NO178076B - Fremgangsmåte til å fremstille heterologe proteiner i Pichia pastoris ved bruk av ekspresjonsvektorer inneholdende sekvenser som induseres av metanol - Google Patents

Description

Oppfinnelsen angår fremstilling av heterologe proteiner i Pichia pastoris ved bruk av ekspresjonsvektorer som inneholder sekvenser som induseres av metanol. En annen side ved oppfinnelsen angår ekspresjonsvektorene inneholdende de ovenfor nevnte sekvenser.

Etter hvert som rekombinant-DNA-teknologi har utviklet seg

i den senere tid, er den regulerte fremstilling ved hjelp av mikroorganismer av en rekke forskjellige nyttige polypeptider blitt mulig. Mange eukaryote polypeptider, f.eks. menneskelig veksthormon, leukocyttinterferoner, menneskelig insulin og menneskelig proinsulin er allerede blitt fremstilt ved forskjellige mikroorganismer. Det ventes at den fortsatte anvendelse av teknikker som allerede beherskes, i fremtiden vil tillate fremstilling ved hjelp av mikroorganismer av en rekke andre nyttige polypeptidprodukter.

De grunnleggende teknikker anvendt innen feltet rekombinant-DNA-teknologi er kjent av fagfolk. De faktorer som det er ønskelig skal foreligge for at en vertsmikroorganisme skal være nyttig i utøvelsen av rekombinant-DNA-teknologi, innbefatter, men er ikke begrenset til: (1) et gen som koder for et eller flere ønskede polypeptider, og utstyrt med tilstrekkelige kontrollsekvenser nødvendige for ekspresjon i vertsmikroorganismen, (2) en vektor, vanligvis et plasmid, i hvilken genet kan innføyes. Vektoren tjener til å garantere overføring av genet inn * i cellen og opprettholdelse av DNA-sekvensene i cellen, såvel som et høyt nivå av ekspresjon av det ovenfor nevnte gen, og

(3) en egnet vertsmikroorganisme, inn i hvilken vektoren

som bærer det ønskede gen kan transformeres, idet vertsmikroorganismen også har det celleapparat som tillater ekspresjon av informasjonen kodet for ved det innføyde gen.

Et grunnleggende element anvendt i rekombinant-DNA-teknologi er plasmidet, som er ekstrakromosomalt, dobbelttrådet DNA

som finnes i visse mikroorganismer. Der hvor plasmider er funnet å eksistere naturlig i mikroorganismer, er de ofte funnet å opptre i flere kopier pr. celle. Foruten naturlig forekommende plasmider er en rekke kunstige plasmider eller hybride vektorer blitt fremstilt av mennesker. Innlemmet i den informasjon som er kodet for i plasmid-DNA er den som er nødvendig for å reprodusere

plasmidet i datterceller, dvs. en autonom replikasjonssekvens eller en replikasjonsopprinnelse. En eller flere fenotypiske seleksjonsegenskaper må også være innlemmet i informasjonen kodet for i det plasmide DNA. De fenotypiske seleksjonsegenskaper tillater at kloner av vertscellen inneholdende det plasmid som er av interesse, kan gjenkjennes og velges ut ved preferensiell vekst av cellene i selektive medier.

Nytten av plasmider ligger i det faktum at de kan kløyves spesifikt av et eller annet restriksjonsendonuklease eller restri-ksjonsenzym som hver kjenner igjen et spesifikt, unikt sete på det plasmide DNA. Deretter kan homologe gener, heterologe gener, dvs. gener avledet fra organismer andre enn verten, eller genefragmenter innsettes i plasmidet ved endesammenføyning av det kløyvede plasmid, og ønsket genetisk materiale på kløyvingsstedet eller ved rekonstruerte ender som støter opp til kløyvingsstedet. Det resulterende rekombinerte DNA-materiale kan betegnes som en

hybrid vektor.

DNA-rekombinasjon utføres utenfor vertsmikroorganismen. Den resulterende hybride vektor kan innføres i vertsmikroorganismen ved en prosess kjent som transformasjon. Ved dyrking av den transformerte mikroorganisme kan store mengder av den hybride vektor fås. Når genet er riktig innføyd med hensyn til de deler av plasmidet som styrer transkripsjon og translasjon av den kodede DNA-beskjed, kan den resulterende hybride vektor brukes til å dirigere produksjonen av polypeptidsekvensen for hvilken det innføyde gen koder. Produksjonen av polypeptid på denne måte kalles for genekspresjon.

Genekspresjon initieres i en DNA-region kjent som promotorregionen. I transkripsjonsfasen av ekspresjonen vikler DNA seg ut, hvilket legger den fri som en templat for syntese av messenger-RNA. RNA-polymerase binder seg til promotorregionen og vandrer langs det utkveilede DNA fra sin 3'-ende til sin 5'-ende, idet det transkriberer informasjonen som inneholdes i kodetråden inn i messenger-RNA (mRNA) fra 5'-enden til 3'-enden av mRNA-molekylet. Messenger-RNA-molekylet er i sin tur bundet ved ribosomer, hvor mRNA translateres til polypeptidkjeden. Hver amonisyre er kodet for ved en nukleotidtriplett eller kodon inne i hva som kan betegnes som det strukturelle gen, dvs. den del av genet som koder for aminosyresekvensen av det uttrykte produkt. Da tre nukleotider koder for produksjonen av hver aminosyre, er det mulig for en nukleotidsekvens å bli "lest" på tre forskjellige måter. Den spesielle leseramme som koder for det ønskede polypeptidprodukt betegnes som den riktige leseramme.

Etter å ha bundet seg til promotoren, transkriberer RNA-polymerase først en 5'-lederregion av mRNA, deretter en transla-sjonsinitiering eller startkodon fulgt av nukleotidkodonene inne i selve det strukturelle gen. For å oppnå det ønskede genprodukt er det nødvendig for initierings- eller startkodonet å initiere korrekt translasjonen av messenger-RNA ved ribosomet i den riktige leseramme. Til slutt blir stoppkodoner transkribert på enden av det strukturelle gen, hvilket bevirker at ytterligere sekvenser av mRNA forblir utranslatert til peptid av ribosomene, selv om ytterligere sekvenser av mRNA er blitt dannet ved interaksjonen av RNA-polymerase med DNA-templaten. Således bestemmer stoppkodoner slutten av translasjonen og derfor slutten av videre innlemmelse av aminosyrer i polypeptidproduktet. Polypeptidproduktet kan fås ved oppløsing (lysing) av vertscellen og utvinning av produktet ved egnet rensing fra annet mikrobielt protein, eller, under visse omstendigheter, ved rensing av fermenteringsmediet hvor vertscellene er blitt dyrket og inn i hvilket polypeptidproduktet er blitt avsondret.

I praksis kan bruken av rekombinant-DNA-teknologi skape mikroorganismer som er istand til å uttrykke fullstendig heterologe polypeptider, dvs, polypeptider som ikke vanligvis finnes i eller produseres av en gitt mikroorganisme såkalt direkte ekspresjon. Alternativt kan det uttrykkes et fusjonsprotein, dvs. et heterologt polypeptid smeltet sammen med en porsjon av aminosyresekvensen av et homologt polypeptid, dvs. polypeptider som finnes i eller produseres ved den vertsmikroorganisme som foreligger i vill tilstand (ikke-transformert) såkalt indirekte ekspresjon. Med indirekte ekspresjon blir det opprinnelig oppnådde fusjonsproteinprodukt iblant etterlatt inaktivt for det formål det er beregnet på inntil det sammensmeltede homologe/heterologe polypeptid kløyves i et ekstracellulært miljø. Således har f.eks. cyanogenbromid-kløyving av metioninrester gitt somatostatin, tymosin-alfa-1 og komponent A- og B-kjeder av menneskelig insulin fra sammensmeltede homologe/heterologe polypeptider, mens enzymatisk kløyving av agrensede rester har

gitt beta-endorfin.

Inntil nå har kommersielle anstrengelser for å anvende rekombinant-DNA-teknologi til fremstilling av forskjellige polypeptider konsentrert seg om Escherichia coli som en vertsorganisme. I visse situasjoner kan imidlertid E. coli vise seg å være uønsket som vert. F.eks. E. coli inneholder en rekke toksiske pyrogene faktorer som må elimineres fra et eventuelt polypeptid som er nyttig som et farmasøytisk produkt. Virknings-fullheten med hvilken denne rensing kan oppnås, vil selvsagt variere med det spesielle polypeptid. Dessuten kan de proteoly-tiske aktiviteter av E. coli i alvorlig grad begrense utbyttet av visse nyttige produkter. Disse og andre forhold har ført til øket interesse for alternative verter, og særlig er bruken av euka-ryotiske organismer for fremstillingen av polypeptidprodukter tiltrekkende.

Tilgjengeligheten av midler for fremstilling av polypeptidprodukter i eukaryote systemer, f.eks. gjær, kan skaffe betydelige fordeler i forhold til bruken av prokaryote systemer såsom E. coli for fremstillingen av polypeptider kodet for ved rekombinant-DNA. Gjær er blitt brukt i fermenteringer i stor skala i århundreder sammenlignet med den forholdsvis nye utvikling av fermentering av E. coli i stor skala. Gjær kan generelt dyrkes til høyere celletettheter enn bakterier, og lar seg lett tilpasse kontinuerlig fermenteringsbehandling. Dyrkingen av gjær såsom Pichia pastoris til ultrahøye celletettheter, dvs. celletettheter som overstiger 100 g/l, er angitt av Wegner i US-PS 4 414 329. Ytterligere fordeler av gjærverter innbefatter det faktum at mange kritiske funksjoner av organismen, f.eks. oksidativ fosforylering, er anordnet inne i organeller og derfor ikke utsatt for de mulige skadelige virkninger av organismens produksjon av polypeptider som er fremmede for vertsceller av den type som finnes i vill tilstand. Som en eukaryot organisme kan gjær vise seg istand til å glykosylere uttrykte polypeptidprodukter der hvor slik glykosylering er viktig for bioaktiviteten av polypeptidproduktet. Det er også mulig at som en eukaryot organisme vil gjær oppvise de samme kodon-preferanser som høyere organismer og således helle i retning av mer effektiv produksjon av ekspresjonsprodukter fra gener fra pattedyr eller fra komple-mentært DNA (cDNA) som fås ved revers transkripsjon fra, f.eks.,

pattedyr-mRNA.

Utviklingen av dårlig karakteriserte gjærarter som vert/- vektor-systemer er i høy grad hemmet i mangelen på kunnskap om transformasjonsbetingelser og egnede vektorer. Dessuten er auxotrofiske mutasjoner ofte ikke tilgjengelige, hvilket uteluk-ker en direkte utvelging for transformanter ved auxotrofisk komplementering. Dersom rekombinant-DNA-teknologi fullt ut skal oppfylle hva den lover, må nye vert/vektor-systemer konstrueres som letter manipuleringen av DNA samt optimaliserer ekspresjonen av innføyde DNA-sekvekser slik at de ønskede polypeptidprodukter kan fremstilles under regulerte betingelser og med høyt utbytte.

Hensikten med foreliggende oppfinnelse er derfor å tilveiebringe en fremgangsmåte for fremstilling av heterologe polypeptider i Pichia pastoris ved bruk av ekspresjonsvektorer som inneholder regulerende sekvenser som induseres av metanol samt den ovennevnte ekspresjonsvektor. "

Disse hensikter med oppfinnelsen vil fremgå fra den foreliggende beskrivelse og krav.

I henhold til den foreliggende oppfinnelse er det funnet, ■ isolert og karakterisert DNA-sekvenser som styrer transkripsjonen av DNA til messenger-RNA og translasjon av messenger-RNA for å gi et polypeptidprodukt. De nye DNA-sekvenser ifølge oppfinnelsen er nyttige for fremstillingen av polypeptidprodukter ved (a) gjærstammer som kan dyrkes på metanol som en karbon- og energikilde, (b) gjærstammer som kan dyrkes på glykose, etanol, fruktose og lignende, og (c) gjærstammer som kan dyrkes på glycerol, galaktose, acetat og lignende.

Fig. 1 er en korrelasjon av forholdet mellom den genomiske klon (pPG 6.0) og cDNA-klon (pPC 15.0) for protein p76. Fig. 2 er en korrelasjon av forholdet mellom den genomiske klon (pPG 4.0) og cDNA-kloner (pPC 8.3 og pPC 8.0) for protein p72 (alkoholoksidase). Fig. 3 er en korrelasjon av forholdet mellom den genomiske klon (pPG 4.8) og cDNA-klon (pPC 6.7) for protein p40. Fig. 4 gir restriksjonskart for regulerende områder ifølge oppfinnelsen fra klon pPG 6.0. Fig. 5 er et restriksjonskart av det regulerende område ifølge oppfinnelsen fra klon pPG 4.0. Fig. 6 er et restriksjonskart av det regulerende område

ifølge oppfinnelsen fra klon pPG 4.8.

Fig. 7 er et restriksjonskart av en sekvens av DNA oppnådd fra 3'-enden av det p76 strukturelle gen. Fig. 8 gir restriksjonskart av sekvenser av DNA oppnådd fra 3'-enden av det p72 (alkoholoksidase) strukturelle gen. Fig. 9 er et restriksjonskart av en sekvens av DNA oppnådd fra 3'-enden av det p4 0 strukturelle gen. Fig. 10 er et restriksjonskart av protein p76 strukturelt gen, og det 5' regulerende område for dette. -Fig. 11 er et restriksjonskart av protein p40 strukturelt gen, og det 5' regulerende område for dette.

Fig. 12 er et restriksjonskart av protein p7 6 cDNA.

Fig. 13 er et restriksjonskart av protein p72 (alkoholoksidase) cDNA.

Fig. 14 er et restriksjonskart av protein p40 cDNA.

Fig. 15 gir restriksjonskart av to nye p76 regulerende område/lacZ DNA-konstruksjoner ifølge oppfinnelsen. Fig. 16 er et restriksjonskart av en ny p72 (alkoholoksidase) regulerende område/lacZ DNA-konstruksjon ifølge oppfinnelsen.

Fig. 17 er et restriksjonskart av plasmid pSAOHl.

Fig. 18 er et restriksjonskart av plasmid pSAOH 5.

Fig. 19 er et restriksjonskart av plasmid pSAOH 10.

Fig. 20 er et restriksjonskart av plasmid pTAFH.85.

Fig. 21 er et restriksjonskart av plasmid pT7 6H 1.

Fig. 22 er et restriksjonskart av plasmid pT76H 2.

Fig. 22a er et restriksjonskart av plasmid pT76H 3.

Fig. 22b er et restriksjonskart av plasmid pT76H 4.

Fig. 23 er et restriksjonskart av plasmid pYA 2.

Fig. 24 er et restriksjonskart av plasmid pYA 4.

Fig. 25 er et restriksjonskart av plasmid pYJ 8.

Fig. 26 er et restriksjonskart av plasmid pYJ8 Cia.

Fig. 27 er et restriksjonskart av plasmid pYJ30.

Fig. 28 gir et restriksjonskart av plasmid pTAFH 1 og viser hvordan plasmidet ble oppnådd. Fig. 29 gir et restriksjonskart av plasmid pTAO 12 og viser hvordan plasmidet ble oppnådd.

Fig. 3 0 er et restriksjonskart av plasmid pTAO 13.

Fig. 30a er et restriksjonskart av plasmid pT76U 1.

Fig. 31 gir et restriksjonskart av plasmid pTAO 1 og viser hvordan plasmidet ble oppnådd. Fig. 32 gir et restriksjonskart av plasmid pTAF.85 og viser hvordan plasmidet ble oppnådd. Fig. 33 gir et restriksjonskart av plasmid YEp 13.

Fig. 34 er et restriksjonskart av pBPf 1.

De følgende forkortelser er anvendt gjennom hele den foreliggende søknad for å representere de restriksjonsenzymer som ble anvendt:

A = Asu II

B = BamHI

B2 = Bglll

Bc = Bell

C = Clal

H2 = HincII

H3 = Hindlll

K = Kpnl

Nd2 = Ndel

Nr = Nrul

Ps = Pstl

P<v->l <=> Pvul

P<v>2 <=> PvulI

R]_ - EcoRI

R5 = EcoRV

Rs = Rsal

S = Sali

S3 = Sau3AI

Sc = SacI

Sm = Smal

Sp = SphI

Ss = Sstl

St = Stul

T = Taql

Th = Thai

Xb = Xbal

Xh = Xhol

Xm = Xmal

I de vedlagte figurer er restriksjonssteder som anvendes for manipulering av DNA-fragmenter, men som ødelegges ved binding

(ligation), angitt ved at forkortelsen for det ødelagte sete settes i parentes.

Detaljert beskrivelse av oppfinnelsen

I henhold til den foreliggende oppfinnelse er det tilveiebragt en fremgangsmåte til fremstilling av polypeptid som omfatter å dyrke en transformert gjærstamme oppnådd ved å transformere en Pichia pastoris-vert med en ekspresjonsvektor som bærer rekombinant DNA-materiale, hvor det rekombinante DNA-materialet omfatter et DNA-fragment som omfatter et regulatorisk område-avledet fra Pichia pastoris, hvor det regulatoriske område reagerer på nærværet av metanol i vekstmediet med hvilket en vertsorganisme for DNA-fragmentet er i kontakt, hvor det regulatoriske område er i stand til å kontrollere transkripsjonen av mRNA når det er plassert på 5'-enden av et DNA som koder for mRNA'et, hvor det regulatoriske område er valgt fra: (a) det regulatoriske område som kontrollerer transkripsjonen av mRNA som koder for dihydroksyacetonsyntetase, som kan oppnås fra klon pPG6.0 (NRRL B-15867) fra 5'-HindIII-restriksjonssettet til 3'-Xhol-restriksjonssettet; (b) det regulatoriske område som kontrollerer transkripsjonen av mRNA som koder for alkoholoksidase, som oppnås fra klon pPG4.0 (NRRL B-15868) fra 5'-EcoRI-restriksjonssettet til 3'-EcoRV-restriksjonssettet; (c) det regulatoriske område som kontrollerer transkripsjonen av mRNA som koder for p40 som oppnås fra klon pPG4.8 (NRRL B-15869) fra 5'-BamHI-restriksjonssettet til 3'-Sall-restriksj onssettet;

hvor dyrkingen foretas i et næringsmedium og ekspresjonen induseres i nærvær av metanol og gjenvinning av polypeptidene.

Videre er der i henhold til oppfinnelsen tilveiebragt en ekspresjonsvektor med et DNA-fragment som omfatter et regulerende område som kan styre polyadenyleringen, avslutningen av transkripsjonen og avslutningen av translasjonen av mRNA når det anordnes ved 3'-enden av det polypeptidkodende område som koder for produksjon av messenger-RNA, idet transkripsjonen og translasjonen av messenger-RNA styres av et regulerende område som reagerer på minst én av de følgende betingelser: nærværet av metanol, karbonkildehunger når cellene dyrkes på visse substrater andre enn metanol, og nærværet av ikke-katabolittundertrykkende

karbonkilder andre enn metanol.

Isolering av regulerbare gener fra Pichia pastoris

Et cDNA-bibliotek på ca. 20 000 enheter ble fremstilt i E.

coli med poly-A+ RNA isolert fra Pichia pastoris-celler dyrket på metanol som den eneste karbonkilde (se eksempel III). Arkivet ble sortert ved hybridisering ved anvendelse av kinasebehandlet poly-A+ RNA isolert fra Pichia pastoris dyrket enten i nærvær av

metanol eller etanol. Etter flere runder av denne pluss/minus-sorter-ing ble tre adskilte ikke-homologe cDNA-kloner identifisert som kopier av metanolspesifikke messenger-RNA. Disse kloner ble betegnet som pPC 6.4, pPC 8.0, og pPC 15.0, og ble funnet å inneholde innskudd på henholdsvis 470, 750 og 1100 nukleotiders lengde.

I et forsøk på å oppnå cDNA-kloner av større lengde, ble et andre cDNA-bibliotek fremstilt ved anvendelse av mildere Sl-nukleasefordøyelsesforhold enn dem som ble anvendt for fremstilling av det første cDNA-bibliotek, og medlemmene av dette nye bibliotek ble sortert individuelt med <32>P-merkede cDNA-kloner pPC 6.4, pPC 8.0 og pPC 15.0. Som et resultat ble større cDNA-kloner isolert svarende til cDNA-kloner pPC 6.4 og pPC 8.0. De større kloner, pPC 6.7 og pPC 8.3, ble funnet å inneholde innskudd som målte henholdsvis 1200 og 2100 nukleotider (se fig. 2 og 3). En cDNA-klon med et innskudd større enn 1100 nukleotider for pPC 15.0 er ikke blitt observert etter sortering av mer enn 40.000 cDNA-kloner.

Isoleringen av de genomiske DNA-fragmenter svarende til hver av disse cDNA-kloner, ble oppnådd ved først å skjære ut og elektroeluere fra agarosegeler Pichia pastoris DNA-fragmenter av restriksjonsendonuklease-behandlet kromosomalt DNA som hybridiserte med <32>P-merket pPC 15.0, pPC 8.0 eller pPC 6.4. Deretter ble de eluerte genomiske DNA-fragmenter klonet inn i Escherichia coli og de riktige genomiske kloner identifisert ved sortering en rekke ganger med hver av de ovenfor angitte dDNA-prober.

Sammenhengen mellom hver cDNA-klon og dens tilsvarende genomiske klon er vist på fig. 1, 2 og 3. pPC 15.0 er kodet for

inne i et 6000-nukleotid Hindlll genomisk fragment som foreligger i klon pPG 6.0 (fig. 1). 5'-enden av genet kodet for ved pPC 15.0 er orientert mot fragmentet Hindlll-EcoRI på 1300 bp som innehol-

des i pPG 6.0, mens 3'-enden av genet ligger i nærheten av Pstl-setene i pPG 6.0.

cDNA-klonen pPC 8.3 er innlemmet inne i den genomiske klon pPG 4.0 (fig. 2). pPG 4.0 inneholder en innføyelse på 4000 nukleotider av EcoRI-PvuII av tilstøtende genomisk DNA. Orienteringen av pPC 8.3 innenfor pPG 4.0 plasserer 5'-enden av genet for denne cDNA-klon nær BamHI-setene, mens 3'-enden av dette gen er anordnet nær PvuII-setet. Orienteringen av pPC 8.0 (en beslektet cDNA-klon) innenfor pPG 4.0 plasserer 5'-enden av denne cDNA-kMon nær Kpnl-setet ved 3'-enden av pPG 4.0, og 3'-enden av cDNA-klonen er anordnet nær PvuII-setet.

cDNA-klon pPC 6.0 er anordnet helt og holdent innenfor et genomisk fragment EcoRI-BamHI på 4800 nukleotider (fig. 3). Klon pPC 6.4 er i sin tur anordnet helt og holdent innenfor cDNA-klonen pPC 6.7. Da pPC 6.7 var en mer fullstendig kopi enn pPC 6.4, ble den sistnevnte ikke undersøkt videre. 5'-enden av genet er anordnet nærmere BamHI-enden enn EcoRI-enden av den genomiske klon pPG 4.8 (fig. 3).

I alle de ovenfor beskrevne genomiske kloner er der minst 1,2 kilobasepar av flankerende genomisk DNA-sekvens som er 5' overfor de strukturelle gener kopiert i hver av cDNA-klonene.

Hver av de genomiske kloner og cDNA-kloner beskrevet ovenfor er blitt deponert i the Northern Regional Research Center of the United States of America, Peoria, Illinois, for å sikre adgang for offentligheten ved utstedelse av denne søknad som patent. Alle kloner er blitt deponert i E. coli-verter:

Alle de ovenfor angitte organismer er blitt ugjenkallelig deponert og gjort tilgjengelige for offentligheten fra og med 31. august 1984.

Entyd~ ighet av pPG 6. 0. pPG 4. 0 og pPG 4. 8 overfor metanolassimilerende gjærsorter

Hver av de ovenfor beskrevne cDNA-kloner er blitt merket og anvendt som prober av kromosomal-DNA-sekvenser fra en rekke metanolassimilerende gjærsorter og en metanol-ikkeassimilerende-gjærsort. Homologe gener for alle tre cDNA ble funnet å eksistere i stort sett alle metanolassimilerende gjærsorter, men var klart ikke tilstede i metanol-ikke-assimilerende gjær (S. cerevisiae). Det antas således at disse gener er unike for metanolassimilerende -gjær. Dessuten viser Southern hybridiseringseksperimenter beskrevet i detalj i eksempel XVII at en høy grad av homologitet eksisterer mellom disse unike på metanol reagerende gener fra forskjellige metanolassimilerende gjærsorter.

Karakterisering av RNA- transkripsjoner av pPG 6. 0, pPG 4. 0 og pPG 4. 8 gener.

Innvirkningen av metanol på ekspresjonen av hver av disse klonede gener kan observeres ved undersøkelse av virkningene på transkripsjon av disse gener. Isolert poly-A+ RNA fra Pichia pastoris-celler dyrket med etanol eller metanol som eneste karbonkilde ble brukt til fremstilling av Northern-hybridise-ringsfiltere (se eksempel IV). Tre identiske par filtere fra metanol- og etanoldyrkede celler (se eksempel I) ble probet separat med <32->merket pPC 15.0, pPC 8.0 og pPC 6.4. Klonene pPC 15.0, pPC 8.0 og pPC 6.4 hybridiserte til RNA-molekyler (på henholdsvis ca. 2400, 2300 og 1300' nukleotider) fra metanoldyrkede celler. Ingen hybridisering av kloner pPC 15.0 og pPC 8.0 med hybridiseringssondene ble observert med RNA oppnådd fra celler dyrket i nærvær av etanol. Når RNA isolert fra celler dyrket på etanol ble sondert med pPC 6.4, hybridiserte imidlertid klonen til en 1300-nukleotid RNA-molekyl identisk med den som ble observert med metanoldyrkede celler på et nivå som ble anslått (kvalitativt) til å være fem ganger så lavt.

Størrelsebestemmelse av proteinprodukter kodet for med pPG 6. 0, pPG 4. 0 og pPG 4. 8

For å bestemme hvilke proteinprodukter som var kodet for ved hver av de ovenfor identifiserte cDNA-kloner, ble poly-A+ RNA fra Pichia pastoris-celler dyrket på metanol hybridisert selektivt til hver av cDNA-klonene. Det hybrid-selekterte mRNA, dvs. mRNA som hybridiserte til hver av cDNA-klonene, ble deretter translatert in vitro, og hver av proteinproduktene oppløst ved elektroforese ved bruk av SDS-denaturerende betingelser (se eksempel V). Resultatene av disse in vitro positive hybridise-ringstranslasjons-eksperimenter viste at kloner pPC 15.0, pPC 8.3 og pPC 6.7 velger mRNA-molekyler som koder informasjon for polypeptider på henholdsvis 76.000 (p76), 72.000 (p72) og 40.000 (p40) dalton. Disse samme proteiner observeres når det samlede poly-A+ RNA (dvs. ikke-hybridselekter) fra metanoldyrkede Pichia pastoris-celler translateres i det samme in vitro-system.

Identifisering av p72 som alkoholoksidase

A. Molekylvektsammenligning

En prøve som var meget høyt anriket for alkoholoksidase-protein ble fremstilt ved dialyse av klarede celle-lysater mot H20 (se eksempel VII). Den krystallinske bunnfelling som ble oppnådd som et resultat av denne dialyse ble vist ved SDS-elektroforese å inneholde hovedsakelig to polypeptider på 76 000 resp. 72 000 dalton. Bunnfellingen ble underkastet ytterligere rensing ved kromatografi gjennom Sephacryl 200 (se eksempel VII) som viste at alkoholoksidase-aktivitet svarte til aktiviteten av det rensede 72 000-dalton polypeptid. Størrelsen av dette polypeptid var identisk med størrelsen av proteinproduktet valgt av cDNA-klonen pPC 8.3 (se eksempel X).

B. Immunoutfelling

Ytterligere understøttelse for at kloner pPC 8.3 og pPG 4.0 koder for alkoholoksidase strukturelt gen ble oppnådd ved en immunologisk metode (eksempel XI). Proteinpreparatet isolert fra Pichia pastoris inneholdende både 76 000-dalton og 72 000-dalton polypeptidene ble brukt til å frembringe spesielle antisera for disse polypeptider i kaniner. Når det hybridselekterte poly-A+ RNA fra klon pPC 8.3 ble translatert in vitro, ble bare 72 000-dalton-translasjonsproduktet utfelt ved det antisera som ble fremstilt mot proteinpreparatet fra Pichia pastoris-celler.

C. Sammenligning mellom forutsagt og faktisk aminosyresekvens

For ytterligere å verifisere at klon pPC 8.3 i virkelighe-ten er den cDNA-klon som koder for Pichia pastoris alkoholoksidase, ble aminosyresekvensen for aminoterminalenden av proteinet sammenlignet med den forutsagte aminosyresekvens kodet for ved pPC 8.3. Således ble den NH2-terminale aminosyresekvens (sekvens

A) av det isolerte 72 OOO-dalton-protein funnet å være (eksempel

VIII) :

Sekvens A

I parallell med dette ble nukleotidsekvensen av 5'-enden av det gen som kodes for i pPC 8.3 og pPG 4.0 bestemt. Den forutsagte aminosyresekvens for aminosyrer 2-19 (se sekvens B) avledet fra DNA-sekvensen av både de genomiske og cDNA-klonene var helt i overensstemmelse med de første 18 aminosyrer av den ovenfor bestemte aminosyresekvens (sekvens A) for isolert Pichia pastoris alkoholoksidase:

Sekvens B

I tillegg til dette ble hele nukleotidsekvensen for det kodende område av alkolholoksidasegen bestemt. Nukleotidsekvensen ble bestemt, og den forutsagte aminosyresekvens er angitt i sekvens B'og antas å være:

Sekvens B'

En sammenligning av de ovenfor angitte nukleotidsekvenser med den publiserte (Ledeboer et al.) nukleotidsekvens for det tidligere beskrevne alkoholoksidase fra Hansenula polymorpha viser en rekke viktige forskjeller innbefattet den forutsagte aminosyresekvens, den virkelige størrelse av genet (og det resulterende protein), kodonbrukbias og lignende.

Identifisering av p76 som dihydroksyacetonsyntase

Nukleotidsekvensen for de første 51 nukleotider av p76-genet ble bestemt ved standardteknikker. Fra denne sekvens kan aminosyresekvensen for aminoterminalenden av p76-proteinet forutsies:

Denne forutsagte aminosyresekvens for p7 6 kan sammenlignes med den publiserte aminosyresekvens for di-hydroksyacetonsyntase (DHAS)-protein fra Hansenula polymorpha (Manowicz et al.). Skjønt flere forskjeller i sekvensene er tydlige, er der likhetspunkter mellom de to proteiner som kan skjelnes:

Basert på den betydelige grad av homologi og den lignende proteinstørrelse (ca. 76 000 dalton) av Pichia p76 og Hansenula DHAS, er p76 foreløpig identifisert som DHAS fra Pichia.

Som ovenfor med alkoholoksidasegenet, antyder en sammenligning mellom nukleotidsekvensen for de første 51 nukleotider av Pichia DHAS-proteinet og den tidligere publiserte (Janowicz et al.) nukleotidsekvens av Hansenula DHAS en rekke forskjeller i kodonbrukbias, den forutsagte aminosyresekvens, den totale størrelse av genet, etc.

DNA- fragmenter inneholdende regulerbare promotorer fra Pichia pastoris

De 5' regulerende områder av oppfinnelsen er angitt i detalj i restriksjonskartene vist på fig. 4, 5 og 6. Det 5' regulerende område som styrer ekspresjonen av polypeptid p76 er anordnet innenfor DNA-fragmentet vist på fig. 4a. Det tilnærmet 2,9 kilobase store HindIII-XhoI-fragmentet er tydelig vist å inneholde den regulerende funksjon som angitt nærmere nedenunder.

Da cDNA-klonen pPC 15.0 ikke er en fullkopi cDNA, er det mest sannsynlig at i det minste et parti av det DNA-fragment som er vist på fig. 4a inkluderer strukturelle kodesekvenser for polypeptid p76. Således antas det at den regulerende funksjon ligger i HindIII-EcoRI-fragmentet på ca. 1300 basepar vist på fig. 4b. Et nytt 3-galaktosidase-gen inneholdende konstruerte materialer (constructs) som skal beskrives i nærmere detalj nedenfor, støtter denne antagelse.

Det 5' regulerende område som styrer ekspresjonen av polypeptid p72 (alkoholoksidase) er anordnet innenfor det ca. 2000 basepar EcoRI-BamHI DNA-fragment vist på fig. 5. Nye konstruerte materialer inneholdende 3-galaktosidase nærmere angitt nedenfor viser den regulerbare beskaffenhet av dette DNA-fragment . Fig. 6 viser et restriksjonskart for det ca. 3 kilobasepar store BamHI-Sall DNA-fragment som inkluderer det 5' regulerende område som styrer produksjonen av polypeptid p4 0. Dette fragment kan klart skjelnes fra de 5' regulerende områder vist i detalj på fig. 4 og 5 og basert, blant annet, på de forskjellige restrik-sjonseter anordnet innen DNA-fragmentet. Fig. 10, 2a og 11 viser restriksjonsenzymdata for de regulerende områder pluss strukturelle gener for henholdsvis polypeptidene p76, p72 (alkoholoksidase) og p40. Følgelig viser fig. 10 detaljer for det 3.8 kilobasepar store Hindlll-Pstl-fragment av Pichia pastoris genomisk DNA som styrer og koder for produksjonen av polypeptid p76. Fig. 2a angår det 4.0 kilobasepar store EcoRI-PvuII-fragment av Pichia pastoris genomisk DNA som styrer og koder for produksjonen av polypeptid p7 2 (alkoholoksidase) . Fig. 11 viser 3.7 kilobaseparet BamHI-EcoRV-fragmentet av Pichia pastoris genomisk DNA som styrer og koder for produksjonen

av polypeptid p40.

De genomiske kloner pPG 6.0, pPG 4.0 og pPG 4.8 er også blitt karakterisert ved restriksjonskartlegging. Således er klonen pPG 6.0 vist i detalj på fig. la. Som et referansepunkt er 5'-enden av DNA-fragmentet ansett som origo. Klonen pPG 6.0 er et HindIII-fragment av Pichia pastoris kromosomalt DNA som er ca. 6 kilobasepar i lengde og kløyves som følger av forskjellige

restriksjonsenzymer:

Klon pPG 4.0 er vist i detalj pa fig. 2a. Klonen er et EcoRI-HindIII-fragment av kromosomalt DNA som er ca. 4 kilobasepar i lengde. Under henvisning til 5'-enden av klonen som origo ble de følgende restriksjonsdata oppnådd for pPG 4.0:

Klon pPG 4.8 er vist i detalj på fig. 3a. Klonen er et 4.8 kilobasepar BamHI-EcoRI-fragment av Pichia pastoris kromosomalt DNA med følgende ytterligere restriksjonssteder:

De genomiske kloner pPG 6.0, pPG 4.0 og pPG 4.8 ble manipulert ved innføyelse inn i unike restriksjonsseter på E. coli-plasmidet pBR322. Klon pPG 6.0, som er et HindIII-fragment, ble passende klonet inn i Hindlll-setet av pBR322. Klon pPG 4.0 ble klonet inn i EcoRI-PvuII-setene av pBR322, og klon pPG 4.0 ble klonet inn i EcoRI-BamHI-setene av pBR 322. (Se eksempel VI). E, coli-stammer transformert med disse plasmider er blitt deponert i Northern Regional Research Center, Peoria, Illinois for å sikre fri adgang for offentligheten ved utstedelse av en patent for denne søknad. De deponerte stammer er blitt gitt de følgende aksesjonsnummer:

Fig. 7, 8 og 9 gir restriksjonskartdata for de 3' regulerende områder av henholdsvis polypeptidene p76, p72 (alkoholoksidase) og p40. De 3' regulerende områder er nyttige i regulering av polyadenyleringen, avslutningen av transkripsjonen og avslutningen av translasjonen av messenger-RNA som er kodet for ved foregående nukleotidsekvenser. Således er det 3' regulerende område fra polypeptid p76-genet, et 2,7 kilobasepar EcoRI-HindIII-fragment vist på fig. 7, nyttig for regulering av polyadenyleringen såvel som avslutningen av transkripsjonen og avslutningen av translasjonen av mRNA-molekylet som koder for polypeptid p76, eller et hvilket som helst annet mRNA avledet fra et gen innføyet på oversiden av det 3' regulerende område. Det 0,2 kilobasepar store StuI-PvuII-fragment fra p72-genet vist i detalj på fig. 8a, det 0,3 kilobasepar store Stul-Hindlll-fragment fra p72-genet vist i detalj på fig. 8b, det 3,2 kilobasepar store Sall-EcoRI-fragment fra p72-genet vist i detalj på fig. 8c, og det 1,9 kilobasepar store PvuII-EcoRI-fragment fra p40-genet vist i detalj på fig. 9 har lignende nytte, både med hensyn til de strukturelle gener med hvilke de er assosiert i villtype Pichia pastoris, og hvilke som helst fremmede (dvs. heterologe) gener som kan være innføyet på oversiden av disse 3' regulerende områder.

Da alkoholoksidasegenet i pPG 4.0 slutter innen noen få hundre basepar fra AO-genets transkripsjonsavslutningssted, ble den ytterligere 3'-frekvens vist i detalj på fig. 8c oppnådd som følger. Det første trinn var å fordøye Pichia kromosomalt DNA med EcoRI og Sali og hybridisere det fordøyede DNA med et 2,0 kbp <32>P-merket BamHI-Hindlll-fragment fra AO-genet ved Southern-blotmetode. Blant de Pichia EcoRI-Sall-fordøyelsesfragmenter som hybridiserte med AO-genproben var et 3.2 kbp-fragment som koder for 3'-partiet av AO-genet og sekvenser som flankerer 3'-endestykket av genet.

Det 3' AO-genfragment ble deretter klonet ved utvinning av EcoRl-Sall-skårede Pichia-DNA-fragmenter på ca. 3.2 kbp ved geleluering og innsetting av fragmentene i EcoRI- og Sall-fordøyet pBR322. Tilslutt ble et rekombinant plasmid pPG 3.2 som inneholder 3' AO-genfragmentet identifisert ved kolonihybri-disering ved anvendelse av det merkede AO-genfragment som probe. En E. coli-stamme transformert med plasmid pPG 3.2 er blitt deponert hos Northern Regional Research Center, Peoria, Illinois, for å sikre fri adgang for offentligheten ved utstedelse av et patent for denne søknad. Den deponerte stamme er blitt tildelt aksesjonsnummer NRRL B-15999. Fig. 8c viser et restriksjonsendonuklease-kløyvingsstedkart av Pichia-DNA-fragmentet fra pPG 3.2. Fragmentet inneholder ca. 1.5 kbp som koder for 3'-partiet av AO (fra Sali til Hindlll) og ca. 1.7 kbp av sekvensen 3' av AO-genet.

Karakterisering av cDNA- kloner

cDNA-klonene for de regulerbare gener fra Pichia pastoris

er også blitt karakterisert ved restriksjonskartlegging. På fig. 12 er p76 cDNA, et 1.1 kilobasepar-fragment vist i detalj. Under henvisning til 5'-enden av DNA-sekvensen som origo, kløyver restriksjonsenzymet Xhol p76 cDNA ca. 500 basepar fra origo HincII kløyver ca. 950 basepar fra origo og EcoRI kløyver p76 cDNA ca. 1050-1100 basepar fra origo. cDNA-klonen vist på fig. 12, samt cDNA-klonene vist på fig. 13 og 14 er alle vist med Pstl-avslutninger. Disse er kunstig skapte restriksjonsseter produsert ved GC-haledannelse av det opprinnelig oppnådde komplementære DNA for å lette kloning av DNA-fragmentene inn i pBR322. Basert på Northern-hybridiseringsundersøkelser og størrelsen av polypeptidproduktet, er det anslått at cDNA-klonen pPC 15.0 er en ufullstendig kopi av p76 mRNA og representerer bare ca. halvparten av den samlede messenger-RNA-sekvens.

På fig. 13 er et kompositt-restriksjonskart for p72 (alkoholoksidase)-cDNA konstruert ved overlapping av kloner pPC 8.3 og pPC 8.0. Som angitt ovenfor er 5'-enden av DNA-sekvensen betegnet som origo. Således gir behandling av alkoholoksidase-cDNA med en rekke restriksjonsenzymer de følgende størrelsesfrag-menter :

Restriksjonsenzymkartlegging av 3'-enden av alkoholoksidase-genet i klonen pPC 8.0 og pPC 8.3 viste at cDNA-klonen pPC 8.3 mangler ca. 2 50 nukleotider av alkoholoksidase-mRNA-sekvensen (fig. 2). De sekvenser som foreligger ved 3'-enden av alkoholoksidase mRNA foreligger i cDNA-klonen pPC 8.0 som overlapper pPC 8.3 med ca. 500 nukleotider.

Fig. 14 viser et restriksjonskart for cDNA av polypeptid p40, et 1,2 kilobasepar-fragment. Under henvisning til 5'-enden av cDNA-klonen som origo, kløyves klonen pPC 6.7 med Sali (og HincII) ca. 1000 baser fra origo.

Hver av cDNA-fragmentene er blitt klonet inn i pBR322 som deretter transformeres inn i E. coli. De transformerte stammer er blitt deponert hos Northern Regional Research Center i Peoria, Illinois, for å sikre fri adgang for offentligheten ved utstedelse av den foreliggende søknad som patent. De deponerte stammer er blitt gitt de følgende aksesjonsnummer:

Hver av de ovenfor beskrevne cDNA-kloner er nyttige som prober for identifisering og isolering av kromosomalt DNA som koder for produksjonen av polypeptider som er unike for veksten av gjær på metanol som en karbon- og energikilde. Følgelig ble, som allerede beskrevet, disse kloner anvendt til å identifisere P. pastoris kromosomale DNA-fragmenter inneholdende de regulerende områder og strukturelle kodingsinformasjon for de unike polypeptider som observeres når P. pastoris dyrkes på metanol. På lignende måte har disse cDNA-kloner nytte som sonder for identi-fiseringen og isoleringen av analoge gener fra andre metanolassimilerende gjærsorter, som f.eks. Torulopsis molischiana, Hansenula capsulatum, H. nonfermantens og lignende (se eksempel XVII).

Detaljert analyse av alkoholoksidase- qenet

Det 5' regulerende område av klon pPG 4.0 ble ytterligere karakterisert ved bestemmelse av nukleotidsekvensen av klonen på oversiden (5') av det punkt hvor den strukturelle informasjon for p72 (alkoholoksidase) er kodet. De første 250 nukleotider før stedet hvor mRNA-translasjonen starter (ATG-kodon) antas å være:

Sekvens C

Promotorfunksjonen av klon pPG 4.0 antas å inneholdes inne i

denne sekvens av nukleotidbasér.

For å beskrive mer fullstendig dette nye DNA-fragment, er ytterligere 301 nukleotider lengre oppe i sekvensen vist i detalj i sekvens C ovenfor, blitt bestemt. Således antas det at de første 551 nukleotider før stedet hvor mRNA-translasjon starter er:

Sekvens D

De ytterligere nukleotider som inneholdes i sekvens D (sammenlignet med sekvens C) antas å meddele, ved en ukjent mekanisme, ytterligere regulerende funksjoner til promotorområdet inneholdt i sekvens C. Det skal forstås at sekvens D representerer bare partiell DNA-sekvensering for 1.1 kbp DNA-fragmentet vist i eksempel XIV og XV for å kunne regulere genekspresjon i gjær. Det kan være at ytterligere reguleringsfunksjoner er kodet for i det parti av l.l kbp DNA-fragmentet som ikke er vist i detalj i sekvens D.

For ytterligere å beskrive dette nye 1.1 kbp DNA-fragment, ble ytterligere nukleotidsekvensering utført for fullt ut å avgrense nukleotidsekvensen av hele 1.1 kbp DNA-fragmentet vist i eksempel XIV og XV for å kunne styre genekspresjon i gjær. Nukleotidsekvensen er angitt som sekvens D':

Sekvens D'

Det vil forstås av fagfolk at ytterligere styringsfunksjoner relativ til sekvens C og D kan kodes for i det parti av sekvens D' som ligger høyere oppe (dvs. i 5'-retningen) av nukleotidsekvensen vist i detalj i sekvens C og D.

For å bestemme hvor RNA-transkripsjonen for alkoholoksidase-genet initieres, ble DNA-sekvensene rundt 5'-enden av dette gen fra den genomiske klon pPG 4.0 og cDNA-klonen pPC 8.3 sammenlignet. cDNA-klonen pPC 8.3 inneholder ca. 100 nukleotider av en utranslatert region 5' i forhold til alkoholoksidase-genet. Basert på denne sekvens ble et oligonukleotid på 15 baser (5'-CTTCTCAAGTTGTCG-3'); komplimentært med hensyn til nukleotider -29 til -43, hvor A av translasjonstartsetet (ATG-kodon) er angitt som +1 og G i 5'-retningen er angitt som -1, syntetisert (se eksempel IX) og brukt som et initieringsmiddel (primer) for å strekke seg langs alkoholoksidase-mRNA for å nå 5'-enden. Sekvensen av cDNA som ble oppnådd fra dette initierings-forlengelseseksperiment avslørte tre forskjellige transkripsjonene initieringspunkter for Pichia pastoris alkoholoksidase-mRNA. Hovedtranskripsjonen begynner 114 nukleotider fra translasjons-initieringskodonet. To mindre alternative transkripsjoner begynner 117 og 111 nukleotider på oversiden (5') fra alkoholoksidase-AUG-kodonet.

De 55 nukleotider som går foran for starten av alkoholoksidase-mRNA inneholder en formodet Goldberg-Hogness boks (TATAA-boks). Sekvensen TATAAA finner sted ved stillingen -40 fra 5'-enden av det dominerende transkript for alkoholoksidase-mRNA og derfor- 165 nukleotider ovenfor initieringskodonet for dette protein.

Det 3' regulerende område av alkoholoksidase-genet ble ytterligere karakterisert ved bestemmelse av nukleotidsekvensen for ca. 12 0 nukleotider på nedsiden av det punkt hvor den strukturelle informasjon for p72 (alkoholoksidase) er kodet. Sekvensen er angitt nedenunder som sekvens D'':

Sekvens D''.

Detaljert analyse av p76- qenet

Det 5' regulerende område av klonen pPG 6.0 ble også videre karakterisert ved bestemmelse av nukleotidsekvensen av klonen på oversiden (5') av det punkt hvor den strukturelle informasjon for p7 6 er kodet. De første 622 nukleotider før mRNA-translasjbn-startstedet (ATG-kodon) antas å være:

Sekvens D'''

Promotorfunksjonen av klone pPG 6.0 antas å inneholdes inne i denne sekvens av nukleotidbaser, skjønt fagfolk vil innse at ytterligere regulerende egenskaper kan meddeles ved sekvenser lengre oppe enn de sekvenser som er vist som sekvens D'''.

Det 3' regulerende område av klon pPG 6.0 ble ytterligere karakterisert ved bestemmelse av nukleotidsekvensen for ca. 180 nukleotider på nedsiden (3') av det punkt hvor den p76 strukturelle informasjon er kodet for. Sekvensen er angitt nedenunder som sekvens D'''' :

Sekvens D''''

Ekspresjon i transformert gjær

De ovenfor beskrevne plasmider ifølge oppfinnelsen er nyttige i gjærstammer som kan transformeres. Regulering av genekspresjon i gjær ved de nye DNA-fragmenter ifølge oppfinnelsen kan oppnås ved at de transformerte organismer underkastes karbonkildehunger. Karbonkildehunger etter dyrking på en rekke katabolittundertrykkende, så vel som på ikke-katabolittundertrykkende karbonkilder, induserer ekspresjon av genproduktet som holdes under styring av de regulerende områder ifølge oppfinnelsen. En annen måte å oppnå ekspresjon av det ønskede genprodukt i egnede arter av transformert gjær på, er å dyrke transformerte gjærsorter på metanol. Ytterligere en måte til å indusere ekspresjon av det ønskede genprodukt er å dyrke transformert gjær på medier inneholdende ikke-katabolittundertrykkende karbonkilder .

Regulerende områder er nyttige for ekspresjon i alle gjærstammer, da de regulerende områder er blitt vist å induseres under en rekke forskjellige betingelser. Således kan gjærsorter som kan vokse på metanol eller på ikke-katabolittundertrykkende karbonkilder, bringes til å produsere fremmede, dvs, heterologe polypeptider direkte, mens gjærsorter som kan vokse på katabolittundertrykkende karbonkilder kan bringes til å produsere fremmede polypeptider ved at gjærcellene som er dyrket på denne måten underkastes betingelser av karbondkildehunger.

Transformerte gjærstammer som kan benyttes i fremgangsmåten, omfatter medlemmer av slekten:

Candida,

Kloeckera,

Saccharomyces,

Schizosaccharomyces,

Rhodotorula,

Hansenula,

Torulopsis,

Pichia, og

Kluyveromyces.

Gjærsorter fra disse slekter foretrekkes fordi deres sikkerhet ved håndtering, vekstbetingelser og lignende er blitt etablert, og er godt kjent blant fagfolk.

Gjærstammer til bruk i fremgangsmåten vil være de gjærsorter som er istand til å vokse på metanol som karbon- og energikilde. Gjærsorter som er kjent for å være istand til å vokse på metanol omfatter medlemmer av slektene:

Candida,

Kloeckera,

Saccharomyces,

Rhodotorula,

Hansenula,

Torulopsis, og

Pichia.

Da de regulerende områder ifølge oppfinnelsen også induseres ved vekst på ikke-katabolittundertrykkende karbonkilder, samt betingelser av karbonkildehunger, er gjærsorter som kan dyrkes på slike ikke-metanolske substrater, så som:

glukose,

acetat,

glycerol,

etanol,

laktose,

galaktose,

fruktose,

sukrose,

nyttige i utførelsen av fremgangsmåten. Ved å dyrke vertsorganismen på en egnet ikke-katabolittundertrykkende ikke-metanolsk karbonkilde, som f.eks. glycerol og galaktose, eller ved å dyrke vertsmekanismen på en egnet katabolitt-undertrykkende karbonkilde som f.eks. etanol, glukose og fruktose,og deretter underkaste vertsorganismen til betingelser av karbonkildehunger, kan ekspresjon av et genprodukt under styring av de regulerende områder oppnås.

Dessuten, fordi regulerende områder reagerer på en rekke forskjellige vekstbetingelser, både med hensyn til induksjon og undertrykkelse av ekspresjon, kan den regulerte ekspresjon av et genprodukt under styring av de regulerende områder oppnås. Således kan f.eks. celler dyrkes på en karbonkilde som induserer bare lave nivåer av fremmedgenekspresjon og deretter byttes om til metanol som sterkt induserer genekspresjon. Alternativ kan regulert genekspresjon oppnås ved anvendelse av blandinger av induserende/undertrykkende matningsmaterialer, som f.eks. metanol/glukose-blandinger. Som nok et alternativ kan høye ekspresjonsnivåer frembrakt ved dyrking på metanol reduseres etter ønske ved at man setter til dyrkningsmedia en undertrykkende karbonkilde, som f.eks. glukose eller etanol. Fagfolk vil selvsagt være underforstått med at andre variasjoner av matningsblandinger og andre rekkefølger for innføring av matningsmateriale er mulige, og at dette gir stor kontroll over nivået av genekspresjon som fås fra de regulerende områder ifølge oppfinnelsen.

En foretrukket vertsgjærstamme er mutanten Pichia pastoris GS115, som er en mutant som mangler evnen til å produsere histidin, og således er blitt betegnes som å ha mutantgenotypen his4. GS115 fås fra Pichia pastoris NRRL Y-11430, og er blitt deponert i Northern Regional Research Center hos De Forente Staters landbruksdepartement i Peoria, Illinois for å sikre fri adgang av verten til offentligheten ved utstedelse av denne søknad som patent. Pichia pastoris GS115 er blitt gitt aksesjons-nummeret NRRL Y-15851 fra og med den 31. august 1984. Denne spesielle vert er nyttig fordi det er en auxotrof mutant som mangler histidinveien. Transformasjon av denne vert med en vektor som inneholder, blant andre DNA-sekvenser, HIS4-genfunksjonen, tillater lett utvelgelse for transformert vert.

De regulerende områder er også vist å være nyttige for den regulerte ekspresjon av heterologe genprodukter i gjærstammer av slekten Saccharomyces, for hvilke et stort antall auxotrofe mutanter er kjent. Ytterligere vertsgjærstammer kan omfatte ATCC 24683 (en trpl, adel, his2, leul, gall, ural mutant), ATCC 24684 (en trpl, adel, his7, gall, ural mutant), ATCC 32810 (en trp5, arg4, his5, lysi, ade2, gal2 mutant), ATCC 34182 (en ade3, his, lys, ura mutant), ATCC 34352 (en ural mutant), ATCC 34353 (en ura2 mutant), ATCC 38523 (en argl, thrl mutant), ATCC 38626 (en leu2, his4 mutant), ATCC 38660 (en his4, leu2, thr4 mutant), ATCC 42243 (en ura3 mutant), ATCC 42336 (en adel, his4, thr4 mutant), ATCC 42403 (en arg4, lys7 mutant), ATCC 42404 (en adel, his4, leu2 mutant), ATCC 42564 (en ural, his6 mutant), ATCC 42596 (en his4, leu2, lysi mutant), ATCC 42957 (en his4, leu2, thr4, trp5 mutant), ATCC 42950 (en ade mutant), ATCC 42951 (en ade, leu mutant), ATCC 44069 (en ural mutant), ATCC 44070 (en leu2, his4 mutant), ATCC 44222 (en his4 mutant), ATCC 44376 (en his4, ade2 mutant), ATCC 44377 (en his4, leul mutant), og lignende, som er lett tilgjengelig for fagfolk.

Det vil forstås av fagfolk at nyttige vertsstammer ikke er begrenset til auxotrofe mutanter. Således skaffer transformasjon av prototrofe stammer med positive utvelgelsesmarkører, som f.eks. antibiotiske resistensgener, også en nyttig måte til oppdagelse og isolering av transformerte stammer.

Escherichia coli kan også være en egnet vert for plasmidene. Fagfolk vet at mange stammer av E. coli er egnede verter. Flere stammer som anvendes i det foreliggende arbeid er angitt nedenunder:

Pichia pastoris transformasionsfremganqsmåte

Transformasjonen av Pichia pastoris er ikke blitt beskrevet tidligere. De eksperimentelle fremgangsmåter for transformasjon av Pichia pastoris er vist i nærmere detalj nedenunder (eksempel XII) . For å utvikle et transformasjonssystem for P. pastoris ble den auxotrofe mutant GS115 (NRRL Y-15851) isolert og funnet å være defekt med hensyn til histidinveien, da stammen ikke har noen påviselig histidinoldehydrogenase-aktivitet.

GS115 (NRRL Y-15851) kan transformeres ved enzymatisk fordøyelse av celleveggene for å gi sfæroplaster; sfæroplastene blir så blandet med det transformerende DNA og inkubert i nærvær av kalsiumioner og polyetenglykol, deretter regenerert i selektivt dyrkningsmedium som mangler histidin. Det transformerende DNA innbefatter HIS4-genet, i hvilket vertsstammen er mangelfull, og således overlever bare transformerte celler på det selektive dyrkningsmedium som anvendes.

Isolering av Pichia pastoris HIS4- gen

HIS4-genet ble isolert fra stammen P. pastoris NRRL Y-11430 ved delvis digestion av det samlede kromosomale DNA med Sau3A fulgt av sentrifugering gjennom sukrosegradienter (se eksempel XIII) . Fragmenter på 5 til 20 kbp ble klonet inn i BamHI-kløy-vingsstedet av S. cerevisiae/E. coli-skyttelvektor YEpl3 (ATCC 37115, fig. 33) og transformert inn i E. coli. Ca. 50.000 kolonier ble kombinert og det samlede plasmid-DNA ekstrahert. Sfæroplaster av S. cerevisiae-stamme 5799-4D (NRRL Y-15859), en his4ABC-mutant, ble blandet med ca. 1 jug av YEpl3 Pichia DNA-biblioteket ved fremgangsmåten ifølge Hinnen et al (1978) og tillatt å regenerere i et medium som manglet histidin. Transformasjonen resulterte i ca. 1 x 10<3> prototrofe gjærkolonier fra en populasjon av 5 x IO<7> samlede regenererbare sfæroplaster. En parallell sammenligningsprøve inkubert uten DNA produserte ingen kolonier. Samlet gjær-DNA ble ekstrahert fra 20 av His+-koloniene og transformert tilbake inn i E. coli. Sytten av gjær-DNA-preparatene produserte ampicillinresistente kolonier. Disse klonede fragmenter ble videre karakterisert ved

størrelsebestemmelse og kartlegging av restriksjonsenzym samt ved deres evne til å krysshybridisere med et merket S. cerevisiae

HIS4-fragment ved lav stringens (post-hybridiseringsvasker i 2 x SSC ved 55°) ved fremgangsmåten beskrevet i eksempel XIII, §G. De HIS4-inneholdende plasmider inneholdt hver ett eller flere fragmenter som hybridiserte til S. cerevisiae HIS4-genet. Et slikt HIS4-inneholdende plasmid ble reklonet for å gi HIS4-inneholdende plasmid betegnet som pYJ8 og er vist på fig. 25. Plasmid pYJ8 inneholder pBR325-sekvenser, innbefattet kloramfenikol- og ampicillinresistente gener, samt Pichia HIS4-genet.

ARG4-genet ble isolert fra P. pastoris NRRL Y-11430 ved anvendelse av en analog protokoll og ARG- S. cerevisiae-stammen S2072A (en arg4 leu2 trpl gal2, som ble skaffet fra the Yeast Genetic Stock Center, Berkely, CA.).

Fagfolk vil innse at andre markeringsgener fra Pichia på samme måte kan isoleres ved anvendelse av de riktige mangelfulle S. cerevisiae-stammer.

Isolering av Pichia pastoris autonome replikasionssekvenser

En annen nyttig komponent av vektorene ifølge oppfinnelsen er Pichia-avledede autonome replikasjonssekvenser (PARS) som fremmer både transformasjonshyppigheten av GS115 (NRRL Y-15851) og bibeholdelsen av plasmid som et stabilt ekstrakromosomalt element.

For å søke etter Pichia ARS-er, ble DNA fra Pichia pastoris GS115 (NRRL Y-15851) delvis fordøyet med Taql og 5-10 kbp-fragmenter ble isolert og klonet inn i det unike Clal-sete av pYJ8 Cia. (Se fig. 26). Plasmid-DNA ble utvunnet fra ca. 10.000 His+ Pichia-kolonier og brukt til å transformere E. coli. Plasmider fra ca. 10.000 ampicillin-resistente kolonier ble isolert og deretter transformert tilbake inn i GS115. Førti av His+-gjærkoloniene fra denne underarkiv-transformasjon ble hver for seg strøket.ut (streaked) på selektiv medium og dyrket i separate kulturer i selektivt medium. Det samlede gjær-DNA ble ekstrahert fra hver av disse førti kulturer og transformert inn i E. coli. To plasmider, pYA63 (PARS1) og pYA90 (PARS2), hvis gjær-DNA-preparater ga de mest ampicillin-resistente E. coli-kolonier, ble valgt for videre analyse. Begge disse plasmider transformerte Pichia pastoris GS115 (NRRL Y-15851) med meget høy frekvens, og

hver inneholdt en innføyelse av fremmed DNA.

Som et mål på evnen av ARS-er til å opprettholde plasmider som autonome elementer i Pichia, ble kulturer av gjærceller som var blitt transformert med hvert plasmid dyrket i selektivt medium og prøver ble tatt fra tid til annen. Tilstanden av plasmidsekvensene i cellene ble bestemt ved Southern hybridisering av ikke-begrensede gjær-DNA-molekyler til radioaktivt merket pBR3 25. Plasmider pYA63 og pYA90 ble opprettholdt i Pichia i minst 10 generasjoner i det selektive medium (men var blitt integrert etter 50 generasjoner).

En av de mulige Pichia autonome replikasjonssekvenser (PARS 1") ble klonet inn i flere andre Pichia-vektorer for å undersøke dens evne til å opprettholde transformasjons-DNA som et autonomt element. Plasmider pYJ30 (fig. 27) og pBPfl (fig. 34) forelå fremdeles som autonome elementer etter 2 0 generasjoners vekst på selektive media (His<->) og forelå i multikopier pr. celle. Southern blotanalyse av celler transformert med pYJ30 indikerer ca. 10 kopier pr. celle.

For å bestemme hvorvidt plasmider pSA0H5 (se fig. 18) og pT7 6H4 (se fig. 22b) som inneholder PARS1 som er fremskaffet ved henholdsvis pYJ3 0 og pBPfl oppviser lignende stabilitet overfor plasmidene fra hvilke de ble avledet, ble celler inneholdende disse vektorer dyrket under selektive betingelser i ca. 50 generasjoner under selektive betingelser (His-) i nærvær av glukose. Cellene ble deretter byttet over til ikke-selektive betingelser (His<+>) og tapet av prototrofi ble målt. Stabiliteten av disse plasmider var sammenlignbar med stabiliteten av pYJ30, innbefattet det hurtige tap av His prototrofi ved ombytte til ikke-selektive media. Således antas det at eksperimenter utført med plasmider inneholdende den autonome replikasjonssekvens PARS1 skaffer resultater av genekspresjon fra autonomt plasmid DNA.

Nytt p- qalaktosidase- gen inneholdende konstruerte materialer

For å vise evnen til de regulerende områder med hensyn til å regulere produksjonen av proteinprodukter, ble nye konstruerte materialer av DNA fremstilt. Således ble E. coli lacZ-genet plassert i flere plasmider under styring av de regulerende områder av gener som koder for polypeptid p72 (alkoholoksidase) eller p76. Fremstillingen av plasmider pSAOHl, pSAOH5, pSAOHIO, pTAFH.85, pT76Hl, pT76H2, pT76H3 og pT76H4 er beskrevet i eksempel XIV.

Skjønt innføringen av det regulerende område/e-galaktosidase genfusjoner ifølge oppfinnelsen inn i vertsgjærceller er beskrevet her idet der anvendes plasmider som bæreren for innføring, vil fagfolk forstå at det ikke er nødvendig for det regulerende område/strukturelt-gen-konstruerte-materiale å innføres i cellen via et plasmid. Følgelig kan et hvilket som helst molekyl som er istand til å opprettholdes i gjæren anvendes. Derfor kan det konstruerte materiale av regulerende område/- strukturelt gen ifølge oppfinnelsen manipuleres via vektorer andre enn plasmider. Alternativt kan det konstruerte materiale av regulerende område/strukturelt gen integreres inn i kromosomet av vertsgjærcellen.

Fagfolk vil også innse at omfanget av den foreliggende oppfinnelse ikke er begrenset til produksjonen av 3-galaktosidase under styringen av de regulerende områder som her er beskrevet. De mange forskjellige polypeptider som kan produseres under styringen av regulerende områder, er begrenset bare av leserens oppfinnsomhet. Mange fremgangsmåter finnes for fremstillingen av DNA-sekvensene som koder for ønskede polypeptider. F.eks. kan oligonukleotider av forskjellig lengder syntetiseres ved kjente fremgangsmåter. Flere slike oligonukleotider kan settes sammen, som følge av deres spesielle baseparende egenskaper, til lengre dobbelttrådede molekyler. Komponenten oligonukleotider av dette dobbelttrådede molekyl kan ligeres av enzymet DNA-ligase. Alternativt kan DNA-molekyler med den ønskede kodingssekvens syntetiseres ved bruk av enzymet revers-transkriptase under anvendelse av messenger-RNA relatert til det ønskede polypeptid som en templat for virkningen av revers-transkriptase. Nok en annen mulighet er kloningen av genomiske DNA-fragmenter og observasjon av hvorvidt direkte ekspresjon av det ønskede produkt finner sted.

DNA-sekvensen som koder for det ønskede polypeptid kan modifiseres for fremstilling av det konstruerte materiale av regulerende område/strukturelt gen ved en rekke forskjellige fremgangsmåter. F.eks. kan endene av det DNA som er fremstilt som beskrevet ovenfor, ligatiseres med enzymet DNA-ligase til korte, dobbelttrådede DNA-molekyler som inneholder nukleotidsekvensen som gjenkjennes av spesielle restriksjonsendonukleaser, såkalte koblingsmolekyler (linker molecules). Fordøyelse av disse molekyler med et spesielt restriksjons-endonuklease etter ligering, vil generere endepunkter svarende til det spesielle restriksjons-endonuklease-gjenkjennelsessete ved endene av den fremstilte DNA-sekvens.

Tre spesielle konstruerte genmaterialer av regulerende område/3-galaktosidase fremstilt i løpet av dette arbeid, er beskrevet ved restriksjonskartdata vist på fig. 15 og 16. Restriksjonskartet vist på fig. 15a beskriver et konstruert materiale som omfatter en 0.85 kilobasepar-porsjon Hindlll-BamHI som fås fra 5' regulerende område av pPG 6.0 og lacZ-genet fra E. coli (-det 3.6 kilobasepar fragment BamHI-NruI som er vist). Dette samme konstruerte materiale eller stykke (construct) foreligger i hvert av plasmidene pTAFH.85, pT76Hl og pT7 6H2 som skal beskrives nærmere nedenunder. (Se eksempel XIV). Restriksjonskartet vist på fig. 15b beskriver et stykke omfattende en porsjon på 1.3 kilobasepar Hindlll-EcoRI som fås fra det 5' regulerende område av pPG 6.0 og lacZ-genet fra E. coli. Dette samme stykke foreligger i hvert av plasmidene pT76Ul, pT76H3 og pT6H4 som skal beskrives nærmere nedenunder (se eksempel XIV).

Fig. 16 er et restriksjonskart av et stykke omfattende et fragment på 1.1 kilobasepar av EcoRI-BamHI som fås fra en porsjon av det 5' regulerende område av pPG4.0 og lacZ-genet fra E. coli. Dette stykke foreligger i hvert av plasmidene pSAOHl, pSAOH5 og pSAOHIO, som skal beskrives nærmere nedenunder (se eksempel XIV).

Plasmidet pSAOHl er vist skjematisk på fig. 17. Foruten å inneholde genfusjonen av regulerende område/3-galaktosidase vist i detalj på fig. 16, er plasmidet vist å inneholde: (a) pBR322-sekvenser innbefattet Amp<R->genet; (b) Pichia pastoris HIS4-gen;

(c) S. cerevisiae 2 ji-sirkel DNA; og

(d) det avbrutte URA3-gen fra S. cerevisiae.

Plasmidet har derfor evnen til å gjennomgå transformasjon og replikasjon i E. coli-verter og gjærverter. Utvelgbare markører foreligger for manipulering av DNA i enten E. coli-eller gjærverter.

Plasmid pSA0H5 er vist skjematisk på fig. 18. Plasmidet ligner pSAOHl beskrevet ovenfor, men med den unntagelse at S. cerevisiae 2/z-sirkel DNA og noe av Pichia pastoris HIS4-genet som flankerer DNA er blitt sløyfet, mens en Pichia pastoris autonom replikasjonssekvens (PARS1 fra pYA63) er blitt tilføyet.

Plasmid pSAOHIO er vist skjematisk på fig. 19. Plasmidet inneholder: (a) genfusjon av regulerende område/3-galaktosidase; (b) pBR325-sekvenser, innbefattet gener som meddeler tetracyclinresistens, kloramfenikolresistens og ampicillinresis-tens (henholdsvis tet<R>, cam<R> og amp<R>); og (c) S. cerevisiae HIS4-gen (som fås fra plasmid pYA2 som beskrevet nedenunder).

Plasmider pTAFH.85, pT7 6Hl og pT7 6H2 er analoge med de tre ovenfor beskrevne plasmider, med den unntagelse at genfusjonen av regulerende område/3-galaktosidase som ble anvendt, var den som er beskrevet på fig. 15a (istendenfor den fusjon som er beskrevet på fig. 16) .

Plasmider pT76H3 og pT76H4 er analoge med henholdsvis pSAOHl og pSA0H5, bortsett fra at genfusjonen av det regulerende område/3-galaktosidase som ble anvendt var den som er beskrevet på fig. 15b (istedenfor den fusjon som er beskrevet på fig. 16).

Plasmid pTAFH.85 er vist skjematisk på fig. 20 og omfatter: (a) genfusjonen av det regulerende område/3-galaktosidase vist på fig. 15a; (b) pBR322-sekvenser, innbefattet amp<R->genet; (c) Pichia pastoris HIS4-gen;

(d) S. cerevisiae 2/z-sirkel DNA; og

(e) det avbrutte URA3-gen fra S. cerevisiae.

Plasmid pT76Hl er vist skjematisk på fig. 21 og omfatter: (a) genfusjonen av det regulerende område/3-galaktosidase yist på fig. 15a;

(b) pBR322-sekvenser innbefattet amp<R->genet; og

(c) Pichia pastoris HIS4-gen og autonom replikasjonssekvens (PARS1).

Plasmid pT76H2 er vist skjematisk på fig. 22 og omfatter: (a) genfusjonen av det regulerende område/3-galaktosidase vist på fig. 15a; (b) pBR325-sekvenser innbefattet gener som meddeler tetracyclinresistens» klorampenikolresistens og ampicillinresi-stens; og

(c) S. cerevisiae HIS4-gen.

Plasmid pT76H3 er vist skjematisk på fig. 22a og omfatter: (a) genfusjonen av det regulerende område/3-galaktosidase vist på fig. 15b; (b) pBR322-sekvenser innbefattet amp<R->genet; (c) P. pastoris HIS4-gen;

(d) S. cerevisiae 2/i-sirkel DNA; og

(e) det avbrutte URA3-gen fra S. cerevisiae.

Plasmid pT76H4 er vist skjematisk på fig. 22b og omfatter: (a) genfusjonen av det regulerende område/3-galaktosidase vist på fig. 15b; (b) pBR322-sekvenser innbefattet amp<R->genet;

-(c) Pichia pastoris HIS4-gen; og

(d) Pichia pastoris autonom replikasjonssekvens (PARS1).

Ekspresjon av 3- galaktosidase i gjær

Pichia pastoris GS115 (NRRL Y-15851) ble transformert med de nye 3-galaktosidase gen-inneholdende konstruerte materialer som beskrevet ovenfor. Flere av de resulterende transformerte gjærstammer er blitt deponert hos Northern Regional Research Center i De forente Staters Landbruksdepartement, og er gitt deponeringsaksesjonsnummer som følger:

De nye 3-galaktosidase genholdige stykker ble også brukt til å transformere E. coli. Transformerte bakterielle stammer er også blitt deponert hos Northern Regional Research Center i Peoria, Illinois, for å sikre tilgjengelighet for offentligheten ved utstedelse av den foreliggende søknad som patent. De transformerte stammer er blitt gitt de følgende aksjesjonsnummer:

Pichia pastoris GS115 (NRRL Y-15851) transformert med hver av de første åtte plasmider beskrevet ovenfor som inneholder alkoholoksidasen, og genfusjoner av p76 regulerende område/lacZ ifølge oppfinnelsen, ble dyrket til stasjonær fase på mininalt mediuirT supplert med biotin pluss glukose som karbonkilde. Straks cellene nådde den stasjonære fase ble de flyttet til minimalt medium supplert med biotin pluss metanol som karbonkilde. Etter at cellene hadde vokst i ca. 3-5 generasjoner ved 30°C ble de flyttet til nytt minimalt medium supplert med biotin og dyrket på glukose eller metanol som karbonkilde. Ved bestemte tider ble dyrkningsprøver tatt ut og analysert for nærvær av 3-galaktosidase og alkoholoksidase ved fremgangsmåter beskrevet i detalj i eksempel VII og XV.

Det ble funnet at celler dyrket på glukose som karbonkilde ikke produserte noen påviselige mengder av 3-galaktosidase eller alkoholoksidase, mens celler dyrket på metanol som den eneste karbonkilde uttrykte betydelige mengder av både alkoholoksidase og 3-galaktosidase. Det ble også funnet at de celler som var dyrket på glukose, når de ble utsatt for betingelser av karbonkildehunger, også uttrykte målbare mengder av alkoholoksidase samt 3-galaktosidase. Det er således klart at de regulerende områder ifølge oppfinnelsen reagerer både på nærværet av metanol, samt betingelser av karbonkildehunger.

Som bekreftelse på at de regulerende områder reagerer på dyrkning på ikke-katabolittundertrykkende karbonkilder, samt betingelser av karbonkildehunger, ble et plasmid inneholdende det alkoholoksidase-regulerende område, pTA0l3; og et plasmid inneholdende det p7 6-regulerende område, pT76Ul, brukt til å transformere en ikke-metanolbenyttende stamme av gjær, Saccharomyces cerevisiae. En av de transformerte stammer som ble anvendt, med laboratoriebetegnelsen SEY2102-pTAO13 er blitt deponert hos the Northern Regional Research Center i Peoria, Illinois, for å sikre adgang for offentligheten ved utstedelse av en patent for denne søknad. Den transformerte stamme er blitt gitt aksesjonsnummer NRRL Y-15858. Saccharomyces cerevisiae NRRL Y-15858 og SEY2102-pT76Ul ble dyrket på glukose, fruktose, etanol, glycerol og galaktose i ca. 5 generasjoner, og deretter underkastet betingelser av karbonkildehunger. Den vanlige analyse for 3-galaktosidase (se eksempel XV) etter 5 generasjoner viste at glycerol- og galaktosedyrkede celler produserte store mengder 3-galaktosidase, mens glukose- og fruktosedyrkede celler produserte stort sett ikke noe 3-galaktosidase. Når 3-galaktosidase ble målt etter 6 timer under karbonkildehunger, ble produksjonen av moderate mengder 3-galaktosidase ved de transformerte organismer dyrket på glukose og fruktose samt betydelige mengder 3-galaktosidase produsert av glycerol- og galaktosedyrkede celler observert. Således er de regulerende områder istand til å styre produksjonen av proteinprodukter i genetisk meget forskjellige gjærverter, og er ikke begrenset til anvendelse i metanolbrukende stammer.

EKSEMPLER

Bufrene og oppløsningene som anvendes i de følgende eksempler har de sammensetninger som er angitt nedenunder:

Med mindre noe annet er angitt, representerer de ovenfor viste

oppløsninger de grunnleggende (lx) konsentrasjoner som anvendes. I eksemplene hvor forskjellige konsentrasjonsnivåer anvendes, er dette angitt ved at det henvises til oppløsningen som et multip-pel av den grunnleggende (lx) konsentrasjon.

De følgende forkortelser er brukt i eksemplene med den følgende mening:

Forskjellige fremgangsmåter utført på en rutinemessig basis følger en standardprotokoll som skal angis i nærmere detalj. Sentrifugering utføres i en periode og med en spinnhastighet tilstrekkelig til å skaffe en klar ovenpåflytende væske. Generelt utføres sentrifugering av gjærceller ved minst 1500 g i minst 5 minutter.

Nukleinsyreekstraksjoner med fenol/kloroform/isoamylalkohol omfatter å bringe den nukleinsyreholdige oppløsning i berøring med et like stort volum av en blanding av fenol, kloroform og isoamylalkohol, hvor volumforholdet mellom disse er henholdsvis 50:48:2. Ekstraksjoner med'kloroform/isoamylalkohol innbefatter å bringe oppløsningen som skal behandles i berøring med et like stort volum av en blanding av kloroform og isoamylalkohol med et volumforhold på henholdsvis 48:2.

Når geler, filtre etc. beskrives som vasket eller bløtet i en spesiell oppløsning, ble hele gelen, filteret eller lignende neddykket i et passende kar (skål, bolle, liten flaske eller ampulle etc.) for å bringe hele overflaten av gelen, filteret eller lignende i berøring med den aktuelle oppløsning.

Etanolutfelling av nukleinsyrer omfatter først justering av saltinnholdet av den nukleinsyreholdige oppløsning, og deretter å bringe oppløsningen i berøring med to volumer av kald etanol.

EKSEMPEL I

Dyrking og fremstilling av gjærceller

Pichia pastoris NRRL Y-11430 ble dyrket under karbonbegren-sede betingelser i kontinuerlig kultur ved 3 0°C med enten metanol eller etanol som den eneste karbonkilde i IMl-salter minimalt medium som beskrevet av Wegner i US PS 4.414.329. IMl-minimumsme-dia inneholder pr. liter media 36 mM KH2P04, 23 mM (NH4)2S04, 2 mM MgS04, 6,7 mK KC1, 0,7 mM CaCl2, 0,2 piM CuS04-5H20, 1,25 mM Kl, 4,5 mM MnS04, 2 fiK Na2Mo04, 0,75 MM H3BO3, 17,5 mM ZnS04, 44,5 jLtM FeCl2 og 1,6 /jM biotin. Cellene som ble dyrket på metanol ble dyrket opp til en celletetthet på 140 g/l (tørr vekt) med en oppholdstid på ca. 12 timer. Cellene dyrket på etanol ble dyrket opp til en celletetthet på 90 g/l med en oppholdstid på ca. 11,5 timer. Når metanol eller etanol ble matet inn i fermenterings-apparatet, ble matningsmaterialer inneholdende konsentrasjoner på henholdsvis 2 0% og 4 5% alkohol anvendt.

Ti gram av fermenteringsapparat-dyrkede Pichia pastoris-celler ble samlet opp ved sentrifugering og resuspendert ved ca. IO<8> celler/ml i 0,1 M Tris (pH 8,0) inneholdende 1% 2-merkaptoetanol. Disse celler ble inkubert i 5-10 minutter ved 37°C og samlet opp ved sentrifugering. Pelleten ble vasket en gang med 3 0 ml S-buffer og resuspendert i 5 ml S-buffer pr. g celler. Zymolyase ble satt til cellesuspensjonen for å gi en endelig konsentrasjon på 500 /jg/ml. Cellene ble inkubert ved 37°C i 20 minutter og deretter sentrifugert, ovenpåflytende væske ble dumpet og cellepelleten samlet opp. Denne pellet ble frosset i flytende nitrogen og lagret ved -70°C for senere bruk.

EKSEMPEL II

Isolering av gjær- RNA

Samlet celle-RNA ble fremstilt ved pulverisering av den frossede pellet fremstilt som beskrevet i eksempel I med en morter og støter, og den frossede pellet ble ytterligere oppbrutt i 2-5 minutter i en Waring-blandemaskin i nærvær av flytende nitrogen. Den pulveriserte pellet ble satt til PK-buffer ved en konsentrasjon på 7,5 ml pr. gram celler. Proteinase K ble satt til den resuspenderte pellet for å gi en endelig konsentrasjon på 4 00 /ug/ml, og suspensjonen ble inkubert ved værelsestemperatur i

10 minutter. Denne blanding ble ekstrahert med

fenol/kloroform/isoamylalkohol fulgt av- en kloroform/- isoamylalkohol-ekstraksjon. Nukleinsyrer ble utfelt ved justering av oppløsningen, slik at den ble 0,25M NaCl og tilsetning av etanol. Pelleten ble resuspendert. i et minimumvolum av ETS-buffer, dvs. det volum av buffer som var tilstrekkelig til å løse opp nukleinsyrene; generelt fra ca. 100 ug inntil ca. 1 mg DNA pr. ml oppløsning. Denne oppløsning ble re-ekstrahert med fenol/kloroform/isoamylalkohol, deretter med kloroform/isoamylalkohol, og tilslutt utfelt med etanol.

Nukleinsyrene ble reoppløst i et minimumsvolum av TE-buffer. Det RNA som forelå i denne oppløsning ble anriket enten ved sentrifugering gjennom en 4 ml CsCl-pute (1 g CsCl/ml, 1 mM EDTA i 10 mM Tris-buffer (pH 7,4)), eller ved utfelling idet oppløsningen ble gjort 2 M LiCl, opprettholdelse ved 4-8°C over natten og oppsamling ved sentrifugering. Poly A+ RNA ble valgt ut fra oppløsningen ved affinitetskromatografi på oligo(dT)-cellu-losekolonner. Generelt ble 0,25 mg oligo(dT)-cellulose type 3 (Collaborative Research) fremstilt for kromatografi pr. 5-10 mg samlet RNA. 0,25 g oligo(dT)-cellulose ble oppslemmet i 2 ml ETS-buffer og helt opp i en liten silisert glasskolonne. Denne oligo(dT)-cellulosekolonne ble vasket ved at der ble lagt et lag på 10 ml av 0,1 M NaOH over oligo(dT)-cellulosen, og vaskeoppløs-ningen ble tillatt å strømme gjennom oligo(dT)-cellulosematrisen. Oligo(dT)-cellulosen ble deretter vasket på samme måte med 10 ml

ETS-b-uffer og vasket tilslutt med 10 ml 0,5 M NETS-buffer.

Det samlede RNA (5-10 mg) ble resuspendert i ETS-buffer ved konsentrasjon ikke større enn ca. 10 mg/ml, plassert i et vannbad på 65°C i 2 minutter og deretter øyeblikkelig plassert på is. RNA-oppløsningen ble deretter tillatt å varmes opp til værelsestemperatur, og en utgangsoppløsning av 5 M NaCl ble tilsatt for å gi en endelig saltkonsentrasjon i RNA-oppløsningen på 0,5 M NaCl. Den resulterende RNA-oppløsning ble lagt som et lag oppå den fremstilte oligo(dT)-cellulosekolonne og tillatt å langsomt strømme gjennom kolonnen med en hastighet på ca. 1 dråpe pr. 5 sekunder. Det material som strømmet ut av kolonnebunnen ble samlet opp i et rør og lagt pånytt som et lag oppå toppen av kolonnen. Det material som ble samlet opp fra kolonnebunnen ble lagt som et lag på toppen for annen gang, hvilket førte til at RNA-oppløsningen ble ført gjennom oligo(dT)-cellulosekolonnen alt i alt 3 ganger. Etter den siste passasje gjennom kolonnen ble materialet samlet opp og merket som poly A-, dvs. ikke-poly A RNA. Kolonnen ble deretter vasket med 3 0 ml 0,5 M NETS, og tilslutt ble poly A+ RNA eluert fra kolonnen ved at 5 ml ETS-buffer ble ladet på kolonnen og denne buffer ble tillatt å strømme langsomt gjennom, idet poly A+ RNA-fraksjonen ble samlet opp i den 5 ml fraksjon som strømmet fra bunnen av kolonnen. Under antagelse av at der ikke var noe NaCl i poly A+ RNA-fraksjonen, ble NaCl-konsentrasjonen av denne fraksjon justert til 0,25 M NaCl og RNA utfelt med etanol.

EKSEMPEL III

Konstruksjon av cDNA- bibliotek

Komplementære DNA-kloner (cDNA-kloner) ble syntetisert som følger. 10 jig poly A+ RNA fremstilt som beskrevet i eksempel II ble resuspendert i 7 jil H20 og bragt på en endelig konsentrasjon av 2,7 mM CH3HgOH, deretter inkubert ved værelsestemperatur i 5 minutter. Den første tråd av cDNA ble syntetisert ved 42°C i 15 minutter i 50 fil av en oppløsning inneholdende 50 mM Tris (pH

8,3) ved 42°C, 10 mM MgCl2, 30 mM 2-merkaptoetanol, 70 mM KCl,

500 juM av hver av dATP, dGTP og TTP, 200 /uM dCTP, 25/xg/ml oligo(dT), 60 ug/ ml actinomycin D, 25 enheter RNasin, 25 /liCi oc-<32>P dCTP (32,5 pmol) og 120 enheter av revers-transkriptase. Denne reaksjonsblanding ble inkubert ved 37°C i ytterligere 15

minutter. Reaksjonen ble avsluttet ved tilsetningen av 2 /il 0,5 M EDTA og 0,5 jul 2 0% SDS. Reaksjonen ble justert til 0,3 M NaOH og inkubert ved 65°C i 30 minutter. Reaksjonsblandingen ble deretter nøytralisert ved tilsetning av 10 /il IM Tris (pH 7,4) og justering av reaksjonsblandingen til 0,21 M HC1.

Reaksjonsblandingen ble ekstrahert med

fenol/kloroform/isoamylalkohol, deretter med kloroform/- isoamylalkohol og tilslutt kromatografert over en Sephadex G50-kolonne i TE-buffer. Det radioaktive enkelttrådede cDNA ble slått sammen"* til én fraksjon og konsentrert til 100 /il enten ved butanolekstraksjon eller inndampning ved sentrifugering under vakuum. Det enkelttrådede cDNA ble etanolutfelt fra den konsent-rerte oppløsning, cDNA ble samlet opp ved sentrifugering og resuspendert i 100 fil vann.

Den vandige oppløsning av enkelttrådet cDNA ble justert på 2,5 M ammoniumacetat, utfelt med etanol, samlet opp ved sentrifugering og resuspendert i 20 /il vann. Denne enkelttrådede DNA-oppløsning ble bragt på et endelig volum av 50 /il med 50 mM kaliumfosfatbuffer (pH 7,4) inneholdende 5 mM MgCl2, 1 mM 2-merkaptoetanol, 250 /iM av hver av dATP, dGTP og TTP, 125 fiM dCTP, 25/iCi-cx-<32>P-dCTP (32,5 pmol) og 8 enheter Klenow-fragment DNA Poll (New England Biolabs). Den resulterende reaksjonsblanding ble inkubert ved 3 7°C i en time for å syntetisere den komplementære andre DNA-tråd til til det enkelttrådede cDNA. Reaksjonen ble avsluttet ved tilsetning av 2 fil av 0,5 M EDTA. Det dobbelttrådede cDNA ble ekstrahert med fenol/kloroform/isoamylalkohol, deretter med kloroform/isoamylalkohol og kromatografert over en Sephadex G50-kolonne i TE-buffer. De dobbelttrådede cDNA-fraksjoner ble slått sammen, og det sammenslåtte materiale ble konsentrert og utfelt som beskrevet for det enkelttrådede cDNA.

Etter den endelige etanolutfelling og oppsamling av det dobbelttrådede cDNA ved sentrifugering, ble pelleten resuspendert i 20,25 ill vann, deretter bragt på et endelig volum av 50 lii med 50 mM Tris (pH 8,3 ved 42°C) inneholdende 10 mM MgCl2, 3 0 mM 2-merkaptoetanol, 70 mM KC1, 500 jiK av dXTP og 150 enheter av revers transkriptase. Den resulterende oppløsning ble inkubert ved 42°C i 15 minutter for å sikre fullførelse av syntesen av den andre tråd av cDNA. Reaksjonen ble avsluttet ved tilsetning av 2 lii 0,5 M EDTA og konsentrert og utfelt som beskrevet for reaks jo-

nen av det enkelttrådede cDNA.

Pelleten av dobbelttrådet cDNA ble resuspendert i 40 /il H20 og oppløsningen bragt på en endelig volum av 47 fj. 1 ved tilsetning av 5 /xl av en utgangsoppløsning inneholdende 2,8 M NaCl, 2 00 mM NaOAc og 45 mM ZnS04, og deretter justert på en pH-verdi av 4,5 ved 22°C med HC1. For å digestere hårnålsløkken, ble tre separate reaksjoner utført med tre forskjellige konsentrasjoner av S^-nuklease. Én enhet, 10 enheter eller 100 enheter S1-nuklease ble tilsatt for å bringe reaksjonsvolumet på 50 /ul, og reaksjonen ble inkubert ved 22°C i 3 0 minutter. Reaksjonen ble avsluttet ved tilsetningen av 2 /ul 0,5 M EDTA og 2,67 jul 2 M Tris-base. 6 /ug kaninlever-tRNA ble tilsatt som en bærer og reaksjonsblandingen ble konsentrert og utfelt som beskrevet ovenfor med den unntagelse at DNA-pelletene ble resuspendert i TE-buffer "snarere enn vann. Etter den endelige utfelling ble pelleten resuspendert i 20 /ul TE-buffer og bragt på et endelig volum av 50 jul i terminaltransferase-buffer (BRL) inneholdende 10 pmol av a-<32>P-dCTP, 2 juM dCTP og 21 enheter terminaltransferase (Ratcliff Biochem.). Den resulterende oppløsning ble inkubert ved 37°C i 30 minutter for å tilføye poly-d(C)-hale til den 3'-OH-ende av det dobbelttrådede cDNA. Reaksjonen ble avsluttet ved tilsetningen av 5 jul 0,5 M EDTA, ekstrahert, kromatograf ert og lagret som en etanolutfelling.

Det dobbelttrådede cDNA forsynt med d(C)-hale ble enten resammenføyd direkte til pBR322, forsynt med poly d(G)-hale, som var åpnet ved Pstl-setet, eller først størrelsesfraksjonert på en Sepharose CL4B-200-kolonne (25 jul fraksjoner) . For det ufraksjo-nerte arkiv ble 150 ng av dobbelttrådet poly-d(C)-haleforsynt cDNA føyet sammen i 180 /ul av 10 mM Tris (pH 7,4) som er 0,1 M i NaCl og 1 mM i EDTA med 900 ng av d(G)-haleforsynt pBR322 som var åpnet ved Pstl-setet. Hver 25 jul fraksjon av det fraksjonerte arkiv ble føyet sammen med 125 ng poly-d(G)-haleforsynt p-BR322 i et endelig volum på 50 /ul av den samme sammenføyningsblanding som er beskrevet ovenfor. Sammenføyingsreaksjonene ble inkubert ved 65°C i 3 minutter, deretter 42°C i 2 timer og ble tillatt å avkjøle langsomt til værelsestemperatur.

Biblioteket av sammenføyet cDNA ble transformert inn i kompetent E. coli LE392 (ATCC 33572) fremstilt som følger: Et inokulum av LE392 ble dyrket over natten ved 37°C i 2x LB-media.

5 /il av denne kultur som var blitt fremstilt over natten ble inokkulert i 200 /il nytt 2x LB-media og dyrket til en OD60o P a 0,2-0,3 ved 37°C. Denne kultur ble plassert på is i 10 minutter, og cellene ble deretter utvunnet ved sentrifugering ved 4°C. Cellepelleten ble resuspendert i 80 ml iskaldt 0,1 M CaCl2 og inkubert i 2 5 minutter ved 4°C. Cellene ble samlet opp ved sentrifugering ved 4°C, cellepelleten resuspendert i 2 ml iskaldt 0,1 M CaCl2 og inkubert i minst 2 timer ved 4°C før bruk. Deretter ble 2 00 /il kompetente celler pr. 50 /il

sammenføyingsblanding anvendt for transformasjonen. De kompetente celler og DNA ble kombinert og inkubert ved ca. 4°C i 10 minutter, fulgt av inkubering ved 37°C i 5 minutter og tilslutt plassert på is i 10 minutter. Et like stort volum av 2x LB-media ble satt til transformasjonsblandingen og inkubert ved 37°C i 45 minutter. De transformerte celler ble lagt på plater ved 250 /il/plate på 150 mm 2x LB-plater inneholdende 15 /ig/ml tetracyklin. Platene ble inkubert ved 37°C i 24 timer og lagret ved 4°C.

Kopifiltre (replica filters) ble fremstilt ved pressing av nitrocellulosefiltre oppå et opprinnelig filter brukt til å løfte koloniene bort fra platen. Disse kopifiltre ble inkubert på 2x LB-Tet-plater (15 /ig/ml tetracyklin) . Koloniene på filtrene ble preparert for undersøkelse med prober, idet filtrene ble overført til 2x LB-Tet-platene inneholdende 200 /ig/ml kloramfenikol, og filtrene ble inkubert ved 37°C i minst 12 timer, og deretter ble koloniene underkastet lysering, idet filterne ble tillatt å flyte på et vandig bad bestående av 1,5 M NaCl og 0,5 M NaOH i 10 minutter. Filtrene ble deretter nøytralisert ved at de fikk flyte på et vandig bad av 1,5 M NaCl og 0,5 M Tris (pH 7,4) i 15 minutter, og denne nøytralisasjon ble gjentatt. Filtrene ble deretter tørket i luft og tilslutt tørket under vakuum i 2 timer ved 70°C.

EKSEMPEL IV

Kolonihvbridisering

De vakuumtørkede nitrocellulosefiltre inneholdende cDNA-arkivet (fremstilt som beskrevet i det foregående eksempel) ble prehybridisert ved 42°C i 5 timer i prehybridiseringsbuffer. Filtrene ble fjernet fra prehybridiseringsbufferen og ganske lett gnidd med en behansket hånd i 5x SSPE for å fjerne celleavfall. Filtrene ble plassert i hydridiseringsbuffer (det samme som prehydridiseringsbuffer, bortsett fra lx Denhardts). Enten <32>p-merket enkelttrådet cDNA (IO<6> cpm/ml) eller ende-merket poly A+ RNA ble hybridisert til filtrene i 17 timer ved 42°C. Etter hybridisering ble filtrene vasket ganske kort i 2x SSPE ved 22°C fulgt av 2 ganger vasking ved 65°C i 0,lx SSPE, 10 minutter for hver.

Ende-merking av poly A+ mRNA ble utført ved tilsetning av

2 ug av poly A+ mRNA til et volum på 50 /il inneholdende 50 M Tris (pH 9,5), oppvarming til 100°C i 3 minutter og hurtig avkjøling på is. Denne RNA-oppløsning ble fortynnet til endelig volum på 200 /il og justert til 50 mM Tris (pH 9,5), 10 mM MgCl2, 5 mM DDT og 50 pmol av <32>P-a-ATP. 10 enheter av T4-polynukleotidkinase ble tilsatt og blandingen inkubert ved 37°C i en time. Kinasebehandlingen ble avsluttet ved tilsetting av 10 /il 0,5 M EDTA, ekstrahert med fenol/kloroform/isoamylalkohol og kromatografert gjennom Sephadex G50 for å fjerne den ikke-innlemmede radioaktive merkelapp.

EKSEMPEL V

Northern- hybridiseringer

2-5 /ig poly A+ mRNA ble varmet opp ved 6 5°C i 5 minutter i 10 mM natriumfosfatbuffer (pH 7,4) inneholdende 50% formamid, 2,2 M formaldehyd og 0,5 mM EDTA. Den resulterende oppløsning ble avkjølt til værelsestemperatur og en passende mengde (generelt ca. 0,2 volumer regnet på volumet av prøven som ble behandlet) av 5x prøvebuffer (0,5% SDS, 0,025% bromfenol blått, 25% glycerol, 25 mM EDTA) ble tilsatt. Prøvene ble ladet på en 1,5% agarosegel fremstilt i 10 mM natriumfosfatbuffer (pH 7,4) inneholdende 1,1 M formaldehyd, og underkastet elektroforese i den samme buffer. Gelen ble farget med acridinorange (33 /ig/ml) i 10 mM natriumfosfatbuffer (pH 7,4), avfarget ved neddykking av gelen i den samme buffer i 10 minutter, neddykket i 10x SSPE i minst 10 minutter, og RNA deretter overført til nitrocellulose som beskrevet i eksempel VI.

EKSEMPEL VI

Isolering av genomisk DNA og kloner

Pichia genomisk DNA ble isolert ved bruk av fremgangsmåten beskrevet i eksempel II for Pichia RNA-isolering. Pelleten av nukleinsyre ble resuspendert i et minimumvolum av TE-buffer og inkubert med 20 jLtg/ml RNase A i 30 minutter ved 37°C. Oppløsnin-gen ble bragt til 0,14 M NaCl og behandlet med proteinase K ved 200 /ig/ml i 15 minutter ved 22°C. Den resulterende oppløsning ble først ekstrahert med fenol/kloroform/isoamylalkohol og deretter med kloroform/isoamylalkohol og tilslutt utfelt med etanol. Det utfelte DNA ble resuspendert i et minimumsvolum av TE-buffer og sentrifugert for å klare DNA-oppløsningen.

JL0 /ig Pichia genomisk DNA fremstilt som beskrevet i det foregående avsnitt, ble fordøyd med forskjellige restriksjonsenzymer (BRL) og underkastet elektroforese på en 1% agarosegel inneholdende TAE. DNA-fragmentene i gelen ble denaturert ved at gelen ble blotet i 1,5 M NaCl, 0,5 M NaOH i 20 minutter. Gelen ble nøytralisert ved bløting i 1,5 M NaCl, 0,5 M Tris (pH 7,4) i 20 minutter. Før overføring ble gelen bløtet i 10x SSPE i minst 5 minutter. Et ark av nitrocellulose ble skåret til størrelsen av gelen, fuktet i vann og bløtet kort i 10x SSPE. Dette filter ble lagt på toppen av gelen som i sin tur var blitt plassert på et stykke parafilm. Et ark Whatman filterpapir og en stabel papir-håndklær ble plassert på toppen av nitrocellulosen for å trekke DNA ut av gelen og overføre den til nitrocellulosen. Et lodd ble plassert på bunken av papir for å lette overføringen. DNA ble tillatt å overføre på denne måte i minst 3 timer. Etter overfø-ringen ble filteret bløtet i 5x SSPE for en kort periode, deretter lufttørket og tørket under vakuum ved 7 0°C i 2 timer. Komplementære genomiske fragmenter ble identifisert ved hybridisering til nick-translaterte (nick-translated) cDNA-kloner pPC 8.0, pPC 6.4 og pPC 15.0 ved bruk av de samme prehybridiserings-, hybridiserings-, og vaskebuffere som beskrevet i eksempel IV.

200 ng av cDNA-klonene ble nick-translatert i 90 minutter ved 40°C i 30 /il av en oppløsning inneholdende 50 mM Tris-HCl (pH 7,4), 10 mM MgS04, 100 /aM DTT, 50 /ig/ml BSA, 20 /iM hver av dGTP, TTP og dATP, 31,25 pmol <32>P-a-dCTP (3200 Ci/mmol, NEN), 2 enheter E. coli-DNA Poll (BRL) og 0,02 ng DNasel. Reaksjonen ble avsluttet ved tilsetningen av 1 /il 0,5 M EDTA og 1 /il 2 0% SDS. Den merkede DNA-oppløsning ble bragt på en endelig konsentrasjon av 0,3 M NaOH og plassert i kokende vann i 3 minutter. Denne blanding ble kromatografert på en Sephadex G50-kolonne. De

merkede DNA-fraksjoner ble slått sammen, den spesifikke aktivitet bestemt, og sonden brukt i hybridiseringsforsøk.

Genomiske fragmenter som hybridiserte til cDNA-probene ble isolert ved fordøyelse av 200 /jg Pichia genomisk DNA med forskjellige restriksjonsenzymer (BRL) og elektroforese av det fordøyede materiale på en 1% agarosegel i TAE-buffer. Bånd av passende størrelse ble skåret fra agarosegelen, DNA ble elektroeluert, ført gjennom en Elutip-kolonne og etanolutfelt.

De elektroeluerte fragmenter ble resuspendert i vann og fragmenter på 200 ng ble ligert til 500 ng av pBR322 som var kløyvet ved det riktige restriksjonssetet og defosforylert når nødvendig. Ligasjonsreaksjonen ble utført i 300 /il 66mM Tris (pH 7,4) inneholdende 6,6 mM MgCl2, 10 mM DTT, 0,4 mM ATP, 25 /ig/ml BSA og 40-80 enheter av T4 DNA-ligase, deretter inkubert ved 4°C i 24 timer. Ligeringsblandingen ble transformert direkte inn i kompetente LE392 E. coli-celler. Cellene ble gjort kompetente, og transformasjonen utført som beskrevet i eksempel III. En serie på tre transformasjoner ble utført med 10, 40 og 100 ng av pBR322 (pluss innføyet materiale) , hver transformasjon i 100 /il kompetente celler. Cellene ble overført til plater som beskrevet i eksempel III, bortsett fra at den antibiotiske seleksjon var 50 /ig/ml ampicillin. Klonene ble overført til nitrocellulose, replikert og preparert for hybridisering som beskrevet i eksempel III. Filtrene ble undersøkt med prober med det riktige nick-translaterte cDNA-fragment. Utstrykningsrensede (streak-purified) kolonier som var positive i hybridiseringen ble brukt til å fremstille ytterligere plasmid som følger.

Den plasmidbærende LE392 E. coli ble dyrket til en OD60o på 1,0 i lx LB-media inneholdende 50 /ig/ml ampicillin og oppformert over natten ved tilsetningen av kloramfenikol til en endelig konsentrasjon på 200 /ig/ml. Cellene ble vasket i 0,8% NaCl, 20 mM Tris (pH 8,0), 20 mM EDTA, og deretter lysozymbehandlet i 25% sukrose, 50 mM Tris (pH 7,4) og 20 mM EDTA med 450 fig/ ml lysozym. Lysering ble oppnådd ved tilsetning av 5 M NaCl til en endelig konsentrasjon på 2,0 M fulgt av tilsetningen av et like stort volum av 0,2% Triton X-100 og 40 mM EDTA. Preparatet ble klaret ved spinning ved 20.000 omdr./min. i 45 minutter. Den ovenpåflytende væske ble deretter ekstrahert med fenol/kloroform/isoamylalkohol og deretter med kloroform/isoamylalkohol, og utfelt med EtOH. Pelleten ble resuspendert i TE-buffer, behandlet med RNase A, ekstrahert med fenol/kloroform/isoamylalkohol og kloroform/- isoamylalkohol. Fast CsCl ble tilsatt for å gi en endelig konsentrasjon på 800 /xg/ml pluss at EtBr ble tilsatt for å gi en endelig konsentrasjon på 1 mg/ml. Den resulterende oppløsning ble spunnet i en Vti-50-rotor ved 49.000 omdr./min. i 18-20 timer ved 20°C.

Plasmidbåndet ble gjort synlig ved UV-fluorescens og trukket opp fra røret ved bruk av en injeksjonssprøyte og sprøytespiss. Plasmidoppløsningen ble ekstrahert med n-butanol fire ganger, og utfelt med etanol ved -2 0°C. Etanolutfellingen ble gjentatt minst to ganger for å fjerne alt CsCl. Plasmidet ble lagret ved -2 0°C som en etanolutfelling.

EKSEMPEL VII

Rensing av alkoholoksidase

Proteinprøver fra Pichia pastoris-celler dyrket på metanol som beskrevet i eksempel I, ble fremstilt ved lysering av gjærceller fulgt av en klarende spinning for å fjerne celleavfall, som følger: En porsjon av utløpsstrømmen fra gjæringsappa-ratet ble fjernet og justert på pH 7,5 med ammonionhydroksid, og ble homogenisert på en Dyno-Mill modell KDL ved bruk av en 0,6 liters beholder i en kontinuerlig operasjon ved 30°C ved bruk av beltekombinasjon nr. 3 og en strøm på 20-30 ml/h. Kulene i møllen var av blyfritt glass med en diameter på 0,3-0,5 mm. Det resulterende homogenat ble sentrifugert ved 5°C og 20.000 Xg i 30 minutter for å gi en cellefri ovenpåflytende væske.

Seks 130 ml porsjoner av den cellefrie ovenpåflytende væske ble plassert i dialyseposer av celluloseacetat og dialysert ved 5°C mot ca. 8 1 destillert vann. Etter 4 dager ble den vandige fase i hver pose dekantert. Faststoffene som var tilbake i posene besto av to typer faststoff. Det tynne øvre, hvite lag ble forsiktig fjernet og kastet. Faststoffet på bunnen var brungult og var krystallinsk alkoholoksidase. En porsjon av den krystallinske alkoholoksidase ble oppløst i destillert vann (ca. 10 ganger volumet av faststoffet), og en analyse ved farge-peroksidase-metoden viste en aktivitet på 94 EU/ml. Den spesifikke aktivitet av alkoholoksidasen var 10,4 EU/mg protein.

Den krystallinske bunnfelling som ble oppnådd ved den ovenfor beskrevne dialyse ble dialysert mot 0,05 M kaliumfosfat-buf fer (pH 7,5) og anvendt på en 2x 200 cm Sepachryl 200 (Pharma-cia) -kolonne ekvilibrert med den samme buffer. Fraksjoner på 3,5 ml ble samlet opp ved en strømningshastighet på 10 ml/h og analysert for alkoholoksidaseaktivitet.

Alkoholoksidaseaktiviteten for reaksjonen med metanol ble bestemt ved den følgende analysemetode (farge-peroksidase-metode). En farge-buffer-blanding ble fremstilt ved blanding av 0,1 ml av en o-dianisidinoppløsning (1 vektprosent o-dianisidin i vann) -med 12 ml gjennomluftet 0,1 M natriumfosfat-buffer (pH 7,5). Analyseblandingen ble fremstilt med 2,5 ml av farge-buffer-blandingen, 50 /il metanol, 10 /il av en peroksidaseoppløsning (1 mg av pepperrot-peroksidase Sigma, type II) , og 2 5 /il av alkohol-oksidaseoppløsning. Analyseblandingen ble holdt på 25°C i en 4xlxl cm liten Kyvette, og økningen i absorbans av fargen ved 460 nm ble målt i 2-4 minutter. Enzymaktiviteten ble beregnet som følger

aktivitet (/imol/min/ml eller enzymenheter/ml) = min x H/5

hvor 11,5 er en faktor basert på en standardkurve fremstilt med kjente porsjoner av E2°2 ol3 A er forandringen i absorbans under eksperimentperioden.

En samlet mengde på 0,1 /xg samlet protein fra hver fraksjon ble også analysert for alkoholoksidaseinnhold ved gel-elektroforese med SDS-polyacrylamid (12%).

EKSEMPEL VIII

DNA- oa proteinsekvenser

Bestemmelse av DNA-sekvenser ble utført ved dideoksy-kjedeforlengelsemetoden ved bruk av bakteriofag M13 (Sanger et al, 198 0) eller ved den kjemiske modifikasjonsmetode (Maxam og Gilbert, 1980). DNA-fragmentene svarende til 5'-enden av alkoholoksidasegenet ble innsatt i M13mp8- og M13mp9-vektorene eller ende-merket for den kjemiske modifikasjonsmetode ved bruk av restriksjonsenzymseter tilgjengelige i dette område.

HindIII/SalI-fragmentet på 710bp fra pPG 4.0 ble ende-merket for Maxam-Gilbert-sekvensering ved at 3 3 jug av plasmidet først ble fordøyet med Hindlll. Reaksjonsblandingen ble ekstrahert "med fenol/kloroform/isoamylalkohol, kloroform/isoamylalkohol og utfelt med etanol. DNA ble samlet opp ved sentrifugering pg resuspendert i 31 /il vann. 100 /iCi av <32>P-oc-dCTP (3200 Ci/mmol) og 2 enheter Klenow-fragment DNA Poll ble satt til reaksjonsblandingen for å gi et endelig volum på 50 /il inneholdende 400 /iM dATP, 400 /iM dGTP, 50 mM Tris (pH 7,4), 10 mM MgS04, og 1 mM DTT. Reaksjonsblandingen ble inkubert ved 37°C i 1 time og stoppet ved tilsetning av 2 /il 0,5 M EDTA. Blandingen ble deretter ekstrahert med fenol/kloroform/isoamylalkohol, ekstrahert med kloroform/isoamylalkohol, kromatografert på en Sephadex G50-kolonne og de merkede nukleinsyrefraksjoner slått sammen og etanolutfelt. Etter sentrifugering ble DNA-pelleten resuspendert i vann og digestert med Sali. Det fordøyede produkt ble underkastet elektroforese på en 1% agarosegel i TAE-buffer, og 710 bp-båndet ble skåret fra gelen, DNA ble elektroeluert, butanolekstrahert og etanolutfelt. Fragmentet ble resuspendert i 100 /il TE-buffer, justert til 2,5 M ammoniumacetat og deretter etanolutfelt. Det resulterende DNA-fragment ble resuspendert i TE-buffer ved en konsentrasjon på 50.000 cpm//il.

De fire basemodifikasjonsreaksjoner ble utført som følger: (a) G-reaksjonen (guanin) ble inkubert i 8 minutter ved 22°C og inneholdt 1 /il (50.000 cpm) av det merkede DNA-fragment, 4 /il vann, 200 /il 50 mM natriumkakodylat, pH 8,0, l mM EDTA (DMS-buffer) og 1 /il dimethylsulfat. Reaksjonen ble avsluttet ved tilsetningen av 50 /il DMS-stoppbuf f er inneholdende 1,5 M natriumacetat (pH 7,0), IM 2-merkaptoetanol og 100 /ig/ml tRNA, deretter ble etanol (750 /il) tilsatt og reaksjonsblandingen ble holdt på -70°C i minst 15 minutter, (b) G/A (guanin/adenin)-reaksjonen ble inkubert i 10 minutter ved 22°C og inneholdt 2 /il (100.000 cpm) av det merkede DNA-fragment, 8 /il vann og 3 0 /il maursyre. Reaksjonen ble avsluttet ved tilsetningen av 200 /il Hz-stoppbuf-fer (0,3 M natriumacetat, pH 5,5, 0,1 M EDTA og 25 /ig/ml tRNA), deretter ble etanol (750 /il) tilsatt, og reaksjonsblandingen holdt på -70°C i minst 15 minutter, (c) T/C (tymin/cytosin)-reaksjonen ble inkubert i 10 minutter ved 2 2°C og inneholdt 2 /il (100.0 00 cpm) av det merkede DNA-fragment, 18 /il vann og 3 0 /il hydrazin. Reaksjonen ble avsluttet som beskrevet i (b) ovenfor, (d) C (cytosin)-reaksjonen ble inkubert i 10 minutter ved 22°C og inneholdt 1 /il (50.000 cpm) av det merkede DNA-fragment, 4 /il vann, 15 fil 5 M NaCl, og 30 jul hydrazin. Reaksjonen ble avsluttet som beskrevet i (b) ovenfor.

DNA-pelletene ble samlet opp ved sentrifugering, resuspendert i 250 jul 0,3 M-natriumacetat, pH 5,5, og etanolutf elt med 750 jul 95% etanol. Pelletene ble samlet opp ved sentrif ugering, tørket under vakuum i 5 minutter og DNA ble kløyvet ved at pelletene ble resuspendert i 100 jul av en 1:10 (v/v) fortynning av piperidin. Kløyvingsreaksjonen ble inkubert ved 9 0°C i 3 0 minutter og avsluttet ved tilsetningen av 500 jul 98% etanol, 60 mM natriumacetat (pH 5,5) og 10 jug/ml tRNA. Reaksjonsblandingen ble plassert i et bad av tørris/etanol (ca. -70°C) i ca. 5 minutter og DNA-fragmentene ble slått sammen ved sentrifugering. Fragmentene ble resuspendert i 50 jul 0,3 M natriumacetat (pH 5,5), og deretter etanolutf elt med 100 /ul 95% etanol. Denne etanolutfelling ble gjentatt, pelletene ble vasket med 95% etanol og fordampet under vakuum i løpet av sentrifugeringen. Pelleten ble resuspendert i 10 /ul 80% formamid, 10 mM NaOH, 1 mM EDTA, 0,1% xylencyanol og 0,1% bromfenol blått. 2-3 jul ble underkastet elektroforese på en 10% 0,4 mm tykk polyakrylamidgel i TBE-buffer.

Aminosyresekvensen av alkoholoksidase ble bestemt ved Sequemat, Inc. (Watertown, Mass.) ved anvendelse av 2 mg renset alkoholoksidase fra Pichia pastoris. De første 18 aminosyrer av det modne protein ble funnet å være: Ma-Ile-Pro-Glu-Glu-Phe-Asp-Ile-Leu-Val-Leu-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Ser.

EKSEMPEL IX

Bestemmelse av alkoholoksidase- transkripsjonsinitieringssete

For å bestemme hvor starten av mRNA for alkoholoksidase var anordnet, ble et starter-forlengelseseksperiment utført ved bruk av et syntetisk oligonukleotid kopiert fra DNA-sekvensene av 5'-enden av alkoholoksidasegenet som startmateriale og 10 jug poly A+ Pichia pastoris mRNA som templat. 10 fig Pichia pastoris poly A+ mRNA ble kombinert med 3 ng starter (primer) (5'-CTT CTC AAG TTG TCG-3') i et endelig volum på 9,3 fil som var 43 mM NaCl, 29,2 mM Tris (pH 8,3), 5,2 mM MgCl2, og 4,3 mM DTT. Nukleinsyrene ble denaturert ved 7 0°C i 5 minutter og resammenføyet ved at de ble tillatt å langsomt avkjøle til 22°C. Resammenføyingsblandingen ble satt til et rør inneholdende 4 jul dNTP-blanding 0,8 jul RT-buffer, og 1/il 32P-oc-dCTP (800 Ci/mmol) . 3 fil av denne blanding ble satt til 1 /ul av hver av de respektive dNTP. De siste 3/ul i denne blanding ble satt til 1 /il vann. Reaksjonene ble startet ved tilsetningen av 1 /il "dil" RT og inkubert ved 42°C i 15 minutter. Reaksjonene ble skyllet med 3 /il "Chase" RT ved 42°C i 15 minutter. Reaksjonene ble stoppet ved tilsetningen av 7,5/il formamid/farge-blanding og 4-5 /il ble underkastet elektroforese på en 0,4 mm tykk gradientgel i lx TBE. Etter elektroforese ble gelen fiksert i 10% eddiksyre med 10% metanol i 2 0 minutter. Gelen ble tørket under vakuum og brukt til å eksponere en XAR røntgenfilm.

Gradientgelen ble fremstilt som følger: 300 /il 10% ammoniumpersulfat og 14 /il TEMED ble satt til 30 ml toppgel, 75 /il 10% ammoniumpersulfat og 3,5 /il TEMED ble satt til 7 ml bunngel, 6 ml toppgel ble trukket opp i en pipette, og deretter ble 6 ml av bunngel trukket opp i den samme pipette. Gelen ble helt mellom gelplatene fulgt av 22 ml toppgel.

EKSEMPEL X

mRNA- hvbridisering- seleksjon og in vitro translasjoner

Positive hybridiserings-translasjonseksperimenter ble utført ved linearisering av 20 /ig klonet Pichia genomisk DNA (fremstilt som beskrevet i eksempel VI) ved fordøyelse med forskjellige restriksjonsendonukleaser. Dette DNA ble denaturert ved at oppløsningen ble gjort 0,3 M NaOH og inkubering ved 65°C i 10 minutter. Den denaturerte DNA-holdige oppløsning ble hurtig avkjølt på is og nøytralisert ved justering til 0,5 M Tris*HCl (pH 7,4). Et like stort volum av 20x SSPE ble satt til det denaturerte DNA straks før binding av DNA til nitrocellulosefUt-rene. Før påføring av DNA på nitrocellulosefiltrene (Schleicher og Schuell BA83, 9 mm dia.), ble filtrene preparert ved fukting med H20, koking i 10 minutter og skylling 3 ganger i 10x SSPE. 10 /ug DNA ble deretter bundet til hvert filter ved påføring av DNA til filteret, lufttørking og til slutt tørking av filtrene under vakuum ved 7 0°C i 2 timer.

Før prehybridisering ble filtrene med det bundne DNA plassert i 1 ml sterilt vann og varmet opp i 1 minutt ved 100°C, avkjølt på is, skyllet ved at de ble virvlet rundt i 1 ml sterilt vann, og renset med 1 ml prehybridiseringsbuffer. Filtrene ble prehybridisert i 1 ml prehybridiseringsbuf fer, deretter ble 40 /ug (2 jug/ml ETS) av poly A+ mRNA tilsatt direkte til prehybridiseringsbuf feren. Hybridiseringsblandingen ble varmet opp ved 65°C i 10 minutter og deretter inkubert ved 42°C i 24 timer.

Etter hydridiseringen ble filtrene vasket ganske kort 2 ganger i lx SSPE som inneholdt 0,5% SDS ved 22°C, 7 ganger i lx SSPE som inneholdt 0,5% SDS ved 50°C i 5 minutter hver, 3 ganger i 0,ix SSPE ved 50°C i 5 minutter hver, og en gang i 0,lx SSPE ved 65°C i 10 minutter. RNA ble eluert fra filtrene ved koking i 1 minutt i 3 00 fil H20 inneholdende 15 fig kaninlever-tRNA. Det eluerte RNA ble hurtig frosset i et bad av tørris-etanol. RNA-blandingen ble tillatt å varme opp til værelsestemperatur og filtrene fjernet. RNA-blandingen ble deretter utfelt ved justering av mediet til 2,5 M ammoniumacetat og utfelling med etanol 2 ganger, og tilslutt resuspendert i 100 fil H20 før lyofilisering.

Translasjoner ble utført i henhold til standardteknikker kjent av fagfolk, som f.eks. instruksjoner skaffet av New England Nuclear in vitro kaninreticulocyttlysat-translasjonspakker. Proteinprodukter ble underkastet elektroforese på 8% polyacryla-midgeler inneholdende en 4,5% stablingsgel (stacking gel).

EKSEMPEL XI

Antiserafremstillinger og immunoutfellinger

Antisera fremdrevet i kaniner mot et ekstrakt fra Pichia pastoris-celler inneholdende både p72 (alkoholoksidase) og p76-polypeptider ble fremstilt ved bruk av standardprotokoller. Ekstrakter ble dialysert mot PBS før injeksjoner. Over en periode på 8 uker fikk hver kanin 3 injeksjoner, som besto av 1 mg samlet protein i et volum på 0,1 ml med 0,2 ml av Freunds fullstendige hjelpemiddel. Injeksjoner ble gitt intradermalt på 6-10 steder i kaninen. Ved slutten av 8 uker ble blod tatt fra kaninene og deres sera testet mot renset Pichia pastoris alkoholoksidase ved Ouchterlony dobbelt diffusjons-fremgangsmåte.

Rensede anti-p72- (alkoholoksidase) og anti-p76 protein-antistoffer fra kanin ble fremstilt ved affinitetskromatografi av hele antisera gjennom en CNBr-koplet p72 (alkoholoksidase)-76 Sepharose 4B-kolonne. Et gram av CNBr-aktivert gel ble fremstilt ved hydratisering av gelen i 15 minutter i 200 ml 1 mM HCl fulgt av 3x 50 ml vaskinger i koblingsbuffer (0,1 M natriumkarbonat (pH 8) og" 0,5 M NaCl). 5 ml av en 6 mg/ml oppløsning av p72-p76 i koblingsbuffer ble satt til gelen og forsiktig omrørt over natten ved 4°C. Ubundet protein ble fjernet ved vasking med 3x 50 ml med koblingsbuffer. De gjenværende aktive grupper ble eliminert ved en 2 timers inkubasjon i 1 M etanolamin (pH 8). Ikke-kovalentbundet materiale ble fjernet fra gelen ved en 50 ml vask med 2 M natriumtiocyanat i PBS. Før kromatografi av antiseraene, ble gelen til slutt vasket med 3x 50 ml PBS. 5 ml klaret anti-p72-p76 antisera ble blandet med gelen og inkubert med forsiktig agita&jon i 2 timer ved 4°C. Antisera/gel-blandingen ble deretter pipettert inn i en lx 8 cm kolonne og vasket med 150 ml PBS. Renset antistoff ble eluert fra kolonnen med 6 ml av 2 M natriumtiocyanat i PBS. Etter eluering fra gelen ble det rensede antistoff underkastet omfattende dialyse mot PBS som inneholdt 0,02% natriumazid.

De affinitetsrensede antisera ble" satt til en in vitro translasjonsblanding i PBS, 1% NP40 og inkubert over natten ved 4°C. Antistoff/antigen-komplekset ble utfelt med pansorbin på is i 2,5 timer. Pansorbin ble fremstilt ved vasking i RIPA-buffer. Pansorbin-utfellinger ble vasket 4 ganger i RIPA-buffer og oppløst i Laemmli-ladebuffer før elektroforese.

EKSEMPEL XII

Pichia pastoris- transformasionsfremqanqsmåte

A. Celledyrking

1. Inokuler en koloni av Pichia pastoris GS115 (NRRL Y-15851) inn i ca. 10 ml YPD-medium og rist kulturen ved 30°C i 12-20 h. 2. Etter ca. 12-20 h, fortynn cellene til en OD600 på ca. 0,01-0,1 og hold cellene i logaritmisk vekstfase i YPD-medium ved 30°C i ca. 6-8 h. 3. Etter ca. 6-8 h, inokuler 100 ml av YPD-medium med 0,5 ml av startkulturen ved en OD60o på ca. 0,1 (eller ekvivalent mengde). Rist ved 30°C i ca. 12-20 h. 4. Innhøst kulturen når OD60o er ca• 0,2-0,3 (etter ca. 16-20 h) ved sentrifugering ved 1500 g i 5 minutter.

B. Fremstilling av sfæroplaster

l. Vask cellene en gang i 10 ml sterilt vann. (Alle sentrifugeringer for trinn 1-5 er ved 1500 g i 5 minutter.)

2. Vask cellene en gang i 10 ml nylig fremstilt SED.

3. Vask cellene 2 ganger i 10 ml steril 1 M Sorbitol.

4. Resuspender cellene i 10 ml SCE-buffer.

5. Tilsett 5-10 /il av 4 mg/ml Zymolyase 60.000. Inkuber cellene ved 30°C i 30-60 minutter.

Da fremstillingen av sfæroplaster er et kritisk trinn i transformasjonsfremgangsmåten, bør man overvåke sfæroplastdannel-sen som følger: tilsett 100 porsjoner av celler til 900 /il av 5% SDS og 900 /il av 1 M Sorbitol før eller like etter tilsetningen av~zymolase, og på forskjellige tidsrom under inkubasjonspe-rioden. Stopp inkubasjonen på det punkt hvor cellene lyserer i SDS, men ikke i Sorbitol (vanligvis mellom 30 og 60 minutters inkubasjon). 6. Vask sfæroplastene 2 ganger i 10 ml steril 1 M Sorbitol ved sentrifugering ved 1000 g i 5-10 minutter. (Tiden og hastig-heten for sentrifugeringen kan variere, sentrifuger tilstrekkelig til å pelletere sfæroplaster, men ikke så mye at de revner pga. kraften.)

7. Vask cellene en gang i 10 ml sterilt CaS.

8. Resuspender cellene i en samlet mengde på 0,6 ml CaS.

C. Transformasi on

1. Tilsett DNA-prøver (inntil 20 /il volum) til 12 x 75 mm sterile polypropenrør (DNA bør foreligge i vann eller TE-buffer; for maksimale transformasjonshyppigheter med små mengder DNA er det tilrådelig å tilsette ca. 1 /il av 5 mg/ml E. coli-DNA behandlet med lydbølger (sonicated) til hver prøve). 2. Tilsett 100 /il sfæroplaster til hver DNA-prøve og inkuber ved værelsestemperatur i ca. 2 0 minutter. 3. Tilsett 1 ml PEG-oppløsning til hver prøve og inkuber ved værelsestemperatur i ca. 15 minutter. 4. Sentrifuger prøvene ved 1000 g i 5-10 minutter og dekanter PEG-oppløsningen. 5. Resuspender prøvene i 150 /il SOS og inkuber i 30 minutter ved værelsestemperatur. 6. Tilsett 850 /xl av steril 1 M Sorbitol og påfør porsjoner av prøvene på plater som beskrevet nedenunder.

D. Regenerering av sfæroplaster

1. Resept for regenererings-agarmedium:

"a. Agar/Sorbitol - 9 g Bacto-agar, 54,6 Sorbitol, 240 ml H20, autoklav.

b. 10X glukose - 20 g dekstrose, 100 ml H20, autoklav.

c. 10X SC - 6,75 g gjær-nitrogenbase uten aminosyrer, 100 ml H20, autoklav (tilsett en hvilken som helst ønsket aminosyre eller nukleinsyre inntil en konsentrasjon på 200 /ig/ml før eller etter behandling i autoklave). d. Tilsett 30 ml 10X glukose og 30 ml 10X SC til 240 ml av den smeltede agar/sorbitol-oppløsning. Tilsett 0,6 ml av 0,2 mg/ml biotin og en hvilken som helst annen ønsket aminosyre eller nukleinsyre til en konsentrasjon på 20 /ig/ml. Hold smeltet regererasjonsagar på 55-60°C.

2. Påføring av transformasjonsprøver på plater:

Hell bunnagarlag på 10 ml regenereringsagar pr. plate minst 30 minutter før transformasjonsprøvene er klare. Fordel 10 ml porsjoner av regenereringsagar til rør i et bad på 45-50°C under den tid transformasjonsprøvene er i SOS. Tilsett porsjoner av transformasjonsprøver beskrevet ovenfor til rør med regenereringsagar og hell oppå bunnagarlaget på platene. Tilsett en porsjon av hver prøve til 10 ml porsjoner av smeltet regenereringsagar som holdes på 45-50°C, og hell hver av disse på plater inneholdende et fast 10 ml bunnagarlag av regenereringsagar.

3. Bestemmelse av kvaliteten av sfæroplastpreparat:

Fjern 10 /il av en prøve og fortynn 100 ganger ved tilsetning til 990 /il av 1 M sorbitol. Fjern 10 /il av den 100 ganger fortynnede oppløsning, og fortynn ytterligere 100 ganger ved tilsetning til en andre 990 /il porsjon av 1 M sorbitol. Stryk ut på platen 100 /il av begge de fortynnede oppløsninger på YPD-agermedium for å bestemme konsentrasjonen av hele celler som ikke er blitt til sfæroplast, og som er tilbake i preparatet. Tilsett 100 /il av hver fortynnet prøve til 10 ml regenereringsagar supplert med 40 /il/ml histidin for å bestemme de samlede regenererbare sfæroplaster. Gode verdier for et transformasjonseksperi-ment er 1-3 X IO<7> samlede regenererbare sfæroplaster/ml og ca. 1 x IO<3> hele celler/ml.

4. Inkuber platene ved 30°C i 3-5 dager.

EKSEMPEL XIII

Isolering av Pichia pastoris HIS4- qen og autonome replikasionssekvenser

A. Stammer

De stammer som ble anvendt innbefatter:

(a) Pichia pastoris stamme NRRL Y-11430; (b) Pichia pastoris GS115 (his4, NRRL Y-15851); (c) S. cerevisiae stamme 5799-4D (en his4-260 his4-39, NRRL Y-1585-9) ; og (d) E. coli stamme 848 (F- met thi gal T]_R 80s hsdR-hsdM<+>).

B. Plasmider

pYA2 (se fig. 23; består av S. cerevisiae HIS4-genet på et 9.3 kbp Pstl-fragment innsatt ved Pstl-setet av pBR325) var kilden for S. cerevisiae HIS4-genfragmentene, og er blitt deponert i en E. coli-vert og er tilgjengelig for offentligheten som NRRL B-15874.

YEpl3 er tilgjengelig fra the American Type Culture Collection, og er blitt gitt deponeringsnummer ATCC 37115.

C. Media

Pichia pastoris ble dyrket i YPD (rikt) eller IMG (minimalt) media. IMG, et minimalt medium, består av de følgende: 1. IM1-salter på en endelig konsentrasjon av 3 6,7 mM KH2P04, 22,7 mM (N<H>4)2S04, 2,0 mM MgS04'7H20, 6,7 mM KCl, 0,7 mM CaCl2-2H20, fremstilt som en 10x utgangsoppløsning og behandlet i autoklav; 2. Sporsalt ved en endelig konsentrasjon på 0,2 mM CuS04-5H20, 1,25 /iM Kl, 4,5 /iM MnS04'H20, 2,0 jliM NaMo04-2H20, 0,75 /iM H3BO3, 17,5 /iM ZnS04-7H20, 44,5 /iM FeCl3-6H20, fremstilt som en 4 00x utgangsoppløsning og filtersterilisert;

3. 0,4 /ig/ml biotin; og

4. 2% dekstrose.

E. coli ble dyrket i enten LB-medium eller 2B-medium (0,2% NH4P04, 1,2% Na2HP04, 0,013% MgS04'7H20, 0,074% CaCl2-2H20, 1 /ig/ml tiamin og 0,4% dekstrose) supplert med 100 /ig/ml tryptofan, og 0,2% casamino-syrer.

D. DNA- isolering

1. Fremstilling av gjær- DNA i stor skala

Både Pichia pastoris og S. cerevisiae DNA-fremstillinger ble utført ved dyrking av gjærceller i 100 ml minimalt medium inntil A600 er lik 1-2 og deretter høsting av cellene ved sentrifugering ved 2000 g i 5 minutter. Cellene ble vasket en gang i H20, en gang i SED, en gang i 1 M sorbitol og deretter suspendert i 5 ml 0,1 M Tris-HCl (pH 7,0) som er 1 M i sorbitol. Cellene ble blandet med 50-100 /il av en 4 mg/ml oppløsning av Zymola"se 60.000 og inkubert ved 30°C i 1 time for å digestere celleveggene. Sfæroplastpreparatet ble deretter sentrifugert ved 1000 g i 5-10 minutter og suspendert i Lysis-buffer (0,1% SDS, 10 mM Tris-HCl (pH 7,4), 5 mM EDTA og 50 nM NaCl). Proteinase K og RNase A ble hver tilsatt til 100 ug/ ml og blandingene inkubert ved 37°C i 30 minutter. DNA ble deproteinisert ved forsiktig blanding av preparatet med et like stort volum av kloroform inneholdende isoamylalkohol (24:1, v/v) og fasene ble separert ved sentrifugering ved 12.000 g i 20 minutter. Den øvre (vandige) fase ble trukket av inn i et nytt rør og ekstrahert med et like stort volum av fenol/kloroform/isoamylalkohol. Fasene ble separert som tidligere og toppfasen plassert i et rør inneholdende 2-3 volumer av kald 100% etanol. Prøven ble forsiktig blandet og DNA ble samlet opp ved opprulling på en plaststav. DNA ble øyeblikkelig oppløst i 1 ml TE-buffer og dialysert over natten ved 4°C mot 100 volumer TE-buffer.

2. Fremstilling av qjær- DNA i liten skala

5 ml gjærkulturer i minimalt medium ble dyrket til A60o var lik 1-5, og høstet ved sentrifugering ved 2000 g i 5 minutter. Celler ble suspendert i 1 ml SED og overført til et 1,5 ml mikrofuge-rør, vasket en gang i 1 M sorbitol og resuspendert i 0,5 ml av 0,1 M Tris-HCl (pH 7,4) som er 1 M i sorbitol. Zymolase 60.000 (10 /il av en 4 mg/ml oppløsning) ble tilsatt, og cellene ble inkubert i 30-60 minutter ved 30°C. Cellene ble deretter sentrifugert i 1 minutt, suspendert i Lysis-bufferen, og inkubert ved 65-70°C. Etter 15 minutter ble prøvene blandet med 100 /il av 5 M kaliumacetat, holdt i et isbad i 15 minutter, og sentrifugert i 5 minutter. De ovenpåflytende væsker ble dekantert inn i et nytt mikrofuge-rør inneholdende 1 ml av 100% etanol, blandet og sentrifugert i 10 sekunder. Tilslutt ble DNA-pelletene lufttørket

i 10-15 minutter og oppløst i 50 /xl TE-buffer.

3. Isolering av E. coli- DNA i stor skala

E. coli-kulturene for plasmidfremstillinger i stor skala (0,5-11) ble dyrket ved 37°C med risting i 2B-medium supplert som beskrevet ovenfor, og med det riktige antibiotikum. For celler som inneholdt pBR322-avledede plasmider ble kulturer dyrket til en A550 på ca. 0,7 ved hvilket tidspunkt tilstrekkelig kloramfenikol ble tilsatt for å gi en konsentrasjon på 100 fig/ ml, og celler høstet ca. 15 timer senere. Stammer som inneholdt pBR325-avledede plasmider ble inokulert inn i det 2B-medium som var blitt supplert ved en start-A550 på ca. 0,01-0,05 og inkubert med risting ved 37°C i 20-24 timer før høsting.

4. Fremstilling av E. coli- DNA i liten skala

For hurtige plasmidisoleringer i liten skala ble 2 ml kulturer i det supplerte 2B-medium med antibiotikum dyrket over natten ved 37°C med risting, og høstet ved sentrifugering i 1,5 ml mikrofuge-rør. Plasmider fra alle fremstillinger ble isolert ved den alkaliske lyseringsmetode beskrevet av Birnboim og Doly

(1979) .

E. Restriksions- DNA og fragmentisolering

Restriksjonsenzymer ble skaffet fra New England Biolabs og Bethesda Research Laboratories og fordøyelser ble utført ved rutineteknikker. Restriksjonskartlegginger ble utført ved sammenligning av parallelle fordøyelser av plasmider med og uten innføyet DNA. Restriksjonsfragmenter ble renset ved elektroeluering fra agarosegeler inn i Whatman 3 MM-papirstriper på et underlag av dialyserør. Fragmentene ble utvunnet fra papiret og rørene ved 3-4 vaskinger med 0,1-0,2 ml volumer av en oppløsning som inneholdt 0,1 M NaCL, 50 mM Tris-HCl (pH 8,0) og 1 mM EDTA. Tilslutt ble fragmentene ekstrahert med fenol/kloroform/isoamylalkohol, utfelt med etanol og reoppløst i et lite volum TE-buffer.

F. Bibliotekoppbygging av P. pastoris i E. coli

For oppbygging av arkivet av Pichia pastoris DNA-YEpl3 ble 100 /ug av YEpl3 digestert fullstendig med BamHI og behandlet med alkalisk fosfatase av kalvetarm for å fjerne ende 5'-fosfatet fra DNA. En 100 /ug porsjon av Pichia pastoris DNA, villtype, fra Pichia pastoris NRRL Y-11430 ble delvis digestert med 10 enheter av Sau3AI ved inkubering i 5 minutter ved 3 7°C i et samlet volum på 1 ml. Fragmenter på 5-10 kbp ble størrelseselektert ved sentrif ugering gjennom 5-20% sukrosegradienter. 1 jug av vektoren og 2/ug av Pichia Sau3AI-fragmenter ble blandet med 20 enheter av T4-DNA-ligase i et samlet volum på 200 jul og inkubert over natten ved 4°C. De ligerte DNA-molekyler ble transformert inn i E. coli ved tilsetning av hele ligeringsreaksjonsblandingen til 2 ml kompetente E. coli-848-celler og inkubering i 15 minutter ved 0°C. Blandingen ble varmet opp ved 37°C i 5 minutter, hvoretter 40 ml LB-medium ble tilsatt og inkuberingen ved 37°C fortsatt i ytterligere 1 time. Ampicillin ble deretter tilsatt for å gi en samlet konsentrasjon på 100 /ug/ml, og inkubasjonen fortsatte i 1 time til. Tilslutt ble cellene sentrifugert i 10 minutter ved 3 000 g, resuspendert i 1 ml nytt LB-medium, og strøket ut i like store porsjoner på 10 LB-agarplater inneholdende 100 /ug/ml ampicillin. De ca. 50.000 kolonier som resulterte, ble skrapet fra platene, og en porsjon av cellene ble inokulert i 500 ml av det supplerte 2B-medium med en start-A55Q på ca. 0,1. Kulturen ble dyrket, og plasmidet ble ekstrahert som beskrevet ovenfor. Av de kolonier som ble slått sammen for biblioteket, var 96 av 100 som ble testet tetracyclinfølsomme, og 7 av 10 som ble undersøkt inneholdt plasmider med innskutt DNA.

For oppbygging av biblioteket av Pichia pastoris DNA-pYJ8 Cia, ble 50 /ig av pYJ8 Cia fordøyet fullstendig med Clal og behandlet i alkalisk fosfatase fra kalvetarm for å fjerne ende-5'-fosfatet fra DNA. En 100 /xg porsjon av DNA fra Pichia pastoris NRRL Y-15851 ble delvis fordøyet med 20 enheter Taql ved inkubering i 5 minutter ved 65°C i et samlet volum på 1 ml. Fragmenter på 5-10 kbp ble størrelseselektert ved elektroeluering fra en 0,5% agarosegel (se eksempel II, avsnitt E). 1 Mg av vektoren og 2 Mg av Pichia Taql-fragmentene ble blandet med 2 0 enheter T4-DNA-ligase i et samlet volum på 200 /il og inkubert over natten ved 4°C. De ligerte DNA-molekyler ble transformert inn i E. coli ved tilsetning av hele ligasjons-reaksjonsblandingen til 2 ml kompetent E. coli-848-celler og inkubering i 15 minutter ved 0°C. Blandingen ble varmet til 37°C i 5 minutter, hvoretter 40 ml LB-medium ble tilsatt og inkubasjonen ved 37°C fortsatte i nok en time. Ampicillin ble deretter tilsatt for å gi en samlet konsentrasjon på 100 / ig/ ml, og inkubasjonen fortsatte i en time til. Tilslutt ble cellene sentrifugert i 10 minutter ved 3000 g, resuspendert i 1 ml nytt LB-medium og strøket ut i like store porsjoner på 10 LB-agarplater inneholdende 100 ug/ ml ampicillin. De ca. 10.000 kolonier som resulterte, ble skrapet fra platene, og en porsjon av.cellene ble inokulert i 500 ml av det supplerte 2B-medium ved en start-A550 på ca. 0,1. Kulturen ble dyrket, og plasmid ekstrahert som beskrevet ovenfor.

G. Southern- hybridiseringer

"For overføring av store eller superkveilede DNA-molekyler til nitrocellulose ble DNA første delvis hydrolysert ved bløting av agarosegeler i 0,25 M HCl i 10 minutter før alkalisk denature-ring. Hybridiseringen av merkede fragmenter fra S. cerevisiae HIS4-genet til Pichia pastoris-DNA ble utført i nærvær av 50% formamid, 6x SSC, 5x Denhardts, 0,1% SDS, 1 mM EDTA, og 100 jug/ml denaturert sildesperma-DNA ved 42°C. Post-hybridiseringsvaskinger ble utført i lx SSC, 1 mM EDTA, 0,1% SDS og 1,0% natriumpyrofosfat ved 65°C. DNA var <32>P-merket som beskrevet i eksempel IV.

H. DNA- sekvensering

DNA-sekvensering var ved dideoksynukleotid-kjedeavslut-ningsmetoden ifølge Sanger et al (1980).

I. Gjærtransformasjoner

S. cerevisiae-transformasjoner ble utført ved sfæroplast-genereringsmetoden ifølge Hinnen et al (1978).

Pichia pastoris-transformasjoner ble utført ifølge fremgangsmåten beskrevet ovenfor.

J. Analyse av Pichia pastoris- transformanter

Evnen til hvert plasmid til å opprettholdes som et autonomt element i Pichia pastoris-celler ble bestemt som" følger: En transformant-koloni ble tatt fra regenereringsagarplaten og strøket ut på en SD-medium-agarplate og inokulert i flytende IMG-medium. SD-platen ble inkubert ved 3 0°C i 3 dager, hvoretter en enkelt koloni ble tatt fra denne plate, strøket ut på en andre SD-plate, og inokulert i en andre beholder av IMG-medium. Denne fremgangsmåte ble gjentatt en tredje gang. De 3 IMG-kulturer ble dyrket ved 3 0°C med risting til en A60o Pa ca- 1-2/°9 deretter høstet ved sentrifugering. DNA fra gjærkulturene ble ekstrahert som beskrevet ovenfor, underkastet elektroforese ved 3 0 Volt og 30 mA i 10-15 timer inn i 0,8% agarosegeler, overført til nitrocellulose og hybridisert til <32>P-merket pBR322 eller pBR325 som beskrevet ovenfor. Som sammenligningsprøver ble en prøve inneholdende 10 ng plasmid isolert fra E. coli, og en prøve inneholdende 1-2 ug ikke-transformert Pichia pastoris GS115 DNA underkastet elektroforese i parallell med forsøksprøvene.

K. Isolering av Pichia DNA- sekvenser

DNA-fragmenter som inneholdt Pichia HIS4-genet ble isolert fra Pichia DNA-arkivet ved deres evne til å komplementere S. cerevisiae his4-stammer. Arkivet var sammensatt av 5-2 0 kbp Sau3AI partiell-digesteringsfragmenter av vill type Pichia DNA innføyet i BamHI-setet av S. cerevisiae/E. coli-skyttelvektoren YEpl3. Sfæroplaster av S. cerevisiae NRRL Y-15859 (5799-4D; en his4ABC~-stamme) ble generert ved teknikken ifølge Hinnen et al

(1978), blandet med Pichia DNA-biblioteket og tillatt å regenerere i et medium som manglet histidin. Transformasjonen resulterte i ca. lxlO<3> prototrofe gjærkolonier fra en populasjon av 5xl0<7> samlede regenererbare sfæroplaster. Samlet gjær-DNA ble ekstrahert fra 20 av His+-koloniene og transformert inn i E. coli. 17 av gjær-DNA-preparatene ga ampicillinresistente kolonier, og hver inneholdt plasmid som besto av YEpl3 pluss innføyet DNA. For å bekrefte at His+-transformerende plasmider inneholdt Pichia HIS4-genet og ikke et DNA-fragment med undertrykkende aktivitet, ble restriksjonsdigestionsprodukter av plasmidene hybridisert til et merket DNA-fragment inneholdende en stor porsjon av S. cerevisia HIS4-genet og vasket ved lav strenghet. Hver av plasmidene som komplementerte his4 S. cerevisia-stammene inneholdt sekvenser som hybridiserte til S. cerevisiae HIS4-genet.

For å søke etter DNA-fragmenter som inneholdt Pichia ARS-aktivitet, ble DNA fra Pichia pastoris GS115 (NRRL Y-15851) delvis digestert med Taql og 5-10 kbp-fragmenter ble isolert og klonet inn i det unike Clal-sete av pYJ8 Cia (se fig. 26). Plasmid-DNA ble utvunnet fra ca. 10.000 His+ Pichia-kolonier og brukt til å transformere E. coli. Plasmider fra ca. 10.000 ampicillinresistente kolonier ble isolert og deretter transformert tilbake inn i GS115. 40 av His+-gjærkoloniene fra denne sub-bibliotektransformasjon ble hver for seg strøket ut på selektivt medium og dyrket i separate kulturer i selektivt medium. Det samlede gjær-DNA ble ekstrahert fra hver av disse 40 kulturer og transformert inn i E. coli. To plasmider pYA63 (PARS1) og pYA9 0 (PARS2), hvis gjær-DNA-preparater produserte de fleste ampicillinresistente E. coli-kolonier, ble valgt ut for videre analyse. Begge disse plasmider transformerte Pichia pastoris GS115 (NRRL Y-15851) med meget høy frekvens, og hver inneholdt en innføyelse av fremmed DNA.

EKSEMPEL XIV

Konstruksjon av regulerende område/ lacZ- genfusioner

A. p72 ( alkoholoksidase) regulerende område konstruert materiale

Plasmid pPG 4.0, en pBR322-vektor som inneholder det 4 kilobasepar EcoRI-PvuII genomiske DNA-fragment fra Pichia pastoris ble kuttet med Pstl, behandlet med Sl-nuklease for å gi butte ender der hvor kløyving fant sted, og deretter kuttet med BamHI for å gi et DNA-fragment på 1.12 kbp som inneholder det regulerende område av alkoholoksidase og kodeinformasjonen for de første 15 aminosyrer av alkoholoksidase. Dette 1.12 kbp-store DNA-fragment har den følgende nukleotidsekvens:

Dette 1.12 kbp ble ligert inn i EcoRI/Smal/BamHI-koblingen (kløyvet med BamHI og Smal) av E. coli/S. cerevisiae-skyttelvektoren pSEYlOl, Douglas et al (1984). Vektoren pSEYlOl inneholder E. coli lacZ-genet og er et flerkoblingsledd (polylinker) med den følgende nukleotidsekvens:

for å gi hybrid plasmid pTAOll (se fig. 29).

Da genfusjonen av regulerende område/lacZ av pTAOll er ute av fase med hensyn til produksjon av 3-galaktosidase som vist i sekvens E:

Vektor" pTAOll er kløyvet ved det unike BamHI-sete og den følgende Smal-kobling innføyet:

som således gir hybrid vektor pTA012, som har den nukleotidsekvens som er vist i sekvens F med hensyn til det regulerende område/lacZ-fusjonen, og således er den regulerende område/lacZ-fusjon av pTA012 fremdeles ute av fase med hensyn til LacZ-leserammen. For å bringe N-terminal-kodings-informasjonen for alkoholoksidase-strukturellgenet inn i en åpen leseramme med det strukturelle lacZ-gen, ble pTA012 behandlet med EcoRI-Smal og det resulterende DNA-fragment ligert inn i pSEYlOl, som på samme måte var blitt behandlet med EcoRI og Smal, hvilket ga hybrid vektor pTA013 (se fig. 30) og den nukleotidsekvens som er vist i sekvens G. Vektoren pTA013 ble deretter brukt til å transformere S. cerevisiae SEY2102 for videre undersøkelser beskrevet nedenunder i eksempel XV.

Vektoren PTA013 ble deretter kløyvet med Pstl eller Pstl-Nrul og fusjonen av regulerende område/lacZ inneholdt i det kløyvede fragment ble ligert med det HIS4-genholdige fragment av skyttelvektorer pTAFHl (se fig. 28) , pYJ30 (se fig. 27) eller pYA2 (se fig. 23) for å gi henholdsvis plasmider pSAOH 1, pSAOH 5 og pSAOH 10.

B. p76 regulerende område konstruerte materialer

Genfusjoner av regulerende område/lacZ ble fremstilt som følger med det p76 regulerende område.

1. Anvendelse av hele 5'-partiet av pPG 6.0

1.35 kb-paret EcoRI-fragmentet av pPG 6.0 ble klonet inn i det unike EcoRI-sete av .pSEYlOl, en E. coli/S. cerevisiae-skyttelvektor for å gi plasmid pT76Ul (se fig. 30a). Vektor pT7 6Ul ble deretter kløyvet med Pstl-Nrul, og dets større DNA-fragment ligert med det HIS4-genholdige fragment av skyttelvektor pTAFHl (fig. 28) som beskrevet ovenfor for å gi pT76H3,

eller med EcoRI-enden fylt i Pstl-EcoRI-fragmentet av skyttelvektor pBP fl (se fig. 34) for å gi pT76H4.

2. Bruk av et Bal31-digest av 5'-pPG 6.0

Et 1.3 5 kb-par EcoRI-fragment av pPG 6.0 ble klonet inn i det unike EcoRI-sete av pSEY8, en E. coli/S. cerevisiae-skyttelvektor som også har et unikt Sall-sete som grenser opp til EcoRI-setet inn i hvilket Pichia-DNA ble innsatt, for således å gi plasmid pTAOl (se fig. 31). Plasmidet pTAOl ble kløyvet med Sali, behandlet med Bal31-eksonuklease for å fremstille fragmenter med avrundede ender av polypeptid p76 regulerende område av forskjellige lengder. Fragmenter med avrundede ender ble frigjort fra resten av plasmidet pSEY8 ved kløyving med EcoRI. De resulterende DNA-fragmenter ble klonet inn i Eco/Smal-koblingen av pSEYlOl for å gi blant annet plasmid pTAF.85 (se fig. 32). Plasmid pTAF.85 er analogt med pTAOll vist på fig. 29 med det p7 6 regulerende område istedenfor det p72 (alkoholoksidase) regulerende område.

Vektor pTAF.85 ble deretter behandlet på en måte analog med behandlingen av vektor pTA013 for å gi plasmider pTAF.85, pT76Hl og pT76H2. Således ble de følgende vektorer kløyvet og ligert:

EKSEMPEL XV

Regulering av 3- qalaktosidaseproduksion i Pichia pastoris

Produksjonen av 3-galaktosidase ved forskjellige Pichia pastoris GS115 (NRRL Y-15851) transformanter dyrket på forskjellige karbonkilder og under forskjellige betingelser ble undersøkt. De transformerte stammer ble dyrket i minimalt medium inneholdende 0,5 ug/ ml biotin og 0,1% glukose ved 3 0°C inntil de nådde stasjonær fase. Cellene ble deretter samlet opp ved sentrifugering og overført til minimalt medium inneholdende 0,5 fig/ ml biotin og 0,5 metanol og dyrket i 3-5 generasjoner ved 3 0°C. Etter denne opprinnelige dyrking på metanol ble celler samlet opp ved sentrifugering og overført til nytt minimalt medium inneholdende 0,5 ng/ xal biotin og enten 0,1% 74

glukose eller 0,3% metanol som karbonkilde. Cellene ble deretter inkubert ved 30°C i ca. 80 timer, idet prøver ble tatt ut fra tid til annen for å bestemme nivåene av alkoholoksidase og B-galaktosidase. Etter 20-50 timer var karbonkilden uttømt, og deretter ble cellene opprettholdt under disse karbonkildehunger-betingelser. Resultatene er angitt i tabell I.

Alkoholoksidase ble bestemt ved farge/peroksidase-metoden beskrevet ovenfor (se eksempel VII), og P-galaktosidase ble bestemt som følger:

Bestemmelse av P- galaktosidase

A. Nødvendige oppløsninger:

O- nitrofenvl- e- D- galaktosid • ( ONPG) :

Løs opp 400 mg ONPG (Sigma N-1127) i 100 ml destillert vann for å gi 4 mg/ml ONPG-oppløsning.

B. Analvsefremgangsmåte:

1. Ta ut en porsjon fra kulturmediet (0,1-0,5 OD60o av gjærceller) , sentrifuger og vask cellepelleten med vann. 2. Tilsett 1 ml Z-buffer til cellepelleten, 30 / sl CHC13 og 30 Ml 0,1% SDS, virvle rundt (vortex), inkuber i 5 minutter ved 30°C. 3. Start reaksjonen med tilsetning av 0,2 ml ONPG (4 mg/ml), virvle rundt. 4. Stopp reaksjonen med tilsetning av 0,5 ml av en 1 M Na2C03-oppløsning ved de riktige tidspunkt (A420<<>1)•

5. Les absorbansen av ovenpåflytende væske ved 420 nm.

C. Beregning av g- galaktosidase- aktivitetsenheter

1 U = 1 nmol av ortonitrofenol (ONP) dannet pr. minutt ved 3 0°C og pH 7. 1 nmol ONP har en absorbans ved 420 nm (<A>420) Pa 0,0045 med en 1 cm banelengde; således representerer en absorbans på 1 ved 420 nm 222 nmol ONP/ml, eller 378 nmol/1,7 ml da det samlede volum av ovenpåflytende væske som analyseres er 1,7 ml. Enhetene som uttrykkes i tabellene, blir følgelig beregnet således:

Resultatene vist i tabell I indikerer at et protein som er fremmed for gjær, dvs, 3-galaktosidase, kan produseres i Pichia pastoris regulert enten ved nærværet av metanol i næringsmediet eller ved karbonkildehunger etter dyrking på en katabolittundertrykkende karbonkilde.

EKSEMPEL XVI

Regulering av 3- galaktosidaseproduksion i S. cerevisiae

Saccharomyces cerevisiae SEY2102, en stamme som krever supplering av uracil, leucin og histidin for å overleve, ble transformert med plasmider pTA013 og pT76Ul. Transformerte organismer ble lett isolert ved at man valgte for kolonier som ikke krevet uracilsupplering for vekst. De isolerte transformanter er blitt gitt laboratoriebetegnelsene henholdsvis SEY2102-pTAO13, og SEY2102-pT76Ul. SEY2102-pTAO13 er blitt deponert hos Northern Regional Research Center i Peoria, Illinois, for å sikre tilgjengelighet for offentligheten fra og med deponeringsdatoen 31. august 1984. Denne stamme er blitt gitt deponeringsnummer NRRL Y-15858.

Celler av NRRL Y-15858 og SEY2102-pT7 6Ul ble inkubert ved 30°C i 3-4 generasjoner i minimalt medium inneholdende 20 iig/ml histidin og leucin og 5% glukose. Celler ble deretter byttet om, dvs. samlet opp ved sentrifugering og overført til YP-medium med 3% av karbonkilden angitt i tabell II og dyrket i ca. 5 generasjoner ved 3 0°C. Celler ble deretter inkubert i ytterligere 50 timer under betingelser av karbonkildehunger, og periodisk tatt prøver av for 3-galaktosidase. Resultatene er angitt i tabell II. B. p76 regulerende område (pT76Ul)

Disse resultater antyder at et protein fremmed for gjær, dvs, P-galaktosidase, kan produseres ved Saccharomyces cerevisiae regulert av de p72 (alkoholoksidase) og p76 regulerende områder under betingelser av karbonkildehunger når en katabolittundertrykkende karbonkilde anvendes for dyrking, eller ved dyrking av transformerte S. cerevisiae-celler på en forholdsvis ikke-katabolittundertrykkende karbonkilde så som glycerol eller galaktose.

Ekspresjonsnivåene for e-galaktosidase i S. cerevisiae under styring av de regulerende områder ifølge oppfinnelsen, kan sammenlignes med ekspresjonsnivåene som er mulige med andre S. cerevisiae regulerte promotorer.

Det kan ses at de regulerende områder av oppfinnelsen er overraskende minst like virksomme som, eller mer virksomme som

S. cerevisiae-promotorer enn promotorer som er native for S. cerevisiae.

EKSEMPEL XVII

Southern- hybridiseringer med gjær- qenoroisk DNA

Ni forskjellige metanolassimilerende gjærsorter og en metanol ikke-assimilerende gjær ble dyrket på henholdsvis minimale media (IMI, se eksempel I) pluss 0,75% metanol eller 1,0% glukose. Samlet kromosomalt DNA ble isolert som beskrevet i eksempel VI, dvs. de samlede nukleinsyrer ble isolert, behandlet med RNase A, ekstrahert først med fenol/kloroform/isoamylalkohol, deretter med kloroform/isoamylalkohol og tilslutt etanolutfelt. Det utfelte DNA ble resuspendert i et minimumsvolum av TE-buffer og sentrifugert for å rense DNA-oppløsningen.

Southern-hybridiseringsfiltre ble fremstilt som beskrevet i eksempel VI, dvs. 10 /i<? samlet DNA fra forskjellige gjær-slekter ble fordøyet med et overskudd av Hindlll, underkastet elektroforese, DNA-denaturert, gelen nøytralisert og DNA overført til nitrocellulosefiltre. Prehybridiseringsbetingelser for disse filtre innbefattet behandling med 50% deionisert formamid, 6x SSC, 5x Denhardts, 1 mM EDTA, 0,1% SDS og 100 /ig/ml denaturert laksesperma-DNA ved 4 2°C over natten. De samme betingelser ble brukt som et hybridiseringsmedium ved anvendelse av 32P-innsnitt-translaterte prober med en endelig konsentrasjon på IO<6> cpm/ml. Probene innbefattet cDNA-inn-skuddene (Pstl-fragmenter) fra kloner pPC 8.3, pPC 15.0 og pPC 6.7, samt et Bglll DNA-fragment på 2.7 kbp av P. pastoris HIS4-gen. Hver av disse sonder ble hver for seg brukt på identiske filtre for hybridisering som varte 24 timer ved 42°C. Etter hybridisering ble filtrene vasket to ganger i 15 minutter ved værelsestemperatur og tre ganger ved 65°C i 15 minutter i en oppløsning inneholdende 2xSSC, 1 mM EDTA, 0,1% SDS og 0,1% natriumpyrofosfat. Andre vaskinger ble forsøkt med lavere strenghet, dvs. ved 55°C og 42°C, for å bekrefte hybridi-seringsresultatene. Filtrene ble deretter autoradiografert i 72 timer. Resultatene av disse hybridiseringer er angitt i tabell

III.

Resultatene angitt i tabell III viser at gener for polypeptider analoge med p76, p72 og p40 foreligger i praktisk talt alle metanolassimilerende gjærsorter. Det er bemerkelses-verdig at ingen av disse 3 gener ble observert ved hybridisering av DNA fra en metanol ikke-assimilerende gjærsort S. cerevisiae, mens homologi mellom P. pastoris HIS4-genet og HIS4-genet fra S. cerevisiae ble klart observert.

Bibliografi

Birnboim og Doly (1979) Nucl. Acids Res. 7, 1513-1523.

M.G. Douglas et al (1984) Proe. Nat. Acad. Sei. U.S. 81, 3983-3987 .

Hinnen et al (1978) Proe. Nat. Acad. Sei., USA .75, 1929-1933. 2.A. Janowicz et al (1985) Nucl. Acids Res. 13., 3043-3062.

A.M. Ledeboer et al (1985) Nucl. Acids Res. 13, 3063-3082.

Maxam og Gilbert (1980) Methods in Enzymology 65, 499-560.

Southern (1975) J. Mol. Biol. 98, 503-517.

Sanger et al (1980) J. Mol. Biol. 143. 161-178.

Claims (23)

1. Fremgangsmåte til fremstilling av polypeptid, karakterisert ved at det omfatter å dyrke en transformert gjærstamme oppnådd ved å transformere en Pichia pastoris-vert med en ekspresjonsvektor som bærer rekombinant DNA-materiale, hvor det rekombinante DNA-materialet omfatter et DNA-fragment som omfatter et regulatorisk område avledet fra Pichia pastoris, hvor det regulatoriske område reagerer på nærværet av metanol i vekstmediet med hvilket en vertsorganisme for DNA-fragmentet er i kontakt, hvor det regulatoriske område er i stand til å kontrollere transkripsjonen av mRNA når det er plassert på 5'-enden av et DNA som koder for mRNA'et, hvor det regulatoriske område er valgt fra; (a) det regulatoriske område som kontrollerer transkripsjonen av mRNA som koder for dihydroksyacetonsyntetase, som kan oppnås fra klon pPG6.0 (NRRL B-15867) fra 5-HindlII-restriksjonssetet til 3'-Xhol-restriksjonssetet; (b) det regulatoriske område som kontrollerer transkripsjonen av mRNA som koder for alkoholoksidase, som oppnås fra klon pPG4.0 (NRRL B-15868) fra 5'-EcoRI-restriksjonssetet til 3'-EcoRV-restriksjonssetet; (c) det regulatoriske område som kontrollerer transkripsjonen av mRNA som koder for p40 som oppnås fra klon pPG4.8 (NRRL B-15869) fra 5'-BamHI-restriksjonssetet til 3'-Sall-restriksjonssetet; hvor dyrkingen foretas i et næringsmedium og ekspresjonen induseres i nærvær av metanol og gjenvinning av polypeptidene.

2. Fremgangsmåte som angitt i krav 1, karakterisert ved at DNA-fragmentet videre omfatter et polypeptidkodende område hvor det regulatoriske område er plassert i 5'-enden av det polypeptidkodende område.

3. Fremgangsmåte som angitt i krav 2, karakterisert ved at DNA-fragmentet videre omfatter en 3'-sekvens av DNA nedstrøms for den polypeptidkodende region hvor 3'-sekvensen av DNA er i stand til å kontrollere polyadenylering, avslutning av transkripsjon og avslutning av translasjon av mRNA, kodet for av det polypeptidkodende område.

4. Fremgangsmåte som angitt i krav 1, karakterisert ved at det regulatoriske område er avledet fra Pichia pastoris NRRL Y-11430.

5. Fremgangsmåte som angitt i krav 3, karakterisert ved at DNA-fragmentet videre omfatter en eller flere tilleggs-DNA-sekvenser avledet fra gruppen bakterielt piasmid-DNA, bakteriofag DNA, gjærpiasmid DNA og gjærkromosomalt DNA.

6. Fremgangsmåte som angitt i krav 5, karakterisert ved at det gjærkromosomale DNA omfatter en autonom replikerende DNA-sekvens og et markørgen.

7. Fremgangsmåte som angitt i et av kravene 2-6, karakterisert ved at det polypeptidkodende område koder for et heterologt polypeptid.

8. Fremgangsmåte som angitt i et av kravene 2-6, karakterisert ved at det polypeptidkodende område koder for alkoholoksidase.

9. Fremgangsmåte som angitt i et av kravene 2-6, karakterisert ved at det polypeptidkodende område koder for dihydroksyacetonsyntase.

10. Fremgangsmåte som angitt i et av kravene 2-6, karakterisert ved at det polypeptidkodende område koder for polypeptid p40.

11. Fremgangsmåte som angitt i et av kravene 2-6, karakterisert ved at fragmentet er i form av et lukket sirkelformet hybrid-plasmid.

12. Fremgangsmåte som angitt i krav 1, karakterisert ved at Pichia pastoris-verten er GS 115 (NRRL Y-15851).

13. Fremgangsmåte som angitt i et av kravene 1-12, karakterisert ved at næringsmediet for dyrking av den transformerte gjærstamme inneholder metanol.

14. Ekspresjonsvektor som omfatter en DNA-sekvens for et regulerende område fra Pichia pastoris, karakterisert ved at den bærer rekombinant DNA-materiale, hvor det rekombinante DNA-materialet omfatter et DNA-fragment som omfatter et regulatorisk område avledet fra Pichia pastoris, hvor det regulatoriske område reagerer på nærværet av metanol i vekstmediet med hvilket en vertsorganisme for DNA-fragmentet er i kontakt, hvor det regulatoriske område er i stand til å kontrollere transkripsjonen av mRNA når det er plassert på 5-enden av et DNA som koder for mRNAet, hvor det regulatoriske område er valgt fra; (a) det regulatoriske område som kontrollerer transkripsjonen av mRNA som koder for dihydroksyacetonsyntetase, som kan oppnås fra klon pPG6.0 (NRRL B-15867) fra 5'-Hindlll-restriksjonssetet til 3-Xhol-restriksjonssetet; (b) det regulatoriske område som kontrollerer transkripsjonen av mRNA som koder for alkoholoksidase, som oppnås fra klon pPG4.0 (NRRL B-15868) fra 5'-EcoRI-restriksjonssetet til 3'-EcoRV-restriksjonssetet; (c) det regulatoriske område som kontrollerer transkripsjonen av mRNA som koder for p40 som oppnås fra klon pPG4.8 (NRRL B-15869) fra 5-BamHI-restriksjonssetet til 3'-Sall-restriksjonssetet.

15. Ekspresjonsvektor som angitt i krav i 4 karakterisert ved at DNA-fragmentet videre omfatter et polypeptidkodende område hvor det regulatoriske område er plassert i 5'-enden av det polypeptidkodende område.

16. Ekspresjonsvektor som angitt i krav 15 karakterisert ved at DNA-fragmentet videre omfatter en 3-sekvens av DNA nedstrøms for den polypeptidkodende region hvor 3'-sekvensen av DNA er i stand til å kontrollere polyadenylering, avslutning av transkripsjon og avslutning av translasjon av mRNA, kodet for av det polypeptidkodende område.

17. Ekspresjonsvektor som angitt i et av kravene 14-16, karakterisert ved at det regulatoriske område er avledet fra Pichia pastoris NRRL Y-11430.

18. Ekspresjonsvektor som angitt i et av kravene 14-17, karakterisert ved at DNA-fragmentet videre omfatter en eller flere tilleggs-DNA-sekvenser avledet fra gruppen bakterielt plasmid-DNA, bakteriofag DNA, gjærplasmid DNA og gjærkromosomalt DNA.

19. Ekspresjonsvektor som angitt i krav 18, karakterisert ved at det gjærkromosomale DNA omfatter en autonom replikerende DNA-sekvens og et markørgen.

20. Ekspresjonsvektor som angitt i et av kravene 15-19, karakterisert ved at det polypeptidkodende område koder for et heterologt polypeptid.

21. Ekspresjonsvektor som angitt i et av kravene 15-19, karakterisert ved at fragmentet er i form av et lukket sirkelformet hybrid-plasmid.

22. Ekspresjonsvektor som angitt i et av kravene 14-21, karakterisert ved at det nevnte regulerende område for alkoholoksidase har nukleotidsekvensen:

23. Ekspresjonsvektor som angitt i et av kravene 14-21, karakterisert ved at det nevnte regulerende område for alkoholoksidase har nukleotidsekvensen: