制备的质粒pBHg-BCA1-Fvcpc2OE和pBHg-BCA1-Fvcpc2RNAi转化农杆菌AGL-1感受态细胞中。具体步骤如下：

1、取两管50μL AGL-1感受态细胞(北京博迈德基因技术有限公司，货号：BC302-01)，分别加入1μg质粒pBHg-BCA1-Fvcpc2OE和质粒pBHg-BCA1-Fvcpc2RNAi，用移液枪轻轻的吹吸混匀，冰上放置10min。

2、将离心管放于液氮种速冻5min。

3、立即置于37℃静置水浴中5min，不要晃动水面。

4、将离心管放回冰上，保持5min。

5、加入1mL LB液体培养基，28℃静置培养2-3h。

6、吸取菌液涂布于含有50μg/mL卡那霉素和50μg/mL利福平的LB的平板上，28℃先正面放置1h，再倒置培养48-72h。待单菌落长出后挑取单菌落，用验证引物Pgpd-detect-F和TtrpC-detect-R对单菌落进行菌落PCR验证，靶序列大小分别为1595bp(pBHg-BCA1-Fvcpc2OE)和943bp(pBHg-BCA1-Fvcpc2RNAi)，分别得到含有质粒pBHg-BCA1-Fvcpc2OE的农杆菌菌株AGL1-Fvcpc2OE和含有质粒pBHg-BCA1-Fvcpc2RNAi的农杆菌菌株AGL1-Fvcpc2RNAi。引物序列如下：

Pgpd-detect-F:5’-AACCGCCATCTTCCACACTT-3’；

TtrpC-detect-R:5’-AACACCATTTGTCTCAACTCCG-3’。

四、农杆菌转化金针菇野生型菌株

将步骤三制备的农杆菌菌株AGL1-Fvcpc2OE和AGL1-Fvcpc2RNAi转化金针菇野生型菌株(金针菇菌株FL19)。具体步骤如下：

1、准备金针菇野生型菌株菌块：提前两天用打孔器将长满金针菇菌丝的CYM培养基打成小圆块(d＝5mm)，于CYM液体培养基中静置培养48h。

2、将含有目的片段质粒的农杆菌(AGL1-Fvcpc2OE和AGL1-Fvcpc2RNAi)分别转接到含利福平及卡那霉素的LB液体培养基中，28℃震荡培养12-16h(150rpm)。

3、待农杆菌菌液的OD600达0.5-0.8时，转入灭菌的50mL离心管，封口膜封口后，4500rpm，4℃离心12min，收集菌体。

4、用IM培养基洗涤农杆菌2次。然后加入5mL的IM培养基(重悬农杆菌菌体)，28℃，150rpm，避光培养4-6小时至OD600为0.3-0.5，以诱导其转化能力。

5、将步骤1中准备好的菌块加入到诱导后的农杆菌中，液体静置培养3-6h后，将菌块转到覆有玻璃纸的IM培养基上，25℃共培养3-6天。

6、共培养完成后，用无菌水清洗菌块以清除农杆菌，转到含有12.5μg/mL潮霉素B和200μM头孢噻肟钠的CYM筛选平板上，25℃静置培养3-4周待转化子长出。

五、金针菇转化子的筛选

1、样品准备

(1)将从CYM筛选平板上挑出来的单菌落继续转接到含有12.5μg/mL潮霉素B和200μM头孢噻肟钠的CYM筛选平板，筛选5代。

(2)将筛选完5代依然生长良好的菌株转接到不含有潮霉素B的覆有玻璃纸的CYM平板上，长满菌丝后收取菌丝，一部分用于DNA提取，另一部分用于RNA提取。同时以金针菇野生型菌株作为对照。

2、菌株DNA提取及验证

(1)收集金针菇野生型菌丝，迅速扔进液氮保存。

(2)液氮研磨菌丝体，加入400μL提取缓冲液(SDEB)和400μL 2×CTAB缓冲液，涡旋混匀。

(3)加入800μL酚/氯仿(1:1)溶液，充分混匀，12000rpm离心10min。

(4)吸取上清液并转入新的1.5mL离心管中，加入500μL氯仿，充分混匀，12000rpm离心10min。

(5)吸取适量上清液并转入新的1.5mL离心管中，加入0.6倍体积的异丙醇，混匀，4℃放置10～20min，12000rpm离心10min，弃上清。

(6)75％的乙醇清洗沉淀两次，12000rpm离心10min，弃上清。

(7)短暂离心，将多余的酒精吸出，晾干。

(8)加入适量DNA溶解液(DNA溶解液配制：1mL 10mM Tris-HCl(pH8.0)中加入10μLRNaseA)溶解DNA。

(9)37℃水浴2h，-20℃保存。

(10)分别以金针菇野生型、Fvcpc2过表达突变菌株和Fvcpc2过表达突变菌株的DNA为模板，进行PCR扩增验证，用验证引物Pgpd-detect-F和TtrpC-detect-R对单菌落进行菌落PCR验证，靶序列分别为无条带(金针菇野生型)、1558bp(Fvcpc2过表达突变菌株)和1224bp(Fvcpc2过表达突变菌株)，同时分别以相应质粒作为阳性对照。引物序列如下：

Pgpd-detect-F:5’-AACCGCCATCTTCCACACTT-3’；

TtrpC-detect-R:5’-AACACCATTTGTCTCAACTCCG-3’。

3、菌株RNA提取及定量PCR验证转录水平

对上述步骤2中所得到的阳性突变体提取RNA，同时进行定量PCR实验。具体操作如下：

(1)将收集的菌样置于1.5mL离心管并迅速投入液氮中冻存。

(2)液氮研磨菌丝体，加入0.7mL Trizol，混匀，室温放置5min。4℃，12000rpm离心10min，吸取上清于1.5mL Axygen离心管中。

(3)加入0.7mL氯仿，涡旋振荡器上轻微振荡15s，室温放置5min。4℃，12000rpm离心15min。

(4)吸取适量上清，加入0.6倍体积预冷的异丙醇，混匀，室温放置10min。4℃，12000rpm离心10min，弃上清。

(5)75％的冰冷乙醇清洗两次，晾干酒精。

(6)用100μL RNA-free水溶解RNA。

(7)紫外分光光度计检测RNA，记录RNA样品的OD260、OD280及Ratio值。然后根据公式：RNA样品的浓度＝OD260值×40×RNA样品的稀释倍数，计算RNA的浓度。

(8)普通凝胶电泳检测RNA的完整性：1％浓度的琼脂糖凝胶，2μg RNA样品上样量，电压为180V，电泳15min，EB染色后紫外下观察RNA条带。

(9)用cDNA合成试剂盒分别将所有RNA样品反转成cDNA，用于定量PCR。

(10)以上述cDNA样品为模板，用定量PCR引物Q-Fvcpc2-F和Q-Fvcpc2-R对Fvcpc2进行定量扩增，采用2^-ΔΔCt的计算方法对实验数据进行处理。同时以actin作为内参基因。引物为Q-actin-F和Q-actin-R。引物序列如下：

Q-Fvcpc2-F:5’-CGATACTGGCTCTGTGCAGCTA-3’；

Q-Fvcpc2-R:5’-ACACTCGGGTTGCCTTCCTT-3’；

Q-actin-F:5’-CACCATGTTCCCTGGTATTG-3’；

Q-actin-R:5’-CACCAATCCAGACAGAGTATTT-3’。

PCR反应程序为：95℃预变性60s；95℃变性15s、58℃退火15s、72℃延伸45s，40个循环；溶解曲线分析：65℃～95℃，每0.05s增加0.5℃并检测。

(11)对所得的定量PCR数据进行分析，选取相对比野生型，Fvcpc2上调表达的菌株作为Fvcpc2过表达突变菌株，Fvcpc2下调表达的菌株作为Fvcpc2敲低表达突变菌株。共得到Fvcpc2过表达突变菌株3株，分别为：Fvcpc2^OE#5、Fvcpc2^OE#33和Fvcpc2^OE#124，表达量相对于野生型分别上调至2.59±0.05倍、2.06±0.07倍及2.09±0.12倍。Fvcpc2敲低表达突变菌株3株，分别为：Fvcpc2^RNAi#11、Fvcpc2^RNAi#41和Fvcpc2^RNAi#43，表达量相对于野生型分别下降9.4±2.1％、67.7±2.9％和69.7±0.5％，数据结果如图3所示。以上菌株作为实验菌株。

实施例2、Fvcpc2在调控金针菇菌丝生长中的应用

一、对Fvcpc2突变菌株进行平板菌丝生长观察实验

将金针菇野生型、Fvcpc2过表达突变菌株(Fvcpc2^OE#5、Fvcpc2^OE#33和Fvcpc2^OE#124)和Fvcpc2敲低表达突变菌株(Fvcpc2^RNAi#11、Fvcpc2^RNAi#41和Fvcpc2^RNAi#43)分别用打孔器做成大小一致的菌块(d＝5mm)，并分别接种到不含药物的CYM平板上，25℃培养7天之后拍照。在培养的过程中，每隔24小时测量菌丝生长长度，并做记录，计算各个菌株平均生长速率。

对不同菌株生长情况和生长速率分析结果如下：在CYM平板上，Fvcpc2过表达突变菌株菌丝的生长与野生型无显著性差异，而Fvcpc2敲低表达突变菌株菌丝生长变弱变慢，Fvcpc2^RNAi#11、Fvcpc2^RNAi#41和Fvcpc2^RNAi#43的菌丝生长速率相比于FL19菌株分别下降42.8±1.1％,38.8±3.1％and 27±5.2％，说明Fvcpc2低表达影响金针菇菌丝生长(图4)。

二、对Fvcpc2突变菌株进行栽培料菌丝生长观察实验

将金针菇野生型、Fvcpc2过表达突变菌株(Fvcpc2^OE#5、Fvcpc2^OE#33和Fvcpc2^OE#124)和Fvcpc2敲低表达突变菌株(Fvcpc2^RNAi#11、Fvcpc2^RNAi#41和Fvcpc2^RNAi#43)分别用打孔器做成大小一致的菌块(d＝5mm)，并分别接种于装有325g栽培料的组培瓶中，25℃培养至有菌丝长满瓶底拍照。

结果如图5所示。Fvcpc2过表达突变菌株(12天)比野生型(15天)先长满栽培料，而Fvcpc2敲低表达突变菌株(22天)最晚长满栽培料。在栽培料上，由菌丝生长速率：Fvcpc2过表达突变菌株>野生型>Fvcpc2敲低表达突变菌株可知，Fvcpc2高表达促进菌丝生长，Fvcpc2低表达抑制菌丝生长，Fvcpc2高表达使得菌株更适应栽培料的营养环境，Fvcpc2可以作为分子选育优良菌株提供参考。

实施例3、Fvcpc2在调控金针菇子实体发育中的应用

一、对Fvcpc2突变菌株进行出菇观察实验

1、将金针菇野生型、Fvcpc2过表达突变菌株(Fvcpc2^OE#5、Fvcpc2^OE#33和Fvcpc2^OE ^#124)和Fvcpc2敲低表达突变菌株(Fvcpc2^RNAi#11、Fvcpc2^RNAi#41和Fvcpc2^RNAi#43)分别用打孔器做成大小一致的菌块(d＝5mm)，并分别接种到装有325g栽培料的组培瓶中，25℃培养，70％湿度，黑暗培养15-20天，直到所有菌株菌丝长满栽培瓶。

2、分别对每个栽培瓶进行搔菌，即用灭菌处理的手术刀轻轻刮去栽培瓶顶部的厚菌丝，继续在25℃，70％湿度，黑暗条件下培养至栽培瓶顶部长满新的菌丝，得到覆菌后的栽培瓶。

3、将覆菌后的栽培瓶在15℃，95％湿度，黑暗条件下培养，进行冷刺激，培养5-7天会有原基(金针菇最初始的子实体)长出。定期观察并拍照。

对出菇结果分析如下：在刺激出菇后的第6天，Fvcpc2过表达突变菌株有原基(原基是肉眼可见的最初始的子实体，原基的状态和数量决定了子实体的状态和产量产生)产生，而野生型菌株在刺激出菇处理后第7天产生原基，此时，Fvcpc2过表达突变菌株有更多更密集的原基。原基产生后继续低温培养，培养至第38天时，Fvcpc2过表达菌株子实体发育良好，菌柄细直且基部颜色加深，菌伞打开，已经开始进入成熟期，而此时野生型菌株菌柄还在发育中，处于伸长期，同时Fvcpc2敲低表达突变菌株仍然没有原基出现。培养至第41天时，野生型菌株进入成熟期，至此Fvcpc2敲低表达突变菌株依旧没有原基出现。由此可以看出，Fvcpc2过表达菌株比野生型提早1天产生原基，提前3天进入成熟期，而且菌株更高大(图6)，而Fvcpc2敲低表达突变菌株无原基产生，子实体发育缺陷。说明Fvcpc2是金针菇子实体发育中的关键基因，决定着原基的形成，Fvcpc2的表达量显著影响着金针菇原基的形成以及子实体的发育，是金针菇子实体发育过程中必需的正调控因子。

二、对金针菇野生型和Fvcpc2过表达突变菌株进行生物量测定实验

因为Fvcpc2敲低的菌株不产生子实体，因此对生物量的测定只限于野生型和Fvcpc2过表达突变菌株。为了更有效的进行统计，同时也为了和菇厂收割金针菇方法保持一致，本发明只对高度超过栽培瓶瓶口，即长度>6cm的子实体进行统计学分析。

结果如图7所示。结果表明：Fvcpc2过表达突变菌株普遍比野生型生物量有所增加，其中菌株Fvcpc2^OE#5生物量增加最为显著，子实体产量增加13.07±0.87％，尤其是子实体株高增加15.86±1.59％，是一株良好的增产菌株，结合提前进入成熟期的特性，在生产应用中可以缩短生产周期，减少能耗和人工成本，是一株很好的低能耗高产量的生产菌株。

实施例4、Fvcpc2在调控粗糙脉孢菌的菌丝生长和子实体发育中的应用

一、CPC-2在不同物种的有性发育时期上调表达及在多种物种中保守存在

1、CPC-2在不同物种的有性发育时期上调表达

将金针菇转录组数据中原基阶段上调表达的基因与粗糙脉孢菌转录组数据中有性发育时期上调的基因进行序列比对，找到了18个结构保守的基因。其中cpc-2(Cross-pathway control 2)是已知的在粗糙脉孢菌有性发育过程中发挥重要功能的保守基因，该基因缺失后(Δcpc-2)不能形成原子囊壳和子囊壳，即母本不育。CPC-2与金针菇里的基因相似性很高(Identity＝73％，Coverage＝99％(E＝3e-180))。此外，搜索其他真菌有性发育时期cpc-2同源基因的表达情况，发现cpc-2同源基因在镰刀菌(Fusarium graminearum，Fusarium verticillioides)、冠突曲霉(Aspergillus cristatus)、葡萄孢(Botrytisspecies)、真姬菇(Hypsizygus marmoreus)、灰盖鬼伞(Coprinopsis cinerea)、裂褶菌(Schizophyllum commune)、双孢菇(Agaricus bisporus)、灵芝(Ganoderma lucidum)和香菇(Lentinula edodes)等子囊菌和担子菌有性发育的不同阶段呈现不同程度的上调表达(表1)。该检索结果结合Δcpc-2的表型预示着cpc-2功能和结构可能共保守。

表1、cpc-2同源基因在不同真菌中的不同阶段呈现不同程度的上调表达

2、FvCPC2在多种物种中保守存在

以FvCPC2的氨基酸序列为参考序列，在NCBI中搜索不同真核生物中的同源序列，并基于不同生物中的同源序列构建系统发育树。具体步骤如下：

分别选取了动物界、植物界、子囊菌门和单子菌门中几种代表性物种，如智人(Homo.sapiens)、斑马鱼(Danio rerio)、水稻(Oryza sativa)、拟南芥(Arabidopsisthaliana)、灰盖鬼伞(Coprinopsis cinerea)、粗糙脉孢菌(Neurospora crassa、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisia)等，找到FvCPC2的同源序列构建无根树(图8)，分析系统进化树可以得出，FvCPC2与其在不同物种中的同源蛋白同源性很高，说明CPC-2功能和结构可能共保守。为了进一步验证该结论，为了明确Fvcpc2是否是结构功能共保守，以模式真菌：粗糙脉孢菌为例，用金针菇来源的Fvcpc2对粗糙脉孢菌Δcpc-2进行原位回补，同时用粗糙脉孢菌来源的cpc-2对粗糙脉孢菌Δcpc-2进行自身原位回补作为阳性对照。

二、回补载体的构建

1、质粒pCB1532-cpc-2的构建

(1)用引物cpc2-CM-3’-F和cpc2-3’-R以粗糙脉孢菌基因组DNA为模板进行PCR扩增，得到cpc-2基因的下游片段(cpc-2-down)，靶序列大小为1557bp。引物序列如下：

cpc2-CM-3’-F:5’-GACTAGTCTACACCCTTCTACCCTTCTACCC-3’；

cpc2-3’-R:5’-ACGCGTCGACTTACAAGACATCAAGACTCCTCGG-3’。

PCR反应程序为：98℃30s；98℃10s，66℃90s，72℃90s(25cycles)；72℃10min；4℃。

(2)用普通质粒小提试剂盒提取pCB1532质粒，并用限制性内切酶SpeI和SalI酶切消化该质粒，同时用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收酶切产物。

(3)用片段重组试剂盒(南京诺唯赞生物科技有限公司，货号：C113-01)将步骤(1)制备的cpc-2-down连入步骤(2)酶切回收后的pCB1532，并进行大肠杆菌转化和验证，得到质粒pCB1532-cpc-2-down。

(4)用引物cpc2-CM-5’-F和cpc2-5’-R以粗糙脉孢菌基因组DNA为模板进行PCR扩增，得到cpc-2基因的上游片段(cpc-2-up)，靶序列大小为3884bp。引物序列如下：

cpc2-CM-5’-F:5’-AATGGGCCCGACACCAAGGCGAAAGGCAG-3’；

cpc2-5’-R:5’-AATGGGCCCGTGGTGTGAAGGGAGATTTAGCATA-3’。

PCR反应程序为：98℃30s；98℃10s，68℃90s，72℃4min(25cycles)；72℃10min；4℃。

(5)用普通质粒小提试剂盒提取质粒pCB1532-cpc-2-down，并用限制性内切酶SalI酶切消化该质粒，同时用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收酶切产物。

(6)用片段重组试剂盒(南京诺唯赞生物科技有限公司，货号：C113-01)将步骤(4)制备的cpc-2-up片段连入步骤(5)酶切回收后的pCB1532-cpc-2-down，得到质粒pCB1532-cpc-2。

质粒pCB1532-cpc-2为将cpc-2-up和cpc-2-down用重组试剂盒在SpeI和SalI酶切位点与质粒pCB1532融合后得到的载体。

2、质粒pCB1532-Fvcpc2的构建

(1)用引物New-RH-cpc2-P和RH-cpc2-P-R以金针菇基因组DNA为模板进行PCR扩增，得到cpc-2启动子片段(Pcpc-2)，靶序列大小为1738bp。引物序列如下：

New-RH-cpc2-P:5’-ACGCGTCGACATACCCAAGGACTTCGAAAACACTT-3’；

RH-cpc2-P-R:5’-CTGAAGCCATCCTTTCTGGTTGATCAGGGGA-3’。

PCR反应程序为：98℃30s；98℃10s，59℃90s，72℃2min(25cycles)；72℃10min；4℃。

(2)用引物RH-cpc2-T-F和New-RH-cpc2-T-R以质粒pCSN44为模板进行PCR扩增，得到cpc-2终止子片段(Tcpc-2)，靶序列大小为757bp。引物序列如下：

RH-cpc2-T-F:5’-ACCAGAAAGGATGGCTTCAGACCAATTGCG-3’；

New-RH-cpc2-T-R:5’-TCCGACGTCTTTATGAGGTGACAGTCCAGACACG-3’。

(3)用引物RH-cpc2-T-F和New-RH-cpc2-T-R以金针菇基因组cDNA为模板进行PCR扩增，得到金针菇Fvcpc2-CDS片段，靶序列大小为948bp。引物序列如下：

RH-cpc2-T-F:5’-CACCTCATAAAGACGTCGGAGCCGGGACT-3’；

New-RH-cpc2-T-R:5’-GGGGTACCGAGGACGACTTGAGTGAGCGG-3’。

PCR反应程序为：98℃30s；98℃10s，66℃90s，72℃60s(25cycles)；72℃10min；4℃。

(4)用片段重组试剂盒(南京诺唯赞生物科技有限公司，货号：C113-01)将步骤(1)-(3)制备的Pcpc-2、Fvcpc2-CDS和Tcpc-2片段连入酶切回收后的pCB1532质粒，得到质粒pCB1532-Fvcpc2。

质粒pCB1532-Fvcpc2为将Pcpc-2、Fvcpc2-CDS和Tcpc-2用重组试剂盒在SpeI和SalI酶切位点与质粒pCB1532融合后得到的载体。

三、粗糙脉孢菌电转化及转化子筛选

分别将步骤一制备的质粒pCB1532-cpc-2和pCB1532-Fvcpc2转化粗糙脉孢菌cpc-2缺失突变株(Δcpc-2)，分别得到回补菌株：粗糙脉孢菌cpc-2回补Δcpc-2的菌株cpc-2；Δcpc-2和金针菇Fvcpc2回补粗糙脉孢菌Δcpc-2的菌株Fvcpc2；Δcpc-2。具体步骤如下：

1、电转化

(1)冰上预冷离心管及1M山梨醇。

(2)将2mL预冷的1M山梨醇加入培养7天的粗糙脉孢菌cpc-2缺失突变株(Δcpc-2)孢子斜面试管中，在涡旋振荡器上振荡，得到孢子液；然后将孢子液倒入预冷的2mL离心管中，4℃、4000rpm离心2min。

(3)弃上清，去掉菌丝，将孢子液悬浮在剩余的液体中，用枪吹吸混匀并转入新的预冷的2mL离心管中。

(4)加入1mL预冷的1M山梨醇，用枪吹吸几次清洗孢子，4℃、4000rpm离心2min。此操作重复3次。

(5)将孢子悬浮在剩余的液体中，调整孢子浓度至2.5×10⁹个/mL，将孢子分装成40μL/管。

(6)在孢子悬液中分别加入2μg质粒(2～5μL)(pCB1532-cpc-2或pCB1532-Fvcpc2)，用枪吹吸混匀，冰浴2h。

(7)处理电击杯：75％的乙醇浸泡10min，蒸馏水冲洗，晾干，紫外灯照射灭菌30min。

(8)倒底层培养基：20mL粗糙脉孢菌电转培养基/15cm平板，底层培养基中加入7.5μL 50mg/mL的氯嘧磺隆至终浓度为15μg/mL。

(9)电转：1500v，25μf，600Ω，立即加入1mL预冷的1M山梨醇，用枪吹吸混匀，转入新的离心管。

(10)将孢子液与50℃的10mL粗糙脉孢菌电转培养基混匀，铺在底层培养基上。

(11)28℃培养2～3天。

2、转化子筛选

将长出的转化子挑出，提取DNA，分别用引物对1532P2374/cpc2-detect-5’-F(靶序列大小为5188bp)和1532P467R/cpc2-detect-3’-R(靶序列大小为4938bp)进行PCR验证，分别得到回补菌株：金针菇Fvcpc2回补粗糙脉孢菌Δcpc-2的菌株Fvcpc2；Δcpc-2和粗糙脉孢菌cpc-2回补Δcpc-2的菌株cpc-2；Δcpc-2。引物序列如下：

1532P2374:5’-GTTCTACGAGGACCGCTACTCACATAC-3’；

cpc2-detect-5’-F:5’-GGCAACGACAGCACCCACT-3’；

1532P467R:5’-GTTTGTTCGCTCGCTCGTGATTCTG-3’；

cpc2-detect-3’-R:5’-TCGTTTGTAAATGAGAGAGGTACGG-3’。

PCR反应程序为：94℃5min；94℃50s，60℃90s，72℃5min(25cycles)；72℃10min；4℃。

四、Fvcpc2正向调控粗糙脉孢菌子实体发育

对粗糙脉孢菌野生型、cpc-2缺失突变株(Δcpc-2)和回补菌株(Fvcpc2；Δcpc-2和cpc-2；Δcpc-2)进行有性发育分析，具体步骤如下：收集粗糙脉孢菌野生型(FGSC#4200，a)、cpc-2缺失突变株(Δcpc-2)和回补菌株(Fvcpc2；Δcpc-2和cpc-2；Δcpc-2)的孢子，并稀释到2×10⁶个/mL浓度，分别点2μL孢子在覆有滤纸的杂交平板中央，进行25℃黑暗培养6天后观察。

结果如图9所示。cpc-2缺失突变株(Δcpc-2)在杂交培养基上只能进行菌丝生长，没有原子囊壳(粗糙脉孢菌的初级子实体)产生。与此同时，回补菌株Fvcpc2；Δcpc-2和野生型、cpc-2；Δcpc-2都能在杂交培养基上产生原子囊壳。产生原子囊壳后在杂交平板四周点上父本孢子(FGSC#2225，A，2×10⁶个/mL，2μL孢子)后继续黑暗25℃培养8天后观察并拍照。cpc-2缺失突变株(Δcpc-2)依然只能进行菌丝生长，而野生型和回补菌株Fvcpc2；Δcpc-2和cpc-2；Δcpc-2在滤纸上产生子囊壳(粗糙脉孢菌的子实体)。说明Fvcpc2能够回补敲除cpc-2后造成的原子囊壳和子囊壳缺失的缺陷，金针菇的FvCPC2和粗糙脉孢菌的CPC-2在粗糙脉孢菌子实体发育过程中发挥相同的功能。

五、Fvcpc2正向调控粗糙脉孢菌菌丝生长和产孢

1、菌丝生长

粗糙脉孢菌cpc-2缺失突变株(Δcpc-2)不仅有性发育受到阻断，而且菌丝的无性发育也受到影响，表现为菌丝生长相对于野生型减弱，生长速率变慢，产孢量降低。为了明确Fvcpc2在粗糙脉孢菌无性发育中的功能，将粗糙脉孢菌野生型(FGSC#4200)、cpc-2缺失突变株(Δcpc-2)和回补菌株(Fvcpc2；Δcpc-2和cpc-2；Δcpc-2)的菌块(d＝5mm)，分别接种在Vogel’s平板中央于28℃培养，进行生长速率测定，每小时测量并记录菌丝生长长度。

结果如图10所示，Δcpc-2相比于野生型(0.41±0.006cm/h)降低到0.29±0.03cm/h，而回补菌株cpc-2；Δcpc-2和Fvcpc2；Δcpc-2的菌丝生长速率分别达到0.41±0.014和0.39±0.02cm/h，恢复菌丝正常生长。

2、产孢

将粗糙脉孢菌野生型(FGSC#4200)、cpc-2缺失突变株(Δcpc-2)和回补菌株(Fvcpc2；Δcpc-2和cpc-2；Δcpc-2)孢子(2×10⁶个/mL，2μL孢子)接种于Vogel’s斜面上，在28℃培养8天后洗下孢子并统计。

Δcpc-2菌株孢子浓度相对于野生型(12.07±1.62×10⁷个/mL)下降了45.32±0.2％(6.6±0.2×10⁷个/mL)，而回补菌株(cpc-2；Δcpc-2和Fvcpc2；Δcpc-2)的孢子浓度均恢复到野生型水平，分别为13.07±0.95×10⁷个/mL和13.4±1.25×10⁷个/mL。说明，Fvcpc2在粗糙脉孢菌中能补足cpc-2缺失后造成的菌丝生长及产孢的缺陷，即在粗糙脉孢菌无性发育过程中Fvcpc2发挥着与cpc-2相似的功能。

由以上结果可知，Fvcpc2回补Δcpc-2之后，菌丝生长、产孢和有性发育都恢复到野生型水平。表明金针菇的FvCPC2和粗糙脉孢菌的CPC-2在无性发育和有性发育过程中发挥相同的功能，FvCPC2不仅结构保守，而且功能保守。结合FvCPC2在不同食用菌基因组中的进化保守性(图8)和转录组数据中在子实体发育阶段上调的功能保守性(表1)，说明FvCPC2不仅正向调控金针菇和粗糙脉孢菌的菌丝生长和子实体发育，同样也调控在基因组上保守存在的其他食用菌的菌丝生长和子实体发育，即FvCPC2对食用菌(包括真姬菇、双孢菇、灵芝、香菇、金针菇和草菇)子实体发育的功能具有普适性，在对不同种食用菌(包括真姬菇、双孢菇、灵芝、香菇、金针菇和草菇)的基因工程育种方面也具有普适性。

序列表

<110>中国科学院微生物研究所

<120>FvCPC2蛋白及其编码基因在调控多种食用菌菌丝生长和子实体发育中的应用

<160>2

<170>PatentIn version 3.5

<210>1

<211>1273

<212>DNA

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<400>1

atggcttcag accaattgcg gttcctcgga tctctggaag ggcacaaagg atgggttacc 60

gctatcgcga catcgcagga gaacccagac atgatcctca ccgcctctag aggtatcatc 120

gcgccgactt ttcgcactcc aaggctaaaa aatatttcgc agacaaaact atcattgtgt 180

ggcagcttac ccgcgacgag gattcctacg gttatcccaa acgcatcctt actggccaca 240

accacttcgt ttccgacgtc gttatttcgt ccgatggtca atttgccctc tcttcatcct 300

gggaccacac tctccgtctt tgggatttga acaccggcgc cacgacccgt cgcttcgtcg 360

gccacacctc cgatgtcctg tccgtcagct tcagtgctga taacaggcag atcgtctctg 420

gttctcgcga caagactatc aaactctgga atactttagg agagtgcaaa tacgatatca 480

aagatgagtg tcacaccgaa tggtacgtct ccaatccagc gaaaggtgta ctcggcctga 540

caatttactt agggtatcct gcgtgaggtt cagccctaac gtttcgaacc ccgtcattgt 600

ctcgtgcggt tgggatcgtg tagtgaaggt aagccctgcg ttcttcctac cagatcaagt 660

cattcccgtt cgctatgatg cattatcttt aatatttgct acttcagagg acctcgtcca 720

atgagactaa ttttccacca agatctctga gcttccttcg tcgaattcgt tttctatgga 780

ccgctaactt acttttatcc accaggtctg ggaactctcg aagttcaagc tgaagaccaa 840

ccactacgga cacactggat acatcaacac cgtttccgtc tcccccgatg gttcactggc 900

tgcctcaggt ggcaaggacg gtatcaccat gctctgggac ctcaacgagg gcaagcacct 960

ctactccctc gaggccggcg atattgtcaa cgccctcgtg ttctcgccca accgatactg 1020

gctctgtgca gctaccgcaa gctgtgtcaa gatcttcgat ctcgagagca agtaagcatt 1080

gggcatgatc atgtaacgtc agctaaatgt cctcctcagg tctatcgttg atgagctcaa 1140

gcctgcctac accgacgtgc aggacgaagg aaggcaaccc gagtgtgtct ccattgcatg 1200

gtctgcagat ggtcagactc tgttcgctgg cttcaccgac aaccagctcc gtgtctggac 1260

tgtcacctca taa 1273

<210>2

<211>315

<212>PRT

<213>人工序列(Artificial Sequence)

<400>2

Met Ala Ser Asp Gln Leu Arg Phe Leu Gly Ser Leu Glu Gly His Lys

1 5 10 15

Gly Trp Val Thr Ala Ile Ala Thr Ser Gln Glu Asn Pro Asp Met Ile

20 25 30

Leu Thr Ala Ser Arg Asp Lys Thr Ile Ile Val Trp Gln Leu Thr Arg

35 40 45

Asp Glu Asp Ser Tyr Gly Tyr Pro Lys Arg Ile Leu Thr Gly His Asn

50 55 60

His Phe Val Ser Asp Val Val Ile Ser Ser Asp Gly Gln Phe Ala Leu

65 70 75 80

Ser Ser Ser Trp Asp His Thr Leu Arg Leu Trp Asp Leu Asn Thr Gly

85 90 95

Ala Thr Thr Arg Arg Phe Val Gly His Thr Ser Asp Val Leu Ser Val

100 105 110

Ser Phe Ser Ala Asp Asn Arg Gln Ile Val Ser Gly Ser Arg Asp Lys

115 120 125

Thr Ile Lys Leu Trp Asn Thr Leu Gly Glu Cys Lys Tyr Asp Ile Lys

130 135 140

Asp Glu Cys His Thr Glu Trp Val Ser Cys Val Arg Phe Ser Pro Asn

145 150 155 160

Val Ser Asn Pro Val Ile Val Ser Cys Gly Trp Asp Arg Val Val Lys

165 170 175

Val Trp Glu Leu Ser Lys Phe Lys Leu Lys Thr Asn His Tyr Gly His

180 185 190

Thr Gly Tyr Ile Asn Thr Val Ser Val Ser Pro Asp Gly Ser Leu Ala

195 200 205

Ala Ser Gly Gly Lys Asp Gly Ile Thr Met Leu Trp Asp Leu Asn Glu

210 215 220

Gly Lys His Leu Tyr Ser Leu Glu Ala Gly Asp Ile Val Asn Ala Leu

225 230 235 240

Val Phe Ser Pro Asn Arg Tyr Trp Leu Cys Ala Ala Thr Ala Ser Cys

245 250 255

Val Lys Ile Phe Asp Leu Glu Ser Lys Ser Ile Val Asp Glu Leu Lys

260 265 270

Pro Ala Tyr Thr Asp Val Gln Asp Glu Gly Arg Gln Pro Glu Cys Val

275 280 285

Ser Ile Ala Trp Ser Ala Asp Gly Gln Thr Leu Phe Ala Gly Phe Thr

290 295 300

Asp Asn Gln Leu Arg Val Trp Thr Val Thr Ser

305 310 315

Claims

1.FvCPC2蛋白质在如下任一中的应用：

(a1)调控食用菌菌丝生长；

(a2)调控食用菌子实体发育；

(a3)调控食用菌生物量和/或产量；

(a4)调控食用菌出菇周期；

(a5)调控真菌菌丝生长；

(a6)调控真菌子实体发育；

(a7)调控真菌产孢水平；

所述FvCPC2蛋白质为如下a)或b)或c)或d)的蛋白质：

a)氨基酸序列是序列2所示的蛋白质；

2.与权利要求1中所述的FvCPC2蛋白质相关的生物材料在如下任一中的应用：

(a1)调控食用菌菌丝生长；

(a2)调控食用菌子实体发育；

(a3)调控食用菌生物量和/或产量；

(a4)调控食用菌出菇周期；

(a5)调控真菌菌丝生长；

(a6)调控真菌子实体发育；

(a7)调控真菌产孢水平；

所述与权利要求1中所述的FvCPC2蛋白质相关的生物材料为下述A1)至A8)中的任一种：

A1)编码权利要求1中所述的FvCPC2蛋白质的核酸分子；

A2)含有A1)所述核酸分子的表达盒；

A3)含有A1)所述核酸分子的重组载体；

A4)含有A2)所述表达盒的重组载体；

A5)含有A1)所述核酸分子的重组微生物；

A6)含有A2)所述表达盒的重组微生物；

A7)含有A3)所述重组载体的重组微生物；

A8)含有A4)所述重组载体的重组微生物。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：A1)所述核酸分子为如下1)或2)或3)所示的基因：

1)其编码序列是序列1所示的cDNA分子或基因组DNA分子；

2)与1)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码权利要求1中所述的FvCPC2蛋白质的cDNA分子或基因组DNA分子；

3)在严格条件下与1)或2)限定的核苷酸序列杂交，且编码权利要求1中所述的FvCPC2蛋白质的cDNA分子或基因组DNA分子。

4.根据权利要求1-3任一所述的应用，其特征在于：

所述调控为促进或提高；

或，所述调控食用菌生物量和/或产量体现在如下(c1)-(c3)中任一种：

(c1)提高食用菌子实体数量；

(c2)提高食用菌子实体高度；

(c3)提高食用菌子实体湿重；

或，所述调控食用菌出菇周期体现在促进金针菇的原基期和/或成熟期提前。

5.根据权利要求1-4任一所述的应用，其特征在于：

所述食用菌为真姬菇、双孢菇、灵芝、香菇、金针菇或草菇；所述食用菌具体可为金针菇；

或，所述真菌为粗糙脉孢菌。

6.一种培育产量高和/或出菇周期短的转基因食用菌的方法，包括提高受体食用菌中权利要求1中所述的FvCPC2蛋白质的表达量和/或活性，得到转基因食用菌的步骤；所述转基因食用菌的产量高于所述受体食用菌和/或所述转基因食用菌的出菇周期短于所述受体食用菌。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：

所述转基因食用菌的产量高于所述受体食用菌体现在如下(d1)-(d3)中任一种：

(d1)转基因食用菌的子实体数量多于所述受体食用菌；

(d2)转基因食用菌的子实体高度高于所述受体食用菌；

(d3)转基因食用菌的子实体湿重大于所述受体食用菌；

或，所述转基因食用菌的出菇周期短于所述受体食用菌体现在转基因食用菌的原基期和/或成熟期早于所述受体食用菌；

或，所述提高受体食用菌中权利要求1中所述的FvCPC2蛋白质的表达量和/或活性的方法为在受体食用菌中过表达权利要求1中所述的FvCPC2蛋白质；

或，所述过表达的方法为将权利要求1中所述的FvCPC2蛋白质的编码基因导入受体食用菌；

或，所述权利要求1中所述的FvCPC2蛋白质的编码基因通过重组载体导入受体食用菌；

或，所述权利要求1中所述的FvCPC2蛋白质的编码基因是序列1所示的DNA分子；

或，所述受体食用菌为金针菇。

8.一种培育菌丝生长缓慢和/或子实体发育缺陷的转基因食用菌的方法，包括降低受体食用菌中权利要求1中所述的FvCPC2蛋白质的表达量和/或活性，得到转基因食用菌的步骤；所述转基因食用菌菌丝生长缓慢和/或子实体发育缺陷。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：所述降低受体食用菌中权利要求1中所述的FvCPC2蛋白质的表达量和/或活性的方法是通过对所述受体食用菌中权利要求1中所述的FvCPC2蛋白质的编码基因进行敲除或抑制表达来实现。

10.一种培育菌丝生长速率提高和/或产孢水平提高的真菌的方法，包括提高受体菌中权利要求1中所述的FvCPC2蛋白质的表达量和/或活性的步骤；

所述受体菌为缺失cpc-2的粗糙脉孢菌。