NO854333L - Isolering av gener fra gjaerarter av slekten pichia. - Google Patents
Isolering av gener fra gjaerarter av slekten pichia.Info
- Publication number
- NO854333L NO854333L NO854333A NO854333A NO854333L NO 854333 L NO854333 L NO 854333L NO 854333 A NO854333 A NO 854333A NO 854333 A NO854333 A NO 854333A NO 854333 L NO854333 L NO 854333L
- Authority
- NO
- Norway
- Prior art keywords
- dna
- pichia
- plasmid
- gene
- fragment
- Prior art date
Links
- 241000235648 Pichia Species 0.000 title claims description 86
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 title claims description 65
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims description 49
- 238000002955 isolation Methods 0.000 title description 9
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 92
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 78
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 69
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 claims description 63
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 46
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 41
- 101150069554 HIS4 gene Proteins 0.000 claims description 34
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 claims description 34
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 32
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 31
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 31
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 31
- 230000009466 transformation Effects 0.000 claims description 30
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 29
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims description 25
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 claims description 23
- 239000000463 material Substances 0.000 claims description 20
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 claims description 18
- 230000002950 deficient Effects 0.000 claims description 14
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 13
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 13
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 claims description 13
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 12
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 claims description 12
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 11
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 claims description 11
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 8
- 230000010076 replication Effects 0.000 claims description 8
- RKNHJBVBFHDXGR-KEOHHSTQSA-N 1-(5-phospho-beta-D-ribosyl)-ATP Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O[C@H]1N1C(N=CN([C@H]2[C@@H]([C@H](O)[C@@H](COP(O)(O)=O)O2)O)C2=N)=C2N=C1 RKNHJBVBFHDXGR-KEOHHSTQSA-N 0.000 claims description 7
- 230000029087 digestion Effects 0.000 claims description 7
- 239000013605 shuttle vector Substances 0.000 claims description 7
- 238000000605 extraction Methods 0.000 claims description 6
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 5
- 108010085336 phosphoribosyl-AMP cyclohydrolase Proteins 0.000 claims description 5
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 claims description 4
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 claims description 4
- 241000235070 Saccharomyces Species 0.000 claims description 4
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 3
- 230000007547 defect Effects 0.000 claims description 3
- 230000012010 growth Effects 0.000 claims description 3
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims description 3
- 230000006696 biosynthetic metabolic pathway Effects 0.000 claims description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 claims description 2
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 claims description 2
- 239000006151 minimal media Substances 0.000 claims description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims 2
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 claims 1
- 241000235058 Komagataella pastoris Species 0.000 description 32
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 17
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 17
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 16
- 239000000047 product Substances 0.000 description 15
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 14
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 13
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 12
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 11
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 11
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 10
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 10
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 10
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 8
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 7
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- PHTQWCKDNZKARW-UHFFFAOYSA-N isoamylol Chemical compound CC(C)CCO PHTQWCKDNZKARW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 6
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 6
- 239000007984 Tris EDTA buffer Substances 0.000 description 5
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 5
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 5
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 5
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 5
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 5
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 5
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- IQUPABOKLQSFBK-UHFFFAOYSA-N 2-nitrophenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1[N+]([O-])=O IQUPABOKLQSFBK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108010033128 Glucan Endo-1,3-beta-D-Glucosidase Proteins 0.000 description 4
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 4
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 4
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 4
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 4
- 230000009469 supplementation Effects 0.000 description 4
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 3
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 3
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 3
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 3
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 3
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 3
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 3
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 3
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 3
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 3
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 3
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 238000000844 transformation Methods 0.000 description 3
- 239000007222 ypd medium Substances 0.000 description 3
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 2
- ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N Formamide Chemical compound NC=O ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101150009006 HIS3 gene Proteins 0.000 description 2
- 241001506991 Komagataella phaffii GS115 Species 0.000 description 2
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 2
- 101100394989 Rhodopseudomonas palustris (strain ATCC BAA-98 / CGA009) hisI gene Proteins 0.000 description 2
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 2
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 2
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 2
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 2
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 2
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 229960005091 chloramphenicol Drugs 0.000 description 2
- WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N chloramphenicol Chemical compound ClC(Cl)C(=O)N[C@H](CO)[C@H](O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N 0.000 description 2
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 2
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 2
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 2
- 239000013068 control sample Substances 0.000 description 2
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 2
- 239000008121 dextrose Substances 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 2
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 2
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 2
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 2
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 235000019796 monopotassium phosphate Nutrition 0.000 description 2
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 2
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 2
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 2
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 2
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 2
- -1 polypropylene Polymers 0.000 description 2
- SCVFZCLFOSHCOH-UHFFFAOYSA-M potassium acetate Chemical compound [K+].CC([O-])=O SCVFZCLFOSHCOH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M potassium dihydrogen phosphate Chemical compound [K+].OP(O)([O-])=O GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 239000007320 rich medium Substances 0.000 description 2
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 2
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 2
- 239000006152 selective media Substances 0.000 description 2
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 2
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 2
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 2
- 101150005709 ARG4 gene Proteins 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N Calcium cation Chemical compound [Ca+2] BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 1
- 102000004594 DNA Polymerase I Human genes 0.000 description 1
- 108010017826 DNA Polymerase I Proteins 0.000 description 1
- 238000007399 DNA isolation Methods 0.000 description 1
- 108010067770 Endopeptidase K Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 108091092566 Extrachromosomal DNA Proteins 0.000 description 1
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 1
- 102100024319 Intestinal-type alkaline phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 101710184243 Intestinal-type alkaline phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 239000007836 KH2PO4 Substances 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000006142 Luria-Bertani Agar Substances 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 108020002230 Pancreatic Ribonuclease Proteins 0.000 description 1
- 102000005891 Pancreatic ribonuclease Human genes 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- 239000004743 Polypropylene Substances 0.000 description 1
- 101100008030 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) CUE1 gene Proteins 0.000 description 1
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 1
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- KGBXLFKZBHKPEV-UHFFFAOYSA-N boric acid Chemical compound OB(O)O KGBXLFKZBHKPEV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910001424 calcium ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 244000309466 calf Species 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 229910000366 copper(II) sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000006862 enzymatic digestion Effects 0.000 description 1
- 238000007429 general method Methods 0.000 description 1
- 230000001279 glycosylating effect Effects 0.000 description 1
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 1
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000009931 harmful effect Effects 0.000 description 1
- 229940094991 herring sperm dna Drugs 0.000 description 1
- 101150085823 hsdR gene Proteins 0.000 description 1
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 238000009630 liquid culture Methods 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 229940111688 monobasic potassium phosphate Drugs 0.000 description 1
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000003463 organelle Anatomy 0.000 description 1
- 230000010627 oxidative phosphorylation Effects 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 description 1
- 229940127557 pharmaceutical product Drugs 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 1
- 238000007747 plating Methods 0.000 description 1
- 229920001155 polypropylene Polymers 0.000 description 1
- 235000011056 potassium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 239000004540 pour-on Substances 0.000 description 1
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 230000001698 pyrogenic effect Effects 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 1
- 238000004513 sizing Methods 0.000 description 1
- 238000002791 soaking Methods 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 1
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- FQENQNTWSFEDLI-UHFFFAOYSA-J sodium diphosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O FQENQNTWSFEDLI-UHFFFAOYSA-J 0.000 description 1
- 229940048086 sodium pyrophosphate Drugs 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 1
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 1
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 1
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 1
- 235000019818 tetrasodium diphosphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000001577 tetrasodium phosphonato phosphate Substances 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 238000011426 transformation method Methods 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 1
- 238000004804 winding Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
- C12N15/90—Stable introduction of foreign DNA into chromosome
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
- C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
- C12N15/815—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts for yeasts other than Saccharomyces
Description
Oppfinnelsen angår feltet rekombinant DNA-teknologi. En side ved oppfinnelsen angår isoleringen av funksjonelle gener fra gjærstammer av slekten Pichia. En annen side ved oppfinnelsen angår DNA-fragmenter som regulerer ekspresjonen av et genprodukt, dvs. et polypeptid. Nok en side ved oppfinnelsen angår den integrative transformasjon av gjærstammer av slekten Pichia.
Inntil nå har industrielle anstrengelser med hensyn til anvendelse av rekombinant DNA-teknologi for fremstilling av forskjellige polypeptider konsentrert seg om Escherichia coli som en vertsorganisme. I visse situasjoner kan imidlertid E.
coli vise seg å være uegnet som vert. F.eks. inneholder E. coli en rekke giftige pyrogene faktorer som må elimineres fra et hvilket som helst polypeptid som er nyttig som et farmasøytisk produkt. Virkningsfullheten med hvilken denne rensing kan oppnås, vil selvsagt variere med det spesielle polypeptid. Dessuten kan de proteolytiske aktiviteter av E. coli i alvorlig grad begrense utbyttene av visse nyttige produkter. Disse og andre betraktninger har ført til øket interesse i alternative verter, og særlig er bruken av eukaryotiske organismer for fremstillingen av polypeptidprodukter tiltrekkende.
Tilgjengeligheten av midler til fremstillingen av polypeptidprodukter i eukaryotiske systemer, f.eks. gjær, kan by på betydelige fordeler sammenlignet med bruken av prokaryotiske systemer, så som E. coli, for fremstillingen av polypeptider som er kodet for ved rekombinant DNA. Gjær er blitt anvendt i fermenteringer i stor skala i århundrer, sammenlignet med den relativt nye bruk av E. coli-fermenteringer i stor skala. Gjær kan generelt dyrkes til høyere celletettheter enn bakterier, og kan lett tilpasses kontinuerlig fermenteringsbehandling. Dyrkin-gen av gjær, så som Pichia pastoris til ultrahøye celletettheter, dvs. celletettheter høyere enn 100 g/l, er angitt av Wegner i US PS 4.41 4.329. Ytterligere fordeler med gjrarverter innbefatter det faktum at mange kritiske funksjoner av organis-men, f.eks. oksidativ fosforylering, er anordnet inne i organel-ler, og derfor ikke utsatt for de mulige skadelige virkninger av organismens produksjon av polypeptider som er fremmed for celler av den ville type. Som en eukaryotisk organisme kan gjær vise seg å være i stand til å glykosylere uttrykte polypeptidproduk ter hvor slik glykosilering er viktig for bioaktiviteten av polypeptidproduktet. Det er også mulig at som en eukaryotisk organisme vil gjæren oppvise de samme kodonpreferanser som høyere organismer og være tilbøyelig til mer effektiv produksjon av ekspresjonsprodukter fra pattedyrgener eller fra komplemen-tært DNA (cDNA) som fås ved revers transkripsjon fra f.eks. pattedyr-mRNA.
Utviklingen av dårlig karakteriserte gjærarter som vert/vektor-systemer er i høy grad hindret av mangelen på kunnskap om transformasjonsbetingelser og egnede vektorer. Dessuten er auxotrofe mutasjoner ofte ikke tilgjengelige,
hvilket utelukker en direkte utvelgelse for transformanter ved auxotrof komplementering. Dersom rekombinant DNA-teknologi fullt ut skal oppfylle hva den lover, må nye vert/vektor-systemer konstrueres som letter manipuleringen av DNA, samt optimaliserer ekspresjonen av innføyde DNA-sekvenser, slik at de ønskede polypeptidprodukter kan fremstilles under regulerte betingelser og med høyt utbytte.
Et grunnleggende element anvendt i rekombinant DNA-teknologi, er plasmidet som er et ekstrakromosomalt dobbelttrå-det DNA som finnes i visse mikroorganismer. Der hvor plasmider er blitt funnet å forekomme naturlig i mikroorganismer, er de ofte funnet å forekomme i multikopier pr. celle. Foruten naturlig forekommende plasmider, er en rekke av mennesker produserte plasmider eller hybride vektorer blitt fremstilt. Innlemmet i informasjonen kodet for i plasmid DNA er den som er nødvendig for å reprodusere plasmidet i datterceller, dvs. en autonom replikasjonssekvens. En eller flere fenotypiske selek-sj onskarakteristikker må også innlemmes i informasjonen kodet for i plasmid DNA. De fenotypiske seleksjonskarakteristikker tillater kloner av vertscellen inneholdende det aktuelle plasmid å bli gjenkjent og selektert ved preferensiell dyrking av cellene i selektive media.
En hensikt med oppfinnelsen er derfor å fremstille funksjonelle gener fra gjærstammer av slekten Pichia som er nyttige f.eks. som fenotypiske seleksjonsmarkører.
En annen hensikt med oppfinnelsen er nye regulerende områder som reagerer på nærværet eller fraværet av aminosyrer i dyrkingsmediet.
Nok en hensikt med oppfinnelsen er den integrative transformasjon av gjærstammer av slekten Pichia.
Enda en hensikt med oppfinnelsen er en fremgangsmåte til fremstilling av polypeptider ved anvendelse av de nye DNA-fragmenter ifølge oppfinnelsen som fenotypiske seleksjonsmarke-rer og/eller som regulerende områder.
Disse og andre hensikter med oppfinnelsen vil fremgå fra beskrivelsen og kravene.
I henhold til oppfinnelsen er HIS4-genet fra en gjærstamme av slekten Pichia oppdaget, isolert ogkarakterisert. Dessuten er en generell fremgangsmåte til isolering av funksjonelle gener fra gjærstammer av slekten Pichia utviklet. De nye gener som er isolert er nyttige som fenotypiske seleksjonsrnarkører i et vert/vektor-system som anvender gjærstammer av slekten Pichia som vert.
I henhold til en annen utførelsesform av oppfinnelsen er der oppdaget, isolert ogkarakterisertet regulerende område som reagerer på nærværet eller fraværet av aminosyrer i dyrkingsmediet. Dette regulerende område er nyttig f.eks. for den regulerte ekspresjon av polypeptidprodukter i gjær.
I henhold til nok en utførelsesform av oppfinnelsen er en fremgangsmåte til den integrative transformasjon av gjær av slekten Pichia utviklet. Denne fremgangsmåte for transformering av gjær skaffer en måte til rekombinasjon av vektorsekvenser inn i det kromosomale DNA av verten. Denne rekombinasjon resulterer i stabil opprettholdelse av innføyde DNA-sekvenser i det vert-kromosomale DNA. Stabil opprettholdelse av innføyde sekvenser oppnås uten det krav til selektive dyrkingsbetingelser for celleopprettholdelse av innføyde DNA-sekvenser som ekstrakromosomalt DNA.
Fig. 1 er et restriksjonskart av plasmid YEp13.
Fig. 2 er et restriksjonskart av plasmid pYA4.
Fig. 3 er et restriksjonskart av et 6.0 kilobasepar(kbp)-fragment av Pichia kromosomalt DNA som inneholder Pichia HIS4-genet. Spesielle underfragmenter av interesse er også vist.
Fig. 4 er et restriksjonskart av plasmid pYJ3.
Fig. 5 er et restriksjonskart av plasmid pBPf1.
Fig. 6 er et restriksjonskart av plasmid pBPf3.
De følgende forkortelser er brukt i fremstillingen for å representere de anvendte restriksjonsenzymer:
Pa de vedlagte figurer er restriksjonsseter som anvendes for manipuleringen av DNA-fragmentet, men som ødelegges ved liga-sjon, angitt ved at forkortelsen for det ødelagte sete er satt i parentes. Restriksjonsseter som er blitt ødelagt på andre måter er angitt ved en stjerne ved forkortelsen for det ødelagte sete.
I henhold til en utførelsesform av oppfinnelsen er der skaffet en fremgangsmåte til isolering av funksjonelle gener fra gjærstammer av slekten Pichia. Fremgangsmåten er basert på den forståelse at Pichia-gener og -genprodukter har evnen til å komplementere defektene i Saccharomyces cerevisiae mutante vertsstammer, og derved reversere vertens mutante fenotyper. Fremgangsmåten omfatter: (1) Transformasjon av defekte Saccharomyces cerevisiae-stammer med fragmenter av Pichia kromosomalt DNA som er blitt rekombinert inn i S. cerevisiae/E. coli-skyttelvektorer; (2) seleksjon av transformerte stammer ved deres evne til å overleve og vokse i selektive dyrkingsmedia idet de selektive dyrkingsmedia er spesielt frie for de næringsmidler eller skaffer ikke de betingelser som er nødvendige for at den defekte vertsstamme skal vokse; (3) isolering og utvinning av Pichia DMA-fragmenter som inneholder de ønskede gener fra de plasmider som inneholdes i de selekterte transformerte stammer.
Det er oppdaget at de funksjonelle gener fra mikroorganismer av slektene Pichia og Saccharomyces er tilstrekkelig like til å tillate at man drar fordel av godt karakteriserte defekte stammer av Saccharomyces cerevisiae, for å isolere komplementære funksjonelle gener fra Pichia. F.eks. er gener ekvivalente med Saccharomyces HIS3- og HIS4-gener fra Pichia isolert. Disse nye gener som er isolert, er for formålet ifølge oppfinnelsen betegnet som Pichia HIS3- og 111S 4-genene. Disse nye gener er blitt isolert ved transformering av de riktige mutanter av S. cerevisiae med et arkiv av Pichia kromosomalt DNA og selekte-ring for transformerte stammer som overlever i fraværet av histidinsupplering i mediene. Fagfolk vil innse at man kunne isolere Pichia leu2-genet ved transformering av en leu2 S. cerevisia-mutant med et arkiv av Pichia kromosomalt DNA, og selektere for transformerte stammer som overlever i fravær av leucin-supplering i mediene. På lignende måte kunne man isolere Pichia ARG4-genet ved transformering av en passende S. cerevisiae-mutant med et arkiv av Pichia kromosomalt DNA, og fortsette som angitt ovenfor med den unntagelse at seleksjonsmediet ville mangle arginin-supplering.
Isolering og karakterisering av Pichia pastoris HIS4- qen
HIS4-genet ble isolert fra stammen P. pastoris NRRL Y-11430 ved delvis digestion av det samlede kromosomale DNA med Sau3A fulgt av sentrifugering gjennom sukrosegradienter (se eksempel II). Fragmenter på 5-20 kbp ble klonet inn i BamHI-kløyvingsstedet for S. cerevisiae/E. coli-skyttelvektoren YEp13 (ATCC 37115; fig. 1) og transformert inn i E. coli. Ca. 50.000 kolonier ble kombinert, og det samlede plasmid DNA ekstrahert. Sfæroplaster av S. cerevisiae stamme 5799-4D (NRRL Y-15859), en his4ABC-mutant ble blandet med ca. 1 \ xg av YEp1 3 Pichia DNA-arkivet ved fremgangsmåten ifølge Hinnen et al (1978) og tillatt å regenerere i et medium som manglet histidin. Transformasjonen resulterte i ca. 1x10^ prototrofe gjærkolonier fra en populasjon på 5x1 0^ samlede regenererbare sfæroplaster. En parallell sammenligningsprøve inkubert uten DNA produserte ingen kolonier. Det samlede gjær-DNA ble ekstrahert fra 20 av His+-koloniene og transformert tilbake inn i E. coli. 17 av gjær-DNA-preparatene produserte ampicillinresistente kolonier. Disse klonede fragmenter ble ytterligerekarakterisert vedrestriksjonsenzym-størrel-seangivelse og -kartlegging, samt ved deres evne til å krysshyb-ridisere med et merket S. cerevisiae HIS4-fragment ved lav strenghet (etterhybridiseringsvasker i 2xSSC ved 55°C; SSC er 0,15 M NaCl og 15 tnH natriumcitrat justert på pH 7,0 med NaOH). De fleste plasmider inneholdt ett eller flere fragmenter som hybridiserte til S. cerevisiae HIS4-genet. Et slikt HIS4-holdig plasmid ble reklonet for å gi et HIS4-holdig plasmid betegnet som pYJ8 og vist på fig. 4. Plasmid pYJ8 inneholder pBR325-sekvenser innbefattet funksjonelle kloramfenikol- og ampicillinresistente gener, samt Pichia HIS4-genet.
Et detaljert restriksjonskart av Pichia HIS4-genet, som omfatter enzymaktivitetene for histidinoldehydrogenase, fosforibosyl-ATP-cyklohydrase og fosforibosyl-ATP-pyrofosfohydratase, er vist på fig. 3a. Under henvisning til 5'-enden av det 6 kpb store DNA-fragment som origo, ble det følgende kløyvingsmønster oppnådd:
Ved subkloning av dette 6,0 kbp fragment, ble det funnet at et 2.7 kbp BglII-fragment av dette Pichia-DNA beholdt evnen til å transformere Pichia- eller Saccharomyces-stammer defekte i HIS4A-, IIIS4B- eller IIIS4C-genkodede aktiviteter. Således er f.eks. Pichia pastoris NRRL Y-15851 (GS115), en his4-mutant, istand til å vokse på media uten histidinsupplering når den er transformert med plasmid pBPfl som vist på fig. 5. Plasmid p3Pf1 inneholder det 2.7 kbp BglII-fragment av Pichia kromosomalt DNA vist på fig. 3b på tegningen.
For å øke nytten av p3Pf1 ble BamKI-setet inne i det 2.7 kbp BglII-fragment som inneholder Pichia HIS4-genet ødelagt før innlemmelse av dette fragment inn i pBPf1. Således ble Pichia KIS4-genet som inneholdes i en vektor med ingen andre BamHl-seter kløyvet ved BamHI og de resulterende heftende (sticky) ender ble fylt igjen med en blanding av alle fire deoksynukleo-tider i nærvær av DNA-polymerase-I for å gi stumpe (blunt) ender. De nydannede stumpe ender ble ligatisert for å gi et modifisert HIS4-gen uten et BamHI-gjenkjennelsessete. Dette modifiserte HIS4-gen var kilden til det 2.7 kbp BglII-fragment som ble brukt i konstruksjonen av plasmid pBPf1. Plasseringen av det ødelagte BamHI-sete er angitt ved B<*>på fig. 5 og 6. Bemerk at BamHI-setet i flerkoblingen av pBPfl er et unikt restriksj onssete for vektoren. Det videre nærvær av unike EcoRI- og Smal-restriksjonsseter gjør dessuten pBPfl til en vektor som er nyttig for utforskning av evnen til DNA-fragmenter til å fremme og/eller regulere ekspresjonen av et genprodukt i transformert Pichia pastoris. ;I henhold til en annen utførelsesform av oppfinnelsen er et DNA-fragment omfattende et regulerende område som reagerer på nærværet eller fraværet av aminosyrer i dyrkingsmediet blitt isolert ogkarakterisert. Således er der på fig. 3c vist et ca. 600 bp EcoRI-PvuII-fragment av DNA som fås fra 5<1->enden av det 6.0 kbp store fragment inneholdende Pichia HIS4-genet. Dette fragment reagerer på nærværet eller fraværet av aminosyrer i dyrkningsmediet. I et rikt medium, så som YPD, er det regulerende område "av", dvs. Pichia HIS4-genkodede produkter blir ikke lenger syntetisert. Og omvent, når histidin foreligger i lav konsentrasjon i dyrkningmediet blir det regulerende område "skrudd på", dvs. Pichia HIS4-genkodede produkter blir syntetisert . ;Regulering av polypeptidproduksjon under styring av dette nye regulerende område er vist med det nye plasmid pBPf3 vist på fig. 6. Plasmidet inneholder blant annet det HIS4-regulerende område og LacZ-genet. Pichia pastoris NRRL Y-15851 transformert med plasmid pBPf3 produserer betydelig mengder i3-galaktosidase nar det dyrkes i media som mangler histidin, men produserer minst 10 ganger mindre J3-galaktosidase nar det dyrkes i et rikt medium såsom YPD som innbefatter histidin. ;Integrativ transformasjon av Pichia ;I henhold til nok en utførelsesform av oppfinnelsen er der skaffet en fremgangsmåte til integrativ rekombinasjon av plasmidsekvenser inn i genornet av gjærstammer av slekten Pichia. Fremgangsmåten for integrativ rekombinasjon betegnes i den foreliggende fremstilling som "integrativ transformasjon". ;Transformasjonen av Pichia pastoris er ikke tidligere blitt beskrevet. De eksperimentelle fremgangsmåter for transformasjon av Pichia pastoris er angitt i nærmere detalj nedenunder (eksempel I). For å utvikle et transformasjonssystem for P. pastoris ble den auxotrofe mutant (GS115) NRRL Y-15851 isolert og funnet å være defekt i histidinveien idet stammen ikke har noen påviselig histidinoldehydrogenase-aktivitet. ;Gjærstammer av slekten Pichia kan transformeres ved enzymatisk digestion av celleveggene for å gi sfæroplaster; sfæroplastene blir deretter blandet med det transformerende DNA og inkubert i nærvær av kalsiumioner og polyetenglykol, deretter regenerert i selektivt dyrkingsmedium. Det transformerende DNA innbefatter det funksjonelle gen i hvilken vertsstamraen er defekt, slik at bare transformerte celler overlever og vokser på det selektive medium som anvendes. ;Integrativ transformasjon av Pichia kan utføres ved at man som det transformerende DNA anvender en vektor omfattende: (i) et gen som kan selekteres i den Pichia-vertsstamme som transformeres; (ii) Pichia DNA-sekvenser som har en betydelig grad av homologi med genornet av Pichia-vertsstammen; og (iii) ytterligere DNA-fragmenter valgt fra gruppen bestående av: ;regulerende områder, og ;polypeptidkodende områder, ;idet det transformerende DNA-materiale inneholder stort sett ingen autonom replikasjonssekvensaktivitet i Pichia. ;Valgfritt kan det transformerende DNA ytterligere omfatte: ;(iv) DNA-sekvenser med bakteriell opprinnelse av replika- ;sjon oy minst én markør selekterbar i bakterier. ;Den ytterligere innlemmelse av DNA-sekvensene som beskrevet i (iv) letter fremstillingen av DNA i store mengder, idet den tillater formering i bakterier. Dessuten kan innlemmelse av disse sekvenser skaffe ytterligere unike restriksjonsseter som er nyttige for videre modifisering av det transformerende DNA. ;En egnet integrativ transformasjonsvektor er representert ved plasmid pYJ8 vist på fig. 4. Transformasjon av en vert såsom Pichia pastoris NRRL Y-15851 med plasmid pYJ8, eller et derivat av pYJ8 inneholdende ytterligere DNA-sekvenser, vil føre til integrasjon av plasmid DNA inn i vertens kromosom. Dette skyldes den betydelig grad av homologi mellom det defekte gen av den auxotrofe mutant og det funksjonelle gen som skaffes av plasmidet, og det nyttige fravær av et ARS-element i plasmidet. Med mindre integrasjon finner sted, har et plasmid uten et ARS-element ingen måte hvorved det kan føres videre til datterceller, og vil derfor gå "tapt" fra fremtidige generasjoner av vertsceller. Homologien mellom Pichia-avledede DNA-sekvenser av den transformerende vektor og de verts-genome sekvenser skaffer drivkraften for rekombinasjon av vektoren og verts-DNA. Som et resultat blir plasmid DNA integrert inn i vertskromosomet. ;EKSEMPLER ;Buffrene og oppløsningene anvendt i de følgende eksempler har de nedenfor angitte sammensetninger: ;
De følgende forkortelser er brukt i eksemplene med den følgende betydning: ;
Pichia pastoris transf orrnasj onsf remgangsmåte ;A. Celledyrking ;1. Pod en koloni av Pichia pastoris GS 115 (NRRL Y-15851) inn i ca. 10 ml YPD-medium og rist kulturen ved 30°C i 12-20 timer. 2. Etter ca. 12-20 timer, fortynn cellene til en OD500på ca. 0,01-0,1 og hold cellene i logaritmisk vekstfase i YPD-medium ved 30°C i 6-8 timer. 3. Etter ca. 6-8 timer, pod 100 ml YPD-medium med 0,5 ml av startkulturen ved en OD500ca« 0,1 (eller ekvivalent mengde). Rist ved 30°C i ca. 12-20 timer. 4. Høst kulturen når OD500er 0/2-0,3 (etter ca. 16-20 timer) ved sentrifugering ved 1500 g i 5 minutter. ;B. Fremstilling av sfæroplaster ;1. Vask cellene en gang i 10 ml sterilt vann (alle sentrifugeringer for trinn 1-5 er ved 1500 g i 5 minutter). ;2. Vask cellene en gang i 10 ml nylig fremstilt SED. ;3. Vask cellene to ganger i 10 ml steril 1 M sorbitol. ;4. Resuspender cellene i 10 ml SED-buffer. ;5. Tilsett 5-10 ul av 4 mg/ml Zymolase 60.000 (Miles Laboratories). Inkuber cellene ved 30°C i 30-60 minutter. ;Da fremstillingen av sfæroplaster er et kritisk trinn i transformasjonsfremgangsmåten, bør dannelsen av sfæroplaster overvåkes som følger: Tilsett 100 ul porsjoner av celler til 900 ul av 5% SDS og 900 ul av 1 M sorbitol før eller like etter tilsetningen av zymolase ved forskjellige tidspunkter under inkubasjonsperioden. Stopp inkubasjonen ved det punkt hvor cellene lyserer i SDS, men ikke i sorbitol (vanligvis mellom 30 og 60 minutters inkubasjon). 6. Vask sfæroplastene to ganger i 10 ml steril W sorbitol ved sentrifugering ved 1.000 g i 5-10 minutter (tiden og hastigheten for sentrifugeringen kan variere; sentrifuger tilstrekkelig til å pelletere sfæroplastene, men ikke sa mye at de brytes opp ved kraften). ;7. Vask cellene en gang i 10 ml sterilt CaS. ;8. Resuspender cellene i en samlet mengde på 0,6 ml CaS. ;C. Transforrnasj on ;1. Tilsett DNA-prøver (inntil 20 ul volum) til 12 x 75 mm sterile polypropenrør (DNA bør foreligge i vann eller TE-buffer; for maksimale transformasjonshyppigheter med små mengder DNA er det tilrådelig å tilsette ca. 1 ul av 5 mg/ral lydbehandlet (sonicated) E. coli-DNA til hver prøve). 2. Tilsett 100 ul sfæroplaster til hver DNA-prøve, og inkuber ved værelsestemperatur i ca. 20 minutter. 3. Tilsett 1 ml PEG-oppløsning til hver prøve, og inkuber ved værelsestemperatur i ca. 15 minutter. 4. Sentrifuger prøvene ved 1.000 g i 5-10 minutter, og dekanter PEG-oppløsningen. 5. Resuspender prøvene i 150 ul SOS og inkuber i 30 minutter ved værelsestemperatur. 6. Tilsett 850 ul steril 1 M sorbitol og dann plater av porsjoner av prøver som beskrevet nedenunder. ;D. Regenerering av sfæroplaster ;1. Oppskrift for regenereringsagarmedium: ;a. Agar-sorbitol: 9 g Bacto-agar, 54,6 g sorbitol, 240 ml H2O, autoklav. ;b. 10X glukose: 20 g dekstrose, 100 ml H2O, autoklav. ;c. 10X SC: 6,75 g gjær-nitrogenbase uten aminosyrer, 100 ml H2O, autoklav (tilsett en hvilken som helst ønsket aminosyre eller nukleinsyre inntil en konsentrasjon på 200 ug/ml før eller etter autoklaving). d. Tilsett 30 ml 10X glukose og 30 ml 10X SC til 300 ml av den smeltede agar/sorbitol-oppløsning. Tilsett 0,6 ml av 0,2 ing/ml biotin og en hvilken som helst annen ønskelig aminosyre eller nukleinsyre til en konsentrasjon på 20 ug/ml. Hold smeltet regenereringsagar på 55-60°C. ;2. Plating av transformasjonsprøver: ;Hell bunnagarlag på 10 ml regenereringsagar pr. plate minst 30 minutter før transformasjonsprøvene er klare. Fordel 10 ml porsjoner av regenereringsagar på rør i et bad på 45-50°C i løpet av den periode som transformasjonsprøvene er i SOS. Tilsett porsjoner av transformasjonsprøver beskrevet ovenfor til rør med regenereringsagar og hell oppå bunnagarlaget av platene. Tilsett en porsjon av hver prøve til 10 ml porsjoner av smeltet regenereringsagar holdt på 45-50°C, og hell hver oppå platene inneholdende et fast bunnagarlag av regenereringsagar. 3. Bestemmelse av kvaliteten av sfæroplastfremsti1ling: Fjern 10 ul av en prøve og fortynn 100 ganger ved tilsetning til 990 ul av 1 M sorbitol. Fjern 10 ul av oppløsningen som er fortynnet 100 ganger, og fortynn ytterligere 100 ganger ved tilsetning til en andre 990 ul porsjon av 1 M sorbitol. Stryk ut på plate 100 ml av begge fortynninger på YPD-agarmedium for å bestemme konsentrasjonen av ikke-sfæroplastdannede hele celler som er tilbake i preparatet. Tilsett 100 ul av hver fortynning til 10 ml regenereringsagar supplert med 40 ug/ml histidin for å bestemme de samlede regenererbare sfæroplaster. Gode verdier for et transformasjonseksperiment er 1-3 x 10^ samlede regenererbare sfæroplaster/ml og ca. 1 x 10-^ hele celler/ml. ;4. Inkuber platene ved 30°C i 3-5 dager. ;EKSEMPEL II ;Isolering av Pichia pastoris HIS4- gen ;A. Stammer ;De stammer som ble anvendt innbefattet: ;(a) Pichia pastoris-stamme NRRL Y-11430; (b) Pichia pastoris-stamme NRRL Y-1 5851 (GS115-his4 ) ; (c) S. cerevisiae-stamme 5799-4D (en his4-260 his4-39, NRRL Y-15859); og (d) E. coli-stamme 848 (F"met thi gal T-jR 4>80s hsdR"hsdn<+>). ;B. Plasmider ;pYA2, som består av S. cerevisiae HIS4-genet på et 9.3 kbp ;Pstl-fragment innføyet ved Pstl-setet på pBR325 var kilden for S. cerevisiae HIS4-genfragmentene, og er blitt deponert i en E. coli-vert, og er tilgjengelige for offentligheten som NRRL B-15874. ;yEP13 er tilgjengelig fra American Type Culture Collec-tion, og er blitt gitt aksesjonsnummer ATCC 37115. ;C. Media ;Pichia pastoris ble dyrket i YPD (rikt) eller IMG (minimalt) media. IMG, et minimalt medium består av følgende: 1. IM-)-salter på en endelig konsentrasjon av 36,7 mM KH2P04, 22,7 mM (N<H>4)2S04, 2,0 mM M<g>S04'7H20, 6,7 mM KC1, 0,7 nM CaCl2*2H20, fremstilt som en 1Ox-utgangsoppløsning og autokla-vet ; 2. Sporsalter på en endelig konsentrasjon av 0,2 rM CuS04'5H20, 1 ,25 uM Kl, 4,5 uM MnSC^^O, 2,0 mM NaMoC^^^O, 0,75 m H3BO3, 17,5 m ZnS04«7H20, 44,5 uM FeCl3'6H20, fremstilt som en 400x-utgangsoppløsning og filtersterilisert;
3. 0,4 ug/ml biotin, og
4. 2% dekstrose.
E. coli ble dyrket i enten LB-medium eller 2B-medium supplert med 100 ug/ml tryptofan, og 0,2% Casaminosyrer.
D. DNA- isolering
1. Fremstilling av gjær- DNA i stor skala
Både Pichia pastoris og S. cerevisiae DNA-fremstillinger ble utført ved dyrking av gjærceller i 100 ml minimalt medium inntil A500er li}c 1-2, og deretter innhøsting av cellene ved sentrifugering ved 2.000 g i 5 minutter. Cellene ble vasket en gang i H20, en gang i SED, en gang i 1 M sorbitol, og deretter suspendert i 5 ml 0,1 M Tris-HCl (pH 7,0) som er 1 M i sorbitol. Cellene ble blandet med 50-100 ul av en 4 mg/ral oppløsning av Zymolase 60.000 (Miles Laboratories), og inkubert ved 30°C i 1 time for å digestere celleveggene. Sfæroplastfremstillingen ble deretter sentrifugert ved 1.000 g i 5-10 minutter og suspendert i Lysis-buffer (0,1% SDS, 10 mM Tris-HCl (pH 7,4), 5 mM EDTA og 50 mM NaCl). Proteinase K (Boehringer Mannheim) og RNase A (Sigma) ble hver satt til 100 ug/ml og blandingen inkubert ved 37°C i 30 minutter. DNA ble deproteinisert ved forsiktig blanding av preparatet med et like stort volum kloroform inneholdende isoamylalkohol (24:1, v/v), og fasene ble separert ved sentrifugering ved 12.000 g i 20 minutter. Den ovre (vandige) fase ble trukket ut inn i et nytt rør og ekstrahert med et like stort volum fenol/kloroform/isoamylalkohol (25:24:1 v/v/v). Fasene ble separert som tidligere, og toppfasen plassert i et rør inneholdende 2-3 volumer kald 100%etanol. Prøven ble forsiktig blandet og DNA samlet opp ved oppvikling på en plaststav. DNA ble øyeblikkelig oppløst i 1 ml TE-buffer og dialysert over natten ved 4°C mot 100 volumer TE-buffer.
2. Fremstilling av gjær- DNA i liten skala
5 ml av gjærkulturer i minimalt medium ble dyrket inntil A500var lik 1-5 og høstet ved sentrifugering ved 2.000 g i 5 minutter. Celler ble suspendert i 1 ml SED og overført til et 1,5 ml mikrofuge-rør, vasket en gang i 1 M sorbitol og resus-pendert i 0,5 ml av 0,1 M Tris-HCl (pH 7,4) som er 1 M i sorbitol. Zymolase 60.000 (Miles Laboratories, 10 ul av en 4 mg/ml oppløsning) ble satt til hver prøve, og cellene ble inkubert i 30-60 minutter ved 30°C. Cellene ble deretter sentrifugert i 1 minutt, suspendert i Lysis-bufferen og inkubert ved 65-70°C. Etter 15 minutter ble prøvene blandet med 100 ul 5 M kaliumacetat, holdt i et isbad i 15 minutter, og sentrifugert i 5 minutter. De ovenpåflytende væsker ble dekantert inn i et nytt mikrofuge-rør inneholdende 1 ml 100%etanol, blandet og straks sentrifugert i 10 sekunder. Tilslutt ble DNA-pelletene lufttørket i 10-15 minutter og oppløst i 50 ul TE-buffer.
3. Fremstilling av E. coli- DNA i stor skala
E. coli-kulturer for fremstilling av plasmid i stor skala (0,5-1 1) ble dyrket ved 37°C under risting i 2B-medium supplert som beskrevet ovenfor og med det riktige antibiotikum. For celler som inneholdt pBR322-avledede plasmider ble kulturer dyrket til en A550på ca. 0,7, på hvilket tidspunkt tilstrekkelig mengde kloramfenikol ble tilsatt for å gi en konsentrasjon på 100 ug/ml, og celler høstet ca. 15 timer senere. Stammer som innehold pBR325-avledede plasmider ble podet inn i det"supplerte 2B-medium med en start-A55ø på 0,01-0,05 og inkubert under risting ved 37°C i 20-24 timer før høsting. Plasmider ble isolert ved den alkaliske lyseringsmetode beskrevet av Birnboim og Doly (1 979 ) .
4. Fremstilling av E. coli- DNA i liten skala
For hurtig isolering av plasmid i liten skala, ble 2 mis kulturer i det supplerte 2B-mediurn med antibiotikum dyrket over natten ved 37°C under risting, og høstet ved sentrifugering i 1,5 ml mikrofuge-rør. Plasmider ble isolert ved en alkalisk lyseringsmetode beskrevet av Birnboim og Doly (1979).
E. Restriksjon av DNA og fragmentisolering
Restriksj onsenzymer ble skaffet fra Nev; England Biolabs og Bethesda Research Laboratories og digestioner ble utført ved vanlige teknikker. Restriksjonskartlegninger ble utført ved sammenligning av parallelle digestioner av plasmider med og uten innføyet DNA. Restriksjonsfragmetet ble renset ved elektroelue-ring fra agarosegeler inn i Whatman 3 MM papirstrimler på et underlag av dialyserør. Fragmentene ble utvunnet fra papiret og røret ved 3-4 vaskinger med 0,1-0,2 ml volumer av en oppløsning som inneholdt 0,1 M NaCl, 50 mM Tris-HCl (pH 8,0) og 1 mM EDTA. Til slutt ble fragmentene ekstrahert med fenol/kloroform/isoamylalkohol, utfelt med etanol og reoppløst i et lite volum av TE-buffer.
F. Konstruksjon av Pichia pastoris- arkiv i E. coli
For konstruksjonen av Pichia pastoris DNA-YEp13-arkivet, ble 100 ug YEp13 digestert fullstendig med BarnHI og behandlet med alkalisk fosfatase av kalvetarmer for å fjerne ende-5<1->fosfatet fra DNA. En 100 ug porsjon av vill type Pichia pastoris-DNA fra Pichia pastoris NRRL Y-11430 ble delvis digestert rned 10 enheter Sau3AI ved inkubering i 5 minutter ved 37°C i et samlet volum på 1 ml. Fragmenter på 5-20 kbp ble størrelses-selektert ved sentrifugering gjennom 5-20% sukrosegradienter.
1 ug av vektoren og 2 ug av Pichia Sau3AI-fragmenter ble blandet med 20 enheter T4 DNA-ligase (Bethesda Research Laboratories) i et samlet volum på 200 ul og inkubert over natten ved 4°C. Det ligatiserte DNA ble transformert inn i E. coli ved tilsetning av hele ligasjonsreaksjonsblandingen til 2 ml kompetente E. coli 848 celler og inkubering i 15 minutter ved 0°C. Blandingen ble varmet opp til 37°C i 5 minutter, hvoretter 40 ml LB-medium ble tilsatt og inkubasjonen ved 37°C fortsatt i ytterligere 1 time. Ampicillin ble deretter tilsatt for å gi en samlet konsentrasjon på 100 ug/ml og inkuberingen fortsatte i 1 time til. Tilslutt ble cellene sentrifugert i 10 minutter ved 3.000 g, resuspen-dert i 1 ml nytt LB-medium og spredd utover i like store porsjoner pa 10 LB-agarplater inneholdende 100 ng/ml am.picillin. De ca. 50.000 kolonier som resulterte, ble skrapet fra platene, og en porsjon av cellene ble podet inn i 500 ml av det supplerte 2B-medium ved en start-A55Qpå ca. 0,1. Kulturen ble dyrket og plasmidet ekstrahert som beskrevet ovenfor. Av koloniene som ble slått sammen for arkivet var 96 ut av 100 som ble testet følsomme for tetracyklin, og 7 ut av 10 som ble undersøkt inneholdt plasmider med innføyet DNA.
G. Southern- hybridiseringer
Hybridiseringer ble utført ved fremgangsmåten ifølge Southern (1975). For overføring av store eller superkveilede DNA-molekyler til nitrocellulose, ble DNA først delvis hydroly-sert ved bløting av agarosegeler i 0,25 M HC1 i 10 minutter før alkalisk denaturering. Alle hybridiseringer av merkede fragmenter ble utført i nærvær av 50% formamid, 6x SSC, 5x Denhardts oppløsning, 0,1% SDS, 1 mM EDTA, og 100 ug/ml denaturert sildesperma-DNA ved 42°C. Etterhybridiserings-vasker for hybridisering av merkede fragmenter fra S. cerevisiae HIS4-genet til Pichia pastoris-DNA ble utført under de lave strenghetsbe-tingelser av 2x SSC, 1 mM, 0,1% SDS og 1,0% natriumpyrofosfat ved 55°C.
H. 32p_rner)cing
Innsnittstranslasjoner (nick translations) ble utført i henhold til fremgangsmåten ifølge Rigby et al (1977).
I. Gj ærtransformasjoner
S. cerevisiae-transformasjoner ble utført ved sfæroplast-genereringsmetoden ifølge Hinnen et al (1978).
Pichia pastoris-transformasjoner ble utført i henhold til fremgangsmåten beskrevet ovenfor.
J. Isolasjon av Pichia HIS4- genet
DNA-fragmenter som inneholdt Pichia HIS4-genet ble isolert fra et Pichia DNA-arkiv ved deres evne til å komplementere S. cerevisiae his4-stammer. Arkivet var sammensatt av 5-20 kbp Sau3AI partielle digestionsfragmenter av vill type Pichia DNA innføyet i BamHI-setet av S. cerevisiae/E. coli-skyttelvektor YEp13. Sfæroplaster av S. cerevisiae NRRL Y-15859 (5799-4D; en his4ABC"-stamme) ble generert ved teknikken ifølge Hinnen et al
(1978), blandet med Pichia DNA-arkivet og tillatt å regenerere i et medium defekt i histidin. Transformasjonen resulterte i ca. 1x 10^ prototrofe gjærkolonier fra en populasjon av 5x1 samlede regenererbare sfæroplaster. Samlet gjær-DNA ble ekstrahert fra 20 av His+-koloniene og transformert inn i E. coli. 17 av gjær DNA-preparatene produserte ampicillinresistente kolonier, og hver inneholdt plasmid som besto av YEp13 pluss innføyet DNA. For å bekrefte at His+-transformerende plasmider inneholdt Pichia HIS4-genet og ikke et DNA-fragment med under-trykkende aktivitet, ble restriksjons-digestionsprodukter av plasmidene hybridisert til et merket DNA-fragment inneholdende en stor porsjon av S. cerevisiae HIS4-genet og vasket ved lav strenghet. Hver av plasmidene som komplementerte his4 S. cerevisiae-stammene inneholdt sekvenser som hybridiserte til S. cerevisiae HIS4-genet.
Et av de His+-transformerende plasmider ble utvalgt for ytterligere karakterisering. Et detaljert restriksjonskart av 6.0 kbp-fragmentet er vist pa fig. 3. Det minste underfragment som kan transformere his4-mutanten NRRL Y-15851 (GS115) ved stor hyppighet ble funnet å være 2.7 kbp BglII-fragmentet (se fig. 3) ved transforrnasjon av GS115 med porsjoner av 6.0 kbp-fragmentet. Dette BglII-fragment var også istand til å transformere S. cerevisiae his4-mutanten NRRL Y-15859 med stor hyppighet. Således antas det at det HIS4-gen som ble isolert ogkarakteriserti henhold til oppfinnelsen inneholder HIS4A-, HIS4E- og HIS4C-genfunksjoner som er blitt identifisert i S. cerevisiae, dvs, henholdsvis fosforibosyl-ATP-cyklohydrase, fosforibosyl-ATP-pyrofosfohydratase og histidinoldehydrogenase.
EKSEMPEL III
Konstruksjon av regulerende område/ LacZ- genfusjoner
For å identifisere et DNA-fragment som inneholder Pichia HIS4-promotor og regulerende sekvenser, ble plasmid pYJ3 underkastet restriksjon med EcoRI og PvuII og elektroeluert. Et 600 bp-fragment av Pichia-DNA ble samlet opp og ligatisert inn i plasmid pBPf 1 som var blitt kløyvet ved flerkoblingssetet med EcoRI og Smal. Det resulterende plasmid, pBPf3, ble brukt til å transformere Pichia pastoris NRRL Y-15851, som deretter ble brukt i videre undersøkelser rettet på produksjonen av B-galaktosidase under styring av Pichia HIS4 regulerende område.
EKSEMPEL IV
Ekspresjon av ( 3- galaktosidase under aminosyrestyring A. Platekulturanalyser
P. pastoris NRRL Y-15851 transformert med pBPf3 ble smurt på YPD- og SD-medium 2% agarplater supplert med 0,4 ug/ml biotin og 40 ug/ml Xgal (5-bromo-4-kloro-3-indolyl-B-D-galaktosid). De SD-inneholdende plater ble justert til en pH-verdi på 7 ved tilsetning av monobasisk kaliumfosfat. Prinsippet ved Xgal-analysen er at S-galaktosidase, dersom det.foreligger i cellene, vil reagere med Xgal for å gi en forbindelse med en blå farge. Den resulterende blå farge kan påvises visuelt. Blå farge ble utviklet i de pBPf3 transformerte P. pastoris-celler i løpet av 4-5 timer på den minimale (SDS-medium) plate, mens ca. 1 ukes inkubasjon var nødvendig for at utvikling av blå farge skulle finne sted på plater inneholdende det rike (YPD) medium. Som en sammenligning ble hverken utransformerte P. pastoris-celler, eller pBPfl transformerte P. pastoris-celler, eller pBPf2 (et derivat av pBPfl med et 400 bp R-] -R2-f ragment fra 5<1->enden av Pichia HIS4-genet) transformerte P. pastoris-celler blå under noen av de betingelser som ble utprøvet. Disse observasjoner tyder på at 600 bp R-| -R2 Pichia HIS4-f ragment/LacZ-genfusjonen uttrykkes og reguleres under et aminosyre-kontrollsystem.
B. Analyser av flytende kultur
P. pastoris NRRL Y-15851 ble transformert med plasmid pBPf3. Transformerte celler ble podet inn i SD-medium supplert med 0,4 ug/ml biotin og dyrket ved 30°C med risting inntil A500pr. ml oppløsning var ca. 0,7. Deretter ble 3,5 ml porsjoner av kultur satt til hver av 2 kolber inneholdende 96,5 ml av et av de følgende media:
I. SD-medium pluss 0,4 ug/ml biotin, og
II. HAM.
Disse to kulturer ble dyrket logaritmisk ved 30°C med risting i 80 timer. Prøvene ble fjernet etter spesielle tidspe-rioder og analysert for B-galaktosidase.
B- galaktosidase- analyse
1. Nødvendige oppløsninger:
fyll opp til 1 1; pH-verdien bør være 7.
O- nitrof enyl- 6- D- galaktosid ( ONPG) :
Los opp 400 mg ONPG (Sigma N-1127) i 100 ml destillert vann for å gi 4 mg/ml ONPG-oppløsning.
2. Analysefremgangsmåte:
i. Ta ut en porsjon fra dyrkingsmediet (0,1-0,5 OD500av gjærceller), sentrifuger og vask cellepelleten med vann. ii. Tilsett 1 ml Z-buffer til cellepelleten, 30 yl CHCI3og 30 ul 0,1% SDS, svirr rundt, inkuber i 5 minutter ved 30°C. iii. Start reaksjonen ved tilsetning av 0,2 ml ONPG (4 mg/ml), svirr rundt. iv. Stopp reaksjonen ved tilsetning av 0,5 ml av en 1 M Na2C03~oppløsning ved passende tidspunkter (A420<<>"')»v. Les absorbansen av ovenpåflytende væske ved 420 nm.
3. Beregning av 6- galaktosidase- enheter:
1 U = 1 ninol av ortonitrofenol (ONP) dannet pr. minutt ved 30°C og pH 7. 1 nmol ONP har en absorbans ved 420 nm (A420) på 0,0045 med en 1 cm banelengde; således representerer en absorbans på 1 ved 420 nm 222nmol ONP/ml, eller 370 nmol/1,7 ml da det samlede volum av ovenpåf ly tende veeske som analyseres er 1,7 ml. Enhetene vist i tabellene blir derfor beregnet som følger:
Resultatene av disse forsøk er angitt i tabellen.
Resultatene vist i tabellen angir at B-galaktosidase uttrykkes under styring av Pichia HIS4-promotorområdet.
EKSEMPEL V
Integrativ transformasjon av Pichia
For å demonstrere integrativ rekombinasjon av en vektor inn i genornet av P. pastoris, ble P. pastoris NRRL Y-15851 transformert med plasmid pYJ8 (se fig. 4), en vektor som kan selekteres i his4 Pichia-verter såsom NRRL Y-15051. Plasmid pYJ8 har ca. 6.0 kbp DNA-sekvenser som er homologe med Pichia-genomet. Videre har plasmid pYJ8 ikke noen påviselig autonom replikasjonssekvensaktivitet i Pichia-verter. Transformasjonen av NRRL Y-15851 med pYJ8 resulterte i dannelsen av ca. 50 His<+->kolonier pr. ug pYJ8. Nærværet av pYJ8-sekvenser i P. pastoris-genomet ble demonstrert som følger: Transformante kolonier ble tatt opp fra regenereringsagar-platen og strøket ut på en SD-mediumagarplate. SD-platen ble inkubert ved 30°C i 3 dager, hvoretter en enkelt koloni av hver transformant ble podet inn i en kolbe med IMG-medium. IMG-kulturene ble dyrket ved 30°C med risting til en A5Q0på 1-2 og deretter høstet ved sentrifugering. DNA fra gjærkulturene ble ekstrahert som beskrevet ovenfor, og 1-2 ug av hver DNA (ikke-begrenset) ble underkastet elektroforese ved 30 Volt og 30 mh i 10-15 timer inn i 0,8% agarosegeler, overført til nitrocellulose og hybridisert til<32p_>rnerket p3R322 som beskrevet ovenfor. Som sammenligningsprø-ver ble en prøve inneholdende 10 ng av plasmid pYJ8 isolert fra E. coli, og en prøve inneholdende 1-2 ug av ikke-transformert Pichia pastoris GS115 DNA ble underkastet elektroforese i parallell med de eksperimentelle prøver. I hver av de pYJ8/- Pichia-transformanter som ble undersøkt, hybridiserte den merkede pBR322-sonde til det høymolekylære Pichia kromosomale DNA. I sammenligningsprøven hybridiserte ikke noen merket sonde til det ikke-transformerte Pichia DNA.
Eksemplene er gitt bare for å vise utførelsen av oppfinnelsen, og skal ikke anses å begrense oppfinnelsen på noen måte. Rimelige variasjoner og modifikasjoner som ikke avviker fra oppfinnelsens omfang og ånd, kan foretas og anses å ligge innenfor oppfinnelsens område.
Bibliografi
Birnboirn og Doly ( 1 979 ) Nucl. Acids Res. 7 1 51 3-1 523.
Hinnen et al (1978) Proe. Nat. Acad. Sei., Usa 75, 1929-1933. Rigby et al ( 1 977 ) J. Mol. Biol. 1J_3 , 237.
Southern (1 975) J. Mol. Biol. 98. 503-51 7.
Den følgende del av beskrivelsen utgjør foretrukne utførelses-forrner 1-30, avfattet i samme form som krav. 1. En fremgangsmåte til isolering av funksjonelle gener fra gjærstammer av slekten Pichia omfattende: (a) fremstilling av et arkiv ved behandling av Pichia samlet DNA med et passende restriksjonsenzym for å gi Pichia DNA-fragmenter og kloning av de nevnte DNA-fragmenter inn i en Saccharomyces cerevisiae/Escherichia coli-skyttelvektor; (b) transforrnasjon med det nevnte arkiv en mutant vertsstamme av Saccharomyces cerevisiae som har en selekterbar fenotype som et resultat av en defekt i minst ett genprodukt; (c) dyrking av de transformerte stammer under selektive dyrkingsbetingelser, idet de selektive dyrkingsbetingelser ikke skaffer de betingelser som kreves av den defekte vertsstamme for vekst; (d) isolering av plasmid DNA fra de nevnte transformerte stammer; og (e) utvinning av Pichia DNA innføyet materiale fra de nevnte plasmider. 2. Fremgangsmåte som angitt i punkt 1, hvor den nevnte Saccharomyces cerevisiae/Escherichia coli-skyttelvektor er YEp13. 3. Fremgangsmåte som angitt i punkt 1, hvor den nevnte Saccharomyces cerevisiae vertsstamme er defekt i en aminosyre/- biosyntetisk-vei. 4. Fremgangsmåte som angitt i punkt 3, hvor Saccharomyces cerevisiae-vertsstammen er defekt i HIS4-genet. 5. Fremgangsmåte som angitt i punkt 4, hvor den nevnte vertsstamme er Saccharomyces cerevisiae NRRL Y-15859. 6. Fremgangsmåte som angitt i punkt 1, hvor de nevnte selektive dyrkingsbetingelser omfatter gjær-minimalt-media som mangler histidin. 7. Et gen som koder for produksjonen av histidinoldehydrogenase, eller en underenhet derav, eller en ekvivalent av et slikt gen eller underenhet. 8. Gen som angitt i punkt 7, som ytterligere koder for produksjonen av fosforibosyl-ATP-cyklohydrase og fosforibosyl-
ATP-pyrofosfohydratase eller en underenhet derav eller en ekvivalent av et slikt gen eller underenhet. 9. Gen som angitt i punkt 7, hvor det nevnte gen er kjennetegnet ved restriksjonskartet på fig. 3b på tegningen. 10. Gen som angitt i punkt 7, ytterligere omfattende flankerende områder av kromosomalt DNA som kjennetegnet ved restriksjonskartet på fig. 3a på tegningen. 11. Et DNA-fragment som omfatter et regulerende område, idet det regulerende område reagerer på nærværet eller fraværet av næringsstoffer i dyrkingsmediet som en vertsorganisme for det nevnte DNA-fragment er i berøring med, og hvor det nevnte regulerende område kan styre produksjonen av polypeptider når det er anordnet ved 5'-enden av det DMA som koder for produksjonen av de nevnte polypeptider, og mutanter av det nevnte DNA-fragment. 12. Et DNA-fragment som angitt i punkt 11, hvor fragmentet er kjennetegnet ved restriksjonskartet på fig. 3c på tegningen. 13. Et DNA-fragment som angitt i punkt 11, ytterligere omfattende LacZ-genet anordnet ved 3'-enden av det nevnte regulerende område. 14. Et DNA-fragment som angitt i punkt 13, hvor fragmentet er kjennetegnet ved 4.2 kbp EcoRl/NruI-fragmentet på restriksjonskartet på fig. 6 på tegningen. 15. Hybrid plasmid pYJ8 med restriksjonskartet som vist på fig. 4 på tegningen. 16. Hybrid plasmid pBPf3 med restriksjonskartet som vist på fig. 6 på tegningen.
17. Escherichia coli NRRL B-15809 (LE392-pYJS).
18. Escherichia coli NRRL B-15892 (LE392-pBPf1).
19. Fremgangsmåte omfattende:
(a) dyrking av Escherichia coli NRRL B-15889 (LE392-pYJ8) i et næringsmedium;
(b) oppsplitting av de dyrkede celler; og
(c) utvinning av plasmid pYJ8 fra de oppsplittede celler. 20. Fremgangsmåte som angitt i punkt 19, ytterligere omfattende: (d) digestering av plasmid pYJ8 med en av restriksjons-enzymkombinasjonene valgt fra gruppen bestående av:
Nr u I,
EcoRV og Nrul,
EcoRV og SphI, og
Nrul og SphI, og
(e) utvinning av et DNA-fragment på ca. 6.0 kbp.
21. Fremgangsmåte som angitt i punkt 19, ytterligere omfattende: (d) digestering av plasmid pYJ8 med restriksjonsenzymet Bglll; og
(e) utvinning av et DNA-fragment på ca. 2.7 kbp.
22. Fremgangsmåte som angitt i punkt 19, ytterligere omfattende: (d) digestering av plasmid pYJ8 med restriksjonsenzymene EcoRI og PvuII; og
(e) utvinning av et DNA-fragment på ca. 600 basepar.
23. Fremgangsmåte for den interaktive transformasjon av gjær av slekten Pichia omfattende å transformere vertsstamsner av slekten Pichia med rekombinant DNA-materiale, idet det nevnte rekombinante DNA-materiale omfatter: (i) et gen som kan selekteres i en Pichia-vertsstamme; (ii) Pichia DNA-sekvenser som har en høy grad av homologi med genornet av Pichia-vertsstammen, og (iii) ytterligere DNA valgt fra gruppen bestående av regulerende områder, og
polypeptidkodende områder,
hvor det nevnte rekombinante DNA-materiale inneholder stort sett ingen autonom replikasjonsaktivitet i Pichia.
24. Fremgangsmåte som angitt i punkt 23, hvor det nevnte rekombinante DNA-materiale ytterligere omfatter: (iv) DN/i-sekvenser som har en bakteriell opprinnelse av replikasjon, og minst én markør selekterbar i bakterier. 25. Fremgangsmåte som angitt i punkt 23, hvor det nevnte rekombinante DNA-materiale omfatter plasmid pYJ8. 26. Fremgangsmåte som angitt i punkt 23, hvor det nevnte rekombinante DNA-materiale omfatter plasmid pYJ8ACla. 27. Fremgangsmåte til regulering av ekspresjonen av polypeptid i en transformert gjærstamme omfattende å dyrke den nevnte transformerte gjærstamme i nærvær eller fravær av tilsatte neeringsstof f er, idet den nevnte transformerte gjærstamme er blitt transformert med rekombinant DNA-materiale, hvilket rekombinante DNA-materiale omfatter et regulerende område og et polypeptidkodende område, idet det nevnte regulerende område reagerer på nærværet av næringsstoffer i dyrkingsmediet som den transformerte gjaerstamme er i kontakt med, idet det nevnte regulerende område kan styre produksjonen av polypeptider når det er anordnet ved 5'-enden av det DN/i-kodende område som koder for produksjonen av det nevnte polypeptid, idet det nevnte polypeptidkodende område uttrykkes i fraværet av tilsatt næringsstoff og ikke uttrykkes i nærværet av tilsatt næringsstoff . 28. Fremgangsmåte som angitt i punkt 27, hvor den transformerte gjærstamme er en gjær av slekten Pichia. 29. Fremgangsmåte som angitt i punkt 27, hvor det nevnte rekombinante DNA-materiale er plasmid pBPf3. 30. Fremgangsmåte som angitt i punkt 27, hvor det nevnte næringsstoff omfatter histidin.
Claims (10)
1. Fremgangsmåte til isolering av funksjonelle gener fra gjærstammer av slekten Pichia omfattende: (a) fremstilling av et arkiv ved behandling av Pichia samlet DNA med et passende restriksjonsenzym for å gi Pichia DNA-fragmenter og kloning av de nevnte DN/v-f ragmenter inn i en Saccharomyces cerevisiae/Escherichia coli-skyttelvektor; (b) transformering med det nevnte arkiv en mutant Saccharomyces cerevisiae-vertsstamme som har en selekterbar fenotype som et resultat av en defekt i minst ett genprodukt; (c) dyrking av de transformerte stammer under selektive dyrkingsbetingelser; idet de nevnte selektive dyrkingsbetingelser ikke skaffer de betingelser som kreves av den defekte vertsstamme for vekst; (d) isolering av plasmid DNA fra de nevnte transformerte stammer; og (e) utvinning av Pichia DNA innføyde materialer fra de nevnte plasmider.
2. Fremgangsmåte som angitt i krav 1,karakterisert vedat den nevnte Saccharomyces cerevisiae/Escherichia coli-skyttelvektor er YEp13, særlig hvor Saccharomyces cerevisiae-vertsstammen er defekt i en aminosyre-biosyntetisk-vei, særlig hvor Saccharomyces cerevisiae-vertsstammen er defekt i HIS4-genet, særlig hvor vertsstammen er Saccharomyces NRRL Y-15859, særlig hvor de selektive dyrkingsbetingelser omfatter gjær-minimalt-media som mangler histidin.
3. Et gen som koder for produksjonen av histidinoldehydrogenase, eller en underenhet derav eller en ekvivalent av et slikt gen eller underenhet, særlig et som ytterligere koder for produksjonen av fosforibosyl-ATP-cyklohydrase og fosforibosyl-ATP-pyrofosfohydratase eller en underenhet derav eller en evivalent av et slikt gen eller underenhet, særlig hvor genet er kjennetegnet ved restriksjonskartet på fig. 3b på tegningen, særlig ytterligere omfattende flankerende områder av kromosomalt DNA som kjennetegnet ved restriksjonskartet på fig. 3a på tegningen.
4. Et DNA- fragment omfattende et regulerende område, hvor det nevnte regulerende område reagerer på nærværet eller fraværet av riaaringsstof f er i dyrkingsmediet som vertsorganismen for DNA-fragmentet er i kontakt med, og hvor det nevnte regulerende område kan styre produksjonen av polypeptider når det er anordnet ved 5'-enden av det DMA som koder for produksjonen av de nevnte polypeptider, og mutanter av det nevnte DN/\-fragment, særlig hvor fragmentet er kjennetegnet ved restriksjonskartet på fig. 3c på tegningen, særlig ytterligere omfattende LacZ-genet anordnet ved 3'-enden av det regulerende område, særlig hvor det nevnte fragment er kjennetegnet ved 4.2 kbp EcoRI/NruI-fragmentet på restriksjonskartet på fig. 6 på tegningen.
5. Hybrid plasmid pYJ8 som har restriksjonskartet som vist på fig. 4 på tegningen eller hybrid plasmid pBPf3 som har restriksj onskartet som vist på fig. 6 på tegningen.
6. Escherichia coli NRRL B-15889 (LE392-pYJ8) eller Escherichia coli NRRL B-15892 (LE392-pBPf1).
7. Fremgangsmåte omfattende: (a) dyrking av Escherichia coli NRRL N-15839 (LE392-pYJ8) i et næringsmedium; (b) oppsplitting av de dyrkede celler; og (c) utvinning av plasmid pYJ8 fra de oppsplittede celler;
særlig ytterligere omfattende: (d) digestering av plasmid pYJ8 med en av restriksjonsen-zymkombinasjonene valgt fra gruppen bestående av: Nr ul, EcoRV og Nrul, EcoRV og SphI, og Nrul og SphI; og (e) utvinning av et DNA-fragment på ca. 6.0 kbp, særlig ytterligere omfattende: (d) digestering av plasmid pYJ8 med restriksjonsenzymet Bglll; og (e) utvinning av et DNA-fragment på ca. 2.7 kbp, særlig ytterligere omfattende: (d) digestering av plasmid pYJ8 med restriksjonsenzymene EcoRI og PvuII; og (e) utvinning av et DNA-fragment på ca. 600 basepar.
8. Fremgangsmåte for den integrative transformasjon av gjær av slekten Pichia omfattende å transformere vertsstammer av slekten Pichia med rekombinant DNA-materiale;
idet det nevnte rekombinante DNA-materiale omfatter: (i) et gen som kan selekteres i en Pichia vertsstamme; (ii) Pichia DNA-sekvenser som har en betydelig grad av homologi med genornet av Pichia-vertsstarnmen; og (iii) ytterligere DNA valgt fra gruppen bestående av: regulerende områder, og polypeptidkodende områder;
idet det nevnte rekombinante DNA-materiale inneholder stort sett ingen autonom replikasjonsaktivitet i Pichia, særlig hvor det rekombinante DNA-materiale ytterligere omfatter: (iv) DNA-sekvenser som har en bakteriell opprinnelse av replikasjon og minst én markør selekterbar i bakterier;
saerlig hvor det nevnte rekombinante DNA-materiale omfatter plasmid pYJ8, særlig hvor det nevnte rekombinante DNA-materiale omfatter plasmid pYJSACla.
9. Fremgangsmåte til regulering av ekspresjonen av polypeptid i en transformert gjærstame omfattende dyrking av den transformerte gjærstamme i nærvær eller fravær av tilsatte næringssstof-fer, idet den transformerte gjærstamme er blitt transformert med rekombinant DNA-materiale; idet det nevnte rekombinante DNA-materiale omfatter et regulerende område og et polypeptidkodende område, idet det nevnte regulerende område reagerer på nærværet av næringsstoffer i det dyrkingsmedium som den transformerte gjærstamme er i kontakt med, idet det nevnte regulerende område kan styre produksjonen av polypeptider når det er anordnet ved 5'-enden av det DNA-område som koder for produksjonen av det nevnte polypeptid, idet det nevnte polypeptidkodende område yttrykkes i fraværet av tilsatt næringssstoff og ikke yttrykkes i nærværet av tilsatt næringsstoff.
10. Fremgangsmåte som angitt i krav 9,karakterisert vedat den transformerte gjærstamme er en gjær av slekten Pichia, særlig hvor det nevnte rekombinante DNA-materiale er plasmid pBPf3, særlig hvor det tilsatte næringsstoff omfatter histidin.
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US06/666,578 US4885242A (en) | 1984-10-30 | 1984-10-30 | Genes from pichia histidine pathway and uses thereof |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
NO854333L true NO854333L (no) | 1986-05-02 |
Family
ID=24674601
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
NO854333A NO854333L (no) | 1984-10-30 | 1985-10-30 | Isolering av gener fra gjaerarter av slekten pichia. |
Country Status (12)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US4885242A (no) |
EP (1) | EP0188677A3 (no) |
JP (3) | JP2617443B2 (no) |
AU (1) | AU571748B2 (no) |
DK (1) | DK496285A (no) |
ES (1) | ES8609477A1 (no) |
FI (1) | FI854144L (no) |
GR (1) | GR852608B (no) |
IL (1) | IL76764A0 (no) |
NO (1) | NO854333L (no) |
PT (1) | PT81401B (no) |
ZA (1) | ZA858182B (no) |
Families Citing this family (38)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4855231A (en) * | 1984-10-30 | 1989-08-08 | Phillips Petroleum Company | Regulatory region for heterologous gene expression in yeast |
IL89993A0 (en) * | 1988-04-25 | 1989-12-15 | Phillips Petroleum Co | Expression of the hiv 24kda gag protein in methylotrophic yeasts |
IL90021A0 (en) * | 1988-04-25 | 1989-12-15 | Phillips Petroleum Co | Process for the production of interferon |
IL89992A0 (en) * | 1988-04-25 | 1989-12-15 | Phillips Petroleum Co | Expression of human serum albumin in methylotrophic yeasts |
CA2000101A1 (en) * | 1988-12-22 | 1990-06-22 | Mary E. Digan | Pichia pastoris glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase gene |
WO1990009434A1 (en) * | 1989-02-13 | 1990-08-23 | The Salk Institute Biotechnology/Industrial Associates, Inc. | Production of superoxide dismutase in pichia pastoris yeast cells |
US5268273A (en) * | 1990-12-14 | 1993-12-07 | Phillips Petroleum Company | Pichia pastoris acid phosphatase gene, gene regions, signal sequence and expression vectors comprising same |
WO1992013951A1 (en) * | 1991-02-04 | 1992-08-20 | The Salk Institute Biotechnology/Industrial Associates, Inc. | Production of human serum albumin in methylotrophic yeast cells |
CA2105064A1 (en) * | 1991-04-01 | 1992-10-02 | Martin Anthony Gleeson | Genes which influence pichia proteolytic activity, and uses therefor |
CA2058820C (en) * | 1991-04-25 | 2003-07-15 | Kotikanyad Sreekrishna | Expression cassettes and vectors for the secretion of human serum albumin in pichia pastoris cells |
US5330901A (en) * | 1991-04-26 | 1994-07-19 | Research Corporation Technologies, Inc. | Expression of human serum albumin in Pichia pastoris |
EP0788546B9 (en) * | 1994-10-18 | 2007-06-13 | Dendreon Corporation | Nematode-extracted serine protease inhibitors and anticoagulant proteins |
US5866543A (en) * | 1995-06-05 | 1999-02-02 | Corvas International, Inc. | Nematode-extracted anticoagulant protein |
US5863894A (en) * | 1995-06-05 | 1999-01-26 | Corvas International, Inc. | Nematode-extracted anticoagulant protein |
US5866542A (en) * | 1994-10-18 | 1999-02-02 | Corvas International, Inc. | Nematode-extracted anticoagulant protein |
US5945275A (en) * | 1994-10-18 | 1999-08-31 | Corvas International, Inc. | Nematode-extracted anticoagulant protein |
US5872098A (en) * | 1995-06-05 | 1999-02-16 | Corvas International, Inc. | Nematode-extracted anticoagulant protein |
CA2202351A1 (en) * | 1994-10-18 | 1996-04-25 | George Phillip Vlasuk | Nematode-extracted serine protease inhibitors and anticoagulant proteins |
MX9605082A (es) | 1996-10-24 | 1998-04-30 | Univ Autonoma De Nuevo Leon | Levaduras metilotroficas modificadas geneticamente para la produccion y secrecion de hormona de crecimiento humano. |
EP0972847A3 (en) * | 1998-04-24 | 2000-02-09 | Hoechst Marion Roussel | Method for screening antimycotic substances |
WO1999055907A2 (en) * | 1998-04-24 | 1999-11-04 | Hoechst Marion Roussel | Method for screening antimycotic substances using essential genes from s. cerevisiae |
US6440414B1 (en) * | 1999-10-01 | 2002-08-27 | Amgen Inc. | Pharmaceutical compositions of fibrinolytic agent |
US6261820B1 (en) * | 1999-10-01 | 2001-07-17 | Amgen Inc. | Fibronolytically active polypeptide |
US7033776B2 (en) * | 1999-12-17 | 2006-04-25 | Amgen Inc. | Method for treatment of indwelling catheter occlusion using fibrinolytic metalloproteinases |
US8697394B2 (en) * | 2000-06-28 | 2014-04-15 | Glycofi, Inc. | Production of modified glycoproteins having multiple antennary structures |
US7598055B2 (en) * | 2000-06-28 | 2009-10-06 | Glycofi, Inc. | N-acetylglucosaminyltransferase III expression in lower eukaryotes |
US7863020B2 (en) | 2000-06-28 | 2011-01-04 | Glycofi, Inc. | Production of sialylated N-glycans in lower eukaryotes |
KR100787073B1 (ko) * | 2000-06-28 | 2007-12-21 | 글리코파이, 인크. | 변형된 당단백질의 제조방법 |
US7449308B2 (en) | 2000-06-28 | 2008-11-11 | Glycofi, Inc. | Combinatorial DNA library for producing modified N-glycans in lower eukaryotes |
US7625756B2 (en) | 2000-06-28 | 2009-12-01 | GycoFi, Inc. | Expression of class 2 mannosidase and class III mannosidase in lower eukaryotic cells |
US7009045B2 (en) * | 2000-07-14 | 2006-03-07 | Archer-Daniels-Midland Company | Transformation systems for flavinogenic yeast |
ATE494367T1 (de) * | 2002-12-18 | 2011-01-15 | Hoffmann La Roche | Rekombinante desoxyribonuclease i aus rinder- pankreas mit hoher spezifischer aktivität |
ATE387494T1 (de) * | 2002-12-20 | 2008-03-15 | Hoffmann La Roche | Hitzelabile desoxyribonuklease i-varianten |
US7332299B2 (en) | 2003-02-20 | 2008-02-19 | Glycofi, Inc. | Endomannosidases in the modification of glycoproteins in eukaryotes |
EP1460425A1 (en) * | 2003-03-17 | 2004-09-22 | Boehringer Mannheim Gmbh | Deglycosylated enzymes for conjugates |
CA2486195C (en) * | 2003-12-05 | 2012-03-06 | Stephan Glaser | Recombinantly expressed carboxypeptidase b and purification thereof |
ES2370657T3 (es) * | 2005-09-14 | 2011-12-21 | Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh | Escisión de precursores de insulinas mediante una variante de tripsina. |
DE202008014341U1 (de) | 2008-10-28 | 2009-02-12 | Heßler, Christoph, Dr. | Mobile Fräse zur Kantenbearbeitung |
Family Cites Families (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DK368882A (da) * | 1981-08-25 | 1983-02-26 | Alan John Kingsman | Expessions vektorer |
US4617274A (en) * | 1981-10-29 | 1986-10-14 | Phillips Petroleum Company | Biochemical conversions by yeast fermentation at high cell densities |
EP0128743A3 (en) * | 1983-06-07 | 1985-12-27 | Genex Corporation | Expression of foreign genes in yeast |
AU578486B2 (en) * | 1984-08-03 | 1988-10-27 | Ronald Norman Belsham | Picture frame clamp |
US4837148A (en) * | 1984-10-30 | 1989-06-06 | Phillips Petroleum Company | Autonomous replication sequences for yeast strains of the genus pichia |
US4879231A (en) * | 1984-10-30 | 1989-11-07 | Phillips Petroleum Company | Transformation of yeasts of the genus pichia |
-
1984
- 1984-10-30 US US06/666,578 patent/US4885242A/en not_active Expired - Lifetime
-
1985
- 1985-10-16 AU AU48751/85A patent/AU571748B2/en not_active Ceased
- 1985-10-20 IL IL76764A patent/IL76764A0/xx unknown
- 1985-10-23 FI FI854144A patent/FI854144L/fi not_active Application Discontinuation
- 1985-10-24 ZA ZA858182A patent/ZA858182B/xx unknown
- 1985-10-29 GR GR852608A patent/GR852608B/el unknown
- 1985-10-29 ES ES548305A patent/ES8609477A1/es not_active Expired
- 1985-10-29 DK DK496285A patent/DK496285A/da not_active Application Discontinuation
- 1985-10-29 EP EP85113734A patent/EP0188677A3/en not_active Withdrawn
- 1985-10-30 NO NO854333A patent/NO854333L/no unknown
- 1985-10-30 JP JP60243783A patent/JP2617443B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1985-10-30 PT PT81401A patent/PT81401B/pt not_active IP Right Cessation
-
1994
- 1994-09-07 JP JP6213968A patent/JPH07163354A/ja active Pending
-
1996
- 1996-12-09 JP JP8328822A patent/JP2710610B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JPH07163354A (ja) | 1995-06-27 |
US4885242A (en) | 1989-12-05 |
PT81401A (en) | 1985-11-01 |
DK496285A (da) | 1986-05-01 |
JP2710610B2 (ja) | 1998-02-10 |
ZA858182B (en) | 1986-06-25 |
AU4875185A (en) | 1986-06-12 |
JPS61108391A (ja) | 1986-05-27 |
PT81401B (pt) | 1987-11-11 |
IL76764A0 (en) | 1986-02-28 |
EP0188677A3 (en) | 1987-09-30 |
DK496285D0 (da) | 1985-10-29 |
FI854144A0 (fi) | 1985-10-23 |
JPH09168388A (ja) | 1997-06-30 |
GR852608B (no) | 1986-03-04 |
AU571748B2 (en) | 1988-04-21 |
JP2617443B2 (ja) | 1997-06-04 |
EP0188677A2 (en) | 1986-07-30 |
ES8609477A1 (es) | 1986-07-16 |
ES548305A0 (es) | 1986-07-16 |
FI854144L (fi) | 1986-05-01 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
NO854333L (no) | Isolering av gener fra gjaerarter av slekten pichia. | |
EP0226752B1 (en) | Method for high-level expression of polypeptides in yeast of the genus Pichia | |
EP0096430B2 (en) | Cloning system for Kluyveromyces species | |
NO177269B (no) | Autonome replikasjonssekvenser (PARS) for gjærarter av slekten Pichia og plasmid inneholdende disse | |
Jarvis et al. | Identification of a DNA segment that is necessary and sufficient for α-specific gene control in Saccharomyces cerevisiae: implications for regulation of α-specific and a-specific genes | |
NO864276L (no) | Gen som koder for produksjonen av pichia-argininsuccinatlyase. | |
CA1339099C (en) | Yeast vector | |
US5166329A (en) | DNA encoding the alcohol oxidase 2 gene of yeast of the genus Pichia | |
NO178076B (no) | Fremgangsmåte til å fremstille heterologe proteiner i Pichia pastoris ved bruk av ekspresjonsvektorer inneholdende sekvenser som induseres av metanol | |
NO301285B1 (no) | DNA-sekvens som koder for det regulatoriske område for alkoholoksidase II hos Pichia pastoris | |
DK171879B1 (da) | Fremgangsmåde til transformation af Yarrowia lipolytica og fremgangsmåde til kloning af gener ved komplementering af mutanter i Y.lipolytica | |
US5135868A (en) | Cultures of yeast of the genus Pichia altered by site selective genomic modification | |
WO1988010308A1 (en) | Pheromone-inducible yeast promoter | |
EP0399455B1 (en) | Stably transformed yeast host cells and their use for the production of albumin | |
Toh-e et al. | Las21 participates in extracellular/cell surface phenomena in Saccharomyces cerevisiae | |
NO891485L (no) | Fremgangsmaate til fremstilling av 22 kd sgh-protein og lineaer genevektor. | |
IE83234B1 (en) | DNA fragment encoding an AOX | |
NO315206B1 (no) | Nye celler inneholdende alkoholoksidase II regulatorisk område |