DD276886A5 - Expressin und Sekretion heterologer Proteine durch transformierte Spezies von Yarrowia Lipolytica - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft Verfahren zur Herstellung und Sekretion eines heterologen Proteins durch eine Kultur von Yarrowia Lipolytica. Die Aufgabe der Erfindung besteht darin, Verfahren zur Herstellung und Sekretion eines heterologen Proteins durch eine Kultur von Yarrowia lipolytica bereitzustellen. Erfindungsgemaess werden Verfahren zur Herstellung und Sekretion eines heterologen Proteins durch eine Kultur von Y. lipolytica zur Verfuegung gestellt, das(i) das Einfuehren eines Expressionsvektors in Y. lipolytica, welcher eine DNA-Sequenz, die fuer ein dieser Y. lipolytica heterologes Protein codiert, ein Y. lipolytica-Gen oder eine Y. lipolytica-Promotor-, eine Signal- und eine Transkriptions-Terminator-DNA-Sequenz eines Y. lipolytica-Gens enthaelt,(ii)das Kultivieren der so hergestellten transformierten Y. lipolytica von (i) in einem geeigneten Naehrmedium und(iii)das Gewinnen des heterologen Proteins umfasst.

Description

Anwendungsgebiet der Erfindung

Dio Erfindung betrifft Vorfahren zur Horstollung und Sokrotion oinos hetorologen Proteins durch eine Kultur von Y. lipolytica. Dioso Erfindung bozioht sich auf die Tochnologio der Proteinsekretion aus Hefe. Genauer gesagt bezieht sie sich auf rokombinante Yarrowia lipolytics-Klonierungsvehikol, die hoterologe DNA enthalten, welche für die Expression und Sekretion von Säugoproteinen (ι. B. Prochyniosin) und anderen Polypeptiden codiert, und auf Expressionsvektoron, die einen

Y. lipolytica^Genpromotor (ζ. 8. XPR2 oder LEU2), eine Signalsequenz (oder Präsequenz) der alkalischen Protease, eine Pioregion und eine XPR2-Terminatorregion enthalten, und Varianten oder funktionelle Äquivalente hiervon, die durch Degeneration des genetischen Codes oder durch die Verwendung von anderen Genbestandteilen von Y. lipolytica entstehen. Weiterhin bezieht sie sich auf transformierte Hefen, die diese Expressions- und Sekretionsvektoren tragen, auf ihre Verwendung zur Herstellung heterologer Proteine in deren nativem, funl.tionellem Zustand und auf Verfahren zur Bereitstellung des oben Erwähnten.

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen

Die wirtschaftliche Attraktivität eines stetigen und ausreichenden Angebotes an einer Vielzahl von Proteinen oder Polypeptiden, die für einen Industriezweig (z. B. Prorennin, Rinderwachstumshormon) oder für medizinische Zwecke (z. B. Urogastron, Gewebeplasminogen3ktivator, menschliches Anaphylatoxin C5a) von Wert sind und insbesondere an solchen, die aus einer Quelle stammen, welche hohe Qualitätsprodukte in leicht gawinnbarer, funktioneller Form liefert, veranlaßte viele Forscher dazu, die Technologie rekombinanter DNA auf Mikroorganismen als „Fabriken" für die Herstellung heterologer Proteine anzuwp'ic'rjn.

Ausgedehnte Studien sind auf die Pioteinsekretion als mögliche Lösung für Schwierigkeiten gerichtet, die bei der Gewinnung exogener oder heterologer (fremder) Proteine in einer biologisch aktiven Form aus intrazellulären Anhäufungen in rekombinanten Wirtszellen, insbesondere aus Escherichfa coli, auftreten. In E. coli wird das heterologe Protein häufig innerhalb der Zelle in Form von refraktilen Einschlußkörpern produziert. Solch ein Protein besitzt im allgemeinen nur geringe Wasserlöslichkeit und hat wenig oder keine biologische Aktivität. Extrahieren dieses Proteins aus den refraktilen Einschlußkörpern umfaiM im allgemeinen intensives chemisches Behandeln, das eventuell teuer ist und dazu führen ^ann, daß wenig oder gar kein Protein in der gewünschten, nativen, biologisch aktiven Form isoliert wird. Außerdem wird die Wahrscheinlichkeit der Kontamination des genannten Proteins mit unerwünschten, von E. coli produzierten Substanzen dadurch vergrößert, daß es notwendig ist, die Zellen aufzubrechen, um die refraktilen Körper freizusetzen. Auch andere Organismen als E. coli produzieren heterologes Protein in unlöslicher, intrazellulärer Form. Beispielsweise offenbart das britische Patent 2,091,271, veröffentlicht am 28. Juli 1982, eine genetische Modifikation von S. cerevisiae mittels der Technologie rekombinanter DNA, um Rennin oder Chymosin de« Kalbes - die Ausdrücke sind hier auswechselbar verwendet - zu exprimieren. Angesichts dieser Schwierigkeiten hat man sich oei dem Versuch, das Protein in einer nativen, aktiven Konfiguration herzustellen, der Sekretion des genannten Proteins aus dem Wirtsorganismus zugewandt.

Ob ein bestimmtes Protein, einschließlich heterologen Proteins, oder ein Polypeptid durch einen gegebenen Organismus sezerniert wird, scheint vom Protein abzuhängen. In den meisten eukariotischen Zellen ist ein Teil der Proteinsynthesemaschinerie mit der Membran des endoplasmatischen Retikulums assoziiert und die Sequenz von Aminosäuren (genannt die „Signalsequenz"), die sich nahe dem Aminoende der in Entstehung begriffenen Polypeptidkette befindet, dient dazu, das Protein zur Durchquerung der Membran zu veranlassen. Die Signalsequenz wird anschließend während des Sekretionsprozesses proteolytisch gespalten, was aktives, reifes Protein ergibt. Verschiedene Versuche sind gemacht worden, um Verfahren zur Sekretion von hetei, dogen Proteinen unter Verwendung von Signalsequenzen in Mikroorganismen, einschließlich Bacillus subtilis, Saccharomyces cerevisiae, und in Säugerzellen in Kultur zu entwickeln. Die genannten Organismen haben sich jedoch nicht als ideal erwiesen.

Inhärente Eigenschaften von B. subtilis-er sezerniert beispielsweise viele Proteine, darunter zahlreiche Proteasen, die leicht das sekretierte heterologe Protein abbauen; Instabilität transformierter Stämme, die aus dem Verlust heterologer DNA folgt - haben seine Nutzbarmachung verhindert.

Säugerzellen sind mit Erfolg gentechnologischen Manipulationen unterworfen worden, um heterologe Proleine zu exprimieren und zu sezernieren, aber diese Systeme sind technologisch anspruchsvoll und in der Handhabung teuer und bleiben für die kommerzielle Herstellung der meisten Proteine als Produkte unbrauchbar.

Obwohl Untersuchungen über Proteinsekretion mit S. cerevisiae erfolgreicher waren als solche mit B. subtilis, scheint selbst S. cerevisiae einigen inhärenten Beschränkungen in seiner Eigenschaft als System für die Proteinsekretion zu unterliegen. Die europäische Patentanmeldung 0123544, veröffentlicht am 31.Oktober 1984, beschreibt die Isolierung des alpha-Faktor-Genes von S. cerevisiae und die Verwendung von dessen Promotor- und/oder Signalpeptid-Teilen in Kombination mit DNA, die für Proteine codiert, die für Hefe heterolog sind, in einem Plasmid für die Transformation von Hefezellen, die in der Lage sind, in Zellkultur diskretes, reifes Protein zu produzieren. Die europäische Patentanmeldung 0088632, veröffentlicht am 14. September 1983, beschreibt ein Verfahren für die Expression und Sekretion von heterclogem Protein in S. cerevisiae. Jedoch scheint die Größe des Proteins, das S. cerevisiae wirksam mit diesem und anderen Sekretionssystemen sezernieren kann, auf etwa 20000 Dalton beschränkt zu fein. Die Überwindung dieser allgemeinen Ineffizienz von S. cerevisiae als Sekretionsorganismus machte vielfache Änderungen durch Mutationen nötig, wie von Smith et al., Science 229,1219-1224 (1985) beschrieben. Eine Ausnahme dieses allgomeinon Tronds ist die Beobachtung, daß Aspergillus-Enzyme, die größer als 20000 sind, anscheinend durch S. cerevisiae sezerniort worden können, abor diese Enzyme worden von S. cerevisiae in hohem Maße glyccsyliert und dies könnto c'o Wirksamkeit der Sokrotion boeinflusson.

Rosondoi os Intorosso ist auf Yarrowia lipolytica, oino industrioll wichtige Hefespecies, die zur Herstellung von Citronensäure und Einzollor-Protoin vorwondot wird, gorichtot. Sio kann außordom zur Herstellung von Etythritol, Mannit und Isopropyläpfelsäure vorwondot wordon. Im Gogonsntz zu S. cerevisiae ist Y. lipolytica wegen ihrer Fähigkoit, Proteine mit höherem Molekulargewicht (alkalischo Protoaso, sauro Protease und RNAso) wirkungsvoll in ihr Wachstumsmedium zu sozernieren, wodurch sie die Möglichkeit dor Gowinnung hotorologor Protoine in nativom Zustand ohne die Notwendigkeit dor Zerstörung der produzierenden Zollon gostattot, von bosondorom Intorosso und Wort. Außerdem sozornicrt Y. lipolytica quantitativ nur wenig Protoino, wodurch sio dio Möglichkeit zur Herstellung oinos gewünschten hotorologon Proteins im Wachstumsmedium als vorhorrschondor Proteinspozios und dio Vereinfachung dor Gowinnung dieser, heterologen Proteinproduktes bietet.

Y. lipolytica produziert große Mengen an extrazellulärer Protease. Dies ist das von Y. lipolytica vorwiegend sezernierte Protein. Die jeweilige Protease (alkalisch, sauer oder neutral) wird durch den verwendeten Stamm der Y. lipolytica bedingt (Ogrydziak et al., J. Gen.Microbiol. (1982), 128,1225-1234). Über eine teilweise erfolgte Sequenzanalyse der N-terminalen Aminosäuresequenz alkalischer extrazellulärer Protease wurde von Ogrydziak et al., (loc. cit.) berichtet. Die anhängige amerikanische Patentanmeldung mit dem Aktenzeichen 634,505, eingereicht am 25. Juli 1984, beschreibt Verfahren für die Transformierung von Y. lipolytica und für die Klonierung von Y. lipolytica-Genen durch Komplementierung von Mutationen. Sie offenbart die Klonierung des XPR2-Gens, das für eine sezernierte alkalische Protease codiert, durch Komplementierung einer xpr2-Mutation von Y. lipolytica. Die Methodologie umfaßt die Transformierung eines Wirtsstammes von Y. lipolytica durch eine teilweise Bg' Il-Verdauung einer Y. lipolytica-Genbank im Vektor plD40, beschrieben in der europäischen Anmeldung 0138508, veröffentlicht am 24. April 1985, der korrespondierenden Anmeldung zu der obengenannten US-Anmeldung.

Ziel der Erfindung

Die vorliegende Erfindung stellt eine Methodologie für die Herstellung von Vektoren zur Verfügung, welche, wenn sie in Y. lipolytica eingeführt werden, den Wirten die Fähigkeit zur Herstellung spezifischer Proteine, die von heterologer DNA aus beliebiger Quelle, aber insbesondere von eukaryotischer und synthetischer DNA codiert werden, und zu ihrer Sekretion in das Medium vermitteln; rekombinante Y. lipolytica-Klonierungsvehikel, die heterologe DNA, welche für die Expression von Säugerprotein und anderen Polypeptiden codiert, enthalten, einschließlich von für die Transformation von Y. lipolytica-Wirten geeigneten Plasmiden, und besonders von integrierbaren Expressionsvektoren, die den LEU2-Genpromotor, den XPR2-Genpromotor, die Präpro-Region der alkalischen Protease und die XPR2-Terminator-Region enthalten; und Expressionsplasmide mit einer heterologen codierenden Sequenz mit XPR2-Sekretionssignalen strangabwärts vom LEU2-Promotor, die in der Lage sind, ein heterologes Protein in durch sie transformierter Y. lipolytica zu exprimieren und zu sezernieren.

Die Erfindung legt also die Expression und Sekretion von reifem heterologem Protein und insbesondere die von Prorennin und menschlichem Anaphylatoxin C5a von genetisch veränderten Y. lipolytica-Zellkulturen dar. Die Ermittlung der genauen Identität der Aminosäuresequenz wie auch der DNA-Sequenz für die exozelluläre alkalische Protease von Y. lipolytica hat es möglich gemacht, festzustellen, daß heterologes Protein mittels der Technik rekombinanter DNA für die Produktion in Zellkultur exprimiert und sezerniert werden kann. Im Falle von Prorennin wird die reife Form des Zymogens (Rennin-Vorläufers) exprimiert und sezerniert.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Die Aufgabe der Erfindung besteht darin, Verfahren zur Herstellung und Sekretion eines heterologen Proteins durch eine Kultur von Y. lipolytica bereitzustellen.

Es ist nun gefunden worden, daß Y. lipolytica genetisch mittels der Technik der rekombinanten DNA modifiziert werden kann, um Transformanten zu produzieren, die heterolog'. Proteine in ihrer nativen Form exprimieren und sezernieren können. Dies wird durch die Konstruktion von Vektoren bewer'.r'elligt, die die Signal- oder die Signal- und die erste (Prol-) oder beide Prosequenzen (Prol- + Pro2-) des XPR2-Gens U.j'jen, verknüpft mit der strukturellen Gensequenz des heterologen Proteins, welches sezerniert werden soll.

Transformierte Spezies, die durch Einbau vr Vektor-DNA, welche ein Fragment des XPR2-Gens, dem regulatorische oder strukturelle Anteile an beiden Enden des Gp iS fehlen, am XPR2-Locus hergestellt wurden, produzieren keine alkalische Protease mehr, eine Eigenschaft, die nicht nur für d ι Sekretion von heterologem Protein wünschenswert ist, sondern die auch für das Screening von vermuteten Transformanten benutzt werden kann.

Weiterhin sind Vektoren, die den XPR2-Promotor und Sequenzen für die sekretorische Signalsequenz der alkalischen Protease tragen, in der Lage, in einer iransformierten Y. lipolytica-Zelle die Sekretion des reifen heterologen Proteins zu bewirken. Einige rekombinante DNA-Vektoren dieser Art können Expression/Sekretion ein einem Hefegenom unabhängig vom Ort der Integration bewirken. Im allgemeinen liefern Vektoren, die genügend flankierende 5' und 3'-DNA enthalten, unabhängig vom Ort der Integra'ion die Expression des Produktes.

Außerdem ist überraschender- und unerwarteterweise entdeckt worden, daß die Integrierung eines von pBR322 abgeleiteten Plasmids in chromosomale DNA von Y. lipolviica eine Homologieregion ergibt, die in der Lage ist, weitere ortsgerichtete integrative Transformationen anzuregen. Die integrierte Kopie von pBR322 fungiert also als eine Eingangsregion (docking platform) für dazukommende, transformierende DNA. Der Einbau einer bleibenden Kopie von pBR322 in chromosomale DNA von Y. lipolytica ergibt also trotz der Tatsache, daß pBR322 keine native DNA von Y. lipolytica ist, ein bekanni-ts Ziel für den Einbau. Transformierungsempfängor vom Stamm Y. lipolytica, die einen solchen Bereich enthalten, bieten zwei wesentliche Vorteile vor Empfängern, denen oin solcher Bereich fehlt, nämlich das Vorhandensein einer Region mit einer bekannten Sequenz und einer boktnnten Restriktionskarto, die als Ziel für den ortsgerichteten Einbau dienen kann, und, falls pBR322 als Ziel für den Einbau vorwondot wird, dio Möglichkeit der Bestimmung, ob das eintretende Plasmid eine vollständige funktionell Einheit oder oin suiciic·^ Gor,, im Gogonsatz zu nur einem Teil des gesuchten Gens, enthält. Beispielsweise würde ein Plasmid, das nur ein 3'-Fragmont dos XPR2-Gonsonthält, oinon XPR2-1002-Empfänger Iransformieren, wenn es das Codon des Wildtyps enthielte und am XPR2-Locus oingebaut würdo. Dasselbe Plasmid würde jedoch den XPR2-1002-Wirt nicht in den proteasepositiven Phänotyp transformieren, worin os in pBR322 integriert würde, woil ihm die gesamte funktionell Einheit fehlen würde. In transformierten Stämmon von Y. lipolytica, die eino Homologioregion zu heterologor Vektor-DNA enthalten, fungiert diese Rogion, die oxogono DNA onthält, als Empfängerort währond dor intogrativen Transformation dor Y. lipolytica. Außer pBR322 und dosson Dorivaton können Cosmido, Bakteriophagen wio M13 und Lambda, synthetisch derivatisierte DNA und übliche Plasmido wie pU 13 zur Horstollung von transformierten Y. Ilpolytica-Spozies mit einer Eingangsregion (docking p.atform) vorwendotwordon.

Mit „LEU 2"-Promotorsequenz ist die strangaufwärts gelegene, nicht translatierte Region oberhalb des ATG, die die meisten, wenn nichi alle für die Expression benötigten Merkmale enthält, gemeint.

Mit „XPR2"-Promotorsequenz ist die strangaufwärts nicht translatierte Region vor der Signal- (oder Prä-)Sequenz gemeint, die für die Expression notwendig ist. Außerdem kann die Signalsequenz des XPR2-Gens, mit oder ohne die Prosequenz, verwendet werden, um Proteine unter der Expressionskontrolle von anderen Promotoren von Y. lipolytica als denen des XPR2-Gens zu sezernieren. So sind Vektoren, die den LEU2-Promotor und Sequenzen für das Sekretionssignal der alkalischen Protease tragen, in der Lage, in einer transformierten Y. lipolytica-Zelle die Sekretion von reifem, heterologem Protein zu bewirken. Menschliches Anaphylatoxin C5a, auch unter dem Namen „menschliches Komplement-Protein C5a" (menschliches C 5a) bekannt, ist ein bioaktives Polypeptid-Fragment, das in vivo als Folge der Komplementaktivierung gebildet wird. Es wirkt als Immunmodulator bei der Regulierung bestimmter Teilbereiche der humoralen und zellulären Immunantwort. Seine Primärstruktur und die anderer Anaphylatoxine ist aufgeklärt. Eine Zusammenfassung der chemischen, physikalischen und biologischen Eigenschaften ist von Hugli in „Complement", herausgegeben von H.J.Müller-Eberhard und P.A. Miescher, S. 73-99,1985, Springer-Verlag, New York, vorgelegt worden.

Es wird den Fachleuten bewußt sein, daß heterologe DNA, die für faktisch jede beliebige bekannte Aminosäuresequenz codiert, mutatis mutandi in der vorliegenden Erfindung Verwendung finden kann. Die hier offenbarte Methodologie ist mutatis mutandi auf die Produktion und Sekretion eines jeden beliebigen bekannten, heterologen Proteins anwendbar, wobei repräsentative Vertreter im US Patent 4,532,207, erteilt am 30. Juli 1985, aufgelistet sind. Ferner kann ein beliebiges anderes Gen von durch Y. lipolytica sezernierten Proteinen wie z. B. das Ribonukleasegen und das Gen der sauren Protease anstelle des XPR2-Gens verwendet werden, wie auch Hybrid-Gene, die durch Vereinigen von Fragmenten von zwei oder mehreren dieser Gene, z. B. der Signalsequenz des XPR 2-Gens und der Promotorsequenz des Ribonuklease-Gens, konstruiert werden. Ebenfalls eingeschlossen in den Rahmen dieser Erfindung sind die funktionellen Äquivalente der hier beschriebenpn DNA- oder Nukleotidsequenzen. Die Degeneration des genetischen Codes erlaubt die Substitution bestimmter Codons durch andere Codons, die für dieselbe Aminosäure codieren und demzufolge zu demselben Protein führen. Die DNA oder Nukleotidsequenz kann stark schwanken, da mit der Ausnahme von Methion'n und Tryptophan die bekannten Aminosäuren durch mehr als ein Codon codiert werden können. Deshalb könnten das vollständige XPR2-Gen oder Teile davon i'Pter Bildung einer DNA-Sequenz synthetisiert werden, die sich von der in Figur 3 gezeigten deutlich unterscheiden würde. Die dadurch codierte Aminosäuresequenz würde jedoch erhalten bleiben. Solche funktionellen Änderungen einer gegebenen DNA- oder Nukleotidsequenz liefern die Möglichkeit, Sekretion und/oder Prozessieren von heterologen Proteinen zu fördern, die durch daran geknüpfte, fremde DNA-Sequenzen codiert werden. Alle Abwandlungen Uer Nukleotidsequenz des XPR2-Gens und Fragmente hiervon, die der genetischen Code gestattet, werden deshalb von dieser Erfindung umfaßt. Weiterhin ist es möglich Codons zu deletieren oder ein oder mehrere Codons durch andere als die degenerierten Codons zu ersetzen, um ein strukturell modifiziertes Polypeptid herzustellen, das jedoch im wesentlichen dieselbe Anwendbarkeit oder Aktivität wie das von dem unmodifizierten DNA-Molekül produzierte Polypeptid besitzt. Diese zwei Polypeptide sind funktionell äquivalent, wie auch die zwei DNA-Moleküle, die ihre Produktion bewirken, auch wenn sich die Unterschiede zwischen den erwähnten DNA-Molekülen nicht von der Degeneriertheit des genetischen Codes ableiten. Das einfachste Beispiel hierfür findet man beim Prorennin A und Prorennin B, den zwei allelen Formen des Prorennins, die sich nur durch die Anwesenheit eines Aspartatrestes in Position 286 im Prorennin A und eines Glycinrestes in dieser Position im Prorennin B unterscheiden.

Unter Anwendung dieser Methodologie ist die Expression und Sekretion der heterologen Säugerproteine Prorennin und menschliches Anaphylatoxin C5a in Y. lipolytica gelungen, wobei Expressions- und Sekretionssignale von Y. Iipolytica-XPR2- und/oder LEU2-Genen verwendet wurden. Die DNA-S^ ,uenzen für Prorennin und menschliches Anaphylatoxin wurden über synthetische Oligonukleotide mit der XPR2-Gensequenz an Orten verknüpft, von denen man annahm, daß sie für die Prozessifirungsstellen des Signalpeptids der alkalischen Protease oder des Proteasevorläufer, die hier als Prol und Pro 2 bezeichnet werden, codieren, und für die Herstellung von Genkonstruktionen verwendet, die anschließend durch integrative Transformation in Y. lipolytica eingebracht wurden. Die rekombinanten Kulturen exprimierten hsterologe Proteine mit dem Ml '<?kulargewicht und den Immunreaktivitäten von Prorennin und menschlichem Anaphylatoxin C5a und sekretierten sie in das Wachstumsmedium. Das so hergestellte Prorennin wird wahrscheinlich zu einer nativen Konfiguration gefaltet, da es nach der Entfernung des Propeplides vollständige enzymatische Aktivität entwickelt.

Der A'isdruck„rekombinantes DNA-Material "umfaßt so, wie er hier verwendet wird, beliebiges Material, das mindestens einen der folgenden Bestandteile enthält: das XPR2-Gen von Y. lipolytica, dessan Signal- (oder Prä-), dessen Prol- und Pro2- (welche zusammen die Pro-Region bilden), dessen Promotor- oder dessen Terminatorsequenz; den LEU2-Promotor; und funktioneile Äquivalente der vorgenannten Sequenzen, die wegen der Degeneration des genetischen Codes in Frage kommen. Repräsentativ für das erwähnte rekombinante DNA-Material sind DNA-Fragmente, Plasmide oder Vektoren oder transformierte Spezies, die beliebige oder alle der vorgenannten Sequenzen enthalten.

Materialien. Restriktionsendonukleasen und T4-Ligase wurden von New England Biolabs bezogen, bakterielle alkalische Phosphatase von Bethseda Research Laboratories, T4-Polynukleotidkinnse von PL-Biochemicals und (gamma-³²p)ATP von New England Nucloar. Alle Enzyme wurden unter den von den Herstellern empfohlenen Bedingungen eingesetzt. Medien.

GPP-Modium-IGIycorin/Protooso-Pepton-Medium) enthielt (pro Liter): 6,7g Glycerin, 1,6g Difco Proteose-Pepton, 1,7g Difco Hofo-Stickstoffbaso ohne Aminosäuren und Ammoniumsulfat, 30mg Uracil und 0,5 ml/l Polypropylenglycol mit MG 2000 (Polyscioncos) in 4OmM Phosphatpuffor (pH 6,8). (Das Polypropylenglycol wurde weggelassen, wenn das iViudium für Kulturen benutzt wurdo, die für dio Verwendung von Ronnin-Enzymbostimmungen gezüchtet wurden.) ProtoosePepton wuide getrennt im Phosphatpuffor autokluvicrt.

YEPD-Modium - (Hofooxtrakt/Popton/Doxtroso-fviudium) onthiolt (pro Liter): 5g Hefeextrakt, 10g Pepton und 20g Dextrose. E. coli wurdo in LB-Modium boi 37"C gezüchtet. LB-Modium enthielt (pro Liter): 10g Bacto-Trypton, 10g Bacto-Hefeextrakt, 10g Natriumchlorid, mit Natriumhydroxid auf pH7,5eingestollt.

DNA-Sequenzanalyse. Dio DNA-Fragmonto dor hior büschriebonen verschiedenen Plasmide wurden adf Polyacrylamidgelen isoliort und nach dom Vorfahron von Maxam ot al.. Methods in Enzymology, 65, 499 (1980), sequenziert.

Verknüpfungsverfahren. DNA-Fragmente, gespaltene Vektorplasmide eingeschlossen, wurden durch Vermischen der gewünschten Bestandteile (DNA-Fragmen e mit geeignet konstruierten Enden, um korrekte Verknüpfung zu liefern) mitT4-DNA-Ligase ligiprt. Annähernd 10 Ligase-Einheiten wurden für pg-Mengen an Vektor und Insertionsfragmenten zugegeben. Die dabei entstandene Mischung der Ligationsreaktion wurde in kompetente Zellen von E. coli K12 des Stammes MM 294 (ATCC-33625) oder HB101 (ATCC-33694) transformiert.

Herstellung chemisch synthetisierter DNA. Um die Hybrid-Gene für die Expression und Sekretion von Prorennin zu konstruieren, wurden acht Oligonukleotide mit Hilfe eines modifizierten Phosphoramiditverfahrens (Sinha et al., Tetrahedron Letters 24,5843 (19831 auf einem automatisierten Genetic Design 6500 DNA-Syntheseapparat (Watertown, MA) synthetisiert und über 6M Harnstoff-20% Polyacrylamid-Gele gereinigt.

Aliquots komplementärer Oligonukleotide wurden vermischt und bei 4°C über Nacht in TE (10 ml Tris-HCI, pH 8,01 mM NaEDTA) miteinander gepaart. Aliquots (etwa 2μ9> der doppelsträngigen Oligonukieotide wurden in einem 20pg-Reaktionsansatz, der 7OmM Tris (pH7,6), 1OmM MgCI₂,5mM Dithiothreitol, und 5mM ATP enthielt, bei 37°C unter Verwendung von T4-Polynukleotidkinasephosphoryliert.

Herstellung von Plasmid-DNA. Die Herstellung von Plasmid-DNA in großem Maßstab erfolgte nach dem Verfahren von Holmes et al., Anal. Biochem., 114,195-197 (1981) und durch anschließende Ethidiumbromid-CsCI Gloichgewichts-Dichtegradienten-Zentrifugation. Mengen von Plasmid-DNA im Miniprep-Maßstab wurden nachdem Verfahren von Birnboimetai., NAR 1,1513 (1979), (alkalisches SDS) hergestellt.

Konstruktion der Expressions-/Sekretionsvektoren für Prorennin. Um die endgültigen Expressionsvektoren zu erhalten, wurde eine Reihe verschiedener Konstruktionen gemacht. Alle Schritte sind in den beigefügten Zeichnungen im Diagramm dargestellt. Im allgemeinen wurden DNA-Fragmente mittels Golelektrophorese isoliert und mit anderen Fragmenten oder gespaltener Plasmid-DNA in 20μΙ 5OmM Tris-HCI (pH 7,5), 1OmM MgCI₂,2OmM Dithiothreitol, ImM ATP und 200 Einheiten T4-Ligase bei 4°C verknüpft. Wenn Teilverdauung der DNA mit Restriktionsendonuklease nötig war, wurden die optimalen Spaltungszeiten experimentell bestimmt.

Identifizierung von Prorennin in Kulturflüssigkeit. Ma ließ transformierte Hefen, die die Expressionsvektoren enthielten, über Nacht in GPP-Medium (siehe oben) wachsen. Nach Zentrifugation zur Entfernung der Hefezellen wurden jeweils 1 ml 50%ige TCA zu jeder 5ml-Probe der Kulturflüssigkeit gegeben und 60min lang bei 4⁰C gehalten. Durch Zentrifugieren erhielt man einen Rückstand in Tablettenform und wusch diesen zweimal mit 2ml kaltem Aceton. Das ausgefällte Protein wurde in 100μΙ SDS-Probenpuffer gelöst und gleiche Mengen wurden auf 10%igen SDS-Polyacrylamidgelon der Elektrophorese unterworfen (Laemmli, U.K., [1970!, Nature 227,680). Die durch das Gel getrennten Proteine wurden elektrophoretisch auf Nitrocellulose übertragen (Schleicher und Schuell, 0,22 um) und Prorennin wurde durch Immunoblot-Analyse von Plattengelen (Hawkes, R. et al., [1982] Anal. Biochem. 119,142) identifiziert. Das Filter wurde mit Anti-Prorennin-Antikörper vom Kaninchen überschichtet und dann mit gegen Kaninchen-lgG gerichtetem, mit Peroxidase konjugiertem Ziegen-Antikörper inkubiert (Cappel, Malvern, Pa). Die gebundenen Antikörper wurden durch Anfärben mit 4-Chlor-l-naphthol und Wasserstoffperoxid sichtbar gemacht. Milchgerinnungsaktivität von Prorennin in Kulturflüssigkeit. Die Kulturflüssigkeit von verschiedenen transformierten Y. lipolytica-Spezies wurde nach einem modifizierten Verfahren von Ernstrom, J. Dairy Sei. 41,1664(1958) auf ihre Milchgerinnungsaktivität unto, sucht. Die Bestimmung umfaßt, kurz umrissen, die Messung der Zeitspanne, die Rennin in aktivierten Kulturüberständen zur Gerinnung von gepufferter Magermilch benötigt, und die Korrelation dieser Werte mit einem gereinigten Rennin-Standard. Man ließ Hefekulturen (25ml) über Nacht in GPP-Medium wachsen. Nach Zentrifugieren, um die Zellen zu entfernen, wurden jeweils 5ml des Kulturüberstands im Vakuum gefriergetrocknet. Jeder der lyophilisierten Überstände wurde in 300μΙ destilliertem Wasser resuspendiert.

Außerdom wurde eine Verdünnungsreihe von gereinigtem Kalbs-Prorennin als Standard zum Kon troll vergleich hergestellt. Das Prorennin in den Medienkonzentraten und in den Kontrollen wurde durch Zugabe von etwa 5-1 ΟμΙ konz. HCI bis zu einem pH von annähernd 2 und durch einstündiges Inkubieren bei 22⁰C aktiviert. Magermilch wurde durch Zusatz von 60g trockenem Magermilchpulver (Difco) zu 500ml 41.5mM Natriumacetat (pH6,3) und 13,6mM CaCI₂ und 20minütiges Rühren bei4°C hergestellt. Das Substrat wurde direkt nach seiner Herstellung für die Bestimmungen verwendet. Eine Probe von 60; I (?u 1 ml des Kulturüberstandes äquivalent) jeder Enzympräparation wurde bei 37⁰C zu jeweils 1 ml Magermilch hinzugefügt und die Gerinnungszeit wurde aufgezeichnet.

Herstellung von synthetischen Oligonukleotiden für das C5a-Gen. Die für die Synthese des C5a-Strukturgens verwendeten Oligedesoxynukleotide wurden mit Hilfe eines modifizierten Phosphoramidit-Verfahrens (Sinha et al., loc. cit.) unter Verwendung einer Glasfritte mit definierter Porengröße auf einer automatisierten Genetic Design 6500 (Watertown, MA) DNA.-Syntheseapparatur auf chemischem Wege hergestellt. Die Vorschrift gibt die Verwendung von 3%iger (w/v) Dichloressigsäure in Dichlormethan für die Detritylierung, „in Iine"-Aktivierung der Phosphoramidite mit gesättigtem Tetrazol in Acetonitril, Schützen durch „Capping-Reaktion" mit Di-Ethoxyphosphintetrazolid und Oxidation mit wäßrigem lod/THF (Matteucci et al., [1981|, J. Amer. Chem. Soc. 105, Γ¹183) an. Die Gesamtzeit für einen Additions2yklus betrug 14min. Die zehn 47-mere, die Segmente A-J in Fig.9, erhielt man mit 98,8%iger durchschnittlicher Ausbeute/Stufe (mittels Tritylanalyse), sie wurden nach dem Verfahren von Matteucci et al., loc.cit., deblockert, mit Ethanol aus 0,3M Natriumacetat gefall; und mittels präparativer Gelolektrophorese auf 10%igon, denaturierenden Polyacrylamid-Harnstoff-Gelen isoliert, bevor sie gepaart wurdon.

Zusammensetzen, Klonieren und Sequenzieren von menschlichem C5 a-Gen. Fig. 9 zeigt die Aminosäuresequenz des gesuchten Proteins und dio Anordnung dor synthetischen Oligonuklootide, die zur Herstellung eines für menschliches C5a-Protein codiorondon Gons bonötigt worden. AlIo Oligomoron, mit Ausnahmo von A und F, wurden an ihren 5'-Enden mit T4-Polynuklootidkinaso phosphoryliort. Das Zusammonsetzon dos Gens schloß zwei primäre Paarungs-ZVerknüpfungs-Reaktionen oin, botroffonddioOligomoro A, B, I und J und dieOligomore C, D, E, F, G und H. Die gebildeten 94 Bp und 141 Bp langen doppolstrangigon DN A-Fragmonto wurden nach Elektrophorese auf einem 10%igen Polyacrylamid-Gel isoliert und miteinander Ii(JiOi t und das aus ihnen ontstandono 235Bp lango Produkt wurde mittels Gelelektrophorese isoliert. Das 235Bp lange DNA-Fragmont, das oin für C5a codierondos Strukturgon onthielt, wurde zwischen die EcoRI- und Hindlll-Stellen der pBR322-Vektor-DNA insortiort und in kompetonto Zollon des Stammes HG 101 von E. coli K-12 transformiert. Restriktionsanalyse von Plasmid-DNA, dio aus 6 transformierten Spozios isoliert wurde, zoigto, daß 5 dor 6 Klono ein EcoRI/Hindlll-Fragment in der richtigen Größe enthiolton. Dio Nukleotidsequonz der C 5a-Gonrogionoin6s jeden diosorPlasmido wurde nach dem Vorfallt en von Maxam ot al., Methods Enzymol. 65, 499 (1980) bestimmt.

Konstruktion und Charakterisierung desCöa-Expressionsplasmidsfür E. coli. Verfahiun für die Isolierung von DNA-Fragmenten und die Bedingungen für die Ligatonsreaktionen waren identisch mit denen von Maniatis et al., (1982) Molecular Cloning; A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, publizierten. De· trp-Promotor-Operator von E. coli wurde ursprünglich aus ptrpLI gewonnen (Edmann et al., [19811 Nature 291,503). Das 360Bp lange EcoRI-Fragment, das die im Cöa-Expressionsplasmid (pC5a-48) verwendete trp-Promotor-Operator-Sequenz enthielt, wurde aus dem Prorennin-Expressionsplasmid pPFZ-R2, beschrieben in der europäischen Patentanmeldung Nr.0147178, veröffentlicht am 3. Juli 1985, isoliert. Identifizierung von C5a in der Kulturflüssigkeit von Y. lipolytica. Das Verfahren war dasselbe wie dasjenige, das oben für Prorennin beschrieben wurde, mit der Ausnahme, daß Ziegen-Anti-C5a- und gegen Ziegen-lgG gerichtete Kaninchen-Antikörper (Cappel) beim Immunoblot verwendet wurden. Der Ziegen-Antikörper gegen menschliches C5a wurde nach dem Verfahren von Manderino et al., J. Immunol. Methods, 53,41-50 (1982) hergestellt.

Die Vektoren

pLD40- beschrieben in der europäischen Patentanmeldung 0138508, veröffentlicht am 24. April 1985

Die Mikroorganismen:

ATCC 20774 Yarrowia lipolytica PC 30869

ATCC20781 mit XPR2 transformierte Yarrowia lipolytica DL112 - PC-30869 ATCC 20776 Yarrowia lipolytica DL-148.

Transformierte Spezies von Y. lipolytica ATCC 20688 mit durch SnaBI verdautem pLS-3 ATCC 20775 Yarrowia lipolytica DL-144

Transformierte Spezies von Y. lipolytica ATCC 20688 mit ungescnnittenem pLS-3

ATCC 20777 Transformierte Spezies von Y. lipolytica PC-30869 mit durch SnaBI geschnittenem pC 5 aX-3 ATCC 20778 Transformierte Spezies von Y. lipolytica PC-30869 mit durch SnaBI geschnittenem pXX-11 ATCC 20779 Transformierte Spezies von Y. lipolytica PC-30869 mit durch SnaBI geschnittenem pXX-22 ATCC 20780 Transformierte Spezies von Y. lipolytica PC-30869 mit durch SnaBI geschnittenem pXX-33 ATCC 20794 Transformierte Spezies von Y. lipolytica PC-30869 mit pLD56

ATCC 20795 Transformierte Spezies von Y. lipolytica ATCC 20794 mit durch Nrul geschnittenem pLX-34 Sie sind dem Budapester Abkommen entsprechend in der Ameiican Type Culture Collection, Rockville, Maryland, USA, hinterlegt worden, einer anerkannten Hinterlegungstelle, die das Verbleiben des hinterlegten Gutes und dessen leichte Verfügbarkeit für die Öffentlichkeit für den Fall, daß ein Patent auf diese Anmeldung gewährt wird, garantiert. Die hinterlegten Stämme sind, solange die amerikanische Prioritälsanmeldung dieser Anmeldung abhängig ist, einer vom Präsidenten des amerikanischen Patent- und Warenzeichenamtes zu bestimmenden Person, die hierfür die Berechtigung erhält, unter den Bezeichnungen 37 CFR 1.14 und 35 USC 122 und in Übereinstimmung mit ausländischen Patentgesetzen in Ländern, in denen korrespondierende Anmeldungen dieser Anmeldung oder von deren Vorli>i'f eingereicht sind, zugänglich. Alle Beschränkungen der Verfügbarkeit der hinterlegten Mikroorganismen ff ..« Öffentlichkeit werden bei Gewährung des Patentes unwiderruflich aufgehoben.

Die taxonomischen Studien von Y. lipolytica ATCC20774 (identifiziert in der Kulturensammlung von Pfizer Inc. als PC 30869) wurden von Dr. J. R. De Zeeuw durchgeführt, der die nun folgende Beschreibung zur Verfügung stellte. Die angewandten Verfahren sind solche, die von J.L.Lodder in „The Yeasts", zweite Ausgabe, N.Holland Publishing Co., Amsterdam, 1970, empfohlen werden.

CBS599, die Musterkultur für die Species Candida lipolytica („The Yeasts", zweite Ausgabe, N.Holland Publishing Co., Amsterdam, 1970) und CBS 6124, die Musterkultur für Saccharomycopsis lipolytica in „The Yeasts, dritte Ausgabe, wurden zum Vergleich herangezogen. Früher wurde die Spezies auch mit Endomycopsis lipolytica bezeichnet. Ihr imperfektes Stadium ist Candida lipolytica. Die taxonomische Stellung der Spezies wurde von van der Walt und von Arx, Antonie van Leeuwenhoek, 46, 517-521 (1980) festgelegt. Der bevorzugte Name ist nun Yarrowia lipolytica.

Die morphologischen und physiologischen Charakteristika des Stammes PC-30869 und die der Kulturhaltung stimmen mit der Standardbeschreibung für die Spezies überein, die als Saccharomycopsis lipolytica in „The Yeasts", dritte Ausgabe, Herausgegeben von Kreger-van Ri], S.406-408, Elsevier Science Publishers B. V., Amsterdam, 1984, aufgelistet ist.

Tabelle 1 Vergleich von Stämmen von Yarrowia lipolytica

Pfizer-	Quelle	Gonotyp
Zugriffs-	NRRL YB-423 (auch CBS 6124),	Wildtyp
Nummer	Mustorkulturin „TheYeasts",	diploid
PC-30265	dritte Ausgabe
	CBS 599, Mustork'jltur in „The Yeasts",	MATA Wildtyp,
	zweite Ausgabe	haploid
PC-30286	Siohounton	MATBbio-6-leu2-40
		xpr2-1002
PC-30868

PC30869 wurde durch gonotischo Rokombination geeigneter Mutanten von Y. lipolytica PC-22208, einer aus Boden isolierten Spozios von Pfizor, und Y. lipolytica PC-30026, einer Subkultur von NRRL Y-1094, konstruiert. PC-30869 unterscheidet sich im Phänotyp von ihron Wildtyp-Vorläuforn dadurch, daß sie (1) keine aktive exozelluläre alkalische Protee -.e produziert, (2) Biotin für ihr Wachstum bonötigt una (3) oino Quelle für L-Loucin benötigt.

Während des Wachstums von PC-30869 in der log-Phase in Hefeextrakt-Pepton-Glucose- (YEPD-) Kulturbrühe sind sprossende Zellen ovoid und besitzen eine durchschnittliche Größe von 2,6 χ 5,5 Mikrometer. Auf YEPD-Agar sind Psfiudo- und echtes Mycel hervorstechend. Blastosporen sind vorhanden, vorwiegend einzeln in pleuralen Positionen. Es sind keine Carotinoid-Pigmente sichtbar. Die Kultur verhält sich bei der Kreuzung mit authentischen Teststämmen für die Spezies als Haploid vom „B"-Typ („mating type B") (Tabelle 5). Typische Ascosporulierung wird auf V8-Agar beobachtet. Das Kohlenstoffassimilierungsmuster ist in der beigefügten Tabelle 2 dargestellt. Fermentation findet nicht statt. Ammoniumionen und Harnstoff, aber nicht Nitrat, werden als einzige Stickstoffquellen verwertet (Tabelle 3). Der Stamm PC-30869 benötigt die Vitamine Thiamin und D-Biotin (Tabelle 4). Von den Wildtyp-Vorläufern der Kultur w>rd nur Thiamin benötigt. Kein Wachstum beobachtet man bei 37⁰C.

Tabelle 2 Kohlepstoffassimilation^lal

Auflistung

derRef.-Lit.-^(bl Kultur

Quelle Beschreibung 30265 30286 30869

1.L-Arabinose - -

2. Cellobiose - -

3. Erythritol + + + + + + + + + +

4. D-Galactose - - -

5. D-Glucose + + + + + + + + + +

6. Inositol - - -

7. Lactose - -

8. Ma'tose - -

9.D-Mannitol + + + + + + + + + +

10. Raffinose - -

H.Ribitol - -

12.D iibose -(+) - - t +

13. L-Rhamnose - - - -

14. Lösliche Stärke - -

15. Saccharose - -

16. Trehalose - 17.D-Xylose - -

18. Bernsteinsäure + + + + + + + + + +

19. Zitronensäure + + + + + + + + + +

(a) Das Basalmedium war Bacto-Hefen-Stickstoffbase, ergänzt durch weitere 10pg/l D-Biotin und 149mg/l L-Leucinethylester χ HCI, um 100mg/l L-Leucin zur Verfugung zu stellen.

(b) Kreger-van Rij. (loc. cit.)

Tabelle 3 Stickstoffassimilation¹·"

Auflistung

derRef.-Lit.-^(b) Kultur

Quelle Beschreibung 30265 30286 30869

1.(NH₄I₂SO₄ + + + + + + + + + +

2.KNO₃ - -

3. Harnstoff + + + + + + + + + +

(a) Das Basalmedium war Bacto-Hefen-Kohlenstoffbase, ergänzt durch 116mg/l Natrium-Ketoisocaproat zur Bereitstellung

eines Äquivalentes von 100mg/l L-Leucin und mit zusätzlichen 10pg/l D-Biotin "(b) .Kreger-van Rij. (loc. cit.)

Tabelle 4 Vitaminbedarf'"

Ergänzung des Basalmodiums'⁰'

I.Koino

2. Thiamin χ HCI

3. D-Biotin

4. Thiamin plus Biotin

(a) Das Basalmudium war vitaminfroio Bacto-Hofobase plus 149mg/l L-Leucinethylester x HCI, um 100mg/l L-Leucin zur Vorfügung zu stellon.

(b) Krogor-van Rij (loc. cit.)

(c) 200pg/l Thiamin χ HCI und/oder 10pg/l D-Biotin wie angogoben (tr) Spuren (trace)

Ergebnis bei""	30628	Kultur	3086!
d.zit.Lit.	tr	30286	-
-	t- + +	tr	-
t-	tr	+ + +	tr
-	ι ι ι	tr	t- l· I
I-	t- ι- +

Tabelle 5 Ascosporulierung

Test-Stamm

30265

gepaarte Kultur 30286

Keine (Kultur mit sich selbst gepaart) ++ -

30264 (ein A-Paarungs-Typ) + +

30267 (ein B-Paarungs-Typ) ++ + + +

(a) Die Kulturen 3C264 und 30267 sind haploide Stämme vom entgegengesetztem Paarungs-Typ, von Dr. L. J. Wickerham freundlicherweise zur Verfügung gestellt. Sie sind in Science 167,1141 (1970) formal beschrieben.

(b) 30264 nach Wickerham ist C. lipolytica YB-421

(c) 30267 nach Wickerham ist C. lipolytica YB-423-12

Tabelle 6	In Ref.1"1 an	30265	Kultur	30869
Andere Charakteristika	gegebene Daten	ovoid	30286	ovoid
	ovoid	3,3 x	ovoid	2,6 x
	(2-4,5) x	9,1	3,Ox	5,5
Zellform	(4-22)		8,2
Durchschnittl.		Sprossung		Sprossung
Zellgröße	Sprossung	fehlt	Sprossung	fehlt
Vegetative	fehlt	keines	fehlt	keines
Vermehrung	keines		keines
Fermentation
Wachstum bei 37 °C:

Koloniewachstum: Die drei Kulturen wuchsen auf ähnliche Weise und verhielten sich wie in der Literatur beschrieben. Pseudo- und echtes Mycel vorherrschend. Blastosporen vorhanden, meist einzeln in pleuralen Positionen. Kein Carotinoid-Pigment sichtbar.

(a) Kreger-van Rij. (loc. cit.)

PC-30869 unterscheidet sich von anderen in der Patentliteratur beschriebenen Stämmen von Y. lipolytica, wie beim Vergleich

ihrer Phänotypen (Tabellen 7 und 8) deutlich wird.

ATCC 20228 (Nubel et al., US Patent 4,155,811) zeigt wildtypartiges Verhalten bei der Nährstoffaufnahme wie die Musterstämme für die Species, CBS 599 und CBS 6124. Typischerweise benötigt er kein Uracil, Leucin oder Biotin zum Wachstum und er

verflüssigt Gelatine.

ATCC 20628 (De Zeeuw et al., US Patent 4,407,953) benötigt im Gegensatz zu ATCC 20228 den Zusatz von Leucin für sein Wachstum. Wie ATCC 20/:28 benötigt er kein Uracil oder Biotin. Er verflüssigt außerdem Gelatine.

ATCC 9.0688 (Europäische Patentanmeldung 0138508) wächst nur, wenn das Medium sowohl durch Uracil als auch durch Leucin ergänzt wird.Dieser Bedarf anUracilunterscheidetATCC 20688 sowohl von ATCC 20228 als auch von ATCC 20628.ATCC 20688

benötigt kein Biotin und verflüssigt Gelatine.

Die Kultur PC-30869 unterscheidet sich von allen obengenannten Stämmen. Sie benötigt Biotin und Leucin, aber kein Uracil für

ihr Wachstum. Sie verflüssigt Gelatine nicht.

Tabelle 7 Benötigte Nährstoffe

Kultur

Keiner

Aus dem angegebenen Medium weggelassene Nährstoffe Leucin Uracil

Biotin

CBS599 CBS 6124 ATCC 20228 ATCC 20628 ATCC 20688 PC-30869

ι- ι +

+ I- t-

I- ι- t-

Dns vollständige Modium enthielt 16,7g/l vitaminfreio Bacto-Hefobase plus 100mg/l Uracil, 100mg/l L-Leucin, 10pg/l D-Biotin uncl200pl/IThiamin χ HCI.

Tabelle 8 Gelatineverflüssigung

Kultur Verflüssigung

CBS599 +

CBS 6124 +

ATCC 20228 +

ATCC 20628 +

ATCC 20668 +

PC-30869

Das Medium enthielt 120g/l Gelatine und 16,7g/l vitaminfreie Bacto-Hofebase plus 100mg/l Uracil, 100mg/l L-Leucin, D Biotin und 200Mg/IThiamin χ HCI.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Fig. 1 - Partielle lineare Restriktionskarte der überlappenden Plasmide pLD 57. pLD 58 und pLD 62, isoliert aus Y. lipolytica, Stamm DL112.

Fig.2 - Synthetische Oligonukleotid-Bruchstücke für das XPR2-Gen. Aus der veröffentlichten Sequenz für den größten Teil der ersten 25 Aminosäurereste der reifen Protease (Ogrydziak et al., loc. cit.) bieten zwei Regionen (markiert mit I und III der Möglichkeit, 14-more Oligonucleotid-Bruchstücke mit 32facher oder geringerer Degeneration zu konstruieren. Die zwei Regionen beginnen bei den Aminosäuren 7 bzw. 18. Vier verschiedene, achtfach degenerierte Bruchstückgemische wurden für jede Region hergestellt und man ordnete ihnen Nummern zwischen 170 und 186 zu, wie dargestellt. In den gezeigten, abgeleiteten Nukleinsäuresequenzen bedeutet „X" alle 4 Basen, „U" steht für beide Purine und „Y" steht für beide Pyrimidine.

Fig.3 - Nukleotidsequenz des XPR2-Gens, wobei die Promotor-, die Prä- (-157 bis -136), die Pro 1- (-135 bis -98), die Pro 2-(—97 bis -1), die alkalische extrazelluläre Protease- und die Terminator-Sequenzen gezeigt sind.

Fig.4 - Konstruktionssequenz für den Terminator-Vektor pterm 4.

Fig. 5 - Konstruktionssequenz und Restriktionskarte des Plasmids pLS-3

Fig.6 - Konstruktionssequenz und Restriktionskarte des Plasmids pXX-33

Fig.7 - Konstruktionssequenz und Restriktionskarte des Plasmids pXX-22

Fig.8 - Konstruktionssequenz und Restriktionskarte des Plasmids pXX-11

Fig.9 - Aminosäuresequenz von menschlichem AnaphylatoxinC5a

Fig. 10 - Restriktionskarte des Plasmids pC5a-48

Fig. 11 - Konstruktionssequenz und Restriktionskarte des r'lasmids pC5aX-3 Fig. 12 - Nukleotidsequenz des LEU2-Gens

Fig. 13 -. Konstruktionssequenz und Restriktionskarte des Plasmids pLX-34

Sequenzanalyse des XPR2-Gens. Die DNA-Sequenzanalyse des klonierten XPR2-Gens wurde mit Hilfe des chemischen Abbauverfahrens (Maxam et al. 1980, Methods Enzymol. 65,499) an überlappenden Restriktionsfragmenten durchgeführt, die aus den Plasmiden pLD57, pLD58, pLD62 (Fig. 1) und pLD84 und pLD86 (siehe unten) hergestellt worden waren. Die Ergebnisse zeigten, daß in der Tat die klonierten Hefegenom-DNA's das Gen für die exozelluläre alkalische Protease enthielten. Die Nukleotidsequenz des XPR2-Gens und die Aminosäuresequenz des Vorläufers der alkalischen Protease mit ihrer Signalsequenz, wie sie sich von der Nukleotidsequenz ableitet, sind in Fig. 3 dargestellt. Ein Großteil der Aminosäuresequenz der exozellulären Protease war unbekannt (Ogrydziak et al., loc. cit.) und wird hier zum erstenmal vorgestellt. Darüber hinaus werden die für die Expression und die Sekretion der exozellulären Protease benötigten Sequenzen hier zum erstenmal beschrieben. Die DNA-Sequenz, die für die alkalische Protease, ihren Vorläufer und die Signalsequenzen codiert, besteht aus 1362 Basenpaaren (Fig. 3). Aus der Nukleotidsequenz ergab sich, daß die Primärstruktur dieser Polypeptidkette aus 454 Aminosäureresten besteht. Die alkalische Protease wird in der Zelle in Form eines Verläufers synthetisiert, der proteolytisch in die sezernierte oder reife Form überführt wird. Die Analyse der N-terminalen Aminosäuresequenz, abgeleitet von der Nukleotidsequenz, offenbarte die Existenz eines mutmaßlichen Signalpeptids im Vorläufermolekül. Dieses Signalpeptid enthält 22 Aminosäurereste und seine strukturellen Eigenschaften sind denen höherer eukaryotischer und prokaryotischer Signalpeptide ähnlich (Perlman et al., 1983, J. Mol. Biol. 167,391). Einer Region in der abgeleiteten Aminosäuresequenz, die im allgemeinen mit den bekannten 25 N-terminalen Aminosäuren der reifen alkalischen Protease übereinstimmt (Ogrydziak ei al., 1982, J. Gen. Microbiol. 128, 1225), gehen 157 Aminosäurereste voraus, die das Signalpeptid und zwei Spaltstellen vom Trypsin-Typ (Lys-Arg) enthalten. Diese Spaltstellen wurden benutzt, um die Proregion in Prol (-135 bis -98) und Pro 2 (-97 bis -1) zu teilen. Siehe Fig. 3. Die reife alkalische Protease besitzt 297 Aminosäuren, wie aus der Nukleotidsequenz abgeleitet wurde. Die für die verschiedenen Formen der Protease aus der Nukleotidsequenz abgeleiteten Aminosäuresequenzen stimmten mit den Größen der gereinigten Formen der Enzyme überein. Zusätzlich zu der Struktursequenz des Vorläufers der alkalischen Protease wurden annähernd 700Bp der 5'-flankieronden Sequenz und 600Bp der 3'-flankierenden Sequenz bestimmt. Analysen dieser Regionen zeigten, daß sie Sequenzen umfassen, dio zu anderon eukaryotischen Promotoren und Terminatoren anaolge Sequenzen enthalten und wahrscheinlich für die Expression der alkalischen Protease wesentlich sind.

Wie obon erwähnt, ist die Mothoclologio für die Transformierung von Y. lipolytica und für die Klonierung von Y. lipolytica-Genen durch Komplomontation von Mutationon, einschließlich des Klonierens des XPR2-Gens, das für eine sezernierte alkalische Protoaso codiert, durch Komplomentation einer xpr2-Mutation in der europäischen Patentanmeldung 0138508 beschrieben. Das dort boschriobeno Vorfahren umfaßt das Transformieren oinos Y. lipolytica-Wirtsstammes mit einer Y. lipolytica-Genbank, unter toilwoisor Verdauung durch BgIII im Vektor plD40 hergestellt, wobei dieser Vektor durch die Tatsache charakterisiert ist, daß er oin kloinos Sogmont, das die LEU2-Rogion von Y. lipolytica enthält, und 3ECoRI^ECoRV, 6 Aval, 1 BgIII, 1 Ncol, 1 Apal, 2Xhol und

1 BstXI Endonukleasen-Restriktionsstellen beherbergt. Eine der transformierten Y. lipolytica-Spezies wurde verwendet, um das Wildtyp-Gen (pLD84 und pLD86) aus Y. lipolytica NRRL Y-1094 für die Verwendung in der Expressions-ZSekretions-Vektorkonstruktion wie in Beispiel 1 beschrieben zu gewinnen.

Sequenzanalyse des LEU2-Gens. Die DNA-Sequenzanlayse des klonierten LEU2-Gens in pLD?5 (EP 38508) wurde mit Hilfe der chemischen Abbaumethode (Maxam et al. 1980, Methods Enzymol. 65,499) an überlappenden Restriktionsfragmenten durchgeführt. Um die für die beta-lsopropylmalat- (IPM-) Dehydrogenase codierende Region und den passenden Leserahmen zu lokalisieren, bediente man sich der abgeleiteten Aminosäuresequenz, die für das LEU2-Gen von S. cerevisiae bereits bestimmt wurde (Andreadis et al., 1984, J. Biol. Chem. 259,8059). Die Region der Genomsequenz von Y. lipolytica, die für eine Aminosäuresequenz codiert, welche einer Region der S. cerevisiae-Proteinsequenz homolog ist, wurde identifiziert. Die Nukleotidsequenz des 2,8 Kilobasenpaare tragenden LEU2Gens und die Aminosäuresequenz von beta-IPM-Dehydrogenase, wie sie sich von der Nukleotidsequenz ableitet, sind in Fig. 12 dargestellt. Darüber hinaus sind die Sequenzen, die für die Expression der beta-IPM-Dehydrogenase von Y. lipolytica benötigt werden, hier zum erstenmal beschrieben. Die DNA-Sequenz, die für dieses 405 Aminosr uren enthaltende Protein codiert, besteht aus 1215 Basenpaaren (Fig. 12). Zusätzlich zu der für die beta-IPM-Dehydrogenase codierenden Sequenz wurden eine annähernd 798 Bp lange 5'-flankierende Sequenz und eine 797 Bp lange 3'-flankierende Sequenz (einschließlich des Translations-Terminations-Codons TAA) aufgeklärt. Die Analyse dieser Regionen zeigte, daß sie zu anderen eukaryotischen Promotoren und Terminatoren analoge Sequenzen enthalten und für die Expression unabdingbar sind.

Die in 5'-Richtung strangaufwärts liegende Region des LEU2-Gens von Y. lipolytica enthält 78 Bp vor dem Translationsstart und 30 Bp vor dem mutmaßlichen mRNA-Start eine TATATATA-Sequenz. Eine zweite Sequenz, die für den Beginn der Transkription in Eukaryoten wichtig ist, ist die CAAT-Box, die im LEU2-Gen 74 Bp vor der mutmaßlichen Transkriptions-Initiationsstelle liegt, die -48 Bp vom ATG entfernt liegt (l^:ig. 12).

Die in 3'-Richtung strangabwärts liegende Region besitzt eine Sequenz im Bereich der Nukleotide 72 bis 120 nach dem S'op-Codon (TAA), die der 5'-TAG... .TA(T)GT....Il l-3'-Sequenz homolog ist, welche nach einem Vorschlag von Zaret et al., Cell 28, 563 (1982) wesentlich für die Transkriptionsbeendigung in S. cerevisiae ist.

Ausführungsbeispiele

Beispiel 1

Der verwendete Wirtsstamm war ATCC 20774 (MATB Ieu2-4O bio-6 xpr2-1002). Die mit XPR2 transformierte Y. lipolytica ATCC 20781 wurde als Kolonie entdeckt, welche nach Replika-Plattierung von Leucin-Mangel-Platten eine Zone auf Magermilch-Indikatorplatten bildete. Chromosomale DNA wurde aus den transformierten Spezies nach dem Verfahren der europäischen Patentanmeldung 0138508 hergestellt und verwendet, um das den für die sekreferte Protease zu gewinnen. Die chromosomale DNA wurde mit Bglll-Enzym teilweise verdaut, ligiert, um das Fragment, das sowohl das E. coli-Replikon als auch das ampicillinresistente Gen aus dem Vektor enthielt, zu zirkularisieren, und zur Transformierung von E. coli verwendet. Die chromosomale DNA wurde auch mit Sall-Enzym verdaut und für ein Southern-Experiment verwendet, welches ergab, daß die normale LEU2-Region der tiansformierten Spezies nicht gestört war. (Ein 520 Bp langes Segment von Sail bis Eco Rl der LEU2-Region, direkt 5' zum Segment des in pLD40 enthaltener lEU2 gelegen, wurde als Sonde verwendet). Die XPR2-Region mußte also, da Homologie für den Einbau einer Plasmidbank in Y. lipolytica notwendig ist, der Integrationsort sein. Drei überlappende, jedoch unterschiedliche Plasmide, pLD57, pLD58und pLD62, wurden als erstes aus Y. lipolytica ATCC 20781 isoliert. Sie sind in Fig. 1 dargestellt. Hybridisierungen mit synthetischen Oligonukleotid-Bruchstücken für das XPR-Gen, basierend auf der bekannten Sequenz der ersten 25 Aminosäurereste des reifen, sekretierten Pioteasepruteins (Fig. 2 und 3) zeigten, daß das Gen für die sekretierte Protease Moniert worden war. Um festzustellen, ob das isolierte Gen die Wildtyp-Kopie odar die Mutanten-Kopie verkörperte, wurde der empfangene Y. lipolytica-Stamm mit pLD58 transformiert. Da keine Protease-positiven, transformierten Stämme aus irgend einem der leucinunabhängigen Transformanten entstanden, wurde geschlossen, daß das pLD58 die mutierten AIIeIe des Gens enthielt. Die Form des XPR2-Gens, die im Wildtyp-Stamm NRRL Y-1094 vorliegt, wurde durch ein Hybridisierungsexperiment mit einer Kolonie von E. coli erhalten. Als Sonde wurHe das 2 kB lange Fragment von Pvul bis EcoRI verwendet, von dem man aufgrund von Sequenzierungsdaten annimmt, daß es da^ gesamte Strukturgen enthält. Von der ursprünglichen Bank der Fragmente aus der Teilverdauung der NRRL Y-1094 DNA in pLD40 mit Sau3A, beschrieben in der europäischen Patentanmeldung 0138508, erhielt man einige Kolonien, die mit dem Bruchstück hybridisierten. Zwei dieser Kolonien, enthielten die sehr ähnlichen Plasmide mit den Bezeichnungen pLD84 und pLDü6, die zur Entwicklung des Expressionsvektors verwerdet wurden. Beide Plasmide enthalten dasselbe 5'-Ende der XPR2-Regir>n-, die Sau3Α-Stelle (die mit der BamHI-Stelle des Vektors verknüpft war und sie regenerierte), bei der die Sequenz in Fig.3 begirnt. Alle zwei enthalten das gesamte Strukturgen für die Protease und den vermutlichen Transkriptionsterminator und enthalten ingesamt annähernd 4 bis 5 insertierte kB von der XPR2-Region des Stammes NRRL Y-1094. Die Insertionssequenz in pLD86 enthält einige hundert zusätzliche Basenpaare am 3'-Ende. Da wir die 3'-Verlängerung bis zu der Bglll-Stelle (Basenpaar 2655) für die Konstruktion des Expressionsvektors benutzten, lieferten die zwei Plasmide dieselbe DNA, die funktionell in der Sequenz identisch zur Fig. 3 war. Konstruktion des EKpressioris/Sekrcticnsvukicr-jr.. Der Pian, der zum Erreichen von Expression und Sekretion von Prorennin in Y. lipolytica entwickelt wurde, benutzt die Konstruktion von verschiedenen Hybridgenen in einem integrativen Klonierungsvoktor. Eine solcher Ansatz bringt mehrere verschiedene Plasmide hervor, die extensive Regionen gemeinsamer DNA-Sequenzen teilen. Tatsächlich wurde ein modulares Konstruktionsschema verwendet, um Vektoren zusammenzustellen, dio das Proronnin-Gen in 3'-Richtung zur vermuteten Frozessierungsstelle für das XPR2-Signalpeptid, der vermuteten Prol-Prozessiorungsstollo und dor Spaltstelle, von der man waiß, daß sie die reife alkalische Protease orzeugt, insertiert enthalten. Im allgemeinen ist für das hetorologo Gen ?u wünschen, daß es für die Expression zwischen die Höfe-Promotor- und Torminatorsoquenzon οι igofügt wird. Man hat erkannt, daß der N-terminale Teil der Hybiiugensoquenzen in den verschiedenen Plasmidkonstruktionon variiert, wogegen die Proronnin-Strukturgonsequenz, die XPR2-Terminatorsequenz und die Shuttle-Vektor-DNA in jeclor Expressionsplasmid-Konstruktion die gleicho ist. Es war vorgesehen, daß dasselbe Strokturgen-Fraoment für

Prorennin und das Terminator-/Vektorplasmid in jeder Expressionsplasmid-Konstruktion verwendet werden sollte, wie unten beschrieben. Die verschiedenen Expres:"ioni>-/Sekretionsplasmid-Konstruktionen für Prorennin unterscheiden sich in dor Region unmittelbar strarigabwärts von der XPR2-Genpromotorsequenz in der Länge der N-terminalen Sequenz für den Vorläufer der alkalischen Protease, die sicVi von der Gensequenz für das Prorennin befindet. Deshalb wurde vorherbestimmt, daß die Promotor-Fragmentkomponente jedes Expressionsplasmides die variable Sequenz in der Region der XPR2-Prorennin-Verknüpfung sein sollte. Alle Expressions-/Sekretionsvektoron wurden durch eine ähnliche Ligierungsreaktion, drei Fragment-Komponenten enthaltend, zusammengesetzt.

Die experimentellen Stufen, die für die Konstruktion des Terminatorverktors pterm 4 verwendet wurden, sind in Fig. 4 dargestellt. Zuerst wurde ein synthetischer Linker mit einem Fragment ligiert, das das 3'-Ende des XPR2-Gens, einschließlich der Transkriptionsterminierung und des Polyadenylierungssignals, enthält. Kurz gesagt wurde das Plasmid pLD84 mit der Endonuklease Kpnl gespalten und mit der synthetischen, doppelsträngigen Linker-DNA wie in Fig.4 abgebildet ligiert. Das Verknüpfungsprodukt wurde mit den Endor.uli'easen Hindlll und BgIII gespalten und ein Fragment mit 760 Basenpaaren wurde in das Plasmid pLD41, das mit den beiden selben Endonukleasen linearisiert worden war, unter Bildung von pterm 4 eingesetzt. Plasmid pterm 4 wurde anhand seiner Restriktionskarte identifiziert. Die Ergebnisse einer Reihe von Verdauungen durch Restriktionsendonukleasen wurden unter Verwendung von EcoRV, EcoRI, Kpnl, Bglll-Hindlll und BgIII-BcII analysiert. Die Verdauungen ergeben geeignete Fragmente, die die Gegenwart des synthetischen Linkers und des „kompletten" 3'-Endes des XPR2-Gens im Shuttle-Plasmid pLD41, beschrieben in der europäischen Patentanmeldung 0138508, bestätigen. Eine partielle Karte dieses 7,3-kB-TerminatorvPktors ist in Fig.4 dargestellt.

Konsttuktion des Expressions-/Sekretions-Plasmids pLS-3. Fig.5 umreißt die Konstruktion des anfänglichen P! ,smids, das für die Sekretion von Prorennin in Y. lipolytica verwendet wurde. Seine Restriktionskarte wird in Fig. 5 vorgestellt. Die Konstruktion des Sekretionsplasmids für Prorennin wurde mit der Herstellung eines Fragmentes begonnen, das den größten Teil dor Prorennin-Strukturgensequenz trägt. Das 1080 Basenpaare lange Bcll-BamHI (partielle) DNA-Fragment, das die codierende Sequenz für die Prorenninreste 6 bis 365 enthält, wurde aus dem E. coli Prorennin-Expressionsplasmid pPFZ 84A isoliert. (Plasmin pPFZ-84 A ist ein Derivat des Prorennin-Expressionsplasmids pPFZ-R 2, dessen Konstruktion in der europäischen Anmeldung Nr. 0147178, veröffentlicht am 3. Juli 1985, beschrieben ist und wurde durch synthetische, oligonukleotid-gesteuerte Mutagenese gebildet, wobei ein Restriktionsfragment ersetzt wurde. pPFZ-84 A unterscheidet sich im wesentlichen von pPFZ-R 2 nur durch zwei Basenpaare an den Prorennin-Aminosäureresten 214 [Asn-Asp] un^rl 286 [Asp-GIy), wobei es f'"ir das sogenannte Prorennin-A-Allel codiert, beide Plasmide enthalten jedoch die gesuchte Sequenz für Prorennin uno sind in diosem Beispiel funktionell äquivalent.) Das Fragment XPR2-Promotorkomponente, das die codierenden Sequenzen für den alkalischen Proteasevorläufer 1 bis 157 und für Prorennin 1 bis 5 enthält, wurde wie folgt hergestellt. Das 870 Basenpaare lange Hindlll-Aval DNA-Hragment, das die Promotorregion und das 5'-Ende des alkalischen Protease-Gens enthält, wurde aus dem XPR2-Subklon-Plasmid pLD90 isoliert. Dieses Fragment wurde mit einem synthetischen Frgament mit der Struktur:

5¹CCGAGATTCCTGCTTCTTCTAATGCCAAGCCAGCTGAGATCACTAG 3' 3' LJAAGGACGAAGAAGATTACGGTTCGCTCGACTCTAGTGATCCTAG 5¹

Leserichtung—» ligiert.

Diese Sequenz enthält ein kohäsives Aval-Ende, gefolgt von Sequenzen, die für die letzten neun Codons des Propeptids der alkalischen Protease codieren, und daran anschließend Sequenzen, die für die ersten vier Aminosäuren von Prorennin codieren, und endet in einer BamHI-Stelle. Das Fragment der Promotorkomponente wurde durch eine Standard-Verknüpfungsreaktion mit T4-Ligase unter Verwendung des syntiietischen Fragments und des 870 Basenpaare langen Hindlll-Aval-Fragmonts und anschließender Spaltung mit Hindlll und BamHI gebildet. Die gebildeten, ligierten Sequenzen wurden mittels Polyacrylamidgol-Elektrophorese gereinigt, um das passende 916 Basenpaare lange Hindlll-BamHI-DNA-Fragment zu selektieren. Das 3'-Ende des Hybrid-Gens wurde aus dem Terminator-/Vektorplasmid pterm 4, der oben beschi ieben ist, gewonnen. Das Plasmid pterm 4 wurde mit Hindlll und Bell verdaut und das annähernd 7,3 kB lange Hindlll-Bcll-Terminntor-/Vektor-DNA-Fragment, das den XPR2-Terminator, einen solektionsfähigen LEU2-Marker und pBR322 enthielt, wurde aus einem Agarosegel isoliert. Das Plasmid pLS-3 für die Expressions/Sekretion von Prorennin wurde zusammengefügt, indem die drei DNA-Fragme . Komponenten (mit Hindlll-Bcll gespaltenes Plasmid pterm4, zusammen mit dem 916 Bp langen Hindlll-BamHi-Promotor- und dem 1080 Bp langen Bai nHI-Bcll-Fragment, das das Prorennin-Gen enthält) inkubiert wurden, die wie oben beschriebon in Gegenwart von T4-Ligase konstruiert worden waren (siehe Fig. 5). Die Ligationsmischung wurde verwendet, um den Stamm MM294 von E. coli K12 mit Hilfe des CaCI₂-Verfahrens von Dagertetal., Gene 6,23-28 (1979) zu transformieren. Aus den ampicillinresistonten, selektierten transformierten Spezies wurden Plasmide isoliert und das Plasmid pLS-3 wurde anhand seiner Restriktionskarte (Fig.6A) identifiziert. Die XPR2-Prorennin-Region diuses Plasmids wurde sequenziert, um die korrekte Sequenz der synthetischen DNA und die korrekte Verknüpfung der gewünschten Fragmente zu bestätigen. Herstellung von pLDau. Dieses Plasmid enthält einen Subklon aus pLD84. Eine DNA-Region von der Pvul-Stelle in der Promotorregion von XPR2 bis zur EcoRI-Stelle in der Terminatorregion wurde in die Hindlll-Stellc von pBR322 auf folgende Weise subkloniert. Einige Mikrogramm pLD84 wurden mit den zwei oben erwähnten Restriktionsenzymen verdaut. Dann wurden die „vorstehenden" Endon der verdauten DNA-Moleküle mit dem Klenow-Fragment von DNA-Polymerasel aufgefüllt. Anschließend wurden mit Kinaso behandelte Hincllll-Linkor (CAAGCTTG von New England Biolabs) mit T4-Ligase an die Enden gohoftet. Üborschüssige Linker wurden ont'ernt und „vorstehende" Hindlll-Enden wurden durch anschließende Verdauung mit Hindlll-Enzym gebildet. Die Mischung der DNA-Moleküle wurde auf oinem präparation Agarosegel aufgetrennt und dio gowünschto 2-kB-Bando wurtlon ausgeschnitten, gereinigt und zu einer Ligations-Reaktionsmischung mit dom durch Hindlll verdauton, mit bakterieller alkalischer Phosphatase behandelten Vektor pBR322 gegeben. Die Ligationsmischung wurde zur Trdnsformiorung kompotonter E. coli verwendet. Die Anordnung, bei dor dio EcoRI-Stelle des XPR 2-Terminators näher an der EcoRI-Stollo dos pBR322 liogt, wurdo pLD90 gonannt und dio umgekehrte Anordnung wurde pLD91 genannt.

Das äußerste jä'-Ende der XPR2-Promotorregion, die in das pLS3 eingebaut wurde, ist die Pvul-Stelle, etwa 280 Bp nach dem Anfang des in Fig. 3 sequenzierten Bereichs. Es wurde gefunden, daß Plasmide, die das Wildtyp-Protease-Gen unter der Kontrolle von nur dieser Größe des Promotors enthielten, die transformierte Spezies nicht zur Herstellung größerer Proteasemengen befähigten, wenn sie on einer Stelle in größerer Entfernung vom jeweiligen Ort des xpr2 integriert waren (beurteilt durch klare Zonen auf Magermilchschalen).

Wir stellten fest, daß, wenn pLS-3 einen gekürzten und dadurch „unvollständigen" Promotor enthielt, ein „Integrant" der aus der Rekombination zwischen dem Plasmid und einem verbliebenen XPR2-Gen vom Wildtyp entstanden war, einen vollständigen Promotor für die Expression des Prochymosin-Fusionsproduktes, aber einen unvollständigen Promotor für dio Steuerung der Protease-Expression ergab. Ein analoges Genstückelungs-Experiment wurde von Shortle et al. (Science 217,371-373,1982) mit dem Actin-Gen von S. cerevisiae durchgeführt. In Übereinstimmung mit unseren Erwartungen fehlte tatsächlich einigen LeucinunaDhängigen, mit pLS-3 transformierten Spezies nun die Protease. Die Transformanten, denen die Protease felilte, schienen eher die gesuchten „Integranten" am XPR2-Locus zu sein als die unerwünschten Nebenprodukte wie z. B. die Genkonvertanten am Ieu2-Locus. Wir entdeckten, daß ungeschnittenes pLS-3 mit dem Emfpängerstamm ATCC 20688 6,5% Transformation mit Protease-Defizienz hervorbrachte, während mit SnaBI geschnittenes Plasmid annähernd 70% transformierte Spezies, denen die Protease fehlte, ergab. Das Auftreten von Genstückelung bei dieser Transformation wurde benutzt, um die Notwendigkeit einer großen Zahl von Southern-Blot-Experimenten zur Auffindung des kori okten integrierenden Plasmids unter allen 1 ransformanten zu umgehen.

Flasmide, die das Protease-Strukturgen des Wildtyps unter Kontrolle des XPR2-Promotors (mit Beginn wie in Tig. 3 sequenziert) enthalten, gestatten die Expression bedeutender Mengen Protease, wenn sie an einer anderen Stelle als der des xpi 2-Locus in Y. lipolytica eingebaut werden. Die wirksame Expression heterologer Gene aus diesen Arten vor „Integranten" dürfe jedoch weitere Modifikation dieser Kontrollregion der DNA erfordern.

Sekretion von Prorennin. Der Stamm ATCC 20688 von Y. lipolytica wurde mit ungoschnittener pLS-3-DNA und mit durch SnaBI verdauter pLS-3-DNA transformiert, wobei man die xpr"leu ^-Transformanten ATCC 20775 (DL 144) bzw. ATCC 20776 (DL 148) erhielt. Diese transformierten Stämme wurden in ein Tewöhrchen mit YEPD-Medium inokuliert. Man ließ die Zelten über Nacht bei 28°C wachsen. Eine Probe (250μΙ) dieser Kultu/en wurde 1:100 in 25ml GPP-Medium verdünnt. Man ließ die iellan in Scliüttelflaschen bei 28°C 16-18 Stunden lang bis zu einer resultierenden Absorption von 5,0 bis 7,0 bei 600nm wachsen und erntete mittels Zentrifugation. Die gebildete Kultcrflüssigkeit oder der Überstand wurde auf Gegenwart von Prorennin untersucht, indem der Überstand eingeengt und das Konzentrat SDS-PAGE unterworfen wurde. Das Platten-Gel wurde elektrophoretisch in Gegenwart von 20mMTr:s-'3ase, 15OmM Glycin, 20% Methanol bei 50OmA 2 Stunden lang bei4°Cauf Nitrozellulosepapier übertragen. Die Fntfernung des Proteins aus dem Platten-Gel wurde durch Anfärben mit Coomassie-Blue bestätigt.

Das Nitrozellulosepapier wurde bei 37°C getrocknet und bei 65⁰C eine Stunde lang gebacken und daraufhin in TBS (20OmM NaCI, 5OmM Tris-HCI, pH 7,5) gewaschen. Dann wurde das Papier bei Raumtemperatur 30min lang in TBS, das 10% Pferdeserum (Gibco, Chagrin Falls, Ohio) enthielt, und anschließend 16 Stunden lang in TBS, das 10% Pferdeserum und eine entsprechende Verdü nnuhg von Prorennin-Antikörper enthielt, inkubiert. Dann v/urde das Papier dreimal 10 min lang in TBS gewaschen, gefolgt von Inkubation in TBS, das 1C% Pferdeserum enthielt, und darauffolgender zweistündiger Inkubation in TBS, das 10% Pfordeserum und eine geeignete Verdünnung von Ziegen· Antikörper gegen Kaninchen-lgG, konjugiert an Meerretiich-Peroxidase, enthielt. Anschließend wurde das Papier dreimal 10min lang in TBS gewaschen und in TBS, das 0,01 % Wasserstoffperoxid enthielt, in Gegenwart von 4-Chlor-1-Napthol (3mg/ml in Methanol) entwickelt, das bis :u einer Konzentration von 0,5mg/ml zugegeben wurde. Das Vorliegen von Prorennin mit einem Molekulargewicht von 40000 wurde in beiden Überständen gesichert.

Nach saurer Aktivierung der konzentrierten Kulturüberstände (siehe oben) war in den Proben, die aus den transformierten, pLS-3 enthaltenden Kulturen ATCC 20775 und 20776 hergestellt worden waren, signifikante Milchgerinnungsaktivität vorhanden. Wie (irwattet gab es keine Milchgerinnungsaktivität in den Kontroll-Kulturüberständen aus dem Empfängerstamm Y. lipolytica ATCC 20686.

Konstruktion des Expressions-/S .Kretionsplasmids pXX-33. Dio Modifikation zur Umwandlung von pLS-3 in ein verbessertes Expressionsplasmid pXX-33 ist in Fig.6 in groben Zügen dargestellt. Eine solche Modifizierung vergrößerte die XPR2-Promotorregion um 280 Bp. Wie im Fall des pLS-3 enthält das Expressionsplasmid pXX-33 ein Hybrid-Gen, das für das gesamte Präpro-Peptid (157 Aminosäurereste) der alkalischen Protease codiert und mit der gesamten Strukturgen-Sequenz des Prorennins verbunden ist.

Bevor das gegenüber dem pLS-3 in der XPR2-Promotorsequenz um 280 Bp vergößerte Prorennin-Expressions'/Sekretions-Plasmid konstruiert werden konnte, war es notwendig, ein Restriktionsfragment, das das gesamte Gen der alkalischen Protease enthielt, in eine Hindlll-Spaltstelle zu subklonieren. Dieser Subklon wurde durch die Zugabe von synthetischen Linkern zu einem Restriktionsfragment zusammengesetzt, welches aus dem Klon pLD86 einer Genombank von XPR2 isoliert worden war. Die Konstruktion dieses XPR2-Subklons mit einer strangaufwärts gelegenen Hindlll-Stelle wurde durch die Herstellung eines DNA-Fragments initiiert, das das gesamte Gen der alkalischen Protease enthielt. Das 2,3 kB lange EcoRI-BamHI- (Teil-) Fragment aus dor Genom-Region des XPR2· Klons pLD86 wurde mittels Agarose-Gelelektrophorese gereinigt und mit einem synthetischen Fragmont mit der Soquonz

5' GATCGAAGCTTG 3' 3' TTCGAACTTAA 5'

ligiort. Dioso Linkorsoquonz enthält oin kohäsivos Ende für BamHI (aber stollt die BamHI-Schnittstelle nicht wieder her), gefolgt von oinor Hindlll-Stollo und danach oinom „ vorstohondon" EcoRI-Ende. Das Verknüpfungsprodukt wurde mit Hindill verdaut und in dio Hindlll-Schnittstollo von pBR322 insertiort. Das Plasmid pXHP-24 wurdo anhand seiner Restriktionskarte identifiziert und wurde zur Quelle der XPR2-Promotorfragmonto für später folgendo Expressionskonstruktionen. Im Plnsmid pXHP-24 ist das subkloniorte XPR2-Gen annähomd um 280 Basenpaare dor 5'-XPR2-PromotorsGquonz länger als die

Xh"2-Promotorsequenz, die im pLS-3 enthalten ist. Das Fragment der Promotorkomponente wurde zuerst durch eine Standard-Verknüpfungsreaktion unter Beteiligung des synthetischen DNA-Fragrnents (das oben für pLS-3 beschrieben wurde) und des 1150 Basenpaare langen Hindlll-Aval-Fragments von pHP-2 mit Hilfe von T4-Ligase und nachfolgender Spaltung mit Hindill und BamHI gebildet. Die entstandenen ligierten Sequenzen wurden mittels Gelelektrophorese gereinigt, wobei das etwa 1196 Basenpaare lange Hindlll-BamHI-Fragment selektiert wurde. Ein zweites Fragment, das für die Aminosäurereste 6 bis 151 des Prorennins codiert, wurde aus pLS-3 durch Spaltung mit BamHI und Xmal und Gelreinigung des gebildeten 440 Basenpaare langen BamHI-Xmal-DNA-Fragmentes hergestellt. Ein drittes Fragment, das den Rest des Prorennin-Gens, den XPR2-Terminator und Vektorsequenzen enthält, wurde aus pLS-3 durch Spaltung mit Hindlll und Xmal und durch Gelreinigung des annähernd 8,0 kB langen Hindlll-Xmal-Vektorfragmentes hergestellt. Dann wurden die drei Fragmente unter Verwendung des oben beschriebenen Standardverfahrens ligiert. Die Ligations-Reaktionsmischung wurde verwendet, um den Stamm MM 294 von E. coli K12 zu transformieren. Die Plasmide wurden aus den transformierten Stämmen isoliert, auf Basis der Ampicillin-Resistenz selektioniert und das Plasmid pXX-33 wurde mit Hilfe seiner Restriktionskarte identifiziert (Fig. 6). Die Protease-Prorennin-Region dieses Plasmids wurde sequenziert, um die korrekte Verbindung der gewünschten Fragmente zu bestätigen. Y. lipolytica ATCC 20774 wurde anschließend mit durch SnaBI geschnittenem pXX-33 transformiert, was Y. lipolyüca ATCC 20780 ergab, und das von den transformierten Kulturen in die Kulturbrühe sezernierte Prorennin wurde wie oben für den Fall des pLS-3 beschrieben bestimmt. Die Gegenwart von Prorennin im Kulturenüberstand wurde bestätigt. Nach der Säureaktivierung von konzentrierten Kulturüberständen (siehe oben) beobachtete man signifikante Milchgerinnungsaktivität in den Proben, die aus den transformierten Kulturen des Stammes Y. lipolytica ATCC 20780 hergestellt worden waren.

Konstruktion des Expressions-/Sekretionsplasmids pXX-22. Die experimentellen Stufen, die für die Konstruktion des ^lixprei;sions-/SekrGtionsplasmids pXX-22 verwendet wurden, sind in Fig. 7 dargestellt. Der Expressionsveklor unterscheidet sich von pLS-3 in doppelter Hinsicht. Er enthält, wie pXX-33, das zusätzliche, 280 Bp lange Segment der XFR2-Prornotorsequenz. Außerdem enthält er die für das Signalpeptid der alkalischen Protease codierende Sequenz und nur 38 Aminosäurereste des Propeitids(Prol).

Die Konstruktionsmethode für pXX-22 war der, die für pXX-33 verwendet wurde, analog. Das Fragment der Promotorkomponento wurde zuerst durch eine Standard-Verknüpfungsreaktion unter Beteiligung des 890 Basenpaare langen Hindlll-Bglil-Fragmentes aus pXHP-24 und des synthetischen DNA-Fragments mit der Sequenz

5' GATCTTGCTGAGATCACTAG 3¹

3' AACGACTCTAGTGATCCTAG 5'

mit Hilfe von T4-Ligase und nachfolgender Spaltung mit Hindlll und BamHI gebildet. Die entstandenen ligierten Sequenzen wurden mittels Isolierung des 920 Basenpaare langen Hindlll-BamHI-DNA-Fragmentes durch Gelelektrophorese gereinigt. Ein zweites Fragment, das für die Aminosäurereste 6 bis 151 von Prorennin codiert, wurde aus pLS-3 durch Spaltung mit BamHI und Xmal und Gelreinigung des gebildeten 440 Basenpaare langen BamHI-Xmal-DNA-Fragmentes hergestellt. Ein drittes Fragment, das den Rest des Prorennin-Gens, den XPR2-Terminator und Vektorsequenzen enthält, wurde aus pLS-3 durch Spaltung mit Hindlll und Xmal und durch Gelreinigung des annähernd 8,0 kB langen Hindlll-Xmal-Vektorfragmentes gereinigt. Dann wurden die drei Fragmente unter Verwendung des oben beschriebenen Standardverfahrens ligieit. Die Ligations-Reaktionsmischung wurde verwendet, um den Stamm MM 294 von E. coli K12 zu transformieren. Die Plasmide wurden aus den transformierten Stämmen isoliert, und das Plasmid pXX-22 wurde mit Hilfe seiner Restriktionskarte identifiziert (Fig.7).

Y. lipolytica ATCC 20774 wurde anschließend mit durch SnaBI geschnittenes pXX-22 transformiert, was Y. lipolytica ATCC 20779 ergab, und das von den transformierten Kulturen in die Kulturbrühe sezernierte Prorennin wurde wie oben fürden Fall des pLS-3 beschrieben bestimmt. Die Gegenwart von Prorennin im Kulturenüberstand wurde nach dem oben beschriebenen Verfahren bestätigt. Nach der sauren Aktivierung von konzentrierten Kulturüberständen (siehe oben) beobachtete man signifikante Milchgerinnungsaktivität in den Proben, die aus den transformierten Kulturen des Stammes Y. lipolytica ATCC 20779 hergestellt worden waren.

Konstruktion des Expressions-/Sekretionsplasmids pXX-11. Die experimentellen Stufen für die Konstruktion des Expressions-/ Sekretionsplasmids pXX-11 sind in Fig.8 in groben Zügen dargestellt. Dieses Plasmid enthält die Sequenz für den XPR2-Promotor und das 22 Aminosäurereste lange Signalpeptid in Verknüpfung mit der Sequenz, die für Prorennin codiert. Die Konstruktionsmethoda, die für pXX-11 angewandt wurde, war der für pXX-22 und pXX-33 benutzten ähnlich. Kurz gesagt wurde das Fragment der Promotorkomponente durch eine Standard-Verknüpfungsreaktion unter Beteiligung des etwa 750 Basenpaare langen Hindlll-Bglll-DNA-Fragmentes aus pXHP-24 und des synthetischen DNA-Fragments mit der Sequenz

5' TGGCCGCTCCCCTGGCCGCCCCTGCCGCTGAGATCACTAG 3'

3 ' AAGACCGGCGAGGGGACCGGCGGGGACGGCGACTCTAGTGATCCTAG 5 ' >

mit Hilfo von T4-Ligaso und nachfolgender Spaltung mit Hindlll und BamHI gebildet. Die entstandenen ligierten Sequenzen wurdon mittels Gololoktrophorose goroinigt, wobei das otwa 790 Basonpanie lange Hindlll-BamHI-DNA-Fragment selektiert wurclo. Ein zwoitos Fragment, das für dio Aminosäurorosto 6 bis 151 dos Proronnins codiert, wurde aus pLS-3 durch Spaltung mit BamHI und Xmal und Golroinigung des gebildeten 440 Basonpaaro langen BamHI-Xmal-DNA-Fragmentes hergestellt. Ein drittes Fragment, das dun Rost dos Proronnin-Strukturgon«, don XPR2-Terminator und Shuttlo-Vektor-Sequonzen enthält, wurde aus pLS-3 durch Spaltung mit Hindlll und Xmal und durch Golroinigung dos annähornd 8,0 kB langen Vektorfragments goreinigt. Dann wurdon (üo droi DNA-Fragmente untor Vorwendung dos oben beschriebenen Standardverfahrens ligiert. Die Ligations-Roaktionsmischung wurdo vorwondot, um den Stamm MM 294 von E. coli K12 zu transformieren. Die Plasmide wurden aus den soloktiorton Transformanton isoliort ur' das Plasmid pXX-11 wurdo mit Hilfo soiner Restriktionskarte identifiziert (Fig.8). Der ΧΡΗΣ-ΡΓΟΓοηηιη-ΤθίΙ dieses Plasmids wurdo sequenziert, um dio richtige Sequenz der synthetischen DNA und die korrekte Vorbindung der gowünschten Fragmente zu bestätigen

Y. lipolytica ATCC 20774 wurdo anschließend mit durch SnaBI geschnittenem pXX-11 transformiert, was Y. lipolytica

ATCC 20778 ergab, und das von den transformierten Kulturen in die Kulturbrühe sezernierte Prorennin wurde wie oben für den Fall des pLS-3 beschrieben bestimmt. Die Gegenwart von Prorennin im Kulturenüberstand wurde dem oben beschriebenen Verfahren entsprechend bestätigt.

Bestimmungen der Milchgerinnung (siehe oben) zeigten die Gegenwart von signifikanter Milchgerinnungsaktivität in den Kulturüberständen der pXX-11-haltigen Transformanten ATCC 20778.

Beispiel 2

Konstruktion der Eingangsregion (Docking Platform)

Das Wildtyp-BIO-Gen, das dem bio-6-Allel in ATCC 20774 entspricht, wurde mittels Komplementierung wie folgt kloniert. Eine Genbank einer partiell mit Sau 3 A verdauten, chromosomalen Y. lipolytica-DNA, eingefügt in die BamHI-Schnittstelle von pLD40 (welches pBR322 plus LEU2 an der EcoRI-Stelle ist) wurde konstruiert und eine große Menge der Genbank-DNA wurde ^Is Plasmidpräparation von verschiedenen E. coli-Kulturen hergestellt. (Diese ist mit der Genbank identisch, die für die Klonifung des XPR2-Gens verwendet wurde.) Einige Mikrogramm der Genbank-DNA wurden mit dem Enzym Apal (das einmal in der LEU2-Region schneidet) verdaut. Dann wurde diese DNA benutzt, um ATCC 20774 (Ieu2 xpr2 bio) zu transformieren, wöbe! die Transformationsmischung auf synthetischem Medium, das kein Leucin enthielt, ausplattiert wurde. Man erhielt Zehntausende von leucinunabhängigen, transformierten Spezies. Um herauszufinden, welche Kolonien, wenn überhaupt, Genbankplasmide enthielten, die das das BIO-Gen umfaßten, wurden die leucinunabhängigen transformierten Spezies auf Agar-Platten abklatschplattiert, die Biotin-Selektionsmedium enthielten (Rp. pro Liter: 25mg Desthiobiotin, 20g Glucose, 5g Ammoniumsulfat, Ig KH₂PO₄,0,5g MgSO₄ χ 7H₂0.0,1g CaCI₂,0,1 g NaCI, 500μg Borsäure, 400pgThiamin χ HCI,400pg ZnSO₄ x 7H₂0,400Mg MnSO₄,/.00pg Na₂MoO₄ x 2H₂O, 200pg FeCI₃ χ 6H₂0,100pg Kl und 40pg CuSO₄ x 5H₂O). Eine von mehreren BIO⁺-transformierten Y. lipolytica-Spezies, die auf dem Biotin-Selektionsmedium wuchsen, wurde mit DL31 bezeichnet. Es gelang uns im folgenden, das Genbankplasmid, das das BIO-Gen enthielt, aus dem Y. lipolytica-Stamm DL31 zu gewinnen. Chromosom<ile DNA wurde aus einer Kultur des Stammes DL31 hergestellt. Einige Mikrogramm dieser chromosomalen DNA wurden mit dem Restriktionsenzym Apal vt.'daut, um das Genbankplasmid herauszuschneiden. Eine Probe der verdauten DNA wurde in einer Ligationsreaktion eingesetzt, um das unbekannte Genbankplasmid zu zirkularisieren. Die Ligationsmischung wurde daraufhin benutzt, um eine Kultur von E. coli auf Ampicillinresistenz zu transformieren, um das unbekannte, BlO-haltige Plasmid in E. coli zu gewinnen. Man erhielt ein paar transformierte, smpicillinresistente E. coli-Spezies. Plasmidpräparationen wurden in kleinem Maßstab an den transformierten E. coli-Spezies ausgeführt. Die so erhaltenen Rastriktionsbruchstücke der Plasmid-DNA zeigten, daß das unbekannte, BlO-haltige Plasmid, wie erwartet, dem pLD40 mit einem in die BamHI-Schnittstelle inserierten Bruchstück äquivalent war. Dieses Plasmid muß ursprünglich aus unserer Genbank stammen und wurde mit pLD51 bezeichnet.

Das Plasmid pLD56 wurde als Subklon von pLD51 durch die Abtrennung des LEU2-Gens aus pLD51 wie folgt gebildet. Eine Probe des Plasmids pLD51 wurde mit dem Enzym EcoRI verdaut, um die LEU2-Region zu entfernen. Die verdaute DNA wurde in einer DNA-Ligationsreaktion benutzt, um das Plasmid zu rezirkularisieren. Anschließend wurde eine Transformation von E. coli durchgeführt, um das kleinere, BlO-haltige Plasmid zu klonieren. Es ließ sich zeigen, daß einer der ampicillinresistenten, transformierten E. coli-Stämme das erwartete kleinere Plasmid enthielt, das mit pLD56 bezeichnet wurde. Einige Fesiriktionsbruchstüekevon pLD56 wurden hergestellt. Das BlO-haltige Segment von pLD5fi, das als Insertion an der BamHI-Stelle von pBR322 erscheint, war annähernd 3,6 kB lang.

E ine sehr ungenaue Restriktionskarte der 3,6 kB langen, in die BamHI-Stelle von pBR322 irsertierten Y. lipolytica-DNA (die pLD56 enthält) ist unten mit den ungefähren Abständen der Basenpaare vom Anfangspunkt der Insertion an gerechnet in Klammern beschrieben. Die G^roßenabschätzur.gen wurden von nur wenigen Agarosegf len her vorgenommen und unierliegen relativ großen quantitativen Fehlern: Pvull (800), Pvull (1 200), Pstl (1 800), MIuI (2000), PMl (2300), EcoRV (270C), Ncol (3200). (Für die Orientierung: die Sall-Stelle von pBR 322 sollte vor den beschriebenen Schnittstellen liegen und die Hindlll-Stelle sollte ihnen folgen.)

Der Stamm ATCC 20774 (MAT3 leu2-4 bio-6 xpr2-1002) wurde mit intakter pLD56 (pBR322 plus annähernd 3,6kB aus der ohromosomalen DNA von Y. lipolytica, die das BIO-Gen enthalten) transformiert. Drei verschiedene biotinunabhängige transformierte Spezies wurden auf im Vergleich zum Ausgangsstamm hochfrequente Transformation von durch Nrul geschnittenes (auf pBR322 gerichtet) pLD40 (LEU2 auf pBR322) getestet, um festzustellen, welche ein in die BIO-Region eingebautes ortsfestes pBR322 enthielt. Alle drei zeigten wegen der Integration des pLD40 in das ortsfeste pBR322 eine hochfrequente Transformation. Dies wurde dutch Hybridisierungsoxperimente nach dem Southern-Blot-Verfahren bestätigt. Eine der drei ursprünglichen ΒΙΟ-transformierten Y. lipolytica-Spezies wurde DL118 genannt und weiter als DNA-Empfänger benutzt. Die cbige Restriktionskarte wurde benötigt, um zu bestimmen, i) was als BIO-spezifische Hybridisierungssonde verwendet werden soilte (ein Ncol-Pvull-Stück), ii) welches Enzym benotigt würde, um das pLD56-Plasmid korrekt herauszuschneiden (MIuI), iii) welches Enzym nur einmal im pBR3!!2-Teil schneiden würde (CIaI) und iv) welches Enzym im gesamten Plasmid nicht schneiden würde (Apal). Southern-Hybridisierungen von durch CIaI und Apal verdauten Bruchstücken von DNA aus ATCC 20774 und DL118 (mit einem BIO-Fragment als Sonde) zeigten, daß wie erwartot die Biotin-Region von DL118 (im Vergloich zu der BIO-Region von ATCC 20774) durch einen zusätzlichen Einbau von DNA mit der ungefähren Länge von pLD56 unterbrochen war. Mlul-Vordauungen an DL118-DNA (getestet mit pBR322) zeigten außerdem, daß dieser Zusatz die gioicho Größo wio intaktes pLD56 besaß.

Konstruktion des Express!ons-/Sekretionsplasmids pLX-34. Ein Exprossionsplasmid wurde konstruiert, welches die für Proronnin codiorondo Suquonz mit den XPR2-Sokretionssignalen (157 Aminosäuren Präpro-Sequenz) strangabwärts vom LEU2-Promotor aus gesohon plaziert. Diosos Exprossionsplasmid zoigt auf, daß auch ein anderer Prornotor als der XPR2-Prc.-notor benutzt wordon kann, um die Sourtition von hetorologorn Protein zu bewirken. Weiterhin ist dieser Expressionsvektor in der Lago, unabhängig von dor Einbiiustello im Y. lipolytica-Genom Expression/Sekretion zu bowirken. Die gelungene Sokrotion von Proronnin mit oinom andoron Promotor als dom XPR-Promotor zeigt die Durchführbarkeit einer Expressions-Voktor-Konstruktion zur Identifizierung alternativer nouor, starker Promotoren in Y. lipolytica. Zusätzlich kann dieser Ansatz benutzt werdtin, um eine Exprossionskultur mit zwoi getrennten Promnnin-Hybridgenen zu gewinnen, wobei eines Jörn LEU2-Promotor und das andoro vom XPR2-Promotor oxprimiert wird, dio an verschiedenen Stellen im Genom dos Wirtes eingebaut sind.

Die experimentell 3n Stufen, die für die Konstruktion eines Expressionsvektors angewendet werden, welcher das Prorennin-Gen mit Sekretionssigrialen für die alkalische Protease (157 Aminosäuren lange XPR2-Präpro-Sequenz), exprimiert durch LEU 2-Promotor-Sequenzen, enthält, sind in Fig. 13 dargestellt. Die Konstruktion dieses Plasmids wurde mit der Herstellung eines LEU2-Promotor-Fragmer!tes begonnen, welches etwa 300 Basenpaara der 5'-untranslatierten Sequenz enthält, die dem ATG-Codon, das die Translation des beta-lsopropylmalat-Dehydrogenase-Gens (Fig. 12) initiiert, vorangehen. Das 300 Bp lange Hindlll-Fokl-DNA-Fragment, das für einen 270 Bp langen Teil der LEU2-Promotorsequenz codiert, wurde aus dem Shuttle-Vektor pLD40 isoliert. Dieses Fragment wurde mit einem 54 Bp langen Linker mit der Sequenz

_Leu2

Fokl

5'- ATACAACCACACACATCCACAATG' 3'- TTGGTGTGTGTAGGTGTTAC

Χρ_Γ2

BgII

AAGCTCGCTACCGCCTTTACTATTCTCACTGCCGTTC-B ' TTCGAGCGATGGCGGAAATGATAAGAGTGACGGC -5'

mit T4-Ligase verknüpft und anschließend mit Hindill verdaut. Die entstandenen ligierten Sequenzen wurden durch Isolierung des etwa 360 Basenpaare langen Hindlll-Bgll-DNA-Fragmentes mittels Gelelektrophorese gereinigt. Ein zweites, a<s Bestandteil nötiges Fragment, das für den Rest der XPR2-Präpro-Sequenz und die ersten 152 Aminosäuren des Prorennins codiert, wurde durch Spaltung mit BgII und Xmal aus dem Expressionsplasmid pXX-33 (Fig. 6) und Gelreinigung des gebildeten 8b/ Basenpaare langen DNA-Fragmentes isoliert. Ein drittes Fragment, das den Rest des Prorennin-Gens, den XPR2-Terminator und Vektorsequenzen enthält, wurde durch Spaltung von pXX-33 mit Hindlll und Xmal und Gelreinigung (durch Spaltung) des etwa 8,0 kB langen Vektorfragmentes hergestellt. Die drei DNA-Fragmente wurden unter Verwendung der oben beschriebenen Standardverfahren miteinander ligiert. Die Ligations-Reaktionsmischung wurde verwendet, um den Stamm HB101 von E. coli K12 zu transformieren. Plasmide wurden aus den transformierten Spezies auf der Basis der Ampicillinresistenz isoliert und das Plasmid pLX34 wurde durch seine Restriktionskarte identifiziert (Fig. 13).

Y. lipolytica ATCC 20794 (DL 118) wurde mit durch Nrul gespaltene pLX-34-DNA behandelt, wobei man Y. lipolytica ATCC 20795 (DL251) erhielt, und das von der leucinunabhängigan, transformierten Kultur in die Kulturflüssigkeit sezernierte Prorennin wurde wie oben für das pLS-3 beschrieben bestimmt. Diese Transfcrmationstechnik lenkte den Einbau von pLX-34 in eine pBR322-Sequenz, die vorher in den bio-Locus im Wirtschromosom (oben beschrieben) eingebracht worden war. Der Einbau von pLX-34 an dieser Stelle wurde durch Southern-Analyse bestätigt.

Die Verwendung von DL118 eis Empfänger. Southern-Hybridisierungsf.xperimente wurden wie folgt ausgeführt: Nrul-Verdauung von DNA aus transformierten DL118-Spezies (hybridisiert mit z.B. einem Prochymosin-Teststück, wenn das eingefügte Plasmid ein Prochymosin-Expressionsplasmid war) schnitt genau das eingefügte Plasmid heraus. Ein paar Nanogramm des durch Nrul verdauten transformierenden Plasmids diente zur Überprüfung der korrekten Größe der Hybridisierungsbande. Auch die Verdauung von DNA dieser transformierten Spezies (getestet mit 32 p-markiertem pBR 322) durch MIuI (MIuI schnitt das transformierende Plasmid nicht) zeigte, daß die ortsansässige pBR322-Sequenz von DL118 durch Zugabe von einem oder mehreren Molekülen des transformierenden Plasmids unterbrochen wurde. Dies zeigte, daß der Einbau an der gewünschten Stelle stattfand.

Die transformierte Kultur Y. lipolytica ATCC 20795 (DL251) wurde in YEPD-Medium bei 22°C gezüchtet, um die Expression durch den LEU2-Promotor zu begünstigen. Das Vorliegen von Prorennin in den Kulturüberständen wurde mit Hilfe des Milchgerinnungstests (siehe oben) an sauer aktivierten Kulturüberständen gesichert und durch Immuno-Blot-Analyse (siehe oben) bestätigt. Diese Ergebnisse zeigen, daß dieses Hybrid-Gen eine unabhängige Expressionseinheit ist, die zur Expression/ Sekretion befähigt ist, wenn sie an einem anderen Ort als XPR2 oder LEU2 eingebaut wird. Diese Eigenschaft erlaubt die Konstruktion einer Expressionskultur mit mehrfachen Hybrid-Genen, die möglicherweise in der Lage sind, gesteigerte Mengen an extrazellulärem Prorennin zu erzielen.

Beispiel 3

Sequenz eines synthetischen Gens für menschliches C5a. Der Plan, der zum Erreichen der bakteriellen Produktion von menschlichem Anaphylatoxin C5a entwickelt wurde, war voraussgehenden Verfahren analog, die für die Synthese und Expression von EGF verwendot wurden, wie in der europäischen Patentanmeldung Nr.0147178 beschrieben. Er sieht die Konstruktion eines Gens vor, in dem die codierende Sequenz für die aktivierte Komplementkomponente C5a synthetisch hergestellt wurdo. Da die bekannte Aminosäuresequenz von menschlichem C5a festgelegt ist, entwarfen wir ein DNA-Fragment, das für die Information ihrer 74 Aminosäuren codiert (Fig.9). Die synthetische Gensequenz war so ausgewählt, daß sie die von E. coli und S. cerevisiae bovorzugto Codon-Bonutzung maximiert und Stellon für mehrere Restriktionsendonukleasen anbietet, um dio Charakterisierung zu orloichtorn. Diosor Ansatz erlaubto die direkte Expression von Anaphylatoxin in E. coli, indem man ein ATG-Initiationscodon für dio Protoinsynthoso vor das für die erste Aminosäure des C 5 a Polypeptids codiende Triplett einführte. Um soino Insortion in der gewünschton Anordnung in das Plasmid pBR322 zu erleichtern, wurde das synthetische C5n-Gen so konstruiort, daß os an seinen Endon Erkennungsstellen für dio Restriktionsondonukloasen EcoRI und Hindlll enthielt. Um die zu bildondo C5£>-Gonsoquenz herzustollon, wurden zohn 47-moro vermittels dos Phosphoramidit-Verfahrens synthetisiert und zu oinom 235 Basonpaaro langen, doppolsträngigon DNA-Fragment zusammengefügt. Das C5a-Genfragmont wurde in an der gooignoton Stello gespaltenos pBR322 insortiort und das klonierte Gon wurde mittels Analyse durch Restriktionsspaltung von Plasmid-DNA aus willkürlich ausgewählton transformierten Spozies identifiziert. Mohrero C5a-Klone wurden dann durch Sequonzioron dor DNA analysiert, um oinon Klon mit der richtigen Sequenz zu identifizieren. Die gewünschte Nukleotidsequenz für die C5a-Gon-Rogion wurdo in 2 dor 5 untorsuchton Klono gofunden.

Bakterielle Expression von menschlichem C5a. Die Konstruktion des Cöa-Expressions-Plasmids wurde durch Spaltung des C5a-Subklons mit der Res' iktionsendonuklease EcoRI begonnen, gefolgt von Dephosphorylierung durch Behandeln mit bakterieller alkalischer Phosphatase. Durch Verwenden eines 360Bp langen EcoRI-DNA-Fragments aus pPFZ-R2, das den trp-Promotor-Operator und Ribosomenbindungsstellen-Sequenzen enthält, wurde ein C5a-Expressionsplasmid konstruiert. Kompetente E. coli-Zellen vom Stamm HB101 wurden mit der Ligations-Reaktionsmischung transformiert. Einige antibiotikaresistente Kolonien aus jeder Transformation wurden gereinigt und ihre Plasmid-DNA's wurden der Analyse durch Restriktionsendonukleasen-Kartierung unterworfen, um diejenigen zu identifizieren, in denen der trp-Promotor so angeordnet ist, daß Transkription des C5a-Gens resultiert. Mehrere isolierte Spezies aus dieser Verknüpfungsreaktion wurden als Plasmide identifiziert, die das Anaphylatoxin-Gen in Nachbarschaft zur bakteriellen Promotorsequenz in der Anordnung enthielten, die für die direkte Expression von C5a benötigt wird. Eine Restriktionskarte des C5a-Expressionsplasmids pC5a-4f ist in Fig. 10 dargestellt.

Expression und Sekretion von menschlichem Anaphylatoxin in Y. lipolytica

Der Expressions-/Sekretionsvektor pC5aX-3, der für die Sektretion von menschlichem Anaphylatoxin C5a codiert, wurde nach Techniken hergestellt, wie sie in Beispiel 1 für pXX-33 beschrieben wurden. Y. lipolytica ATCC20774 wurde anschließend durch diesen Sekretionsvektor transformiert und das durch die transformierten Kulturen produzierte menschliche C5 a wurde wie oben beschrieben bestimmt, mit der Ausnahme, daß Anti-C5a der Ziege und Anti-Ziegen-lgG des Kaninchens im Immuno-Blot-Verfahren verwendet wurden. Für das in diesem Beispiel verwendete Plasmid wurde die Anwesenheit von C5a im Kulturüberstand bestätigt.

Konstruktion des Expressions-/Sekretions-Plasmids pC5aX-3.

Die experimentellen Stufen für die Konstruktion des Anaphylatoxin-Expressions-/Sekretions-Plasmids pC5aX-3 sind in Fig. 11 dargestellt. Dieses Plasmid enthält die Sequenz für den „vollständigen" XPR2-Promotor und für das 157 Aminosäurereste lange Signal- und Propeptid, die an eine synthetische, für die 74 Aminosäurereste von C5a codierende Sequenz geknüpft sind. Der Konstruktionsplan, der für das pC5aX-3 angewendet wurde, war dem für pXX-33 angewandten ähnlich. Zuerst wurde das Plasmid pXHP-24 (oder ein anderes Plasmid, das die gewünschte Sequenz enthält) mit Hind III und Ava I gespalten und das 1150 Basenpaare lange Fragment, das den XPP.2-Promotor enthält, wurde mittels Gel gereinigt. Ein zweites Fragment, das das 3^r-Ende der XPR2-Propeptid- und der Cöa-Strukturgen-Sequenz enthält, wurde mit Hilfe einer Standard-ligationsreaktion gebildet, wobei das annähernd 220 Basepaare lange Hinfl-Hindlll-DNA-Fragment aus dem E. coli-Expressionsplasmid pC5a-48 und das synthetische Fragment

5' CCGAGATTCCTGCTTCTTCTAATGCCAAGCGA 3' 3 ' CTAAGGACGAAGAAGATTACGGTTCGCTTGA 5'

mit T4-Ligase eingesetzt wurden, gefolgt von Spaltung mit Aval und Hindill. Die entstandenen ligierten Sequenzen wurden durch Gelelektrophorese gereinigt, wobei man das etwa 250 Basenpaare lange Aval-Hindlll-Fragment selektierte. Das den Promotor enthaltende Hindlll-Aval-Fragment und das für C5a codierende Aval-Hindlll-Fragment wurden darauf mit T4-Ligase ligiert und anschließend mit Hindlll verdaut. Das etwa 1,4kB lange Fragment wurde mit Hilfe von Gel gereinigt und für eine Verknüpfung mit durch Hindlll gespaltenem pterm 4 (oben beschrieben) verwendet. Die Ligations-Reaktionsmischung wurde verwendet, um den Stamm MM 294 von E. coli K12 zu transformieren. Auf Ampicillinresistenz selektierte Plasmide wurden aus den selektierten transformierten Spezies isoliert und das Plasmid pC5aX-3 wurde anhand seiner Restriktionskarte identifiziert. Y. lipolytica, Stamm PC-30869, ATCC20774, wurde dann mit durch SnABI gespaltenem pC5aX-3 transformiert und das von den transformierten Kulturen in das Kulturmedium sezernierte Anaphylatoxin wurde wie oben beschrieben bestimmt. Die Anwesenheit von C5a im Kulturüberstand wurde durch das oben beschriebene Verfahren bestätigt.

Es ist bekannt, daß viele Proteine, die durch an das endoplasmatische Reticulum gebundene Ribosomen synthetisiert werden, als Glycoproteine produziert werden. In der Tat kann die Glycosylierung die Sekretion eines gegebenen Proteins beeinflussen. N-verknüpfte Glycosylierung von eukaryotischen Proteinen tritt an den Tripeptid-Sequenzen Asparagin-X-Threonin und Asparagin-X-Serin auf, wobei X eine beliebige Aminosäure außer möglicherweise Aspartat (Hubbard, S. et. al [19811, Ann. Rev. Biochem. 50,555) sein kann. Die Aminosäuresequenz von Prorennin enthält zwei solche Tripeptid-Sequenzen, eine Analyse von in Y. lipolytica sezerniertem Prorennin mittels Gelelektrophorese ergab jedoch keinen Hinweis auf die Glycosylierung. In anderen sezernierten eukaryotischen Proteinen sind nicht alle Asparagin-X-Threonin-/-Serin-Stellen glycosyliert. Es ist wahrscheinlich, daß bestimmte Asparagine innerhalb von Tripepted-Sequenzen nicht glycosyliert werden, da sie für die Glycosylierungsenzyme unerreichbar sind.

Im Fall von menschlichem C5a enthält die Aminosäuresequenz eine einzige Glycosylierungsstelle oder Tripeptid-Sequenz (Asn-Ile-Ser), die normalerweise ein komplexes Oligosaccharid besitzt, das an Asparagin gebunden ist (Fernandez, H., et al. [1976], J. Immol. 117,1688). Ein Teil der in das Kulturmedium von Y. lipolytica sezernierten C 5 a-Moleküle scheint glycosyliert zu soin, da ein broiter Bereich antigener Aktivität im Bereich der hohen Molekulargewichte des Immunoblots zu sehen war. Diese heterogene eloktrophorotische Mobilität ist der analog, die man an anderen sezernierten Proteinen beobachtet hat, und sie ist wahrscheinlich oine Folgo dos schwankenden Grades an Kohlehydrataddition. Für die vorliegende Erfindung läßt die scheinbare Glycosyliorung bestimmter sozorniertor hoterologor Proteine vermuten, daß die Expression und Sekretion in Y. lipolytica für die Horstollung von violon, normal glycosylierten oukaryotischon Proteinen nützlich sein wird.

Claims (13)

1. Verfahren zur Herstellung und Sekretion eines heterologen Proteins durch eine Kultur von Y. lipolytica, dadurch gekennzeichnet, daß es (i) das Einführen eines Expressionsvektors in

Y. lipolytica, welcher eine DNA-Sequenz, die für ein dieser Y. lipolytica heterologes Protein codiert, ein Y. lipolytica-Gen oder eine Y. lipolytica-Promotor-, eine Signal- und eine Transkriptions-Terminator-DNA-Sequenz eines Y. lipolytica-Gens enthält, (ii) das Kultivieren der so hergestellten, transformierten Y. lipolytica von (i) in einem geeigneten Nährmedium und (iii) das Gewinnen des heterologen Proteins umfaßt.

2. Verfahren zur Herstellung eines heterologen Proteins durch eine Kultur von Y. lipolytica, nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß es (i) das Einführen in Y. lipolytica eines Expressionsvektors, der eine DNA, die für ein zu Y. lipolytica heterologes Protein codiert und mindestens einen der folgenden Bestandteile enthält: das LEU2-Gen, dessen Promotor- oder Terminator-Sequenz, das XPR2-Gen, die Promotor-, die Signal-, die Prol-, die Pro2- oder die Terminator-DNA-Sequenz des XPR2-Gens, (ii) das Kultivieren der so hergestellten, transformierten Y. lipolytica von (i) in einem geeigneten Nährmedium und (iii) das Gewinnen des heterologen Proteins umfaßt.

3. Verfahren nach Punkt 2, dadurch gekennzeichnet, daß das genannte Gen das XPR2-Gen oder das LEU2-Genist.

4. Verfahren nach Punkt 3, dadurch gekennzeichnet, daß die DNA-Sequenz des heterologen Prr teins die Sequenz für Prorennin oder menschliches Anaphylatoxin C5a ist.

5. Verfahren zur Herstellung eines heterologen Proteins nach einem der vorhergehenden Punkte, dadurch gekennzeichnet, daß es das Kultivieren einer transformierten Y. lipolytica, die die Identifizierungs-Charakteristika von ATCC20780 besitzt, in einem geeigneten Nährmedium umfaßt.

6. Verfahren zur Herstellung eines heterologen Proteins nach einem der Punkte 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß es das Kultivieren einer transformierten Y. lipolytica, die die Identifizierungs-Charakteristika von ATCC20779 besitzt, in einem geeigneten Nährrnedium umfaßt.

7. Verfahren zur Herstellung eines heterologen Proteins nach einem der Punkte 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß es das Kultivieren einer transformierten Y. lipolytica, die die Identifizierungs-Charakteristika von ATCC 20778 besitzt, in einem geeigneten Nährmedium umfaßt.

8. Verfahren zur Herstellung eines heterologen Proteins nach einem der Punkte 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß es das Kultivieren einertransformierten Y. lipolytica, die die Identifizierungs-Charakteristika von ATCC20777 besitzt, in einem geeigneten Nährmedium umfaßt.

9. Verfahren nach Punkt 3, dadurch gekennzeichnet, daß das Gen für das heterologe Protein zwischen die Promotor- und die Terminatorsequenzen des XPR2-Gens eingefügt wird.

10. Verfahren nach Punkt 7, gekennzeichnet dadurch, daß das Gen für das heterologe Protein das Prorennin-Gen oder das Gen für menschliches Anaphylatoxin C5a ist.

11. Verfahren zur Herstellung eines hoterologen Proteins nach einem der Punkte 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß es das Kultivieren einer transformierten Y. lipolytica, die die Identif izierungs-Charak'eristika von ATCC20795 besitzt, in einem geeigneten Nährmedium umfaßt.

12. Verfahren zum Herstellen eines heterologen Proteins nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß es das Kultivieren einer transformierten Y. lipoiytica umfaßt, die eine zu der heterologen Vektor-DNA homologe Region besitzt, wobei diese Region exogene DNA enthält, die während der integrativen Transformation dieser Y. lipolytica als Empfängerstelle fungiert.

13. Verfahren nach Punkt 12 zum Herstellen eines heterologen Proteins, dadurch gekennzeichnet, daß sich die Homologie-Reqion von pBR322 oder einem von dessen Derivaten ableitet.

Hierzu I^Seiten Zeichnungen