DK171878B1 - Vektor med tilstrækkelig homologi til integration af DNA'et i kromosomalt DNA fra Yarrowia lipolytica, fremgangsmåde til fremstilling af den Y.lipolytica transformerende vektor og transformanter opnået derved - Google Patents

Description

DK 171878 B1

Opfindelsen angår hidtil ukendte vektorer som replicerer autonomt i Escherichia coli og integrerer, men ikke replicerer autonomt i Yarrowia lipolytica, som er ejendommelige ved det i krav l's kendetegnende del angivne; 5 fremgangsmåde til fremstilling af sådanne Y. lipolytica transformerende vektorer, der er ejendommelig ved det i krav 7's kendetegnende del angivne, samt transformanter af Y. lipolytica og E. coli indeholdende de nævnte vektorer, der er ejendommelige ved det i krav 8 og 10's kende-10 tegnende del angivne.

Hovedvægten ved molekylær kloning er blevet lagt på pro-karyoter af især E. coli og senere Bacillus subtilis, som værtsorganismer. Til trods for dens udstrakte anvendelse som værtsorganisme ved kloning og udtrykkelse af hetero-15 logt DNA, er E. coli kendt for at frembyde visse problemer, såsom manglende evne til at secernere proteiner i dens vækstmedium med påfølgende let isolering deraf. De proteiner, der således produceres intracellulær er sædvanligvis ikke i deres native tilstand og forefindes som 20 uopløselige aggregater, kaldet inklusionslegemer. Det eventuelle behov for at ødelægge cellerne for at udvinde proteinet forøger muligheden for forurening deraf med toxisk stof.

I betragtning af de anførte vanskeligheder har man vendt 25 sig til B. subtilis som en alternativ værtsorganisme, da den secernerer protein og ikke producerer toxiner. Imidlertid er B. subtilis som værtsorganisme underlagt visse begrænsninger; ustabilitet af transformerede stammer, hvilket resulterer i tab af heterologt DNA, og den hyppi-30 ge reduktion i det indtrædende DNA's evne til at sameksistere med værts-DNA'et.

I erkendelse af de ovennævnte vanskeligheder med proka-ryoter som værtsorganismer har opmærksomheden ændret sig DK 171878 B1 2 til eukaryoter, og især gærarter, som værtsorganismer. Gærarter af industriel betydning er ikke-toxiske og kan dyrkes til meget høje tætheder. Nogle arter er godt analyseret genetisk, og nogle arter kan secernere proteiner.

5 Den første transformation af en gær, Saccharomyces cere-visiae, blev rapporteret af Hinnen et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 13 1929-1933 (1978), som påviste, at et klonet segment af gær-DNA, som koder for LEU2-locuset kunne transformere en ikke-reverterende leu2“-mutant af gær til 10 en LEU+ fenotype. Denne transformation blev vist at stamme fra integration i kromosomet af plasmidet indeholdende LEU2-segmentet af DNA. Integrationen involverede rekombination mellem homologe segmenter af DNA.

Hinnen et al. giver i "Overproduction of Microbial Pro-15 duets", udgivet af Krumphanzl et al., Academic Press, N.Y., Ch. 30, 1982, en oversigt over gærtransformations-procedurer. En forudsætning for gærtransformation blev beskrevet af Ratzkin et al. Proc. Natl. Acad. Sci. 74. 487-491 (1977) i forbindelse med deres kloning af gær 20 (Saccharomyces cerevisiae) LEU2 ved komplementering af en E. coli leuB mutation.

Sjostak et al., Plasmid 2, 536-554 (1979) beskriver konstruktionen af plasmider indeholdende LEU2-genet af gær og fragmenter af rDNA og integrationen af plasmiderne i 25 rDNA-locusset efter gærtransformation. Grundretningen for deres undersøgelse involverede integrationen af en genetisk markør, LEU2-genet, indsat i rDNA-locusset som genetisk markør til kortlægning af rDNA'et. Et af de rapporterede plasmider, pSZ20, indeholdende BglII-B-fragmentet 30 af rDNA og Sall-Xhol LEU2-fragmentet, er identificeret som en nyttig vektor til kloning af fragmenter af gær-DNA i gær.

DK 171878 B1 3

Orr-Weaver et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 23, 6354-6358 (1981) påviste høj-frekvens-integration af lineære plas-mider afledt fra pBR322, som alle er ikke-replicerende i gær og kun transformerer ved integration, i Saccharomyces 5 cerevisiae, når plasmiderne skæres i DNA-sekvenser, som er homologe med gærkromosomet.

Yarrowia lipolytica, en industrielt vigtig gærart, anvendes til at fremstille citronsyre og enkeltcelleprotein.

Den kan også anvendes til at fremstille erythritol, man-10 nitol og isopropylæblesyre. Y. lipolytica lider af visse iboende mangler såsom dens begrænsede spektrum af udnyttelige carbonkilder. Den samlede værdi af Y. lipolytica kunne forøges ved eliminering af en sådan mangel, f.eks. ved indførelse af korrigerende DNA fra andre arter.

15 Y. lipolytica er af særlig interesse og værdi på grund af dens evne til at secernere proteiner (alkalisk protease, sur protease og RNAse) til dens vækstmedium, hvilket tillader potentiel udvinding af heterologe proteiner i den native tilstand uden behov for itubrydning af de produce-20 rende celler.

Et højeffektivt system til transformation af S. cerevisiae omfattende et replicerende hybridt plasmid, et S. cerevisiae - E. coli hybridplasmid, som kan selekteres i og udvindes fra både E. coli og S. cerevisiae, er beskrevet 25 af Beggs, Nature 275, 104-109 (1978). Højfrekvens-transformationssystemer for Schizosaccharomyces pombe og Kluy-veromyces lactis er rapporteret af henholdsvis Beach et al., Nature 290, 3, 123-128 (1982).

Indtil den foreliggende opfindelse var der imidlertid in-30 tet tegn på, at der i Y. lipolytica eksisterede et DNA plasmid, der kunne tjene som basis for en transformationsvektor. Yderligere er Y. lipolytica resistent over for antibiotika som G418, hvilket bevirker, at selektionsske- DK 171878 B1 4 maer baseret på en sådan antibiotisk resistens ved transformation er uanvendelige. Herudover er tilgængelige vektorer udviklet til Saccharomyces cerevisiae yderligere ikke brugbare til anvendelse med Y. lipolytica.

5 Der er nu fundet en fremgangsmåde til transformation af Y. lipolytica ved indførelse deri af DNA omfattende et område med homologi til den nævnte Y. lipolytica og en detekterbar genetisk markør. Af særlig interesse er den fremgangsmåde, som består i indførelse i den nævnte Y.

10 lipolytica af et fragment af Y. lipolytica DNA eller, alternativt og fortrinsvis, en vektor indeholdende et fragment af Y. lipolytica DNA, hvilken DNA eller vektor er detekterbar i den nævnte Y. lipolytica, samt hertil anvendelige vektorer og mikrobielle transformanter omfat-15 tende de nævnte vektorer. I almindelighed indeholder det nævnte Y. lipolytica DNA-fragment ved denne transformationsproces en selekterbar markør, som fungerer i Y. lipolytica, især i Y. lipolytica med en mutation i genet svarende til den nævnte selekterbare markør. Af særlig inte-20 resse og værdi for denne opfindelse er anvendelsen af et Y. lipolytica DNA-fragment med et gen, som koder for et biosyntetisk eller metabolisk enzym, som LEU2-genet (koder for enzymet β-isopropylmalat-dehydrogenase, EC1.1.1.85) eller HISl-genet (koder for enzymet ATP-25 phosphoribosyltransferese, EC2.4.2.17) eller URA3-genet (koder for enzymet ortidin-5'-phosphat-decarboxylase, EC4.1.1.23) eller XPR2-genet (koder for enzymet alkalisk extracellulær protease, EC3.4.21.14), og Y. lipolytica-stammer med henholdsvis en leu2“, en hisi-, en ura3- el-30 ler en xpr2- mutation.

De omhandlede plasmider (eller vektorer, betegnelserne anvendes valgfrit i denne beskrivelse), som er beskrevet i denne beskrivelse med krav, har flere egenskaber fælles; et bakterielt replikon, tillader deres mangfoldiggø- DK 171878 B1 5 relse i E. coli; tilstedeværelsen af en selekterbar genetisk markør, som er detekterbar og funktionel i E. coli; tilstedeværelsen af et strukturgen, som fungerer fysiologisk i Y. lipolytica og hyppigt i E. coli; og tilstedevæ-5 reisen af Y. lipolytica DNA-fragmenter, som sørger for deres integrering i Y. lipolytica genomet.

I almindelighed baseres produktionen af nyttige vektorer til opfindelsens formål på fremstilling af hybride vektorer, dvs. vektorer som fungerer fysiologisk i en hetero-10 log mikroorganisme (dvs. enhver anden art end Y. lipolytica), ønskeligt en bakterie, og fortrinsvis E. coli, og også i Y. lipolytica. Sådanne vektorer omfatter mikrobielt DNA og fragmenter af kromosomalt DNA af Y. lipolytica, hvilket fragmenter indeholder mindst én selekterbar 15 genetisk markør, dvs. et gen, som fungerer og er detek-terbart i Y. lipolytica. De således konstruerede vektorer samvirker med homologe kromosomale sekvenser i Y. lipolytica, hvorved de bliver integreret i et kromosom deraf, således at der opnås transformation.

20 Som fagfolk vil indse, forøger dannelsen af vektorer indeholdende mere end et gen af gæroprindelse sandsynligheden for ud fra disse vektorer at danne integranter, dvs. transformanter omfattende de nævnte vektorer, og især integranter med mere end ét gen. Tilstedeværelsen af multi-25 pie gener forøger og forbedrer selvfølgelig evnen til at detektere tilstedeværelsen af vektoren i en gær.

Integration opnås med cirkulære, lineære og afbrudt-lineære vektorer. Lineære og afbrudt-lineære vektorer integreres med højere effektivitet end cirkulære vektorer.

30 Vektorerne har derfor ønskeligt et unikt restriktionsbindingssted, dvs. et sted som ikke findes i den oprindelige mikrobielle DNA-vektor eller andet sted i vektorens Y. lipolytica-fragment-komponent. Linearisering af vektoren DK 171878 B1 6 ved et sådant sted skaber dobbeltstrenget DNA med kraftigt kombinogene ender, som er i stand til at transformere Y. lipolytica ved integrering med homologe kromosomale sekvenser. Som Orr-Weaver et al. (se ovenfor) har vist i 5 S. cerevisiae, er afbrudt-lineære plasmider også i stand til integration. Sådanne plasmider fremstilles ved at fremstille to restriktionsenzymskæringer i vektorens kromosomale Y. lipolytica DNA-segment. I tilfældet med det nedenfor beskrevne pLD25 muliggør tilstedeværelsen af to 10 Bglll bindingssteder hensigtsmæssigt fremstilling af afbrudt-lineære plasmider.

Værdien af vektorerne ifølge opfindelsen baseres på tilstedeværelsen deri af en selekterbar genetisk markør, som er detekterbar og funktionel i Y. lipolytica hvorfor den 15 er en detekterbar markør. Egnede markører er følgende Y. lipolytica gener: LEU2, ADE1, URA3, XPR2 og HISI, men som fagfolk vil indse, kan ethvert Y. lipolytica gen som giver en selektion anvendes. LEU2-genet, det hele eller en del deraf, er særligt værdifuldt. Det nævnte gen eller en 20 del deraf opnås udfra Y. lipolytica ved en delvis nedbrydning af Y. lipolytica kromosomalt DNA med en egnet restriktionsendonuclease, f.eks. Sau3A. De nævnte vektorer eller subkloner deraf muliggør skabelsen af Y. lipolytica kloningsvektorer ved indsætning deri af tilfældige 25 segmenter af DNA ved kendte metodologi. De resulterende vektorer anvendes derpå til at transformere Y. lipolytica stammer, som har en mutation i genet svarende til den se-lekterbare markør. Det transformerende DNA, som har en sådan Y. lipolytica markør, kan tilføre selektiv vækst-30 fordel til recipienten eller korrigere for en auxotroph mutation i recipienten.

Det foretrækkes almindeligvis at anvende et Y. lipolytica DNA-fragment, som indeholder hele LEU2-genet, da dette fragment muliggør fremstilling af en vektor, som fungerer DK 171878 B1 7 fysiologisk i både E. coli og Y. lipolytica. Imidlertid er anvendelsen af et Y. lipolytica DNA-fragment, som indeholder hele LEU2-genet, ikke nødvendig for heldig gennemførelse af fremgangsmåden. Det er kun nødvendigt at 5 anvende et DNA-fragment, som inkluderer en tilstrækkelig mængde af en vild-type-sekvens til at give et vild-type-gen ved integration i recipienten. Selv om dette fragment ikke er funktionelt i E. coli, er det detekterbart i Y. lipolytica.

10 Ligeledes værdifulde til fremstilling af vektorer, som er nyttige ved transformation af Y. lipolytica, er fragmenter af Y. lipolytica DNA, som opnås ved en fuldstændig BamHI-nedbrydning af kromosomalt Y. lipolytica DNA, og som inkluderer HISl-genet, eller som opnås ved en delvis 15 Sau3A-nedbrydning af kromosomalt Y. lipolytica DNA, og som inkluderer URA3-genet deraf. Disse fragmenter indeholder ligerbare termini, og når de ligeres med lineari-seret (f.eks. ved anvendelse af BamHI) YEp24, en E. coli - S. cerevisiae vektor (Botstein et al., Gene £, 17-24, 20 1979 ), giver de hybride vektorer bærende HISl-genet eller URA3-genet.

Under anvendelse af de heri beskrevne, hidtil ukendte vektorer kan der indsættes tilfældige segmenter af Y. lipolytica deri ved "haglbøsse"-teknik. De resulterende 25 vektorer anvendes til at transformere forskellige mutanter, og transformanter selekteres ved standardmetoder.

F.eks. kan LEU2-holdige vektorer anvendes til at klone andre Y. lipolytica gener, såsom URA3. Det resulterende klonede URA3-gen i eventuelle selekterede transformanter 30 kan derpå subklones bort fra LEU2-genet og anvendes som en effektiv Y. lipolytica vektor.

Sædvanligvis kombineres et bakterielt E. coli, plasmidre-plikationsorigin og en selektiv genetisk markør for den DK 171878 B1 8 nævnte bakterie ved kendt metodologi med hele eller en del af et Y. lipolytica gen, der kan selekteres for, og som dermed kan detekteres, i Y. lipolytica. E. coli kloningssystemet er specielt anvendeligt, da det let giver 5 store mængder plasmid-DNA ved vækst og opformering i E. coli og muliggør konstruktionen af vektorer og genbiblioteker i E. coli.

De her beskrevne plasmider er nyttige som vektorer i forbindelse med rekombinant-DNA-metodologi. Forskellige ge-10 ner kan indsættes i dem, f.eks. ved spaltning af dem med en egnet restriktionsendonuclease til dannelse af lineært DNA med ligerbare termini efterfulgt af omsætning af det lineære DNA med et exogent gen, som har ligerbare termini . De resulterende plasmider transformeres derpå ind i 15 en egnet Y. lipolytica værtsmikroorganisme, som ved dyrkning under passende betingelser producerer det ønskede produkt. Plasmiderne pLD25 og pLD28, som hver indeholder LEU2-genet fra Y. lipolytica, kan selekteres og detekteres i en Y. lipolytica recipient. De kan således anvendes 20 til at muliggøre frembringelsen af Y. lipolytica kloningsvektorer .

Desuden giver de her beskrevne plasmider muligheder ved at forbedre Y. lipolytica mikroorganismers gæringsegenskaber, for at forbedre den industrielle anvendelighed 25 ved at overvinde iboende mangler. F.eks. kan gener, der koder for udnyttelsen af forskellige carbonkilder, indføres i dem, og det resulterende plasmid transformeres Y. lipolytica for at modificere værtens næringsbehov og således udvide spektret af carbonkilder, som kan udnyttes 30 af Y. lipolytica.

Vektorerne, f.eks. plasmider eller cosmider, der kræves til dette formål, kan konstrueres ved teknik, som er velkendt for fagfolk inden for rekombinant-DNA-teknologien.

DK 171878 B1 9 Y. lipolytica DNA-sekvensen, der koder for et bestemt pe-riplasmisk enzym> isoleres ved kendte metoder og indsættes i f.eks. i pLD25 eller et derivat deraf. Et ønsket strukturgen, f.eks. maltasegenet, kan passende fusioneres 5 ind i DNA-sekvensen for et periplasmisk enzym, og det resulterende plasmid transformeres ind i Y. lipolytica og integreres i et af Y. lipolytica's kromosomer. Den således frembragte transformant vil ved dyrkning være i stand til at hydrolysere maltose til glucose, en ønsket egen-10 skab, som ikke besiddes af udgangsstammen.

Plasmidet pLD25 replicerer autonomt i E. coli og integrerer, men replicerer ikke autonomt i Y. lipolytica. Det opnås ved indsætning i det i E. coli replicerende plasmid pBR322 af et Y. lipolytica DNA-fragment, som ønskeligt er 15 udrustet med to distinkte egenskaber, for det første tilstedeværelsen af et strukturgen, som fungerer fysiologisk i Y. lipolytica og fortrinsvis også i E. coli, og som er detekterbart i Y. lipolytica, for det andet er i besiddelse af et unikt restriktionssted (dvs. der ikke findes 20 i det oprindelige E. coli plasmid eller andetsteds i Y. lipolytica værtsfragmentet) i et område flankerende den DNA-sekvens, som indføres i Y. lipolytica værtsstammen med det formål at korrigere mangler i værtens strukturgen. For at opnå høj frekvens af transformation er besid-25 delsen af et unikt restriktionssted nødvendig.

De nedenfor beskrevne plasmider og pLD21 og pLD23, som hver bærer HISl-genet fra Y. lipolytica opnås ved indsætning i henholdsvis YEp24 og pBR322 af et fragment opnået ved den fuldstændige BamHI-nedbrydning af et kromosomalt 30 DNA fra Y. lipolytica.

Plasmidet pLD25 indeholder et fragment af Y. lipolytica DNA, der komplementerer E. coli leuB- mutationer, og DK 171878 B1 10 plasmiderne pLD21 og pLD23 et fragment, der komplemente-rer E. coli hisG“-mutationer.

Plasmidet pLD28 replicerer autonomt i E. coli og integrerer, men replicerer ikke autonomt, i Y. lipolytica. Det 5 konstrueres ved indsætning af et Sall-fragment, der indeholder Y. lipolytica LEU2-genet, i Sall-stedet i YEp24.

Det er, som bemærket, en integrerende vektor i Y. lipolytica, selekterbar i en leu2-mutant, et multikopi-plasmid i S. cerevisiae, selekterbart i ura3- eller en leu2-10 mutant, og et multikopi-plasmid i E. coli selekterbart ved ampicillin-resistens eller ved adekvat funktion af S. cerevisiae URA3-genet i en pyrF-mutant eller mindst effektivt ved den ringe om end detekterbare funktion af Y. lipolytica LEU2-genet i en leuB-mutant.

15 Plasmiderne pLD25 og pLD28 er bifunktionelle vektorer for E. coli og Y. lipolytica. De indeholder begge bakterielle sekvenser, som muliggør DNA-replicering i E. coli, og sekvenser, der muliggør integration i gær; dvs. de indeholder et E. coli repliceringsorigin og et Y. lipolytica ho-20 mologiområde. Betegnelsen "bifunktionel" anvendes til at angive, at disse vektorer konstrueret i E. coli, kan integreres i Y. lipolytica kromosomer og tilbageføres i E. coli for at fuldende kredsløbet. Plasmidet pLD28 er også en bifunktionel vektor for S. cerevisiae. Disse bifunkti-25 onelle vektorer muliggør kloningen af Y. lipolytica gener ved komplementering af mutationer i E. coli og ved direkte komplementering af mutanter i S. cerevisiae eller Y. lipolytica. Disse fænomener viser, at der dannes et funktionelt LEU2-gen-produkt i begge heterologe systemer.

30 Denne erkendelse af direkte komplementering i Y. lipolytica gør det nu muligt at klone ethvert gen, for hvilket en mutation kan identificeres.

DK 171878 B1 11

Det nedenfor beskrevne plasmid pLD40 blev konstrueret ved indsætning i EcoRI-stedet i pBR322 af et lille segment indeholdende LEU2-området fra Y. lipolytica, hvilket segment opnås ved en delvis EcoRI-nedbrydning af pLD25.

5 Plasmidet pLD55, et URA3-holdigt plasmid, blev opnået ved indsætning af URA3-genet fra Y. lipolytica i BamHI-stedet i pLD40.

I det følgende gives en kort forklaring af tegningsfigurerene .

10 Figur 1. Delvis Sau3A-nedbrvdning af et genbibliotek af Y. lipolytica i pBR322. Denne agarosegel viser, at biblioteket (mærket LIB) indeholder noget supersnoet pBR322-plasmid uden indsætnings-DNA, der vandrer lige ovenfor 2,3 kb λ-HindIII standarden (mærket STD), medens resten 15 af molekylerne indeholder diverse (4-10 kb) størrelsesfraktionerede indsætninger af Y. lipolytica DNA, der vandrer som en næsten kontinuert udtværing over 4,3 kb standarden. Den mellemliggende bane indeholder et uskåret plasmid (pLD21) og viser to adskilte bånd.

20 Figur 2. Southern-hybridiserina af_EcoRI-nedbrudt Y.

lipolytica bulk DNA og pLD25 probeundersøgt med radioaktivt pLD25. De tre interne bånd mærket b, c og d af pLD25 viser homologi med stykker af total Y. lipolytica DNA med identiske størrelser. To yderligere, svagere bånd (mærket 25 1 og 2) i Y. lipolytica banen har sandsynligvis homologi med de mindre Y. lipolytica portioner af plasmidbånd a og e. Banen mærket "STD" indeholder λ-HindIII-størrelses-standarder. Banen mærket "P" indeholder omkring 2 ng EcoRI-nedbrudt pLD25. Banen mærket "Yl" indeholder om-30 kring 1 μg totalt Y. lipolytica DNA. Ved et lignende Southern-forsøg under anvendelse af pBR322 som probe hy-bridiserede kun båndene a og e fra pLD25.

DK 171878 B1 12

Figur 3. Restriktionskort over pLD25. Et delvist restriktionskort baseret på en enkelt og nogle dobbelte restriktionsforøgelser er vist. Bindingssteder indesluttet i klammer er ikke blevet ordnet i forhold til hverandre.

5 Alle angivne størrelser er tilnærmelser baseret på agaro-segel-observationer. Den tynde linie repræsenterer pBR322-DNA (i standard formatet med EcoRI-bindingsstedet ved kl. 12), og den tykke linie repræsenterer indsæt-nings-DNA fra Y. lipolytica. Indsætningen har 3 10 EcoRV-(RV), i Aval-(A) - men kun et er blevet kortlagt), 1 Sphl-(SP), 1 Kpnl-(K), 2 Sall-(S), 4 EcoRI-(RI), 2-XhoI-(X) og 2 nært beliggende Bglll-(B) steder. Indsætningerne mangler Hindlll-, Clal-, BamHI- og Nrul-steder.

En 2,3 kb subklon med EcoRI-ender, mærket leu2 er kun 15 funktionel i E. coli i én orientering i EcoRI-stedet i pBR322.

Figur 4. Southern hybridisering af HindiII-nedbrudt bulk- DNA fra Y. lipolvtlca transf ormanter_med_radioaktiv pBR322-probe. HindiII-nedbrydningen af totalt DNA isole-20 ret fra fire forskellige transformanter og udgangsstammen blev kørt på en agarosegel, blottet og probeundersøgt med mærket pBR322. Y. lipolytica transformant nr. 6 blev tilfældigt valgt fra en kultur transformeret med intakt cirkulær pLD25. Transformanterne 11, 12 og 15 var fra en 25 kultur transformeret med Kpnl-lineariseret pLD25. Alle Y. lipolytica transformanter gav to hybridiseringsbånd, et stærkere (1) med en længde på over 23 kb og et svagere (2) med samme størrelse som 9,3 kb λ-HindIII-standarden. Banen mærket "PC" indeholdt DNA fra moderstammen 30 (PC30827; ATCC20688) uden væsentlig hybridisering til proben.

Figur 5. Restriktionsnedbrvdninaer_af_PLD23 og pLD24.

Denne agarosegel indeholder λ-HindIH-størrelsesstandar- DK 171878 B1 13 der i den yderste venstre bane og a) EcoRI, b) BamHI, c) ingen enzymbehandlinger af henholdsvis pLD23 (komplementerer E. coli hisG-mutanter) og pLD24 (komplementerer ikke). Hver bane b indeholder to nærtbeliggende BamHI-bånd: 5 Det største svarende til pBR322 og det lidt mindre bånd (omkring 4 kg) repræsenterende Y. lipolytica BamHI-indsætningen. EcoRI-nedbrydningerne viser, at Y. lipolytica stykket er i modsatte orienteringer i de to plasmi-der.

10 Figur 6. Restriktionskort over pLD28. Foruden et 5,2 kb Y. lipolytica Sall-stykke indeholdende LEU2-området indeholder dette plasmid et 2,2 kb EcoRI-stykke med replika-tionsoriginet fra gær-2 μιη-plasmidet og et 2,2 kb HindiIl-stykke med S. cerevisiae URA3-genet indsat i de 15 tilsvarende bindingssteder i pBR322.

Figur 7. Restriktionskort over pLD40. Restriktionsstedsforkortelserne er som i de foranstående figurer. Desuden er der blevet kortlagt bindingssteder for Ncol (N), Apal (Ap) og BstXI (Bs). Det LEU2-holdige Y. lipolytica seg-20 ment er mellem 2,3 og 2,4 kb langt og blev indst i EcoRI-stedet i pBR322. Restriktionsstederne i pBR322 er ikke vist.

Figur 8. Restriktionsnedbrvdninger af PLD55 sammenlignet med pLD40. Banerne i denne gel er (foruden λ-HindIII 25 størrelsesstandarderne) a) ikke-nedbrudt pLD40, b) Apal-nedbrudt pLD40 c) EcoRI-nedbrudt pLD40, d) EcoRI-nedbrudt pLD55, e) Apal-nedbrudt pLD55 og f) ikke-nedbrudt pLD55. Disse nedbrydninger viser, at det klonede URA3-holdige område har to EcoRI-steder og er omkring 4 kb langt.

30 Plasmiderne

Plasmidet pLD25 indeholder selekterbare genetiske markører for E. coli og Y. lipolytica og er afledt fra det i DK 171878 B1 14 E. coli replicerende plasmid pBR322, et multikopi-plas-mid. Det blev konstrueret ved indsætning af et ca. 6,6 kb fragment opnået ved en delvis nedbrydning af kromosomalt Y. lipolytica DNA med Sau3A i BamHI-stedet i pBR322.

5 Plasmidet pLD28, en subklon af pLD25, indeholder også se-lekterbare genetiske markører for E. coli og Y. lipolytica og desuden for S. cerevisiae, og er afledt fra YEp24.

Det blev konstrueret ved indsætning af Sall-fragmentet på ca. 5,3 kb, der indeholder Y. lipolytica LEU2-genet, i 10 Sall-stedet i YEp24.

Plasmidet pLD40, også en subklon af pLD25, blev konstrueret ved indsætning af EcoRI-fragmentet på 2,3 eller 2,4 kb opnået ved delvis nedbrydning af pLD25 i EcoRI-stedet i pBR322.

15 Mikroorganismerne

De anvendte mikroorganismer var en stamme af E. coli og en stamme af Y. lipolytica, hvilke stammer er identificeret i Pfizer Inc's kultursamling som henholdsvis E. coli JC-355 [Clark et al., Molec. Gen. Genet. 105. 1 (1969) 20 opnået som stamme nr. 869 fra the E. coli Genetic Stock Center, Yale University] og Y. lipolytica PC-30827. Den nævnte Y. lipolytica stamme er genstand for US patentansøgning nr. 539 363 indleveret af J. R. Dezeeuw den 6. oktober 1983. Ansøgningen har ført til US patent 25 4 628 033. En yderligere mikroorganisme E. coli MC1061, anvendt til fremstillingen af et genbibliotek af Y. lipolytica i vektor pBR322, er beskrevet af Casadaban et al., J. Mol. Biol. 138. 179-207 (1980). Den er særlig nyttig til dette formål på grund af dens evne til at opnå høj 30 frekvens af transformationen. Andre mikroorganismer kan anvendes i stedet for den nævnte E. coli MC1061. Repræsentative egnede mikroorganismer er stammer af E. coli, som er restriktion-, såsom E. coli HB101 (NRRLB-11371), DK 171878 B1 15 også tilgængelig som ATCC 33694, og som kan gøres kompetente til transformation.

En stamme af E. coli, som er defekt med hensyn til leu-cin- og uracil-gener (DB 6507, ATCC 35673 en Tn5-5 indsætningsmutant af HB101, fra D. Botstein) er leuB pyrF74:: Tn hsdR~M“ og kræver også prolin.

De følgende mikroorganismer er blevet deponeret i og er tilgængelige fra den permanente samling i The American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, U.S.A.: ATCC 20688 Yarrowia lipolytica PC-30827 ATCC 20687 Yarrowia lipolytica PC-30827 transformant med pLD25 ATCC 39464 Escherichia coli JC-355 transformant med pLD25 ATCC 20718 Yarrowia lipolytica PC-30827 transformant med pLD55 10

De er blevet deponeret under betingelserne for Buda- pesttraktaten i the American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, U.S.A. en anerkendt deponeringsinstitution, som yder permanente deponeringer og let til-15 gængelighed dertil for offentligheden, hvis der udstedes patent på basis af denne ansøgning. Alle begrænsninger på offentlighedens adgang til de deponerede mikroorganismer vil blive uigenkaldeligt fjernet efter udstedelse af patentet.

20 Den taxonomiske undersøgelse af Y. lipolytica ATCC 20688 blev gennemført af Doktor L. H. Huang, som gav den nedenfor anførte beskrivelse. De anvendte medier og metoder er dem, der er anbefalet af J. Lodder in "The Yeasts", 2nd udgave, N. Holland Publishing Co., Amsterdam, 1970.

DK 171878 B1 16 CBA 599 typekulturen for arten Candida lipolytica, [også kendt som Saccharomycopsis lipolytica; nu klassificeret som Yarrowia lipolytica (Wickerham et al. ) et van der Walt og von Arx, Antonie van Leeuwenhoek, 517-521, 5 1980], blev undersøgt til sammenligning.

Da stammen PC-30827 kræver leucin og uracil (J. R. DeZe-euw), sattes både leucinethylester og uracil i koncentrationer på henholdsvis 149 mg/L og 20 mg/L til de følgende definerede medier: basalmediet til prøvning for assimila-10 tion af carbonforbindelser, bouillonen til prøvning for assimilation af kaliumnitrat, den vitaminfrie bouillonen til prøvning for vækst og bouillonen til prøvning af virkningen af vitaminer på vækststimulering. Leucinethylester udnyttes i sammenligning med leucin langsomt som 15 carbonkilde. De andre medier var af organisk art og skulle understøtte vækst uden supplementer. Til stammen CBS-599 anvendtes også de ovennævnte definerede medier med og uden supplementerne.

Som vist i de følgende beskrivelser, havde kulturerne de 20 fleste af de dyrkningsmæssige og morphologiske egenskaber fælles. Nogle få forskelle blev bemærket. F.eks. blev stregkulturen af stamme CBS-599 på glucose-gærekstrakt-pepton-agar lidt ru eller lidt rynket, medens stregkulturen af stamme PC-30827 blev fint rynket. Stamme PC-30827 25 viste ringe vækst på majsmelager og producerede mindre virkeligt mycelium sammenlignet med stamme CBS-599.

For stamme CBS-599 var resultaterne, hvor de definerede medier blev suppleret med leucinethylester og uracil, de samme som den uden supplementer, undtagen at citronsyre 30 blev udnyttet uden supplementerne, men ikke i mediet med supplementerne. Dette tyder på, at supplementerne ikke blev anvendt som hverken carbon- eller nitrogenkilder; DK 171878 B1 17 således er deres tilsætning til de definerede medier for stamme PC-30827 acceptabel.

Sammenlignet med stamme CBS-599, viste stamme PC-30827 ingen til svag snarere end godt vækst på ravsyre, D-glu-5 citol og glycerol; ingen snarere svag vækst på vitaminfrit medium og salicin; ingen til svag snarere end god vækst på thiamin for vækststimulering. Stamme PC-30827 voksede ikke på L-sorbose, medens det omvendte var tilfældet for stamme CBS-599.

10 De adskillige forskelle ved biokemiske prøvninger med stamme PC-30827 og CBS-599 var af kvantitativ art. Mutantstammen PC-30827 havde de fleste af de biokemiske prøvninger fælles med typekulturen CBS-599. Når resultaterne blev anvendt i en nøgle over arterne af Candida 15 foreslået af van Oden og Buckley i The Yeasts, Red. J. Lodder, 1070, henførtes hver af de to stammer til Candida Lipolytica - det imperfekte stadium af Yarrowia lipolyti-ca.

Stamme.,..CBS-599 20 Vækst Då glucose-gærekstrakt-pepton-vand:

Efter 3 dage ved 28 °C er cellerne ægformede, aflangt ægformede til aflange med 1-3 knopper. De ægformede celler måler 5-16 x 3-7 Mm; de aflange celler er op til 30 Mm lange. Pseudomycelium forefindes; en hinde forefindes; 25 sediment.

Vækst på glucose-gærekstrakt-pepton-agar:

Efter en måned ved 28 °C er kulturen flødefarvet, hævet, svagt ru eller svagt rynket med en mat eller fugtig overflade.

DK 171878 B1 18

Dalmau-pladekulturer på majsmelagar: Vækst moderat, næsten hvid. Pseudomycelium og ægte, vægdelt mycelium forekommer. Enkelte, parrede eller tre ægformede biastosporer dannes terminalt eller pleuralt på 5 hyferne eller pseudohyferne, sommetider på en kransstillet måde.

Gæring: Negativ på glucose, galactose, saccharose, maltose, trehalose og lactose.

Assimilation af carbonforblndelser: Basalmedium (basalme-10 dium plus leucinethylester og uracil)

Glucose +(+) Opløselig Ribitol -(-)

Galactose -(-) stivelse -(-) Galactitol -(-) L-Sorbose +(+) D-Xylose -(-) D-Mannitol +(+)

Saccharose -{-) L-Arabinose -(-) D-Glucitol +(+)

Maltose -(-) D-Arabinose -(-) Saiicin - til svag

Cellobiose -(-) D-Ribose svag(svag) (- til svag)

Trahalose -(-) L-Rhamnose -(-) Dl-Maelkesyre svag ( + )

Lactose -(-) Ethanol +(+)

Mellibiose -(-) Glycerol +(+) a-Methyl-

Raffinose -(-) Erythritol +(+) D-glucosid -(-)

Melezitose -(-) Inositol -(-) Ravsyre +(+)

Citronsyre +(-)

Assimilation af kaliumnitrat (med eller uden leucinethylester og uracil): Negativ.

Vækst i vitamin-frit medium (med eller uden leucinethyl-15 ester og uracil): Svag vækst.

Vitamin-stimulerende vækst: Thiamin i næringsvæsker med eller uden leucinethylester og uracil stimulerer vækst.

DK 171878 B1 19

Natriumchlorid-tolerance: 11-12%.

Maximumstemperatur for vækst: Mellem 37 og 45 °C.

Stamme PC-3Q827 Vækst i alucose-gærekstrakt-pepton-vand: 5 Efter 3 dage ved 28 °C er cellerne ægformede, aflangt ægformede, aflange, sjældent elliptiske, med 1-3 knopper.

De ægformede celler måler 5-14 x 3-6 μπι; de aflange celler er op til 25 μπι lange. Pseudomycelium forekommer; en hinde forekommer; sediment.

10 Vækst på alucose-aærekstrakt-pepton-agar:

Efter en måned ved 28 °C er stregkulturen flødefarvet, hævet, fint rynket, med en mat overflade.

Dalmau-pladekulturer på maismelaaar; Vækstringe, næsten hvide. Pseudomycelium forekommer, 15 sparsomt og kort. Ægte, vægdelt mycelium forekommer sjældent. Enkelte eller parrede ægformede til kugleformede biastospore blandes terminalt eller pleuralt, sommetider i grupper.

Gæring: Negativ på glucose, galactose, saccharose, malto-20 se, trehalose og lactose.

Assimilation af carbonforbindelser: (basalmedium plus leucinethylester og uracil)

Glucose svag opløselig Ribitol

Galactose - stivelse - Galactitol L-Sorbose - D-Xylose - D-Mannitol

Saccharose - L-Arabinose - D-Glucitol - til svag

Maltose - D-Arabinose - Salicin

Cellobiose - D-Ribose svag DL-Maelkesyre svag DK 171878 B1 20

Trehalose - L-Rhamnose - α-Methyl-

Lactose - Ethanol svag D-glucosid

Melibiose - Glycerol - Ravsyre - til svag

Raffinose - Erythritol + Citronsyre

Melezitiose - Inositol

Assimilation af kaliumnitrat (plus leucinethylester og uracil): Negativ Vækst i vitamin-frit medium (plus leucinethylester og 5 uracil): Negativ

Vitamin-stimulerende vækst: Thiamin i næringsvæsker med leucinethylester og uracil stimulerer svag eller ingen vækst.

Natriumchlorid-tolerance: 11-12% 10 Maximumstemperatur for vækst: Mellem 37 og 45 °C.

Y. lipolytica PC-30827 indeholder den sjældent reverte-rende mutation leu2-35. Y. lipolytica LEU2-genet koder for enzymet a-isopropylmalat-dehydrogenase (EC1.1.1.85) og er kodet for af leuB-genet E. coli og LEU2-genet i S.

15 cerevisiae.

Indsætning af pLD25 i hver af E. coli JC-355 og i Y. lipolytica ATCC 20688, gav transformanter af begge indeholdende pLD25. De er identificeret i kultursamlingen hos Pfizer Inc. som henholdsvis F.D. 27534 og F.D. 27533.

20 Hver af transformanterne er blevet deponeret i ATCC under de tidligere anførte adgangsbetingelser og er blevet tildelt accesionsnumrene henholdsvis ATCC 39464 og ATCC 20687.

Kromosomalt DNA fra Y. lipolytica stamme NRRL Y-1094, en 25 vild-type-stamme (dvs. en stamme, der er almindeligt anvendt af fagfolk indenfor mikrobiologiske processer) blev DK 171878 B1 21 opnået ved den metode, der er beskrevet af Hereford et al., Cell, 1£, 1261-1271 (1979).

Det hidtil ukendte plasmid pLD25 ifølge opfindelsen blev konstrueret ved ligering af lineariseret pBR322 med en 5 delvis Sau3A-nedbrydning af kromosomalt Y. lipolytica DNA ved hjælp af T4-ligase. pBR322 blev isoleret ved centrifugering i CsCl-ethidiumbromid-gradienter for at adskille kovalent lukket supersnoet pBR322 fra bakterielt DNA. Det isolerede pBR322 blev lineariseret ved spaltning i te-10 tracyclinresistens-genet (TcR) ved nedbrydning med re-striktionsendonuclease BamHI, hvilket resulterede i et lineært fragment med kohæsive (sticky) ender og med ampi-cillinresistens (AmpR) efterladt som det fænotype træk. Agarosegel-elektroforese af vektoren viste, at den var i 15 det væsentlige fri for bakterielt DNA. Det således fremstillede lineariserede pBR322 behandles derpå ønskeligt med alkalisk phosphatase for at forhindre efterfølgende selvligering, dvs. recirkularisering og dimer-dannelse af vektor-DNA'et.

20 Den anden komponent af pLD25 opnås ved delvis nedbrydning af det kromosomale DNA fra Y. lipolytica stamme NRRL Y-1094, en vild-type-stamme, med restriktionsendonucleasen Sau3A, som skaber næsten tilfældige fragmenter med kohæsive ender, der er komplementære med fragmenterne af Bam-25 HI-spaltningen af pBR322. DNA i området 4-10 kb, indhøstet fra agarose-geler, blev renset ved kendte procedurer før ligering med BamHI-skåret, med alkalisk phosphatase behandlet vektor pBR322.

Størrelsen af DNA-fragmenterne er ikke kritisk for frem-30 gangsmåden ifølge opfindelsen. Det kritiske aspekt hvad angår DNA-fragmenterne er, at de indeholder hele eller en tilstrækkelig del af den detekterbare markør, f.eks. LEU2-genet. Desuden må de indeholde kohæsive ender kom- DK 171878 B1 22 plementære med dem, der skabes ved restriktionsendonucle-asespaltning af E. coli plasmidet, i dette tilfælde pBR322.

Vektor-DNA'et og den delvise Sau3A-nedbrydning af kromo-5 somal Y. lipolytica DNA ligeres ved hjælp af T4 ligase i nærvær af adenosintriphosphat (ATP) som cofaktor.

Ligeringsblandingen transformeres først ind i E. coli MC 1061 (Casdaban et al., J. Mol. Biol. 138, 179-207, 1980), en stamme af E. coli, som giver en meget høj transforma-10 tionsfrekvens og er hsdR" hsdM+, hvorved der opnås et Y. lipolytica genbibliotek i den nævnte E. coli. Alle de potentielt forskellige ampicillin-resistente transformanter af E. coli MC 1061 blev dyrket sammen på ampicillin plus L-agarplader og indhøstet. Den indhøstede kultur blev 15 dyrket i en liter ampicillinholdigt medium. De blandede plasmider blev isoleret ved standardmetodologi til frembringelse af et genbibliotek. En prøve af biblioteket blev transformeret ind i E. coli JC-355. Transformanter blev selekteret på basis af ampicillinresistens. Disse 20 transformanter blev derpå replicaudpladet på syntetiske medier, der manglede leucin. Alternativt kunne transformationsblandingen direkte udplades på syntetiske medier, der manglede leucin og indeholdt ampicillin. Flere således selekterede transformanter var leucin-prototrophe.

25 Plasmidet i de nævnte transformanter isoleres ved standard metoder og betegnes som pLD25.

Plasmid-minipræparationer fremstillet udfra de sjældne leucin-prototrophe transformanter og analyseret ved nedbrydning med HindiII og Sall findes at indeholde de for-30 ventede 3,7 kb fragment fra pBR322 og 2 store fragmenter, som tyder på en indsætningsstørrelse på omkring 6,6 kb. Desuden fandtes et lille fragment (fra Sall-bindings-stedet i pBR322 til det nærmeste Sall-sted i indsætnin- DK 171878 B1 23 gen, se figur 3). Sammenligning af Southern-blot-hybridi-seringer (Southern, J. Mol. Biol. 2å, 503-517, 1975) af plasmid pLD25 med hybridiseringer af EcoRI-nedbrudt kromosomalt DNA fra Y. lipolytica viste, at de 3 interne 5 fragmenter i den klonede indsætning var identiske i det kromosomale DNA.

Transformanter af Y. lipolytica med intakt pLD25 og med KpnI-skåret pLD25 blev prøvet for at bestemme, som de indeholdt integreret eller uafhængigt replicerende pLD25 10 (det LEU2-holdige plasmid). Kromosomalt DNA blev fremstillet udfra de leucin-prototrophe transformanter og udgangsstammen Y. lipolytica ATCC 20688. DNA-prøverne blev spaltet med Hindlll, kørt på 0,5% agarosegel og analyseret ved Southern-blotteknikken under anvendelse af radio-15 aktivt pBR322 for at måle tilstedeværelsen af plasmidet pLD25 i prøverne. Der blev ikke iagttaget nogen homologi mellem Y. lipolytica udgangsstammen og proben. Da der er ét Hindlll-bindingssted i pLD25 (i pBR322-segmentet) og intet i Y. lipolytica segmentet, kunne der observeres et 20 bånd af pLD25 størrelse (ca. 11 kb) dersom pLD25 blev repliceret uafhængigt i transformanterne. Fraværet af et sådant bånd fører til den konklusion, at transformanterne alle er integranter. Cirkulære, lineariserede og afbrudt-lineariserede plasmider kan transformere Y. lipolytica 25 ved rekombination med homologe kromosomale sekvenser. Imidlertid var transformant-sekvensen meget højere i de Kpnl-skårne plasmid-behandlede celler end i de intakte plasmid-behandlede celler, hvilket yderligere tyder på, at der skete integrativ transformation som beskrevet af 30 Orr-Weaver et al. for S. cerevisiae (Proc. Natl. Acad.

Sci., 23, 6354-6358, 1981) også i Y. lipolytica. De ovennævnte Southern-blots viser, at strukturen af de integrerede transformanter afledt fra lineære molekyler opfører sig identisk med strukturen af transformanter afledt fra 35 cirkulære molekyler (dvs. plasmider). Yderligere DK 171878 B1 24

Southern-blot forsøg har vist, at nogle af de sjældne transformanter stammende fra intakt-plasmid-behandlinger mangler pBR322-hybridiserbart materiale og sandsynligvis opstod ved genomdannelses- eller dobbelte rekombinations-5 hændelser.

Anvendeligheden af det her beskrevne transformationssystem påvises ved shuttlefunktionen af de integrerede plasmider beskrevet i det nævnte transformationssystem fra Y. lipolytica til E. coli for at fuldende kredsløbet.

10 Endvidere muliggør de integrative shuttlevektorer kloning af ønskede Y. lipolytica gener ved konstruktion af genbiblioteker efterfulgt af selektion eller afsøgning i en Y. lipolytica recipient.

Forsag 15 Materialer oa metoder:

De fleste restriktionsenzymer, herunder BamHI, Sall, Bglll, Hindlll og Sau3A, blev fremskaffet fra New England Biolabs (NEB) ligesom T4-DNA-ligase og E. coli polymerase I. Apal blev fremskaffet fra Boehringer-Mannheim. Alle 20 enzymer blev anvendt ifølge de betingelser for deres anvendelse, som er beskrevet af de respektive producenter.

Sall blev også fremskaffet fra Bethesda Research Laboratories (BRL) og var den bakterielle alkaliske phosphatase, Kpnl, Xhol. Den bakterielle alkaliske phosphatase 25 blev anvendt i en mængde på omkring 100 enheder pr. μg lineariseret plasmid-DNA ved 65 °C i BamHI-prøvningspuffer i 2 timer. Restriktionsnedbrydninger blev analyseret ved elektroforese i neddykkede 0,8% agarose-geler under anvendelse af "Tris"-borat-EDTA-puffer (Maniatis et al., 30 "molecular Cloning", Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y., 1982).

DK 171878 B1 25

Medier:

Beriget medium til E. coli var L- bouillon indeholdende pr. liter 10 g Bacto-trypton, 5 g Bacto-gærekstrakt og 5 g NaCl og indstillet til pH 7,5. Minimalmedium til E. co-5 li indeholdt 56 salte med 0,33% dextrose (Low, J. Bacte-riol. 113. 798-812, 1973). Aminosyrer eller baser blev suppleret til 50 μg/ml, hvor der var behov for det. Bakterier blev dyrket ved 37 °C.

Beriget medium til gær var YPD indeholdende 1% Bak-10 togærekstrakt, 2% Bacto-pepton og 2% dextrose. Gærmini-malmedium, SD, indeholdt 0,67% Bacto-gærnitrogenbase uden aminosyrer og 2% dextrose. Syntetisk komplet medium indeholdt 870 mg/1 pulveriserede lagersupplementer fremstillet ved formaling af følgende sammen i en morter og stø-15 der: 2 g af hver af adeninsulfat, uracil, tryptophan, histidin-HCl, arginin-HCl og methionin, 3 g tyrosin, 6 g leucin, 5 g phenylalanin, 20 g thronin, 3 g lysin. Til næringsmæssig prøvning eller selektion blev den pågældende ingrediens udeladt fra mediet. Y. lipolytica blev dyr-20 ket ved 28 °C.

Isolering af kromosomalt Y. lipolvtica DNA: a. DNA af kloninoskvalitet.

Vild-type-stammen NRRL Y-1094 blev dyrket ved 28 °C til

1-2 x 10® celler pr. ml i 4 x 300 ml YPD i Fernbach-25 rystekolber efter podning med 15 μΐ fra en frisk kultur i stationær fase. Alle de følgende manipulationer af cellerne blev gennemført ved 29 °C eller stuetemperatur. Cellerne blev indhøstet ved centrifugering, vasket i 50 ml 1 M NaCl og nedcentrifugeret igen. Derpå gennemførtes 30 en 15 minutters før-sfæroplast-dannelses-inkubation i 50 ml 0,2 M Tris(hydroxymethyl)aminomethan-HCl ("Tris"-HCl) pH 8,5 0,02 M ethylendiamintetraeddikesyre (EDTA), 1 M

DK 171878 B1 26

NaCl og 0,1 M 2-mercaptoethanol efterfulgt af indhøstning ved centrifugering. Cellepellen blev gensuspenderet i 40 ml 1 M NaCl indeholdende 1 mg/ml zymolase 5000 (fra Kirin Breweries, Japan) og inkuberet i 45 minutter. På dette 5 tidspunkt var mere end 90% af cellerne omdannet til sfær-oplaster påvist mikroskopisk ved cellelyse efter fortynding i vand.

Sfæroplasterne blev nedcentrifugeret og gensuspenderet i 4 reagensglas i ialt 16 ml 1 M NaCl. Der tilsattes 40 ml 10 lysepuffer [50 mM "Tris" pH 6,8, 100 mM EDTA, 0,5% natri-umdodecylsulfat (SDS)] indeholdende 0,1 mg/ml proteinase K, og lysatet blev inkuberet ved 37 °C i 1,5 time. Lysa-tet blev ekstraheret med et lige så stort volumen phe-nol/chloroform (1:1). Efter centrifugering ved 9000 15 omdr./min for at adskille faserne blev den vandige fase igen ekstraheret med phenol/chloroform. Den endelige vandige fase blev kombineret med to volumener ethanol til frembringelse af store bundfald af DNA. Væsken blev hældt fra, og pellen skyllet med 70% og 100% ethanol før vaku-20 umtørring. Den tørrede pelle blev genopløst i 8 ml TE (10 mM "Tris"-HCl pH 8, 1 mM EDTA) ved 65 °C efterfulgt af RNAse nedbrydning med 300 μΐ. RNAse A (1 mg/ml, kogt i 5 minutter) i 1 time ved 37 °C. Materialet blev ekstraheret to gange med phenol/chloroform og ethanolfældet som før.

25 Det endelige bundfald blev skyllet med ether for vakuumtørring .

DNA-pellen blev genopløst i TE som før, og der tilsattes 2 ml 100 x TE efterfulgt af vand til 29,04 g. Opløsningen blev sat til 37,67 g CsCl, overført til centrifugeglas og 30 nedcentrifugeret i 17 timer ved 4000 omdr./min. ved 15 °C i en Beckman L8-70 ultracentrifuge under anvendelse af en VTi 50 rotor. Gradienten blev indhøstet ved at dyppe fraktioner indeholdende omkring 1,25 ml fra glassets bund efter punktur med en nål. Fraktionerne blev prøvet for DK 171878 B1 27 DNA ved elektroforese af prøver på en agarosegel indeholdende 0,5 μ9/ιη1 ethidiumbromid, og fraktionerne 16, 17 og 18 (ud af 26) blev bevaret. Disse DNA-holdige fraktioner blev hældt sammen, dialyseret overfor fire udskiftninger 5 af 1 x TE og ethanol fældet. DNA’et blev genopløst i 0,6 ml 1 x TE, og præparatet blev ved absorbans ved 260 nm bedømt til at indeholde 129 μg DNA.

b. DNA til Southern-blots.

Vi fandt, at SDS-sfæroplast-lysen og kaliumacetatbehand-10 lingen fra S. cerevisiae mini-prep-metoden (samlet i Sherman et al., "Methods in Yeast Genetics", Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y., 1981) var hensigtsmæssig til opnåelse af Y. lipolytica DNA.

Præparation af plasmid-DNA.

15 Bakterielt plasmid-DNA blev præpareret ved hurtigkogningsmetoden beskrevet af Holmes et al., Anal. Biochem.

114. 193-197 (1981). Efterfølgende centrifugering i CsCl-ethidiumbromidgradienter blev kun gennemført for præparationer i stor målestok. DNA-præparaterne blev opbevaret 20 ved 4 °C i steril TE-puffer.

E. coli transformation.

Der anvendtes CaCl2~metoden beskrevet af Dagert et al.,

Gene £, 23-28 (1978). Både celler behandlet med CaCl2 natten over og kortvarigt behandlede celler blev anvendt 25 ved transformationer.

Southern-blotforsøg.

DNA overført til nitrocellulose (Southern 1975) blev hy-bridiseret til ^2P-mærkede "nick-translaterede" prober i 6 x SCP puffer (20 x SCP lageropløsning indeholder 2,0 M 30 NaCl, 0,6 Na2HP04, og 0,2 M EDTA pH 6,2), 1% sacrosyl, DK 171878 B1 28 med 40 pg/ml denatureret kalvethymus- eller E. coli DNA. Nick-translationsmetoden beskrevet af Maniatis et al. (loc. cit.) blev anvendt med E. coli polymerase I.

Fremstilling af delvise Sau3A-nedbrvdninper af Y. lipolv-5 tica DNA.

Omkring 15 μg af dette DNA blev delvist nedbrudt med restriktionsenzymet Sau3A (New England Biolabs) i hvert af fire glas under anvendelse af 0,05, 0,1, 0,2 og 0,4 enzymenheder pr. μg DNA i 0,5 time ved 37 °C ifølge leveran-10 dørens forskrift. Reaktionerne blev stoppet ved opvarmning til 65 °C i 10 minutter, og reaktionsblandingerne derpå anbragt på 0,8% præparative agarosegeler. DNA i størrelsesområdet 4-10 kb (sammenlignet med Hindlll-skårne λ-størrelsesstandarder fra Bethesda Research Labs) 15 blev indhøstet fra gelerne, elektroelueret, renset på DE52-søjler (Yang et al., Methods en Enzymology, ££, 176, 1979) og ethanol fældet før ligering med BamHI-skåret, med alkalisk phosphatase behandlet vektor pBR322.

Konstruktion af et genbibliotek af Y. lipolvtica.i vektor 20 PBR322.

Ligeringsblandingen indeholdende omkring 1 pg DNA blev anvendt til at transformere E. coli stamme MC1061 (Casadaban et al., J. Mol. Biol. 1M, 179-207, 1980) til skabelse af et Y. lipolytica genbibliotek. Transformati-25 onsblandingen gav omkring 1,4 x 10^ kolonier på 10 mg/ml ampicillin plus L-agarplader. 50 kolonier blev anbragt på en enkelt plade og replica-udpladet til prøvning af resistens over for 5 mg/ml tetracyclin. 44 (88%) var følsomme, hvilket tyder på at de mest sandsynligt indeholdt en 30 indsætning i BamHI-bindingsstedet for at afbryde tetR-genet i pBR322. Plasmidpræparationer i minimålestok fra 18 tilfældigt valgte ampR-kolonier blev undersøgt ved restriktionsenzymnedbrydning i form af dobbeltnedbrydninger DK 171878 B1 29 med Hindlll og Sall og nedbrydninger med BamHI. Ti af plasmiderne havde indsætninger med en gennemsnitsstørrelse omkring 7 kb.

48 ampicillinplader indeholdende omkring 1,4 x 10^ E. co-5 li transformantkolonier blev replica-udpladet på LB plus 10 μg/ml ampicillin. Replica blev vasket med 5 ml 0,85% NaCl hver. De sammenhældte celler blev pelleteret ved centrifugering og gensuspenderet i 11 ml LB og 2,5 ml 80% glycerol. To kulturer med 1 L LB og 10 μg/ml ampicillin i 10 Fernbach-kolber blev sat i gang med 4 ml af de sammenhældte bakterier hver, og de resterende bakterier blev opbevaret ved -70 °C. Kulturerne blev anvendt til at fremstille det plasmid-DNA, der blev betegnet som vort Y. lipolytica genbibliotek af fragmenter fra delvis Sau3A-15 nedbrydning i pBR322.

Afsøgning af genbiblioteket i E. coli mutanter

Flere E. coli stammemutanter for forskellige genetiske markører blev transformeret med genbiblioteket. For at opnå genetisk komplementering er to hovedfaktorer nødven-20 dige: (1) det tilsvarende Y. lipolytica gen må indeholdes intakt på mindst et af plasmiderne i vort bibliotek; og (2) Y. lipolytica genet må fungere i en tilstrækkelig grad i E. coli celler. Biblioteket blev af søgt både ved direkte selektion for hver markør på det passende medium 25 og også ved indledende selektion for ampicillinresistens efterfulgt af replica-udpladning på selektivt medium. For hver undersøgt genetisk markør blev der undersøgt 10^ transformanter. Stamme JC355 blev anvendt til med held at klone LEU2-genet.

30 Alle E. coli kolonier, som voksede på selektive medier, blev yderligere undersøgt ved en "retransformations"-prøvning. Til denne prøvning blev plasmid præpareret ud fra en 5 ml kultur af stammen, der voksede på selektive DK 171878 B1 30 medier. Plasmid-minipræparaterne blev derpå anvendt til at transformere den pågældende mutante E. coli udgangsstamme. Tilstedeværelsen af mange ampicillinresistente transformanter, men få eller ingen kolonier på selektive 5 medier førte til den konklusion, at den oprindelige koloni ikke indeholdt det ønskede Y. lipolytica gen og mest sandsynligt voksede på grund af mutation til prototrophi.

Hvis alle de ampicillinresistente kolonier også voksede på selektive medier for det gen, som blev prøvet, blev 10 det konkluderet, at plasmidet opnået udfra den oprindelige koloni indeholdt en indsætning, der komplementerede E. coli mutationen. Der blev fundet i alt 7 leucin-uafhængige transformanter af JC355 (leuB6), der indeholdt den identiske indsætning i pBR322. Plasmidminipræparatio-15 ner udfra to af disse kolonier gav 100% (37/37 og 31/31) ampicillinresistente leucin-prototrophe transformanter ved retransformations-prøvningen. Plasmidet blev betegnet pLD25.

Bekræftelse på. at det E. coli leuB6-komplementerende DNA 20 kom fra Y. lipolvtica.

For at bekræfte, at indsætnings-DNA'et fra pLD25 kom fra Y. lipolytica, gennemførtes et Southern-blotforsøg (1975). Der fremstilledes et nyt præparat af totalt Y. lipolytica DNA, idet man undlod det afsluttende CsCl-25 gradient-trin. EcoRI-nedbrydningsmønsteret af Y. lipolytica DNA'en afslørede identitet med tre bånd inden for indsætningen i pLD25 (fig. 2).

Yderligere karakterisering af indsætningen i PLD25.

Der blev afledt et delvist restriktionskort af pLD25 un-30 der anvendelse af flere fælles enzymer (fig. 3). Den totale mængde Y. lipolytica DNA indeholdt i plasmidet blev bedømt til omkring 6,6 kb.

DK 171878 B1 31

Transformationsforskrift.

En modifikation af lithiumacetat-metoden (Ito et al., J. Bacteriol. 153r 163-168, 1983) med den ultralydbehandlede bærer-DNA-tilsætning anvendt til S. cerevisiae transfor-5 mation blev tilpasset til Y. lipolytica transformation.

Sene log-fase-kulturer på 3-10 x 107 celler/ml gav sædvanligvis flere transformanter end log-fase (1 x 107 celler/ml) kulturer. 50 ml YPD-kulturer blev pelleteret og derpå gensuspenderet i 10 ml 10 mM "Tris", 1 mM EDTA pH 10 7,5. De blev genpelleteret og gensuspenderet i 2-3 volu mener af den ovenstående puffer plus 0,1 M lithiumacetat og blandet forsigtigt på en New Brunswick valsetromle ved 28 °C i 1 time. De Li-behandlede celler blev delt op i flere transformationsglas indeholdende mellem 0,1 og 1,0 15 ml celler, 1 μg transformerende plasmid og 50 μg ultralydbehandlet heterolog bærer-DNA (størrelsesområdet viste sig at være 0,5-9 kb på en agarosegel). Transformationsglassene blev efterladt ved 28 °C i 30 minutter, og derpå tilsattes 7 volumener PEG-reagens (40% polyethylenglycol 20 4000, 0,1 M LiAc, 10 mM "Tris", 1 mM EDTA, pH 7,5 - fil tersteriliseret. Efter yderligere 1 time ved 28 °C anvendtes varmepuls (sædvanligvis 37 °C i 5 minutter). Cellerne blev endeligt nedcentrifugeret ved 3000 omdr./min. i 2 minutter, gensuspenderet i vand og udpladet på pas-25 sende medier.

Konstruktion af PLD28:

En blanding af 2 μg hver af pLD25 og YEp24 (ATCC 37051) blev inkuberet ved 37 °C med 6,25 enheder Sall i 50 μΐ Sall-puffer i 1,5 time. Nedbrydningen blev derpå ekstra-30 heret med et lige så stort volumen phenol efterfulgt af tre ekstraktioner med ether (1,5 ml). DNA'et blev udfældet ved tilsætning af tilstrækkeligt natriumchlorid og absolut ethanol til at give 0,1 M natriumchlorid- og 70% DK 171878 B1 32 ethanol-koncentration. DNA'et blev opsamlet og opløst i et lige så stort volumen TE puffer. 10 μΐ af DNA-opløsningen blev derpå behandlet med T4-DNA-ligase i 20 μg reaktionsvolumen i 1 time ved 14 °C. Selektion for det 5 ønskede rekombinante plasmid blev udført ved transformation af E. coli DB 6507 ifølge de efterfølgende procedurer. Transformationsblandingen blev udpladet på 11 plader med syntetisk medium for E. coli, indeholdende threonin, prolin og leucin, men uden uracil. Der blev opnået mere 10 end 100 kolonier pr. plade. De resulterende transforman-ter blev replica-udpladet på leucin-deficiente plader for at prøve for tilstedeværelsen af Y. lipolytica LEU2-genet på hvert plasmid. De kolonier, der voksede langsomt uden tilsat leucin, blev udstrøget til enkelte kolonier på am-15 picillinplader og prøvet for tetracyclinfølsomhed. 24 kolonier, som var ampicillinresistente, tetracyclinfølsom-me, blev anvendt til plasmid-minipræparationer. Plasmid-DNA-præparaterne blev analyseret ved SalI-nedbrydning for de to forventede bånd (7,5 kb fra YEp24 og 5,3 kb fra 20 LEU2) og ved EcoRI-nedbrydning for de 5 forventede bånd (fig. 6). To plasmider havde det passende mønster. Det første plasmid blev bevaret og betegnet pLD28.

Konstruktion af plasmidet PLD40 med et mindre segment af LEU2-genet end både pLD25 og oLD28 25 En delvis EcoRI-nedbrydning af pLD25 blev udført ved behandling af omkring 25 μg pLD25 med 20 enheder restriktionsenzym i 200 μΐ og udtage af aliquoter efter 9, 12, 15, 18 og 21 minutter. Ved hver tid anbragtes 20% af det totale volumen i gelprøvepuffer indeholdende 33 mM EDTA 30 (efter fortynding) for at stoppe reaktionen. Tidsprøverne blev kørt på en gel, og det ønskede bånd (der vandrede lidt langsommere end 2,3 kb λ-HindIII-størrelsesstandar-den) blev udskåret med et barberblad. Båndet blev elek-troelueret i en dialysepose og renset på en minisøjle DK 171878 B1 33 (Schleicher and Schuell Elutip-D), som angivet af leverandøren. Den vektor, som anvendtes til at klone det LEU2-holdige bånd, var EcoRl-nedbrudt, bakteriel alkalisk phosphatase behandlet pBR322. Vektoren og indsætnings-5 DNA'et blev kombineret med T4-DNA-ligase, og den resulterende blanding blev anvendt til at transformere E. coli stamme MC1061 til ampicillinresistens. Plasmid-minipræpa-rater blev undersøgt ved nedbrydning med EcoRI-restrik-tionsendonuclease. Fire af de første 34 præparater inde-10 holdt den ønskede indsætning. For at prøve indsætningernes orientering i hvert plasmid udførtes dobbeltnedbrydning med HindiII og Xhol. Tre havde orienteringen af pLD40 (fig. 7), og et den omvendte orientering. Det blev navngivet pLD41. Disse to plasmider blev transformeret 15 ind i E. coli JC355 (efter at der var foretaget præparationer i stor målestok i MC1061) for at prøve for udtrykkeisen af Y. lipolytica LEU2-genet. Overraskende viste det sig, at transformanten indeholdende pLD40 gav udmærket vækst på medier, der manglede leucin, (bedre end 20 transformanter indeholdende pLD25 eller pLD28), men at transformanten indeholdende pLD41 ikke voksede uden tilsat leucin. Bakterielle komplette medier for dette forsøg bestod af 56/2 plus vitamin Bl, glucose, histidin, ar-ginin, methionin, leucin og 20 μg ampicillin. Det blev 25 konkluderet, at transkriptionen af LEU2-genet i pLD40 blev fremmet af mod-klokken-promotoren PI beskrevet af D. Stuber and H. Bujard (1981, Proc. Natl. Acad. Sci., 78: 167-171). Det er muligt, at den lavere bakterielle ud-trykkelse af Y. lipolytica LEU2-genet i pLD25 og pLD28 30 (sammenlignet med pLD40) stammer fra et segment af Y.

lipolytica DNA, der virker som en svag bakteriel promotor.

DK 171878 B1 34

Transformation af en Y. lipolvtica leu2-mutant med pLD25.

Y. lipolytica stamme PC-30827 (MATA leu2-35 ura3-ll) ATCC 20688 konstrueret af J. R. DeZeeuw blev anvendt som recipient for LEU2-genet klonet i pLD25. Det blev fundet, at 5 kulturer i senere stadier af vækst gav flere transforman-ter end celler i tidlig log-fase.

Denne erkendelse holdt stik, selv når omkring lige store antal celler i tidlig henholdsvis sen-fase blev behandlet med DNA og udpladet på leucin-deficiente plader. Plasmi-10 der, der var blevet lineariseret enten ved at være skåret i et unikt restriktionssted, eller ved at der var efterladt et lille gab (Bglll-skåret) i Y. lipolytica DNA'et, gav mange flere transformanter end intakt pLD25 eller plasmid lineariseret ved skæring i Hindlll-restriktions-15 stedet i pBR322. Disse sidstnævnte resultater mindre om det integrative transformationssystem i S. cerevisiae udviklet af Orr-Weaver et al., loc. cit. Tilsætningen af ultralydbehandlet E. coli DNA til det ved transformationen anvendte pLD25 gav flere transformanter, end når der 20 tilsattes enten bærer-DNA med stor molekylvægt eller ingen bærer-DNA. Mindre variationer i varigheden og temperaturer af opvarmningschoket efter inkubation af cellerne med DNA og polyethylenglycol viser sig kun at have en lille virkning på udbyttet af transformanter.

25 Transformanternes stabilitet.

En koloni af transformanterne omfattende pLD25 i Y. lipolytica ATCC 20687, her betegnet som DL10 blev udstrøget på en YPD-plade til enkelte kolonier efter at have vokse ikke-selektivt på en YPD-plade. Den resulterende YPD-30 kultur-plade blev repliceret på leucin-deficient syntetisk medium. Alle de ca. 50 godt adskilte kolonier var leucin-uafhængige, hvilket påviser stabilitet af transformanterne.

DK 171878 B1 35

Southern-blot for at detektere integration af pLD25 Y. lipolytica transformanterne var stabile, og transformationsfrekvensen blev stærkt forøget ved linearisering af donor-plasmid-DNA'et. Dette tydede på, at transforman-5 terne stammede fra integration af plasmidet i kromosomalt DNA ved det homologe bindingssted med enderne af donor-DNA'et som fundet i S. cerevisiae systemet af Orr-Weaver et al., loc. cit. Et Southern-blot forsøg (fig. 4) med HindiII-nedbrydning af Y. lipolytica DNA viste de samme 10 to bånd af homologi med pBR322 i transformanter stammende fra enten intakt eller lineariseret plasmid. Den iagttagelse, at det ene bånd var større end 23 kb λ-størrelsesstandarden, er tegn på integration af plasmidet i kromosomalt DNA.

15 Kloning af Y. lipolvtica HISl-genet Konstruktion af genbiblioteket.

Vektoren YEp24 (Botstein et al., Gene £, 17-24, 1979) blev nedbrudt med BamHI og behandlet med alkalisk phosphatase som beskrevet tidligere for pBR322. Det indsæt-20 nings-DNA, der anvendtes ved ligeringsreaktionen, var en fuldstændig BamHI-nedbrydning af kromosomalt Y. lipolytica DNA opnået fra Y. lipolytica NRRL-Y-1094 som beskrevet ovenfor. Nedbrydningen af kromosomalt DNA blev størrelsesfraktioneret før ligering, blot phenol ekstraheret.

25 Der blev opnået i alt ca. 27 000 ampicillinresistente transformantkolonier af E. coli stamme MC 1061 under anvendelse af ligeringsprodukterne. Plasmid-DNA'et opnået ud fra kulturer af disse sammenhældte transformantkolonier blev betegnet som biblioteket af BamHI-fragmenter af 30 Y. lipolytica i YEp24. Indsætningsfrekvensen blev bedømt som 95% (19/20 transformanter var tetracyclinfølsomme), og den gennemsnitlige indsætningsstørrelse var 4,2 kb.

DK 171878 B1 36

Isolering af HlSl-genet.

BamHI-biblioteket blev anvendt til at transformere mange forskellige E. coli auxotrophen i et forsøg på at finde et Y. lipolytica gen, der ville komplementere et mutant 5 E. coli gen. To transformantkolonier af E. coli hisGl mutanten AT2535 (fremskaffet som nr. 4517 E. coli Genetic Stock Center, Yale University) blev isoleret på syntetisk medium, der manglede histidin og indeholdt ampicillin. Begge kolonier indeholdt det samme plasmid pLD2l, som be-10 stod af en indsætning på omkring 4 kb i vektoren. Re-transformationsprøvningen var positiv med 419/419 ampi-cillinresistente transformanter af AT2535 med pLD21 bedømt som histidin-uafhængig ved replica-udpladning. Et Southern hybridiseringsforsøg viste, at BamHI-indsætnin-15 gen i pLD21 såvel som de to indsætningsfragmenter skabt ved en dobbeltnedbrydning med BamHI plus EcoRI vandrede sammen med fragmenter af kromosomalt Y. lipolytica DNA, som var blevet skåret på lignende måde.

For at prøve, om andre alleler af hisG kunne komplemente-20 res af pLD21, blev E. coli stamme NR5525 (E. coli Genetic Stock Center nr. 6416), som indeholder en TnlO-indsætning i HISG-genet, transformeret med plasmidet. Alle ampicil-linresistente transformantkolonier var i stand til at vokse langsomt efter replica-udpladning på medier uden 25 histidin, som det ville forventes fra TnlO's polaritetsvirkningen på de nedenfor beliggende gener i histidin-operonet. Direkte selektion for transformanterne på definerede medier, der manglede histidin og indeholdt ampicillin, var ikke mulig, antageligvis på grund af den 30 stærke polaritetsvirkning. Da Y. lipolytica DNA-indsæt-ningen i pLD21 var i stand til at komplementere hisG-mutationer i E. coli, konkluderede vi at den indeholdt Y. lipolytica HISl-genet i en form, der fungerede i E. coli.

DK 171878 B1 37

Virkningen af orientering på udtrvkkelse.

For at prøve om Y. lipolytica DNA-indsætningen fungerede uafhængigt af vektoren YEp24, blev BamHI-stykket subklo-net i pBR322. Indsætninger i begge orienteringer blev be-5 stemt ved EcoRI-nedbrydningsmønstret (fig. 5). pLD23, plasmidet med EcoRI-bindingsstedet i indsætningen fjernes fra EcoRI-stedet i pBR322, komplementerede de to tidligere anvendte hisG E. coli mutanter, medens pLD24, den anden orientering, ikke komplementerede mutationerne. Såle- 10 des er en sekvens på plasmidet nødvendig for effektiv udtrykkel se af Y. lipolytica HISl-genet i dette E. coli system. Det antages, at tetR-promotoren i pBR322 er den nødvendige komponent.

Transformation med udvidede segmenter af kromosomalt DNA.

15 Det ca. 5,3 eller 5,4 kb lange Sall-stykke af Y. lipolytica DNA indeholdende LEU2-genet (gel renset fra en plas-mid-nedbrydning) fandtes at være i stand til at transformere Y. lipolytica leu2-mutantrecipienten til prototrophi med en høj frekvens (større end 1000 transformanter pr.

20 μ9)· Denne integrationshændelse repræsenterer en anden slags rekombination end transformationen med et lineari-seret plasmid. Det frembyder muligheden af at indsætte en ønsket sekvens i et område af Y. lipolytica DNA og integrere den ønskede sekvens uden også at integrere bakte- 25 rievektoren i værten. Denne type system er blevet udviklet i S. cerevisiae af R. Rothstein, Methods in Enzymolo-gy 101:202 (1983). Præparater af kromosomalt Y. lipolytica DNA, både med stor molekylvægt og let sheared, blev også anvendt til opnåelse af LEU2-transformanter.

30 Kloning af URA3-genet

Det første trin bestod i konstruktion af et genbibliotek af delvise Sau3A-nedbrydninger af Y. lipolytica DNA i DK 171878 B1 38

BamHI-bindingsstedet af pLD40 ifølge den ovenfor beskrevne procedure til konstruktion af et genbibliotek i pBR322.

For at opnå en høj frekvens af transformation og også at 5 målrette molekylerne i biblioteket til at integrere ved LEU2-locusset blev biblioteks-DNA'et nedbrudt med enzymet Apal, som foretager et snit i LEU2-området af udgangsvektoren pLD40. (Da det ikke var kendt, om det ukendte URA3-gen selv indeholdt et Apal-bindingssted, udførtes også en 10 delvis Apal-nedbrydning af en prøve af biblioteks-DNA'et for at sikre, at nogle af de således producerede molekyler kun ville blive spaltet ved et enkelt bindingssted. Imidlertid var den delvise nedbrydning ikke nødvendig).

Transformation af en Y. lipolvtica URA3-mutant med pLD40-15 bibliotek

En 50 ml kultur af Y. lipolytica stamme PC 30827 (ATCC 20688), recipienten, i YPD- bouillon blev dyrket til en OD ved 600 nm på 4,9. Dette svarende til et pakket volumen på 0,9 ml celler efter vaskningstrinnet i pH 7,5 TE-20 puffer som ved den ovenfor beskrevne transformationsforskrift. Cellerne blev derpå suspenderet i to gange deres volumen af lithiumacetat i TE, blandet forsigtigt på en rulletromle ved 30 °C i 1 time og derpå opdelt i tre transformationsglas. Hvert glas (15 ml Corning polysty-25 ren-centrifugeglas) modtog 0,9 ml cellesuspension, 300 μg (100 μΐ) ultralydbehandlet heterologt E. coli bærer-DNA og 6 μg Apal-behandlet biblioteks-DNA. Transformationsglassene blev inkuberet ved 30 °C i 30 minutter og derpå blandet med 7 ml PEG-reagens (beskrevet ovenfor) og inku-30 beret i yderligere 1 time. Glassene blev derpå underkastet et varmechok ved 37 °C i 10 minutter, hvorefter cellerne blev nedcentrifugeret ved 3000 omdr./min i 2 minutter. Cellerne fra hvert glas blev gensuspenderet i 0,6 ml DK 171878 B1 39 sterilt vand og udpladet på 12 plader med leucin-deficiente syntetiske helmedier.

Efter tre dage voksede i alt ca. 10 000 kolonier på de leucin-deficiente medier. Den negative kontrolplade kørt 5 parallelt med transformationsforsøget (intet DNA blev anvendt på disse celler, som i øvrigt blev behandlet identisk med de transformerede celler) indeholdt ingen voksende leucin-uafhængige kolonier.

De 36 transformationsplader blev replica-udpladet på ura-10 cil-deficiente syntetiske medier. Kun en koloni, som var uracil-uafhængig, blev fundet den næste dag. Denne koloni blev yderligere forarbejdet til udvinding af URA3-genet som beskrevet nedenfor. Et andet transformationsforsøg blev gennemført for at bestemme, om direkte selektion for 15 uracil-uafhængighed snarere end en første selektion for celler, der havde modtaget et plasmid (dvs. leucin-uafhængighed), efterfulgt af afsøgning for det ønskede træk, var mulig. Dette andet forsøg lignede det første, men gav en højere transformationsfrekvens på mellem 5 000 20 og 10 000 transformanter pr. μg transformerende DNA. Tre yderligere URA3-transformanter blev opnået ved dette forsøg ved direkte selektion på uracil-deficient medium og en yderligere ved leucin-selektion efterfulgt af afsøgning.

25 Udvinding af det URA3-holdige plasmid PLD55

En 50 ml YPD-kultur af den første uracil-uafhængige transformant blev dyrket natten over og indhøstet til DNA-præparation under anvendelse af den tidligere beskrevne phenol/chloroform- og protease-metode. Ca. 3 μg 30 (7%) af dette præparat af kromosomalt DNA blev nedbrudt fuldstændigt med enzymet Apal efterfulgt af ekstraktioner med phenol, phenol/chloroform og chloroform/isoamylalko-hol og derefter ethanolfældning. Dette DNA blev ligeret DK 171878 B1 40 med T4-DNA-ligase i et totalt volumen på 80 μΐ. 10 μΐ af denne reaktionsblanding blev anvendt til at transformere 100 μΐ kompetent E. coli plasmid stamme MC1061 til ampi-cillin-resistens. E. coli plasmid-minipræparater blev 5 fremstillet ud fra 9 transformanter og anvendt til en restriktionsanalyse. Alle 7 præparater, der gav spalteligt DNA, indeholdt identiske restriktionsmønstre med enzymerne Apal og EcoRI (fig. 8). De to præparater, der antageligvis ikke var rene nok til at tillade enzymnedbrydning, 10 havde identisk vandrende supersnoede plasmider som de andre 7. Det udvundne plasmid indeholdt de to EcoRI-bånd, som er karakteristiske for LEU2-indsætningen i pLD40 foruden de tre andre bånd. Med hensyn til nøjagtigheden af den viste gel (ca. 0,5-1 kb) manglede den URA3-holdige 15 indsætning i pLD40 et Apal-sted og indeholdt to EcoRI-steder.

For at bekræfte at plasmidet faktisk indeholdt USA3-genet, gennemførtes et retransformationsforsøg. Apal-nedbrydnings-minipræparatet blev anvendt til at transfor-20 mere Y. lipolytica recipienten. En del af denne transformationsblanding blev udpladet på uracil-deficiente medier, og en del på leucin-deficiente medier. Plader med omkring 100 transformanter på hver type medier blev udvalgt til replica-udpladning på det andet medium. Alle de leu-25 cin-selekterede kolonier var også uracil-uafhængige. Overraskende viste det sig, at kun omkring halvdelen af kolonierne selekteret på de uracil-deficiente medier også var leucin-uafhængige. Dette sidstnævnte resultat kan forklares ved visse hypoteser om nedbrydning og reparati-30 on af det transformerende DNA i det målrettede område (som i Orr-Weaver et al., Methods in Enzymology 101:228

[1984]). Da alle de leucin-uafhængige transformanter også var uracil-uafhængige, konkluderes det, at integration af plasmidet i LEU2-området komplementerede ura3-mutationen, DK 171878 B1 41 og at plasmidet, betegnet pLD55, indeholdt URA3-genet fra Y. lipolytica.

Påvisning af shuttlefunktion DNA blev præpareret ud fra Y. lipolytica transformanten 5 med pLD25 (ATCC 20687) ved den ovenfor beskrevne phe-nol/chloroform- og protease-metode, men uden efterfølgende anvendelse af cæsiumchlorid-gradienten.

Nogle få μg af det således isolerede DNA blev nedbrudt med enzymet Kpnl (det samme enzym, som blev anvendt for 10 at fremstille transformanten), phenol-ekstraheret, renset på en Schleicher og Schuell Elutip-D minisøjle (efter producentens retningslinier) og derpå ligeret under anvendelse af T4-DNA-ligase. Ligeringer i både middel (mere end 50 μg DNA pr. ml) og lave (mindre end 10 μg/ml) kon-15 centrationer var resultatrige ved en efterfølgende bakteriel transformation. Ligeringsblandingerne blev anvendt til at transformere E. coli stamme MC1061 til ampicillin-resistens som beskrevet tidligere. Der blev opsamlet mere end 10 E. coli transformanter og gennemført mini-plasmid-20 præparationer. Det store flertal af disse indeholdt plas-mider, som i restriktionsmønster var identiske med pLD25. Nogle få indeholdt tilsyneladende indsætninger af andre stykker af DNA i pLD25's Kpnl-bindingsstedet. Antageligvis var disse ekstra stykker forskellige Kpnl-fragmenter 25 af Y. lipolytica DNA, som blev indsat i den lineariserede vektor under ligeringen.

Et andet eksempel involverer plasmidet pLD28 og påviser de genetisk funktionelle forskelle mellem Y. lipolytica og S. cerevisiae. Y. lipolytica stamme ATCC 20688 blev 30 transformeret med Bglll skåret pLD28 til opnåelse af stammen DL11, som blev selekteret på leucin-deficient-syntetisk medium. Når den blev replica-udpladet på ura-cil-deficient syntetisk medium, blev der ikke detekteret DK 171878 B1 42 vækst, hvilket tyder på (eftersom enzymfunktionsprøvninger viser, at Y. lipolytica URA3-genet koder for det samme enzym som S. cerevisiae URA3-genet), at S. cerevisiae genet ikke komplementerede den tilsvarende Y. lipolytica 5 mutation. Plasmidet blev udvundet fra Y. lipolytica som ovenfor, bortset fra at der anvendtes enzymet Bglll, således at det udvundne plasmid manglede det lille Bglll-fragment. For at prøve om Y. lipolytica LEU2-genet ville fungere i S. cerevisiae, blev stammen DB745 (leu2-3,112 10 ura3-52 adel-100), konstrueret i D. Botstein's laborato rium og udbredt anvendt som vært for plasmider (se f.eks. Guarente and Ptashne, 1981 proc. NatΊ Acad Sci. USA 2Å, 2199, lignende stammer er tilgængelige som ATCC 44773 og ATCC 44774), transformeret med pLD28, idet der blev se-15 lekteret på uracil-deficient medium. S. cerevisiae transformanterne blev replica-udpladet på leucin-deficient medium og fandtes at vokse langsomt uden tilsat leucin. Det var muligt at selektere direkte for pLD28 i S. cerevisiae baseret på dets evne til i ringe grad at komplementere 20 leu2, selv om transformanter fremkom 24-48 timer senere på leucin-deficiente plader end uracil-deficiente plader, og der blev opnået en lidt lavere transformationsfrekvens. Således kan Y. lipolytica LEU2-genet fungere, om end svagt, når det sidder på dette multikopi-plasmid i S.

25 cerevisiae.

Den almene anvendelighed af den her beskrevne fremgangsmåde til opnåelse af Y. lipolytica gener fra biblioteker ved eftersøgning af de nævnte gener, som vil fungere Y. lipolytica, blev yderligere påvist ved heldig transforma-30 tion af et Y. lipolytica proteasegen og et Y. lipolytica adeningen.

Under anvendelse af det tidligere beskrevne bibliotek på basis af pLD40 og shuttlesystemet ifølge denne opfindelse er et Y. lipolytica proteasegen (XPR2) blevet klonet med DK 171878 B1 43 held. Den anvendte procedure lignede den, der er beskrevet ovenfor til kloning af URA3, XPR2 er strukturgenet for den secernerede alkaliske protease (Sims and Orgryd-ziak, J. Bacteriol, 145. 404, 1981). Recipientstammer af 5 Y. lipolytica, der inkluderede genetiske markører leu2, adel og xpr2, blev konstrueret ved genetisk standardteknik (Ogrydziak et al., Mol. Gen. Genetics, 163. 229, 1978). Ieu2-mutationen beskrevet tidligere heri, og forskellige xpr2-alleler og adel-allelet er tilgængelige fra 10 ATCC som numrene 46026-46028 og 46057-46070, deponeret af Ogrydziak (se Sims and Ogrydziak, loc. cit).

Biblioteket blev behandlet ifølge den af R. Parket, et al. beskrevne metode med delvis nedbrydning i nærvær af ethidiumbromid (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2A, 851, 15 1977) under anvendelse af enzymet Bglll. For at bestemme den passende mængde Bglll-enzym, ethidiumbromid og DNA, der skal anvendes, anvendtes et område af ethidiumbromid-koncentrationer på 0,005-1 μρ pr. μΐ med omkring 1 μg bibliotek-DNA i 10 μΐ indeholdende 4 enzymenheder pr.

20 glas. Inkubationstiden var 1 time ved 37 °C. Glasset indeholdende omkring 0,05 μg/μl ethidiumbromid viste sig at give kraftig linearisering af plasmiderne i biblioteket uden at skabe nogen mindre fragmenter, som ville tyde på mere end et snit pr. molekyle. Dette forhold mellem kom-25 ponenterne blev opskaleret til fremstilling af bibliotek-DNA til transformationsformål. Denne behandling af bibli-oteks-DNA'et fjerner problemer som ellers ville forekomme, hvis både det målrettede integrationssted (LEU2-området) og det ønskede ukendte gen (XPR2) havde bin-30 dingssteder for det enzym, som anvendes til linearisering (Bglll). Transformanter opnået ud fra således behandlet DNA kunne være integranter ved enten LEU2-området eller XPR2-området i genomet. Under anvendelse af den samme transformationsmetode som før blev der opnået mere end 35 80 000 kolonier på leucin-deficient syntetisk medium.

DK 171878 B1 44

Disse blev replica-udpladet på skummetmælksindikatorpla-der (D. Ogrydziak et al., Genetics flZ, 621, 1977). Pro- tease-positive transformanter blev genkendt ved fremkomsten af en klaringszone på skummetmælkspladerne.

5 Endvidere er adeningenet fra Y. lipolytica blevet klonet ved komplementering. En dobbelt-mutant-recipient (leu2 adel) blev transformeret som beskrevet ovenfor, og leu-cin-uafhængige kolonier replica-udpladet på medier til selektion af ADE1. ADEl-holdige plasmider udvindes fra 10 transformanter og bekræftes ved retransformation.

Claims (13)

1. Vektor, som replicerer autonomt i E. coli, k e n - 5 detegnet ved, at den omfatter DNA indeholdende et område med tilstrækkelig homologi til integration af DNA'et i kromosomalt DNA fra Yarrowia lipolytica og en i Y. lipolytica detekterbar genetisk markør.

2. Vektor ifølge krav 1, kendetegnet ved, 10 at det nævnte DNA omfatter LEU2-, HISI- eller URA3-genet fra den nævnte Y. lipolytica. 3. pLD25, en vektor ifølge krav 1, kende tegnet ved et restriktionsendonuclease-spalt-ningskort som vist i fig. 3 og indeholdt i E. coli JC- 15 355, ATCC 39464.

4. Plasmid pLD28, en vektor ifølge krav 1, ken detegnet ved et restriktionsendonuclease-spaltningskort som vist i fig. 6, og som omfatter et Sall fragment indeholdende Y. lipolytica LEU2-genet indført i

20 Sall bindingsstedet af YEp24.

5. Plasmid pLD55, en vektor ifølge krav 1, ken detegnet ved et restriktionsmønster som vist i fig. 8 og indeholdende URA3-genet af Y. lipolytica indført i BamHI bindingsstedet af pLD40.

6. Plasmid pLD40, en vektor ifølge krav 1, ken detegnet ved et restriktionsendonuclease-spaltningskort som vist i fig. 7 og indeholdende LEU2 regionen af Y. lipolytica opnået ved en delvis EcoRl fordøjelse af pLD25 indført i EcoRl bindingsstedet af pBR322. DK 171878 B1

7. Fremgangsmåde til fremstilling af en Y. lipolytica transformerende vektor, kendetegnet ved, at man (a) lineariserer plasmid pBR322 med et restriktionsenzym, 5 (b) ligerer det lineariserede pBR322 med DNA omfattende et område med homologi med den nævnte Y. lipolytica og en detekterbar genetisk markør, og (c) transformerer E. coli mutanter med ligeringsproduktet fra trin (b) for at detektere funktionelle Y. lipoly-10 tica gener.

8. Transformant, kendetegnet ved, at den omfatter en vektor ifølge krav 1 i Y. lipolytica med en mutation i genet svarende til den nævnte selekterbare markør.

9. Transformant ifølge krav 8, kendetegnet ved, at den omfatter pLD25 i Y. lipolytica med deponeringsnummeret ATCC 20688, og at den har identificeringsegenskaber som Y. lipolytica ATCC 20687.

10. Transformant, kendetegnet ved, at den 20 omfatter pLD25, vektoren ifølge krav 3, i E. coli JC-355, og at den har identificeringsegenskaber som E. coli ATCC 39464.

11. Transformant ifølge krav 8, kendetegnet ved, at den omfatter pLD55 i Y. lipolytica, og at den har 25 identificeringsegenskaber som Y. lipolytica ATCC 20718.

12. Yarrowia lipolytica med identificeringsegenskaber som ATCC 20688.

13. Yarrowia lipolytica ifølge krav 12 deponeret som ATCC 20688.