JPH06233686A - アルコールオキシダーゼをコードする遺伝子 - Google Patents

アルコールオキシダーゼをコードする遺伝子

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JPH06233686A
JPH06233686A JP5150894A JP15089493A JPH06233686A JP H06233686 A JPH06233686 A JP H06233686A JP 5150894 A JP5150894 A JP 5150894A JP 15089493 A JP15089493 A JP 15089493A JP H06233686 A JPH06233686 A JP H06233686A
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Abstract

(57)【要約】 【構成】 アルコールオキシダーゼの遺伝情報をコード
する遺伝子をピキア属に属する酵母より単離する。 【効果】 この遺伝子の利用によりアルコールオキシダ
ーゼが効率よく産生される。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】この発明は、組換ＤＮＡについての技術分
野に関する。この発明の側面の１つは、メセンジャーＲ
ＮＡへのＤＮＡの転写並びにメセンジャーＲＮＡの蛋白
への翻訳の開始及び終了を調節するＤＮＡ断片に関す
る。他のもう一つの側面は、上述のＤＮＡ断片を統合す
るベクターの発現に関するものである。更に他のもう一
つの側面は、上述の発現ベクターで形質転換した新規な
微生物に関するものである。更にもう一つの側面は、ポ
リペプチドに関するものである。
【０００２】最近組換ＤＮＡ技術が開発されに従い、有
用なポリペプチドが種々、微生物による制御下での生産
が可能となった。多くの真核生物由来のポリペプチド、
例えば、ヒト成長ホルモン、白血球インターフェロン、
ヒトインシュリン及びヒトプロインシュリンが既に種々
な微生物により生産されている。既に獲得した技術の継
続的応用が将来他の種々な有用なポリペプチド製品の微
生物による産出を可能とするものと期待されている。
【０００３】組換ＤＮＡ技術において使用される基本的
な技術は、当業者には既知のことである。組換ＤＮＡ技
術の実施に必要な宿主微生物に望まれる要素としては、
次のものがあるが、これのみに限定されるわけではな
い。 （１）ひとつ以上の所望のポリペプチドの遺伝情報を有
して居り、かつ宿主微生物中で発現するのに必要とされ
る適切な制御配列を有していている遺伝子。 （２）ベクター、通常は、プラスミドであるが、その中
に当該遺伝子を挿入可能なこと。当該ベクターは、細胞
中への遺伝子の挿入と、当該遺伝子の高水準の発現に加
え、細胞中での当該ＤＮＡ配列の保持を可能とするのに
役立つ。 （３）適切な宿主微生物で、かつ、この宿主は所望の遺
伝子を有するベクターで形質転換することができ、ま
た、その宿主微微生物は、挿入された遺伝子により暗号
化されている情報の発現を許す細胞質の容器を有してい
ること。組換ＤＮＡ技術に使用される基本的要素は、プ
ラスミドであり、染色体外の、二重鎖のＤＮＡで、ある
種の微生物内で見出されたものである。自然界におい
て、微生物中に存在するとして見出されたプラスミドの
場合、細胞１個あたり多数のコピーがしばしば存在する
ことが見出されている。自然界に存在するプラスミドに
加えて、種々の人工プラスミドやハイブリッドベクター
も作出されている。プラスミドＤＮＡ中に暗号化された
情報中に含まれるもので、娘細胞中でプラスミドを再生
するときに必要とされるものは、自律複製配列である。
一つ又はそれ以上の遺伝子表現型の淘汰特性が、プラス
ミドＤＮＡ中に暗号化されている情報に含まれていなけ
ればならない。この遺伝子表現型の淘汰特性が、淘汰
（選抜）培地中で細胞の優先的生育により区別され、選
抜されうる特性を有するプラスミドを含有する宿主細胞
のクローン化を可能とする。
【０００４】プラスミドの利用性は、一種又は他の種類
制限のエンドヌクレアーゼ又は制限酵素−いずれも当該
プラスミド上に定まった特異的切断部位を認識している
のであるが−その酵素により特定の個所で切断されると
いう事実に存する。切断した後、同質又は宿主以外の微
生物由来の外来遺伝子、あるいは、遺伝子断片を、切断
部位、又は該部位に隣接し再構築された部位で、切断さ
れたプラスミドと所望の遺伝子材料との末端を結合させ
ることにより挿入する。生成した組換ＤＮＡ材料をハイ
ブリッドベクターと称することも可能である。
【０００５】ＤＮＡ組換は、宿主微生物の菌外体で行な
われる。生成したハイブリッドベクターは、形質転換と
して知られている過程により宿主微生物に導入される。
形質転換された微生物を生育させることにより、大量の
ハイブリッドベクターを得ることができる。遺伝子がそ
のＤＮＡ中に暗号化されている情報の転写及び翻訳をつ
かさどるプラスミド内の場所に正しく挿入された場合
は、生成したハイブリッドベクターは、挿入遺伝子を暗
号化したポリペプチド配列の生産を指示するために使用
することができる。ポリペプチドのこの方法による生産
を遺伝子発現という。
【０００６】遺伝子発現は、ＤＮＡ内のプロモータ領域
として知られている領域内で開始する。発現の転写段階
ではメッセンジャーＲＮＡの合成のための鋳型としてむ
き出しになりながら当該ＤＮＡは解き広がる。ＲＮＡポ
リメラーゼは、プロモータ領域に結合し、遺伝情報を暗
号化（又は指定）している鎖に含まれる当該情報を転写
しながら、解き広がったＤＮＡに沿って５´未満から３
´未満へと移動する。該メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮ
Ａ）は、次々に、当該ｍＲＮＡが、ポリペプチドへと翻
訳される場所であるリボソームに結合する。各アミノ酸
は、構造遺伝子と称される部分内の核酸トリプレット又
はコドン、すなわち、発現された産物のアミノ酸配列を
コード化している遺伝子の部分によって、遺伝情報とし
て暗号化（コード化）されている。３個の核酸は、核ア
ミノ酸の産生についての情報をコード化しているので、
一つの核酸配列を３通りの異なった型で読むことは可能
である。所望のポリペプチド産物をコード化している特
定の読み取り枠は適切な解読枠と称されている。
【０００７】プロモータに結合した後、ＲＮＡポリメラ
ーゼは、最初にｍＲＮＡの５´のリーダー（ｌｅａｄｅ
ｒ）領域をまず転写し、次いで翻訳開始又は開始コドン
を、次いで構造遺伝子それ自体の内部の核酸コドンを転
写する。所望の遺伝子産物を得るために、適切な解読枠
中でリボゾームによるメッセンジャーＲＮＡの翻訳を正
しく開始する事が、開始すなわち開始コドンにとって必
要なことである。最後に、終止コドンが、構造遺伝子の
終点で転写され；たとえ、ＤＮＡ鋳型とｍＲＮＡポリメ
ラーゼとの間の相互作用により追加のｍＲＮＡ配列が形
成されたとしても、当該リボゾームによっては、ペプチ
ドへとは翻訳されずに残っている追加のｍＲＮＡ配列が
生ずる。このようにして、終止コドンが翻訳の終了を決
定し、それ故に、更にポリペプチド産品へのアミノ酸組
込の終了を決定する。当該ポリペプチド産品は、細胞を
溶解し、当該産品を他の微生物蛋白より適当な精製法に
より回収するか、又は、特定の条件下では、当該宿主細
胞が成長し、当該ポリペプチドが分泌されている醗酵培
地から精製し、得ることができる。
【０００８】実際には、組換ＤＮＡ技術の利用は完全に
外来のポリペプチド、すなわちある微生物内で本来は見
出されない、換言すれば、生産できないペプチドを発現
する−−いわゆる直接発現できる微生物を作出可能であ
る。逆に、融合蛋白、すなわち、同種のポリペプチド、
つまり、野生型（形質転換されていない）宿主微生物内
で見出される、換言すれば生産されるもののアミノ酸配
列の一部分に融合した外来ポリペプチドの発現−−すな
わち間接発現も可能である。間接発現については、当該
当初に得られた融合蛋白産品は、時として、その目的と
する使用に関して、当該同質性／外来ポリペプチドが細
胞外の環境で開裂するまでは、不活性である。それ故、
例えば、メチオニン残基の臭化シアン開裂が融合同質／
外来ポリペプチドからソマトスタチン、チモシンアルフ
ァ１並びにヒトインシュリンの成分Ａ鎖及びＢ鎖を生成
するのに対し、一方特定化された残基の酵素による開裂
がベーターエンドルフィンを生成する。
【０００９】現在まで、種々のポリペプチドを産出する
ために組換ＤＮＡ技術を商業的に利用しようとする試み
は、宿主生物として大腸菌を用いるものに集中してい
る。しかし、ある場合には、大腸菌は宿主としては適切
でないということが判明している。例えば、大腸菌は、
医薬品として有用なポリペプチドから除外しなければな
らない有害な発熱因子を多数含有している。この精製が
良好に実施されるための効率は、いうまでもなく、特定
のポリペプチドにより異なる。更に、大腸菌の蛋白分解
能がある種の有用な製品の収率を著るしく制限する。こ
れら及びその他の点を配慮し、代替宿主、特にポリペプ
チドの生産のために真核生物を使用することに興味の対
象が移りつつある。
【００１０】真核系、すなわち酵母におけるポリペプチ
ド産品の産出手段が存在することは、組換ＤＮＡにより
遺伝情報が暗号化されたポリペプチドの産品に大腸菌な
どの原核系を使用することと比較して、顕著な利点を提
供できることとなった。酵母は、大腸菌の大規模醗酵が
比較的最近になり到来したのに比べて、数世紀にもわた
って大規模醗酵に使用されてきている。酵母は、細菌に
比較して一般により高い菌体濃度でも生育でき、連続醗
酵工程にも応用されている。事実、ピキア パストリス
（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）などの酵母は、極
めて高い細胞濃度、すなわち、１００ｇ／ｌを越える細
胞濃度でも生育できることを米国特許第４１４１４３２
９号［フィリップス石油（株）所有］でウエグナーが開
示している。酵母宿主の別の利点には、生物の多くの臨
界的機能、例えば、酸化的リン酸化反応が細胞機関の中
に存在するので、そのため野生型の宿主細胞にとっては
異物であるポリペプチドの当該生物による生産により、
場合によっては、起りうる恐ろしい影響に曝されること
がないという事実も含んでいる。真核生物として、酵母
は発現されたポリペプチド産品の生物活性にとっては重
要である。真核生物として酵母は高等生物と同様のコド
ン優位性を示し、哺乳動物の遺伝子や、例えば哺乳動物
のｍＲＮＡから逆転写により得られた相補的ＤＮＡ（ｃ
ＤＮＡ）由来の発現産品の効率的産出へ向うことも可能
である。
【００１１】充分に特性が明らかにはされていない酵母
類の宿主／ベクター系としての開発は、形質転換条件に
ついての知識の欠如と適切なベクターが存在しないこと
により随分と妨げられた。更に、栄養要求性の変更株が
しばしば入手出来ず、そのため、栄養要求的補体による
形質転換体を直接選抜することを不可能としている。も
しも、組換ＤＮＡ技術が充分にその約束を果せたら、Ｄ
ＮＡの操作を可能とし挿入したＤＮＡの配列の発現を適
正化し、その結果、所望のポリペプチド産品が制御され
た条件下で、かつ、高収率で産出できることとなる新し
い宿主／ベクター系が発明されるにちがいない。
【００１２】この発明により、本発明者等は、ＤＮＡの
ｍＲＮＡへの転写とポリペプチド産品を得るための該メ
ッセンジャーＲＮＡの翻訳を調節するＤＮＡ配列を見出
し、単離し、特性を明らかとした。この発明の新規なＤ
ＮＡ配列は、（ａ）メタールを炭素及びエネルギー源と
して成育することのできる酵母菌株、（ｂ）グルコー
ス、エタノール、単糖等上で成育することのできる酵母
菌株、及び（ｃ）グリセロール、ガラクトーズ、酢酸塩
又はエステルなどで成育できる酵母菌株を用いたポリペ
プチド産品の産出に有用である。
【００１３】次の略号を、使用した制限酵素を表示する
ために本明細書を通して使用した。
【化５】
【００１４】この発明により、少くとも次の一つの条件
に応答性の調節領域を含有する新規のＤＮＡ断片を提供
する；メタノールの存在、メタノール以外のある種の基
質で細胞を生育されたときの炭素源飢餓、及びメタノー
ル以外の非異化代謝産物制限炭素源の存在。
【００１５】本発明のＤＮＡ断片の調節領域が、メッセ
ンジャーＲＮＡ産出の情報をコード化しているＤＮＡの
５´末端の位置についている場合、メッセンジャーＲＮ
Ａの転写を制御できる。本発明者らによるこの発明の技
術的範囲には当然に上述のＤＮＡ断片の変異体（ミュー
タント）をも含むものである。
【００１６】更に、この発明によれば、メッセンジャー
ＲＮＡ産出に関する情報をコード化している当該ポリペ
プチドコード化領域の３´末端の位置についていると
き、メッセンジャーＲＮＡ転写の終了及び翻訳の終了を
制御できる調節領域を含むＤＮＡ断片を提供する。なお
当該メッセンジャーＲＮＡの転写及び翻訳は、次の条件
の少くなくとも１つに応答性の調節領域により制御され
ている：メタノールの存在、メタノール以外のある種の
基質で細胞を生育させたときの炭素飢餓、及びメタノー
ル以外の非異化代謝産物制限炭素源の存在。本発明者ら
の発明の技術的範囲には、当然に上述ＤＮＡ断片の変異
体も含むものである。
【００１７】更に、この発明の１つの特異的な実施態様
によれば、ペロオキソームの中へ情報をコード化された
ポリペプチドの組込みを指揮するＤＮＡ断片を提供す
る。ペロオキソームは、メタールで生育させた酵母細胞
中に大量に存在する細胞内体である。これらの細胞内体
は、細胞液とプロテアーゼなどの酵素から、組込まれた
ポリペプチドを単離するのに役立つ。
【００１８】この発明のもう１つの実施態様によれば、
アルコールオキダーゼ産出の情報をコード化している遺
伝子、約４０キロダルトンの蛋白及び７６キロダルトン
の蛋白を提供する。更に、もう１つの実施態様によれ
ば、上述のＤＮＡ断片を含有するプラスミド及び形質転
換された生物を提供する。更にもう１つのこの発明の実
施態様によれば、この発明のプラスミド及びＤＮＡ断
片、並びに外来ポリペプチド、すなわち宿主生物由来で
ないポリペプチドの産出方法を提供する。
【００１９】ピキア パストリスからの調節遺伝子の単
離 単一の炭素源としてのメタノールで生育させたピキア
パストリスから分離されたポリＡ+ ＲＮＡを用いて、約
２００００よりなるｃＤＮＡライブラリーを大腸菌内で
調製した。ライブラリーは、メタノール又はエタノール
の存在下で生育させたピキア パストリスから単離した
キナーゼ化したポリＡ+ ＲＮＡを用いたハイブリダイゼ
ーションによりスクリーニングした。このプラス−マイ
ナス スクリーニングを数回繰り返した後、メタノール
特異性メッセンジャーＲＮＡのコピーであると、３種の
顕著な、非同質性のｃＤＮＡクローンを同定した。この
クローンは、ｐＰＣ６．４、ｐＰＣ８．０及びｐＰＣ１
５．０と命名され、そしてそれぞれ長さにおいて４７
０、７５０及び１１００の核酸よりなる挿入を含有する
ことが判明した。
【００２０】より長いｃＤＮＡクローンを得るための企
てとして、最初のｃＤＮＡライブラリーの調製に使用し
たものよりも、より穏やかなＳ１ヌクレアーゼ消化条件
を用いて、第２のｃＤＮＡライブラリーを調製した。そ
してこの新しいライブラリーはそれぞれ32Ｐ−標識のｃ
ＤＮＡクローンｐＰＣ６．４、ｐＰＣ８．０及びｐＰＣ
１５．０でスクリーニングした。その結果、ｃＤＮＡク
ローンｐＰＣ６．４及びｐＰＣ８．０に対応するより大
きなｃＤＮＡを単離した。このより大きなクローン、ｐ
ＰＣ６．７及びｐＰＣ８．３は、１２００と２１００の
核酸の長さの挿入をそれぞれ含有していることが判明し
た（図２及び図３参照）。ｐＰＣ１５．０に対応する１
１００を越える核酸よりなる挿入を持つｃＤＮＡクロー
ンは、４００００を越えるｃＤＮＡクローンをスクリー
ニングしたが見出されなかった。
【００２１】これらのｃＤＮＡクローンの各々に対応す
るゲノムＤＮＡ断片の単離は、32Ｐ標識のｐＰＣ１５．
０、ｐＰＣ８．０又はｐＰＣ６．４でハイブリダイゼー
ションした染色体ＤＮＡを制限エンドヌクレアーゼ処理
のピキア パストリスＤＮＡ断片の切断及びアガロース
ゲルからの電気溶出により達成された。次いで、溶出し
たゲノムＤＮＡ断片を大腸菌へとクローン化し、上述の
各々のｃＤＮＡプローブで数回スクリーニングすことに
より適当なゲノムクローニングを同定した。
【００２２】各ｃＤＮＡクローンとその対応するゲノム
クローンの関係は、図１、図２及び図３に示した。ｐＰ
Ｃ１５．０は、クローンｐＰＧ６．０に存在する６００
０の核酸よりなるＨｉｎｄIII のゲノム断片内に情報が
コード化されている（図１参照）。ｐＰＣ１５．０でコ
ード化されている遺伝子の５´末端は１３００ｂｐのｐ
ＰＧ６．０中に含まれるＨｉｎｄIII へ向いているが、
一方、この遺伝子の３´末端は、ｐＰＧ６．０内のＰｓ
ｔＩ部位の近くに位置している。
【００２３】当該ｃＤＮＡクローンｐＰＣ８．３は、ゲ
ノムクローンｐＰＧ４．０の内部に含まれている（図２
参照）。ｐＰＧ４．０は、隣接するゲノムＤＮＡの４０
００核酸よりなるＥｃｏＲＩ−ＰｖｕIIを含有する。ｐ
ＰＧ４．０内でのｐＰＣ８．３のオリエンテーション
は、ＢａｍＨＩ部位近くのこのｃＤＮＡの遺伝子の５´
末端に位置しているが、この遺伝子の３´末端は、当該
ＰｖｕII部位の近くに位置している。ｐＰＧ４．０内で
のｐＰＣ８．０（関連したｃＤＮＡクローン）のオリエ
ンテーションは、ｐＰＧ４．０の３´末端のＫｐｎＩ部
位に近いこのクローンの５´末端に位置しており、この
ｃＤＮＡのクローンの３´末端は、ＰｖｕII部位近くに
位置している。
【００２４】このｃＤＮＡクローンｐＰＣ６．７は、４
８００の核酸のＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩゲノム断片内に
全部が位置している（図３参照）。クローンｐＰＣ６．
４は、順繰りに、ｃＤＮＡクローンｐＰＣ６．７の内部
に完全に位置している。ｐＰＣ６．７は、ｐＰＣ６．４
よりもより完全なコピーであったので、後者は、更に研
究はしなかった。当該遺伝子の５´末端は、ゲノムクロ
ーンｐＰＧ４．８のＥｃｏＲＩ末端よりもＢａｍＨＩ末
端のより近い位置に位置している（図３参照）。
【００２５】上述のすべてのゲノムクローンの場合、当
該ｃＤＮＡクローンの各々中でコピーされた構造遺伝子
に対して５´である、少くなくとも１．２キロ塩基対よ
りなるフランキング（ｆｌａｎｋｉｎｇ）ゲノムＤＮＡ
配列が存在している。上述のゲノム及びｃＤＮＡクロー
ンの各々は、この出願が特許となったとき、公衆が入手
可能にするために、イリノイ州ピオリア市の米国合衆国
北方地区研究センター（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ Ｒｅｇｉｏ
ｎａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ）に寄託して
ある。すべてのクローンは、大腸菌宿主内に入れて、寄
託している。
【表１】
【００２６】上記の生物はすべて取り消ししないとの条
件で寄託してあり、１９８４年８月３１日より公衆は入
手できるようにしてある。
【００２７】メタノール同化酵母に対するｐＰＧ６．
０、ｐＰＧ４．０及びｐＰＧ４．８の特異性 上述のｃＤＮＡクローンの各々は、標識し一連のメタノ
ール同化酵母と１つの非メタノール非同化酵母からの染
色体ＤＮＡ配列のプローブとして用いた。３個の総ての
ｃＤＮＡの同質性遺伝子は、すべてのメタノール同化酵
母中に実質的に存在することが見出されたが、メタノー
ル非同化酵母（エス・セレビシエ）中には、明らかに存
在しなかった。かくして、これらの遺伝子は、メタノー
ル同化酵母に対して特異的であるというることが信じら
れるに到った。加えて、実施例XVIIで詳述したサザン
ハイブリダイゼーションは、これらの、種々のメタノー
ル同化酵母由来の特異的メタノール応答性遺伝子の間に
は、高い同質性が存在することを実証している。
【００２８】ｐＰＧ６．０、ｐＰＧ４．０及びｐＰＧ
４．８遺伝子のＲＮＡ転写に関する特性 メタノールの、これらのクローン化された遺伝子の各々
の発現についての影響は、これらの遺伝子の転写につい
ての影響を研究することにより観察しうる。エタノール
又はメタノールを唯一の炭素源として成育させたピキア
パストリス細胞からの単離ポリＡ+ ＲＮＡをノーザン
ハイブリダイゼーションフィルターを用意するのに使
用した（実施例IV参照）。３個のメタノール及びエタノ
ールで生育させた細胞からのフィルターの同一の対（実
施例Ｉ参照）は、標識したｐＰＣ１５．０、ｐＰＣ８．
０及びｐＰＣ６．４で別々にプローブした。当該クロー
ンｐＰＣ１５．０、ｐＰＣ８．０、及びｐＰＣ６．４
を、メタノールで生育させた細胞からのＲＮＡ分子（そ
れぞれ約２４００、２３００、及び１３００のヌクレオ
チド）にハイブリッド化した。エタノールの存在下で生
育させた細胞から得たＲＮＡを用いてのクローンｐＰＣ
１５．０及びｐＰＣ８．０のハイブリダイゼーション
プローブとのハイブリダイゼーションは、観察されなか
った。しかし、エタノールで生成させた細胞から単離し
たＲＮＡをｐＰＣ６．４でプローブしたところ、当該ク
ローンは、メタノールで生育した細胞で見られたのと同
一の１３００個のヌクレオチドのＲＮＡ分子とハイブリ
ッド化したが、推定で（量的に）５倍低い水準であっ
た。
【００２９】ｐＰＧ６．０、ｐＰＧ４．０及びｐＰＧ
４．８により情報がコード化されている蛋白産品のサイ
ズの測定 いかなる蛋白産品が、上記のｃＤＮＡクローンの各々に
よりコード化されているかを決定するために、ピキア
パストリスのメタノールで生育させた細胞からのポリＡ
+ ＲＮＡを、選択的に、当該ｃＤＮＡのそれぞれにハイ
ブリダイゼーションした。当該ハイブリッド−選択ｍＲ
ＮＡ、すなわち、当該ｃＤＮＡクローンの各々とハイブ
リダイゼーションしたｍＲＮＡを、次いで、試験管内で
翻訳し、蛋白産品の各々を、ＳＤＳ変性条件を使用した
電気泳動により溶解した（実施例Ｖ参照）。この試験管
内での陽性のハイブリダイゼーション−翻訳実験結果
は、７６０００ダルトンのポリペプチド（ｐ７６）、７
２０００ダルトンのポリペプチド（ｐ７２）及び４００
００ダルトンのポリペプチド（ｐ４０）についての遺伝
情報コード化しているｍＲＮＡをクローンｐＰＣ１５．
０、ｐＰＣ８．３及びｐＰＣ６．７がそれぞれ選択する
ことを示した。これらと同一の蛋白が、メタノールで生
育したピキア パストリスの細胞からの前ポリＡ+ ＲＮ
Ａ（つまり、ハイブリッド−選択ではない）が、同一の
試験管内系で翻訳した場合に観察されている。
【００３０】ｐ７２のアルコール オキシダーゼとして
の同定 Ａ．分子量比較 アルコールオキシダーゼ蛋白を高度に富化したサンプル
を、澄明細胞分解物をＨ2 Ｏに対して透析することによ
り調製した（実施例VII 参照）。この透析により得られ
た結晶性沈澱物は、それぞれ７６０００及び７２０００
ダルトンの二つのポリペプチドを主として含有している
ことがＳＤＳ電気泳動により明らかとされた。この沈澱
物は、セファアクリル２００を通したクロマトグラフィ
ーで更に精製し（実施例VII 参照）、その結果、アルコ
ールオキシダーゼ活性は、精製した７２０００ダルトン
のポリペプチドの活性に対応していることが実証され
た。このポリペプチドのサイズは、ｃＤＮＡｐＰＣ８．
３で選択された蛋白産品のそれと同一であった（実施例
Ｘ参照）。
【００３１】Ｂ．免疫沈澱 クローンｐＰＣ８．３とｐＰＧ４．０がアルコールオキ
シダーゼ構造遺伝子をコード化していることの追加の照
明は、免疫的手法により得られた（実施例XI参照）。７
万６千と７万２千ダルトンのポリペプチドの両方を含む
ピキア パストリスから単離された蛋白調製品は、これ
らのポリペプチドに対しての特異的抗血精をウサギの内
で高めるのに使用した。クローンｐＰＣ８．３由来のハ
イブリッド−選択ポリＡ+ ＲＮＡを試験管内で翻訳させ
たところ、７２０００ダルトンの翻訳産品のみが、ピキ
ア パストリス細胞よりの蛋白調製品に対して作った抗
血精により沈澱した。
【００３２】Ｃ．予測された／実際のアミノ酸配列比較 クローンｐＰＣ８．３６が、ピキア パストリス−アル
コールオキシダーゼをコード化したｃＤＮＡクローンで
あることを更に実証するために、蛋白のアミノ酸末端に
ついてのアミノ酸配列を、ｐＰＣ８．３によりコード化
された予測アミノ酸配列と比較した。かくして、当該単
離７２０００ダルトン蛋白のＮＨ2 末端アミノ酸配列
（配列Ａ）は次の通りであると決定された（実施例VIII
参照）：
【化６】
【００３３】配列Ａ 平行して、ｐＰＣ８．３及びｐＰＧ４．０内のコード化
された遺伝子の５´末端のヌクレオチド配列を決定し
た。ゲノム及びｃＤＮＡクローンの両方のＤＮＡ配列か
ら誘導されたアミノ酸２−１９についての予測アミノ酸
配列は、上で決定した単離ピキア パストリスアルコー
ルオキシダーゼについての予測アミノ酸配列（配列Ａ）
の最初の１８個のアミノ酸と完全に一致した。
【化７】
【００３４】配列Ｂ 加えて、当該アルコールオキシダーゼ遺伝子のコード化
領域に関する全ヌクレオチド配列を決定した。決定した
ヌクレオチドと予測アミノ酸配列は、配列Ｂ´として示
し、それらは次の通であると信じられている：
【化８】
【化９】
【化１０】
【化１１】
【化１２】
【００３５】配列Ｂ´ 上記のヌクレオチド配列とレデボエル等により公表され
ているハンセンヌラポリモルファ由来の、既に記載され
ているアルコールオキシダーゼに関するヌクレオチド配
列との比較により、予測アミノ酸配列、実際の遺伝子
（及び生成蛋白）の大きさ、コドンの利用バイアス等を
含む沢山の顕著な差異があることが明らかにされてい
る。
【００３６】ｐ７６のジヒドロオキシアセトンの合成酵
素としての同定 ｐ７６の遺伝子の最初の５１個についてのヌクレオチド
の配列を標準方法により決定した。この配列から、当該
ｐ７６蛋白のアミノ末端についてのアミノ酸配列が予測
できる：
【化１３】
【００３７】このｐ７６に関する予測アミノ酸配列は、
ハンセンヌラ ポリモルファから得たジヒドロオキシア
セトン合成酵素（ＤＨＡＳ）の公表されたアミノ酸配列
（ジャノビッツ等）に比敵しうるものである。配列での
数種類の差異は明らかではあるが、識別できる類似性が
この２つの蛋白には存在する；すなわち、
【化１４】 ピキアｐ７６とハンセンヌラＤＨＡＳとの有意な程度の
同質性と同程の蛋白サイズ（約７６０００ダルトン）に
もとづき、ｐ７６を仮にピキア由来ＤＨＡＳと同定し
た。アルコールオキシダーゼの場合と同様に、ピキアＤ
ＨＡＳの最初の５１個のヌクレオチドについてのヌクレ
オチド配列と、先きに公表されているハンセンヌラＤＨ
ＡＳのヌクレオチド配列（ジャノビッツ等参照）との比
較により、コドン利用バイアス、予測アミノ酸配列、当
該遺伝子の全体の大きさなどにおいて多くの差異がある
ことが示唆されている。
【００３８】ピキア パストリスからの調節領域を含む
ＤＮＡ断片 この発明の５´調節領域は、制限酵素地図（以下単に制
限地図と称す。）で詳細に図４、図５及び図６に示す。
ポリペプチドｐ７６の発現を制御する当該５´領域は、
図４ａに記述したＤＮＡ断片の内に位置する。当該約
２．９キロ塩基対のＨｉｎｄIII −ＸｈｏＩ断片は、明
白に、以下に詳述するように、当該調節領域を含有する
ことを実証している。ｃＤＮＡクローンｐＰＣ１５．０
は、完全なコピーのｃＤＮＡではないので、ポリペプチ
ドｐ７６をコード化している構造遺伝子を、図４ａに記
述した当該ＤＮＡ断片の少くなくとも一部分を含有して
いるようである。調節領域は図４ｂに示した約１３００
塩基対のＨｉｎｄIII −ＥｃｏＲＩ断片中に残留してい
ると信じられている。新規のβ−ガラクトシダーゼ遺伝
子を含む構造については以下に詳述するが、この示唆を
支持する。
【００３９】ポリペプチドｐ７２（アルコールオキシダ
ーゼ）の発現を制御する５´領域は、図５に示した約２
０００塩基対のＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩＤＮＡ断片内に
位置している。新規のβ−グリコシダーゼ遺伝子含有構
造については以下に記述するが、この構造が該ＤＮＡ断
片の調節性質を実証している。図６は、ポリペプチドｐ
４０の産出を制御する当該５´調節領域を含む約３キロ
塩基対ＢａｍＨＩ−ＳａｌＩＤＮＡ断片に関する制限地
図を示す。図１０、図２ａ及び図１１は、ポリペプチド
ｐ７６、ｐ７２（アルコールオキシダーゼ）及びｐ４０
に関する調節領域と構造遺伝子の制限酵素のデータをそ
れぞれ示す。それ故、図１０は、ポリペプチド７２（ア
ルコールオキシダーゼ）の産出を制御し、コード化して
いるピキア パストリスのゲノムＤＡＮの３．８キロ塩
基対のＨｉｎｄIII −ＰｓｔＩ断片の詳細について示
す。図２ａは、ポリペプチドｐ７２（アルコールオキシ
ダーゼ）の産出を制御し、コード化しているピキア パ
ストリスゲノムＤＮＡの４．０キロ塩基対ＥｃｏＲＩ−
ＰｖｕII断片を取扱っている。図１１は、ポリペプチド
ｐ４０の産出を制御し、コード化しているパキア パス
トリスゲノムＤＮＡの３．７キロ塩基対ＢａｍＨＩ−Ｅ
ｃｏＲＩ断片を表わす。
【００４０】ゲノムクローンｐＰＧ６．０、ｐＰＧ４．
０及びｐＰＧ４．８もまた制限酵素の地図化により特性
を明らかとしている。かくして、クローンｐＰＧ６．０
は図１ａに詳述している。参照点として、当該ＤＮＡ断
片の５´末端をオリジンと看做している。クローンｐＰ
Ｇ６．０は、ピキア パストリス染色体ＤＮＡのＨｉｎ
ｄIII 断片で、約６．０キロの塩基対の長さで、種々の
制限酵素により以下の如く開環する。
【表２】
【００４１】クローンｐＰＧ４．０は、図２ａに詳細に
示している。このクローンは、約４キロ塩基対の長さの
染色体のＥｃｏＲＩ−ＰｖｕII断片である。クローンの
５´末端をオリジンとして、ｐＰＧ４．０については次
の制限データが得られた。
【表３】
【００４２】クローンｐＰＧ４．８は、図３ａに詳細に
示している。このクローンは、約４．８キロ塩基対を有
する、次の追加の制限酵母切断部位を持つピキア パス
トリス染色体ＤＮＡのＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩ断片であ
る。
【表４】
【００４３】ゲノムクローンｐＰＧ６．０、ｐＰＧ４．
０及びｐＰＧ４．８を、大腸菌プラスミドｐＢＲ３２２
の特異的制限酵素切断部位（以下制限部位と称す。）へ
と挿入することにより操作した。クローンｐＰＧ６．０
は、ＨｉｎｄIII 断片の一つであり、これは、ｐＰＢＲ
３２２のＥｃｏＲＩ−ＰｖｕII部位へと、クローンｐＰ
Ｇ４．８は、ｐＢＲ３２２のＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩ部
位へとクローン化した（実施例VI参照）。これらのプラ
スミド形質転換した大腸菌菌株は、この出願が特許され
たとき、公衆が入手できるようにするため、イリノイ州
ペオリア市の北方地区研究センターに寄託してある。寄
託した菌株には次の寄託番号が付与されている。
【表５】
【００４４】図７、図８及び図９は、それぞれ、ポリペ
プチドｐ７６、ｐ７２）アルコールオキシダーゼ）及び
ｐ４０の３´調節領域についての制限地図データを提示
する。当該３´調節領域は、先行するヌクレオチド配列
により情報がコード化されているメッセンジャーＲＮＡ
のポリアデニル化、転写終了及び翻訳終了を制御するの
に有用である。かくして、このポリペプチドｐ７６遺伝
子からの３´調節領域は、図７に示した如く２．７キロ
の塩素対のＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄIII 断片であるが、こ
れは、ポリペプチドｐ７６の遺伝情報をコード化してい
るｍＲＮＡ、又は当該３´調節領域の上流に挿入された
遺伝子由来の他のいずれのｍＲＮＡのポリアデニル化、
転写終了及び翻訳終了制御に有用である。ｐ７２遺伝子
からの０．２キロ塩基対のＳｔｕＩ−ＰｖｕII断片は図
８ａに記述し、ｐ７２遺伝子からの０．３キロ塩基対の
ＳｔｕＩ−ＨｉｎｄIII 断片は図８ｂに詳述し、ｐ７２
遺伝子からの３．２塩基対のＳａｌＩ−ＥｃｏＲＩ断片
は図８ｃに、ｐ４０遺伝子からの１．９塩基対のＳａｌ
Ｉ−ＥｃｏＲＩ断は図９に詳述しているが、これらは、
野性型ピキア パストリスと会合している構造遺伝子及
びこれらの３´調節領域の上流に挿入可能などんな異質
の（すなわち、外来の）遺伝子に関して、同様な有用性
を有している。
【００４５】ｐＰＧ４．０内の当該アルコールオキダー
ゼ遺伝子（ＡＯ）は、当該ＡＯ遺伝子の転写終了部位の
数百の塩基対の範囲内で終結しているので、図８ｃに詳
記した当該追加の３´配列は次のようにして得た。まず
最初、ピキア染色体ＤＮＡをＥｃｏＲＩとＳａｌＩで消
化し、サザンブロット法でＡＯ遺伝子からの２．０Ｋｐ
ｂ（キロ塩基対と同義）の32ｐ標識ＢａｍＨＩ−Ｈｉｎ
ｄIII 断片と当該消化断片とをハイブリダイゼーション
した。当該ＡＯ（アルコールオキダーゼと同義）遺伝子
プローブとハイブリダイゼーションをしたピキア Ｅｃ
ｏＲＩ−ＳａｌＩ消化断片の中で、ＡＯ遺伝子の３´部
分と当該遺伝子の３´末端の側面に付いている配列をコ
ード化している３．２Ｋｂｐ断片があった。
【００４６】当該３´ＡＯ遺伝子断片は、次いで、約
３．２ＫｂｐのＥｃｏＲＩ−ＳａｌＩ断片ピキアＤＮＡ
断片を回収し、当該断片をＥｃｏＲＩ及びＳａｌＩ消化
ｐＢＲ３２２へと挿入することによりクローン化した。
最後に、組換プラスミド−３´ＡＯ遺伝子断片を含むｐ
ＰＧ３．２を、標識したＡＯ遺伝子断片をプローブとし
て用いるクローンハイブリダイゼーションにより確認し
た。この出願が特許されたとき、公衆が自由に入手でき
るようにするため、プラスミドｐＰＧ３．２で形質転換
した大腸菌をイリノイ州ペオリア市の北方地区研究セン
ターに寄託している。寄託菌の寄託番号は、ＮＲＲＬＢ
−１５９９９である。図８ｃは、ｐＰＧ３．２からのピ
キアＤＮＡの制限エンドヌクレアーゼ開環部位の地図を
示す。この断片は、ＡＯの３´部分（ＳａｌＩからＨｉ
ｎｄIII まで）をコード化している約１．５ＫｂｐとＡ
Ｏの配列３´の約１．７Ｋｂｐを含有する。
【００４７】ｃＤＮＡクローンの特性化 ピキア パストリスからの調節遺伝子に関するｃＤＮＡ
クローンについても、制限酵素の地図化により特性を明
らかとした。図１２において、当該ｐ７６ｃＤＮＡ、
１．１キロ塩基対断片について詳記している。当該ＤＮ
Ａ配列の５´末端をオリジンとし説明すると、制限酵素
ＸｈｏＩはｐ７６のｃＤＮＡをオリジンから約５００の
塩基対で、ＨｉｎｃIIはオリジンから約９５０塩基対
で、そしてＥｃｏＲＩはオリジンから約１０５０−１０
００塩基対でｐ７６のｃＤＮＡを開環する。図１２に示
したｃＤＮＡクローン、図１３及び図１４に示したｃＤ
ＮＡはＰｓｔＩ末端と共にすべて示してある。これら
は、当初に得られた相補ＤＮＡを、ｐＢＲ３２２へと当
該ＤＮＡ断片のクローン化を実施するためにＣ−Ｇテー
リング（ｔａｉｌｉｎｇ）に人工的に創り出された制限
酵素による切断部位である。ノーザンハイブリダイゼー
ション研究と当該ポリペプチド産品の大きさにもとづい
て、ｃＤＮＡクローンｐＰＣ１５．０が、当該メッセン
ジャーＲＮＡ配列の約半分だけを代表する、ｐ７６ｍＲ
ＮＡの不完全コピーと推定されている。
【００４８】図１３では、ｐ７２（アルコールオキシダ
ーゼ）ｃＤＮＡ−これは、ｐＰＣ８．３とｐＰＣ８．０
のオーバラップにより構築されたものであるが−に関す
る複合制限地図を示してある。上記の如く、このＤＮＡ
配列の５´末端をオリジンとして説明している。それ
故、種々の制限酵素でアルコールオキシダーゼｃＤＮＡ
を処理することにより、次の大きさの断片が得られる。
【表６】
【００４９】クローンｐＰＣ８．０とｐＰＣ８．３にお
けるアルコールオキシダーゼ遺伝子の３´末端の制限酵
素の地図化により、ｃＤＮＡクローンｐＰＣ８．３は、
約２５０のヌクレオチドが当該アルコールオキシダーゼ
配列からなくなっていることが明らかとなった（図２参
照）。図１４は、１．２キロ塩基対のポリペプチドｐ４
０のｃＤＮＡの制限地図を表わす。このｃＤＮＡクロー
ンの５´末端をオリジンとして説明すると、クローンｐ
ＰＣ６．７はオリジンから約１０００塩基対でＳａｌＩ
（及びＨｉｎｃII）により開環する。
【００５０】このｃＤＮＡ断片のそれぞれは、ｐＢＲ３
２２へとクローン化して居り、大腸菌をこれで形質転換
している。この出願が特許されたとき、公衆が自由に入
手できるようにするためにイリノイ州ペオリア市の北方
地区研究センターに、これらの形質転換菌株は寄託して
ある。寄託菌株は次の寄託番号を有する。
【表７】
【００５１】上記の各ｃＤＮＡクローンは、メタノール
を炭素及びエネルギーとする酵母の生育に、特異的であ
るポリペプチドの遺伝情報をコード化している染色体Ｄ
ＮＡの同定及び単離の際のプローブとして有用である。
それ故、すでに記述した如く、ピキア パストリスをメ
タノールで生育させたときに認められる特異的ポリペプ
チドに関する調節領域及び構造的にコード化している情
報を含むピー・パストリスの染色体ＤＮＡ断定の同定に
使用した。同様の方法で、他のメタノール同化酵母、例
えば、トルロプシス モリシアナ（Ｔｏｒｕｌｏｐｓｉ
ｓ ｍｏｌｉｓｃｈｉａｎａ）、ハンセンヌラ カプス
ラタム（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ ｃａｐｓｕｌａｔｕ
ｍ）、エイチ・ノンファメンタンス（Ｈ．ｎｏｎｆｅｒ
ｍｅｎｔａｓ）などからの類似の遺伝子の同定及び単離
の際のプローブしての有用性を有している（実施例XVII
参照）。
【００５２】アルコールオキシダーゼの詳細な解析 クローンｐＰＧ４．０の５´調節領域は、ｐ７２（アル
コールオキシダーゼ）に関する構造的情報がコード化さ
れている点のクローンの上流の（５´）ヌクレオチド配
列を決定することにより更に特性化を行なった。当該ｍ
ＲＮＡ翻訳開始部位（ＡＴＧコドン）の前の最初の２５
０個のヌクレオチドは次の通りであると信じられてい
る。
【００５３】
【化１５】 配列Ｃ クローンｐＰＧ４．０のプロモータ機能は、この配列の
ヌクレオチド塩基内に含まれていると信じられている。
この新規のＤＮＡ断片を更に充分に記述するために、上
で詳記した配列Ｃの配列の上流の更に３０１個のヌクレ
オチドを決定した。かくして、当該ｍＲＮＡ翻訳開始部
位の前の最初の５５３個のヌクレオチドは次の通りであ
ると信じられている。
【００５４】
【化１６】 配列Ｄ 配列Ｄに含まれている追加のヌクレオチド（配列Ｃと比
較して）は、 その操作は不明であるが、配列Ｃの内に
含まれているプロモータ領域に追加の調節機能を付与す
るものと信じられている。配列Ｄは、酵母中で遺伝子発
現を調節できる、実施例XIV 及びXVで示した１．１Ｋｂ
ｐのＤＮＡ断片に関してほんの一部のＤＮＡの配列化を
表示すると認識すべきである。配列Ｄでは詳記されてい
ない１．１ＫｂｐＤＮＡ他断片の１部分に、恐らく追加
の制御機能がコード化されているであろう。この新規
１．１ＫｂｐＤＮＡ断片を更に記述するために、酵母内
での遺伝子発現を制御することのできる、実施例XIV 及
びXVで示した全１．１ＫｂｐのＤＮＡ断片のヌクレオチ
ド配列を充分に記述するべく、追加のヌクレオチド配列
化を実施した。このヌクレオチド配列は配列Ｄ´として
記述してある。
【００５５】
【化１７】 配列Ｄ´ 当業者であれば、配列Ｃ及びＤで詳記したヌクレオチド
配の更に上流（すなわち、５´指向における）にある配
列Ｄ´のその部分に、配列Ｃ及びＤに関連した、追加の
制御機能コード化できうることを認識している。
【００５６】どこで当該アルコールオキシダーゼ遺伝子
のＲＮＡ転写が始じまるのか決定するために、当該ゲノ
ムクローンｐＰＧ４．０及び当該ｃＤＮＡクローンｐＰ
Ｃ８．３からのこの遺伝子の５´末端の付近のＤＮＡ配
列を比較した。当該アルコールオキシダーゼ遺伝子に、
翻訳されない領域５´の約１００個のヌクレオチドを、
ｃＤＮＡクローンｐＰＣ８．３は含有している。この配
列にもとづいて、翻訳開始部位（ＡＴＧコドン）のＡを
＋１とし、５´方向のＧを−１として表わしたとき、−
２９から−４３のヌクレオチドに関して相補的である１
５塩基（５´−ＣＴＴＣＴＣＡＡＧＴＴＧＴＣＧ−３
´）のオリゴヌクレオチドを合成して（実施例IX参
照）、アルコールオキシダーゼｍＲＮＡに沿って当該５
´末端まで拡大するためのプライマーとして用いた。こ
のプライマー−伸長実験から得たｃＤＮＡの配列は、ピ
キア パストリス アルコールオキシダーゼに関し三つ
の異なった転写開始点を明らかにした。主要な転写は、
翻訳開始コドンから１１４のヌクレオチドから開始す
る。二つの副次的どちらか一方が選ばれる転写は、当該
アルコールオキシダーゼＡＵＧコドンの上流（５´）の
１１７及び１１１のヌクレオチドで開始する。アルコー
ルオキシダーゼｍＲＮＡの開始点に先行する５５のヌク
レオチドは、うわさのゴルドベルグ−ホッグネスボック
ス（ＴＡＴＡＡｂｏｘ）を含む。当該ＴＡＴＡＡＡ配列
は、アルコールオキシダーゼｍＲＮＡのための主要な転
写の５´末端から−４０の位置、すなわち、この蛋白の
翻訳コドンから１５４のヌクレオチド上流で発生する。
【００５７】アルコールオキシダーゼの３´調節領域
は、ｐ７２（アルコールオキシダーゼ）構造的情報がコ
ード化されている点の約１２０ヌクレオチド下流に関す
るヌクレオチドを決定することで更に特性化を行なっ
た。この配列は、配列Ｄ´´として以下に示してある。
【化１８】 配列Ｄ´´ ｐ７６遺伝子の詳細な解析 当該クローンｐＰＧ６．０の５´調節領域は、更にｐ７
６の構造的遺伝子がコード化されている場所の当該クロ
ーンの上流（５´）のヌクレオチド配列を決定すること
により特性化された。当該ｍＲＮＡ翻訳開始部位（ＡＴ
Ｇコドン）に先行した最初の６２２のヌクレオチドは次
の通りであると考えられる。
【００５８】
【化１９】 配列Ｄ´´´ クローンｐＰＧ６．０のプロモータ機能は、このヌクレ
オチド塩基の配列の内に含まれていると考えられるが、
当業者は、配列Ｄ´´´として表わされる配列よりも更
に上流の配列により追加の調節性質を与えうることを認
識している。クローンｐＰＧ６．０の当該３´調節領域
を、当該ｐ７６構造的情報がコード化されている場所の
約１８０ヌクレオチド上流の（３´）のヌクレオチド配
列を決定することにより特性化した。当該配列は、配列
Ｄ´´´´として以下に示す。
【００５９】
【化２０】 配列Ｄ´´´´ 形質転換酵母の発現 本発明の上記プラスミドは、形質転換することのできる
酵母菌株で有用性を有している。酵母中での遺伝子発現
の、本発明による新規ＤＮＡ断片による調節は、当該形
質転換した生物を炭素源飢餓にさらすことにより達成さ
れる。種々の異化代謝産物制限及び非異化代謝産物制限
炭素源で生育させた後での炭素源飢餓は、この発明の調
節領域の制御下で保持されていた遺伝子産品の発現を誘
発する。当該所望の遺伝子産品の形質転換酵母の適切な
種での発現を達成するための他の手段は、形質転換酵母
をメタノールで生育させることである。当該所望の遺伝
子産品の発現を誘発するもう一つの手段は、非異化代謝
産物制限炭素源を含む。培地上で形質転換酵母を生育さ
せることである。この発明の調節領域は、すべての酵母
菌株での発現に有用である。何故ならば、種々な条件下
で当該調節領域は誘導されることが示されているからで
ある。かくして、メタノール又は非異化代謝産物制限炭
素源で生育できる酵母で異質の、つまり、外来性のポリ
ペプチドを直接生産することができる；一方、異化代謝
産物制限炭素源で生育できる酵母では、当該酵母細胞を
炭素飢餓条件下で生育させることにより異質のポリペプ
チドを生産することができる。
【００６０】この発明の工程で好ましい形質転換酵母菌
株は、カンジダ、クロエケラ（Ｋｌｏｅｃｋｅｒａ）、
サッカロミセス、ロドトルラ、ハンセンヌラ、トルロプ
シス、ピキア及びクルイベロマイセス（Ｋｌｕｙｖｅｒ
ｏｍｙｃｅｓ）属に属するものを含む。これらの属の酵
母は、取扱い上の安全性、生育条件などについて既に確
立して居り、当業者によく知られている故に、好まし
い。本発明の工程の一つ態様に使用する菌株として特に
好ましいものは、メタノールを炭素及びエネルギー源と
して生育できる酵母菌株である。メタノールで生育でき
る酵母として知られている酵母には、カンジダ、クロエ
ケラ、サッカロミセス、ロドトルラ、ハンセンヌラ、ト
ルロプシス、及びピキア属に属するものが含まれる。
【００６１】本発明の調節領域は、非異化代謝産物制限
炭素源、及び炭素飢餓条件下での生育によりまた誘導さ
れるので、グルコース、アセテート（塩又はエステ
ル）、グリセロール、エタノール、ラクトーズ、ガラク
トーズ、果糖及び蔗糖等又はこれらの２つ又はそれ以上
のいずれの組合せ混合物を基質として生育することがで
きる酵母は、また本発明の実施に有用である。当該宿主
生物を適当な非異化代謝産物制限性の非メタノール炭素
源、例えば、グリセロール及びガラクトーズで生育させ
るか、又は、当該宿主生物を適当な異化代謝産物制限性
炭素源、例えば、エタノール、グルコース及び果糖で生
育させ、次いで当該宿主生物を炭素飢餓条件下にさらす
ことにより、本発明の調節領域の制限下で遺伝子産品の
発現が達成できる。
【００６２】更に、この発明の調節領域は、発現の誘発
及び発現の抑制の両方において、種々な条件に対して応
答性であるので、この発明の調節領域の制御下で遺伝子
産品の調節された発現が達成される。それ故に、例え
ば、たんに低い水準の異質の遺伝子の発現を誘発する炭
素源で生成させ、次いで遺伝子発現を強く誘発するメタ
ノールにきりかえることができる。また、調節された遺
伝子の発現は、誘発／抑制基質の混合物、例えば、メタ
ノール／グルコース混合物を用いることにより達成でき
る。再にもう一つの方法としては、メタノールで生育さ
せて誘導した高水準の発現を、グルコース又はエタノー
ルなどの抑制炭素源の生育用培地に加えることにより所
望の如く低下させることができる。勿論、当業者なら
ば、基質混合物の種々のバリエーション及び基質導入の
順序の種々のバリエーションが可能であり、この発明の
調節領域から得られた遺伝子発現の水準を随分制御でき
るということを承知している。
【００６３】特別に好ましい宿主酵母菌株の一つは、変
異株ピキア パストリスＧＳ１１５であり、これは、ヒ
スチジン生産能欠損変異株の一つで、それ故に、変異遺
伝子型ｈｉｓ４を持つものとして命名されている、ＧＳ
１１５は、ピキア パストリスＮＲＲＬ Ｙ−１１４３
０から誘導されたもので、イリノイ州ペオリア市にある
合衆国農務省の北方地区研究センターに、この発明が特
許されたとき公衆が自由に入手可能となるように、寄託
してある。ピキア パストリスＧＳ１１５は、寄託番号
ＮＲＲＬ Ｙ−１５８５１が１９８４年８月３１日現在
で割り当られている。この特別の宿主は、ヒスチジン
（代謝）経路に欠缺のある栄養要求性変異株であるので
有用である。この宿主の、種々の他のＤＮＡ配列中、Ｈ
ＩＳ４遺伝子機能を含有するベクターでの形質転換は、
形質転換宿主の容易な選抜を可能とする。
【００６４】本発明の調節領域は、沢山の栄養要求性の
変異株が知られている、サッカロミセス属に属する酵母
菌株内で外来遺伝子産品の調節された発現に有用である
こともまた実証されている。追加の好ましい宿主酵母菌
株には、ＡＴＣＣ２６４２３（ｔｒｐ１、ａｄｅ１、ｈ
ｉｓ２、ｌｅｕ１、ｇａｌ１、ｎｒａ１変異株）、ＡＴ
ＣＣ２４６８４（ｔｒｐ１、ａｄｅ１、ｈｉｓ７、ｇａ
ｌ１、ｎｒａ１変異株）、ＡＴＣＣ３２８１０（ｔｒｐ
５、ａｒｇ４、ｈｉｓ５、ｌｙｓ５、ａｄｅ５、ｇａｌ
２変異株）、ＡＴＣＣ３４１８２（ａｄｅ３、ｈｉｓ、
ｌｙｓ、ｕｒａ変異株）ＡＴＣＣ３４３５２（ｕｒａ２
変異株）、ＡＴＣＣ３４３５３（ｕｒａ２変異株）、Ａ
ＴＣＣ３８５２３（ａｒｇ１、ｔｈｒ１変異株）、ＡＴ
ＣＣ３８６２６（ｌｅｕ２、ｈｉｓ４変異株）、ＡＴＣ
Ｃ３８６６０（ｈｉｓ４、ｌｅｕ２、ｔｈｒ４変異
株）、ＡＴＣＣ４２２４３（ｕｒａ変異株）、ＡＴＣＣ
４２３３６（ａｄｅ１、ｈｉｓ４、ｔｈｒ４変異株）、
ＡＴＣＣ４２４０３（ａｒｇ４、ｌｙｓ７変異株）、Ａ
ＴＣＣ４２４０４（ａｄｅ１、ｈｉｓ４、ｌｅｕ２変異
株）、ＡＴＣＣ４２５６４（ｕｒａ１、ｈｉｓ６変異
株）、ＡＴＣＣ４２５９６（ｈｉｓ４、ｌｅｕ２、ｌｙ
ｓ変異株）、ＡＴＣＣ４２９５７（ｈｉｓ４、ｌｅｕ
２、ｔｈｒ４、ｔｒｐ変異株）、ＡＴＣＣ４２９５０
（ａｄｅ変異株）、ＡＴＣＣ４２９５１（ａｄｅ、ｌｅ
ｕ変異株）、ＡＴＣＣ４４０６９（ｕｒａ１変異株）、
ＡＴＣＣ４４０７０（ｌｅｕ２、ｈｉｓ４変異株）、Ａ
ＴＣＣ４４２２２（ｈｉｓ変異株）、ＡＴＣＣ４４３７
６（ｈｉｓ４、ａｄｅ２変異株）、ＡＴＣＣ４４３７７
（ｈｉｓ４、ｌｅｕ１変異株）などが、当業者にとって
は、容易に入手可能である。
【００６５】当業者にとって、有用な宿主菌株は、栄養
要求性の変異株のみに限定されないことは明らかなこと
である。それ故、陽性淘汰マーカー、例えば、抗生物質
抵抗性遺伝子をもつ原栄養要求性の菌株の形質転換は、
また、形質転換菌株の検出及び分離の有用な手段を提供
する。
【００６６】大腸菌はまたこの発明のプラスミドの宿主
として適当である。当業者は、大腸菌の多くの菌株が適
当な宿主であると認めている。この発明で使用した数種
の菌株は以下にまとめて示す。菌株名称 寄託番号 ＭＣｌ０６１ 不明 ＬＥ３９２ ＡＴＣＣ＃３３５７２ ＭＭ２９４ ＡＴＣＣ＃３３６２５
【００６７】ピキア パストリスの形質転換手順 ピキア パストリスの形質転換についてはいままでに記
載されていない。ピキア パストリスの形質転換に関す
る実験手順については、より詳しく以下に記載する（実
施例XII 参照）。ピー・パストリスの形質転換系の開発
のため、栄養要求性の変異株ＧＳ１１５（ＮＲＲＬ Ｙ
−１５８５１）を分離し、当該菌株が検出しうるヒスチ
ジノール脱水素酵素活性を有しないので、ヒスチジン経
路において欠缺していると決定した。ＧＳ１１５（ＮＲ
ＲＬ Ｙ−１５８５１）は、細胞株の酵素消化によりス
フェロプラストを得、更に次の工程を行なうことにより
形質転換される。すなわち、当該スフェロプラストを形
質転換用ＤＮＡと混合し、カルシュウム イオンとポリ
エチレン グリコールの存在下でインキュベートし、次
いでヒスチジンを欠く淘汰用生育倍で再生する。当該形
質転換用ＤＮＡは、当該宿主菌株の欠缺しているＨＩＳ
４遺伝を含み、それ故に、形質転換された細胞のみが採
用された淘汰用生育培地で生存できる。
【００６８】ピキア パストリスＨＩＳ４遺伝子の単離 ＨＩＳ４遺伝子は、ピー・パストリスＮＲＲＬ Ｙ−１
１４３０から、全染色体のＳａｕ３Ａを用いた部分消化
及びそれに続いての蔗糖濃度勾配遠心法により単離した
（実施例XIII参照）。エス・セレビシエ−大腸菌シャト
ルベクターＹＥｐ１３（ＡＴＣＣ３７１１５：図３３参
照）のＢａｍＨＩ切断部位に、５〜２０Ｋｂｐの断片を
クローン化し、大腸菌を形質転換した。エス・セレビシ
エ５７９９−４Ｄ株（ＮＲＲＬ Ｙ−１５８５９）、ｈ
ｉｓ４ＡＢＣ変異株のスフェロプラストを約１μｇのヒ
ンネン等の方法によりＹＥｐ１３ピキアＤＮＡライブラ
リーと混合し、ヒスチジン欠損培地で再生させた。全再
生スフェロプラスト５×１０7 個から、形質転換体とし
ては、約１×１０3 コロニーの原栄養性酵母が得られ
た。ＤＮＡなしで培養した対照サンプルでは、コロニー
の発生はなかった。２０個のＨｉｓ+ コロニーから、全
酵母ＤＮＡを抽出し、大腸菌を逆形質転換させた。１７
の酵母ＤＮＡ調製物がアンピシリン抵抗性コロニーを形
成した。これらのクローン化された断片は、制限酵素切
断物の大きの測定及び同地図化並びに実施例XIIIＧ項記
載の方法で低厳密度下での標識されたエス・セレビシエ
ＨＩＳ４断片とのクロスハイブリダイゼーション（ポス
トハイブリッド化洗浄については、５５℃、２×ＳＳＣ
で実施）に対する能力により更に特性を明らかとした。
このＨＩＳ４含有断片は、それぞれがエス・セレビシエ
ＨＩＳ４遺伝子とハイブリッド化した断片を含有してい
た。そのうちの１つのＨＩＳ４含有プラスミドを再クロ
ーン化して、ｐＹＪ８と命名したＨＩＳ４含有プラスミ
ドを得、第２５図に示している。プラスミドｐＹＪ８
は、クロラムフェニコール及びアンピシリン抵抗性遺伝
子とピキアＨＩＳ４遺伝子を含むｐＢＲ３２５配列を含
有している。
【００６９】当該ＡＲＧ４は、ピー・パストリスＮＲＲ
Ｌ Ｙ−１１４３０から、同様のプロトコールと、Ａｒ
ｇ−エス・セレビシエ菌株Ｓ２０７２Ａ［ａｒｇ４、ｌ
ｅｕ２、ｔｒｐ１、ｇａｌ２；カナダ国バークレー市酵
母遺伝子貯蔵センター（Ｙｅａｓｔ Ｇｅｎｅｔｉｃ
Ｓｔｏｃｋ Ｃｅｎｔｅｒ）より入手した］を用いて、
分離したものである。当業者ならば、ピキアからの他の
マーカー遺伝子を、エス・セレビシエ菌株の適当な欠損
株を用いて同様に分離できることは明らかである。ピキア パストリス自律複製配列の分離 他のもう一つの、本発明のベクターとしての有用な成分
は、ピキア由来の自律複製配列配列（ＰＡＲＳ）であ
り、これは、ＧＳ１１５の形質転換頻度も、安定な染色
体外要素として当該プラスミドを保持することも増強す
る。
【００７０】ピキアＡＲＳを探索するために、ピキア
パストリスＧＳ１１５（ＮＲＲＬＹ−１５８５１）から
のＤＮＡをＴａｑＩで一部消化し、５〜１０Ｋｂｐの断
片を単離し、ｐＹＪ８ΔＣｌａの特異的ＣｌａＩ部位へ
とクローン化した（図２６参照）。プラスミドＤＮＡを
約１００００個のＨｉｓ+ ピキアコロニーから回収し、
大腸菌の形質転換に用いた。約１００００のアンピシリ
ン抵抗性コロニーからプラスミドを単離し、次いでＧＳ
１１５へと逆形質転換した。このサブライブラリーの形
質転換から４０個のＨｉｓ+ 酵母コロニーを別々に淘汰
培地に線条接種し、淘汰培地中で別のカルチャー（ｃｕ
ｌｔｕｒｅ）で生育させた。全酵母ＤＮＡをこれら４０
個の培養菌から抽出し、大腸菌を形質転換した。二つの
プラスミド、ｐＹＡ６３（ＰＡＲＳ１）及びｐＹＡ９０
（ＰＡＲＳ２）−この両者の酵母ＤＮＡ調製物は、もっ
ともアンピシリン抵抗性の大腸菌を産出した−、は更に
解析するために選抜された。これらのプラスミドの両者
とも、ピキア パストリスＧＳ１１５（ＮＲＲＬ Ｙ−
１５８５１）を非常に高頻度で形質転換し、各々とも外
来性のＤＮＡの挿入１つを含有していた。
【００７１】ピキア内でプラスミドを自律性要素として
保持するための当該ＡＲＳの能力を測定するために、欠
くプラスミドで形質転換された酵母細胞を淘汰培地中で
培養し、定期的にサンプルを採取した。細胞中のプラス
ミド配列の状態は、制限酵素で処理してない酵母ＤＮＲ
を放射能で標識したｐＢＲ３２５へとサザンハイブリダ
イゼーションすることにより決定した。プラスミドｐＹ
Ａ６３及びｐＹＡ９０は少なくとも１０世代の間淘汰用
培地で、ピキア内に保持されていた（５０世代までには
統合されてしまった。）。ピキア自律複製配列（ＰＡＲ
Ｓ１）と予想されるものの１つを、自律要素として形質
転換ＤＮＡを保持する能力をたしかめるために他の類種
類のピキアベクター中にクローン化した。プラスミドｐ
ＹＪ３０（図２７参照）及びｐＢＰｆ１（図３４参照）
は、淘汰培地（Ｈｉｓ- ）中で２０世代も生育させた後
でも、依然として自律要素として存在して居り、細胞あ
たり多数のコピーが存在していた。ｐＹＪ３０で形質転
換した細胞のサザンブロット解析は、細胞当り約１０個
のコピーの存在を示している。
【００７２】ｐＹＪ３０及びｐＢＰｆ１により与えられ
たＰＡＲＳ１を夫々含有するプラスミド、ｐＳＡＯＨ５
（図１８参照）及びｐＴ７６Ｈ４（図２２ｂ参照）が、
誘導源のプラスミドと同様の安定性を示すか否かを確か
めるために、これらのベクターを含有する細胞を、グル
コースの存在下、淘汰条件（Ｈｉｓ- ）下で５０世代に
わたり生育させた。これらのプラスミドの安定性は、ｐ
ＹＪ３０の安定性、これは、非淘汰培地に移し替えると
迅速にＨｉｓ原栄養性を損失するが、そのことを含め
て、に相当するものであった。それ故、自律複製配列、
ＰＡＲＳ１を含有するプラスミドを用いた実験は、自律
プラスミドからの遺伝子表現の結果を提示するものと考
えられる。
【００７３】新規のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子含有構
造 この発明による調節領域が、蛋白産品の産出を制御する
能力を実証するべく、新規のＤＮＡ構造を調製した。つ
まり、大腸菌ｌａｃＺ遺伝子を、ポリペプチドｐ７２
（アルコールオキシダーゼ）又はｐ７６の遺伝情報をコ
ード化している遺伝子の調節領域の制御下で数種類のプ
ラスミドにうえつけた。プラスミドｐＳＡＯＨ１、ｐＳ
ＡＯＨ５、ｐＳＡＯＨ１０、ｐＴＡＦＨ．８５、ｐＴ７
６ＨＩ、ｐＴ７６Ｈ３及びｐＴ７６Ｈ４の調製について
は、実施例XIV に記載している。この発明の調節領域−
β−ガラクトシダーゼ遺伝子融合体のプラスミドを伝播
体として、宿主酵母細胞への導入についてはここで記述
するが、当業者であれば、調節領域−構造遺伝子構築を
プラスミドを経由して細胞へと導入する必要のないこと
は明らかなことである。それ故、酵母中で保持できるも
のであれば、どんな分子も用いることができる。当該調
節領域−構造遺伝子構築を、かわりに、当該宿主酵母細
胞の染色体へ統合できる。
【００７４】当業者であれば、また、ここで記述した調
節領域の規制下でβ−ガラクトシダーゼを産出すること
に、この発明の技術的範囲は限らないことは明らかなこ
とである。この発明の調節領域の規制下での産品できる
ポリペプチドの種類は、この明細書をどう読解するかに
よってのみ限定されるのである。多くの方法が、所望の
ポリペプチドの情報をコード化しているＤＮＡ配列の調
製には存在している。例えば、公知の方法により、種々
の長さのオリゴヌクレオチドが合成出来る。いくつかの
このようオリゴヌクレオチドが、それ自身の特異的塩基
対合性質の結果集合し、長い二重鎖分子となる。この二
重鎖の分子の成分オリゴペプチドは、酵素ＤＮＡリガー
ゼに結合（リゲート）することができる。所望の遺伝情
報をコード化している配列を含有するＤＮＡ分子は、か
わりに、逆転写酵素の作用に対して鋳型として、所望の
ポリペプチドに関連したメッセンジャーＲＮＡを使用
し、酵素、逆転写酵素の利用により合成することができ
る。更にもう一つの可能性は、ゲノムＤＮＡ断片のクロ
ーン化及び所望の産品の直接発現が起るか否かの観察で
ある。
【００７５】所望のポリペプチドの遺伝情報をコード化
しているＤＮＡ配列は、種々の方法により、調節領域−
構造遺伝子構築の調製のために修飾することが可能であ
る。例えば、上記の如く調製されたＤＮＡの末端を、特
定の制限エンドヌクレアーゼにより認識されたヌクレオ
チド配列を含有する短かい二重鎖ＤＮＡ、いわゆるリン
カー分子に、酵素、ＤＮＡリガーゼを用いてリゲートす
ることができる。これらの分子の特定制限エンドヌクレ
アーゼを用いて、リゲーションに次いで、消化すること
により、調製されたＤＮＡ配列の末端で、特定の制限エ
ンドヌクレアーゼ認識部位に対応する末端（ｔｅｒｍｉ
ｎｉ）を生成する。
【００７６】この発明により調製された、３個の特定調
節領域−β−ガラクトシダーゼ遺伝子構築は、図１５及
び図１６に提示した制限地図化データを用いて記述して
いる。図１５ａに提示した制限地図は、ｐＰＧ６．０の
５´調節領域から誘導した０．８５キロ塩基対のＨｉｎ
ｄIII −ＢａｍＨＩ部分と大腸菌からのｌａｃＺ遺伝子
よりなる構築（３．６キロ塩基対のＢａｍＨＩ−Ｎｒｕ
Ｉ断片として示した）を記述する。これと同じ構築がプ
ラスミドｐＴＡＦＨ．８５、ｐＴ７６Ｈ１及びｐＴ７６
Ｈ２のそれぞれに存在するが、それについては、以下
（実施例XIV ）でより詳しく記述する。図１５ｂに提示
した制限地図は、ｐＰＧ６．０の５´調節領域から誘導
された１．３キロ塩基対のＨｉｎｄIII −ＥｃｏＲＩ部
分と大腸菌からのｌａｃＺよりなる構築を記述する。こ
れと同じ構築は、プラスミドｐＴ７６Ｕ１、ｐＴ７６Ｈ
３及びｐＴ７６Ｈ４のそれぞれに存在して居り、詳細に
ついては以下（実施例XIV 参照）に述べる。
【００７７】図１６は、ｐＰＧ４．０の５´調節領域の
一部から誘導した１．１キロ塩基対のＥｃｏＲＩ−Ｂａ
ｍＨＩ断片と大腸菌のｌａｃＺ遺伝子よりなる構築につ
いて記述している。これの構築は、プラスミドｐＳＡＯ
Ｈ１、ｐＳＡＯＨ５及びｐＳＡＯＨ１０のそれぞれに存
在し、以下（実施例XIV ）で詳述する。プラスミドｐＳ
ＡＯＨ１は、図１７に図式的に表示してある。図１６に
詳記した調節領域−β−ガラクトシダーゼ遺伝子融合を
含有することに加えて、当該プラスミドは次のものを含
有することが明らかにされている： （ａ）ｐＢＲ３２２配列、ＡｍｐR 遺伝子も含む、
（ｂ）ピキア パストリスＨＩＳ４遺伝子、（ｃ）エス
・セレビシエ２μの環状（ｃｉｒｃｌｅ）ＤＮＡ、及び
（ｄ）エス・セレビシエ由来の断続（ｉｎｔｅｒｒｕｐ
ｔｅｄ）ＵＲＡ３遺伝子。 それ故、当該プラスミドは、大腸菌宿主及び酵母宿主に
おいて形質転換又は複製する能力を有する。淘汰可能な
マーカーは、大腸菌又は酵母宿主内でＤＮＡの操作のた
めに存在している。
【００７８】プラスミドｐＳＡＯＨ５は図１８に図式的
に表示してある。当該プラスミドは、上記のｐＳＡＯＨ
１に類似しているが、次の点、即ち、エス・セレビシエ
２μ環状ＤＮＡとピキア パストリスＨＩＳ４遺伝子フ
ランキングＤＮＡのいくつかが除去され、一方、ピキア
パストリス自律複製配列（ｐＹＡ６３からのＰＡＲＳ
１）が加えられた点でことなる。
【００７９】プラスミドｐＳＡＯＨ１０は、図１９に図
式的に示す。当該プラスミドは、（ａ）調節領域−β−
ガラクトシダーゼ遺伝子融合、（ｂ）テトラサイクリン
抵抗性、クロラムフェニコール抵抗性及びアンピシリン
抵抗性（それぞれｔｅｔR 、ｃａｍR 及びａｍｐR ）を
与える遺伝子を含むｐＢＲ３２５配列、と（ｃ）エス・
セレビシエＨＩＳ４遺伝子（以下に記述する通りプラス
ミドｐＹＡ２より得たもの）を含有する。プラスミドｐ
ＴＡＦＨ．８５、ｐＴ７６Ｈ１及びｐＴ７６Ｈ２は、用
いた調節領域−β−ガラクトシダーゼ遺伝子融合が図１
５ａに記載したもの（図１６に記載した融合の代わり
に）であることを除き、上記の３種のプラスミドに類似
している。プラスミドｐＴ７６Ｈ３及びｐＴ７６Ｈ４
は、使用した調節領域−β−ガラクトシダーゼ遺伝子融
合が（図１６に記載した融合に替え）図１５ｂに記載し
たものであることをのぞき、ｐＳＡＯＨ１とｐＳＡＯＨ
５と類似している。
【００８０】プラスミドｐＴＡＦＨ．８５は、図２０に
図式的に表示してあり、それは、（ａ）図１５ａに示し
た調節領域−β−ガラクトシダーゼ遺伝子融合、（ｂ）
ａｍｐR 遺伝子を含むｐＢＲ３２２配列、（ｃ）ピキア
パストリスＨＩＳ４遺伝子、（ｄ）エス・セレビシエ
２μ環状ＤＮＡと、（ｅ）エス・セレビシエ由来の断続
ＵＲＡ３遺伝子を含有する。プラスミドｐＴ７６Ｈ１
は、図２１に図式的に表示しているが、それは、（ａ）
図１５ａに示した調節領域−β−ガラクトシダーゼ遺伝
子融合、（ｂ）ａｍｐR 遺伝子を含むｐＢＲ３２２配
列、と（ｃ）ピキア パストリスＨＩＳ４遺伝子と自律
複製配列（ＰＡＲＳ１）を含有する。プラスミドｐＴ７
６Ｈ２は、図２２に図式的に表示してあるが、それは、
（ａ）図１５ａに示した調節領域−β−ガラクトシダー
ゼ遺伝子融合、（ｂ）テトラサイクリン抵抗性、クロラ
ムフェニコール抵抗性及びアンピシリン抵抗子付与遺伝
子を含有するｐＢＲ３２５配列、と（ｃ）エス・セレビ
シエＨＩＳ４遺伝子を含有する。プラスミドｐＴ７６Ｈ
３は、図２２ａに図式的に表示しているが、それは、
（ａ）図１５ｂに示した調節領域−β−ガラクトシダー
ゼ遺伝子融合、（ｂ）ａｍｐ R 遺伝子を含むｐＢＲ３２
２配列、（ｃ）ピー・パストリスＨＩＳ４遺伝子、
（ｄ）エス・セレビシエ２μ環状ＤＮＡと、（ｅ）エス
・セレビシエ由来の断続ＵＲＡ３遺伝子を含有する。プ
ラスミドｐＴ７６Ｈ４は、図２２ｂに図式的に示してあ
るが、それは、（ａ）図１５ｂに示した調節領域−β−
ガラクトシダーゼ遺伝子融合、（ｂ）ａｍｐ R 遺伝子を
含有するｐＢＲ３２２配列、（ｃ）ピキア パストリス
ＨＩＳ４遺伝子と、（ｄ）ピキア パストリス自律複製
配列（ＰＡＳ１）を含有する。
【００８１】酵母におけるβ−ガラクトシダーゼの発現 ピキア パストリスＧＳ１１５（ＮＲＲＬ Ｙ−１５８
５１）を上記の新規β−ガラクトシダーゼ遺伝子含有構
築で形質転換した。得られた形質転換酵母菌株のうち数
種類のものは、合衆国農務省北方地区研究センターに寄
託してあり、次の如き寄託番号が付与されている。
【表８】
【００８２】この新規β−ガラクトシダーゼ遺伝子含有
構築を大腸菌の形質転換にも使用した。形質転換細菌の
菌株を、この出願が特許されたとき公衆が自由に入手可
能にするためイリノイ州ピオリア市の北方地区研究所に
寄託した。この形質転換菌株は次の寄託番号が付与され
ている。
【表９】
【００８３】ピキア パストリスＧＳ１１５（ＮＲＲＬ
Ｙ−１５８５１）を本発明のアルコールオキシダーゼ
及びｐ７６調節領域−ｌａｃＺ遺伝子融合を含有する上
記８種のプラスミドで形質転換し、ビチオンと炭素源と
してグルコースを補充した最少培地で定常期まで生育さ
せた。定常期に達すると、ビオチンと炭素源としてメタ
ノールを補充した最少培地に移し替えた。特定時点で、
培養菌のサンプルを採取し、実施例VII 及びXVに記載し
た方法で、β−ガラクトシダーゼ及びアルコールオキシ
ダーゼの存在について分析した。グルコースを炭素源と
して生育させた細胞は、検出できる水準のβ−ガラクト
シダーゼもアルコールオキシダーゼも産出しなかった
が、一方、メタノールを唯一の炭素源として生育させた
細胞は、顕著な水準のアルコールオキシダーゼ及びβ−
ガラクトシダーゼを発現していることが判明した。グル
コースで生育させた細胞を、炭素源飢餓条件にさらすと
測定しうる量のアルコールオキシダーゼばかりでなくβ
−ガラクトシダーゼを同様に発現することが判明した。
それ故、本発明の調節領域が、炭素飢餓条件にも、メタ
ノールの存在にも応答性であることは明らかである。
【００８４】本発明の調節領域が非異化代謝産物制限炭
素源同様炭素飢餓条件での生育に応答性であることの実
証のため、アルコールオキシダーゼ調節領域含有のプラ
スミド、ｐＴＡＯ１３、ｐ７６調節領域含有のプラスミ
ド、ｐＴ７６Ｕ１を用いて非メタノール利用酵母菌株、
サッカロミセス セレビシエの形質転換に使用した。使
用した形質転換菌株の一つで、当実験室内名称ＳＥＹ２
１０２−ｐＴＡＯ１３を有する菌株を、この出願が特許
されたとき公衆が入手可能とするためイリノイ州ピオリ
ア市の北方地区研究センターに寄託してある。この形質
転換菌株には寄託番号ＮＲＲＬ Ｙ−１５８５８が付与
されている。サッカロミセス セレビシエＮＲＲＬ Ｙ
−１５８５８及びＳＥＹ２１０２−ｐＴ７６Ｕ１をグル
コース、果糖、エタノール、グリセロール及びガラクト
ースで約５世代の間生育させ、次いで炭素源飢餓条件に
さらした。５世代間の生育後β−ガラクトシダーゼの通
常分析（実施例XV参照）により、グリセロール及びガラ
クトースで生育させた細胞は、大量のβ−ガラクトシダ
ーゼを産出したが、一方グルコース及び果糖で生育させ
た細胞は、実質的には、β−ガラクトシダーゼを産出し
なかった。炭素源飢餓条件下で６時間生育させたのち、
β−ガラクトシダーゼを測定したところ、グルコース及
び果糖で生育させた形質転換菌株でも、中程度の、また
グリセロール及びガラクトースで生育させたものでは、
相当な量のβ−ガラクトシダーゼの産出が認められた。
それ故、この発明の調節領域は、遺伝子に非常に異なっ
た酵母宿主での蛋白質産品の産出を制御でき、メタノー
ル利用酵母での利用に限定されるものではない。
【００８５】
【実施例】以下の実施例で使用した緩衝液及び溶液は次
に示したような組成を有する。 １モルトリス ８００ｍｌの水にトリス塩基１２１．１ｇ、ｐＨを所望の値に 緩衝液： 濃塩酸（３５％）を加えて調整。最終ｐＨ調節前に溶液を室温 まで冷却し、最終液量を１リットルとする。 Ｓ−緩衝液： １．５モルのソルビトールを０．０４Ｍ燐酸緩衝液中に含む。 ｐＨ＝６．６ ｐＫ緩衝液： ０．１４モルのＮａＣｌ、１％ドデシル硫酸ソーダ（ＳＤＳ） 、０．０１モルＥＤＴＡを０．０１Ｍ（ｐＨ７．４）トリス緩 衝液中に含む。 ＥＳＴ緩衝液： １０ミリモルのＥＤＴＡ、０．２％ＳＤＳを、０．０１Ｍ（ｐ Ｈ７．４）トリス緩衝液中に含む。 ＴＥ緩衝液： １．０ミリモルのＥＤＴＡを０．０１Ｍ（ｐＨ７．４）のトリ ス緩衝液中に含む。 ＳＳＣ： ０．１５モルのＮａＣｌと、１５ミリモルのクエン酸ソーダを 含み、ｐＨを７．０に調節。 ＴＡＥ： ４０ミリモルの酢酸、５ミリモルのＥＤＴＡを０．０２モル（ ｐＨ８．３）トリス緩衝液に含む。 ＰＢＳ（燐酸緩 １０ミリモルの燐酸ソーダ（ｐＨ７．０）と０．１５モルのＮ 衝食塩水）： ａＣｌ ラムンリー ６２．５ミリモルのトリス−塩酸（ｐＨ６．８）、２％ＳＤＳ （Ｌａｍｍｌｉ）、１０％グリセロール、５％２−メルカプトエタノール、０． 負荷緩衝液： ０１％ブモムフェノールブール ＲＩＰＡ １％ＮＰ４０（シグマ製） 緩衝液： １％デオキシコール酸０．１％ＳＤＳをＰＢＳ中に含む。 ２０倍ＳＳＣ： ２０モルのＥＤＴＡ、０．１６モルのＮａＯＨ、０．２モルの ＮａＨ2 ＰＯ4 ・Ｈ2 Ｏ、３．６モルのＮａＣｌ、ｐＨをＮａ ＯＨで７．０に調整 デンハルト ５ｇのファイコール（Ｆｉｃｏｌｌ）、５ｇのポリビニールピ （Ｄｅｎｈａｒ ロリドン、５ｇの牛血清アルブミン（ＢＳＡ；ペンタックスフ ｄｔ）氏溶液 ラクションＶ）、全容を水で５００ｍｌとする。 （Ｘ５０）： プレハイブリダ ５倍のＳＳＰＥ、５倍のデンハルト氏溶液、５０％の脱イオン イゼーション 化ホルムアミド、０．２％ＳＤＳ、２００μｇ／ｍｌの切断し 緩衝液液： 変性したニシンの精子ＤＮＡ、 ＬＢ（ルリアー ５ｇのバクト−トリプトン、５ｇのバクト−酵母エキス、２． ベールタニ） ５ｇＮａＣｌ、を水１リットル中に含み、ｐＨはＮａＯＨで７ 培地： ．５に調整。 ＹＰＤ培地： １％のバクト−酵母エキス、２％のバクト−ペクトン、２％の デキストローズを水１リットル中に含む。 ＳＤ培地： ６．７５ｇの酵母窒素基剤でアミノ酸を含有しないもの（ＤＩ ＦＣＯ）、２％デキストローズを水１リットル中に含む。 ＳＥＤ： １Ｍのソルビトール、２５ミリモルのＥＤＴＡ、５０ミリモル のＤＴＴ ＳＣＥ緩衝液： ９．１％のソルビトール、１．４７％のクエン酸ソーダ、０． １６８ｇＥＤＴＡ、５０ｍｌの水、ｐＨを塩酸で５．８に調整 。 ＣａＳ： １モルのソルビトール、１０ｍＭのＣａＣｌ2 、濾過、滅菌す る。 ＰＥＧ溶液： ２０％ポリエチレングリコール−３３５０、１０ミリモルのＣ ａＣｌ2 、１０ミリモルのトリス−塩酸（ｐＨ７．４）、濾過 、滅菌する、 ＳＯＳ： １モルのソルビトール、０．３倍のＹＰＤ培地１０ミリモルの ＣａＣｌ2 ホルムアミド染 ０．１％キシレン シクレノール（ｃｙｌｅｎｏｌ）ＦＦ、０ 料ミックス： ．２％プロモフェノールブルー、１０ミリモルのＥＤＴＡ、９ ５％の脱イオンホルムアミド。 トップゲル： ７６．８ｇの尿素、２４ｍｌのアクリルアミドストック、８ｍ ｌの１０倍ＴＢＥ最終容量を１６０ｍｌとする。 アクリルアミド ３８ｇのアクリルアミド、２ｇのビス（Ｎ，Ｎ−メチレンビス ストック： アクリルアミド）、に水を加えて全容を１００ｍｌとする。 ボトムゲル： １４．４ｇの尿素、３．０ｇの蔗糖、７．５ｍｌの１０倍ＴＢ Ｅ、４．５ｍｌのアクリルアミドストック、０．３ｍｌブロム フェノールブルー溶液（０．０１ｇ／ｍｌ）に水を加えて全容 を３０ｍｌとする。 ハイブリダイゼ ５０％ホルムアミド、０．７５％モルＮａＣｌ、０．１モルの ーション選抜用 トリス、ｐＨ７．４、０．００８モルのＥＤＴＡ、０．５％Ｓ プレハイブリダ ＤＳ、２００μｇ／ｍｌのウサギ肺臓ｔＲＮＡ（シグマ製） イゼーション緩 衝液： ０．５モルのＮ ０．５ＭＮａＣｌ、１０ミリモルのＥＤＴＡ、１０ミリモルの ＥＴＳ緩衝液： トリス、ｐＨ７．４、０．２％ＳＤＳ １０倍ＲＴ緩衝 ５００ミリモルのＮａＣｌ、３４０ミリモルのトリス、ｐＨ８ 液： ．３ ６０ミリモルのＭｇＣｌ2 、５０ミリモルのＤＴＴ（ジ チオスライトール） 希釈ＲＴ： ４μｌのＨ2 Ｏ、１μｌの１０倍ＲＴ緩衝液、５μｌの逆転写 酵素、１５単位／μｌ（ライフサイエンセズ社製） ジデオキシ： ｄｄＡＴＰ ０．４９ミリモル ｄｄＣＴＰ ０．１１６５ミリモル ｄｄＧＴＰ ０．３６９ミリモル ｄｄＴＴＰ ０．８２ミリモル ｄＮＴＰ ミックス： ０．６２５ミリモルのｄＧＴＰ、 ０．６２５ミリモルのｄＡＴＰ、 ０．６２５ミリモルのＴＴＰ チェイス （Ｃｈａｓｅ）：１．１２５ミリモルのｄＡＴＰ、 １．１２５ミリモルのｄＣＴＰ、 １．１２５ミリモルのｄＧＴＰ、 １．１２５ミリモルのＴＴＰを１倍ＲＴ緩衝液中に含む。 特に特定しないかぎり、上記の溶液は、使用時基本（１
倍の）濃度を示す。実施例を通して、異なった濃度水準
を採用したところでは、その事実を、基本（１倍の）濃
度の倍数として、当該溶液を言及することにより示して
いる。
【００８６】次の略号を実施例を通して使用している
が、次の意味を有する。 ＥＤＴＡ エチレンジアミン テトラ酢酸 ＴＥＭＥＤ Ｎ，Ｎ，Ｎ´，Ｎ´−テトラメチレンジアミン ＤＴＴ ジチオスライトール ＢＳＡ 牛血精アルブミン ＥｔＢｒ 臭化エチジウム Ｃｉ キューリー ｄＡＴＰ デオキシアデノシン トリホスヘート ｄＧＴＰ デオキシグアノシン トリホスヘート ＴＴＰ チミジン トリホスヘート ｄＣＴＰ デオキシシチジン トリホスヘート ｄＸＴＰ “一般的”デオキシ トリホスヘートヌクレオチド オリゴ（ｄＴ 供給先：コラボレーテブ リサーチ（株）（Ｃｏｌｌａｂｒａｔ ）12-18 ｉｖｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｉｎｃ．） チモリラーゼ 供給先：マイルス ラボラトリーズ社 ６００００ 常套手段として用いた数種類の手順は、ここで以下に詳
記する標準プロトコールに従っている。遠心分離は、澄
明上澄液が得られるに充分な回転速度で、かつ充分な時
間実施する。一般に、酵母細胞の遠心分離は、少くなく
とも１５００Ｇで、少くなくとも５分間実施する。
【００８７】フェノール／クロロホルム／イソアミルア
ルコールでの核酸抽出は、５０：４８：２容のフェノー
ル、クロロホルム及びイソアミルアルコール混合物を、
核酸を含む溶液と等量用い、当該核酸含有溶液と接触さ
せることを含む。クロロホルム／イソアミルアルコール
での核酸抽出は、４８：２容のクロロホルムとイソアミ
ルアルコール混合液を当該溶液と等量を用いて接触させ
ることを含む。ゲル、フィルター、等をある特定の溶液
中で洗った又は同溶液に浸漬したと記載している場合
は、全ゲル、フィルター等を適当な容器、例えば、パ
ン、皿、バイアル等内で、当該ゲル、フィルターなどを
対象溶液と完全に接触させるために浸たした。
【００８８】
【実施例Ｉ】酵母細胞の生育及び調製 ピキア パストリスＮＲＲＬ Ｙ−１１４３０を、ウエ
グナーにより米国特許第４４１４３２９号中で記載した
ＩＭ１塩最少培地中でメタノール又はエタノールを唯一
の炭素源を用いて３０℃で継続培養により、炭素限定下
で培養した。ＩＭ１最少培地は、培地１リットル当り、
３６ｍＭ（ミリモルと同義）ＫＨ2 ＰＯ 4 、２３ｍＭ
（ＮＨ4 ）2 ＳＯ4 、２ｍＭＭｇＳＯ4 、６．７ｍＭＭ
ＫＣｌ、０．７ｍＭＣａＣｌ2 、０．２μ ＭＣｕＳＯ
4 ・５Ｈ2 Ｏ、１．２５μＭＫＩ、４．５μＭＭｎＳＯ
4 、２μＭＮａ2 ＭｏＯ4 、０．７５μＭＨ3 ＢＯ3 、
１７．５μＭＺｎＳＯ4 、４４．５μＭＦｅＣｌ2 及び
１．６μＭビオチンを含む。メタノールで生育させた細
胞は、約１２時間の保持時間で、１４０ｇ／ｌ（乾重）
の細胞濃度まで生育させた。エタノールで生育させた細
胞は、約１１．５時間の保持時間で、９０ｇ／ｌの細胞
濃度まで生育させた。酵母槽へメタノール又はエタノー
ルを仕込む際には、それぞれ２０％及び４０％の濃度を
含む貯蔵仕込液を使用した。１０ｇの醗酵槽で生育させ
たピキア パストリス細胞を遠心分離により収集し、１
％の２−メルカプトエタノールを含む０．１Ｍトリン
（ｐＨ８．０）に、約１０8 細胞／ｍｌの割合で再懸濁
させた。これらの細胞は、５〜１０分３７℃でインキュ
ベートし、遠心分離により回収した。ペレットを１度３
０ｍｌのＳ−緩衝液で洗浄し、細胞ｇ当り５ｍｌのＳ−
緩衝液に再懸濁させた。チモリラーゼ（マイルス バイ
オケミカルズ製）を細胞懸濁液に加えて、最終濃度で５
００μｇ／ｍｌとした。当該細胞を３７℃で２０分間イ
ンキュベートし、次いで遠心分離した。上澄を捨て、細
胞ペレットを回収した。このペレットを、液体窒素中で
凍結し、後の使用のために−７０℃で保存した。
【００８９】
【実施例ＩＩ】酵母のＲＮＡの単離 全細胞ＲＮＡは、実施例Ｉで記載した如く調製した凍結
ペレットを乳鉢と乳棒で粉砕し、更に液体窒素の存在下
でワリングブレンダーで約２〜５分当該ペレットを破砕
することにより調製した。この粉砕したペレットをＰＫ
緩衝液に、細胞ｇ当り７．５ｍｌの濃度で加えた。プロ
テナーゼＫ（ベーリンガーマンハイム製）を再懸濁させ
た細胞に最終濃度で４００μｇ／ｍｌとなるまで加え、
当該懸濁液を室温で１０分インキュベートした。この混
合液をフェノール／クロロホルム／イソアミルアルコー
ルで抽出し、次いでクロロホルム／イソアミルアルコー
ル抽出を行なった。核酸を、当該溶液を０．２５ＭＮａ
Ｃｌの濃度となるよう調整し、エタノールを加えて沈澱
させた。当該ペレットをＥＴＳ緩衝液の最少量、つま
り、核酸を溶解させるに充分な量の緩衝液量；一般に
は、溶液ｍｌ当りＤＮＡを約１００μｇから最高約１ｍ
ｇ程度に再懸濁させた。この溶液をフェノール／クロロ
ホルム／イソアミルアルコールを用いて、次いで、クロ
ロホルム／イソアミルアルコールを用いて再抽出し、最
後にエタノールで沈澱させた。
【００９０】この核酸をＴＥ緩衝液の最少量中に再溶解
させた。この溶液中に存在するＲＮは、４ｍｌＣｓＣ１
クション［１ｇＣｓＣｌ／ｍｌ １ｍＭＥＤＴＡを１０
ｍＭのトリス緩衝液（ｐＨ７．４）］を通した遠心分離
で富化するか、又は該溶液を２ＭＬｉＣｌとし、４〜８
℃で一晩保持し、沈澱させ、遠心分離により回収した。
当該ポリＡ+ ＲＮＡを、オリゴ（ｄＴ）セルロースカラ
ム上で親和力クロマトグラフィーにより溶液より選抜し
た。一般に、０．２５ｇのオリゴ（ｄＴ）セルローズ、
型式３（コラボレイテブ リサーチ製）を、全ＲＮＡ５
〜１０ｍｇ当りクロマトグラフィーのために用意した。
０．２５ｇのオリゴ（ｄＴ）セルローズを２ｍｌのＥＴ
Ｓ緩衝液でスラリー化して、少さな、シリコンを充填し
たガラスカラム中に注ぎ込んだ。このオリゴ（ｄＴ）セ
ルローズカラムを、当該オリゴ（ｄＴ）セルローズの上
に０．１ＭのＮａＯＨを置き、洗浄液をオリゴ（ｄＴ）
セルローズマトリックスを通過させることにより、洗浄
した。このオリゴ（ｄＴ）セルローズを次いで１０ｍｌ
のＥＴＳ緩衝液を用いて同一の方法で洗浄し、最後に
は、１０ｍｌのＮＥＴＳ緩衝液で洗浄した。全ＲＮＡ
（５〜１０ｍｇ）を、約１０ｍｇ／ｍｌを越えない濃度
でＥＴＳ緩衝液に再懸濁させ、６５℃のウォターバス上
に２分間置いたのち、直ちに氷上に置いた。次いで、当
該ＲＮＡ溶液を室温にまで加温し、５ＭのＮａＣｌの貯
蔵液を、当該ＲＮＡ溶液中での最終塩類濃度が０．５Ｍ
ＮａＣｌとなるよう加えた。得られたＲＮＡ溶液を、既
に調製したオリゴ（ｄＴ）セルローズカラム上におき約
５秒間に１滴の割合でゆっくりと通過させた。カラムの
底から流れ出る材料を試験管中にとり、再びカラムの上
端に加えた。カラムの底から流れ出る材料を二度カラム
上端に加えたときに、当該ＲＮＡ溶液は当該オリゴ（ｄ
Ｔ）セルローズカラムを合計３回通過したこととなる。
カラムを最後に通過させたのち、当該材料を回収し、ポ
リＡ- 、すなわち、非ポリＡＲＮＡと標識した。当該カ
ラムを３０ｍｌの０．５Ｍ ＮＥＴＳで洗浄し、最後
に、ポリＡ+ ＲＮＡカラム上に５ｍｌのＥＴＳ緩衝液を
負荷し、この緩衝液をゆっくりと通過させ、当該ポリＡ
+ ＲＮＡフラクションを、カラムの底から流出す各５ｍ
ｌのフラクションにして回収する事で、溶出させた。当
該ポリＡ+ ＲＮＡフラクションには、ＮａＣｌが全くな
いと仮定して、このフラクションのＮａＣｌ濃度が０．
２５ＭＮａＣｌとなるように調整し、エタノールでＲＮ
Ａを沈澱させた。
【００９１】
【実施例ＩＩＩ】ｃＤＮＡライブラリーの構築 相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）クローンを次のようにして合成
した。実施例IIで記載した如く調製したポリＡ+ ＲＮＡ
を１０μｇ、７μｌのＨ2 Ｏに再懸濁させ、最終濃度を
２．７ｍＭＣＨ3 ＨｇＯＨにし、次いで室温で５分間イ
ンキュベートした。ｃＤＮＡの最初の鎖を、４２℃で１
５分間、５０ｍＭトリス（ｐＨ８．３；４２℃）、１０
ｍＭＭｇＣｌ2 、３０ｍＭ２−メルカプトエタノール、
７０ｍＭＭＫＣｌ、各５００μＭのｄＡＴＰ、ｄＧＴ
Ｐ、ＴＴＰ、２００μＭのｄＣＴＰ、２５μｇ／ｍｌの
オリゴ（ｄＴ）、６０μｇ／ｍｌのアクチノマイシン
Ｄ、２５単位のアールナシン（ＲＮ ａｓｉｎ：バイオ
テック社製）、２５μＣｉα− 32ＰｄＣＴＰ（３２．５
ｐモル）及び１２０単位の逆転写酵素（ライフ サイエ
ンセイズ社製）を含む溶液５０μｌ中で合成させた。こ
の反応混液を３７℃で更に１５分間インキュベートし
た。０．５ＭＥＤＴＡ２μｌと２０％ＳＤＳ０．５μｌ
を加えて反応終了させた。反応混液をフェノール／クロ
ロホルム／イソアミルアルコールで抽出し、次いでクロ
ロホルム／イソアミルアルコールで抽出、最後にセファ
デックスＧ５０カラムを用いＴＥ緩衝液中でクロマトグ
ラフにかけた。この放射能を有する一本鎖のｃＤＮＡ
を、１つのフラクションにプールし、ブタノール抽出
か、真空下での遠心分離による留去により１００μｌま
で濃縮した。この単鎖ｃＤＮＡを当該濃縮溶液よりエタ
ノール沈澱させ、ｃＤＮＡを遠心分離により回収し、１
００μｌの水に再懸濁させた。
【００９２】この単鎖のｃＤＮＡ水溶液を２．５ｍＭ酢
酸アンモニアに調整し、エタノールで沈澱させ、遠心分
離により回収し、２０μｇの水に再懸濁させた。この単
鎖ＤＮＡ溶液を、５ｍＭのＭｇＣｌ2 、１ｍＭの２−メ
ルカプトエタノール、各２５０μＭのｄＡＴＰ、ｄＧＴ
Ｐ及びＴＴＰ、１２５μＭのｄＣＴＰ、２５μＣｉのα
−32Ｐ−ｄＣＴＰ（３２．５ｐモル）及び８単位のレナ
ウ（Ｋｌｅｎｏｗ）断片ＤＮＡＰｏｌＩ（ニューイング
ランド バイオラボ製）を含有する５０ｍＭ燐酸カリ緩
衝液で最終容量を５０μｌとした。得られた反応混液
を、当該単鎖ＤＮＡに相補的な第二のＤＮＡ鎖を合成す
るため、一時間、３７℃でインキュベートした。反応
は、２μｌの０．５ＭのＥＤＴＡの添加により終結させ
た。当該二重鎖ｃＤＮＡフラクションをプールし、プー
ルしたものの単鎖ｃＤＮＡについて記載したと同じ方法
で濃縮し、沈澱させた。最終のエタノール沈澱及び遠心
分離による二重鎖の回収後、当該ペレットは、水２０．
２５μｌに再懸濁させ、次いで、１０ｍＭのＭｇＣ
ｌ2 、３０ｍＭの２−メルカプトエタノール、７０ｍＭ
のＫＣｌ、５００μＭのｄＸＴＰ及び１５０単位の逆転
写酵素を含む５０ｍＭトリス緩衝液（４２℃でｐＨ８．
３）を用いて最終液量を５０μｌとした。得られた溶液
を４２０℃で１５分間インキュベートし、第２のｃＤＮ
Ａの合成を確実とした。反応を２μｌの０．５ＭＥＤＴ
Ａの添加により終了させ、単鎖のｃＤＮＡについて記載
したと同じ方法により濃縮し、沈澱させた。
【００９３】この二重鎖ｃＤＮＡペレットを４２μｌの
水に再懸濁させ、次いで、２．８ＭＮａＣｌ、２００ｍ
ＮａＯＡｃ及び４５ｍＭのＺｎＳＯ4 を含む貯蔵溶液を
５μｌ加えて最終容量を４７μｌとした。ヘアピンルー
プを消化させるために、三種類の濃度のＳ1 ヌクレアー
ゼ（シグマ製）を用い３つの反応を別々に行なった。１
単位、１０単位、１００単位のＳ1 ヌクレアーゼを加
え、液量を５０μｌとし、次いで、２２℃で３０分イン
キュベートした。反応を２μｌの０．５ＭＥＤＴＡ及び
２．６７μｌの２Ｍトリス塩基を加えて終結させた。６
μｇのウサギの肝臓ｔＲＮＡをキャリヤーとして加え
て、反応混液を、ＤＮＡペレットを水の代りにＴＥ緩衝
液に再懸濁させたことを除き上記の如く、濃縮、沈澱さ
せた。最後の沈澱後、当該ペレットを２０μｌのＴＥ緩
衝液に再懸濁させ、１０ｐモルのα− 32Ｐ−ｄＣＴＰ、
２μｌのｄＣＴＰ及び２１単位のターミナル トランス
フェラーゼ［ラットリッフ バイオケム（Ｒａｔｌｉｆ
ｆ Ｂｉｏｃｈｅｍ）製］を含むターミナル トランス
フェラーゼ緩衝液（ＢＲＬ）中で、最終容量を５０μｌ
とした。得られた溶液を、ポリｄ（ｃ）テールを当該二
重鎖ｃＤＮＡに加えるために３７℃で３０分間インキュ
ベートした。反応を、５μｌの０．５ＭのＥＤＴＡを加
え終了させ、抽出しクロマトグラフにかけ、エタノール
沈澱物として貯蔵した。
【００９４】当該二重鎖、ｄ（ｃ）末端と結合した（ｔ
ａｉｌｅｄ）ｃＤＮＡを、直接ポリｄ（Ｇ）末端と結合
したｐＢＲ３２２で、ＰｓｔＩ部位の開いているものと
再アニール化するか又はセファローズＣＬ４Ｂ−２００
カラム（２５μｍｌフラクション）でまずサイズフラク
ションを行なった。末フラクション化ライブラリーにつ
いては、１５０ｎｇの二重鎖のポリｄ（ｃ）末端結合ｃ
ＤＮＡを、ＮａＣｌでは０．１Ｍ、ＥＤＴＡでは１ｍＭ
である、１０ｍＭトリス（ｐＨ７．４）１８０μｌ中で
９００ｎｇのｄ（Ｇ）末端結合ｐＢＲ３２２でＰｓｔＩ
部位が開いているものとアニール化した。各２５μｌの
フラクション化したライブラリーのフラクションを上記
と同一のアニール化混合液中で最終液量５０μｌとし
て、１２５ｎｇのポリｄ（Ｇ）末端結合ｐＢＲ３２２に
アニール化した。当該アニール反応は６５℃で３分間イ
ンキュベートし、次いで４２℃で２時間、そしてゆっく
りと室温にまで冷却して行なった。
【００９５】当該アニール化ｃＤＮＡライブラリーで、
調製したコンピテント大腸菌ＬＥ３９２（ＡＴＣＣ３３
５７２）を次に述べた如く形質転換した。ＬＥ３９２を
２×ＬＢ培地に接種し、３７℃で一晩生育させた。この
一晩培養物５ｍｌを２００ｍｌの新しい２×ＬＢ培地に
接種し、３７℃でＯＤ600 で０．２〜０．３となるまで
生育させた。この培養物を氷の上に１０分間置いて、次
いで細胞を４℃で遠心分離により回収した。当該細胞ペ
レットは、８０ｍｌの氷で冷やした。０．１ＭのＣａＣ
ｌ2 に再懸濁させ、２５分間４℃でインキュベートし
た。細胞を４℃で遠心分離により収集し、細胞ペレット
を２ｍｌの氷で冷やした０．１ＣａＣｌ2に再懸濁させ
使用前に４℃で少くなくとも２時間インキュベートし
た。次いで、２００μｌのコンピテント細胞をアニーリ
ングミックス５０μｌ当り、形質転換用として用いた。
コンピテント細胞とＤＮＡをあわせ、約４℃で１０分間
インキュベートし、次いで、３７℃で５分間インキュベ
ートし、最後に１０分間氷の上に放置した。当量の２×
ＬＢ培地を形質転換ミックスに加え、３７℃で４５分間
インキュベートした。この形質転換した細胞は、１５μ
ｇ／ｍｌのテトラサイクリンを含有する２×ＬＢ平板培
地（１５０ｍｍ）上２５０μｌ／プレートで平板培養し
た。平板培地を３７℃で２４時間インキュベートし、４
℃に貯えた。
【００９６】レプリカフィルターを平板上のコロニーを
切り取るのに使用した原フィルターの上にニトロセルロ
ーズのフィルターを押しつけることにより調製した。こ
れらのレプリカフィルターは２×ＬＢ−Ｔｅｔ（１５μ
ｇ／ｍｌのテトラサイクリン）平板培地上でインキュベ
ートした。フィルター上のコロニーを、フィルターをク
ロラムフェニコール２００μｇ／ｍｌ含有する２×ＬＢ
−Ｔｅｔ平板培地に移し替え、フィルターを３７℃で少
くなくとも１２時間インキュベートし、次いでコロニー
を、フィルターを１．５ＭＮａＣｌ及び０．５ＭＮａＯ
Ｈよりなる水溶液プールに１０分間浮遊させることによ
って溶解させることにより、プローブの用意をした。フ
ィルターは次いで１．５ＭＮａＣｌと０．５Ｍトリス
（ｐＨ７．４）よりなる水溶液プールに１５分間浮遊さ
せて中和し、この中和をもう一度くりかえした。フィル
ターを次いで風乾し、最後に７０℃で２時間真空乾燥し
た。
【００９７】
【実施例ＩＶ】コロニー ハイブリダイゼーション 当該ｃＤＮＡライブラリーを含有する真空乾燥したニト
ロセルローズフィルター（先の実施例において記載の如
く調製）をプレハイブリダイゼーション緩衝液中で４２
℃、５時間プレハイブリッド化した。フィルターを当該
プレハイブリダイゼーション緩衝液から除き、細胞渣を
のぞくため５×ＳＳＰＥ中で手袋をはめた手で軽くこす
った。フィルターをハイブリダイゼーション緩衝液（１
×のデンハルト氏液をのぞきプレハイブリダイゼーショ
ン緩衝液と同一）に放置した。32Ｐ−標識単鎖ｃＤＮＡ
（１０6 ｃｐｍ／ｍｌ）又は末端標識ポリＡ+ ＲＮＡで
のフィルターのハイブリダイゼーションを、４２℃、１
７時間行なった。ハイブリダイゼーション後、フィルタ
ーを２×ＳＳＰＥ中で２２℃で簡単に洗い、次いで二度
６５℃で０．１×ＳＳＰＥで各１０分間洗った。ポリＡ
+ ｍＲＮＡの末端標識化は、２μｇのポリＡ+ ｍＲＮＡ
を５０μｌの５０Ｍトリス（ｐＨ９．５）含有液に加
え、１００℃に３分間加熱し、迅速に氷上で冷却するこ
とにより行なった。このＲＮＡ溶液を、最終容量２００
μｌまでに希釈し、５０ｍＭトリス（ｐＨ９．５）、１
０ｍＭＭｇＣｌ2 、５ｍＭＤＤＴ及び５ｐモルの32Ｐ−
ＡＴＰに調整した。１０単位のＴ4 ポリヌクレオチドキ
ナーゼ（ベリンガーマンハイム製）を加え、混合液を３
７℃で１時間インキュベートした。キナーゼ化反応は、
１０μｌの０．５ＭＥＤＴＡを添加して終了させ、フェ
ノール／クロロホルム／イソアミルアルコールで抽出
し、セファデックスＧ５０を通じクロマトグラフを行な
い、未挿入放射能標識を除去した。
【００９８】
【実施例Ｖ】ノーザンハイブリダイゼーション ２ないし５μｇのポリＡ+ ｍＲＮＡを、５０％ホルムア
ミド、２．２Ｍホルムアルデヒド及び０．５ｍＭＥＤＴ
Ａを含有する１０ｍＭ燐酸ソーダ緩衝液（ｐＨ７．４）
中で５分間６５℃に加熱した。得られた溶液を室温まで
冷却し、適当量（一般的には、処理したサンプルの量の
約０．２容）の５×サンプル緩衝液（０．５％ＳＤＳ、
０．０２５％ブロモフェノール ブルー、２５％グリセ
ロール、２５ｍＭＥＤＴＡ）を加えた。このサンプル
を、１．１Ｍホルムアルデヒドを含む１０ｍＭ燐酸ソー
ダ緩衝液（ｐＨ７．４）中で調製した１．５％アガロー
スゲルに添加し同一の緩衝液中で電気泳動した。ゲルを
１０ｍＭの燐酸ソーダ緩衝液（ｐＨ７．４）に入れたア
クリジンオレンジ（３３μｇ／ｍｌ）で染色し、当該ゲ
ルを同一の緩衝液に１０分間浸漬することにより脱色
し、１０×ＳＳＰＥ中ですくなくとも１０分間浸漬し、
ＲＮＡを実施例VIで記述するようにニトロセルローズへ
と移し替えた。
【００９９】
【実施例ＶＩ】ゲノムＤＮＡとクローンの単離 ピキア ゲノムＤＮＡをピキアＲＮＡ単離の為実施例IIで
記載した方法を用いて単離した。核酸ペレットを最少容
のＴＥ緩衝液に再懸濁させて、２０μｇ／ｍｌＲＮアー
ゼＡを用いて３０分間３７℃でインキュベートした。溶
液を０．１４ＭＮａＣｌまでにし、１５分間２２℃で２
００μｇ／ｍｌのプロテナーゼＫで処理した。得られた
溶液を最初フェノール／クロロホルム／イソアミルアル
コールで、次いでクロロホルム／イソアルミアルコール
で抽出、最後にエタノールで沈澱させた。沈澱したＤＮ
Ａは、最少容のＴＥ緩衝液に再懸濁させ、ＤＮＡ溶液を
澄明にするため遠心分離した。
【０１００】先きの文節に記載したように調製したピキ
アゲノムＤＮＡを１０μｇ、種々の制限酵素（ＢＲＬ）
で消化し、ＴＡＥ含有の１％アガローズゲル上で電気泳
動した。ゲル中のＤＮＡ断片を、１．５ＭＮａＣｌ、
０．５ＭＮａＯＨに２０分浸漬し、変性した。当該ゲル
を１．５ＭＮａＣｌ、０．５Ｍトリス（ｐＨ７．４）中
に２０分間浸漬させ中和した。移し替えに先き立ち、当
該ゲルを１０×ＳＳＰＥ中にすくなくとも５分間浸け
た。ニトロセルローズ紙をゲルの大きさに切り、水で湿
らし、簡単に１０×ＳＳＰＥに浸漬した。このフィルタ
ーをパラフィルム片の上に順においてあるゲルの上にの
せた。ワットマン濾紙１枚と紙タオル一かさねを、ＤＮ
Ａをゲルから引き出し、ニトロセルローズに移しかえる
ためにニトロセルローズの上においた。移動をおこすた
め、当該紙タイルの上に重しをのせた。３時間、このよ
うにして、ＤＮＡを移しかえさせた。この移し替えのの
ち、フィルターを５×ＳＳＰＥに簡単につけ、風乾し、
２時間７０℃で真空乾燥した。相補的ゲノム断片を、実
施例IV記載と同じプレハイブリダイゼーション、ハイブ
リダイゼーション及び洗浄緩衝液を用いて、ニック−ト
ランスレーションされたｃＤＮＡクローンｐＰＣ８．
０、ｐＰＣ６．４及び１ｐＰＣ１５．０へのハイブリダ
イゼーションにより同定した。
【０１０１】２００ｎｇの当該ｃＤＮＡを、５０ｍＭト
リス−塩酸（ｐＨ７．４）、１０ｍＭＭｇＳＯ4 、１０
０μＭ（マイクロモル）、５０μｇ／ｍｌＢＳＡ、各２
０μＭのｄＧＴＰ、ＴＴＰ及びｄＡＴＰ、３１．２５Ｐ
モル（ピコモル）32Ｐ−α−ｄＣＴＰ（３２００Ｃｉ／
ｍＭ、ＭＥＮ）、２単位の大腸菌ＤＮＡＰｏｌＩ（ＢＲ
Ｌ）、及び０．０２ｎｇ（ナノグラム）のＤＮアーゼＩ
（ＤＮａｓｅＩ）を含む溶液３０μｌ中で、１４℃、９
０分間、ニックトランスレーションを行なった。反応
は、０．５ＭＥＤＴＡ／μｌ、及び２０％ＳＤＳ／μｌ
の添加により終了させた。この標識化された溶液を、最
終濃度で０．３ＮａＯＨとし、３分間沸騰水中に置い
た。この混合液を、セファデックスＧ５０カラムでクロ
マトグラムにかけた。標識されたＤＮＡ断片をプール化
し、比活性を測定し、ハイブリダイゼーション実験でプ
ローブとして使用した。
【０１０２】当該ｃＤＮＡプローブにハイブリダイゼー
ションされたゲノム断片を、２００μｇのピキアゲノム
ＤＮＡを種々の制限酵素（ＢＲＬ）で消化し、消化物を
ＴＡＥ緩衝液中の１％アガロースゲルで電気泳動するこ
とにより単離した。適当な大きさのバンドを、当該アガ
ロースゲルより切り取り、ＤＮＡを電気溶出し、エルチ
ップ（Ｅｌｕｔｉｐ）カラム（シュライヒヤー及びシュ
エル製）を通し、エタノールで沈澱させた。
【０１０３】電気泳動断片を水に再懸濁させ、２００ｎ
ｇ（ナノグラム）断片を、適当な制限酵素切断部位を開
環してあり、必要に応じ、脱燐酸してあるｐＢＲ３２
２，５００ｎｇにリゲートした。このリゲーション反応
は、６．６ｍＭＭｇＣｌ2 、１０ｍＭＤＴＴ、０．４ｍ
ＭＡＴＰ、２５μｇ／ｍｌＢＳＡ、及び４０−８０単位
のＴ4 ＤＮＡリガーゼを含有する６６ｍＭのトリス（ｐ
Ｈ７．４）３００μｌ中で実施した。このリゲーション
混液を直接コンピテント大腸菌細胞へと形質転換した。
細胞のコンピテント化及び形質転換については、実施例
III 記載の如く実施した。１０，４０，および１００ｎ
ｇのｐＢＲ３２２（＋挿入）を用い、各１００μｌのコ
ンピテント細胞含有液中で、３個の形質転換をシリーズ
で行なった。抗生物質淘汰を、アンピシリン５０μｇ／
ｍｌを用いたのをのぞき実施例IIIと同様に、当該細胞
を平板培養により行なった。当該クローンを実施例III
記載の通り、ニトロセルロースに移し替え、複製させ、
ハイブリダイゼーションの用意をした。当該フィルター
は、適切なニックトランスレーションされたｃＤＮＡ断
片でプローブした。ハイブリダイゼーションで陽性であ
った、線条接種により純化したクローンを、以下に記載
の如く、追加プラスミドを調製するのに用いた。
【０１０４】プラスミドを有するＬＥ３９２大腸菌株を
アンピシリン５０μｇ／ｍｌ含有の１×ＬＢ培地中で、
ＯＤ600 が１．０となるまで生育させ、クロラムフェニ
コール２００μｇ／ｍｌを最終的に含むまで添加して、
一晩増幅させた。細胞を、０．８％ＮａＣｌ、２０ｍＭ
トリス（ｐＨ８．０）、２０ｍＭＥＤＴＡ中で洗浄し、
次いで、２５％蔗糖、５０ｍＭトリス（ｐＨ７．４）及
び２０ｍＭＥＤＴＡ中で、４５０μｇ／ｍｌのリゾゾー
ム（ｌｙｓｏｚｏｍｅ）で処理した。溶菌は、５ＭのＮ
ａＣｌを加えて最終濃度が２．０Ｍとなる様加え、次い
で、同量の０．２％トリトン×−１００と４０ｍＭＥＤ
ＴＡを加えた。当該調製液を２００００ＲＰＭで、４５
分間遠心分離して澄明とした。上澄液をフェノール／ク
ロロホルム／イソアミルアルコールで、次いでクロロホ
ルム／イソアミルアルコールで抽出し、エタノールで沈
澱させた。ペレットを、ＴＥ緩衝液中に再分散させ、Ｒ
Ｎアーゼ（ＲＮａｓｅ）Ａで処理、再びフェノール／ク
ロロホルム／イソアミルアルコール、次いで、クロロホ
ルム／イソアミルアルコールで抽出した。固体ＣｓＣｌ
を加えて最終濃度８００μｇ／ｍｌとし、またＥｔＢｒ
は、最終濃度１ｍｇ／ｍｌとなるように加えた。得られ
た溶液を、ヴチ（Ｖｔｉ）５０ローター中で１８−２０
時間、２０℃で、４５０００ＲＰＭで遠心分離した。
【０１０５】当該プラスミドをＵＶ蛍光により可視化
し、針と注射器を用いて遠心管より抜き取った。当該プ
ラスミドを、４回ブタノールで抽出し、−２０℃でエタ
ノールで沈澱させた。エタノール沈澱を２回繰り返し、
すべてのＣｓＣｌをのぞいた。当該プラスミドは、エタ
ノール沈澱物のまま−２０℃で貯蔵した。
【０１０６】
【実施例ＶＩＩ】アルコールオキシダーゼの精製 実施例Ｉ記載の如くメタノールで生育させたピキア パ
ストリス細胞からの蛋白を、以下の通り、酵母細胞を溶
解させ、次いで、細胞砕渣をのぞくため遠心分離により
澄明化することにより調製した。すなわち、醗酵廃液の
一部を取り去り、ｐＨ７．５に水酸化アンモニアで調整
し、０．６リットルの容器を用い、ダイノ−ミル（Ｄｙ
ｎｏ−Ｍｉｌｌ）型式ＫＤＬで、３０℃で、ベルト組合
せＮｏ３を用い、２０−３０ｍｌ／時間の流速で連続運
転して、ホモジネート化した。ミル中のビーズは、無鉛
ガラスビーズで、直径０．３−０．５ｍｍのものであっ
た。得られたホモジネートを５℃、２００００Ｇで３０
分間遠心分離し、無細胞上澄液を得た。６個の１３０ｍ
ｌ無細胞上澄液を、酢酸セルロース透析袋に入れ、約８
リットルの蒸留水に対して、５℃で透析した。４日後、
各袋の水溶液の部分をデカンテーションにより除いた。
袋に残っている固体は、二つの型の固体より構成されて
いた。白色の上部の薄い層を注意深くとりのぞき、捨て
た。底部の固体は、ブラウンないし黄色で、結晶性のア
ルコールオキシダーゼであった。このアルコールオキシ
ダーゼの一部を、蒸留水（約固体の１０倍容）に溶解さ
せ、染料−パーオキシダーゼ方法による測定により、活
性は９４ＥＵ／ｍｌであることを示した。当該アルコー
ルオキシダーゼの比活性は、蛋白で１０．４ＥＵ／ｍｇ
であった。上記の透析からの結晶性沈澱物を、０．０５
Ｍの燐酸緩衝液（ｐＨ７．５）に対して透析し、上記緩
衝液で平衡したスパクリル２００（ファルマシア製）カ
ラム、２×２００ｃｍに適用した。３．５ｍｌつづの各
フラクションを、流速１０ｍｌ／時間で収集し、アルコ
ールオキシダーゼ活性について測定した。
【０１０７】メタノールを用いた反応に対する当該アル
コールオキシダーゼは、次の測定方法（染料−パーオキ
シダーゼ法）により測定した。染料−緩衝液混合物を、
０．１ｍｌのｏ−ジアニシジン溶液（１重量％ｏ−ジア
ニシジン水溶液）に、１２ｍｌの通気した０．１Ｍの燐
酸緩衝液（ｐＨ７．５）で混合することにより調製し
た。測定用混液は、２．５ｍｌの染料−緩衝液混合物、
５０μｌのメタノール、１０μｌのパーオキシダーゼ溶
液（１ｍｇのわさびパーオキシダーゼ−シグマ製、タイ
プII）、及び２５μｌのアルコールオキシダーゼ溶液で
調製した。当該測定混液を、４×１×１ｃｍのキュベッ
ト中で２５℃に保持し、染料による吸光度の４５０ｎｍ
における増加を２ないし４分間測定した。酵素活性は、
次式により算出した。 ここで、１１．５は、既知量のＨ2 Ｏ2 を用いて作成し
た標準曲線にもとづく係数で、ΔＡは、実験期間内にお
ける吸光度の変化である。全量で０．１μｇの各フラク
ションからの全蛋白を、ＳＤＳ−ポリアクリルアミド
（１２％）を用いたゲル電気泳動によりアルコールオキ
シダーゼ活性について同様に測定した。
【０１０８】
【実施例ＶＩＩＩ】ＤＮＡ及び蛋白の配列 ＤＮＡ配列の決定は、バクテリオファージＭ１３を用い
たジオキシ鎖の延長方法（シンガー等、１９８０年）又
は化学的修飾法（マキサム及びギルバート、１９８０
年）により実施した。当該アルコールオキシダーゼ遺伝
子の５´末端に対応するＤＮＡ断片を、Ｍ１３ｍｐ８及
びＭ１３ｍｐ９ベクターへと挿入するか、この領域内に
ある制限酵素切断部位を使用する化学的修飾法による末
端標識を行なった。７１ＯｂｐのＨｉｎｄIII ／Ｓａｌ
ＩのｐＰＧ４．０からの断片を、まず３３μｇの当該プ
ラスミドをＨｉｎｄIII で消化することにより、マキサ
ム−ギルバート法による配列決定のための末端標識を行
なった。反応混合液を、フェノール／クロロホルム／イ
ソアミルアルコールで、次いでクロロホルム／イソアミ
ルアルコールで抽出し、エタノールで沈澱させた。当該
ＤＮＡを遠心分離により収集し、３１μｌの水に再懸濁
させた。１００μＣｉの32ｐ−α−ｄＣＴＰ（３２００
Ｃｉ／ｍＭ）及び２単位のレナウ断片ＤＮＡｐｏｌＩを
反応溶液に加えて、４００μＭのｄＡＴＰ、４００μＭ
のｄＧＴＰ、５０ｍＭのトリス（ｐＨ７．４）、１０ｍ
ＭＭｇＳＯ4 、及び１ｍＭのＤＴＴを含有する、最終容
量５０μｌの溶液を得た。この反応混液を、３７℃で１
時間インキュベートし、２μｌの０．５ＭＥＤＴＡを加
えて反応を停止させた。次いで、混液を、フェノール／
クロロホルム／イソアミルアルコールで抽出し、更にク
ロロホルム／イソアミルアルコールで抽出し、セファデ
ックスＧ−５０カラム上でクロマトグラフにかけ、標識
された核酸断片をプールし、エタノールで沈澱させた。
遠心分離後、ＤＮＡペレットを水に再懸濁させ、Ｓａｌ
Ｉで消化した。この消化物をＴＡＥ緩衝液中の１％アガ
ロースゲルで電気泳動させて、ゲルから７１０ｂｐのバ
ンドを切り取って、ＤＮＡを電気溶出させ、ブタノール
で抽出し、エタノールで沈澱させた。当該断片を１００
μｌのＴＥ緩衝液に再懸濁させて、２．５Ｍの酢酸アン
モニウムに調整し、次いでエタノールで沈澱させた。得
られたＤＮＡ断片を５００００ｃｐｍ／μｌの濃度でＴ
Ｅ緩衝液に再懸濁させた。
【０１０９】４種の塩基修飾反応は次のように行なっ
た。すなわち、（ａ）Ｇ（グアニン）反応は、２２℃で
８分間インキュベートして行なったが、反応溶液は、１
μｌ（５００００ＣＰＭ）の当該標識ＤＮＡ断片、４μ
ｌの水、２００μｌの５０ｍＭのカコジル酸ソーダ、ｐ
Ｈ８．０の、１ｍＭＥＴＤＡ（ＤＭＳ緩衝液）及び１μ
ｌのジメチル硫酸を含有していた。反応は、１．５Ｍの
酢酸ソーダ（ｐＨ７．０）を含有したＤＭＳ停止緩衝液
で、かつ１Ｍの２メルカプトエタノール及び１００μｇ
／ｍｌのｔＲＮＡを含むものを添加して終了させ、次い
でエタノール（７５０μｌ）を加え、反応混液を少くな
くとも１５分間−７０℃に保った。（ｂ）Ｇ／Ａ（グア
ニン／アデニン）反応は、インキュベーション１０分間
で、溶液は、２μｌ（１０００００ｃｐｍ）の標識ＤＮ
Ａ断片、８μｌの水及び３０μｌのギ酸を含有してい
た。反応は、２００μｌのＨｚ停止緩衝液（０．３Ｍの
酢酸ソーダ、ｐＨ５．５、０．１ＭＥＴＤＡ、及び２５
μｇ／ｍｌのｔＲＮＡを含有）の添加により終了させ、
次いでエタノール（７５０μｌ）を加えて、反応混液を
少くなくとも１５分間−７０℃に保った。（ｃ）Ｔ／Ｃ
（チミン／シトシン）反応は、２２℃で、１０分間イン
キュベートしたが、反応液には２μｌ（１０００００ｃ
ｐｍ）の標識ＤＮＡ断片、１８μｌのヒドラジンを含有
していた。反応は、上記（ｂ）で記載した如く終結させ
た。（ｄ）Ｃ（シトシン）反応は、２２℃で１０分間イ
ンキュベートし、反応液には１μｌ（５００００ｃｐ
ｍ）の標識ＤＮＡ断片、４μｌの水、１５μｌの５ＭＮ
ａＣｌ、及び２μｌのヒドラジンを含有していた。反応
は、上記（ｂ）記載の如く終了させた。
【０１１０】当該ＤＮＡペレットを遠心分離により収集
し、２５０μｌの０．３Ｍの酢酸ソーダ（ｐＨ５．
５）、７５０μｌの９５％エタノールを加え沈澱させ
た。ペレットを遠心分離により回収し、５分間真空下で
乾燥させ、ペレットを１００μｌの１対１０希釈ピペリ
ジン溶液に再懸濁させて、当該ＤＮＡを開環した。開環
反応は、９０℃で３０分間インキュベートすることによ
り行ない、反応を５００μｌの９８％エタノール、６０
ｍＭの酢酸ソーダ（ｐＨ５．５）と１０μｇ／ｍｌのｔ
ＲＡＮを添加して終了させた。当該断片は、５０μｌの
０．３Ｍ酢酸ソーダ（ｐＨ５．５）に再懸濁させ、次い
で９５％のエタノールを１００μｌ添加し沈澱させた。
このエタノール沈澱をくり返し、当該ペレットを９５％
エタノールで洗浄し、遠心分離をしながら、真空中で乾
燥した。当該ペレットを、１０μｌの８０％ホルムアミ
ド、１０ｍＭＮａＯＨ、１ｍＭＥＤＴＡ、０．１％キシ
レンシアノール、及び０．１％ブロモブルーよりなる溶
液に再懸濁させた。２ないし３μｌを１０％の０．４ｍ
ｍの厚さの、ＴＢＥ緩衝液中のポリアクリルアミドゲル
上で電気泳動させた。アルコールオキシダーゼのアミノ
酸配列は、２ｍｇの精製ピキア パストリス由来のアル
コールオキシダーゼを使用し、スクエマット（Ｓｅｑｕ
ｍａｔ）社（マサチュウセッツ州ウォタータウン市）に
より決定された。この成熟蛋白の最初の１８のアミノ酸
は次の通りであると決定された。Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ｐｒ
ｏ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ａｓｐ−Ｉｌｅ−Ｌｅｕ
−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−
Ｇｌｙ−Ｓｅｒ
【０１１１】
【実施例ＩＸ】アルコールオキシダーゼ転写開始部位の決定 アルコールオキシダーゼ用ｍＲＮＡの開始点がどこに位
置しているかを決定するために、プライマー拡張実験
を、プライマーとしてアルコールオキシダーゼ遺伝子の
５´末端よりなるＤＮＡ配列からコピーした合成オリゴ
ヌクレオチドと１０μｇのポリＡ + ピキア パストリス
ｍＲＮＡを鋳型として使用して行なった。１０μｇピキ
ア パストリスポリＡ+ ｍＲＮＡを、４３ｍＭＮａＣ
ｌ、２９．２ｍＭトリス（ｐＨ８．３）、５．２ｍＭＭ
ｇＣｌ2 及び４．３ｍＭＤＴＴよりなる溶液で最終液量
９．３μｌとした溶液中で、３ｎｇのプライマー（５´
−ＣＴＴＣＴＣ ＡＡＧ ＴＴＧ ＴＣＧ−３´）と結
合させた。当該核酸を７０℃で５分間変性し、２２℃に
ゆっくりと冷しながら再アニール化させた。再アニール
化混液を各１μｌのｄｄＮＴＰに加えた。最終３μｌと
した混液を１μｌの水に加えた。反応は１μｌの希ＲＴ
を添加することにより開始し、４２℃で１５分間インキ
ュベートした。チェイスＲＴを３μｌ用いて反応を４２
℃で１５分間チェイスした。反応は、７．５μｌのホル
ムアミド−染料ミックスを添加し停止させ、１ＸＢＥ中
の０．４ｍｍの厚さの勾配ゲル上で電気泳動させた。電
気泳動後、当該ゲルを１０％の酢酸溶液中で１０％エタ
ノールを用い２０分間かけ固定した。ゲルを真空下で乾
燥させ、ＸＡＲＸ−ｒａｙフィルムに曝露させるのに使
用した。
【０１１２】勾配ゲルは次の如く調製した。すなわち、
３００μｌの１０％ペルオクソ燐酸アンモニアと１４μ
ｌのＴＥＭＥＤを３０ｍｌのゲル最上部に加え、７５μ
ｌの１０％ペルオクソ燐酸アンモニアと３．５μｌのＴ
ＥＭＥＤを７ｍｌの底部ゲルに加え、６ｍｌの頂上ゲル
をピペットで取り、次いで６ｍｌの底部ゲルを同一のピ
ペットで取った。当該ゲルをゲル板の間に注ぎ、次いで
頂上ゲル２２ｍｌを注いだ。
【０１１３】
【実施例Ｘ】ｍＲＮＡハイブリダイゼーション−淘汰及び試験管内翻
訳 陽性ハイブリダイゼーション−翻訳実験を２０μｇのク
ローン化したピキアゲノムＤＮＡ（実施例VIで記載の如
く調製した）を種々の制限エンドヌクレアーゼを用いて
の消化により線形することにより実施した。このＤＮＡ
を、当該溶液を０．３ＭＮａＯＨとし、そして、６５℃
で１０分間インキュベートすることにより、変性化し
た。変性したＤＮＡ−含有溶液は急速に氷上で冷却し、
０．５Ｍトリス−塩酸（ｐＨ７．４）に調節することに
より中和した。当量の２０×ＳＳＰＥを、当該変性ＤＮ
Ａをニトロセルローズフィルターに結合させる直前に、
加えた。当該ＤＮＡをニトロセルローズフィルター（シ
ュライヒヤー及びシュエル製ＢＡ８３、直径９ｍｍ）に
適用する前に、当該フィルターをＨ2 Ｏで湿らし、１０
分間煮沸し、３回１０×ＳＳＰＥ中ですすいだ。１０μ
ｇのＤＮＡを各フィルターに適用させ、当該フィルター
に結合させ、風乾し、最後にフィルターを７０℃で２時
間真空下で乾燥した。
【０１１４】プレハイブリダイゼーションの前に、結合
しているＤＮＡと共にフィルターを１ｍｌの滅菌水中に
入れ、１分間１００℃で加熱し、氷上で冷却し、１ｍｌ
の滅菌水中ではげしくかきまぜながらすすぎ、更に１ｍ
ｌのプレハイブリダイゼーション緩衝液中ですすいだ。
当該フィルターを１ｍｌ中のプレハイブリダイゼーショ
ン緩衝液中でプレハイブリダイゼーション化し、次いで
４０μｇ（２μｇ／ｍｌＥＴＳ）のポリＡ+ ｍＲＮＡを
直接当該プレハイブリダイゼーション緩衝液に加えた。
このハイブリダイゼーション混合液を６５℃で１０分間
加熱し、次いで４２℃で２４時間インキュベートした。
ハイブリダイゼーションに続いて、フィルターを２回
０．５％ＳＰＳを含む１×ＳＳＰＥ中で２２℃で簡単に
洗浄し、次いで０．５％のＳＤＳを含む１×ＳＳＰＥ中
で各５分間、５０℃で７回洗浄し、３回、５０℃で各５
分間０．１×ＳＳＰＥ中で洗浄し、次いで一度１０分間
６５℃で０．１×ＳＳＰＥ中で洗浄した。当該ＲＮＡ
を、１分間、３００μｌの１５μｇのウサギ肝臓ｔＲＮ
Ａを含むＨ2Ｏ中で１分間煮沸して、フィルターから溶
出させた。溶出したＲＮＡを迅速にドライアイスエタノ
ールバス上で凍結した。当該ＲＮＡ混合液を室温まで暖
め、フィルターを除去した。当該ＲＮＡ混合液を２．５
Ｍの酢酸アンモニアに調整して、沈澱させ、メタノール
から２回沈澱させ、最後に凍結乾燥前に１００μｌのＨ
2 Ｏ中に再懸濁させた。
【０１１５】翻訳は、その技術分野で通常の知識を有す
るもの、すなわち当業者により知られた標準方法、例え
ば、ニュー・イングランドヌクレア イン ビトロ ウ
サギ網状赤血球溶解物転写装置により提供されている指
示などにもとづいて実施した。蛋白産物は、４．５％の
スタッキング ゲルを含有する８％のポリアクリルアミ
ドで電気泳動した。
【０１１６】
【実施例ＸＩ】抗血清調製物及び免疫沈澱 ウサギ内でｐ７２（アルコールオキシダーゼ）及びｐ７
６ポリペプチドの両者を含むピキア パストリス細胞か
らの抽出物に対して高められた抗血清は、標準プロトコ
ールを用いて調製した。抽出物を注入前にＰＢＳに対し
て透析した。８週間をかけて、各ウサギに、０．２ｍｌ
のフルンズ（Ｆｒｅｕｎｄｓ）完全補薬で０．１ｍｌと
し、全蛋白１ｍｇを含む注射液を３回注射した。注射は
各ウサギの６〜１０部位に経皮的に行なった。８週後
に、ウサギより採血し、オウチャーロンリー（Ｏｕｃｈ
ｔｅｒｌｏｎｙ）二重拡散方法により精製したピキア
パストリスアルコールオキシダーゼに対して、これらの
血精を検査した。
【０１１７】精製したウサギの抗−ｐ７２（アルコール
オキシダーゼ）及び抗−ｐ７６蛋白抗体は、全血清をＣ
ＮＢｒでカップリングしたｐ７２（アルコールオキシダ
ーゼ）−ｐ７６セファローズ４Ｂカラム（ファルマシア
製）を通す親和性クロマトグラムにより調製した。１ｇ
のＣＮＢｒ活性化ゲルを、当該ゲルを２００リットルの
１ｍＭＨＣｌ中で１５分間水和させ、次いで、カップリ
ング緩衝液［０．１Ｍ炭酸ソーダ（ｐＨ８）及び０．５
ＭＮａＣｌ］５０ｍｌで３回洗浄することにより調製し
た。５ｍｌの、６ｍｇ／ｍｌのｐ７２−ｐ７６含有カッ
プリング緩衝液を当該ゲルに加え、おだやかに４℃で一
晩撹拌した。未結合の蛋白は、カップリング緩衝液５０
ｍｌを用い各３回洗浄し、除去した。残存する活性グル
ープは、１Ｍのエタノールアミン（ｐＨ８）中で２時間
インキュベートして取り除いた。非共有結合材料は、ｐ
ＢＳ中の２Ｍチオシアン酸ソーダ、５０ｍｌでゲルから
除去した。当該抗血清のクロマトグラフィーに先立っ
て、当該ゲルを最終的にＰＢＳ５０ｍｌで３回洗浄し
た。５ｍｌの確認済抗ｐ７２−ｐ７６抗血清を当該ゲル
と混合し、４℃で２時間おだやかに撹拌しながらインキ
ュベートした。当該抗血清−ゲル混合物を１×８ｃｍの
カラム中へピペットで加え、１５０ｍｌのＰＢＳで洗浄
した。精製した抗体は、ＰＢＳ中の２Ｍのチオシアン酸
ソーダ６ｍｌでカラムより溶出させた。ゲルからの溶出
後、精製抗体を０．０２％アジ化ソーダを含有するＰＢ
Ｓに対して広範囲に透析した。当該親和力による精製抗
血清をＰＢＳ中、１％ＮＰ４０中のイン ビトロ翻訳ミ
ックスに加え、インキュベートを４℃で一晩行なった。
抗体−抗原コンプレックスを、氷上で２．５時間、パン
ソルビン（カルバイオケミ製）を用いて沈澱させた。パ
ンソルビンは、ＲＩＰＡ緩衝液中で洗浄して調製した。
パンソルビン沈澱物は、ＲＩＰＡ緩衝液中で４回洗浄
し、レムリー（Ｌａｅｍｍｌｉ）添加緩衝液に電気泳動
前に溶解させた。
【０１１８】
【実施例ＸＩＩ】ピキア パストリスの形質転換手順 Ａ．細胞の成長 １．ＹＰＤ培地約１０ｍｌ中へピキア パストリスＧＳ
１１５（ＮＲＲＬ Ｙ−１５８５１）のコロニーを植え
つけ、３０℃で１２−２０時間振とう培養する。 ２．約１２−２０時間後、ＯＤ600 で約０．０１から
０．１となるように細胞を希釈し、ＹＰＤ培地中で３０
℃で約６〜８時間細胞を対数増殖期に保持する。 ３．約６〜８時間後、ＯＤ600 で約０．１（又はその相
当量）の種培養０．５ｍｌを、ＹＰＤ培地１００ｍｌに
植付ける。３０℃で約１２−２０時間振とう培養する。 ４．ＯＤ600 が約０．２−０．３となったとき（約１６
−２０時間後）培養物を１５００Ｇで５分間遠心分離
し、回収する。
【０１１９】Ｂ．スフェロプラストの調製 １．細胞を１度１０ｍｌの滅菌水中で洗う。（ステップ
１ないし５の遠心分離はすべて１５００Ｇ、５分間であ
る）。 ２．新たに調製したＳＥＤ１０ｍｌ中で細胞を洗う。 ３．滅菌１モルソルビトール溶液１０ｍｌ中で細胞を２
度洗う。 ４．１０ｍｌのＳＣＥ緩衝液に細胞を再分散する。 ５．チモリアーゼ６０，０００（マイルズ ラボラトリ
ーズ社製）ｍｌ当り４ｍｇ含む溶液を５−１０μｌ加え
る。約３０−６０分、３０℃で細胞をインキュベートす
る。スフェロプラストの調製は形質転換手順において
は、危険をはらんだ工程であるため、スフェロプラスト
の形成を次の如くモニターする必要がある。細胞（を含
む液）１００μｌを９００μｌの５％ＳＤＳ及び９００
μｌの１モルのソルビトールに、チモリアーゼの添加前
又は添加直後及びインキュベート期間中種々な間隔で加
える。ＳＤＳ中では細胞が溶解するが、ソルビトール中
では溶解しない点（通常３０から６０分のインキュベー
ション）インキュベーションを停める。 ６．スフェロプラストを滅菌した１モルのソルビトール
１０ｍｌ中で、１，０００Ｇで５−１０分遠心分離しな
がら二度洗浄する（遠心分離のための時間及び速度は変
動する。スフェロプラストがペレット化するに充分なだ
け遠心分離する。しかし、その力で破壊されるほどであ
ってはならない）。 ７．滅菌したＣａＳ１０ｍｌ中で１度洗う。 ８．全量で０．６ｍｌのＣａＳに細胞を再分散させる。
【０１２０】Ｃ．形質転換 １．ＤＮＡのサンプル（２０μｌの容量まで）を１２×
７５ｍｍの滅菌したポリプロピレン管に加える（ＤＮＡ
は水又はＴＥ緩衝液中に分散されていること；少量のＤ
ＮＡで最大限の形質転換頻度を上げるためには各サンプ
ルに、超音波処理した大腸菌を５ｍｇ／ｍｌ含む溶液１
μｌを加えるのが好ましい）。 ２．１００μｌのスフェロプラストを各ＤＮＡサンプル
に加えて、室温で約２０分間インキュベートする。 ３．１ｍｌのＰＥＧ溶液を各サンプルに１ｍｌ加え、室
温で約２０分間インキュベートする。 ４．サンプルを１５００Ｇで５〜１０分間遠心分離し、
ＰＥＧ溶液をデカンテーションにより除く。 ５．サンプルを、ＳＯＳ１５０μｌ中に再分散し、室温
で３０分間インキュベートする。 ６．滅菌した１モルのソルビトール溶液８５０μｌを加
え、以下に記載した様に少量のサンプルをとり平板培養
する。
【０１２１】Ｄ．スフェロプラストの再生 １．再生用寒天培地の組成 ａ．寒天−ソルビトール培地；９ｇのバクト寒天、５
４．６ｇのソルビトール、２４０ｍｌの水、高温滅菌す
る。 ｂ．グルコース１０倍培地；２０ｇのデキストローズ、
１００ｍｌの水、高温滅菌する。 ｃ．ＳＣ１０倍培地；６．７５ｇのアミノ酸を含まない
酵母窒素基材、１００ｍｌの水、高温滅菌する（所望の
アミノ酸又は各酸を２００μｇ／ｍｌの濃度まで高温滅
菌前又はその後に加える） ｄ．３０ｍｌのグルコース１０倍培地及び３０ｍｌのＳ
Ｃ１０倍培地を３００ｍｌの溶解した寒天−ソルビトー
ル溶液に加える。０．２ｍｇ／ｍｌのビオチン液０．６
ｍｌ、及び所望のアミノ酸又は核酸を２０μｇ／ｍｌの
濃度まで加える。溶解した再生用寒天培地を５５−６０
℃に保つ。 ２．形質転換したサンプルの平板培養 形質転換サンプルが用意できる少なくとも３０分前に、
プレートあたり１０ｍｌの再生用寒天培地よりなる基低
部寒天層を注ぐ。試験管に再生用寒天培地１０ｍｌを、
形質転換サンプルがＳＯＳ中に入れてある間に、４５−
５０℃のバス上で、分散させる。再生用寒天培地の入っ
た試験管に適当量の形質転換サンプルを加え、プレート
内の基底部寒天層上に注ぐ。４５−５０℃に保った溶融
状態の再生用寒天培地１０ｍｌにそれぞれのサンプルを
適当量加え、再生用寒天培地よりなる固まった１０ｍｌ
の基底部寒天層上にそれぞれを注ぐ。 ３．スフェロプラスト調製品の品質の決定 １サンプル当り１０μｌをとり、１Ｍのソルビトール９
９０μｌを加えて１００倍に希釈する。１００倍希釈液
を１０μｌとり、９９０μｌの量の１Ｍのソルビトール
を再び加えて更に１００倍希釈する。ＹＰＤ培地上に上
記二つの希釈液１００μｌを、調製品中にスフェロプラ
スト化されずに残存している完全細胞の濃度を測定する
ため、ＹＰＤ寒天培地上に塗布する。４０μｇ／ｍｌヒ
スチジンを加えた再生寒天１０ｍｌに、全再生可能なス
フェロプラストを測定するため各希釈液を１００μｌ加
える。形質転換実験のための良好な値としては、ｍｌ当
り１−３×１０7 の全再生可能なスフェロプラストとｍ
ｌ当り約１×１０3 の完全細胞である。 ４．平板培地を３０℃で３−５日間培養する。
【０１２２】
【実施例ＸＩＩＩ】ピキア パストリスＨＩＳ４遺伝子の分離 Ａ．菌株 使用した菌株は次の通りである。 （ａ）ピキア パストリス ＮＲＲＬ Ｙ−１１４３０
株 （ｂ）ピキア パストリス ＮＲＲＬ Ｙ−１５８５１
（ＧＳ１１５−ｈｉｓ４ ） （ｃ）エス・セレビシエ５７９９−４Ｄ株 （ｈｉｓ４−２６０ ｈｉｓ４−３９；ＮＲＲＬ Ｙ−
１５８５９）、及び （ｄ）大腸菌８４８株（Ｆ- ｍｅｔ ｔｈｉ ｇａｌ
Ｔ1 R φ８０S ｈｓｄＲ- ｈｓｄ Ｍ+ ） Ｂ．プラスミド ｐＹＡ２は、ｐＢＲ３２５のＰｓｔＩ部位に挿入された
９．３Ｋｂ ＰｓｔＩ断片上のエス・セレビシエのＨＩ
Ｓ４遺伝子より構成されて居り、それはエス・セレビシ
エＨＩＳ４遺伝子断片の給源であり、大腸菌宿主に移入
してありＮＲＲＬ Ｂ−１５８７４として公衆が入手可
能である。ＹＥｐ１３はアメリカンタイプカルチャーコ
レクションから入手可能であり、寄託番号はＡＴＣＣ３
７１１５が割り当てられている。 Ｃ．培地 ピキア パストリスはＹＰＤ（富化）培地又はＩＭＧ
（最少）培地で成育させた。ＩＭＧ、最少培地は、次の
ものより構成されている。 １．ＩＭ1 塩類、最終濃度で３６．７ミリモルのＫＨ2
ＰＯ4 、２２．７ミリモルの（ＮＨ4 ）2 ＳＯ4 、２．
０ミリモルのＭｇＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ、６．７ミリモルの
ＫＣｌ、０．７ミリモルのＣａＣｌ2 ・２Ｈ2 Ｏ；１０
倍の貯蔵液として調製し、高温滅菌したもの。 ２．微量塩類、最終濃度で０．２マイクロモルのＣｕＳ
Ｏ4 ・５Ｈ2 Ｏ、１．２５マイクロモルのＫＩ、４．５
マイクロモルのＭｎＳＯ4 ・Ｈ2 Ｏ、２．０マイクロモ
ルのＮａＭｏＯ4 ・２Ｈ2 Ｏ、０．７５マイクロモルの
Ｈ3 ＢＯ3 、１７．５マイクロモルのＺｎＳＯ4 ・７Ｈ
2 Ｏ、４４．５マイクロモルのＦｅＣｌ 3 ・６Ｈ2 Ｏ４
００倍貯蔵液として調製し、濾液を滅菌した。 ３．０．４μｇ／ｍｌのビオチン及び ４．２％デキストローズ 大腸菌はＬＢ培地又は２Ｂ培地１００μｌ／ｍｌのトリ
プトファン及び０．２％カザミノ酸を追加添加したもの
で培養した。
【０１２３】Ｄ．ＤＮＡ分離 １．酵素ＤＮＡの大規模調製 ピキア パストリス及びエス・セレビシエのＤＮＡ調製
は、酵母細胞をＡ600が１−２となるまで最少培地１０
０ｍｌを成育させ、次いで２，０００Ｇで５分間遠心分
離して細胞を回収することにより行なった。当該細胞を
水、ＳＥＤ、１モルのソルビトール中でそれぞれ１度洗
浄し、次いで１Ｍのソルビトールに分散した細胞を５ｍ
ｌの０．１モルのトリス−塩酸（ｐＨ＝７．０）に分散
した。細胞をチモラーゼ６０，０００（マイルズ ラボ
ラトリーズ社製）の４ｍｇ／ｍｌ溶液５０−１００μｌ
と混合して、細胞壁を消化するために１時間３０℃でイ
ンキュベートした。スフェロプラスト調製品を１，００
０Ｇで５−１０分間遠心分離し、溶菌用緩衝液（０．１
％ＳＤＳ、１０ミリモルのトリス−塩酸（ｐＨ７．
４）、５ミリモルのＥＤＴＡ及び５０ミリモルのＮａＣ
ｌ）に懸濁した。プロテナーゼＫ（ベーリンガー マン
ハイム社製）及びＲＮナーゼＡ（シグマ社製）それぞれ
１００μｌ／ｍｌの割合で加え、混合物を３７℃３０分
間インキュベートした。ＤＮＡは、イソアミルアルコー
ルを含有するクロロホルム（２４：１、ｖ／ｖ）を当該
調製物と等量しずかに混合し、蛋白を除き、各相を１
２，０００Ｇで２０分間遠心分離することにより分離し
た。上の（水）相を新しい試験管に移し、当量のフェノ
ール／クロロホルム／イソアミルアルコール（２５：２
４：１、ｖ／ｖ／ｖ）混合液で抽出した。各相を前と同
様分離し、最上相２−３倍量の冷１００％エタノールを
含む試験管に入れた。サンプルをしずかに混合し、ＤＮ
Ａをプラスチック製棒の上にまきつけて回収した。当該
ＤＮＡをただちに１ｍｌのＴＥ緩衝液に溶解し、１００
倍量のＴＥ緩衝液で４０℃で１晩透析した。 ２．小規模酵母ＤＮＡ調製 Ａ600 で１−５でなるまで５ｍｌの酵母の培養物を最少
培地で成長させ、次いで２，０００Ｇで５分間遠心分離
し、収集した。細胞を１ｍｌのＳＥＤに懸濁し、１．５
ｍｌの極小遠心管に移し、１モルのソルビトール中で１
度洗い、１モルのソルビトールに分散させた細胞を０．
１モルトリス塩酸（ｐＨ７．４）０．５ｍｌ中に懸濁し
た。チモリアーゼ６０，０００（マイル ラボラトリー
ズ社；４ｍｇ／ｍｌの溶液を１０μｌ）各サンプルに加
え、当該細胞を３０℃で、３０−６０分間インキュベー
トした。細胞は次いで１分間遠心分離し、溶菌用緩衝液
中に懸濁し、６５−７０℃でインキュベートした。１５
分後にサンプルを５モルの酢酸カリウム１００μｌと混
合し、氷浴中に１５分間保持し、５分間遠心分離した。
上澄液を１００％のエタノール１ｍｌを含む新しい極小
遠心管中へデカンテーションし、混合後ただちに１０秒
間遠心分離した。最終的にペレットを１０−１５分間風
乾し、５μｌのＴＥ緩衝液に溶かした。 ３．大規模大腸菌ＤＮＡの分離 大規模（０．５−１リットル）のプラスミド調製用の大
腸菌の培養物は、上述の如く補足され、かつ適当な抗生
物質を含む２Ｂ培地中で３７℃で振とう培養により成育
させた。ｐＢＲ３２２由来のプラスミドを含む細胞の場
合には、Ａ550で約０．７まで培養し、その時点で１０
０μｇ／ｍｌとなるように充分量のクロラムフェニコー
ルを加え、細胞をおおよそ１５時間後に収集した。ＰＢ
Ｒ３２５由来のプラスミドを含む菌株は、補足された２
Ｂの培地中に、当初のＡ550 が約０．０１−０．０５と
なるよう移植し、収集前２０−２４時間３７℃で振とう
インキュベートした。プラスミドをビルンボイム（Ｂｉ
ｒｎｂｏｉｍ）及びドーリー（Ｄｏｌｙ）のアルカリ溶
菌法（１９７９年）により分離した。 ４．小規模大腸菌ＤＮＡ調製 少量の迅速プラスミド分離のために、抗生物質を含み、
補充した２Ｂ培地中の２ｍｌの培養物を３７℃で振とう
培養し、１．５ｍｌの極小遠心管中で遠心分離により収
集した。プラスミドはビルンボイム及びドーリーのアル
カリ溶菌法（１９７９年）により分離した。
【０１２４】Ｅ．ＤＮＡの制限（酵素）及び断片の分離 制限酵素はニュー・イングランド バイオラボズ及びベ
セスダ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ）リサーチ ラボラトリーズ
から入手し消化は常套手段により行なった。制限（酵
素）の地図化は、挿入ＤＮＡを有するか又は有しないプ
ラスミドの並行消化物との比較により実施した。制限断
片はアガローズゲルから透析管材料でバックアップされ
たワットマン３ＭＭ紙片への電気溶出により純化した。
断片は、紙及び管材料から０．１モルのＮａＣｌ、５０
ミリモルのトリス−塩酸（ｐＨ８．０）と１ミリモルの
ＥＤＴＡを含む溶液０．１ないし０．２ｍｌを用い、３
〜４回洗浄し、回収した。最後に、当該断片をフェノー
ル／クロロホルム／イソアミルアルコールで抽出し、エ
タノールで沈澱させ、少量のＴＥ緩衝液に再溶解した。
【０１２５】Ｆ．大腸菌内でのピー・パストリスのライ
ブラリー構築 ピキア パストリスＤＮＡ−ＹＥｐ１３ライブラリー構
築のために、５０μｇのＹＥｐ１３をＢａｍＨＩで完全
に消化し、仔牛の腸アルカリンフォスファターゼで処理
し、ＤＮＡから末端の５´ホスフェートを除去した。ピ
キア パストリスＮＲＲＬ Ｙ−１１４３０からのＤＮ
Ａ１００μｇを、全量で１ｍｌとし、１０単位のＳａｕ
３ＡＩを用いて、３７℃で５分間インキュベートするこ
とにより一部消化を行なった。５ないし２０Ｋｂｐの断
片を５−２０％の蔗糖濃度勾配遠心法を用いて大きさに
より分離した。当該ベクターの１μｇと２μｇのピキア
Ｓａｕ３ＡＩ断片とを、総容量２００μｌ中でＴ４ＤＮ
Ａリガーゼ（ベセスダリサーチ ラボラトリーズ）の２
０単位と混合し、４℃で１晩インキュベートした。当該
リゲートしたＤＮＡで大腸菌を、同８４８菌細胞液２ｍ
ｌに全リゲーション反応混液を加え、０℃で１５分間イ
ンキュベートすることにより形質転換した。混合物を５
分間で３７℃までに加温し、その時間経過後ＬＢ培地４
０ｍｌを加え、３７℃のインキュベーションを更に１時
間つづけた。次いでアンピシリンを加え、全濃度で１０
０μｇ／ｍｌとし、インキュベーションを再び１時間つ
づけた。最後に、細胞を３，０００Ｇで１０分間遠心分
離し、新しいＬＢ培地１ｍｌ中に再び懸濁させ、１００
μｇ／ｍｌのアンピシリンを含む１０個のＬＢ寒天平板
培地上に等量づつ広げた。結果として約５０，０００コ
ロニーが発生したが、それを平板培地からかき取り、細
胞の１部分を、当初のＡ550 が約０．１となるまで５０
０ｍｌの補充した２Ｂ培地に接種した。培養物を成長さ
せ、プラスミドを上述の方法により抽出した。ライブラ
リー用としてプールしたコロニーの中で、１００試験し
たところ９６がテトラサイクリン感受性で、１０試験し
たところ、７つが挿入ＤＮＡを有するプラスミドを含有
していた。
【０１２６】ピキア パストリスＤＮＡ−ｐＹＪＢΔＣ
ｌａライブラリー構築のために、５０μｇのｐＹＪＢΔ
ＣｌａをＣｌａＩで完全に消化し、仔牛の腸アルカリン
フォスファターゼで処理し、ＤＮＡから末端の５´ホ
スフェートを除去した。ピキア パストリスＮＲＲＬ
Ｙ−１５８５１からのＤＮＡ１００μｇを、全量で１ｍ
ｌとし、２０単位のＴａｑＩを用いて、６５℃で５分間
インキュベートすることにより一部消化を行なった。５
ないし１０Ｋｂｐの断片を０．５％アガロースゲルから
電気溶出により（本実施例、Ｅ項参照）大きさにより分
離した。当該ベクターの１μｇと２μｇのピキア Ｔａ
ｑＩ断片とを、総容量２００μｌ中でＴ４ＤＮＡリガー
ゼ（ベセスダ リサーチ ラボラトリーズ）の２０単位
と混合し、４℃で１晩インキュベートした。当該リゲー
トしたＤＮＡで大腸菌を、同８４８菌細胞液２ｍｌに完
全リゲーション反応混液を加え、０℃で１５分間インキ
ュベートすることにより形質転換した。混合物を５分間
で３７℃までに加温し、その時間経過後ＬＢ培地４０ｍ
ｌを加え、３７℃のインキュベーションを更に１時間つ
づけた。次いでアンピシリンを加え、全濃度で１００μ
ｇ／ｍｌとし、インキュベーションを再び１時間つづけ
た。最後に、細胞を３，０００Ｇで１０分間遠心分離
し、新しいＬＢ培地１ｍｌ中に再び懸濁させ、１００μ
ｇ／ｍｌのアンピシリンを含む１０個のＬＢ寒天平板培
地上に等量づつ広ろげた。結果として約１０，０００コ
ロニーが発生したが、それを平板培地からかき取り、細
胞の１部分を、当初のＡ550 が約０．１となるまで５０
０ｍｌの補充した２Ｂ培地に植えた。培養物を成育さ
せ、プラスミドを上述の方法により抽出した。
【０１２７】Ｇ．サザンハイブリダイゼーション ハイブリダイゼーションはサザンの方法（１９７５年）
により実施した。大きい、又はスーパーコイル型ＤＮＡ
分子のニトロセルローズへの移転には、アルカリ変性に
先立って、アガロースゲルを１０分間０．２５モルのＨ
Ｃｌ中に浸漬することによりＤＮＡをまず一部加水分解
した。エス・セレビシエのＨＩＳ４遺伝子由来の標識し
た断片の、ピキア パストリスＤＮＡへのハイブリダイ
ゼーションは５０％のホルムアミド、６倍量のＳＳＣ、
５倍のデンハルト氏液、０．１％ＳＤＳ、１ミリモルの
ＥＤＴＡ、１００μｇ／ｍｌの変性したニシンの精子Ｄ
ＮＡの存在下で４２℃で行なった。エス・セレビシエＨ
ＩＳ４遺伝子から標識された断片のピキア パストリス
ＤＮＡのハイブリダイゼーションのためのハイブリダイ
ゼーション後の洗浄は、２倍のＳＳＣ、１ミリモルのＥ
ＤＴＡ、０．１％のＳＤＳ及び１．０％のピロリン酸ソ
ーダ中で５５℃で行なった。 Ｈ． 32ｐ−標識 ニック翻訳はリグビイ（Ｒｉｇｂｙ）らの方法（１９７
７年）で実施した。 Ｉ．酵母形質転換 エス ・セレビシエの形質転換はヒンネン（Ｈｉｎｎｅ
ｎ）らの方法（１９７８年）のスフェロプラスト世代法
により実施した。ピキア パストリスの形質転換は上述
した手順に順じ実施した。
【０１２８】Ｊ．自律複製配列に関するピキア パスト
リス形質転換体の解析 ピキア ＡＲＳ含有プラスミドをピキア パストリス細胞
中での自律要素として保持されうる能力について次の如
き方法で決定した。形質転換体のコロニーを再生寒天平
板培地からとり、ＳＤ寒天培地上に塗布し、液体ＩＭＧ
培地へと移植した。そのＳＤ平板培地を３０℃で３日間
培養し、その時点で一つのコロニーを平板培地からつま
みとり、再びＳＤ平板培地上に塗布し、ＩＭＧ培地を含
むフラスコへ再度植え継いだ。この過程を３回繰返し
た。この３個のＩＭＧ培養物を３０℃でＡ600 で約１−
２となるまで振とうしながら成育させ、次いで遠心分離
により収集した。この酵母培養物からのＤＮＡを上述の
方法により抽出し、３０ボルト、３０ミリアンペアで１
０ないし１５時間０．８％アガロースゲルへと電気泳動
し、次いでニトロセルロースへと移転させ、上述の如く
32Ｐ−標識のｐＢＲ３２２又はｐＢＲ３２５にハイブリ
ダイゼーションした。対照として大腸菌から分離したプ
ラスミド１０ｎｇを含むサンプルと形質転換してないピ
キア パストリスＮＲＲＬ Ｙ−１５８５１（ＧＳ１１
５）ＤＮＡを１−２μｇ含むサンプルを実験サンプルと
一緒に電気泳動させた。
【０１２９】Ｋ．ピキア ＨＩＳ４遺伝子の単離 ピキア ＨＩＳ４遺伝子を含むＤＮＡ断片をエス・セレビ
シエｈｉｓ４株を相補する彼らの能力を用いピキアＤＮ
Ａライブラリーから単離した。当該ライブラリーは、エ
ス・セレビシエ−大腸菌シャトルベクターＹＥｐ１３の
ＢａｍＨＩ部位へと挿入された野生型ピキアＤＮＡの５
−２０ＫｂｐＳａｕ３ＡＩの部分消化断片より構成され
ていた。エス・セレビシエＮＲＲＬ Ｙ−１５８５９
（５７９９−４Ｄ；ｈｉｓ４ＡＢＣ株の一つ）のスフェ
ロプラストをヒンネン等の方法（１９７８年）により作
り出し、当該ピキアＤＮＡライブラリーと混合し、ヒス
チジン欠缺培地中で再生させた。形質転換により５×１
０7 の全再生可能なスフェロプラストから１×１０ 3 の
原栄養性の酵母コロニーが得られた。全酵母ＤＮＡを２
０のＨｉｓ+ コロニーから抽出し、大腸菌を形質転換し
た。１７の酵母ＤＮＡ調製物がアンピシリン抵抗性コロ
ニーを形成し、いずれのコロニーもＹＥｐ１３と挿入Ｄ
ＮＡよりなるプラスミドを含有していた。Ｈｉｓ+ 形質
転換プラスミドがピキアＨＩＳ４遺伝子を含有している
がサプレッサー活性をもつＤＮＡ遺伝子を含まないこと
を確認するために、当該プラスミドの制限（酵素）消化
物をエス・セレビシエＨＩＳ４遺伝子の大きな部分を含
む、標識されたＤＮＡ断片へとハイブリダイゼーション
し、低い厳密度で洗浄した。当該ｈｉｓ４エス・セレビ
シエ株を相補したプラスミドのいずれもが、当該エス・
セレビシエＨＩＳ４遺伝子とハイブリダイゼーションさ
れた配列を含有していた。ピキアＡＲＳ活性を有するＤ
ＮＡ断片を探索するため、ピキア パストリスＧＳ１１
５（ＮＲＲＬ Ｙ−１５８５１）からのＤＮＡをＴａｑ
Ｉで部分消化し、５から１０Ｋｂｐ断片を分離しｐＹＪ
８ΔＣｌａの特異的なＣｌａＩ部位にへとクローン化し
た（図２６参照）。約１００００アンピシリン抵抗性コ
ロニーからプラスミドを分離し、ＧＳ１１５へと逆形質
転換した。このサブライブラリー形質転換体から４０の
Ｈｉｓ+ 酵母コロニーを淘汰用培地に別々に塗布し、独
立に淘汰用培地中で生育させた。全酵母ＤＮＡをこの４
０の培養物の各々から抽出し、大腸菌を形質転換した。
２つのプラスミド、すなわち、ＰＡＲＳ１を含むｐＹＡ
６３及びＰＡＲＳ１を含むｐＹＡ９０とを更に解析する
ために選抜した。尚、この両者のＤＮＡ調製物は、アン
ピシリンに対して最も耐性のある大腸菌コロニーを形成
させた。また、このプラスミドは、両者とも、ピキア
パストリスＮＲＲＬ Ｙ−１５８５１（ＧＳ１１５）を
高頻度で形質転換でき、自律要素として保持され、それ
ぞれ一つの外来ＤＮＡ挿入を含有していた。
【０１３０】
【実施例ＸＩＶ】調節領域−ｌａｃ遺伝子融合体の構築 Ａ．ｐ７２（アルコールオキシダーゼ）の調節領域の構
築 ４キロ塩基対を有するピキア パストリスからのＥｃｏ
ＲＩ−ＰｖｕゲノムＤＮＡ断片を含有するｐＢＲ３２２
ベクターの一つ、プラスミドｐＰＧ４．０をＰｓｔＩで
切断し、Ｓ１ヌクレアーゼで処理して、開環を起させ、
平滑末端を得、アルコールオキシダーゼ調節領域及びア
ルコールオキシダーゼの最初の１５個のアミノ酸の関す
る遺伝情報を含む１．１２ＫｂｐのＤＮＡ断片を得るた
めＢａｍＨＩで切断した。この１．１２ＫｐｂＤＮＡ断
片は次のヌクレオチド配列を有する。
【表１０】
【０１３１】この１．１２Ｋｂｐを大腸菌−エス・セレ
ビシエシャトルベクターｐＳＥＹ１０１［ダグラス等
（１９８４）参照］の（ＢａｍＨＩおよびＳｍａＩで開
環した）ＥｃｏＲＩ／ＳｍａＩＢａｍＨＩリンカーへと
リゲートして、ハイブリッドプラスミドｐＴＡ０１１
（図２９参照）得た。尚、ベクターｐＳＥＹ１０１は、
大腸菌のｌａｚ遺伝子及び次のヌクレオチド配列を含有
している：
【化２１】 ｐＴＡ０１１の調節領域−ｌａｃＺ遺伝子融合体は、配
列Ｅに示したようにβ−ガラクトシダーゼの生産に関し
ては、位相を異にしているので、ベクターｐＴＡ０１１
は、その特異的なＢａｍＨＩ部位で開環し、次のＳｍａ
リンカー；
【化２２】 の挿入により、ハイブリッドベクターｐＴＡ０１２を産
出し、
【化２３】
【０１３２】又、当該ベクターは、当該調節領域−ｌａ
ｃＺ融合体に関しては、次のヌクレオチド配列を有し、
【化２４】
【０１３３】それ故に、当該ｌａｃＺの転写解読枠に関
しては、ｐＴＡ０１２の調節領域−ｌａｃ融合体は、依
然として位相を異にしている。当該アルコールオキシダ
ーゼの構造遺伝子に関する遺伝情報をコード化している
Ｎ−末端をｌａｃＺ遺伝子と共に、転写解読枠に導入す
るために、ｐＴＡ０１２をＥｃｏＲＩ−ＳｍａＩで処理
し、得られたＤＮＡ断片を、同様にＥｃｏＲＩ−Ｓｍａ
Ｉで処理されたｐＳＥＹ１０１へとリゲートして、ハイ
ブリッドベクターｐＴＡ０１３を産出した（図３０及び
次のヌクレオチド配列参照）。
【化２５】
【０１３４】このベクターｐＴＡ０１３は、実施例XVで
記載した次の研究のために、次いでエス・セレビシエの
形質転換に使用した。ベクターｐＴＡ０１３は、次いで
ＰｓｔＩ又はＰｓｔＩ−ＮｒｕＩで開環し、開環された
断片中に含まれる調節領域−ｌａｃＺ融合体をシャトル
ベクターｐＴＡＦＨ１のＨＩＳ遺伝子含有断片（図２８
参照）、ｐＹＪ３０（図２７参照）、又はｐＹＡ２（図
２３参照）とリゲートすると、それぞれ、プラスミドｐ
ＳＡＯＨ１、ｐＳＡＯＨ５及びｐＳＡＯＨ１０が得られ
た。 ｐＴＡ０１３に加え、 生成プラスミド ｐＴＡＦＨ１ ｐＳＡＯＨ１ ｐＹＪ３０ ｐＳＡＯＨ５ ｐＹＡ２ ｐＳＡＯＨ１０
【０１３５】Ｂ．ｐ７６調節領域の構築 調節領域−ｌａｃ遺伝子融合体は、ｐ７６７６調節領域
を用いて次のようにして調製した。 １．ｐＰＧ６．０の全５´部分を使用 １．３５キロ塩基対のｐＰＧ６．０のＥｃｏＲＩを、大
腸菌−エス・セレビシエのシャトルベクターの１つｐＳ
ＥＹの特異的なＥｃｏＲＩ部位にクローン化し、プラス
ミドｐＴ７６Ｕ１（図３０ａ参照）を得た。ベクターｐ
Ｔ７６Ｕ１を、次いでＰｓｔＩ−ＮｒｕＩで開環し、よ
り大きなＤＮＡ断片をシャトルベクターｐＴＡＦＨ１の
ＨＩＳ４遺伝子含有断片（図２８参照）と上述のように
リゲート（ｌｉｇａｔｅ）するか、又はシャトルベクタ
ーｐＢＰｆＩ（図３４参照）のＰｓｔＩ−ＥｃｏＲＩ断
片のＥｃｏＲＩ切断末端を満したものでリゲートするこ
とによりｐＴ７６Ｈ３又はｐＴ７６Ｈ４が得られた。 ２．５´−ｐＰＧ６．０のＢａｌ３１消化物を使用 ｐＰＧ６．０の１．３５キロ塩基対のＥｃｏＲＩ断片
を、ピキアＤＮＡの挿入されたＥｃｏＲＩ部位に隣接し
た特異的ＳａｌＩ部位も有する大腸菌−エス・セレビシ
エのシャトルベクターの一つ、ｐＳＥＹ８の特異的Ｅｃ
ｏＲＩ部位にクローン化して、プラスミドｐＴＡ０１
（図３１参照）を得た。このプラスミドｐＴＡ０１をＳ
ａｌＩで開環し、Ｂａｌ３１エンドヌクレアーゼで処理
すると種々の長さのポリペプチドｐ７６調節領域の平滑
末端を有する断片を産出した。この平滑末端を有する断
片は、プラスミドｐＳＥＹ８のＥｃｏＲＩによる切断の
結果生じた残存断片を含んでいなかった。得られたＤＮ
Ａ断片をｐＳＥＹ１０１のＥｃｏＲＩ−ＳｍａＩリンカ
ーへとクローン化して、プラスミドｐＴＡＦ．８５（図
３２参照）などを得た。プラスミドｐＴＡＦ．８５は、
図２９に示したｐＴＡ０１１の類似対であって、ｐ７２
（アルコールオキシダーゼ）調節領域の代りに、ｐ７６
調節領域を有していた。
【０１３６】次いで、ベクターｐＴＡ０１３からプラス
ミドｐＴＡＦＨ．８５を得たのと同様の方法で、ベクタ
ーｐＴＡＦ．８５を処理して、ｐＴ７６Ｈ１及びＰＴ７
６Ｈ２を得た。すなわち、次のベクターを開環し、リゲ
ートした。 ｐＴＡＦ．８５に加えて、 生成プラスミド ｐＴＡＦＨ１ ｐＴＡＦＨ．８５ ｐＹＪ３０ ｐＴ７６Ｈ１ ｐＹＡ２ ｐＴ７６Ｈ２
【０１３７】
【実施例ＸＶ】ピキア・パストリス内でのβ−ガラクトシダーゼ産出の
調節 数種類のピキア・パストリスＧＳ１１５（ＮＲＲＬ Ｙ
−１５８５１）の形質転換体を、種々の条件下で種々な
炭素源上で生育させてβ−ガラクトシダーゼの産出につ
いて、研究した。形質転換した菌株を０．５μｇ／ｍｌ
のビオチン、０．１％のグルコースを含最少培地中で、
定常期になるまで３０℃で生育させた。次いで、細胞を
遠心分離により収集して、ビオチン０．５μｇ／ｍｌ、
メタノール０．５含有の最少培地に移し替えて、３０℃
で約３〜５世代の間生育させた。メタノール中での最初
のこの生育後、ビオチン０．５μｇ／ｍｌと炭素源とし
て０．１％グルコース又は０．３％メタノールを含む新
しい最少培地に移し替えた。細胞を、次いで、３０℃で
約８０時間インキュベートし、定期的にサンプルをとり
アルコールオキシダーゼとβ−グルコシダーゼの水準を
測定した。約２０ないし５０時間後、炭素源を除去しそ
の後は、細胞を炭素源飢餓条件下に保持した。結果は、
表Ｉにまとめて示す。
【表１１】
【０１３８】アルコールオキシダーゼは上述の染料−パ
ーオキシダーゼ方法（実施例VII 参照）で、β−ガラク
トシダーゼは次の様にして測定した。β−ガラクトシダーゼ測定 Ａ．必要とした溶液 Ｚ−緩衝液 最終濃度 Ｎａ2 ＨＰＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ １６．１ｇ ０．０６Ｍ ＮａＨ2 ＰＯ4 ５．５ｇ ０．０４Ｍ ＫＣｌ ０．７５ｇ ０．０１Ｍ ＭｇＳＯ4 ・７Ｈ2 Ｏ ０．２４６ｇ ０．００１Ｍ ２−メルカプトエタノール ２．７ｍｌ ０．０５Ｍ 全量を１１としｐＨを７とするＯ−ニトロフェニル−β−Ｄ−ガラクトシド（ＯＮＰ
Ｇ） ４００ｍｇのＯＮＰＧ（シグマ Ｎ−１１２７）を１０
０ｍｌの蒸留水にとかし４ｍｇ／ｍｌのＯＮＰＧ溶液を
つくる。 Ｂ．分析手順 １．適当量（ＯＤ600 で０．１〜０．５の酵母細胞）を
培養培地からとり、遠心分離し、細胞ペレットを水で洗
う。 ２．１ｍｌのＺ緩衝液を細胞ペレット、３０μｇのＣＨ
Ｃｌ3 及び３０μｌの０．１％ＳＤＳに加え、かきまぜ
（ｖｏｒｔｅｘ）、５分間インキュベートする。 ３．０．２ｍｌのＯＮＧＰ（４ｍｇ／ｍｌ）を加え反応
を開始し、かきまぜる。 ４．適当な時点（Ａ420 ＜１となった時点）で１モルの
Ｎａ2 ＣＯ3 溶液０．５ｍｌを加えて反応を停止させ
る。 ５．４２０ｎｍで上澄液の吸光度を読み取る。 Ｃ．β−ガラクトシダーゼ単位の計算： １単位＝３０℃、ｐＨ７で１分間当り形成されたオルト
ニトロフェノール（ＯＮＰ）の１ｎモル １ｃｍのパスレングス（ｐａｔｈｌｅｎｇｔｈ）で、１
ｎモルのＯＮＰは４２０ｎｍ（Ａ420 ）で０．００４５
の吸光度を持つ。従って、４２０ｎｍでの吸光度１で１
ｍｌ当り２２２ｎモル、又は分析した上澄液の全量が
１．７ｍｌであるので３７８ｎモル／１．７ｍｌであ
る。従って、表中の単位を次の通り計算する。 表１に表わした結果は、酵母にとって外来の蛋白、すな
わちβ−グラクトシダーゼがピキア パストリス内に、
培地中のメタノールの存在又は異化代謝制限炭素源での
生育させた後炭素源飢餓にすることにより産生できるこ
とを示している。
【０１３９】
【実施例ＸＶＩ】ウラシル、ロイシン及びヒスチジンを
生存のために要求する菌株、サッカロミセス セレビシ
エＳＥＹ２１０２を、プラスミドｐＴＡ０１３及びｐＴ
７６Ｕ１で形質転換した。形質転換した生物は、生育に
ウラシルの補充を必要としないコロニーを選抜すること
により容易に分離できた。分離した形質転換体には、そ
れぞれＳＥＹ２１０２−ｐＴＡ０１３及びＳＥＹ２１０
２−ｐＴ７６ＵＩという実験室内の表示を割りあてた。
ＳＥＹ２１０２−ｐＴＡ０１３は、１９８４年８月３１
日付の寄託日で、公衆が入手可能とするためにイリノイ
州ペオリア（Ｐｅｏｒｉａ）市の北方地区研究センター
（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ Ｒｅｇｉｏｎａｌ Ｒｅｓｅａｒ
ｃｈ Ｃｅｎｔｒｅ）に寄託してある。この菌株には寄
託番号ＮＲＲＬ Ｙ−１５８５１が割りあてられてい
る。２０μｇ／ｍｌのヒスチジン及びロイシン並びに５
％グルコースを含む最少培地中で３〜５世代の間３０℃
で、ＮＲＲＬ Ｙ−１５８５１及びＳＥＹ２１０２−ｐ
Ｔ７６Ｕ１をインキュベートした。次いで、細胞を移し
替えた、つまり遠心分離により収集し、表IIに示す炭素
源３％を含むＹＰ培地中へと移し替え、３０℃で５世代
の間生育させた。次いで、細胞を更に５０時間炭素源飢
餓条件下でインキュベートし、時々β−グラクトシダー
ゼ測定のためにサンプリングした。結果は表IIにまとめ
て示す。
【表１２】
【０１４０】これらの結果は、異化代謝産物制限炭素培
地を生育に用いた場合の炭素源飢餓条件下、又は、形質
転換エス・セレビシエ細胞を比較的非異化代謝産物制限
的炭素源、例えば、グリセロールやガラクトースなどを
用いて生育させることにより、酵母にとっては、外来の
蛋白の一つ、すなわち、β−ガラクトシダーゼを、当該
ｐ７２（アルコールオキシダーゼ）及びｐ７６調節領域
により調節されたサッカロミセス セレビシエにより産
出されることを示している。エス・セレビシエ内での、
この発明による調節領域の制御下でのエス・セレビシエ
内でのβ−ガラクトシダーゼの発現水準は、他のエス・
セレビシエ調節プロモターを用いての可能な表現水準に
比敵しうるものである。
【表１３】
【０１４１】驚くべきことに、この発明の調節領域は、
エス・セレビシエ生来のプロモータに比較しエス・セレ
ビシエのプロモータと少くなくとも同等に有効か、又は
より有効であることが明らかとなった。
【０１４２】
【実施例ＸＶＩＩ】酵母のゲノムＤＮＡを用いたサザンハイブリダイゼーシ
ョン ９種類の異なったメタノール同化酵母と１種類のメタノ
ール非同化酵母を最少培地（１Ｍ１、実施例Ｉ参照）に
０．７５％メタノール又は１．０％のグルコースをそれ
ぞれ加えたもので生育させた。全染色体ＤＮＡは、実施
例VIに記載した方法、すなわち、全核酸を分離し、ＲＮ
アーゼで処理し、最初フェノール／クロロホルム／イソ
アミルアルコールで抽出し、次いで、クロロホルム／イ
ソアミルアルコールで抽出し、最後にエタノールで沈澱
をさせた。沈澱させたＤＮＡを最少量のＴＥ緩衝液に再
分散させ、遠心分離により透明なＤＮＡ溶液を得た。サ
ザンハイブリダイゼーションフィルターは実施例VI、す
なわち、様々な酵母種からの全ＤＮＡを過剰のＨｉｎｄ
III で消化し、電気泳動させ、ＤＮＡを変性させ、ゲル
を中和し、ＤＮＡをニトロセルローズ フィルターへ移
し替えることにより調製した。この濾過体（フィルタ
ー）にプレハイブリダイゼーション条件は、４２℃で一
晩、５０％の脱イオン化したホルムアミド、６倍のＳＳ
Ｃ、５倍のデンハルト氏液、１ミリモルのＥＤＴＡ、
０．１％ＳＤＳ及び１００μｇ／ｍｌの変性サケ精子Ｄ
ＮＡを用い処理することを含んでいた。同一条件を、最
終濃度で１０6 ｃｐｍ／ｍｌの32Ｐ−ニック−トランス
レーション プローブに用い、ハイブリダイゼーション
培地とし使用した。このプローブは、ピー・パストリス
ＨＩＳ４遺伝子の２．７ＫｂｐのＢｇｌIIＤＮＡと同
様、ｐＰＣ８．３、ｐＰＣ１５．０及びｐＰＣ６．７の
クローン由来のｃＤＮＡ挿入（Ｐｓｔ断片）を含有して
いた。これらのプローブのいずれも４２℃で２４時間続
いたハイブリダイゼーションに関しては、同一のフィル
ターに別々に使用した。ハイブリダイゼーション後、フ
ィルターを室温で１５分間、６５℃で１５分間、２倍の
ＳＳＣ、１ミリモルのＥＤＴＡ、０．１％のＳＤＳ及び
０．１％のピロリン酸ソーダを含む溶液中で洗浄した。
他の洗浄は低厳密性下、すなわち、５５℃及び４２℃
で、ハイブリダイゼーションを確認するために実施し
た。フィルターは７２時間にわたりオートラジオグラフ
ィーにかけた。これらの結果は、表III にまとめて示し
てある。
【表１４】
【０１４３】表III に示した結果は、ｐ７６、ｐ７２及
びｐ４０に類似したポリペプチドに関する遺伝子が実質
的にすべてのメタノール同化酵母中には存在することを
示している。これらの３種の遺伝子のいずれもが、メタ
ノール非同化酵母、エス・セレビシエからのＤＮＡのハ
イブリダイゼーションは、観察されなかった。このこと
は、ピー・パストリスＨＩＳ４遺伝子とエス・セレビシ
エからのＨＩＳ４遺伝子との間の同質性は既に観察され
ていることからみても、特記すべきことである。
【０１４４】次の文献を本明細書中では引用した。ビル
ボイム及びドーリー（１９７９年）核酸研究、７巻、１
５１３−１５２３頁［Ｂｉｒｎｂｏｉｍ ａｎｄ Ｄｏ
ｌｙ（１９７９）Ｎｕｃｌ．ＡｃｉｄｅｓＲｅｓ．７、
１５１３−１５２３］エム・ジー・ダグラス等（１９８
４年）米国国立教養学会大会講演集、８１巻、３９８３
−３９８７［Ｍ．Ｇ．Ｄｏｕｇｌａｓ ｅｔ ａｌ（１
９８４年）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．
Ｓ．８１、３９８３−３９８７］ヒンネン等（１９７８
年）米国国立教養学会大会講演集、７５巻、１９２９−
１９３３頁［Ｈｉｎｎｅｎ ｅｔ ａｌ（１９８３）Ｐ
ｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ ７５、
１９２９−１９３３］ゼット・エイ・ジャノビッツ等
（１９８５年）核酸研究、１３巻、３０４３−３０６２
頁［Ｚ．Ａ．Ｊａｎｏｗｉｃｚ ｅｔ ａｌ（１９８
５）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１３、３０４３−
３０６２］エイ・エム・レデボエール等（１９８５年）
核酸研究、１３巻、３０６３−３０８２頁［Ａ．Ｍ．Ｌ
ｅｄｅｂｏｅｒ ｅｔ ａｌ（１９８５）Ｎｕｃｌ．Ａ
ｃｉｄｅｓ Ｒｅｓ．１３、３０６３−３０８２］マッ
クサム及びギルバード（１９８０年）酵素方法 ６５
巻、４９９−５６０頁［Ｍａｘａｍ ａｎｄ Ｇｉｌｂ
ｅｒｔ（１９８０）ｉｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎ
ｚｙｍｏｌｏｇｙ ６５、４９９−５６０］サザン（１
９７５年）分子微生物学誌、９８巻、５０３−５１７頁
［Ｓｏｕｔｈｅｒｎ（１９７５）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏ
ｌ．９８、５０３−５１７］サンガー等（１９８０年）
分子微生物学誌、１４３巻、１６１−１７８頁［Ｓａｎ
ｇｅｒ ｅｔ ａｌ（１９８０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏ
ｌ．１４３、１６１−１７８］
【図面の簡単な説明】
【図１】蛋白ｐ７６のゲノムクローン（ｐＰＧ６．０）
とｃＤＮＡクローン（ｐＰＣ１５．０）の間の相互関係
を示す。
【図２】蛋白ｐ７２（アルコールオキシダーゼ）のゲノ
ムクローン（ｐＰＧ４．０）とｃＤＮＡ（ｐＰＣ８．３
及びｐＰＣ８．０）の間の相互関係を示す。
【図３】蛋白ｐ４０のゲノムクローン（ｐＰＧ４．８）
とｃＤＮＡ（ｐＰＣ６．７）の間の相互関係を示す。
【図４】クローンｐＰＧ６．０由来のこの発明の調節領
域の制限地図を示す。
【図５】クローンｐＰ４．０由来のこの発明の調節領域
の制限地図を示す。
【図６】クローンｐＰＧ４．８のこの発明の調節領域の
制限地図を示す。
【図７】ｐ７６構造遺伝子の３´末端から得られたＤＮ
Ａ配列の制限地図を示す。
【図８】ｐ７２（アルコールオキシダーゼ）構造遺伝子
の３´末端から得たＤＮＡ配列の制限地図を示す。
【図９】ｐ４０構造遺伝子の３´末端から得たＤＮＡ配
列の制限地図を示す。
【図１０】蛋白ｐ７６の構造遺伝子とその５´末端の調
節領域の制限地図を示す。
【図１１】蛋白ｐ４０の構造遺伝子とその５´末端の調
節領域の制限地図を示す。
【図１２】蛋白ｐ７６ｃＤＮＡの制限地図を示す。
【図１３】蛋白ｐ４０ｃＤＮＡの制限地図を示す。
【図１４】蛋白ｐ４０の制限地図を示す。
【図１５】この発明の２つの新規なｐ７６の調節領域−
ｌａｃＺ構造の制限地図を示す。
【図１６】この発明の２つの新規なｐ７２（アルコール
オキシダーゼ）調節領域−ｌａｃＺ構造の制限地図を示
す。
【図１７】プラスミドｐＳＡＯＨ１の制限地図を示す。
【図１８】プラスミドｐＳＡＯＨ５の制限地図を示す。
【図１９】プラスミドｐＳＡＯＨ１０の制限地図を示
す。
【図２０】プラスミドｐＴＡＦＨ．８５の制限地図を示
す。
【図２１】プラスミドｐＴ７６Ｈ１の制限地図を示す。
【図２２】プラスミドｐＴ７６Ｈ２の制限地図を示す。
【図２２Ａ】プラスミドｐＴ７６Ｈ３の制限地図を示
す。
【図２２Ｂ】プラスミドｐＴ７６Ｈ４の制限地図を示
す。
【図２３】プラスミドｐＹＡ２の制限地図を示す。
【図２４】プラスミドｐＹＡ４の制限地図を示す。
【図２５】プラスミドｐＹＪ８の制限地図を示す。
【図２６】プラスミドｐＹＪ８ΔＣｌａの、制限地図を
示す。
【図２７】プラスミドｐＹＪ３０の、制限地図を示す。
【図２８】プラスミドｐＴＡＦＨ１の制限地図を提供
し、そして当該プラスミドがどのようにして誘導された
かを示す。
【図２９】プラスミドｐＴＡ０１２の制限地図と、当該
プラスミドがどのようにして誘導されたかを示す。
【図３０】プラスミドｐＴＡ０１３の制限地図を示す。
【図３０Ａ】プラスミドｐＴ７６Ｕ１の制限地図を示
す。
【図３１】プラスミドｐＴＡ０１及び当該プラスミドが
どのようにして誘導されたかを示す。
【図３２】プラスミドｐＴＡＦ．８５の制限地図と、当
該プラスミドがどのようにして誘導されたかを示す。
【図３３】プラスミドＹＥｐ１３の制限地図を示す。
【図３４】プラスミドｐＢＰｆ１の制限地図を示す。
【符号の説明】
図中制限酵の略号をかっこで囲んで示している切断個所
は、ＤＮＡ断片の操作に使用した切断部位ではあるが、
リゲーションにより当該切断部位を破壊したことを示
す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｎ 9/04 Ｅ 9359−4Ｂ (Ｃ１２Ｎ 15/53 Ｃ１２Ｒ 1:84） (Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｒ 1:72） (Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｒ 1:85） (Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｒ 1:78） (Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｒ 1:88） (Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｒ 1:84） (Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｒ 1:645） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者 ポール フレデリツク ブラスト アメリカ合衆国カリフオルニア州デル マ ー，ビア コーテイナ ナンバー ２, 12760 (72)発明者 スチーブン ブラツドリイ エリス アメリカ合衆国カリフオルニア州ラ ジヨ ラ，モーニング ウエイ 3122 (72)発明者 トーマス レイモンド ジンゲラス アメリカ合衆国カリフオルニア州エンシニ タス，ジユニパー ヒル ドライブ 1528 (72)発明者 マイクル ミラー ハーポルド アメリカ合衆国カリフオルニア州サン ジ エゴ，トウエンテイナインス ストリート 1341 (72)発明者 ジユアグ フリデリツク ツシヨツプ アメリカ合衆国カリフオルニア州サン ジ エゴ，カーメル ケイプ 102458

Claims (10)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 アルコールオキシダーゼの生産の遺伝情
    報をコードする遺伝子、そのサブユニット、かかる遺伝
    子の同等物又はその同等物のサブユニット
  2. 【請求項２】 当該遺伝子が図１３の図面の制限地図に
    より特徴づけられた請求項第１項記載の遺伝子
  3. 【請求項３】 当該遺伝子が次のヌクレオチド配列、 【化１】 【化２】 【化３】 【化４】
  4. 【請求項４】 当該遺伝子が更に図２のａ）の制限地図
    により特徴づけられた染色体ＤＮＡのフランキング領域
    を含有する請求項第１ないし３項のいずれか１項に記載
    の遺伝子
  5. 【請求項５】 ポリペプチドｐ７６の生産についての遺
    伝情報をコードする遺伝子、そのサブユニット、かかる
    遺伝子の同等物及びそのサブユニット
  6. 【請求項６】 当該遺伝子が図１２の制限地図により特
    徴づけられている請求項第５項記載の遺伝子
  7. 【請求項７】 当該遺伝子が図１のａ）の制限地図によ
    り特徴づけられている請求項第５項記載の遺伝子
  8. 【請求項８】 ポリペプチドｐ４０の生産についての遺
    伝情報をコードする遺伝子、そのサブユニット、かかる
    遺伝子の同等物及びそのサブユニット
  9. 【請求項９】 当該遺伝子が図１４の図面の制限地図に
    より特徴づけられる請求項第８項記載の遺伝子
  10. 【請求項１０】 当該遺伝子が更に図３のａ）の制限地
    図により特徴づけられた染色体ＤＮＡのフランキング領
    域を含有する請求項第８項記載の遺伝子
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