EP1346057A2 - Verfahren zum herstellen von heterologen proteinen in einem homothallischen pilz der familie sordariaceae - Google Patents

Verfahren zum herstellen von heterologen proteinen in einem homothallischen pilz der familie sordariaceae

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Publication number
EP1346057A2
EP1346057A2 EP01988083A EP01988083A EP1346057A2 EP 1346057 A2 EP1346057 A2 EP 1346057A2 EP 01988083 A EP01988083 A EP 01988083A EP 01988083 A EP01988083 A EP 01988083A EP 1346057 A2 EP1346057 A2 EP 1346057A2
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
fungus
promoter
terminator
nucleic acid
macrospora
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP01988083A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Ulrich Kück
Stefanie PÖGGELER
Sandra Masloff
Minou Nowrousian
Oliver Bartelsen
Gerd Gellissen
Michael Pfeil
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Gellissen Gerd Prof Dr
Dynavax GmbH
Original Assignee
Gellissen Gerd Prof Dr
Rhein Biotech GmbH
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Filing date
Publication date
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Application filed by Gellissen Gerd Prof Dr, Rhein Biotech GmbH filed Critical Gellissen Gerd Prof Dr
Publication of EP1346057A2 publication Critical patent/EP1346057A2/de
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/14—Fungi; Culture media therefor
    • C12N1/145—Fungal isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/645—Fungi ; Processes using fungi

Definitions

  • the present invention relates to methods for producing heterologous protein in a filamentous fungus and to promoters suitable therefor.
  • the present invention further relates to vectors and host cells and to a kit and their use.
  • Genetic engineering methods allow the establishment of expression systems for the production of recombinant proteins.
  • different microorganisms or cell lines were developed and used as host systems.
  • a host was determined according to the criteria of availability, the economy of a production process based on it, the area of application and the properties of the protein to be produced.
  • Mammalian cells are therefore used to produce proteins that require complex mammalian glycosylation.
  • mammalian cell systems are very expensive; the cells are also a potential target for pathogenic viruses.
  • Yeasts and filamentous fungi have a glycosylation pattern that differs from the complex mammalian type, but they can be used for a large number of products.
  • eukaryotic microorganisms they are capable of secretion and can act like bacteria fermented on inexpensive media in large cell densities. Since the culture media contain neither serum nor other potential contaminants, the heterologous protein produced can be purified easily and inexpensively.
  • yeasts such as S. cerevisiae and the methylotrophic yeast Hansenula polymorpha.
  • heterologous proteins in filamentous fungi are the inactivation systems for heterologous DNA, which are particularly effective when heterologous DNA is inserted into the genome of the fungus.
  • the gene inactivation e.g. Very well described for Neurospora crassa or Ascobolus immersus, it can take place at different levels, i.e. the transcriptional or the posttranscriptional level. Similar phenomena have also been described in transgenic plants. An overview of this can be found in Cogoni and Macino (1999).
  • the object of the present invention is therefore to provide a method for producing heterologous protein in a filamentous fungus, which allows efficient production of heterologous proteins and in which contamination of the protein produced by vegetative spores is avoided.
  • this object is achieved by a method for producing heterologous protein in a filamentous fungus, which comprises cultivating a homothallic fungus of the Sordariaceae family which contains an expression cassette which contains the following elements in functional combination:
  • a “heterologous gene” denotes a coding nucleic acid sequence that comes from a different gene than the promoter contained in the expression cassette.
  • homothallic fungi of the Sordariaceae family do not develop macroconidia or microconidia, since they reproduce exclusively sexually. Athrospores, which are formed by the decay of the hyphae, are also not to be found. Contamination of the protein produced with vegetative spores, which is a major problem in the production of pharmaceutically relevant proteins with filamentous fungi, is thus avoided.
  • the Sordariaceae family belongs to the class of Ascomycetes (hose fungi), which according to Strasburger (textbook of botany) is classified in the order of the Sphaeriales (Sordaria- les).
  • hose fungi hose fungi
  • Strasburger textbook of botany
  • Sphaeriales Sphaeriales
  • Sordaria- les the life cycle of homothallic fungi of the Sordariaceae family
  • the life cycle of Sordaria macrospora can be described as follows write: This mushroom is a haplo-dikaryote that only reproduces sexually. Vegetative spores, eg conidiospores, are not formed by this fungus.
  • the fungus is homothallic, that is, it has a monocia that is not overlaid by incompatibility and can therefore reproduce sexually through selfing (K.
  • the fertilization process that precedes sexual reproduction is referred to as autogamous.
  • the sexual ascospores are formed in asci (tubes).
  • the ascospores are actively thrown out of the perithecia.
  • the ascospores are absorbed by the food of herbivores and are released after a gastrointestinal passage.
  • the gastrointestinal passage is a prerequisite for the subsequent germination of the spores on the herbivore manure.
  • the homothallic fungus of the Sordariaceae family which is used in the method according to the invention is preferably a fungus of the genus Sordaria.
  • Homothallic fungi of the Sordariaceae family which are particularly preferred for carrying out the invention are Sordaria macrospora or Sordaria fimicola; other homothallic fungi of the same family which are suitable for carrying out the method according to the invention are Neurospora linoleata, Neurospora africana, Neurospora dodgei, Neurospora galapagosensis, Neurospora pannonica and Neurospora terricola.
  • Sordaria macrospora like Sordaria fimicola, is a coprophilic saprophyte that grows on herbivore manure. The hyphae is taxonomically classified in the department of Eumycota and is therefore one of the higher fungi that have chitin walls. The entire life cycle of Sordaria macrospora is completed within seven days under laboratory conditions. The life cycle is therefore considerably shorter than the four-week cycle of Neurospora crassa. Molecular biological work on the strain development of S. macrospora can therefore be carried out in a considerably shorter time.
  • Codon use in the host organism is crucial for optimal expression of heterologous genes.
  • Table 1 The list of the most common amino acid codons within protein-coding genes in Table 1 shows that there is an astonishing match between the most frequently used amino acid codons in Sordaria macrospora, Drosophila melanogaster and primates. In contrast, there are clear differences to E. coli and Saccharomyces cerevisiae. Due to the similarity of codon usage, S. macrospora is an excellent host system for the production of heterologous proteins of human origin.
  • Homothali mushrooms of the Sordariaceae family can be grown easily and inexpensively in laboratory cultures. As eukaryotic microorganisms, they are also able to make post-translational modifications to recombinant eukaryotic proteins. Another argument in favor of the biotechnical use of homothallic fungi from the Sordariaceae family is that they are not organisms that are pathogenic to humans, animals or plants. Furthermore, recombinant strains of Sordaria macrospora can be produced by genetic engineering methods in combination with classic (conventional) crosses, a considerable advantage over imperfect fungi of the genus Aspergillus.
  • Sterile mutant strains which can be obtained, for example, by mutagenizing protoplasts with EMS or by irradiation with UV light, have no propagation structures and therefore do not produce ascospores.
  • sterile mutants of S. macrospora (Esser and Straub, 1958; Masloff et al., 1999; Nowrosian et al., 1999) can be used in the method according to the invention for producing heterologous protein.
  • the cultivation of the homothallic fungus used to produce heterologous protein preferably takes place at a temperature of 27 ⁇ 2 ° C. This growth optimum is significantly lower than that of Neurospora crassa, which is above 30 ° C. As an important safety-relevant aspect, it should be noted that S. macrospora dies at temperatures of more than 32 ° C.
  • the promoter active in the fungus of the Sordariaceae family comes from a filamentous fungus.
  • This promoter can be, for example, the gpd promoter from Aspergillus nidulans, but the promoter is preferably a promoter from Sordaria macrospora.
  • Particularly preferred promoters are the cpc2 promoter, the nc / Zcf promoter, the ac / promoter or the pp ⁇ / v promoter from Sordaria macrospora.
  • the S. macrospora cpc2 promoter and td / c7 promoter are described below.
  • the ac / 7 gene from S. macrospora was developed by Nowrousian et al. (1999).
  • the ppgl gene from S. macrospora was described by Pöggeler (2000).
  • the terminator active in the fungus of the Sordariaceae family preferably comes from a filamentous fungus.
  • the terminator can be, for example, the f / pC terminator from Aspergillus nidulans (Mullaney et al., 1985) or a terminator from Sordaria macrospora.
  • Particularly preferred terminators from S. macrospora are the cpc2 and t7c./7 terminators described here, the ac / 7 terminator (Nowrosian et al., 1999) and the ppgf terminator (Pöggeler, 2000).
  • the heterologous gene preferably codes for a protein glycosylated after expression in eukaryotes.
  • the heterologous gene can be, for example, a growth factor, a cytokine, a coagulation factor, an industrial protein or a act technical enzyme.
  • the heterologous gene particularly preferably codes for one of the following proteins: G-CSF, GM-CSF, IL-1, IL-2, IL-4, IL-6, IL-1ra, IFN-, IFN-ß, IFN- ⁇ , Erythropoietin, glucoamylase, coagulation factor VIII, coagulation factor XII, coagulation factor XIII, human serum albumin.
  • a sequence is arranged between the promoter and the heterologous gene in reading frame with the heterologous gene, which encodes a signal sequence that functions in the fungus of the Sordariaceae family.
  • the signal sequence is preferably a signal sequence derived from a filamentous fungus, for example the signal sequence of Aspergillus niger glucoamylase (Gordon et al. 2000; Gouka et al. 1997).
  • Signal sequences from Sordaria macrospora e.g. the signal sequence of the S. macrospora ppgl gene are particularly preferred.
  • Another object of the invention is to provide promoters which can be used in the method according to the invention for the production of heterologous protein.
  • nucleic acid molecule that:
  • a promoter active in a homothallic fungus of the Sordariaceae family which is selected from the following nucleic acids:
  • % identity refers to identity at the DNA level, which according to known methods, e.g. of computer-aided sequence comparisons (Altschui et al., 1990) can be determined.
  • identity known to those skilled in the art denotes the degree of relationship between two or more DNA molecules, which is determined by the match between the sequences. The percentage of “identity” results from the percentage of identical regions in two or more sequences below Consideration of gaps or other sequence peculiarities.
  • the identity of related DNA molecules can be determined using known methods. As a rule, special computer programs with algorithms that take account of the special requirements are used. Preferred methods for determining identity initially produce the greatest agreement between the sequences examined. Computer programs for determining identity between two sequences include, but are not limited to, the GCG program package, including GAP (Devereux et al., 1984; Genetics Computer Group University of Wisconsin, Madison, (WI)); BLASTP, BLASTN and FASTA (Altschul at al., 1990).
  • the BLAST X program can be obtained from the National Center for Biotechnology Information (NCBI) and from other sources (BLAST Handbuch, Altschul S. et al., NCB NLM NIH Bethesda MD 20894; Altschul et al., 1990).
  • NCBI National Center for Biotechnology Information
  • the well-known Smith Waterman algorithm can also be used to determine identity.
  • Preferred parameters for sequence comparison include the following:
  • the GAP program is also suitable for use with the above parameters.
  • the above parameters are the default parameters for nucleic acid sequence comparisons.
  • gap opening penalties can be used.
  • the selection will depend on the comparison to be performed and also on whether the comparison is carried out between pairs of sequences, GAP or Best Fit being preferred, or between a sequence and an extensive sequence database, with FASTA or BLAST being preferred.
  • sequence which hybridizes with the counter strand of a sequence according to (a) or (b) indicates a sequence which hybridizes under stringent conditions with the counter strand of a sequence with the features specified under (a) or (b).
  • the hybridizations can be carried out at 68 ° C. in 2 ⁇ SSC. Examples of stringent conditions are described in Sambrook et al. (1989).
  • sequences given in SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 2 correspond to the promoter sequence of the ndkl or cpc2 gene isolated from S. macrospora.
  • the nucleic acid specified in (c) can also have at least 60%, 70%, 80% or 90% identity with one of the sequences specified in (a) or (b). It particularly preferably has 95% identity with one of these sequences.
  • the invention further provides a vector for transforming a homothallic fungus of the Sordariaceae family, which contains the following elements in functional connection with one another: a promoter active in the fungus of the Sordariaceae family,
  • the promoter of the vector according to the invention active in the fungus of the Sordariaceae family can be the grpc / promoter from Aspergillus nidulans.
  • the nucleic acids described in (1) above are particularly preferred as promoters.
  • the Sordaria macrospora ac / 7 and pp ⁇ / f promoters are also preferred.
  • the terminator contained in the vector according to the invention can be the f / pC terminator from Aspergillus nidulans, but the cpc2 terminator, the nd / fZ terminator, the ac / 7 terminator or the ppgv terminator from Sordaria macrospora are special prefers.
  • Suitable selection markers are, for example, the ura5 gene from Sordaria macrospora (Le Chevanton and Lebion, 1989) or Podospora anserina (Turcq and Begueret, 1987).
  • a hygromycin B resistance gene is preferably used as the selection marker.
  • the invention also provides a host organism.
  • This host organism is a homothallic fungus of the Sordariaceae family which contains a vector according to the invention.
  • the host organism preferably belongs to the genus Sordaria; the host organism Sordaria macrospora or Sordaria fimicola is particularly preferred.
  • the host organism is a sterile strain which does not form asexual mitospores or sexual meiospores.
  • the invention further provides a kit that:
  • the nucleic acid molecule, the vector, the host organism and the kit according to the invention can be used to express a heterologous gene under the control of the promoter or used to make one or more proteins.
  • Figure 1 shows the autoradiogram of a Northem hybridization.
  • 5 ⁇ g of S. macrospora mRNA was applied, in the odd lanes from the wild-type strain, in the even lanes from the sterile mutant inf.
  • the acll gene (lane 1, 2), the cpc2 gene (lane 3, 4), the ndk1 gene (lane 5, 6) and the ppg 7 gene (lane 7, 8) were used as the probe.
  • tracks 1, 2 there is an ac / 7 transcript of the size 2.7 kb, in tracks 3, 4 a cpc2 transcript of 1.7 kb, in tracks 5, 6 a ⁇ d / d transcript of 1 , 5 kb and in lanes 7, 8 a ppg 7 transcript of 0.65 kb.
  • FIG. 2 shows the nucleotide sequence of the r? C./c1 gene (partial fragment) from S. macrospora, including the promoter region of approx. 1.4 Kb.
  • FIG. 3 shows the nucleotide sequence of the cpc2 gene from Sordaria macrospora and the amino acid sequences derived therefrom.
  • the intron sequences (4) are marked by underlining, the promoter is located in the section of nucleotide 1-2611, the termination sequence can be found in the area between nucleotide 4258 and nucleotide 4539.
  • Figure 4 shows the cloning scheme for the expression vector pMN110.
  • FIG. 5 shows the nucleotide sequence (promoter and terminator) of the plasmid pMN110.
  • the sequences are derived from the S. macrospora ac / 1 gene.
  • Figure 6 shows the cloning scheme for the expression vector pMN112.
  • FIG. 7 shows the physical-genetic map of the plasmid pMN112.
  • FIG. 8 shows the physical-genetic map of the plasmid pSMY1-1.
  • FIG. 9 shows the nucleotide sequence in the vicinity of the ATG start codon of the / acZ gene of the plasmid pSMYL
  • Figure 10 shows the physical-genetic map of the plasmid pSMY4-1.
  • Figure 11 shows the cloning scheme for the expression vector pSMY3.
  • Figure 12 shows the physical-genetic map of the plasmid pPROM
  • Figure 13 shows the physical-genetic map of the plasmid pTERMI.
  • FIG. 14 shows the physical-genetic map of the plasmid pSMY2.
  • FIG. 15 shows the physical-genetic map of the plasmid pSMY3.
  • FIG. 16 shows the nucleotide sequence of the insert fragment of the plasmid pSMY3.
  • FIG. 17 shows the physical-genetic map of the plasmid pSE40-6.
  • Figure 18 shows the physical-genetic map of the plasmid pSE43-2.
  • FIG. 19 shows microscopic images of transgenic S. macrospora strains (T1p40-6, T1p43-2) which carry the plasmids pSE40-6 and pSE43-2, (a) interference microscopic and (b) fluorescence microscopic images.
  • Figure 20 shows the physical-genetic map of the plasmid pSMY5-1.
  • Figure 21 shows the physical-genetic map of the plasmid GV-MCS.
  • Figure 22 shows the physical-genetic map of the plasmid GV-ndk1-MCS-acl1.
  • Figure 23 shows the physical-genetic map of the plasmid GV-cpc2-MCS-acl1.
  • FIG. 24 shows the plasmid pEGFP / gpd / tel, which served as the starting plasmid for the cloning of the plasmids pSM1 and pSM2.
  • Figure 25 shows the cloning scheme of the plasmid pSM1.
  • Figure 26 shows the cloning scheme of the plasmid pSM2.
  • FIG. 27 shows the fluorescence microscopic analysis of Asci with ascospores of S. macrospora transformants which carry the plasmid pEGFP / gpd / tel.
  • the strain shown comes from a cross between the S. macrospora Transformande T-EG2 and the color-saving mutant of S. macrospora FUS1. The latter carries no g p gene.
  • FIG. 28 shows microscopic images of a transgenic S. macrospora strain which expresses the EGFP gene under the control of the rttf / cf promoter. (a) interference microscopic and (b) fluorescence microscopic image.
  • GM minimal medium: 2% glucose, 0.7% Bacto Yeast Nitrogen Base, 0.4 ⁇ M biotin,
  • - LB 1% Bacto-Trypton, 0.5% yeast extract, 0.5% NaCI, pH 7.2
  • MM minimal medium: 55.5 mM glucose, 1.8 mM KH 2 PO, 1.7 mM K 2 HPO 4l 8.3 mM
  • S. macrospora is grown on solid media for fructification; The fructification can be observed after only 7 days of culture become.
  • S. macrospora is grown on liquid media for nucleic acid preparations, usually in stand cultures in Fernbach flasks.
  • a protoplast suspension (1.5 x 10 8 protoplasts per ml protoplast buffer) from the Sordaria macrospora wild-type strain ATCC MYA-334 is prepared.
  • the suspension is exposed to UV light (0.05 ⁇ W / cm 2 ) when shaken gently. The times vary between 10 and 20 minutes.
  • the protoplasts are then placed on CMS solid medium (0.15% KH 2 PO 4 , 0.05% KCI, 0.05% MgSO 4l 0.37% NH 4 CI, 1% glucose, 0.2% trypton, 0, 2% yeast extract, trace elements, pH 6.4-6.6, 10.8% sucrose, 1.5% agar) and plated and incubated for approx. 48 hours at 27 ° C.
  • the regenerated protoplasts are then inoculated onto MB solid medium (0.8% organic salt in maize flour extract, pH 6.5, 1.5% agar). After 1-4 weeks, the clones are phenotypically characterized to identify sterile mutants. These are usually characterized by changes in the formation of fruiting bodies. In order to distinguish mutants from variants, the mitotic stability of the strains is tested by inoculation on MB medium. After a growth distance of approx. 7 cm, the mycelium is transferred again to fresh nutrient medium. This process is repeated three times. After this test of mitotic stability, the sterile strains are genetically checked in cross-over experiments to isolate ascospores. This creates homokaryotic strains.
  • EMS mutagenesis ethyl methyl sulfonate is used as a mutagenic agent.
  • 5 ⁇ 10 6 protoplasts of the wild-type strain of Sordaria macrospora (see above) in a total volume of 500 ⁇ l are treated with EMS.
  • the final concentration of EMS ( ⁇ M-0880) is 34.1 mg / ml.
  • the mutagenesis is carried out at 27 ° C. for 45 minutes.
  • the protoplasts are then plated out on CMS solid medium as described under 1) above and treated further as described there.
  • strains generated are identified below by “inf” (infertile).
  • S. macrospora mutants are transformed after Walz and Kück (1995).
  • Fungal mycelium of the strain to be transformed is 2 days at 27 ° C in CM liquid medium (0.15% KH 2 P0, 0.05% KCI, 0.05% MgSO 4 , 0.37% NH 4 CI, 1% Glucose, 0.2% tryptone, 0.2% yeast extract, trace elements, pH 6.4 - 6.6, 10.8% sucrose, 1.5% agar) was grown as a stand culture.
  • the mycelium After a washing step of the mycelium in protoplast buffer (13 mM Na 2 HPO 4 , 45 mM KH 2 PO 4 , 600 mM KCL, pH 6.0) and subsequent filtration, the mycelium is dissolved in Novozym solution (10 mg Novozym 234 (Novo Nor disk) / ml protoplast buffer). After 45 minutes of incubation at 100 rpm and 27 ° C., the protoplasts are separated from the residual mycelium using a glass frit (pore size 1, Schott). After pelleting the protoplasts by centrifugation, the cells are washed twice in protoplast buffer and again sedimented.
  • protoplast buffer 13 mM Na 2 HPO 4 , 45 mM KH 2 PO 4 , 600 mM KCL, pH 6.0
  • the protoplasts are then taken up in transformation buffer (1 M sorbitol, 80 mM CaCl 2 , pH 7.5), so that the protoplast titer is 2 ⁇ 10 8 / ml.
  • transformation buffer 1 M sorbitol, 80 mM CaCl 2 , pH 7.5
  • the protoplast titer is 2 ⁇ 10 8 / ml.
  • 2 ⁇ 10 7 / ml protoplasts are mixed with 20 ⁇ g plasmid DNA or 20 ⁇ l cosmid DNA and incubated on ice for 10 min. After the addition of 200 ⁇ l of 25% PEG (in transformation buffer), an incubation for 20 min at RT follows. From the transformation batch, 100-200 ⁇ l of each batch are plated directly onto the CMS medium.
  • the regenerating protoplasts are covered with top agar containing hygromycin B (0.8 M NaCl, 0.8% agar).
  • the hygromycin B concentration in the top agar is selected so that a final concentration of 110 U / ml is present in the entire medium.
  • Transformants appear after 2 to 4 days and are inoculated on BMM medium (0.8% biomalt in maize flour extract, pH 6.5) which contains 100 U / ml hygromycin B. The phenotypic studies of the mutants are carried out on BMM medium without selection pressure.
  • transformants from Sordaria macrospora and the corresponding wild-type control are transferred to CM medium and incubated at 27 ° C.
  • Media or fungal mycelium are harvested by centrifugation or filtration.
  • the different transcript frequencies for different strains were determined in a Northern hybridization. For this purpose, 5 ⁇ g mRNA from the wild-type strain or from the sterile mutant inf were applied and hybridized with the respective probes that were specific for the above-mentioned genes. In the autoradiogram shown in FIG.
  • the ppg1 gene gives the weakest signals, but in comparison to so-called “house-keeping” genes (such as, for example, ⁇ - or ⁇ -tubulin genes), the ppg7 gene is The signal for the acl1 gene is significantly stronger, the strongest signals were found for the cpc2 and ndkl genes.
  • the autoradiogram shows that the four genes are suitable for the construction of expression vectors due to their high transcriptional expression are.
  • oligonucleotide primers 1095 and 1096 were used for the PCR amplifications of the cpc2 gene and the oligonucleotide primers 1265 and 1266 for the amplification of the ndk "gene.
  • the gene fragments were then used for so-called Northern hybridizations, and comparative hybridizations were carried out with other genes from S. macrospora.
  • the comparative hybridizations with 10 different S. macrospora gene probes show that the cpc2 gene and the nd / d gene of S. macrospora have a very high transcriptional level. In comparison to hybridization signals with other probes, this level can be classified as significantly higher.
  • the complete genomic copies of both genes were isolated from an indexed genomic cosmid gene bank by S. macrospora (Pöggeler et al. 1997). The screening resulted in the isolation of the cosmid clones VIG10 (cpc2) and VIIG10 (/ 7d / 1). Sub-fragments of both cosmid clones were sequenced to clearly identify the regulatory sequences.
  • the oligonucleotide pairs cpc9 / cpc11 and cpc10 / cpc12 were used to subamplify parts of the cpc2 promoter from the plasmid pSE36-5.
  • the oligonucleotide pair cpc9 / cpc11 enables the amplification of a 1359 bp amplicon (nucleotide positions 1250-2609 in FIG. 3) which, owing to the oligonucleotide sequence, has ⁇ / col overhangs at both ends.
  • a 1359 bp fragment could also be amplified with the oligonucleotide pair cpc10 / cpc12, here EcoRVr recognition sequences are generated at the ends of the fragment.
  • the sequence of this fragment corresponds to the sequence from nucleotide position 1250 to nucleotide position 2609 in FIG. 3.
  • pSE38-16 contains an approximately 1.4 kb EcoRV fragment in the vector pDrive;
  • pSE39-14 contains an approximately 1.4 kb ⁇ / col fragment in the vector pDrive.
  • ACL ATP citrate lyase
  • the promoter element of the ac / 7 gene from S. macrospora was used for the construction of the expression plasmid pMN110 (see FIG. 4).
  • the oligonucleotides 1197 and 1199 (Table 2) were used together with the genomic DNA from S. macrospora as template DNA.
  • the expected fragment of 2.3 Kb was cloned into the plasmid pMON 38201 (Borovkov and Rivkin, 1997).
  • the resulting plasmid was named pMN95.
  • the terminator sequence of the ac / 7 gene was then amplified and cloned. In this case too, the S.
  • plasmid pMN102 The terminator sequence was then cloned from the plasmid pMN102 into the vector pKS + (Stratagene, La Jolla, California). For this purpose, the plasmid pMN102 was hydrolyzed with the enzymes No and Sa. The resulting restriction fragment of 0.6 Kb was ligated into the Not ⁇ - and Sacl-restricted vector pKS +. The resulting plasmid was named pMN109.
  • This plasmid was then restricted with the enzymes HindW1 and Noü and ligated with the 2.3 Kb fragment of the plasmid pMN95.
  • the resulting plasmid was named pMN110 and was used for further cloning.
  • the cloning strategy is shown in FIG. 4 and the corresponding sequence of the insert DNA of the plasmid pMN110 is shown in FIG. 5.
  • the plasmid pMN112 was constructed, which is suitable for the transformation of S. macrospora and for the transformation of E. coli (see FIG. 6).
  • the plasmid pBCHygro (Silar, 1995) was hydrolyzed with Not ⁇ and the corresponding restriction ends were filled in using Klenow polymerase.
  • the resulting linear plasmid with filled in ⁇ / ofl ends was restricted with the enzyme C / al.
  • This vector molecule treated in this way was used in a ligation in which a 2.9 Kb fragment from the plasmid pMN110 was used This fragment was generated by linearizing the plasmid pMN110 with the enzyme Hind ⁇ .
  • the protruding restriction ends were then filled in with Klenow polymerase in order to generate “blunt” ends.
  • This restriction fragment treated in this way was then restricted with the enzyme C / al and eluted after gel electrophoresis in order to be used for the ligation discussed above.
  • the cloning strategy is shown in FIG. 6 and the resulting plasmid pMN112 is shown in FIG. 7. It has a total size of 9.605 Kb.
  • the expression plasmid pMN112 can be used to produce heterologous proteins in S. macrospora.
  • the ac / 1 promoter is connected to the ac / 1 terminator by a ⁇ / ofl restriction cut. This unique ⁇ / ofl restriction cut is suitable for the insertion of foreign DNA, which is to be expressed under the control of the ac / 1 promoter.
  • the plasmid pSMY1-1 was constructed.
  • the plasmid pSMY1-1 was generated by inserting the / acZ gene into the singular ⁇ / ofl restriction site of the plasmid pMN112.
  • the / acZ gene was generated from the plasmid pSI8.8 (Menne et al., 1994) by PCR amplification.
  • oligonucleotides 1206 and 1215 (Table 2) were used, which have the recognition sequence for the restriction enzyme Not ⁇ at the end.
  • the amplificate has a size of 3.0 Kb and was inserted into the unique site of the plasmid pMON 38201 (Borovkov and Rivkin 1997).
  • the result The resulting plasmid was given the name pMN104, which was subsequently hydrolyzed with Noü.
  • the resulting 3.0 Kb ⁇ / ofl fragment was inserted into the plasmid pMN112 linearized with Nou (see FIG. 7).
  • the resulting plasmids pSMY1-1 (FIG. 8) and pSMY1-2 differ in the orientation of the / acZ gene.
  • the / acZ gene is under the control of the ac / 1 promoter.
  • pSMY1-2 there is an inverse arrangement of the / acZ gene with respect to plasmid pSMY1-1, which means that ac / 1 promoter-controlled expression is not possible.
  • the plasmid pSMY1-2 can thus be used as a control in expression experiments. All constructs were checked for correctness by control DNA sequencing. The sequence on the ATG start codon in plasmid pSMY1-1 is shown in FIG. 9.
  • the transformants selected for hygromycin were examined for the formation of the heterologous gene product ⁇ -galactosidase.
  • the fungal mycelium was washed with glass beads and extraction buffer (2.5 mM Tris-HCl (pH 8), 125 mM NaCl, 2 mM MgCl 2 , 12 mM ⁇ -mercaptoethanol (pH 7.5), 2 mM 4-methylumbelliferyl ß-D-galactopyranoside, 10% (v / v) DMF) added and disrupted by intensive vortexing. The cell debris was removed by centrifugation.
  • the detection of the ⁇ -galactosidase activity in the crude protein extract of the pSMY1-1 transformants is carried out by measuring the release of the fluorescent 4-methylumbilliferone from 4-methylumbelliferyl- ⁇ -D-galactopyranoside. While ß-galactosidase activity was detected in the crude extract of the SMY1-1 transformand, ß-galactosidase activity was not detectable in the crude extract of the SMY1-2 transformande, in which the expression cassette contains the / acZ gene in the inverse orientation.
  • the hsa gene (from plasmid pPreHSA, Rhein Biotech GmbH, Duesseldorf, FRG) was cloned into the expression vector pMN112.
  • the gene for the pre-protein of human serum albumin (PreHsa) was obtained by amplification.
  • the gene for the pre-protein of human serum albumin (PreHsa) was obtained by amplification.
  • the oligonucleotides hsal and hsa2 using the plasmid pPreHsa as tem- the gene was amplified by plate DNA.
  • the 1.8 kb amplificate has terminal no restriction sites.
  • the PCR fragment was inserted into the Xcml-restricted cloning vector pMON 38201 (Borovkov and Rivkin 1997) by ligation.
  • the resulting plasmid was named pMON-HSA.
  • the insert of the plasmid pMON-HSA was checked by sequencing. This plasmid was then restricted with the enzyme Noü and the resulting 1.8 Kb fragment was inserted into the vector pMN112 restricted with Noü.
  • the plasmid thus generated was given the name pSMY4-1 (FIG. 10).
  • the vector pSMY4-2 also created by cloning, contains the PreHsa gene in inverse orientation and was used as a negative control for the expression experiments. All constructs were checked for correctness by control DNA sequencing.
  • the transformants selected for hygromycin were examined for the formation of the heterologous gene product HSA.
  • the fungal mycelium was mixed with glass beads and extraction buffer (2.5 mM Tris-HCl (pH 8), 125 mM NaCl, 2 mM MgCl 2 , 12 mM ⁇ -mercaptoethanol (pH 7.5)) and disrupted by intensive vortexing , The cell debris was removed by centrifugation.
  • the HSA was detected in the crude protein extract by means of an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA).
  • the total protein extracts were pipetted into the wells of a microtiter plate (MaxiSorp, Nunc) and incubated at 4 ° C. overnight. After three times washing the plate with PBS-buffer (137 mM NaCl, 2.7 mM KCI, 4.3 mM Na 2 HPO 4, 14 mM KH 2 PO 4, pH 7.4) containing 0.05% Tween ® 20 contained, the free binding sites were blocked for one hour with a 0.2% Tween ® 20 solution in PBS buffer.
  • PBS-buffer 137 mM NaCl, 2.7 mM KCI, 4.3 mM Na 2 HPO 4, 14 mM KH 2 PO 4, pH 7.4
  • peroxidase-coupled HSA antibody BioTrend, Cologne, FRG; diluted 1: 1000 in PBS buffer with 0.05% Tween ® 20
  • TMB peroxidase substrate 3,3 ', 5,5'-tetramethylbenzidine
  • the ppg1 gene for the sex pheromone from S. macrospora codes for a preproprotein of 277 amino acids. Included here is a leader peptide of 16 amino acids (Pöggeler, 2000), which can be used as a signal sequence for protein secretion.
  • the promoter sequence, the sequence coding for the leader peptide and the termination sequence of the ppg7 gene were used (see FIG. 11).
  • the oligonucleotides ppg1-1 and ppg1-2 were used for the cloning of the promoter sequence together with the sequence encoding the leader peptide. Both oligonucleotides contained sequences for restriction endonucleases (see Table 2). In the case of the oligonucleotide ppg1-1, the recognition sequence for the enzyme Sacl was used, in the case of the oligonucleotide ppg1-2 that for the enzyme Noü. The S. macrospora genomic DNA was used for the amplification with these two oligonucleotides. The amplification gave a 1.8 Kb fragment.
  • the termination sequence of the pp ⁇ l gene was also obtained by amplifying the corresponding sequence.
  • the oligonucleotides ppg1-3 and ppg1-4 were used for this. Both oligonucleotides also contain sequence extensions for the enzyme Noü (ppg1-3) and for the enzyme SamHI (ppg1-4). The amplification with these two oligonucleotides was again carried out using genomic DNA from S. macrospora and yielded an 880 bp DNA fragment.
  • the two amplificates were inserted into the vector pMON38201 linearized with Xcm ⁇ as described above.
  • the plasmids resulting from the cloning were named pPROMI (contains the promoter region) or pTERMI (contains the terminator sequence).
  • the physical-genetic map of the plasmids pPROMI and pTERMI is shown in FIGS. 12 and 13, respectively.
  • the promoter sequence was then cloned into the transformation vector pCB1004 (Carroll et al., 1994).
  • the plasmid pPROMI was restricted with Sacl and Noü, and inserted into the SacUNoü hydrolyzed vector pCB1004.
  • the corresponding recombinant plasmid was given the name pSMY2 (FIG. 14).
  • This plasmid was then hydrolyzed with the enzymes Noü and BamHl and the Noü and SamHI restriction fragment from the plasmid pTERMI was inserted into the vector pSMY2 restricted with Noü and BamHl.
  • the resulting plasmid was given the name pSMY3 (FIG.
  • the vector pSM2 contains the egp gene which is fused with the TtrpC terminator from Aspergillus nidulans. Upstream of the egfp gene is a polylinker region, which allows optimal cloning with different fragments.
  • the EcoRV fragment described in Example 3 from the plasmid pSE38-16 was ligated into the vector pSM2 / EcoRV.
  • the resulting recombinant plasmid was named pSE40-6 ( Figure 17).
  • the correct orientation of the promoter fragment was checked by restriction analysis.
  • the 1.4 kb ⁇ / col fragment from the plasmid pSE39-4 was inserted into the vector pSM3 linearized with ⁇ / col (see example 12, FIG. 26).
  • the resulting recombinant plasmid was named pSE42-9. After restriction of this plasmid with the enzyme Sa / I, the linearization of the plasmid is achieved.
  • the wild-type strain of S. macrospora was transformed in independent experiments with the recombinant plasmids pSE40-6 and pSE43-2. After selecting the Approx. 20 transformants were isolated on hygromycin B transformants in each experiment. In the subsequent analysis, evidence was provided by fluorescence microscopy that the heterologous egr / p protein was produced in S. macrospora.
  • the T1 P40-6 and T1 P43-2 transformants are shown as examples, which carry the recombinant plasmid pSE40-6 and the recombinant plasmid pSE43-2.
  • the fluorescence is clearly and unambiguously recognizable in the fluorescence microscope and is completely absent in the untransformed comparison strains (not shown). No background fluorescence, for example due to phenolic substances, can be seen in the latter.
  • the starting vector pSMY5-1 (FIG. 20) was cut with SssHII and an approximately 4.6 Kb fragment was isolated by gel elution. A synthetic polylinker fragment was added to the fragment and religated. The synthetic fragment was prepared by hybridizing the subsequent oligonucleotides. The oligonucleotides and the sequence of the restriction sites are listed below. The SssHIl sequence is underlined.
  • Linker 2 (SEQ ID NO: 25) ⁇ '-GCGCGCGGAGCTCTCCGGATGATCACTTAAGTCTAGACCTAGGCGCCGGCG
  • the sequence of the restriction sites in the synthetic cloning site was as follows: SssHII- ⁇ val-X7ll-Sfel-Spel-EcoRI-Sgf / ll-6a / 77HI-Sacll- / Vofl-C / al- ⁇ / rul-Acc65l- Kp ⁇ l- SssHII.
  • the construct p-GV-MCS obtained (FIG. 21) was checked by DNA sequencing.
  • promoter elements were installed in various MCS interfaces.
  • a 1378 bp fragment containing the / 7d / c7 promoter (nucleotide positions 6-1383 in Figure 2)
  • a 1331 bp fragment containing the cpc2 promoter (nucleotide positions 1281-2611 in Figure 3)
  • the terminator element of the ac 'gene (nucleotide positions 2338-2860 in FIG. 5) either obtained from previous plasmids using suitable restrictions or amplified with terminal recognition sequences using PCR and cloned into the vector.
  • oligonucleotides ndk ⁇ - (Spel) and ndk3- (EcoRI) were used for the PCR amplification of the / 7d / c7 promoter with terminal Spei and EcoRI interfaces.
  • the oligonucleotides cpc2- (Aval) and cpc2- (Spel) were used for the PCR amplification of the cpc2 promoter with terminal Spei and / Aval restriction sites.
  • the ac / 1 terminator was introduced into the vectors.
  • the terminator element was obtained from the plasmid pSMY1-2 (see Example 5) by means of PCR amplification with terminal ⁇ / ofl / C / al interfaces.
  • the oligonucleotides acM- (Notl) and acM- (Clal) (see Table 2) were used for the amplification.
  • the resulting vectors pGV-ndk1-MCS-acl1 ( Figure 22) and pGV-cpc2-MCS-acI1 ( Figure 23) contain an MCS with the unique restriction sites EcoRI / Bg / ll / BamHI / ⁇ / ofl for the inclusion of heterologous coding sequences.
  • Aspergillus fumigatus phytase (Pasamontes et al., 1997) was chosen as an example for the production of a secreted heterologous gene product.
  • the coding region of the phytase gene as a 1403 bp EcoRI fragment was inserted into the plasmid pGV-ndk1-MCS-acl1 (FIG. 22) downstream of the ndkl or into the plasmid pGV-cpc2-MCS-acl1 ( Figure 23) cloned downstream of the cpc2 promoter.
  • the resulting expression plasmids were verified for their integrity and used for the transformation of Sordaria macrospora.
  • the media supernatants were examined for secreted phytase activity over a period of seven days. Corresponding aliquots were mixed with 25 ⁇ l of 5 M NaAc and 50 ⁇ l of 4-nitrophenyl phosphate. The batch was 60 min. incubated for long at 37 ° C. The enzymatic reaction was stopped by adding 100 ⁇ l of 15% trichloroacetic acid. After the addition of 100 ⁇ l of 1 M NaOH, positive culture supernatant samples appeared colored intensely yellow. The yellowing was quantified by the OD 40 5 measurement in the photometer.
  • the activity determinations of the culture supernatants of the transformants with the respective phytase expression vector were carried out in comparison to the wild-type strain and a transformand with an expression vector without a phytase insert (mock transformande). Expression of the phytase gene in Sordaria macrospora as well as secretion of recombinant phytase in the culture supernatant were detected for both the ndkl and cpc2 promoters.
  • an OD 05 of 0.4 was measured after 190 hours; the corresponding OD 405 values of the media supernatants of the Sordar / a wild type and the mock transformants were 0.136 and 0.09, respectively.
  • an OD 405 of 0.37 was measured after 190 hours; the corresponding OD 405 values of the media supernatants of the Sordar / a wild type and the mock transformants were 0.049 and 0.05, respectively.
  • a coding sequence for a fusion of human lactoferrin and the N-terminus of glucoamylase from Aspergillus awamori was cloned as a 3641 bp EcoRI fragment into the vector pGV-ndk1-MCS-acl1 (FIG. 22). Restriction, fragment isolation and ligation were carried out under standard conditions.
  • the vector with the cpc2 promoter pGV-cpc2-MCS-acl1, FIG. 23
  • the EcoRI fragment was cloned into the Sg / N / SamHI site. Blunt ends were produced at the fragment ends and the intersections of the vector before ligation by Klenow treatment. provides. The treatment was carried out according to standard methods.
  • TMB peroxidase substrate (Pierce, Helingborg) and reaction solution (Pierce) were mixed in a ratio of 1: 1 and added to the sample pockets in 100 ⁇ l aliquots. When the desired color intensity was reached, the reaction was stopped by adding 100 ⁇ l of a 2 M sulfuric acid solution.
  • the color intensity is measured at 450 nm in the ELISA reader.
  • the concentration determinations for the supernatant samples are made by comparison with the values of the standard series.
  • lactoferrin controlled by the nd 7 promoter an OD 450 of 1,375 was measured after seven days; the corresponding OD 450 values of the media supernatants of the Sotdar / a wild type and the mock transformants were 0.2 and 0.24, respectively.
  • lactoferrin CPC2 an OD of 5 o 1, 95 was measured after seven days; the corresponding OD 50 values of the media supernatants of the Sordaria W ⁇ d type and the mock transformants were 0.273 and 0.236, respectively.
  • GFP green fluorescent protein
  • the gfp gene is controlled by the Aspergillus nidulans gpd promoter and terminated by the Aspergillus nidulans frpC termination sequence.
  • the plasmid also contains the hygromycin B resistance gene for the selection of fungal transformants.
  • the construction of the plasmid pSM1 is shown in FIG. 25.
  • the plasmid pSM2 does not contain a gpd promoter.
  • In front of the gfp gene there is a multiple cloning site for several enzymes which are suitable for inserting heterologous or homologous promoter sequences and thus for controlling gfp gene expression.
  • the construction of the plasmid pSM3 is shown in FIG. 26.
  • a sterile Sordaria macrospora strain was transformed with the plasmids pEGFP / gpd / tel, pSM1 and pSM3.
  • the transformants obtained were then selected for hygromycin resistance as described and analyzed by fluorescence microscopy. The analysis was carried out using the Zeiss axi-phot microscope when excited with light of wavelength 420 nm.
  • GFP-producing clones were then used for a formal genetic analysis against the wild-type strain or other tester strains. The intersection can be used to check to what extent the terologic GFP protein is passed on stably in meiosis, and in particular to what extent GFP expression is also stably retained in the offspring.
  • the GFP gene expression can be seen both in the vegetative mycelium of the transformants and in the ascospores.
  • the expected 1: 1 splitting can be clearly seen in the eight-pore Asci (4 spores show fluorescence, 4 spores show no fluorescence).
  • This GFP gene expression can also make it clear that the heterologous gene expression in S. macrospora after the meiotic cross is not destroyed by inactivation processes (e.g. RIP, MIP, quelling).
  • the EGFP gene was amplified with the oligonucleotides EGFP5 'and EGFP3' (see Table 2) by PCR from the vector pSM2.
  • the PCR product obtained was used as a 726 bp EcoRI fragment in the plasmid pGV-ndk1-MCS-acl1 (FIG. 22) downstream of the ndkl or in the plasmid pGV-cpc2-MCS-acl1 (FIG. 23) downstream of the cpc2 Promoter cloned.
  • the resulting expression plasmids were verified for their integrity and used for the transformation of Sordaria macrospora.
  • the intracellular expression of the EGFP gene was detected as described in Example 12.
  • FIG. 28 shows an example of a transformant which contains the EGFP gene under the control of the t? D / c7 promoter.
  • the fluorescence attributable to EGFP can be clearly seen in the fluorescence microscope image (below) and was completely missing in the control (untransformed strain) (not shown).
  • Table 1

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Herstellen von heterologem Protein in einem filamentösen Pilz sowie dafür geeignete Promotoren. Ferner betrifft die vorliegende Erfindung Vektoren und Wirtszellen sowie einen Kit und deren Verwendung. Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein Verfahren zum herstellen von heterologem Protein in einem filamentösen Pilz bereitzustellen, das eine effiziente Produktion heterologer Proteine erlaubt und bei dem eine Kontamination des erzeugten Proteins durch vegetative Sporen vermieden wird. Erfindungsgemäss wird diese Aufgabe durch ein Verfahren zum Herstellen von heterologem Protein in einem filamentösen Pilz gelöst, das (a) das Kultivieren eines homothallischen Pilzes der Familie Sordariaceae, der eine Espressionskassette enthält, die in funktioneller Verbindung die folgenden Elemente enthält: einen in dem Pilz der Familie Sordariaceae aktiven Promotor; ein heterologes Gen und einen in dem Pilz der Familie Sordariaceae aktiven Terminator, sowie (b) das Ernten des erzeugten Proteins in an sich bekannter Weise umfasst.

Description

Verfahren zum Herstellen von heterologen Proteinen in einem homothallischen Pilz der Familie Sordariaceae
Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zum Herstellen von heterologem Protein in einem filamentosen Pilz sowie dafür geeignete Promotoren. Ferner betrifft die vorliegende Erfindung Vektoren und Wirtszellen sowie einen Kit und deren Verwendung.
Gentechnische Methoden erlauben die Etablierung von Expressionssystemen für die Herstellung rekombinanter Proteine. In der etwa 20jährigen Tradition der industriellen Gentechnik wurden dabei unterschiedliche Mikroorganismen oder Zelllinien als Wirtssysteme entwickelt und genutzt. Die Festlegung eines Wirtes erfolgte dabei nach Kriterien der Verfügbarkeit, der Ökonomie eines darauf basierenden Produktionsprozesses, des Anwendungsbereiches und der Eigenschaften des herzustellenden Proteins. Als Expressionssysteme dienten unter anderem unterschiedliche Gram-positive und Gramnegative Bakterien, Säugetierzellen und verschiedene Pilzarten, darunter Hefen und fi- lamentöse Pilze.
Von besonderer wirtschaftlicher Bedeutung ist die Herstellung von Säugetierproteinen und insbesondere menschlichen Proteinen, die in pharmazeutischen Produkten eingesetzt werden. Für die Herstellung solcher Proteine, die oft ein komplexes Glykosylie- rungsmuster aufweisen, sind bakterielle Expressionssysteme wie etwa E. coli häufig nicht geeignet, weil Bakterien solche heterologe Proteine weder sezernieren noch die mit dem Sekretionsweg höherer (eukaryotischer) Organismen verbundenen Modifikationen von Polypeptiden wie die Glykosylierung ausbilden können. Die Deposition rekombinanter Produkte in Einschlusskörpern („inclusion bodies") führt sehr oft zur Ausbildung unlöslicher und biologisch inaktiver Proteinaggregate. Ein heterologes Produkt muß daher häufig in einem aufwendigen De- und Renaturierungsverfahren in eine biologisch aktive Form überführt werden.
Für die Produktion von Proteinen, die eine komplexe Säugetierglykosylierung erfordern, werden deshalb Säugetierzellen verwendet. Säugetierzellsysteme sind jedoch sehr teuer; die Zellen sind darüber hinaus potentielles Ziel pathogener Viren. Hefen und filamentöse Pilze dagegen weisen zwar ein vom komplexen Säugetiertyp abweichendes Glykosylie- rungsmuster auf, sie können jedoch für eine Vielzahl von Produkten genutzt werden. Sie sind als eukaryotische Mikroorganismen zur Sekretion fähig und können wie Bakterien auf preiswerten Medien in großen Zelldichten fermentiert werden. Da die Kulturmedien weder Serum noch andere potentielle Kontaminanten enthalten, kann das hergestellte heterologe Protein leicht und kostengünstig gereinigt werden. Beispiele für etablierte Expressionssysteme sind Hefen wie S. cerevisiae und die methylotrophe Hefe Hansenula polymorpha.
Innerhalb der Gruppe der als bessere "Sezemierer" geltenden filamentosen Pilze wurden verschiedene Aspergillus-Aiϊer, und Neurospora crassa für die heterologe Genexpression genutzt. Diese Pilze wurden jedoch bisher fast ausschließlich für die industrielle Herstellung technischer Enzyme genutzt, weil das Vorhandensein vegetativer Sporen, die in großen Mengen in der Kultur auftreten, und nur schwer zu entfernen sind, ihren Einsatz für die Herstellung pharmazeutischer Produkte verhinderte, da sporenfreie Präparate sich nur mit großem Aufwand herstellen ließen. Dies trifft insbesondere auf die häufig verwendete Art Aspergillus nidulans zu, die sich sexuell (durch Ascosporen) und vor allem asexuell (durch Konidiosporen) vermehren kann.
Ein weiteres Problem bei der Herstellung heterologer Proteine in filamentosen Pilzen stellen die Inaktivierungssysteme für heterologe DNA dar, die insbesondere dann wirksam werden, wenn heterologe DNA in das Genom des Pilzes eingefügt wird. Die Gen- inaktivierung, die z.B. sehr gut für Neurospora crassa oder Ascobolus immersus beschrieben wurde, kann auf verschiedenen Ebenen, also der transkriptioneilen oder der posttranskriptionellen Ebene stattfinden. Ähnliche Phänomene wurden auch bei transge- nen Pflanzen beschrieben. Eine Übersicht hierüber findet sich bei Cogoni und Macino (1999).
Bei Neurospora crassa wurde nach DNA-Transformation das sogenannte RIP-Phänomen beobachtet (Singer et al., 1995; Selker, 1997), bei dem vielfache Kopien heterologer DNA durch Punktmutationen oder DNA-Modifikationen (z.B. Methylierung) inaktiviert werden. Folglich können Fremdgene in Neurospora crassa nach meiotischer Kreuzung nicht effizient exprimiert werden.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es daher, ein Verfahren zum Herstellen von heterologem Protein in einem filamentosen Pilz bereitzustellen, das eine effiziente Produktion heterologer Proteine erlaubt und bei dem eine Kontamination des erzeugten Proteins durch vegetative Sporen vermieden wird. Erfindungsgemäß wird diese Aufgabe durch ein Verfahren zum Herstellen von heterologem Protein in einem filamentosen Pilz gelöst, das das Kultivieren eines homothallischen Pilzes der Familie Sordariaceae, der eine Expressionskassette enthält, die in funktioneller Verbindung die folgenden Elemente enthält:
- einen in dem Pilz der Familie Sordariaceae aktiven Promotor,
- ein heterologes Gen und
- einen in dem Pilz der Familie Sordariaceae aktiven Terminator,
und das Ernten des erzeugten Proteins in an sich bekannter Weise umfasst.
Ein „heterologes Gen" bezeichnet im Sinne der Erfindung eine kodierende Nukleinsäure- sequenz, die von einem anderen Gen stammt als der in der Expressionskassette enthaltene Promotor.
Homothallische Pilze der Familie Sordariaceae bilden, anders als heterothallische Arten dieser Familie oder andere filamentöse Pilze wie Aspergillus nidulans oder Podospora anserina, weder Makrokonidien noch Mikrokonidien aus, da sie sich ausschließlich sexuell vermehren. Auch Athrosporen, die durch Zerfall der Hyphen gebildet werden, sind nicht anzutreffen. Somit wird eine Kontamination des hergestellten Proteins mit vegetativen Sporen, die bei der Produktion von pharmazeutisch relevanten Proteinen mit filamentosen Pilzen ein großes Problem darstellt, vermieden.
Ferner hat es sich überraschenderweise herausgestellt, dass das bei Neurospora crassa und anderen filamentosen Pilzen beobachtete RIP-Phänomen nach DNA-Transformationen bei homothallischen Pilzen der Familie Sordariaceae und insbesondere bei Sordaria macrospora nicht auftritt. Sordaria macrospora besitzt keine genetischen Mechanismen, um repetitive Sequenzen z. B. durch Methylierung oder Punktmutation zu inaktivieren. Folglich wird heterologe DNA, die nach Transformation in das Genom des Pilzes in vielfachen Kopien vorhanden ist, anders als bei Neurospora crassa und anderen filamentosen Pilzen nicht inaktiviert. Eine posttranskriptionelle Geninaktivierung ist bei homothallischen Pilzen der Familie Sordariaceae nicht bekannt.
Die Familie Sordariaceae wird zur Klasse der Ascomyceten (Schlauchpilze) gerechnet, die nach Strasburger (Lehrbuch der Botanik) in die Ordnung der Sphaeriales (Sordaria- les) eingeordnet wird. Als Beispiel für den Lebenszyklus von homothallischen Pilzen der Familie Sordariaceae lässt sich der Lebenszyklus von Sordaria macrospora wie folgt be- schreiben: Es handelt sich bei diesem Pilz um einen Haplo-Dikaryoten, der sich ausschließlich sexuell vermehrt. Vegetative Sporen, z.B. Konidiosporen werden von diesem Pilz nicht gebildet. Der Pilz ist homothallisch, d.h. bei ihm existiert eine Monözie, die nicht durch Inkompatibilität überlagert wird und er kann sich deshalb durch Selbstung sexuell vermehren (K. Esser, Kriptogamen I, 2000). Der Befruchtungsvorgang, der der sexuellen Vermehrung vorausgeht, wird als autogam bezeichnet. Dabei teilen sich die im Ascogon befindlichen haploiden Kerne konjugiert und leiten damit die dikaryotische Phase ein. Die sexuellen Ascosporen werden in Asci (Schläuchen) gebildet. Mehrere Asci (ca. 100) reifen gleichzeitig in Fruchtkörpern, den sogenannten Perithezien, heran. Dieser Fruchtkörpertyp ist für die Vertreter der Sordariales typisch. Nach der Reifung werden die Ascosporen aktiv aus den Perithezien heraus geschleudert. In der Natur werden die Ascosporen durch die Nahrung von Pflanzenfressern aufgenommen und gelangen nach einer Magen-Darm-Passage wieder ins Freie. Die Magen-Darm-Passage ist Voraussetzung für die anschließende Keimung der Sporen auf dem Dung der Pflanzenfresser.
Vorzugsweise handelt es sich bei dem homothallischen Pilz der Familie Sordariaceae, der in dem erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzt wird, um einen Pilz der Gattung Sordaria. Für die Ausführung der Erfindung besonders bevorzugte homothallische Pilze der Familie Sordariaceae sind Sordaria macrospora oder Sordaria fimicola; andere homothallische Pilze derselben Familie, die sich für die Durchführung des erfindungsge- mäßen Verfahrens eignen, sind Neurospora linoleata, Neurospora africana, Neurospora dodgei, Neurospora galapagosensis, Neurospora pannonica und Neurospora terricola.
Sordaria macrospora ist, ebenso wie Sordaria fimicola, ein koprophiler Saprophyt, der auf dem Dung von Herbivoren wächst. Der Hyphenpilz ist taxonomisch in die Abteilung der Eumycota einzuordnen und gehört damit zu den höheren Pilzen, die Chitinwände besitzen. Der gesamte Lebenszyklus von Sordaria macrospora ist unter Laborbedingungen innerhalb von sieben Tagen abgeschlossen. Damit ist der Lebenszyklus erheblich kürzer als der vierwöchige Zyklus von Neurospora crassa. Molekularbiologische Arbeiten zur Stammentwicklung von S. macrospora können daher in erheblich kürzerer Zeit durchgeführt werden.
Für S. macrospora ist sowohl die formalgenetische als auch die molekulargenetische Analyse gut entwickelt. Bei den formalgenetischen Analysen wird die Tatsache genutzt, dass sterile Mutanten von S. macrospora zwar keine Selbstungsasci bilden können, dass jedoch zwei Mutanten, die unterschiedliche Defekte aufweisen, in Kreuzungen sexuell vermehrbar sind. D.h. es findet in sogenannten ascogenen Hyphen eine Meiose statt, die zur Ausbildung von Tetraden führt. Das Resultat sind Asci mit acht linear angeordneten Sporen, von denen jeweils zwei genetisch identisch sind. Die Größe der Sporen (18 x 28 μm) und die ünearität der Anordnung lassen eine Formalgenetik aufgrund der geordneten Tetraden technisch einfach zu. Außerdem ist inzwischen eine Vielzahl von Mutanten beschrieben, die sowohl physiologische als auch morphologische Eigenschaften des Pilzes betreffen (Esser und Straub, 1958; Nowrousian et al., 1999; Masloff et al., 1999; Le Chevanton und Lebion, 1989). Eine indizierte Cosmid-Genbank, die die Genisolation von S. macrospora ermöglicht, wurde von Pöggeler et al. (1997) beschrieben.
Für eine optimale Expression heterologer Gene ist der Kodongebrauch in dem Wirtsorganismus entscheidend. Aus der Auflistung der häufigsten Aminosäurekodons innerhalb proteinkodierender Gene in Tabelle 1 wird ersichtlich, dass zwischen den am häufigsten gebrauchten Aminosäurekodons in Sordaria macrospora, Drosophila melanoga- ster und Primaten eine erstaunliche Übereinstimmung besteht. Im Gegensatz dazu lassen sich zu E. coli bzw. zu Saccharomyces cerevisiae deutliche Unterschiede feststellen. Aufgrund der Ähnlichkeit des Kodongebrauchs stellt S. macrospora also ein hervorragendes Wirtssystem für die Produktion heterologer Proteine humaner Herkunft dar.
Homothaliische Pilze der Familie Sordariaceae können einfach und kostengünstig in Laborkulturen angezogen werden. Als eukaryotische Mikroorganismen sind sie auch in der Lage, posttranslationale Modifikationen von rekombinanten eukaryotischen Proteinen vorzunehmen. Für die biotechnische Verwendung von homothallischen Pilzen der Familie Sordariaceae spricht auch, dass es sich hierbei um keine human-, tier- oder pflanzen- pathogenen Organismen handelt. Ferner können rekombinante Stämme von Sordaria macrospora durch gentechnische Verfahren auch in Kombination mit klassischen (konventionellen) Kreuzungen hergestellt werden, ein erheblicher Vorteil gegenüber imperfekten Pilzen der Gattung Aspergillus.
Die einzigen Sporen, die von homothallischen Pilzen der Familie Sordariaceae und insbesondere von S. macrospora oder S. fimicola gebildet werden, sind sogenannte Ascosporen, die in Fruchtkörpern und Perithezien im Verlauf der sexuellen Fortpflanzung auftreten. Derartige Ascosporen sind im Vergleich zu den Konidiosporen sehr viel größer, schwerer und werden in deutlich geringerer Zahl gebildet. Sie besitzen deshalb eine sehr geringe Verbreitungsfähigkeit. In Submerskulturen bzw. in Schüttelkulturen werden in der Regel keine Ascosporen gebildet. Soll das hergestellte heterologe Protein absolut spo- renfrei sein, so wird in einer besonders bevorzugten Ausführungsform des erfindungs- gemäßen Verfahrens zum Herstellen von heterologem Protein eine sterile Mutante des homothallischen Pilzes der Familie Sordariaceae eingesetzt. Sterile Mutanten-Stämme, die beispielsweise durch Mutagenese von Protoplasten mit EMS oder durch Bestrahlung mit UV-Licht erhalten werden können, weisen keine Vermehrungsstrukturen auf und produzieren daher keine Ascosporen. Beispielsweise können in dem erfindungsgemäßen Verfahren zum Herstellen von heterologem Protein sterile Mutanten von S. macrospora (Esser und Straub, 1958; Masloff et al., 1999; Nowrosian et al., 1999) eingesetzt werden.
Vorzugsweise findet die Kultivierung des zum Herstellen von heterologem Protein eingesetzten homothallischen Pilzes bei einer Temperatur von 27 ± 2°C statt. Dieses Wachstumsoptimum ist deutlich niedriger als das von Neurospora crassa, welches über 30°C liegt. Als wesentlicher sicherheitsrelevanter Aspekt ist anzumerken, dass S. macrospora bei Temperaturen von mehr als 32° C abstirbt.
Gemäß einer bevozugten Ausführungsform der Erfindung stammt der in dem Pilz der Familie Sordariaceae aktive Promotor, unter dessen Kontrolle das heterologe Gen ex- primiert wird, von einem filamentosen Pilz. Dieser Promotor kann beispielsweise der gpd- Promotor aus Aspergillus nidulans sein, vorzugsweise ist der Promotor jedoch ein Promotor aus Sordaria macrospora. Besonders bevorzugte Promotoren sind der cpc2-Pro- motor, der nc/Zcf-Promotor, der ac/ -Promotor oder der ppσ/v-Promotor aus Sordaria macrospora. Der cpc2-Promotor und der t?d/c7-Promotor von S. macrospora werden nachfolgend beschrieben. Das ac/7-Gen von S. macrospora wurde von Nowrousian et al. (1999) beschrieben. Das ppgl -Gen von S. macrospora wurde von Pöggeler (2000) beschrieben.
Vorzugsweise stammt der in dem Pilz der Familie Sordariaceae aktive Terminator von einem filamentosen Pilz. Der Terminator kann beispielsweise der f/pC-Terminator aus Aspergillus nidulans (Mullaney et al., 1985) oder ein Terminator aus Sordaria macrospora sein. Besonders bevorzugte Terminatoren aus S. macrospora sind die hier beschriebenen cpc2- und t7c./ 7-Terminatoren, der ac/7-Terminator (Nowrosian et al., 1999) und der ppgf-Terminator (Pöggeler, 2000).
Vorzugsweise kodiert das heterologe Gen für ein nach Expression in Eukaryonten glyko- syliertes Protein. Bei dem heterologen Gen kann es sich beispielsweise um einen Wachstumsfaktor, ein Cytokin, einen Gerinnungsfaktor, ein industrielles Protein oder ein technisches Enzym handeln. Besonders bevozugt kodiert das heterologe Gen für eines der folgenden Proteine: G-CSF, GM-CSF, IL-1, IL-2, IL-4, IL-6, IL-1ra, IFN- , IFN-ß, IFN-γ, Erythropoietin, Glucoamylase, Gerinnungsfaktor VIII, Gerinnungsfaktor XII, Gerinnungsfaktor XIII, humanes Serumalbumin.
In einer weiteren Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist zwischen dem Promotor und dem heterologen Gen im Leseraster mit dem heterologen Gen eine Sequenz angeordnet, die eine in dem Pilz der Familie Sordariaceae funktionierende Signalsequenz kodiert. Vorzugsweise ist die Signalsequenz eine von einem filamentosen Pilz stammende Signalsequenz, beispielsweise die Signalsequenz der Glucoamylase von Aspergillus niger (Gordon et al. 2000; Gouka et al. 1997). Signalsequenzen aus Sordaria macrospora, z.B. die Signalsequenz des ppgl -Gens von S. macrospora sind besonders bevorzugt.
Eine weitere Aufgabe der Erfindung besteht darin, Promotoren bereitzustellen, die in dem erfindungsgemäßen Verfahren zum Herstellen von heterologem Protein eingesetzt werden können.
Diese Aufgabe wird von einem Nukleinsäure-Molekül gelöst, das:
(1) einen in einem homothallischen Pilz der Familie Sordariaceae aktiven Promotor, der aus folgenden Nukleinsäuren ausgewählt ist:
(a) einer Nukleinsäure mit der in SEQ ID NO:1 angegebenen Sequenz;
(b) einer Nukleinsäure mit der in SEQ ID NO:2 angegebenen Sequenz;
(c) einer Nukleinsäure mit einer Sequenz, die mindestens 50% Identität mit einer der in (a) oder (b) angegebenen Sequenzen aufweist;
(d) einer Nukleinsäure, die mit dem Gegenstrang einer der in (a) oder (b) angegebenen Nukleinsäuren hybridisiert;
(e) einem durch Substitution, Addition und/oder Deletion eines oder mehrerer Nukleotide erhaltenen Derivat einer der in (a) oder (b) angegebenen Nukleinsäuren;
(f) einem Fragment einer der in (a) bis (e) angegebenen Nukleinsäuren, das die Funktion des in dem Pilz der Familie Sordariaceae aktiven Promotors behält;
(g) einer Kombination mehrerer der in (a) bis (f) angegebenen Nukleinsäuren, wobei die Sequenzen der Nukleinsäuren gleich oder verschieden sein können;
oder
(2) eine Nukleinsäure mit einer Sequenz, die zu der Sequenz einer der in (a) bis (g) angegebenen Nukleinsäuren komplementär ist,
umfasst.
Im Sinne der Erfindung bezieht sich der Ausdruck "% Identität" auf Identität auf DNA- Ebene, die gemäß bekannter Verfahren, z.B. der computergestützten Sequenzvergleiche (Altschui et al., 1990) bestimmt werden kann.
Der dem Fachmann bekannte Ausdruck „Identität" bezeichnet den Grad der Verwandtschaft zwischen zwei oder mehr DNA-Molekülen, der durch die Übereinstimmung zwischen den Sequenzen bestimmt wird. Der Prozentsatz der „Identität" ergibt sich aus dem Prozentsatz identischer Bereiche in zwei oder mehr Sequenzen unter Berücksichtigung von Lücken oder anderen Sequenzbesonderheiten.
Die Identität miteinander verwandter DNA-Moleküle kann mit Hilfe bekannter Verfahren bestimmt werden. In der Regel werden spezielle Computerprogramme mit den besonderen Anforderungen Rechnung tragenden Algorithmen eingesetzt. Bevorzugte Verfahren zur Bestimmung der Identität erzeugen zunächst die größte Übereinstimmung zwischen den untersuchten Sequenzen. Computerprogramme zur Bestimmung der Identität zwischen zwei Sequenzen umfassen, sind jedoch nicht eingeschränkt auf, das GCG-Programmpaket, einschließlich GAP (Devereux et al., 1984; Genetics Computer Group University of Wisconsin, Madison, (Wl)); BLASTP, BLASTN und FASTA (Altschul at al., 1990). Das BLAST X Programm kann vom National Centre for Biotechnology Information (NCBI) und aus weiteren Quellen bezogen werden (BLAST Handbuch, Altschul S. et al., NCB NLM NIH Bethesda MD 20894; Altschul et al., 1990). Auch der bekannte Smith Waterman-Algorithmus kann zur Bestimmung von Identität verwendet werden. Bevorzugte Parameter für den Sequenz-Vergleich umfassen die nachstehenden:
Algorithmus: Needleman und Wunsch, J. Mol. Biol 48:443-453 (1970)
Vergleichsmatrix: Übereinstimmung (matches) = + 10,
Nichtübereinstimmung (mismatch) = 0 Lücken-Wert (Gap Penalty): 15
Lückenlängen-Wert: (Gap Length Penalty): 1
Das GAP-Programm ist auch zur Verwendung mit den vorstehenden Parametern geeignet. Die vorstehenden Parameter sind die Standardparameter (default parameters) für Nukleinsäuresequenz-Vergleiche.
Weitere beispielhafte Algorithmen, Lücken-Öffnungs-Werte (gap opening penalties), Lückenausdehnungs-Werte (gap extension penalties), Vergleichsmatrizen einschließlich der im Programm-Handbuch, Wisconsin-Paket, Version 9, September 1997, genannten können verwendet werden. Die Auswahl wird von dem durchzuführenden Vergleich abhängen und weiterhin davon, ob der Vergleich zwischen Sequenzpaaren, wobei GAP oder Best Fit bevorzugt sind, oder zwischen einer Sequenz und einer umfangreichen Sequenz-Datenbank, wobei FASTA oder BLAST bevorzugt sind, durchgeführt wird.
Das Merkmal "Sequenz, die mit dem Gegenstrang einer Sequenz nach (a) oder (b) hybridisiert" weist auf eine Sequenz hin, die unter stringenten Bedingungen mit dem Gegenstrang einer Sequenz mit den unter (a) oder (b) angegebenen Merkmalen hybridisiert. Beispielsweise können die Hybridisierungen bei 68°C in 2 x SSC durchgeführt werden. Beispiele für stringente Bedingungen werden in Sambrook et al. (1989) angegeben.
Die in SEQ ID NO:1 bzw. SEQ ID NO:2 angegebenen Sequenzen entsprechen der Promotorsequenz des aus S. macrospora isolierten ndkl- bzw. cpc2-Gens. Die in (c) angegebene Nukleinsäure kann auch mindestens 60%, 70%, 80% oder 90% Identität mit einer der in (a) oder (b) angegebenen Sequenzen aufweisen. Besonders bevorzugt weist sie 95% Identität mit einer dieser Sequenzen auf.
Ferner stellt die Erfindung einen Vektor zur Transformation eines homothallischen Pilzes der Familie Sordariaceae bereit, der folgende Elemente in funktioneller Verbindung miteinander enthält: - einen in dem Pilz der Familie Sordariaceae aktiven Promotor,
- ein heterologes Gen,
- einen in dem Pilz der Familie Sordariaceae aktiven Terminator sowie
- einen Selektionsmarker.
Der in dem Pilz der Familie Sordariaceae aktive Promotor des erfindungsgemäßen Vektors kann der grpc/-Promotor aus Aspergillus nidulans sein. Als Promotoren werden jedoch die vorstehend unter (1) beschriebenen Nukleinsäuren besonders bevorzugt. Der ac/7- und der ppα/f-Promotor aus Sordaria macrospora sind ebenfalls bevorzugt.
Der in dem erfindungsgemäßen Vektor enthaltene Terminator kann der f/pC-Terminator aus Aspergillus nidulans sein, der cpc2-Terminator, der nd/fZ-Terminator, der ac/7-Termi- nator oder der ppgv-Terminator aus Sordaria macrospora sind jedoch besonders bevorzugt. Als Selektionsmarker eignet sich beispielsweise das ura5-Gen aus Sordaria macrospora (Le Chevanton und Lebion, 1989) oder Podospora anserina (Turcq und Be- gueret, 1987). Vorzugsweise wird als Selektionsmarker ein Hygromycin B-Resistenz-Gen (siehe z.B. Kaster et al., 1983) eingesetzt.
Die Erfindung stellt ferner einen Wirtsorganismus bereit. Bei diesem Wirtsorganismus handelt es sich um einen homothallischen Pilz der Familie Sordariaceae, der einen erfindungsgemäßen Vektor enthält. Vorzugsweise gehört der Wirtsorganismus der Gattung Sordaria an, besonders bevorzugt ist der Wirtsorganismus Sordaria macrospora oder Sordaria fimicola. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei dem Wirtsorganismus um einen sterilen Stamm, der weder asexuelle Mito- noch sexuelle Meiosporen bildet.
Ferner stellt die Erfindung einen Kit bereit, der:
(a) einen erfindungsgemäßen Vektor und
(b) einen zum Herstellen von heterologem Protein geeigneten homothallischen Pilz der Familie Sordariaceae
umfaßt.
Das Nukleinsäuremolekül, der Vektor, der Wirtsorganismus und der Kit gemäß der Erfindung können zur Expression eines heterologen Gens unter der Kontrolle des Promotors oder zum Herstellen von einem oder mehreren Proteinen verwendet werden.
Die folgenden Figuren und Beispiele erläutern die Erfindung.
Figur 1 zeigt das Autoradiogramm einer Northem-Hybridisierung. In den einzelnen Spuren wurden 5 μg mRNA von S. macrospora aufgetragen, in den ungeraden Spuren vom Wildtypstamm, in den geraden von der sterilen Mutante inf. Als Sonde wurden das acll- Gen (Spur 1 , 2), das cpc2-Gen (Spur 3, 4), das ndk1-Gen (Spur 5, 6) und das ppg 7-Gen (Spur 7, 8) verwendet. In den Spuren 1, 2 ist ein ac/7-Transkript der Größe 2,7 kb, in den Spuren 3, 4 ein cpc2-Transkript von 1 ,7 kb, in den Spuren 5, 6 ein πd/d-Transkript von 1 ,5 kb und in den Spuren 7, 8 ein ppg 7-Transkript von 0,65 kb zu erkennen.
Figur 2 zeigt die Nukleotidsequenz des r?c./c1-Gens (Teilfragment) von S. macrospora, inkl. der Promotorregion von ca. 1 ,4 Kb.
Figur 3 zeigt die Nukleotidsequenz des cpc2-Gens von Sordaria macrospora und die davon abgeleiteten Aminosäuresequenzen. Die Intronsequenzen (4) sind durch Unterstreichung gekennzeichnet, der Promotor befindet sich im Abschnitt von Nukleo- tid 1-2611 , die Terminationssequenz ist in dem Bereich zwischen Nukleotid 4258 und Nukleotid 4539 zu finden.
Figur 4 zeigt das Klonierungsschema für den Expressionsvektor pMN110.
Figur 5 zeigt die Nukleotidsequenz (Promotor und Terminator) des Plasmids pMN110. Die Sequenzen stammen von dem ac/1 -Gen von S. macrospora.
Figur 6 zeigt das Klonierungsschema für den Expressionsvektor pMN112.
Figur 7 zeigt die physikalisch-genetische Karte des Plasmids pMN112.
Figur 8 zeigt die physikalisch-genetische Karte des Plasmids pSMY1-1.
Figur 9 zeigt die Nukleotidsequenz in der Nähe des ATG-Startcodons des /acZ-Gens des Plasmids pSMYL
Figur 10 zeigt die physikalisch-genetische Karte des Plasmids pSMY4-1.
Figur 11 zeigt das Klonierungsschema für den Expressionsvektor pSMY3. Figur 12 zeigt die physikalisch-genetische Karte des Plasmids pPROM
Figur 13 zeigt die physikalisch-genetische Karte des Plasmids pTERMI .
Figur 14 zeigt die physikalisch-genetische Karte des Plasmids pSMY2.
Figur 15 zeigt die physikalisch-genetische Karte des Plasmids pSMY3.
Figur 16 zeigt die Nukleotidsequenz des Insertfragmentes des Plasmids pSMY3.
Figur 17 zeigt die physikalisch-genetische Karte des Plasmids pSE40-6.
Figur 18 zeigt die physikalisch-genetische Karte des Plasmids pSE43-2.
Figur 19 zeigt mikroskopische Aufnahmen von transgenen S. macrospora-Stämmen (T1p40-6, T1p43-2), welche die Plasmide pSE40-6 bzw. pSE43-2 tragen, (a) Interferenzmikroskopisches und (b) fluoreszenzmikroskopisches Bild.
Figur 20 zeigt die physikalisch-genetische Karte des Plasmids pSMY5-1.
Figur 21 zeigt die physikalisch-genetische Karte des Plasmids GV-MCS.
Figur 22 zeigt die physikalisch-genetische Karte des Plasmids GV-ndk1-MCS-acl1.
Figur 23 zeigt die physikalisch-genetische Karte des Plasmids GV-cpc2-MCS-acl1.
Figur 24 zeigt das Plasmid pEGFP/gpd/tel, das als Ausgangsplasmid für die Klonierung der Plasmide pSM1 und pSM2 diente.
Figur 25 zeigt das Klonierungsschema des Plasmids pSM1.
Figur 26 zeigt das Klonierungsschema des Plasmids pSM2.
Figur 27 zeigt die fluoreszenzmikroskopische Analyse von Asci mit Ascosporen von S. macrospora-Transformanden, die das Plasmid pEGFP/gpd/tel tragen. Der abgebildete Stamm entstammt einer Kreuzung der S. macrospora Transformande T-EG2 und der Farbspormutante von S. macrospora FUS1. Letztere trägt kein g p-Gen. Zur Interpretation der fluoreszenzmikroskopischen Aufnahme (unten) ist oben das entsprechende lichtmikroskopische Bild wiedergegeben. Figur 28 zeigt mikroskopische Aufnahmen eines transgenen S. macrospora-Stamms, der das EGFP-Gen unter der Kontrolle des rttf/cf-Promotors exprimiert. (a) Interferenz-mikroskopisches und (b) fluoreszenzmikroskopisches Bild.
Beispiele Material und Methoden
Die molekularbiologischen und mikrobiologischen Arbeiten wurden mit Standardmethoden nach dem Stand der Technik durchgeführt (siehe z.B. Sambrook et al., 1989).
A. Anzucht von S. macrospora
1 ) Nährmedien
- BMM (Fruktifikationsmedium): 0,8 % Biomalz in Maismehlextrakt, pH 6,5
- BMM + NaAc (Sporenkeimmedium): BMM + 0,5 % NaAc, pH 6,0
- CCM: 0,3 % Saccharose, 0,05 % NaCI, 0,5 % K2HPO4, 0,05 % MgSO4, 0,001 % FeSO4,
0,5 % Tryptic Soy Broth, 0,1 % Hefeextrakt, 0,1 % Fleischextrakt, 1 ,5 % Dextrin pH 7.0
- GM (Minimalmedium): 2 % Glukose, 0,7 % Bacto Yeast Nitrogen Base, 0,4 μM Biotin,
25 μl/L Mineralkonzentrat (5 % Ascorbinsäure, 5 % ZnSO x 7H2O, 1 % Fe(NH4)2(SO4)2 x 6H2O, 0,25 % CuSO4 x 5H2O, 0,05 % MnSO4 x 1H2O, 0,05 % H3BO4, 0,05 % Na2MoO4, 1 % Chloroform, pH 6.0 - GMU: G mit 10 mM Uridin
- GMS: GM mit 10 % Saccharose
- LB: 1 % Bacto-Trypton, 0,5 % Hefeextrakt, 0,5 % NaCI, pH 7.2
- CM: 0,15 % KH2PO4, 0,05 % KCI, 0,05 % MgSO4, 0,37 % NH4CI, 1 % Glukose, 0,2 % Trypton, 0,2 % Hefeextrakt, Spurenelemente, pH 6.4 - 6.6
- CMS: CM-Medium mit 10,8 % Saccharose
- MM (Minimalmedium): 55,5 mM Glukose, 1,8 mM KH2P0 , 1 ,7 mM K2HPO4l 8,3 mM
Harnstoff, 1 mM MgSO ) 5 μM Biotin, 0,1 ml/l Mineralkonzentrat (vgl. GM-Medium) - MMU: MM mit 10 mM Uridin
- Festmedien: jeweils 1 ,5 % Agar, GM-Topagar: 0,4 % Agar
2. Anzuchtbedinαunαen
In der Regel erfolgt die Anzucht bei 27°C. Zur Fruktifikation wird S. macrospora auf Festmedien angezogen; bereits nach 7 Tagen Kultur kann die Fruktifikation beobachtet werden. Für Nukleinsäurepräparationen wird S. macrospora auf Flüssigmedien angezogen, in der Regel in Standkulturen in Fernbachkolben.
B. Herstellung steriler S. macrosoora-Stämme
1) UV-Mutagenese
Zur UV-Mutagenese wird eine Protoplastensuspension (1 ,5 x 108 Protoplasten pro ml Protoplastenpuffer) vom Sordaria macrospora Wildtypstamm ATCC MYA-334 hergestellt. Die Suspension wird bei leichter Schüttelbewegung UV-Licht (0,05 μW/cm2) ausgesetzt. Die Zeiten variieren zwischen 10 und 20 min. Anschließend werden die Protoplasten auf CMS-Festmedium (0,15 % KH2PO4, 0,05 % KCI, 0,05 % MgSO4l 0,37 % NH4CI, 1 % Glukose, 0,2 % Trypton, 0,2 % Hefeextrakt, Spurenelemente, pH 6,4 - 6,6, 10,8 % Saccharose, 1 ,5 % Agar) ausplattiert und ca. 48 Std bei 27° C inkubiert. Danach werden die regenerierten Protoplasten auf MB-Festmedium (0,8 % Biomalz in Maismehlextrakt, pH 6,5, 1,5 % Agar) überimpft. Nach 1-4 Wochen erfolgt die phänotypische Charakterisierung der Klone, um Sterilmutanten zu identifizieren. Diese sind in der Regel durch eine veränderte Fruchtkörperbildung gekennzeichnet. Um Mutanten von Varianten zu unterscheiden, wird die mitotische Stabilität der Stämme durch Überimpfen auf MB- Medium getestet. Nach einer Wuchsstrecke von ca. 7 cm wird das Myzel erneut auf frisches Nährmedium übertragen. Dieser Vorgang wird dreimal wiederholt. Nach diesem Test der mitotischen Stabilität werden die sterilen Stämme in Kreuzungsexperimenten genetisch überprüft, um Ascosporen zu vereinzeln. Dadurch werden homokaryotische Stämme erzeugt.
2) EMS-Mutaqenese
Bei der EMS-Mutagenese wird Ethylmethylsulfonat als mutagenes Agens eingesetzt. Zur Mutagenese werden 5 x 106 Protoplasten des Wildtypstamms von Sordaria macrospora (siehe oben) in einem Gesamtvolumen von 500 μl mit EMS behandelt. Die Endkonzentration von EMS (σM-0880) beträgt 34,1 mg/ml. Die Mutagenese wird für 45 Min. bei 27°C durchgeführt. Anschließend werden die Protoplasten, wie oben unter 1) ausgeführt auf CMS-Festmedium ausplattiert und wie dort beschrieben weiter behandelt.
Die erzeugten Stämme werden im Folgenden durch „ inf" (infertil) gekennzeichnet.
C. Transformation von sterilen S. macrospora-Stämmen
Die Transformation von S. macrospora-M utanten erfolgt verändert nach Walz und Kück (1995). Pilzmyzel des zu transformierenden Stammes wird 2 Tage bei 27°C in CM-Flüs- sigmedium (0,15 % KH2P0 , 0,05 % KCI, 0,05 % MgSO4, 0,37 % NH4CI, 1 % Glukose, 0,2 % Trypton, 0,2 % Hefeextrakt, Spurenelemente, pH 6,4 - 6,6, 10,8 % Saccharose, 1,5 % Agar) als Standkultur angezogen. Nach einem Waschschritt des Myzels in Pro- toplastenpuffer (13 mM Na2HPO4, 45 mM KH2P04, 600 mM KCL, pH 6,0) und anschließender Filtration wird das Myzel in Novozym-Lösung (10 mg Novozym 234 (Novo Nor- disk)/ml Protoplastenpuffer) aufgenommen. Nach 45 minütiger Inkubation bei 100 UpM und 27° C erfolgt die Abtrennung der Protoplasten vom Restmyzel über eine Glasfritte (Porengröße 1 , Schott). Nach dem Pelletieren der Protoplasten durch Zentrifugation werden die Zellen zweimal in Protoplastenpuffer gewaschen und jeweils erneut sedi- mentiert. Im Anschluß folgt die Aufnahme der Protoplasten in Transformationspuffer (1 M Sorbit, 80 mM CaCI2, pH 7,5), so dass der Protoplastentiter 2 x 108/ml beträgt. Für die Transformation werden jeweils 2 x 107/ml Protoplasten mit 20 μg Plasmid-DNA bzw. 20 μl Cosmid-DNA vermischt und für 10 min auf Eis inkubiert. Nach Zugabe von 200 μl 25%igem PEG (in Transformationspuffer) folgt eine Inkubation für 20 min bei RT. Von dem Transformationsansatz werden jeweils 100-200 μl in verschiedenen Ansätzen direkt auf das CMS-Medium ausplattiert. Nach einer maximal 12stündigen Inkubation bei 27°C werden die regenerierenden Protoplasten mit Hygromycin B-haltigem Topagar (0,8 M NaCI, 0,8 % Agar) überschichtet. Dabei ist die Hygromycin B-Konzentration im Topagar so gewählt, dass eine Endkonzentration von 110 U/ml im gesamten Medium vorliegt. Transformanden erscheinen nach 2 bis 4 Tagen und werden auf BMM-Medium (0,8 % Biomalz in Maismehlextrakt, pH 6,5), das 100 U/ml Hygromycin B enthält, überimpft. Die phänotypische Untersuchungen der Mutanten erfolgen auf BMM-Medium ohne Selektionsdruck.
D. Heterologe Genexpression in Sordaria macrospora
Zum Nachweis der heterologen Genexpression in Sordaria macrospora werden Transformanden von Sordaria macrospora sowie die entsprechende Wildtypkontrolle in CM- Medium überführt und bei 27°C inkubiert. Medien bzw. Pilzmyzel werden durch Zentrifugation bzw. Filtration geerntet.
Beispiel 1 Vergleich der transkriptioneilen Expression der ndkl-, cpc2-, ppgl-, und ach -Gene in Sordaria macrospora
Zum Vergleich der transkriptioneilen Expression der ndkl-, cpc2-, ppgl-, und ac/7-Gene in Sordaria macrospora wurden in einer Northern-Hybridisierung die verschiedenen Transkripthäufigkeiten für verschiedene Stämme ermittelt. Dazu wurden 5 μg mRNA vom Wildtypstamm bzw. von der Sterilmutante inf aufgetragen und mit den jeweiligen Sonden, die spezifisch für die oben genannten Gene waren, hybridisiert. In dem in Figur 1 gezeigten Autoradiogramm ist zu erkennen, dass das ppg1-Gen zwar die schwächsten Signale ergibt, im Vergleich zu sogenannten „house-keeping"-Genen (wie z.B. α- bzw. ß-Tubulingen) wird das ppg7-Gen jedoch stark transkribiert. Deutlich stärker fällt das Signal für das acl1-Gen aus, die stärksten Signale wurden für das cpc2- und das ndkl- Gen gefunden. Das Autoradiogramm macht deutlich, dass die vier Gene aufgrund ihrer hohen transkriptioneilen Expression für die Konstruktion von Expressionsvektoren geeignet sind.
Beispiel 2 Klonierung der regulatorischen Sequenzen des cpc2- und des ncMcf-Gens von
S. macrospora
Zur Klonierung des cpc2- und des ndkl-Gens aus S. macrospora wurde ein Set von Oli- gonukleotiden synthetisiert (siehe Tabelle 2), die die Durchführung von PCR-Amplifikatio- nen ermöglichen. Unter Verwendung genomischer DNA von S. macrospora wurden die Oligonukleotid-Primer 1095 und 1096 für die PCR-Amplifikationen des cpc2-Gens und die Oligonukleotid-Primer 1265 und 1266 für die Amplifikation des ndk" -Gens eingesetzt. Die dabei entstehenden Amplifikate von 655 Bp (cpc2) bzw. 594 Bp (ndk ) wurden anschließend für die DNA-Sequenzierung verwendet. Die DNA-Sequenz des nd/d-Gens, die auch einen 1 ,4 Kb großen Promotorbereich vor dem putativen ATG-Startkodon enthält, ist in Figur 2 angegeben. Das ATG-Startkodon ist in dieser Sequenz an der Position 1384-1386 lokalisiert. Die Nukleinsäuresequenz und die davon abgeleiteten Aminosäuresequenzen des cpc2-Gens sind in Figur 3 angegeben.
Anschließend wurden die Genfragmente für sogenannte Northern-Hybridisierungen benutzt, dabei wurden Vergleichshybridisierungen mit anderen Genen von S. macrospora durchgeführt. Aus den vergleichenden Hybridisierungen mit 10 verschiedenen S. macrospora-Gensonden geht hervor, dass das cpc2-Gen bzw. das nd/d-Gen von S. macrospora ein sehr hohes transkriptionelles Niveau besitzt. Im Vergleich zu Hybri- disierungssignalen mit anderen Sonden ist dieses Niveau deutlich höher einzustufen. Um diese Gene für die Konstruktion von Expressionsvektoren zu nutzen, wurden anschlie- ßend die vollständigen genomischen Kopien beider Gene aus einer indizierten genomischen Cosmid-Genbank von S. macrospora (Pöggeler et al. 1997) isoliert. Das Screening resultierte in der Isolation der Cosmid-Klone VIG10 (cpc2) und VIIG10 (/7d/ 1). Zur eindeutigen Identifizierung der regulatorischen Sequenzen wurden Subfragmente beider Cosmid-Klone sequenziert.
Beispiel 3 Subklonierung des cpc2-Promotors
Zur Subklonierung des cpc2-Promotors wurde der entsprechende Cosmid-Klon mit EcoRV verdaut. Es wurde ein 3,0 kb großes Fragment identifiziert, welches den cpc2- Promotor trägt. Dieses Fragment wurde in einem „Shot-gun"-Experiment in den EcoRV linearisierten Vektor pBCKS+ (Strategene, La Jolla, Kalifornien) eingefügt. Die nach Transformation von E. coli mit dem rekombinanten Vektor erhaltenen Transformanden wurden durch Koloniefilter-Hybridisierung weiter analysiert. Unter ca. 600 E.coli -Transformanden konnten mehrere positive Klone identifiziert werden. Dies führte schließlich zur Isolation eines Einzelklons, der das rekombinante Plasmid pSE36-5 trägt. In der anschließenden Kontroll-DNA-Sequenzierung konnte eindeutig nachgewiesen werden, dass dieses rekombinante Plasmid Teile des cpc2-Gens trägt, und zwar die Sequenz von Nu- kleotid-Position 1 bis zur Nukleotid-Position 2981 in der Figur 3.
Zur Subamplifizierung von Teilen des cpc2-Promotors aus dem Plasmid pSE36-5 wurden die Oligonukleotidpaare cpc9/cpc11 und cpc10/cpc12 verwendet. Das Oligonukleotidpaar cpc9/cpc11 ermöglicht die Amplifikation eines 1359 bp großen Amplikons (Nukleotid-Po- sitionen 1250-2609 in Figur 3), welches aufgrund der Oligonukleotidsequenz an den beiden Enden Λ/col-Überhänge trägt. Mit dem Oligonukleotidpaar cpc10/cpc12 konnte ebenfalls ein 1359 bp großes Fragment amplifiziert werden, hier werden an die Enden des Fragmentes EcoRVrErkennungssequenzen generiert. Die Sequenz dieses Fragments entspricht der Sequenz von Nukleotid-Position 1250 bis zur Nukleotid-Position 2609 in der Figur 3.
Die oben beschriebenen Amplifikate wurden anschließend in den Vektor pDrive (Qiagen, Hilden, BRD) subkloniert. Nach der entsprechenden Ligation und Transformation in E. coli wurden rekombinante Stämme durch DNA-Hybridisierung identifiziert. Als Resultat wurden zwei rekombinante Plasmide mit der folgenden Bezeichnung erhalten: a) pSE38-16 enthält ein etwa 1 ,4 kb großes EcoRV-Fragment in dem Vektor pDrive;
b) pSE39-14 enthält ein etwa 1 ,4 kb großes Λ/col-Fragment in dem Vektor pDrive.
Beispiel 4 Konstruktion von Expressionsvektoren mit regulatorischen Elementen des ach -Gens von S. macrospora
Bei Tieren und Pilzen ist die ATP-Citratlyase (ACL) im Cytosol lokalisiert, während das homologe Protein in Pflanzen im Chloroplasten lokalisiert ist. Bei allen drei Organismensystemen produziert ACL Acetyl-CoA, welches vornehmlich für die Fettsäure- und Sterol- biosynthese benutzt wird. In Pilzen besteht das Enzym aus zwei Untereinheiten, die von zwei separaten Genen (ac/7, acl2), die benachbart auf der chromosomalen DNA lokalisiert sind, kodiert werden (Nowrousian et al., 2000). Im Gegensatz dazu wird das kontinuierliche Polypeptid bei Tieren von einem Gen kodiert.
Das Promotorelement des ac/7-Gens von S. macrospora (Nowrousian et al. 1999) wurde für die Konstruktion des Expressionplasmids pMN110 verwendet (siehe Figur 4). Zur Amplifikation der Promotorsequenz wurden die Oligonukleotide 1197 und 1199 (Tabelle 2) zusammen mit der genomischen DNA von S. macrospora als Template-DNA eingesetzt. Die Klonierungen des erwarteten Fragments in einer Größe von 2,3 Kb erfolgte in das Plasmid pMON 38201 (Borovkov und Rivkin, 1997). Das resultierende Plasmid erhielt die Bezeichnung pMN95. Anschließend wurde die Terminatorsequenz des ac/7-Gens amplifiziert und kloniert. Auch in diesem Fall diente die genomische DNA von S. macrospora als Template-DNA, um durch PCR mit den Oligonukleotiden 1194 und 1200 ein Fragment von einer Größe von 0,6 Kb zu generieren. Das resultierende Plasmid erhielt die Bezeichnung pMN102. Anschließend erfolgte eine Umklonierung der Terminatorsequenz aus dem Plasmid pMN102 in den Vektor pKS+ (Stratagene, La Jolla, Kalifornien). Zu diesem Zweck wurde das Plasmid pMN102 mit den Enzymen No und Sa hydrolysiert. Das entstehende Restriktionsfragment von 0,6 Kb wurde in den Not\- und Sacl-restringierten Vektor pKS+ ligiert. Das daraus resultierende Plasmid erhielt die Bezeichnung pMN109. Dieses Plasmid wurde anschließend mit den Enzymen HindWl und Noü restringiert und mit dem 2,3 Kb großen Fragment des Plasmids pMN95 ligiert. Das resultierende Plasmid erhielt die Bezeichnung pMN110 und diente für weitere Klonierungen. Die Klonierungsstrategie ist in Figur 4 und die entsprechende Sequenz der Insert- DNA des Plasmides pMN110 ist in der Figur 5 wiedergegeben. Im nächsten Klonierungsschritt wurde das Plasmid pMN112 konstruiert, das für die Transformation von S. macrospora und für die Transformation von E. coli geeignet ist (siehe Figur 6). Zu diesem Zweck wurde das Plasmid pBCHygro (Silar, 1995) mit Not\ hydrolysiert und die entsprechenden Restriktionsenden mit Hilfe der Klenow-Polymerase aufgefüllt. Das resultierende lineare Plasmid mit aufgefüllten Λ/ofl-Enden wurde mit dem Enzym C/al restringiert. Dadurch entsteht ein lineares Vektormolekül, das durch ein „Blunt"-Ende bzw. durch einen C/al-Schnitt terminiert ist. Dieses so behandelte Vektormolekül wurde in einer Ligation eingesetzt, bei der ein 2,9 Kb großes Fragment aus dem Plasmid pMN110 eingesetzt wurde. Dieses Fragment wurde dadurch generiert, dass das Plasmid pMN110 mit dem Enzym Hind\\\ linearisiert wurde. Anschließend erfolgte eine Auffüllung der überstehenden Restriktionsenden mit Klenow-Polymerase, um „Blunt"-En- den zu generieren. Dieses so behandelte Restriktionsfragment wurde anschließend mit dem Enzym C/al restringiert und nach Gelelektrophorese eluiert, um für die oben besprochene Ligation eingesetzt zu werden. Die Klonierungsstrategie wird in Figur 6 gezeigt und das resultierende Plasmid pMN112 ist in der Figur 7 wiedergegeben. Es besitzt eine Gesamtgröße von 9,605 Kb.
Das Expressionsplasmid pMN112 kann zur Herstellung heterologer Proteine in S. macrospora eingesetzt werden. In diesem Plasmid ist der ac/1 -Promotor mit dem ac/1- Terminator durch einen Λ/ofl-Restriktionsschnitt verbunden. Dieser singuläre Λ/ofl-Re- striktionsschnitt ist für die Insertion von Fremd-DNA geeignet, die unter der Kontrolle des ac/1 -Promotors exprimiert werden soll.
Beispiel 5 Produktion von bakterieller ß-Galaktosidase in Sordaria macrospora unter der
Kontrolle des ac/f-Promotors
Um das bakterielle ß-Galaktosidasegen (lac∑) in S. macrospora zu exprimieren, wurde das Plasmid pSMY1-1 konstruiert. Das Plasmid pSMY1-1 wurde erzeugt, indem das /acZ-Gen in die singuläre Λ/ofl-Restriktionsschnittstelle des Plasmids pMN112 inseriert wurde. Das /acZ-Gen wurde aus dem Plasmid pSI8.8 (Menne et al., 1994) durch PCR- Amplifikation generiert. Zu diesem Zweck wurden die Oligonukleotide 1206 und 1215 (Tabelle 2) verwendet, die terminal die Erkennungssequenz für das Restriktionsenzym Not\ besitzen. Das Amplifikat besitzt eine Größe von 3,0 Kb und wurde in die singuläre Schnittstelle des Plasmids pMON 38201 (Borovkov und Rivkin 1997) inseriert. Das resul- tierende Plasmid erhielt die Bezeichnung pMN104, welches anschließend mit Noü hy- drolysiert wurde. Das resultierende 3,0 Kb Λ/ofl-Fragment wurde in das mit Noü lineari- sierte Plasmid pMN112 (siehe Figur 7) inseriert. Die resultierenden Plasmide pSMY1-1 (Figur 8) und pSMY1-2 unterscheiden sich durch die Orientierung des /acZ-Gens. Im Plasmid pSMY1-1 befindet sich das /acZ-Gen unter der Kontrolle des ac/1 -Promotors. Beim pSMY1-2 liegt eine inverse Anordnung des /acZ-Gens gegenüber dem Plasmid pSMY1-1 vor, dadurch ist keine ac/1 -Promotor kontrollierte Expression möglich. Somit kann das Plasmid pSMY1-2 als Kontrolle in Expressionsexperimenten eingesetzt werden. Alle entstandenen Konstrukte wurden durch Kontroll-DNA-Sequenzierung auf ihre Richtigkeit hin überprüft. Die Sequenz am ATG-Startkodon im Plasmid pSMY1-1 ist in der Figur 9 wiedergegeben.
Nach Transformation von Sordaria macrospora mit den Expressionsplasmiden pSMY1-1 und pSMY1-2 wurden die auf Hygromycin selektierten Transformanden hinsichtlich der Bildung des heterologen Genproduktes ß-Galaktosidase untersucht. Das Pilzmyzel wurde zu diesem Zweck mit Glasperlen und Extraktionspuffer (2,5 mM Tris-HCI (pH 8), 125 mM NaCI, 2 mM MgCI2, 12 mM ß-Mercaptoethanol (pH 7,5), 2 mM 4-Methylumbelliferyl- ß-D-galaktopyranosid, 10 % (v/v) DMF) versetzt und durch intensives Vortexen aufgeschlossen. Die Zelltrümmer wurden durch Zentrifugation abgetrennt. Der Nachweis der ß-Galaktosidase-Aktivität im Protein-Rohextrakt der pSMY1-1 -Transformande erfolgt durch die Messung der Freisetzung des fluoreszierenden 4-MethyIumbilliferon aus 4-Methylumbelliferyl-ß-D-galaktopyranosid. Während im Rohextrakt der SMY1-1- Transformande ß-Galaktosidase-Aktivität nachgewiesen wurde, war im Rohextrakt der SMY1-2-Transformande, bei der die Expressionskassette das /acZ-Gen in der inversen Orientierung enthält, ß-Galaktosidase-Aktivität nicht nachweisbar.
Beispiel 7
Produktion des Prä-Proteins des humanen Serumalbumins unter der Kontrolle des ac/f-Promotors von Sordaria macrospora
Um das Prä-Protein des menschlichen Serumalbumins (HSA) in Sordaria zu produzieren, wurde das hsa-Gen (aus Plasmid pPreHSA, Rhein Biotech GmbH, Düsseldorf, BRD) in den Expressionsvektor pMN112 kloniert. Zu diesem Zweck wurde das Gen für das PräProtein des humanen Serumalbumins (PreHsa) durch Amplifikation gewonnen. Mit Hilfe der Oligonukleotide hsal und hsa2 unter Verwendung des Plasmids pPreHsa als Tem- plate-DNA wurde das Gen amplifiziert. Das 1 ,8 Kb große Amplifikat besitzt terminal Noü- Restriktionsstellen. Das PCR-Fragment wurde in den mit Xcml-restringierten Klonie- rungsvektor pMON 38201 (Borovkov und Rivkin 1997) durch Ligation inseriert. Das resultierende Plasmid erhielt die Bezeichnung pMON-HSA. Das Insert des Plasmids pMON- HSA wurde durch Sequenzierung überprüft. Dieses Plasmid wurde anschließend mit dem Enzym Noü restringiert und das resultierende 1 ,8 Kb große Fragment in den mit Noü restringierten Vektor pMN112 inseriert. Das so erzeugte Plasmid erhielt die Bezeichnung pSMY4-1 (Figur 10). Der ebenfalls durch Klonierung entstandene Vektor pSMY4-2 enthält das PreHsa-Gen in inverser Orientierung und wurde als Negativ-Kontrolle für die Ex- pressionsexperimente eingesetzt. Alle entstandenen Konstrukte wurden durch Kontroll- DNA-Sequenzierung auf ihre Richtigkeit hin überprüft.
Nach Transformation von Sordaria macrospora mit den Expressionsplasmiden pSMY4-1 und pSMY4-2 wurden die auf Hygromycin selektierten Transformanden hinsichtlich der Bildung des heterologen Genproduktes HSA untersucht. Das Pilzmyzel wurde zu diesem Zweck mit Glasperlen und Extraktionspuffer (2,5 mM Tris-HCI (pH 8), 125 mM NaCI, 2 mM MgCI2, 12 mM ß-Mercaptoethanol (pH 7,5)) versetzt und durch intensives Vortexen aufgeschlossen. Die Zelltrümmer wurden durch Zentrifugation abgetrennt. Der Nachweis des HSA im Protein-Rohextrakt erfolgte mittels eines Enzyme-Linked Immunosorbent Assays (ELISA). Die Gesamtproteinextrakte wurden in die Kavitäten einer Mikrotiterplatte (MaxiSorp, Nunc) pipettiert und über Nacht bei 4°C inkubiert. Nach dreimaligem Waschen der Platte mit PBS-Puffer (137 mM NaCI, 2,7 mM KCI, 4,3 mM Na2HPO4, 14 mM KH2PO4, pH 7,4), der 0,05% Tween®20 enthielt, wurden die freien Bindungsstellen eine Stunde lang mit einer 0,2%igen Tween®20-Lösung in PBS-Puffer blockiert. Nach erneutem dreimaligen Waschen wurde mit Peroxidase gekoppelter HSA-Antikörper (BioTrend, Köln, BRD; 1:1000 verdünnt in PBS-Puffer mit 0,05% Tween®20) hinzugefügt und eine Stunde lang bei Raumtemperatur inkubiert. Die Entwicklung des ELISA erfolgte durch Farbreaktion des Peroxidase-Substrates 3,3',5,5'-Tetramethylbenzidine (TMB) in Gegenwart von Wasserstoffperoxid nach den Angaben des Herstellers (Pierce, Helsing- borg). In den Rohextrakten der SMY4-1 -Transformanden konnte HSA nachgewiesen werden; in den Expressionskontrollen mit dem Ausgangsstamm sowie den SMY4-2-Transformanden war der HSA-Nachweis negativ. Beispiel 6
Konstruktion von Expressionsvektoren mit regulatorischen Elementen des ppg-f-Gens von Sordaria macrospora
Das ppg1-Gen für das Sexualpheromon von S. macrospora kodiert für ein Präproprotein von 277 Aminosäuren. Hier eingeschlossen ist ein Leader-Peptid von 16 Aminosäuren (Pöggeler, 2000), das als Signalsequenz für die Proteinsekretion eingesetzt werden kann.
Für die Konstruktion des Expressionsplasmids pSMY3 wurde die Promotorsequenz, die Leader-Peptid kodierende Sequenz sowie die Terminationssequenz des ppg7-Gens verwendet (siehe Figur 11).
Für die Klonierung der Promotorsequenz zusammen mit der das Leader-Peptid kodierenden Sequenz wurden die Oligonukleotide ppg1-1 und ppg1-2 verwendet. Beide Oligonu- kleotide enthielten Sequenzen für Restriktionsendonukleasen (siehe Tabelle 2). Im Falle des Oligonukleotids ppg1-1 wurde die Erkennungssequenz für das Enzym Sacl verwendet, im Fall des Oligonukleotids ppg1-2 die für das Enzym Noü. Für die Amplifikation mit diesen beiden Oligonukleotiden wurde die genomische DNA von S. macrospora eingesetzt. Die Amplifikation lieferte ein 1 ,8 Kb großes Fragment.
Die Terminationssequenz des ppαl-Gens wurde ebenfalls durch Amplifikation der entsprechenden Sequenz gewonnen. Hierzu wurden die Oligonukleotide ppg1-3 sowie ppg1-4 verwendet. Beide Oligonukleotide enthalten ebenfalls Sequenzerweiterungen für die Enzyme Noü (ppg1-3) bzw. für das Enzym SamHI (ppg1-4). Die Amplifikation mit diesen beiden Oligonukleotiden wurde wiederum unter Verwendung genomischer DNA von S. macrospora vorgenommen und lieferte ein 880 Bp großes DNA-Fragment.
Die beiden Amplifikate wurden wie oben beschrieben in den mit Xcm\ linearisierten Vektor pMON38201 inseriert. Die aus der Klonierung resultierenden Plasmide erhielten die Bezeichnung pPROMI (enthält die Promotorregion), bzw. pTERMI (enthält die Terminatorsequenz). Die physikalisch-genetische Karte der Plasmide pPROMI und pTERMI ist in der Figur 12 bzw. Figur 13 wiedergegeben.
Anschließend erfolgte die Umklonierung der Promotorsequenz in den Transformationsvektor pCB1004 (Carroll et al., 1994). Zu diesem Zweck wurde das Plasmid pPROMI mit Sacl und Noü restringiert, und in den SacUNoü hydrolysierten Vektor pCB1004 inseriert. Das entsprechende rekombinante Plasmid erhielt die Bezeichnung pSMY2 (Figur 14). Anschließend wurde dieses Plasmid mit den Enzymen Noü und BamHl hydrolysiert und das Noü- und SamHI-Restriktionsfragment aus dem Plasmid pTERMI wurde in den mit Noü und BamHl restringierten Vektor pSMY2 inseriert. Das resultierende Plasmid erhielt die Bezeichnung pSMY3 (Figur 15) und enthält sowohl die Promotorsequenz, inkl. der Leader-Peptid kodierenden Sequenz sowie die Terminatorsequenz des ppgl -Gens. Die Promotorsequenz wird mit der Terminatorsequenz durch einen Λ/ofl-Restriktionsschnitt verbunden. Dieser Restriktionsschnitt ist in dem Plasmid pSMY3 Singular und kann deshalb für die Insertion von heterologer DNA verwendet werden. Die DNA Sequenz des Inserts im Plasmid pSMY3 ist in der Figur 16 wiedergegeben.
Beispiel 7
Konstruktion von Expressionsvektoren mit regulatorischen Elementen des cpc2-Gens von Sordaria macrospora
Im Folgenden wird die Konstruktion von Expressionsvektoren mit regulatorischen Elementen des cpc2-Gens auf der Grundlage des bereits beschriebenen Vektors pSM2 verschieben. Der Vektor pSM2 (siehe Beispiel 12, Figur 26) enthält das egp-Gen, welches mit dem TtrpC-Terminator von Aspergillus nidulans fusioniert ist. Stromaufwärts des egfp- Gens befindet sich eine Polylinker-Region, welche die optimale Klonierung mit verschiedenen Fragmenten erlaubt.
Im ersten Konstrukt wurde das in Beispiel 3 beschriebene EcoRV-Fragment aus dem Plasmid pSE38-16 in den Vektor pSM2/EcoRV ligiert. Das resultierende rekombinante Plasmid erhielt die Bezeichnung pSE40-6 (Figur 17). Die richtige Orientierung des Promotorfragmentes wurde durch Restriktionsanalyse überprüft. In einem zweiten alternativen Vektor wurde das 1,4 kb große Λ/col-Fragment aus dem Plasmid pSE39-4 (siehe Beispiel 3) in den mit Λ/col linearisierten Vektor pSM3 (siehe Beispiel 12, Figur 26) inseriert. Das resultierende rekombinante Plasmid erhielt die Bezeichnung pSE42-9. Nach Restriktion dieses Plasmids mit dem Enzym Sa/I wird die Linearisierung des Plasmids erreicht. Abschließend erfolgte die Ligation mit einem 1 ,4 kb großen Sa/I-Fragment aus dem Plasmid pCB1004. Dieses Sa//-Fragment trägt das Hygromycin B-Gen, welches zur Selektion in Pilztransformanden genutzt werden kann. Das entsprechende rekombinante Plasmid erhielt die Bezeichnung pSE43-2 (Figur 18).
In unabhängigen Experimenten wurde der Wildtyp-Stamm von S. macrospora mit den rekombinanten Plasmiden pSE40-6 und pSE43-2 transformiert. Nach Selektion der Transformanden auf Hygromycin B wurden in jedem Experiment ca. 20 Transformanden isoliert. In der anschließenden Analyse wurde durch fluoreszenzmikroskopische Untersuchungen der Nachweis erbracht, dass das heterologe egr/p-Protein in S. macrospora produziert wurde. In Figur 19 werden exemplarisch die T1 P40-6- und T1 P43-2-Trans- formanden dargestellt, die das rekombinante Plasmid pSE40-6 bzw. das rekombinante Plasmid pSE43-2 tragen. Die Fluoreszenz ist deutlich und eindeutig im Fluoreszenz-Mikroskop erkennbar und fehlt bei den untransformierten Vergleichsstämmen vollständig (nicht gezeigt). Bei letzteren ist auch keine Hintergrundfluoreszenz z.B. durch phenolische Substanzen erkennbar.
Beispiel 8 Konstruktion des Basisplasmids pGV-MCS
Zur Konstruktion eines Vektors, der einen Austausch von Promotor- und Terminatorelementen und Selektionsmarkem erlaubt und Multiklonierungssequenzen (MCS) enthält, wurde der Ausgangsvektor pSMY5-1 (Figur 20) mit SssHIl geschnitten und ein etwa 4,6 Kb-Fragment durch Gelelution isoliert. Das Fragment wurde um ein synthetisches Polylinkerfragment erweitert und religiert. Das synthetische Fragment wurde durch Hybridisation der nachfolgenden Oligonukleotide hergestellt. Nachfolgend sind die Oligonukleotide und die Abfolge der Restriktionsschnittstellen aufgeführt. Die SssHIl Sequenz ist unterstrichen.
Linker 1 (SEQ ID NO:24)
5'-TCGACGCGCGCCTCGAGAGGCCTACTAGTGAATTCAGATCTGGATCCGCGG
CCGCATCGATTCGCGAGGTACCGCGCGCA
Linker 2 (SEQ ID NO:25) δ'-GCGCGCGGAGCTCTCCGGATGATCACTTAAGTCTAGACCTAGGCGCCGGCG
TAGCTAAGCGCTCCATGGCGCGCGTTCGA
Die Abfolge der Restriktionsschnittstellen in der synthetischen Klonierungsstelle war wie folgt: SssHII- \val-X7θl-Sfel-Spel-EcoRI-Sgf/ll-6a/77HI-Sacll-/Vofl-C/al-Λ/rul-Acc65l- Kpπl-SssHII. Das erhaltene Konstrukt p-GV-MCS (Figur 21) wurde durch DNA-Sequenzierung überprüft. Beispiel 9
Konstruktion von Expressionsvektoren mit dem ndkl- bzw. cpc2-Promotor basierend auf dem Basisplasmid pGV-MCS
In nachfolgenden Klonierungsschritten wurden verschiedene Promotoren und Terminatoren in den Vektor pGV-MCS eingeführt. Der Einbau von Promotorelementen erfolgte in verschiedene Schnittstellen der MCS. Dazu wurden ein 1378 bp großes Fragment, das den /7d/c7-Promotor enthält (Nukleotid-Positionen 6-1383 in Figur 2), ein 1331 bp großes Fragment, das den cpc2-Promotor enthält (Nukleotid-Positionen 1281-2611 in Figur 3) und das Terminatorelement des ac '-Gens (Nukleotid-Positionen 2338-2860 in Figur 5) entweder aus Vorgängerplasmiden mit Hilfe geeigneter Restriktionen gewonnen oder mit endständigen Erkennungssequenzen mit Hilfe von PCR amplifiziert und in den Vektor kloniert.
Zur PCR-Amplifikation des /7d/c7-Promotors mit endständigen Spei- und EcoRI- Schnittstellen wurden die Oligonukleotide ndkδ-(Spel) und ndk3-(EcoRI) (siehe Tabelle 2) benutzt. Zur PCR-Amplifikation des cpc2-Promotors mit endständigen Spei- und /Aval-Restriktionsschnittstellen wurden die Oligonukleotide cpc2-(Aval) und cpc2-(Spel) (siehe Tabelle 2) benutzt.
In einem nächsten Schritt wurde der ac/1 -Terminator in die Vektoren eingeführt. Das Terminatorelement wurde mit endständigen Λ/ofl/C/al-Schnittstellen durch PCR-Amplifikation aus dem Plasmid pSMY1-2 (siehe Beispiel 5) gewonnen. Zur Amplifikation wurden die Oligonukleotide acM-(Notl) und acM-(Clal) (siehe Tabelle 2) benutzt.
Die so entstandenen Vektoren pGV-ndk1-MCS-acl1 (Figur 22) und pGV-cpc2-MCS-acI1 (Figur 23) enthalten eine MCS mit den unikalen Restriktionsschnittstellen EcoRI/Bg/ll/BamHI/Λ/ofl für die Aufnahme heterologer kodierender Sequenzen.
Beispiel 10
Produktion von Phytase in Sordaria macrospora unter der Kontrolle des cpc2- bzw. ndkl -Promotors
Als Beispiel für die Produktion eines sezemierten heterologen Genproduktes wurde die Phytase von Aspergillus fumigatus (Pasamontes et al., 1997) gewählt. Der kodierende Bereich des Phytase-Gens als 1403 Bp großes EcoRI-Fragment wurde in das Plasmid pGV-ndk1-MCS-acl1 (Figur 22) stromabwärts des ndkl- bzw. in das Plasmid pGV-cpc2-MCS-acl1 (Figur 23) stromabwärts des cpc2-Promotors kloniert. Die resultierenden Expressionsplasmide wurden hinsichtlich ihrer Integrität verifiziert und für die Transformation von Sordaria macrospora eingesetzt. Über einen Zeitraum von sieben Tagen wurden die Medienüberstände auf sezemierte Phytaseaktivität untersucht. Entsprechende Aliquots wurden mit 25 μl 5 M NaAc und 50 μl 4-Nitrophenylphosphat versetzt. Der Ansatz wurde 60 min. lang bei 37°C inkubiert. Die enzymatische Umsetzung wurde durch Zugabe von 100 μl 15%iger Trichloressigsäure abgestoppt. Nach Zugabe von 100 μl 1 M NaOH erschienen positive Kulturüberstandsproben intensiv gelb gefärbt. Die Gelbfärbung wurde durch die OD405-Messung im Photometer quantifiziert.
Die Aktivitätsbestimmungen der Kulturüberstände der Transformanden mit dem jeweiligen Phytase-Expressionsvektor wurde im Vergleich zum Wildtyp-Stamm sowie einer Transformande mit Expressionsvektor ohne Phytase-Insert (Mock-Transformande) durchgeführt. Sowohl für den ndkl- als auch für den cpc2-Promotor konnte eine Expression des Phytasegens in Sordaria macrospora sowie eine Sekretion rekombinanter Phytase in den Kulturüberstand nachgewiesen werden.
Für die vom nd/d-Promotor kontrollierte Expression von Phytase wurde nach 190 Stunden eine OD 05 von 0,4 gemessen; die entsprechenden OD405-Werte der Medienüberstände des Sordar/a-Wildtyps bzw. der Mock-Transformande betrugen 0,136 bzw. 0,09. Für die vom cpc2-Promotor kontrollierte Expression von Phytase wurde nach 190 Stunden eine OD405 von 0,37 gemessen; die entsprechenden OD405-Werte der Medienüberstände des Sordar/a-Wildtyps bzw. der Mock-Transformande betrugen 0,049 bzw. 0,05.
Beispiel 11 Produktion von humanem Laktoferrin in Sordaria macrospora unter der Kontrolle des ndkl- bzw. des cpc2-Promotors
Eine kodierende Sequenz für eine Fusion aus humanem Laktoferrin und dem N-Terminus der Glucoamylase aus Aspergillus awamori wurde als 3641 Bp großes EcoRI-Fragment in den Vektor pGV-ndk1-MCS-acl1 (Figur 22) kloniert. Restriktion, Fragmentisolation und Ligation erfolgte unter Standardbedingungen. Bei dem Vektor mit dem cpc2-Promotor (pGV-cpc2-MCS-acl1, Figur 23), der eine zusätzliche EcoRI-Schnittstelle in der Promotorsequenz enthält, erfolgte die Klonierung des EcoRI-Fragmentes in die Sg/N/SamHI-Schnittstelle. An den Fragmentenden und den Schnittstellen des Vektors wurden vor der Ligation durch Klenow-Behandlung stumpfe Enden ("blunt ends") herge- stellt. Die Behandlung erfolgte nach Standardmethoden.
Die Transformation mit den generierten Vektoren erfolgte wie zuvor beschrieben. Der Nachweis positiver Laktoferrin-sezernierender Transformanden erfolgte durch ELISA Nachweis nach folgendem Protokoll:
1. Beschichtung einer Mikrotiterplatte (Nunc Maxisorp) mit 100 μl/Probentasche mit Anti-hLaktoferrin in 0,1 M NaCO3 pH 9,6 (Verdünnung 1:2400) (rabbit affinity-purified anti-hLactoferrin; ICN, Costa Mesa, Kalifornien; 2,4 mg/ml) und Inkubation über Nacht
2. Waschen mit 200 μl PBS + 0,05% Tween®20 (3 x)
3. Inkubation mit jeweils 200 μl PBS + 0,05% Tween®20 + 1% BSA 2 Stunden lang bei Raumtempertaur unter leichtem Schütteln
4. Waschen wie in 2.
5. Anlagerung 2 Stunden lang bei RT von 100 μl/Tasche von Vedünnungen eines hLaktoferrin-Standards (ICN). Die Verdünnungen erfolgen in PBS (Kontrolle) oder in Aliquots zu testender Kulturüberstände der verschiedenen rekombinanten Klone.
6. Waschen wie in 2.
7. Anlagerung des Zweitantikörpers 1 Stunde lang bei RT. Als Zweitantikörper wurde Anti-hLaktoferrin (Peroxidase-konjugiert) (Rabbit Affinity-purified; Jackson Immuno Research Laboratories, West Grove, PA, USA) verwendet (1:5000-Verdünnung einer 0,8 mg/ml Lösung in PBS + 0,25% Tween®20 + 0,25% BSA ).
8. Waschen wie in 2.
9. Entwicklung des TMB Peroxidase Substrates. TMB Peroxidase-Substrat (Pierce, Hel- singborg) und Reaktionslösung (Pierce) wurden im Verhältnis 1:1 gemischt und in 100 μl-Aliquots auf die Probentaschen gegeben. Bei Erreichen der gewünschten Farbintensität wurde die Reaktion durch Zugabe von jeweils 100 μl einer 2 M Schwefelsäure-Lösung abgestoppt.
10. Die Messung der Farbintensität erfolgt bei 450 nm im ELISA-Reader. Die Konzentrationbestimmungen für die Überstandproben erfolgt durch Vergleich mit den Werten der Standardreihe.
Die ELISA-Messungen der Kulturüberstände der Transformanden mit dem jeweiligen Laktoferrin-Expressionsvektor wurden im Vergleich zum Wildtyp-Stamm sowie einer Transformande mit Expressionsvektor ohne Laktoferrin-Insert (Mock-Transformande) durchgeführt. Sowohl für den ndkl- als auch für den cpc2-Promotor konnte eine Expres- sion des Laktoferringens in Sordaria macrospora sowie eine Sekretion rekombinanten Laktoferrins in den Kulturüberstand nachgewiesen werden. Für die vom nd 7-Promotor kontrollierte Expression von Laktoferrin wurde nach sieben Tagen eine OD450 von 1 ,375 gemessen; die entsprechenden OD450-Werte der Medienüberstände des Sotdar/a-Wild- typs bzw. der Mock-Transformande betrugen 0,2 bzw. 0,24. Für die vom cpc2-Promotor kontrollierte Expression von Laktoferrin wurde nach sieben Tagen eine OD 5o von 1 ,95 gemessen; die entsprechenden OD 50-Werte der Medienüberstände des Sordaria-WΛd- typs bzw. der Mock-Transformande betrugen 0,273 bzw. 0,236.
Beispiel 12
Konstruktion von Expressionsvektoren und Produktion des "Green fluorescent protein" (GFP) in Sordaria macrospora unter der Kontrolle des gprf-Promotors von Aspergillus nidulans
Um das heterologe gfp-Gen (Clonetech, USA) in Sordaria macrospora zu exprimieren, wurden zwei Expressionsplasmide konstruiert, bei denen das gfp-Gen unter die Kontrolle verschiedener Promotoren gestellt wurde bzw. Promotor-frei ist. Als Ausgangsplasmid diente das Plasmid pEGFP/gpd/tel (Inglis et al., 1999) (siehe Figur 24).
Bei dem Plasmid pSM1 wird das gfp-Gen durch den gpd-Promotor von Aspergillus nidulans kontrolliert und durch die frpC-Terminationssequenz von Aspergillus nidulans terminiert. Außerdem enthält das Plasmid das HygromycinB-Resistenz-Gen zur Selektion von pilzlichen Transformanden. Die Konstruktion des Plasmids pSM1 wird in der Figur 25 wiedergegeben. Anders als das Plasmid pSM1 enthält das Plasmid pSM2 keinen gpd- Promotor. Vor dem gfp-Gen befindet sich eine multiple Klonierungsstelle für mehrere Enzyme, die geeignet sind, um heterologe oder homologe Promotorsequenzen zu inserieren und damit die gfp-Genexpression zu steuern. Die Konstruktion des Plasmids pSM3 ist in der Figur 26 dargestellt.
In drei verschiedenen Experimenten wurde ein steriler Sordaria macrospora-Stamm mit den Plasmiden pEGFP/gpd/tel, pSM1 und pSM3 transformiert. Anschließend wurden die erhaltenen Transformanden wie beschrieben auf Hygromycin-Resistenz selektioniert und fluoreszenzmikroskopisch analysiert. Die Analyse erfolgte mit dem Zeiss-Mikroskop Axio- phot bei Anregung mit Licht der Wellenlänge 420 nm. GFP-produzierende Klone wurden anschließend für eine formalgenetische Analyse gegen den Wildtypstamm bzw. andere Testerstämme verwendet. Durch die Kreuzung kann überprüft werden, inwieweit das he- terologe GFP-Protein in der Meiose stabil weitervererbt wird, und insbesondere inwieweit die GFP-Expression auch in den Nachkommen stabil erhalten bleibt.
Wie aus der Figur 27 ersichtlich ist, ist sowohl im vegetativen Myzel der Transformanden wie auch in den Ascosporen die GFP-Genexpression erkennbar. Die zu erwartende 1:1 Aufspaltung ist deutlich in den achtsporigen Asci erkennbar (4 Sporen zeigen Fluoreszenz, 4 Sporen zeigen keine Fluoreszenz). Durch diese GFP-Genexpression kann zudem deutlich gemacht werden, dass die heterologe Genexpression bei S. macrospora nach der meiotischen Kreuzung nicht durch Inaktivierungsprozesse (z. B. RIP, MIP, Quelling) zerstört wird.
Beispiel 13
Produktion von GFP in Sordaria macrospora unter der Kontrolle des cpc2- bzw. ndkl -Promotors
Das EGFP-Gen wurde mit den Oligonukleotiden EGFP5' und EGFP3' (siehe Tabelle 2) per PCR aus dem Vektor pSM2 amplifiziert. Das erhaltene PCR-Produkt wurde als 726 Bp großes EcoRI-Fragment in das Plasmid pGV-ndk1-MCS-acl1 (Figur 22) stromabwärts des ndkl- bzw. in das Plasmid pGV-cpc2-MCS-acl1 (Figur 23) stromabwärts des cpc2-Promotors kloniert. Die resultierenden Expressionsplasmide wurden hinsichtlich ihrer Integrität verifiziert und für die Transformation von Sordaria macrospora eingesetzt. Die intrazelluläre Expression des EGFP-Gens wurde wie im Beispiel 12 beschrieben nachgewiesen.
In Figur 28 wird exemplarisch eine Transformande dargestellt, die das EGFP-Gen unter der Kontrolle des t?d/c7-Promotors enthält. Die auf EGFP zurückzuführende Fluoreszenz ist im fluoreszenzmikroskopischen Bild (unten) eindeutig erkennbar und fehlte bei der Kontrolle (untransformiertem Stamm) vollständig (nicht gezeigt). Tabelle 1
Vergleich der am häufigsten gebrauchten Aminosäurekodons in E. coli, Saccharomyces cerevisiae {S.c), Sordaria macrospora (S.m.), Drosophila me- lanogaster (D.m.) und Primaten (Prim). Schattiert wurden solche Kodons in den einzelnen Spalten, die auch bei Sordaria macrospora am häufigsten gebraucht werden.
Tabelle 2
Verwendete Oligonukleotide
Tabelle 2 (Forts.)
Tabelle 3
Rekombinante Plasmide
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Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zum Herstellen von heterologem Protein in einem filamentosen Pilz, umfassend das Kultivieren eines homothallischen Pilzes der Familie Sordariaceae, der eine Expressionskassette enthält, die in funktioneller Verbindung die folgenden Elemente enthält:
- einen in dem Pilz der Familie Sordariaceae aktiven Promotor,
- ein heterologes Gen und
- einen in dem Pilz der Familie Sordariaceae aktiven Terminator,
und das Ernten des erzeugten Proteins in an sich bekannter Weise.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der homothallische Pilz der Gattung Sordaria angehört.
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass der homothallische Pilz Sordaria macrospora oder Sordaria fimicola ist.
4. Verfahren nach Anspruch 1 , 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem Pilz um eine sterile Mutante handelt.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Kultivierung des homothallischen Pilzes bei 27 + 2°C stattfindet.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass der in dem homothallischen Pilz der Familie Sordariaceae aktive Promotor von einem filamentosen Pilz stammt.
7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass der Promotor ein Promotor aus Sordaria macrospora ist.
8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass der Promotor der cpc2-Promotor, der πd/ 7-Promotor, der ac/7-Promotor und der ppg7-Promotor aus Sordaria macrospora ist.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass der in dem Pilz der Familie Sordariaceae aktive Terminator von einem filamentosen Pilz stammt.
10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass der Terminator ein Terminator aus Sordaria macrospora ist.
11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass der Terminator der der cpc2-Terminator, der πdA -Terminator, ac/7-Terminator oder der ppgl- Terminatoraus Sordaria macrospora ist.
12. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass das heterologe Gen für ein nach Expression in Eukaryonten glykosyliertes Protein kodiert.
13. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem heterologen Gen um einen Wachstumsfaktor, ein Cytokin, einen Gerinnungsfaktor, ein industrielles Protein oder ein technisches Enzym handelt.
14. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass das heterologe Gen für eines der folgenden Proteine kodiert: G-CSF, GM-CSF, IL-1, IL-2, IL-4, IL-6, IL-1ra, IFN-α, IFN-ß, IFN-γ, Erythropoietin, Glucoamylase, Gerinnungsfaktor VIII, Gerinnungsfaktor XII, Gerinnungsfaktor XIII, humanes Serumalbumin.
15. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass zwischen dem Promotor und dem heterologen Gen im Leseraster mit dem heterologen Gen eine Sequenz angeordnet ist, die eine in dem Pilz der Familie Sordariaceae funktionierende Signalsequenz kodiert.
16. Verfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass die Signalsequenz eine Signalsequenz aus einem filamentosen Pilz ist.
17. Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass die Signalsequenz eine Signalsequenz aus Sordaria macrospora ist.
18. Nukleinsäure-Molekül, umfassend:
(1) einen in einem homothallischen Pilz der Familie Sordariaceae aktiven Promo- tor, der aus folgenden Nukleinsäuren ausgewählt ist:
(a) einer Nukleinsäure mit der in SEQ ID NO:1 angegebenen Sequenz;
(b) einer Nukleinsäure mit der in SEQ ID NO:2 angegebenen Sequenz;
(c) einer Nukleinsäure mit einer Sequenz, die mindestens 50% Identität mit einer der in (a) oder (b) angegebenen Sequenzen aufweist;
(d) einer Nukleinsäure, die mit dem Gegenstrang einer der in (a) oder (b) angegebenen Nukleinsäuren hybridisiert;
(e) einem durch Substitution, Addition und/oder Deletion eines oder mehrerer Nukleotide erhaltenen Derivat einer der in (a) oder (b) angegebenen Nukleinsäuren;
(f) einem Fragment einer der in (a) bis (e) angegebenen Nukleinsäuren, das die Funktion des in dem Pilz der Familie Sordariaceae aktiven Promotors behält;
(g) einer Kombination mehrerer der in (a) bis (f) angegebenen Nukleinsäuren, wobei die Sequenzen der Nukleinsäuren gleich oder verschieden sein können;
oder
(2) eine Nukleinsäure mit einer Sequenz, die zu der Sequenz einer der in (a) bis (g) angegebenen Nukleinsäuren komplementär ist.
19. Nukleinsäure-Molekül nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass die unter (c) angegebene Nukleinsäure mindestens 70% Identität mit einer der in (a) oder (b) angegebenen Sequenzen aufweist.
20. Nukleinsäure-Molekül nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass die unter (c) angegebene Nukleinsäure mindestens 90% Identität mit einer der in (a) oder (b) angegebenen Sequenzen aufweist.
21. Nukleinsäure-Molekül nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass die unter (c) angegebene Nukleinsäure mindestens 95% Identität mit einer der in (a) oder (b) angegebenen Sequenzen aufweist.
22. Vektor zur Transformation eines homothallischen Pilzes der Familie Sordariaceae, dadurch gekennzeichnet, dass er folgende Elemente in funktioneller Verbindung miteinander enthält:
- einen in dem Pilz der Familie Sordariaceae aktiven Promotor,
- ein heterologes Gen,
- einen in dem Pilz der Familie Sordariaceae aktiven Terminator sowie
- einen Selektionsmarker.
23. Vektor nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, dass der in dem Pilz der Familie Sordariaceae aktive Promotor der ac/ -Promotor aus Sordaria macrospora oder der ppg7-Promotor aus Sordaria macrospora ist.
24. Vektor nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, dass der in dem homothallischen Pilz der Familie Sordariaceae aktive Promotor eine Nukleinsäure gemäß einem der Ansprüche 18 bis 21, Alternative (1) umfasst.
25. Vektor nach einem der Ansprüche 22 bis 24, dadurch gekennzeichnet, dass der in dem Pilz der Familie Sordariaceae aktive Terminator der cpc2-Terminator, der /7d/ 7-Terminator, der ac/7-Terminator oder der ppg7-Terminator aus Sordaria macrospora ist.
26. Vektor nach einem der Ansprüche 22 bis 25, dadurch gekennzeichnet, dass der Selektionsmarker ein Hygromycin B-Resistenz-Gen ist. i
27. Wirtsorganismus, dadurch gekennzeichnet, dass er ein homothallischer Pilz der Familie Sordariaceae ist, der einen Vektor gemäß einem der Ansprüche 22 bis 26 enthält.
28. Wirtsorganismus nach Anspruch 27, dadurch gekennzeichnet, dass er der Gattung Sordaria angehört.
29. Wirtsorganismus nach Anspruch 28, dadurch gekennzeichnet, dass er Sordaria macrospora oder Sordaria fimicola ist.
30. Wirtsorganismus nach Anspruch 27, 28 oder 29, dadurch gekennzeichnet, dass es sich um einen sterilen Stamm handelt.
31. Kit, umfassend:
(a) einen Vektor gemäß einem der Ansprüche 22 bis 26 und
(b) einen zum Herstellen von heterologem Protein geeigneten homothallischen Pilz der Familie Sordariaceae.
32. Verwendung eines Nukleinsäure-Moleküls gemäß einem der Ansprüche 18 bis 21 oder eines Expressionsvektors gemäß einem der Ansprüche 22 bis 26 oder eines Kits gemäß Anspruch 31 zur Expression eines heterologen Gens unter der Kontrolle des Promotors.
33. Verwendung eines Nukleinsäure-Moleküls gemäß einem der Ansprüche 18 bis 21 oder eines Expressionsvektors gemäß einem der Ansprüche 22 bis 26 oder eines Kits gemäß Anspruch 31 zum Herstellen von einem oder mehreren Proteinen.
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