HU205627B - Process for producing polypeptides by yeasts containing area for controlling gen expression - Google Patents

Process for producing polypeptides by yeasts containing area for controlling gen expression Download PDF

Info

Publication number
HU205627B
HU205627B HU854160A HU416085A HU205627B HU 205627 B HU205627 B HU 205627B HU 854160 A HU854160 A HU 854160A HU 416085 A HU416085 A HU 416085A HU 205627 B HU205627 B HU 205627B
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
dna
regulatory region
gene
transformed
yeast
Prior art date
Application number
HU854160A
Other languages
English (en)
Other versions
HUT38678A (en
Inventor
Paul Frederick Brust
Steven Bradley Ellis
Thomas Raymond Gingeras
Michael Miller Harpold
David Womak Stroman
Juerg Friedrich Tschopp
Original Assignee
Phillips Petroleum Co
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from US06/666,391 external-priority patent/US4808537A/en
Application filed by Phillips Petroleum Co filed Critical Phillips Petroleum Co
Publication of HUT38678A publication Critical patent/HUT38678A/hu
Publication of HU205627B publication Critical patent/HU205627B/hu

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0006—Oxidoreductases (1.) acting on CH-OH groups as donors (1.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/67—General methods for enhancing the expression
    • C12N15/68—Stabilisation of the vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
    • C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
    • C12N15/815—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts for yeasts other than Saccharomyces

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)

Description

A találmány a rekombináns DNS-biotechnológia területére vonatkozik. Egyik szempontja szerint a találmány olyan DNS-fragmensekkel foglalkozik, amelyek szabályozzák a DNS átírását hírvivő (messenger) RNS-sé, valamint a hírvivő RNS fehérjévé átfordításának (transzlációjának) beindítását és leállítását. Egy másik szempont szerint a találmány kifejeződő vektorokkal foglalkozik, amelyek magukba foglalják a fentebb leírt DNS-fragmenseket. Egy, még további szempont szerint a találmány a fentebb leírt kifejeződő vektorokkal transzformált új mikroorganizmusokkal foglalkozik. Egy további szempont szerint a találmány polipeptidek előállításával foglalkozik.
Ahogyan az elmúlt években a rekombináns DNStechnológia kifejlődött, a hasznos polipeptidek óriási választékának szabályozott termelése vált lehetővé mikroorganizmusok által. Több eukarióta polipeptidet, mint pl. humán növekedési hormont, leukocita interferonokat, humán inzulint és humán proinzulint már termelnek különböző mikroorganizmusokkal. A már kézben lévő technikák folyamatos alkalmazásától a jövőben azt várjuk, hogy lehetővé teszik további hasznos polipeptidek előállítását is mikroorganizmusokkal.
A rekombináns DNS-technológia területén alkalmazott alapvető technikák ismertek azok számára, akik a szakterületen jártasak. A rekombináns DNS-technológia gyakorlati alkalmazásához a mikroorganizmus-gazdaszervezetek esetén előnyös, ha a következő elemek jelen vannak (a korlátozás igénye nélkül):
(1) egy vagy több kívánt polipeptidet kódoló gén, megfelelő, a gazda-mikroorganizmusban való kifejeződéshez szükséges szabályozószekvenciákkal ellátva.
(2) egy vektor, általában egy plazmid, amelybe a gént be lehet iktatni. A vektor arra szolgál, hogy biztosítsa a gén átvitelét a sejtbe és a DNS-szekvenciák megtartását a sejtben, valamint a fentebb említett gének kifejeződésének magas szintjét, és (3) egy megfelelő gazda-mikroorganizmus, amelybe a kívánt gént hordozó vektort transzformálni lehet, ahol a gazda-mikroorganizmusnak szintén van olyan sejtapparátusa, amely lehetővé teszi a beiktatott gén által kódolt információ kifejeződését.
A rekombináns DNS-technológiában alkalmazott egyik alapelem a plazmid, amely bizonyos mikroorganizmusokban található extrakromoszomális, kettős szálú DNS. Ahol a plazmidok a természetben mikroorganizmusokban vannak jelen, ezek gyakran sejtenként többszörös kópiaszámmal fordulnak elő. A természetes módon előforduló plazmidokon kívül sokféle ember alkotta plazmidot vagy hibrid vektort állítottak elő. A plazmidDNS-ben kódolt információkba beletartozik az az információ is, amely ahhoz szükséges, hogy a plazmid reprodukálódjon a leánysejtekben, azaz egy autonóm módon replikálódó szekvenciára vagy a replikációs origóra van szükség. Egy vagy több fenotípusos szelekciós jellemző szintén kell, hogy legyen a plazmid-DNS-ben kódolt információban. A fenotípusos szelekciós jellemzők lehetővé teszik a szóban forgó plazmidot tartalmazó gazdasejt kiónjainak felismerését és szelektálását a sejtek szelektív tápkőzegekben történő növesztésével.
A plazmidok alkalmazhatósága azon a tényen alapszik, hogy ezeket fajlagosan lehet hasítani egyik vagy másik restrikciós endonukleázzal vagy restrikciós enzimmel, amelyek mindegyike egy fajlagos, egyedi helyet ismer fel a plazmid-DNS-en. Ezután a homológ géneket, heterológ géneket, vagyis a gazdaszervezettől eltérő organizmusokból származó géneket vagy génfragmenseket lehet beiktatni a plazmidba (-) a hasított plazmid és a kívánt genetikai anyag végeinek összekapcsolásával (a hasítási helynél vagy a hasítási helyhez szomszédos helyreállított végnél). Az így létrejött rekombináns DNS-anyagot nevezhetjük hibrid vektornak.
A DNS-rekombináciőt a gazda-mikroorganizmuson kívül hajtjuk végre. A létrejött hibrid vektort a gazdamikroorganizmusba a transzformációként ismert folyamat segítségével juttatjuk be. A transzformált mikroorganizmus növesztésével nagy mennyiségű hibrid vektort nyerhetünk. Ha a gént a kódolt DNS-üzenet transzkripcióját és transzlációját irányító részek szempontjából megfelelően iktatjuk be, az így létrejött hibrid vektor alkalmazható azon polipeptid-szekvencia termelésének irányítására, amelyet a beiktatott gén kódol. A polipeptid ilyen módon való termelését génkifejeződésnek nevezzük.
A génkifejeződés a promotorterületként ismert DNS-területben kezdődik. A kifejeződés transzkripciós fázisában a DNS lecsavarodik, mintaként (templátként) szolgálva a hírvivő RNS szintéziséhez. Az RNS-polimeráz a promotorterülethez kötődik és végigutazik a sértetlen DNS mentén annak 3’ végétől 5’ végéig, átírva a kódoló szálban tartalmazott információt a hírvivő RNS-be (mRNS) az mRNS 5’ végétől a 3’ végéig. A hírvivő RNS azután a riboszőmákhoz kötődik, ahol az mRNS polipeptidlánccá fordítódik át. Minden egyes aminosavat egy nukleotid triplet vagy kodon kódol egy olyan szerkezeten belül, amelyet strukturgénnek nevezhetünk, ez a génnek egy olyan része, amely a kifejezett termék aminosav-szekvenciáját kódolja. Mivel mindegyik aminosav előállítását három nukleotid kódolja, a nukleotidszekvencia „leolvasása” három különböző úton lehetséges. Azt a leolvasó keretet, amely a kívánt polipeptid terméket kódolja, a megfelelő leolvasókeretnek nevezzük.
A promotorhoz való kötődés után az RNS-polimeráz először az mRNS egy 5’ vezető területét, majd egy transzlációs iniciáló vagy startkodont ír át, ezt követik a nukleotid kodonok magán a strukturgénen belül. Abból a célból, hogy a kívánt génterméket nyerjük, szükséges, hogy az indító- vagy startkodon korrektül (-) indítsa be a hírvivő RNS transzlációját a riboszómák által (a megfelelő leolvasókeretben). Végül a strukturgén végénél a stopkodonok íródnak át, amelyek azt idézik elő, hogy az mRNS bármilyen további szekvenciáit a riboszómák nem írják át, még ha további mRNS-szekvencíák képződtek is az RNS-polimeráznak a DNS-templáttal való kölcsönhatása révén. így a stopkodonok meghatározzák a transzláció végét, és ezáltal az aminosavak további beépülésének végét a polipepíid termékbe. A polipeptid termék a gazdasejtek
HU 205 627 Β lizálásával és a többi mikrobiális fehérjétől való megfelelő tisztítással nyerhető ki, vagy bizonyos körülmények között a fermentációs közeg tisztításával, amelyben a gazdasejt nőtt és amelybe a polipeptid termék kiválasztódott.
Gyakorlatilag a rekombináns DNS-technológia teljesen heterológ polipeptidek, azaz az adott mikroorganizmusban rendes körülmények közt nem található vagy nem termelődő polipeptidek kifejezésére képes mikroorganizmusokat eredményezhet - ez az úgynevezett közvetlen kifejeződés. Ki lehet azonban fejezni, vagy lehet termelni egy fúziós fehérjét is, azaz egy olyan heterológ polipeptidet, amely egy homológ polipeptid aminosav-szekvenciájának egy részéhez van fúzionálva, ahol a homológ polipeptid olyan polipeptidet jelent, amely megtalálható a vad típusú (nem transzformáit) mikroorganizmusban - ezt hívjuk közvetett kifejeződésnek. A közvetett kifejeződés esetén a kezdetben nyert fúziós fehérjetermék néha inaktív a szándékolt felhasználás szempontjából, amíg a fuzionált homológ/heterológ polipeptidet extracelluláris környezetben el nem hasítjuk. így pl. a metioningyökök cianogénbromidos elhasítása (-) szomatosztatint, timozin-alfa-l-et és a humán inzulin A és B lánckomponenseket eredményez (a fuzionált homológ/heterológ polipeptidekből), míg a meghatározott gyökök enzimes lehasítása bétaendorfint eredményez.
Eddig az ipari erőfeszítések különböző polipeptidek termelésére rekombináns DNS-technológiát alkalmazva Escherichia colira, mint gazdaszervezetre irányulnak. Néhány helyzetben azonban az E. coli alkalmatlannak bizonyult gazdaszervezetnek. így pl. az E. coli egy sor toxikus pirogén faktort taralmaz, amelyeket el kell távolítani minden olyan polipeptidből, amely gyógyászati termékként használatos. A tisztítás hatékonysága természetesen minden egyes polipeptidnél változó. Ezen kívül az E. coli proteolitikus aktivitása nagy mértékben korlátozza bizonyos hasznos termékek kitermelését. Ezek és más megfontolások vezettek másfajta gazdaszervezetek iránti megnövekedett érdeklődéshez, főleg az eukariőta szervezetek polipeptid termékek előállítása céljára történő alkalmazása iránt. A polipeptid termékek eukariőta rendszerekben, pl. élesztőkben történő termeléséhez szükséges eszközök jelentős előnyöket jelentenek a prokarióta-rendszerek, mint pl. E. coli alkalmazásához viszonyítva a rekombináns DNS által kódolt polipeptidek előállításánál. Az élesztőket évszázadok óta alkalmazzák nagy léptékű fermentációkhoz, míg ezzel összehasonlítva az E. colifermentációk nagy léptékű fermentációi viszonylag nem régen jelentek meg. Az élesztők általában nagyobb sejtsűrűséggel nőnek mint a baktériumok, és könnyen adaptálhatók folyamatos fermentációs folyamatokhoz. Élesztők, mint a Pichia pastoris nagy sejtsűrűségű, azaz 100 g/1 sejtsűrűségen túli növesztését ismerteti Wagner a 4 414 329 lajstromszámú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban (bejelentő a Phillips Petroleum Co.). Az élesztő gazdaszervezetek további előnyei, hogy az organizmus több kritikus funkciója, pl. az oxidatív foszforilezés, organellumokon belül helyezkedik el, és ezáltal nincs kitéve azoknak az esetleges káros hatásoknak, amelyeket a vad típusú gazdasejtek számára idegen polipeptidnek az organizmus által végzett termelése okozhat. Az élesztők, lévén eukariőta organizmusok, képesek lehetnek a kifejezett polipeptid termékek glikozilezésére, ahol az ilyen glikozilezés fontos a polipeptid termék bioaktivitásához. Az is lehetséges, hogy eukariőta organizmusként az élesztők ugyanazokat a kodonokat részesítik előnyben, mint a magasabb rendű organizmusok, így az emlős génekből, vagy pl. az emlős mRNS-ből reverz transzkripcióval nyert komplementer DNS-ből (cDNS) származó kifejeződő termékek hatásosabb termelésére hajlamosak.
A szegényesen jellemzett élesztőfajták, mint gazda/vektor-rertdszerek elterjedését akadályozza a transzformálási körülmények és a megfelelő vektorok ismeretének hiánya. Ezen kívül auxotróf mutánsok gyakran nem állnak rendelkezésre, eleve kizárva a transzformánsok közvetlen szelekcióját auxotróf komplementációval. Ahhoz, hogy a rekombináns DNS-technológia teljes mértékben beváltsa ígéretét, új gazda/vektorrendszereket kell konstruálni, amelyek a DNS-manipulációt valamint a beiktatott DNS-szekvenciák optimális kifejeződését megkönnyítik úgy, hogy a kívánt polipeptid terméket szabályozott körülmények között és nagy kitermeléssel lehessen készíteni.
A jelen találmány kidolgozása során olyan DNSszekvenciákat fedeztünk fel, izoláltunk és jellemeztünk, amelyek a DNS átírását a hírvivő RNS-be és a hírvivő RNS transzlációját szabályozzák egy polipeptidet eredményezve. A jelen találmány szerint új DNSszekvenciák használhatók polipeptid termékek termeléséhez
a) olyan élesztősejtek által, amelyek képesek nőni metanolon, mint egyedüli szén- és energiaforcáson;
b) olyan élesztősejtek által, amelyek képesek nőni glükózon, etanolon, fruktózon és hasonlókon; és
c) olyan élesztősejtek által, amelyek képesek nőni glicerinen, galaktózon, acetáton és hasonlókon.
A következőkben az ábrák rövid ismertetését adjuk:
Az 1. ábra a p76 fehérje genom kiónja (pPG 6.10) (a) és cDNS kiónja (pPC 15.0) (b) közti hasonlítást mutatja.
A 2. ábra a p72 fehérje genom kiónja (pPG 4.0) (a) és cDNS kiónja (pPC 8.3) (b) (alkoholoxidáz), valamint a (pPC 8.0) rokon cDNS-klón (e) összehasonlítását mutatja.
A 3. ábra a p40 fehérje genom kiónja (pPG 4.8) (a) és cDNS kiónja (pPC 6.7) (b) összehasonlítását mutatja·
A 4. ábra a pPG 6.0 klón találmány szerinti szabályozóterülete restrikciós térképét (b), illetve a szerkezeti szekvenciákhoz tartozó térképet (a) mutatja.
Az 5. ábra a pPG 4.0 klón találmány szerinti szabályozóterülete restrikciós térképét mutatja.
A 6. ábra a pPG 4.8 klón találmány szerinti szabályozóterülete restrikciós térképét mutatja.
A 7. ábra a p76 strukturgén 3’ végéből nyert DNSszekvencia restrikciós térképe.
HU 205 627 Β
A 8. ábra a p72 (alkoholoxidáz) strukturgén 3’ végéből nyert DNS-szekvenciák restrikciós térképét mutatja. (a: 0,2 kb StuI-PvuII fragmens, b: 0, kb Stul— Hindül fragmens; c: 3,2 kb Sall-EcoRI fragmens).
A 9. ábra a p40 strukturgén 3’ végéből nyert DNSszekvencia restrikciós térképe.
A 10. ábra a p76 strukturgén és a hozzá tartozó 5’ szabályozóterűlet restrikciós térképe.
All. ábra a p40 fehérjestrukturgén és a hozzá tartozó 5‘ szabályozőterület restrikciós térképe.
A12. ábra a p76 fehérje cDNS restrikciós térképe.
A 13. ábra a p72 fehérje (alkoholoxidáz) cDNS restrikciós térképe.
A14. ábra a p40 fehérje cDNS restrikciós térképe.
A15. ábra a találmány szerinti két új p76 szabályozóterület lacZ DNS-konstrukció restrikciós térképét mutatja (a: pPG 6.0 5’ szabályozóterületéből származó 0,85 kbp HindüI-BamHI és E. coliból származó lacZgén; b: pPG 6.0 5’ szabályozóterületéből származó 1,3 kbp Hindlü-EcoRI és E. coliból származó lacZ-gén).
A 16. ábra egy találmányunk szerinti új p72 (alkoholoxidáz) szabályozóterület lacZ DNS-konstrukciő.
A17. ábra a pSAOH 1 plazmid restrikciós térképe.
A18. ábra a pSAOH 5 plazmid restrikciós térképe.
A19. ábra a pSAOH 10 plazmid restrikciós térképe.
A 20. ábra a pTAFH.85 plazmid restrikciós térképe.
A 21. ábra apT76H 1 plazmid restrikciós térképe.
A 22. ábra a pT76H 2 plazmid restrikciós térképe.
A 22 a) ábra a pT76H 3 plazmid restrikciós térképe.
A 22 b) ábra a p!76H 4 plazmid restrikciós térképe.
A 23. ábra a pYA2 plazmid restrikciós térképe.
A 24. ábra a pYA4 plazmid restrikciós térképe.
A 25. ábra a pYJ8 plazmid restrikciós térképe.
A 26. ábra a pYJ8 ACla plazmid restrikciós térképe.
A 27. ábra a pYJ30 plazmid restrikciós térképe.
A 28. ábra a pTAFH 1 plazmid restrikciós térképe, és mutatja, hogyan készült a plazmid.
A 29. ábra a pTAO 12 plazmid restrikciós térképe, és mutatja, hogyan készült a plazmid.
A 30. ábra a pTAO 13 plazmid restrikciós térképe.
A 30 a) ábra a pT76U 1 plazmid restrikciós térképe.
A 31. ábra a pTAO 1 plazmid restrikciós térképe, és mutatja, hogyan készült a plazmid.
A 32. ábra a pTAF.85 plazmid restrikciós térképe, és mutatja, hogyan készült a plazmid.
A 33. ábra az YEpl3 plazmid restrikciós térképét szolgáltatja.
A 34. ábra a pBPjl plazmid restrikciós térképe.
A találmány szerinti eljárásban alkalmazott restrikciós enzimeket a következőképpen rövidítjük:
A = Asuü
B = BamHI
B2 = BglII
Bc = Bell
C = Clal
H2 = HincII
H3 = Hindül
K = KpnI
Nd, = Ndel
Nr = Nrul
Ps = Psü
pVl = Pvul
Pv2 = PvuII
Ri = EcoRI
r5 = EcoRV
Rs = Rsal
S = Sáli
s3 = Sau3AI
Se = SacI
Sm = Smal
Sp = Sphl
Ss = SstI
St = Stul
T = Taql
Th = Thai
Xb — Xbal
Xh = Xhol
Xm - Xmal
Az ábrákon azokat a restrikciós helyeket, amelyeket a DNS-fragmensek manipulációja során alkalmazunk, de a ligálás során megszűnnek, zárójelbe tett rövidítéssel jelöltük.
A találmány tárgya tehát eljárás egy olyan új DNSfragmens előállítására, amely a következő feltételek legalább egyikére érzékeny szabályozóterületet tartalmaz: metanol jelenléte, szénforrás, amikor a sejtek metanoltól eltérő bizonyos szubsztrátumokon nőnek, és metanoltól eltérő nem katabolit represszáló szénforrások jelenléte. A találmány szerinti DNS-fragmens szabályozóterülete képes a hírvivő RNS átírásának szabályozására, amikor olyan DNS 5’ végénél van elhelyezve, amely a hírvivő RNS termelését kódolja. Találmányunk oltalmi körén belül vannak a fentebb leírt DNS-fragmensek mutánsai is.
A találmány szerinti eljárással előállított DNS-fragmens tartalmaz továbbá egy olyan szabályozóterületet, amely képes a poliadenilezésnek, az átírás befejezésének és a hírvivő RNS transzlációja befejezésének a szabályozására, amikor annak a polipeptid-kódoló területnek a 3’ végénél helyezkedik el, amely a hírvivő RNS termelését kódolja, ahol a hírvivő RNS átírását és transzlációját egy olyan szabályozóterület szabályozza, amely a következő feltételek legalább egyikére érzékeny: metanol jelenléte, szénforrás hiánya, amikor a sejtek metanoltól eltérő bizonyos szubsztrátumokon növekednek, és metanoltól eltérő nem katabolit represszáló szénforrások jelenléte. Találmányunk oltalmi körén belül vannak a fentebb leírt DNSfragmensek mutánsai is.
A találmány szerinti eljárás egy speciális kiviteli módja értelmében olyan DNS-fragmenseket állítunk elő, amelyek a kódolt polipeptidek peroxiszómákba történő beépítését irányítják. A peroxiszómák intracelluláris testecskék, amelyek nagy mennyiségben vannak jelen a metanolban nőtt élesztősejtekben. Ezek az intracelluláris testecskék arra szolgálnak, hogy a polipeptid terméket az intracelluláris folyadékokból, valamint az enzimekből, mint pl. a proteázokból izolálják.
A találmány szerinti eljárás egy másik kiviteli módja értelmében alkoholoxidáz, vagyis egy kb. 40 kilodalto4
HU 205 627 Β nos fehérje és egy 76 kilodaltonos fehérje termelését kódoló géneket állítunk elő.
A találmány szerinti eljárás egy további kiviteli módja értelmében a fentebb leírt DNS-fragmenseket tartalmazó plazmidokat és transzformált organizmusokat állítunk elő.
A találmány szerinti eljárással előállított plazmidokkal transzformált gazdasejteket tenyésztve olyan heterológ polipeptideket lehet előállítani, amelyek a gazdaszervezetben eredetileg nem voltak jelen.
Szabályozható gének izolálása Pichia pastorisból
Egy kb. 20 000 tagból álló cDNS-könyvtárat készítünk E. coliban poliA+ RNS-sel, amelyet metalon, mint egyedüli szénforráson nőtt Pichia pastoris-sejtekből izoláltunk (lásd III. példa). A könyvtárat hibridizálással átvizsgáljuk metanol vagy etanol jelenlétében nőtt Pichia pastorisból izolált, kinázzal kezelt poliA+ RNS-t alkalmazva. Több ilyen plusz-mínusz átvizsgálás után három elkülönült, nem homológ cDNS-klónt azonosítunk, mint a metanolra fajlagos hírvivő RNS-ek másolatait. Ezeket a kiónokat pPC 6.4 pPC 8.0 és pPC 15.0 jelzéssel látjuk el és meghatározzuk, hogy 470, 750, illetve 1100 nukleotid hosszúságú beiktatásokat tartalmaznak.
Egy kísérletben, hogy nagyobb hosszúságú cDNSklónokat nyerjünk, egy második cDNS-könyvtárat készítünk, enyhébb Sl-nukleázos emésztési körülményeket alkalmazva, mint amelyeket az első cDNS-könyvtár készítésénél alkalmaztunk, és ennek az új könyvtárnak a tagjait egyenként átvizsgáljuk 32P-vel jelzett pPC 6.4, pPC 8.0 és pPC 15.0 cDNS-klónokkal. Ennek eredményeképpen nagyobb cDNS-klónokat izolálunk, amelyek megfelelnek a pPC 6.4 és pPC 8.0 cDNS-klónoknak. A nagyobb pPC 6.7 és pPC 8.3 klónokról úgy találjuk, hogy 1200 illetve 2100 nukleotid méretű beiktatásokat tartalmaznak (lásd 2. és 3. ábra). Olyan cDNS-klónt, amely a pPC 15.0 1100 nukleotidjánál nagyobb beiktatással rendlekezett volna, nem figyeltünk meg több, mint 40 000 cDNS-klón átvizsgálásakor.
Ezen DNS-klónok mindegyikének megfelelő genomjából DNS-fragmensek izolálását úgy hajtjuk végre, hogy Picha pastoris restrikciós endonukleázzal kezelt kromoszomális DNS-fragmenseit, amelyek a 32Pvel jelzett pPC 15.0, pPC 8.0 vagy pPC 6.4-gyel hibridizálnak, kivágjuk és elektroelucióval kinyerjük az agaróz gélből. Ezután az elulált genomiális DNS-fragmenseket Escherichia coliba klónozzuk, és a megfelelő genomiális kiónokat azonosítjuk többször átvizsgálva a fenti cDNS-vizsgáló minták mindegyikével.
Az egyes cDNS-klónok és megfelelő genomiális kiónjaik kapcsolatát az 1., 2. és 3. ábrák ábrázolják. A pPC 15.0 egy 6000 nukleotidos HindlII genomiális fragmensen belül kódolódik, amely a pPG 6.0 kiónban van jelen (1. ábra). A pPC 15.0 által kódolt gén 5’ vége a pPG 6.0-ban levő 1300 bp-s HindlH-EcoRI fragmens felé irányul, míg a gén 3’ vége közvetlen közelségben van a pPG 6.0-ban levő PstI helyekhez.
A pPC 8.3 cDNS-klón a pPG 4.0 genomiális kiónba van belefoglalva (2. ábra). A pPG 4.0 tartalmazza a hatásos genomiális DNS 4000 nukleotidból álló EcoRI-PvuII beiktatását. A pPC 8.3 orientációja a pPG 4.0-n belül az ehhez a cDNS-klónhoz tartozó gén 5’ végét a BamHI helyek közelébe helyezi, míg ennek a génnek a 3’ vége a PvuII hely közelében helyezkedik el. A pPC 8.0 (egy rokon cDNS-klón) orientációja a pPG 4.0-n belül ennek a cDNS-klónnak az 5’ végét a pPG 4.0 3’ végénél levő KpnI hely közelébe helyezi, és a cDNS-klón 4’ vége a PvuII hely közelében van elhelyezve.
A pPC 6.7 cDNS-klón teljesen egy 4800 nukleotidot tartalmazó EcoRI-BamHI genomiális fragmensen belül helyezkedik el (lásd 3. ábra). A pPC 6.4 klón viszont teljesen a pPC 6.7 cDNS-klónon belül helyezkedik el. Mivel a pPC 6.7 egy sokkal teljesebb másolat, mint a pPC 6.4 az utóbbit nem vizsgáljuk tovább. A gén 5’ vége közelebb helyezkedik el a BamHI végéhez, mint a pPG 4.8 genomiális klón EcoRI végéhez (3. ábra).
Mindegyik fentebb leírt genomiális kiónokban legalább 1,2 kilobázispár szegélyező genom DNS-szekvencia van, amely a cDNS-klónok mindegyikében a másolt szerkezeti génekhez képest 5’ irányban helyezkedik el.
A fentebb leírt genomiális és cDNS-klónokat az Amerikai Egysük Államok Northern Régiónál Research Center intézetében (NRRL, Peoria, Illinois) E. coli gazdaszervezetekben helyeztük letétbe 1984. augusztus 31-én:
Plazmid Gazdaszervezet Letéti szám
pPG 6.0 E. coli LE392-pPG 6.0 NRRLB-15 867
pPg 4.0 E. coli LE392-pPG 4.0 NRRLB-15 868
pPg 4.8 E. coli LE392-pPG 4.8 NRRL B-15 869
pPC 15.0 E. coli LE392-pPG 15.0 NRRLB-15 870
pPC 8.3 E. coli LE392-pPC 8.3 NRRLB-15 871
pPC 6.7 E. coli LE392-pPC 6.7 NRRLB-15 872
pPC 8.0 E. coli LE392-pPC 8.0 NRRL B-15 873
A pPG 6.0, pPG 4.0 és pPG 4.8 egyedülálló volta metanolt asszimiláló élesztőkben A fentebb leírt cDNS-klónok mindegyikét jelezzük és egy sor metanolasszimiláló élesztőből és metanolt nem asszimiláló élesztőből nyert kromoszomális DNSszekvenciát vizsgáló mintáiként alkalmazzuk. A három cDNS mindegyikében homológ génekről úgy találjuk, hogy lényegében az összes metanolasszimiláló élesztőben léteznek, de teljesen világosan nincsenek jelen a metanolt nem asszimiláló élesztőkben (S. cerevisiae). Ezért úgy hisszük, hogy ezek a gének egyediek a metanolasszimiláló élesztőkben. Ezen túl a XVH. példában részletezett Southern hibridizálási kísérletek azt demonstrálják, hogy nagy mértékű homológia áll fenn a különböző metanolasszimiláló élesztőkből nyert, metanolra érzékeny egyedi gének között.
A pPG 6.0, pPG 4.0 és pPG 4.8 gének RNS-átiratainak jellemzése
A metanol befolyását megfigyelhetjük ezen klóno5
HU 205 627 Β zott gének mindegyikének kifejeződésére úgy, hogy ezeknek a géneknek az átírására gyakorolt hatásait tanulmányozzuk. Etanolon vagy metanolon, mint egyedi szénforráson nőtt Pichia pastoris-sejtekből izolált poliA+ RNS-t használunk, hogy Northern hibridizáló szűrők előállítására (lásd IV. példa) (-) készített három azonos szűrőpárt vizsgálunk át (Metanolon és etanolon nőtt sejtekről) (lásd I. példa), külön-külön 32P-vel jelzett pPC 15.0-val, pPC 8.0-val és pPC 6.4gyel. A pPC 15.0, pPC 8.0 és pPC 6.4 kiónok a metanolban nőtt sejtekből származó RNS-molekulákhoz (mintegy 2400,2300, illetve 1300 nukleotid hosszúságú) hibridizálódnak. A pPC 15.0 és pPC 8.0 kiónok hibridizálása nem figyelhető meg etanol jelenlétében nőtt sejtekből nyert RNS-sel készült hibridizáló vizsgáló mintákkal. Amikor azonban etanolon nőtt sejtekből izolált RNS-t vizsgálunk pPC 6.4-gyel, a klón hibridizálódik egy 1300 nukleotidos RNS-molekulához, amely azonos azzal, amelyet a metanolon nőtt sejtekkel látunk, de egy (minőségileg) becsült ötször alacsonyabb szinten.
A pPG 6.0, pPG 4.0 és pPG 4.8 által kódolt fehérjetermékek méretének meghatározása
Abból a célból, hogy meghatározzuk, milyen fehérjetermékeket kódolnak a fentebb azonosított cDNS-klőnok, metanolon nőtt Pichia pastoris-sejtekből nyert poliA+ RNS-t hibridizálunk szelektíven az egyes cDNS-klónokhoz. A hibridszelektált mRNS-t, vagyis azt az mRNS-t, amely az egyes cDNS-klőnokhoz hibridizálődik, azután in vitro transzlációban alkalmazzuk és minden egyes fehérjeterméket elektroforézissel kinyerünk, SDS-denaturálás feltételei között (lásd V. példa). Ezeknek az in vitro pozitív hibridizáló transzlációs kísérleteknek az eredményei azt jelzik, hogy a pPC 15.0, pPC 8.3 és pPC 6.7 kiónok szelektálják azokat az mRNS-eket, amelyek a 76 000 (p76), 72 000 (p72), illetve 40 000 (p40) dalton molekulatömegű polipeptidekhez szolgáló információkat kódolják. Ugyanezeket a fehérjéket figyeljük meg, amikor metanolon nőtt Pichia pastoris sejtekből nyert teljes poliA+ RNS-t (azaz nem hibridszelektált RNSt) vetünk alá transzlációnak ugyanabban az in vitro rendszerben.
A p72, mint alkoholoxidáz azonosítása
A) Molekulatömeg-összehasonlítás Alkoholoxidázban erősen dúsított mintát készítünk derített sejtlizátumok vízzel szemben végzett dialízisével (lásd VH példa). Az ebből a dialízisből nyert kristályos csapadékról SDS-elektroforézissel kimutatjuk, hogy zömmel két polipeptidet tartalmaz 76 000 illetve 72 000 dalton molekulatömeggel. A csapadékot további tisztításnak vetjük alá kromatográfiával Sephacryl 200-on (lásd VII. példa), ami azt demonstrálja, hogy az alkoholoxidáz-aktivitás megfelel a tisztított 72 000 dalton molekulatömegű polipeptid aktivitásának. Ennek a polípeptidnek a mérete azonos annak a fehérjeterméknek a méretével, amelyet a pPC 8.3 cDNS-klőnnal szelektálunk (lásd X. példa).
B) Immunkicsapás
Azt, hogy a pPC 8.3 és pPG 4.0 kiónok kódolják az alkoholoxidáz-strukturgént, immunológiai úton is igazoljuk (XI. példa). A Pichia pastorisból izolált, mind a 76 000, mind a 72 000 molekulatömegű polipeptidet tartalmazó fehérjekészítmény segítségével ezekre a polipeptidekre fajlagos antiszérumokat hozunk létre nyuIakban. Amikor a pPC 8.3 klónból nyert, hibridszelektált poliA+ RNS-t in vitro transzlációnak vetjük alá, csupán a 72 000 dalton molekulatömegu transzlációs termék csapódik ki a Pichia pastoris-sejtekből készült fehérjekészítmények elleni antiszérummal.
C) Jósoltlvalódi aminosav-szekvencia összehasonlítása
Annak további igazolására, hogy a pPC 8.3 klón valóban az a cDNS-klón, amely a Pichia pastorisalkoholoxidázt kódolja, a fehérje aminoterminális végéhez tartozó aminosav-szekvenciát összehasonlítjuk a pPC 8.3-mal kódolt jósolt aminosav-szekvenciával. így az izolált 72 000 dalton molekulatömegű fehérje NH2-terminális aminosav-szekvenciáját (A szekvencia) a következőnek határozzuk meg (VIH. példa): Ala-He-Pro-Glu-Glu-Phe-Asp-He-Leu-Val-Leu-GIyGly-Gly-Ser-Ser-Gly-Ser.
„A” szekvencia
Ezzel párhuzamosan meghatározzuk a pPC 8.3 és pPG 4.0-ban kódolt gének 5’ végének nukleotidszekvenciáját. A jósolt aminosav-szekvencia mind a genomiális, mind a cDNS-klónok DNS-szekvenciáiból származó 2-19 aminosavak esetén (lásd B szekvencia) tökéletesen egyezett a fentebb meghatározott, az izolált Pichia pastoris-alkoholoxidázhoz tartozó aminosavszekvencia (A szekvencia) első 18 aminosavával:
Jósolt aminosav-szekvencia:
Met Alá Ile Pro Glu Glu Phe
Nukleotid szekvencia
5' -ATG GCT ATC CCC GAA GAG TTT (pPC 8.3 és pPG 4.0)
3' -TAC CGA TAG GGG CTT CTC AAA
Asp Ile Leu Val Leu Gly Gly Gly Ser Ser Gly Ser GAT ATC CTA GTT CTA GGT GGT GGA TCC AGT GGA TCC-3' CTA TAS GAT CAA GAT CCA CCA CCT AGG TCA CCT AGG-115' „B” szekvencia
Ezen kívül meghatározzuk az alkoholoxidáz génkódoló területéhez tartozó teljes nukleotidszekvenciát. A meghatározott nukleotidszekvenciát és a jósolt aminosav-szekvencia a kővetkező: Jósolt aminosav-szekvencia: Met Alá Ile Pro Glu Glu Phe
Nukleotidszekvencia:
5' -ATG GCT ATC CCC GAA GAG TTT (pPC 8.3 és pPG 4.0)
3' -TAC CGA TAG GGG CTT CTC AAA
Asp Ile Leu Val Leu Gly Gly Gly Ser Ser Gly Ser GAT ATC CTA GTT CTA GGT GGT GGA TTC AGT GGA TCC
CTA TAG GAT CAA GAT CCA CCA CCT AGG TCA CCT AGG
Cys Ile Ser Gly Arg Leu Alá Asn Leu Asp His Ser TGT ATT TCC GGA AGA TTG GCA AAC TTG GAC CAC TCC
ACA TAA AGG CCT TCT AAC CGT TTG AAC CTG GTG AGG
HU
Leu Lys Val Gly Leu Ile Glu Alá Gly Glu Asn Gin TTG AAA GTT GGT CTT ATC GAA GCA GGT GAG AAC CAA AAC TTT CAA CCA GAA TAG CTT CGT CCA CTC TTG GTT
Pro Gin Gin Pro Met Gly Leu Pro Ser Arg Tyr Leu
CCT CAA CAA CCC ATG GGT CTA CCT TCC AGG TAT TTA
GGA GTT GTT GGG TAC CCA GAT GGA AGG TCC ATA AAT
Pro Lys Lys Gin Lys Leu Asp Ser Lys Thr Alá Ser
CCC AAG AAA CAG AAG TTG GAC TTC AAG ACT GCT TCC
GGG TTC TTT GTC TTC AAC CTG AGG TTC TGA CGA AGG
Phe Tyr Thr Ser Asn Pro Ser Pro His Leu Asn Gly
TTC TAC ACT TCT AAC CCA TCT CCT CAC TTG AAT GGT
AAG ATG TGA AGA TTG GGT AGA GGA GTG AAC TTA CCA
Arg Arg Alá Ile Val Pro Cys Alá Asn Val Leu Gly
AGA AGA GCC ATC GTT CCA TGT GCT AAC GTC TTG GGT
TCT TCT CGG TAG CAA GGT ACA CGA TTG CAG AAC CCA
Gly Gly Ser Ser Ile Asn Phe Met Met Tyr Thr Arg
GGT GGT TCT TCT ATC AAC TTC ATG ATG TAC ACC AGA
CCA CCA AGA AGA TAG TTG AAG TAC TAC ATG TGG TCT
Gly Ser Alá Ser Asp Ser Asp Asp ? Gin Alá Glu
GGT TCT GCT TCT GAT TCT GAT GAC TTN CAA GCC GAG
CCA AGA CGA AGA CTA AGA CTA CTG AAN GTT CGG CTC
Gly Ser Lys Thr Glu Asp Leu Leu Pro Leu Met Lys
GGC TCG AAA ACA GAG GAC TTG CTT CCA TTG ATG AAA
CCG AGC TTT TGT CTC CTG AAC GAA GGT AAC TAC TTT
Lys Thr Glu Thr Tyr Gin Arg Alá ? Gin ? Tyr
AAG ACT GAG ACC TAC CAA AGA GCT TGN CAA CNA TAC
TTC TGA CTC TGG ATG GTT TCT CGA ACN GTT GNT ATG
Pro Asp Ile His Gly Phe Glu Gly Pro Ile Lys Val
CCT GAC ATT CAC GGT TTC GAA GGT CCA ATC AAG GTT
GGA CTG TAA GTG CCA AAG CTT CCA GGT TAG TTC CAA
Ser Phe Gly Asn Tyr Thr Tyr Pro Val Cys Gin Asp
TCT TTC GGT AAC TAC ACC TAC CCA GTT TGC CAG GAC
AGA AAG CCA TTG ATG TGG ATG GGT CAA ACG GTC CTG
Phe Leu Arg Alá Ser Glu Ser Gin Gly Ile Pro Tyr
TTC TTG AGG GCT TCT GAG TCC CAA GGT ATT CCA TAC
AAG AAC TCC CGA AGA CTC AGG GTT CCA TAA CGT ATG
Val Asp Asp Leu Glu Asp Leu Val Leu Thr His Gly
GTT GAC GAT CTG GAA GAC TTG GTA CTG ACT CAC GGT
CAA CTG CTA GAC CTT CTG AAC CAT GAC TGA GTG CCA
Alá Glu His Trp Leu Lys Trp Ile Asn Arg Asp Thr
GCT GAA CAC TGG TTG AAG TGG ATC AAC AGA GAC ACT
CGA CTT GTG ACC AAC TTC ACC TAG TTC TCT CTG TGA
Gly Arg Arg Ser Asp Ser Alá His Alá Phe Val His
CGT CGT TCC GAC TCT GCT CAT GCA TTT GTC CAC TCT
GCA GCA AGG CTG AGA CGA GTA CGT AAA CAG GTG AGA
Ser Thr Met Arg Asn His Asp Asn Leu Tyr Leu Ile
TCT ACT ATG AGA AAC CAC GAC AAC TTG TAC TTG ATG
AGA TGA TAC TCT TTG GTG CTG TTG AAC ATG AAC TAG
Cys Asn Thr Lys Val Asp Lys Ile Ile Val Glu Asp
TGT AAC ACG AAG GTC GAC AAA ATT ATT GTC GAA GAC
ACA TTG TGC TTC CAG CTG TTT TAA TAA CAG CTT CTG
Gly Arg Alá Alá Alá Val Arg Thr Val Pro Ser Lys
GGA AGA GCT GCT GCT GTT AGA ACC GTT CCA AGC AAG
CCT TCT CGA CGA CGA CAA TCT TGG CAA GGT TCG TTC
Pro Leu Asn Pro Lys Lys Pro Ser Hiy Lys Ile Tyr
CCT TTG AAC CCA AAG AAG CCA AGT CAC AAG ATC TAC
GCA AAC TTG GGT TTC TTC GGT TCA GTG TTC TAG ATG
Arg Alá Arg Lys Gin Ile Phe Leu Ser Cys Gly Thr
CGT GCT AGA AAG CAA ATC TTT TTG TCT TGT GGT ACC
GCA CGA TCT TTC GTT TAG AAA AAC AGA ACA CCA TGG
627 B
Ile Ser Ser Pro Leu Val Leu Glu Arg Ser Gly Phe
ATC TCC TCT CCA TTG GTT TTG CAA AGA TCC GGT TTT
TAG AGG AGA GGT AAC CAA AAC GTT TCT AGG CCA AAA
Gly Asp Pro Ile Lys Leu Arg Alá Alá Gly Val Lys
GGT GAC CCA ATC AAG TTG AGA GCC GCT GGT GTT AAG
CCA CTG GGT TAG TTC AAC TCT CGG CGA CCA CAA TTC
Pro Leu Val Asn Leu Pro Gly Val Gly Arg Asn Phe
CCT TTG GTC AAC TTG CCA GGT GTC GGA AGA AAC TTC
GGA AAC CAG TTG AAC GGT CCA CAG CCT TCT TTG AAG
Gly Asp His Thr Lys Ile Pro Pro Gly Lys Tyr Met
GGT GAC CAC ACC AAG ATT CCT CCT GGA AAG TAC ATG
CCA CTG GTG TGG TTC TAA GGA GGA CCT TTC ATG TAC
Thr Met Phe His Phe Leu Glu Tyr Pro Phe Ser Arg
ACT ATG TTC CAC TTC TTG GAA TAC CCA TTC TCC AGA
TGA TAC AAG GTG AAG AAC CTT ATG GGT AAG AGG TCT
Gly Ser Ile His Ile Thr Ser Pro Asp Pro Tyr Alá
CGT TCC ATT CAC ATT ACC TCC CCA GAC CCA TAC GCA
CCA AGG TAA GTG TAA TGG AGG GGT CTG GGT ATG CGT
Alá Pro Asp Phe Asp Arg Gly Phe Met Asn Asp Glu
GCT CCA GAC TTC GAC CGA GGT TTC ATG AAC GAT GAA
CGA GGT CTG AAG CTG GCT CCA AAG TAC TTG CTA CTT
Arg Asp Met Alá Pro Met Val Trp Alá Tyr Lys Ser
AGA GAC ATG GCT CCT ATG GTT TGG GCT TAC AAG TCT
TCT CTG TAC CGA GGA TAC CAA ACC CGA ATG TTC AGA
Ser Arg Glu Thr Alá Arg Arg Ser Asp His Phe Alá
TCT AGA GAA ACC GCT AGA AGA AGT GAC CAG TTT GCC
AGA TCT CTT TGG CGA TCT TCT TCA CTG GTG AAA CGG
Gly Glu Val Thr Ser His His Pro Leu Phe Pro Tyr
GGT GAG GTC ACT TCT CAC CAC CCT CTG TTC CCA TAC
CCA CTC CAG TGA AGA GTG GTG GGA GAC AAG GGT ATG
Ser Ser Glu Alá Arg Alá Leu Glu Met Asp Leu Glu
TCA TCC GAG GCC AGA GCC TTG GAA ATG GAT TTG GAG
AGT AGG CTC CGG TCT CGG AAC CTT TAC CTA AAC CTC
Thr Ser Asn Alá Tyr Gly Gly Pro Leu Asn Leu Ser
ACC TCT AAT GCC TAC GGT GGA CCT TTG AAC TTG TCT
TGG AGA TTA CGG ATG CCA CCT GGA AAC TTG AAC AGA
Alá Gly Leu Alá His Gly Ser Trp Thr Gin Pro Leu
GCT GGT CTT GCT CAC GGT TCT TGG ACT CAA CCT TTG
CGA CCA GAA CGA GTG CCA AGA ACC TGA GTT GGA AAC
Lys Lys Pro Thr Alá Lys Asn Glu Gly His Val Thr
AAG AAG CCA ACT GCA AAG AAC GAA GGC CAC GIT ACT
TTC TTC GGT TGA CGT TTC TTG CTT CCG GTG CAA TGA
Ser Asn Gin Val Glu Leu His Pro Asp Ile Glu Tyr
TCG AAC CAG GTC GAG CTT CAT CCA GAC ATC GAG TAC
AGC TTG GTC CAG CTC GAA GTA GGT CTG TAG CTC ATG
Asp Glu Glu Asp Asp Lys Alá Ile Glu Asn Tyr Ile
GAT GAG GAG GAT GAC AAG GCC ATT GAG ACC TAC ATT
CTA CTC CTC CTA CTG TTC CGG TAA CTC TTG ATG TAA
Arg Glu His Thr Glu Thr Thr Trp His Cys Leu Gly
CGT GAG CAC ACT GAG ACC ACA TGG CAC TGT CTG GGA
GCA CTC GTG TGA CTC TGG TGT ACC GTG ACA CCA GGT
Thr Cys Ser Ile Gly Pro Arg Glu Gly Ser Lys Ile
ACC TGT TCC ATC GGT CCA AGA GAA GGT TCC AAG ATC
TGG ACA AGG TAG CCA GGT TCT CTT CCA AGG TTC TAG
Val Lys Trp Gly Gly Val Leu Asp His Arg Ser Asn
GTC AAA TGG GGT GTT GTT TIG GAC CAC AGA TCC AAC
CAG TTT ACC CCA CAA CAA AAC CTG GTG TCT AGG TTG
Val Tyr Gly Val Lys Gly Leu Lys Val Gly Asp Leu
GTT TAC GGA GTC AAG GGC TIG AAG GTT GGT GAC TTG
CAA ATG CCT CAG TTC CCG AAC TTC CAA CCA CTG AAC
HU 205 627 Β
Ser Val Cys Pro Asp Asn Val Gly Cys Asn Thr Tyr TCC GTG TGC CCA GAC AAT GTT GGT TGT AAC ACC TAC AGG CAC ACG GGT CTG TTA CAA CCA ACA TTG TGG ATG
Thr Thr Alá Leu Leu Ile Gly Glu Lys Thr Alá Thr ACC ACC GCT CTT TTG ATC GGT GAA AAG ACT GCC ACT TGG TGG CGA GAA AAC TAG CCA CTT TTC TGA CGG TGA
Leu Val Gly Glu Asp Leu Gly Tyr Ser Gly Glu Alá TTG GTT GGA GAA CAT TTA GGA TAC TCT GGT GAG GCC AAC CAA CCT CTT CTA AAT CCT ATG AGA CCA CTC CGG
Leu Asp Met Thr Val Pro Gin Phe Lys Leu Gly Thr TTA GAC ATG ACT GTT CCT CAG TTC AAG TTG GGC ACT AAT CTG TAC TGA CAA GGA GTC AAG TTC AAC CCG TGA
Tyr Glu Lys Thr Gly Leu Alá Arg Phe Stop
TAC GAG AAG ACC GGT CTT GCT AGA TTC TAA-3'
ATG CTC TTC TGG CCA GAA CGA TCT AAG ATT-5'
B’ szekvencia
A fenti nukleotidszekvencia összehasonlítása a Hansenula polymorphából nyert, korábban leírt alkoholoxidáz Ledeboer és munkatársai által publikált nukleotidszekvenciájával számos jelentős különbséget tár fel, beleértve a jósolt aminosav-szekvenciát, a gén (és az ennek eredményeként létrejött fehérje) aktuális méretét, a kodoneltolódási hajlamát és hasonlókat.
A p76, mint dihidroxi-aceton szintetáz azonosítása
A p76 gén első 51 nukleotidjához a nukleotídszekvenciát meghatározzuk standard technikákkal. Ebből a szekvenciából a p76 fehérje aminoterminális végének aminosavszekvenciáját meg lehet jósolni:
Aminosav-szekvencia: Met Alá Arg Ile Pro Lys
Nukleotidszekvencia:
5' -ATG GCT AGA ATT CCA AAA
3' -TAC CGA TCT TAA GGT TTT
Pro Val Ser Thr Gin Asp Asp Ile His Gly Leu
CCA GTA TCG ACA CAA GAT GAC ATT CAT GAA TTG-3'
GGT CAT AGC TGT GTT CTA CTG TAA GTA CTT AAC-5'
A p76-nak ezt a megjósolt aminosavszekvenciáját össze lehet hasonlítani a Hansenula polymorphából nyert dihidroxi-aceton-szintetáz (DHAS) fehérje már publikált aminosav-szekvenciájával (Manowi és munkatársai). Bár a két szekvenciában számos különbség látható, vannak hasonlóságok is a két fehérje között, amelyet fel lehet ismerni:
PichiaDHAS:
Met-Ala- -Arg-Ile-Pro-Lys-ProHansenula DHAS:
Met-Ser-Met-Arg-Ile-Pro-Lys -AlaVal-Ser-Thr-Gln-Asp-Ile-His-Glu- -Leu.Ala-Ser-Val-Asn-Asp-Glu-Gln-His-Gln-Axg-IleA Pichia p76 és Hansenula DHAS jelentős mértékű homológiájára és a hasonló fehérjemérete (kb. 76 000 dalton) alapozva a p76-ot próbaképpen azonosíthatjuk a Pichia DHAS-ének.
Mint a fentebb az alkoholoxidáz-génnél, a Pichia DHAS-fehérje első 51 nukleotidja nukleotidszekvenciájának összehasonlítása a Hansenula DHAS már korábban publikált (Janowicz és munkatársai) nukleotidszekvenciájával számos különbséget sugall a kodoneltolódási hajlamban, a jósolt aminosav-szekvecíában, a gén teljes méretében stb.
Szabályozható promotorokat tartalmazó DNS-fragmensek Pichia pastorisból
A találmány szerinti eljárással előállított 5’ szabályozóterületeket részletezzük a 4., 5. és 6. ábrákon bemutatott restrikciós térképeken. Az 5’ szabályozóterület, amely a p76 polipeptid kifejeződését szabályozza, a 4a) ábrában ábrázolt DNS-ffagmensen belül helyezkedik el. A mintegy 2,9 kilobázispáros HindHlΎ/ζοΙ-fragmensről világosan kimutattuk, hogy tartalmazza a szabályozóterületet, amint ezt az alábbiakban teljesebben részletezzük.
Mivel a pPC 15.0 cDNS-klón nem teljes cDNS-kópia, a legvalószínűbb, hogy a 4a) ábrában ábrázolt DNS-fragmens legalább egy részlete magában foglalja a p76 polipeptidhez szolgáló szerkezeti kódoló szekvenciákat. így a szabályozófunkcióról úgy véljük, hogy a 4b) ábrában bemutatott mintegy 1300 bázispáros Hindlü-EcoRI-fragmensben van jelen. Az új β-galaktozidáz-gént tartalmazó szerkezetek, amelyeket a későbbiekben részletesebben tárgyalunk, alátámasztják ezt a véleményt.
Az 5’ szabályozóterület, amely a p72 polipeptid (alkoholoxidáz) kifejeződését szabályozza, az 5. ábrában ábrázolt, mintegy 2000 bázispáros EcoRI-EcoRV DNS-fragmensen belül helyezkedik el. Az alább ismertetendő új β-galaktozidáz-gént tartalmazó szerkezetek demonstrálják ennek a DNS-fragmensnek a szabályozható természetét.
A 6. ábra a mintegy 3 kilobázispáros BamHI-Sall DNS-fragmens restrikciós térképét mutatja, amely fragmens magában foglalja a p40 polipeptid termelését szabályozó 5’ szabályozóterületet. Ez a fragmens világosan megkülönböztethető a 4. és 5. ábrákon részletezett 5’ szabályozóterületektől, többek között a DNSfragmensen belül elhelyezkedő eltérő restrikciós helyek alapján.
A10., 2a) és 11, ábrák a p76, p72 (alkoholoxidáz), illetve p40 polipeptidekhez szolgáló szabályozóterületekhez és strukturgénekhez tartozó restrikciós enzimes adatokat mutatják. Ezen belül a 10. ábra a Pichia pastoris genomiális DNS 3,8 kilobázispáros HindHI-PríI-fragmensének részleteit mutatja, amely a p76 polipeptid termelését szabályozza és kódolja. A 2a) ábra a Pichia pastoris genomiális DNS 4,0 kilobázispáros EcoRI-PvuH-fragmensét mutatja, amely a p72 (alkoholoxidáz) polipeptid termelését szabályozza és kódolja. A II. ábra a Pichia pastoris genom DNS 3,7 kilobázispáros BamHI-EcoRIfragmensét mutatja be, amely a p4ű polipeptid termelését szabályozza és kódolja.
A pPG 6.0, pPG 4.0 és pPG 4.8 genomiális kiónokat szintén lehet jellemezni restrikciós térképezéssel. így a pPG 6.0 kiónt az la) ábra részletezi. A tájékozódás egyik pontjaként a DNS-fragmens 5’ végét véljük a kiindulásnak G,origin”). A pPG 6.0 a Pichia pastoris kromoszomális DNS HindlII-fragmense, amely hoszszát tekintve mintegy 6 kilobázispár, és a következő különböző restrikciós enzimekkel hasad el:
HU 205 627 Β
Restrikciós enzim Hasítási helyek Távolság a kiindulástól (origin) bp
HincII 5 1070,1740,1890,3320, 5520
EcoRI 2 1300,3450
Xho 1 2860
PstI 2. 3820,4200
PvuII 1 4120
Pvul 1 4950
A pPg 4.0 kiónt részletesen a 2a) ábra mutatja be. A klón a kromoszomális DNS egy EcoRI-HindlII-fragmense, amely mintegy 4 kilobázispár hosszúságú. A klón 5’ végét tekintve kiindulásnak („origin”), a következő restrikciós adatokat nyerjük pPG 4.0-hoz:
Restrikciós enzim Hasítási helyek Távolság a kiindulástól (Origin) bp
Hindin 3 400, 600,1840
PstI 1 8500
BamHI 2 1960,1970
Sáli 1 2620
BglII 2 1040,2700
KpnI 2 500, 2730
Xbal 1 3330
Stul 1 3880
Ndel 1 420
Hindi 2 870,2430
SstI 1 1200
Bell 2 1710, 4080
AsuH 2 1900,2300
EcoRv 1 1930
PvuH 1 4120
A pPG 4.8 kiónt részletesen a 3a) ábrán ábrázoljuk. A klón Pichia pastoris kromoszomális DNS 4,8 kilobázispáros BamHI-EcoRI-fragmense, amely a következő további restrikciós helyekkel rendelkezik:
Restrikciós enzim Hasítási helyek Távolság a kiindulástól (origin) bp
Clal 1 410
KpnI 3 500, 3890,4280
Pvul 1 1120
Sáli 1 2900
PvuH 1 4135
EcoRV 2 3690, 3890
BglII 1 4500
Xmal 1 4800
A pPG 6.0, pPG 4.0 és pPG 4.8 genomiális kiónokat a pBR322 E. coli-plazmidon levő egyedi restrikciós helyekbe való beiktatással manipuláljuk. A pPG 6.0 kiónt, amely HindlII-fragmens, egyszerűen klónozzuk a pBR322 HindlII helyére. A pPG 4.0 kiónt a pBR322 EcoRI-PvuU helyeire klónozzuk, és a pPG 4.8-at a pBR322 EcoRI-BamHI helyeire klónozzuk (lásd VI. példa). Az ezekkel a plazmidokkal transzformált E. coli-törzseket a Northern Régiónál Research Center (NRRL) intézetben a következő számokon helyeztük letétbe:
Genom osztály Laboratóriumi elnevezés Deponálást szám
pPG 6.0 LE392-pPG 6.0 NRRL B-15 867
pPG 4.0 LE392-pPG 4.0 NRRL B-15 868
pPG 4.8 LE392-pPG 4.8 NRRL B-15 869
A 7., 8. és 9. ábrák a p76, p72 (alkoholoxidáz), illetve p40 polípeptidek 3’ szabályozóterületeihez tartozó restrikciós térkép adatait mutatja. A 3’ szabályozószakaszok hasznosak a poliadenilezés, az átírás leállítása és a hírvivő RNS transzlációjának megállítása szabályozásában, amely RNS-t a megelőző nukleotidszekvenciák kódolnak. így a p76 polipeptid génjéből származó 3’ szabályozószakasz, amely a 7. ábrán bemutatott, 2,7 kilobázispár EcoRI-HindlII-fragmens, hasznos a poliadenilezés, valamint az átírás megállítása és a p76 polipeptidet kódoló mRNS transzlációjának megállítása szabályozásában, vagy bármilyen más mRNS szabályozásában, amely a 3’ szabályozóterülettől „felfelé” beiktatott génből származik. A 8a) ábrán részletezett, p72 génből származó 0,2 kilobázispár StuI-PvuII-fragmens, a 8b) ábrán részletezett, p72 génből származó 0,3 kilobázispár StuI-HindlII-fragmens, p72 génből származó, 3,2 kilobázispár Sall-EcoRI-fragmens, és a 9. ábrán részletezett, p40 génből származó, 1,9 kilobázispár Sáli— EcoRI-fragmens hasonlóképpen hasznosíthatók mind azokra a strukturgénekre vonatkozóan, amelyekkel ezek össze vannak kapcsolva a vad típusú Pichia pastorisban, mint bármilyen idegen (azaz heterológ) génekre vonatkozóan, amelyeket be lehet iktatni ezektől a 3’ szabályozóterületektől „felfelé”.
Mivel az alkoholoxidáz-gén a pPG 4.0-ban az AO gén átírás-megállítási helytől néhány száz bázispáron belül van, a 8c ábrán részletezett további 3’ szekvenciát nyerünk a következő módon. Az első lépésben a Pichia kromoszomális DNS-t EcoRI-gyel és Sall-gyel emésztjük és az emésztett DNS-t hibridizáljuk az AO génből származó, 2,0 kilobázispár 32P-vel jelzett BamHIHindlII-fragmenssel, Southern foltképző módszer segítségével. A Pichia EcoRI-Sall emésztett fragmensei között, amelyek hibridizálódnak az AO gén vizsgálómintával, van egy 3,2 kilobázispár fragmens, amely kódolja az AO gén 3’ részét és a gén 3’ terminálisát szegélyező szekvenciákat.
Az AO gén 3’ fragmensét azután klónozzuk úgy, hogy a mintegy 3,2 kbp-s, EcoRI-Sall hasított Pichia DNS-fragmenseket gélelucióval kinyerjük, és a fragmenseket EcoRI-el és Sall-el emésztett pBR322-be iktatjuk. Végül egy rekombináns plazmidot, a pPG
3.2- t, amely tartalmazza az AO gén 3’ fragmensét, telephibridizálással azonosítunk, vizsgáló mintaként jelzett AO génfragmenst alkalmazva. Egy pPG 3.2 plazmiddal tamszformált E. coli törzset deponáltunk a Northern Régiónál Research Center intézetnél (Peoria, Illinois) NRRL B-15 999 számon. A 8c) ábra a pPG
3.2- ből származó Pichia DNS-fragmens restrikciós endonukleáz hasítási helyének térképét mutatja. A fragmens az AO 3’ részét (Sall-töl HindHI-ig) kódoló 1,5
HU 205 627 Β kbp-t és az AO gén 3’ szekvenciájának mintegy 1,7 kbp-át tartalmazza.
A cDNS-klónok jellemzése
APichiapastorisból származó szabályozható génekhez tartozó cDNS-klónokat szintén jellemeztük restrikciós térképezéssel. A 12. ábrán a p76 cDNS-t egy 1,1 kilobázispár fragmenst részletezzük. A DNS-szekvencia 5’ végére, mint kiindulásra („origin”) vonatkoztatva az Xhol restrikciós enzim a p76 cDNS-t mintegy 500 bázispár távolságra hasítja, a HincH a kiindulástól mintegy 950 bázispár távolságra hasít és az EcoRI a p76 cDNS-t a kiindulástól számítva mintegy 10501100 bázispár távolságra hasítja. A 12. ábrán bemutatott cDNS-klón, valamint a 13. és 14. ábrán bemutatott cDNS-klónok mind PstI végekkel vannak bemutatva. Ezek mesterségesen megalkotott restrikciós helyek, az eredetileg nyert kompIementer-DNS G-C farokképzésével előállítva, hogy megkönnyítsük a DNS-fragmensek klónozását pBR322-be. Northern hibridizálási tanulmányokra és a polipeptid termék méretére alapítva úgy becsülhető, hogy a pPC 15.0 cDNS-klón a p76 mRNS nem tökéletes másolata, amely csupán a teljes hírvivő RNS-szekvencia mintegy felét képviseli.
A 13. ábrán a p72 (alkoholoxidáz) cDNS összetett restrikciós térképét mutatjuk be, amely a pPC 8.3 és pPC 8.0 klónok átfedésével van megalkotva. Akárcsak fentebb, a DNS-szekvencia 5’ végét tekintjük kiindulásnak („origin”). így az alkoholoxidáz cDNS kezelése különböző restrikciós enzimekkel a következő méretű fragmenseket adja:
Restrikciós enzim Hasítási helyek Távolság a kiindulástól (origin) bp
AsuH 2 20,420
EcoRV 1 50
BamHI 2 80,90
HincH 1 550
Sáli 1 820
BglII 1 820
KpnI 1 850
Xbal 1 1450
Rsal 1 1760
Stul 1 2000
ApPC 8.0 és pPC 8.3 kiónokban az alkoholoxidázgén 3’ végének restrikciós enzim térképezése feltárja, hogy a pPC 8.3 cDNS-klőnnak hiányzik mintegy 250 nukleotidja az alkoholoxidáz mRNS-szekvencíáből (2. ábra). Az alkoholoxidáz mRNS 3’ végénél jelen lévő szekvenciák jelen vannak a pPC 8.0 cDNS-klónban, amely átfedi a pPC 8.3-at mintegy 500 nukleotiddal.
A 14. ábra a p40 polipeptid cDNS-hez, egy 1,2 kilobázispár fragmenshez szolgáló restrikciós térképet nyújt. A cDNS-klón 5’ végét tekintve kiindulásnak (origin), a pPC 6.7 kiónt a Sáli (és a HincII) az origintől mintegy 1000 báispárral hasítja.
A cDNS-fragmensek mindegyikét pBR322-be klónozzuk, amelyet azután E. coliba transzformálunk. A transzformáit törzseket deponáltuk a Northern Régiónál Research Center Intézetnél (Peoria, Illinois) a következő számokon:
cDNS-klón Laboratóriumi elemzés Deponálási szám
pPC 15.0 pPC 8.3 pPC 8.0 pPC 6.7 LE392.pPC 15.0 LE392-pPC 8.3 MM294_pPC8.0 LE392-pPC 6.7 NRRL B-15 870 NRRL B-15 871 NRRL B-15 873 NRRL B-15 872
A fentebb leírt cDNS-klónok mindegyike hasznos vizsgáló mintaként a metanolon, mint egyedüli szén- és energiaforráson növekedő élesztő egyedi polipeptidjeinek termelését kódoló kromoszomális DNS azonosításához és izolálásához. Ezért, mint korábban leírtuk, ezeket a kiónokat alkalmazzuk olyan Pichia pastoris kromoszomális DNS-fragmensek azonosítására, amelyek olyan egyedi polipeptidekre vonatkozó szabályozóterületeket és szerkezeti kódoló információkat tartalmaznak, amely polipeptideket akkor észleljük, amikor a Pichia pastoris metanolon nő. Hasonló módon ezek a cDNS-klónok hasznosíthatók vizsgáló mintaként más metanolasszimiláló élesztőkből származó analóg gének azonosításához és kinyeréséhez is, ilyenek lehetnek pl. a Torulopsis molischiana, Hansenula capsulatum, H. nonfermentans és hasonlók (lásd XVII. példa).
Az alkoholoxidáz gén részletes elemzése
A pPG 4.0 klón 5’ szabályozőterületét tovább jellemezzük a klón nukleotidszekvenciájánakmeghatározásával attól a ponttól „felfelé” (5’ felé), ahol a p72 (alkoholoxidáz) szerkezeti információja kódolődik. Az mRNS transzlációs starthely (ATG kodon) előtti első 250 nukleotidról úgy véljük, hogy a következő:
5'-ATGCTTCCAA GATTCTGGTG GGAATACIGC TGATAGCCTA
ACGTTCATGA TCAAAATTTA ACTGTTCTAA CCCCTACTTG
GACAGGCAAT ATATAAACAG AAGGAAGCTG CCCTGTCTTA
AACCTTTTTT TTTATCATCA TTATTAGCTT ACTTTCATAA
TTGCGACTGG TTCCAATTGA CAAGCTTTTG ATTTTAACGA
CTTTTAACGA CAACTTGAGA AGATCAAAAA ACAACTAATT ATTCGAAACG-3'.
C szekvencia
A pPG 4.0 klón promotor funkciójáról úgy véljük, hogy a nukleotidbázisoknak ezen a szekvenciáján belül található meg.
Abból a célból, hogy még teljesebben leírhassuk ezt az új DNS-fragmenst, további 301 nukleotidot határoztunk meg a fenti C szekvenciában részletezett szekvenciától tovább „felfelé”.
így az mRNS transzlációs starthely előtti első 551 nukleotidról úgy véljük, hogy a következők:
5' -AATGGCCAAAA CTGACAGTTT AAACGCTGTC TTGGAACCTA
ATATGACAAA AGCGTGATCT CATCCAAGAT GAACTAAGTT
TGGTTCGTTG AAATTCTAAC GGCCAGTTGG GAACTAAGTT
ACTTCCAAAA GTCGCCATAC CGTTTGTCTT GTTTGGTATI
GATTGACGAA TGCTCAAAAA TAATCTCATT AATGCTTAGC
GCAGTCTCTC TATCGCTTCT GAACCCGGTG GCACCTGTGC
HU 205 627 Β
CGAAACGCAA ATGGGGAAAC AACCCGCTTT TTGGATGATT
ATGCATTGTC CTCCACATTGT ATGCTTCCAA GATTCTGGTG
GGAATACTGC TGATAGCCTA ACGTTCATGA TCAAAATTTA
ACTGTTCTAA CCCCTACTTG GACAGGCAAT ATATAAACAG
AAGGAAGCTG CCCTGTCTTA AACCTTTTTT TTTATCATCA
TTATTAGCTT ACTTTCATAA TTGCGACTGG TTCCAATTGA
CAAGCTTTTG ATTTTAACGA CTTTTAACGA CAACTTGAGA AGATCAAAAA ACAACTAATT ATTCGAAACG-3'
D szekvencia
A D szekvenciában található további nukleotidokról (a C szekvenciával összhasonlítva) úgy hisszük, hogy a C szekvencián belül található promotomak további szabályozófunkciót nyújt ismeretlen mechanizmus útján. Látható, hogy a D szekvencia a XIV. és XV. példákban bemutatott élesztőkben a génkifejeződés szabályozására képes 1,1 kbp-os DNS-fragmensnek csupán DNS-szekvencia részletét képviseli. Lehet, hogy a további szabályozófunkciók a D szekvenciában nem részletezett 1,1 kbp-os DNS-fragmens részében kódolódnak.
Abból a célból, hogy tovább leírjuk ezt az új 1,1 kbp-os DNS-fragmenst, további nukleotidszekvenciaelemzést végeztünk, hogy teljesen körvonalazzuk a XIV. és XV. példában bemutatott teljes 1,1 kbp-os DNS-fragmenst, amely képes a génkifejeződést szabályozni élesztőben. A nukleotidszekvenciát mint D’ szekvenciát ábrázoljuk:
5' -AGATCTAA CATCCAAAGA
CGAAAGGTTG AATGAAACCT TTTTGCCATC CGACATCCAC
AGGTCCATTC TCACACATAA GTGCCAAACG CAACAGGAGG
GGATACACTA GCAGCAGACG TTGCAAACGC AGGACTCATC
CTCTTCTCTA ACACCATTTT GCATGAAAAC AGCCAGTTAT
GGGCTTGATG GAGCTCGCTC ATTCCAATTC CTTCTATTAG
GCTACTAACA CCATGACTTT ATTAGCCTGT CTATCCTGGC
CCCCCTGGCG AGGTCATGTT TGTTTATTTC CGAATGCAAC
AAGCTCCGCA TTACACCCGA ACATCACTCC AGATGAGGGC
TTTCTGAGTG TGGGGTCAAA TAGTTTCATG TTCCCAAATG GCCCAAACT GACAGTTTAA ACGCTGTCTT GGAACCTAAT
ATGACAAAAG CGTGATCTCA TCCAAGATGA ACTAAGTTTG
GTTCGTTGAA ATCCTAACGG CCAGTTGGTC AAAAAGAAAC TTCCAAAAGT CGCCATACCG TTTGTCTTGT TTGGTATTGA TTGACGAATG CTCAAAAATA ATCTCATTAA TGCTTAGCGC AGTCTCTCTA TCGCCTCTGA ACCCGGTGGC ACCTGTGCCG AAACGCAAAT GGGGAAACAA CCCGCTTTTT GGATGATTAT GCATTGTCCT CCACATTGTA TGCTTCCAAG ATTCTGGTGG GAATACTGCT GATAGCCTAA CGTTCATGAT CAAAATTTAA CTGTTCTAAC CCCTACTTGG ACAGGCAATA TATAAACAGA AGGAAGCTGC CCTGTCTTAA ACCTTTTTTT TTATCATCAT TATTAGCTTA CTTTCATAAT TGCGACTGGT TCCAATTGAC AAGCTTTTGA ttttaacgac ttttaacgac aacttgagaa
GATCAAAAAA GAACTAATTA TTCGAAACG-3'
D’ szekvencia
Azok, akik a szakterületen jártasak, felismerik, hogy a C és D szekvenciákhoz viszonyított további szabályozófunkciókat lehet kódolni a D’ szekvenciának abban a részében, amely a C és D szekvenciákban részletezett nukleotidszekvenciáktól tovább „felfelé” (vagyis az 5’ irányban) van.
Hogy meghatározzuk, hol kezdődik az alkoholoxidáz-génhez az RNS-átírás, a pPG 4.0 genomiális kiónból és a pPC 8.3 cDNS-klónból ennek a génnek az 5’ vége körüli DNS-szekvenciákat összehasonlítjuk. A pPC 8.3 cDNS-klón az alkoholoxidáz-génhez 5’ irányban egy le nem fordított terület mintegy 100 nukleotidját tartalmazza. Erre a szekvenciára alapozva 15 bázisos oligonukleotidot (5’-CTTCTCAAGTTGTTCG-3’) szintetizálunk (lásd IX. példa), amely a -29-től -43 nukleotidok szempontjából komplementer, ahol a transzlációs rajthely (ATG kodon) a nukleotidját +l-nek és a nukleotidot 5’ irányban -1-nek jelöljük. A 15 bázisos oligonukleotidot primőrként alkalmazzuk, hogy meghosszabbítsuk az alkoholoxidáz mRNS mentén, hogy elérje az 5’ végét. Az ebből a primermeghosszabbítási kísérletből nyert cDNS-szekvencia három különböző átírási kiindulási pontot eredményez Pichia pastoris alkoholoxidáz mRNS-hez. A fő átirat 144 nukleotidra kezdődik a transzlációs kiindulási kodontól. Két kisebb alternatív kodon kezdődik 117 illetve 111 nukleotidra „fölfelé” (5’ irányban) az alkoholoxidáz AUG kodontól.
Az alkoholoxidáz mRNS rajtját megelőző 55 nukleotid egy feltételezett Goldberg-Hogness „box”-ot (TATAA box) tartalmaz.
A TATAAA szekvencia 40 helyre található az alkoholoxidáz mRNS-hez szolgáló uralkodó átirat 5’ végétől és ennél fogva 165 nukleotiddal „fölfelé” az ehhez a fehérjéhez szolgáló kiindulási kodontól.
Az alkoholoxidáz-gén 3’ szabályozóterületét tovább jellemezzük, meghatározva a nukleotidszekvenciát mintegy 120 nukleotidra „lefelé” attól a ponttól, ahol a p72-höz (alkoholoxidáz) tartozó szerkezeti információ kódolódik. A szekvenciát az alábbiakban mutatjuk be, mint D’ szekvenciát:
5'-TCAAGAGGAT GTCAGAATGC CATTTGCCTG AGAGATGCAG
GTCTCATTTT TGATACTTTT TTATTTGTAA CCTATATAGT
ATAGGATTTT TTTTGTCAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA-3'
D” szekvencia
A p76 gén részletes elemzése
A pPG 6.0 klón 5’ szabályozóterületét tovább jellemezzük, meghatározva a klón nukleotidszekvenciáját attól a ponttól „felfelé” (5’ irányában), ahol a p76-hoz tartozó szerkezeti információ kódolódik, Az első 622 nukleotidról az mRNS transzlációs rajthely (ATG kodon) előtt úgy hisszük, hogy a következők:
5'-TT
CACCCATACA ACTATAAACC TTAGCAÁTTG AAATAACCCC
AATTCATTGT TCCGAGTTTA ATATACTTGC CCCTATAAGA
AACCAAGGGA TTTCAGCTTC CTTACCCCAT GAACAGAATC
TTCCATTTAC CCCCCACTGG AGAGATCCGC CCAAACGAAC
AGATAATAGA AAAAAACAAT TCGGACAAAT AGAACACTTT
CTCAGCCAAT TAAAGTCATT CCATGCACTC CCTTTAGCTG
CCGTTCCATC CCTTTGTTCA GCAACACCAT CGTTAGCCAG
TACGAAAGAG GAAACTTAAC CGATACCTTG GAGAAATCTA
AGGCGCGAAT GAGTTTAGCC TAGATATCCT TAGTGAAGGG
TGTCCGATAC TTCTCCACAT TCAGTCATAG ATGGGCAGCT
TGTATCATGA AGAGACGGAA ACGGGCATAA GGGTAACCGC
HU 205 627 Β
CA&ATTATAT AAAGACAACA TGCCCCAGTT TAAAGTTTTT
CTTTCCTATT CTTGTATCCT GAGTGACCGT TGTGTTTAAT
ATAAAAAGTT CGTTTTAACT TAAGACCAAA ACCAGTTACA
ACAAATTATA ACCCCTCTAA ACACTAAAGT TCACTCTTAT
CAAACTATCA AACATCAAAA-3'
D’” szekvencia
A pPG 6.0 klón promotor funkciójáról úgy hisszük, hogy a nukleotidbázisoknak ezen a szekvenciáján belül található, bár azok akik a szakterületen jártasak, felismerhetik, hogy további szabályozótulajdonságok adódhatnak azon szekvenciák által, amelyek a D’” szekvenciához adott szekvenciáktól tovább „felfelé” találhatók.
A pPG 6.0 klón 3’ szabályozóterületét tovább jellemezzük, meghatározva a nukleotidszekvenciát mintegy 180 nukleotidra „lefelé” (3’ irányban) attól a ponttól, ahol a p76 szerkezeti információja kódolódik. A szekvenciát az alábbiakban mutatjuk be, mint D’” szekvenciát
5' -GTCAGCAGTG TTTCCTGCCA AAGCCATCAA GAGGACGTAC
ATGCTCTCAT TTTTTGGTTT TCTATGTCCG ACGGGGTTCG
TAAACTGGCT TCCTCCTTTT CTTTTCCTGT TGCATTTTAT
TTGGTCAAAC AAAACTAGGG TCTTTTCCTA AAACCTTATG
TCAATGGACC TACCACATAG-3'
D’”’ szekvencia
A transzformált élesztő kifejeződése
A jelen találmány szerinti fentebb leírt plazmidok olyan élesztőkben hasznosíthatók, amelyek transzformálhatók. A génkifejezödés szabályozását élesztőkben a jelen találmány szerinti új DNS-fragmensek segítségével úgy lehet kivitelezni, hogy a transzformált organizmusokat szénfonáséhezésnek vetjük alá. A szénforráséhezés különböző mind katabolit represszáló, mind nem katabolit represszáló szénforrásokon való növesztés után a találmány szerinti szabályozószakaszok szabályozása alatt tartott géntermék kifejeződését indukálja. A kívánt géntérmék kifejeződésének elérésére transzformált élesztők megfelelő fajaiban egy másik mód a transzformált élesztők növesztése metanolon. Egy megint másik mód a kívánt géntermék kifejeződésének redukálására a transzformált élesztő növesztése olyan tápközegen, amely nem katabolit-represszáló szénforrásokat tartalmaz.
A jelen találmány szerinti szabályozó területek hasznosak a kifejeződéshez minden élesztő törzsben, mivel a szabályozóterületekről kimutattuk, hogy különböző körülmények között indukálhatok. így pl. a metanolon vagy nem katabolit represszáló szénforrásokon növekedni képes élesztőknél elő lehet idézni, hogy idegen, vagyis heteroíóg olipeptideket közvetlenül állítsanak elő; míg a katabolit represszáló szénforrásokon növekedni képes élesztőknél úgy lehet előidézni, hogy idegen polipeptidet állítsanak elő, hogy az így nőtt élesztősejteket szénforrás-éhezési feltételeknek vetjük alá.
A találmány szerinti eljárásban transzformálásra előnyösen a kővetkező nemzetségek tagjai alkalmazhatók:
Candida,
Kloeckera,
Saccharomyces,
Schizosaccharomyces,
Rhodotorula,
Hansenula,
Torulopsis,
Pichia és
Kluyveromyces.
Az ezekből a nemzetiségekből nyert élesztők azért előnyösek mert kezelésük biztonságos, növekedési és egyéb feltételeik jól meghatározottak és jól ismertek mindazok számára, akik a szakterületen járatosak.
Különösen előnyös élesztő törzsek a jelen találmány szerinti eljárás egyik kiviteli módjához való alkalmazáshoz azok az élesztő törzsek, amelyek képesek nőni metanolon, mint egyedüli szén- és energiafonráson. Azok az élesztők, amelyekről ismert, hogy képesek növekedni metanolon, a következő nemzetiségek tagjai:
Candida,
Kloeckera,
Saccharomyces,
Rhodotorula,
Hansenula,
Torulopsis és
Pichia.
Mivel a jelen találmány szerinti szabályozőterületek szintén indukálhatok nem katabolit represszáló szénforrásokban való növesztéssel, valamint szénforráséhezés körülményei között, azok az élesztő törzsek, amelyek képesek növekedni az olyan nem metanol szubsztrátumokon, mint:
glükóz, acetát, glicerin, etanol, laktóz, galaktóz, fruktóz, szacharóz és hasonlók, valamint a fentiekből kettőnek vagy többnek a keveréke, szintén használhatók. A gazdaszervezet növesztésével megfelelő nem katabolit represszáló, nem metanol szénforráson, pl. glicerinen és galaktózon, vagy a gazdszervezet növesztésével megfelelő katabolit represszáló szénforráson, pl. etanolon, glükózon és fruktózon, majd szénforrás-éhezési körülményeknek kitéve a gazdaszervezetet, el lehet érni a géntermék kifejeződését a találmány szerinti szabályozóterületek szabályozása alatt.
Ezen kívül, mivel a találmány szerinti szabályozóterületek érzékenyek a különböző növekedési feltételekre mind a kifejeződés indukcióját, mind represszióját tekintve, a találmány szerinti szabályozóterületek szabályozása alatt a géntermék szabályozott kifejeződését lehet elérni. így pl. sejteket lehet növeszteni olyan szénforráson, amely az idegen génkifejeződését csak alacsony szinten indukálja, majd át lehet kapcsolni metanolra, amely azután erősen indukálja a génkifeje12
HU 205 627 Β ződést. Egy más módszer szerint a génkifejeződést úgy lehet elérni, hogy indukáló/represszáló tápanyagok keverékét, pl. metanol-glükóz keveréket alkalmazunk. Egy újabb másik módszer szerint a metanolon történt növekedés által előidézett magas kifejeződési szinteket csökkenteni lehet ha szükséges, represszáló szénforrás, pl. glükóz vagy etanol hozzáadásával a növesztő tápközeghez. Természetesen azok, akik a szakterületen jártasak, felismerik, hogy a tápanyagkeverékeknek és a tápanyag-beadási sorrendeknek más variációi is lehetségesek, és ezek a szabályozás nagy lehetőségét nyújtják a találmány szerinti szabályozóterületekből nyert génkifejeződés szintjén.
Különösen előnyös élesztő törzs a Pichia pastoris GS115, amely hisztidin előállítási képessége szempontjából hiányos mutáns, és így mutáns genotípusa alapján his4 jelöléssel bír. A GS115 a Pichia pastoris NRRL Y-ll 430-ból származik, és az United States Department of Agriculture (Egyesült Államok Mezőgazdasági Minisztérium) Northern Régiónál Research Center (Északi-területi kutatóközpont) (Peoria, Illinois) letétbe van helyezve. A Pichia pastoris GS115 az NRRL Y-15 851 deponálási számon. Ez a szóban forgó gazdaszervezet azért hasznos, mert ez a hisztidin útban hiányos auxotróf mutáns. Ennek a gazdaszervezetnek a transzformálása egy vektorral, amely más DNS-szekvenciák között a HIS4 génfunkciót is tartalmazza, lehetővé teszi a transzformált gazdaszervezet könnyű szelekcióját.
A jelen találmány szerinti szabályozóterületekről kimutattuk, hogy hasznosak a Saccharomyces nemzetiség élesztő törzseiben is a heterológ géntermékek szabályozott kifejeződéséhez, ebben az élesztő nemzetiségben számos auxotróf mutáns ismeretes. További előnyös gazda élesztőtörzsek lehetnek:
ATCC 24 683 (trp 1, ade 1, his 2, leu 1, gal 1, ura 1 mutáns), ATCC 24 684 (trp 1, ade 1, his 7, gal 1, ura 1 mutáns), ATCC 32 810 (tpr 5, arg 4, his 5, lys 1, ade 2, gal 2 mutáns), ATCC 34 182 (ade 3, his, lys, ura mutáns), ATCC 34 352 (ura 2 mutáns), ATCC 34 353 (ura 2 mutáns), ATCC 34 353 (ura 2 mutáns), ATCC 38 523 (arg 1, thr 1 mutáns), ATCC 38 626 (leu 2, his 4 mutáns), ATCC 38 660 (his 4, leu 2, thr 4 mutáns), ATCC 42 243 (ura 3 mutáns), ATCC 42 336 (ade 1, his 4, thr 4 mutáns), ATCC 42 403 (arg 4, lys 7 mutáns), ATCC 42 404 (ade 1, his 4, leu 2 mutáns), ATCC 42 564 (ura 1, his 6 mutáns), ATCC 42 596 (his 4, leu 2, lys 1 mutáns), ATCC 42 957 (his 4, leu 2, thr 4, trp 5 mutáns), ATCC 42 950 (ade mutáns), ATCC 42 951 (ade, leu mutáns), ATCC 44 069 (ura 1 mutáns), ATCC 44070 (leu 2, his 4 mutáns), ATCC 44 222 (his 4 mutáns), ATCC 44 376 (his 4, ade 2 mutáns), ATCC 44 377 (his 4, leu 1 mutáns) és hasonlók, ezek könnyen hozzáférhetők azok számára, akik a szakterületen jártasak.
Azok, akik a szakterületen jártasak, felismerik, hogy a hasznos gazda törzsek nem szorítkoznak az auxotróf mutánsokra. így pozitív szelekciós markerekkel, pl', antibiotikum-rezisztencia génekkel rendelkező protot: róf törzsek transzformálása szintén hasznos eszközt nyújt transzformált törzsek kimutatásához és izolálásához.
Az Escherichia coli szintén megfelelő gazdaszervezet a találmány szerinti plazmidokhoz. Azok, akik a szakterületen jártasak, felismerik, hogy számos E. coli törzs megfelelő gazdaszervezet. A jelen munkában alkalmazott különböző törzseket az alábbi táblázat foglalja össze:
Törzs jelzése Deponálási szám
MC 1061 nem ismeretes
LE392 ATCC 33 572
MM294 ' ATCC 33 625
Pichia pastoris transzformálási eljárás
A Pichia pastoris transzformálását korábban még nem írták le. A Pichia pastoris transzformálásához szükséges kísérleti eljárásokat később (XII. példa) nagyobb részletességgel is bemutatjuk. Abból a célból, hogy a P. pastorishoz transzformálási rendszert fejlesszünk ki, a GS115 auxotróf mutáns (NRRL Y-15 851) izoláljuk, és meghatározzuk, hogy ez hiányos a hisztidinútban, vagyis nem rendelkezik kimutatható hisztidinol-dehidrogenáz aktivitással.
A GS115-öt (NRRL Y-15 851) a sejtfalak enzimes emésztésével transzformálhatjuk, így szferoplasztokat nyerve; a szferoplasztokat azután összekeverjük a transzformáló DNS-sel és kalciumionok, valamint polietilénglikol jelenlétében inkubáljuk, majd hisztidinhiányos, szelektív növekvő tápközegben regeneráljuk. A transzformáló gén magában foglalja a HIS4-gént, amelyben a gazdaszervezet hiányos, így csupán a transzformált sejtek élik túl az alkalmazott szelektív tápközegen való növesztést.
A Pichia pastoris HIS4 gén izolálása
A HIS4 gén a P. pastoris NRRL Y-ll 430 törzsből izoláljuk a teljes kromoszomális DNS Sau3A-val történő részleges emésztésével, amelyet centrifugálás követ szacharóz gradiensen (lásd XIII. példa). Az 5-20 kbp közti fragmenseket az YEpl3 S. cerevisiae E. coli „ingázó” vektor (ATCC 37 115; 33. ábra) BamHI hasítási helyébe klónozzuk, és E. coliba transzformáljuk. Mintegy 50 000 telepet egyesítünk és a teljes plazmidDNS-t kivonjuk. 5799-4D S. cerevisiae törzs (NRRL Y-15 859), amely his4ABC mutáns, szferoplasztjait összekeverjük mintegy 1 μg YEpl3 Pichia DNS„könyvtár”-ral Hinnen és munkatársai (1978) eljárása szerint, és hagyjuk regenerálódni olyan tápközegben, amely hisztidinben hiányos. A transzformálás mintegy lxlO3 prototróf élesztőtelepet eredményez az 5xl07 teljes regenerálható szferoplaszt-populációból. Egy párhuzamos kontrollminta DNS nélkül inkubálva nem termel telepeket. A His+ telepek közül 20-ból a teljes élesztő-DNS-t kivonjuk és visszatranszformáljuk E. coliba. Az élesztő-DNS-készítményekből 17 termel ampicillinrezisztens telepeket. Ezeket a klónozott fragmenseket tovább jellemezzük restrikciós enzimes méretmeghatározással és térképezéssel, valamint azzal a képességükkel, hogy kis erővel képesek kereszthibridizálásra jelzett S. cerevisiae HIS4 fragmenssel (hibridi13
HU 205 627 Β zálás utáni mosások 2xSSC-vel 55 °C hőmérsékleten) a ΧΠΪ. példa G. fejezetében leírt módszerrel. A HIS4tartalmú plazmidok mindegyike tartalmaz egy vagy több fragmenst, amely hibridizálódik a S. cerevisiae HIS4 génnel. Egy ilyen HTS4-tartalmú plazmidot reklónozunk, így a pYJ8 jelű HIS4-tartalmú plazmidot nyerünk, amelyet a 25. ábrán mutatunk be. A pYJ8 plazmid pBR325 szekvenciákat tartalmaz, beleértve a klóramfenikol- és ampicillin-rezisztenciagéneket valamint a Pichia HIS4 génjét.
Az ARG4 gént P. pastoris NRRL Y-ll 430-ból izoláljuk, azonos eljárást alkalmazva, valamint az S2072-t S. cerevisiae Arg törzsből [arg 4, leu 2, trp 1, gal 2 mutáns; a törzs beszerezhető a Yeast Genetic Stock Center intézettől (Berkeley, Kalifornia)].
Szakember számára nyilvánvaló, hogy Pichiából származó más marker géneket hasonlóképpen lehet izolálni a megfelelően hiányos S. cerevisiae törzseket alkalmazva.
A Pichia pastoris autonóm replikációs szekvenciáinak izolálása.
A jelen találmány szerinti vektoroknak másik hasznos komponensei a Pichia eredetű autonóm replikációs szekvenciák (PARS), amelyek növelik mind a GS115 (NRRL Y-15 851) transzformációs gyakoriságát, mind a plazmidnak, mint stabil extrakromoszomális elemnek a fenntarthatóságát.
Hogy a Pichia ARS-eket kutathassuk, Pichia pastoris GS115 (NRRL Y-15 851)-ből származó DNS-t részlegesen emésztünk Taql-gyel az 5 és 10 kbp közti fragmenseket izoláljuk és a pYJ8 Δ Cla egyedi Clal helyére klónozzuk (lásd 26. ábra). A plazmid-DNS-t mintegy 10 000 His+ Pichiatelepből kinyerjük és E. coli transzformálásához alkalmazzuk. Mintegy 10 000 ampicillinrezisztens-telepből plazmidokat izolálunk, majd visszatranszformáljuk GS115-be. Ebből az „alkönyvtár”-transzformációból 40 His+ élesztőtelepet elkülönítve szelektív közegre élesztjük és külön tenyészetekben növesztjük szelektív tápközegekben. Ennek a 40 tenyészetnek mindegyikéből kivonjuk a teljes élesztőDNS-t és E. coliba transzformáljuk. Két plazmidot, a pYA63-at (PARS1) és pYA90-et (PARS2), amelyeknek az élesztő-DNS-preparátumai az ampicillinre leginkább rezisztens E. coli tenyészeteket produkálják, kiválasztunk további elemzésre. Mindkét plazmid transzformálja a Pichia pastoris GS115-öt (NRLL Y-15 851) igen nagy frekvenciával és mindegyik tartalmaz idegen DNS-beiktatást.
Az ARS-ek olyan képességének mértékére, hogyan tartják fenn a plazmidot, mint autonóm elemet Pichiában, élesztősejtek tenyészeteit, amely sejtek a plazmidok valamelyikével transzformálva voltak, növesztjük szelektív tápközegben és időnként mintát veszünk. A plazmídszekvenciák állapotát a sejtekben a nem korlátozott élesztő-DNS-ek radioaktívan jelzett pBR325höz történő Southem-hibridizálásával határozzuk meg. A pYA63 és pYA90 plazmidok fennmaradnak a Pichiában, a szelektív tápközegben legalább 10 generáción keresztül (de integrálódnak az 50. generációig).
A feltételezett Pichia autonóm replikációs szekvenciák egyikét (PARS 1) számos más Pichia-vektorba klónozzuk, hogy megvizsgáljuk azt a képességét, hogyan tartja meg a transzformáló DNS-t mint autonóm elemet. ApYJ30 (27. ábra) és pBPJl (34. ábra) plazmidok még jelen vannak 20 növekedési generáció után is autonóm elemként szelektív tápközegen (His’) és jelen vannak több kópiában sejtenként. A pYJ30-cal transzformáit sejtek Southem-foltelemzése mintegy 10 kópiát jelez sejtenként.
Meghatározzuk, vajon a pSAOH5 (18. ábra) és pT76H4 (22b ábra) plazmidok, amelyek tartalmazzák a pYJ30 illetve pBPJl által nyújtott PARS 1-et, mutatnak-e azokhoz a plazmidokhoz hasonló stabilitást, amelyekből származnak. Az ezeket a vektorokat tartalmazó törzseket szelektív feltételek között növesztjük (His) mintegy 50 generáción át glükóz jelenlétében. A sejteket ezután nem szelektív körülmények közé (His+) visszük át és a prototrófía elvesztését megfigyeljük. Ezeknek a plazmidoknak a stabilitása összehasonlítható a pYJ30 stabilitásával, beleértve a His-prototrófia gyors elvesztését nem szelektív tápközegbe való átvitelekor. így úgy véljük, hogy az autonóm replikációs szekvenciát, PARS 1-et tartalmazó plazmidokkal végrehajtott kísérletek a génkifejeződést eredményezik az autonóm plazmid DNS-ről.
Új $-galaktozidáz gént tartalmazó konstrukciók.
Abból a célból, hogy a jelen találmány szerinti szabályozóterületek azon képességét demonstráljuk, hogy a fehérjetermékek termelését szabályozzák, új DNSkonstrukciót készítünk. így az E. coli lacZ gént számos plazmidba, a p72 (alkoholoxidáz) vagy p76 polipeptidet kódoló gén szabályozóterületeinek szabályozása alá áthelyezzük. A pSAOHl, pSAOH5, pSAOHIO, pTAFH.85, pT76Hl, pT76H2, pT76H3 és pI76H4 plazmidok előállítását a XIV. példában írjuk le.
Bár a találmány szerinti szabályozóterület - β-galaktozidáz gén fúziós termékbevezetését gazda élesztősejtbe plazmiddal mint hordozóval ismertetjük, a szakember számára nyilvánvaló, hogy nem szükséges a sejtbe plazmid útján bevezetni a szabályozóterületstrukturgénkonstrukciót, hanem bármiféle molekula, amely képes fennmaradni élesztőben, alkalmazható. Ezáltal a találmány szerinti szabályozóterület-strukturgénkonstrukciókat plazmidoktól eltérő vektorok útján is lehet manipulálni. Egy más módszer szerint a szabályozóterület-strukturgénkonstrukciót a gazda élesztősejtkromoszómájába integrálni is lehet.
Szakember számára nyilvánvaló, hogy a jelen találmány oltalmi köre nem korlátozódik a β-galaktozidáz termelésére az itt ismertetett szabályozőterületek szabályozása alatt. A különböző polipeptideknek, amelyek a találmány szerinti szabályozóterületek szabályozása alatt termelődhetnek, csupán az olvasó képzelete szab határt. Több eljárás létezik olyan DNS-szekvenciák készítésére, amelyek a kívánt polipeptideket kódolják, így pl. különböző hosszúságú oligonukleotidokat lehet szintetizálni ismert eljárásokkal. Számos ilyen olígonukleotidot lehet összeilleszteni ezek fajlagos bázis14
HU 205 627 Β párképző tulajdonságai következtében hosszabb, kétszálú molekulákká. A kétszálú molekula alkotó oligonukleotidjait egyesíteni (ligálni) lehet DNS-ligáz enzimmel. Egy más módszer szerint a kívánt kódolószekvenciával rendelkező DNS-molekulát reverz transzkriptáz enzim alkalmazásával lehet szintetizálni, a kívánt polipeptidre vonatkozó hírvivő RNS-t alkalmazva templátként a reverz transzkriptáz akciójához. Egy további másik lehetőség a genomiális DNS-fragmensek klónozása és annak megfigyelése, vajon a kívánt termék kifejeződése történik-e.
Azt a DNS-szekvenciát, amely a kívánt polipeptidet kódolja, a szabályozóterület-strukturgénkonstrukció elkészítéséhez sokféle eljárással lehet módosítani. így pl. a fentebb leírt módon készített DNS végeit ligálni lehet DNS-ligáz enzimmel fajlagos restrikciós endonukleázok által felismert nukleotidszekvenciát tartalmazó rövid, kétszálú DNS-molekulákhoz, az úgynevezett „linker-” (kapcsoló-) molekulához. A ligálást követően ezeknek a molekuláknak az emésztése valamely fajlagos restrikciós endonukleáz felismerhető helynek megfelelő végeket hoz létre a készített DNS-szekvencia végeinél.
Ennek a munkának a folyamán készített három fajlagos szabályozóterület β-galaktozidázgén-konstrukciót írunk le a 15. és 16. ábrákon bemutatott restrikciós térkép segítségével. A 15a) ábrán bemutatott restrikciós térkép egy olyan konstrukciót ír le, amely pPG 6.0 5’ szabályozóterületéből származó, 0,85 kilobázispáros HindlII-BamHI részből és E. coliból származó lacZ génből (a bemutatott 3,6 kilobázispáros BamHI-Nru-fragmens) áll. Ugyanez a konstrukció van jelen a pTAFH.85, pT76Hl és pT76H2 plazmidok mindegyikében, amelyeket a későbbiekben részletesebben írunk le (lásd XIV. példa). A 15b) ábrán bemutatott restrikciós térkép leír egy olyan konstrukciót, amely a pPG 6.0 5’ szabályozóterületből származó, 1,3 kilobázispáros HindlII-EcoRI részből és az E. coliból származó lacZ génből áll. Ugyanez a konstrukció van jelen a pT76Ul, pT76H4 plazmidok mindegyikében, amelyeket a későbbiekben részletesebben írunk le (lásd XIV. példa).
A16. ábra egy olyan konstrukció restrikciós térképe, amely a pPG 4.0 5’ szabályozóterületéből származó, 1,1 kilobázispáros EcoRI-BamHI-fragmensből és az E. coliból származó lacZ génből áll. Ugyanez a konstrukció van jelen a pSAOHl, pSAOH5 és pSAOHIO plazmidokban, amelyeket a későbbiekben részletesebben írunk le (lásd XIV. példa).
ApSAOHl plazmidot vázlatosan a 17. ábrán illusztráljuk. Azon túl, hogy a szabályozószakasz β-galaktozidáz gén 16. ábrában részletezett fúziós termékét tartalmazza, a plazmidról kimutattuk, hogy tartalmaz:
(a) pBR322 szekvenciákat, beleértve az AmpR gént;
(b) Pichia pastoris HIS4 gént;
(c) S. cerecisiae 2 μ köralakú DNS-t;
(d) az S. cerevisiae-ből a megszakított URA3 gént.
A plazmidnak ennél fogva megvan az a képességé, hogy transzformálódjon és replikálódjon E. coli és élesztő gazdaszervezetekben. A DNS manipulációjához szelektálható markerek vannak jelen mind az E.
coliban, mind az élesztő gazdaszervezetben.
ApSAOH5 plazmidot vázlatosan a 18. ábrán illusztráljuk. A plazmid hasonló a fentebb leírt pSAOHl-hez, azzal a különbséggel, hogy az S. cerevisiae 2 μ köralakú DNS és a Pichia pastoris HIS4 gént szegélyező DNS-ek közül néhány hiányzik, míg hozzá van téve egy Pichia pastoris autonóm módon replikálódó szekvencia (PARSl apYA63-ból).
A pSAOHIO plazmidot vázlatosan a 19. ábrán illusztráljuk. A plazmid tartalmaz:
(a) szabályozóterület β-galaktozidáz gén fúziós terméket;
(b) pBR325 szekvenciákat, beleértve a tetraciklinrezisztenciát, klóramfenikol-rezisztenciát és ampicillin-rezisztenciát (tetR, illetve camR, illetve ampR) átvivő géneket; és (c) S. cerevisiae HIS4 gént (az alább leírt módon pYA2 plazmidból nyerve).
A pTAFH.85, pT76Hl és pT76H2 plazmidok analógok a fentebb leírt három plazmiddal, azzal a kivétellel, hogy az alkalmazott szabályozóterület β-galaktozidáz fúziós termék az, amelyet a 15a) ábrán leírtunk (a 16. ábrán leírt fúziós termék helyett).
A pT76H3 és pT76H4 plazmidok analógok a pSAOHl illetve pSAOH5 plazmidokkal azzal a kivétellel, hogy az alkalmazott szabályozószakasz β-galaktozidáz-gén fúziós tennék a 15b) ábrán leírt termék (a 16. ábrán leírt fúziós termék helyett).
A pTAFH.85 plazmidot vázlatosan a 20. ábrában illusztráljuk, ez tartalmazza:
(a) a 15 a) ábrán bemutatott szabályozószakasz β-galaktozidáz-gén fúziós terméket;
(b) pBR322 szekvenciákat, beleértve az ampR gént;
(c) a Pichia pastoris HIS 4 gént;
(d) S. cerevisiae 2 μ köralakú DNS-t; és (e) az S. cerevisiae-ből származó megszakított URA3 gént.
A pT76Hl plazmidot vázlatosan a 21. ábrán illusztráljuk, ez tartalmazza:
(a) a 15a) ábrán bemutatott szabályozószakasz β-galaktozidáz-gén fúziós terméket;
(b) pBR322 szekvenciákat, beleértve az ampR gént;
(c) a Pichia pastoris HIS4 gént és autonóm módon replikálódó szekvenciát (PARS1).
A pT76H2 plazmidot vázlatosan a 22. ábrán illusztráljuk, és ez tartalmazza;
(a) a 15a) ábrán bemutatott szabályozószakasz β-galaktozidáz-gén fúziós termékét;
(b) pBR325 szekvenciákat, beleértve a tetraciklin rezisztenciát, klóramfenikol-rezisztenciát és ampicillin-rezisztenciát átvivő géneket; és (c) S. cerevisiae HIS4 gént.
A pT76H3 plazmidot vázlatosan a 22a) ábrán illusztráljuk, és ez tartalmazza:
(a) a 15b) ábrán bemutatott szabályozószakasz β-galaktozidáz gén fúziós terméket;
(b) pBR322 szekvenciákat, beleértve az ampR gént;
(c) a Pichia pastoris HIS4 gént;
(d) S. cerevisiae 2μ köralakú DNS-t, és
HU 205 627 Β (e) az S. cerevisiae-ből a megszakított URA3 gént.
A pI76H4 plazmidot vázlatosan a 22b) ábrán illusztráljuk, ez tartalmazza:
(a) a 15b) ábrán bemutatott szabályozóterűlet β-galaktozidáz-gén fúziós termékét;
(b) pBR322 szekvenciákat, beleértve az ampR gént;
(c) Pichia pastoris HIS4 gént; és (d) Pichia pastoris autonóm replikációs szekvenciát (PARS1).
A $-gaIaktozidáz kifejeződése élesztőben.
Pichia pastoris GS115-öt (NRRL Y-15 851) transzformálunk az új, β-galaktozidáz géntartalmú, fentebb leírt konstrukcióval. A létrejött számos transzformált élesztőtörzset deponáltuk az United States of Department Agrículture (Egyesült Államok Mezőgazdasági Minisztériuma), Northern Régiónál Research Center intézetnél a következő deponálási számokon:
Gazdaszervezet Plazmid A transzformált törzs deponálási száma
GS115 pSAOH 1 NRRL Y-15 852
GS115 pSAOH 5 NRRL Y-15 853
GS115 pSAOHIO NRRL Y-15 854
GS115 pTAFH.85 NRRL Y-15 855
GS115 pT76H 1 NRRL Y-15 856
GS115 pT76H 2 NRRL Y-15 857
Az új β-galaktozidáz géntartalmú konstrukciókat lehet alkalmazni E. coli transzformálására is. Atranszformált baktériumtörzseket szintén deponáltuk a Northern Régiónál Research Center intézetnél (Peoria, Illinois), a következő számokon:
Gazdaszervezet Plazmid A transzformált törzs deponálási száma
MC1061 pSAOH 1 NRLLB-15 861
MC1061 pSAOH 5 NRRLB-15 862
MC1061 pSAOHIO NRRL B-15 863
MC1061 pTAFH.85 NRRLB-1564
MC1061 pT76H 1 NRRL B-15 865
MC1061 pI76H 2 NRRLB-15 866
MC1061 pTAO 13 NRRL B-15 875
MC1061 pI76H 3 NRRLB-15 800
MC1061 pI76H 4 NRRLB-18 001
MC1061 pI76U 1 NRRLB-18 002
Az alkoholoxidázt és a találmány szerinti p76 szabályozóterűlet lacZ gén fúziós terméket tartalmazó első nyolc plazmiddal Pichia pastoris GS115 törzset (NRRL Y-15 851) transzformálunk és növesztünk stacionárius fázisig minimál tápközegen, amely biotinnal és glükózzal, mint szénforrással ki van egészítve. Amikor a sejtek elérik a stacionárius fázist, átvisszük ezeket olyan minimál tápközegre, amely biotinnal és metanollal, mint szénforrással van kiegészítve. Miután a sejtek mintegy 3-5 generáción át nőnek 30 °C hőmérsékleten, ezeket átvisszük olyan friss minimál tápközegre, amely biotinnal van kiegészítve, és növesztjük glükózon vagy metanolon, mint egyedüli szénforráson. Meghatározott időpontokban a tenyészetekből mintákat veszünk ki és elemezzük β-galaktozidáz és alkoholoxidáz jelenlétére a VH. és XV. példákban részletezendő módszerekkel.
Úgy találjuk, hogy a glükózon, mint egyedüli szénforráson nőtt sejtek nem termelnek kimutatható szinten β-galaktozidázt vagy alkoholoxidázt, míg azok a sejtek, amelyek metanolon, mint egyedüli szénforráson nőnek, jelentős szinten fejezik ki mind az alkoholoxidázt mind a β-galaktozidázt. Úgy találjuk ezen túl, hogy a glükózon nőtt sejtek, amikor szénforráséhezésnek tesszük ki ezeket, szintén mérhető mennyiségű alkoholoxidázt valamint β-galaktozidázt fejeznek ki. így világos, hogy a a találmány szerinti szabályozó területek fogékonyak mind a metanol jelenlétére, mind a szénforráséhezés feltételeire.
Igazolásként, hogy a találmány szerinti szabályozóterület fogékony a nem katabolitrepresszáló szénforráson növekedésre valamint a szénforráséhezés körülményeire, egy alkoholoxidáz szabályozóterületet tartalmazó plazmidot (pTA013), és egy p76 szabályozóterületet tartalmazó plazmidot (pI76Ul) alkalmazunk egy nem metanolhasznosító élesztő törzs, a Saccharomyces cerevisíae transzformálására. Az alkalmazott transzformált törzsek egyikét, amelynek laboratóriumki jelzése SEY2102-pTA013, deponáltuk a Northern Régiónál Research Center intézetnél (Peoria, Illinois), NRRL Y-15 858 deponálási számon. A Saccharomyces cerevisíae NRRL Y-15 858-atés SEY2102-pT76Hl-et növesztünk glükózon, ffuktózon, etanolon, glicerinen és galaktózon mintegy öt generáción át, majd szénforráséhezés feltételeinek vetjük alá. A β-galaktozidáz szokásos mérése (lásd XV. példa) öt generáció után azt jelzi, hogy glicerinen és a galaktózon nőtt sejtek nagy mennyiségű β-galaktozidázt termelnek, míg a glükózon és ffuktózon nőtt sejtek lényegében nem termelnek β-galaktozidázt. Amikor β-galaktozidázt mérünk 6 órával a szénforráséhezés után, a β-galaktozidáz mérsékelt mennyiségeinek termelését figyelhetjük meg a glükózon és ffuktózon nőtt transzformáit organizmusok által, ugyanakkor glicerinen és a galaktózon nőtt sejtek által termelt β-galaktozidáz jelentős mennyiségeit figyeljük meg. így a találmány szerinti szabályozó területek képesek a fehérjetermékek termelésének szabályozására genetikailag igen eltérő élesztő gazdaszervezetekben és nem korlátozódnak a metanolhasznosító törzsekben való alkalmazkodásra.
PÉLDÁK
Az alábbiakban megadjuk a következő példákban szereplő pufferek és oldatok összetételét (a megadott százalékértékek tömegszázalékot jelölnek):
mól/literes Triszpuffer: 121,1 g Trisz-bázis 800 ml vízben; a pH-t vizes sósavoldat hozzáadásával beállítjuk a kívánt értékre; az oldatot hagyjuk lehűlni szobahőmérsékletre, mielőtt a végső pH-beállítást elvégeznénk és az 1 literes végső térfogatra beállítjuk az oldatot.
HU 205 627 Β
S-puffer: 1,5 mól/liter szorbit 0,04 mól/literes nátrium-foszfát-pufferban, pH = 6,6.
PK-puffer: 0,14 mól/liter NaCl,
1% nátrium-dodecil-szulfát (SDS),
0,01 mól/liter EDTA
0,05 mól/literes Trisz-pufferban (pH 8,4).
ETS-puffer: 10 mmól/liter EDTA,
0,2% SDS
0,01 mól/literes Trisz-pufferban (pH = 7,6).
TE-puffer: 1,0 mmól/liter EDTA
0,01 mól/liter Trisz-pufferban (pH = 7,4).
SSC: 0,15 mól/liter NaCl, mmól/liter nátrium-citrát beállítva pH 7,0-ra NaOH-dal.
TAE: 40 mmól/liter ecetsav, mmól/liter EDTA
0,02 mól/literes Trisz-pufferban (pH 8,3).
PBS (foszfáttal pufferolt sóoldat): 10 mmól/liter nátrium-foszfát (pH 7,0),
0,15 mól/liter NaCl.
Laemmli terhelő puffer: 62,5 mmól/liter Trisz-HCl (pH 6,8),
2% SDS,
10% glicerin,
5% 2-merkapto-etanol,
0,01% brómfenolkék.
RIPA-puffer: 1 % NP40 (S igma),
1% nátrium-dezoxikolát,
0,1% SDS PBS-ben.
X SSPE: 20 mmól/liter EDTA,
0,16 mól/liter NaOH,
0,2 mól/liter NaH2PO4.H2O,
3,6 mól/liter NaCl beállítva pH 7,0-ra NaOH-dal.
Denhardtféle oldat (50 x): 5 g Ficoll, g polivinil-pirrolidon, g szarvasmarha-szérumalbumin (BSA; Pentax V. Frakció)
500 ml teljes térfogatra kiegészítve vízzel.
Előhibridizáló puffer: 5 X SSPE, x Denhardt-féle oldat,
50% ionmentesített formamid,
0,2% SDS,
200 μg/ml zúzot és denaturált heringsperma-DNS.
LB- (Luria-Bertani) tápközeg: 5 g Bacto tripton, g Bacto élesztőkivonat,
2.5 g NaCl liter vízben, beállítva pH 7,5-re NaOHdal.
YPD-tápközeg: 1% Bacto élesztőkivonat,
2% Becto pepton, 2% glükóz.
SD-tápközeg: 6,7 g „élesztő-nitrogénbázis aminosavak nélkül” (DIFCO),
2% glükóz liter vízben.
SÉD: 1 mól/liter szorbit, mmól/liter EDTA, mmól/liter DTT,
SCE-puffer: 9,1 g szorbit,
1,47 g nátrium-citrát,
0,168 g EDTA, ml víz beállítva pH 5,8-ra HCl-dal.
CaS: 1 mól/liter szorbit, mmól/liter CaCl2 szűrővel sterilezve.
PEG-oldat: 20% polietilén-glikol-3350, mmól/liter CaCl2, mmól/liter Trisz-HCl (pH 7,4) szűrővel sterilezve.
SOS: 1 mól/liter szorbit,
0,3 x YPD tápközeg, mmól/liter CaCl2.
Formamid festékkeverék: 0,1% „xylene cyanol FF”,
0,2% brómfenolkék, mmól/liter EDTA,
95% ionmentesített formamid.
Fedőgél: 76,8 g karbamid, ml akril-amid alapanyag, 8mll0xTBE
160 ml végső térfogatra kiegészítve.
Akrilamid alapanyag: 38 g akril-amid, g bisz (N,N-metilén-bisz-akril-amid) vízzel kiegészítve 100 ml teljes térfogatra.
Fenékgél: 14,4 g karbamid,
3,0 g szacharóz,
7.5 ml lOxTBE,
4.5 ml akril-amid alapanyag,
0,3 ml brómfenolkék oldat (0,01 g/ml) vízzel kiegészítve 30 ml teljes térfogatig.
Előhibridizáló puffer a hibridizálási szelekcióhoz: 50% formamid,
0,75 mól/liter NaCl,
0,1 mól/liter Trisz, pH 7,4,
0,008 mól/liter EDTA,
HU 205 627 Β
0,5% SDS,
200 g/ml nyúlmáj tRNS (Sigma).
Oőmól/literesNETSpuffer. 0,5 mól/liter NaCl, mmól/liter EDTA, mmól/liter Trisz, pH 7,4,
0,2% SDS.
IOxRTpuffer: 500 mmól/liter NaCl,
340 mmól/liter Trisz, pH 8,3, mmól/liter MgCl2, mmól/liter DTT (ditiotreitol).
dilRT: 4glH2O, μΐ lOxRT-puffer, μΐ reverz transzkriptáz, 15 egység g/gl (Life Sciences, Ins.).
didezoxi:
ddATP: 0,49 mmól/liter, dd CTP: 0,1165 mmól/liter, dd GTP: 0,369 mmól/liter, dd TTP: 0,82 mmól/liter, dNTP keverék: 0,625 mmól/liter dGTP,
0,625 mmól/liter dATP,
0,625 mmól/liter ΊΤΡ.
Chase: 1,125 mmól/liter dATP,
1,125 mmól/liter dCTP,
1,125 mmól/liter dGTP,
1,125 mmól/liter IT'P, lx RT-pufferban.
Hacsak másképpen nem jelezzük, a fenti koncentrációk az alkalmazott alap (lx) koncentrációt képviselik. A példák folyamán, ahol eltérő koncentrációszinteket alkalmazunk, ezt a tényt jelöljük, utalva az alap (lx ) koncentráció szorzószámára.
A példákban a kővetkező rövidítéseket használjuk:
EDTA etilén-diamin-teraecetsav
TEMED Ν,Ν,Ν’ ,N ’ -tetrametilén-diamin
DTT ditiotreitol
BSA szarvasmarha-szérumalbumin
EtBr etidium-bromid
Ci Curie
dATP dezoxi-adenozin-trifoszfát
dGTP dezoxi-guanozin-trifoszfát
TTP timidin-trifoszfát
dCTP dezoxi-citidin-trifoszfát
dXTP „általános” dezoxi-trifoszfát nukleotid
oligo(dT) 12-18
Forrás: Collaborative Research, Inc.
Zymolyase 60 000
Forrás: Miles Laboratories
Az enzimeket a gyártó cégek által javasolt körülmények között alkalmazzuk.
Számos eljárást rutinalapon végzünk el, standard leírásokat követve, amelyeket itt részletezünk majd.
A centrifugálást olyan időtartamig és fordulatsebességgel végezzük, hogy tiszta felülűszót kapjunk. Általában az élesztősejtek centrifugálását legalább 1500 gnál végezzük legalább 5 percen át.
A nukleinsavak kivonását azonos térfogatú, 50 : 48 : 2 térfogatarányú fenol: kloroform: izoamil-alkoholkeverékkel, illetve azonos térfogatú, 48:2 térfogatarányú kloroform: izoamil-alkohol-keverékkel végezzük.
Amikor gélekről, szűrőkről stb. azt írjuk le, hogy mossuk vagy áztatjuk egy speciális oldatban, a teljes gélt, szűrőt vagy hasonlót belemerítjük egy megfelelő edénybe (tálca, csésze, cső stb.) abból a célból, hogy a gél, szűrő stb. teljes felületét érintkezésbe hozzuk a szóban forgó oldattal.
A nukleinsavak etanolos kicsapását úgy végezzük, hogy először a nukleinsavat tartalmazó oldat sótartalmát beállítjuk, majd az oldatot érintkezésbe hozzuk két térfogat hideg etanollal.
I. Példa
Az élesztősejtek növesztése és kinyerése
Pichia pastoris NRRL Y-ll 430-at növesztünk szénforrásban korlátozott körülmények között folyamatos tenyészetben 30 °C hőmérsékleten azaz metanolt vagy etanolt, mint egyedüli szénforrást tartalmazó IMI só minimál tápközegben, amint ezt Wegner leírta a 4 414 329 lajstromszámú amerikai egyesült államok-beli szabadalmi leírásban. Az IMI minimál táptömeg 1 liter tápközegre számítva 36 mmól KH2PO4-et, 23 mmól (NH4)2SO4-ot, 2 mmól MgSO4-ot, 6,7 mmól KCl-t, 0,7 mmól CaCl2-t, 0,2 gmól CuSO4.5H2O-t, 1,25 gmól Kl-ot, 4,5 gmól MnSO4-ot, 2 gmól Na2MoO4-ot, 0,75 gmól H3BO3-at, 17,5 gmól ZnSO4-ot, 44,5 gmól FeCl2-ot és 1,6 gmól biotint tartalmaz. A metanolon növekvő sejteket 140 g/liter (száraz tömeg) sejtsűrűségig növesztjük mintegy 12 óra tartási idővel. Az etanolon növekvő sejteket 90 g/liter sejtsűrűségig növesztjük mintegy 11,5 óra tartási idővel. Amikor metanolt vagy etanolt táplálunk be a fermentolba, 20, illetve 45% alkoholt tartalmazó koncentrációjú betápláló törzsoldatot alkalmazunk.
g, fermentolban nőtt Pichia pastoris-sejtet gyűjtünk össze centrifugálással, és újra szuszpendáljuk mintegy 108 sejt/ml-re 0,1 mól/liter Triszben (pH 8,0), amely 1% 2-merkapto-etanolt is tartalmaz. Ezeket a sejteket 5-10 percig inkubáljuk 37 °C hőmérsékleten, és centrifugálással összegyűjtjük. Az üledéket egyszer mossuk 30 ml S-pufferban és újra szuszpendáljuk 5 ml S-pufferban, 1 g sejtre számítva. Zymolase-t (Miles Biochemicals) adunk a sejtszuszpenzióhoz, hogy 500 gg/ml végső koncentrációt érjünk el. A sejteket 37 °C hőmérsékleten inkubáljuk, majd centrifugáljuk; a felülúszőt eldobjuk és a sejtüledéket összegyűjtjük. Ezt az üledéket folyékony nitrogénben lefagyasztjuk és -70 °C hőmérsékleten tároljuk a későbbi felhasználáshoz.
II. példa
Az éleszlő-RNS izolálása
A teljes sejt RNS-t kipreparáljuk az 1. példában leírt fagyott üledék elporításával mozsárban mozsártörővei, majd a fagyott üledék további aprításával 2-5 percig Waring Blender-keverőgéppel, folyékony nitrogén je18
HU 205 627 Β lenlétében. A porított üledéket PK-pufferhoz adjuk
7,5 ml/g sejtkoncentrációban. Kproteinázt (Boehringer Mannheim) adunk az újra szuszpendált üledékhez, hogy végső koncentrációja 400 pg/ml legyen, és a szuszpenziót szobahőmérsékleten 10 percen át inkubáljuk. Ezt a keveréket fenol/kloroform/izoamil-alkohol keverékkel majd ezt követően kloroform/izoamilalkohol keverékkel extraháljuk. A nukleinsavakat NaCI 0,25 mól/liter koncentrációig történő adagolásával és etanol hozzáadásával kicsapjuk. Az üledéket minimális térfogatú ETS-pufferban újra szuszpendáljuk, vagyis olyan térfogatú pufferban, amely elegendő a nukleinsavak feloldásához; ez általában 100 pg-l mg DNS-t jelent 1 ml oldatra. Ezt az oldatot újra extraháljuk fenol/kloroform/izoamil-alkohollal majd kloroform/izoamil-alkohollal, végül etanollal kicsapjuk.
A nukleinsavakat újra feloldjuk minimális térfogatú TE-pufferban. Az ebben az oldatban levő RNS-t dúsítjuk vagy centrifugálással 4 ml CsCl „párnán” [1 g CsCl/ml, 1 mmól/liter EDTA, 10 mmól/liter Tris- (pH 7,4) pufferban] vagy kicsapással olyan módon, hogy az oldatot LiCl-ra nézve 2 mól/literessé tesszük, 4-8 °C hőmérsékleten tartjuk egy éjszakán át, majd centrifugálással összegyűjtjük. A poli A+ RNS-t az oldatból oligo(dT) cellulóz oszlopon végzett affinitás-kromatográfiával kigyűjtjük. Általában 0,25 g oligo(dT) cellulózt (3, típus, Collaborative Research) készítünk elő a kromatográfiához 5-10 mg teljes RNS-re számítva. 0,25 g oligo(dT) cellulózból 2 ml ETS-pufferral zagyot képzünk és egy kis, szilikonozott üvegoszlopba töltjük. Ezt az oligo(dT) cellulóz oszlopot mossuk olyan módon, hogy 10 ml 0,1 mól/literes oldatot rétegezünk az oligo(dT) cellulózra, és a mosóoldatot hagyjuk átfolyni az oligo(dT) cellulóz mátrixon. Az oligo(dT) cellulózt azonos módon mossuk 10 ml ETS-pufferral, és utoljára 10 ml 0,5 mól/literes NETS-pufferral mossuk.
A teljes RNS-t (5-10 mg) újra szuszpendáljuk ETSpufferban legfeljebb 10 mg/ml koncentrációban, 65 °C hőmérsékletű vízfürdőre helyezzük 2 percre, majd azonnal jégre helyezzük. Az RNS-oldatot azután hagyjuk felmelegedni szobahőmérsékletre, és 5 mól/literes NaCI törzsoldatból annyit adunk hozzá, hogy az RNSoldatban a végső sókoncentráció 0,5 mól/liter NaCI legyen. Az így létrejött RNS-oldatot az elkészített oligo(dT) cellulóz oszlopra rétegezzük és lassan hagyjuk átáramolni az oszlopon keresztül mintegy 1 csepp/5 másodperc sebességgel. Az oszlop alján kifolyó anyagot egy csőben összegyűjtjük, és újra az oszlop tetejére rétegezzük. Az oszlop aljáról összegyűjtött anyagot ismét a tetejére rétegezzük másodszor ismételve, olyan RNS-oldatot nyerve, amely összességében háromszor halad keresztül az oligo(dT) cellulóz oszlopon. Az utolsó áthaladás után az anyagot összegyűjtjük és poliA-RNS, azaz nem poliA-RNS-t jelöljük. Az oszlopot azután 30 ml 0,5 mól/literes NETS-el mossuk és végül a poliA+-RNS-t az oszlopról eluáljuk olyan módon, hogy 5 ml ETS-puffert terhelünk az oszlopra és ezt a puffért hagyjuk lassan átáramlani, összegyűjtve a poliA+-RNS-frakciót az oszlop fenekéről folyó 5 ml frakcióban. Feltéve hogy nincs NaCI a poliA+-RNSfrakcióban, a frakció NaCI koncentrációját 0,25 móí/literre állítjuk be és az RNS-t etanollal kicsapjuk.
III. példa
A cDNS-„könyvtár megalkotása
Komplementer DNS- (cDNS-) kiónokat szintetizálunk az alábbiak szerint. 10 g H. példában leírtak szerint készített poliA+-RNS-t újra szuszpendálunk 7 μΐ H2O-ban, majd 2,7 mmól/liter CH3HgOH végső koncentrációra állítjuk be, majd szobahőmérsékleten inkubáljuk 5 percen át. Az első cDNS-szálat 42 °C hőmérsékleten 15 percen át szintetizáljuk 50 μΐ olyan oldatban, amely 50 mmól/1 Triszt (pH 8,3 42 °C hőmérsékleten), 10 mmól/liter MgCl2-t, 30 mmól/liter 2-merkapto-etanolt, 70 mmól/liter KCl-t, 500500 gmól/liter dATP-t, dGTP-t és TTP-t, 200 pmől/liter dCTP-t, 25 pg/ml oligo(dT)-t, 60 gg/ml aktinomicin D-t, 25 egység RN-azint (Biotec, Inc,), 25 gCi a-32P-dCTP-t (32,5 pmól) és 120 egység reverz transzkriptázt (Life Sciences, Inc.) tartalmaz. A reakciókeveréket 37 °C hőmérsékleten inkubáljuk további 15 percen át. A reakciót 2 μΐ 0,5 mól/literes EDTA és 0,5 μΐ 20%-os SDS hozzáadásával állítjuk le. A reakciókeveréket 0,3 mól/liter NaOH-koncentrációra állítjuk be és inkubáljuk 65 °C hőmérsékleten 30 percen át. A reakciókeveréket ezután 10 μΐ 1 mól/literes Trisz (pH 7,4) hozzáadásával semlegesítjük, és a reakciókeveréket 0,21 mól/l HCl-koncentrációra állítjuk be. A reakciókeveréket ezután fenol/kloroform/izoamil-alkohol keverékkel majd kloroform-izoamil-alkohol keverékkel extraháljuk, és végül Sephadex G50 oszlopon TE-pufferban összegyűjtjük és 100 μΐ-re koncentráljuk vagy butanolos extrahálással vagy vákuum alatti centrifugálással történő bepárlással. Az egyszálú cDNS-t etanollal kicsapjuk a koncentrált oldatból, a cDNS-t centrifugálással összegyűjtjük és újra szuszpendáljuk 100 μΐ vízben.
A vizes egyszálú cDNS-oldatot 2,5 mól/liter ammónium-acetát-koncentrációra állítjuk be, etanollal kicsapjuk, centrifugálással összegyűjtjük és 20 μΐ vízben újra szuszpendáljuk. Ezt az egyszálú DNS-oldatot 50 μΐ végső térfogatra visszük 50 mmól/literes káliumfoszfát-pufferral, amely 5 mmól/liter MgCl2-t, 1 mmól/liter 2-merkapto-etanolt, 250-250 pmól/liter dATP-t, dGTP-t és TTP-t, 125 gmól/liter dCTP-t, 25 pCi-a-32P-dCTP-t (32,5 pmól) és 8 egység DNS Poll Klenow-fragmenst (New England Biolabs) tartalmaz. Az így létrejött reakciókeveréket 37 °C hőmérsékleten inkubáljuk egy órán át abból a célból, hogy szintetizáljuk a komplementer második DNS-szálat az egyszálú cDNS-hez. A reakciót 2 μΐ 0,5 mól/literes EDTA hozzáadásával állítjuk le. A kétszálú cDNS-t fenol/kloroform/izoamil-alkohollal extraháljuk majd kloroform/izoamil-alkohollal extraháljuk, és Sephadex G50 oszlopon kromatografáljuk TE-pufferban. A kétszálú cDNS-frakciókat összegyűjtjük, és az összegyűjtött anyagot koncentráljuk és kicsapjuk, amint ezt az egyszálú DNS-nél leírtuk.
A végső etanolos kicsapás és a kétszálú cDNS centrifugálással történő összegyűjtése után az üledéket 2019
HU 205 627 Β pl vízben újra szuszpendáljuk, majd 50 μΐ végső térfogatta állítjuk be 50 mmól/liter írisszel (pH 8,3 42 °C hőmérsékleten), amely 10 mmól/liter MgCI2-ot, 30 mmól/liter 2-merkapto-etanolt, 70 mmól/liter KCl-ot, 500 mól/liter dXTP-t és 150 egység reverz transzkriptázt tartalmaz. Az így létrejött oldatot 42 °C hőmérsékleten Inkubáljuk 15 percen át abból a célból, hogy biztosítsuk a cDNS második szála szintézisének teljességét. A reakciót 2 μΐ 0,5 mól/literes EDTA hozzáadásával állítjuk le és koncentráljuk, majd kicsapjuk, amint ezt egy egyszálú cDNS reakciójánál leírtuk.
A kétszálú cDNS-üledéket újra szuszpendáljuk 42 μΐ H2O-val és az oldatot 47 μΐ végső térfogatra állítjuk be 5 μΐ törzsoldat hozzáadásával, amely 2,8 mól/liter NaCl-ot, 200 mmól/liter NaOAc-ot és 45 mmól/liter ZuSO4-ot tartalmaz, majd a pH-t 22 °C hőmérsékleten 4,5-re állítjuk be. Abból a célból, hogy a „hajtű”-hurkot leemésszük, három külön reakciót végzünk három különböző koncentrációjú SÍ nukleázzal (Sigma). 1 egység, 10 egység vagy 100 egység SÍ nukleázt adunk hozzá, a reakicókeveréket 50 μΐ-re egészítve ki, és a reakciót 22 °C hőmérsékleten inkubáljuk 30 percen át A reakciót 2μ1 0,5 mól/literes EDTA és 2,67 μΐ 2 mól/literes Trisz-bázis hozzáadásával állítjuk le. 6 μg nyűlmáj tRNS-t adunk hozzá hozdozóként és a reakciókeveréket koncentráljuk, majd kicsapjuk, amint ezt korábban leírtuk, azzal az eltéréssel, hogy a DNSüledéket ΤΕ-pufferben inkubáljuk víz helyett. Az utolsó kicsapás után az üledéket újra szuszpendáljuk 20 μΐ TE-pufferban, és 50 μΐ végső koncentrációra egészítjük ki teminális transzferáz pufferral (BRL), amely 10 pmól a-32P-dCTP-t, 2 pmól/liter dCTP-t és 21 egység terminális transzferázt tartalmaz (Ratliff Biochem). Az így létrejött oldatot 37 °C hőmérsékleten 30 percen át inkubáljuk abból a célból, hogy poli(d/C)-farkat kapcsoljunk a kétszálú cDNS 3’-OH végéhez. A reakciót 5 μΐ 0,5 mól/literes EDTA hozzáadásával állítjuk le, éxtraháljuk, kromatografáljuk és etanolos csapadékként tároljuk.
A kétszálú, d/C-farokkal ellátott cDNS-t vagy ismét újból kötjük a PstI helyénél nyitott, poli(G)-farokkal ellátott pBR322-höz vagy először méret szerint farkcionáljuk Sepharose CL 4B-200 oszlopon (25 μΐ-es frakciók). A nem frakcionált „könyvtár” esetében 150 ng kétszálú, poIi(d/C)-farokkal ellátott cDNS-t kötünk 180 μΐ lOmmól/Iiteres Triszben (pH 7,4) - amely NaCl-ra 0,1 mól/literes és EDTA-ra 1 mmól/literes 900 ng d/G-farokkal ellátott, PstI helyénél nyitott pBR322-höz. A frakcionált „könyvtár” minden 25 mles frakciójához 125 ng poli(d/G)-farokkal ellátott pBR322-t kötünk 50 μΐ végső térfogatú, a fentebb leírttal azonos összetételű kötőkeverékben. A kötő reakciókeveréket 65 °C hőmérsékleten inkubáljuk 3 percen át majd 42 °C hőmérsékleten 2 órán át, majd hagyjuk lehűlni lassan szobahőmérsékletre.
A kötött cDNS „könyvtár”-at alkalmas E. coli LE392-be (ATCC 33 572) kötjük a következő módon: LE392 inokulumot növesztünk egy éjszakán át 37 °C hőmérsékleten 2 x LB tápközegben. 5 ml ilyen egy éjszakán át nőtt tenyészetet ínokulálunk 200 ml friss 2 x LB tápközegbe és növesztjük 37 °C hőmérsékleten, amíg az OD^ érték 0,2-0,3 lesz. Ezt a tenyészetet 10 percre jégbe helyezzük és a sejteket ezután 4 °C hőmérsékleten végzett centrifugálással összegyűjtjük. A sejtüledéket 80 ml jéghideg 0,1 mól/literes CaCl2ban újra szuszpendáljuk és 25 percen át inkubáljuk 4°C hőmérsékleten. A sejteket 4 °C hőmérsékleten végzett centrifugálással összegyűjtjük, a sejtüledéket újra szuszpendáljuk 2 ml jéghideg 0,1 mól/literes CaCl2-ban és legalább 2 óra hosszat inkubáljuk 4 °C hőmérsékleten felhasználás előtt. Ezután 200 μΐ megfelelő sejtet alkalmazunk 50 μΐ „kötőkeverék”-hez a transzformálásnál. A megfelelő sejteket és a DNS-t egyesítjük és kb. 4 °C hőmérsékleten Inkubáljuk 10 percen át, ezt követi az inkubálás 37 °C hőmérsékleten 5 percen át, végül a keveréket 10 percre jégé helyezzük. Azonos térfogat 2 x LB-tápközeget adunk a transzformációs keverékhez és inkubáljuk 37 °C hőmérsékleten 45 percen át. A transzformált sejteket lemezre visszük 250 μΐ/lemez mennyiségben, 150 mmes 2 x LB lemezekre, amelyek 15 pg/ml tetraciklint is tartalmaznak. A lemezeket ezután 37 °C hőmérsékleten inkubáljuk 24 órán át, és 4 °C hőmérsékleten tároljuk.
Replikalemezeket készítünk, nittocellulóz szűrőket „átpecsételve” egy eredeti szűrőre, hogy a telepeket a lemezről kiemeljük. Ezeket a replikalemezeket 2 X LB-Tet lemezeken (15 pg/ml tetraciklin) inkubáljuk. A szűrőn levő telepeket az átvizsgáláshoz úgy készítjük elő, hogy átvíve a szűrőket 2 x LB-Tet lemezekre visszük át, amelyek 200 pg/ml klóramfenikolt is tartalmaznak, majd a szűrőket 37 °C hőmérsékleten legalább 12 órán át inkubáljuk, majd a telepeket lizáljuk úgy, hogy a szűrőket vizes gyűjtőedényben öblítjük 10 percen át, az öblítővíz 1,5 mól/liter NaCl-t és 0,5 mól/liter NaOH-t tartalmaz. A szűrőket ezután semlegesítjük vizes gyűjtőedényben öblítve 15 percen át, az öblítővíz 1,5 mól/liter NaCl-tés 0,5 mól/liter Triszt (pH 7,4) tartalmaz; ezt a semlegesítő öblítést még egyszer megismételjük. A szűrőket ezután levegőn szárítjuk és végül vákuumban szárítjuk 2 órán át 70 °C hőmérsékleten.
IV. példa
Telep-hibridizálás
A cDNS-könyvtárat tartalmazó, vákuumban szárított nittocellulóz szűrőket (amelyeket az előző példák szerint készítettünk) előhibridizáljuk 42 °C hőmérsékleten 5 órán át előhibridizáló pufferban. A szűrőket eltávolítjuk az előhibridizáló pufferból és enyhén ledörzsöljük kesztyűs kézzel 5 x SSPE-be abból a célból, hogy a sejttörmeléket eltávolítsuk. A szűrőket hibridizáló pufferba helyezzük (ez azonos az előhibridizáló pufferral az 1 x Denhardt-féle oldat kivételével), vagy SÍ nukleázzal enyhébb körülmények között emésztett 32P-vel jelzett egyszálú cDNS- t (106 beütés/perc/ml), vagy végén jelzett metanolon vagy etanolon nőtt Pichia pastorisból izolált poliA+mRNS-t hibridizálunk a szűrőkhöz 17 órán át 42 °C hőmérsékleten. A hibridizálás után a szűrőket rövid ideig mossuk 2 x SSPE-ben 22 °C hőmérsékleten,
HU 205 627 Β ezt követi két mosás 65 °C hőmérsékleten 0,1 x SSPE-ben, mindkettő 10 percig,
A poliA+-mRNS vég jelzését úgy hajtjuk végre, hogy 2 pg poliA+-mRNS-t adunk 50 μΐ térfogatú 50 mmól/literes íriszhez (pH 9,5), 100 °C hőmérsékleten melegítjük 3 percen át, majd gyorsan lehűtjük jégen. Ezt az RNS-oldatot 200 μΐ végső térfogatra hígítjuk és beállítjuk 50 mmól/liter Trisz (pH 9,5), 10 mmól/liter MgCl2, 5 mmól/liter DTT és 50 pmól 32P-cc-ATP tartalomra. 10 egység T4 polinukleotid-kinázt (Boehringer Mannheim) adunk hozzá és a keveréket 37 °C hőmérsékleten inkubáljuk 1 órán át. A kinázreakciót 10 μΐ 0,5 mól/literes EDTA hozzáadásával leállítjuk fenol/kloroform/izoamil-alkohol- keverékkel extraháljuk és kromatografáljuk Sephadex G50-en át, hogy eltávolítsuk a be nem épült radioaktív jelzést.
V. példa
Northern hibridizálás
2-5 pg poliA+-mRNS-t melegítünk 65 °C hőmérsékleten 5 percen át 10 mmól/literes nátrium-foszfátpufferban (pH = 7,4), amely 50% formamldot, 2,2 mól/liter formaldehidet és 0,5 mmól/liter EDTA-t tartalmaz. Az így létrejött oldatot szobahőmérsékletre lehűtjük, és megfelelő mennyiségű (általában a kezelt minta térfogatára vonatkoztatva 0,2 térfogat) 5 x „minta puffer”-t adunk hozzá (0,5% SDS, 0,025% brómfenolkék, 25% glicerin, 25 mmól/liter EDTA). A mintákat 1,5 %-os agaróz gélre visszük, amely 1,1 mól/liter formaldehidet tartalmazó 10 mmól/literes nátriumfoszfát-pufferral (pH 7,4) készült, és azonos pufferban elektroforézisnek vetjük .alá, A gélt akridin naranccsal (33 gg/ml) festjük meg 10 mmól/liter nátrium-foszfát pufferban (pH 7,4), festékmentesítjük a gélt azonos pufferban 10 percig öblítve, majd 10 x SSPE-ben legalább 10 percig öblítve az RNS-t nitrocellulózra viszszük át, amint ezt a VI. példában leírjuk.
VI. példa
Genomiális DNS és klánok izolálása
Pichia genomiális DNS-t izolálunk a II. példában a Pichia RNS izolálásához leírt módszert alkalmazva. A nukleinsav-üledéket újra szuszpendáljuk minimális térfogatú TE-pufferban, és inkubáljuk 20 gg/ml RN-áz A-val 30 percen át 37 °C hőmérsékleten. Az oldat NaCi-koncentrációját 0,14 mól/literre állítjuk és K proteinázzal kezeljük, 200 gg/ml mennyiségben alkalmazva 15 percen át 22 °C hőmérsékleten. Az így létrejött oldatot először fenol/kloroform/izoamil-alkohollal majd kloroform/izoamil-alkohollal extraháljuk, és végül etanollal kicsapjuk. A kicsapott DNS-t újra szuszpendáljuk minimális térfogatú TE-pufferban, és centrifugáljuk, hogy tisztítsuk a DNS-oldatot.
gg, az előző bekezdésben leírtak szerint készített Pichia genomiális DNS-t emésztünk különböző restrikciós enzimekkel (BRL) és elektroforézisnek vetjük alá 1%-os agaróz gélen, amely TAE-t tartalmaz. A DNSfragmenseket a gélen denaturáljuk a gélt 1,5 mól/liter NaCl és 0,5 mól/liter NaOH-oldatba áztatva 20 percen át. Az átvitel előtt a gélt legalább 5 percig 10 X SSPEben áztatjuk. Egy nitrocellulóz lemezt vágunk a gél méretéhez, vízben megnedvesítjük és röviden áztatjuk 10 x SSPE-ben. Ezt a szűrőt a gél tetejére fektetjük, amelyet viszont már előzőleg egy darab parafilmre helyezzünk. Whatman-szűrőpapírlapot és egy papírtörölköző köteget helyezünk a nitrocellulóz tetejére, hogy a DNS-t kivonjuk a gélből és átvigyük a nitrocellulózra. Egy súlyt teszünk rá a kötegre, hogy megkönnyítsük az átvitelt, A DNS-t hagyjuk ezen a módon átvándorolni legalább 3 órán át. Az átvitel után a szűrőt röviden leöblítjük 5 x SSPE-ben, levegőn szárítjuk, és vákuumban szárítjuk 70 °C hőmérsékleten 2 órán át. Komplementer genomfragmenseket azonosítunk hibridizálással a pPC 8.0, pPC 6.4 és pPC 15.0 „nick” transzlációnak alávetett cDNS-klónokhoz, ugyanazokat az előhibridizáló, hibridizáló- és mosópufferokat alkalmazva, amelyeket a IV. példában leírtunk.
200 ng cDNS-klónt vetünk alá nick-transzlációnak 14 °C hőmérsékleten 30 μΐ oldatban, amely 50 mmól/liter Trisz-HCl-t (pH 7,4), 10 mmól/liter MgSO4-et, 100 pmól/liter DTT-t, 50 pg/ml BSA-t, 2020 pmól/liter dGTP-t, TTP-t és dATP-t, 31,25 pmól 32P-a-dCTP-t (3200 Ci/mmól, NEN), 2 egység E. coli DNS Poll-et (BRL) és 0,02 ng DN-áz I-et tartalmaz. A reakciót 1 μΐ 0,5 mól/literes EDTA és 1 μΐ 20%-os SDS hozzáadásával állítjuk le. A jelzett DNS-oldatot 0,3 mól/liter NaOH-koncentrációra állítjuk be és percre forró vízbe helyezzük. Ezt a keveréket Sephadex G50 oszlopon kromatografáljuk. A jelzett DNS-frakicókat összegyűjtjük, a fajlagos aktivitást meghatározzuk, és a vizsgáló mintát a hibridizálási kísérletekben alkalmazzuk.
Azokat a genom fragmenseket, amelyek hibridizálódnak a cDNS vizsgáló mintákhoz, izoláljuk, 2Ó0 pg Pichia genom DNS-t emésztve az előbbiekben használt restrikciós enzimekkel (BRL) és az emésztett anyagot elektroforézisnek vetjük alá 1%-os agaróz gélen TAEpufferban. A cDNS-klőnokkal hibridizálódó fragmenseknek megfelelő méretű sávokat kivágjuk az agaróz gélből, a DNS-t elektroelucióval kivonjuk, átengedjük Elutip oszlopon (Schleicher and Schüll) és etanollal kicsapjuk.
Az elektroelucióval nyert fragmenseket újra szuszpendáljuk vízben és 200 ng fragmenst ligálunk 500 ng pBR322-höz, amelyet a megfelelő restrikciós helyeken elhasítottunk és szükség esetén defoszforileztünk. A ligálási reakciót 300 pl 66 mmól/literes Triszben (pH 7,4) hajtjuk végre, amely 6,6 mmól/liter MgCl2-t, 10 mmól/liter DTT-t, 0,4 mmól/liter ATP-t, 25 μg/ml BSA-t és 4080 egység T4 DNS-ligázt tartalmaz, majd inkubálunk °C hőmérsékleten 24 órán át. A ligálási keveréket közvetlenül megfelelő E. coli LE392 sejtekbe transzformáljuk. A sejteknek a reakcióhoz alkalmassá tételét és a transzformálást a Hl.példában leírtak szerint végezzük. 3 transzformáció-sorozatot végzünk el 10, 40 és 100 ng pBR322-vel (plusz beiktatás), minden transzformációhoz 100 μΐ megfelelő sejtet alkalmazva. A sejteket lemezre visszük, amint ezt a IH. példában leírtuk, azzal a különbséggel, hogy az antibiotikumos szelekciót 50 pg/ml ampicillinnel végezzük. A kiónokat átvisszük
HU 205 627 Β nitrocellulózra, replikáljuk és a hibridizáláshoz előkészítjük a IH. példában leírtak szerint A szűrőket átvizsgáljuk a megfelelő nick-transzlációnak alávetett cDNS-fragmensekkel. A szélesztéssel tisztított telepeket, amelyek a hibridizálásban pozitívak, alkalmazzuk további plazmidok előállítására a következőképpen.
A plazmidot hordozó LE392 E. coli-t növesztjük 1,0 ODgoo értékig 1 x LB-tápközegben, amely 50 pg/ml ampicillint is tartalmaz és egy éjszakán át szaporítjuk klóramfenikol hozzáadásával 200 pg/ml végső koncentrációig. A sejteket 0,8% NaCl-t, 20 mmól/liter Triszt (pH 8,0), 20 mmól/liter EDTA-t tartalmazó oldattal mossuk, majd lizozimmal kezeljük 25% szacharózt, 50 mmól/liter Triszt (pH 7,4), 20 mmól/liter EDTA-t és 450 pg/ml lizozimot tartalmazó oldatban. A lízist annyi mól/liter NaCl hozzáadásával érjük el, hogy a végső koncentráció 2,0 mól/liter legyen, ezt követi azonos térfogatú, 0,2%-os Triton X-100 és 40 mmól/literes EDTA hozzáadása. A preparátumot 20 000 fordulat/perccel 45 percen át végzett forgatással tisztítjuk. A felülúszót azután fenol/kloroform/izoamil-alkohol keverékkel extraháljuk majd klorofoim/izoamil-alkohollal extraháljuk, és etanollal kicsapjuk. Az üledéket újra szuszpendáljuk TE-pufferban, RNáz A-val kezeljük, fenol/klorofonn/izoamil-alkohol keverékkel extraháljuk majd kloroform/izoamil-alkohol keverékkel extraháljuk. Szilárd CsCI-t adunk hozzá, hogy annak végső koncentrációja 800 pg/ml legyen, valamint EtBr-t adunk hozzá, hogy annak végső koncentrációja I mg/ml legyen. Az így létrejött oldatot Vti 50 rotorban forgatjuk 49 000 fordulat/percnél 18-20 órán át 20 eC hőmérsékleten.
A plazmidcsíkokat UV fluoreszcenciával tesszük láthatóvá és a csőből tűvel és injekciós fecskendővel szedjük ki. A plazmidoldatot n-butanollal extraháljuk négyszer és etanollal kicsapjuk -20 °C hőmérsékleten. Az etanolos kicsapást legalább még kétszer megismételjük, hogy eltávolítsuk az összes CsCl-t. A plazmidot -20 °C hőmérsékleten tároljuk, mint etanolos csapadékot.
VII. példa
Az alkoholoxidáz tisztítása
Az I. példa szerint leírt módon metanolon nőtt Pichia pastoris-sejtekből nyert fehérjemintákat készítünk az élesztősejtek lizálásával, amelyet tisztító centrifugálás követ a sejttörmelék eltávolítására a következő módon. A fermetor-folyadék egy részét kivesszük és pH 7,5-re állítjuk be ammónium-hidroxiddal, majd Dyno-Mill Model KDL berendezésen homogenizáljuk 0,6 literes edényt alkalmazva folytonos üzemmenetben 30 °C hőmérsékleten 3# szíjkombinációt használva és 20-30 ml/óra átfolyást. A gyöngyök a malomban ólommentes üveggyöngyök 0,3-05 mm átmérővel. Az így létrejött homogenizátumot 5 °C hőmérsékleten és 20 000 g-vel centrifugáljuk 30 percen át, sejtmentes felülúszót nyerve.
A sejtmentes felülúszó 6 db 130 ml-es frakcióját cellulózacetát dializálózacskóba tesszük és 5 °C hőmérsékleten dializáljúk 8 liter desztillált vízzel szemben. 4 nap után az egyes zacskók vizes fázisait dekantáljuk. A zacskókban maradt szilárd anyagok két típusú szilárd anyagot tartalmaznak. A vékony fehér felső réteget gondosan eltávolítjuk és eldobjuk. Az alsó szilárd anyag barnás-sárga színű, ez kristályos alkoholoxidáz. A kristályos alkoholoxidáz egy részét desztillált vízben újra oldjuk (kb. a szilárd anyag tízszeres térfogatának megfelelő mennyiségben), és a mérés a festék-peroxidáz módszerrel 94 enzimegység/ml aktivitást mutat. Az alkoholoxidáz fajlagos aktivitása 10,4 enzimegység/mg fehérje.
A fentebb leírt dialízisből létrejött kristályos csapadékot 0,05 mól/literes kálium-foszfáttal (pH 7,5) szemben dializáljúk, és 2x200 cm-es, azonos pufferral kiegyensúlyozott Sephacryl 200 (Pharmacia) oszlopra kötjük. 3,5 ml-es frakciókat szedünk 10 ml/óra átáramlási sebesség mellett, és mérjük az alkoholoxidáz aktivitását.
Az alkoholoxidáz-aktivitást a metanollal végzett reakcióhoz a következő vizsgálati eljárással (festék-peroxidáz módszer) határozzuk meg. Festék-puffer keveréket készítünk 0,1 ml o-dianizidin oldat (1 tömeg% o-dianizidin vízben) összekeverésével 12 ml levegőztetett 0,1 mól/literes nátrium-foszfát-pufferral (pH 7,5). A mérési keveréket 2,5 ml festék-puffer keverékből, 50 pl metanolból, 10 μΐ peroxidáz oldatból [1 mg torma-peroxidáz (Sigma, H. típus)] és 25 μΐ alkoholoxidáz oldatból készítjük el. A mérési keveréket 25 °C hőmérsékleten tartjuk egy 4x1x1 cm-es küvettában, és a festék által előidézett növekedést az abszorbanciában 460 nm-nél rögzítjük 2-4 percen át. Az enzimaktivitást a következő képlet alapján számítjuk:
Aktivitás (pmól/perc/ml vagy enzimegység/ml) ~-perc x 11,5, ahol a 11,5 egy standard görbére alapozott faktor, amely standard görbét H2O2 ismert alikvotjaival készí- 50 tettük el, és ΔΑ a változás az abszorbanciában a kísérleti intervallum során.
Minden frakcióból 0,1 pg teljes fehérjét alkoho Ioxidáz-tartalmát mérjük gélelektroforézissel, SDS-poliakrilamidon (12%).
VIII. példa
DNS és fehérje frakcióelemzés
A DNS-szekvenciák meghatározását a didezoxi lánchosszabbító módszerrel hajtjuk végre Ml3 bakteri- 60 ofágot alkalmazva (Sanger és munkatársai, 1980), vagy kémiai módosító eljárással (Maxam-Gilbert, 1980). Az alkoholoxidáz gén 5’ végének megfelelő DNS-fragmenseket beiktatjuk az M13mp8 és M13mp9 vektorokba, vagy végjelezzük a kémiai módosítási eljáráshoz, az ezen a területen rendelkezésre álló restrik55 ciós enzimhelyeket alkalmazva.
A pPG 4.0-ból származó 710 bp-s HindlII/SalI-fragmenst végjelezzük a Maxam-Gilbert-féle szekvenciaelemzéshez, először 33 pg plazmidot emésztve HindHI-al. A reakciókeveréket fenol/kloroform/izoamilalkohol keverékkel extraháljuk, majd kloroform-izo22
HU 205 627 Β amil-alkohol keverékkel extraháljuk, és etanollal kicsapjuk. A DNS-t centrifugálással összegyűjtjük és újra szuszpendáljuk 31 μΐ vízben. 100 μθί 32P-ct-dCTP-t (3200 Ci/mmól) és két egység Poll Klenow-fragmenst adunk a reakciókeverékhez, hogy a keverék végső térfogata 50 μΐ legyen, és a keveréket úgy állítjuk be, hogy végül 400 μΐ/liter dATP-t, 400 μπιόΐ/liter dGTP-t, 50 mmól/liter Triszt (pH 7,4), 10 mmól/liter MgSO4-ot és 1 mmól/liter DTT-t tartalmazzon. A reakciókeveréket 37 °C hőmérsékleten indukáljuk 1 órán át, és a reakicót 2 μΐ 0,5 mól/literes EDTA hozzáadásával állítjuk le. A keveréket azután fenol/kloroform/izoamil-alkohol keverékkel extraháljuk, majd kloroform-izoamil-alkohol keverékkel extraháljuk, majd kloroform-izoamil-alkohol keverékkel Sephadex G-50 oszlopon kromatografáljuk, és a jelzett nukleinsav-frakciókat összegyűjtjük és etanollal kicsapjuk. Centrifugálás után a DNS-üledéket vízben újra szuszpendáljuk és Sall-gyel emésztjük. Az emésztett anyagot elektroforézisnek vetjük alá 1%-os agaróz gélen TAE-pufferban, és a 710 bp-os csíkot kivágjuk a gélből, a DNS-t elektroelucióval kinyerjük, butanolial extraháljuk és etanollal kicsapjuk. A fragmenst újra szuszpendáljuk 100 μΐ TE-pufferban, 2,5 mól/literes ammónium-acetát koncentrációra állítjuk be, majd etanollal kicsapjuk. Az így létrejött DNS-fragmenst újra szuszpendáljuk TE-pufferban 50 000 cpm/μΐ koncentrációnál.
A négy bázismódosító reakciót a következőképpen hajtjuk végre:
a) a G (guanin) reakciókeveréket inkubáljuk 8 percen át 22 °C hőmérsékleten, ez 1 μΐ (50 000 cpm) jelzett DNS-fragmenst, 4 μΐ vizet, 200 ml 50 mmól/literes nátrium-kakodilátot (pH 8,0), 1 mmól/liter EDTA-t (DMS-puffer) és 1 μΐ dimetil-szulfátot tartalmaz. A reakciót 50 ml DMS-leállító puffer hozzáadásával állítjuk le, amely 1,5 mól/liter nátrium-acetátot (pH 7,0), 1 mól/liter 2-merkapto-etanolt és 100 μg/ml tRNS-t tartalmaz, majd etanolt (750 μΐ) adunk a reakicókeverékhez, és a reakciókeveréket -70 °C hőmérsékleten tartjuk legalább 15 percig.
b) a G/A (guanin/adenin) reakciókeveréket inkubáljuk 10 percen át 22 °C hőmérsékleten, ez 2 μΐ (100 000 cpm) jelzett DNS-fragmenst, 8 μΐ vizet és 30 μΐ hangyasavat tartalmaz. A reakciót 200 μΐ Hz leállító-puffer hozzáadásával állítjuk le [0,3 mól/liter nátrium-acetát (pH 5,5), 0,1 mól/liter EDTA és 25 μg/ml tRNS], majd etanolt (750 μΐ) adunk hozzá, és a reakciókeverékez -70 °C hőmérsékleten tartjuk legalább 15 percig.
c) a T/C (timidin/citozin) reakciókeveréket inkubáljuk 10 percen át 22 °C hőmérsékleten, ez 2 μί (100 000 Cpm) jelzett DNS-fragmenst, 18 μΐ vizet és 30 μg hidrazint tartalmaz. A reakciót azonos módon állítjuk le, ahogyan ezt a fentebb említett b) pontban leírtuk.
d) a C (citozin) reakciókeveréket 10 percen át inkubáljuk 22 °C hőmérsékleten, ez 1 μΐ (50 000 cpm) jelzett DNS-fragmenst, 4 μΐ vizet, 15 μg 5 mól/literes NaCl-t és 30 μΐ hidrazint tartalmaz. A reakciót a b) pontban leírtak szerint állítjuk le.
A DNS-üledéket centrifugálással összegyűjtjük, újra szuszpendáljuk 250 μΐ 0,3 mól/literes nátrium-acetátban (pH 5,5) és etanolos kicsapást végzünk 750 μΐ 95%-os etanollal. Az üledéket centrifugálással összegyűjtjük, vákuumban szárítjuk 5 percig, és a DNS-t elhasítjuk az üledéket újra szuszpendálva 100 μΐ 1: 10 (térf./térf.) piperídinnel történő hígítással. A hasítási reakciókeveréket 90 °C hőmérsékleten inkubáljuk 30 percen át, és leállítjuk 500 μΐ 98%-os etanolt, 60 mmól/liter nátrium-acetátot (pH 5,5) és 10 μg/ml tRNS-t tartalmazó oldat hozzáadásával, A reakciókeveréket szárazjég/etanol fürdőbe (kb. -70 °C) helyezzük mintegy 5 percre, és a DNS-fragmenseket centrifugálással összegyűjtjük. A fragmenseket újra szuszpendáljuk 50 μΐ 0,3 mól/literes nátrium-acetátban (pH 5,5), majd etanolos kicsapást végzünk 100 μΐ 95%-os etanollal. Ezt az etanolos kicsapást megismételjük, az üledéket 95%-os etanollal mossuk, centrifugáljuk és vákuumban bepároljuk. Az üledéket újra szuszpendáljuk 10 μΐ 80%-os formamidot, 10 mmól/liter NaOH-t, 1 mmól/liter EDTA-t, 0,1% xilol-cianolt és 0,1% brómfenolkéket tartalmazó oldatban. 2-3 μΐ-t elektroforézisnek vetünk alá 10%-os, 0,4 mm vastag poliakrilamid gélen, TBE-pufferban.
Az alkoholoxidáz aminosav-szekvenciáját a Sequemat, Inc. (Watertown, Massachussets) készülékével határozzuk meg, 2 mg tisztított, Pichia pastorisból nyert alkoholoxidázt alkalmazva. Az érett fehérje első 18 aminosava a következő szekvenciát mutatja (a kezdő Met nélkül): Ala-Ile-Pro-Glu-Glu-Phe-Asp-Ile-LeuVal-Leu-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Ser.
IX. példa
Az alkoholoxidáz-átírás kiindulási helyének meghatározása
Hogy meghatározzuk, hogy az alkoholoxidázhoz tartozó mRNS rajthelye hol helyezkedik el, egy primer kiterjesztési kísérletet hajtunk végre az alkoholoxidáz gén 5’ vége DNS-szekvenciáiról másolt szintetikus oligonukleotidot alkalmazva primerként és 10 μg poliA+ Pichia pastoris mRNS-t alkalmazva templátként. 10 μg Pichia pastoris poliA+-mRNS-t egyesítünk 3 ng primerrel (5’-CTT CTC AAG TTG TCG-3’) 9,3 μΐ végső térfogatban, amely 43 mmól/liter NaCl-ot, 29,2 mmól/liter Triszt (pH 8,3), 5,2 mmól/liter MgCl2-t és 4,3 mmól/liter DTT-t tartalmaz. A nukleinsavakat 70 °C hőmérsékleten 5 percen át denaturáljuk és újra egyesítjük lassan lehűlni hagyva 22 °C hőmérsékletre. Az újraegyesített keveréket egy csőbe helyezzük, amely 4 μΐ dNTP-keveréket, 0,8 μί RT-puffert és 1 μί 32P-ct-dCTP-t (800 Ci/mmól) tartalmaz. 3 μΐ-t ebből a keverékből hozzáadunk 1-1 μΐ mindegyik megfelelő dNTP-hez. Az utolsó 3 μΐ-t a keverékből 1 μΐ vízhez adjuk. A reakciókat 1 μΐ dilRT hozzáadásával indítjuk be, és 42 °C hőmérsékleten indukáljuk 15 percen át. A reakciókeveréket 3 μΐ Chase RT-vel kezeljük 42 °C hőmérsékleten 15 percen át. A reakciókat 7,5 μΐ formamid-festék keverék hozzáadásával állítjuk le, és 45 μΐ-t elektroforézisnek vetünk alá 0,4 mm vastag gradiensgélen 1 x TBE-ben. Elektroforézis után a gélt 10%-os ecetsavban rögzítjük 10% metanollal 20 per23
HU 205 627 Β cen át. A gélt vákuum alatt szántjuk és XAR röntgensugárfílmnek exponálásához használjuk.
A gradiensgélt a következő módon készítjük: 300 μΐ 10%-os ammónium-perszulfátot és 14 μΐ TEMED-et adunk 30 ml fedőgélhez; 75 μΐ 10%-os ammóniumperszulfátot adunk 7 ml fenékgélhez, 6 ml fedőgélt veszünk ki pipettával, majd 6 ml fenékgélt veszünk ki ugyanazzal a pipettával. A gélt a géllemezek köré öntjük: ezt követi 22 ml fedőgél.
X. példa mRNS hibridizációs szelekció és in vitro transzlációk
Pozitív hibridizációs-transzlációs kísérleteket hajtunk végre 20 pg klónozott Pichia genom DNS (amelyet a VI. példában leírtak szerint állítottunk elő) linearizálásával, különböző restrikciós endonukleázokkal kezelve. Ezt a DNS-t denaturáljuk az oldatot 0,3 mól/literes NaOH koncentrációra állítva be, majd inkubálva 65 °C hőmérsékleten 10 percen át. A denaturált DNS-tartalmú oldatot jégen gyorsan lehűtjük és semlegesítjük 0,5 mól/liter Trisz-HCl koncentrációra beállítással (pH 7,4). Azonos térfogatú 20 x SSPE-t adunk a denaturált DNS-hez közvetlenül a DNS-nek a nitrocellulőz szűrőhöz való kötése előtt, Mielőtt a DNS-t a nitrocellulőz szűrőkre vinnénk (Schleicher and Schuell BA83,9 mm átmérő), a szűrőket előkészítjük H2O-val nedvesítve, 10 percig forralva, majd háromszor 10 x SSPE-ben öblítve. 10 pg DNS-t kötünk ezután minden szűrőhöz úgy, hogy a DNS-t a szűrőre visszük, levegőn majd vákuumban 70 °C hőmérsékleten 2 órán át szántjuk.
Az előhibridizálás előtt a szűrőket a kötött DNS-sel 1 ml steril vízbe helyezzük és 1 percig melegítjük 100 °C hőmérsékleten, jégen hűtjük, 1 ml steril vízzel Vörtex-berendezésben öblítjük és 1 ml előhibridizáló pufferrban, majd 40 pg (2 pg/ml ETS) poliA+-mRNS-t adunk közvetlenül az előhibridizáló pufferba. A hibridizáló keveréket 65 °C hőmérsékleten 10 percen át melegítjük, majd inkubáljuk 42 °C hőmérsékleten 24 órán át.
A hibridizálási követően a szűrőket kétszer röviden lemossuk I x SSPE-ben, amely 0,5% SDS-t is tartalmaz, 22 °C hőmérsékleten, majd hétszer 1 x SSPEben, amely 0,5% SDS-t is tartalmaz, 50 °C hőmérsékleten öblítésenként 5 percig, majd háromszor 0,1 x SSPE-ben 50 °C hőmérsékleten öblítésenként 5 percig, és egyszer 0,1 x SSPE-ben 65 °C hőmérsékleten 10 percig. Az RNS-t eluáljuk a szűrőről 1 percig forralva 300 pl H2O-val, amely 15 pg nyúlmáj tRNS-t tartalmaz. Az elulált RNS-t gyorsan lefagyasztjuk szárazjeges etanolos fürdőben. Az RNS keveréket hagyjuk szobahőmérsékletre felmelegedni, majd a szűrőket eltávolítjuk. Az RNS-keveréket ezután kicsapjuk a közeget 2,5 mól/liter ammónium-acetát koncentrációra állítva be, és etanollal kétszer kicsapva, és végül a csapadékot újra szuszpendáljuk 100 pl vízben, mielőtt liofileznénk.
A fenti RNS-ről történő transzlációkat standard szakember számára ismert módszerekkel végezzük, ilyenek pl. azok az útmutatások, amelyeket a New England Nuclear által forgalmazott in vitro nyúl retikulocita lizátum transzlációs készlethez mellékelt útmutatáson. A fehérjetermékeket 8%-os poliakrilamid-gélen, amely 4,5% kötegelt gélt tartalmaz, vetjük alá elektroforézisnek.
XI. példa
Antiszérum-készítmények és immunkicsapás
Mind p72 (alkoholoxidáz) mind p76 polipeptidet tartalmazó, Pichia pastoris-sejtekből származó kivonat ellen nyulakban kialakuló antiszérumot készítünk, standard eljárásokat alkalmazva a következőképpen: Az extraktumokat PBS-sel szemben dializáljuk injekciózás előtt. Egy 8 hetes eljárás során minden nyúl 3 injekciót kap, amelyek mindegyike 1 mg teljes fehérjét tartalmaz, 0,1 ml térfogatban, 0,2 ml Freund-féle komplett adjuvánssal együtt. Az injekciókat bőr alá adjuk be, 6-10 helyre beadva a nyúlba. A nyolcadik hét végén a nyulakat elvéreztetjük, és ezeket a szérumokat megvizsgáljuk tisztított Pichia pastoris alkoholoxidáz ellenanyag jelenlétére Ouchterlony kettős diffúziós eljárással, amelynek során az antigént és az antitestet egymással szemben diffúndáltatjűk, és azok immunkomplexet képeznek az agaron. (Basic and Clinical Immunology, 1987, Ed: D. P. Stítes, J. D. Stobo, J. V. Wells.)
Tisztított nyúl anti-p72 (alkoholoxidáz) és anti-p76 fehérje antitesteket készítünk a teljes antiszérum affinitás-kromatográfiájával CNBr-dal kapcsolt p72 (alkoholoxidáz)-p76 Sepharose 4B oszlopon (Pharmacia) keresztül. 1 g CNBr-dal aktivált gélt készítünk gélt hidráivá 15 percen át 200 ml mmól/h'teres HCl-ben, ezt követi a mosás 3x50 ml kapcsolőpufferban [0,1 mől/liter nátrium-karbonát (pH 8) és 0,5 mól/liter NaCl]. 5 ml p72-p76 6 mg/ml-es oldatot (kapcsolőpufferban) adunk a gélhez és enyhén keverjük egy éjszakán át 4 °C hőmérsékleten. A nem kötődött fehérjét eltávolítjuk 3x50 ml kapcsolópufferrel öblítve. A megmaradó aktív csoportokat 1 mól/literes etanol-aminnal (pH 8) végzett 2 órás inkubálással távolítjuk el. A nem kovalensen kötött anyagot a gélről 50 ml 2 mmól/literes (PBS-ben) nátrium-tiocianát oldattal végzett mosással távolítjuk el. Az antiszérum kromatográfiája előtt a gélt végül 3x50 ml PBS-sel mossuk. 5 ml tisztított anti p72-p76 antiszérumot keverünk össze a géllel és inkubáljuk enyhe keverés közben 2 órán át 4 °C hőmérsékleten. Az antiszérum-gél keveréket azután egy 1x8 cmes oszlopra pipettázzuk és 15 ml PBS-sel mossuk. A tisztított antitestet eluáljuk az oszlopról 6 ml 2 mól/literes nátrium-tiocianáttal (PBS-ben). Ágéiról történtelúciő után a tisztított antitestet erőteljesen dializáljuk PBS ellen, amely 0,02% nátrium-azidot is tartalmaz.
Az affinitás-kromatográfiáva tisztított antiszérumokat egy PBS-ben (1% NP40-nel kiegészítve) levő in vitro transzlációs keverékhez adjuk és egy éjszakán át inkubáljuk 4 °C hőmérsékleten. Az antigén-antitest komplexet Pansorbinnal (Calbiochem) kicsapjuk jégen 2,5 órán át. A Pansorbint RIPA-pufferban végzett mosással készítjük elő. A Pansorbin-csapadékokat négy24
HU 205 627 Β szer mossuk RIPA-pufferban és Laemmli töltőpufferban oldjuk elektroforézis előtt.
XII. példa
Pichia pastoris transzformálási eljárás
A) Sejtnövesztés.
1. Egy Pichia pastoris GS115 (NRRL Y-15 851) telepet inokulálunk kb. 10 ml YPD tápközegbe és a tenyészetet 30 °C hőmérsékleten rázatjuk 12-20 órán át.
2. Mintegy 12-20 óra múlva a sejteket kb. 0,01-0,1 OD600 értékre hígítjuk és a sejteket a lóg növekedési fázisban tartjuk YPD tápközegben 30 °C hőmérsékleten kb. 6-8 órán át.
3. Kb. 6-8 óra múlva 100 ml YPD tápközeget inokulálunk 0,5 ml inokulumtenyészettel kb. 0,1 OD^-as értékkel (vagy ezzel egyenértékű mennyiséggel). 30 °C hőmérsékleten rázatjuk a tenyészetet 12-20 órán át.
4. Amikor a tenyészet eléri a mintegy 0,2-0,3 OD600 értéket (mintegy 16-20 óra múlva), a tenyészetet kinyerjük 1500 g-vel 5 percen át végzett centrifugálással.
B) Szferoplasztok előállítása
1. A sejteket egyszer lemossuk 10 ml steril vízzel. (Az 1-5. lépésekben minden centrifugálást 5 percen át, 1500 g-vel végzünk).
2. A sejteket egyszer lemossuk 10 ml frissen készített SED-del.
3. A sejteket kétszer lemossuk 10 ml steril, 1 mól/literes szorbit-oldattal.
4. A sejteket újra szuszpendáljuk 10 ml SCE-pufferban.
5. 5-10 pl 4 mg/ml-es Zymolyase 60 000-t (Miles Laboratories) adunk hozzá. A sejteket 30 °C hőmérsékleten inkubáljuk 30-60 percen át.
Mivel a szferoplasztok készítése kritikus lépés a transzformálási eljárásban, a szferoplasztkészítést meg kell figyelni a következőképpen. Sejtek 100 μΐ-es alikvotjait hozzáadjuk 900 pl 5%-os SDS-hez és 900 μΐ 1 mól/literes szorbitoldathoz a zimoliázhoz való hozzáadás előtt vagy közvetlen az után, valamint az inkubálási periódus különböző időpontjaiban. Az inkubálást annál a pontnál állítjuk le, ahol a sejtek lizálódnak SDS-ben, de nem lizálódnak szorbitban (általában az inkubálás 30. és 60. perce között).
6. A szferoplasztokat kétszer mossuk steril 1 mól/literes szorbitoldattal 1000 g-vel centrifugálva 5-10 percen át. (A centrifugálás ideje és sebessége változó lehet; a centrifugálásnak, elegendőnek kell lenni, hogy a szferoplasztok az üledékbe jussana, de nem szabad olyan soknak lenni, hogy az erőtől összezúzódjanak).
7. A sejteket egyszer mossuk 10 ml steril CaS-ben.
8. A sejteket újra szuszpendáljuk összesen 0,6 ml CaS-ben.
C) transzformálás
1. A transzformáló plazmid-DNS-mintákat (20 μΐ térfogatig) 12x75 mm-es steril polipropilén csövekbe visszük. (A DNS vízben vagy TE-pufferban; a maximális transzformálási gyakorisághoz kis mennyiségű DNS-sel ajánlatos hozzáadni kb. 1 μΐ 5 mg/ml-es ultrahanggal kezelt E. coli DNS-t mindegyik mintához).
2. 100 μΐ szferoplasztot adunk minden egyes DNSmintához és szobahőmérsékleten inkubáljuk kb. 20 percen át.
3.1 ml PEG-oldatot adunk minden egyes DNS-mintához és szobahőmérsékleten inkubálunk kb. 15 percen át.
4. A mintákat 1000 g-nél centifugáljuk 5-10 percen át, és a PEG-oldatot dekantáljuk.
5. A mintákat újra szuszpendáljuk 150 μΐ SDS-ben és inkubáljuk 30 percen át szobahőmérsékleten.
6. 850 μΐ steril, 1 mól/literes szorbitoldatot adunk hozzá és lemezre visszük a minták alkivonatjait, amint ezt az alábbiakban leírjuk.
D) A szferoplasztok regenerálása
1. Előírás a Regeneráló Agar Tápközeg elkészítéséhez.
a) Agar-szorbit: 9 g Bacto agart, 54,6 g szorbitot és
240 g vizet autoklávozunk.
b) 10 x glükóz: 20 g glükózt és 100 ml vizet autoklávozunk.
c) 10 X SSC: 6,75 g élesztő nitrogénbázist (aminosavak nélkül) és 100 ml vizet autoklávozunk (bármilyen szükséges aminosavat vagy nukleinsavat 200 μg/ml koncentrációig hozzáadhatunk az autoklávozás előtt vagy után).
d) 30 ml 10 x glükózt és 30 ml 10 ΧΔ SSC-t hozzáadunk az olvadt agar-szorbit oldathoz. 0,6 ml 0,2 mg/ml-es biotinoldatot, és 20 mg/ml koncentrációig bármilyen kívánt aminosavat vagy nukleinsavat adunk hozzá. A Regeneráló Agart olvadt állapotban tartjuk 55-60 °C hőmérsékleten.
2. A transzformálási minták lemezre vitele. Lemezenként 10 ml regeneráló agárból fenékagar réteget öntünk ki legalább 30 perccel azelőtt, mielőtt a transzformálási minták készen vannak. A regeneráló agar 10 ml-es alikvotjait csövekbe osztjuk el, amelyek 45-50 °C-os fürdőben vannak, abban az időszakban, amíg a transzformálási minták SDS-ben vannak. A fentebb leírt transzformálási minták alikvotjait a regeneráló agarai töltött csövekbe adjuk és a lemezek fenékagar rétegére öntjük olyan módon, hogy a megfelelő mintamennyiséget 10 ml-es olvadt, 45-50 °C hőmérsékleten tartott regeneráló agarba visszük és a 10 ml szilárd fenékagar réteget képző regeneráló agart tartalmazó lemezekre öntjük.
3. A szferoplasztkészítmény minőségének meghatározása.
Egy minta 10 μΐ-ét kivesszük és százszorosára hígítjuk 990 μΐ 1 mól/literes szorbitoldat hozzáadásával. A százszorosán hígított mintából 10 μΐ-t kiveszünk és további százszoros hígításnak vetjük alá egy második 990 μΐ 1 mól/literes szorbitoldat hozzáadásával. Mindkét hígításból 100 μΐ-es mennyiséget YPD-agarlemezre szélesztünk, hogy meghatározzuk a készítményben maradt, szferoplaszttá nem alakult teljes sejtek koncentrációját. 100 μΐ-t minden hígításból 10 ml regeneráló agárhoz (amely 40 μg/ml hisztidinnel van kiegészítve) adunk, hogy meghatározzuk az összes regenerálható szferoplasztot. A transzformálási kísérleteknél jó eredmények: 1-3 x 107 összes regenerálható szferoplaszt/ml és 1 χ 103 teljes sejt/ml.
HU 205 627 Β
4. A lemezeket 30 °C hőmérsékleten 3-5 napon át inkubáljuk.
XIII. példa
Pichia pastoris HIS4 gén és autonóm replikáciős szekvenciák izolálása A Törzsek
Az alkalmazott törzsek a következők:
a) Pichia pastoris NRRL Y-ll 430 törzs;
b) Pichia pastoris GS115 (his4; NRRL Y-15 851);
c) S. cerevisiae 5799—4D törzs (his4-260 his4—39; NRRL Y-15 859); és
d) E. coli 848 törzs (F' met thi gal T,R 080s hsdR hsdM+).
B) Plazmidok pYA2 (lásd 23. ábra, az S. cerevisiae HIS4 gént tartalmazó 9,3 kilobázispáros Pstl-fragmensből áll, beiktatva a pBR325 PstI helyénél) a forrása az S. cerevisiae HIS4 gén fragmenseknek, ez egy E. coli gazdaszervezetben van deponálva és a köz rendelkezésére áll NRRL B-15 874 letéti számon.
Az YEpl3 rendelkezésre áll az American Type Culture Collection-nál az ATCC 37 115 letéti számon.
C) Tápközegek
A Pichia pastorist YPD (dús) vagy IMG (minimál) tápközegen növesztjük. Az IMG, amely minimáltápközeg, a következőkből áll:
1. IML sók: végső koncentrációban 36,7 mmól/liter KH2PO4, 22,7 mmől/liter (NH4)2SO4,2,0 mmől/liter MgSO4.7H20,6,7 mmól/liter KC1,0,7 mmól/liter CaCl22H2O, tízszeres koncentrációjú törzsoldatként elkészítve és autoklávozva;
2. Nyomelem-sók: végső koncentrációban 0,2 gmól/liter CuSO4.5H20,1,25 gmól/liter KI, 4,5 gmól/liter MnSO4.H2O, 2,0 pmól/liter NaMoO4.2H2O, 0,75 pmól/liter H3BO3,17,5 pmól/liter ZnSO4.7H2O, 44,5 pmól/liter FeCl3.6H2O, 400-szoros koncentrációjú törzsoldatként elkészítve és szűréssel sterilezve;
3. 0,4 pg/ml biotin; és
4. 2% glükóz.
Az E. colit vagy LB tápközegben, vagy 2B tápközegben tenyésztjük (0,2% NH4PO4, 1,2% Na2HPO4, 0,013% MgSO4.7H2O, 0,074% CaCl2.2H2O, 1 pg/ml tiamin és 0,4% glükóz), amely 100 pg/ml triptofánnal és 0,2% kazamino-savval (hidrolizált kazein) van kiegészítve.
D) ADNS izolálása
I. Az élesztő DNS nagy léptékű előállítása.
Mind a Pichia pastoris, mind a S. cerevisiae DNSkészítését úgy hajtjuk végre, hogy élesztősejteket növesztünk 100 ml minimál tápközegen, amíg az A^qq érték 1-2 lesz, majd a sejteket 2000 g-nél 5 percig végzett centrifugálással kinyerjük. A sejteket egyszer vízben, egyszer SED-ben, egyszer 1 mól/literes szorbitoldatban mossuk, majd 5 ml 0,1 mól/liter TriszHCl (pH 7,0) 1 mól/liter szorbitoldatban szuszpendáljuk. A sejteket 50-100 pl 4 mg/ml-es Zymolyase 60 000 oldattal (Miles Laboratories) összekeverjük és 30 °C hőmérsékleten I órán át inkubáljuk, hogy a sejtfalakat elemésszük. A szferoplasztkészítményt azután centrifugáljuk 1000 g-nél 5-10 percen át és „lizáló puffer”-ban szuszpendáljuk (0,1% SDS, 10 mmól/liter Trisz-HCl (pH 7,4), 5 mmól/liter EDTA és 50 mmól/liter NaCl). K proteinázt (Boehringer Mannheim) és RN-áz A-t (Sigma) adunk hozzá 100-100 gg/ml mennyiségben és a keveréket 37 °C hőmérsékleten 30 percig inkubáljuk. A DNS-t fehérjementesítjük, a készítményt enyhén kevertetve egyenlő térfogat kloroformmal, amely izoamil-alkoholt is tartalmaz (24: 1 térf/térf.), és a fázisokat 12 000 g-vel 20 percig végzett centrifugálással választjuk el. A felső (vizes) fázist egy friss csőbe szívjuk át, és azonos térfogatnyi fenol/kloroform/izoamil-alkohol keverékkel extraháljuk. A fázisokat az előzőek szerint elválasztjuk, és a felső fázist egy 2-3 térfogat hideg, 95%-os etanolt tartalmazó csőbe helyezzük. A mintát enyhén keverjük, és a DNS-t összegyűjtjük egy műanyag rúdra feltekerve. A DNS-t azonnal feloldjuk 1 ml TE-pufferban és egy éjszakán át dializáljuk 4 °C hőmérsékleten 100 térfogat TE-puffer ellen.
2. Az élesztő-DNS kis léptékű előállítása.
ml minimál tápközegben nőtt élesztőtenyészetet növesztünk, amíg az Α^θθ érték 1-5 lesz, és a sejteket 2000 g-vel 5 percen át végzett centrifugálással kinyerjük. A sejteket 1 ml SED-ben szuszpendáljuk és átvisszük 1,5 ml-es mikrocentrifuga-csőbe, egyszer mossuk 1 mól/literes szorbitoldattal és újra szuszpendáljuk 0,5 ml 0,1 mól/literes Trisz-HCl-dal (pH 7,4), amely szorbitra 1 mól/literes Zymolyase 60000-t (10 (il 4 mg/ml-es oldatból) adunk hozzá és a sejteket 3060 percig inkubáljuk 30 °C hőmérsékleten. A sejteket ezután centrifugáljuk 1 percig, „lizáló puffer”-ban szuszpendáljuk és 60-70 °C hőmérsékleten inkubáljuk. 15 perc múlva a mintákat 100 gl 5 mól/literes káliumacetáttal összekeverjük, jégfürdőben tartjuk 15 percen át, majd 5 percen át centrifugáljuk. A felülúszókat dekantáljuk egy friss mikrocentrifuga-csőbe, amely 1 ml 95%-os etanolt tartalmaz, összekeverjük és 10 másodpercig centrifugáljuk. Végül a DNS-üledéket levegőn szárítjuk 10-15 percig, majd 50 gl TE-pufferban oldjuk.
3. E. coli-DNS nagy léptékű izolálása.
A nagy léptékű (0,5-1 liter) plazmidkészítéshezE. coli-tenyészeteket növesztünk 37 °C hőmérsékleten 2B tápközegben rázatva, amely a fentiek szerinti és a megfelelő antibiotikummal van kiegészítve. Azokhoz a sejtekhez, amelyek pBR322 eredetű plazmidokat tartalmaznak, a tenyészeteket mintegy 0,7 A550 értékig növesztjük, ekkor megfelelő mennyiségű klóramfenikolt adunk hozzá, hogy koncentrációja 100 gg/ml legyen, és a sejteket mintegy 15 óra múlva kinyerjük. Azokat a törzseket, amelyek pBR325 eredetű plazmidokat tartalmaznak, kiegészített 2B tápközegbe inokuláljuk kb. 0,01-0,05 kiindulási A550 értéknél és rázatás mellett inkubáljuk 37 °C hőmérsékleten 20-24 órán át akinyerés előtt.
4. E. coli-DNS kis léptékű előállítása
A kis léptékű gyors plazmidizoláláshoz 2 ml-es tenyészeteket növesztünk kiegészített 2B tápközegben antibiotikummal .együtt egy éjszakán át rázatással, majd centrifugálással kinyerjük a sejteket 1,5 ml-es
HU 205 627 Β mikrocentrifuga-csövekben. A preparátumokból a plazmidokat a Bimbóim és Doly (1979 Nucl. Acids. Rés. 7, 1519-1523) által leírt alkalikus lízis módszer szerint izoláljuk.
E) Restrikciós DNS-fragmens izolálás
A restrikciós enzimeket a New England Biolabs-tól és a Bethesda Research Laboratories-től szerezzük be és az emésztést a forgalmazó előírása szerint végezzük. A restrikciós térképezést beiktatott DNS-sel rendelkező és beiktatott DNS nélküli plazmidok párhuzamosan emésztett termékeit összehasonlítva hajtjuk végre. A restrikciós fragmenseket az agaróz-gélből Whatman 2MM papírcsíkokra történő elektroelucióval tisztítjuk. A fragmenseket a papírról 3-4 mosással nyerjük ki, a mosást 0,1-0,2 ml oldattal végezve, amelynek összetétele 0,1 mól/liter NaCl, 50 mmól/liter Trisz-HCI (pH 8,0) és 1 mmól/liter EDTA, Végül a fragmenseket fenol/kloroform/izoamll-alkohol keverékkel extraháljuk, etanollal kicsapjuk és újra feloldjuk kis mennyiségű TE-pufferban.
F) P. pastoris-Jcönyvtár” megalkotása E. coliban.
A Pichia pastoris DNS-YEpl3-„könyvtár” megalkotásához 100 pg YEpl3-at emésztünk BamHI-el teljes mértékig, és borjúbél alkálikus foszfatázzal kezeljük, hogy eltávolítsuk a DNS-ről a terminális 5’ foszfátot. Pichia pastoris NRRL Y-ll 430-ból nyert vad típusú Pichia pastoris DNS egy 100 pg-os alikvotját részlegesen emésztjük 10 egység Sau3AI-gyel 5 percig inkubálva 37 °C hőmérsékleten 1 ml teljes térfogatban. Az 5 és 10 kilobázis közti fragmenseket méret szerint szelektáljuk centrifugálással 5-20% szacharóz gradiensen át végzett centrifugálással. A vektor 1 pg-ját és 2 pg Pichia Sau3AI-fragmenst összekeverünk 20 egység T4 DNS-ligázzal (Bethesda Research Laboratories) 200 pl teljes térfogatban és egy éjszakán át inkubáljuk 4 °C hőmérsékleten. A ligáit DNS-eket E. coliba transzformáljuk a teljes ligálási reakció keveréket hozzáadva 2 ml megfelelő E. coli 848 sejttenyészethez, és 15 percig inkubáljuk 0 °C hőmérsékleten. A keveréket 37 °C hőmérsékleten melegítjük 5 percen át, ezután 40 ml LB-tápközeget adunk hozzá, és a 37 °C hőmérsékleten végzett inkubálást folytatjuk további 1 órán át. Ezután ampicillint adunk olyan mennyiségben, hogy teljes koncentrációja 100 pg/ml legyen, majd az inkubálást újabb 1 órán át folytatjuk. Végül a sejteket 10 percen át centrifugáljuk 3000 g-nél, újra szuszpendáljuk 1 ml friss LB-tápközegben és egyenlő alikvotokban 10 LB agarlemezre szélesztjük, amely lemezek 10 pg/ml ampicillint is tartalmaznak. A mintegy 50 000 telepet, amely létrejön, a lemezekről lekaparjuk és a sejtek egy részletét 500 ml kiegészített 2B tápközegbe inokuláljuk, mintegy 0,1Α550 kiindulási értéknél. A tenyészetet növesztjük és a plazmidot a fentebb leírtak szerint extraháljuk. A telepekből, amelyeket a „könyvtárból kigyűjtjük, 100 vizsgált telepből 96 tetraciklin érzékeny és 10 vizsgált telepből 7 tartalmaz beiktatott DNSsel rendelkező plazmidot.
A Pichia pastoris DNS - pYJ8 Δ Cla-„könyvtár” megalkotásához 50 pg pYj8 Cla-t emésztünk teljes mértékben Clal-el és kezelünk borjúbél alkálikus foszfatázzal, hogy eltávolítsuk a DNS-ről a terminális 5’ foszfátot.
Pichia pastoris NRRL Y-15 851-ből származó DNS 100 pg-os alikvotját részben emésztjük 20 egység Taqlgyel, 5 percig inkubálva 65 °C hőmérsékleten 1 ml teljes térfogatban. Az 5-10 kilobázispár közti fragmenseket méret szerint szelektáljuk elektroelucióval 0,5% agarózgélről (lásd II. példa, E. fejezet). A vektor 1 pg-ját és 2 pg Pichia pastoris Taql-fragmenst összekeverünk 20 egység T4 DNS ligázzal (Bethesda Research Laboratories) 200 pl teljes térfogatban és egy éjszakán át inkubáljuk 4 °C hőmérsékleten. A ligáit DNS-eket E. coliba transzformáljuk a teljes ligálási reakciókeveréket hozzáadva 2 ml megfelelő E. coli 848 sejttenyészethez, és 15 percig inkubáljuk 0 °C hőmérsékleten. A keveréket 37 °C hőmérsékleten melegítjük 5 percen át, ezután 40 ml LBtápközeget adunk hozzá és az inkubálást további 1 órán át folytatjuk 37 °C hőmérsékleten. Ezután ampicillint adunk olyan mennyiségben, hogy annak koncentrációja 100 pg/ml legyen, és az inkubálást további egy órán át folytatjuk. Végül a sejteket 10 percen át centrifugáljuk 3000 g-nél, újra szuszpendáljuk 1 ml friss LB-tápközegben, és egyenlő alikvotokban 10 LB-agarlemezre szélesztjük, amely lemez 100 pg/ml ampicillint is tartalmaz. A mintegy 10 000 telepet, amely képződik, lekaparjuk a lemezekről és a sejtek egy részletét 500 ml kiegészített 2B tápközegbe inokuláljuk kb. 0,1 kiindulási A550 értéknél. A tenyészeteket növesztjük és a plazmidot a fentiekben leírtak szerint extraháljuk.
G) Southern-hibridizálás
A nagy vagy nagyon feltekercselt DNS-molekulák nitrocellulózra való átviteléhez a DNS-t először részlegesen hidrolizáljuk úgy, hogy az agaróz gélt 0,25 mól/literes HCl-dal áztatjuk az alkálival végzett denaturálás előtt. Az S. cerevisiae HIS4 génből nyert jelzett fragmensek hibridizálását Pichis pastoris-DNShez 50% formamid, 6 x SSC, 5 x Denhardt-oldat, 0,1% SDS, 1 mmól/liter EDTA és 100 pg/ml denaturált heringsperma-DNS jelenlétében hajtjuk végre 42 °C hőmérsékleten. Az utóhibridizáló mosás 1 x SSC, 1 mmól/liter EDTA, 0,1% SDS és 1,0% nátrium-pirofoszfát oldatban történik 65 °C hőmérsékleten. A DNS-t 32P-vel jelezzük olyan módon, ahogyan ezt alV. példában leírtuk.
H) DNS-szekvencia-elemzés
A DNS-szekvencia-elemzést a Sanger és munkatársai didezoxi-nukleotid-lánc befejezési módszerével végezzük (1980) (J, Mól. Bioi. 143,161-178).
I) Az élesztő transzformálása
Az S. cerevisiae transzformálását Hinnen és munkatársai (1979) szferoplaszt-kialakítási módszerével hajtjuk végre, (Proc. Nat. Acad. Sci., USA 75,1929-1933).
A Pichia pastoris transzformálást a fentebb leírt eljárást követve hajtjuk végre.
J) A Pichia pastoris transzformánsok elemzése
Az egyes plazmidoknak azt a képességét, hogy autonóm elemként fennmaradnak Pichia pastoris-sejtekben, a következőképpen határozzuk meg: transzformáns telepet veszünk fel a regeneráló agarlemezről és SD-tápközeget tartalmazó agarlemezre szélesítjük, valamint folyékony IMG tápközegbe inokuláljuk. Az SD-lemezeket 30 °C hőmérsékleten inkubáljuk, ezután egy egyes telepet ve27
HU 205 627 Β szünk fel erről a lemezről, szélesztjük egy második SDIemezre, valamint inokuláljuk egy második lombik 1MGtápközegbe. Ezt a folyamatot harmadszor is megismételjük. A három IMG-tenyészetet 30 °C hőmérsékleten növesztjük rázatással, amíg az Agoo érték kb. 1-2 lesz, majd a sejteket centrifugálással kinyerjük. Az élesztő tenyészetekből a DNS-t extraháljuk a fentebb leírtak szerint, elektroforézisnek vetjük alá 30 voltnál és 30 milliampernél 10-15 órán át 0,8% agaróz gélen, átvisszük nitrocellulózra és hibridizáljuk 32P-jelzett pBR322-höz vagy pBR325-höz, amint ezt fentebb leírtuk. Kontrollként egy mintát, amely 10 ng E. coliból izolált plazmidot és egy mintát, amely 1-2 pg nem transzformált GS115 DNS-t tartalmaz, a kísérleti mintával párhuzamosan vetünk alá elektroforézisnek.
K) Pichia DNS-szekvenciák izolálása.
DNS-fragmenseket, amelyek a Pichia HIS4 gént tartalmazzák, izolálunk egy Pichia DNS-„könyvtár”-bóI azon képességük alapján, hogy komplementerek az S. cerevisiae his4 törzsekkel. A könyvtár az YEpl3 S. cerevisiae-E. coli „ingázó”-vektor BamHI helyébe beiktatott, vad típusú Pichia DNS 5-20 kb-s Sau3 AI-gyel részlegesen emésztett fragmenseiből tevődik össze. Az S. cerevisiae NRRL Y-15 859 (5799-4D; his4ABO törzs) szferoplasztjait hozzuk létre Hinnen és munkatársai (1978) technikájával, összekeverjük a Pichia DNSkönyvtárral és regenerálódni hagyjuk egy hisztidinben hiányos tápközegben. A transzformálás mintegy 1 x 103 prototróf élesztőtelepet eredményez az 5 x 107 teljes regenerálható szferoplaszt-populációkból. A teljes élesztőDNS-t kivonjuk 20 His* telepből és E. coliba transzformáljuk. Az élesztő-DNS-készítmények közül 17 termel ampicillinrezisztens telepeket és mindegyik tartalmaz olyan plazmidot, amely YEpl3-ból + beiktatott DNS-ből áll. Annak igazolására, hogy a His* transzformáló gén tartalmazza a Pichia HIS4 gént és nem szupresszor-aktiviíással bíró DNS-fragmens, a plazmidok restrikciós emésztési termékeit hibridizáljuk az S. cerevisiae HIS4 gén nagy részletét tartalmazó jelzett DNS-fragmenshez, és mossuk kis erővel. A plazmidok mindegyike, amely komplementálja a his4 S. cerevisiae törzset, tartalmazza azokat a szekvenciákat, amelyek hibridizálódnak az S. cerevisiae HIS4 génhez.
Hogy megkeressük azokat a DNS-fragmenseket, amelyek Pichia ARS aktivitást tartalmaznak, Pichia pastoris GS115-ből (NRRL Y-15 851) származó DNS-t részlegesen emésztünk Taql-gyel és az 5 és 10 kilobázispár közti fragmenseket izoláljuk, és a pYJ8 Δ Cla egyedi Clal helyébe klónozzuk (lásd 26. ábra). A plazmid DNS-t a mintegy 10 000 His*4Pichia-telepből kinyerjük és E.coli transzformálására használjuk fel. A mintegy 10 000 ampicillinrezisztens telepből plazmidokat izolálunk, majd visszatranszformáljuk GS115-be. Ebből az „alkönyvtár-transzformálásból származó 40 His*élesztőtelepet külön-külön szelektív tápközegbe visszük és növesztjük külön tenyészetekben szelektív tápközegekben. Ennek a 40 tenyészetnek mindegyikéből a teljes élesztőDNS-t extraháljuk és E. coliba transzformáljuk. Két plazmidot, pYA63-at (PARS1) és pYA90-et (PARS2), amelyek élesztő-DNS készítményei leginkább ampicillinrezisztens E. coli telepeket produkálják, további elemzésre kiválasztjuk. Ezeknek a plazmidoknak mindegyike transzformálja a Pichia pastoris GS115-öt (NRRL Y-15
851) igen nagy gyakorisággal és mindegyik tartalmaz egy idegen DNS-beiktatást.
XIV. példa
Szabályozóterület lacZ gén fúziós termék megalkotása
A) p72 (alkoholoxidáz) szabályozóterület konstrukciók. pPG 4.0 plazmidot, egy pBR322 vektort, amely tartalmazza a Pichia pastorisból származó, 4 kilobázispáros EcoRI-PvuII genomiális DNS-fragmenst, Pstl-gyel hasítunk, S1 nukleázzal kezelünk, hogy „tompa” végeket alakítsunk ki, ahol a hasítás történik, majd BamHI-vel hasítunk, így 1,12 kbp-s DNS-fragmenst nyerünk, amely tartalmazza az alkoholoxidáz szabályozóterületét és az alkoholoxidáz első 15 aminosavához tartozó kódoló információt. Ennek az 1,12 kbp-s DNS-fragmensnek a nukleotidszekvenciája a következő:
B
1,12 kbp , „S1 nukleáz”-zal....CTA GGT GGT G ’ kezelt vég...............GAT CCA CCA CCT AG |
B alkoholoxidáz Leun GIy12Glyi3
Ezt az 1,12 kbp-t ligáljuk a pSEYlOl E. coli-S. cerevisiae „ingázó”-vektor EcoRI/Smal/BamHI kapcsolójába (BamHI-gyel és Smal-gyel hasítva) [Douglas és munkatársai (1984) Proc. Nat. Acad. Sci. U. S. 81, 3983-3987]. ApSEYlOl vektor tartalmazza az E. coli lacZ gént és egy, a következő nukleotidszekvenciával rendelkező ,,poli-linker”-t:
Rí Sm B
I II
Rt Sm B Val9 VaI10..pgalaktozidáz a fenti ligálással a pTAOll hibridplazmidot kapjuk (lásd 29. ábra)
A pTAOll szabályozó terület lacZ gén fúziós terméke a β-galaktozidáz termelése szempontjából fázison kívül van, amint ez az E szekvencia és az előbbi két szekvencia összehasonlításából látszik: ,
E szekvencia
R, B | 1,12 kbp j
...GAATTCCG.....CTA GGT GGT GGA TCC CGT GGTT...
...CrTAAGGG.....GATCCACCACCrAGGGCAGCAA...
f í
R, B
Leu, ,Gly f2Gly,3Gly14Ser15Arg Arg A pTAOll plazmidot egyedi BamHI helyénél elhasítjuk és a következő Smal kapcsolót iktatjuk be:
HU 205 627 Β
Sm j
GATCACCCGGGT
TGGGCCCACTAG í
Sm így hozzuk létre pTA012 hibridvektort, amelynek nukleotidszekvenciája a szabályozóterület lacZ fúziós termék tekintetében a következő:
F szekvencia
R[ Sm
1,12 kbp ί
GAATTCCC.............CTA GGT GGT GGA TCA CCC GGG TGA TCC CGT CGT
CITAAGGG...........GAT CCA CCA CCT AGT GGG CCC ACT AGG GCA GCA
I t
R[ Sm
LeuuGly12Gly13Gly14Ser15Pro Gly Ser Arg Arg és így a pTA012 szabályozó terület lacZ fúziós terméke még fázison kívül van a lacZ olvasókeret szempontjából. Abból a célból, hogy az alkoholoxidáz struktur- 20 génhez szolgáló N-terminális kódoló információt nyitott olvasókeretbe vigyük a lacZ strukturgénnel, a pTA012-t EcoRI-Smal-gyel kezeljük és az így létrejött DNS-fragmenseket pSEYlOl-hez ligáljuk, amelyeket előzőleg szintén kezeltünk EcoRI-gyel és Smal-gyel, így hozzuk létre a pTA013 hibridvektort (lásd a 30. ábrát és az alábbi nukleotidszekvenciát):
G szekvencia
Rj Sm B ) 1,12 kbp | r
GAATTCCC...CTA GGT GGT GGA TCA CCC GGG GAT CCC GTC GTT CITAAGGG...GAT CCC CCC CCT AGT GGG CCC CTA GGG CAG CAA t t f
Rj Sm B
LeuuGly12Glyj3Gly14Ser15Pro Gly Asp Pro Val9Val10..β-galaktozidáz
ApTA013 vektort használjuk ezután az S. cerevisiae SEY 2102 transzformálásához a XV. példában alább leírt további tanulmányokhoz.
A pTA013 vektort azután elhasítjuk Pstl-gyel vagy Pstl-NruI-gyel és a szabályozóterület lacZ fúziós terméket, amelyet a hasított fregmens tartalmaz, ligáljuk a pTAFHl (lásd 28. ábra), pYJ30 (lásd 27. ábra), vagy pYA2 (lásd 23. ábra) „ingázó”-vektorok HIS4 géntartalmú fragmensével, a pSAOHl, pSAOH5, illetve pSAOHIO plazmldokat nyerve.
pTA013 plusz Létrejött plazmidok
pTAFHl pSAOHl
pYJ30 pSAOH5
pYA2 pSAOHIO
B) p76 szabályozóterület megalkotása
A szabályozóterület lacZ gén fúziós terméket a p76
szabályozóterülettel a következőképpen alkotjuk meg:
1. A pPG 6.0 teljes 5 ’ területét alkalmazva.
A pPG 6.0 1,35 kb-páros EcoRI fragmensét klónozzuk a pSEYlOl, egy E. coli-S. cerevisiae „ingázó”-vektor, egyedi EcoRI helyébe, a pT76Ul plazmidot nyerve (lásd 30a. ábra). A pT6Ul vektort azután elhasítjuk Pstl-NruI-gyel, és a nagyobb DNS-fragmenst ligáljuk a pTAFHl „ingázó”-vektor (28. ábra) HIS4 gén tartalmú fragmensével, amint ezt fentebb a pT76H3 készítésénél leírtuk, vagy a pBPfl (lásd 34. ábra) „ingázó”-vektor Pstl-EcoRI-fragmensben EcoRl-végen kitöltött fragmensével ligáljuk, a pT76H4et nyerve.
2. Az 5’-pPG 6.0 Bal31 emésztett terméket alkalmazva.
pPG 6.0 1,35 kb-páros EcoRI fragmensét klónozzuk pSEY8, egy E. coli-S. cerevisiae „ingázó”-vektor, egyedi EcoRI helyére, amely vektornak van egy egyedi Sáli helye is az EcoRI hely szomszédságában, amelybe a Pichia DNS-t iktatjuk be, így nyerve a pTAlOl plazmidot (lásd 31. ábra). A pTAOl plazmidot Sall-gyel hasítjuk, Bal31 exonukleázzal kezeljük, hogy különböző hosszúságú, tompavégű p76 polipeptid szabályozószakasz-fragmenseket állítsunk elő. A tompa végű fragmenseket megszabadítjuk a pSEY8 plazmid megmaradt részétől EeoRI-vel végzett hasítással. Az így létrejött DNS-fragmenseket pSEYlOl EcoRI-Smal linkerjébe klónozzuk, így, többek között, a pTAF.85 plazmidot nyerve. A pTAF.85 plazmidot lacZ gén és ampicillinrezisztencia-gén alapján szelektáljuk. [A lacZ gén alapján történő szelekciót a Davis, Dibnes, Battey: Basic Methods is Molecular Biology, Elsevier New York (1986) irodalmi hely ismerteti].
A pTAF.85 plazmid analóg a 29. ábrában bemutatott
HU 205 627 Β pTAOll-el, de p76 szabályozóterűletet tartalmaz a p72 (alkoholoxidáz) szabályozóterület helyett.
A pTAF.85 vektort azután analóg módon kezeljük, mint a pTA013 vektort, a pTAFH.85, pT76Hl és pT76H2 plazmidokat nyerve. így a következő vektoro- 5 kát hasítjuk és ligáljuk:
pTAF.85 plusz: Létrejött plazmidok pTAFHl pTAFH.85 pYJ30 pT76Hl pYA2 pT76H2 10
XV. példa
A $-galaktozidáz-termelés szabályozása Pichia pastorisban
A β-galaktozidáz-termelést vizsgáljuk számos, kü- 15 lönböző szénforrásban és különböző körülmények között nőtt Pichia pastoris GS115 (NRRL Y-15 851) transzformánsnál. A transzformált törzseket minimál tápközegen növesztjük, amely 0,5 pg/ml biotint és 0,1% glükózt tartalmaz, 30 °C hőmérsékleten, amíg a 20 tenyészet nem éri el a stacioner fázist. A sejteket ezután centrifugálással összegyűjtjük, és átvisszük olyan minimál tápközegbe, amely 0,5 pg/ml biotint és 0,5% metanolt tartalmaz, és növesztjük 3-5 generáción keresztül 30 °C hőmérsékleten. Ez után a me- 25 tanolon történt kezdeti növekedés után a sejteket centrifugálással összegyűjtjük és friss minimál tápközegre visszük át, amely 0,5 pg/ml biotint és szénforrásként vagy 0,1% glükózt, vagy 0,3% metanolt tartalmaz. A sejteket azután 30 °C hőmérsékleten inku- 30 báljuk 80 órán át, ebből időszakonként mintát veszünk ki, hogy meghatározzuk az alkoholoxidáz- és a β-galaktozidázszintet. Mintegy 20-50 óra múlva a szénforrás kimerül és azután a sejtek ebben a szénforráséhezéses állapotban maradnak fenn. Az eredmé- 35 nyékét az I, táblázat mutatja be: ·
1. TÁBLÁZAT
A β-galaktozidáz és alkoholoxidáz (egység/ODgoo) maximális szintjei (inkubációs idő, óra) Pichia pastoris NRRL Y-15 851 transzformánsaiban
I. RÉSZ
β-galaktozidáz3
plazmid 1% glükóz glükőzéhezés 0,3% metanol
pSAOHl 0 660 (20) 1361 (0)
pSAOH5 0,1-0,2 567 (20) 1168(0)
pSAOHIO 0 886 (20) 1559 (0)
pTAFH.85 0 0,17 (80) 0,5
pT76Hl 0 3,20 (80) 0
pT76H2 0 né né
pT76H3 0 20 781
pT76H4 0,3-0,6 40(80) 3100
aA sejteket különböző időpontokban vettük ki és a β-galaktozidáz és alkoholoxidáz aktivitás mérést a szövegben leírtak szerint végezzük.
né - nem észleltük a zárójelben lévő számok az inkubálás idejét jelentik órában. 60
II. RÉSZ
Alkoholoxidáz3
plazmid 1% glükóz glükózéhezés 0,3% metanol
pSAOHl 0 35 530
pSAOH5 0 60 550
pSAOHIO 0 167 425
pTAFH.85 0 né né
pT76Hl 0 né né
pT76H2 0 né né
pT76H3 0 né né
pT76H4 0 né né
aA sejtet különböző időpontokban vettük ki és a β-gaiaktozidáz és alkoholoxidáz aktivitást a szövegben leírtak szerint végeztük, né - nem észleltük
Az alkoholoxidázt a festék-peroxidáz módszerrel határozzuk meg, amint ezt fentebb leírtuk (lásd VH. példa) és a β-galaktozidázt a következőképpen határozzuk meg:
$-galaktozidázaktivitás-mérés
Végső koncentráció: 0,06 mól/liter 0,04 mól/liter 0,01 mól/liter 0,001 mól/liter 0,05 mól/liter
A) Szükséges oldatok:
Z puffer:
Na2HPO4.7H2O 16,1 g '
NaH2PO45,5g KC10,75g MgSO4.7H2O 0,246 g 2-merkapto-etanol 2,7 ml feltöltve 1 literre, a pH 7-re beállítva. O-rütrofenil-Q-D-galaktozid (ONPG):
400 mg ONPG-t (Sigma N-1127) feloldunk 100 ml desztillált vízzel, így 4 mg/ml-es ONPG-oldatot készítünk.
B) Meghatározási eljárás
1. A tenyészet tápközegéből alikvotot veszünk ki (0,1-0,5 ODgoo értékű élesztősejt-tenyészetekből), centrifugáljuk és a sejtüledéket vízzel mossuk.
2. 1 ml Z puffért adunk a sejtüledékhez, és 30 pl CHCl3-atés 30 pl 0,1%-os SDS-t, Vortex készülékkel keverjük, 5 percig inkubáljuk 30 °C hőmérsékleten.
3. Elindítjuk a reakciót 0,2 ml ONPG (4 mg/ml) hozzáadásával, Vortex berendezésben.
4. A reakciót leállítjuk 0,1 ml 1 mól/literes Na2CO3 oldat hozzáadásával a megfelelő időpontban (A42O<1).
5. A felülúszó abszorbanciáját 420 nm-nél leolvassuk.
C) A ^-galaktozidáz aktivitás-egységek kiszámítása: 1 egység = 1 nmól orto-nitro-fenol (ONP), amely percenként keletkezik 30 °C hőmérsékleten és pH 7nél. 1 nmól ONP-nek 420 nm-nél (A420) 0,0045 abszorbanciája van 1 cm úthossznál; így az 1 abszorbancia 420 nm-nél 222 nmól ONP/ml-t jelent, vagy 378 nmól/l,7 ml-t, mível az analizálandó felülúszó teljes térfogata 1,7 ml. Ezáltal a táblázatokban kifejezett egységeket a következőképpen számoljuk ki:
A420
U =-X378 t (perc)
HU 205 627 Β
Az I. táblázatban közölt eredmények azt jelzik, hogy egy élesztőben idegen fehérjét pl. a β-galaktozidázt lehet termelni Pichia pastorisban, a termelést vagy a tápközegben metanol jelenlétével szabályozva, vagy szénforráséhezéssel szabályozva katabolit-represszáló szénforráson történt növekedés után.
XVI. PÉLDA
A $-galaktozidáz termelésének szabályozása S. cervisiae-ban.
Saccharomyces cerevisiae SEY2102-t, amely túléléséhez uracil-, leucin- és hisztidinkiegészítést igénylő törzs, transzformálunk pTA013 és pT76Ul plazmidokkal. A transzformált organizmusokat könnyen izolálhatjuk azoknak a telepeknek a szelektálásával, amelyek nem igényelnek uracilkiegészjtést a növekedéshez. Az izolált transzformánsokat SEY2102-pTA013 illetve SEY2102-pT76Ul laboratóriumi jelzéssel láttuk el. Az SEY2102-pTA013-az deponáltuk a Northern Régiónál Research Center intézetnél (Peoris, Illinois) 1984. augusztus 31-én az NRRL Y-15 858 számon.
Az NRRL Y-15 858 és az SEY2102-pT76Ul sejtjeit 30 °C hőmérsékleten inkubáljuk 3-4 generáción át minimál tápközegen, amely 20-20 gg/ml hisztidint és leucint, valamint 5% glükózt is tartalmaz. A sejteket ezután áthelyezzük, vagyis centrifugálással összegyűjtjük és átvisszük YP tápközegbe, amely 3%, H. táblázatban jelzett szénforrással van kiegészítve, és növesztjük 30 °C hőmérsékleten 5 generáción keresztül. A sejteket azután további 50 órán át inkubáljuk a szénforráséhezés körülményei között, és időszakonként mintát veszünk β-galaktozidáz aktiválás-méréshez. Az eredményeket a II. táblázat foglalja össze.
II. TÁBLÁZAT
β-galaktozidáz termelése S. cerevisiae β-galaktozidáz által (egy-
ség/ODéoo)
A) Alkoholoxidáz szabályozóterület (pTA013)
Szénforrás 5 generáció Éhezési körülmények
után 6 óra 20 óra 50 óra
glükóz 0,2 105 66 né
fruktóz 0,3 30 31 28
etanol 23 137 115 77
glicerin 640 806 656 788
galaktóz 982 960 651 766
B) p76 szabályozóterület (pT76Ul)
Szénforrás 5 generáció Éhezési körülmények
után 12 óra 25 óra 30 óra
glükóz 2,3 254 815 803
glicerin 470 né né né
né = nem észleltük
Ezek az eredmények azt jelzik, hogy az élesztő számára idegen fehérjét, vagyis a β-galaktozidázt lehet előállítani Saccharomyces cerevisiae-ban a p72 (alkoholoxidáz) és p76 szabályozóterületek irányítása alatt a szénforráséhezés körülményei között, amikor valamilyen katabolitrepresszáló szénforrást alkalmazunk a növesztéshez, vagy a transzformált S. cerevisiae-sejtek növesztésével viszonylag nem katabolitrepresszáló szénforrásokon, mint pl. glicerinen vagy galaktózon.
A β-galaktozidáz kifejeződési szintjét az S. cerevisiae-ban a jelen találmány szerinti szabályozóterületek irányítása alatt össze lehet hasonlítani azokkal a kifejeződési szintekkel, amelyek más S. cerevisiae szabályozott promotorokkal lehetségesek.
Promotor Szénforrás β-galaktozidáz egység (ODéoo)
citokróm C-lacZ fúziós tennék (CYC1) Raffinóz (3%) 460
galaktóz-permeáz-lacZ fúziós termék (GAL2) Galaktóz (2%) 450
Invertáz-lacZ fúziós termék (SUC2) Glükóz (0,1%) 160
Látható, hogy a találmány szerinti szabályozóterület legalább olyan hatásos, vagy hatásosabb S. cerevisiae promotorként, mint az S. cerevisiae-ban „benszülött” promotorok.
XVII. PÉLDA
Southern-hibridizálás élesztő genomiális DNS-sel
Kilenc különböző metanolt asszimiláló törzset és egy metanolt nem asszimiláló törzset növesztünk minimál tápközegen (IMI, lásd 1. példa), amely még 0,75% metanolt, illetve 1% glükózt tartalmaz. A teljes kromoszomális DNS-t izoláljuk, ahogyan ezt a VI. példában leírtuk, azaz a teljes nukleinsavat izoláljuk, RN-áz A-val kezeljük, extraháljuk először fenol-kloroform/izoamil-alkohol keverékkel, majd kloroform/izoamil-alkohol keverékkel, végül etanollal kicsapjuk. A kicsapott DNS-t újra szuszpendáljuk minimális térfogatú TE-pufferban és centrifugáljuk, hogy derítsük a DNS-oldatot.
Southem-hibridizáló szűrőket készítünk, amint ezt a
VI. példában leírtuk, azaz 10 pg, különböző élesztő fajtákból származó teljes DNS-t emésztünk Hindlll fölöslegével, elektroforézisnek vetjük alá, a DNS-t denaturáljuk, a gélt semlegesítjük, és a DNS-t átvisszük nitrocellulóz szűrőkre. Ezekhez a szűrőkhöz az előhibridizálás körülményei a következők: egy éjszakán át kezeljük egy olyan oldattal, amely 50% ionmentesített formamidot, 6 x SSC-t, 5 x Denhardt-oldatot, 1 mmól/liter EDTA-t, 0,1% SDS-t és 100 pg/ml denaturált lazacsperma-DNS-t tartalmaz. Ugyanezeket a körülményeket alkalmazzuk a hibridizáló tápközeghez is, 32P-vel jelölt nick-transzlációnak alávetett vizsgáló mintákat alkalmazva, 106 beütés/perc/ml végső koncentrációt alkalmazva. A vizsgáló minták magukban
HU 205 627 Β foglalják a pPC 8.3, pPC 15.0 és pPC 6.7 klónokból származó cDNS-beiktatásokat (PstI fragmensek), valamint a P. pastoris HIS4 gén 2,7 kbp-s BglII DNS-fragmensét. Ezeknek a vizsgáló mintáknak mindegyikét külön alkalmazzuk azonos szűrőkön a hibridizáláshoz, amely 24 órán keresztül tart 42 °C hőmérsékleten. Hibridizálás után a szűrőket kétszer mossuk 15 percen át szobahőmérsékleten, és háromszor 65 °C hőmérsékleten 15 percen át egy olyan oldatban, amely 2 X SSC-t, 1 mmól/liter EDTA-t, 0,1% SDS-t és 0,1% nátrium-pirofoszfátot tartalmaz. További mosásokat is próbálunk kisebb intenzitással, pl. 55 °C és 42 °C hőmérsékleten, hogy igazoljuk a hibridizálási eredményeket. Ezeknek a hibridizálásoknak az eredményeit a ÜL táblázat foglalja össze.
III. TÁBLÁZAT
P. pastoris gének hibridizálása különböző élesztő kromoszomális DNS-ekhezx
P. pastoris
HIS4 pPC 8.3 pPC 15.0 pPC 6.7
1. P. pastoris NRRL Y-ll 430 + + + +
2. P. pastoris NRRL Y-l 603 + + + +
3. Hansenula capsulatum + + -f- -i-
4.H.henricii + 4- (+) +
5. H. nonfermentans 4- 4- 4· +
6. H. polymorpha w 4- (+) 4-
7. H. wickerhamii + + + 4-
8. Torulopsis molischiana + + 4-
9. Saccharomyces cerevisiae (+) - - -
10. P. pastoris NRRL Y-15 851 + + + +
*Megjegyzés: + hibridizálás (+) gyenge hibridizálás
- hibridizálás netn figyelhető meg az alkalmazott körülmények között
A ΠΙ. táblázatban megadott eredmények azt jelzik, hogy a p76, p72 és p40-hez analóg polipeptidek génjei gyakorlatilag jelen vannak minden metanolt asszimiláló törzsben. Megjegyzésre érdemes, hogy ennek a három génnek egyikét sem figyeljük meg egy metanolt nem asszimiláló törzs, az S. cerevisiae DNS-ével való hibridizálásnál, míg homológia a P. pastoris HIS4 gén és az S. cerevisiae-ból származó HIS4 gén között könnyen megfigyelhető.
Bibliográfia
Bimbóim és Doly (1979): Nucl. Acids Rés. 7, 15311523.
M. G. Douglas és munkatársai (1984): Proc. Nat. Acad. Sci. USA 81,3983-3987.
Hinnen és munkatársai (1978). Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 75,1928-1933.
Z. A. Janowicz és munkatársai (1985): Nucl. Acids. Rés. 13,3043-3062.
A. M. Ledeboerés munkatársai (1985): Nucl. Acids. Rés. 13,3063-3082.
Maxam és Gilbert (1980): Methods in Enzymology
65, 499-560.
Southern (1975): J. Mól. Bioi. 98,503-517.
Sanger és munkatársai (1980): J. Mól. Bioi. 143,

Claims (16)

  1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK
    1. Eljárás polipeptidek előállítására élesztőben, azzal jellemezve, hogy (a) egy élesztő gazdaszervezetet olyan expressziós vektorral transzformálunk, amely tartalmaz
    - egy Pichia pastorisból származó 5’-szabályozőterületet, amely érzékeny a tápközegben jelen lévő metanolra, és amely az mRNS-sé történő átírást szabályozza,
    - egy polipeptid-kódoló területet,
    - adott esetben egy további 3’-szabályozóterületet, amely a poliadenilezést és az mRNS-sé történő átírás leállítását szabályozza,
    - adott esetben további egy vagy több bakteriális plazmid DNS, bakteriofág DNS, élesztő plazmid DNS, élesztő kromoszomális DNS-eredetű DNS-szekvenciát, továbbá
    - adott esetben egy marker génszekvenciát, (b) a transzformált gazdaszervezetet tenyésztjük, és (c) a kifejezett polipeptidet kinyerjük.
  2. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy gazdaszervezetként metanolon mint szén- és energiaforráson növekedni képes élesztő törzset használunk.
  3. 3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy gazdaszervezetként Pichia nemzetségbe tartozó élesztő törzset használunk.
  4. 4. Az 1-3. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy gazdaszervezetként Pichia pastoris GS115 (NRRL Y-15 851) törzset használunk.
  5. 5. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy 5’ szabályozóterületként Pichia pastoris NRRL Y11 430 törzsből származó szabályozóterületet használunk.
  6. 6. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy polipeptidkódoló területként alkoholoxidáz termelését kódoló területet használunk.
  7. 7. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy polipeptidkódoló területként DAS polipeptid termelését kódoló területet használunk.
  8. 8. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy polipeptidkódoló területként egy heterológ polipeptid termelését kódoló területet használunk.
  9. 9. A 8. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy polipeptidkódoló területként β-galaktozidáz termelését kódoló területet használunk.
  10. 10. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy 5’ szabályozóterületként egy az alkoholoxidáz termelését kódoló mRNS átírását szabályozó területet tartalmazó vektorral transzformálunk.
  11. 11. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy 5’ szabályozőterületként egy a DAS polipeptid
    HU 205 627 Β termelését kódoló mRNS átírását szabályozó területet tartalmazó vektorral transzformálunk.
  12. 12. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy 5’ szabályozóterületként egy a p40 polipeptid termelését kódoló mRNS átírását szabályozó területet tartalmazó vektorral transzformálunk.
  13. 13. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy 5’ szabályozóterületként a következő szekvenciával rendelkező szabályozó területet tartalmazó vektorral transzformálunk:
    5' -ATGCTTCCAA GATTCTGGTG GGAATACTGC TGATAGCCTA
    ACGTTCATGA TCAAAATTTA ACTGTTCTAA CCCCTACTTG
    GACAGGCAAT ATATAAACAG AAGGAAGCTG CCCTGTCTTA
    AACCTTTTTT TTTATCATCA TTATTAGCTT ACTTTCATAA
    TTGCGACTGG TTCCAATTGA CAAGCTTTTG ATTTTAACGA
    CTTTTAACGA CAACTTGAGA AGATCAAAAA ACAACTAATT
    ATTCGAAACG-3'.
  14. 14. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy 5’ szabályozó területként a következő szekvenciával rendelkező szabályozó területet tartalmazó vektorral transzformálunk:
    5' -AATGGCCCAAA CTGACAGTTT AAACGCTGTC TTGGAACCTA
    ATATGACAAA AGCGTGATCT CATCCAAGAT GAACTAAGTT
    TGGTTCGTTG AAATCCTAAC GGCCAGTTGG TCAAAAAGAA
    ACTTCCAAAA GTCGCCATAC CGTTTGTCTT GTTTGGTATT
    GATTGACGAA TGCTCAAAAA TAATCTCATT AATGCTTAGC
    GCAGTCTCTC TATCGCTTCT GAACCCGGTG GCACCTGTGC
    CGAAACGCAA ATCGGGAAAC AACCCGCTTT TTGGATGATT
    ATGCATTCTC CTCCACATTGT ATGCTTCCAA GATTCTGGTG
    GGAATACTGC TGATAGCCTA ACGTTCATGA TCAAAATTTA
    ACTGTTCTAA CCCCTACTTG GACAGGCAAT ATATAAACAG
    AAGGAAGCTG CCCTGTCTTA AACCTTTTTT TTTATCATCA
    TTATTAGCTT ACTTTCATAA TTGCGACTGG TTCCAATTGA
    CAAGCTTTTG ATTTTAACGA CTTTTAACGA CAACTTGAGA
    AGATCAAAAA ACAACTAATT ATTCGAAACG-3' .
  15. 15. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy 5’ szabályozóterületként a következő szekvenciával rendelkező szabályozó területet tartalmazó vektorral transzformálunk:
    5'-ÁGATCTAA CATCCAAAGA
    CGAAAGGTTG AATCAAACCT TTTTGCCATC CGACATCCAC
    AGGTCCATTC TCACACATAA GTGCCAAACG CAACAGGAGG
    GGATACACTA GCAGCAGACG TTGCAAACGC AGGACTCATC CTCTTCTCTA ACACCATTTT GCATCAAAAC AGCCAGTTAT GGGCTTCATG GAGCTCGCTC ATTCCAATTC CTTCTATTAG GCTACTAACA CCATCACTTT ATTAGCCTGT CTATCCTGGC CCCCCTGGCG AGGTCATG.TT TCTTTATTTC CGAATGCAAC AAGCTCCGCA TTACACCCGA ACATCACTCC AGATCAGGGC TTTCTCAGTG TGGGGTCAAA TAGTTTCATG TTCCCAAATG
    GCCCAAACT GACAGTTTAA ACGCTCTCTT GGAACCTAAT ATCACAAAAG CGTGATCTCA TCCAAGATGA ACTAAGTTTG GTTCGTTCAA ATCCTAACGG CCAGTTGGTC AAAAAGAAAC TTCCAAAAGT CGCCATACCG TTTGTCTTCT TTGGTATTGA TTGACGAATG CTCAAAAATA ATCTCATTAA TGCTTAGCGC AGTCTCTCTA TCGCTTCTGA ACCCGGTGGC ACCTGTGCCG AAACGCAAAT GGGGAAACAA CCCGCTTTTT GGATGATTAT GCATTCTCCT CCACATTGTA TGCTTCCAAG ATTCTGGTCG GAATACTCCT GATAGCCTAA CGTTCATGAT CAAAATTTAA CTGTTCTAAC CCCTACTTGG ACAGGCAATA TATAAACAGA AGGAAGCTGC CCTGTCTTAA ACCTTTTTTT TTATCATCAT TATTAGCTTA CTTTCATAAT TCCGACTGGT TCCAATTGAC AAGCTTTTGA TTTTAACGAC TTTTAACGAC AACTTGAGAA
    GATCAAAAAA CAACTAATTA TTCGAAACG-3' .
  16. 16. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzaljellemezve, hogy 5’ szabályozóterületként a következő szekvenciával rendelkező szabályozó területet tartalmazó vektorral transzformáljuk:
    5'-TT
    CACCCATACA ACTATAAACC TTAGCAATTC AAATAACCCC AATTCATTGT TCCGAGTTTA ATATACTTGC CCCTATAAGA AACCAAGGGA TTTCAGCTTC CTTACCCCAT GAACAGAATC TTCCATTTAC CCCCCACTGG AGAGATCCGC CCAAACGAAC AGATAATAGA AAAAAACAAT TCGGACAAAT AGAACACTTT CTCAGCCAAT TAAAGTCATT CCATCCACTC CCTTTAGCTG CCGTTCCATC CCTTTCTTGA GCAACACCAT CGTTAGCCAG TACGAAAGAG GAAACTTAAC CGATACCTTG GAGAAATCTA AGGCGCGAAT GAGTTTAGCC TAGATATCCT TAGTCAAGGG TGTCCGATAC TTCTCCACAT TCAGTCATAG ATGGGCAGCT TCTATCATGA AGAGACGGAA ACGGGCATAA GGGTAACCGC CAAATTATAT AAAGACAACA TGCCCCAGTT TAAAGTTTTT CTTTCCTATT CTTGTATCCT GAGTCACCGT TGTCTTTAAT ATAAAAAGTT CGTTTTAACT TAAGACCAAA ACCAGTTACA ACAAATTATA ACCCCTCTAA ACACTAAAGT TCACTCTTAT
    CAAACTATCA AACATCAAAA- 3'
HU854160A 1984-10-30 1985-10-30 Process for producing polypeptides by yeasts containing area for controlling gen expression HU205627B (en)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US06/666,391 US4808537A (en) 1984-10-30 1984-10-30 Methanol inducible genes obtained from pichia and methods of use
US06/780,102 US4855231A (en) 1984-10-30 1985-09-25 Regulatory region for heterologous gene expression in yeast

Publications (2)

Publication Number Publication Date
HUT38678A HUT38678A (en) 1986-06-30
HU205627B true HU205627B (en) 1992-05-28

Family

ID=27099454

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU854160A HU205627B (en) 1984-10-30 1985-10-30 Process for producing polypeptides by yeasts containing area for controlling gen expression

Country Status (23)

Country Link
US (1) US4855231A (hu)
EP (2) EP0183071B1 (hu)
JP (5) JP2502508B2 (hu)
KR (1) KR930001117B1 (hu)
CN (1) CN1011243B (hu)
AR (1) AR242988A1 (hu)
AT (1) ATE83263T1 (hu)
AU (1) AU572002B2 (hu)
CA (1) CA1340733C (hu)
DD (1) DD254211A5 (hu)
DE (1) DE3586889T2 (hu)
DK (1) DK496385A (hu)
ES (1) ES8609458A1 (hu)
FI (1) FI94427C (hu)
GR (1) GR852611B (hu)
HU (1) HU205627B (hu)
IE (1) IE930804L (hu)
IL (1) IL76765A (hu)
NO (1) NO178076C (hu)
NZ (1) NZ213842A (hu)
PL (1) PL158965B1 (hu)
PT (1) PT81399B (hu)
YU (1) YU46695B (hu)

Families Citing this family (115)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5741672A (en) * 1984-07-27 1998-04-21 Unilever Patent Holdings B.V. Expression and production of polypeptides using the promoters of the hansenula polymorpha MOX and DAS genes
US4879231A (en) * 1984-10-30 1989-11-07 Phillips Petroleum Company Transformation of yeasts of the genus pichia
US5032516A (en) * 1985-10-25 1991-07-16 Phillips Petroleum Company Pichia pastoris alcohol oxidase II regulatory region
US4882279A (en) * 1985-10-25 1989-11-21 Phillips Petroleum Company Site selective genomic modification of yeast of the genus pichia
US4818700A (en) * 1985-10-25 1989-04-04 Phillips Petroleum Company Pichia pastoris argininosuccinate lyase gene and uses thereof
US4895800A (en) * 1985-11-26 1990-01-23 Phillips Petroleum Company Yeast production of hepatitis B surface antigen
IL81817A0 (en) * 1986-03-14 1987-10-20 Phillips Petroleum Co Methanol and glucose responsive yeast regulatory regions
ZA872534B (en) * 1986-05-08 1987-11-25 Phillips Petroleum Co Yeast production of streptokinase
IL82935A0 (en) * 1986-08-12 1987-12-20 Phillips Petroleum Co Secretion of heterologous proteins from yeast
US5002876A (en) * 1986-09-22 1991-03-26 Phillips Petroleum Company Yeast production of human tumor necrosis factor
DE3789866T2 (de) * 1987-07-17 1994-09-22 Rhein Biotech Proz & Prod Gmbh DNA-Moleküle, die für FMDH-Kontrollabschnitte und Strukturgene für ein Protein mit FMDH-Aktivität kodieren, sowie deren Anwendung.
ES2204884T3 (es) * 1988-01-05 2004-05-01 Roche Diagnostics Gmbh Procedimiento para la obtencion de proteinas o productos genicos que contienen proteinas.
FI891695A (fi) * 1988-04-11 1989-10-12 Phillips Petroleum Co Expression av laxtillvaexthormon i methyltrofisk jaest av slaektet pichia.
IL90021A0 (en) * 1988-04-25 1989-12-15 Phillips Petroleum Co Process for the production of interferon
NZ228774A (en) * 1988-04-25 1991-05-28 Phillips Petroleum Co Hbv particles containing pres 2 proteins and recombinant processes for their production in yeast cells
IL89992A0 (en) 1988-04-25 1989-12-15 Phillips Petroleum Co Expression of human serum albumin in methylotrophic yeasts
IL89993A0 (en) * 1988-04-25 1989-12-15 Phillips Petroleum Co Expression of the hiv 24kda gag protein in methylotrophic yeasts
IL89989A0 (en) * 1988-04-25 1989-12-15 Phillips Petroleum Co Expression of human interleukin-2 in methylotrophic yeasts
DE3851535T2 (de) * 1988-12-20 1995-02-02 Rhein Biotech Proz & Prod Gmbh Mutanter Stamm von einem methylotrophen Organismus und Verfahren zur Herstellung eines Proteins in methylotrophen Organismus.
AU5196290A (en) * 1989-02-13 1990-09-05 Salk Institute Biotechnology/Industrial Associates, Inc., The Production of superoxide dismutase in pichia pastoris yeast cells
GB8924883D0 (en) * 1989-11-03 1989-12-20 Shell Int Research Expression vector and polypeptide synthesis
US5264554A (en) * 1990-01-19 1993-11-23 The Blood Center Of Southeastern Wisconsin, Inc. Platelet cell adhesion molecule and variants thereof
US5369028A (en) * 1990-04-03 1994-11-29 The Salk Institute Biotechnology/Industrial Associates, Inc. DNA and mRNA encoding human neuronal nicotinic acetylcholine receptor compositions and cells transformed with same
US6440681B1 (en) 1990-04-03 2002-08-27 Merck & Co., Inc. Methods for identifying agonists and antagonists for human neuronal nicotinic acetylcholine receptors
US5258302A (en) * 1990-07-03 1993-11-02 The Salk Institute Biotechnology/Industrial Associates, Inc. DNA for expression of aprotinin in methylotrophic yeast cells
US5612198A (en) * 1990-09-04 1997-03-18 The Salk Institute Production of insulin-like growth factor-1 in methylotrophic yeast cells
CA2090969C (en) * 1990-09-04 2001-08-21 Russell Arthur Brierley Production of insulin-like growth factor-1 in methylotrophic yeast cells
US5268273A (en) * 1990-12-14 1993-12-07 Phillips Petroleum Company Pichia pastoris acid phosphatase gene, gene regions, signal sequence and expression vectors comprising same
WO1992013951A1 (en) * 1991-02-04 1992-08-20 The Salk Institute Biotechnology/Industrial Associates, Inc. Production of human serum albumin in methylotrophic yeast cells
EP0578746B1 (en) * 1991-04-01 2002-07-03 Merck &amp; Co., Inc. GENES WHICH INFLUENCE $i(PICHIA) PROTEOLYTIC ACTIVITY, AND USES THEREFOR
CA2058820C (en) * 1991-04-25 2003-07-15 Kotikanyad Sreekrishna Expression cassettes and vectors for the secretion of human serum albumin in pichia pastoris cells
US5330901A (en) * 1991-04-26 1994-07-19 Research Corporation Technologies, Inc. Expression of human serum albumin in Pichia pastoris
US5834262A (en) * 1992-01-06 1998-11-10 E. I. Du Pont De Nemours And Company Oxidation of glycolic acid to glyoxylic acid using a microbial cell transformant as catalyst
ES2093294T3 (es) * 1992-02-28 1996-12-16 Suntory Ltd Nuevo vector que comprende un promotor inducible por el metanol y/o glicerol.
US5708141A (en) * 1992-05-11 1998-01-13 Corvas International, Inc. Neutrophil inhibitors
AU6355494A (en) * 1993-03-03 1994-09-26 E.I. Du Pont De Nemours And Company Production of glycolate oxidase in methylotrophic yeast
CA2155330C (en) 1993-03-08 2002-01-29 Kathryn J. Elliott Human neuronal nicotinic acetylcholine receptor compositions and methods employing same
WO1994021802A1 (en) * 1993-03-25 1994-09-29 Biosource Genetics Corporation PICHIA PASTORIS ALCOHOL OXIDASE ZZA1 and $i(ZZA2)
ES2182843T3 (es) 1993-04-20 2003-03-16 Merck & Co Inc Subunidades de receptor humano de n-metil-d-aspartato, acidos nucleicos que codifican las mismas y su uso.
US5912122A (en) 1993-06-04 1999-06-15 Sibia Neurosciences, Inc. Nucleic acids encoding and method for detecting nucleic acid encoding human metabotropic glutamate receptor subtype mGluR6
US5521297A (en) 1993-06-04 1996-05-28 Salk Institute Biotechnology/Industrial Associates Nucleic acids encoding human metabotropic glutamate receptors
US6001581A (en) * 1993-06-04 1999-12-14 Sibia Neurosciences, Inc. Cation-based bioassay using human metabotropic glutamate receptors
US6638905B2 (en) 1993-06-18 2003-10-28 The Salk Institute For Biological Studies Cloning and recombinant production of CFR receptor(s)
US6495343B1 (en) 1993-06-18 2002-12-17 The Salk Institute For Biological Studies Cloning and recombinant production of CRF receptor(s)
AU1091595A (en) * 1993-11-08 1995-05-29 Salk Institute Biotechnology/Industrial Associates, Inc., The Human neuronal nicotinic acetylcholine receptor compositions and methods employing same
US5453161A (en) * 1993-11-12 1995-09-26 Enichem S.P.A. Polyamic acid to polyimide conversion by microwave heating
US5866542A (en) * 1994-10-18 1999-02-02 Corvas International, Inc. Nematode-extracted anticoagulant protein
CA2202351A1 (en) * 1994-10-18 1996-04-25 George Phillip Vlasuk Nematode-extracted serine protease inhibitors and anticoagulant proteins
US5866543A (en) * 1995-06-05 1999-02-02 Corvas International, Inc. Nematode-extracted anticoagulant protein
US5945275A (en) * 1994-10-18 1999-08-31 Corvas International, Inc. Nematode-extracted anticoagulant protein
US5872098A (en) * 1995-06-05 1999-02-16 Corvas International, Inc. Nematode-extracted anticoagulant protein
JP3811186B2 (ja) * 1994-10-18 2006-08-16 コーバス インターナショナル， インコーポレイテッド 線虫から抽出されるセリンプロテアーゼ阻害剤および抗凝固性タンパク質
US5863894A (en) * 1995-06-05 1999-01-26 Corvas International, Inc. Nematode-extracted anticoagulant protein
US6720140B1 (en) * 1995-06-07 2004-04-13 Invitrogen Corporation Recombinational cloning using engineered recombination sites
US6143557A (en) * 1995-06-07 2000-11-07 Life Technologies, Inc. Recombination cloning using engineered recombination sites
US6485967B1 (en) 1995-06-07 2002-11-26 Merck & Co., Inc. Human neuronal nicotinic acetylcholine receptor α6 and β3 nucleic acid
US5965389A (en) * 1995-11-09 1999-10-12 Zymogenetics, Inc. Production of GAD65 in methylotrophic yeast
MX9605082A (es) 1996-10-24 1998-04-30 Univ Autonoma De Nuevo Leon Levaduras metilotroficas modificadas geneticamente para la produccion y secrecion de hormona de crecimiento humano.
DE69834533T2 (de) 1997-10-01 2006-10-12 Dsm Ip Assets B.V. Verfahren zur Protein-Herstellung
US7351578B2 (en) * 1999-12-10 2008-04-01 Invitrogen Corp. Use of multiple recombination sites with unique specificity in recombinational cloning
US20030124555A1 (en) * 2001-05-21 2003-07-03 Invitrogen Corporation Compositions and methods for use in isolation of nucleic acid molecules
WO1999021977A1 (en) * 1997-10-24 1999-05-06 Life Technologies, Inc. Recombinational cloning using nucleic acids having recombination sites
CN101125873A (zh) * 1997-10-24 2008-02-20 茵维特罗根公司 利用具重组位点的核酸进行重组克隆
DE69941406D1 (de) * 1998-07-06 2009-10-22 Tosoh Corp IL-6 Rezeptor IL-6-gekoppeltes Fusionsprotein
AU5584999A (en) * 1998-08-28 2000-03-21 Invitrogen Corporation System for the rapid manipulation of nucleic acid sequences
US6780615B1 (en) 1998-12-31 2004-08-24 Genway Biotech Inc. Production of recombinant monellin using methylotrophic yeast expression system
US6720174B1 (en) 1999-01-28 2004-04-13 Novozymes A/S Phytases
ATE443074T1 (de) 1999-03-02 2009-10-15 Life Technologies Corp Zubereitungen und methoden zur verwendung in rekombinatorischem klonen von nukleinsäuren
US7504253B2 (en) * 1999-06-11 2009-03-17 The Burnham Institute For Medical Research Nucleic acid encoding proteins involved in protein degradation, products and methods related thereof
US6261820B1 (en) * 1999-10-01 2001-07-17 Amgen Inc. Fibronolytically active polypeptide
US6440414B1 (en) * 1999-10-01 2002-08-27 Amgen Inc. Pharmaceutical compositions of fibrinolytic agent
MXPA02004666A (es) 1999-11-12 2003-06-24 Fibrogen Inc Gelatinas recombinantes.
CA2392753A1 (en) 1999-12-10 2001-06-14 Invitrogen Corporation Use of multiple recombination sites with unique specificity in recombinational cloning
US7033776B2 (en) * 1999-12-17 2006-04-25 Amgen Inc. Method for treatment of indwelling catheter occlusion using fibrinolytic metalloproteinases
WO2001077351A1 (en) * 2000-04-07 2001-10-18 MAX-PLANCK-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Vectors and methods for dual protein expression in pichia pastoris and escherichia coli
US7244560B2 (en) * 2000-05-21 2007-07-17 Invitrogen Corporation Methods and compositions for synthesis of nucleic acid molecules using multiple recognition sites
US7863020B2 (en) * 2000-06-28 2011-01-04 Glycofi, Inc. Production of sialylated N-glycans in lower eukaryotes
US8697394B2 (en) * 2000-06-28 2014-04-15 Glycofi, Inc. Production of modified glycoproteins having multiple antennary structures
US7598055B2 (en) * 2000-06-28 2009-10-06 Glycofi, Inc. N-acetylglucosaminyltransferase III expression in lower eukaryotes
WO2002000879A2 (en) 2000-06-28 2002-01-03 Glycofi, Inc. Methods for producing modified glycoproteins
US7449308B2 (en) * 2000-06-28 2008-11-11 Glycofi, Inc. Combinatorial DNA library for producing modified N-glycans in lower eukaryotes
US7625756B2 (en) 2000-06-28 2009-12-01 GycoFi, Inc. Expression of class 2 mannosidase and class III mannosidase in lower eukaryotic cells
US6803225B2 (en) 2000-06-30 2004-10-12 Flanders Interuniversity Institute For Biotechnology Protein glycosylation modification in Pichia pastoris
US7009045B2 (en) * 2000-07-14 2006-03-07 Archer-Daniels-Midland Company Transformation systems for flavinogenic yeast
US7198924B2 (en) * 2000-12-11 2007-04-03 Invitrogen Corporation Methods and compositions for synthesis of nucleic acid molecules using multiple recognition sites
EP1385866A4 (en) 2001-04-05 2006-03-29 Univ Nebraska ALCOHOL OXIDASE-1 REGULATING NUCLEOTIDE SEQUENCES FOR HETEROLOGIC GENE EXPRESSION IN YEAST
US6645739B2 (en) 2001-07-26 2003-11-11 Phoenix Pharmacologies, Inc. Yeast expression systems, methods of producing polypeptides in yeast, and compositions relating to same
EP1497434A4 (en) * 2002-04-15 2005-08-24 Merck & Co Inc MATRIX ANALYSIS OF GENE EXPRESSION IN CELLS
US7252933B2 (en) 2002-06-26 2007-08-07 Flanders Interuniversity Institute For Biotechnology Protein glycosylation modification in methylotrophic yeast
US20040204953A1 (en) * 2002-07-17 2004-10-14 Lincoln Muir Subscription based systems, methods and components for providing genomic and proteomic products and services
DE60335602D1 (de) * 2002-12-18 2011-02-17 Roche Diagnostics Gmbh Rekombinante Desoxyribonuclease I aus Rinder-Pankreas mit hoher spezifischer Aktivität
ATE387494T1 (de) * 2002-12-20 2008-03-15 Hoffmann La Roche Hitzelabile desoxyribonuklease i-varianten
US7332299B2 (en) 2003-02-20 2008-02-19 Glycofi, Inc. Endomannosidases in the modification of glycoproteins in eukaryotes
EP1460425A1 (en) * 2003-03-17 2004-09-22 Boehringer Mannheim Gmbh Deglycosylated enzymes for conjugates
EP1673457B1 (en) * 2003-08-25 2011-05-18 Funzyme Biotechnologies SA Novel fungal proteins and nucleic acids encoding same
US8293503B2 (en) 2003-10-03 2012-10-23 Promega Corporation Vectors for directional cloning
EP1697534B1 (en) 2003-12-01 2010-06-02 Life Technologies Corporation Nucleic acid molecules containing recombination sites and methods of using the same
DE602004025192D1 (de) * 2003-12-05 2010-03-11 Roche Diagnostics Gmbh Rekombinante Carboxypeptidase B und ihre Aufreinigung
ATE517919T1 (de) * 2005-09-14 2011-08-15 Sanofi Aventis Deutschland Spaltung von insulinvorstufen durch eine trypsinvariante
AT504588B1 (de) * 2006-11-16 2008-08-15 Univ Graz Tech Nukleinsäure-promotor
ES2531194T3 (es) 2008-03-03 2015-03-11 Abbvie Inc Métodos para transformar levaduras
KR20110101198A (ko) 2008-12-12 2011-09-15 이 아이 듀폰 디 네모아 앤드 캄파니 재생 가능 자원으로부터의 선형 다이카르복실산의 제조 방법
EP2258855A1 (en) 2009-05-28 2010-12-08 Universität für Bodenkultur Wien Expression sequences
CA2784944A1 (en) 2009-12-21 2011-06-30 Centre Hospitalier Universitaire Vaudois Synergic action of a prolyl protease and tripeptidyl proteases
SG194937A1 (en) 2011-05-20 2013-12-30 Alderbio Holdings Llc High-purity production of multi-subunit proteins such as antibodies in transformed microbes such as pichia pastoris
BR112014003841B1 (pt) 2011-08-19 2022-02-15 H. Lundbeck A/S Método para identificar uma célula hospedeira diploide de pichia pastoris que produz um anticorpo desejado com uma maior pureza
KR102128957B1 (ko) 2011-10-07 2020-07-02 론자 리미티드 조절가능한 프로모터
TWI670279B (zh) 2013-03-15 2019-09-01 美商艾爾德生物製藥股份有限公司 抗體純化及純度監測
CA2905180C (en) 2013-03-15 2023-03-07 Alder Biopharmaceuticals, Inc. Temperature shift for high yield expression of polypeptides in yeast and other transformed cells
US9150870B2 (en) 2013-03-15 2015-10-06 Lonza Ltd. Constitutive promoter
WO2014139608A1 (en) 2013-03-15 2014-09-18 Lonza Ltd Constitutive promoter
US10053501B2 (en) 2013-03-21 2018-08-21 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Purification of triple helical proteins
JP6440687B2 (ja) 2013-04-30 2018-12-19 ドナルド ダンフォース プラント サイエンス センター 抗真菌性植物タンパク質、ペプチド、及び使用方法
KR102384622B1 (ko) 2013-09-09 2022-04-11 에보닉 오퍼레이션스 게엠베하 변형된 세균 콜라겐-유사 단백질
WO2016120764A1 (en) 2015-01-26 2016-08-04 Centre Hospitalier Universitaire Vaudois (Chuv) Aspergillus oryzae prolyl endopeptidases and use thereof in degradation of polypeptides

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
IE54046B1 (en) * 1981-08-25 1989-05-24 Celltech Ltd Expression vectors
IE54592B1 (en) * 1982-03-08 1989-12-06 Genentech Inc Anumal interferons, processes involved in their production, compositions containing them, dna sequences coding therefor and espression vehicles containing such sequences and cells transformed thereby
PT76727B (en) * 1982-05-19 1985-12-27 Gist Brocades Nv Process for the preparation of clones for kluyveromyces species
WO1984001153A1 (en) * 1982-09-15 1984-03-29 Collaborative Res Inc Production of interferon in yeast by use of invertase promoter
EP0173378B1 (en) * 1984-07-27 1991-06-12 Unilever N.V. Process for preparing a polypeptide by culturing a transformed microorganism, a transformed microorganism suitable therefor and dna sequences suitable for preparing such microorganism
US4837148A (en) * 1984-10-30 1989-06-06 Phillips Petroleum Company Autonomous replication sequences for yeast strains of the genus pichia
US4879231A (en) * 1984-10-30 1989-11-07 Phillips Petroleum Company Transformation of yeasts of the genus pichia
US4885242A (en) * 1984-10-30 1989-12-05 Phillips Petroleum Company Genes from pichia histidine pathway and uses thereof

Also Published As

Publication number Publication date
YU46695B (sh) 1994-04-05
CN85109718A (zh) 1986-08-20
JPH08173161A (ja) 1996-07-09
AU572002B2 (en) 1988-04-28
NO178076B (no) 1995-10-09
PL256012A1 (en) 1986-09-23
JPH0698789A (ja) 1994-04-12
US4855231A (en) 1989-08-08
EP0183071A2 (en) 1986-06-04
DD254211A5 (de) 1988-02-17
JPH06233686A (ja) 1994-08-23
EP0183071A3 (en) 1987-09-23
HUT38678A (en) 1986-06-30
ATE83263T1 (de) 1992-12-15
GR852611B (hu) 1986-03-04
PT81399B (pt) 1987-11-11
FI854142L (fi) 1986-05-01
EP0483115A3 (en) 1992-05-06
KR930001117B1 (ko) 1993-02-18
JPH08196275A (ja) 1996-08-06
EP0183071B1 (en) 1992-12-09
CN1011243B (zh) 1991-01-16
JP2552808B2 (ja) 1996-11-13
DE3586889D1 (de) 1993-01-21
YU169585A (en) 1991-04-30
DK496385A (da) 1986-05-01
IE930804L (en) 1986-04-30
CA1340733C (en) 1999-09-14
JPS61173781A (ja) 1986-08-05
AU4875285A (en) 1986-06-12
ES548307A0 (es) 1986-09-01
EP0483115A2 (en) 1992-04-29
PL158965B1 (pl) 1992-10-30
FI94427C (fi) 1995-09-11
JP2552807B2 (ja) 1996-11-13
AR242988A1 (es) 1993-06-30
NZ213842A (en) 1991-11-26
PT81399A (en) 1985-11-01
JP2502508B2 (ja) 1996-05-29
FI854142A0 (fi) 1985-10-23
ES8609458A1 (es) 1986-09-01
KR870003197A (ko) 1987-04-15
IL76765A (en) 1991-06-30
NO854312L (no) 1986-05-02
FI94427B (fi) 1995-05-31
NO178076C (no) 1996-01-17
DK496385D0 (da) 1985-10-29
DE3586889T2 (de) 1993-04-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US4855231A (en) Regulatory region for heterologous gene expression in yeast
US4808537A (en) Methanol inducible genes obtained from pichia and methods of use
CA1273882A (en) Autonomous replication sequences for yeast strains of the genus pichia
US5032516A (en) Pichia pastoris alcohol oxidase II regulatory region
EP0263311A2 (en) Yeast production of human tumor necrosis factor
US5670630A (en) Expression of hepatitis B S and preS2 proteins in methylotrophic
JPH07163354A (ja) 機能遺伝子を含むｄｎａ断片
EP0118551A1 (en) Production of interferon in yeast by use of invertase promoter
US5310660A (en) Method and a hybrid promoter for controlling exogenous gene transcription
AU605036B2 (en) Expression of hepatitis B2 pres protein in methylothrophic yeasts
EP0339569A2 (en) Expression of the HIV 24 KDA GAG protein in methylotrophic yeasts
IE67053B1 (en) Pichia pastoris alcohol oxidase II regulatory region
JPH02303497A (ja) サケ成長ホルモンのピキア属メチロトローフ酵母での発現

Legal Events

Date Code Title Description
HMM4 Cancellation of final prot. due to non-payment of fee