JPH082304B2 - プラスミドとその製造方法 - Google Patents
プラスミドとその製造方法Info
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- JPH082304B2 JPH082304B2 JP62317320A JP31732087A JPH082304B2 JP H082304 B2 JPH082304 B2 JP H082304B2 JP 62317320 A JP62317320 A JP 62317320A JP 31732087 A JP31732087 A JP 31732087A JP H082304 B2 JPH082304 B2 JP H082304B2
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- lipolytica
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
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- C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
- C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
- C12N15/815—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts for yeasts other than Saccharomyces
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- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、サッカロミコプシス・リポリティカの自己
複製配列を含むプラスミドとその製造方法に関するもの
である。
複製配列を含むプラスミドとその製造方法に関するもの
である。
本発明では、サッカロミコプシス・リポリティカの菌
体内で複製されるプラスミドをはじめて製作することが
できたものである。
体内で複製されるプラスミドをはじめて製作することが
できたものである。
本発明のサッカロミコプシス・リポリティカの自己複
製配列を含むプラスミドは、その応用が発酵業界に大い
に期待されるところである。
製配列を含むプラスミドは、その応用が発酵業界に大い
に期待されるところである。
（従来技術） 一般的に、酵母はプラスミドを含むものが少く、サッ
カロミコプシス・リポリティカもプラスミドは全く含ま
ないものとして知られている。
カロミコプシス・リポリティカもプラスミドは全く含ま
ないものとして知られている。
また、ほとんどの酵母は、菌体内で生産した酵素やペ
プタイド等を分泌しないが、例外的にサッカロミコプシ
ス・リポリティカは酵素やペプタイド等を分泌する能力
を有しているのである。
プタイド等を分泌しないが、例外的にサッカロミコプシ
ス・リポリティカは酵素やペプタイド等を分泌する能力
を有しているのである。
（発明が解決しようとする問題点） しかしながら、サッカロミコプシス・リポリティカの
菌体内で複製できるプラスミドは知られておらず、酵
素、ペプタイド等の生産を試みることはできなかった。
菌体内で複製できるプラスミドは知られておらず、酵
素、ペプタイド等の生産を試みることはできなかった。
（問題点を解決するための手段） 本発明者らは、サッカロミコプシス・リポリティカの
菌体内で複製できるプラスミドを求めて鋭意研究した結
果、サッカロミコプシス・リポリティカの染色体上の自
己複製配列を組込み、菌体内で複製するプラスミドを得
るのに成功したのである。
菌体内で複製できるプラスミドを求めて鋭意研究した結
果、サッカロミコプシス・リポリティカの染色体上の自
己複製配列を組込み、菌体内で複製するプラスミドを得
るのに成功したのである。
本発明は、サッカロミコプシス・リポリティカの自己
複製配列を含むプラスミドに関するものである。
複製配列を含むプラスミドに関するものである。
更に詳細には、本発明はサッカロミコプシス・リポリ
ティカのLew 2遺伝子及び自己複製配列とアンピシリン
耐性遺伝子を含むプラスミドに関するものである。
ティカのLew 2遺伝子及び自己複製配列とアンピシリン
耐性遺伝子を含むプラスミドに関するものである。
本発明のプラスミドはサッカロミコプシス・リポリテ
ィカ（Saccharomycopsis lipolytica）からのLen 2遺伝
子（β−イソプロピルマレートデヒドロゲナーゼ遺伝
子）及び自己複製配列（Autonomously Replicating Seq
uence）（以下、ARSという）を含み、かつ、大腸菌とサ
ッカロミセス、セレビシェのシャトルベクターpVC 1か
ら出発して作製されたので大腸菌とサッカロミコプシス
・リポリティカ間のシャトルベクターともなり得るもの
である。
ィカ（Saccharomycopsis lipolytica）からのLen 2遺伝
子（β−イソプロピルマレートデヒドロゲナーゼ遺伝
子）及び自己複製配列（Autonomously Replicating Seq
uence）（以下、ARSという）を含み、かつ、大腸菌とサ
ッカロミセス、セレビシェのシャトルベクターpVC 1か
ら出発して作製されたので大腸菌とサッカロミコプシス
・リポリティカ間のシャトルベクターともなり得るもの
である。
本発明のプラスミド、即ちシャトルベクターに外来有
用遺伝子を挿入し、大腸菌を形質転換させて大量のプラ
スミドを得、これを用いてサッカロミコプシス・リポリ
ティカを宿主菌として有用物質を生産することが可能と
なる。
用遺伝子を挿入し、大腸菌を形質転換させて大量のプラ
スミドを得、これを用いてサッカロミコプシス・リポリ
ティカを宿主菌として有用物質を生産することが可能と
なる。
本発明の新規なプラスミドは、例えば以下の通りに作
製される。
製される。
サッカロマイセス・セレビジェのベクターpVC 1を制
限酵素Bam HIにて切断する。その切断部位にサッカロミ
コプシス・リポリティカの全DNAを制限酵素Sau 3AIで部
分切断した断片を挿入し、大腸菌を形質転換させ、アン
ピシリン（Ap）耐性、β−ガラクトシダーゼ非産生とな
ったものを選択し、これにより各々プラスミドDNAを分
離し、ジーンライブラリーとする。
限酵素Bam HIにて切断する。その切断部位にサッカロミ
コプシス・リポリティカの全DNAを制限酵素Sau 3AIで部
分切断した断片を挿入し、大腸菌を形質転換させ、アン
ピシリン（Ap）耐性、β−ガラクトシダーゼ非産生とな
ったものを選択し、これにより各々プラスミドDNAを分
離し、ジーンライブラリーとする。
次に該ジーンライブラリーでロイシン要求性のサッカ
ロマイセス、セレビシェDKD−50株を宿主としてヒンネ
ン等のプロトプラスト法（Hinnen,A.,Hicks,J.B.,Fink,
G.R.,Proc.Natl.Acad.Sci.75.,1929（1978）を用いて形
質転換させ、ロイシンを含まない最少培地（下記の組
成）上で増殖させた。
ロマイセス、セレビシェDKD−50株を宿主としてヒンネ
ン等のプロトプラスト法（Hinnen,A.,Hicks,J.B.,Fink,
G.R.,Proc.Natl.Acad.Sci.75.,1929（1978）を用いて形
質転換させ、ロイシンを含まない最少培地（下記の組
成）上で増殖させた。
酵母用アミノ酸不含窒素源 （Yeast Nitrogen Base w/o Amino acid） （ディフコ（Difco）社製） 0.67％ グルコース 2 ％ ソルビトール 1.2M トリプトファン 0.01％ ヒスチジン 0.0035％ 寒天 2.0％ 得られた形質転換体よりプラスミドDNAを分離し、大
腸菌を形質転換させて、Ap耐性となったコロニーを選択
し、これより新規なプラスミドpVCL 2を分離する。
腸菌を形質転換させて、Ap耐性となったコロニーを選択
し、これより新規なプラスミドpVCL 2を分離する。
このプラスミドpVCL 2から、さらにこれより小さく
て、なおかつpVCL 2と同様の性質、機能を有するプラス
ミド（pUCL−1,pUCL−2,pSL−12,pSL−13）を作製す
る。
て、なおかつpVCL 2と同様の性質、機能を有するプラス
ミド（pUCL−1,pUCL−2,pSL−12,pSL−13）を作製す
る。
次に、pSL−13を制限酵素Bam HIで切断する。その切
断部位にサッカロミコプシス・リポリティカの全DNAを
制限酵素Sau 3AIで部分切断した断片を挿入し、大腸菌
を形質転換させ、Ap耐性、β−ガラクトシダーゼ非産生
となったものを選択し、これより各々プラスミドDNAを
分離し、ジーンライブラリーとする。
断部位にサッカロミコプシス・リポリティカの全DNAを
制限酵素Sau 3AIで部分切断した断片を挿入し、大腸菌
を形質転換させ、Ap耐性、β−ガラクトシダーゼ非産生
となったものを選択し、これより各々プラスミドDNAを
分離し、ジーンライブラリーとする。
該ジーンライブラリーでロイシン要求性のサッカロミ
コプシス・リポリティカMX 9−11 leuF株を宿主として
ダビドウ等の方法（Davidow,L.S.,Apostolakos,D.,O′D
onnell,M.M.,Proctor,A.R.,Ogrydziak,D.M.,Wing,R.A.,
Stasko,I.,and DeZeeuw,J.R.,Curr.Genet.,10,39（198
5））を用いて形質転換させ、ロイシンを含まない最少
培地（下記の組成）上で増殖させる。
コプシス・リポリティカMX 9−11 leuF株を宿主として
ダビドウ等の方法（Davidow,L.S.,Apostolakos,D.,O′D
onnell,M.M.,Proctor,A.R.,Ogrydziak,D.M.,Wing,R.A.,
Stasko,I.,and DeZeeuw,J.R.,Curr.Genet.,10,39（198
5））を用いて形質転換させ、ロイシンを含まない最少
培地（下記の組成）上で増殖させる。
酵母用アミノ酸不含窒素源 0.67％ グルコース 2 ％ 寒天 2 ％ 得られた形質転換体よりプラスミドDNAを分離し、大
腸菌を形質転換させて、Ap耐性となったコロニーを選択
し、これより新規なプラスミドpSL13−２を分離する。
腸菌を形質転換させて、Ap耐性となったコロニーを選択
し、これより新規なプラスミドpSL13−２を分離する。
プラスミドpSL13−２を含む大腸菌はpSL13−2,FERM P
−9695として微工研に寄託されている。
−9695として微工研に寄託されている。
得られたプラスミドpSL13−２でサッカロミコプシス
・リポリティカを形質転換し、プラスミドが多数複製さ
れるのが確認される。
・リポリティカを形質転換し、プラスミドが多数複製さ
れるのが確認される。
次に本発明を実施例により更に詳細に説明する。
実施例１ （１）新規プラスミドpVCL 2の作製 Saccharomycopsis lipolytica野生株（ATCC44601）を
YEPD培地（組成：酵母エキス１％、ペプトン２％、グル
コース２％）にて30℃、48時間培養後、これより全DNA
を抽出し、制限酵素Sau 3AIで部分切断した。
YEPD培地（組成：酵母エキス１％、ペプトン２％、グル
コース２％）にて30℃、48時間培養後、これより全DNA
を抽出し、制限酵素Sau 3AIで部分切断した。
一方、大腸菌とSaccharomyces cerevisiaeとのシャト
ルベクターpVC 1（pUC 9とYRp 7のそれぞれ制限酵素Hae
IIとPvu Iで切断した断片を連結して作製した。S.cere
visiaeのTrp 1を含む）を制限酵素Bam HIで切断した。
次に双方のDNAをT4 DNA連結酵素を用いて連結反応させ
た後、大腸菌JM 83株を形質転換させ、Ap（50μg/ml）
を含んだＸ−Gal寒天培地（上層培地（20ml）：トリプ
トン１％、NaCl 0.8％、塩酸チアミン10mg/l、寒天２
％、下層培地（3ml）：トリプトン１％、NaCl 0.8％、
塩酸チアミン10mg/l、100mM IPTG（isopropyl β−Ｄ−
thiogalactopyranoside）10μｌ、20mg/mlX−ga1（５−
bromo−４−chloro−３−indolyl−β−Ｄ−galactopyr
anoside）50μｌ、寒天0.6％）で12時間培養した。
ルベクターpVC 1（pUC 9とYRp 7のそれぞれ制限酵素Hae
IIとPvu Iで切断した断片を連結して作製した。S.cere
visiaeのTrp 1を含む）を制限酵素Bam HIで切断した。
次に双方のDNAをT4 DNA連結酵素を用いて連結反応させ
た後、大腸菌JM 83株を形質転換させ、Ap（50μg/ml）
を含んだＸ−Gal寒天培地（上層培地（20ml）：トリプ
トン１％、NaCl 0.8％、塩酸チアミン10mg/l、寒天２
％、下層培地（3ml）：トリプトン１％、NaCl 0.8％、
塩酸チアミン10mg/l、100mM IPTG（isopropyl β−Ｄ−
thiogalactopyranoside）10μｌ、20mg/mlX−ga1（５−
bromo−４−chloro−３−indolyl−β−Ｄ−galactopyr
anoside）50μｌ、寒天0.6％）で12時間培養した。
生じたAp耐性コロニーのうち白色コロニーを14600個
得た。これらのコロニーからプラスミドを分離し、S.li
polyticaのジーンライブラリーとした。
得た。これらのコロニーからプラスミドを分離し、S.li
polyticaのジーンライブラリーとした。
次に、S.cerevisiaeDKD−5D株（FERM P−7526）（MAT
a,trpl,leu2,his3）を宿主としてヒンネン（Hinnen）ら
のプロトプラスト形質転換法を用いて、上記ジーンライ
ブラリーで形質転換させ、ロイシン欠失寒天培地にて再
生を行った。30℃で５〜７日間培養後、生育してくるコ
ロニーを分離し、ロイシン欠失液体培地で培養後、DNA
を菌体から分離し、再度大腸菌JA 221株を形質転換さ
せ、Ap耐性となったコロニーを分離した。この菌体より
調製したプラスミドDNAを分離し、これをpVCL 2と称し
た。
a,trpl,leu2,his3）を宿主としてヒンネン（Hinnen）ら
のプロトプラスト形質転換法を用いて、上記ジーンライ
ブラリーで形質転換させ、ロイシン欠失寒天培地にて再
生を行った。30℃で５〜７日間培養後、生育してくるコ
ロニーを分離し、ロイシン欠失液体培地で培養後、DNA
を菌体から分離し、再度大腸菌JA 221株を形質転換さ
せ、Ap耐性となったコロニーを分離した。この菌体より
調製したプラスミドDNAを分離し、これをpVCL 2と称し
た。
（２）プラスミドpVCL 2の制限酵素地図の作成 制限酵素Bgl II、EcoR I、Kpn I、Sal Iを用いてプラ
スミドpVCL 2を切断して、その断片の大きさから、それ
ぞれの切断部位の相対位置を決定した。それを第１図Ａ
に示す。このうち１はS.lipolytica由来DNA断片（3.4k
b）を示す。
スミドpVCL 2を切断して、その断片の大きさから、それ
ぞれの切断部位の相対位置を決定した。それを第１図Ａ
に示す。このうち１はS.lipolytica由来DNA断片（3.4k
b）を示す。
（３）プラスミドpVCL 2のS.cerevisiae及びS.lipolyti
caにおける発現 プラスミドpVCL 2でS.cerevisiaeを伊藤らのリチウム
金属法（H.Ito、Y.Fukuda、K.Murata and A.Kimura、J.
Bacteriol、153,165（1983））を用いて形質転換したと
ころDNA 1μｇ当り1500個の形質転換体が得られた。
caにおける発現 プラスミドpVCL 2でS.cerevisiaeを伊藤らのリチウム
金属法（H.Ito、Y.Fukuda、K.Murata and A.Kimura、J.
Bacteriol、153,165（1983））を用いて形質転換したと
ころDNA 1μｇ当り1500個の形質転換体が得られた。
プラスミドpVCL 2のを制限酵素Kpn Iで切断後、S.lip
olytica MX9−11 leu F株（leu 2変異株）をDavidowら
の方法（Lance S. Davidow、 Diane Apostolakos、Mich
ele M. O′Donnell、Alan R.Proctor、David M.Ogrydzi
ak、Rod A.Wing、Irene Stasko、and John R.Dezeeuw、
Curr.Genet.,10,39（1985））に従って形質転換したと
ころ、DNA 1μｇ当り5915個の形質転換体が得られた。
olytica MX9−11 leu F株（leu 2変異株）をDavidowら
の方法（Lance S. Davidow、 Diane Apostolakos、Mich
ele M. O′Donnell、Alan R.Proctor、David M.Ogrydzi
ak、Rod A.Wing、Irene Stasko、and John R.Dezeeuw、
Curr.Genet.,10,39（1985））に従って形質転換したと
ころ、DNA 1μｇ当り5915個の形質転換体が得られた。
（４）pUCL−1,pUCL−2,PSL−12,pSL−13の作製 プラスミドpVCL 2から、さらにこれより小さくて、な
おかつpVCL 2と同様の性質、性能を有するプラスミド
（pUCL−1,pUCL−2,pSL−12,pSL−13）を作製すること
ができる。すなわち、プラスミドpVCL 2を制限酵素Sal
Iにて切断し、2.8kbの画分を分離し、これをベクターpU
C 19を制限酵素Sal Iにて切断した部位に挿入し、pUCL
−１、pUCL−２を作製した（pUCL−１とpUCL−２は2.8k
b DNA断片の挿入方向が逆）。
おかつpVCL 2と同様の性質、性能を有するプラスミド
（pUCL−1,pUCL−2,pSL−12,pSL−13）を作製すること
ができる。すなわち、プラスミドpVCL 2を制限酵素Sal
Iにて切断し、2.8kbの画分を分離し、これをベクターpU
C 19を制限酵素Sal Iにて切断した部位に挿入し、pUCL
−１、pUCL−２を作製した（pUCL−１とpUCL−２は2.8k
b DNA断片の挿入方向が逆）。
pVCL 2とpUC 19からpUCL−１及びpUCL−２の作製図は
第１図に示される。
第１図に示される。
第１図において制限酵素の略記号の意味は次の通りで
ある。
ある。
E:EcoR I、S:Sal I、Bg:Bgl II 更に、pUCL−２を制限酵素Bam HIとBgl IIで切断し、
2.7kbの画分を分離し、これをベクターpUC19Bg（pUC19
のEco 0109切断部位をBgl II切断部位に変換したもの）
を制限酵素Bgl IIにて切断した部位に挿入し、pSL−12,
pSL−13を作製した（pSL−12とpSL−13は2.7kb DNA断片
の挿入方向が逆）。
2.7kbの画分を分離し、これをベクターpUC19Bg（pUC19
のEco 0109切断部位をBgl II切断部位に変換したもの）
を制限酵素Bgl IIにて切断した部位に挿入し、pSL−12,
pSL−13を作製した（pSL−12とpSL−13は2.7kb DNA断片
の挿入方向が逆）。
pUC 19BgとpUCL−２からpSL−12及びpSL−13の作製図
は第２図に示される。
は第２図に示される。
第２図において制限酵素の略記号の意味は次の通りで
ある。
ある。
B:Bam HI、Bg:Bgl II、S:Sal I、E:EcoR I。
（５）プラスミドpUCL−１及びpSL−13のS.lipolytica
における発現 プラスミドpUCL−１及びpSL−13により、S.lipolytic
a MX9−11 leu F（leu 2変異株）をDavidowらの方法に
従って形質転換したところ表１のような結果を得た。
における発現 プラスミドpUCL−１及びpSL−13により、S.lipolytic
a MX9−11 leu F（leu 2変異株）をDavidowらの方法に
従って形質転換したところ表１のような結果を得た。
（６）新規プラスミドpSL13−２の作製 S.lipolytica野生株（ATCC 44601）をYEPD培地にて30
℃、48時間培養後、これより全DNAを抽出し、制限酵素S
au 3AIで部分切断した。一方、プラスミドpSL−13を制
限酵素Bam HIで切断した。次に双方のDNAをT4 DNA連結
酵素を用いて連結反応させた後、大腸菌JM 109を形質転
換させ、Ap（50μg/ml）を含んだＸ−Gal寒天培地で12
時間培養した。
℃、48時間培養後、これより全DNAを抽出し、制限酵素S
au 3AIで部分切断した。一方、プラスミドpSL−13を制
限酵素Bam HIで切断した。次に双方のDNAをT4 DNA連結
酵素を用いて連結反応させた後、大腸菌JM 109を形質転
換させ、Ap（50μg/ml）を含んだＸ−Gal寒天培地で12
時間培養した。
生じたAp耐性コロニーのうち白色コロニーを2500個得
た。これらのコロニーからプラスミドを分離し、S.lipo
lyticaのジーンライブラリーとした。
た。これらのコロニーからプラスミドを分離し、S.lipo
lyticaのジーンライブラリーとした。
次に、S.lipolytica MX9−11 leu F（leu 2変異株）
を宿主としてDavidowらの方法を用いて、上記ジーンラ
イブラリーで形質転換させ、ロイシン欠失寒天培地にて
再生を行った。30℃で４〜５日間培養後、生育してくる
コロニーを分離し、ロイシン欠失液体培地で培養後、DN
Aを菌体から分離し、再度大腸菌JM 109を形質転換さ
せ、Ap耐性となったコロニーを分離した。この菌体より
調製したプラスミドDNAを分離し、これをpSL13−２と称
した。
を宿主としてDavidowらの方法を用いて、上記ジーンラ
イブラリーで形質転換させ、ロイシン欠失寒天培地にて
再生を行った。30℃で４〜５日間培養後、生育してくる
コロニーを分離し、ロイシン欠失液体培地で培養後、DN
Aを菌体から分離し、再度大腸菌JM 109を形質転換さ
せ、Ap耐性となったコロニーを分離した。この菌体より
調製したプラスミドDNAを分離し、これをpSL13−２と称
した。
pSL13−２を含む大腸菌JM 109はpSL13−2FERMP−9695
として微工研に寄託されている。
として微工研に寄託されている。
（７）プラスミドpSL13−２のS.lipolyticaにおける発
現 プラスミドpSL13−２を無切断で、Davidowらの方法に
従って、S.lipolytica MX9−11 leu Fを形質転換したと
ころ、DNA 1μｇ当り577個の形質転換体が得られた。プ
ラスミドpSL 13を用い同様の条件で形質転換を行なった
ところ、DNA 1μｇ当り0.6個の形質転換体しか得られな
かったので、pSL13−２はS.lipolytica中で機能するARS
を含んでいるものと認められた。
現 プラスミドpSL13−２を無切断で、Davidowらの方法に
従って、S.lipolytica MX9−11 leu Fを形質転換したと
ころ、DNA 1μｇ当り577個の形質転換体が得られた。プ
ラスミドpSL 13を用い同様の条件で形質転換を行なった
ところ、DNA 1μｇ当り0.6個の形質転換体しか得られな
かったので、pSL13−２はS.lipolytica中で機能するARS
を含んでいるものと認められた。
（８）プラスミドpSL13−２の制限酵素地図の作成 制限酵素Bam HI、EcoR I、Kpn I、Hind III、Sma I、
Xho Iを用いてプラスミドpSL13−２を切断して、その断
片の大きさから、それぞれの切断部位の相対位置を決定
した。それを第３図に示す。
Xho Iを用いてプラスミドpSL13−２を切断して、その断
片の大きさから、それぞれの切断部位の相対位置を決定
した。それを第３図に示す。
第３図において制限酵素の略記号の意味は次の通りで
ある。
ある。
B:Bam HI、Bg:Bgl II、E:EcoR I、K:Kpn I、H:Hind II
I、S:SalI、Sm:Sma I、Xh:Xho I
I、S:SalI、Sm:Sma I、Xh:Xho I
第１図はpVCL 2とpUC 19からのpUCL−１及びpUCL−２の
作製図で、第２図はpUC 19BgとpUCL−２からのpSL−12
及びpSL−13の作製図で、第３図はpSL13−２の制限酵素
地図を示すものである。
作製図で、第２図はpUC 19BgとpUCL−２からのpSL−12
及びpSL−13の作製図で、第３図はpSL13−２の制限酵素
地図を示すものである。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:645）
Claims (2)
- 【請求項１】下記に示す制限酵素地図を有し、サッカロ
ミコプシス・リポリティカ由来の自己複製配列を含むプ
ラスミド。 - 【請求項２】下記の（ａ）〜（ｈ）の工程からなること
を特徴とする、下記に示す制限酵素地図を有し、サッカ
ロミコプシス・リポリティカ由来の自己複製配列を含む
プラスミドの製法。 （ａ）サッカロマイセス・セレビジェのベクターPVC1を
用いてサッカロミコプシス・リポリティカのジーンライ
ブラリーを作製し、 （ｂ）次いで、該ジーンライブラリーでロイシン要求性
サッカロマイセス・セレビジェを宿主として形質転換
し、 （ｃ）得られた形質転換体からプラスミドを分離して大
腸菌を形質転換し、アンピシリン耐性のプラスミドを分
離し、 （ｄ）該アンピシリン耐性プラスミドを制限酵素により
切断し、サッカロミコプシス・リポリティカのLeu2遺伝
子領域を単離し、 （ｅ）大腸菌ベクターを制限酵素で切断し、（ｄ）で単
離した領域と連結させ、 （ｆ）（ｅ）で連結されたプラスミドを用いてサッカロ
ミコプシス・リポリティカのジーンライブラリーを再度
作製し、 （ｇ）次いで、該ジーンライブラリーでロイシン要求性
サッカロミコプシス・リポリティカを宿主として形質転
換し、 （ｈ）得られた形質転換体からプラスミドを分離して大
腸菌を形質転換し、アンピシリン耐性のプラスミドを分
離する。
Priority Applications (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP62317320A JPH082304B2 (ja) | 1987-12-17 | 1987-12-17 | プラスミドとその製造方法 |
| US07/285,032 US5118625A (en) | 1987-12-17 | 1988-12-16 | Autonomously replicating plasmid and saccharomycopsis lipolytica transformed therewith |
| EP88121186A EP0320994A1 (en) | 1987-12-17 | 1988-12-17 | Plasmid and a method for producing thereof |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP62317320A JPH082304B2 (ja) | 1987-12-17 | 1987-12-17 | プラスミドとその製造方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH01160483A JPH01160483A (ja) | 1989-06-23 |
| JPH082304B2 true JPH082304B2 (ja) | 1996-01-17 |
Family
ID=18086893
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP62317320A Expired - Fee Related JPH082304B2 (ja) | 1987-12-17 | 1987-12-17 | プラスミドとその製造方法 |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5118625A (ja) |
| EP (1) | EP0320994A1 (ja) |
| JP (1) | JPH082304B2 (ja) |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7009045B2 (en) * | 2000-07-14 | 2006-03-07 | Archer-Daniels-Midland Company | Transformation systems for flavinogenic yeast |
| KR100529254B1 (ko) * | 2003-09-22 | 2005-11-17 | 한국생명공학연구원 | Ｈａｒｓ36서열을 이용하여 효모 한세눌라 폴리모르파균주에서 라이브러리를 제조하는 방법 및 상기 방법에의하여 제조된 라이브러리 |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| IN163393B (ja) * | 1983-10-06 | 1988-09-17 | Pfizer | |
| EP0166659B1 (fr) * | 1984-06-26 | 1989-08-30 | Institut National De La Recherche Agronomique (Inra) | Vecteurs de transformation de la levure yarrowia lipolytica, procédé de transformation et levure transformée |
| US4937189A (en) * | 1985-10-18 | 1990-06-26 | Pfizer Inc. | Expression and secretion of heterologous proteins by Yarrowia lipolytica transformants |
-
1987
- 1987-12-17 JP JP62317320A patent/JPH082304B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
1988
- 1988-12-16 US US07/285,032 patent/US5118625A/en not_active Expired - Fee Related
- 1988-12-17 EP EP88121186A patent/EP0320994A1/en not_active Withdrawn
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US5118625A (en) | 1992-06-02 |
| JPH01160483A (ja) | 1989-06-23 |
| EP0320994A1 (en) | 1989-06-21 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |