NO173743B - Fremgangsmaate for transformering av yarrowia lipolytica, samt fremgangsmaate for fremstilling av vektor for anvendelse ved fremgangsmaaten - Google Patents

Abstract

Fremgangsmåte for transformering av Yarrowia lipolytica,. vektorer for anvendelse til dette som innbefatter DNA av en mikrobiell vektor og kromosomalt DNA av Y. lipolytica og transformanter som innbefatter nevnte vektorer i E. coli og Y. lipolytica, og integrerende skyttelvektorer for Escherichia-Yarrowia transgenerisk kloning. Nevnte vektorer eller subkloner av disse muliggjør dannelse av Yt lipolytica-kloningsvektorer hvori spesifikke eller tilfeldige segmenter av DNA kan innføres, og de resulterende vektorer brukes til å transformere en passende vertmikrobe, spesielt Y. lipolytica, for å forbedre fermenterings-karakteristikaene av denne og således deres industrielle anvendelse.Den beskrevne metodikk tillater kloning av gener fra en gensamling av Y. lipolytica ved komplementering med en. integrerende vektor.

Description

Denne oppfinnelse vedrører en fremgangsmåte for transformering av Yarrowia lipolytica for å forbedre dens anvendelse til industrielle formål; for fremstilling av vektorer og subkloner av disse anvendbare til dette, spesielt vektorer som replikerer autonomt i Escherichia coli og integrerer, men ikke replikerer autonomt i Yarrowia lipolytica; for fremstilling av transformanter av E.coli

og Y. lipolytica som inneholder nevnte vektorer og deres anvendelse for å produsere proteiner. Se forøvrig kravene, spesielt krav 1, 4-9 og 10.

Hovedvekten i molekylær kloning er blitt rettet mot prokaryoter, spesielt E. coli, og mer nylig Bacillus subtilis, som vertsorganismer. E. coli er på tross av sin utstrakte anvendelse som vertsorganisme for kloning og fremstilling av heterologt DNA, kjent for å forårsake bestemte problemer, slik som manglende proteinsekresjon i sitt vekstmedium med påfølgende letthet i isole-ringen av denne. Proteinene som således blir produsert intra-cellulært, er vanligvis ikke i sin naturlige tilstand og finnes som uløselige aggregater, kalt inklusjons-legemer. Det mulig behov for å ødelegge cellene for å gjenvinne proteinet, frembringer muligheten for kontaminering av dette med et toksisk stoff.

I lys av de nevnte vanskeligheter har man studert B. subtilis som en alternativ vertsorganisme, siden den utskiller protein og ikke produserer toksiner. Imidlertid er B. subtilis som vertsorganisme underkastet bestemte begrensninger; ustabilitet av transformerte stammer, som resulterer i tap av heterologt DNA, og hyppig redusering i evne til å gå inn i DNA for å fungere sammen med verts-DNA.

Ved oppdagelsen av de ovenfor nevnte vanskelighetene med prokaryoter som vertsorganismer, ble oppmerksomheten flyttet til eukaryoter, og spesielt gjærsopper, som vertsorganismer. Gjærsopper av industriell viktighet er ikke-toksiske og kan dyrkes opp til svært høye tettheter. Noen arter er godt analysert genetisk, og noen arter kan utskille proteiner.

Den første transformering av en gjærsopp, Saccharomyces cerevisiae, ble rapportert av Hinnen et al., Proe. Nati. Acad.

Sei., 75, 1929-1933 (1978) som demonstrerte at et klonet segment av gjærsopp DNA som kodet for LEU2-locus kunne transformere en ikke-reverterende leu2~-mutant av gjærsopp til en LEU+-fenotype. Denne transformering var vist å resultere fra integrering i kromosomet av plasmidet som inneholdt LEU2-segmentet av DNA. Integreringen involverte rekombinering mellom homologe segmenter av DNA.

Hinnen et al. i "Overproduction of Microbial Products", utgitt av Krumphanzl et al., Academic Press, N.Y., Ch. 30, 1982, representerer et overblikk over fremgangsmåter for gjærsopp-transformering. En betingelse for gjærsopp-transformering ble beskrevet av Ratzkin et al., Proe. Nati. Acad. Sei. 74, 487-491

(1977) i deres kloning av gjærsopp (Saccharomyces cerevisiae) LEU2 ved komplementering av en E. coli leuB mutasjon.

Sjostak et al., Plasmid 2, 536-554 (1979) beskriver

dannelsen av plasmider som inneholder LEU2-genet av gjærsopp og fragmenter av rDNA og integreringen av plasmider i rDNA-locus som følger gjærsopp-transformering. Grunntanken i deres under-søkelse involverte integrering av en genetisk markør, LEU2-

genet, innført i rDNA locus, som en genetisk markør for å kart-legge rDNA. Et av de rapporterte plasmider pSZ20, som inneholdt BglII-B-fragmentet av rDNA og Sall-Xhol LEU2-fragmentet, er identifisert som en anvendbar vektor for kloning av fragmenter av gjærsopp DNA i gjærsopper.

Orr-Weaver et al., Proe. Nati. Acad. Sei., 78, 6354-6358

(1981) demonstrerte høyfrekevns-integrering av lineære plasmider fått fra pBR322, hvorav alle er ikke-replikerende i gjærsopp og transformerer bare ved integrering, i Saccharomyces cerevisiae når plasmidene blir kuttet inne i DNA-sekvenser som er homologe til g j aerkromosomet.

Yarrowia lipolytica, en industrielt viktig gjærsopp-art, anvendes til å produsere sitronsyre og enkeltcelleprotein, dvs. protein produsert av gjærsopp som har et høyt innhold av visse ønskelige aminosyrer. Slik gjærsopp benyttes deretter som for-tilsetning. Det kan også anvendes til å produsere erytritol, mannitol og isopropyl-eplesyre. Y. lipolytica lider av spesielle arvelige mangler, slik som et begrenset spektrum av anvendbare karbonkilder. Den totale verdi av Y. lipolytica kunne økes ved å eliminere slike mangler som f.eks. ved å introdusere korrigerende DNA fra en annen art. Y. lipolytica er av spesiell interesse og verdi, på grunn av dens evne til å utskille proteiner (alkalisk protease, syreprotease og RNAse) i sitt vekstmedium, og tillater således gjenvinnelse av heterologe proteiner i den naturlige tilstand uten behovet for å ødelegge de produserende celler.

Et høy-effektivt system for transformering av S. cerevisiae innbefatter et replikerende hybridplasmid, et S. cerevisiae -

E. coli hybrdidplasmid, som kan selekteres i og gjenvinnes fra både E. coli og S. cerevisiae, er beskrevet av Beggs, Nature 275, 104-109 (1978). Høyfrekvens-transformeringssystemer for Schizosaccharo-myces pombe og Kluyveromyces lactis er rapportert av Beach et al., Nature 290, 140-142 (1981) og av Das et al., Current Genetics 6, 123-128 (1982), henholdsvis.

Det er nå blitt funnet en fremgangsmåte for transformering av Y. lipolytica ved i denne å innføre DNA som inneholder et område med homologi til nevnte Y. lipolytica og en påvisbar genetisk markør. Av spesiell interesse er fremgangsmåten som innbefatter å innføre i nevnte Y. lipolytica et fragment av Y. lipolytica DNA eller, alternativt eller fortrinnsvis, en vektor som inneholder eller inkluderer et fragment av Y. lipolytica DNA, idet nevnte DNA eller vektor er påvisbar i nevnte Y. lipolytica, samt vektorer anvendbare til dette. Hovedsakelig i denne transformeringsprosessen inneholder nevnte Y. lipolytica DNA-fragment en selekterbar markør som virker i Y. lipolytica, spesielt i Y. lipolytica som har en mutasjon i genet som tilsvarer nevnte selekterbare markør. Av spesiell interesse og verdi for denne oppfinnelse er anvendelsen av et Y. lipolytica DNA-fragment som har et gen som koder for et biosyntetisk eller metabolsk enzym, slik som LEU2-genet (koder for enzymet /3-isopropylmalat-dehydrogenase, EC1.1.85) eller URA3-genet (koder for enzymet orotidin-5'-fosfatdekarboksylase, EC4.1.1.23), eller XPR2-genet (koder for enzymet alkalinsk ekstracellulær protease, EC3.4.21.14) og Y. lipolytica-stammer som har en leu2~, en hisl", en urea3~ eller xpr2~ mutasjon, henholdsvis.

De nye plasmider (eller vektorer, betegnelsene brukes om hverandre her) som er beskrevet her, har flere karakteristika felles; et bakterie-replikon som tillater deres forøkelse i E. coli; tilstedeværelse av en selekterbar genetisk markør påvisbar i og funksjonell i E. coli, og tilstedeværelse av et strukturelt gen som virker fysiologisk i Y. lipolytica og hyppig i E. coli, og tilstedeværelse av Y. lipolytica DNA-fragmenter som sørger for deres integrering i genomet av Y. lipolytica.

Generelt, til formål for denne oppfinnelse, er produksjonen

av anvendbare vektorer basert på fremstilling av hybridvektorer; dvs. vektorer med fysiologisk virkning både i en heterolog mikroorganisme (dvs. en hvilken som helst art forskjellig fra Y. lipolytica), mest ønskelig en bakterie, fortrinnsvis E. coli,

og i Y.lipolytica. Slike vektorer innbefatter mikrobiell DNA og fragmenter av kromosomal DNA av Y. lipolytica hvis fragmenter inneholder minst én selekterbar genetisk markør; dvs. et gen som virker i og er påvisbart i Y. lipo-lytica. De således dannede vektorer reagerer med homologe kromoso-male sekvenser i Y. lipolytica og blir integrert i et kromosom av denne, og utfører således transformering.

Som fagmannen på området vil oppdage, øker dannelsen av vektorer som inneholder mer enn ett gen som stammer fra gjærsopp sannsynligheten for å danne integranter fra nevnte vektorer; dvs. transformanter som inneholder nevnte vektorer, og spesielt integranter som har mer enn ett gen. Dette betyr at det er større sannsynlighet for at vektorer med mer enn ett gen som stammer fra gjærsopp, vil integrere i et kromosom av transformanter (dvs-, danne integranter). Tilstedeværelse av multiple gener øker og forbedrer selvfølgelig evnen til å påvise tilstedeværelse av vektor i en gjærsopp.

Integrering blir utført med sirkulære, lineære og åpne-lineære former av nevnte vektorer. Åpne-lineære vektorer dannes ved å kutte en vektor på to steder (dvs. at ikke hele vektoren befinner seg på ett DNA-stykke). Lineære og åpne-lineære vektorer integrerer med høyere effektivitet enn sirkulære vektorer gjør. Vektorene har der-for ønskelig et unikt restriksjonssete; dvs. et sete som ikke er til stede i den opprinnelige mikrobielle DNA-vektor eller noe annet sted i Y. lipolytica-fragmentkomponenten av vektoren. Lineærise-ringen av vektoren på et slikt sted danner dobbeltstrenget DNA som har sterk rekombinant-genetiske ender i stand til å transformere Y. lipolytica ved integrering i homologe kromosom-sekvenser. Som Orr-Weaver et al. (loe.eit.) har vist i S. cerevisiae, er avbrutt-lineære plasmider også i stand til integrering. Slike plasmider fremstilles ved å lage to restriksjonsenzymkutt inne i Y.lipolytica-kromosomal-DNA-segmentet av vektoren. I tilfelle av pLD25 beskrevet nedenfor tillater tilstedeværelsen av to Bglll-seter på en passende måte fremstilling av åpne lineære plasmider.

Verdien av vektorene som fremstilles i henhold til denne oppfinnelse er basert på tilstedeværelsen i dem av en selekterbar genetisk markør, påvisbar i og virksom i Y. lipolytica, således en påvisbar markør. Passende markører er de følgende Y. lipolytica-gener: LEU2, ADE1, URA3, XPR2 og HIS1, men som fagmannen på området vil oppdage, kan et hvilket som helst Y. lipolytica-gen som gir en selektering, anvendes. LEU2-genet eller en del av dette, er spesielt verdifullt. Nevnte gen eller en del av det fåes fra Y. lipolytica ved en delvis fordøying av kromosomalt DNA av Y. lipolytica ved en passende restriksjons-endonuklease, for eksempel Sau3A. Nevnte vektorer eller subkloner av dem tillater dannelse av Y. lipolytica-kloningsvektorer ved å innføre i disse tilfeldige segmenter av DNA ved kjente metoder.

De resulterende vektorer blir så brukt til å overføre

Y. lipolytica-stammer som har en mutasjon i genet som svarer til den selekterbare markør. Den transformerende DNA som har en slik Y. lipolytica-markør, kan gi fordeler i selektiv vekst hos resipienten eller korrigere for en auxotrop mutering i resipienten.

Det er generelt foretrukket å anvende et Y. lipolytica-DNA-fragment som inneholder hele LEU2-genet, siden nevnte fragment tillater fremstilling av en vektor som virker fysiologisk i både E. coli og Y. lipolytica. Imidlertid er anvendelse av et

Y. lipolytica DNA-fragment som. har hele LEU2-genet, ikke nødvendig for vellykket gjennomføring av fremgangsmåten i henhold til oppfinnelsen. Det er bare nødvendsig å anvende et DNA-fragment som inkluderer en tilstrekkelig mengde av vill-type-sekvensen for å gi et vill-typegen ved integrering i resipienten. Nevnte fragment er, mens det ikke virker i E. coli, påvisbart i Y. lipolytica.

Også verdifulle for fremstillingen av vektorer som er anvendbare i denne oppfinnelse, er fragmenter av Y. lipolytica DNA fått ved en fullstendig BamHl-fordøyelse av Y. lipolytica-kromosomalt DNA og som inkluderer HISl-genet eller ved en delvis Sau3A-fordøyelse av Y. lipolytica kromosomalt DNA og som inkluderer URA3-genet av denne. Nevnte fragmenter inneholder ligerbare ender, og når de blir ligert med lineærisert, f.eks. ved anvendelse av BamHl, YEp24, en E. coli - S. cerevisiae vektor, (Botstein et al., Gene 8, 17-24 (1979) gir hybridvektorer som bærer HISl-genet eller URA3-genet.

Ved å bruke de nye vektorer som er beskrevet her, kan tilfeldige segmenter av Y. lipolytica innføres i disse ved hjelp av "shotgun"-teknikken. De resulterende vektorer kan anvendes til å transformere forskjellige mutanter og transformanter selektert ved standardmetoder. For eksempel kan LEU2-inneholdende vektorer anvendes til å klone andre Y. lipolytica-gener, slik som URA3. Det resulterende klonede URA3-gen i en hvilken som helst av de valgte transformanter kan så bli subklonet bort fra LEU2-genet og brukt som en effektiv Y. lipolytica-vektor.

Hovedsakelig blir et bakterielt, f.eks. E. coli, plasmid-replikeringsutgangspunkt og en selektiv genetisk markør for nevnte bakterie kombinert ved hjelp av kjent metodikk med hele eller en del av Y. lipolytica-genet som kan bli selektert for, og påvist, i Y. lipolytica. E. coli-kloningssystemet er spesielt anvendbart siden det lett gir store mengder (volum) av plasmid DNA ved vekst og forøkning i E. coli; og tillater dannelse av vektorer og gene-biblioteker i E. coli.

De heri beskrevne plasmider er anvendbare som vektorer i rekombinant-DNA-metodikk. Forskjellige gener kan innføres i dem ved, for eksempel, å spalte dem med en passende restriksjons-endonuklease for å gi lineært DNA som har ligerbare ender, fulgt av å få nevnte lineære DNA til å reagere med et eksogent gen som har ligerbaree ender. De resulterende plasmider blir så transformert inn i en passende vertsmikroorganisme, f.eks. gjærsopper slik som S. cerevisiae og Y. lipolytica som, ved kulturering under passende betingelser, produserer det ønskede produkt. Plasmider pLD25 og pLD28 som hver inneholder LEU2-genet fra Y. lipolytica, kan selekteres i og påvises i en Y. lipolytica-resipient. De kan således anvendes til å muliggjøre dannelsen av Y. lipolytica-kloningsvektorer.

I tillegg gir de her beskrevne plasmider måter til å forbedre fermenterings-karakteristika av mikroorganismer, spesielt for Y. lipolytica, for å forbedre den industrielle anvendbarheten ved å overvinne arvelige mangler i denne. For eksempel kan gener som koder for anvendelse av forskjellige karbonkilder, innføres i dem, og det resulterende plasmid blir tranformert inn i en passende vert slik som Y. lipolytica for å modifisere ernærings-karakteristikkene av nevnte vert, og således utvide spekteret for anvendbare karbonkilder av Y. lipolytica.

Vektorene, f.eks. plasmider eller kosmider, som trenges til dette formål, kan dannes ved teknikker kjent for dem som er dyktige på området rekombinant DNA-teknologi. Y. lipolytica-DNA-sekvensen som koder for et spesielt periplasmisk enzym, blir isolert ved hjelp av kjente metoder og innført i f.eks. pLD2 5 eller en avledning av denne. Et ønsket strukturelt gen, f.eks. maltase-genet, kan på en passende måte bli sammenføyd inn i DNA-sekvensen for et periplasmisk ensym, og det resulterende plasmid blir transformert inn i Y. lipolytica og integrert inn i et av Y. lipolyticas kromosomer ved hjelp av fremgangsmåten i henhold til denne oppfinnelse. Den således dannede transformant vil ved kultivering være i stand til å hydrolysere maltose inn i glukose, en ønsket egenskap som ikke innehas av opphavet.

Plasmid pLD25 replikerer autonomt i E. coli og integrerer, men replikerer ikke autonomt i Y. lipolytica. Det fås ved å innføre i E. coli-replikerende plasmid pBR322 et Y. lipolytica DNA-fragment som ønskelig er utstyrt med to distinkte egenskaper: for det første tilstedeværelse av et strukturelt gen som virker fysiologisk i Y. lipolytica og fortrinnsvis også i E. coli og som er påvisbart i Y. lipolytica; for det annet besittelse av et unikt restriksjonssted (dvs. ikke til stede i det opprinnelige E. coli-plasmid eller noe annet sted i Y. lipolytica-vertsfragmentet) i et område som dekker sidene av DNA-sekvensen som er innført i Y. lipolytica-vertsstammen med det formål å korrigere defekter i det strukturelle genet i nevnte vert. For å oppnå høy transformerings-frekvens er besittelse av et unikt restriksjonssted vesentlig.

Plasmidene pLD21 og pLD23 som er beskrevet nedenfor, som hver bærer HISl-genet av Y. lipolytica, fås ved å innføre i YEp24 og pBR22, henholdsvis, et fragment fått ved den fullstendige BamHl-fordøying av kromosomalt DNA av Y. lipolytica.

Plasmid pLD25 inneholder et fragment av Y. lipolytica DNA som komplementerer E. coli leuB~-mutasjoner, og plasmider pLD21 og pLD23 et fragment som kompiementerer E. coli hisG~-mutasjoner. men replikerer ikke autonomt i Y. lipolytica. Det blir dannet ved innføring av et Sall-fragment som inneholder Y. lipolytica LEU2-genet i Sall-sete av YEp24. Det er en integrerende vektor i Y. lipolytica, som bemerket, selekterbar i en leu2-mutant, et multikopi-plasmid i S. cerevisiae selekterbart i en ura3- eller en leu2-mutant, og et multikopi-plasmid i E.coli, selekterbart ved ampicillin-resistens eller ved tilstrekkelig funksjon av S. cerevisiae URA3-genet i en pyrF-mutant eller minst effektivt ved den dårlige, dog påvisbare funksjon av Y. lipolytica LEU2-genet i en leuB-mutant.

Plasmidene pLD25 og pLD28 er skyttel-vektorer for E. coli og

Y. lipolytica. Begge inneholder bakteriesekvenser som muliggjør DNA-replikering i E. coli og sekvenser som muliggjør integrering

i gjærceller; dvs., de inneholder et E. coli-utgangspunkt for replikering og et homologt Y. lipolytica-område. Betegnelsen "skyttel" brukes for å angi at nevnte vektorer dannet i E. coli kan integreres i Y. lipolytica-kromosomer og gjeninnføres i E. coli for å fullstendiggjøre cyklus. Plasmid pLD28 er også en skyttelvektor for S. cerevisiae. Disse skyttelvektorer muliggjør kloning av Y.lipolytica-gener ved komplementering av mutasjoner i E. coli og ved direkte komplementering av mutanter i S. cerevisiae eller Y. lipolytica. Disse fenomener indikerer at et funksjonelt LEU2-gen-produkt er i ferd med å dannes i begge heterologe systemer. Dette funn av direkte komplementering i Y. lipolytica tillater nå kloning av et hvilket som helst gen for hvilket en mutasjon kan identifiseres.

Plasmid pLD40, beskrevet nedenfor, ble dannet ved å innføre i EcoRl-sete av pBR3 22 et lite segment som inneholdt LEU2-området av Y. lipolytica,- idet man fikk nevnte segment fra en delvis EcoRl-fordøyelse av pLD25. Plasmid pLD55, et URA3-inneholdende plasmid, fikk man ved å innføre på BamHI-stedet av pLD40 URA3-genet av Y. lipolytica.

Figur 1.

Sau3A delvis fordøyd gen- bibliotek av Y. lipolytica i pBR 322

Denne agarosegel viser at biblioteket (merket LIB) inneholder noe pBR322 superspiral-plasmid uten innført DNA som vandrer like over 2,3 kb lambda-Hindlll-standarden (merket STD), mens resten av molekylene inneholder mange (4-10 kb) størrelsefraksjonerte stykker av Y. lipolytica DNA innsatt i pBR322 som vandrer som en nesten kontinuerlig masse over 4,3 kb-standarden. Feltet imellom inneholder et ukuttet plasmid (pLD21) og viser to atskilte bånd.

Figur 2.

Southern- hybridiserinq av EcoRI fordøyd Y. lipolytica bulk DNA

og pLD25 prøvet med radioaktiv pLD25

De tre indre båndene merket b, c og d av pLD25 viser homologi med stykker med identisk størrelse av total Y. lipolytica DNA. To tilleggsbånd, som er svakere (merket 1 og 2) i Y. lipolytica-feltet har sannsynligvis homologi med de små Y. lipolytica-delene av plasmidbånd a og e. Feltet merket "STD" inneholder lambda-Hinlll-størrelses-standarder. Feltet merket "P" inneholder ca. 2 ng av EcoRI,fordøyd pLD25. Feltet merket "Yl" inneholder ca. 1 mikrogram av total Y. lipolytica DNA. I et lignende Southern-eksperiment som brukte pBR322 som prøve, hybridiserte bare bånd a og e fra pLD25.

Figur 3.

Restriksionskart for pLD25

Et delvis restriksjonskart basert på enkle og noen dobbelte restriksjons-fordøyinger er vist. Seter som står i klamme, er ikke blitt ordnet i forhold til hverandre. Størrelsene er tilnærmelser basert på agarose-gelobservasjoner, og er antydet ved den relative distanse langs sirkelen, som har en omkrets lik 11 kb. Den tynne linjen representerer pBR322 DNA (i standardformatet med EcoRI sete på kl. 12) og den tykke linjen representerer innført DNA fra Y. lipolytica. Den innførte del har 3 EcoRV, 8 Aval (bare én er avmerket), 1 SphI, 1 Kpnl, 2 Sali, 4 EcoRI, 2 Xhol og 2 nærliggende Bglll-seter. Den innfelte del mangler Hindlll-, Clal-, BamHI- og Nrul-sete. En 2,3 kb-subklon med EcoRI-ender, merket leu2, er funksjonell i E. coli i bare én orientering i EcoRI-sete i pBR322.

Figur 4.

Southern- hybridiserinq av HindIII- fordøyd bulk DNA fra

Y. lipolytica transformanter med radioaktiv pBR3 2 2 prøve

Hindlll-fordøyinger av total DNA isolert fra fire forskjellige transformanter og opphavsstammen ble kjørt på én agarosegel, avtrykket og prøvet med merket pBR322. Y. lipolytica transformant # 6 ble vilkårlig valgt fra en kultur transformert med intakt, sirkulær pLD25. Transformantene 11, 12 og 15 var fra en kultur transformert med Kpnl-lineærisert pLD25. Alle Y. Lipolytica-transformanter ga to hybridiseringsbånd, et sterkere (1) på større enn 23 kb lengde og et svakere (2) samme større som 9,3 kb lambda-Hindlll-standarden. Feltet merket PC inneholdet opphavs (PC30827; ATCC 20688) DNA uten signifikant hybridisering med prøven.

Figur 5.

Restriksions- fordøyinqer av PLD23 og pLD24

Denne agarosedel inneholder lambda-Hindlll størrelsesstandarder i det ytre-venstre felt, og a) EcoRI, b) BamHI, c) ingen enzym-behandlinger av pLD23 (komplementerer E. coli hisG-mutanter) og pLD24 (kompiementerer ikke), henholdsvis. Hvert felt b inneholder to nærtliggende BamHI-bånd: det største tilsvarer pBR322 og det litt mindre båndet (ca. 4 kb) representerer den Y. lipolytica BamHI innfelte del. EcoRI-fordøyingene viser at Y. lipolytica-stykket er i motsatte orienteringer i de to plasmider.

Figur 6.

Restriksnonskart for pLD28

I tillegg til et 5,3 kb Y. lipolytica Sali stykke som inneholder LEU2-området, inneholder dette plasmid et 2,2 kb EcoRI-stykke med utgangspunkt for replikering fra to-mikron-gjærplasmidet og et 1,1 kb Hindlll-stykke med S. cerevisiae URA 3-genet innfelt på de tilsvarende seter i pBR322.

Figur 7.

Restriksjonskart for pLD4 0

Restriksjons-sete-forkortelsene er som på de foregående figurer. I tillegg er setene for Ncol, Apal og BstXI blitt avtegnet. Det Y. lipolytica LEU2-inneholdende segment er mellom 2,3 og 2,4 kb langt og ble innført i EcoRI-setet i pBR322. Restriksjonssetet i pBR322 er ikke vist.

Figur 8.

Restriksjons- fordøyinger fra pLD55 sammenlignet med pLD40

Feltene av denne gel (i tillegg til lambda-Hindlll-størrelses-standardene) er a) ufordøyd pLD40, b) Apal-fordøyd pLD40, c) EcoRI-fordøyd pLD40, d) EcoRI-fordøyd pLD55, e) Apal-fordøyd pLD55 og f) ufordøyd pLD55. Disse fordøyinger indikerer at.det klonete URA3-inneholdende område har to EcoRI-seter og er ca. 4 kb langt.

Plasmidene

Plasmid pLD25 inneholder selekterbare genetiske markører, dvs. et ampicillin-resistens-gen (for anvendelse i E. coli) og LEU2, (funksjonelt i E. coli og Y. lipolytica), og er dannet fra det E. coli-replikerende plasmid pBR322, et multikopiplasmid. Det ble dannet ved å innføre i BamHI-setet i pBR322, et ca. 6,6 kb fragment fått ved en delvis fordøying av Y. lipolytica-kromosomal DNA med Sau3A. Plasmid pLD28, en subklone av pLD25, inneholder også selekterbare genetiske markører for E. coli og Y. lipolytica, og også for S. cerevisiae og er dannet fra YEp24. Det ble dannet ved innføring av det ca. 5,3 kb Sall-fragment som inneholder Y. lipolytica LEU2-genet på Sall-setet i Yep24.

Plasmid pLD40,, også en subklone av pLD25, ble dannet ved innføring av 2,3 eller 2,4 kb EcoRI delvis fordøyd fragment fra pLD25 på EcoRI-setet i pBR322.

Mikroorganismene

Mikroorganismene som ble anvendt, var en stamme av E. coli

og en stamme av Y. lipolytica, disse stammer er identifisert i kulturbiblioteket til Pfizer Inc. som E. coli JC-355 (Clark et al., Molec. Gen. Genet. 105. 1 (1969) fått som stamme 869 fra E. coli Genetic Stock Center, Yale University, og Y. lipolytica PC-3 0827, henholdsvis. Nevnte Y. lipolytica er emnet for US-søknad Serial nr. 539 363 av J. R. DeZeeuw, inngitt 6. oktober 1983. En videre mikroorganisme, E. coli MC1061, anvendt i produksjonen av et gen-bibliotek av Y. lipolytica i vektor pBR322 er beskrevet av Casadaban et al., J. Mol. Biol. 138, 179-207

(1980). Den er spesielt anvendbar til dette formål på grunn av dens evne til å oppnå høy frekvens av transformering. Andre mikroorganismer kan brukes istedenfor nevnte E. coli MC1061. Representative for passende mikroorganismer er stammer av E. coli som er restriksjons-minus, slik som E. coli HB101 (NRRLB-11371), som også kan fåes som ATCC 33694, og som kan gjøres kompetente for transformering.

En stamme av E. coli som mangler leucin og uracil-

gener (DB 6507, ATCC 35673 en Tn5 innføringsmutant av HB101, fra D. Botstein) er leuB pyrF74::Tn5 hsdR~M~ og krever også prolin.

De følgende mikroorganismer er blitt deponert i, og er tilgjengelige fra, det permanente biblioteket av American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, USA:

De er blitt deponert under betegnelsene av Budapest-konvensjonen i American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, en anerkjent deponerings-institusjon som gir varighet av depotene og lett adgang til dem av almenheten hvis et patent er bevilget på denne ansøkning.

Det taksonomiske studium av Y. lipolytica ATCC 20688 ble utført av Dr. L. H. Huang, som ga beskrivelsen gitt nedenfor.

De anvendte media og metoder er de anbefalt av J. Lodder i

"The Yeasts", annen utgave, N. Holland Publishing Co., Amsterdam, 1970.

CBS 599, kulturtypen for artene Candida lipolytica [også kjent som Saccharomycopsis lipolytica; nå klassifisert som Yarrowia lipolytica (Wickerham et al.) av van der Walt og

von Arx, Antonie van Leeuwenhoeck 46, 517-521, 1980], ble kjørt til sammenligning.

Siden stamme PC-30827 trenger leucin og uracil (J. R. DeZeeuw) ble både leucinetylester og uracil i konsentrasjoner på 149 mg/l og 20 mg/l, henholdsvis, tilsatt til de følgende definerte medier: Basal-medium for assimilering av karbonforbindelser, buljong for assimilering av kaliumnitrat, vitaminfri buljong for vekst og buljong for å teste virkningen av vitaminer på vekststimulering. Leucinetylester som sammenlignet med leucin, ble langsomt anvendt som en karbonkilde. De andre medier var organiske i natur og burde understøtte veksten uten tilsetninger. I stamme CBS-599 ble de ovenfor nevnte definerte medier med og uten tilsetninger også brukt.

Som vist i beskrivelsene som følger, hadde kulturene de fleste av de kulturelle og morfologiske karakteristika til felles. Noen få forskjeller ble lagt merke til. For eksempel var strek-kulturene av stamme CNS-599 på glukose-gjærekstrakt-peptonagar lett ruglet eller lett rynket, den til stamme PC-3 0827 fint rynket. Stamme PC-3 0827 viste dårlig vekst på maismelagar og produserte mindre ekte mycelium sammenlignet med stamme CBS-599.

I stamme CBS-599 var resultatene hvor de definerte medier

var tilsatt leucinetylester og uracil de samme som de uten tilsetninger med unntak av at sitronsyre ble anvendt uten tilsetninger, men ikke i medium med tilsetninger. Dette indikerer at tilsetningene ikke ble brukt hverken som karbon- eller nitrogen-kilder; således er deres tilsetning til de definerte medier for art PC-30827 akseptabel.

Sammenlignet med stamme CBS-599, viste stamme PC-30827 ingen til svak heller enn god vekst på ravsyre, D-glucitol og glycerol; ingen heller enn svak vekst på vitaminfritt medium og salicin; ingen til svak heller enn god vekst på thiamin for vekststimulering. Stamme PC-30827 vokste ikke på L-sorbose, mens det motsatte var sant for stamme CBS-599.

De mange forskjeller i biokjemiske tester mellom stamme PC-30827 og CBS-55 var kvantitativ i natur. Mutantstamme PC-30827 hadde de fleste av de biokjemiske tester til felles med typekultur CBS-599. Når resultatene ble brukt i en nøkkel til arter av Candida foreslått av van Uden og Buckley i The Yeasts, utg. J. Lodder, 1970, ble hver av de to stammer plassert som Candida lipolytica - den ufullkomne tilstand av Yarrowia lipolytica.

Stamme CBS- 5 99

Vekst på glukose- gjærekstrakt- pepton- vann:

Etter 3 dager ved 28°C er cellene ovoide, forlenget ovoide til forlengete med 1 til 3 knopper. De ovoide celler måler 5-16 x 3-7 pm; de forlengete celler måler opp til 30 pm lengde. Pseudomycelium til stede; et pellikulum til stede; sediment.

Vekst på glukose- gjærekstrakt- pepton- agar:

Etter 1 måned ved 28°C er kulturen fløtefarvet, hevet, lett ru eller lett rynket, med en matt eller fuktig overflate.

Dalmau- platekulturer på maismel- agar:

Vekst moderat, off-white. Pseudomycelium og ekte, septat mycelium er til stede. Enkle, parrete eller tre ovoide blastosporer er dannet terminalt eller lateralt på hyfene eller pleudofysene, noen ganger på en verticil måte.

Fermentering: Negativ på glukose, galaktose, sukrose, maltose, trehalose og laktose.

Assimilering av karbonforbindelser: Basalmedium (basal-medium pluss leucinetylester og uracil)

Assimilering av kaliumnitrat (med eller uten leucinetylester og uracil): Negativ.

Vekst i vitaminfritt medium (med eller uten leucinetylester og uracil): Svak vekst.

Vitamin- stimulerende vekst: \T.iamin i buljonger med eller uten leucinetylester og uracil stimulerer vekst.

Natriumklorid- toleranse; 11%-12%.

Maksimum veksttemperatur; Mellom 37 og 45°C.

Vekst i glukose- gjærekstrakt- peptonvann;

Etter 3 dager ved 28°C er cellene ovoide, forlengete ovoide, forlengete, sjelden elliptiske, med 1 til 3 knopper. De ovoide celler måler 5-14 x 3-6 nm; de forlengete celler måler opp til 25 nm lengde. Pseudomycelium til stede, et pellikulum til stede; sediment.

Vekst på glukose- gjærekstrakt- peptonagar;

Etter 1 måned ved 28°C er strek-kulturen fløtefarvet, hevet, svakt rynket, med en matt overflate.

Dalmau- platekulturer på maismelagar:

Vekst dårlig, off-white. Pseudomycelium er til stede, spar-somt og kort. Ekte, septat mycelium er sjelden til stede. Enkle eller parrete ovoider til kuleformete blastosporer er dannet terminalt eller lateralt, noen ganger i grupper.

Fermentering; Negativ på glukose, galaktose, sukrose, maltose, trehalose og laktose.

Assimilering av karbonforbindelser; (basalmedium pluss leucinetylester og uracil)

Assimilering av kaliumnitrat (pluss leucinetylester og ureacil): Negativ.

Vekst i vitaminfritt medium (pluss leucinetylester og urac.i 1) : Negativ.

Vitamin- stimulerende vekst: Tiamin i buljong med leucinetylester og uracil stimulerer svak eller ingen vekst.

Natriumklorid- toleranse: 11%-12%.

Maksimum veksttemperatur: Mellom 37 og 45°C.

Y. lipolytica PC-30827 inneholder den sjeldent reverterende mutasjon leu2-35. Y. lipolytica LEU2-genet koder for enzymet /3-isopropylmalat-dehydrogenase (EC1.1.85) og blir kodet for av leuB-genet i E. coli og LEU2-genet i S. cerevisiae.

Innfelling av pLD25 i hver av E. coli JC-355 og Y. lipolytica ATCC 20688 ga transformanter som inneholder pLD25 i E. coli JC-355 og i Y. lipolytica ATCC 20688, henholdsvis. De er identifisert i kulturbiblioteket til Pfizer Inc. som F.D.27534 og F.D.27533, henholdsvis. Hver av transformantene er blitt deponert i ATCC under adgangsbetingelser til disse som fremsatt ovenfor, og er blitt tildelt adgangsnummer ATCC 39464 og ATCC 20687, henholdsvis.

Kromosomal DNA fra Y. lipolytica stamme NRRL Y-1094, en villtype-stamme (dvs. en stamme vanligvis brukt av de som er dyktige på området for mikrobiologiske fremgangsmåter) ble oppnådd ved metoden til Hereford et al., Cell. 18, 1261-1271 (1979).

Den nye plasmid pLD2 5 av denne oppfinnelse ble dannet ved ligering av lineærisert pBR322 med en delvis Sau3A-fordøyelse av Y. Lipolytica kromosomal DNA ved hjelp av T4 ligase. pBR3 22 ble isolert ved sentrifugering i CaCl-ethidiumbromid-gradienter for å separere kovalente lukkete superspiral pBR322 fra bakterie DNA. pBR322 ble lineærisert ved spalting innen tetracyklin-resistens-genet (Tc<R>) ved fordøyelse med restriksjons-endonuklease BamHI som resulterte i et lineært fragment som har kohesive (klebrige) ender og etterlater ampicillin-resistens (Amp<R>) som det fenotypiske trekk. Gel-(agarose) elektroforese av vektoren viste at den virkelig var fri for bakterie-DNA. Det således produserte lineæriserte pBR322 blir så ønskelig behandlet med alkalisk fosfatase for å forhindre påfølgende selv-ligering; dvs. resirkularisering av dimer-dannelse av DNA-vektoren.

Den andre komponenten av pLD25 fåes ved å utsette kromosomalt DNA av Y. lipolytica stamme NRRL Y-1094, en villtype-stamme, for delvis fordøying med restriksjons-endonuklease Sau3A som danner nesten vilkårlige fragmenter med kohesive ender, komplementære til de fra BamHl-spaltingen av pBR322. DNA i området 4-10 kb, høstet fra agarosegeler ble renset ved hjelp av kjente fremgangsmåter før ligeringen med BamHI-kuttet, alkalisk fosfatase-behandlet vektor pBR322.

Størrelsen av DNA-fragmentene er ikke kritisk for fremgangsmåten i henhold til denne oppfinnelse. Det kritiske aspekt som angår nevnte DNA-fragmenter, er at de inneholder hele eller en tilstrekkelig del av den påvisbare markør, f.eks. LEU2-genet.

I tillegg må de inneholde kohesive ender komplementære til de som er dannet ved restriksjons-endonuklease-spaltning av E. coli-plasmidet, i dette tilfelle pBR322.

Vektor DNA og den delvis Sau3A-fordøying av Y. lipolytica kromosomal DNA blir lagret ved hjelp av T4-ligase i nærvær av adenosin-trifosfat (ATP) som kofaktor.

Ligeringsblandingen blir først transformert i E. coli MC 1061 (Casdaban et al., J. Mol. Biol. 138, 179-207, 1980), en stamme av E. coli som gir en veldig høy transformeringsfrekvens og er hsdR" HsdM<+>, og således gir et Y. lipolytica-genbibliotek i nevnte

E. coli. De totalt potensielt forskjellige ampicillin-resistente transformanter av E. coli MC 1061 ble dyrket sammen på ampicillin pluss L-agarplater og høstet. Den høstete kultur ble dyrket i 1 liter ampicillin-inneholdende medium. De blandete plasmider ble isolert ved hjelp av standard metodikk for å produsere et gen-bibliotek. En prøve av nevnte genbibliotek ble transformert inn i E. coli JC-355. Transformanter ble selektert på grunnlag av ampicillin-resistens. Disse transformanter ble så replika-platet på syntetisk medium som manglet leucin. Alternativt kunne trans-former ingsblandingen bli direkte platet ut på syntetisk medium som manglet leucin og inneholdt ampicillin. Flere transformanter valgt på denne måte var leucin-prototrofe. Plasmidet i nevnte transformanter blir isolert ved hjelp av standardmetoder og referert til som pLD25.

Plasmid-minipreparater laget fra de sjeldne leucin-prototrofe transformanter og analysert ved fordøyelse med Hindlll og Sali, er funnet å inneholde det forventede 3,7 kg fragment fra pBR322 og 2 store fragmenter som indikerer en størrelse på

det innfelte stykke på ca. 6,6 kb. I tillegg ble et lite fragment (fra Sall-setet i pBR322 til det nærere Sall-sete i den innfelte del (se fig. 3) funnet. Sammenligning av Southern-blot-hybridiseringer (Southern, J. Mol. Biol. 98, 503-517,

1975) av plasmid pLD25 med hybridise-ringer av EcoRI fordøyd kromosomal DNA av Y. lipolytica viste at de 3 fragmentene i det

indre av den klonete innfelte del var identiske i kromosomal DNA.

Transformanter av Y. lipolytica med intakt pLD25 og med Kpnl-kuttet pLD2 5 ble testet for å bestemme om de inneholdt integrert eller uavhengig replikerende pLD25 (det LEU2-inneholdende plasmid). Kromosomal DNA ble isolert fra de leucin-proto-trofe transformanter og opphavet Y. lipolytica ATCC 20688. DNA-prøvene ble spaltet med Hindlll, kjørt på 0,5% agarosegel og analysert ved hjelp av Southern-blot-teknikken ved å bruke radioaktiv pBR3 22 til å måle tilstedeværelse av plasmid pLD25 i prøvene. Ingen homologi mellom opphavsstammen Y. lipolytica og prøven ble observert. Siden det er ett Hindlll-sete i pLD25 (innen pBR322-segmentet), og ingen i Y. lipolytica-segmentet, ville et bånd på pLD25-størrelse (ca. 11 kb) sees hvis pLD25 replikerte uavhengig i transformantene. Fravær av et slikt bånd fører til den konklusjon at alle transformantene med intakt pLD25 eller Kpnl-kuttet pLD25 resulterte i integrering av hel pLD25, inklusive Y. lipolytica-sekvenser. Sirkulære, lineæriserte og åpne-lineæriserte plasmider kan transformere Y. lipolytica ved rekombinering med homologe kromosomale sekvenser. Imidlertid var transformant-frekvensen mye høyere i de Kpnl-kuttete plasmid-behandlede celler enn i de intakte plasmid-behandlete celler, som videre indikerer at integrerende transformering som beskrevet av Orr-Weaver et al. for S. cerevisiae (Proe. Nati. Acad. Sei., 78, 6354-6358, 1981) forekom i Y. lipolytica også. Southern-blot nevnt ovenfor viser at strukturen av de integrerte transformanter fått fra lineære molekyler, oppfører seg identisk med strukturen av transformanter fått fra sirkulære molekyler (dv. plasmider). Videre Southern-blot-forsøk har vist at noen av de sjeldne transformantene som resulterer fra intakt-plasmidbehandlinger, mangler pBR322-hybridiserbart materiale og sannsynligvis ble dannet fra gen-konversjon eller dobbel-rekombinasjonstilfeller.

Anvendbarheten av det her beskrevne transformeringssystem er demonstrert i skytteloverføringen av de integrerte plasmider beskrevet i nevnte transformeringssystem fra Y. lipolytica til E. coli for å fullføre cyklus. Videre muliggjør de integrerende skyttelvektorer kloning av ønskete Y. lipolytica-gener ved dannelse av genbibliotek fulgt av seleksjon eller utvelging av en Y. lipolytica-resipient.

EKSPERIMENTELT

Materialer og metoder:

Alle enzymer ble brukt i samsvar med betingelsene for deres anvendelse beskrevet av de respektive forhandlere. Den bakterielle alkaliske fosfatase, Kpnl, ble brukt ved ca. 100 enheter pr. mikrogram av lineærisert plasmid DNA ved 65 °C i BamHI assay-buffer i to timer. Restriksjons-fordøyinger ble analysert ved elektro-forese i nedsenkete 0,8% agarosegeler som brukte Tris-Borat-EDTA-buffer (Maniatis et al., "Molecular Cloning", Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y. 1982).

Medier:

E. coli-rikt medium var L-buljong inneholdende, pr. liter,

10 g Bacto-trypton, 5 g Bacto-gjærekstrakt og 5 g NaCl, justert til pH 7,5. E. coli minimal-medium var 56 salter med 0,33% dekstrose (Low, J. Bacteriol. 113, 798-812 (1973). Aminosyrer eller baser ble tilsatt til 50 /Ltg/ml hvor det trengtes. Bakterier ble dyrket ved 37°C.

Gjær-rikt medium var YPD, som innehold 1% Bacto-gjær-ekstrakt, 2% Bacto-pepton og 2% dekstrose. Gjær-minimalmedium, SD, inneholdt 0,67% Bacto-gjærnitrogenbase uten aminosyrer og 2% dekstrose. Syntetisk komplett medium inneholdt 870 mg/l av pulveriserte stam-tilsetninger laget ved å gni det følgende sammen i en morter og knuse: 2 g av hver av adeninsulfat, uracil, tryptofan, histidin-HC1, arginin-HCl og metionin. 3 g tyrosin, 6 g leucin, 5 g fenyl-alanin, 20 g threonin, 3 g lysin. For næringsmiddeltesting eller seleksjon ble den passende ingrediens utelatt av komplett medium. Y. lipolytica ble dyrket ved 28°C.

Isolering av Y. lipolytica- kromosomal DNA:

a. Klonin<g>skvalitet DNA. Villtypestamme NRRL Y-1094 ble dyrket ved 28°C til 1-2 x IO<8> celler pr. ml i 4 x 300 ml YPD i rystende Fernbach-kolbe, etter inokulering med 15 mikroliter fra en frisk stasjonærfasekultur. Alle av de følgende behandlinger av cellene ble utført ved 28°C eller romtemperatur. Cellene ble høstet ved sentrifugering, vasket i 50 ml IM NaCl, og sentrifugert ned igjen.

Så ble en 15 minutters "pre-sfæro-plasterende11 inkubering i 50 ml 0,2M tris (hydroksymetyl)-aminometan-HCl (Tris-HCl) pH 8,5, 0,02M etylendiamintetraeddikdyre (EDTA), IM NaCl og 0,1M 2-merkaptoetanol fulgt av høsting ved sentrifugering. Cellepelleten ble resuspendert i 40 ml IM NaCl som inneholdt 1 mg/ml Zymolyase 5000 og inkubert i 4 5 minutter. På dette tidspunkt var mer enn 90% av cellene omdannet til sfæroplaster som påvist mikroskopisk ved cellelysis etter fortynning i vann.

Sfæroplastene ble sentrifugert ned og resuspendert i 4 tuber i en total mengde på 16 ml IM NaCl. 40 ml lysisbuffer [50 mM Tris pH 6,8, 100 mM NaCl, 100 mM EDTA, 0,5% natriumdodecylsulfat (SDS)] som inneholdt 0,1 mg/ml proteinase K, ble tilsatt, og lysatet inkubert ved 37°C i 1,5 timer. Lysatet ble ekstrahert med et likt volum fenol:kloroform (1:1). Etterfulgt av sentrifugering med 900 rpm for å separere fasene ble den vandige fase igjen ekstrahert med fenol/kloroform. Den endelige vandige fase ble kombinert med to volumer av etanol for å produsere store presipitater av DNA. Væsken ble helt av og pelleten renset med 70% og 100% etanol før vakuumtørking. Den tørkede pellet ble gjenoppløst i 8 ml TE (10 mM Tris-HCl pH 8, 1 mM EDTA) ved 65°C fulgt av RNAse-fordøying med 300 mikroliter RNAse A (1 mg/ml, kokt i 5 minutter) i 1 time ved 37°C. Materialet ble ekstrahert to ganger med fenol/kloroform, og etanol presipitert som før. Slutt-presipitatet ble renset med eter før vakuumtørking.

DNA-pelleten ble gjenløst i TE som før og 2 ml 100 x TE ble tilsatt etterfulgt av vann til 29,04 g. Løsningen ble tilsatt til 37,67 g CsCl, overført til sentrifugerør og sentrifugert i 17 timer ved 40 000 rpm ved 15°CX i en Beckman L8-70 ultra-sentrifuge som brukte en VTi 50 rotor. Grandienten ble høstet ved å dryppe fraksjoner som inneholdt ca, 1,25 ml fra bunnen av røret etter å ha punktert med en nål. Fraksjonene ble undersøkt for DNA ved å kjøre prøve på en agarosegel som inneholdt 0,5 /ig/ml ethidium-bromid, og fraksjoner 16, 17 og 18 (av 26) ble bevart. Disse DNA-inneholdende fraksjoner ble ført sammen, dialysert mot fire forandringer av 1 x TE og presipiterte etanol. DNA ble gjenløst i 0,6 ml 1 x TE, og preparatet ble estimert ved absorbans ved 2 60 nm, til å inneholde 129 mikrogram DNA.

b. DNA for Southern- blot. Vi fant at SDS-sfæroplastlysis og kaliumacetatbehandling fra S. cerevisiae mini-prepmetoden (kompilert i Sherman et al., "Methods in Yeast Genetics",

Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y., 1981) var passende for å få

Y. lipolytica DNA.

Fremstilling av <p>lasmid DNA. Bakteriell plasmid DNA ble fremstilt ved hurtig-kokemetoden til Holmes et al., Anal. Biochem. 114, 193-197 (1981). Etterfølgende sentrifugering i CsCl-ethidiumbromid-gradienter ble utført bare for fremstilling i store mengder. DNA-preparatet ble lagret ved 4°C i steril TE-buffer.

E. coli- transformering. CaCl2-metoden av Dagert et al.,

Gene 6, 23-28 (1979) ble anvendt. Både over natten CaCl2-behandlete og korttids-behandlete celler ble brukt i transformeringene.

Generell forklaring av Southern- blot- forsøk. DNA overført til nitrocellulose (Southern 1975) ble hybidisert til <32>p-merkete "nikk-translaterte" prøver i 6 x SCP buffer (20 x SCP-stamme inneholder 2,0 M NaCl, 0,6 M Na2HP04 og 0,2 M EDTA pH 6,2),

1% sacrosyl, med 4 0 /Ltg/ml denaturert kalvethymus eller E. coli DNA. "Nikk"-translasjonsmetoden til Maniatis et al. (loe.eit.) ble brukt med E. coli polymerase I.

Fremstillin<g> av Sau3A delvis fordøyelser av Y. lipolytica DNA. Ca. 15 /xg av dette DNA ble delvis fordøyet med restriksjonsenzym Sau3A i hvert av fire rør ved å bruke 0,05, 0,1, 0,2 og 0,4 enzymenheter pr. \ iq DNA i 0,5 time ved 37 °C idet man fulgte forhand-lerens protokoll. Reaksjonene ble stoppet ved oppvarming ved 65"C i 10 minutter, så helt på 0,8% forbedredende agarosegeler. DNA i størrelsesområde på 4-10 kilobaser (sammenlignet med HindiII-kuttet lambda-størrelsemarkører) ble høstet fra gelene, elektro-eluert, renset på DE52 kolonner (Yang et al., Methods in Enzymology, 68, 176, 1979) og etanolpresipitert før ligering med BamHI-kuttet, alkalisk fosfatase-behandlet, vektor pBR322.

Dannelse av et genbibliotek av Y. lipolytica i vektor pBR322. Ligeringsblandingen som inneholdt ca. 1 fig DNA, ble brukt til å overføre E. coli-stamme MC1061 (Casadaban et el., J. Mol. Biol.

138, 178-207, 1980) til å danne et Y. lipolytica-genbibliotek. Transformeringsblandingen ga ca. 1,4 x IO<4> kolonier på 10 mg/ml ampicillin pluss L agarplater. 50 kolonier ble plassert på en enkelt plate, og replika-platet for å teste resistens mot 5 mg/ml tetra-cyklin. 44 (88%) var sensitive, hvilket indikerer at de mest sannsynlig inneholdt en innfelt del i BamHI-setet til å avbryte tet<R->genet av pBR322. Mini-skala-plasmidpreparater fra 18 vilkårlig valgte amp<R->kolonier ble undersøkt ved restriksjons-enzym-fordøying med Hindlll og Sali dobbelt-fordøyinger og BamHI-fordøyinger.

10 av plasmidene hadde innfelte stykker, på et gjennomsnitt på ca.

7 kilobaser i størrelse.

48 ampicillinplater som inneholdt ca. 1,4 x IO<4> E. coli trans-formantkolonner, ble replika-platet på LB pluss 10 /zg/ml ampicillin. Replikaene ble vasket med 5 ml 0,85% NaCl hver. De samlete cellene ble pelletisert ved sentrifugering av resuspendert i 11 ml LB og 2,5 ml 80% glycerol. To kulturer med 1 liter LB og 10 ug/ ml ampicillin i Fernbach-kolber ble satt opp med 4 ml av de samlete bakterier hver, og de gjenværende bakterier ble lagret ved -70°C. Kulturene ble anvendt til å fremstille det plasmid-DNA som var utvalgt som vårt Y. lipolytica-genbibliotek av Sau3A delvis for-døyete fragmenter i pBR322.

Selekterinq av qenbiblioteket i E. coli- mutanter.

Flere E. coli-stammer som var mutanter for forskjellige genetiske markører, ble transformert med gen-biblioteket. For å få genetisk komplementering er to hovedfaktorer nødvendig: (1) det tilsvarende Y. lipolytica-gen må være inneholdt intakt i minst ett av plasmidene i biblioteket; og (2) Y. lipolytica-genet må virke i en tilstrekkelig utstrekning i E. coli-celler. Biblioteket ble selektert både ved direkte seleksjon for hver markør på det passende medium og også ved initial-seleksjon for ampicillin-resistens fulgt av replika-plating på selektivt medium. For hver genetiske markør som ble undersøkt, ble mindt IO<5> transformanter undersøkt. Stamme JC355 ble brukt til en vellykket kloning av LEU2-genet.

Alle E. coli-kolonier som vokste på selektivt medium, ble videre undersøkt ved en "re-transformerings"-test. Til denne testen ble plasmid fremstilt fra en 5 ml kultur av stammen som grodde på selektivt medium. Plasmid mini-prep ble så brukt til å transformere den opphavsmutant E. coli stammen. Tilstedeværelse av mange ampicillin-resistente transformanter, men få eller ingen kolonier på selektivt medium, førte til konklusjonen at den opprinnelige kolonien ikke inneholdt det ønskede Y. lipolytica-genet og mest sannsynlig vokste på grunn av mutering til prototrofi. Hvis alle de ampicillin-resistente kolonier også vokste på selektivt medium for genet som ble testet, ble det konkludert at plasmidet fått fra den opprinnelige kolonien, inneholdt et innfelt stykke som komplementerte E. coli-mutasjonen. En total mengde på 7 leucin-uavhengige transformanter av JC3 55 (leuB6) som inneholdt den identiske innfelte del i pBR322 ble funnet. Plasmid mini-preparater fra to av disse kolonier ga 100% (37/37 og 31/31) ampicillin-resistente leucin-prototrofe transformanter i retransformeringstesten. Plasmidet ble betegnet pLD25.

Verifisering av at E. coli leuB6- komplementerende DNA kom fra Y. lipolytica. (Probe: radiomerket pLD25). For å verifisere at den innførte DNA fra pLD25 kom fra Y. lipolytica ble et Southern (1975)-blot-eksperiment utført. En ny fremstilling av Y. lipolytica total DNA ble utført, idet man unngikk det siste CsCl-gradientskritt. EcoRI-fordøyingsmønsteret av Y. lipolytica DNA åpenbarte identitet med tre bånd internt til den innfelte del i pLD25 (fig. 2).

Videre karakterisering av den innfelte del i pLD25.

Et delvis restriksjonskart av pLD25 ble utarbeidet ved å bruke flere felles enzymer (fig. 3). Den totale mengde av Y. lipolytica DNA inneholdt i plasmidet, ble estimert ved ca. 6,6 kb.

Transformerin<g>sprotokoll. En modifisering av lithium-acetat-metoden (Ito et al., J. Bacteriol. 153. 163-168, 1983) med den soniserte bærer DNA-tilsetning brukt til S. cerevisiae-transformering, ble tilpasset til Y. lipolytica-transformering (som forklart nedenfor). Sene log fasekulturer 3-10 x IO<7> celler/ml ga vanligvis flere transformanter enn log fase (1 x IO<7> celler/ml) kulturer. 50 ml YPD kulturer ble pelletert og så resuspendert i 10 ml 10 mM Tris, 1 mM EDTA pH 7,5. De ble repelletert og resuspendert i 2-3 volumer av bufferen nevnt ovenfor pluss 0,1 M litium-acetat ' og blandet forsiktig på en New Brunswick roter-trommel ved 28°C i 1 time. De Li-behandledte cellene ble separert i multiple trans-formeringsrør som inneholdt mellom 0,1 og 1,0 ml celler, 1 ug transformerende plasmid og 50 /ug sonisert heterolog bærer DNA (størrelses-området viste seg å være 0,5-9 kg på en agarose-gel). Transforme-ringsrørene ble satt bort ved 28°C i 30 minutter, og så ble 7 volumer av PEG-reagens (40% polyetylenglykol 4000, 0,1 M LiAc, 10 mM Tris, 1 mM EDTA pH 7,5 - filter sterilisert) tilsatt. Etter enda 1 time ved 28°C ble varmepulsering (vanligvis 37°C i 5 minutter) anvendt. Cellene ble til slutt sentrifugert ned ved 3000 rpm i 2 minutter, resuspendert i vann og platet ut på passende medium.

Dannelse av pLD28:

En blanding av 2 /xg av hver av pLD25 og YEp24 (ATCC 37051) ble inkubert ved 37°C med 6,25 enheter av Sali i 50 /il av Sall-buffer i 1,5 timer. Det fordøyde DNA ble så ekstrahert med et likt volum fenol fulgt av tre ekstraheringer med eter (1,5 ml). DNA ble presipitert ved tilsetning av tilstrekkelig mengde natriumklorid og absolutt etanol til å gi 0,IM natriumklorid og 70% etanolkonsentra-sjon. DNA ble fjernet og løst i et likt volum av TE-buffer. 10 /il DNA løsning ble så behandlet med T4-DNA-ligase i 20 /il reaksjons-volum i 1 time ved 14°C. Seleksjon for det ønskede rekombinant-plasmid ble utført ved å transformere E. coli DB 6507, som forklart i det følgende. Transformeringsblandingen ble platet ut på 11

E. coli syntetiske mediumplater som inneholdt threonin, prolin og leucin, men manglet uracil. Mer enn 100 kolonier pr. plate ble oppnådd. De resulterende transformanter ble replikaplatet på leucin-manglende plater for å teste dem for nærvær av Y. lipolytica LEU2-genet på hvert plasmid. De kolonier som vokste langsomt uten tilsatt leucin, ble strøket ut for enkle kolonier på ampicillinplater og testet for tetracyklin-sensitivitet. 24 kolonier som var ampicillin-resistente, tetracyklin-sensitive, ble anvent til mini-plasmidpreparater. Plasmid DNA preparater ble analysert ved Sall-fordøying for de to forventede bånd (7,5 kb fra YEp24 og 5,3 kb fra LEU2) og ved hjelp av EcoRI-fordøying for de 5 forventede bånd

(fig. 6). To plasmider hadde det passende mønster. Det første plasmid ble spart og angitt som pLD28.

Dannelse av pLD4O/ plasmid

som har et mindre segment av LEU2- genet enn både pLD25 og pLD28.

En delvis EcoRI fordøying av pLD25 ble utført ved å behandle ca. 25 /xg av pLD25 med 20 enheter restriksjonsenzym i 2 00 yl og ved å fjerne alikvote mengde ved 9, 12, 15, 18 og 21 minutter. På hvert tidspunkt ble 2 0% av det totale volum plassert i gel-prøvebuffer som inneholdt 3 3 mM EDTA (etter fortynning) for å stoppe reaksjonen. Tidspunktene ble kjørt på en gel, og det ønskede bånd (som vandret svakt langsommere enn 2,3 kb lambda Hindlll størrelses-standarden) ble skåret bort med et barberblad. Båndet ble elektroeluert i en dialysevæske og renset på en mini-kolonne (Schleicher og Schuell Elutip-D), som angitt av leverandøren. Vektoren som ble brukt til å klone det LEU2-inneholdende bånd, var EcoRI-fordøyd, bakteriell, alkalisk fosfatase-behandlet pBR322. Vektoren og innført DNA ble ført sammen med T4 DNA-ligase og den resulterende blandingen brukt til å transformere E. coli MC1061 til ampicillinresistens. Plasmid-mini-preparater ble undersøkt ved fordøying med EcoRI restriksjons-endonuklease. Fire av de 34 første preparater inneholdt den ønskede innfelte del. For å teste orienteringen av de innfelte deler i hvert plasmid ble doble Hindlll og Xhol fordøyinger gjort. Tre hadde orienteringen til pLD4 0 (fig. 7), og én den motsatte orientering. Den ble gitt navnet pLD41. Disse to plasmider ble transformert inn i E. coli JC3 55 (etter at fremstillinger i store mengder ble gjort i MC1061) for å teste for fremstillingen av Y. lipolytica LEU2-genet. Overraskende ga transformanten som inneholdt pLD40 utmerket vekst på medier som manglet leucin (bedre enn transformanter som inneholdt pLD25 eller pLD28), men transformanten som inneholdt pLD41 vokste ikke uten tilsatt leucin. Bakterielt komplett medium til dette eksperiment besto av 56/2 pluss vitamin Bl, glukose, histidin, arginin, metionin, leucvin og 2 0 mikrogram/ml ampicillin. Det ble konkludert at transkripsjon av LEU2-genet i pLD40 ble fremmet av den i mot klokken gående promoter Pl beskrevet av D. Stuber og H. Bujard (1981), Proe. Nati. Acad. Sei., 78:167-171). Det er mulig at det lave nivå av bakteriell fremstilling av Y. lipolytica LEU2-genet i pLD2 5 og pLD28 (sammenlignet med pLD4 0) resulteres fra et segment av Y. lipolytica DNA som virker som en svak bakteriepromoter.

Transformering av en Y. lipolytica leu2- mutant med pLD25

Y. lipolytica stamme PC-30827 (MATA leu2-35 ura3-ll) ATCC 20688 konstruert av J. R. DeZeeuw ble brukt som en resipient for LEU2-genet klonet i pLD25. Det ble funnet at kulturer i sene stadier av vekst ga flere transformanter enn de tidligere log-faseceller. Dette funn var riktig selv når tilnærmelsesvis like nummer av tidlig versus sene log-faseceller ble behandlet med DNA og platet på leucin-manglende plater. Plasmider som var blitt lineærisert enten ved et kutt ved et unikt restriksjons-sete eller ved å etterlate en liten åpning (Bglll-kutt i Y. lipolytica DNA ga mange flere transformanter enn intakt pLD25 eller plasmid lineærisert ved å kutte av ved Hindlll-restriksjons-setet i pBR322. Disse sistnevnte resultater er de samme som det integrerende transformeringssystem i S.cervisiae utviklet av Orr-Weaver et al., loe.eit. Tilsetningen av sonisert E. coli DNA til pLD25 brukt i transformering ga flere transformanter enn når enten stor molekylvekt eller ingen bærer-DNA ble tilsatt. Små variasjoner i varigheten og temperaturen av varmesjokket som etterfulgte inkubering av celler med DNA og polyetylenglykol viser seg bare å ha liten virkning på utbyttet av transformanter.

Stabilitet av transformantene. En koloni av transformanten som inneholdt pLD25 i Y. lipolytica ATCC 20687, her betegnet som DL10, ble strøket ut på en YPD-plate for enkle kolonier etterfulgt av ikke-selektiv vekst på en YPD-plate. Den resulterende YPD-kulturplate ble replikert på leucin-manglende syntetisk medium. Alle de ca. 50 godt atskilte kolonier var leucin-uavhengige, hvilket viser stabilitet av transformantene.

Southern- blot for å påvise integrering av pLD25

Y. lipolytica-transformantene var stabile, og transformerings-frekvensen ble sterkt øket ved lineærisering av donorplasmid DNA. Dette indikerte at transformantene resulterte fra integrering av plasmidet i kromosomalt DNA ved seter homologe til endene av donor DNA som funnet i S. cerevisiae-systemet av Orr-Weaver et al., loe. eit. Et Southern-blot-eksperiment (fig. 4) av HindIII-fordøyinger av Y. lipolytica DNA viste de samme to båndene for homologi til pBR322 i transformanter som resulterer fra enten intakt eller lineærisert plasmid. Observasjonen av ett bånd var større enn den 23 kilobase lambda størrelsesstandard er bevis på integrering av plasmidet i kromosomalt DNA.

Kloning av Y. lipolytica HISl- gen

Konstruksjon av gen- bibliotek. Vektoren YEp24 (Botstein et al., Gene 8, 17.24, 1979) ble fordøyd med BamHI og behandlet med alkalisk fosfatase som beskrevet tidligere for pBR322. Det innfelte DNA anvendt i ligeringsreaksjonen var en fullstendig BamHI-fordøying av Y. lipolytica kromosomal DNA fått fra Y. lipolytica NRRL Y-1094 som beskrevet ovenfor. Den kromosomale DNA-fordøying var ikke størrelses-fraksjonert før ligering, bare fenolekstrahert. En total mengde på ca. 27 000 ampicillin-resistente transformant-kolonier av E. coli stamme MC 1061 ble oppnådd ved å bruke ligeringsproduktene. Plasmid-DNA fått fra kulturene av disse samlete transformant-kolonier ble betegnet som bibliotek av BamHI-fragmenter av Y. lipolytica i YEp24. Innføringsfrekvensen ble estimert som 95% (19/20 transformanter var tetracyklin-sensitive), og den gjennomsnittlige innførte størrelse var 4,2 kb.

Isolering av HISl- gen. BamHI-biblioteket ble brukt til å tranformere mange forskjellige E. coli auxotrofer i et forsøk på

å finne et Y. lipolytica-gen som ville komplementere et mutant E. coli-gen. To transformant-kolonier av E. coli hisGl-mutant AT2535 (fått som # 4517 E. coli Genetic Stock Center, Yale University) ble isolert på syntetisk medium som manglet histidin og inneholdt ampicillin. Begge kolonier inneholdt det samme plasmid pLD21, som bestod av en innfelt del på ca. 4 kb i vektoren. Retransformerings-testen var positiv med 419/419 ampicillin-resistente transformanter av AT2535 med pLD21 notert som histidin-uavhengige ved replika-plating. Et Southern-hybridiserings-eksperiment viste at den BamHI-innfelte del i pLD21 såvel som de to innfelte fragmentene dannet ved fordøying av DNA med BamHI og EcoRI, migrerte sammen med fragmentene av Y. lipolytica kromosomal DNA som hadde blitt kuttet på samme måte.

For å teste om andre alleler av hisG kunne bli komplemen-

tert av pLD21, ble E. coli stamme NK5526 (E. coli Genetic Stock Center # 6416) som inneholder en TnlO innfelt del i HISG-genet,

ble transformert med plasmidet. Alle ampillicin-resistente transformantkolonier var i stand til langsom vekst etter

replika-plating på medier uten histidin som ville forventet fra polariteteffekten av TnlO på nedstrøms-genene i histidin-operon. Direkte seleksjon for transformantene på definert medium som manglet histidin og inneholdt ampicillin, var ikke mulig, antageligvis på grunn av den sterke polariteteffekten. Siden Y. lipolytica DNA-innføringen i pLD21 var i stand til å komplementere hisG-mutasjoner i E. coli, konkluderte vi at den inneholdt Y. lipolytica HIsl-genet i en form som virket i E. coli.

Virkningen av orientering på ekspresjon. For å teste om den

Y. lipolytica DNA-innfelte del virket uavhengig av vektor YEp24, ble BamHI-stykket subklonet inn i pBR322. Innfelte deler i begge orienteringer ble bestemt ved hjelp av EcoRI-fordøyingsmønster (fig. 5)» Plasmid pLD23, plasmidet med EcoRI-sete av den innfelte del lenger fra EcoRI-sete av pBR322, komplementerte de to hisG

E. coli-mutanter anvendt tidligere, mens derimot pLD24, den andre orienteringen unnlot å komplementere mutasjonene. Således trengs en sekvens på plasmidet for effektiv fremstilling av Y. lipolytica HISl-genet i dette E. coli-systemet. Det er antatt at tet<R->promoteren av pBR322 er den nødvendige komponent.

Transformering med utvidete segmenter av kromosomal DNA.

Det ca. 5,3 eller 5,4 kb lange Sall-stykke av Y. lipolytica DNA som inneholder LEU2-genet (gel-renset fra en plasmid-fordøying) ble funnet å være i stand til å transformere Y. lipolytica leu2-mutant-resipienten til prototrofi ved en høy frekvens (større enn 1000 transformanter pr. /xg). Denne integreringsbegivenhet representerer en type rekombinasjon som er forskjellig fra transformering med et lineærisert plasmid. Den gir muligheten til innføring av en ønsket sekvens i et område av Y. lipolytica DNA og til integrering av den ønskede sekvens uten også å integrere den bakterielle vektor i verten. Det DNA som ble brukt var et Sall-fragment renset fra bakteriell vektor-DNA (se ovenfor). Denne type system er blitt utviklet i S. cerevisiae av R. Rothstein, Methods in Enzymology 101:202 (1983). Preparater av Y. lipolytica-kromosomal DNA, både høy molekylvekt og lett kuttet ble også brukt for å få LEU2-transformanter.

Kloning av URA3- genet

Det første skritt innbefattet dannelse av et gen-bibliotek av Sau3A delvis fordøyelse av Y. lipolytica DNA i BamHI-sete i pLD40 i henhold til fremgangsmåten beskrevet ovenfor for konstruksjon av et gen-bibliotek i pBR322.

For å få en høy frekvens av transformering og også for å inn-stille molekylene i biblioteket til å integrere i LEU2-locus, ble DNA-biblioteket fordøyd med enzymet Apal som lager et kutt i LEU2-området av opphavsvektor pLD40. (Siden det ikke var kjent om det ukjente URA3-genet selv inneholdt et Apal-sete, ble en delvis Apal-fordøying av en prølve av DNA-biblitoteket også utført for å for-sikre seg om at noen av de således produserte molekyler ville bli spaltet bare på et enkelt sete. Imidlertid var de delvise for-døyinger ikke nødvendige).

Transformering av en Y. lipolytica URA3- mutant med pLD40- bibliotek

En 50ml kultur av Y. lipolytica stamme PC 30827 (ATCC 20688), resipienten, i YPD-buljong ble dyrket til en OD ved 600 nm på 4,9. Dette tilsvarer et samlet volum på 0,9 ml av celler etter trinnet med vasking i pH 7,5 TE-buffer som i den ovenfor beskrevne transfor-meringsprotokoll. Cellene ble så suspendert i to ganger sitt volum av litiumacetat i TE, blandet forsiktig i en roter-trommel ved 30°C i 1 time og så fordelt på tre transformeringsrør. Hvert rør (15 ml Corning-polystyren-sentrifugerør) mottok 0,9 ml cellesuspensjon, 3 00 /ig (100 fil) av sonisert heterolog E. coli-bærer DNA og 6 /xg Apal-behandlet DNA-bibliotek. Transformeringsrørene ble inkubert ved 30°C i 3 0 minutter, og så blandet med 7 ml PEG-reagens (beskrevet ovenfor) og inkubert i 1 time til. Rørene ble så utsatt for et varmesjokk på 37°C i 10 minutter, hvoretter cellene ble sentrifugert ned ved 3000 rpm i 2 minutter. Cellene fra hvert rør ble resuspendert i 0,6 ml sterilt vann og platet ut på 12 plater med leucin-manglende syntetisk komplett medium.

Etter 3 dager vokste en total mengde på ca. 10 000 kolonier på det laucin-manglende medium. Den negative kontrollplaten som ble laget parallelt med transformerings-eksperimentet (ikke noe DNA ble brukt på disse celler som ellers ble behandlet identisk til de transformerte celler) inneholdt ingen voksende leucin-inneholdende kolonier.

manglende syntetisk media. Bare én koloni som var uracil-uavhengig ble funnet neste dag. Denne koloni ble videre behandlet for å oppdage URA3-genet som beskrevet nedenfor. Et annet transforme-ringseksperiment ble gjort for å bestemme om direkte seleksjon for uracil-uavhengighet heller enn en første seleksjon for celler som hadde mottatt et plasmid (dvs. leucin-uavhengighet) fulgt av seleksjon for det ønskede trekk, var mulig. Dette andre eksperiment var lik det første, men ga en høyere transformerings-frekvens på mellom 5000 og 10 000 tranformanter pr. mikrogram av transformerende DNA. Tre tilleggs-URA3-transformanter ble oppnådd i dette eksperiment ved direkte seleksjon på uracil-manglende medium og ett til ved leucin-seleksjon fulgt av screening.

Oppda<g>else av det URA3- inneholdende plasmid pLD55

En 50 ml YPD-kultur av den første uracil-uavhengige transformant ble dyrket over natten og høstet for DNA-fremstilling ved å bruke fenol-kloroform og protease-metoden som beskrevet tidligere. Ca. 3 ug (7%) av dette kromosomale DNA-preparat ble fullstendig fordøyd med enzymet Apal, fulgt av ekstraheringer med fenol, fenol/ kloroform og kloroform/isoamyl-alkohol og så etanol-presipitering. Dette DNA ble ligert med T4 DNA-ligase i et totalt volum på 80 fil.

10 fil fra denne reaksjon ble brukt til å transofrmere 100 fil av kompetent E. coli stamme MC1061 til ampicillin-resistens. E. coli mini-plasmidpreparater ble laget fra 9 transformanter og anvendt til restriksjonsanalyse. Alle 7 preparater som ga spaltbar DNA, inneholdt identiske restriksjonsmønstre med enzymene Apal og EcoRI

(fig. 8). 2 preparater som antageligvis ikke var rene nok til å tillate enzym-forhøyelse hadde identisk-migrerende superspiral-plasmider med de andre 7. Det oppdagete plasmid inneholdt de to EcoRI-bånd karakteristiske for den LEU2-innfelte del i pLD4 0 i tillegg til tre andre bånd. Med nøyaktigheten av den angitte gel (ca. 0,5 til 1 kb) manglet den URA3-inneholdende innfelte del i pLD40 et Apal-sete og inneholdt 2 EcoRI-seter.

For å verifisere at plasmidet virkelig inneholdt URA3-genet, gjorde man et retransformerings-forsøk. Mini-prep-Apal-fordøyingen ble brukt til å transformere Y. lipolytica-resipienten. En del av denne transformeringsblandingen ble platet ut på uracil-manglende medium og en del på leucin-manglende medium.

Plater med ca. 100 transformanter på hver type medium ble valgt til replika-plating på det andre mediet. Alle de leucin-selekterte kolonier var også uracil-uavhengige. Overraskende nok var bare ca. halvparten av de valgte koloniene på det uracil-manglende medium også leucin-uavhengig. Dette sistnevnte resultat kan forklares ved hjelp av noen hypoteser om degradering og reparering av den transformerende DNA i det målrettede område (som i Orr-Weaver et al., Methods in Enzymology 101:228 [1983]). Siden alle de leucin-uavhengige transformanter, dvs. transformanter som først var blitt dyrket på uracil, også var uracil-uavhengige, er det konkludert med at disse kompiementerte URA3-mutasjoner p.g.a. integrering i LEU2-området, og at plasmidet, betegnet pLD55, inneholdt URA3-genet av Y. lipolytica. Imidlertid var kun ca. halvparten av transformantene som først var blitt dyrket på leucin (dvs. de var uracil-uavhengige), også leucin-uavhengige.

Demonstrering av skvttel- overføring

DNA ble fremstilt fra Y. lipolytica-transformanten med pLD25 (ATCC 20687) ved hjelp av fenol-kloroform/proteasemetoden beskrevet ovenfor, men uten påfølgende anvendelse av cesiumklorid-gradienten.

Noen få mikrogram av det således isolerte DNA ble fordøyd med enzymet Kpnl (det samme enzymet som ble anvendt til å lage transformanten), fenolekstrahert, renset på en Schleicher- og Schuell-Elutip-D-minikolonne (idet man fulgte produsentens anvisninger) og så ligert ved å bruke T4 DNA-ligase. Ligeringer både ved middels (mer enn 50 /xg DNA pr. ml) og lave (mindre enn 10 /xg/ml) konsentrasjoner var vellykket i den påfølgende bakterietransformering. Ligeringsblandingene ble brukt til å transformere E. coli stamme MC1061 for ampicillin-resistens som beskrevet tidligere. Mer

enn 10 E. coli-transformanter ble samlet, og miniplasmid-preparater ble laget. En stor majoritet av disse inneholdt plasmider identiske i restriksjonsmønster med pLD25. Noen få inneholdt tydelige innførte deler av forskjellige DNA-stykker i Kpnl-sete av pLD25. Antagelig var disse ekstra stykker forskjellige Kpnl-fragmenter av Y. lipolytica DNA som ble innført i den lineæriserte vektor i løpet av ligeringen.

Et annet eksempel involverer plasmid pLD28 og demonstrerer

de genetisk funksjonelle forskjeller mellom Y. Lipolytica og

S. cerevisiae. Y. lipolytica stamme ATCC 20688 ble transformert med Bglll-kuttet pLD28 til å gi stamme DL11, som ble selektert på leucin-manglende syntetisk medium. Når den ble replika-platet på uracil-manglende syntetisk medium, ble ingen vekst påvist, hvilket antyder (siden enzym-assay-tester indikerer at Y. lipolytica URA3-genet koder for det samme enzym som S. cerevisiae URA3-genet) at S. cerevisiae-genet ikke komplementerte den tilsvarende Y. lipolytica-mutasjon. Plasmidet ble gjenvunnet fra Y. lipolytica som ovenfor unntatt at enzym Bglll ble brukt slik at det gjenvunne plasmid manglet det lille Bglll-fragment. For å teste om Y. lipolytica LEU2-genet ville virke i S. cerevisiae, ble stamme DB745 (leu2-3,112 ura3-52 adel-100), konstruert i D. Botstains laboratorium og vidt anvendt som vert for plasmider (se for eksempel Guarente og Ptashne, 1981, Proe. Nat'l. Acad. Sei., USA 78, 2199, lignende stammer kan fåes som ATCC 44773 og ATCC 44774) ble transformert med pLD28, selektert på uracil-manglende medium. S. cerevisiae-transformantene ble replika-platet på leucin-manglende medium og ble funnet å vokse langsomt uten tilsatt leucin. Det var mulig å selektere direkte for pLD28 i S. cerevisiae basert på dens evne til på en dårlig måte å komplementere leu2, selv om transformantene kom fram 24-48 timer senere på leucin-manglende plater enn på uracil-manglende plater og en svakt lavere transformeringsfrekvens ble oppnådd. Således kan Y. lipolytica LEU2-genet virke, om enn svakt, når det er på dette multikopi-plasmid i S. cerevisiae.

Hoveddelen av den her beskrevne metode for å få Y. lipolytica-gener fra biblioteker ved å se etter nevnte gener som vil virke i Y. lipolytica, ble videre demonstrert ved vellykket transformering av Y. lipolytica-proteasegen og et Y. lipolytica-adenin-gen.

Idet man anvendte det tidligere beskrevne pLD40-baserte bibliotek og skyttelsystemet av denne oppfinnelse, er et Y. lipolytica-proteasegen (XPR2) blitt klonet på en vellykket måte. Fremgangsmåten som ble brukt var lik den beskrevet ovenfor for kloning av URA3. XPR2 er det strukturelle gen for den utskilte alkalinske protease (Sims og Ogrydziak, J. Bacteriol. 145, 404, 1981). Resipient-stammer av Y. lipolytica som inkluderte de genetiske markører leu2, adel og xpr2 ble konstruert ved standard genetiske teknikker (Ogrydziak et al., Mol. Gen. Genetics, 163,

229, 1978).

Ieu2-mutasjonen er beskrevet her, og forskjellige xpr2-alleler og adel-alleler er tilgjengelige fra ATTC som nr. 46026-46028 og 46067-46070, deponert av Ogrydziak (se Sims og Ogrydziak, loe.eit).

Bibliotektet ble behandlet i henhold til etidiumbromid-delvis-fordøyelsesmetoden til R. Parker, et al. (Proe. Nati. Acad. Sei., USA, 74, 851, 1977) idet man brukte enzym Bglll. For å bestemme den passende mengde å bruke av Bglll-enzym, etidiumbromid og DNA ble et område av etidiumbromidkonsentrasjoner fra 0,005 til 1 ug/ ul brukt med ca. 1 /xg av DNA-bibliotek i 10 fj. 1 som inneholdt 4 enzymenheter pr. rør. Inkuberingstiden var 1 time ved 37°C. Røret som inneholdt ca, 0,05 ng/ iil av etidiumbromid, viste seg å gi mye lineærisering av plasmidene i biblioteket uten å danne noen mindre fragmenter som ville være indikator på mer enn ett kutt pr. molekyl. Dette forhold av komponenter ble opptrappet for å fremstille oppsamlet DNA til transformeringsformål. Denne behandling av DNA-bibliotek unngår problemer som ellers ville forekommet hvis både det målbestemte integrasjonssete (LEU2-område) og det ønskede ukjente gen (XPR2) hadde setet for enzymet som ble anvendt til lineærisering (Bglll). Transformanter fått fra således behandlet DNA kunne være integranter enten i LEU2 eller XPR2-områder av genomet. Idet vi brukte samme transformeringsmetoder som tidligere, fikk vi mer enn 80 000 kolonier på leucin-manglende syntetisk medium. Disse ble replikaplatet på skummet melk-indikatorplater (D. Ogrydziak et al., Genetics 87, 621, 1977). Protease-positive transformanter ble påvist ved dannelse av en oppklaringssone på skummetmelk-platene.

Enda videre er adeningenet av Y. lipolytica blitt klonet ved komplementering. En dobbelt mutant-resipient (leu 2 adel) transformert som beskrevet ovenfor, og leucin-uavhengige kolonier ble replikaplatet på medium for å selektere for ADE1. ADE1-inneholdende plasmider er gjenvunnet fra transformanter og verifisert ved retransformering.

Claims (10)

1. Fremgangsmåte for fremstilling av Yarrowia lipolytica-transformanter, karakterisert ved at den innbefatter å innføre i nevnte Y. lipolytica en vektor som omfatter et autonomt replikerende Escherichia coli-plasmid som omfatter et Y. lipolytica DNA-fragment som inneholder et område av homologi til, og som kan integrere i, nevnte Y. lipolytica, og en påvisbar genetisk markør, idet nevnte fragment har et gen som fungerer fysiologisk i Y. lipolytica.

2. Fremgangsmåte i henhold til krav 1, karakterisert ved at nevnte Y. lipolytica er mutert i LEU2- eller URA3-genet.

3. Fremgangsmåte i henhold til krav 1, karakterisert ved at nevnte Y. lipolytica er Y. lipolytica som har de identifiserende karakteristika av ATCC 20688.

4. Fremgangsmåte for fremstilling av en transformant som innbefatter pLD25 i Y. lipolytica, idet nevnte transformant har de identifiserende karakteristika av ATCC 20687, karakterisert ved at den innbefatter transformering av Y. lipolytica som har deponeringsnummer ATCC 2 0688 med plasmidet pLD25.

5. Fremgangsmåte for fremstilling av en transformant som innbefatter pLD55 i Y. lipolytica, idet nevnte transformant har de identifiserende karakteristika av ATCC 20718, karakterisert ved at den innbefatter transformering av Y. lipolytica ATCC 20688 med plasmidet pLD55.

6. Fremgangsmåte for fremstilling av plasmid pLD2 5, karakterisert ved at den innbefatter å innføre i E. coli-replikerende plasmid pBR322 et Y. lipolytica DNA-fragment, idet nevnte fragment omfatter det strukturelle gen LEU2 som fungerer fysiologisk i Y. lipolytica og E. coli og som er påvisbart i Y. lipolytica, og et unikt restriksjons-sete i et område som omgir DNA-sekvensen som er innført i Y. lipolytica-verten, idet nevnte plasmid har endonuklease-spaltningskartet som vist i figur 3.

7. Fremgangsmåte for fremstilling av plasmid pLD28, karakterisert ved at den innbefatter innføring i Sall-setet i YEp24 (ATCC 37051) av et Sall-fragment som inneholder Y. lipolytica LEU2-genet idet nevnte plasmid har endonuklease-spaltningskartet som vist i figur 6.

8. Fremgangsmåte for fremstilling av plasmid pLD55, idet nevnte plasmid er karakterisert ved et restriksjonsmønster som vist i figur 9, karakterisert ved at den innbefatter innføring i BamHI-setet i plasmid pLD40 av URA3-genet Y. lipolytica.

9. Fremgangsmåte for å fremstille plasmid pLD4 0, idet nevnte plasmid har restriksjons-endonukleasekartet som vist i figur 7, karakterisert ved at den innbefatter innføring i EcoRI-setet i plasmid pBR322 av et DNA-segment som inneholder LEU2-området av Y. lipolytica, idet nevnte segment ble oppnådd ved en delvis EcoRI-fordøying av pLD25 (fig. 3).

10. Anvendelse av fremgangsmåten ifølge krav 1, for kloning av gener ved komplementering av mutanter i Y. lipolytica.