HU205627B - Process for producing polypeptides by yeasts containing area for controlling gen expression - Google Patents
Process for producing polypeptides by yeasts containing area for controlling gen expression Download PDFInfo
- Publication number
- HU205627B HU205627B HU854160A HU416085A HU205627B HU 205627 B HU205627 B HU 205627B HU 854160 A HU854160 A HU 854160A HU 416085 A HU416085 A HU 416085A HU 205627 B HU205627 B HU 205627B
- Authority
- HU
- Hungary
- Prior art keywords
- dna
- regulatory region
- gene
- transformed
- yeast
- Prior art date
Links
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 title claims abstract description 79
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 title claims abstract description 79
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims abstract description 79
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 52
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 title claims description 84
- 230000008569 process Effects 0.000 title abstract description 7
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 title description 32
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 165
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 claims abstract description 114
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 claims abstract description 53
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 51
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims abstract description 36
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims abstract description 28
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 175
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 141
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 106
- 108010025188 Alcohol oxidase Proteins 0.000 claims description 76
- 241000235058 Komagataella pastoris Species 0.000 claims description 76
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 claims description 53
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 44
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 claims description 43
- 241000235648 Pichia Species 0.000 claims description 42
- 102000005936 beta-Galactosidase Human genes 0.000 claims description 30
- 238000013518 transcription Methods 0.000 claims description 16
- 230000035897 transcription Effects 0.000 claims description 16
- 241001506991 Komagataella phaffii GS115 Species 0.000 claims description 12
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 claims description 12
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 claims description 10
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 claims description 5
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 claims description 4
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 3
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 claims description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims description 2
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 claims 1
- 230000000754 repressing effect Effects 0.000 abstract description 13
- 235000003642 hunger Nutrition 0.000 abstract description 11
- 230000037351 starvation Effects 0.000 abstract description 11
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 136
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 122
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 110
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 86
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 86
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 85
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 75
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 64
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 56
- 239000000047 product Substances 0.000 description 56
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 53
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 53
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 52
- PHTQWCKDNZKARW-UHFFFAOYSA-N isoamylol Chemical compound CC(C)CCO PHTQWCKDNZKARW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 52
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 48
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 46
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 43
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 43
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 42
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 40
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 36
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 34
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 33
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 33
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 33
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 32
- 101150069554 HIS4 gene Proteins 0.000 description 31
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 31
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 30
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 29
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 28
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 27
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 27
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 26
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 26
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 25
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 23
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 23
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 23
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 22
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 22
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 22
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 21
- 101150066555 lacZ gene Proteins 0.000 description 21
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 19
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 19
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 18
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 18
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 17
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 17
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 17
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 17
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 17
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 17
- 239000007984 Tris EDTA buffer Substances 0.000 description 16
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 16
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 16
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 16
- 208000037065 Subacute sclerosing leukoencephalitis Diseases 0.000 description 15
- 206010042297 Subacute sclerosing panencephalitis Diseases 0.000 description 15
- ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N Formamide Chemical compound NC=O ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 14
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 14
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 13
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 12
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 12
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 12
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 12
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 12
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 11
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 11
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 10
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 10
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 10
- 239000002585 base Substances 0.000 description 10
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 10
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 10
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 10
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 10
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 10
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 10
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 10
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 10
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 9
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 9
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 9
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 9
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 9
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 9
- 239000006152 selective media Substances 0.000 description 9
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 101150041132 AO gene Proteins 0.000 description 8
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 108010067193 Formaldehyde transketolase Proteins 0.000 description 8
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 8
- SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N dATP Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 8
- HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N dGTP Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N 0.000 description 8
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 8
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 8
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 7
- SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N dATP Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1CC(O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 7
- 229930182830 galactose Natural products 0.000 description 7
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 7
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 7
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 7
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 7
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 7
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 7
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 241000222120 Candida <Saccharomycetales> Species 0.000 description 6
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 6
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 6
- WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N Formaldehyde Chemical compound O=C WSFSSNUMVMOOMR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N N-Butanol Chemical compound CCCCO LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 6
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 6
- 241000364057 Peoria Species 0.000 description 6
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- RZCIEJXAILMSQK-JXOAFFINSA-N TTP Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 RZCIEJXAILMSQK-JXOAFFINSA-N 0.000 description 6
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 6
- AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M caesium chloride Chemical compound [Cl-].[Cs+] AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 229960005091 chloramphenicol Drugs 0.000 description 6
- WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N chloramphenicol Chemical compound ClC(Cl)C(=O)N[C@H](CO)[C@H](O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N 0.000 description 6
- RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-N dCTP Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](CO[P@](O)(=O)O[P@](O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C1 RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-N 0.000 description 6
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 6
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 6
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 6
- 239000000463 material Substances 0.000 description 6
- 125000001360 methionine group Chemical group N[C@@H](CCSC)C(=O)* 0.000 description 6
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 6
- 0 CC*CN(C)** Chemical compound CC*CN(C)** 0.000 description 5
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 5
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 5
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 5
- 102100031780 Endonuclease Human genes 0.000 description 5
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 5
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 5
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 5
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 5
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 5
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 5
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 5
- WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N alpha-D-galactose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N 0.000 description 5
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 5
- UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N bromophenol blue Chemical compound C1=C(Br)C(O)=C(Br)C=C1C1(C=2C=C(Br)C(O)=C(Br)C=2)C2=CC=CC=C2S(=O)(=O)O1 UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 5
- 238000011160 research Methods 0.000 description 5
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 5
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 5
- 239000012064 sodium phosphate buffer Substances 0.000 description 5
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 5
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 5
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 5
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 5
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 5
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 5
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 5
- 239000007222 ypd medium Substances 0.000 description 5
- IQUPABOKLQSFBK-UHFFFAOYSA-N 2-nitrophenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1[N+]([O-])=O IQUPABOKLQSFBK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- KUWPCJHYPSUOFW-YBXAARCKSA-N 2-nitrophenyl beta-D-galactoside Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC1=CC=CC=C1[N+]([O-])=O KUWPCJHYPSUOFW-YBXAARCKSA-N 0.000 description 4
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108020004638 Circular DNA Proteins 0.000 description 4
- 229930091371 Fructose Natural products 0.000 description 4
- 239000005715 Fructose Substances 0.000 description 4
- RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N Fructose Chemical compound OC[C@H]1O[C@](O)(CO)[C@@H](O)[C@@H]1O RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N 0.000 description 4
- 108010093031 Galactosidases Proteins 0.000 description 4
- OAKJQQAXSVQMHS-UHFFFAOYSA-N Hydrazine Chemical compound NN OAKJQQAXSVQMHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108020002230 Pancreatic Ribonuclease Proteins 0.000 description 4
- 102000005891 Pancreatic ribonuclease Human genes 0.000 description 4
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 4
- 241000235070 Saccharomyces Species 0.000 description 4
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 4
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 4
- ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N Uracil Chemical compound O=C1C=CNC(=O)N1 ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 4
- ROOXNKNUYICQNP-UHFFFAOYSA-N ammonium persulfate Chemical compound [NH4+].[NH4+].[O-]S(=O)(=O)OOS([O-])(=O)=O ROOXNKNUYICQNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 4
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 4
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N cytosine Chemical compound NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 4
- 238000012869 ethanol precipitation Methods 0.000 description 4
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 4
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 4
- 230000006870 function Effects 0.000 description 4
- 108010050848 glycylleucine Proteins 0.000 description 4
- UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N guanine Chemical compound O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2 UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 4
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 4
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 4
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 4
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 4
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 4
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 4
- 230000009711 regulatory function Effects 0.000 description 4
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 4
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 4
- 108010082737 zymolyase Proteins 0.000 description 4
- USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N Ammonium acetate Chemical compound N.CC(O)=O USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000005695 Ammonium acetate Substances 0.000 description 3
- 101710141722 Arylsulfatase Proteins 0.000 description 3
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 3
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 3
- 230000005526 G1 to G0 transition Effects 0.000 description 3
- 102000002464 Galactosidases Human genes 0.000 description 3
- YWAQATDNEKZFFK-BYPYZUCNSA-N Gly-Gly-Ser Chemical compound NCC(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O YWAQATDNEKZFFK-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 3
- 108010002311 N-glycylglutamic acid Proteins 0.000 description 3
- 239000012083 RIPA buffer Substances 0.000 description 3
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 3
- 101150006914 TRP1 gene Proteins 0.000 description 3
- LVTKHGUGBGNBPL-UHFFFAOYSA-N Trp-P-1 Chemical compound N1C2=CC=CC=C2C2=C1C(C)=C(N)N=C2C LVTKHGUGBGNBPL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 101150050575 URA3 gene Proteins 0.000 description 3
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 3
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 3
- 235000019257 ammonium acetate Nutrition 0.000 description 3
- 229940043376 ammonium acetate Drugs 0.000 description 3
- 108010068380 arginylarginine Proteins 0.000 description 3
- 238000009739 binding Methods 0.000 description 3
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 3
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 3
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 3
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 3
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 3
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 3
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 3
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 3
- 230000002934 lysing effect Effects 0.000 description 3
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 3
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 3
- 101800000857 p40 protein Proteins 0.000 description 3
- 101150057545 p72 gene Proteins 0.000 description 3
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 3
- 230000001172 regenerating effect Effects 0.000 description 3
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 3
- 210000003705 ribosome Anatomy 0.000 description 3
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 3
- 238000002791 soaking Methods 0.000 description 3
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 3
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 3
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 3
- -1 that is Polymers 0.000 description 3
- AXFMEGAFCUULFV-BLFANLJRSA-N (2s)-2-[[(2s)-1-[(2s,3r)-2-amino-3-methylpentanoyl]pyrrolidine-2-carbonyl]amino]pentanedioic acid Chemical compound CC[C@@H](C)[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O AXFMEGAFCUULFV-BLFANLJRSA-N 0.000 description 2
- HZAXFHJVJLSVMW-UHFFFAOYSA-N 2-Aminoethan-1-ol Chemical compound NCCO HZAXFHJVJLSVMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- OMLWNBVRVJYMBQ-YUMQZZPRSA-N Arg-Arg Chemical compound NC(N)=NCCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(O)=O OMLWNBVRVJYMBQ-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 2
- HOBNTSHITVVNBN-ZPFDUUQYSA-N Asp-Ile-Leu Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)O)N HOBNTSHITVVNBN-ZPFDUUQYSA-N 0.000 description 2
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- 101100381981 Caenorhabditis elegans bam-2 gene Proteins 0.000 description 2
- 101100512078 Caenorhabditis elegans lys-1 gene Proteins 0.000 description 2
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 102000004594 DNA Polymerase I Human genes 0.000 description 2
- 108010017826 DNA Polymerase I Proteins 0.000 description 2
- 108010054576 Deoxyribonuclease EcoRI Proteins 0.000 description 2
- 108010067770 Endopeptidase K Proteins 0.000 description 2
- 108010001498 Galectin 1 Proteins 0.000 description 2
- 108010001496 Galectin 2 Proteins 0.000 description 2
- 102100021736 Galectin-1 Human genes 0.000 description 2
- 102100021735 Galectin-2 Human genes 0.000 description 2
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 2
- JVSBYEDSSRZQGV-GUBZILKMSA-N Glu-Asp-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O JVSBYEDSSRZQGV-GUBZILKMSA-N 0.000 description 2
- 108010033128 Glucan Endo-1,3-beta-D-Glucosidase Proteins 0.000 description 2
- 241001149669 Hanseniaspora Species 0.000 description 2
- 101000976075 Homo sapiens Insulin Proteins 0.000 description 2
- 102100024319 Intestinal-type alkaline phosphatase Human genes 0.000 description 2
- 101710184243 Intestinal-type alkaline phosphatase Proteins 0.000 description 2
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 2
- LZHJZLHSRGWBBE-IHRRRGAJSA-N Leu-Lys-Val Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O LZHJZLHSRGWBBE-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 2
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000006142 Luria-Bertani Agar Substances 0.000 description 2
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 2
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 2
- KWYHDKDOAIKMQN-UHFFFAOYSA-N N,N,N',N'-tetramethylethylenediamine Chemical compound CN(C)CCN(C)C KWYHDKDOAIKMQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 2
- 101100342977 Neurospora crassa (strain ATCC 24698 / 74-OR23-1A / CBS 708.71 / DSM 1257 / FGSC 987) leu-1 gene Proteins 0.000 description 2
- 101100366988 Neurospora crassa (strain ATCC 24698 / 74-OR23-1A / CBS 708.71 / DSM 1257 / FGSC 987) stu-1 gene Proteins 0.000 description 2
- 102000043276 Oncogene Human genes 0.000 description 2
- 108700020796 Oncogene Proteins 0.000 description 2
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 2
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 2
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 2
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 2
- NQRYJNQNLNOLGT-UHFFFAOYSA-N Piperidine Chemical compound C1CCNCC1 NQRYJNQNLNOLGT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- SUENWIFTSTWUKD-AVGNSLFASA-N Pro-Leu-Val Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O SUENWIFTSTWUKD-AVGNSLFASA-N 0.000 description 2
- DWGFLKQSGRUQTI-IHRRRGAJSA-N Pro-Lys-Lys Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@@H]1CCCN1 DWGFLKQSGRUQTI-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 2
- 108700005075 Regulator Genes Proteins 0.000 description 2
- 241000223252 Rhodotorula Species 0.000 description 2
- 239000012506 Sephacryl® Substances 0.000 description 2
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 2
- MMAPOBOTRUVNKJ-ZLUOBGJFSA-N Ser-Asp-Ser Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CO)N)C(=O)O MMAPOBOTRUVNKJ-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 2
- UIGMAMGZOJVTDN-WHFBIAKZSA-N Ser-Gly-Ser Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O UIGMAMGZOJVTDN-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 2
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 2
- CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L Sodium Carbonate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C([O-])=O CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N Sodium azide Chemical compound [Na+].[N-]=[N+]=[N-] PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 2
- UMPVMAYCLYMYGA-ONGXEEELSA-N Val-Leu-Gly Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(O)=O UMPVMAYCLYMYGA-ONGXEEELSA-N 0.000 description 2
- KOSRFJWDECSPRO-UHFFFAOYSA-N alpha-L-glutamyl-L-glutamic acid Natural products OC(=O)CCC(N)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(O)=O KOSRFJWDECSPRO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910001870 ammonium persulfate Inorganic materials 0.000 description 2
- 108010093581 aspartyl-proline Proteins 0.000 description 2
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 2
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 2
- 235000011148 calcium chloride Nutrition 0.000 description 2
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 2
- 244000309466 calf Species 0.000 description 2
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 2
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 2
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 2
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 2
- 238000007385 chemical modification Methods 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N cyanogen bromide Chemical compound BrC#N ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 2
- 229940104302 cytosine Drugs 0.000 description 2
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 2
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 2
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 2
- 108010057083 glutamyl-aspartyl-leucine Proteins 0.000 description 2
- 239000011544 gradient gel Substances 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 229940094991 herring sperm dna Drugs 0.000 description 2
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 2
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 2
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 2
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 2
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 2
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 2
- PBGKTOXHQIOBKM-FHFVDXKLSA-N insulin (human) Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H]1CSSC[C@H]2C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@H](C(N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3C=CC(O)=CC=3)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=3NC=NC=3)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CNC1=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O)=O)CSSC[C@@H](C(N2)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)[C@@H](C)CC)[C@@H](C)CC)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)C1=CN=CN1 PBGKTOXHQIOBKM-FHFVDXKLSA-N 0.000 description 2
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 2
- 108010073093 leucyl-glycyl-glycyl-glycine Proteins 0.000 description 2
- KWGKDLIKAYFUFQ-UHFFFAOYSA-M lithium chloride Chemical compound [Li+].[Cl-] KWGKDLIKAYFUFQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000012160 loading buffer Substances 0.000 description 2
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 2
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 2
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 2
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 2
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 2
- BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N methanoic acid Natural products OC=O BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000002824 peroxisome Anatomy 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 2
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 description 2
- SCVFZCLFOSHCOH-UHFFFAOYSA-M potassium acetate Chemical compound [K+].CC([O-])=O SCVFZCLFOSHCOH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 2
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 2
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 2
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 2
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- FQENQNTWSFEDLI-UHFFFAOYSA-J sodium diphosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O FQENQNTWSFEDLI-UHFFFAOYSA-J 0.000 description 2
- 229940048086 sodium pyrophosphate Drugs 0.000 description 2
- VGTPCRGMBIAPIM-UHFFFAOYSA-M sodium thiocyanate Chemical compound [Na+].[S-]C#N VGTPCRGMBIAPIM-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 235000019818 tetrasodium diphosphate Nutrition 0.000 description 2
- 239000001577 tetrasodium phosphonato phosphate Substances 0.000 description 2
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 2
- LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K tripotassium phosphate Chemical compound [K+].[K+].[K+].[O-]P([O-])([O-])=O LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 229940035893 uracil Drugs 0.000 description 2
- 108700026220 vif Genes Proteins 0.000 description 2
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 2
- DTSCLFDGIVWOGR-UHFFFAOYSA-N 1,3-dimethyl-5h-pyrido[2,3]pyrrolo[2,4-b]pyrimidine-2,4-dione Chemical compound C12=NC=CC=C2NC2=C1N(C)C(=O)N(C)C2=O DTSCLFDGIVWOGR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OAKPWEUQDVLTCN-NKWVEPMBSA-N 2',3'-Dideoxyadenosine-5-triphosphate Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@H]1CC[C@@H](CO[P@@](O)(=O)O[P@](O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 OAKPWEUQDVLTCN-NKWVEPMBSA-N 0.000 description 1
- DQVAZKGVGKHQDS-UHFFFAOYSA-N 2-[[1-[2-[(2-amino-4-methylpentanoyl)amino]-4-methylpentanoyl]pyrrolidine-2-carbonyl]amino]-4-methylpentanoic acid Chemical compound CC(C)CC(N)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)N1CCCC1C(=O)NC(CC(C)C)C(O)=O DQVAZKGVGKHQDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OSBLTNPMIGYQGY-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;2-[2-[bis(carboxymethyl)amino]ethyl-(carboxymethyl)amino]acetic acid;boric acid Chemical compound OB(O)O.OCC(N)(CO)CO.OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O OSBLTNPMIGYQGY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150033839 4 gene Proteins 0.000 description 1
- OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 4-(3-methoxyphenyl)aniline Chemical compound COC1=CC=CC(C=2C=CC(N)=CC=2)=C1 OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150005709 ARG4 gene Proteins 0.000 description 1
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 description 1
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 1
- VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N Ammonium hydroxide Chemical compound [NH4+].[OH-] VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UISQLSIBJKEJSS-GUBZILKMSA-N Arg-Arg-Ser Chemical compound NC(N)=NCCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O UISQLSIBJKEJSS-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- NUBPTCMEOCKWDO-DCAQKATOSA-N Arg-Asn-His Chemical compound C1=C(NC=N1)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)N NUBPTCMEOCKWDO-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- KWTVWJPNHAOREN-IHRRRGAJSA-N Arg-Asn-Phe Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(O)=O KWTVWJPNHAOREN-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 1
- RRGPUNYIPJXJBU-GUBZILKMSA-N Arg-Asp-Met Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(O)=O RRGPUNYIPJXJBU-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- PBSOQGZLPFVXPU-YUMQZZPRSA-N Arg-Glu-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)NCC(O)=O PBSOQGZLPFVXPU-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- QAXCZGMLVICQKS-SRVKXCTJSA-N Arg-Glu-His Chemical compound C1=C(NC=N1)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)O)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)N QAXCZGMLVICQKS-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- GNYUVVJYGJFKHN-RVMXOQNASA-N Arg-Ile-Pro Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)N GNYUVVJYGJFKHN-RVMXOQNASA-N 0.000 description 1
- JQFZHHSQMKZLRU-IUCAKERBSA-N Arg-Lys Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCCN=C(N)N JQFZHHSQMKZLRU-IUCAKERBSA-N 0.000 description 1
- AMIQZQAAYGYKOP-FXQIFTODSA-N Arg-Ser-Asn Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O AMIQZQAAYGYKOP-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- CGWVCWFQGXOUSJ-ULQDDVLXSA-N Arg-Tyr-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O CGWVCWFQGXOUSJ-ULQDDVLXSA-N 0.000 description 1
- BXUHCIXDSWRSBS-CIUDSAMLSA-N Asn-Leu-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O BXUHCIXDSWRSBS-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- JLNFZLNDHONLND-GARJFASQSA-N Asn-Leu-Pro Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)N JLNFZLNDHONLND-GARJFASQSA-N 0.000 description 1
- KZYSHAMXEBPJBD-JRQIVUDYSA-N Asn-Thr-Tyr Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(O)=O KZYSHAMXEBPJBD-JRQIVUDYSA-N 0.000 description 1
- XEGZSHSPQNDNRH-JRQIVUDYSA-N Asn-Tyr-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O XEGZSHSPQNDNRH-JRQIVUDYSA-N 0.000 description 1
- CBHVAFXKOYAHOY-NHCYSSNCSA-N Asn-Val-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O CBHVAFXKOYAHOY-NHCYSSNCSA-N 0.000 description 1
- AXXCUABIFZPKPM-BQBZGAKWSA-N Asp-Arg-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(O)=O AXXCUABIFZPKPM-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- UGKZHCBLMLSANF-CIUDSAMLSA-N Asp-Asn-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O UGKZHCBLMLSANF-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- TVVYVAUGRHNTGT-UGYAYLCHSA-N Asp-Asp-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O TVVYVAUGRHNTGT-UGYAYLCHSA-N 0.000 description 1
- CELPEWWLSXMVPH-CIUDSAMLSA-N Asp-Asp-Lys Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CELPEWWLSXMVPH-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- GHODABZPVZMWCE-FXQIFTODSA-N Asp-Glu-Glu Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O GHODABZPVZMWCE-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- RWHHSFSWKFBTCF-KKUMJFAQSA-N Asp-His-Phe Chemical compound C1=CC=C(C=C1)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC2=CN=CN2)NC(=O)[C@H](CC(=O)O)N RWHHSFSWKFBTCF-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 1
- DWOGMPWRQQWPPF-GUBZILKMSA-N Asp-Leu-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O DWOGMPWRQQWPPF-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- 241000972773 Aulopiformes Species 0.000 description 1
- 101100238763 Bacillus subtilis hsdRM gene Proteins 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102400000748 Beta-endorphin Human genes 0.000 description 1
- 101800005049 Beta-endorphin Proteins 0.000 description 1
- 101100328086 Caenorhabditis elegans cla-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100289894 Caenorhabditis elegans lys-7 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100148606 Caenorhabditis elegans pst-1 gene Proteins 0.000 description 1
- BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N Calcium cation Chemical compound [Ca+2] BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 108091033380 Coding strand Proteins 0.000 description 1
- NQSUTVRXXBGVDQ-LKXGYXEUSA-N Cys-Asn-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O NQSUTVRXXBGVDQ-LKXGYXEUSA-N 0.000 description 1
- VFGADOJXRLWTBU-JBDRJPRFSA-N Cys-Ile-Ser Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CS)N VFGADOJXRLWTBU-JBDRJPRFSA-N 0.000 description 1
- IZUNQDRIAOLWCN-YUMQZZPRSA-N Cys-Leu-Gly Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)NCC(=O)O)NC(=O)[C@H](CS)N IZUNQDRIAOLWCN-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- 102000018832 Cytochromes Human genes 0.000 description 1
- 108010052832 Cytochromes Proteins 0.000 description 1
- 108010008286 DNA nucleotidylexotransferase Proteins 0.000 description 1
- 238000012270 DNA recombination Methods 0.000 description 1
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 1
- 102100029764 DNA-directed DNA/RNA polymerase mu Human genes 0.000 description 1
- 108010092160 Dactinomycin Proteins 0.000 description 1
- 101710088194 Dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 102000007260 Deoxyribonuclease I Human genes 0.000 description 1
- 108010008532 Deoxyribonuclease I Proteins 0.000 description 1
- 235000006149 Eugenia stipitata Nutrition 0.000 description 1
- 108060002716 Exonuclease Proteins 0.000 description 1
- 229920001917 Ficoll Polymers 0.000 description 1
- OPAINBJQDQTGJY-JGVFFNPUSA-N Glu-Gly-Pro Chemical compound C1C[C@@H](N(C1)C(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(=O)O)N)C(=O)O OPAINBJQDQTGJY-JGVFFNPUSA-N 0.000 description 1
- ZGKXAUIVGIBISK-SZMVWBNQSA-N Glu-His-Trp Chemical compound N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](Cc1c[nH]cn1)C(=O)N[C@@H](Cc1c[nH]c2ccccc12)C(O)=O ZGKXAUIVGIBISK-SZMVWBNQSA-N 0.000 description 1
- QDMVXRNLOPTPIE-WDCWCFNPSA-N Glu-Lys-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O QDMVXRNLOPTPIE-WDCWCFNPSA-N 0.000 description 1
- KXRORHJIRAOQPG-SOUVJXGZSA-N Glu-Tyr-Pro Chemical compound C1C[C@@H](N(C1)C(=O)[C@H](CC2=CC=C(C=C2)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)O)N)C(=O)O KXRORHJIRAOQPG-SOUVJXGZSA-N 0.000 description 1
- JLXVRFDTDUGQEE-YFKPBYRVSA-N Gly-Arg Chemical compound NCC(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCN=C(N)N JLXVRFDTDUGQEE-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- UPOJUWHGMDJUQZ-IUCAKERBSA-N Gly-Arg-Arg Chemical compound NC(=N)NCCC[C@H](NC(=O)CN)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O UPOJUWHGMDJUQZ-IUCAKERBSA-N 0.000 description 1
- OVSKVOOUFAKODB-UWVGGRQHSA-N Gly-Arg-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)CCCN=C(N)N OVSKVOOUFAKODB-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 1
- LLXVQPKEQQCISF-YUMQZZPRSA-N Gly-Asp-His Chemical compound C1=C(NC=N1)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)O)NC(=O)CN LLXVQPKEQQCISF-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- FZQLXNIMCPJVJE-YUMQZZPRSA-N Gly-Asp-Leu Chemical compound [H]NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O FZQLXNIMCPJVJE-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- LXXLEUBUOMCAMR-NKWVEPMBSA-N Gly-Asp-Pro Chemical compound C1C[C@@H](N(C1)C(=O)[C@H](CC(=O)O)NC(=O)CN)C(=O)O LXXLEUBUOMCAMR-NKWVEPMBSA-N 0.000 description 1
- HDNXXTBKOJKWNN-WDSKDSINSA-N Gly-Glu-Asn Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O HDNXXTBKOJKWNN-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- JSNNHGHYGYMVCK-XVKPBYJWSA-N Gly-Glu-Val Chemical compound [H]NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O JSNNHGHYGYMVCK-XVKPBYJWSA-N 0.000 description 1
- OLPPXYMMIARYAL-QMMMGPOBSA-N Gly-Gly-Val Chemical compound CC(C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)CNC(=O)CN OLPPXYMMIARYAL-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- ALOBJFDJTMQQPW-ONGXEEELSA-N Gly-His-Val Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC1=CN=CN1)NC(=O)CN ALOBJFDJTMQQPW-ONGXEEELSA-N 0.000 description 1
- BHPQOIPBLYJNAW-NGZCFLSTSA-N Gly-Ile-Pro Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)NC(=O)CN BHPQOIPBLYJNAW-NGZCFLSTSA-N 0.000 description 1
- DKEXFJVMVGETOO-LURJTMIESA-N Gly-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)CN DKEXFJVMVGETOO-LURJTMIESA-N 0.000 description 1
- LRQXRHGQEVWGPV-NHCYSSNCSA-N Gly-Leu-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)CN LRQXRHGQEVWGPV-NHCYSSNCSA-N 0.000 description 1
- BCCRXDTUTZHDEU-VKHMYHEASA-N Gly-Ser Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O BCCRXDTUTZHDEU-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- YOBGUCWZPXJHTN-BQBZGAKWSA-N Gly-Ser-Arg Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCN=C(N)N YOBGUCWZPXJHTN-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- VNNRLUNBJSWZPF-ZKWXMUAHSA-N Gly-Ser-Ile Chemical compound [H]NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(O)=O VNNRLUNBJSWZPF-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 1
- POJJAZJHBGXEGM-YUMQZZPRSA-N Gly-Ser-Lys Chemical compound C(CCN)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)CN POJJAZJHBGXEGM-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- DNAZKGFYFRGZIH-QWRGUYRKSA-N Gly-Tyr-Ser Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)CC1=CC=C(O)C=C1 DNAZKGFYFRGZIH-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 1
- RYAOJUMWLWUGNW-QMMMGPOBSA-N Gly-Val-Gly Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)NCC(O)=O RYAOJUMWLWUGNW-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- FNXSYBOHALPRHV-ONGXEEELSA-N Gly-Val-Lys Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCCN FNXSYBOHALPRHV-ONGXEEELSA-N 0.000 description 1
- JBCLFWXMTIKCCB-UHFFFAOYSA-N H-Gly-Phe-OH Natural products NCC(=O)NC(C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 JBCLFWXMTIKCCB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RGPWUJOMKFYFSR-QWRGUYRKSA-N His-Gly-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O RGPWUJOMKFYFSR-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 1
- RAVLQPXCMRCLKT-KBPBESRZSA-N His-Gly-Phe Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(O)=O RAVLQPXCMRCLKT-KBPBESRZSA-N 0.000 description 1
- FYTCLUIYTYFGPT-YUMQZZPRSA-N His-Gly-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O FYTCLUIYTYFGPT-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- ZRSJXIKQXUGKRB-TUBUOCAGSA-N His-Ile-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O ZRSJXIKQXUGKRB-TUBUOCAGSA-N 0.000 description 1
- SVVULKPWDBIPCO-BZSNNMDCSA-N His-Phe-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O SVVULKPWDBIPCO-BZSNNMDCSA-N 0.000 description 1
- BZAQOPHNBFOOJS-DCAQKATOSA-N His-Pro-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O BZAQOPHNBFOOJS-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- VCBWXASUBZIFLQ-IHRRRGAJSA-N His-Pro-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O VCBWXASUBZIFLQ-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 1
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 1
- 102000002265 Human Growth Hormone Human genes 0.000 description 1
- 108010000521 Human Growth Hormone Proteins 0.000 description 1
- 239000000854 Human Growth Hormone Substances 0.000 description 1
- 241000125026 Humbertiella henrici Species 0.000 description 1
- YKRIXHPEIZUDDY-GMOBBJLQSA-N Ile-Asn-Arg Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCN=C(N)N YKRIXHPEIZUDDY-GMOBBJLQSA-N 0.000 description 1
- BEWFWZRGBDVXRP-PEFMBERDSA-N Ile-Glu-Asn Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O BEWFWZRGBDVXRP-PEFMBERDSA-N 0.000 description 1
- JXMSHKFPDIUYGS-SIUGBPQLSA-N Ile-Glu-Tyr Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(=O)O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(C=C1)O)C(=O)O)N JXMSHKFPDIUYGS-SIUGBPQLSA-N 0.000 description 1
- GQKSJYINYYWPMR-NGZCFLSTSA-N Ile-Gly-Pro Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)NCC(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)N GQKSJYINYYWPMR-NGZCFLSTSA-N 0.000 description 1
- YSGBJIQXTIVBHZ-AJNGGQMLSA-N Ile-Lys-Leu Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O YSGBJIQXTIVBHZ-AJNGGQMLSA-N 0.000 description 1
- UDBPXJNOEWDBDF-XUXIUFHCSA-N Ile-Lys-Val Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)O)N UDBPXJNOEWDBDF-XUXIUFHCSA-N 0.000 description 1
- XLXPYSDGMXTTNQ-DKIMLUQUSA-N Ile-Phe-Leu Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](Cc1ccccc1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O XLXPYSDGMXTTNQ-DKIMLUQUSA-N 0.000 description 1
- XLXPYSDGMXTTNQ-UHFFFAOYSA-N Ile-Phe-Leu Natural products CCC(C)C(N)C(=O)NC(C(=O)NC(CC(C)C)C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 XLXPYSDGMXTTNQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PXKACEXYLPBMAD-JBDRJPRFSA-N Ile-Ser-Ser Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)O)N PXKACEXYLPBMAD-JBDRJPRFSA-N 0.000 description 1
- RQZFWBLDTBDEOF-RNJOBUHISA-N Ile-Val-Pro Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)N RQZFWBLDTBDEOF-RNJOBUHISA-N 0.000 description 1
- 108010065920 Insulin Lispro Proteins 0.000 description 1
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 description 1
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 description 1
- LHSGPCFBGJHPCY-UHFFFAOYSA-N L-leucine-L-tyrosine Natural products CC(C)CC(N)C(=O)NC(C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 LHSGPCFBGJHPCY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- LZDNBBYBDGBADK-UHFFFAOYSA-N L-valyl-L-tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(NC(=O)C(N)C(C)C)C(O)=O)=CNC2=C1 LZDNBBYBDGBADK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- 235000000391 Lepidium draba Nutrition 0.000 description 1
- OIARJGNVARWKFP-YUMQZZPRSA-N Leu-Asn-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)NCC(O)=O OIARJGNVARWKFP-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- ZDSNOSQHMJBRQN-SRVKXCTJSA-N Leu-Asp-His Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)N[C@@H](CC1=CN=CN1)C(=O)O)N ZDSNOSQHMJBRQN-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- XVSJMWYYLHPDKY-DCAQKATOSA-N Leu-Asp-Met Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(O)=O XVSJMWYYLHPDKY-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- RVVBWTWPNFDYBE-SRVKXCTJSA-N Leu-Glu-Arg Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O RVVBWTWPNFDYBE-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- PRZVBIAOPFGAQF-SRVKXCTJSA-N Leu-Glu-Met Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(O)=O PRZVBIAOPFGAQF-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- QJXHMYMRGDOHRU-NHCYSSNCSA-N Leu-Ile-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)NCC(O)=O QJXHMYMRGDOHRU-NHCYSSNCSA-N 0.000 description 1
- FIICHHJDINDXKG-IHPCNDPISA-N Leu-Lys-Trp Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC1=CNC2=C1C=CC=C2)C(O)=O FIICHHJDINDXKG-IHPCNDPISA-N 0.000 description 1
- CHJKEDSZNSONPS-DCAQKATOSA-N Leu-Pro-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O CHJKEDSZNSONPS-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- AAKRWBIIGKPOKQ-ONGXEEELSA-N Leu-Val-Gly Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)NCC(O)=O AAKRWBIIGKPOKQ-ONGXEEELSA-N 0.000 description 1
- QYOXSYXPHUHOJR-GUBZILKMSA-N Lys-Asn-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O QYOXSYXPHUHOJR-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- JYXBNQOKPRQNQS-YTFOTSKYSA-N Lys-Ile-Ile Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(O)=O JYXBNQOKPRQNQS-YTFOTSKYSA-N 0.000 description 1
- XREQQOATSMMAJP-MGHWNKPDSA-N Lys-Ile-Tyr Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(O)=O XREQQOATSMMAJP-MGHWNKPDSA-N 0.000 description 1
- MUXNCRWTWBMNHX-SRVKXCTJSA-N Lys-Leu-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O MUXNCRWTWBMNHX-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- YXPJCVNIDDKGOE-MELADBBJSA-N Lys-Lys-Pro Chemical compound C1C[C@@H](N(C1)C(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CCCCN)N)C(=O)O YXPJCVNIDDKGOE-MELADBBJSA-N 0.000 description 1
- QVTDVTONTRSQMF-WDCWCFNPSA-N Lys-Thr-Glu Chemical compound OC(=O)CC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H]([C@H](O)C)NC(=O)[C@@H](N)CCCCN QVTDVTONTRSQMF-WDCWCFNPSA-N 0.000 description 1
- NQOQDINRVQCAKD-ULQDDVLXSA-N Lys-Tyr-Met Chemical compound CSCC[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC1=CC=C(C=C1)O)NC(=O)[C@H](CCCCN)N NQOQDINRVQCAKD-ULQDDVLXSA-N 0.000 description 1
- QLFAPXUXEBAWEK-NHCYSSNCSA-N Lys-Val-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O QLFAPXUXEBAWEK-NHCYSSNCSA-N 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- JHKXZYLNVJRAAJ-WDSKDSINSA-N Met-Ala Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O JHKXZYLNVJRAAJ-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- 239000011837 N,N-methylenebisacrylamide Substances 0.000 description 1
- PESQCPHRXOFIPX-UHFFFAOYSA-N N-L-methionyl-L-tyrosine Natural products CSCCC(N)C(=O)NC(C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 PESQCPHRXOFIPX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AMQJEAYHLZJPGS-UHFFFAOYSA-N N-Pentanol Chemical compound CCCCCO AMQJEAYHLZJPGS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KZNQNBZMBZJQJO-UHFFFAOYSA-N N-glycyl-L-proline Natural products NCC(=O)N1CCCC1C(O)=O KZNQNBZMBZJQJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010066427 N-valyltryptophan Proteins 0.000 description 1
- 101100395023 Neurospora crassa (strain ATCC 24698 / 74-OR23-1A / CBS 708.71 / DSM 1257 / FGSC 987) his-7 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000320412 Ogataea angusta Species 0.000 description 1
- 241000826199 Ogataea wickerhamii Species 0.000 description 1
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 1
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 1
- DOXQMJCSSYZSNM-BZSNNMDCSA-N Phe-Lys-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O DOXQMJCSSYZSNM-BZSNNMDCSA-N 0.000 description 1
- YOFKMVUAZGPFCF-IHRRRGAJSA-N Phe-Met-Asn Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O YOFKMVUAZGPFCF-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 1
- LYCOGHUNJCETDK-JYJNAYRXSA-N Phe-Met-Met Chemical compound CSCC[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC1=CC=CC=C1)N LYCOGHUNJCETDK-JYJNAYRXSA-N 0.000 description 1
- ODGNUUUDJONJSC-UFYCRDLUSA-N Phe-Pro-Tyr Chemical compound C1C[C@H](N(C1)C(=O)[C@H](CC2=CC=CC=C2)N)C(=O)N[C@@H](CC3=CC=C(C=C3)O)C(=O)O ODGNUUUDJONJSC-UFYCRDLUSA-N 0.000 description 1
- WEDZFLRYSIDIRX-IHRRRGAJSA-N Phe-Ser-Arg Chemical compound NC(=N)NCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 WEDZFLRYSIDIRX-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 1
- MHNBYYFXWDUGBW-RPTUDFQQSA-N Phe-Tyr-Thr Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC1=CC=C(C=C1)O)NC(=O)[C@H](CC2=CC=CC=C2)N)O MHNBYYFXWDUGBW-RPTUDFQQSA-N 0.000 description 1
- FXEKNHAJIMHRFJ-ULQDDVLXSA-N Phe-Val-His Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CN=CN1)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC2=CC=CC=C2)N FXEKNHAJIMHRFJ-ULQDDVLXSA-N 0.000 description 1
- 229920002562 Polyethylene Glycol 3350 Polymers 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- 241000866625 Polymorphus Species 0.000 description 1
- 108010021757 Polynucleotide 5'-Hydroxyl-Kinase Proteins 0.000 description 1
- 102000008422 Polynucleotide 5'-hydroxyl-kinase Human genes 0.000 description 1
- 239000004743 Polypropylene Substances 0.000 description 1
- CJZTUKSFZUSNCC-FXQIFTODSA-N Pro-Asp-Asn Chemical compound NC(=O)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@@H]1CCCN1 CJZTUKSFZUSNCC-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- GDXZRWYXJSGWIV-GMOBBJLQSA-N Pro-Asp-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)O)NC(=O)[C@@H]1CCCN1 GDXZRWYXJSGWIV-GMOBBJLQSA-N 0.000 description 1
- HXOLCSYHGRNXJJ-IHRRRGAJSA-N Pro-Asp-Phe Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(O)=O HXOLCSYHGRNXJJ-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 1
- ULIWFCCJIOEHMU-BQBZGAKWSA-N Pro-Gly-Asp Chemical compound OC(=O)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H]1CCCN1 ULIWFCCJIOEHMU-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- ZKQOUHVVXABNDG-IUCAKERBSA-N Pro-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H]1CCCN1 ZKQOUHVVXABNDG-IUCAKERBSA-N 0.000 description 1
- RUDOLGWDSKQQFF-DCAQKATOSA-N Pro-Leu-Asn Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O RUDOLGWDSKQQFF-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- WIPAMEKBSHNFQE-IUCAKERBSA-N Pro-Met-Gly Chemical compound CSCC[C@@H](C(=O)NCC(=O)O)NC(=O)[C@@H]1CCCN1 WIPAMEKBSHNFQE-IUCAKERBSA-N 0.000 description 1
- AUYKOPJPKUCYHE-SRVKXCTJSA-N Pro-Met-Val Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@@H]1CCCN1 AUYKOPJPKUCYHE-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- LEIKGVHQTKHOLM-IUCAKERBSA-N Pro-Pro-Gly Chemical compound OC(=O)CNC(=O)[C@@H]1CCCN1C(=O)[C@H]1NCCC1 LEIKGVHQTKHOLM-IUCAKERBSA-N 0.000 description 1
- FIODMZKLZFLYQP-GUBZILKMSA-N Pro-Val-Ser Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O FIODMZKLZFLYQP-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- 108010076181 Proinsulin Proteins 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- MUPFEKGTMRGPLJ-RMMQSMQOSA-N Raffinose Natural products O(C[C@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O[C@@]2(CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O2)O1)[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 MUPFEKGTMRGPLJ-RMMQSMQOSA-N 0.000 description 1
- 101150014136 SUC2 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000235346 Schizosaccharomyces Species 0.000 description 1
- YUSRGTQIPCJNHQ-CIUDSAMLSA-N Ser-Arg-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O YUSRGTQIPCJNHQ-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- LTFSLKWFMWZEBD-IMJSIDKUSA-N Ser-Asn Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(N)=O LTFSLKWFMWZEBD-IMJSIDKUSA-N 0.000 description 1
- DKKGAAJTDKHWOD-BIIVOSGPSA-N Ser-Asn-Pro Chemical compound C1C[C@@H](N(C1)C(=O)[C@H](CC(=O)N)NC(=O)[C@H](CO)N)C(=O)O DKKGAAJTDKHWOD-BIIVOSGPSA-N 0.000 description 1
- RNFKSBPHLTZHLU-WHFBIAKZSA-N Ser-Cys-Gly Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCC(=O)O)N)O RNFKSBPHLTZHLU-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- VQBCMLMPEWPUTB-ACZMJKKPSA-N Ser-Glu-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O VQBCMLMPEWPUTB-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 1
- JFWDJFULOLKQFY-QWRGUYRKSA-N Ser-Gly-Phe Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(O)=O JFWDJFULOLKQFY-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 1
- LQESNKGTTNHZPZ-GHCJXIJMSA-N Ser-Ile-Asn Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O LQESNKGTTNHZPZ-GHCJXIJMSA-N 0.000 description 1
- LRWBCWGEUCKDTN-BJDJZHNGSA-N Ser-Lys-Ile Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(O)=O LRWBCWGEUCKDTN-BJDJZHNGSA-N 0.000 description 1
- LRZLZIUXQBIWTB-KATARQTJSA-N Ser-Lys-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O LRZLZIUXQBIWTB-KATARQTJSA-N 0.000 description 1
- XKFJENWJGHMDLI-QWRGUYRKSA-N Ser-Phe-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)NCC(O)=O XKFJENWJGHMDLI-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 1
- PJIQEIFXZPCWOJ-FXQIFTODSA-N Ser-Pro-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O PJIQEIFXZPCWOJ-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- QPPYAWVLAVXISR-DCAQKATOSA-N Ser-Pro-His Chemical compound C1C[C@H](N(C1)C(=O)[C@H](CO)N)C(=O)N[C@@H](CC2=CN=CN2)C(=O)O QPPYAWVLAVXISR-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- GYDFRTRSSXOZCR-ACZMJKKPSA-N Ser-Ser-Glu Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(O)=O GYDFRTRSSXOZCR-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 1
- UYLKOSODXYSWMQ-XGEHTFHBSA-N Ser-Thr-Met Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CO)N)O UYLKOSODXYSWMQ-XGEHTFHBSA-N 0.000 description 1
- SGZVZUCRAVSPKQ-FXQIFTODSA-N Ser-Val-Cys Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CO)N SGZVZUCRAVSPKQ-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- 102000005157 Somatostatin Human genes 0.000 description 1
- 108010056088 Somatostatin Proteins 0.000 description 1
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 1
- 239000008049 TAE buffer Substances 0.000 description 1
- 239000008051 TBE buffer Substances 0.000 description 1
- JZRWCGZRTZMZEH-UHFFFAOYSA-N Thiamine Natural products CC1=C(CCO)SC=[N+]1CC1=CN=C(C)N=C1N JZRWCGZRTZMZEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MMTOHPRBJKEZHT-BWBBJGPYSA-N Thr-Cys-Ser Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O MMTOHPRBJKEZHT-BWBBJGPYSA-N 0.000 description 1
- LGNBRHZANHMZHK-NUMRIWBASA-N Thr-Glu-Asp Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(=O)O)C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)O)N)O LGNBRHZANHMZHK-NUMRIWBASA-N 0.000 description 1
- XOTBWOCSLMBGMF-SUSMZKCASA-N Thr-Glu-Thr Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O XOTBWOCSLMBGMF-SUSMZKCASA-N 0.000 description 1
- QQWNRERCGGZOKG-WEDXCCLWSA-N Thr-Gly-Leu Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O QQWNRERCGGZOKG-WEDXCCLWSA-N 0.000 description 1
- UUSQVWOVUYMLJA-PPCPHDFISA-N Thr-Lys-Ile Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(O)=O UUSQVWOVUYMLJA-PPCPHDFISA-N 0.000 description 1
- CGCMNOIQVAXYMA-UNQGMJICSA-N Thr-Met-Phe Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(O)=O CGCMNOIQVAXYMA-UNQGMJICSA-N 0.000 description 1
- STUAPCLEDMKXKL-LKXGYXEUSA-N Thr-Ser-Asn Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O STUAPCLEDMKXKL-LKXGYXEUSA-N 0.000 description 1
- BCYUHPXBHCUYBA-CUJWVEQBSA-N Thr-Ser-His Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](Cc1cnc[nH]1)C(O)=O BCYUHPXBHCUYBA-CUJWVEQBSA-N 0.000 description 1
- DSGIVWSDDRDJIO-ZXXMMSQZSA-N Thr-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O DSGIVWSDDRDJIO-ZXXMMSQZSA-N 0.000 description 1
- VEENWOSZGWWKHW-SZZJOZGLSA-N Thr-Trp-His Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CNC2=CC=CC=C21)C(=O)N[C@@H](CC3=CN=CN3)C(=O)O)N)O VEENWOSZGWWKHW-SZZJOZGLSA-N 0.000 description 1
- QNXZCKMXHPULME-ZNSHCXBVSA-N Thr-Val-Pro Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)N)O QNXZCKMXHPULME-ZNSHCXBVSA-N 0.000 description 1
- 108010046075 Thymosin Proteins 0.000 description 1
- 102000007501 Thymosin Human genes 0.000 description 1
- 102000004357 Transferases Human genes 0.000 description 1
- 108090000992 Transferases Proteins 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SLCSPPCQWUHPPO-JYJNAYRXSA-N Tyr-Glu-Lys Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 SLCSPPCQWUHPPO-JYJNAYRXSA-N 0.000 description 1
- HIINQLBHPIQYHN-JTQLQIEISA-N Tyr-Gly-Gly Chemical compound OC(=O)CNC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 HIINQLBHPIQYHN-JTQLQIEISA-N 0.000 description 1
- QHLIUFUEUDFAOT-MGHWNKPDSA-N Tyr-Leu-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC1=CC=C(C=C1)O)N QHLIUFUEUDFAOT-MGHWNKPDSA-N 0.000 description 1
- RGYCVIZZTUBSSG-JYJNAYRXSA-N Tyr-Pro-Val Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O RGYCVIZZTUBSSG-JYJNAYRXSA-N 0.000 description 1
- ITDWWLTTWRRLCC-KJEVXHAQSA-N Tyr-Thr-Arg Chemical compound NC(N)=NCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H]([C@H](O)C)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 ITDWWLTTWRRLCC-KJEVXHAQSA-N 0.000 description 1
- QVYFTFIBKCDHIE-ACRUOGEOSA-N Tyr-Tyr-Lys Chemical compound C1=CC(=CC=C1C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC2=CC=C(C=C2)O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O)N)O QVYFTFIBKCDHIE-ACRUOGEOSA-N 0.000 description 1
- MUPFEKGTMRGPLJ-UHFFFAOYSA-N UNPD196149 Natural products OC1C(O)C(CO)OC1(CO)OC1C(O)C(O)C(O)C(COC2C(C(O)C(O)C(CO)O2)O)O1 MUPFEKGTMRGPLJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091023045 Untranslated Region Proteins 0.000 description 1
- DNOOLPROHJWCSQ-RCWTZXSCSA-N Val-Arg-Thr Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O DNOOLPROHJWCSQ-RCWTZXSCSA-N 0.000 description 1
- HZYOWMGWKKRMBZ-BYULHYEWSA-N Val-Asp-Asp Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)O)N HZYOWMGWKKRMBZ-BYULHYEWSA-N 0.000 description 1
- GBESYURLQOYWLU-LAEOZQHASA-N Val-Glu-Asp Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(=O)O)C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)O)N GBESYURLQOYWLU-LAEOZQHASA-N 0.000 description 1
- ROLGIBMFNMZANA-GVXVVHGQSA-N Val-Glu-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)O)NC(=O)[C@H](C(C)C)N ROLGIBMFNMZANA-GVXVVHGQSA-N 0.000 description 1
- OXGVAUFVTOPFFA-XPUUQOCRSA-N Val-Gly-Cys Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O)N OXGVAUFVTOPFFA-XPUUQOCRSA-N 0.000 description 1
- SYSWVVCYSXBVJG-RHYQMDGZSA-N Val-Leu-Thr Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C(C)C)N)O SYSWVVCYSXBVJG-RHYQMDGZSA-N 0.000 description 1
- DIOSYUIWOQCXNR-ONGXEEELSA-N Val-Lys-Gly Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)NCC(O)=O DIOSYUIWOQCXNR-ONGXEEELSA-N 0.000 description 1
- PHZGFLFMGLXCFG-FHWLQOOXSA-N Val-Lys-Trp Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC1=CNC2=CC=CC=C21)C(=O)O)N PHZGFLFMGLXCFG-FHWLQOOXSA-N 0.000 description 1
- SSYBNWFXCFNRFN-GUBZILKMSA-N Val-Pro-Ser Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O SSYBNWFXCFNRFN-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- GUIYPEKUEMQBIK-JSGCOSHPSA-N Val-Tyr-Gly Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](Cc1ccc(O)cc1)C(=O)NCC(O)=O GUIYPEKUEMQBIK-JSGCOSHPSA-N 0.000 description 1
- 241001074363 Zaedyus Species 0.000 description 1
- QOTAEASRCGCJDN-UHFFFAOYSA-N [C].CO Chemical compound [C].CO QOTAEASRCGCJDN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HGEVZDLYZYVYHD-UHFFFAOYSA-N acetic acid;2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;2-[2-[bis(carboxymethyl)amino]ethyl-(carboxymethyl)amino]acetic acid Chemical compound CC(O)=O.OCC(N)(CO)CO.OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O HGEVZDLYZYVYHD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000061 acid fraction Substances 0.000 description 1
- DPKHZNPWBDQZCN-UHFFFAOYSA-N acridine orange free base Chemical compound C1=CC(N(C)C)=CC2=NC3=CC(N(C)C)=CC=C3C=C21 DPKHZNPWBDQZCN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930183665 actinomycin Natural products 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 230000006978 adaptation Effects 0.000 description 1
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 description 1
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 1
- 238000005273 aeration Methods 0.000 description 1
- 238000013019 agitation Methods 0.000 description 1
- 238000007605 air drying Methods 0.000 description 1
- 239000003513 alkali Substances 0.000 description 1
- 239000000908 ammonium hydroxide Substances 0.000 description 1
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 description 1
- 108010062796 arginyllysine Proteins 0.000 description 1
- 108010040443 aspartyl-aspartic acid Proteins 0.000 description 1
- 108010038633 aspartylglutamate Proteins 0.000 description 1
- 108010092854 aspartyllysine Proteins 0.000 description 1
- 230000002567 autonomic effect Effects 0.000 description 1
- DZBUGLKDJFMEHC-UHFFFAOYSA-N benzoquinolinylidene Natural products C1=CC=CC2=CC3=CC=CC=C3N=C21 DZBUGLKDJFMEHC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WOPZMFQRCBYPJU-NTXHZHDSSA-N beta-endorphin Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)CNC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CC=1C=CC(O)=CC=1)[C@@H](C)O)[C@@H](C)O)C(C)C)[C@@H](C)O)C1=CC=CC=C1 WOPZMFQRCBYPJU-NTXHZHDSSA-N 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 229910001424 calcium ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 150000001721 carbon Chemical class 0.000 description 1
- OSQPUMRCKZAIOZ-UHFFFAOYSA-N carbon dioxide;ethanol Chemical compound CCO.O=C=O OSQPUMRCKZAIOZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005018 casein Substances 0.000 description 1
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 229920002301 cellulose acetate Polymers 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- YTRQFSDWAXHJCC-UHFFFAOYSA-N chloroform;phenol Chemical compound ClC(Cl)Cl.OC1=CC=CC=C1 YTRQFSDWAXHJCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 239000002131 composite material Substances 0.000 description 1
- 239000013068 control sample Substances 0.000 description 1
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 108010060199 cysteinylproline Proteins 0.000 description 1
- WRTKMPONLHLBBL-KVQBGUIXSA-N dXTP Chemical compound O1[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C[C@@H]1N1C(NC(=O)NC2=O)=C2N=C1 WRTKMPONLHLBBL-KVQBGUIXSA-N 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 229960003964 deoxycholic acid Drugs 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 230000001627 detrimental effect Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 239000005546 dideoxynucleotide Substances 0.000 description 1
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 1
- VAYGXNSJCAHWJZ-UHFFFAOYSA-N dimethyl sulfate Chemical compound COS(=O)(=O)OC VAYGXNSJCAHWJZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000006073 displacement reaction Methods 0.000 description 1
- 230000006862 enzymatic digestion Effects 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 1
- 102000013165 exonuclease Human genes 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 235000019253 formic acid Nutrition 0.000 description 1
- 108010090279 galactose permease Proteins 0.000 description 1
- 108010063718 gamma-glutamylaspartic acid Proteins 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001279 glycosylating effect Effects 0.000 description 1
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 1
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 1
- JYPCXBJRLBHWME-UHFFFAOYSA-N glycyl-L-prolyl-L-arginine Natural products NCC(=O)N1CCCC1C(=O)NC(CCCN=C(N)N)C(O)=O JYPCXBJRLBHWME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010025801 glycyl-prolyl-arginine Proteins 0.000 description 1
- 108010015792 glycyllysine Proteins 0.000 description 1
- 108010081551 glycylphenylalanine Proteins 0.000 description 1
- 108010037850 glycylvaline Proteins 0.000 description 1
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 125000000487 histidyl group Chemical group [H]N([H])C(C(=O)O*)C([H])([H])C1=C([H])N([H])C([H])=N1 0.000 description 1
- 108010036413 histidylglycine Proteins 0.000 description 1
- 108010025306 histidylleucine Proteins 0.000 description 1
- 108010018006 histidylserine Proteins 0.000 description 1
- 101150102883 hsdM gene Proteins 0.000 description 1
- 101150085823 hsdR gene Proteins 0.000 description 1
- 238000001114 immunoprecipitation Methods 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 229940047124 interferons Drugs 0.000 description 1
- 210000002977 intracellular fluid Anatomy 0.000 description 1
- 108010031424 isoleucyl-prolyl-proline Proteins 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 238000011031 large-scale manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 108010012058 leucyltyrosine Proteins 0.000 description 1
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- MFPODHWDVFPSKC-BTVCFUMJSA-N methanol;(2r,3s,4r,5r)-2,3,4,5,6-pentahydroxyhexanal Chemical compound OC.OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)C=O MFPODHWDVFPSKC-BTVCFUMJSA-N 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 239000004570 mortar (masonry) Substances 0.000 description 1
- ZIUHHBKFKCYYJD-UHFFFAOYSA-N n,n'-methylenebisacrylamide Chemical compound C=CC(=O)NCNC(=O)C=C ZIUHHBKFKCYYJD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 1
- 210000002445 nipple Anatomy 0.000 description 1
- 210000003463 organelle Anatomy 0.000 description 1
- 230000010627 oxidative phosphorylation Effects 0.000 description 1
- 238000010979 pH adjustment Methods 0.000 description 1
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 1
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 description 1
- 229940127557 pharmaceutical product Drugs 0.000 description 1
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 229940050929 polyethylene glycol 3350 Drugs 0.000 description 1
- 229920001155 polypropylene Polymers 0.000 description 1
- 239000001267 polyvinylpyrrolidone Substances 0.000 description 1
- 229920000036 polyvinylpyrrolidone Polymers 0.000 description 1
- 235000013855 polyvinylpyrrolidone Nutrition 0.000 description 1
- 235000011056 potassium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 229910000160 potassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000008057 potassium phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 235000011009 potassium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 230000001376 precipitating effect Effects 0.000 description 1
- 108010089164 prolyl-leucyl-asparagyl-prolyl-lysine Proteins 0.000 description 1
- 108010079317 prolyl-tyrosine Proteins 0.000 description 1
- 108010015796 prolylisoleucine Proteins 0.000 description 1
- 108010090894 prolylleucine Proteins 0.000 description 1
- 235000019833 protease Nutrition 0.000 description 1
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010298 pulverizing process Methods 0.000 description 1
- 230000001698 pyrogenic effect Effects 0.000 description 1
- 150000003254 radicals Chemical class 0.000 description 1
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 1
- MUPFEKGTMRGPLJ-ZQSKZDJDSA-N raffinose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO[C@@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O2)O)O1 MUPFEKGTMRGPLJ-ZQSKZDJDSA-N 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000014493 regulation of gene expression Effects 0.000 description 1
- 210000001995 reticulocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 1
- 235000019515 salmon Nutrition 0.000 description 1
- 239000012723 sample buffer Substances 0.000 description 1
- 238000007789 sealing Methods 0.000 description 1
- 108010026333 seryl-proline Proteins 0.000 description 1
- 239000013605 shuttle vector Substances 0.000 description 1
- 238000010583 slow cooling Methods 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910000029 sodium carbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- FHHPUSMSKHSNKW-SMOYURAASA-M sodium deoxycholate Chemical compound [Na+].C([C@H]1CC2)[C@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@@H](CCC([O-])=O)C)[C@@]2(C)[C@@H](O)C1 FHHPUSMSKHSNKW-SMOYURAASA-M 0.000 description 1
- IHQKEDIOMGYHEB-UHFFFAOYSA-M sodium dimethylarsinate Chemical compound [Na+].C[As](C)([O-])=O IHQKEDIOMGYHEB-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- VVLFAAMTGMGYBS-UHFFFAOYSA-M sodium;4-[[4-(ethylamino)-3-methylphenyl]-(4-ethylimino-3-methylcyclohexa-2,5-dien-1-ylidene)methyl]-3-sulfobenzenesulfonate Chemical compound [Na+].C1=C(C)C(NCC)=CC=C1C(C=1C(=CC(=CC=1)S([O-])(=O)=O)S(O)(=O)=O)=C1C=C(C)C(=NCC)C=C1 VVLFAAMTGMGYBS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- NHXLMOGPVYXJNR-ATOGVRKGSA-N somatostatin Chemical compound C([C@H]1C(=O)N[C@H](C(N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC=CC=2)C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC=CC=2)C(=O)N[C@@H](CC=2C3=CC=CC=C3NC=2)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@H](C(=O)N1)[C@@H](C)O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](C)N)C(O)=O)=O)[C@H](O)C)C1=CC=CC=C1 NHXLMOGPVYXJNR-ATOGVRKGSA-N 0.000 description 1
- 229960000553 somatostatin Drugs 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 238000009987 spinning Methods 0.000 description 1
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 1
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 230000009469 supplementation Effects 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 235000019157 thiamine Nutrition 0.000 description 1
- KYMBYSLLVAOCFI-UHFFFAOYSA-N thiamine Chemical compound CC1=C(CCO)SCN1CC1=CN=C(C)N=C1N KYMBYSLLVAOCFI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960003495 thiamine Drugs 0.000 description 1
- 239000011721 thiamine Substances 0.000 description 1
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 1
- LCJVIYPJPCBWKS-NXPQJCNCSA-N thymosin Chemical compound SC[C@@H](N)C(=O)N[C@H](CO)C(=O)N[C@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@H](C(C)C)C(=O)N[C@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@H](C(C)C)C(=O)N[C@H](CO)C(=O)N[C@H](CO)C(=O)N[C@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@H]([C@H](C)O)C(=O)N[C@H](C(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N[C@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N[C@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N[C@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@H](C(C)C)C(=O)N[C@H](C(C)C)C(=O)N[C@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@H](CCC(O)=O)C(O)=O LCJVIYPJPCBWKS-NXPQJCNCSA-N 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000005030 transcription termination Effects 0.000 description 1
- 238000000844 transformation Methods 0.000 description 1
- 230000014621 translational initiation Effects 0.000 description 1
- 108700004896 tripeptide FEG Proteins 0.000 description 1
- UNXRWKVEANCORM-UHFFFAOYSA-N triphosphoric acid Chemical class OP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O UNXRWKVEANCORM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 108010080629 tryptophan-leucine Proteins 0.000 description 1
- 108010058119 tryptophyl-glycyl-glycine Proteins 0.000 description 1
- 108010017949 tyrosyl-glycyl-glycine Proteins 0.000 description 1
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 1
- NLIVDORGVGAOOJ-MAHBNPEESA-M xylene cyanol Chemical compound [Na+].C1=C(C)C(NCC)=CC=C1C(\C=1C(=CC(OS([O-])=O)=CC=1)OS([O-])=O)=C\1C=C(C)\C(=[NH+]/CC)\C=C/1 NLIVDORGVGAOOJ-MAHBNPEESA-M 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
- C12N9/0006—Oxidoreductases (1.) acting on CH-OH groups as donors (1.1)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/67—General methods for enhancing the expression
- C12N15/68—Stabilisation of the vector
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
- C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
- C12N15/815—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts for yeasts other than Saccharomyces
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
Abstract
Description
A találmány a rekombináns DNS-biotechnológia területére vonatkozik. Egyik szempontja szerint a találmány olyan DNS-fragmensekkel foglalkozik, amelyek szabályozzák a DNS átírását hírvivő (messenger) RNS-sé, valamint a hírvivő RNS fehérjévé átfordításának (transzlációjának) beindítását és leállítását. Egy másik szempont szerint a találmány kifejeződő vektorokkal foglalkozik, amelyek magukba foglalják a fentebb leírt DNS-fragmenseket. Egy, még további szempont szerint a találmány a fentebb leírt kifejeződő vektorokkal transzformált új mikroorganizmusokkal foglalkozik. Egy további szempont szerint a találmány polipeptidek előállításával foglalkozik.The present invention relates to the field of recombinant DNA biotechnology. In one aspect, the invention relates to DNA fragments that control the transcription of DNA into messenger RNA and the initiation and termination of translation (translation) of messenger RNA into protein. In another aspect, the invention relates to expression vectors that include the DNA fragments described above. In yet another aspect, the invention relates to novel microorganisms transformed with the expression vectors described above. In another aspect, the invention relates to the production of polypeptides.
Ahogyan az elmúlt években a rekombináns DNStechnológia kifejlődött, a hasznos polipeptidek óriási választékának szabályozott termelése vált lehetővé mikroorganizmusok által. Több eukarióta polipeptidet, mint pl. humán növekedési hormont, leukocita interferonokat, humán inzulint és humán proinzulint már termelnek különböző mikroorganizmusokkal. A már kézben lévő technikák folyamatos alkalmazásától a jövőben azt várjuk, hogy lehetővé teszik további hasznos polipeptidek előállítását is mikroorganizmusokkal.As recombinant DNA technology has evolved in recent years, microorganisms have been able to regulate the production of a huge variety of useful polypeptides. More eukaryotic polypeptides, e.g. human growth hormone, leukocyte interferons, human insulin and human proinsulin are already produced by various microorganisms. The continued use of techniques already in the art is expected in the future to allow the production of additional useful polypeptides by microorganisms.
A rekombináns DNS-technológia területén alkalmazott alapvető technikák ismertek azok számára, akik a szakterületen jártasak. A rekombináns DNS-technológia gyakorlati alkalmazásához a mikroorganizmus-gazdaszervezetek esetén előnyös, ha a következő elemek jelen vannak (a korlátozás igénye nélkül):Basic techniques of recombinant DNA technology are known to those of skill in the art. For the practical application of recombinant DNA technology in microorganism hosts, it is preferred that the following elements be present (without limitation):
(1) egy vagy több kívánt polipeptidet kódoló gén, megfelelő, a gazda-mikroorganizmusban való kifejeződéshez szükséges szabályozószekvenciákkal ellátva.(1) a gene encoding one or more desired polypeptides provided with appropriate regulatory sequences necessary for expression in the host microorganism.
(2) egy vektor, általában egy plazmid, amelybe a gént be lehet iktatni. A vektor arra szolgál, hogy biztosítsa a gén átvitelét a sejtbe és a DNS-szekvenciák megtartását a sejtben, valamint a fentebb említett gének kifejeződésének magas szintjét, és (3) egy megfelelő gazda-mikroorganizmus, amelybe a kívánt gént hordozó vektort transzformálni lehet, ahol a gazda-mikroorganizmusnak szintén van olyan sejtapparátusa, amely lehetővé teszi a beiktatott gén által kódolt információ kifejeződését.(2) a vector, usually a plasmid, into which the gene can be inserted. The vector serves to ensure the transfer of the gene to the cell and the retention of DNA sequences in the cell, as well as a high level of expression of the aforementioned genes, and (3) an appropriate host microorganism into which the vector carrying the desired gene can be transformed, the host microorganism also has a cell apparatus that allows expression of the information encoded by the inserted gene.
A rekombináns DNS-technológiában alkalmazott egyik alapelem a plazmid, amely bizonyos mikroorganizmusokban található extrakromoszomális, kettős szálú DNS. Ahol a plazmidok a természetben mikroorganizmusokban vannak jelen, ezek gyakran sejtenként többszörös kópiaszámmal fordulnak elő. A természetes módon előforduló plazmidokon kívül sokféle ember alkotta plazmidot vagy hibrid vektort állítottak elő. A plazmidDNS-ben kódolt információkba beletartozik az az információ is, amely ahhoz szükséges, hogy a plazmid reprodukálódjon a leánysejtekben, azaz egy autonóm módon replikálódó szekvenciára vagy a replikációs origóra van szükség. Egy vagy több fenotípusos szelekciós jellemző szintén kell, hogy legyen a plazmid-DNS-ben kódolt információban. A fenotípusos szelekciós jellemzők lehetővé teszik a szóban forgó plazmidot tartalmazó gazdasejt kiónjainak felismerését és szelektálását a sejtek szelektív tápkőzegekben történő növesztésével.One of the basic elements used in recombinant DNA technology is the plasmid, which is an extrachromosomal double-stranded DNA found in certain microorganisms. Where plasmids are naturally occurring in microorganisms, they often occur at multiple copy numbers per cell. In addition to the naturally occurring plasmids, a variety of human-made plasmids or hybrid vectors have been produced. The information encoded in plasmid DNA also includes the information necessary for the plasmid to be reproduced in daughter cells, i.e., an autonomously replicating sequence or origin of replication. One or more phenotypic selection traits must also be present in the information encoded in the plasmid DNA. The phenotypic selection characteristics allow the recognition and selection of clones of a host cell containing the plasmid of interest by growing the cells in selective media.
A plazmidok alkalmazhatósága azon a tényen alapszik, hogy ezeket fajlagosan lehet hasítani egyik vagy másik restrikciós endonukleázzal vagy restrikciós enzimmel, amelyek mindegyike egy fajlagos, egyedi helyet ismer fel a plazmid-DNS-en. Ezután a homológ géneket, heterológ géneket, vagyis a gazdaszervezettől eltérő organizmusokból származó géneket vagy génfragmenseket lehet beiktatni a plazmidba (-) a hasított plazmid és a kívánt genetikai anyag végeinek összekapcsolásával (a hasítási helynél vagy a hasítási helyhez szomszédos helyreállított végnél). Az így létrejött rekombináns DNS-anyagot nevezhetjük hibrid vektornak.The utility of plasmids is based on the fact that they can be specifically cleaved by one or another restriction endonuclease or restriction enzyme, each of which recognizes a specific, unique site on the plasmid DNA. The homologous genes, heterologous genes, i.e. genes or gene fragments from non-host organisms, can then be inserted into the plasmid (-) by linking the ends of the cleaved plasmid and the desired genetic material (at the cleavage site or at the end of the cleavage site). The resulting recombinant DNA material may be called a hybrid vector.
A DNS-rekombináciőt a gazda-mikroorganizmuson kívül hajtjuk végre. A létrejött hibrid vektort a gazdamikroorganizmusba a transzformációként ismert folyamat segítségével juttatjuk be. A transzformált mikroorganizmus növesztésével nagy mennyiségű hibrid vektort nyerhetünk. Ha a gént a kódolt DNS-üzenet transzkripcióját és transzlációját irányító részek szempontjából megfelelően iktatjuk be, az így létrejött hibrid vektor alkalmazható azon polipeptid-szekvencia termelésének irányítására, amelyet a beiktatott gén kódol. A polipeptid ilyen módon való termelését génkifejeződésnek nevezzük.DNA recombination is performed outside the host microorganism. The resulting hybrid vector is introduced into the host microorganism by a process known as transformation. By growing the transformed microorganism, a large amount of hybrid vectors can be obtained. If the gene is inserted appropriately for the transcriptional and translational control regions of the encoded DNA message, the resulting hybrid vector can be used to direct the production of the polypeptide sequence encoded by the inserted gene. Production of the polypeptide in this manner is termed gene expression.
A génkifejeződés a promotorterületként ismert DNS-területben kezdődik. A kifejeződés transzkripciós fázisában a DNS lecsavarodik, mintaként (templátként) szolgálva a hírvivő RNS szintéziséhez. Az RNS-polimeráz a promotorterülethez kötődik és végigutazik a sértetlen DNS mentén annak 3’ végétől 5’ végéig, átírva a kódoló szálban tartalmazott információt a hírvivő RNS-be (mRNS) az mRNS 5’ végétől a 3’ végéig. A hírvivő RNS azután a riboszőmákhoz kötődik, ahol az mRNS polipeptidlánccá fordítódik át. Minden egyes aminosavat egy nukleotid triplet vagy kodon kódol egy olyan szerkezeten belül, amelyet strukturgénnek nevezhetünk, ez a génnek egy olyan része, amely a kifejezett termék aminosav-szekvenciáját kódolja. Mivel mindegyik aminosav előállítását három nukleotid kódolja, a nukleotidszekvencia „leolvasása” három különböző úton lehetséges. Azt a leolvasó keretet, amely a kívánt polipeptid terméket kódolja, a megfelelő leolvasókeretnek nevezzük.Gene expression begins in the DNA region known as the promoter region. During the transcriptional phase of expression, DNA is twisted, serving as a template (template) for the synthesis of messenger RNA. The RNA polymerase binds to the promoter region and runs along the intact DNA from its 3 'end to its 5' end, transcribing the information contained in the coding strand into the messenger RNA (mRNA) from the 5 'end to the 3' end of the mRNA. The messenger RNA then binds to ribosomes, where the mRNA is translated into a polypeptide chain. Each amino acid is encoded by a nucleotide triplet or codon within a structure that can be termed a structural gene, a portion of the gene that encodes the amino acid sequence of the expressed product. Since the production of each amino acid is encoded by three nucleotides, there are three different ways to "read" the nucleotide sequence. The reading frame that encodes the desired polypeptide product is called the appropriate reading frame.
A promotorhoz való kötődés után az RNS-polimeráz először az mRNS egy 5’ vezető területét, majd egy transzlációs iniciáló vagy startkodont ír át, ezt követik a nukleotid kodonok magán a strukturgénen belül. Abból a célból, hogy a kívánt génterméket nyerjük, szükséges, hogy az indító- vagy startkodon korrektül (-) indítsa be a hírvivő RNS transzlációját a riboszómák által (a megfelelő leolvasókeretben). Végül a strukturgén végénél a stopkodonok íródnak át, amelyek azt idézik elő, hogy az mRNS bármilyen további szekvenciáit a riboszómák nem írják át, még ha további mRNS-szekvencíák képződtek is az RNS-polimeráznak a DNS-templáttal való kölcsönhatása révén. így a stopkodonok meghatározzák a transzláció végét, és ezáltal az aminosavak további beépülésének végét a polipepíid termékbe. A polipeptid termék a gazdasejtekAfter binding to the promoter, the RNA polymerase first transcribes a 5 'leader region of the mRNA, then a translational initiation or start codon, followed by the nucleotide codons within the structural gene itself. In order to obtain the desired gene product, it is necessary that the start or start codon correctly (-) initiate translation of the messenger RNA by the ribosomes (in the appropriate reading frame). Finally, the stop codons are transcribed at the end of the structural gene, causing any additional mRNA sequences not to be transcribed by the ribosomes, even if additional mRNA sequences were formed by interaction of the RNA polymerase with the DNA template. Thus, stop codons determine the end of translation, and thus the end of further incorporation of amino acids into the polypeptide product. The polypeptide product is a host cell
HU 205 627 Β lizálásával és a többi mikrobiális fehérjétől való megfelelő tisztítással nyerhető ki, vagy bizonyos körülmények között a fermentációs közeg tisztításával, amelyben a gazdasejt nőtt és amelybe a polipeptid termék kiválasztódott.This can be achieved by lysing the lysine and appropriate purification from other microbial proteins or, in some circumstances, purifying the fermentation medium in which the host cell has grown and into which the polypeptide product is excreted.
Gyakorlatilag a rekombináns DNS-technológia teljesen heterológ polipeptidek, azaz az adott mikroorganizmusban rendes körülmények közt nem található vagy nem termelődő polipeptidek kifejezésére képes mikroorganizmusokat eredményezhet - ez az úgynevezett közvetlen kifejeződés. Ki lehet azonban fejezni, vagy lehet termelni egy fúziós fehérjét is, azaz egy olyan heterológ polipeptidet, amely egy homológ polipeptid aminosav-szekvenciájának egy részéhez van fúzionálva, ahol a homológ polipeptid olyan polipeptidet jelent, amely megtalálható a vad típusú (nem transzformáit) mikroorganizmusban - ezt hívjuk közvetett kifejeződésnek. A közvetett kifejeződés esetén a kezdetben nyert fúziós fehérjetermék néha inaktív a szándékolt felhasználás szempontjából, amíg a fuzionált homológ/heterológ polipeptidet extracelluláris környezetben el nem hasítjuk. így pl. a metioningyökök cianogénbromidos elhasítása (-) szomatosztatint, timozin-alfa-l-et és a humán inzulin A és B lánckomponenseket eredményez (a fuzionált homológ/heterológ polipeptidekből), míg a meghatározott gyökök enzimes lehasítása bétaendorfint eredményez.In practice, recombinant DNA technology can result in microorganisms that are capable of expressing completely heterologous polypeptides, that is, polypeptides that are normally not present or produced in a given microorganism - a so-called direct expression. However, it is also possible to express or produce a fusion protein, that is, a heterologous polypeptide fused to a portion of the amino acid sequence of a homologous polypeptide, wherein the homologous polypeptide is a polypeptide found in a wild-type (untransformed) microorganism - this is called indirect expression. In the case of indirect expression, the initially obtained fusion protein product is sometimes inactive for its intended use until the fused homologous / heterologous polypeptide is cleaved in an extracellular environment. so e.g. cyanogen bromide cleavage of methionine residues results in (-) somatostatin, thymosin alfa-1 and human insulin A and B chain components (from fused homologous / heterologous polypeptides), whereas enzymatic cleavage of the specified radicals results in beta-endorphin.
Eddig az ipari erőfeszítések különböző polipeptidek termelésére rekombináns DNS-technológiát alkalmazva Escherichia colira, mint gazdaszervezetre irányulnak. Néhány helyzetben azonban az E. coli alkalmatlannak bizonyult gazdaszervezetnek. így pl. az E. coli egy sor toxikus pirogén faktort taralmaz, amelyeket el kell távolítani minden olyan polipeptidből, amely gyógyászati termékként használatos. A tisztítás hatékonysága természetesen minden egyes polipeptidnél változó. Ezen kívül az E. coli proteolitikus aktivitása nagy mértékben korlátozza bizonyos hasznos termékek kitermelését. Ezek és más megfontolások vezettek másfajta gazdaszervezetek iránti megnövekedett érdeklődéshez, főleg az eukariőta szervezetek polipeptid termékek előállítása céljára történő alkalmazása iránt. A polipeptid termékek eukariőta rendszerekben, pl. élesztőkben történő termeléséhez szükséges eszközök jelentős előnyöket jelentenek a prokarióta-rendszerek, mint pl. E. coli alkalmazásához viszonyítva a rekombináns DNS által kódolt polipeptidek előállításánál. Az élesztőket évszázadok óta alkalmazzák nagy léptékű fermentációkhoz, míg ezzel összehasonlítva az E. colifermentációk nagy léptékű fermentációi viszonylag nem régen jelentek meg. Az élesztők általában nagyobb sejtsűrűséggel nőnek mint a baktériumok, és könnyen adaptálhatók folyamatos fermentációs folyamatokhoz. Élesztők, mint a Pichia pastoris nagy sejtsűrűségű, azaz 100 g/1 sejtsűrűségen túli növesztését ismerteti Wagner a 4 414 329 lajstromszámú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban (bejelentő a Phillips Petroleum Co.). Az élesztő gazdaszervezetek további előnyei, hogy az organizmus több kritikus funkciója, pl. az oxidatív foszforilezés, organellumokon belül helyezkedik el, és ezáltal nincs kitéve azoknak az esetleges káros hatásoknak, amelyeket a vad típusú gazdasejtek számára idegen polipeptidnek az organizmus által végzett termelése okozhat. Az élesztők, lévén eukariőta organizmusok, képesek lehetnek a kifejezett polipeptid termékek glikozilezésére, ahol az ilyen glikozilezés fontos a polipeptid termék bioaktivitásához. Az is lehetséges, hogy eukariőta organizmusként az élesztők ugyanazokat a kodonokat részesítik előnyben, mint a magasabb rendű organizmusok, így az emlős génekből, vagy pl. az emlős mRNS-ből reverz transzkripcióval nyert komplementer DNS-ből (cDNS) származó kifejeződő termékek hatásosabb termelésére hajlamosak.So far, industrial efforts to produce various polypeptides using recombinant DNA technology have focused on Escherichia coli as a host. However, in some situations, E. coli proved to be unfit to host. so e.g. E. coli contains a number of toxic pyrogenic factors that must be removed from any polypeptide used as a pharmaceutical product. Of course, the purification efficiency will vary with each polypeptide. In addition, the proteolytic activity of E. coli greatly limits the yield of certain useful products. These and other considerations have led to increased interest in other types of hosts, particularly the use of eukaryotic organisms for the production of polypeptide products. The polypeptide products are found in eukaryotic systems, e.g. The tools needed for yeast production have significant advantages over prokaryotic systems such as yeast. Compared with E. coli in the production of polypeptides encoded by recombinant DNA. Yeasts have been used for large-scale fermentations for centuries, whereas, in comparison, large-scale fermentations of E. coliferations have been relatively recent. Yeasts usually grow at a higher cell density than bacteria and are easily adapted to continuous fermentation processes. Growth of yeasts such as Pichia pastoris at high cell densities, i.e., above 100 g / l, is described by Wagner in U.S. Patent No. 4,414,329 (filed by Phillips Petroleum Co.). A further advantage of yeast hosts is that several critical functions of the organism, e.g. oxidative phosphorylation is located within the organelles and thus is not exposed to the potential detrimental effects of the production of a foreign polypeptide by wild-type host cells. Yeasts, being eukaryotic organisms, may be capable of glycosylating expressed polypeptide products, where such glycosylation is important for the bioactivity of the polypeptide product. It is also possible that, as a eukaryotic organism, yeasts prefer the same codons as higher organisms, such as those derived from mammalian genes or e.g. tend to produce more efficiently expressed products derived from complementary DNA (cDNA) obtained by reverse transcription from mammalian mRNA.
A szegényesen jellemzett élesztőfajták, mint gazda/vektor-rertdszerek elterjedését akadályozza a transzformálási körülmények és a megfelelő vektorok ismeretének hiánya. Ezen kívül auxotróf mutánsok gyakran nem állnak rendelkezésre, eleve kizárva a transzformánsok közvetlen szelekcióját auxotróf komplementációval. Ahhoz, hogy a rekombináns DNS-technológia teljes mértékben beváltsa ígéretét, új gazda/vektorrendszereket kell konstruálni, amelyek a DNS-manipulációt valamint a beiktatott DNS-szekvenciák optimális kifejeződését megkönnyítik úgy, hogy a kívánt polipeptid terméket szabályozott körülmények között és nagy kitermeléssel lehessen készíteni.The prevalence of poorly characterized yeast strains such as host / vector systems is hampered by lack of transformation conditions and lack of knowledge of appropriate vectors. In addition, auxotrophic mutants are often unavailable, precluding the direct selection of transformants by auxotrophic complementation. To fully fulfill the promise of recombinant DNA technology, new host / vector systems must be constructed that facilitate DNA manipulation and optimal expression of the inserted DNA sequences so that the desired polypeptide product can be produced under controlled conditions and in high yield.
A jelen találmány kidolgozása során olyan DNSszekvenciákat fedeztünk fel, izoláltunk és jellemeztünk, amelyek a DNS átírását a hírvivő RNS-be és a hírvivő RNS transzlációját szabályozzák egy polipeptidet eredményezve. A jelen találmány szerint új DNSszekvenciák használhatók polipeptid termékek termeléséhezIn the development of the present invention, DNA sequences have been discovered that regulate DNA transcription into messenger RNA and translation of messenger RNA resulting in a polypeptide. According to the present invention, novel DNA sequences can be used to produce polypeptide products
a) olyan élesztősejtek által, amelyek képesek nőni metanolon, mint egyedüli szén- és energiaforcáson;(a) by yeast cells capable of growing on methanol as the sole carbon and energy source;
b) olyan élesztősejtek által, amelyek képesek nőni glükózon, etanolon, fruktózon és hasonlókon; és(b) by yeast cells capable of growing on glucose, ethanol, fructose and the like; and
c) olyan élesztősejtek által, amelyek képesek nőni glicerinen, galaktózon, acetáton és hasonlókon.(c) by yeast cells capable of growing on glycerol, galactose, acetate and the like.
A következőkben az ábrák rövid ismertetését adjuk:The following is a brief description of the figures:
Az 1. ábra a p76 fehérje genom kiónja (pPG 6.10) (a) és cDNS kiónja (pPC 15.0) (b) közti hasonlítást mutatja.Figure 1 shows a comparison between the genome clone of p76 protein (pPG 6.10) (a) and cDNA clone (pPC 15.0) (b).
A 2. ábra a p72 fehérje genom kiónja (pPG 4.0) (a) és cDNS kiónja (pPC 8.3) (b) (alkoholoxidáz), valamint a (pPC 8.0) rokon cDNS-klón (e) összehasonlítását mutatja.Figure 2 shows a comparison of the p72 protein genome clone (pPG 4.0) (a) and cDNA clone (pPC 8.3) (b) (alcohol oxidase) and (pPC 8.0) cDNA clone (e).
A 3. ábra a p40 fehérje genom kiónja (pPG 4.8) (a) és cDNS kiónja (pPC 6.7) (b) összehasonlítását mutatja·Figure 3 shows a comparison of the genome clone (pPG 4.8) (a) and cDNA clone (pPC 6.7) (b) of the p40 protein ·
A 4. ábra a pPG 6.0 klón találmány szerinti szabályozóterülete restrikciós térképét (b), illetve a szerkezeti szekvenciákhoz tartozó térképet (a) mutatja.Figure 4 shows a restriction map (b) and a map of structural sequences (a) of the regulatory region of pPG 6.0 according to the invention.
Az 5. ábra a pPG 4.0 klón találmány szerinti szabályozóterülete restrikciós térképét mutatja.Figure 5 is a restriction map of the regulatory region of pPG 4.0 according to the invention.
A 6. ábra a pPG 4.8 klón találmány szerinti szabályozóterülete restrikciós térképét mutatja.Figure 6 shows a restriction map of the regulatory region of pPG clone 4.8 according to the invention.
A 7. ábra a p76 strukturgén 3’ végéből nyert DNSszekvencia restrikciós térképe.Figure 7 is a restriction map of the DNA sequence obtained from the 3 'end of the p76 structural gene.
HU 205 627 ΒHU 205 627 Β
A 8. ábra a p72 (alkoholoxidáz) strukturgén 3’ végéből nyert DNS-szekvenciák restrikciós térképét mutatja. (a: 0,2 kb StuI-PvuII fragmens, b: 0, kb Stul— Hindül fragmens; c: 3,2 kb Sall-EcoRI fragmens).Figure 8 shows a restriction map of the DNA sequences obtained from the 3 'end of the p72 (alcohol oxidase) structural gene. (a: 0.2 kb StuI-PvuII fragment, b: 0, kb StuI-HindIII fragment; c: 3.2 kb SalI-EcoRI fragment).
A 9. ábra a p40 strukturgén 3’ végéből nyert DNSszekvencia restrikciós térképe.Figure 9 is a restriction map of the DNA sequence obtained from the 3 'end of the p40 structural gene.
A 10. ábra a p76 strukturgén és a hozzá tartozó 5’ szabályozóterűlet restrikciós térképe.Figure 10 is a restriction map of the p76 structural gene and its 5 'regulatory region.
All. ábra a p40 fehérjestrukturgén és a hozzá tartozó 5‘ szabályozőterület restrikciós térképe.All. Figure 3B is a restriction map of the p40 protein structural gene and its regulatory region 5 '.
A12. ábra a p76 fehérje cDNS restrikciós térképe.A12. Figure 3B is a cDNA restriction map of p76 protein.
A 13. ábra a p72 fehérje (alkoholoxidáz) cDNS restrikciós térképe.Figure 13 is a cDNA restriction map of p72 protein (alcohol oxidase).
A14. ábra a p40 fehérje cDNS restrikciós térképe.A14. Figure 3B is a cDNA restriction map of p40 protein.
A15. ábra a találmány szerinti két új p76 szabályozóterület lacZ DNS-konstrukció restrikciós térképét mutatja (a: pPG 6.0 5’ szabályozóterületéből származó 0,85 kbp HindüI-BamHI és E. coliból származó lacZgén; b: pPG 6.0 5’ szabályozóterületéből származó 1,3 kbp Hindlü-EcoRI és E. coliból származó lacZ-gén).A15. Fig. 2A shows a restriction map of the lacZ DNA construct of the two novel p76 regulatory regions of the invention (a: 0.85 kbp from HindIII-BamHI from the regulatory region of pPG 6.05 'and lacZ gene from E. coli; b: 1.3 kbp from the regulatory region of pPG 6.05' HindIII-EcoRI and the lacZ gene from E. coli).
A 16. ábra egy találmányunk szerinti új p72 (alkoholoxidáz) szabályozóterület lacZ DNS-konstrukciő.Figure 16 is a novel lacZ DNA construct of the novel p72 (alcohol oxidase) regulatory region of the present invention.
A17. ábra a pSAOH 1 plazmid restrikciós térképe.A17. Figure 3B is a restriction map of plasmid pSAOH1.
A18. ábra a pSAOH 5 plazmid restrikciós térképe.A18. Figure 3B is a restriction map of plasmid pSAOH 5.
A19. ábra a pSAOH 10 plazmid restrikciós térképe.A19. Figure 3B is a restriction map of plasmid pSAOH 10.
A 20. ábra a pTAFH.85 plazmid restrikciós térképe.Figure 20 is a restriction map of plasmid pTAFH.85.
A 21. ábra apT76H 1 plazmid restrikciós térképe.Figure 21 is a restriction map of plasmid pT76H1.
A 22. ábra a pT76H 2 plazmid restrikciós térképe.Figure 22 is a restriction map of plasmid pT76H2.
A 22 a) ábra a pT76H 3 plazmid restrikciós térképe.Figure 22a is a restriction map of plasmid pT76H3.
A 22 b) ábra a p!76H 4 plazmid restrikciós térképe.Figure 22 b is a restriction map of plasmid p76H4.
A 23. ábra a pYA2 plazmid restrikciós térképe.Figure 23 is a restriction map of plasmid pYA2.
A 24. ábra a pYA4 plazmid restrikciós térképe.Figure 24 is a restriction map of plasmid pYA4.
A 25. ábra a pYJ8 plazmid restrikciós térképe.Figure 25 is a restriction map of plasmid pYJ8.
A 26. ábra a pYJ8 ACla plazmid restrikciós térképe.Figure 26 is a restriction map of plasmid pYJ8 ACla.
A 27. ábra a pYJ30 plazmid restrikciós térképe.Figure 27 is a restriction map of plasmid pYJ30.
A 28. ábra a pTAFH 1 plazmid restrikciós térképe, és mutatja, hogyan készült a plazmid.Figure 28 is a restriction map of plasmid pTAFH1 showing how the plasmid was constructed.
A 29. ábra a pTAO 12 plazmid restrikciós térképe, és mutatja, hogyan készült a plazmid.Figure 29 is a restriction map of plasmid pTAO 12 showing how the plasmid was constructed.
A 30. ábra a pTAO 13 plazmid restrikciós térképe.Figure 30 is a restriction map of plasmid pTAO 13.
A 30 a) ábra a pT76U 1 plazmid restrikciós térképe.Figure 30 (a) is a restriction map of plasmid pT76U1.
A 31. ábra a pTAO 1 plazmid restrikciós térképe, és mutatja, hogyan készült a plazmid.Figure 31 is a restriction map of plasmid pTAO1 showing how the plasmid was constructed.
A 32. ábra a pTAF.85 plazmid restrikciós térképe, és mutatja, hogyan készült a plazmid.Figure 32 is a restriction map of plasmid pTAF.85 showing how the plasmid was constructed.
A 33. ábra az YEpl3 plazmid restrikciós térképét szolgáltatja.Figure 33 provides a restriction map of plasmid YEpl3.
A 34. ábra a pBPjl plazmid restrikciós térképe.Figure 34 is a restriction map of plasmid pBP11.
A találmány szerinti eljárásban alkalmazott restrikciós enzimeket a következőképpen rövidítjük:The restriction enzymes used in the method of the invention are abbreviated as follows:
A = AsuüA = Asuü
B = BamHIB = BamHI
B2 = BglIIB 2 = BglII
Bc = BellB c = Bell
C = ClalC = Clal
H2 = HincIIH 2 = HincII
H3 = HindülH 3 = Hindyl
K = KpnIK = KpnI
Nd, = NdelNd, = Ndel
Az ábrákon azokat a restrikciós helyeket, amelyeket a DNS-fragmensek manipulációja során alkalmazunk, de a ligálás során megszűnnek, zárójelbe tett rövidítéssel jelöltük.In the figures, restriction sites which are used during manipulation of DNA fragments but disappear during ligation are indicated by brackets.
A találmány tárgya tehát eljárás egy olyan új DNSfragmens előállítására, amely a következő feltételek legalább egyikére érzékeny szabályozóterületet tartalmaz: metanol jelenléte, szénforrás, amikor a sejtek metanoltól eltérő bizonyos szubsztrátumokon nőnek, és metanoltól eltérő nem katabolit represszáló szénforrások jelenléte. A találmány szerinti DNS-fragmens szabályozóterülete képes a hírvivő RNS átírásának szabályozására, amikor olyan DNS 5’ végénél van elhelyezve, amely a hírvivő RNS termelését kódolja. Találmányunk oltalmi körén belül vannak a fentebb leírt DNS-fragmensek mutánsai is.The present invention therefore relates to a process for the preparation of a novel DNA fragment comprising a regulatory domain sensitive to at least one of the following conditions: presence of methanol, carbon source when cells grow on certain substrates other than methanol, and non-catabolite repressing carbon sources other than methanol. The regulatory region of the DNA fragment of the invention is capable of regulating transcription of messenger RNA when positioned at the 5 'end of a DNA encoding the production of messenger RNA. Mutants of the DNA fragments described above are also within the scope of the present invention.
A találmány szerinti eljárással előállított DNS-fragmens tartalmaz továbbá egy olyan szabályozóterületet, amely képes a poliadenilezésnek, az átírás befejezésének és a hírvivő RNS transzlációja befejezésének a szabályozására, amikor annak a polipeptid-kódoló területnek a 3’ végénél helyezkedik el, amely a hírvivő RNS termelését kódolja, ahol a hírvivő RNS átírását és transzlációját egy olyan szabályozóterület szabályozza, amely a következő feltételek legalább egyikére érzékeny: metanol jelenléte, szénforrás hiánya, amikor a sejtek metanoltól eltérő bizonyos szubsztrátumokon növekednek, és metanoltól eltérő nem katabolit represszáló szénforrások jelenléte. Találmányunk oltalmi körén belül vannak a fentebb leírt DNSfragmensek mutánsai is.The DNA fragment produced by the method of the invention further comprises a regulatory region capable of controlling polyadenylation, termination of transcription, and termination of translation of messenger RNA when located at the 3 'end of the polypeptide coding region that expresses messenger RNA. encoding, whereby transcription and translation of messenger RNA is regulated by a regulatory region sensitive to at least one of the following conditions: presence of methanol, absence of carbon source when cells grow on certain substrates other than methanol, and presence of non-catabolite repressing carbon sources other than methanol. Mutants of the DNA fragments described above are also within the scope of the present invention.
A találmány szerinti eljárás egy speciális kiviteli módja értelmében olyan DNS-fragmenseket állítunk elő, amelyek a kódolt polipeptidek peroxiszómákba történő beépítését irányítják. A peroxiszómák intracelluláris testecskék, amelyek nagy mennyiségben vannak jelen a metanolban nőtt élesztősejtekben. Ezek az intracelluláris testecskék arra szolgálnak, hogy a polipeptid terméket az intracelluláris folyadékokból, valamint az enzimekből, mint pl. a proteázokból izolálják.In a particular embodiment of the method of the invention, DNA fragments are generated which direct the incorporation of encoded polypeptides into peroxisomes. Peroxisomes are intracellular cells that are present in large amounts in yeast cells grown in methanol. These intracellular bodies serve to transfer the polypeptide product from intracellular fluids as well as enzymes, e.g. isolated from proteases.
A találmány szerinti eljárás egy másik kiviteli módja értelmében alkoholoxidáz, vagyis egy kb. 40 kilodalto4According to another embodiment of the process of the invention, an alcohol oxidase, i.e., a ca. 40 kilolithos4
HU 205 627 Β nos fehérje és egy 76 kilodaltonos fehérje termelését kódoló géneket állítunk elő.Genes encoding the production of a protein of 205 627 Β n and a protein of 76 kilodaltons were prepared.
A találmány szerinti eljárás egy további kiviteli módja értelmében a fentebb leírt DNS-fragmenseket tartalmazó plazmidokat és transzformált organizmusokat állítunk elő.In a further embodiment of the invention, plasmids and transformed organisms containing the DNA fragments described above are prepared.
A találmány szerinti eljárással előállított plazmidokkal transzformált gazdasejteket tenyésztve olyan heterológ polipeptideket lehet előállítani, amelyek a gazdaszervezetben eredetileg nem voltak jelen.Culturing host cells transformed with plasmids produced by the method of the invention can produce heterologous polypeptides that were not originally present in the host.
Szabályozható gének izolálása Pichia pastorisbólIsolation of regulatory genes from Pichia pastoris
Egy kb. 20 000 tagból álló cDNS-könyvtárat készítünk E. coliban poliA+ RNS-sel, amelyet metalon, mint egyedüli szénforráson nőtt Pichia pastoris-sejtekből izoláltunk (lásd III. példa). A könyvtárat hibridizálással átvizsgáljuk metanol vagy etanol jelenlétében nőtt Pichia pastorisból izolált, kinázzal kezelt poliA+ RNS-t alkalmazva. Több ilyen plusz-mínusz átvizsgálás után három elkülönült, nem homológ cDNS-klónt azonosítunk, mint a metanolra fajlagos hírvivő RNS-ek másolatait. Ezeket a kiónokat pPC 6.4 pPC 8.0 és pPC 15.0 jelzéssel látjuk el és meghatározzuk, hogy 470, 750, illetve 1100 nukleotid hosszúságú beiktatásokat tartalmaznak.An approx. A 20,000-member cDNA library was constructed in E. coli with polyA + RNA isolated from Pichia pastoris cells grown on metal as the sole carbon source (see Example III). The library was screened by hybridization using kinase-treated polyA + RNA isolated from Pichia pastoris grown in methanol or ethanol. After several such minus screenings, three distinct non-homologous cDNA clones were identified as copies of the methanol-specific messenger RNAs. These clones are designated pPC 6.4 pPC 8.0 and pPC 15.0 and are determined to contain inserts of 470, 750, and 1100 nucleotides in length.
Egy kísérletben, hogy nagyobb hosszúságú cDNSklónokat nyerjünk, egy második cDNS-könyvtárat készítünk, enyhébb Sl-nukleázos emésztési körülményeket alkalmazva, mint amelyeket az első cDNS-könyvtár készítésénél alkalmaztunk, és ennek az új könyvtárnak a tagjait egyenként átvizsgáljuk 32P-vel jelzett pPC 6.4, pPC 8.0 és pPC 15.0 cDNS-klónokkal. Ennek eredményeképpen nagyobb cDNS-klónokat izolálunk, amelyek megfelelnek a pPC 6.4 és pPC 8.0 cDNS-klónoknak. A nagyobb pPC 6.7 és pPC 8.3 klónokról úgy találjuk, hogy 1200 illetve 2100 nukleotid méretű beiktatásokat tartalmaznak (lásd 2. és 3. ábra). Olyan cDNS-klónt, amely a pPC 15.0 1100 nukleotidjánál nagyobb beiktatással rendlekezett volna, nem figyeltünk meg több, mint 40 000 cDNS-klón átvizsgálásakor.In an experiment to obtain larger length cDNA clones, a second cDNA library was constructed using milder S1 nuclease digestion conditions than used for the first cDNA library, and members of this new library were screened individually with 32 P-labeled pPC 6.4. , pPC 8.0 and pPC 15.0 cDNA clones. As a result, larger cDNA clones corresponding to pPC 6.4 and pPC 8.0 cDNA clones were isolated. Larger clones pPC 6.7 and pPC 8.3 are found to contain inserts of 1200 and 2100 nucleotides respectively (see Figures 2 and 3). No cDNA clone having an insert greater than 1100 nucleotides of pPC 15.0 was observed when screening more than 40,000 cDNA clones.
Ezen DNS-klónok mindegyikének megfelelő genomjából DNS-fragmensek izolálását úgy hajtjuk végre, hogy Picha pastoris restrikciós endonukleázzal kezelt kromoszomális DNS-fragmenseit, amelyek a 32Pvel jelzett pPC 15.0, pPC 8.0 vagy pPC 6.4-gyel hibridizálnak, kivágjuk és elektroelucióval kinyerjük az agaróz gélből. Ezután az elulált genomiális DNS-fragmenseket Escherichia coliba klónozzuk, és a megfelelő genomiális kiónokat azonosítjuk többször átvizsgálva a fenti cDNS-vizsgáló minták mindegyikével.Isolation of DNA fragments from the corresponding genome of each of these DNA clones is accomplished by digestion of the Picha pastoris restriction endonuclease-treated chromosomal DNA fragments hybridizing with 32 P-labeled pPC 15.0, pPC 8.0, or pPC 6.4, and by electroelution with agarose. . The eluted genomic DNA fragments are then cloned into Escherichia coli and the corresponding genomic clones identified by multiple screening with each of the above cDNA probing samples.
Az egyes cDNS-klónok és megfelelő genomiális kiónjaik kapcsolatát az 1., 2. és 3. ábrák ábrázolják. A pPC 15.0 egy 6000 nukleotidos HindlII genomiális fragmensen belül kódolódik, amely a pPG 6.0 kiónban van jelen (1. ábra). A pPC 15.0 által kódolt gén 5’ vége a pPG 6.0-ban levő 1300 bp-s HindlH-EcoRI fragmens felé irányul, míg a gén 3’ vége közvetlen közelségben van a pPG 6.0-ban levő PstI helyekhez.The relationship between each cDNA clone and its corresponding genomic clone is depicted in Figures 1, 2 and 3. PPC 15.0 is encoded within a 6,000 nucleotide HindIII genomic fragment that is present in pPG 6.0 clone (Figure 1). The 5 'end of the gene encoded by pPC 15.0 is directed towards the 1300 bp HindIII-EcoRI fragment in pPG 6.0, while the 3' end of the gene is in close proximity to the PstI sites in pPG 6.0.
A pPC 8.3 cDNS-klón a pPG 4.0 genomiális kiónba van belefoglalva (2. ábra). A pPG 4.0 tartalmazza a hatásos genomiális DNS 4000 nukleotidból álló EcoRI-PvuII beiktatását. A pPC 8.3 orientációja a pPG 4.0-n belül az ehhez a cDNS-klónhoz tartozó gén 5’ végét a BamHI helyek közelébe helyezi, míg ennek a génnek a 3’ vége a PvuII hely közelében helyezkedik el. A pPC 8.0 (egy rokon cDNS-klón) orientációja a pPG 4.0-n belül ennek a cDNS-klónnak az 5’ végét a pPG 4.0 3’ végénél levő KpnI hely közelébe helyezi, és a cDNS-klón 4’ vége a PvuII hely közelében van elhelyezve.The pPC 8.3 cDNA clone is included in the pPG 4.0 genomic clone (Figure 2). PPG 4.0 includes the insertion of 4,000 nucleotides of EcoRI-PvuII effective genomic DNA. The orientation of pPC 8.3 within pPG 4.0 places the 5 'end of the gene for this cDNA clone close to the BamHI sites, while the 3' end of this gene is located near the PvuII site. The orientation of pPC 8.0 (a related cDNA clone) within pPG 4.0 places the 5 'end of this cDNA clone near the KpnI site at the 3' end of pPG 4.0, and the 4 'end of the cDNA clone near the PvuII site is placed.
A pPC 6.7 cDNS-klón teljesen egy 4800 nukleotidot tartalmazó EcoRI-BamHI genomiális fragmensen belül helyezkedik el (lásd 3. ábra). A pPC 6.4 klón viszont teljesen a pPC 6.7 cDNS-klónon belül helyezkedik el. Mivel a pPC 6.7 egy sokkal teljesebb másolat, mint a pPC 6.4 az utóbbit nem vizsgáljuk tovább. A gén 5’ vége közelebb helyezkedik el a BamHI végéhez, mint a pPG 4.8 genomiális klón EcoRI végéhez (3. ábra).The pPC 6.7 cDNA clone is located completely within a EcoRI-BamHI genomic fragment containing 4800 nucleotides (see Figure 3). The pPC 6.4 clone, on the other hand, is completely within the pPC 6.7 cDNA clone. Since pPC 6.7 is a much more complete copy than pPC 6.4, the latter is not considered further. The 5 'end of the gene is located closer to the BamHI end than the EcoRI end of the pPG 4.8 genomic clone (Figure 3).
Mindegyik fentebb leírt genomiális kiónokban legalább 1,2 kilobázispár szegélyező genom DNS-szekvencia van, amely a cDNS-klónok mindegyikében a másolt szerkezeti génekhez képest 5’ irányban helyezkedik el.Each of the genomic clones described above contains at least 1.2 kilobase pairs of flanking genomic DNA sequences located in the 5 'direction relative to the copied structural genes in each cDNA clone.
A fentebb leírt genomiális és cDNS-klónokat az Amerikai Egysük Államok Northern Régiónál Research Center intézetében (NRRL, Peoria, Illinois) E. coli gazdaszervezetekben helyeztük letétbe 1984. augusztus 31-én:The genomic and cDNA clones described above were deposited with E. coli hosts at the United States Northern Region Research Center (NRRL, Peoria, Illinois) on August 31, 1984:
A pPG 6.0, pPG 4.0 és pPG 4.8 egyedülálló volta metanolt asszimiláló élesztőkben A fentebb leírt cDNS-klónok mindegyikét jelezzük és egy sor metanolasszimiláló élesztőből és metanolt nem asszimiláló élesztőből nyert kromoszomális DNSszekvenciát vizsgáló mintáiként alkalmazzuk. A három cDNS mindegyikében homológ génekről úgy találjuk, hogy lényegében az összes metanolasszimiláló élesztőben léteznek, de teljesen világosan nincsenek jelen a metanolt nem asszimiláló élesztőkben (S. cerevisiae). Ezért úgy hisszük, hogy ezek a gének egyediek a metanolasszimiláló élesztőkben. Ezen túl a XVH. példában részletezett Southern hibridizálási kísérletek azt demonstrálják, hogy nagy mértékű homológia áll fenn a különböző metanolasszimiláló élesztőkből nyert, metanolra érzékeny egyedi gének között.Unique nature of pPG 6.0, pPG 4.0, and pPG 4.8 in methanol assimilating yeasts Each of the cDNA clones described above is labeled as chromosomal DNA sequences from a variety of methanol-assimilating yeast and non-methanol assimilating yeast. Homologous genes in each of the three cDNAs are found to exist in substantially all of the methanol-assimilating yeasts but are clearly absent in non-methanol-assimilating yeasts (S. cerevisiae). Therefore, we believe that these genes are unique in methanol-assimilating yeasts. In addition, the XVH. Examples of Southern hybridization experiments detailed in Example 1A show that there is a high degree of homology between the individual methanol-sensitive genes obtained from different methanol-assimilating yeasts.
A pPG 6.0, pPG 4.0 és pPG 4.8 gének RNS-átiratainak jellemzéseCharacterization of RNA transcripts of the pPG 6.0, pPG 4.0 and pPG 4.8 genes
A metanol befolyását megfigyelhetjük ezen klóno5The influence of methanol can be observed on this clone5
HU 205 627 Β zott gének mindegyikének kifejeződésére úgy, hogy ezeknek a géneknek az átírására gyakorolt hatásait tanulmányozzuk. Etanolon vagy metanolon, mint egyedi szénforráson nőtt Pichia pastoris-sejtekből izolált poliA+ RNS-t használunk, hogy Northern hibridizáló szűrők előállítására (lásd IV. példa) (-) készített három azonos szűrőpárt vizsgálunk át (Metanolon és etanolon nőtt sejtekről) (lásd I. példa), külön-külön 32P-vel jelzett pPC 15.0-val, pPC 8.0-val és pPC 6.4gyel. A pPC 15.0, pPC 8.0 és pPC 6.4 kiónok a metanolban nőtt sejtekből származó RNS-molekulákhoz (mintegy 2400,2300, illetve 1300 nukleotid hosszúságú) hibridizálódnak. A pPC 15.0 és pPC 8.0 kiónok hibridizálása nem figyelhető meg etanol jelenlétében nőtt sejtekből nyert RNS-sel készült hibridizáló vizsgáló mintákkal. Amikor azonban etanolon nőtt sejtekből izolált RNS-t vizsgálunk pPC 6.4-gyel, a klón hibridizálódik egy 1300 nukleotidos RNS-molekulához, amely azonos azzal, amelyet a metanolon nőtt sejtekkel látunk, de egy (minőségileg) becsült ötször alacsonyabb szinten.EN 205,627 by studying the effects of these genes on transcription. PolyA + RNA isolated from Pichia pastoris cells grown on ethanol or methanol as a unique carbon source was used to screen for three identical filter pairs (from methanol and ethanol grown cells) to produce Northern hybridization filters (see Example IV). Example 1) with 32 P-labeled pPC 15.0, pPC 8.0 and pPC 6.4, respectively. Clones pPC 15.0, pPC 8.0 and pPC 6.4 hybridize to RNA molecules (approximately 2400,2300 and 1300 nucleotides in length) from cells grown in methanol, respectively. Hybridization of the pPC 15.0 and pPC 8.0 clones was not observed with RNA hybridization probes obtained from cells grown in ethanol. However, when RNA isolated from cells grown in ethanol is probed with pPC 6.4, the clone hybridizes to a 1300 nucleotide RNA molecule identical to that seen with methanol grown cells, but at a (qualitatively) fivefold lower level.
A pPG 6.0, pPG 4.0 és pPG 4.8 által kódolt fehérjetermékek méretének meghatározásaDetermine the size of protein products encoded by pPG 6.0, pPG 4.0 and pPG 4.8
Abból a célból, hogy meghatározzuk, milyen fehérjetermékeket kódolnak a fentebb azonosított cDNS-klőnok, metanolon nőtt Pichia pastoris-sejtekből nyert poliA+ RNS-t hibridizálunk szelektíven az egyes cDNS-klónokhoz. A hibridszelektált mRNS-t, vagyis azt az mRNS-t, amely az egyes cDNS-klőnokhoz hibridizálődik, azután in vitro transzlációban alkalmazzuk és minden egyes fehérjeterméket elektroforézissel kinyerünk, SDS-denaturálás feltételei között (lásd V. példa). Ezeknek az in vitro pozitív hibridizáló transzlációs kísérleteknek az eredményei azt jelzik, hogy a pPC 15.0, pPC 8.3 és pPC 6.7 kiónok szelektálják azokat az mRNS-eket, amelyek a 76 000 (p76), 72 000 (p72), illetve 40 000 (p40) dalton molekulatömegű polipeptidekhez szolgáló információkat kódolják. Ugyanezeket a fehérjéket figyeljük meg, amikor metanolon nőtt Pichia pastoris sejtekből nyert teljes poliA+ RNS-t (azaz nem hibridszelektált RNSt) vetünk alá transzlációnak ugyanabban az in vitro rendszerben.In order to determine which protein products are encoded by the cDNA clones identified above, polyA + RNA obtained from methanol-grown Pichia pastoris cells is selectively hybridized to each cDNA clone. The hybrid-selected mRNA, i.e., the mRNA which hybridizes to each cDNA clone, is then used for in vitro translation and each protein product is recovered by electrophoresis under the conditions of SDS denaturation (see Example V). The results of these in vitro positive hybridization translational experiments indicate that clones pPC 15.0, pPC 8.3 and pPC 6.7 select mRNAs that are 76,000 (p76), 72,000 (p72), and 40,000 (p40). ) encodes information for dalton molecular weight polypeptides. The same proteins are observed when total polyA + RNA (i.e., non-hybrid selected RNA) from Pichia pastoris cells grown on methanol is translated into the same in vitro system.
A p72, mint alkoholoxidáz azonosításaIdentification of p72 as an alcohol oxidase
A) Molekulatömeg-összehasonlítás Alkoholoxidázban erősen dúsított mintát készítünk derített sejtlizátumok vízzel szemben végzett dialízisével (lásd VH példa). Az ebből a dialízisből nyert kristályos csapadékról SDS-elektroforézissel kimutatjuk, hogy zömmel két polipeptidet tartalmaz 76 000 illetve 72 000 dalton molekulatömeggel. A csapadékot további tisztításnak vetjük alá kromatográfiával Sephacryl 200-on (lásd VII. példa), ami azt demonstrálja, hogy az alkoholoxidáz-aktivitás megfelel a tisztított 72 000 dalton molekulatömegű polipeptid aktivitásának. Ennek a polípeptidnek a mérete azonos annak a fehérjeterméknek a méretével, amelyet a pPC 8.3 cDNS-klőnnal szelektálunk (lásd X. példa).A. Molecular Weight Comparison A highly enriched sample in alcohol oxidase is prepared by dialysis of clarified cell lysates against water (see Example VH). The crystalline precipitate obtained from this dialysis was found to contain two polypeptides with a molecular weight of 76,000 and 72,000 daltons, respectively, by SDS electrophoresis. The precipitate was further purified by chromatography on Sephacryl 200 (see Example VII) demonstrating that the alcohol oxidase activity corresponds to that of the purified 72,000 Dalton polypeptide. The size of this polypeptide is the same as the size of the protein product selected by the pPC 8.3 cDNA clone (see Example X).
B) ImmunkicsapásB) Immune strike
Azt, hogy a pPC 8.3 és pPG 4.0 kiónok kódolják az alkoholoxidáz-strukturgént, immunológiai úton is igazoljuk (XI. példa). A Pichia pastorisból izolált, mind a 76 000, mind a 72 000 molekulatömegű polipeptidet tartalmazó fehérjekészítmény segítségével ezekre a polipeptidekre fajlagos antiszérumokat hozunk létre nyuIakban. Amikor a pPC 8.3 klónból nyert, hibridszelektált poliA+ RNS-t in vitro transzlációnak vetjük alá, csupán a 72 000 dalton molekulatömegu transzlációs termék csapódik ki a Pichia pastoris-sejtekből készült fehérjekészítmények elleni antiszérummal.The cloning of the alcohol oxidase gene by clones pPC 8.3 and pPG 4.0 is also confirmed immunologically (Example XI). Protein preparations isolated from Pichia pastoris containing both the 76,000 and 72,000 molecular weight polypeptides produce antisera specific for these polypeptides in rabbits. When hybrid selected polyA + RNA from pPC 8.3 is subjected to in vitro translation, only the translation product of 72,000 Dalton molecular weight precipitates with antiserum to protein preparations from Pichia pastoris cells.
C) Jósoltlvalódi aminosav-szekvencia összehasonlításaC) Comparison of Predicted Amino Acid Sequences
Annak további igazolására, hogy a pPC 8.3 klón valóban az a cDNS-klón, amely a Pichia pastorisalkoholoxidázt kódolja, a fehérje aminoterminális végéhez tartozó aminosav-szekvenciát összehasonlítjuk a pPC 8.3-mal kódolt jósolt aminosav-szekvenciával. így az izolált 72 000 dalton molekulatömegű fehérje NH2-terminális aminosav-szekvenciáját (A szekvencia) a következőnek határozzuk meg (VIH. példa): Ala-He-Pro-Glu-Glu-Phe-Asp-He-Leu-Val-Leu-GIyGly-Gly-Ser-Ser-Gly-Ser.To further confirm that pPC clone 8.3 is indeed the cDNA clone encoding Pichia pastoris alcohol oxidase, the amino acid sequence at the amino terminus of the protein is compared to the predicted amino acid sequence of pPC 8.3. Thus, the NH 2 -terminal amino acid sequence (SEQ ID NO: A) of the isolated protein of 72,000 daltons was determined as follows (Example VIH): Ala-He-Pro-Glu-Glu-Phe-Asp-He-Leu-Val-Leu -GIyGly-Gly-Ser-Ser-Gly-Ser.
„A” szekvenciaSequence A
Ezzel párhuzamosan meghatározzuk a pPC 8.3 és pPG 4.0-ban kódolt gének 5’ végének nukleotidszekvenciáját. A jósolt aminosav-szekvencia mind a genomiális, mind a cDNS-klónok DNS-szekvenciáiból származó 2-19 aminosavak esetén (lásd B szekvencia) tökéletesen egyezett a fentebb meghatározott, az izolált Pichia pastoris-alkoholoxidázhoz tartozó aminosavszekvencia (A szekvencia) első 18 aminosavával:In parallel, the nucleotide sequence of the 5 'end of the genes encoded in pPC 8.3 and pPG 4.0 was determined. The predicted amino acid sequence for the 2-19 amino acids derived from the DNA sequences of both the genomic and cDNA clones (see SEQ ID NO: B) perfectly matched the first 18 amino acids of the above Pichia pastoris alcohol oxidase sequence (SEQ ID NO: A):
Jósolt aminosav-szekvencia:Predicted amino acid sequence:
Met Alá Ile Pro Glu Glu PheMet Alá Ile Pro Glu Glu Phe
Nukleotid szekvenciaNucleotide sequence
5' -ATG GCT ATC CCC GAA GAG TTT (pPC 8.3 és pPG 4.0)5 '-ATG GCT ATC CCC GAA GAG TTT (pPC 8.3 and pPG 4.0)
3' -TAC CGA TAG GGG CTT CTC AAA3 '-TAC CGA TAG GGG CTT CTC AAA
Asp Ile Leu Val Leu Gly Gly Gly Ser Ser Gly Ser GAT ATC CTA GTT CTA GGT GGT GGA TCC AGT GGA TCC-3' CTA TAS GAT CAA GAT CCA CCA CCT AGG TCA CCT AGG-115' „B” szekvenciaAsp Ile Leu Val Leu Gly Gly Gly Ser Ser Gly Ser GAT ATC CTA GTT CTA GGT GGT GGA TCC AGT GGA TCC-3 'CTA TAS GAT CAA GAT CCA CCA CCT AGG TCA CCT AGG-115' Sequence B
Ezen kívül meghatározzuk az alkoholoxidáz génkódoló területéhez tartozó teljes nukleotidszekvenciát. A meghatározott nukleotidszekvenciát és a jósolt aminosav-szekvencia a kővetkező: Jósolt aminosav-szekvencia: Met Alá Ile Pro Glu Glu PheIn addition, the complete nucleotide sequence belonging to the gene coding region of the alcohol oxidase is determined. The determined nucleotide sequence and the predicted amino acid sequence are as follows: Predicted amino acid sequence: Met Alá Ile Pro Glu Glu Phe
Nukleotidszekvencia:nucleotide sequence:
5' -ATG GCT ATC CCC GAA GAG TTT (pPC 8.3 és pPG 4.0)5 '-ATG GCT ATC CCC GAA GAG TTT (pPC 8.3 and pPG 4.0)
3' -TAC CGA TAG GGG CTT CTC AAA3 '-TAC CGA TAG GGG CTT CTC AAA
Asp Ile Leu Val Leu Gly Gly Gly Ser Ser Gly Ser GAT ATC CTA GTT CTA GGT GGT GGA TTC AGT GGA TCCAsp Ile Leu Val Leu Gly Gly Gly Ser Ser Gly Ser GAT ATC CTA GTT CTA GGT GGT GGA TTC AGT GGA TCC
CTA TAG GAT CAA GAT CCA CCA CCT AGG TCA CCT AGGCTA TAG GAT CAA GAT CCA CCA CCT AGG TCA CCT AGG
Cys Ile Ser Gly Arg Leu Alá Asn Leu Asp His Ser TGT ATT TCC GGA AGA TTG GCA AAC TTG GAC CAC TCCCys Ile Ser Gly Arg Leu Al Asn Leu Asp His Ser TGT ATT TCC GGA AGA TTG GCA AAC TTG GAC CAC TCC
ACA TAA AGG CCT TCT AAC CGT TTG AAC CTG GTG AGGACA TAA AGG CCT TCT AAC CGT TTG AAC CTG GTG AGG
HUHU
Leu Lys Val Gly Leu Ile Glu Alá Gly Glu Asn Gin TTG AAA GTT GGT CTT ATC GAA GCA GGT GAG AAC CAA AAC TTT CAA CCA GAA TAG CTT CGT CCA CTC TTG GTTLeu Lys Val Gly Leu Ile Glu Alá Gly Glu Asn Gin TTG AAA GTT GGT CTT ATC GAA GCA GGT GAG AAC CAA AAC TTT CAA CCA GAA TAG CTT CGT CCA CTC TTG GTT
Pro Gin Gin Pro Met Gly Leu Pro Ser Arg Tyr LeuPro Gin Gin Pro Met Gly Leu Pro Ser Arg Tyr Leu
CCT CAA CAA CCC ATG GGT CTA CCT TCC AGG TAT TTACCT CAA CAA CCC ATG GGT CTA CCT TCC AGG TAT TTA
GGA GTT GTT GGG TAC CCA GAT GGA AGG TCC ATA AATGGA GTT GTT GGG TAC CCA GAT GGA AGG TCC ATA AAT
Pro Lys Lys Gin Lys Leu Asp Ser Lys Thr Alá SerPro Lys Lys Gin Lys Leu Asp Ser Lys Thr Alá Ser
CCC AAG AAA CAG AAG TTG GAC TTC AAG ACT GCT TCCCCC AAG AAA CAG AAG TTG GAC TTC AAG ACT GCT TCC
GGG TTC TTT GTC TTC AAC CTG AGG TTC TGA CGA AGGGGG TTC TTT GTC TTC AAC CTG AGG TTC TGA CGA AGG
Phe Tyr Thr Ser Asn Pro Ser Pro His Leu Asn GlyPhe Tyr Thr Ser Asn Pro Ser Pro His Leu Asn Gly
TTC TAC ACT TCT AAC CCA TCT CCT CAC TTG AAT GGTTTC TAC ACT TCT AAC CCA TCT CCT CAC TTG AAT GGT
AAG ATG TGA AGA TTG GGT AGA GGA GTG AAC TTA CCAAAG ATG TGA AGA TTG GGT AGA GGA GTG AAC TTA CCA
Arg Arg Alá Ile Val Pro Cys Alá Asn Val Leu GlyArg Arg Alá Ile Val Pro Cys Alá Asn Val Leu Gly
AGA AGA GCC ATC GTT CCA TGT GCT AAC GTC TTG GGTAGA AGA GCC ATC GTT CCA TGT GCT AAC GTC TTG GGT
TCT TCT CGG TAG CAA GGT ACA CGA TTG CAG AAC CCATCT TCT CGG TAG CAA GGT ACA CGA TTG CAG AAC CCA
Gly Gly Ser Ser Ile Asn Phe Met Met Tyr Thr ArgGly Gly Ser Ser Ile Asn Phe Met Met Tyr Thr Arg
GGT GGT TCT TCT ATC AAC TTC ATG ATG TAC ACC AGAGGT GGT TCT TCT ATC AAC TTC ATG ATG TAC ACC AGA
CCA CCA AGA AGA TAG TTG AAG TAC TAC ATG TGG TCTCCA CCA AGA AGA TAG TTG AAG TAC TAC ATG TGG TCT
Gly Ser Alá Ser Asp Ser Asp Asp ? Gin Alá GluGly Ser Alá Ser Asp Ser Asp Asp? Gin Alá Glu
GGT TCT GCT TCT GAT TCT GAT GAC TTN CAA GCC GAGGGT TCT GCT TCT GAT TCT GAT GAC TTN CAA GCC GAG
CCA AGA CGA AGA CTA AGA CTA CTG AAN GTT CGG CTCCCA AGA CGA AGA CTA AGA CTA CTG AAN GTT CGG CTC
Gly Ser Lys Thr Glu Asp Leu Leu Pro Leu Met LysGly Ser Lys Thr Glu Asp Leu Leu Pro Leu Met Lys
GGC TCG AAA ACA GAG GAC TTG CTT CCA TTG ATG AAAGGC TCG AAA ACA GAG GAC TTG CTT CCA TTG ATG AAA
CCG AGC TTT TGT CTC CTG AAC GAA GGT AAC TAC TTTCCG AGC TTT TGT CTC CTG AAC GAA GGT AAC TAC TTT
Lys Thr Glu Thr Tyr Gin Arg Alá ? Gin ? TyrLys Thr Glu Thr Tyr Gin Arg Alá? Gin? Tyr
AAG ACT GAG ACC TAC CAA AGA GCT TGN CAA CNA TACAAG ACT GAG ACC TAC CAA AGA GCT TGN CAA CNA TAC
TTC TGA CTC TGG ATG GTT TCT CGA ACN GTT GNT ATGTTC TGA CTC TGG ATG GTT TCT CGA ACN GTT GNT ATG
Pro Asp Ile His Gly Phe Glu Gly Pro Ile Lys ValPro Asp Ile His Gly Phe Glu Gly Pro Ile Lys Val
CCT GAC ATT CAC GGT TTC GAA GGT CCA ATC AAG GTTCCT GAC ATT CAC GGT TTC GAA GGT CCA ATC AAG GTT
GGA CTG TAA GTG CCA AAG CTT CCA GGT TAG TTC CAAGGA CTG TAA GTG CCA AAG CTT CCA GGT TAG TTC CAA
Ser Phe Gly Asn Tyr Thr Tyr Pro Val Cys Gin AspSer Phe Gly Asn Tyr Thr Tyr Pro Val Cys Gin Asp
TCT TTC GGT AAC TAC ACC TAC CCA GTT TGC CAG GACTCT TTC GGT AAC TAC ACC TAC CCA GTT TGC CAG GAC
AGA AAG CCA TTG ATG TGG ATG GGT CAA ACG GTC CTGAGA AAG CCA TTG ATG TGG ATG GGT CAA ACG GTC CTG
Phe Leu Arg Alá Ser Glu Ser Gin Gly Ile Pro TyrPhe Leu Arg Alá Ser Glu Ser Gin Gly Ile Pro Tyr
TTC TTG AGG GCT TCT GAG TCC CAA GGT ATT CCA TACTTC TTG AGG GCT TCT GAG TCC CAA GGT ATT CCA TAC
AAG AAC TCC CGA AGA CTC AGG GTT CCA TAA CGT ATGAAG AAC TCC CGA AGA CTC AGG GTT CCA TAA CGT ATG
Val Asp Asp Leu Glu Asp Leu Val Leu Thr His GlyVal Asp Asp Leu Glu Asp Leu Val Leu Thr His Gly
GTT GAC GAT CTG GAA GAC TTG GTA CTG ACT CAC GGTGTT GAC GAT CTG GAA GAC TTG GTA CTG ACT CAC GGT
CAA CTG CTA GAC CTT CTG AAC CAT GAC TGA GTG CCACAA CTG CTA GAC CTT CTG AAC CAT GAC TGA GTG CCA
Alá Glu His Trp Leu Lys Trp Ile Asn Arg Asp ThrAlá Glu His Trp Leu Lys Trp Ile Asn Arg Asp Thr
GCT GAA CAC TGG TTG AAG TGG ATC AAC AGA GAC ACTGCT GAA CAC TGG TTG AAG TGG ATC AAC AGA GAC ACT
CGA CTT GTG ACC AAC TTC ACC TAG TTC TCT CTG TGACGA CTT GTG ACC AAC TTC ACC TAG TTC TCT CTG TGA
Gly Arg Arg Ser Asp Ser Alá His Alá Phe Val HisGly Arg Arg Ser Asp Ser Alá His Alá Phe Val His
CGT CGT TCC GAC TCT GCT CAT GCA TTT GTC CAC TCTCGT CGT TCC GAC TCT GCT CAT GCA TTT GTC CAC TCT
GCA GCA AGG CTG AGA CGA GTA CGT AAA CAG GTG AGAGCA GCA AGG CTG AGA CGA GTA CGT AAA CAG GTG AGA
Ser Thr Met Arg Asn His Asp Asn Leu Tyr Leu IleSer Thr Met Arg Asn His Asp Asn Leu Tyr Leu Ile
TCT ACT ATG AGA AAC CAC GAC AAC TTG TAC TTG ATGTCT ACT ATG AGA AAC CAC GAC AAC TTG TAC TTG ATG
AGA TGA TAC TCT TTG GTG CTG TTG AAC ATG AAC TAGAGA TGA TAC TCT TTG GTG CTG TTG AAC ATG AAC TAG
Cys Asn Thr Lys Val Asp Lys Ile Ile Val Glu AspCys Asn Thr Lys Val Asp Lys Ile Ile Val Glu Asp
TGT AAC ACG AAG GTC GAC AAA ATT ATT GTC GAA GACTGT AAC ACG AAG GTC GAC AAA ATT ATT GTC GAA GAC
ACA TTG TGC TTC CAG CTG TTT TAA TAA CAG CTT CTGACA TTG TGC TTC CAG CTG TTT TAA TAA CAG CTT CTG
Gly Arg Alá Alá Alá Val Arg Thr Val Pro Ser LysGly Arg Alá Alá Alá Val Arg Thr Val Pro Ser Lys
GGA AGA GCT GCT GCT GTT AGA ACC GTT CCA AGC AAGGGA AGA GCT GCT GCT GTT AGA ACC GTT CCA AGC AAG
CCT TCT CGA CGA CGA CAA TCT TGG CAA GGT TCG TTCCCT TCT CGA CGA CGA CAA TCT TGG CAA GGT TCG TTC
Pro Leu Asn Pro Lys Lys Pro Ser Hiy Lys Ile TyrPro Leu Asn Pro Lys Lys Pro Ser Hiy Lys Ile Tyr
CCT TTG AAC CCA AAG AAG CCA AGT CAC AAG ATC TACCCT TTG AAC CCA AAG AAG CCA AGT CAC AAG ATC TAC
GCA AAC TTG GGT TTC TTC GGT TCA GTG TTC TAG ATGGCA AAC TTG GGT TTC TTC GGT TCA GTG TTC TAG ATG
Arg Alá Arg Lys Gin Ile Phe Leu Ser Cys Gly ThrArg Alá Arg Lys Gin Ile Phe Leu Ser Cys Gly Thr
CGT GCT AGA AAG CAA ATC TTT TTG TCT TGT GGT ACCCGT GCT AGA AAG CAA ATC TTT TTG TCT TGT GGT ACC
GCA CGA TCT TTC GTT TAG AAA AAC AGA ACA CCA TGGGCA CGA TCT TTC GTT TAG AAA AAC AGA ACA CCA TGG
627 B627 B
Ile Ser Ser Pro Leu Val Leu Glu Arg Ser Gly PheIle Ser Ser Pro Leu Val Leu Glu Arg Ser Gly Phe
ATC TCC TCT CCA TTG GTT TTG CAA AGA TCC GGT TTTATC TCC TCT CCA TTG GTT TTG CAA AGA TCC GGT TTT
TAG AGG AGA GGT AAC CAA AAC GTT TCT AGG CCA AAATAG AGG AGA GGT AAC CAA AAC GTT TCT AGG CCA AAA
Gly Asp Pro Ile Lys Leu Arg Alá Alá Gly Val LysGly Asp Pro Ile Lys Leu Arg Under Al Gly Val Lys
GGT GAC CCA ATC AAG TTG AGA GCC GCT GGT GTT AAGGGT GAC CCA ATC AAG TTG AGA GCC GCT GGT GTT AAG
CCA CTG GGT TAG TTC AAC TCT CGG CGA CCA CAA TTCCCA CTG GGT TAG TTC AAC TCT CGG CGA CCA CAA TTC
Pro Leu Val Asn Leu Pro Gly Val Gly Arg Asn PhePro Leu Val Asn Leu Pro Gly Val Gly Arg Asn Phe
CCT TTG GTC AAC TTG CCA GGT GTC GGA AGA AAC TTCCCT TTG GTC AAC TTG CCA GGT GTC GGA AGA AAC TTC
GGA AAC CAG TTG AAC GGT CCA CAG CCT TCT TTG AAGGGA AAC CAG TTG AAC GGT CCA CAG CCT TCT TTG AAG
Gly Asp His Thr Lys Ile Pro Pro Gly Lys Tyr MetGly Asp His Thr Lys Ile Pro Pro Gly Lys Tyr Met
GGT GAC CAC ACC AAG ATT CCT CCT GGA AAG TAC ATGGGT GAC CAC ACC AAG ATT CCT CCT GGA AAG TAC ATG
CCA CTG GTG TGG TTC TAA GGA GGA CCT TTC ATG TACCCA CTG GTG TGG TTC TAA GGA GGA CCT TTC ATG TAC
Thr Met Phe His Phe Leu Glu Tyr Pro Phe Ser ArgThr Met Phe His Phe Leu Glu Tyr Pro Phe Ser Arg
ACT ATG TTC CAC TTC TTG GAA TAC CCA TTC TCC AGAACT ATG TTC CAC TTC TTG GAA TAC CCA TTC TCC AGA
TGA TAC AAG GTG AAG AAC CTT ATG GGT AAG AGG TCTTGA TAC AAG GTG AAG AAC CTT ATG GGT AAG AGG TCT
Gly Ser Ile His Ile Thr Ser Pro Asp Pro Tyr AláGly Ser Ile His Ile Thr Ser Pro Asp Pro Tyr Alá
CGT TCC ATT CAC ATT ACC TCC CCA GAC CCA TAC GCACGT TCC ATT CAC ATT ACC TCC CCA GAC CCA TAC GCA
CCA AGG TAA GTG TAA TGG AGG GGT CTG GGT ATG CGTCCA AGG TAA GTG TAA TGG AGG GGT CTG GGT ATG CGT
Alá Pro Asp Phe Asp Arg Gly Phe Met Asn Asp GluAlá Pro Asp Phe Asp Arg Gly Phe Met Asn Asp Glu
GCT CCA GAC TTC GAC CGA GGT TTC ATG AAC GAT GAAGCT CCA GAC TTC GAC CGA GGT TTC ATG AAC GAT GAA
CGA GGT CTG AAG CTG GCT CCA AAG TAC TTG CTA CTTCGA GGT CTG AAG CTG GCT CCA AAG TAC TTG CTA CTT
Arg Asp Met Alá Pro Met Val Trp Alá Tyr Lys SerArg Asp Met Alá Pro Met Val Trp Al Tyr Tyr Lys Ser
AGA GAC ATG GCT CCT ATG GTT TGG GCT TAC AAG TCTAGA GAC ATG GCT CCT ATG GTT TGG GCT TAC AAG TCT
TCT CTG TAC CGA GGA TAC CAA ACC CGA ATG TTC AGATCT CTG TAC CGA GGA TAC CAA ACC CGA ATG TTC AGA
Ser Arg Glu Thr Alá Arg Arg Ser Asp His Phe AláSer Arg Glu Thr Alá Arg Arg Ser Asp His Phe Alá
TCT AGA GAA ACC GCT AGA AGA AGT GAC CAG TTT GCCTCT AGA GAA ACC GCT AGA AGA AGT GAC CAG TTT GCC
AGA TCT CTT TGG CGA TCT TCT TCA CTG GTG AAA CGGAGA TCT CTT TGG CGA TCT TCT TCA CTG GTG AAA CGG
Gly Glu Val Thr Ser His His Pro Leu Phe Pro TyrGly Glu Val Thr Ser His His Pro Leu Phe Pro Tyr
GGT GAG GTC ACT TCT CAC CAC CCT CTG TTC CCA TACGGT GAG GTC ACT TCT CAC CAC CCT CTG TTC CCA TAC
CCA CTC CAG TGA AGA GTG GTG GGA GAC AAG GGT ATGCCA CTC CAG TGA AGA GTG GTG GGA GAC AAG GGT ATG
Ser Ser Glu Alá Arg Alá Leu Glu Met Asp Leu GluSer Ser Glu Alá Arg Alá Leu Glu Met Asp Leu Glu
TCA TCC GAG GCC AGA GCC TTG GAA ATG GAT TTG GAGTCA TCC GAG GCC AGA GCC TTG GAA ATG GAT TTG GAG
AGT AGG CTC CGG TCT CGG AAC CTT TAC CTA AAC CTCAGT AGG CTC CGG TCT CGG AAC CTT TAC CTA AAC CTC
Thr Ser Asn Alá Tyr Gly Gly Pro Leu Asn Leu SerThr Ser Asn Alá Tyr Gly Gly Pro Leu Asn Leu Ser
ACC TCT AAT GCC TAC GGT GGA CCT TTG AAC TTG TCTACC TCT AAT GCC TAC GGT GGA CCT TTG AAC TTG TCT
TGG AGA TTA CGG ATG CCA CCT GGA AAC TTG AAC AGATGG AGA TTA CGG ATG CCA CCT GGA AAC TTG AAC AGA
Alá Gly Leu Alá His Gly Ser Trp Thr Gin Pro LeuAlá Gly Leu Alá His Gly Ser Trp Thr Gin Pro Leu
GCT GGT CTT GCT CAC GGT TCT TGG ACT CAA CCT TTGGCT GGT CTT GCT CAC GGT TCT TGG ACT CAA CCT TTG
CGA CCA GAA CGA GTG CCA AGA ACC TGA GTT GGA AACCGA CCA GAA CGA GTG CCA AGA ACC TGA GTT GGA AAC
Lys Lys Pro Thr Alá Lys Asn Glu Gly His Val ThrLys Lys Pro Thr Alá Lys Asn Glu Gly His Val Thr
AAG AAG CCA ACT GCA AAG AAC GAA GGC CAC GIT ACTAAG AAG CCA ACT GCA AAG AAC GAA GGC CAC GIT ACT
TTC TTC GGT TGA CGT TTC TTG CTT CCG GTG CAA TGATTC TTC GGT TGA CGT TTC TTG CTT CCG GTG CAA TGA
Ser Asn Gin Val Glu Leu His Pro Asp Ile Glu TyrSer Asn Gin Val Glu Leu His Pro Asp Ile Glu Tyr
TCG AAC CAG GTC GAG CTT CAT CCA GAC ATC GAG TACTCG AAC CAG GTC GAG CTT CAT CCA GAC ATC GAG TAC
AGC TTG GTC CAG CTC GAA GTA GGT CTG TAG CTC ATGAGC TTG GTC CAG CTC GAA GTA GGT CTG TAG CTC ATG
Asp Glu Glu Asp Asp Lys Alá Ile Glu Asn Tyr IleAsp Glu Glu Asp Asp Lys Alá Ile Glu Asn Tyr Ile
GAT GAG GAG GAT GAC AAG GCC ATT GAG ACC TAC ATTGAT GAG GAG GAT GAC AAG GCC ATT GAG ACC TAC ATT
CTA CTC CTC CTA CTG TTC CGG TAA CTC TTG ATG TAACTA CTC CTC CTA CTG TTC CGG TAA CTC TTG ATG TAA
Arg Glu His Thr Glu Thr Thr Trp His Cys Leu GlyArg Glu His Thr Glu Thr Thr Trp His Cys Leu Gly
CGT GAG CAC ACT GAG ACC ACA TGG CAC TGT CTG GGACGT GAG CAC ACT GAG ACC ACA TGG CAC TGT CTG GGA
GCA CTC GTG TGA CTC TGG TGT ACC GTG ACA CCA GGTGCA CTC GTG TGA CTC TGG TGT ACC GTG ACA CCA GGT
Thr Cys Ser Ile Gly Pro Arg Glu Gly Ser Lys IleThr Cys Ser Ile Gly Pro Arg Glu Gly Ser Lys Ile
ACC TGT TCC ATC GGT CCA AGA GAA GGT TCC AAG ATCACC TGT TCC ATC GGT CCA AGA GAA GGT TCC AAG ATC
TGG ACA AGG TAG CCA GGT TCT CTT CCA AGG TTC TAGTGG ACA AGG TAG CCA GGT TCT CTT CCA AGG TTC TAG
Val Lys Trp Gly Gly Val Leu Asp His Arg Ser AsnVal Lys Trp Gly Gly Val Leu Asp His Arg Ser Asn
GTC AAA TGG GGT GTT GTT TIG GAC CAC AGA TCC AACGTC AAA TGG GGT GTT GTT TIG GAC CAC AGA TCC AAC
CAG TTT ACC CCA CAA CAA AAC CTG GTG TCT AGG TTGCAG TTT ACC CCA CAA CAA AAC CTG GTG TCT AGG TTG
Val Tyr Gly Val Lys Gly Leu Lys Val Gly Asp LeuVal Tyr Gly Val Lys Gly Leu Lys Val Gly Asp Leu
GTT TAC GGA GTC AAG GGC TIG AAG GTT GGT GAC TTGGTT TAC GGA GTC AAG GGC TIG AAG GTT GGT GAC TTG
CAA ATG CCT CAG TTC CCG AAC TTC CAA CCA CTG AACCAA ATG CCT CAG TTC CCG AAC TTC CAA CCA CTG AAC
HU 205 627 ΒHU 205 627 Β
Ser Val Cys Pro Asp Asn Val Gly Cys Asn Thr Tyr TCC GTG TGC CCA GAC AAT GTT GGT TGT AAC ACC TAC AGG CAC ACG GGT CTG TTA CAA CCA ACA TTG TGG ATGSer Val Cys Pro Asp Asn Val Gly Cys Asn Thr Tyr TCC GTG TGC CCA GAC AAT GTT GGT TGT AAC ACC TAC AGG CAC ACG GGT CTG TTA CAA CCA ACA TTG TGG ATG
Thr Thr Alá Leu Leu Ile Gly Glu Lys Thr Alá Thr ACC ACC GCT CTT TTG ATC GGT GAA AAG ACT GCC ACT TGG TGG CGA GAA AAC TAG CCA CTT TTC TGA CGG TGAThr Thr Alá Leu Leu Ile Gly Glu Lys Thr Alá Thr ACC ACC GCT CTT TTG ATC GGT GAA AAG ACT GCC ACT TGG TGG CGA GAA AAC TAG CCA CTT TTC TGA CGG TGA
Leu Val Gly Glu Asp Leu Gly Tyr Ser Gly Glu Alá TTG GTT GGA GAA CAT TTA GGA TAC TCT GGT GAG GCC AAC CAA CCT CTT CTA AAT CCT ATG AGA CCA CTC CGGLeu Val Gly Glu Asp Leu Gly Tyr Ser Gly Glu Alá TTG GTT GGA GAA CAT TTA GGA TAC TCT GGT GAG GCC AAC CAA CCT CTT CTA AAT CCT ATG AGA CCA CTC CGG
Leu Asp Met Thr Val Pro Gin Phe Lys Leu Gly Thr TTA GAC ATG ACT GTT CCT CAG TTC AAG TTG GGC ACT AAT CTG TAC TGA CAA GGA GTC AAG TTC AAC CCG TGALeu Asp Met Thr Val Pro Gin Phe Lys Leu Gly Thr TTA GAC ATG ACT GTT CCT CAG TTC AAG TTG GGC ACT AAT CTG TAC TGA CAA GGA GTC AAG TTC AAC CCG TGA
Tyr Glu Lys Thr Gly Leu Alá Arg Phe StopTyr Glu Lys Thr Gly Leu Alá Arg Phe Stop
TAC GAG AAG ACC GGT CTT GCT AGA TTC TAA-3'TAC GAG AAG ACC GGT CTT GCT AGA TTC TAA-3 '
ATG CTC TTC TGG CCA GAA CGA TCT AAG ATT-5'ATG CTC TTC TGG CCA GAA CGA TCT AAG ATT-5 '
B’ szekvenciaSequence B '
A fenti nukleotidszekvencia összehasonlítása a Hansenula polymorphából nyert, korábban leírt alkoholoxidáz Ledeboer és munkatársai által publikált nukleotidszekvenciájával számos jelentős különbséget tár fel, beleértve a jósolt aminosav-szekvenciát, a gén (és az ennek eredményeként létrejött fehérje) aktuális méretét, a kodoneltolódási hajlamát és hasonlókat.Comparison of the above nucleotide sequence with that of the previously described alcohol oxidase from Hansenula polymorphus published by Ledeboer et al. Reveals several significant differences, including the predicted amino acid sequence, the actual size of the gene (and the resulting protein), codon deletion hair.
A p76, mint dihidroxi-aceton szintetáz azonosításaIdentification of p76 as dihydroxyacetone synthase
A p76 gén első 51 nukleotidjához a nukleotídszekvenciát meghatározzuk standard technikákkal. Ebből a szekvenciából a p76 fehérje aminoterminális végének aminosavszekvenciáját meg lehet jósolni:For the first 51 nucleotides of the p76 gene, the nucleotide sequence is determined by standard techniques. From this sequence, the amino acid sequence of the amino terminus of the p76 protein can be predicted:
Aminosav-szekvencia: Met Alá Arg Ile Pro LysAmino acid sequence: Met Alá Arg Ile Pro Lys
Nukleotidszekvencia:nucleotide sequence:
5' -ATG GCT AGA ATT CCA AAA5 '-ATG GCT AGA ATT CCA AAA
3' -TAC CGA TCT TAA GGT TTT3 '-TAC CGA TCT TAA GGT TTT
Pro Val Ser Thr Gin Asp Asp Ile His Gly LeuPro Val Ser Thr Gin Asp Asp Ile His Gly Leu
CCA GTA TCG ACA CAA GAT GAC ATT CAT GAA TTG-3'CCA GTA TCG ACA CAA GAT GAC ATT CAT GAA TTG-3 '
GGT CAT AGC TGT GTT CTA CTG TAA GTA CTT AAC-5'GGT CAT AGC TGT GTT CTA CTG TAA GTA CTT AAC-5 '
A p76-nak ezt a megjósolt aminosavszekvenciáját össze lehet hasonlítani a Hansenula polymorphából nyert dihidroxi-aceton-szintetáz (DHAS) fehérje már publikált aminosav-szekvenciájával (Manowi és munkatársai). Bár a két szekvenciában számos különbség látható, vannak hasonlóságok is a két fehérje között, amelyet fel lehet ismerni:This predicted amino acid sequence of p76 can be compared to the published amino acid sequence of the dihydroxyacetone synthase (DHAS) protein from Hansenula polymorph (Manowi et al.). Although there are many differences between the two sequences, there are similarities between the two proteins that can be recognized:
PichiaDHAS:PichiaDHAS:
Met-Ala- -Arg-Ile-Pro-Lys-ProHansenula DHAS:Met-Ala -Arg-Ile-Pro-Lys-ProHansenula DHAS:
Met-Ser-Met-Arg-Ile-Pro-Lys -AlaVal-Ser-Thr-Gln-Asp-Ile-His-Glu- -Leu.Ala-Ser-Val-Asn-Asp-Glu-Gln-His-Gln-Axg-IleA Pichia p76 és Hansenula DHAS jelentős mértékű homológiájára és a hasonló fehérjemérete (kb. 76 000 dalton) alapozva a p76-ot próbaképpen azonosíthatjuk a Pichia DHAS-ének.Met-Ser-Met-Arg-Ile-Pro-Lys -AlaVal-Ser-Thr-Gln-Asp-Ile-His-Glu-Leu.Ala-Ser-Val-Asn-Asp-Glu-Gln-His-Gln -Axg-IleA Based on the significant homology of Pichia p76 and Hansenula DHAS and based on a similar protein size (about 76,000 Daltons), p76 can be tentatively identified as Pichia DHAS.
Mint a fentebb az alkoholoxidáz-génnél, a Pichia DHAS-fehérje első 51 nukleotidja nukleotidszekvenciájának összehasonlítása a Hansenula DHAS már korábban publikált (Janowicz és munkatársai) nukleotidszekvenciájával számos különbséget sugall a kodoneltolódási hajlamban, a jósolt aminosav-szekvecíában, a gén teljes méretében stb.As discussed above for the alcohol oxidase gene, comparison of the nucleotide sequence of the first 51 nucleotides of the Pichia DHAS protein with that of Hansenula DHAS previously published (Janowicz et al.) Suggests a number of differences in codon displacement, predicted amino acid sequence, etc.
Szabályozható promotorokat tartalmazó DNS-fragmensek Pichia pastorisbólDNA fragments containing Pichia pastoris containing regulatory promoters
A találmány szerinti eljárással előállított 5’ szabályozóterületeket részletezzük a 4., 5. és 6. ábrákon bemutatott restrikciós térképeken. Az 5’ szabályozóterület, amely a p76 polipeptid kifejeződését szabályozza, a 4a) ábrában ábrázolt DNS-ffagmensen belül helyezkedik el. A mintegy 2,9 kilobázispáros HindHlΎ/ζοΙ-fragmensről világosan kimutattuk, hogy tartalmazza a szabályozóterületet, amint ezt az alábbiakban teljesebben részletezzük.The regulatory regions 5 'produced by the method of the invention are detailed in the restriction maps shown in Figures 4, 5 and 6. The regulatory region 5 ', which regulates expression of the p76 polypeptide, is located within the DNA fragment shown in Figure 4a. The HindHl kil / ζοΙ fragment of about 2.9 kilobase pairs was clearly shown to contain the regulatory region, as further elaborated below.
Mivel a pPC 15.0 cDNS-klón nem teljes cDNS-kópia, a legvalószínűbb, hogy a 4a) ábrában ábrázolt DNS-fragmens legalább egy részlete magában foglalja a p76 polipeptidhez szolgáló szerkezeti kódoló szekvenciákat. így a szabályozófunkcióról úgy véljük, hogy a 4b) ábrában bemutatott mintegy 1300 bázispáros Hindlü-EcoRI-fragmensben van jelen. Az új β-galaktozidáz-gént tartalmazó szerkezetek, amelyeket a későbbiekben részletesebben tárgyalunk, alátámasztják ezt a véleményt.Because the cDNA clone pPC 15.0 is not a complete cDNA copy, it is most likely that at least a portion of the DNA fragment depicted in Figure 4a contains structural coding sequences for the p76 polypeptide. Thus, the regulatory function is believed to be present in the approximately 1300 base pair HindIII-EcoRI fragment shown in Figure 4b. Structures containing the novel β-galactosidase gene, which will be discussed in more detail below, support this view.
Az 5’ szabályozóterület, amely a p72 polipeptid (alkoholoxidáz) kifejeződését szabályozza, az 5. ábrában ábrázolt, mintegy 2000 bázispáros EcoRI-EcoRV DNS-fragmensen belül helyezkedik el. Az alább ismertetendő új β-galaktozidáz-gént tartalmazó szerkezetek demonstrálják ennek a DNS-fragmensnek a szabályozható természetét.The regulatory region 5 ', which regulates the expression of the p72 polypeptide (alcohol oxidase), is located within the approximately 2000 base pair EcoRI-EcoRV DNA fragment shown in Figure 5. The novel β-galactosidase gene-containing constructs described below demonstrate the controllable nature of this DNA fragment.
A 6. ábra a mintegy 3 kilobázispáros BamHI-Sall DNS-fragmens restrikciós térképét mutatja, amely fragmens magában foglalja a p40 polipeptid termelését szabályozó 5’ szabályozóterületet. Ez a fragmens világosan megkülönböztethető a 4. és 5. ábrákon részletezett 5’ szabályozóterületektől, többek között a DNSfragmensen belül elhelyezkedő eltérő restrikciós helyek alapján.Figure 6 shows a restriction map of a BamHI-SalI DNA fragment of about 3 kilobase pairs comprising the 5 'regulatory region regulating p40 polypeptide production. This fragment is clearly distinguished from the 5 'regulatory regions detailed in FIGS. 4 and 5, including by the different restriction sites within the DNA fragment.
A10., 2a) és 11, ábrák a p76, p72 (alkoholoxidáz), illetve p40 polipeptidekhez szolgáló szabályozóterületekhez és strukturgénekhez tartozó restrikciós enzimes adatokat mutatják. Ezen belül a 10. ábra a Pichia pastoris genomiális DNS 3,8 kilobázispáros HindHI-PríI-fragmensének részleteit mutatja, amely a p76 polipeptid termelését szabályozza és kódolja. A 2a) ábra a Pichia pastoris genomiális DNS 4,0 kilobázispáros EcoRI-PvuH-fragmensét mutatja, amely a p72 (alkoholoxidáz) polipeptid termelését szabályozza és kódolja. A II. ábra a Pichia pastoris genom DNS 3,7 kilobázispáros BamHI-EcoRIfragmensét mutatja be, amely a p4ű polipeptid termelését szabályozza és kódolja.Figures A10, 2a and 11 show restriction enzyme data for regulatory domains and structural genes for the p76, p72 (alcohol oxidase) and p40 polypeptides, respectively. In particular, Figure 10 shows details of a 3.8 kilobase HindIII-PII fragment of Pichia pastoris genomic DNA that regulates and encodes the production of the p76 polypeptide. Figure 2a is a 4.0 kb EcoRI-PvuH fragment of Pichia pastoris genomic DNA that regulates and encodes the production of the p72 (alcohol oxidase) polypeptide. II. Figure 3B shows a 3.7 kb BamHI-EcoRI fragment of Pichia pastoris genomic DNA that regulates and encodes the production of the p4β polypeptide.
A pPG 6.0, pPG 4.0 és pPG 4.8 genomiális kiónokat szintén lehet jellemezni restrikciós térképezéssel. így a pPG 6.0 kiónt az la) ábra részletezi. A tájékozódás egyik pontjaként a DNS-fragmens 5’ végét véljük a kiindulásnak G,origin”). A pPG 6.0 a Pichia pastoris kromoszomális DNS HindlII-fragmense, amely hoszszát tekintve mintegy 6 kilobázispár, és a következő különböző restrikciós enzimekkel hasad el:Genomic clones pPG 6.0, pPG 4.0 and pPG 4.8 can also be characterized by restriction mapping. Thus, pPG 6.0 clone is detailed in Figure 1a). As a point of orientation, the 5 'end of the DNA fragment is considered to be the origin G, origin'). PPG 6.0 is a HindIII fragment of the Pichia pastoris chromosomal DNA, which is about 6 kilobase pairs in length and is cleaved by the following different restriction enzymes:
HU 205 627 ΒHU 205 627 Β
A pPg 4.0 kiónt részletesen a 2a) ábra mutatja be. A klón a kromoszomális DNS egy EcoRI-HindlII-fragmense, amely mintegy 4 kilobázispár hosszúságú. A klón 5’ végét tekintve kiindulásnak („origin”), a következő restrikciós adatokat nyerjük pPG 4.0-hoz:The pPg 4.0 clone is shown in detail in Figure 2a. The clone is an EcoRI-HindIII fragment of chromosomal DNA about 4 kilobase pairs in length. Considering the origin of the 5 'end of the clone, the following restriction data for pPG 4.0 are obtained:
A pPG 4.8 kiónt részletesen a 3a) ábrán ábrázoljuk. A klón Pichia pastoris kromoszomális DNS 4,8 kilobázispáros BamHI-EcoRI-fragmense, amely a következő további restrikciós helyekkel rendelkezik:Clone pPG 4.8 is depicted in detail in Figure 3a. The clone is a 4.8 kilobase BamHI-EcoRI fragment of Pichia pastoris chromosomal DNA, which has the following additional restriction sites:
A pPG 6.0, pPG 4.0 és pPG 4.8 genomiális kiónokat a pBR322 E. coli-plazmidon levő egyedi restrikciós helyekbe való beiktatással manipuláljuk. A pPG 6.0 kiónt, amely HindlII-fragmens, egyszerűen klónozzuk a pBR322 HindlII helyére. A pPG 4.0 kiónt a pBR322 EcoRI-PvuU helyeire klónozzuk, és a pPG 4.8-at a pBR322 EcoRI-BamHI helyeire klónozzuk (lásd VI. példa). Az ezekkel a plazmidokkal transzformált E. coli-törzseket a Northern Régiónál Research Center (NRRL) intézetben a következő számokon helyeztük letétbe:The genomic clones pPG 6.0, pPG 4.0 and pPG 4.8 were manipulated by inserting into unique restriction sites on E. coli plasmid pBR322. Clone pPG 6.0, a HindIII fragment, was simply cloned into the HindIII site of pBR322. Clone pPG 4.0 was cloned into the EcoRI-PvuU sites of pBR322 and pPG 4.8 was cloned into the EcoRI-BamHI sites of pBR322 (see Example VI). E. coli strains transformed with these plasmids were deposited at the Northern Region Research Center (NRRL) under the following numbers:
A 7., 8. és 9. ábrák a p76, p72 (alkoholoxidáz), illetve p40 polípeptidek 3’ szabályozóterületeihez tartozó restrikciós térkép adatait mutatja. A 3’ szabályozószakaszok hasznosak a poliadenilezés, az átírás leállítása és a hírvivő RNS transzlációjának megállítása szabályozásában, amely RNS-t a megelőző nukleotidszekvenciák kódolnak. így a p76 polipeptid génjéből származó 3’ szabályozószakasz, amely a 7. ábrán bemutatott, 2,7 kilobázispár EcoRI-HindlII-fragmens, hasznos a poliadenilezés, valamint az átírás megállítása és a p76 polipeptidet kódoló mRNS transzlációjának megállítása szabályozásában, vagy bármilyen más mRNS szabályozásában, amely a 3’ szabályozóterülettől „felfelé” beiktatott génből származik. A 8a) ábrán részletezett, p72 génből származó 0,2 kilobázispár StuI-PvuII-fragmens, a 8b) ábrán részletezett, p72 génből származó 0,3 kilobázispár StuI-HindlII-fragmens, p72 génből származó, 3,2 kilobázispár Sall-EcoRI-fragmens, és a 9. ábrán részletezett, p40 génből származó, 1,9 kilobázispár Sáli— EcoRI-fragmens hasonlóképpen hasznosíthatók mind azokra a strukturgénekre vonatkozóan, amelyekkel ezek össze vannak kapcsolva a vad típusú Pichia pastorisban, mint bármilyen idegen (azaz heterológ) génekre vonatkozóan, amelyeket be lehet iktatni ezektől a 3’ szabályozóterületektől „felfelé”.Figures 7, 8 and 9 show restriction map data for the 3 'regulatory regions of p76, p72 (alcohol oxidase) and p40 polypeptides, respectively. The regulatory regions 3 'are useful in the regulation of polyadenylation, transcription termination and arrest of messenger RNA, which is encoded by the preceding nucleotide sequences. Thus, the 3 'regulatory region derived from the p76 polypeptide gene, a 2.7 kilobase Eco RI-HindIII fragment shown in Figure 7, is useful in regulating polyadenylation, transcription, and translation of mRNA encoding the p76 polypeptide, or any other mRNA. , derived from a gene upstream of the 3 'regulatory region. The 0.2 kilobase pair of StuI-PvuII fragment from p72 gene detailed in Fig. 8a, the 0.3 kilobase pair StuI-HindIII fragment from p72 gene detailed in Fig. 8b, the 3.2 kilobase pair of Sall-EcoRI derived from p72 gene. and the 1.9 kilobase SalI-EcoRI fragment derived from the p40 gene detailed in Figure 9 are similarly useful for the structural genes to which they are linked in wild type Pichia pastoris as for any foreign (i.e. heterologous) genes. that can be inserted upstream of these 3 'control regions.
Mivel az alkoholoxidáz-gén a pPG 4.0-ban az AO gén átírás-megállítási helytől néhány száz bázispáron belül van, a 8c ábrán részletezett további 3’ szekvenciát nyerünk a következő módon. Az első lépésben a Pichia kromoszomális DNS-t EcoRI-gyel és Sall-gyel emésztjük és az emésztett DNS-t hibridizáljuk az AO génből származó, 2,0 kilobázispár 32P-vel jelzett BamHIHindlII-fragmenssel, Southern foltképző módszer segítségével. A Pichia EcoRI-Sall emésztett fragmensei között, amelyek hibridizálódnak az AO gén vizsgálómintával, van egy 3,2 kilobázispár fragmens, amely kódolja az AO gén 3’ részét és a gén 3’ terminálisát szegélyező szekvenciákat.Because the alcohol oxidase gene in pPG 4.0 is within a few hundred base pairs of the AO gene transcription stop site, the additional 3 'sequence detailed in Figure 8c is obtained as follows. In the first step, the Pichia chromosomal DNA was digested with EcoRI and SalI and the digested DNA was hybridized with the 2.0 kb 32 P-labeled BamHIHindII fragment from the AO gene by Southern blotting. Among the digested fragments of Pichia EcoRI-SalI which hybridize to the AO gene probe is a 3.2 kilobase pair fragment that encodes sequences flanking the 3 'portion of the AO gene and the 3' terminal of the gene.
Az AO gén 3’ fragmensét azután klónozzuk úgy, hogy a mintegy 3,2 kbp-s, EcoRI-Sall hasított Pichia DNS-fragmenseket gélelucióval kinyerjük, és a fragmenseket EcoRI-el és Sall-el emésztett pBR322-be iktatjuk. Végül egy rekombináns plazmidot, a pPGThe 3 'fragment of the AO gene is then cloned by recovering the approximately 3.2 kbp Eco RI-SalI cleaved Pichia DNA fragments by gel elution and inserting them into Eco RI and SalI digested pBR322. Finally, a recombinant plasmid, pPG
3.2- t, amely tartalmazza az AO gén 3’ fragmensét, telephibridizálással azonosítunk, vizsgáló mintaként jelzett AO génfragmenst alkalmazva. Egy pPG 3.2 plazmiddal tamszformált E. coli törzset deponáltunk a Northern Régiónál Research Center intézetnél (Peoria, Illinois) NRRL B-15 999 számon. A 8c) ábra a pPG3.2, which contains the 3 'fragment of the AO gene, is identified by telephoto hybridization using the AO gene fragment as a probe. An E. coli strain transformed with plasmid pPG 3.2 was deposited with the Northern Region at the Research Center (Peoria, Illinois) under the accession number NRRL B-15999. Figure 8c) is pPG
3.2- ből származó Pichia DNS-fragmens restrikciós endonukleáz hasítási helyének térképét mutatja. A fragmens az AO 3’ részét (Sall-töl HindHI-ig) kódoló 1,53.2 shows a restriction endonuclease cleavage site map of the Pichia DNA fragment from 3.2. The fragment encodes a 3 'portion of AO (SalI to HindIII) 1.5
HU 205 627 Β kbp-t és az AO gén 3’ szekvenciájának mintegy 1,7 kbp-át tartalmazza.EN 205 627 Β kbp and about 1.7 kbp of the 3 'sequence of the AO gene.
A cDNS-klónok jellemzéseCharacterization of cDNA clones
APichiapastorisból származó szabályozható génekhez tartozó cDNS-klónokat szintén jellemeztük restrikciós térképezéssel. A 12. ábrán a p76 cDNS-t egy 1,1 kilobázispár fragmenst részletezzük. A DNS-szekvencia 5’ végére, mint kiindulásra („origin”) vonatkoztatva az Xhol restrikciós enzim a p76 cDNS-t mintegy 500 bázispár távolságra hasítja, a HincH a kiindulástól mintegy 950 bázispár távolságra hasít és az EcoRI a p76 cDNS-t a kiindulástól számítva mintegy 10501100 bázispár távolságra hasítja. A 12. ábrán bemutatott cDNS-klón, valamint a 13. és 14. ábrán bemutatott cDNS-klónok mind PstI végekkel vannak bemutatva. Ezek mesterségesen megalkotott restrikciós helyek, az eredetileg nyert kompIementer-DNS G-C farokképzésével előállítva, hogy megkönnyítsük a DNS-fragmensek klónozását pBR322-be. Northern hibridizálási tanulmányokra és a polipeptid termék méretére alapítva úgy becsülhető, hogy a pPC 15.0 cDNS-klón a p76 mRNS nem tökéletes másolata, amely csupán a teljes hírvivő RNS-szekvencia mintegy felét képviseli.CDNA clones belonging to the regulatory genes from Pichiapastoris were also characterized by restriction mapping. Figure 12 shows a 1.1 kilobase pair fragment of p76 cDNA. Based on the 5 'end of the DNA sequence as the origin, the restriction enzyme XhoI cleaves p76 cDNA at about 500 bp, HincH cleaves at about 950 bp from start, and Eco RI p76 cDNA at start. calculated at about 10501100 base pairs. The cDNA clone shown in Figure 12 and the cDNA clones shown in Figures 13 and 14 are all shown with PstI ends. These are artificially created restriction sites produced by G-C tailing of the originally obtained complementer DNA to facilitate the cloning of the DNA fragments into pBR322. Based on Northern hybridization studies and the size of the polypeptide product, it is estimated that the cDNA clone pPC 15.0 is an imperfect copy of the p76 mRNA, representing only about half of the total messenger RNA sequence.
A 13. ábrán a p72 (alkoholoxidáz) cDNS összetett restrikciós térképét mutatjuk be, amely a pPC 8.3 és pPC 8.0 klónok átfedésével van megalkotva. Akárcsak fentebb, a DNS-szekvencia 5’ végét tekintjük kiindulásnak („origin”). így az alkoholoxidáz cDNS kezelése különböző restrikciós enzimekkel a következő méretű fragmenseket adja:Figure 13 shows a composite restriction map of p72 (alcohol oxidase) cDNA constructed by overlapping clones pPC 8.3 and pPC 8.0. As above, the 5 'end of the DNA sequence is considered to be "origin". Thus, treatment of the alcohol oxidase cDNA with various restriction enzymes yields fragments of the following size:
ApPC 8.0 és pPC 8.3 kiónokban az alkoholoxidázgén 3’ végének restrikciós enzim térképezése feltárja, hogy a pPC 8.3 cDNS-klőnnak hiányzik mintegy 250 nukleotidja az alkoholoxidáz mRNS-szekvencíáből (2. ábra). Az alkoholoxidáz mRNS 3’ végénél jelen lévő szekvenciák jelen vannak a pPC 8.0 cDNS-klónban, amely átfedi a pPC 8.3-at mintegy 500 nukleotiddal.Restriction enzyme mapping of the 3 'end of the alcohol oxidase gene in clones pPC 8.0 and pPC 8.3 reveals that the pPC 8.3 cDNA clone lacks about 250 nucleotides in the alcohol oxidase mRNA sequence (Figure 2). The sequences present at the 3 'end of the alcohol oxidase mRNA are present in the cDNA clone pPC 8.0, which overlaps pPC 8.3 with about 500 nucleotides.
A 14. ábra a p40 polipeptid cDNS-hez, egy 1,2 kilobázispár fragmenshez szolgáló restrikciós térképet nyújt. A cDNS-klón 5’ végét tekintve kiindulásnak (origin), a pPC 6.7 kiónt a Sáli (és a HincII) az origintől mintegy 1000 báispárral hasítja.Figure 14 provides a restriction map for the p40 polypeptide cDNA, a 1.2 kilobase pair fragment. Considering the origin of the 5 'end of the cDNA clone, pPC 6.7 is cleaved by SalI (and HincII) by about 1000 bp from origin.
A cDNS-fragmensek mindegyikét pBR322-be klónozzuk, amelyet azután E. coliba transzformálunk. A transzformáit törzseket deponáltuk a Northern Régiónál Research Center Intézetnél (Peoria, Illinois) a következő számokon:Each cDNA fragment was cloned into pBR322, which was then transformed into E. coli. Transformed strains were deposited at the Northern Region Research Center Institute (Peoria, Illinois) with the following numbers:
A fentebb leírt cDNS-klónok mindegyike hasznos vizsgáló mintaként a metanolon, mint egyedüli szén- és energiaforráson növekedő élesztő egyedi polipeptidjeinek termelését kódoló kromoszomális DNS azonosításához és izolálásához. Ezért, mint korábban leírtuk, ezeket a kiónokat alkalmazzuk olyan Pichia pastoris kromoszomális DNS-fragmensek azonosítására, amelyek olyan egyedi polipeptidekre vonatkozó szabályozóterületeket és szerkezeti kódoló információkat tartalmaznak, amely polipeptideket akkor észleljük, amikor a Pichia pastoris metanolon nő. Hasonló módon ezek a cDNS-klónok hasznosíthatók vizsgáló mintaként más metanolasszimiláló élesztőkből származó analóg gének azonosításához és kinyeréséhez is, ilyenek lehetnek pl. a Torulopsis molischiana, Hansenula capsulatum, H. nonfermentans és hasonlók (lásd XVII. példa).Each of the cDNA clones described above is useful as a probe for the identification and isolation of chromosomal DNA encoding the production of unique polypeptides of methanol as the sole carbon and energy source. Therefore, as described previously, these clones are used to identify chromosomal DNA fragments of Pichia pastoris that contain regulatory regions and structural coding information for individual polypeptides that are detected when Pichia pastoris grows on methanol. Similarly, these cDNA clones can be used as probes to identify and recover analogous genes from other methanol-simulating yeasts, e.g. Torulopsis molischiana, Hansenula capsulatum, H. nonfermentans and the like (see Example XVII).
Az alkoholoxidáz gén részletes elemzéseDetailed analysis of the alcohol oxidase gene
A pPG 4.0 klón 5’ szabályozőterületét tovább jellemezzük a klón nukleotidszekvenciájánakmeghatározásával attól a ponttól „felfelé” (5’ felé), ahol a p72 (alkoholoxidáz) szerkezeti információja kódolődik. Az mRNS transzlációs starthely (ATG kodon) előtti első 250 nukleotidról úgy véljük, hogy a következő:The 5 'regulatory region of pPG 4.0 clone is further characterized by determining the nucleotide sequence of the clone "upstream" (5') where the structural information of p72 (alcohol oxidase) is encoded. The first 250 nucleotides upstream of the mRNA translation start site (ATG codon) are believed to be:
5'-ATGCTTCCAA GATTCTGGTG GGAATACIGC TGATAGCCTA5'-ATGCTTCCAA GATTCTGGTG GGAATACIGC TGATAGCCTA
ACGTTCATGA TCAAAATTTA ACTGTTCTAA CCCCTACTTGACGTTCATGA TCAAAATTTA ACTGTTCTAA CCCCTACTTG
GACAGGCAAT ATATAAACAG AAGGAAGCTG CCCTGTCTTAGACAGGCAAT ATATAAACAG AAGGAAGCTG CCCTGTCTTA
AACCTTTTTT TTTATCATCA TTATTAGCTT ACTTTCATAAAACCTTTTTT TTTATCATCA TTATTAGCTT ACTTTCATAA
TTGCGACTGG TTCCAATTGA CAAGCTTTTG ATTTTAACGATTGCGACTGG TTCCAATTGA CAAGCTTTTG ATTTTAACGA
CTTTTAACGA CAACTTGAGA AGATCAAAAA ACAACTAATT ATTCGAAACG-3'.CTTTTAACGA CAACTTGAGA AGATCAAAAA ACAACTAATT ATTCGAAACG-3 '.
C szekvenciaC sequence
A pPG 4.0 klón promotor funkciójáról úgy véljük, hogy a nukleotidbázisoknak ezen a szekvenciáján belül található meg.The promoter function of pPG 4.0 clone is believed to be located within this sequence of nucleotide bases.
Abból a célból, hogy még teljesebben leírhassuk ezt az új DNS-fragmenst, további 301 nukleotidot határoztunk meg a fenti C szekvenciában részletezett szekvenciától tovább „felfelé”.In order to further describe this new DNA fragment, an additional 301 nucleotides from the sequence detailed in SEQ ID NO.
így az mRNS transzlációs starthely előtti első 551 nukleotidról úgy véljük, hogy a következők:Thus, the first 551 nucleotides upstream of the mRNA translation site are believed to be:
5' -AATGGCCAAAA CTGACAGTTT AAACGCTGTC TTGGAACCTA5 '-AATGGCCAAAA CTGACAGTTT AAACGCTGTC TTGGAACCTA
ATATGACAAA AGCGTGATCT CATCCAAGAT GAACTAAGTTATATGACAAA AGCGTGATCT CATCCAAGAT GAACTAAGTT
TGGTTCGTTG AAATTCTAAC GGCCAGTTGG GAACTAAGTTTGGTTCGTTG AAATTCTAAC GGCCAGTTGG GAACTAAGTT
ACTTCCAAAA GTCGCCATAC CGTTTGTCTT GTTTGGTATIACTTCCAAAA GTCGCCATAC CGTTTGTCTT GTTTGGTATI
GATTGACGAA TGCTCAAAAA TAATCTCATT AATGCTTAGCGATTGACGAA TGCTCAAAAA TAATCTCATT AATGCTTAGC
GCAGTCTCTC TATCGCTTCT GAACCCGGTG GCACCTGTGCGCAGTCTCTC TATCGCTTCT GAACCCGGTG GCACCTGTGC
HU 205 627 ΒHU 205 627 Β
CGAAACGCAA ATGGGGAAAC AACCCGCTTT TTGGATGATTCGAAACGCAA ATGGGGAAAC AACCCGCTTT TTGGATGATT
ATGCATTGTC CTCCACATTGT ATGCTTCCAA GATTCTGGTGATGCATTGTC CTCCACATTGT ATGCTTCCAA GATTCTGGTG
GGAATACTGC TGATAGCCTA ACGTTCATGA TCAAAATTTAGGAATACTGC TGATAGCCTA ACGTTCATGA TCAAAATTTA
ACTGTTCTAA CCCCTACTTG GACAGGCAAT ATATAAACAGACTGTTCTAA CCCCTACTTG GACAGGCAAT ATATAAACAG
AAGGAAGCTG CCCTGTCTTA AACCTTTTTT TTTATCATCAAAGGAAGCTG CCCTGTCTTA AACCTTTTTT TTTATCATCA
TTATTAGCTT ACTTTCATAA TTGCGACTGG TTCCAATTGATTATTAGCTT ACTTTCATAA TTGCGACTGG TTCCAATTGA
CAAGCTTTTG ATTTTAACGA CTTTTAACGA CAACTTGAGA AGATCAAAAA ACAACTAATT ATTCGAAACG-3'CAAGCTTTTG ATTTTAACGA CTTTTAACGA CAACTTGAGA AGATCAAAAA ACAACTAATT ATTCGAAACG-3 '
D szekvenciaD sequence
A D szekvenciában található további nukleotidokról (a C szekvenciával összhasonlítva) úgy hisszük, hogy a C szekvencián belül található promotomak további szabályozófunkciót nyújt ismeretlen mechanizmus útján. Látható, hogy a D szekvencia a XIV. és XV. példákban bemutatott élesztőkben a génkifejeződés szabályozására képes 1,1 kbp-os DNS-fragmensnek csupán DNS-szekvencia részletét képviseli. Lehet, hogy a további szabályozófunkciók a D szekvenciában nem részletezett 1,1 kbp-os DNS-fragmens részében kódolódnak.Additional nucleotides in sequence D (compared to sequence C) are believed to have additional regulatory functions within the C sequence by an unknown mechanism. It can be seen that the sequence D is shown in XIV. and XV. The 1.1 kbp DNA fragment capable of regulating gene expression in yeasts described in Examples 1 to 5 only represents a portion of the DNA sequence. Additional regulatory functions may be encoded within a portion of the 1.1 kbp DNA fragment not detailed in SEQ ID NO: D.
Abból a célból, hogy tovább leírjuk ezt az új 1,1 kbp-os DNS-fragmenst, további nukleotidszekvenciaelemzést végeztünk, hogy teljesen körvonalazzuk a XIV. és XV. példában bemutatott teljes 1,1 kbp-os DNS-fragmenst, amely képes a génkifejeződést szabályozni élesztőben. A nukleotidszekvenciát mint D’ szekvenciát ábrázoljuk:In order to further characterize this novel 1.1 kbp DNA fragment, additional nucleotide sequence analysis was performed to completely outline the XIV. and XV. which is capable of regulating gene expression in yeast. The nucleotide sequence is depicted as the D 'sequence:
5' -AGATCTAA CATCCAAAGA5 '-AGATCTAA CATCCAAAGA
CGAAAGGTTG AATGAAACCT TTTTGCCATC CGACATCCACCGAAAGGTTG AATGAAACCT TTTTGCCATC CGACATCCAC
AGGTCCATTC TCACACATAA GTGCCAAACG CAACAGGAGGAGGTCCATTC TCACACATAA GTGCCAAACG CAACAGGAGG
GGATACACTA GCAGCAGACG TTGCAAACGC AGGACTCATCGGATACACTA GCAGCAGACG TTGCAAACGC AGGACTCATC
CTCTTCTCTA ACACCATTTT GCATGAAAAC AGCCAGTTATCTCTTCTCTA ACACCATTTT GCATGAAAAC AGCCAGTTAT
GGGCTTGATG GAGCTCGCTC ATTCCAATTC CTTCTATTAGGGGCTTGATG GAGCTCGCTC ATTCCAATTC CTTCTATTAG
GCTACTAACA CCATGACTTT ATTAGCCTGT CTATCCTGGCGCTACTAACA CCATGACTTT ATTAGCCTGT CTATCCTGGC
CCCCCTGGCG AGGTCATGTT TGTTTATTTC CGAATGCAACCCCCCTGGCG AGGTCATGTT TGTTTATTTC CGAATGCAAC
AAGCTCCGCA TTACACCCGA ACATCACTCC AGATGAGGGCAAGCTCCGCA TTACACCCGA ACATCACTCC AGATGAGGGC
TTTCTGAGTG TGGGGTCAAA TAGTTTCATG TTCCCAAATG GCCCAAACT GACAGTTTAA ACGCTGTCTT GGAACCTAATTTTCTGAGTG TGGGGTCAAA TAGTTTCATG TTCCCAAATG GCCCAAACT GACAGTTTAA ACGCTGTCTT GGAACCTAAT
ATGACAAAAG CGTGATCTCA TCCAAGATGA ACTAAGTTTGATGACAAAAG CGTGATCTCA TCCAAGATGA ACTAAGTTTG
GTTCGTTGAA ATCCTAACGG CCAGTTGGTC AAAAAGAAAC TTCCAAAAGT CGCCATACCG TTTGTCTTGT TTGGTATTGA TTGACGAATG CTCAAAAATA ATCTCATTAA TGCTTAGCGC AGTCTCTCTA TCGCCTCTGA ACCCGGTGGC ACCTGTGCCG AAACGCAAAT GGGGAAACAA CCCGCTTTTT GGATGATTAT GCATTGTCCT CCACATTGTA TGCTTCCAAG ATTCTGGTGG GAATACTGCT GATAGCCTAA CGTTCATGAT CAAAATTTAA CTGTTCTAAC CCCTACTTGG ACAGGCAATA TATAAACAGA AGGAAGCTGC CCTGTCTTAA ACCTTTTTTT TTATCATCAT TATTAGCTTA CTTTCATAAT TGCGACTGGT TCCAATTGAC AAGCTTTTGA ttttaacgac ttttaacgac aacttgagaaGTTCGTTGAA ATCCTAACGG CCAGTTGGTC AAAAAGAAAC TTCCAAAAGT CGCCATACCG TTTGTCTTGT TTGGTATTGA TTGACGAATG CTCAAAAATA ATCTCATTAA TGCTTAGCGC AGTCTCTCTA TCGCCTCTGA ACCCGGTGGC ACCTGTGCCG AAACGCAAAT GGGGAAACAA CCCGCTTTTT GGATGATTAT GCATTGTCCT CCACATTGTA TGCTTCCAAG ATTCTGGTGG GAATACTGCT GATAGCCTAA CGTTCATGAT CAAAATTTAA CTGTTCTAAC CCCTACTTGG ACAGGCAATA TATAAACAGA AGGAAGCTGC CCTGTCTTAA ACCTTTTTTT TTATCATCAT TATTAGCTTA CTTTCATAAT TGCGACTGGT TCCAATTGAC AAGCTTTTGA ttttaacgac ttttaacgac aacttgagaa
GATCAAAAAA GAACTAATTA TTCGAAACG-3'GATCAAAAAA GAACTAATTA TTCGAAACG-3 '
D’ szekvenciaD '
Azok, akik a szakterületen jártasak, felismerik, hogy a C és D szekvenciákhoz viszonyított további szabályozófunkciókat lehet kódolni a D’ szekvenciának abban a részében, amely a C és D szekvenciákban részletezett nukleotidszekvenciáktól tovább „felfelé” (vagyis az 5’ irányban) van.Those skilled in the art will recognize that additional regulatory functions relative to sequences C and D may be encoded within the portion of sequence D 'further upstream (i.e., 5') from the nucleotide sequences detailed in sequences C and D.
Hogy meghatározzuk, hol kezdődik az alkoholoxidáz-génhez az RNS-átírás, a pPG 4.0 genomiális kiónból és a pPC 8.3 cDNS-klónból ennek a génnek az 5’ vége körüli DNS-szekvenciákat összehasonlítjuk. A pPC 8.3 cDNS-klón az alkoholoxidáz-génhez 5’ irányban egy le nem fordított terület mintegy 100 nukleotidját tartalmazza. Erre a szekvenciára alapozva 15 bázisos oligonukleotidot (5’-CTTCTCAAGTTGTTCG-3’) szintetizálunk (lásd IX. példa), amely a -29-től -43 nukleotidok szempontjából komplementer, ahol a transzlációs rajthely (ATG kodon) a nukleotidját +l-nek és a nukleotidot 5’ irányban -1-nek jelöljük. A 15 bázisos oligonukleotidot primőrként alkalmazzuk, hogy meghosszabbítsuk az alkoholoxidáz mRNS mentén, hogy elérje az 5’ végét. Az ebből a primermeghosszabbítási kísérletből nyert cDNS-szekvencia három különböző átírási kiindulási pontot eredményez Pichia pastoris alkoholoxidáz mRNS-hez. A fő átirat 144 nukleotidra kezdődik a transzlációs kiindulási kodontól. Két kisebb alternatív kodon kezdődik 117 illetve 111 nukleotidra „fölfelé” (5’ irányban) az alkoholoxidáz AUG kodontól.To determine where RNA transcription for the alcohol oxidase gene begins, the DNA sequences around the 5 'end of this gene from the pPG 4.0 genomic clone and the pPC 8.3 cDNA clone are compared. The pPC 8.3 cDNA clone contains about 100 nucleotides of an untranslated region 5 'to the alcohol oxidase gene. Based on this sequence, 15 basic oligonucleotides (5'-CTTCTCAAGTTGTTCG-3 ') were synthesized (see Example IX), which is complementary to nucleotides -29 to -43, where the translational start site (ATG codon) has + 1 nucleotide. and the nucleotide is designated as -1 in the 5 'direction. The 15 basic oligonucleotide is used as a primer to extend along the alcohol oxidase mRNA to reach the 5 'end. The cDNA sequence obtained from this primer extension experiment results in three different transcription start points for Pichia pastoris alcohol oxidase mRNA. The main transcript begins at 144 nucleotides from the translation start codon. Two smaller alternate codons begin at 117 and 111 nucleotides upstream (5 ') from the alcohol oxidase AUG codon.
Az alkoholoxidáz mRNS rajtját megelőző 55 nukleotid egy feltételezett Goldberg-Hogness „box”-ot (TATAA box) tartalmaz.The 55 nucleotides preceding the start of the alcohol oxidase mRNA contains a putative Goldberg-Hogness "box" (TATAA box).
A TATAAA szekvencia 40 helyre található az alkoholoxidáz mRNS-hez szolgáló uralkodó átirat 5’ végétől és ennél fogva 165 nukleotiddal „fölfelé” az ehhez a fehérjéhez szolgáló kiindulási kodontól.The TATAAA sequence is located 40 positions upstream of the 5 'end of the predominant transcript for the alcohol oxidase mRNA and therefore 165 nucleotides upstream of the parent codon for this protein.
Az alkoholoxidáz-gén 3’ szabályozóterületét tovább jellemezzük, meghatározva a nukleotidszekvenciát mintegy 120 nukleotidra „lefelé” attól a ponttól, ahol a p72-höz (alkoholoxidáz) tartozó szerkezeti információ kódolódik. A szekvenciát az alábbiakban mutatjuk be, mint D’ szekvenciát:The 3 'regulatory region of the alcohol oxidase gene is further characterized by determining the nucleotide sequence "downstream" about 120 nucleotides from the point where the structural information for p72 (alcohol oxidase) is encoded. The sequence is shown below as the sequence D ':
5'-TCAAGAGGAT GTCAGAATGC CATTTGCCTG AGAGATGCAG5′-TCAAGAGGAT GTCAGAATGC CATTTGCCTG AGAGATGCAG
GTCTCATTTT TGATACTTTT TTATTTGTAA CCTATATAGTGTCTCATTTT TGATACTTTT TTATTTGTAA CCTATATAGT
ATAGGATTTT TTTTGTCAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA-3'ATAGGATTTT TTTTGTCAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA-3 '
D” szekvenciaD 'sequence
A p76 gén részletes elemzéseDetailed analysis of the p76 gene
A pPG 6.0 klón 5’ szabályozóterületét tovább jellemezzük, meghatározva a klón nukleotidszekvenciáját attól a ponttól „felfelé” (5’ irányában), ahol a p76-hoz tartozó szerkezeti információ kódolódik, Az első 622 nukleotidról az mRNS transzlációs rajthely (ATG kodon) előtt úgy hisszük, hogy a következők:The 5 'regulatory region of pPG 6.0 clone is further characterized by determining the nucleotide sequence of the clone "upstream" (5') where the structural information for p76 is encoded, from the first 622 nucleotides before the mRNA translation start site (ATG codon). we believe that:
5'-TT5'-TT
CACCCATACA ACTATAAACC TTAGCAÁTTG AAATAACCCCCACCCATACA ACTATAAACC TTAGCAÁTTG AAATAACCCC
AATTCATTGT TCCGAGTTTA ATATACTTGC CCCTATAAGAAATTCATTGT TCCGAGTTTA ATATACTTGC CCCTATAAGA
AACCAAGGGA TTTCAGCTTC CTTACCCCAT GAACAGAATCAACCAAGGGA TTTCAGCTTC CTTACCCCAT GAACAGAATC
TTCCATTTAC CCCCCACTGG AGAGATCCGC CCAAACGAACTTCCATTTAC CCCCCACTGG AGAGATCCGC CCAAACGAAC
AGATAATAGA AAAAAACAAT TCGGACAAAT AGAACACTTTAGATAATAGA AAAAAACAAT TCGGACAAAT AGAACACTTT
CTCAGCCAAT TAAAGTCATT CCATGCACTC CCTTTAGCTGCTCAGCCAAT TAAAGTCATT CCATGCACTC CCTTTAGCTG
CCGTTCCATC CCTTTGTTCA GCAACACCAT CGTTAGCCAGCCGTTCCATC CCTTTGTTCA GCAACACCAT CGTTAGCCAG
TACGAAAGAG GAAACTTAAC CGATACCTTG GAGAAATCTATACGAAAGAG GAAACTTAAC CGATACCTTG GAGAAATCTA
AGGCGCGAAT GAGTTTAGCC TAGATATCCT TAGTGAAGGGAGGCGCGAAT GAGTTTAGCC TAGATATCCT TAGTGAAGGG
TGTCCGATAC TTCTCCACAT TCAGTCATAG ATGGGCAGCTTGTCCGATAC TTCTCCACAT TCAGTCATAG ATGGGCAGCT
TGTATCATGA AGAGACGGAA ACGGGCATAA GGGTAACCGCTGTATCATGA AGAGACGGAA ACGGGCATAA GGGTAACCGC
HU 205 627 ΒHU 205 627 Β
CA&ATTATAT AAAGACAACA TGCCCCAGTT TAAAGTTTTTCA & ATTATAT AAAGACAACA TGCCCCAGTT TAAAGTTTTT
CTTTCCTATT CTTGTATCCT GAGTGACCGT TGTGTTTAATCTTTCCTATT CTTGTATCCT GAGTGACCGT TGTGTTTAAT
ATAAAAAGTT CGTTTTAACT TAAGACCAAA ACCAGTTACAATAAAAAGTT CGTTTTAACT TAAGACCAAA ACCAGTTACA
ACAAATTATA ACCCCTCTAA ACACTAAAGT TCACTCTTATACAAATTATA ACCCCTCTAA ACACTAAAGT TCACTCTTAT
CAAACTATCA AACATCAAAA-3'CAAACTATCA AACATCAAAA-3 '
D’” szekvenciaD '' sequence
A pPG 6.0 klón promotor funkciójáról úgy hisszük, hogy a nukleotidbázisoknak ezen a szekvenciáján belül található, bár azok akik a szakterületen jártasak, felismerhetik, hogy további szabályozótulajdonságok adódhatnak azon szekvenciák által, amelyek a D’” szekvenciához adott szekvenciáktól tovább „felfelé” találhatók.The promoter function of clone pPG 6.0 is believed to be within this sequence of nucleotide bases, although those skilled in the art may recognize that additional regulatory properties may result from sequences further upstream of sequences added to sequence D '.
A pPG 6.0 klón 3’ szabályozóterületét tovább jellemezzük, meghatározva a nukleotidszekvenciát mintegy 180 nukleotidra „lefelé” (3’ irányban) attól a ponttól, ahol a p76 szerkezeti információja kódolódik. A szekvenciát az alábbiakban mutatjuk be, mint D’” szekvenciátThe 3 'regulatory region of clone pPG 6.0 is further characterized by determining the nucleotide sequence "downstream" (in the 3' direction) about 180 nucleotides from the point where the structural information of p76 is encoded. The sequence is set forth below as the D '' sequence
5' -GTCAGCAGTG TTTCCTGCCA AAGCCATCAA GAGGACGTAC5 '-GTCAGCAGTG TTTCCTGCCA AAGCCATCAA GAGGACGTAC
ATGCTCTCAT TTTTTGGTTT TCTATGTCCG ACGGGGTTCGATGCTCTCAT TTTTTGGTTT TCTATGTCCG ACGGGGTTCG
TAAACTGGCT TCCTCCTTTT CTTTTCCTGT TGCATTTTATTAAACTGGCT TCCTCCTTTT CTTTTCCTGT TGCATTTTAT
TTGGTCAAAC AAAACTAGGG TCTTTTCCTA AAACCTTATGTTGGTCAAAC AAAACTAGGG TCTTTTCCTA AAACCTTATG
TCAATGGACC TACCACATAG-3'TCAATGGACC TACCACATAG-3 '
D’”’ szekvenciaD '' 'sequence
A transzformált élesztő kifejeződéseExpression of transformed yeast
A jelen találmány szerinti fentebb leírt plazmidok olyan élesztőkben hasznosíthatók, amelyek transzformálhatók. A génkifejezödés szabályozását élesztőkben a jelen találmány szerinti új DNS-fragmensek segítségével úgy lehet kivitelezni, hogy a transzformált organizmusokat szénfonáséhezésnek vetjük alá. A szénforráséhezés különböző mind katabolit represszáló, mind nem katabolit represszáló szénforrásokon való növesztés után a találmány szerinti szabályozószakaszok szabályozása alatt tartott géntermék kifejeződését indukálja. A kívánt géntérmék kifejeződésének elérésére transzformált élesztők megfelelő fajaiban egy másik mód a transzformált élesztők növesztése metanolon. Egy megint másik mód a kívánt géntermék kifejeződésének redukálására a transzformált élesztő növesztése olyan tápközegen, amely nem katabolit-represszáló szénforrásokat tartalmaz.The above-described plasmids of the present invention are useful in yeasts which are transformable. The regulation of gene expression in yeast can be accomplished by the novel DNA fragments of the present invention by subjecting the transformed organisms to carbon spinning. Carbon source starvation and induction of expression of a gene product under control of the regulatory sequences of the invention after growth on various catabolite repressing and non-catabolite repressing carbon sources. Another way to achieve expression of desired gene products in appropriate species of transformed yeast is to grow the transformed yeast in methanol. Another way to reduce expression of the desired gene product is to grow the transformed yeast on a medium containing non-catabolite repressing carbon sources.
A jelen találmány szerinti szabályozó területek hasznosak a kifejeződéshez minden élesztő törzsben, mivel a szabályozóterületekről kimutattuk, hogy különböző körülmények között indukálhatok. így pl. a metanolon vagy nem katabolit represszáló szénforrásokon növekedni képes élesztőknél elő lehet idézni, hogy idegen, vagyis heteroíóg olipeptideket közvetlenül állítsanak elő; míg a katabolit represszáló szénforrásokon növekedni képes élesztőknél úgy lehet előidézni, hogy idegen polipeptidet állítsanak elő, hogy az így nőtt élesztősejteket szénforrás-éhezési feltételeknek vetjük alá.The regulatory regions of the present invention are useful for expression in all yeast strains since the regulatory regions have been shown to be inducible under various conditions. so e.g. yeasts capable of growing on methanolic or non-catabolite-repressing carbon sources can be induced to produce foreign, i.e., heterologous, olipeptides; whereas yeasts capable of growing on catabolite repressing carbon sources can be induced to produce foreign polypeptide by subjecting the yeast cells thus grown to carbon source starvation conditions.
A találmány szerinti eljárásban transzformálásra előnyösen a kővetkező nemzetségek tagjai alkalmazhatók:Preferred members of the following genera for transformation in the method of the invention are:
Candida,Candida,
Kloeckera,Kloeckera,
Saccharomyces,Saccharomyces,
Schizosaccharomyces,Schizosaccharomyces,
Rhodotorula,Rhodotorula,
Hansenula,Hansenula,
Torulopsis,Torulopsis,
Pichia ésPichia and
Kluyveromyces.K..
Az ezekből a nemzetiségekből nyert élesztők azért előnyösek mert kezelésük biztonságos, növekedési és egyéb feltételeik jól meghatározottak és jól ismertek mindazok számára, akik a szakterületen járatosak.Yeasts derived from these nationalities are advantageous because their treatment is safe, their growth and other conditions are well defined and well known to those skilled in the art.
Különösen előnyös élesztő törzsek a jelen találmány szerinti eljárás egyik kiviteli módjához való alkalmazáshoz azok az élesztő törzsek, amelyek képesek nőni metanolon, mint egyedüli szén- és energiafonráson. Azok az élesztők, amelyekről ismert, hogy képesek növekedni metanolon, a következő nemzetiségek tagjai:Especially preferred yeast strains for use in one embodiment of the method of the present invention are those yeast strains that are capable of growing on methanol as the sole source of carbon and energy. Yeasts known to be capable of growing on methanol are members of the following nationalities:
Candida,Candida,
Kloeckera,Kloeckera,
Saccharomyces,Saccharomyces,
Rhodotorula,Rhodotorula,
Hansenula,Hansenula,
Torulopsis ésTorulopsis and
Pichia.Pichia.
Mivel a jelen találmány szerinti szabályozőterületek szintén indukálhatok nem katabolit represszáló szénforrásokban való növesztéssel, valamint szénforráséhezés körülményei között, azok az élesztő törzsek, amelyek képesek növekedni az olyan nem metanol szubsztrátumokon, mint:Because the regulatory regions of the present invention may also be induced by growth in non-catabolite repressing carbon sources and under carbon source starvation conditions, yeast strains capable of growing on non-methanol substrates such as:
glükóz, acetát, glicerin, etanol, laktóz, galaktóz, fruktóz, szacharóz és hasonlók, valamint a fentiekből kettőnek vagy többnek a keveréke, szintén használhatók. A gazdaszervezet növesztésével megfelelő nem katabolit represszáló, nem metanol szénforráson, pl. glicerinen és galaktózon, vagy a gazdszervezet növesztésével megfelelő katabolit represszáló szénforráson, pl. etanolon, glükózon és fruktózon, majd szénforrás-éhezési körülményeknek kitéve a gazdaszervezetet, el lehet érni a géntermék kifejeződését a találmány szerinti szabályozóterületek szabályozása alatt.glucose, acetate, glycerol, ethanol, lactose, galactose, fructose, sucrose and the like, and mixtures of two or more of the foregoing may also be used. With host growth, a suitable non-catabolite repressing non-methanol carbon source, e.g. glycerol and galactose; or, by host growth, a suitable catabolite repressing carbon source, e.g. ethanol, glucose and fructose, and then exposing the host to carbon source starvation conditions, expression of the gene product can be achieved under the control of the regulatory regions of the invention.
Ezen kívül, mivel a találmány szerinti szabályozóterületek érzékenyek a különböző növekedési feltételekre mind a kifejeződés indukcióját, mind represszióját tekintve, a találmány szerinti szabályozóterületek szabályozása alatt a géntermék szabályozott kifejeződését lehet elérni. így pl. sejteket lehet növeszteni olyan szénforráson, amely az idegen génkifejeződését csak alacsony szinten indukálja, majd át lehet kapcsolni metanolra, amely azután erősen indukálja a génkifeje12In addition, since the regulatory regions of the invention are sensitive to different growth conditions in terms of both induction and repression of expression, regulated expression of the gene product can be achieved under the control of the regulatory regions of the invention. so e.g. cells can be grown on a carbon source that only induces foreign gene expression at a low level and then switched to methanol, which is then strongly induced by gene expression12.
HU 205 627 Β ződést. Egy más módszer szerint a génkifejeződést úgy lehet elérni, hogy indukáló/represszáló tápanyagok keverékét, pl. metanol-glükóz keveréket alkalmazunk. Egy újabb másik módszer szerint a metanolon történt növekedés által előidézett magas kifejeződési szinteket csökkenteni lehet ha szükséges, represszáló szénforrás, pl. glükóz vagy etanol hozzáadásával a növesztő tápközeghez. Természetesen azok, akik a szakterületen jártasak, felismerik, hogy a tápanyagkeverékeknek és a tápanyag-beadási sorrendeknek más variációi is lehetségesek, és ezek a szabályozás nagy lehetőségét nyújtják a találmány szerinti szabályozóterületekből nyert génkifejeződés szintjén.EN 205 627 Β to prevent damage. Alternatively, gene expression may be achieved by mixing inducing / repressing nutrients, e.g. methanol-glucose mixture. In another method, high levels of expression induced by growth in methanol can be reduced if necessary by repressing a carbon source, e.g. by adding glucose or ethanol to the growth medium. Of course, those of ordinary skill in the art will recognize that other variations of nutrient mixtures and nutrient delivery sequences are possible and offer great potential for regulation at the level of gene expression derived from the regulatory domains of the invention.
Különösen előnyös élesztő törzs a Pichia pastoris GS115, amely hisztidin előállítási képessége szempontjából hiányos mutáns, és így mutáns genotípusa alapján his4 jelöléssel bír. A GS115 a Pichia pastoris NRRL Y-ll 430-ból származik, és az United States Department of Agriculture (Egyesült Államok Mezőgazdasági Minisztérium) Northern Régiónál Research Center (Északi-területi kutatóközpont) (Peoria, Illinois) letétbe van helyezve. A Pichia pastoris GS115 az NRRL Y-15 851 deponálási számon. Ez a szóban forgó gazdaszervezet azért hasznos, mert ez a hisztidin útban hiányos auxotróf mutáns. Ennek a gazdaszervezetnek a transzformálása egy vektorral, amely más DNS-szekvenciák között a HIS4 génfunkciót is tartalmazza, lehetővé teszi a transzformált gazdaszervezet könnyű szelekcióját.A particularly preferred yeast strain is Pichia pastoris GS115, which is a mutant deficient in histidine production and thus has a His4 designation by its mutant genotype. GS115 is from Pichia pastoris NRRL Y-ll 430 and is deposited with the Northern Territory Research Center (Peoria, Illinois) of the United States Department of Agriculture, Northern Region. Pichia pastoris GS115 is deposited under accession number NRRL Y-15 851. This host is useful because it is a histidine deficient auxotrophic mutant. Transformation of this host with a vector which also contains the HIS4 gene function among other DNA sequences allows for easy selection of the transformed host.
A jelen találmány szerinti szabályozóterületekről kimutattuk, hogy hasznosak a Saccharomyces nemzetiség élesztő törzseiben is a heterológ géntermékek szabályozott kifejeződéséhez, ebben az élesztő nemzetiségben számos auxotróf mutáns ismeretes. További előnyös gazda élesztőtörzsek lehetnek:The regulatory domains of the present invention have also been shown to be useful for the regulated expression of heterologous gene products in the yeast strains of the Saccharomyces nationality, many yeast auxotrophic mutants being known in the yeast. Other preferred host yeast strains include:
ATCC 24 683 (trp 1, ade 1, his 2, leu 1, gal 1, ura 1 mutáns), ATCC 24 684 (trp 1, ade 1, his 7, gal 1, ura 1 mutáns), ATCC 32 810 (tpr 5, arg 4, his 5, lys 1, ade 2, gal 2 mutáns), ATCC 34 182 (ade 3, his, lys, ura mutáns), ATCC 34 352 (ura 2 mutáns), ATCC 34 353 (ura 2 mutáns), ATCC 34 353 (ura 2 mutáns), ATCC 38 523 (arg 1, thr 1 mutáns), ATCC 38 626 (leu 2, his 4 mutáns), ATCC 38 660 (his 4, leu 2, thr 4 mutáns), ATCC 42 243 (ura 3 mutáns), ATCC 42 336 (ade 1, his 4, thr 4 mutáns), ATCC 42 403 (arg 4, lys 7 mutáns), ATCC 42 404 (ade 1, his 4, leu 2 mutáns), ATCC 42 564 (ura 1, his 6 mutáns), ATCC 42 596 (his 4, leu 2, lys 1 mutáns), ATCC 42 957 (his 4, leu 2, thr 4, trp 5 mutáns), ATCC 42 950 (ade mutáns), ATCC 42 951 (ade, leu mutáns), ATCC 44 069 (ura 1 mutáns), ATCC 44070 (leu 2, his 4 mutáns), ATCC 44 222 (his 4 mutáns), ATCC 44 376 (his 4, ade 2 mutáns), ATCC 44 377 (his 4, leu 1 mutáns) és hasonlók, ezek könnyen hozzáférhetők azok számára, akik a szakterületen jártasak.ATCC 24,683 (trp 1, ade 1, his 2, leu 1, gal 1, lord 1 mutant), ATCC 24,684 (trp 1, ade 1, his 7, gal 1, lord 1 mutant), ATCC 32,810 (tpr 5, arg 4, his 5, lys 1, ade 2, gal 2 mutant), ATCC 34 182 (ade 3, his, lys, ura mutant), ATCC 34 352 (ura 2 mutant), ATCC 34 353 (ura 2 mutant) ), ATCC 34 353 (lord 2 mutant), ATCC 38 523 (arg 1, thr 1 mutant), ATCC 38 626 (leu 2, his 4 mutant), ATCC 38 660 (his 4, leu 2, thr 4 mutant), ATCC 42 243 (lord 3 mutant), ATCC 42 336 (ade 1, his 4, thr 4 mutant), ATCC 42 403 (arg 4, lys 7 mutant), ATCC 42 404 (ade 1, his 4, leu 2 mutant) , ATCC 42 564 (lord 1, his 6 mutant), ATCC 42 596 (his 4, leu 2, lys 1 mutant), ATCC 42 957 (his 4, leu 2, thr 4, trp 5 mutant), ATCC 42 950 ( ade mutant), ATCC 42,951 (ade, leu mutant), ATCC 44,069 (lord 1 mutant), ATCC 44070 (leu 2, his 4 mutant), ATCC 44,222 (his 4 mutant), ATCC 44,376 (his 4, ade 2 mutant), ATCC 44,377 (his 4, leu 1 mutant) and the like, these are readily available to those who skilled in the art.
Azok, akik a szakterületen jártasak, felismerik, hogy a hasznos gazda törzsek nem szorítkoznak az auxotróf mutánsokra. így pozitív szelekciós markerekkel, pl', antibiotikum-rezisztencia génekkel rendelkező protot: róf törzsek transzformálása szintén hasznos eszközt nyújt transzformált törzsek kimutatásához és izolálásához.Those skilled in the art will recognize that useful host strains are not limited to auxotrophic mutants. Thus PROT with positive selection markers, e ', antibiotic resistance genes: ROF strains transformation also provides a useful means for the detection and isolation of transformed strains.
Az Escherichia coli szintén megfelelő gazdaszervezet a találmány szerinti plazmidokhoz. Azok, akik a szakterületen jártasak, felismerik, hogy számos E. coli törzs megfelelő gazdaszervezet. A jelen munkában alkalmazott különböző törzseket az alábbi táblázat foglalja össze:Escherichia coli is also a suitable host for the plasmids of the invention. Those skilled in the art will recognize that many E. coli strains are suitable hosts. The different strains used in this work are summarized in the following table:
Törzs jelzése Deponálási számStrain Indication Deposit number
MC 1061 nem ismeretesMC 1061 is not known
LE392 ATCC 33 572LE392 ATCC 33,572
MM294 ' ATCC 33 625MM294 'ATCC 33,625
Pichia pastoris transzformálási eljárásTransformation of Pichia pastoris
A Pichia pastoris transzformálását korábban még nem írták le. A Pichia pastoris transzformálásához szükséges kísérleti eljárásokat később (XII. példa) nagyobb részletességgel is bemutatjuk. Abból a célból, hogy a P. pastorishoz transzformálási rendszert fejlesszünk ki, a GS115 auxotróf mutáns (NRRL Y-15 851) izoláljuk, és meghatározzuk, hogy ez hiányos a hisztidinútban, vagyis nem rendelkezik kimutatható hisztidinol-dehidrogenáz aktivitással.Transformation of Pichia pastoris has not been described before. The experimental procedures for transforming Pichia pastoris are described in greater detail later (Example XII). In order to develop a transformation system for P. pastoris, the GS115 auxotrophic mutant (NRRL Y-15851) was isolated and determined to be deficient in the histidine, i.e., lacking detectable histidine dehydrogenase activity.
A GS115-öt (NRRL Y-15 851) a sejtfalak enzimes emésztésével transzformálhatjuk, így szferoplasztokat nyerve; a szferoplasztokat azután összekeverjük a transzformáló DNS-sel és kalciumionok, valamint polietilénglikol jelenlétében inkubáljuk, majd hisztidinhiányos, szelektív növekvő tápközegben regeneráljuk. A transzformáló gén magában foglalja a HIS4-gént, amelyben a gazdaszervezet hiányos, így csupán a transzformált sejtek élik túl az alkalmazott szelektív tápközegen való növesztést.GS115 (NRRL Y-15,851) can be transformed by enzymatic digestion of cell walls to yield spheroplasts; the spheroplasts are then mixed with the transforming DNA and incubated in the presence of calcium ions and polyethylene glycol and regenerated in selective growing medium with histidine deficiency. The transforming gene includes the HIS4 gene, in which the host is deficient, so that only the transformed cells survive growth on the selective medium used.
A Pichia pastoris HIS4 gén izolálásaIsolation of the Pichia pastoris HIS4 gene
A HIS4 gén a P. pastoris NRRL Y-ll 430 törzsből izoláljuk a teljes kromoszomális DNS Sau3A-val történő részleges emésztésével, amelyet centrifugálás követ szacharóz gradiensen (lásd XIII. példa). Az 5-20 kbp közti fragmenseket az YEpl3 S. cerevisiae E. coli „ingázó” vektor (ATCC 37 115; 33. ábra) BamHI hasítási helyébe klónozzuk, és E. coliba transzformáljuk. Mintegy 50 000 telepet egyesítünk és a teljes plazmidDNS-t kivonjuk. 5799-4D S. cerevisiae törzs (NRRL Y-15 859), amely his4ABC mutáns, szferoplasztjait összekeverjük mintegy 1 μg YEpl3 Pichia DNS„könyvtár”-ral Hinnen és munkatársai (1978) eljárása szerint, és hagyjuk regenerálódni olyan tápközegben, amely hisztidinben hiányos. A transzformálás mintegy lxlO3 prototróf élesztőtelepet eredményez az 5xl07 teljes regenerálható szferoplaszt-populációból. Egy párhuzamos kontrollminta DNS nélkül inkubálva nem termel telepeket. A His+ telepek közül 20-ból a teljes élesztő-DNS-t kivonjuk és visszatranszformáljuk E. coliba. Az élesztő-DNS-készítményekből 17 termel ampicillinrezisztens telepeket. Ezeket a klónozott fragmenseket tovább jellemezzük restrikciós enzimes méretmeghatározással és térképezéssel, valamint azzal a képességükkel, hogy kis erővel képesek kereszthibridizálásra jelzett S. cerevisiae HIS4 fragmenssel (hibridi13The HIS4 gene was isolated from P. pastoris NRRL Y-113030 by partial digestion of total chromosomal DNA with Sau3A followed by centrifugation on a sucrose gradient (see Example XIII). The 5-20 kbp fragments are cloned into the BamHI site of the S. cerevisiae E. coli shuttle vector YEpl3 (ATCC 37,115; Fig. 33) and transformed into E. coli. About 50,000 colonies were pooled and total plasmid DNA was extracted. Spheroplasts of S. cerevisiae strain 5799-4D (NRRL Y-15,859), a mutant of his4ABC, were mixed with about 1 μg of the YEpl3 Pichia DNA "library" according to Hinnen et al. (1978) and allowed to regenerate in media lacking histidine. . Transformation results in approximately 1x10 3 prototrophic yeast colonies out of a total population of 5x10 7 regenerable spheroplasts. A duplicate control sample does not produce colonies when incubated without DNA. From 20 of His + colonies, the whole yeast DNA was extracted and transformed into E. coli. Of the yeast DNA preparations, 17 produce ampicillin-resistant colonies. These cloned fragments are further characterized by restriction enzyme size determination and mapping and their ability to cross-hybridize with the labeled fragment of S. cerevisiae HIS4 (hybrid13
HU 205 627 Β zálás utáni mosások 2xSSC-vel 55 °C hőmérsékleten) a ΧΠΪ. példa G. fejezetében leírt módszerrel. A HIS4tartalmú plazmidok mindegyike tartalmaz egy vagy több fragmenst, amely hibridizálódik a S. cerevisiae HIS4 génnel. Egy ilyen HTS4-tartalmú plazmidot reklónozunk, így a pYJ8 jelű HIS4-tartalmú plazmidot nyerünk, amelyet a 25. ábrán mutatunk be. A pYJ8 plazmid pBR325 szekvenciákat tartalmaz, beleértve a klóramfenikol- és ampicillin-rezisztenciagéneket valamint a Pichia HIS4 génjét.EN 205 627 Β Post wash washing with 2xSSC at 55 ° C) a). Example I, Chapter G. Each HIS4-containing plasmid contains one or more fragments that hybridize to the S. cerevisiae HIS4 gene. Such an HTS4-containing plasmid is promoted to give the HIS4-containing plasmid pYJ8, shown in Figure 25. Plasmid pYJ8 contains pBR325 sequences including the chloramphenicol and ampicillin resistance genes and the Pichia HIS4 gene.
Az ARG4 gént P. pastoris NRRL Y-ll 430-ból izoláljuk, azonos eljárást alkalmazva, valamint az S2072-t S. cerevisiae Arg törzsből [arg 4, leu 2, trp 1, gal 2 mutáns; a törzs beszerezhető a Yeast Genetic Stock Center intézettől (Berkeley, Kalifornia)].The ARG4 gene was isolated from P. pastoris NRRL Y-1130 by the same procedure and S2072 from S. cerevisiae strain Arg [arg 4, leu 2, trp 1, gal 2 mutant; strain available from Yeast Genetic Stock Center (Berkeley, CA)].
Szakember számára nyilvánvaló, hogy Pichiából származó más marker géneket hasonlóképpen lehet izolálni a megfelelően hiányos S. cerevisiae törzseket alkalmazva.One skilled in the art will recognize that other marker genes from Pichia can be similarly isolated using appropriately deficient strains of S. cerevisiae.
A Pichia pastoris autonóm replikációs szekvenciáinak izolálása.Isolation of autonomic replication sequences of Pichia pastoris.
A jelen találmány szerinti vektoroknak másik hasznos komponensei a Pichia eredetű autonóm replikációs szekvenciák (PARS), amelyek növelik mind a GS115 (NRRL Y-15 851) transzformációs gyakoriságát, mind a plazmidnak, mint stabil extrakromoszomális elemnek a fenntarthatóságát.Other useful components of the vectors of the present invention are Pichia-derived autonomous replication sequences (PARS), which increase both the transformation frequency of GS115 (NRRL Y-15851) and the sustainability of the plasmid as a stable extrachromosomal element.
Hogy a Pichia ARS-eket kutathassuk, Pichia pastoris GS115 (NRRL Y-15 851)-ből származó DNS-t részlegesen emésztünk Taql-gyel az 5 és 10 kbp közti fragmenseket izoláljuk és a pYJ8 Δ Cla egyedi Clal helyére klónozzuk (lásd 26. ábra). A plazmid-DNS-t mintegy 10 000 His+ Pichiatelepből kinyerjük és E. coli transzformálásához alkalmazzuk. Mintegy 10 000 ampicillinrezisztens-telepből plazmidokat izolálunk, majd visszatranszformáljuk GS115-be. Ebből az „alkönyvtár”-transzformációból 40 His+ élesztőtelepet elkülönítve szelektív közegre élesztjük és külön tenyészetekben növesztjük szelektív tápközegekben. Ennek a 40 tenyészetnek mindegyikéből kivonjuk a teljes élesztőDNS-t és E. coliba transzformáljuk. Két plazmidot, a pYA63-at (PARS1) és pYA90-et (PARS2), amelyeknek az élesztő-DNS-preparátumai az ampicillinre leginkább rezisztens E. coli tenyészeteket produkálják, kiválasztunk további elemzésre. Mindkét plazmid transzformálja a Pichia pastoris GS115-öt (NRLL Y-15 851) igen nagy frekvenciával és mindegyik tartalmaz idegen DNS-beiktatást.To search for Pichia ARSs, DNA from Pichia pastoris GS115 (NRRL Y-15851) was partially digested with Taql and fragments between 5 and 10 kbp were isolated and cloned into the unique ClaI site of pYJ8 Δ Cla (see Figure 26). figure). Plasmid DNA was recovered from about 10,000 His + Pichiat colonies and used to transform E. coli. Plasmids were isolated from approximately 10,000 ampicillin-resistant colonies and transformed back into GS115. From this "subdirectory" transformation, 40 His + yeast colonies were separately yeast-selective and grown in separate cultures in selective media. Total yeast DNA was extracted from each of these 40 cultures and transformed into E. coli. Two plasmids, pYA63 (PARS1) and pYA90 (PARS2), whose yeast DNA preparations produce cultures of E. coli most resistant to ampicillin, were selected for further analysis. Both plasmids transform Pichia pastoris GS115 (NRLL Y-15,851) at very high frequencies and each contains foreign DNA insertions.
Az ARS-ek olyan képességének mértékére, hogyan tartják fenn a plazmidot, mint autonóm elemet Pichiában, élesztősejtek tenyészeteit, amely sejtek a plazmidok valamelyikével transzformálva voltak, növesztjük szelektív tápközegben és időnként mintát veszünk. A plazmídszekvenciák állapotát a sejtekben a nem korlátozott élesztő-DNS-ek radioaktívan jelzett pBR325höz történő Southem-hibridizálásával határozzuk meg. A pYA63 és pYA90 plazmidok fennmaradnak a Pichiában, a szelektív tápközegben legalább 10 generáción keresztül (de integrálódnak az 50. generációig).To the degree of ability of ARSs to maintain the plasmid as an autonomous element in Pichia, cultures of yeast cells transformed with one of the plasmids are grown in selective medium and occasionally sampled. The status of plasmid sequences in cells is determined by Southem hybridization of unrestricted yeast DNA to radiolabeled pBR325. Plasmids pYA63 and pYA90 persist in Pichia for at least 10 generations (but integrate up to 50 generations) in selective media.
A feltételezett Pichia autonóm replikációs szekvenciák egyikét (PARS 1) számos más Pichia-vektorba klónozzuk, hogy megvizsgáljuk azt a képességét, hogyan tartja meg a transzformáló DNS-t mint autonóm elemet. ApYJ30 (27. ábra) és pBPJl (34. ábra) plazmidok még jelen vannak 20 növekedési generáció után is autonóm elemként szelektív tápközegen (His’) és jelen vannak több kópiában sejtenként. A pYJ30-cal transzformáit sejtek Southem-foltelemzése mintegy 10 kópiát jelez sejtenként.One of the putative Pichia autonomous replication sequences (PARS 1) was cloned into several other Pichia vectors to test its ability to retain transforming DNA as an autonomous element. Plasmids pYJ30 (Figure 27) and pBPJ1 (Figure 34) are still present as autonomous elements on selective media (His') after 20 generations of growth and are present in multiple copies per cell. Southem blot analysis of cells transformed with pYJ30 indicates approximately 10 copies per cell.
Meghatározzuk, vajon a pSAOH5 (18. ábra) és pT76H4 (22b ábra) plazmidok, amelyek tartalmazzák a pYJ30 illetve pBPJl által nyújtott PARS 1-et, mutatnak-e azokhoz a plazmidokhoz hasonló stabilitást, amelyekből származnak. Az ezeket a vektorokat tartalmazó törzseket szelektív feltételek között növesztjük (His) mintegy 50 generáción át glükóz jelenlétében. A sejteket ezután nem szelektív körülmények közé (His+) visszük át és a prototrófía elvesztését megfigyeljük. Ezeknek a plazmidoknak a stabilitása összehasonlítható a pYJ30 stabilitásával, beleértve a His-prototrófia gyors elvesztését nem szelektív tápközegbe való átvitelekor. így úgy véljük, hogy az autonóm replikációs szekvenciát, PARS 1-et tartalmazó plazmidokkal végrehajtott kísérletek a génkifejeződést eredményezik az autonóm plazmid DNS-ről.Plasmid pSAOH5 (Figure 18) and pT76H4 (Figure 22b), which contain PARS 1 provided by pYJ30 and pBPJ1, are determined to have similar stability to the plasmids they are derived from. Strains containing these vectors were selectively grown (His) for about 50 generations in the presence of glucose. The cells are then transferred to non-selective conditions (His + ) and the loss of prototrophy is observed. The stability of these plasmids is comparable to that of pYJ30, including the rapid loss of His-prototrophy upon transfer to a non-selective medium. Thus, it is believed that experiments with plasmids containing the autonomous replication sequence PARS 1 result in gene expression from autonomous plasmid DNA.
Új $-galaktozidáz gént tartalmazó konstrukciók.Constructs containing a new $ galactosidase gene.
Abból a célból, hogy a jelen találmány szerinti szabályozóterületek azon képességét demonstráljuk, hogy a fehérjetermékek termelését szabályozzák, új DNSkonstrukciót készítünk. így az E. coli lacZ gént számos plazmidba, a p72 (alkoholoxidáz) vagy p76 polipeptidet kódoló gén szabályozóterületeinek szabályozása alá áthelyezzük. A pSAOHl, pSAOH5, pSAOHIO, pTAFH.85, pT76Hl, pT76H2, pT76H3 és pI76H4 plazmidok előállítását a XIV. példában írjuk le.In order to demonstrate the ability of the regulatory regions of the present invention to regulate the production of protein products, a novel DNA construct is constructed. Thus, the E. coli lacZ gene is transferred to a number of plasmids, under the control of the regulatory regions of the gene encoding the p72 (alcohol oxidase) or p76 polypeptide. The construction of plasmids pSAOH1, pSAOH5, pSAOH10, pTAFH.85, pT76H1, pT76H2, pT76H3 and pI76H4 is described in XIV. example.
Bár a találmány szerinti szabályozóterület - β-galaktozidáz gén fúziós termékbevezetését gazda élesztősejtbe plazmiddal mint hordozóval ismertetjük, a szakember számára nyilvánvaló, hogy nem szükséges a sejtbe plazmid útján bevezetni a szabályozóterületstrukturgénkonstrukciót, hanem bármiféle molekula, amely képes fennmaradni élesztőben, alkalmazható. Ezáltal a találmány szerinti szabályozóterület-strukturgénkonstrukciókat plazmidoktól eltérő vektorok útján is lehet manipulálni. Egy más módszer szerint a szabályozóterület-strukturgénkonstrukciót a gazda élesztősejtkromoszómájába integrálni is lehet.Although the introduction of the regulatory region-β-galactosidase gene of the present invention into a host yeast cell with a plasmid as a carrier, it will be understood by those skilled in the art that it is not necessary to introduce the regulatory region structural construct into the cell by plasmid. Thus, the regulatory region structural gene constructs of the present invention can also be manipulated by vectors other than plasmids. Alternatively, the regulatory region structural gene construct may be integrated into the yeast chromosome of the host.
Szakember számára nyilvánvaló, hogy a jelen találmány oltalmi köre nem korlátozódik a β-galaktozidáz termelésére az itt ismertetett szabályozőterületek szabályozása alatt. A különböző polipeptideknek, amelyek a találmány szerinti szabályozóterületek szabályozása alatt termelődhetnek, csupán az olvasó képzelete szab határt. Több eljárás létezik olyan DNS-szekvenciák készítésére, amelyek a kívánt polipeptideket kódolják, így pl. különböző hosszúságú oligonukleotidokat lehet szintetizálni ismert eljárásokkal. Számos ilyen olígonukleotidot lehet összeilleszteni ezek fajlagos bázis14It will be apparent to those skilled in the art that the scope of the present invention is not limited to the production of β-galactosidase under the control of the regulatory domains described herein. The various polypeptides that may be produced under the control of the regulatory domains of the invention are limited only by the imagination of the reader. There are several methods for constructing DNA sequences that encode the desired polypeptides, e.g. oligonucleotides of different lengths can be synthesized by known methods. Many of these oligonucleotides can be fused to their specific bases14
HU 205 627 Β párképző tulajdonságai következtében hosszabb, kétszálú molekulákká. A kétszálú molekula alkotó oligonukleotidjait egyesíteni (ligálni) lehet DNS-ligáz enzimmel. Egy más módszer szerint a kívánt kódolószekvenciával rendelkező DNS-molekulát reverz transzkriptáz enzim alkalmazásával lehet szintetizálni, a kívánt polipeptidre vonatkozó hírvivő RNS-t alkalmazva templátként a reverz transzkriptáz akciójához. Egy további másik lehetőség a genomiális DNS-fragmensek klónozása és annak megfigyelése, vajon a kívánt termék kifejeződése történik-e.EN 205 627 Β due to its pairing properties into longer, double-stranded molecules. The oligonucleotides that make up the double-stranded molecule can be joined (ligated) with a DNA ligase enzyme. Alternatively, a DNA molecule having the desired coding sequence may be synthesized using a reverse transcriptase enzyme, using the messenger RNA for the desired polypeptide as a template for the reverse transcriptase action. Another possibility is to clone genomic DNA fragments and monitor whether the desired product is expressed.
Azt a DNS-szekvenciát, amely a kívánt polipeptidet kódolja, a szabályozóterület-strukturgénkonstrukció elkészítéséhez sokféle eljárással lehet módosítani. így pl. a fentebb leírt módon készített DNS végeit ligálni lehet DNS-ligáz enzimmel fajlagos restrikciós endonukleázok által felismert nukleotidszekvenciát tartalmazó rövid, kétszálú DNS-molekulákhoz, az úgynevezett „linker-” (kapcsoló-) molekulához. A ligálást követően ezeknek a molekuláknak az emésztése valamely fajlagos restrikciós endonukleáz felismerhető helynek megfelelő végeket hoz létre a készített DNS-szekvencia végeinél.The DNA sequence encoding the desired polypeptide can be modified by a variety of methods to construct a regulatory region structural gene construct. so e.g. the ends of the DNA prepared as described above can be ligated to short double-stranded DNA molecules containing a nucleotide sequence recognized by specific restriction endonucleases by DNA ligase, a so-called "linker" molecule. After ligation, digestion of these molecules produces ends corresponding to a specific restriction endonuclease recognition site at the ends of the prepared DNA sequence.
Ennek a munkának a folyamán készített három fajlagos szabályozóterület β-galaktozidázgén-konstrukciót írunk le a 15. és 16. ábrákon bemutatott restrikciós térkép segítségével. A 15a) ábrán bemutatott restrikciós térkép egy olyan konstrukciót ír le, amely pPG 6.0 5’ szabályozóterületéből származó, 0,85 kilobázispáros HindlII-BamHI részből és E. coliból származó lacZ génből (a bemutatott 3,6 kilobázispáros BamHI-Nru-fragmens) áll. Ugyanez a konstrukció van jelen a pTAFH.85, pT76Hl és pT76H2 plazmidok mindegyikében, amelyeket a későbbiekben részletesebben írunk le (lásd XIV. példa). A 15b) ábrán bemutatott restrikciós térkép leír egy olyan konstrukciót, amely a pPG 6.0 5’ szabályozóterületből származó, 1,3 kilobázispáros HindlII-EcoRI részből és az E. coliból származó lacZ génből áll. Ugyanez a konstrukció van jelen a pT76Ul, pT76H4 plazmidok mindegyikében, amelyeket a későbbiekben részletesebben írunk le (lásd XIV. példa).The β-galactosidase gene construct of the three specific regulatory regions prepared in the course of this work is described using the restriction map shown in Figures 15 and 16. The restriction map depicted in Figure 15a depicts a construct consisting of a 0.85 kilobase pair HindIII / BamHI portion of the pPG 6.0 5 'regulatory region and an E. coli lacZ gene (the 3.6 kilobase pair BamHI-Nru fragment shown). . The same construct is present in all plasmids pTAFH.85, pT76H1 and pT76H2, which are described in more detail below (see Example XIV). The restriction map depicted in Figure 15b describes a construct consisting of a 1.3 kilobase pair HindIII / EcoRI portion from the pPG 6.05 'regulatory region and the lacZ gene from E. coli. The same construct is present in all plasmids pT76U1, pT76H4, which are described in more detail below (see Example XIV).
A16. ábra egy olyan konstrukció restrikciós térképe, amely a pPG 4.0 5’ szabályozóterületéből származó, 1,1 kilobázispáros EcoRI-BamHI-fragmensből és az E. coliból származó lacZ génből áll. Ugyanez a konstrukció van jelen a pSAOHl, pSAOH5 és pSAOHIO plazmidokban, amelyeket a későbbiekben részletesebben írunk le (lásd XIV. példa).A16. Fig. 3A is a restriction map of a construct consisting of a 1.1 kilobase EcoRI-BamHI fragment from the 5 'regulatory region of pPG 4.0 and the lacZ gene from E. coli. The same construct is present in plasmids pSAOH1, pSAOH5 and pSAOH10, which are described in more detail below (see Example XIV).
ApSAOHl plazmidot vázlatosan a 17. ábrán illusztráljuk. Azon túl, hogy a szabályozószakasz β-galaktozidáz gén 16. ábrában részletezett fúziós termékét tartalmazza, a plazmidról kimutattuk, hogy tartalmaz:Plasmid pSAOH1 is schematically illustrated in Figure 17. In addition to the regulatory region containing the fusion product of the β-galactosidase gene detailed in Figure 16, plasmids have been shown to contain:
(a) pBR322 szekvenciákat, beleértve az AmpR gént;(a) pBR322 sequences including the Amp R gene;
(b) Pichia pastoris HIS4 gént;(b) the Pichia pastoris HIS4 gene;
(c) S. cerecisiae 2 μ köralakú DNS-t;(c) 2 μ circular DNA of S. cerecisiae;
(d) az S. cerevisiae-ből a megszakított URA3 gént.(d) the interrupted URA3 gene from S. cerevisiae.
A plazmidnak ennél fogva megvan az a képességé, hogy transzformálódjon és replikálódjon E. coli és élesztő gazdaszervezetekben. A DNS manipulációjához szelektálható markerek vannak jelen mind az E.The plasmid therefore has the ability to be transformed and replicated in E. coli and yeast hosts. Selectable markers for DNA manipulation are present in all E.
coliban, mind az élesztő gazdaszervezetben.coli, both in the yeast host.
ApSAOH5 plazmidot vázlatosan a 18. ábrán illusztráljuk. A plazmid hasonló a fentebb leírt pSAOHl-hez, azzal a különbséggel, hogy az S. cerevisiae 2 μ köralakú DNS és a Pichia pastoris HIS4 gént szegélyező DNS-ek közül néhány hiányzik, míg hozzá van téve egy Pichia pastoris autonóm módon replikálódó szekvencia (PARSl apYA63-ból).Plasmid pSAOH5 is schematically illustrated in Figure 18. The plasmid is similar to the pSAOH1 described above, except that some of the S. cerevisiae circular DNA and DNA flanking the Pichia pastoris HIS4 gene are missing while an autonomously replicating sequence of Pichia pastoris (PARSl) is added. apYA63 from).
A pSAOHIO plazmidot vázlatosan a 19. ábrán illusztráljuk. A plazmid tartalmaz:Plasmid pSAOHIO is schematically illustrated in Figure 19. The plasmid contains:
(a) szabályozóterület β-galaktozidáz gén fúziós terméket;(a) a regulatory region of a β-galactosidase gene fusion product;
(b) pBR325 szekvenciákat, beleértve a tetraciklinrezisztenciát, klóramfenikol-rezisztenciát és ampicillin-rezisztenciát (tetR, illetve camR, illetve ampR) átvivő géneket; és (c) S. cerevisiae HIS4 gént (az alább leírt módon pYA2 plazmidból nyerve).(b) genes transmitting pBR325 sequences, including tetracycline resistance, chloramphenicol resistance, and ampicillin resistance (tet R and cam R and amp R , respectively); and (c) the S. cerevisiae HIS4 gene (obtained from pYA2 as described below).
A pTAFH.85, pT76Hl és pT76H2 plazmidok analógok a fentebb leírt három plazmiddal, azzal a kivétellel, hogy az alkalmazott szabályozóterület β-galaktozidáz fúziós termék az, amelyet a 15a) ábrán leírtunk (a 16. ábrán leírt fúziós termék helyett).The plasmids pTAFH.85, pT76H1 and pT76H2 are analogous to the three plasmids described above, except that the regulatory region used is the β-galactosidase fusion product described in Figure 15a (instead of the fusion product described in Figure 16).
A pT76H3 és pT76H4 plazmidok analógok a pSAOHl illetve pSAOH5 plazmidokkal azzal a kivétellel, hogy az alkalmazott szabályozószakasz β-galaktozidáz-gén fúziós tennék a 15b) ábrán leírt termék (a 16. ábrán leírt fúziós termék helyett).Plasmids pT76H3 and pT76H4 are analogous to plasmids pSAOH1 and pSAOH5, except that the regulatory region used would be a fusion of the β-galactosidase gene to the product of Figure 15b (instead of the fusion product of Figure 16).
A pTAFH.85 plazmidot vázlatosan a 20. ábrában illusztráljuk, ez tartalmazza:Plasmid pTAFH.85 is schematically illustrated in Figure 20 and includes:
(a) a 15 a) ábrán bemutatott szabályozószakasz β-galaktozidáz-gén fúziós terméket;(a) the regulatory region of Fig. 15 a) fusion product of β-galactosidase gene;
(b) pBR322 szekvenciákat, beleértve az ampR gént;(b) pBR322 sequences including the amp R gene;
(c) a Pichia pastoris HIS 4 gént;(c) the Pichia pastoris HIS 4 gene;
(d) S. cerevisiae 2 μ köralakú DNS-t; és (e) az S. cerevisiae-ből származó megszakított URA3 gént.(d) S. cerevisiae 2 μ circular DNA; and (e) an interrupted URA3 gene from S. cerevisiae.
A pT76Hl plazmidot vázlatosan a 21. ábrán illusztráljuk, ez tartalmazza:Plasmid pT76H1 is schematically illustrated in Figure 21 and includes:
(a) a 15a) ábrán bemutatott szabályozószakasz β-galaktozidáz-gén fúziós terméket;(a) the regulatory region shown in Figure 15a for the β-galactosidase gene fusion product;
(b) pBR322 szekvenciákat, beleértve az ampR gént;(b) pBR322 sequences including the amp R gene;
(c) a Pichia pastoris HIS4 gént és autonóm módon replikálódó szekvenciát (PARS1).(c) the Pichia pastoris HIS4 gene and the autonomously replicating sequence (PARS1).
A pT76H2 plazmidot vázlatosan a 22. ábrán illusztráljuk, és ez tartalmazza;Plasmid pT76H2 is schematically illustrated and included in Figure 22;
(a) a 15a) ábrán bemutatott szabályozószakasz β-galaktozidáz-gén fúziós termékét;(a) the fusion product of the β-galactosidase gene of the regulatory region shown in Figure 15a;
(b) pBR325 szekvenciákat, beleértve a tetraciklin rezisztenciát, klóramfenikol-rezisztenciát és ampicillin-rezisztenciát átvivő géneket; és (c) S. cerevisiae HIS4 gént.(b) genes transmitting pBR325 sequences including tetracycline resistance, chloramphenicol resistance, and ampicillin resistance; and (c) the S. cerevisiae HIS4 gene.
A pT76H3 plazmidot vázlatosan a 22a) ábrán illusztráljuk, és ez tartalmazza:Plasmid pT76H3 is schematically illustrated in Figure 22a and includes:
(a) a 15b) ábrán bemutatott szabályozószakasz β-galaktozidáz gén fúziós terméket;(a) the regulatory region shown in Figure 15b for the β-galactosidase gene fusion product;
(b) pBR322 szekvenciákat, beleértve az ampR gént;(b) pBR322 sequences including the amp R gene;
(c) a Pichia pastoris HIS4 gént;(c) the Pichia pastoris HIS4 gene;
(d) S. cerevisiae 2μ köralakú DNS-t, és(d) S. cerevisiae 2μ circular DNA, and
HU 205 627 Β (e) az S. cerevisiae-ből a megszakított URA3 gént.(E) the interrupted URA3 gene from S. cerevisiae.
A pI76H4 plazmidot vázlatosan a 22b) ábrán illusztráljuk, ez tartalmazza:Plasmid pI76H4 is schematically illustrated in Figure 22b and includes:
(a) a 15b) ábrán bemutatott szabályozóterűlet β-galaktozidáz-gén fúziós termékét;(a) a fusion product of the β-galactosidase gene of the regulatory region shown in Figure 15b;
(b) pBR322 szekvenciákat, beleértve az ampR gént;(b) pBR322 sequences including the amp R gene;
(c) Pichia pastoris HIS4 gént; és (d) Pichia pastoris autonóm replikációs szekvenciát (PARS1).(c) the Pichia pastoris HIS4 gene; and (d) the Pichia pastoris autonomous replication sequence (PARS1).
A $-gaIaktozidáz kifejeződése élesztőben.Expression of $ galactosidase in yeast.
Pichia pastoris GS115-öt (NRRL Y-15 851) transzformálunk az új, β-galaktozidáz géntartalmú, fentebb leírt konstrukcióval. A létrejött számos transzformált élesztőtörzset deponáltuk az United States of Department Agrículture (Egyesült Államok Mezőgazdasági Minisztériuma), Northern Régiónál Research Center intézetnél a következő deponálási számokon:Pichia pastoris GS115 (NRRL Y-15,851) was transformed with the novel β-galactosidase gene containing construct described above. Numerous transformed yeast strains were deposited with the United States of America Department of Agriculture, Northern Region Research Center under the following deposit numbers:
Az új β-galaktozidáz géntartalmú konstrukciókat lehet alkalmazni E. coli transzformálására is. Atranszformált baktériumtörzseket szintén deponáltuk a Northern Régiónál Research Center intézetnél (Peoria, Illinois), a következő számokon:The novel β-galactosidase gene-containing constructs can also be used to transform E. coli. Atransformed bacterial strains were also deposited with the Northern Region at the Research Center Institute (Peoria, Illinois) under the following numbers:
Az alkoholoxidázt és a találmány szerinti p76 szabályozóterűlet lacZ gén fúziós terméket tartalmazó első nyolc plazmiddal Pichia pastoris GS115 törzset (NRRL Y-15 851) transzformálunk és növesztünk stacionárius fázisig minimál tápközegen, amely biotinnal és glükózzal, mint szénforrással ki van egészítve. Amikor a sejtek elérik a stacionárius fázist, átvisszük ezeket olyan minimál tápközegre, amely biotinnal és metanollal, mint szénforrással van kiegészítve. Miután a sejtek mintegy 3-5 generáción át nőnek 30 °C hőmérsékleten, ezeket átvisszük olyan friss minimál tápközegre, amely biotinnal van kiegészítve, és növesztjük glükózon vagy metanolon, mint egyedüli szénforráson. Meghatározott időpontokban a tenyészetekből mintákat veszünk ki és elemezzük β-galaktozidáz és alkoholoxidáz jelenlétére a VH. és XV. példákban részletezendő módszerekkel.The first eight plasmids containing the alcohol oxidase and the p76 regulatory region of the invention containing the lacZ gene fusion product were transformed and grown to a stationary phase in Pichia pastoris GS115 strain (NRRL Y-15,851) in minimal medium supplemented with biotin and glucose as a carbon source. When the cells reach the stationary phase, they are transferred to a minimal medium supplemented with biotin and methanol as a carbon source. After the cells grow for about 3-5 generations at 30 ° C, they are transferred to fresh minimal medium supplemented with biotin and grown on glucose or methanol as the sole carbon source. At defined times, samples are withdrawn from the cultures and analyzed for the presence of β-galactosidase and alcohol oxidase in VH. and XV. by methods detailed in the Examples.
Úgy találjuk, hogy a glükózon, mint egyedüli szénforráson nőtt sejtek nem termelnek kimutatható szinten β-galaktozidázt vagy alkoholoxidázt, míg azok a sejtek, amelyek metanolon, mint egyedüli szénforráson nőnek, jelentős szinten fejezik ki mind az alkoholoxidázt mind a β-galaktozidázt. Úgy találjuk ezen túl, hogy a glükózon nőtt sejtek, amikor szénforráséhezésnek tesszük ki ezeket, szintén mérhető mennyiségű alkoholoxidázt valamint β-galaktozidázt fejeznek ki. így világos, hogy a a találmány szerinti szabályozó területek fogékonyak mind a metanol jelenlétére, mind a szénforráséhezés feltételeire.It has been found that cells grown on glucose as the sole carbon source do not produce detectable levels of β-galactosidase or alcohol oxidase, whereas cells growing on methanol as the sole carbon source express significantly both alcohol oxidase and β-galactosidase. In addition, glucose-grown cells are found to express measurable amounts of alcohol oxidase and β-galactosidase when exposed to carbon sources. Thus, it is clear that the regulatory regions of the present invention are susceptible to both the presence of methanol and the conditions for carbon starch.
Igazolásként, hogy a találmány szerinti szabályozóterület fogékony a nem katabolitrepresszáló szénforráson növekedésre valamint a szénforráséhezés körülményeire, egy alkoholoxidáz szabályozóterületet tartalmazó plazmidot (pTA013), és egy p76 szabályozóterületet tartalmazó plazmidot (pI76Ul) alkalmazunk egy nem metanolhasznosító élesztő törzs, a Saccharomyces cerevisíae transzformálására. Az alkalmazott transzformált törzsek egyikét, amelynek laboratóriumki jelzése SEY2102-pTA013, deponáltuk a Northern Régiónál Research Center intézetnél (Peoria, Illinois), NRRL Y-15 858 deponálási számon. A Saccharomyces cerevisíae NRRL Y-15 858-atés SEY2102-pT76Hl-et növesztünk glükózon, ffuktózon, etanolon, glicerinen és galaktózon mintegy öt generáción át, majd szénforráséhezés feltételeinek vetjük alá. A β-galaktozidáz szokásos mérése (lásd XV. példa) öt generáció után azt jelzi, hogy glicerinen és a galaktózon nőtt sejtek nagy mennyiségű β-galaktozidázt termelnek, míg a glükózon és ffuktózon nőtt sejtek lényegében nem termelnek β-galaktozidázt. Amikor β-galaktozidázt mérünk 6 órával a szénforráséhezés után, a β-galaktozidáz mérsékelt mennyiségeinek termelését figyelhetjük meg a glükózon és ffuktózon nőtt transzformáit organizmusok által, ugyanakkor glicerinen és a galaktózon nőtt sejtek által termelt β-galaktozidáz jelentős mennyiségeit figyeljük meg. így a találmány szerinti szabályozó területek képesek a fehérjetermékek termelésének szabályozására genetikailag igen eltérő élesztő gazdaszervezetekben és nem korlátozódnak a metanolhasznosító törzsekben való alkalmazkodásra.To demonstrate that the regulatory region of the invention is susceptible to growth on non-catabolite repressing carbon source and to carbon source starvation conditions, an alcohol oxidase regulatory domain plasmid (pTA013) and a p76 regulatory domain plasmid (pI76U1) are used in a non-methanol utilizing yeast strain. One of the transformed strains used, designated SEY2102-pTA013, was deposited with the Northern Region at the Research Center Institute (Peoria, Illinois) under the accession number NRRL Y-15858. Saccharomyces cerevisíae NRRL Y-15858 and SEY2102-pT76H1 were grown on glucose, ffuctose, ethanol, glycerol and galactose for about five generations and then exposed to carbon source conditions. Standard measurement of β-galactosidase (see Example XV) after five generations indicates that glycerol and galactose-grown cells produce large amounts of β-galactosidase, whereas glucose and ffuctose-grown cells essentially do not produce β-galactosidase. When β-galactosidase is measured 6 hours after carbon source starvation, the production of moderate amounts of β-galactosidase by transformed organisms grown on glucose and ffuctose is observed, while significant amounts of β-galactosidase produced by glycerol and galactose-grown cells are observed. Thus, the regulatory domains of the invention are capable of regulating the production of protein products in genetically diverse yeast hosts and are not limited to adaptation to methanol utilizing strains.
PÉLDÁKEXAMPLES
Az alábbiakban megadjuk a következő példákban szereplő pufferek és oldatok összetételét (a megadott százalékértékek tömegszázalékot jelölnek):The composition of the following buffers and solutions is given below (the percentages given are by weight):
mól/literes Triszpuffer: 121,1 g Trisz-bázis 800 ml vízben; a pH-t vizes sósavoldat hozzáadásával beállítjuk a kívánt értékre; az oldatot hagyjuk lehűlni szobahőmérsékletre, mielőtt a végső pH-beállítást elvégeznénk és az 1 literes végső térfogatra beállítjuk az oldatot.Mole Tris Buffer: 121.1 g Tris base in 800 mL water; adjusting the pH to the desired value by adding aqueous hydrochloric acid; allowing the solution to cool to room temperature before making the final pH adjustment and adjusting the solution to a final volume of 1 liter.
HU 205 627 ΒHU 205 627 Β
S-puffer: 1,5 mól/liter szorbit 0,04 mól/literes nátrium-foszfát-pufferban, pH = 6,6.S buffer: 1.5 M sorbitol in 0.04 M sodium phosphate buffer, pH 6.6.
PK-puffer: 0,14 mól/liter NaCl,PK buffer: 0.14 M NaCl,
1% nátrium-dodecil-szulfát (SDS),1% sodium dodecyl sulfate (SDS),
0,01 mól/liter EDTA0.01 M EDTA
0,05 mól/literes Trisz-pufferban (pH 8,4).0.05 M Tris buffer pH 8.4.
ETS-puffer: 10 mmól/liter EDTA,ETS buffer: 10 mM EDTA,
0,2% SDS0.2% SDS
0,01 mól/literes Trisz-pufferban (pH = 7,6).0.01 M Tris buffer, pH 7.6.
TE-puffer: 1,0 mmól/liter EDTATE buffer: 1.0 mM EDTA
0,01 mól/liter Trisz-pufferban (pH = 7,4).0.01 mol / L in Tris buffer, pH 7.4.
SSC: 0,15 mól/liter NaCl, mmól/liter nátrium-citrát beállítva pH 7,0-ra NaOH-dal.SSC: 0.15 mol / L NaCl, mmol / L sodium citrate adjusted to pH 7.0 with NaOH.
TAE: 40 mmól/liter ecetsav, mmól/liter EDTATAE: 40 mM acetic acid, EDTA EDM
0,02 mól/literes Trisz-pufferban (pH 8,3).0.02 M Tris buffer pH 8.3.
PBS (foszfáttal pufferolt sóoldat): 10 mmól/liter nátrium-foszfát (pH 7,0),PBS (phosphate buffered saline): 10 mM sodium phosphate, pH 7.0,
0,15 mól/liter NaCl.0.15 M NaCl.
Laemmli terhelő puffer: 62,5 mmól/liter Trisz-HCl (pH 6,8),Laemmli loading buffer: 62.5 mmol / L Tris-HCl, pH 6.8,
2% SDS,2% SDS,
10% glicerin,10% glycerol,
5% 2-merkapto-etanol,5% 2-mercaptoethanol,
0,01% brómfenolkék.0.01% bromophenol blue.
RIPA-puffer: 1 % NP40 (S igma),RIPA buffer: 1% NP40 (S igma),
1% nátrium-dezoxikolát,1% sodium deoxycholate,
0,1% SDS PBS-ben.0.1% SDS in PBS.
X SSPE: 20 mmól/liter EDTA,X SSPE: 20 mM EDTA,
0,16 mól/liter NaOH,0.16 M NaOH,
0,2 mól/liter NaH2PO4.H2O,0.2 M NaH 2 PO 4 .H 2 O,
3,6 mól/liter NaCl beállítva pH 7,0-ra NaOH-dal.3.6 M NaCl adjusted to pH 7.0 with NaOH.
Denhardtféle oldat (50 x): 5 g Ficoll, g polivinil-pirrolidon, g szarvasmarha-szérumalbumin (BSA; Pentax V. Frakció)Denhardt's solution (50 x): 5 g Ficoll, g polyvinylpyrrolidone, g bovine serum albumin (BSA; Pentax V. Fraction)
500 ml teljes térfogatra kiegészítve vízzel.Make up to 500 ml with water.
Előhibridizáló puffer: 5 X SSPE, x Denhardt-féle oldat,Pre-Hybridization Buffer: 5 X SSPE, x Denhardt's solution,
50% ionmentesített formamid,50% deionized formamide,
0,2% SDS,0.2% SDS,
200 μg/ml zúzot és denaturált heringsperma-DNS.200 μg / ml of goat and denatured herring sperm DNA.
LB- (Luria-Bertani) tápközeg: 5 g Bacto tripton, g Bacto élesztőkivonat,LB (Luria-Bertani) medium: 5 g Bacto tripton, g Bacto yeast extract,
2.5 g NaCl liter vízben, beállítva pH 7,5-re NaOHdal.2.5 g NaCl per liter of water, adjusted to pH 7.5 with NaOH.
YPD-tápközeg: 1% Bacto élesztőkivonat,YPD medium: 1% Bacto yeast extract,
2% Becto pepton, 2% glükóz.2% Becto peptone, 2% glucose.
SD-tápközeg: 6,7 g „élesztő-nitrogénbázis aminosavak nélkül” (DIFCO),SD medium: 6.7 g of "Yeast Nitrogen Base without Amino Acids" (DIFCO),
2% glükóz liter vízben.2% glucose per liter of water.
SÉD: 1 mól/liter szorbit, mmól/liter EDTA, mmól/liter DTT,Sediment: 1 mol / liter sorbitol, mmol / liter EDTA, mmol / liter DTT,
SCE-puffer: 9,1 g szorbit,SCE buffer: 9.1 g sorbitol,
1,47 g nátrium-citrát,1.47 g of sodium citrate,
0,168 g EDTA, ml víz beállítva pH 5,8-ra HCl-dal.0.168 g EDTA, ml water was adjusted to pH 5.8 with HCl.
CaS: 1 mól/liter szorbit, mmól/liter CaCl2 szűrővel sterilezve.CaS: 1 mol / l sorbitol, sterilized with a Ca / 2 filter.
PEG-oldat: 20% polietilén-glikol-3350, mmól/liter CaCl2, mmól/liter Trisz-HCl (pH 7,4) szűrővel sterilezve.PEG solution: 20% polyethylene glycol-3350, sterilized by filtration with CaCl2, mmol / L Tris-HCl, pH 7.4.
SOS: 1 mól/liter szorbit,SOS: 1 mol / liter sorbitol,
0,3 x YPD tápközeg, mmól/liter CaCl2.0.3 x YPD medium, mmol / L CaCl2.
Formamid festékkeverék: 0,1% „xylene cyanol FF”,Formamide dye mixture: 0.1% "xylene cyanol FF",
0,2% brómfenolkék, mmól/liter EDTA,0.2% bromophenol blue, mmol / liter EDTA,
95% ionmentesített formamid.95% deionized formamide.
Fedőgél: 76,8 g karbamid, ml akril-amid alapanyag, 8mll0xTBECover gel: 76.8 g urea, ml acrylamide stock, 8mll0xTBE
160 ml végső térfogatra kiegészítve.Make up to a final volume of 160 ml.
Akrilamid alapanyag: 38 g akril-amid, g bisz (N,N-metilén-bisz-akril-amid) vízzel kiegészítve 100 ml teljes térfogatra.Acrylamide starting material: 38 g of acrylamide, supplemented with g of bis (N, N-methylene-bis-acrylamide) water to a total volume of 100 ml.
Fenékgél: 14,4 g karbamid,Bottom gel: 14.4 g urea,
3,0 g szacharóz,3.0 g sucrose,
7.5 ml lOxTBE,7.5 ml 10xTBE,
4.5 ml akril-amid alapanyag,4.5 ml of acrylamide feedstock,
0,3 ml brómfenolkék oldat (0,01 g/ml) vízzel kiegészítve 30 ml teljes térfogatig.0.3 ml bromophenol blue solution (0.01 g / ml) made up to 30 ml with water.
Előhibridizáló puffer a hibridizálási szelekcióhoz: 50% formamid,Pre-Hybridization Buffer for Hybridization Selection: 50% formamide,
0,75 mól/liter NaCl,0.75 mol / liter NaCl,
0,1 mól/liter Trisz, pH 7,4,0.1 M Tris pH 7.4,
0,008 mól/liter EDTA,0.008 mol / liter EDTA,
HU 205 627 ΒHU 205 627 Β
0,5% SDS,0.5% SDS,
200 g/ml nyúlmáj tRNS (Sigma).200 g / ml rabbit liver tRNA (Sigma).
Oőmól/literesNETSpuffer. 0,5 mól/liter NaCl, mmól/liter EDTA, mmól/liter Trisz, pH 7,4,Oőmól / literesNETSpuffer. 0.5 M NaCl, Molar EDTA, Tris pH 7.4,
0,2% SDS.0.2% SDS.
IOxRTpuffer: 500 mmól/liter NaCl,IOxRTpuffer: 500 mM NaCl,
340 mmól/liter Trisz, pH 8,3, mmól/liter MgCl2, mmól/liter DTT (ditiotreitol).340 mmol / L Tris, pH 8.3, mmol / L MgCl 2 , mmol / L DTT (dithiothreitol).
dilRT: 4glH2O, μΐ lOxRT-puffer, μΐ reverz transzkriptáz, 15 egység g/gl (Life Sciences, Ins.).dilRT: 4glH 2 O, μΐ10xRT buffer, μΐ reverse transcriptase, 15 units g / gl (Life Sciences, Ins.).
didezoxi:dideoxy:
ddATP: 0,49 mmól/liter, dd CTP: 0,1165 mmól/liter, dd GTP: 0,369 mmól/liter, dd TTP: 0,82 mmól/liter, dNTP keverék: 0,625 mmól/liter dGTP,ddATP: 0.49 mmol / L, dd CTP: 0.1165 mmol / L, dd GTP: 0.369 mmol / L, dd TTP: 0.82 mmol / L, dNTP Mix: 0.625 mmol / L dGTP,
0,625 mmól/liter dATP,0.625 mmol / liter dATP,
0,625 mmól/liter ΊΤΡ.0.625 mmol / liter ΊΤΡ.
Chase: 1,125 mmól/liter dATP,Chase: 1.125 mmol / liter dATP,
1,125 mmól/liter dCTP,1.125 mmol / liter dCTP,
1,125 mmól/liter dGTP,1.125 mmol / liter dGTP,
1,125 mmól/liter IT'P, lx RT-pufferban.1.125 mmol / L in IT'P, 1x RT buffer.
Hacsak másképpen nem jelezzük, a fenti koncentrációk az alkalmazott alap (lx) koncentrációt képviselik. A példák folyamán, ahol eltérő koncentrációszinteket alkalmazunk, ezt a tényt jelöljük, utalva az alap (lx ) koncentráció szorzószámára.Unless otherwise indicated, the above concentrations represent the base (1x) concentration used. In the examples where different concentration levels are used, this fact is denoted by referring to the multiplication of the base (1x) concentration.
A példákban a kővetkező rövidítéseket használjuk:In the examples, the following abbreviations are used:
Forrás: Collaborative Research, Inc.Source: Collaborative Research, Inc.
Zymolyase 60 000Zymolyase 60,000
Forrás: Miles LaboratoriesSource: Miles Laboratories
Az enzimeket a gyártó cégek által javasolt körülmények között alkalmazzuk.Enzymes are used under the conditions recommended by the manufacturers.
Számos eljárást rutinalapon végzünk el, standard leírásokat követve, amelyeket itt részletezünk majd.Many procedures are performed on a routine basis, following standard descriptions, which will be detailed herein.
A centrifugálást olyan időtartamig és fordulatsebességgel végezzük, hogy tiszta felülűszót kapjunk. Általában az élesztősejtek centrifugálását legalább 1500 gnál végezzük legalább 5 percen át.The centrifugation is carried out for such a time and at a speed that a clear supernatant is obtained. Generally, the yeast cells are centrifuged at at least 1500 g for at least 5 minutes.
A nukleinsavak kivonását azonos térfogatú, 50 : 48 : 2 térfogatarányú fenol: kloroform: izoamil-alkoholkeverékkel, illetve azonos térfogatú, 48:2 térfogatarányú kloroform: izoamil-alkohol-keverékkel végezzük.The nucleic acids are extracted with an equal volume of a 50: 48: 2 by volume mixture of phenol: chloroform: isoamyl alcohol and an equal volume by volume of a 48: 2 mixture of chloroform: isoamyl alcohol.
Amikor gélekről, szűrőkről stb. azt írjuk le, hogy mossuk vagy áztatjuk egy speciális oldatban, a teljes gélt, szűrőt vagy hasonlót belemerítjük egy megfelelő edénybe (tálca, csésze, cső stb.) abból a célból, hogy a gél, szűrő stb. teljes felületét érintkezésbe hozzuk a szóban forgó oldattal.When using gels, filters, etc. it is described as washing or soaking in a special solution, immersing the entire gel, strainer, or the like in a suitable container (tray, cup, tube, etc.), so that the gel, strainer, etc. contacting the entire surface with said solution.
A nukleinsavak etanolos kicsapását úgy végezzük, hogy először a nukleinsavat tartalmazó oldat sótartalmát beállítjuk, majd az oldatot érintkezésbe hozzuk két térfogat hideg etanollal.Ethanol precipitation of the nucleic acids is accomplished by first adjusting the salinity of the solution containing the nucleic acid and then contacting the solution with two volumes of cold ethanol.
I. PéldaExample I
Az élesztősejtek növesztése és kinyeréseGrowth and recovery of yeast cells
Pichia pastoris NRRL Y-ll 430-at növesztünk szénforrásban korlátozott körülmények között folyamatos tenyészetben 30 °C hőmérsékleten azaz metanolt vagy etanolt, mint egyedüli szénforrást tartalmazó IMI só minimál tápközegben, amint ezt Wegner leírta a 4 414 329 lajstromszámú amerikai egyesült államok-beli szabadalmi leírásban. Az IMI minimál táptömeg 1 liter tápközegre számítva 36 mmól KH2PO4-et, 23 mmól (NH4)2SO4-ot, 2 mmól MgSO4-ot, 6,7 mmól KCl-t, 0,7 mmól CaCl2-t, 0,2 gmól CuSO4.5H2O-t, 1,25 gmól Kl-ot, 4,5 gmól MnSO4-ot, 2 gmól Na2MoO4-ot, 0,75 gmól H3BO3-at, 17,5 gmól ZnSO4-ot, 44,5 gmól FeCl2-ot és 1,6 gmól biotint tartalmaz. A metanolon növekvő sejteket 140 g/liter (száraz tömeg) sejtsűrűségig növesztjük mintegy 12 óra tartási idővel. Az etanolon növekvő sejteket 90 g/liter sejtsűrűségig növesztjük mintegy 11,5 óra tartási idővel. Amikor metanolt vagy etanolt táplálunk be a fermentolba, 20, illetve 45% alkoholt tartalmazó koncentrációjú betápláló törzsoldatot alkalmazunk.Pichia pastoris NRRL Y-1130 was grown in a carbon source under limited conditions in a continuous culture at 30 ° C, i.e., IMI salt containing methanol or ethanol as the sole carbon source in minimal medium as described by Wegner in U.S. Patent 4,414,329. . The minimum IMI nutrient weight per 1 liter of medium is 36 mmol KH 2 PO 4 , 23 mmol (NH 4 ) 2 SO 4 , 2 mmol MgSO 4 , 6.7 mmol KCl, 0.7 mmol CaCl 2. 0.2 gm of CuSO 4 .5H 2 O, 1.25 gm of Kl, 4.5 gm of MnSO 4 , 2 gm of Na 2 MoO 4 , 0.75 gm of H 3 BO 3 17.5 gmol contains ZnSO 4 by weight, 44.5 gmol cent FeCl 2 and 1.6 gmol biotin. Cells growing on methanol were grown to a cell density of 140 g / l (dry weight) for approximately 12 hours. Cells growing on ethanol were grown to a cell density of 90 g / l with a holding time of about 11.5 hours. When methanol or ethanol is added to the fermentor, a stock stock solution containing 20% and 45% alcohol is used.
g, fermentolban nőtt Pichia pastoris-sejtet gyűjtünk össze centrifugálással, és újra szuszpendáljuk mintegy 108 sejt/ml-re 0,1 mól/liter Triszben (pH 8,0), amely 1% 2-merkapto-etanolt is tartalmaz. Ezeket a sejteket 5-10 percig inkubáljuk 37 °C hőmérsékleten, és centrifugálással összegyűjtjük. Az üledéket egyszer mossuk 30 ml S-pufferban és újra szuszpendáljuk 5 ml S-pufferban, 1 g sejtre számítva. Zymolase-t (Miles Biochemicals) adunk a sejtszuszpenzióhoz, hogy 500 gg/ml végső koncentrációt érjünk el. A sejteket 37 °C hőmérsékleten inkubáljuk, majd centrifugáljuk; a felülúszőt eldobjuk és a sejtüledéket összegyűjtjük. Ezt az üledéket folyékony nitrogénben lefagyasztjuk és -70 °C hőmérsékleten tároljuk a későbbi felhasználáshoz.g of fermented Pichia pastoris cells were collected by centrifugation and resuspended to about 10 8 cells / ml in 0.1 M Tris pH 8.0 containing 1% 2-mercaptoethanol. These cells were incubated for 5-10 minutes at 37 ° C and harvested by centrifugation. The pellet was washed once with 30 mL of S buffer and resuspended in 5 mL of S buffer per cell. Zymolase (Miles Biochemicals) was added to the cell suspension to reach a final concentration of 500 µg / ml. The cells were incubated at 37 ° C and centrifuged; discarding the supernatant and collecting the cell pellet. This pellet was frozen in liquid nitrogen and stored at -70 ° C for later use.
II. példaII. example
Az éleszlő-RNS izolálásaIsolation of yeast RNA
A teljes sejt RNS-t kipreparáljuk az 1. példában leírt fagyott üledék elporításával mozsárban mozsártörővei, majd a fagyott üledék további aprításával 2-5 percig Waring Blender-keverőgéppel, folyékony nitrogén je18Whole cell RNA was prepared by pulverizing the frozen pellet described in Example 1 in a mortar with a pestle and then crushing the frozen pellet for 2 to 5 minutes in a Waring Blender mixer with liquid nitrogen.
HU 205 627 Β lenlétében. A porított üledéket PK-pufferhoz adjukEN 205 627 Β. The powdered pellet was added to PK buffer
7,5 ml/g sejtkoncentrációban. Kproteinázt (Boehringer Mannheim) adunk az újra szuszpendált üledékhez, hogy végső koncentrációja 400 pg/ml legyen, és a szuszpenziót szobahőmérsékleten 10 percen át inkubáljuk. Ezt a keveréket fenol/kloroform/izoamil-alkohol keverékkel majd ezt követően kloroform/izoamilalkohol keverékkel extraháljuk. A nukleinsavakat NaCI 0,25 mól/liter koncentrációig történő adagolásával és etanol hozzáadásával kicsapjuk. Az üledéket minimális térfogatú ETS-pufferban újra szuszpendáljuk, vagyis olyan térfogatú pufferban, amely elegendő a nukleinsavak feloldásához; ez általában 100 pg-l mg DNS-t jelent 1 ml oldatra. Ezt az oldatot újra extraháljuk fenol/kloroform/izoamil-alkohollal majd kloroform/izoamil-alkohollal, végül etanollal kicsapjuk.At a cell concentration of 7.5 ml / g. Proteinase (Boehringer Mannheim) was added to the resuspended pellet to a final concentration of 400 pg / ml and the suspension was incubated at room temperature for 10 minutes. This mixture was extracted with phenol / chloroform / isoamyl alcohol followed by chloroform / isoamyl alcohol. The nucleic acids are precipitated by addition of NaCl up to 0.25 mol / L and addition of ethanol. The pellet is resuspended in a minimal volume of ETS buffer, i.e., a volume sufficient to dissolve the nucleic acids; this usually means 100 pg-1 mg DNA per ml solution. This solution was re-extracted with phenol / chloroform / isoamyl alcohol and then precipitated with chloroform / isoamyl alcohol and finally ethanol.
A nukleinsavakat újra feloldjuk minimális térfogatú TE-pufferban. Az ebben az oldatban levő RNS-t dúsítjuk vagy centrifugálással 4 ml CsCl „párnán” [1 g CsCl/ml, 1 mmól/liter EDTA, 10 mmól/liter Tris- (pH 7,4) pufferban] vagy kicsapással olyan módon, hogy az oldatot LiCl-ra nézve 2 mól/literessé tesszük, 4-8 °C hőmérsékleten tartjuk egy éjszakán át, majd centrifugálással összegyűjtjük. A poli A+ RNS-t az oldatból oligo(dT) cellulóz oszlopon végzett affinitás-kromatográfiával kigyűjtjük. Általában 0,25 g oligo(dT) cellulózt (3, típus, Collaborative Research) készítünk elő a kromatográfiához 5-10 mg teljes RNS-re számítva. 0,25 g oligo(dT) cellulózból 2 ml ETS-pufferral zagyot képzünk és egy kis, szilikonozott üvegoszlopba töltjük. Ezt az oligo(dT) cellulóz oszlopot mossuk olyan módon, hogy 10 ml 0,1 mól/literes oldatot rétegezünk az oligo(dT) cellulózra, és a mosóoldatot hagyjuk átfolyni az oligo(dT) cellulóz mátrixon. Az oligo(dT) cellulózt azonos módon mossuk 10 ml ETS-pufferral, és utoljára 10 ml 0,5 mól/literes NETS-pufferral mossuk.The nucleic acids are redissolved in a minimum volume of TE buffer. RNA in this solution was enriched either by centrifugation on 4 mL of CsCl "cushion" [1 g CsCl / mL, 1 mM EDTA, 10 mM Tris (pH 7.4) buffer] or by precipitation such that the solution is made up to 2 M per liter of LiCl, kept at 4-8 ° C overnight, and collected by centrifugation. Poly A + RNA was recovered from the solution by affinity chromatography on an oligo (dT) cellulose column. Generally, 0.25 g of oligo (dT) cellulose (type 3, Collaborative Research) is prepared for chromatography based on 5-10 mg total RNA. 0.25 g of oligo (dT) cellulose is slurried with 2 ml of ETS buffer and filled into a small, siliconized glass column. This oligo (dT) cellulose column is washed by layering 10 ml of a 0.1 M solution in oligo (dT) cellulose and allowing the wash solution to flow through the oligo (dT) cellulose matrix. The oligo (dT) cellulose was washed in the same way with 10 mL of ETS buffer and last washed with 10 mL of 0.5 M NETS buffer.
A teljes RNS-t (5-10 mg) újra szuszpendáljuk ETSpufferban legfeljebb 10 mg/ml koncentrációban, 65 °C hőmérsékletű vízfürdőre helyezzük 2 percre, majd azonnal jégre helyezzük. Az RNS-oldatot azután hagyjuk felmelegedni szobahőmérsékletre, és 5 mól/literes NaCI törzsoldatból annyit adunk hozzá, hogy az RNSoldatban a végső sókoncentráció 0,5 mól/liter NaCI legyen. Az így létrejött RNS-oldatot az elkészített oligo(dT) cellulóz oszlopra rétegezzük és lassan hagyjuk átáramolni az oszlopon keresztül mintegy 1 csepp/5 másodperc sebességgel. Az oszlop alján kifolyó anyagot egy csőben összegyűjtjük, és újra az oszlop tetejére rétegezzük. Az oszlop aljáról összegyűjtött anyagot ismét a tetejére rétegezzük másodszor ismételve, olyan RNS-oldatot nyerve, amely összességében háromszor halad keresztül az oligo(dT) cellulóz oszlopon. Az utolsó áthaladás után az anyagot összegyűjtjük és poliA-RNS, azaz nem poliA-RNS-t jelöljük. Az oszlopot azután 30 ml 0,5 mól/literes NETS-el mossuk és végül a poliA+-RNS-t az oszlopról eluáljuk olyan módon, hogy 5 ml ETS-puffert terhelünk az oszlopra és ezt a puffért hagyjuk lassan átáramlani, összegyűjtve a poliA+-RNS-frakciót az oszlop fenekéről folyó 5 ml frakcióban. Feltéve hogy nincs NaCI a poliA+-RNSfrakcióban, a frakció NaCI koncentrációját 0,25 móí/literre állítjuk be és az RNS-t etanollal kicsapjuk.Total RNA (5-10 mg) was resuspended in ETS buffer at a concentration of up to 10 mg / ml in a water bath at 65 ° C for 2 minutes and immediately placed on ice. The RNA solution was then allowed to warm to room temperature and 5 M NaCl stock solution was added to give a final salt concentration of 0.5 M NaCl in the RNA solution. The resulting RNA solution was layered on the prepared oligo (dT) cellulose column and allowed to flow slowly through the column at a rate of about 1 drop / 5 seconds. The spillage at the bottom of the column was collected in a tube and layered again on top of the column. The material collected from the bottom of the column was layered on top again a second time, yielding an RNA solution that had a total of three passes through the oligo (dT) cellulose column. After the final passage, the material is collected and labeled polyA-RNA, i.e., non-polyA-RNA. The column is then washed with 30 mL of 0.5 M NETS and finally the polyA + RNA is eluted from the column by loading 5 mL of ETS buffer and allowing this buffer to slowly flow through, collecting the polyA + + RNA fraction in a 5 ml fraction from the bottom of the column. Assuming no NaCl in the polyA + RNA fraction, the NaCl concentration of the fraction is adjusted to 0.25 mol / L and the RNA is precipitated with ethanol.
III. példaIII. example
A cDNS-„könyvtár megalkotásaCreating a cDNA library
Komplementer DNS- (cDNS-) kiónokat szintetizálunk az alábbiak szerint. 10 g H. példában leírtak szerint készített poliA+-RNS-t újra szuszpendálunk 7 μΐ H2O-ban, majd 2,7 mmól/liter CH3HgOH végső koncentrációra állítjuk be, majd szobahőmérsékleten inkubáljuk 5 percen át. Az első cDNS-szálat 42 °C hőmérsékleten 15 percen át szintetizáljuk 50 μΐ olyan oldatban, amely 50 mmól/1 Triszt (pH 8,3 42 °C hőmérsékleten), 10 mmól/liter MgCl2-t, 30 mmól/liter 2-merkapto-etanolt, 70 mmól/liter KCl-t, 500500 gmól/liter dATP-t, dGTP-t és TTP-t, 200 pmől/liter dCTP-t, 25 pg/ml oligo(dT)-t, 60 gg/ml aktinomicin D-t, 25 egység RN-azint (Biotec, Inc,), 25 gCi a-32P-dCTP-t (32,5 pmól) és 120 egység reverz transzkriptázt (Life Sciences, Inc.) tartalmaz. A reakciókeveréket 37 °C hőmérsékleten inkubáljuk további 15 percen át. A reakciót 2 μΐ 0,5 mól/literes EDTA és 0,5 μΐ 20%-os SDS hozzáadásával állítjuk le. A reakciókeveréket 0,3 mól/liter NaOH-koncentrációra állítjuk be és inkubáljuk 65 °C hőmérsékleten 30 percen át. A reakciókeveréket ezután 10 μΐ 1 mól/literes Trisz (pH 7,4) hozzáadásával semlegesítjük, és a reakciókeveréket 0,21 mól/l HCl-koncentrációra állítjuk be. A reakciókeveréket ezután fenol/kloroform/izoamil-alkohol keverékkel majd kloroform-izoamil-alkohol keverékkel extraháljuk, és végül Sephadex G50 oszlopon TE-pufferban összegyűjtjük és 100 μΐ-re koncentráljuk vagy butanolos extrahálással vagy vákuum alatti centrifugálással történő bepárlással. Az egyszálú cDNS-t etanollal kicsapjuk a koncentrált oldatból, a cDNS-t centrifugálással összegyűjtjük és újra szuszpendáljuk 100 μΐ vízben.Complementary DNA (cDNA) clones are synthesized as follows. Poly A + RNA prepared as described in Example H. In 10 g resuspended μΐ 7 H 2 O and then adjusted to a final concentration of 2.7 mmol / L CH 3 HgOH, then incubated at RT for 5 minutes. The first cDNA strand was synthesized at 42 ° C for 15 minutes in 50 μΐ solution of 50 mM Trist (pH 8.3 at 42 ° C), 10 mM MgCl 2 , 30 mM 2 mercaptoethanol, 70 mM KCl, 500500 gm / d dATP, dGTP and TTP, 200 pmol / liter dCTP, 25 pg / ml oligo (dT), 60 µg / liter ml contains 25 units of actinomycin Dt, 25 units of RN-azine (Biotec, Inc,), 25 gCi of α- 32 P-dCTP (32.5 pmol) and 120 units of reverse transcriptase (Life Sciences, Inc.). The reaction mixture was incubated at 37 ° C for an additional 15 minutes. The reaction was stopped by the addition of 2 μΐ 0.5 M EDTA and 0.5 μΐ 20% SDS. The reaction mixture was adjusted to 0.3 M NaOH and incubated at 65 ° C for 30 minutes. The reaction mixture was then neutralized by the addition of 10 μΐ 1 M Tris pH 7.4 and the reaction mixture was adjusted to a concentration of 0.21 M HCl. The reaction mixture was then extracted with phenol / chloroform / isoamyl alcohol then chloroform / isoamyl alcohol and finally collected on a Sephadex G50 column in TE buffer and concentrated to 100 μΐ by either butanol extraction or centrifugation under vacuum. The single-stranded cDNA was precipitated from the concentrated solution with ethanol, the cDNA was collected by centrifugation, and resuspended in 100 μΐ water.
A vizes egyszálú cDNS-oldatot 2,5 mól/liter ammónium-acetát-koncentrációra állítjuk be, etanollal kicsapjuk, centrifugálással összegyűjtjük és 20 μΐ vízben újra szuszpendáljuk. Ezt az egyszálú DNS-oldatot 50 μΐ végső térfogatra visszük 50 mmól/literes káliumfoszfát-pufferral, amely 5 mmól/liter MgCl2-t, 1 mmól/liter 2-merkapto-etanolt, 250-250 pmól/liter dATP-t, dGTP-t és TTP-t, 125 gmól/liter dCTP-t, 25 pCi-a-32P-dCTP-t (32,5 pmól) és 8 egység DNS Poll Klenow-fragmenst (New England Biolabs) tartalmaz. Az így létrejött reakciókeveréket 37 °C hőmérsékleten inkubáljuk egy órán át abból a célból, hogy szintetizáljuk a komplementer második DNS-szálat az egyszálú cDNS-hez. A reakciót 2 μΐ 0,5 mól/literes EDTA hozzáadásával állítjuk le. A kétszálú cDNS-t fenol/kloroform/izoamil-alkohollal extraháljuk majd kloroform/izoamil-alkohollal extraháljuk, és Sephadex G50 oszlopon kromatografáljuk TE-pufferban. A kétszálú cDNS-frakciókat összegyűjtjük, és az összegyűjtött anyagot koncentráljuk és kicsapjuk, amint ezt az egyszálú DNS-nél leírtuk.The aqueous single-stranded cDNA solution was adjusted to a concentration of 2.5 M ammonium acetate, precipitated with ethanol, collected by centrifugation and resuspended in 20 μΐ water. This single stranded DNA solution was brought to a final volume of 50 μΐ 50 mmol / l potassium phosphate buffer containing 5 mmol / l MgCl 2 -t, 1 mmol / l 2-mercaptoethanol, 250 to 250 pmol / L of each dATP, dGTP and TTP, 125 g / l dCTP, 25 pCi-a- 32 P-dCTP (32.5 pmol) and 8 units of DNA Poll Klenow fragment (New England Biolabs). The resulting reaction mixture was incubated at 37 ° C for one hour in order to synthesize the complementary second strand of DNA for the single-stranded cDNA. The reaction was quenched by the addition of 2 μΐ 0.5 M EDTA. The double-stranded cDNA was extracted with phenol / chloroform / isoamyl alcohol then extracted with chloroform / isoamyl alcohol and chromatographed on a Sephadex G50 column in TE buffer. The double-stranded cDNA fractions were collected and the collected material was concentrated and precipitated as described for single-stranded DNA.
A végső etanolos kicsapás és a kétszálú cDNS centrifugálással történő összegyűjtése után az üledéket 2019After the final ethanol precipitation and centrifugation of the double-stranded cDNA,
HU 205 627 Β pl vízben újra szuszpendáljuk, majd 50 μΐ végső térfogatta állítjuk be 50 mmól/liter írisszel (pH 8,3 42 °C hőmérsékleten), amely 10 mmól/liter MgCI2-ot, 30 mmól/liter 2-merkapto-etanolt, 70 mmól/liter KCl-ot, 500 mól/liter dXTP-t és 150 egység reverz transzkriptázt tartalmaz. Az így létrejött oldatot 42 °C hőmérsékleten Inkubáljuk 15 percen át abból a célból, hogy biztosítsuk a cDNS második szála szintézisének teljességét. A reakciót 2 μΐ 0,5 mól/literes EDTA hozzáadásával állítjuk le és koncentráljuk, majd kicsapjuk, amint ezt egy egyszálú cDNS reakciójánál leírtuk.Resuspend in water and adjust to a final volume of 50 μΐ with 50 mM Iris (pH 8.3 at 42 ° C) containing 10 mM MgCl 2 , 30 mM 2-mercapto- ethanol, 70 mM KCl, 500 M dXTP and 150 units reverse transcriptase. The resulting solution was incubated at 42 ° C for 15 minutes to ensure the completion of the second strand cDNA synthesis. The reaction was stopped and concentrated by the addition of 2 μΐ 0.5 M EDTA and precipitated as described for the single-stranded cDNA reaction.
A kétszálú cDNS-üledéket újra szuszpendáljuk 42 μΐ H2O-val és az oldatot 47 μΐ végső térfogatra állítjuk be 5 μΐ törzsoldat hozzáadásával, amely 2,8 mól/liter NaCl-ot, 200 mmól/liter NaOAc-ot és 45 mmól/liter ZuSO4-ot tartalmaz, majd a pH-t 22 °C hőmérsékleten 4,5-re állítjuk be. Abból a célból, hogy a „hajtű”-hurkot leemésszük, három külön reakciót végzünk három különböző koncentrációjú SÍ nukleázzal (Sigma). 1 egység, 10 egység vagy 100 egység SÍ nukleázt adunk hozzá, a reakicókeveréket 50 μΐ-re egészítve ki, és a reakciót 22 °C hőmérsékleten inkubáljuk 30 percen át A reakciót 2μ1 0,5 mól/literes EDTA és 2,67 μΐ 2 mól/literes Trisz-bázis hozzáadásával állítjuk le. 6 μg nyűlmáj tRNS-t adunk hozzá hozdozóként és a reakciókeveréket koncentráljuk, majd kicsapjuk, amint ezt korábban leírtuk, azzal az eltéréssel, hogy a DNSüledéket ΤΕ-pufferben inkubáljuk víz helyett. Az utolsó kicsapás után az üledéket újra szuszpendáljuk 20 μΐ TE-pufferban, és 50 μΐ végső koncentrációra egészítjük ki teminális transzferáz pufferral (BRL), amely 10 pmól a-32P-dCTP-t, 2 pmól/liter dCTP-t és 21 egység terminális transzferázt tartalmaz (Ratliff Biochem). Az így létrejött oldatot 37 °C hőmérsékleten 30 percen át inkubáljuk abból a célból, hogy poli(d/C)-farkat kapcsoljunk a kétszálú cDNS 3’-OH végéhez. A reakciót 5 μΐ 0,5 mól/literes EDTA hozzáadásával állítjuk le, éxtraháljuk, kromatografáljuk és etanolos csapadékként tároljuk.The double stranded cDNA pellet was resuspended in 42 μΐ H 2 O and the solution brought to a final volume of 47 μΐ in 5 μΐ stock solution to which 2.8 mol / l NaCl 200 mmol / L of NaOAc and 45 mmol / of ZuSO 4 and the pH is adjusted to 4.5 at 22 ° C. To separate the hairpin loop, three separate reactions were performed with three different concentrations of Si nuclease (Sigma). 1 unit, 10 units or 100 units of S1 nuclease was added to the reaction mixture to make 50 μΐ and the reaction was incubated at 22 ° C for 30 minutes. The reaction was 2 μl 0.5 M EDTA and 2.67 μΐ 2 mol / liter of Tris base. 6 μg of rabbit liver tRNA was added as a promoter and the reaction mixture was concentrated and precipitated as described previously, except that the DNA pellet was incubated in ΤΕ-buffer instead of water. After the final precipitation, the pellet was resuspended in 20 μΐ TE buffer and made up to 50 μΐ final concentration with teminal transferase buffer (BRL) containing 10 pmoles α- 32 P-dCTP, 2 pmol / L dCTP and 21 units. contains terminal transferase (Ratliff Biochem). The resulting solution was incubated at 37 ° C for 30 minutes to attach a poly (d / C) tail to the 3 'end of the double stranded cDNA. The reaction was quenched with 5 μ 5 0.5 M EDTA, extracted, chromatographed and stored as an ethanol precipitate.
A kétszálú, d/C-farokkal ellátott cDNS-t vagy ismét újból kötjük a PstI helyénél nyitott, poli(G)-farokkal ellátott pBR322-höz vagy először méret szerint farkcionáljuk Sepharose CL 4B-200 oszlopon (25 μΐ-es frakciók). A nem frakcionált „könyvtár” esetében 150 ng kétszálú, poIi(d/C)-farokkal ellátott cDNS-t kötünk 180 μΐ lOmmól/Iiteres Triszben (pH 7,4) - amely NaCl-ra 0,1 mól/literes és EDTA-ra 1 mmól/literes 900 ng d/G-farokkal ellátott, PstI helyénél nyitott pBR322-höz. A frakcionált „könyvtár” minden 25 mles frakciójához 125 ng poli(d/G)-farokkal ellátott pBR322-t kötünk 50 μΐ végső térfogatú, a fentebb leírttal azonos összetételű kötőkeverékben. A kötő reakciókeveréket 65 °C hőmérsékleten inkubáljuk 3 percen át majd 42 °C hőmérsékleten 2 órán át, majd hagyjuk lehűlni lassan szobahőmérsékletre.The double-stranded d / C-tailed cDNA was either re-bound to pBR322, open at the PstI site, or first size-fractionated on a Sepharose CL 4B-200 column (25 μΐ fractions). For the non-fractionated "library", 150 ng of double-stranded cDNA with poly (d / C) tails was bound in 180 μΐ 10 mM Tris pH 7.4 - 0.1 M NaCl and EDTA- ra for 1 mM 900 ng d / G-tailed pBR322 with a PstI site. To each 25-ml fraction of the fractionated "library" was added 125 ng of pBR322 with poly (d / G) tails in a final volume of 50 μΐ of the same composition as described above. The binding reaction mixture was incubated at 65 ° C for 3 minutes and then at 42 ° C for 2 hours and then allowed to cool slowly to room temperature.
A kötött cDNS „könyvtár”-at alkalmas E. coli LE392-be (ATCC 33 572) kötjük a következő módon: LE392 inokulumot növesztünk egy éjszakán át 37 °C hőmérsékleten 2 x LB tápközegben. 5 ml ilyen egy éjszakán át nőtt tenyészetet ínokulálunk 200 ml friss 2 x LB tápközegbe és növesztjük 37 °C hőmérsékleten, amíg az OD^ érték 0,2-0,3 lesz. Ezt a tenyészetet 10 percre jégbe helyezzük és a sejteket ezután 4 °C hőmérsékleten végzett centrifugálással összegyűjtjük. A sejtüledéket 80 ml jéghideg 0,1 mól/literes CaCl2ban újra szuszpendáljuk és 25 percen át inkubáljuk 4°C hőmérsékleten. A sejteket 4 °C hőmérsékleten végzett centrifugálással összegyűjtjük, a sejtüledéket újra szuszpendáljuk 2 ml jéghideg 0,1 mól/literes CaCl2-ban és legalább 2 óra hosszat inkubáljuk 4 °C hőmérsékleten felhasználás előtt. Ezután 200 μΐ megfelelő sejtet alkalmazunk 50 μΐ „kötőkeverék”-hez a transzformálásnál. A megfelelő sejteket és a DNS-t egyesítjük és kb. 4 °C hőmérsékleten Inkubáljuk 10 percen át, ezt követi az inkubálás 37 °C hőmérsékleten 5 percen át, végül a keveréket 10 percre jégé helyezzük. Azonos térfogat 2 x LB-tápközeget adunk a transzformációs keverékhez és inkubáljuk 37 °C hőmérsékleten 45 percen át. A transzformált sejteket lemezre visszük 250 μΐ/lemez mennyiségben, 150 mmes 2 x LB lemezekre, amelyek 15 pg/ml tetraciklint is tartalmaznak. A lemezeket ezután 37 °C hőmérsékleten inkubáljuk 24 órán át, és 4 °C hőmérsékleten tároljuk.The bound cDNA "library" was bound to a suitable E. coli LE392 (ATCC 33 572) as follows: LE392 inoculum was grown overnight at 37 ° C in 2 x LB medium. 5 ml of this overnight culture were inoculated into 200 ml of fresh 2 x LB medium and grown at 37 ° C until the OD 4 0 was 0.2-0.3. This culture was placed in ice for 10 minutes and the cells were harvested by centrifugation at 4 ° C. The cell pellet was resuspended in 80 ml of ice-cold 0.1 M CaCl 2 and incubated for 25 minutes at 4 ° C. Cells were harvested by centrifugation at 4 ° C, resuspended in 2 ml of ice-cold 0.1 M CaCl 2 and incubated for at least 2 hours at 4 ° C before use. Next, 200 μΐ of the appropriate cell is used for 50 μΐ of the “binding mixture” for transformation. The appropriate cells and DNA are pooled and ca. Incubate at 4 ° C for 10 minutes, then incubate at 37 ° C for 5 minutes, and finally place the mixture in ice for 10 minutes. An equal volume of 2 × LB medium was added to the transformation mixture and incubated at 37 ° C for 45 minutes. Transformed cells are plated at 250 μΐ / plate on 150 μm 2 x LB plates containing 15 pg / ml tetracycline. The plates were then incubated at 37 ° C for 24 hours and stored at 4 ° C.
Replikalemezeket készítünk, nittocellulóz szűrőket „átpecsételve” egy eredeti szűrőre, hogy a telepeket a lemezről kiemeljük. Ezeket a replikalemezeket 2 X LB-Tet lemezeken (15 pg/ml tetraciklin) inkubáljuk. A szűrőn levő telepeket az átvizsgáláshoz úgy készítjük elő, hogy átvíve a szűrőket 2 x LB-Tet lemezekre visszük át, amelyek 200 pg/ml klóramfenikolt is tartalmaznak, majd a szűrőket 37 °C hőmérsékleten legalább 12 órán át inkubáljuk, majd a telepeket lizáljuk úgy, hogy a szűrőket vizes gyűjtőedényben öblítjük 10 percen át, az öblítővíz 1,5 mól/liter NaCl-t és 0,5 mól/liter NaOH-t tartalmaz. A szűrőket ezután semlegesítjük vizes gyűjtőedényben öblítve 15 percen át, az öblítővíz 1,5 mól/liter NaCl-tés 0,5 mól/liter Triszt (pH 7,4) tartalmaz; ezt a semlegesítő öblítést még egyszer megismételjük. A szűrőket ezután levegőn szárítjuk és végül vákuumban szárítjuk 2 órán át 70 °C hőmérsékleten.We make replica disks by "sealing" the nittocellulose filters on an original filter to remove the colonies from the plate. These replica plates are incubated on 2X LB-Tet plates (15 pg / ml tetracycline). The colonies on the filter were prepared for screening by transferring the filters to 2 x LB-Tet plates containing 200 pg / ml chloramphenicol, incubating the filters at 37 ° C for at least 12 hours and then lysing the colonies. for rinsing the filters in an aqueous collecting vessel for 10 minutes, the rinse water contained 1.5 M NaCl and 0.5 M NaOH. The filters were then neutralized by rinsing in an aqueous collector flask for 15 minutes, containing 1.5 M NaCl and 0.5 M Tris pH 7.4; this neutralization rinse is repeated once more. The filters were then air dried and finally vacuum dried for 2 hours at 70 ° C.
IV. példaARC. example
Telep-hibridizálásColony hybridization
A cDNS-könyvtárat tartalmazó, vákuumban szárított nittocellulóz szűrőket (amelyeket az előző példák szerint készítettünk) előhibridizáljuk 42 °C hőmérsékleten 5 órán át előhibridizáló pufferban. A szűrőket eltávolítjuk az előhibridizáló pufferból és enyhén ledörzsöljük kesztyűs kézzel 5 x SSPE-be abból a célból, hogy a sejttörmeléket eltávolítsuk. A szűrőket hibridizáló pufferba helyezzük (ez azonos az előhibridizáló pufferral az 1 x Denhardt-féle oldat kivételével), vagy SÍ nukleázzal enyhébb körülmények között emésztett 32P-vel jelzett egyszálú cDNS- t (106 beütés/perc/ml), vagy végén jelzett metanolon vagy etanolon nőtt Pichia pastorisból izolált poliA+mRNS-t hibridizálunk a szűrőkhöz 17 órán át 42 °C hőmérsékleten. A hibridizálás után a szűrőket rövid ideig mossuk 2 x SSPE-ben 22 °C hőmérsékleten,Vacuum-dried nittocellulose filters containing the cDNA library (prepared as in the previous examples) were pre-hybridized at 42 ° C for 5 hours in pre-hybridization buffer. The filters were removed from the pre-hybridization buffer and gently rubbed with gloved hands into 5 x SSPE to remove cell debris. Filters were placed in hybridization buffer (identical to pre-hybridization buffer except 1x Denhardt's solution) or 32 P-labeled single-stranded cDNA (10 6 rpm / ml) digested with S1 nuclease under milder conditions. polyA + mRNA isolated from Pichia pastoris grown in methanol or ethanol was hybridized to the filters for 17 hours at 42 ° C. After hybridization, the filters are briefly washed in 2 x SSPE at 22 ° C,
HU 205 627 Β ezt követi két mosás 65 °C hőmérsékleten 0,1 x SSPE-ben, mindkettő 10 percig,EN 205 627 Β followed by two washes at 65 ° C in 0.1 x SSPE, both for 10 minutes,
A poliA+-mRNS vég jelzését úgy hajtjuk végre, hogy 2 pg poliA+-mRNS-t adunk 50 μΐ térfogatú 50 mmól/literes íriszhez (pH 9,5), 100 °C hőmérsékleten melegítjük 3 percen át, majd gyorsan lehűtjük jégen. Ezt az RNS-oldatot 200 μΐ végső térfogatra hígítjuk és beállítjuk 50 mmól/liter Trisz (pH 9,5), 10 mmól/liter MgCl2, 5 mmól/liter DTT és 50 pmól 32P-cc-ATP tartalomra. 10 egység T4 polinukleotid-kinázt (Boehringer Mannheim) adunk hozzá és a keveréket 37 °C hőmérsékleten inkubáljuk 1 órán át. A kinázreakciót 10 μΐ 0,5 mól/literes EDTA hozzáadásával leállítjuk fenol/kloroform/izoamil-alkohol- keverékkel extraháljuk és kromatografáljuk Sephadex G50-en át, hogy eltávolítsuk a be nem épült radioaktív jelzést.PolyA + mRNA end labeling was performed by adding 2 µg of polyA + mRNA to 50 μΐ of 50 mM iris (pH 9.5), heating at 100 ° C for 3 minutes, and rapidly cooling on ice. This RNA solution was diluted to a final volume of 200 μΐ and adjusted to 50 mM Tris pH 9.5, 10 mM MgCl2, 5 mM DTT, and 50 pmole 32 P-cc-ATP. Ten units of T4 polynucleotide kinase (Boehringer Mannheim) were added and the mixture was incubated at 37 ° C for 1 hour. The kinase reaction was quenched with 10 μΐ 0.5 M EDTA, extracted with phenol / chloroform / isoamyl alcohol, and chromatographed on Sephadex G50 to remove any unlabeled radioactive label.
V. példaExample V
Northern hibridizálásNorthern hybridization
2-5 pg poliA+-mRNS-t melegítünk 65 °C hőmérsékleten 5 percen át 10 mmól/literes nátrium-foszfátpufferban (pH = 7,4), amely 50% formamldot, 2,2 mól/liter formaldehidet és 0,5 mmól/liter EDTA-t tartalmaz. Az így létrejött oldatot szobahőmérsékletre lehűtjük, és megfelelő mennyiségű (általában a kezelt minta térfogatára vonatkoztatva 0,2 térfogat) 5 x „minta puffer”-t adunk hozzá (0,5% SDS, 0,025% brómfenolkék, 25% glicerin, 25 mmól/liter EDTA). A mintákat 1,5 %-os agaróz gélre visszük, amely 1,1 mól/liter formaldehidet tartalmazó 10 mmól/literes nátriumfoszfát-pufferral (pH 7,4) készült, és azonos pufferban elektroforézisnek vetjük .alá, A gélt akridin naranccsal (33 gg/ml) festjük meg 10 mmól/liter nátrium-foszfát pufferban (pH 7,4), festékmentesítjük a gélt azonos pufferban 10 percig öblítve, majd 10 x SSPE-ben legalább 10 percig öblítve az RNS-t nitrocellulózra viszszük át, amint ezt a VI. példában leírjuk.2-5 µg of polyA + mRNA was heated at 65 ° C for 5 minutes in 10 mM sodium phosphate buffer (pH 7.4) containing 50% formamld, 2.2 mol / L formaldehyde and 0.5 mM / liter of EDTA. The resulting solution was cooled to room temperature and 5 x "sample buffer" (0.5% SDS, 0.025% bromophenol blue, 25% glycerol, 25 mmol / l) was added (usually 0.2 volume relative to the volume of treated sample). liter EDTA). Samples were applied to a 1.5% agarose gel in 10 mM sodium phosphate buffer (pH 7.4) containing 1.1 M formaldehyde and electrophoresed in the same buffer. The gel was acridine orange (33 g / ml), stained with 10 mM sodium phosphate buffer (pH 7.4), the gel was rinsed for 10 minutes in the same buffer, and the RNA was transferred to nitrocellulose by rinsing in 10 x SSPE for at least 10 minutes. VI. Example.
VI. példaVI. example
Genomiális DNS és klánok izolálásaIsolation of genomic DNA and clans
Pichia genomiális DNS-t izolálunk a II. példában a Pichia RNS izolálásához leírt módszert alkalmazva. A nukleinsav-üledéket újra szuszpendáljuk minimális térfogatú TE-pufferban, és inkubáljuk 20 gg/ml RN-áz A-val 30 percen át 37 °C hőmérsékleten. Az oldat NaCi-koncentrációját 0,14 mól/literre állítjuk és K proteinázzal kezeljük, 200 gg/ml mennyiségben alkalmazva 15 percen át 22 °C hőmérsékleten. Az így létrejött oldatot először fenol/kloroform/izoamil-alkohollal majd kloroform/izoamil-alkohollal extraháljuk, és végül etanollal kicsapjuk. A kicsapott DNS-t újra szuszpendáljuk minimális térfogatú TE-pufferban, és centrifugáljuk, hogy tisztítsuk a DNS-oldatot.Pichia genomic DNA was isolated as shown in Figure II. using the method described for isolating Pichia RNA. The nucleic acid pellet was resuspended in a minimal volume of TE buffer and incubated with 20 µg / ml RNase A for 30 minutes at 37 ° C. The solution was adjusted to a concentration of 0.14 M NaCl and treated with proteinase K at 200 µg / ml for 15 minutes at 22 ° C. The resulting solution is extracted first with phenol / chloroform / isoamyl alcohol and then with chloroform / isoamyl alcohol and finally precipitated with ethanol. The precipitated DNA was resuspended in minimal volume of TE buffer and centrifuged to purify the DNA solution.
gg, az előző bekezdésben leírtak szerint készített Pichia genomiális DNS-t emésztünk különböző restrikciós enzimekkel (BRL) és elektroforézisnek vetjük alá 1%-os agaróz gélen, amely TAE-t tartalmaz. A DNSfragmenseket a gélen denaturáljuk a gélt 1,5 mól/liter NaCl és 0,5 mól/liter NaOH-oldatba áztatva 20 percen át. Az átvitel előtt a gélt legalább 5 percig 10 X SSPEben áztatjuk. Egy nitrocellulóz lemezt vágunk a gél méretéhez, vízben megnedvesítjük és röviden áztatjuk 10 x SSPE-ben. Ezt a szűrőt a gél tetejére fektetjük, amelyet viszont már előzőleg egy darab parafilmre helyezzünk. Whatman-szűrőpapírlapot és egy papírtörölköző köteget helyezünk a nitrocellulóz tetejére, hogy a DNS-t kivonjuk a gélből és átvigyük a nitrocellulózra. Egy súlyt teszünk rá a kötegre, hogy megkönnyítsük az átvitelt, A DNS-t hagyjuk ezen a módon átvándorolni legalább 3 órán át. Az átvitel után a szűrőt röviden leöblítjük 5 x SSPE-ben, levegőn szárítjuk, és vákuumban szárítjuk 70 °C hőmérsékleten 2 órán át. Komplementer genomfragmenseket azonosítunk hibridizálással a pPC 8.0, pPC 6.4 és pPC 15.0 „nick” transzlációnak alávetett cDNS-klónokhoz, ugyanazokat az előhibridizáló, hibridizáló- és mosópufferokat alkalmazva, amelyeket a IV. példában leírtunk.gg of Pichia genomic DNA prepared as described in the previous paragraph was digested with various restriction enzymes (BRL) and electrophoresed on a 1% agarose gel containing TAE. The DNA fragments are denatured on the gel by soaking the gel in 1.5 M NaCl and 0.5 M NaOH for 20 minutes. The gel is soaked in 10X SSPE for at least 5 minutes prior to transfer. A nitrocellulose plate is cut to size of the gel, moistened with water and soaked briefly in 10 x SSPE. This filter is placed on top of the gel, which in turn has been placed on a piece of parafilm. A Whatman filter paper sheet and a paper towel stack are placed on top of the nitrocellulose to extract the DNA from the gel and transfer to the nitrocellulose. A weight is placed on the bundle to facilitate transfer. The DNA is allowed to migrate in this manner for at least 3 hours. After transfer, the filter was briefly rinsed with 5 x SSPE, air dried, and vacuum dried at 70 ° C for 2 hours. Complementary genomic fragments were identified by hybridization to cDNA clones subjected to nick translation of pPC 8.0, pPC 6.4 and pPC 15.0, using the same pre-hybridization, hybridization, and wash buffers as described in Figure IV. example.
200 ng cDNS-klónt vetünk alá nick-transzlációnak 14 °C hőmérsékleten 30 μΐ oldatban, amely 50 mmól/liter Trisz-HCl-t (pH 7,4), 10 mmól/liter MgSO4-et, 100 pmól/liter DTT-t, 50 pg/ml BSA-t, 2020 pmól/liter dGTP-t, TTP-t és dATP-t, 31,25 pmól 32P-a-dCTP-t (3200 Ci/mmól, NEN), 2 egység E. coli DNS Poll-et (BRL) és 0,02 ng DN-áz I-et tartalmaz. A reakciót 1 μΐ 0,5 mól/literes EDTA és 1 μΐ 20%-os SDS hozzáadásával állítjuk le. A jelzett DNS-oldatot 0,3 mól/liter NaOH-koncentrációra állítjuk be és percre forró vízbe helyezzük. Ezt a keveréket Sephadex G50 oszlopon kromatografáljuk. A jelzett DNS-frakicókat összegyűjtjük, a fajlagos aktivitást meghatározzuk, és a vizsgáló mintát a hibridizálási kísérletekben alkalmazzuk.200 ng of the cDNA clone was subjected to nick translation at 14 ° C in 30 μΐ of 50 mM Tris-HCl pH 7.4, 10 mM MgSO 4 , 100 pmM DTT. 50 pg / ml BSA, 2020 pmoles / liter dGTP, TTP and dATP, 31.25 pmoles 32 Pa-dCTP (3200 Ci / mmol, NEN), 2 units E. coli It contains DNA Poll (BRL) and 0.02 ng DNase I. The reaction was quenched by addition of 1 μΐ 0.5 M EDTA and 1 μΐ 20% SDS. The labeled DNA solution was adjusted to 0.3 M NaOH and placed in hot water for one minute. This mixture was chromatographed on a Sephadex G50 column. The labeled DNA fraction is collected, the specific activity is determined and the assay sample is used in hybridization experiments.
Azokat a genom fragmenseket, amelyek hibridizálódnak a cDNS vizsgáló mintákhoz, izoláljuk, 2Ó0 pg Pichia genom DNS-t emésztve az előbbiekben használt restrikciós enzimekkel (BRL) és az emésztett anyagot elektroforézisnek vetjük alá 1%-os agaróz gélen TAEpufferban. A cDNS-klőnokkal hibridizálódó fragmenseknek megfelelő méretű sávokat kivágjuk az agaróz gélből, a DNS-t elektroelucióval kivonjuk, átengedjük Elutip oszlopon (Schleicher and Schüll) és etanollal kicsapjuk.The genomic fragments that hybridize to the cDNA probe samples were isolated by digesting 2,000 pg of the Pichia genomic DNA with the previously used restriction enzymes (BRL) and electrophoresing on a 1% agarose gel in TAEpuffer. Lanes corresponding to fragments hybridizing with cDNA clones were excised from the agarose gel, DNA was electroeluted, passed through an Elutip column (Schleicher and Schull) and precipitated with ethanol.
Az elektroelucióval nyert fragmenseket újra szuszpendáljuk vízben és 200 ng fragmenst ligálunk 500 ng pBR322-höz, amelyet a megfelelő restrikciós helyeken elhasítottunk és szükség esetén defoszforileztünk. A ligálási reakciót 300 pl 66 mmól/literes Triszben (pH 7,4) hajtjuk végre, amely 6,6 mmól/liter MgCl2-t, 10 mmól/liter DTT-t, 0,4 mmól/liter ATP-t, 25 μg/ml BSA-t és 4080 egység T4 DNS-ligázt tartalmaz, majd inkubálunk °C hőmérsékleten 24 órán át. A ligálási keveréket közvetlenül megfelelő E. coli LE392 sejtekbe transzformáljuk. A sejteknek a reakcióhoz alkalmassá tételét és a transzformálást a Hl.példában leírtak szerint végezzük. 3 transzformáció-sorozatot végzünk el 10, 40 és 100 ng pBR322-vel (plusz beiktatás), minden transzformációhoz 100 μΐ megfelelő sejtet alkalmazva. A sejteket lemezre visszük, amint ezt a IH. példában leírtuk, azzal a különbséggel, hogy az antibiotikumos szelekciót 50 pg/ml ampicillinnel végezzük. A kiónokat átvisszükThe electroeluted fragments were resuspended in water and 200 ng of the fragment was ligated to 500 ng of pBR322, which was cleaved at appropriate restriction sites and dephosphorylated if necessary. The ligation reaction was performed in 300 µl of 66 mM Tris pH 7.4, 6.6 mM MgCl 2 , 10 mM DTT, 0.4 mM ATP, μg / ml BSA and 4080 units T 4 DNA ligase and incubated at ° C for 24 hours. The ligation mixture is directly transformed into appropriate E. coli LE392 cells. The cells are adapted for reaction and transformed as described in Example III. 3 series of transformations were performed with 10, 40 and 100 ng of pBR322 (plus insert), using 100 μΐ of appropriate cells for each transformation. Cells are plated as in IH. except that the antibiotic selection was carried out with 50 pg / ml ampicillin. The clones are transferred
HU 205 627 Β nitrocellulózra, replikáljuk és a hibridizáláshoz előkészítjük a IH. példában leírtak szerint A szűrőket átvizsgáljuk a megfelelő nick-transzlációnak alávetett cDNS-fragmensekkel. A szélesztéssel tisztított telepeket, amelyek a hibridizálásban pozitívak, alkalmazzuk további plazmidok előállítására a következőképpen.EN 205 627 Β nitrocellulose, replicate and prepare for hybridization IH. The filters are screened for the appropriate nick translated cDNA fragments. Plate-purified colonies that are positive for hybridization are used to construct additional plasmids as follows.
A plazmidot hordozó LE392 E. coli-t növesztjük 1,0 ODgoo értékig 1 x LB-tápközegben, amely 50 pg/ml ampicillint is tartalmaz és egy éjszakán át szaporítjuk klóramfenikol hozzáadásával 200 pg/ml végső koncentrációig. A sejteket 0,8% NaCl-t, 20 mmól/liter Triszt (pH 8,0), 20 mmól/liter EDTA-t tartalmazó oldattal mossuk, majd lizozimmal kezeljük 25% szacharózt, 50 mmól/liter Triszt (pH 7,4), 20 mmól/liter EDTA-t és 450 pg/ml lizozimot tartalmazó oldatban. A lízist annyi mól/liter NaCl hozzáadásával érjük el, hogy a végső koncentráció 2,0 mól/liter legyen, ezt követi azonos térfogatú, 0,2%-os Triton X-100 és 40 mmól/literes EDTA hozzáadása. A preparátumot 20 000 fordulat/perccel 45 percen át végzett forgatással tisztítjuk. A felülúszót azután fenol/kloroform/izoamil-alkohol keverékkel extraháljuk majd klorofoim/izoamil-alkohollal extraháljuk, és etanollal kicsapjuk. Az üledéket újra szuszpendáljuk TE-pufferban, RNáz A-val kezeljük, fenol/klorofonn/izoamil-alkohol keverékkel extraháljuk majd kloroform/izoamil-alkohol keverékkel extraháljuk. Szilárd CsCI-t adunk hozzá, hogy annak végső koncentrációja 800 pg/ml legyen, valamint EtBr-t adunk hozzá, hogy annak végső koncentrációja I mg/ml legyen. Az így létrejött oldatot Vti 50 rotorban forgatjuk 49 000 fordulat/percnél 18-20 órán át 20 eC hőmérsékleten.Plasmid-bearing E. coli LE392 is grown to 1.0 OD 50 in 1x LB medium containing 50 pg / ml ampicillin and grown overnight with the addition of chloramphenicol to a final concentration of 200 pg / ml. Cells were washed with 0.8% NaCl, 20 mM Trist, pH 8.0, 20 mM EDTA, and lysozyme treated with 25% sucrose, 50 mM Trist, pH 7.4 ) In a solution containing 20 mM EDTA and 450 pg / ml lysozyme. Lysis is achieved by the addition of 1 M NaCl to a final concentration of 2.0 M, followed by the addition of an equal volume of 0.2% Triton X-100 and 40 mM EDTA. The preparation was purified by rotation at 20,000 rpm for 45 minutes. The supernatant is then extracted with a phenol / chloroform / isoamyl alcohol mixture, then extracted with chloroform / isoamyl alcohol and precipitated with ethanol. The pellet was resuspended in TE buffer, treated with RNase A, extracted with phenol / chlorophone / isoamyl alcohol and then extracted with chloroform / isoamyl alcohol. Solid CsCI was added to give a final concentration of 800 pg / ml and EtBr was added to a final concentration of I mg / ml. The resulting solution was spun in a Vti 50 rotor at 49,000 rpm / min for 18-20 hours at 20 C, e.
A plazmidcsíkokat UV fluoreszcenciával tesszük láthatóvá és a csőből tűvel és injekciós fecskendővel szedjük ki. A plazmidoldatot n-butanollal extraháljuk négyszer és etanollal kicsapjuk -20 °C hőmérsékleten. Az etanolos kicsapást legalább még kétszer megismételjük, hogy eltávolítsuk az összes CsCl-t. A plazmidot -20 °C hőmérsékleten tároljuk, mint etanolos csapadékot.Plasmid strips are visualized by UV fluorescence and recovered from the tube with a needle and injection syringe. The plasmid solution was extracted four times with n-butanol and precipitated with ethanol at -20 ° C. The ethanol precipitation was repeated at least twice more to remove all CsCl. The plasmid was stored at -20 ° C as ethanol precipitate.
VII. példaVII. example
Az alkoholoxidáz tisztításaPurification of alcohol oxidase
Az I. példa szerint leírt módon metanolon nőtt Pichia pastoris-sejtekből nyert fehérjemintákat készítünk az élesztősejtek lizálásával, amelyet tisztító centrifugálás követ a sejttörmelék eltávolítására a következő módon. A fermetor-folyadék egy részét kivesszük és pH 7,5-re állítjuk be ammónium-hidroxiddal, majd Dyno-Mill Model KDL berendezésen homogenizáljuk 0,6 literes edényt alkalmazva folytonos üzemmenetben 30 °C hőmérsékleten 3# szíjkombinációt használva és 20-30 ml/óra átfolyást. A gyöngyök a malomban ólommentes üveggyöngyök 0,3-05 mm átmérővel. Az így létrejött homogenizátumot 5 °C hőmérsékleten és 20 000 g-vel centrifugáljuk 30 percen át, sejtmentes felülúszót nyerve.Protein samples obtained from Pichia pastoris cells grown on methanol as described in Example I are prepared by lysing yeast cells followed by purification centrifugation to remove cellular debris as follows. A portion of the fermetor fluid was removed and adjusted to pH 7.5 with ammonium hydroxide and homogenized on a Dyno-Mill Model KDL using a 0.6 liter vessel at 30 ° C in continuous operation using a 3 # strap combination and hour flow. The beads in the mill are lead-free glass beads with a diameter of 0.3-05 mm. The resulting homogenate was centrifuged at 5 ° C and 20,000 g for 30 minutes to obtain a cell-free supernatant.
A sejtmentes felülúszó 6 db 130 ml-es frakcióját cellulózacetát dializálózacskóba tesszük és 5 °C hőmérsékleten dializáljúk 8 liter desztillált vízzel szemben. 4 nap után az egyes zacskók vizes fázisait dekantáljuk. A zacskókban maradt szilárd anyagok két típusú szilárd anyagot tartalmaznak. A vékony fehér felső réteget gondosan eltávolítjuk és eldobjuk. Az alsó szilárd anyag barnás-sárga színű, ez kristályos alkoholoxidáz. A kristályos alkoholoxidáz egy részét desztillált vízben újra oldjuk (kb. a szilárd anyag tízszeres térfogatának megfelelő mennyiségben), és a mérés a festék-peroxidáz módszerrel 94 enzimegység/ml aktivitást mutat. Az alkoholoxidáz fajlagos aktivitása 10,4 enzimegység/mg fehérje.Six 130 ml fractions of the cell-free supernatant were placed in a cellulose acetate dialysis bag and dialyzed against 5 liters of distilled water at 5 ° C. After 4 days, the aqueous phases of each bag are decanted. The solids remaining in the bags contain two types of solids. The thin white top layer is carefully removed and discarded. The lower solid is brownish-yellow in color and is a crystalline alcohol oxidase. A portion of the crystalline alcohol oxidase is redissolved in distilled water (approximately ten times the volume of the solid) and the dye peroxidase assay shows 94 enzyme units / ml. The specific activity of the alcohol oxidase is 10.4 enzyme units / mg protein.
A fentebb leírt dialízisből létrejött kristályos csapadékot 0,05 mól/literes kálium-foszfáttal (pH 7,5) szemben dializáljúk, és 2x200 cm-es, azonos pufferral kiegyensúlyozott Sephacryl 200 (Pharmacia) oszlopra kötjük. 3,5 ml-es frakciókat szedünk 10 ml/óra átáramlási sebesség mellett, és mérjük az alkoholoxidáz aktivitását.The crystalline precipitate formed from the dialysis described above is dialyzed against 0.05 M potassium phosphate pH 7.5 and applied to a 2x200 cm column equilibrated in Sephacryl 200 (Pharmacia). 3.5 ml fractions were collected at a flow rate of 10 ml / h and the alcohol oxidase activity was measured.
Az alkoholoxidáz-aktivitást a metanollal végzett reakcióhoz a következő vizsgálati eljárással (festék-peroxidáz módszer) határozzuk meg. Festék-puffer keveréket készítünk 0,1 ml o-dianizidin oldat (1 tömeg% o-dianizidin vízben) összekeverésével 12 ml levegőztetett 0,1 mól/literes nátrium-foszfát-pufferral (pH 7,5). A mérési keveréket 2,5 ml festék-puffer keverékből, 50 pl metanolból, 10 μΐ peroxidáz oldatból [1 mg torma-peroxidáz (Sigma, H. típus)] és 25 μΐ alkoholoxidáz oldatból készítjük el. A mérési keveréket 25 °C hőmérsékleten tartjuk egy 4x1x1 cm-es küvettában, és a festék által előidézett növekedést az abszorbanciában 460 nm-nél rögzítjük 2-4 percen át. Az enzimaktivitást a következő képlet alapján számítjuk:The alcohol oxidase activity for the reaction with methanol is determined by the following assay (dye peroxidase method). A dye-buffer mixture was prepared by mixing 0.1 ml o-dianizidine solution (1 wt% o-dianizidine in water) with 12 ml aeration of 0.1 M sodium phosphate buffer, pH 7.5. The assay mixture is prepared from 2.5 ml dye-buffer mixture, 50 µl methanol, 10 µ 10 peroxidase solution [1 mg horseradish peroxidase (Sigma, type H)] and 25 µΐ alcohol oxidase solution. The assay mixture is maintained at 25 ° C in a 4 x 1 x 1 cm cuvette and the dye-induced increase in absorbance at 460 nm is recorded for 2 to 4 minutes. The enzyme activity is calculated using the following formula:
Aktivitás (pmól/perc/ml vagy enzimegység/ml) ~-perc x 11,5, ahol a 11,5 egy standard görbére alapozott faktor, amely standard görbét H2O2 ismert alikvotjaival készí- 50 tettük el, és ΔΑ a változás az abszorbanciában a kísérleti intervallum során.Activity (pmoles / min / ml or enzyme units / ml) ~ -min x 11.5 where 11.5 is a factor based on a standard curve made with known aliquots of H 2 O 2 and ΔΑ is the change absorbance during the experimental interval.
Minden frakcióból 0,1 pg teljes fehérjét alkoho Ioxidáz-tartalmát mérjük gélelektroforézissel, SDS-poliakrilamidon (12%).Alcohol oxidase content of 0.1 µg of total protein from each fraction was measured by gel electrophoresis on SDS-polyacrylamide (12%).
VIII. példaVIII. example
DNS és fehérje frakcióelemzésDNA and protein fraction analysis
A DNS-szekvenciák meghatározását a didezoxi lánchosszabbító módszerrel hajtjuk végre Ml3 bakteri- 60 ofágot alkalmazva (Sanger és munkatársai, 1980), vagy kémiai módosító eljárással (Maxam-Gilbert, 1980). Az alkoholoxidáz gén 5’ végének megfelelő DNS-fragmenseket beiktatjuk az M13mp8 és M13mp9 vektorokba, vagy végjelezzük a kémiai módosítási eljáráshoz, az ezen a területen rendelkezésre álló restrik55 ciós enzimhelyeket alkalmazva.DNA sequencing is performed by the dideoxy chain extension method using M13 bacteriality (Sanger et al., 1980) or by chemical modification (Maxam-Gilbert, 1980). DNA fragments corresponding to the 5 'end of the alcohol oxidase gene are inserted into the vectors M13mp8 and M13mp9, or end-labeled for chemical modification using restriction enzyme sites available in the art.
A pPG 4.0-ból származó 710 bp-s HindlII/SalI-fragmenst végjelezzük a Maxam-Gilbert-féle szekvenciaelemzéshez, először 33 pg plazmidot emésztve HindHI-al. A reakciókeveréket fenol/kloroform/izoamilalkohol keverékkel extraháljuk, majd kloroform-izo22The 710 bp HindIII / SalI fragment from pPG 4.0 was terminated for Maxam-Gilbert sequence analysis by first digesting 33 µg of plasmid with Hind III. The reaction mixture was extracted with a phenol / chloroform / isoamyl alcohol mixture and then with chloroform-iso
HU 205 627 Β amil-alkohol keverékkel extraháljuk, és etanollal kicsapjuk. A DNS-t centrifugálással összegyűjtjük és újra szuszpendáljuk 31 μΐ vízben. 100 μθί 32P-ct-dCTP-t (3200 Ci/mmól) és két egység Poll Klenow-fragmenst adunk a reakciókeverékhez, hogy a keverék végső térfogata 50 μΐ legyen, és a keveréket úgy állítjuk be, hogy végül 400 μΐ/liter dATP-t, 400 μπιόΐ/liter dGTP-t, 50 mmól/liter Triszt (pH 7,4), 10 mmól/liter MgSO4-ot és 1 mmól/liter DTT-t tartalmazzon. A reakciókeveréket 37 °C hőmérsékleten indukáljuk 1 órán át, és a reakicót 2 μΐ 0,5 mól/literes EDTA hozzáadásával állítjuk le. A keveréket azután fenol/kloroform/izoamil-alkohol keverékkel extraháljuk, majd kloroform-izoamil-alkohol keverékkel extraháljuk, majd kloroform-izoamil-alkohol keverékkel Sephadex G-50 oszlopon kromatografáljuk, és a jelzett nukleinsav-frakciókat összegyűjtjük és etanollal kicsapjuk. Centrifugálás után a DNS-üledéket vízben újra szuszpendáljuk és Sall-gyel emésztjük. Az emésztett anyagot elektroforézisnek vetjük alá 1%-os agaróz gélen TAE-pufferban, és a 710 bp-os csíkot kivágjuk a gélből, a DNS-t elektroelucióval kinyerjük, butanolial extraháljuk és etanollal kicsapjuk. A fragmenst újra szuszpendáljuk 100 μΐ TE-pufferban, 2,5 mól/literes ammónium-acetát koncentrációra állítjuk be, majd etanollal kicsapjuk. Az így létrejött DNS-fragmenst újra szuszpendáljuk TE-pufferban 50 000 cpm/μΐ koncentrációnál.It is extracted with a mixture of amyl alcohol and is precipitated with ethanol. DNA was collected by centrifugation and resuspended in 31 μΐ water. 100 μθί 32 P-ct-dCTP (3200 Ci / mmol) and two units of Poll Klenow fragment were added to the reaction mixture to give a final volume of 50 μΐ and the mixture was adjusted to finally 400 μΐ / liter of dATP , 400 μπιόΐ / liter dGTP, 50 mM Trist (pH 7.4), 10 mM MgSO 4 and 1 mM DTT. The reaction mixture was induced at 37 ° C for 1 h and quenched by the addition of 2 μ ED 0.5 M EDTA. The mixture is then extracted with phenol / chloroform / isoamyl alcohol, then extracted with chloroform / isoamyl alcohol, then chromatographed on a Sephadex G-50 column with chloroform / isoamyl alcohol, and the labeled nucleic acid fractions are collected and precipitated with ethanol. After centrifugation, the DNA pellet was resuspended in water and digested with SalI. The digested material was subjected to electrophoresis on a 1% agarose gel in TAE buffer, and the 710 bp band was excised, the DNA was electroeluted, extracted with butanol and precipitated with ethanol. The fragment was resuspended in 100 μΐ TE buffer, adjusted to 2.5 M ammonium acetate, and precipitated with ethanol. The resulting DNA fragment was resuspended in TE buffer at 50,000 cpm / μΐ.
A négy bázismódosító reakciót a következőképpen hajtjuk végre:The four base-altering reactions are carried out as follows:
a) a G (guanin) reakciókeveréket inkubáljuk 8 percen át 22 °C hőmérsékleten, ez 1 μΐ (50 000 cpm) jelzett DNS-fragmenst, 4 μΐ vizet, 200 ml 50 mmól/literes nátrium-kakodilátot (pH 8,0), 1 mmól/liter EDTA-t (DMS-puffer) és 1 μΐ dimetil-szulfátot tartalmaz. A reakciót 50 ml DMS-leállító puffer hozzáadásával állítjuk le, amely 1,5 mól/liter nátrium-acetátot (pH 7,0), 1 mól/liter 2-merkapto-etanolt és 100 μg/ml tRNS-t tartalmaz, majd etanolt (750 μΐ) adunk a reakicókeverékhez, és a reakciókeveréket -70 °C hőmérsékleten tartjuk legalább 15 percig.a) Incubate the G (guanine) reaction mixture for 8 minutes at 22 ° C with 1 μΐ (50,000 cpm) of the labeled DNA fragment, 4 μΐ of water, 200 ml of 50 mM sodium cacodylate, pH 8.0. Contains 1 mM EDTA (DMS buffer) and 1 μΐ dimethyl sulfate. The reaction was stopped by adding 50 ml of DMS-stop buffer containing 1.5 M sodium acetate (pH 7.0), 1 M 2-mercaptoethanol and 100 μg / ml tRNA, followed by ethanol. (750 μΐ) was added to the reaction mixture and the reaction mixture was kept at -70 ° C for at least 15 minutes.
b) a G/A (guanin/adenin) reakciókeveréket inkubáljuk 10 percen át 22 °C hőmérsékleten, ez 2 μΐ (100 000 cpm) jelzett DNS-fragmenst, 8 μΐ vizet és 30 μΐ hangyasavat tartalmaz. A reakciót 200 μΐ Hz leállító-puffer hozzáadásával állítjuk le [0,3 mól/liter nátrium-acetát (pH 5,5), 0,1 mól/liter EDTA és 25 μg/ml tRNS], majd etanolt (750 μΐ) adunk hozzá, és a reakciókeverékez -70 °C hőmérsékleten tartjuk legalább 15 percig.b) Incubate the G / A (guanine / adenine) reaction mixture for 10 minutes at 22 ° C containing 2 μΐ (100,000 cpm) of the labeled DNA fragment, 8 μΐ of water, and 30 μΐ of formic acid. The reaction was stopped by addition of 200 μΐ Hz stop buffer [0.3 M sodium acetate (pH 5.5), 0.1 M EDTA and 25 μg / ml tRNA] followed by ethanol (750 μΐ). and the reaction mixture is kept at -70 ° C for at least 15 minutes.
c) a T/C (timidin/citozin) reakciókeveréket inkubáljuk 10 percen át 22 °C hőmérsékleten, ez 2 μί (100 000 Cpm) jelzett DNS-fragmenst, 18 μΐ vizet és 30 μg hidrazint tartalmaz. A reakciót azonos módon állítjuk le, ahogyan ezt a fentebb említett b) pontban leírtuk.c) The T / C (thymidine / cytosine) reaction mixture was incubated for 10 minutes at 22 ° C containing 2 μί (100,000 Cpm) of the labeled DNA fragment, 18 μΐ of water and 30 μg of hydrazine. The reaction is stopped in the same manner as described in (b) above.
d) a C (citozin) reakciókeveréket 10 percen át inkubáljuk 22 °C hőmérsékleten, ez 1 μΐ (50 000 cpm) jelzett DNS-fragmenst, 4 μΐ vizet, 15 μg 5 mól/literes NaCl-t és 30 μΐ hidrazint tartalmaz. A reakciót a b) pontban leírtak szerint állítjuk le.d) Incubate the C (cytosine) reaction mixture for 10 minutes at 22 ° C containing 1 μΐ (50,000 cpm) of the labeled DNA fragment, 4 μΐ of water, 15 μg of 5 M NaCl and 30 μΐ of hydrazine. The reaction is stopped as described in b).
A DNS-üledéket centrifugálással összegyűjtjük, újra szuszpendáljuk 250 μΐ 0,3 mól/literes nátrium-acetátban (pH 5,5) és etanolos kicsapást végzünk 750 μΐ 95%-os etanollal. Az üledéket centrifugálással összegyűjtjük, vákuumban szárítjuk 5 percig, és a DNS-t elhasítjuk az üledéket újra szuszpendálva 100 μΐ 1: 10 (térf./térf.) piperídinnel történő hígítással. A hasítási reakciókeveréket 90 °C hőmérsékleten inkubáljuk 30 percen át, és leállítjuk 500 μΐ 98%-os etanolt, 60 mmól/liter nátrium-acetátot (pH 5,5) és 10 μg/ml tRNS-t tartalmazó oldat hozzáadásával, A reakciókeveréket szárazjég/etanol fürdőbe (kb. -70 °C) helyezzük mintegy 5 percre, és a DNS-fragmenseket centrifugálással összegyűjtjük. A fragmenseket újra szuszpendáljuk 50 μΐ 0,3 mól/literes nátrium-acetátban (pH 5,5), majd etanolos kicsapást végzünk 100 μΐ 95%-os etanollal. Ezt az etanolos kicsapást megismételjük, az üledéket 95%-os etanollal mossuk, centrifugáljuk és vákuumban bepároljuk. Az üledéket újra szuszpendáljuk 10 μΐ 80%-os formamidot, 10 mmól/liter NaOH-t, 1 mmól/liter EDTA-t, 0,1% xilol-cianolt és 0,1% brómfenolkéket tartalmazó oldatban. 2-3 μΐ-t elektroforézisnek vetünk alá 10%-os, 0,4 mm vastag poliakrilamid gélen, TBE-pufferban.The DNA pellet was collected by centrifugation, resuspended in 250 μΐ 0.3 M sodium acetate (pH 5.5), and ethanol precipitated with 750 μΐ 95% ethanol. The pellet was collected by centrifugation, dried in vacuo for 5 minutes, and the DNA was cleaved by resuspending the pellet in 100 μΐ 1: 10 (v / v) piperidine. The cleavage reaction mixture was incubated at 90 ° C for 30 minutes and stopped by adding 500 μΐ of 98% ethanol, 60 mM sodium acetate (pH 5.5) and 10 μg / ml tRNA. / ethanol bath (about -70 ° C) for about 5 minutes and the DNA fragments collected by centrifugation. The fragments were resuspended in 50 μΐ 0.3 M sodium acetate (pH 5.5) and ethanol precipitated with 100 μΐ 95% ethanol. This ethanol precipitation was repeated, the pellet was washed with 95% ethanol, centrifuged and concentrated in vacuo. The pellet was resuspended in a solution of 10 μΐ of 80% formamide, 10 mM NaOH, 1 mM EDTA, 0.1% xylene cyanol and 0.1% bromophenol blue. 2-3 μΐ was subjected to electrophoresis on a 10% 0.4 mm thick polyacrylamide gel in TBE buffer.
Az alkoholoxidáz aminosav-szekvenciáját a Sequemat, Inc. (Watertown, Massachussets) készülékével határozzuk meg, 2 mg tisztított, Pichia pastorisból nyert alkoholoxidázt alkalmazva. Az érett fehérje első 18 aminosava a következő szekvenciát mutatja (a kezdő Met nélkül): Ala-Ile-Pro-Glu-Glu-Phe-Asp-Ile-LeuVal-Leu-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Ser.The amino acid sequence of the alcohol oxidase was determined by Sequemat, Inc. (Watertown, Massachussets) using 2 mg of purified alcohol oxidase from Pichia pastoris. The first 18 amino acids of the mature protein show the following sequence (without the initial Met): Ala-Ile-Pro-Glu-Glu-Phe-Asp-Ile-LeuVal-Leu-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Ser.
IX. példaIX. example
Az alkoholoxidáz-átírás kiindulási helyének meghatározásaDetermine the origin of alcohol oxidase transcription
Hogy meghatározzuk, hogy az alkoholoxidázhoz tartozó mRNS rajthelye hol helyezkedik el, egy primer kiterjesztési kísérletet hajtunk végre az alkoholoxidáz gén 5’ vége DNS-szekvenciáiról másolt szintetikus oligonukleotidot alkalmazva primerként és 10 μg poliA+ Pichia pastoris mRNS-t alkalmazva templátként. 10 μg Pichia pastoris poliA+-mRNS-t egyesítünk 3 ng primerrel (5’-CTT CTC AAG TTG TCG-3’) 9,3 μΐ végső térfogatban, amely 43 mmól/liter NaCl-ot, 29,2 mmól/liter Triszt (pH 8,3), 5,2 mmól/liter MgCl2-t és 4,3 mmól/liter DTT-t tartalmaz. A nukleinsavakat 70 °C hőmérsékleten 5 percen át denaturáljuk és újra egyesítjük lassan lehűlni hagyva 22 °C hőmérsékletre. Az újraegyesített keveréket egy csőbe helyezzük, amely 4 μΐ dNTP-keveréket, 0,8 μί RT-puffert és 1 μί 32P-ct-dCTP-t (800 Ci/mmól) tartalmaz. 3 μΐ-t ebből a keverékből hozzáadunk 1-1 μΐ mindegyik megfelelő dNTP-hez. Az utolsó 3 μΐ-t a keverékből 1 μΐ vízhez adjuk. A reakciókat 1 μΐ dilRT hozzáadásával indítjuk be, és 42 °C hőmérsékleten indukáljuk 15 percen át. A reakciókeveréket 3 μΐ Chase RT-vel kezeljük 42 °C hőmérsékleten 15 percen át. A reakciókat 7,5 μΐ formamid-festék keverék hozzáadásával állítjuk le, és 45 μΐ-t elektroforézisnek vetünk alá 0,4 mm vastag gradiensgélen 1 x TBE-ben. Elektroforézis után a gélt 10%-os ecetsavban rögzítjük 10% metanollal 20 per23To determine where the start point of the alcohol oxidase mRNA is located, a primer extension experiment was performed using a synthetic oligonucleotide copied from the 5 'end DNA sequences of the alcohol oxidase gene as a primer and 10 μg of polyA + Pichia pastoris mRNA as a template. 10 μg of Pichia pastoris polyA + mRNA was combined with 3 ng of primer (5'-CTT CTC AAG TTG TCG-3 ') in a final volume of 9.3 μΐ containing 43 mM NaCl, 29.2 mM Trist. (pH 8.3), contains 5.2 mM MgCl 2 and 4.3 mM DTT. The nucleic acids are denatured at 70 ° C for 5 minutes and then re-pooled with slow cooling to 22 ° C. The reconstituted mixture was placed in a tube containing 4 μΐ dNTP mix, 0.8 μί RT buffer and 1 μί 32 P-ct-dCTP (800 Ci / mmol). 3 μΐ of this mixture is added to 1-1 μΐ of each appropriate dNTP. Add the last 3 μΐ of the mixture to 1 μΐ of water. Reactions were initiated by addition of 1 μΐ dilRT and induced at 42 ° C for 15 minutes. The reaction mixture was treated with 3 μΐ Chase RT at 42 ° C for 15 minutes. Reactions were terminated by the addition of 7.5 μΐ formamide-dye mixture and 45 μ elektr subjected to electrophoresis on a 0.4 mm thick gradient gel in 1 x TBE. After electrophoresis, the gel was fixed in 10% acetic acid with 10% methanol at 20 rpm
HU 205 627 Β cen át. A gélt vákuum alatt szántjuk és XAR röntgensugárfílmnek exponálásához használjuk.HU 205 627 Β cent. The gel was dried under vacuum and used to expose the XAR X-ray film.
A gradiensgélt a következő módon készítjük: 300 μΐ 10%-os ammónium-perszulfátot és 14 μΐ TEMED-et adunk 30 ml fedőgélhez; 75 μΐ 10%-os ammóniumperszulfátot adunk 7 ml fenékgélhez, 6 ml fedőgélt veszünk ki pipettával, majd 6 ml fenékgélt veszünk ki ugyanazzal a pipettával. A gélt a géllemezek köré öntjük: ezt követi 22 ml fedőgél.The gradient gel is prepared as follows: 300 μΐ 10% ammonium persulfate and 14 μΐ TEMED are added to 30 mL of overlay gel; Add 75 μΐ of 10% ammonium persulfate to 7 mL of bottom gel, remove 6 mL of top gel with a pipette, and then remove 6 mL of bottom gel with the same pipette. The gel is poured around the gel plates, followed by 22 ml of top gel.
X. példa mRNS hibridizációs szelekció és in vitro transzlációkExample X mRNA hybridization selection and in vitro translations
Pozitív hibridizációs-transzlációs kísérleteket hajtunk végre 20 pg klónozott Pichia genom DNS (amelyet a VI. példában leírtak szerint állítottunk elő) linearizálásával, különböző restrikciós endonukleázokkal kezelve. Ezt a DNS-t denaturáljuk az oldatot 0,3 mól/literes NaOH koncentrációra állítva be, majd inkubálva 65 °C hőmérsékleten 10 percen át. A denaturált DNS-tartalmú oldatot jégen gyorsan lehűtjük és semlegesítjük 0,5 mól/liter Trisz-HCl koncentrációra beállítással (pH 7,4). Azonos térfogatú 20 x SSPE-t adunk a denaturált DNS-hez közvetlenül a DNS-nek a nitrocellulőz szűrőhöz való kötése előtt, Mielőtt a DNS-t a nitrocellulőz szűrőkre vinnénk (Schleicher and Schuell BA83,9 mm átmérő), a szűrőket előkészítjük H2O-val nedvesítve, 10 percig forralva, majd háromszor 10 x SSPE-ben öblítve. 10 pg DNS-t kötünk ezután minden szűrőhöz úgy, hogy a DNS-t a szűrőre visszük, levegőn majd vákuumban 70 °C hőmérsékleten 2 órán át szántjuk.Positive hybridization-translation experiments were performed by linearizing 20 pg of cloned Pichia genomic DNA (prepared as described in Example VI) with various restriction endonucleases. This DNA was denatured by adjusting the solution to 0.3 M NaOH and incubating at 65 ° C for 10 minutes. The denatured DNA solution was rapidly cooled on ice and neutralized to 0.5 M Tris-HCl (pH 7.4). An equal volume of 20 x SSPE is added to the denatured DNA immediately before the DNA is bound to the nitrocellulose filter. Prior to transfer to the nitrocellulose filters (Schleicher and Schuell BA83.9 mm diameter), the filters are prepared with H 2. Moistened with O, boiled for 10 minutes, then rinsed three times in 10 x SSPE. 10 µg of DNA were then bound to each filter by transferring the DNA to the filter and air drying under vacuum at 70 ° C for 2 hours.
Az előhibridizálás előtt a szűrőket a kötött DNS-sel 1 ml steril vízbe helyezzük és 1 percig melegítjük 100 °C hőmérsékleten, jégen hűtjük, 1 ml steril vízzel Vörtex-berendezésben öblítjük és 1 ml előhibridizáló pufferrban, majd 40 pg (2 pg/ml ETS) poliA+-mRNS-t adunk közvetlenül az előhibridizáló pufferba. A hibridizáló keveréket 65 °C hőmérsékleten 10 percen át melegítjük, majd inkubáljuk 42 °C hőmérsékleten 24 órán át.Prior to pre-hybridization, the filters were placed with bound DNA in 1 ml sterile water and heated for 1 minute at 100 ° C, cooled on ice, rinsed with 1 ml sterile water in a Vortex and 1 ml pre-hybridization buffer, then 40 pg (2 pg / ml ETS). ) polyA + mRNA is added directly to the pre-hybridization buffer. The hybridization mixture was heated at 65 ° C for 10 minutes and then incubated at 42 ° C for 24 hours.
A hibridizálási követően a szűrőket kétszer röviden lemossuk I x SSPE-ben, amely 0,5% SDS-t is tartalmaz, 22 °C hőmérsékleten, majd hétszer 1 x SSPEben, amely 0,5% SDS-t is tartalmaz, 50 °C hőmérsékleten öblítésenként 5 percig, majd háromszor 0,1 x SSPE-ben 50 °C hőmérsékleten öblítésenként 5 percig, és egyszer 0,1 x SSPE-ben 65 °C hőmérsékleten 10 percig. Az RNS-t eluáljuk a szűrőről 1 percig forralva 300 pl H2O-val, amely 15 pg nyúlmáj tRNS-t tartalmaz. Az elulált RNS-t gyorsan lefagyasztjuk szárazjeges etanolos fürdőben. Az RNS keveréket hagyjuk szobahőmérsékletre felmelegedni, majd a szűrőket eltávolítjuk. Az RNS-keveréket ezután kicsapjuk a közeget 2,5 mól/liter ammónium-acetát koncentrációra állítva be, és etanollal kétszer kicsapva, és végül a csapadékot újra szuszpendáljuk 100 pl vízben, mielőtt liofileznénk.After hybridization, the filters were washed twice briefly in 1 x SSPE containing 0.5% SDS at 22 ° C, then seven times in 1 x SSPE containing 0.5% SDS at 50 ° C. at 5 ° C for 5 minutes per rinse, then three times in 0.1 x SSPE at 50 ° C for 5 minutes, and once in 0.1 x SSPE at 65 ° C for 10 minutes. The RNA was eluted from the filter by boiling for 1 min with 300 µl H 2 O containing 15 µg of rabbit liver tRNA. The eluted RNA was rapidly frozen in a dry ice-ethanol bath. The RNA mixture was allowed to warm to room temperature and the filters were removed. The RNA mixture was then precipitated by adjusting the medium to 2.5 M ammonium acetate and precipitating twice with ethanol and finally resuspending the precipitate in 100 µl of water before lyophilizing.
A fenti RNS-ről történő transzlációkat standard szakember számára ismert módszerekkel végezzük, ilyenek pl. azok az útmutatások, amelyeket a New England Nuclear által forgalmazott in vitro nyúl retikulocita lizátum transzlációs készlethez mellékelt útmutatáson. A fehérjetermékeket 8%-os poliakrilamid-gélen, amely 4,5% kötegelt gélt tartalmaz, vetjük alá elektroforézisnek.Translations of the above RNA are performed using standard techniques known to those of ordinary skill in the art, e.g. the guidance provided in the guidance provided with the in vitro rabbit reticulocyte lysate translation kit provided by New England Nuclear. The protein products were subjected to electrophoresis on an 8% polyacrylamide gel containing 4.5% bundled gel.
XI. példaXI. example
Antiszérum-készítmények és immunkicsapásAntiserum preparations and immunoprecipitation
Mind p72 (alkoholoxidáz) mind p76 polipeptidet tartalmazó, Pichia pastoris-sejtekből származó kivonat ellen nyulakban kialakuló antiszérumot készítünk, standard eljárásokat alkalmazva a következőképpen: Az extraktumokat PBS-sel szemben dializáljuk injekciózás előtt. Egy 8 hetes eljárás során minden nyúl 3 injekciót kap, amelyek mindegyike 1 mg teljes fehérjét tartalmaz, 0,1 ml térfogatban, 0,2 ml Freund-féle komplett adjuvánssal együtt. Az injekciókat bőr alá adjuk be, 6-10 helyre beadva a nyúlba. A nyolcadik hét végén a nyulakat elvéreztetjük, és ezeket a szérumokat megvizsgáljuk tisztított Pichia pastoris alkoholoxidáz ellenanyag jelenlétére Ouchterlony kettős diffúziós eljárással, amelynek során az antigént és az antitestet egymással szemben diffúndáltatjűk, és azok immunkomplexet képeznek az agaron. (Basic and Clinical Immunology, 1987, Ed: D. P. Stítes, J. D. Stobo, J. V. Wells.)An antiserum to rabbits containing both p72 (alcohol oxidase) and p76 polypeptide derived from Pichia pastoris cells was prepared using standard procedures as follows: The extracts were dialyzed against PBS before injection. In an 8-week procedure, each rabbit receives 3 injections, each containing 1 mg of total protein, in a volume of 0.1 ml along with 0.2 ml of complete Freund's adjuvant. The injections are given subcutaneously at 6-10 sites in the rabbit. At the end of the eighth week, the rabbits are bled and these sera are assayed for the presence of purified Pichia pastoris alcohol oxidase antibody by the Ouchterlony double diffusion procedure, whereby the antigen and antibody are diffused with one another and form an immune complex on the agar. (Basic and Clinical Immunology, 1987, Ed: D. P. Stites, J. D. Stobo, J. V. Wells.)
Tisztított nyúl anti-p72 (alkoholoxidáz) és anti-p76 fehérje antitesteket készítünk a teljes antiszérum affinitás-kromatográfiájával CNBr-dal kapcsolt p72 (alkoholoxidáz)-p76 Sepharose 4B oszlopon (Pharmacia) keresztül. 1 g CNBr-dal aktivált gélt készítünk gélt hidráivá 15 percen át 200 ml mmól/h'teres HCl-ben, ezt követi a mosás 3x50 ml kapcsolőpufferban [0,1 mől/liter nátrium-karbonát (pH 8) és 0,5 mól/liter NaCl]. 5 ml p72-p76 6 mg/ml-es oldatot (kapcsolőpufferban) adunk a gélhez és enyhén keverjük egy éjszakán át 4 °C hőmérsékleten. A nem kötődött fehérjét eltávolítjuk 3x50 ml kapcsolópufferrel öblítve. A megmaradó aktív csoportokat 1 mól/literes etanol-aminnal (pH 8) végzett 2 órás inkubálással távolítjuk el. A nem kovalensen kötött anyagot a gélről 50 ml 2 mmól/literes (PBS-ben) nátrium-tiocianát oldattal végzett mosással távolítjuk el. Az antiszérum kromatográfiája előtt a gélt végül 3x50 ml PBS-sel mossuk. 5 ml tisztított anti p72-p76 antiszérumot keverünk össze a géllel és inkubáljuk enyhe keverés közben 2 órán át 4 °C hőmérsékleten. Az antiszérum-gél keveréket azután egy 1x8 cmes oszlopra pipettázzuk és 15 ml PBS-sel mossuk. A tisztított antitestet eluáljuk az oszlopról 6 ml 2 mól/literes nátrium-tiocianáttal (PBS-ben). Ágéiról történtelúciő után a tisztított antitestet erőteljesen dializáljuk PBS ellen, amely 0,02% nátrium-azidot is tartalmaz.Purified rabbit anti-p72 (alcohol oxidase) and anti-p76 protein antibodies are prepared by affinity chromatography of whole antiserum over CN72r-linked p72 (alcohol oxidase) p76 Sepharose 4B column (Pharmacia). 1 g of CNBr-activated gel is made to hydrate the gel for 15 minutes in 200 ml of mmol / h HCl, followed by washing in 3 x 50 ml of switching buffer [0.1 mol / L sodium carbonate (pH 8) and 0.5 mol / l / liter NaCl]. 5 ml of p72-p76 6 mg / ml solution (in switching buffer) was added to the gel and stirred gently overnight at 4 ° C. Unbound protein was removed by rinsing with 3x50 mL of coupling buffer. The remaining active groups were removed by incubation with 1 M ethanolamine (pH 8) for 2 hours. The non-covalently bound material is removed from the gel by washing with 50 mL of 2 mM sodium thiocyanate (in PBS). The gel was finally washed with PBS (3 x 50 mL) prior to antiserum chromatography. 5 ml of purified anti-p72-p76 antiserum was mixed with the gel and incubated with gentle agitation for 2 hours at 4 ° C. The antiserum-gel mixture was then pipetted onto a 1 x 8 cm column and washed with 15 mL of PBS. The purified antibody was eluted from the column with 6 mL of 2M sodium thiocyanate (in PBS). After elution from its branches, the purified antibody is vigorously dialyzed against PBS containing 0.02% sodium azide.
Az affinitás-kromatográfiáva tisztított antiszérumokat egy PBS-ben (1% NP40-nel kiegészítve) levő in vitro transzlációs keverékhez adjuk és egy éjszakán át inkubáljuk 4 °C hőmérsékleten. Az antigén-antitest komplexet Pansorbinnal (Calbiochem) kicsapjuk jégen 2,5 órán át. A Pansorbint RIPA-pufferban végzett mosással készítjük elő. A Pansorbin-csapadékokat négy24The antisera purified by affinity chromatography were added to an in vitro translation mixture in PBS (supplemented with 1% NP40) and incubated overnight at 4 ° C. The antigen-antibody complex is precipitated with Pansorbin (Calbiochem) on ice for 2.5 hours. Pansorbin is prepared by washing in RIPA buffer. There are four Pansorbin precipitates24
HU 205 627 Β szer mossuk RIPA-pufferban és Laemmli töltőpufferban oldjuk elektroforézis előtt.Wash with RIPA buffer and Laemmli loading buffer before electrophoresis.
XII. példaXII. example
Pichia pastoris transzformálási eljárásTransformation of Pichia pastoris
A) Sejtnövesztés.A) Cell growth.
1. Egy Pichia pastoris GS115 (NRRL Y-15 851) telepet inokulálunk kb. 10 ml YPD tápközegbe és a tenyészetet 30 °C hőmérsékleten rázatjuk 12-20 órán át.1. A colony of Pichia pastoris GS115 (NRRL Y-15 851) is inoculated for approx. 10 ml of YPD medium and the culture is shaken at 30 ° C for 12-20 hours.
2. Mintegy 12-20 óra múlva a sejteket kb. 0,01-0,1 OD600 értékre hígítjuk és a sejteket a lóg növekedési fázisban tartjuk YPD tápközegben 30 °C hőmérsékleten kb. 6-8 órán át.2. After about 12 to 20 hours, the cells are exposed to ca. Dilute 0.01-0.1 OD 600 and keep cells in hanging growth phase in YPD medium at 30 ° C for approx. 6-8 hours.
3. Kb. 6-8 óra múlva 100 ml YPD tápközeget inokulálunk 0,5 ml inokulumtenyészettel kb. 0,1 OD^-as értékkel (vagy ezzel egyenértékű mennyiséggel). 30 °C hőmérsékleten rázatjuk a tenyészetet 12-20 órán át.3. After about 6-8 hours, 100 ml of YPD medium is inoculated with 0.5 ml of inoculum culture for approx. 0.1 OD 4 (or equivalent). The culture was shaken for 12-20 hours at 30 ° C.
4. Amikor a tenyészet eléri a mintegy 0,2-0,3 OD600 értéket (mintegy 16-20 óra múlva), a tenyészetet kinyerjük 1500 g-vel 5 percen át végzett centrifugálással.4. When the culture reaches an OD 600 of about 0.2-0.3 (after about 16-20 hours), the culture is recovered by centrifugation at 1500 g for 5 minutes.
B) Szferoplasztok előállításaB) Preparation of spheroplasts
1. A sejteket egyszer lemossuk 10 ml steril vízzel. (Az 1-5. lépésekben minden centrifugálást 5 percen át, 1500 g-vel végzünk).1. Wash cells once with 10 ml sterile water. (In steps 1-5, each centrifugation is performed at 1500 g for 5 minutes).
2. A sejteket egyszer lemossuk 10 ml frissen készített SED-del.2. Wash cells once with 10 ml freshly prepared SED.
3. A sejteket kétszer lemossuk 10 ml steril, 1 mól/literes szorbit-oldattal.3. Wash cells twice with 10 ml sterile 1 M sorbitol.
4. A sejteket újra szuszpendáljuk 10 ml SCE-pufferban.4. The cells are resuspended in 10 ml of SCE buffer.
5. 5-10 pl 4 mg/ml-es Zymolyase 60 000-t (Miles Laboratories) adunk hozzá. A sejteket 30 °C hőmérsékleten inkubáljuk 30-60 percen át.5. Add 5-10 µl of 4 mg / ml Zymolyase 60,000 (Miles Laboratories). Cells were incubated at 30 ° C for 30-60 minutes.
Mivel a szferoplasztok készítése kritikus lépés a transzformálási eljárásban, a szferoplasztkészítést meg kell figyelni a következőképpen. Sejtek 100 μΐ-es alikvotjait hozzáadjuk 900 pl 5%-os SDS-hez és 900 μΐ 1 mól/literes szorbitoldathoz a zimoliázhoz való hozzáadás előtt vagy közvetlen az után, valamint az inkubálási periódus különböző időpontjaiban. Az inkubálást annál a pontnál állítjuk le, ahol a sejtek lizálódnak SDS-ben, de nem lizálódnak szorbitban (általában az inkubálás 30. és 60. perce között).Since spheroplast preparation is a critical step in the transformation process, spheroplast preparation should be monitored as follows. Aliquots of 100 μΐ cells were added to 900 μl of 5% SDS and 900 μΐ of 1 M sorbitol solution before or immediately after addition to the zymolase and at various times during the incubation period. The incubation is stopped at the point where cells lyse in SDS but not lysate in sorbitol (usually between 30 and 60 minutes of incubation).
6. A szferoplasztokat kétszer mossuk steril 1 mól/literes szorbitoldattal 1000 g-vel centrifugálva 5-10 percen át. (A centrifugálás ideje és sebessége változó lehet; a centrifugálásnak, elegendőnek kell lenni, hogy a szferoplasztok az üledékbe jussana, de nem szabad olyan soknak lenni, hogy az erőtől összezúzódjanak).6. Wash spheroplasts twice with sterile 1 M sorbitol solution by centrifugation at 1000 g for 5-10 minutes. (The time and speed of centrifugation may vary; the centrifugation must be sufficient to allow the spheroplasts to enter the sediment, but not so much as to be crushed by force).
7. A sejteket egyszer mossuk 10 ml steril CaS-ben.7. Wash cells once in 10 ml sterile CaS.
8. A sejteket újra szuszpendáljuk összesen 0,6 ml CaS-ben.8. The cells are resuspended in a total of 0.6 ml CaS.
C) transzformálásC) transformation
1. A transzformáló plazmid-DNS-mintákat (20 μΐ térfogatig) 12x75 mm-es steril polipropilén csövekbe visszük. (A DNS vízben vagy TE-pufferban; a maximális transzformálási gyakorisághoz kis mennyiségű DNS-sel ajánlatos hozzáadni kb. 1 μΐ 5 mg/ml-es ultrahanggal kezelt E. coli DNS-t mindegyik mintához).1. Transfer the transforming plasmid DNA samples (up to 20 μΐ volume) into 12x75 mm sterile polypropylene tubes. (DNA in water or TE buffer; it is recommended to add approximately 1 μΐ of 5 mg / ml sonicated E. coli DNA to each sample for maximum transformation frequency).
2. 100 μΐ szferoplasztot adunk minden egyes DNSmintához és szobahőmérsékleten inkubáljuk kb. 20 percen át.2. Add 100 μΐ spheroplast to each DNA sample and incubate at room temperature for approx. For 20 minutes.
3.1 ml PEG-oldatot adunk minden egyes DNS-mintához és szobahőmérsékleten inkubálunk kb. 15 percen át.Add 3.1 ml of PEG solution to each DNA sample and incubate at room temperature for approx. For 15 minutes.
4. A mintákat 1000 g-nél centifugáljuk 5-10 percen át, és a PEG-oldatot dekantáljuk.4. The samples are centrifuged at 1000 g for 5-10 minutes and the PEG solution is decanted.
5. A mintákat újra szuszpendáljuk 150 μΐ SDS-ben és inkubáljuk 30 percen át szobahőmérsékleten.5. The samples are resuspended in 150 μΐ SDS and incubated for 30 minutes at room temperature.
6. 850 μΐ steril, 1 mól/literes szorbitoldatot adunk hozzá és lemezre visszük a minták alkivonatjait, amint ezt az alábbiakban leírjuk.6. Add 850 μΐ sterile 1 M sorbitol solution and place aliquots of the samples on a plate as described below.
D) A szferoplasztok regenerálásaD) Regeneration of spheroplasts
1. Előírás a Regeneráló Agar Tápközeg elkészítéséhez.1. Specification for Preparation of Regenerating Agar Medium.
a) Agar-szorbit: 9 g Bacto agart, 54,6 g szorbitot és(a) Agar sorbitol: 9 g Bacto agar, 54.6 g sorbitol and
240 g vizet autoklávozunk.Water (240 g) was autoclaved.
b) 10 x glükóz: 20 g glükózt és 100 ml vizet autoklávozunk.b) 10 x glucose: 20 g of glucose and 100 ml of water are autoclaved.
c) 10 X SSC: 6,75 g élesztő nitrogénbázist (aminosavak nélkül) és 100 ml vizet autoklávozunk (bármilyen szükséges aminosavat vagy nukleinsavat 200 μg/ml koncentrációig hozzáadhatunk az autoklávozás előtt vagy után).c) 10 X SSC: 6.75 g of yeast nitrogen base (without amino acids) and 100 ml of water are autoclaved (any necessary amino acid or nucleic acid can be added up to 200 μg / ml before or after autoclaving).
d) 30 ml 10 x glükózt és 30 ml 10 ΧΔ SSC-t hozzáadunk az olvadt agar-szorbit oldathoz. 0,6 ml 0,2 mg/ml-es biotinoldatot, és 20 mg/ml koncentrációig bármilyen kívánt aminosavat vagy nukleinsavat adunk hozzá. A Regeneráló Agart olvadt állapotban tartjuk 55-60 °C hőmérsékleten.d) 30 ml of 10 x glucose and 30 ml of 10 ΧΔ SSC are added to the molten agar sorbitol solution. 0.6 ml of 0.2 mg / ml biotin solution and up to 20 mg / ml are added any desired amino acid or nucleic acid. The Regenerating Agar is kept in a molten state at 55-60 ° C.
2. A transzformálási minták lemezre vitele. Lemezenként 10 ml regeneráló agárból fenékagar réteget öntünk ki legalább 30 perccel azelőtt, mielőtt a transzformálási minták készen vannak. A regeneráló agar 10 ml-es alikvotjait csövekbe osztjuk el, amelyek 45-50 °C-os fürdőben vannak, abban az időszakban, amíg a transzformálási minták SDS-ben vannak. A fentebb leírt transzformálási minták alikvotjait a regeneráló agarai töltött csövekbe adjuk és a lemezek fenékagar rétegére öntjük olyan módon, hogy a megfelelő mintamennyiséget 10 ml-es olvadt, 45-50 °C hőmérsékleten tartott regeneráló agarba visszük és a 10 ml szilárd fenékagar réteget képző regeneráló agart tartalmazó lemezekre öntjük.2. Plate the transformation samples on a plate. A bottom layer of agar was discarded from 10 ml of regeneration agar per plate at least 30 minutes before the transformation samples were ready. Aliquots of 10 ml of regeneration agar are dispensed into tubes in a 45-50 ° C bath while the transformation samples are in SDS. Aliquots of the transformation samples described above are added to tubes filled with regeneration agar and poured onto the bottom agar layer of the plates by transferring an appropriate volume of sample into 10 ml molten regeneration agar at 45-50 ° C and regenerating 10 ml solid bottom agar layer. of agar.
3. A szferoplasztkészítmény minőségének meghatározása.3. Determination of the quality of the spheroplast preparation.
Egy minta 10 μΐ-ét kivesszük és százszorosára hígítjuk 990 μΐ 1 mól/literes szorbitoldat hozzáadásával. A százszorosán hígított mintából 10 μΐ-t kiveszünk és további százszoros hígításnak vetjük alá egy második 990 μΐ 1 mól/literes szorbitoldat hozzáadásával. Mindkét hígításból 100 μΐ-es mennyiséget YPD-agarlemezre szélesztünk, hogy meghatározzuk a készítményben maradt, szferoplaszttá nem alakult teljes sejtek koncentrációját. 100 μΐ-t minden hígításból 10 ml regeneráló agárhoz (amely 40 μg/ml hisztidinnel van kiegészítve) adunk, hogy meghatározzuk az összes regenerálható szferoplasztot. A transzformálási kísérleteknél jó eredmények: 1-3 x 107 összes regenerálható szferoplaszt/ml és 1 χ 103 teljes sejt/ml.Take 10 μΐ of a sample and dilute 100-fold with 990 μΐ of 1 mol / l sorbitol solution. Take 10 μΐ of the 100-fold dilution and further dilute 100-fold by adding a second 990 μΐ of 1 mol / l sorbitol solution. 100 μΐ of each dilution was plated onto YPD agar plates to determine the concentration of whole cells remaining in the preparation which did not become spheroplast. 100 μΐ of each dilution is added to 10 ml regeneration agar (supplemented with 40 μg / ml histidine) to determine all regenerable spheroplasts. Transformation experiments yielded good results: 1-3 x 10 7 total regenerable spheroplasts / ml and 1 x 10 3 whole cells / ml.
HU 205 627 ΒHU 205 627 Β
4. A lemezeket 30 °C hőmérsékleten 3-5 napon át inkubáljuk.4. Incubate the plates at 30 ° C for 3-5 days.
XIII. példaXIII. example
Pichia pastoris HIS4 gén és autonóm replikáciős szekvenciák izolálása A TörzsekIsolation of Pichia pastoris HIS4 gene and autonomous replication sequences The strains
Az alkalmazott törzsek a következők:The strains used are:
a) Pichia pastoris NRRL Y-ll 430 törzs;(a) Pichia pastoris strain NRRL Y-1130;
b) Pichia pastoris GS115 (his4; NRRL Y-15 851);b) Pichia pastoris GS115 (his4; NRRL Y-15,851);
c) S. cerevisiae 5799—4D törzs (his4-260 his4—39; NRRL Y-15 859); ésc) S. cerevisiae strain 5799-4D (his4-260 his4-39; NRRL Y-15,859); and
d) E. coli 848 törzs (F' met thi gal T,R 080s hsdR hsdM+).d) E. coli strain 848 (F 'met thi gal T, R 080 s hsdR hsdM + ).
B) Plazmidok pYA2 (lásd 23. ábra, az S. cerevisiae HIS4 gént tartalmazó 9,3 kilobázispáros Pstl-fragmensből áll, beiktatva a pBR325 PstI helyénél) a forrása az S. cerevisiae HIS4 gén fragmenseknek, ez egy E. coli gazdaszervezetben van deponálva és a köz rendelkezésére áll NRRL B-15 874 letéti számon.B) Plasmids pYA2 (see Figure 23, composed of a 9.3 kilobase PstI fragment containing the S. cerevisiae HIS4 gene inserted at the PstI site of pBR325) is the source of the S. cerevisiae HIS4 gene fragment deposited in an E. coli host. and is available to the public under the accession number NRRL B-15 874.
Az YEpl3 rendelkezésre áll az American Type Culture Collection-nál az ATCC 37 115 letéti számon.YEpl3 is available from the American Type Culture Collection under accession number ATCC 37,115.
C) TápközegekC) Media
A Pichia pastorist YPD (dús) vagy IMG (minimál) tápközegen növesztjük. Az IMG, amely minimáltápközeg, a következőkből áll:Pichia pastoris is grown on YPD (rich) or IMG (minimal) medium. IMG, which is a minimal medium, consists of:
1. IML sók: végső koncentrációban 36,7 mmól/liter KH2PO4, 22,7 mmől/liter (NH4)2SO4,2,0 mmől/liter MgSO4.7H20,6,7 mmól/liter KC1,0,7 mmól/liter CaCl22H2O, tízszeres koncentrációjú törzsoldatként elkészítve és autoklávozva;1. IM L salts: at final concentration of 36.7 mmol / L KH 2 PO 4 , 22.7 mmol / L (NH 4 ) 2 SO 4 , 2.0 mmol / L MgSO 4 .7H 2 0.6,7 mmol / liter KC1,0,7 mmol / l CaCl 2 2H 2 O, prepared as a ten-fold concentrated stock solution and autoclaved;
2. Nyomelem-sók: végső koncentrációban 0,2 gmól/liter CuSO4.5H20,1,25 gmól/liter KI, 4,5 gmól/liter MnSO4.H2O, 2,0 pmól/liter NaMoO4.2H2O, 0,75 pmól/liter H3BO3,17,5 pmól/liter ZnSO4.7H2O, 44,5 pmól/liter FeCl3.6H2O, 400-szoros koncentrációjú törzsoldatként elkészítve és szűréssel sterilezve;2. Trace Salts at a final concentration of 0.2 gmol / L CuSO 4 .5H 2 0,1,25 gmol / L KI, 4.5 gmol / l MnSO 4 .h O 2, 2.0 pmol / L Nam 4 .2H 2 O, 0.75 pmol / l H3BO3,17,5 pmol / L ZnSO 4 .7H 2 O, 44.5 pmol / l FeCl 3 .6H 2 O, prepared as a 400x stock solution and filter sterilized;
3. 0,4 pg/ml biotin; és3. 0.4 pg / ml biotin; and
4. 2% glükóz.4. 2% glucose.
Az E. colit vagy LB tápközegben, vagy 2B tápközegben tenyésztjük (0,2% NH4PO4, 1,2% Na2HPO4, 0,013% MgSO4.7H2O, 0,074% CaCl2.2H2O, 1 pg/ml tiamin és 0,4% glükóz), amely 100 pg/ml triptofánnal és 0,2% kazamino-savval (hidrolizált kazein) van kiegészítve.E. coli is cultured in either LB medium or 2B medium (0.2% NH 4 PO 4 , 1.2% Na 2 HPO 4 , 0.013% MgSO 4 .7H 2 O, 0.074% CaCl 2. 2H 2 O, pg / ml thiamine and 0.4% glucose) supplemented with 100 pg / ml tryptophan and 0.2% casaminic acid (hydrolyzed casein).
D) ADNS izolálásaD) Isolation of ADNS
I. Az élesztő DNS nagy léptékű előállítása.I. Large-scale production of yeast DNA.
Mind a Pichia pastoris, mind a S. cerevisiae DNSkészítését úgy hajtjuk végre, hogy élesztősejteket növesztünk 100 ml minimál tápközegen, amíg az A^qq érték 1-2 lesz, majd a sejteket 2000 g-nél 5 percig végzett centrifugálással kinyerjük. A sejteket egyszer vízben, egyszer SED-ben, egyszer 1 mól/literes szorbitoldatban mossuk, majd 5 ml 0,1 mól/liter TriszHCl (pH 7,0) 1 mól/liter szorbitoldatban szuszpendáljuk. A sejteket 50-100 pl 4 mg/ml-es Zymolyase 60 000 oldattal (Miles Laboratories) összekeverjük és 30 °C hőmérsékleten I órán át inkubáljuk, hogy a sejtfalakat elemésszük. A szferoplasztkészítményt azután centrifugáljuk 1000 g-nél 5-10 percen át és „lizáló puffer”-ban szuszpendáljuk (0,1% SDS, 10 mmól/liter Trisz-HCl (pH 7,4), 5 mmól/liter EDTA és 50 mmól/liter NaCl). K proteinázt (Boehringer Mannheim) és RN-áz A-t (Sigma) adunk hozzá 100-100 gg/ml mennyiségben és a keveréket 37 °C hőmérsékleten 30 percig inkubáljuk. A DNS-t fehérjementesítjük, a készítményt enyhén kevertetve egyenlő térfogat kloroformmal, amely izoamil-alkoholt is tartalmaz (24: 1 térf/térf.), és a fázisokat 12 000 g-vel 20 percig végzett centrifugálással választjuk el. A felső (vizes) fázist egy friss csőbe szívjuk át, és azonos térfogatnyi fenol/kloroform/izoamil-alkohol keverékkel extraháljuk. A fázisokat az előzőek szerint elválasztjuk, és a felső fázist egy 2-3 térfogat hideg, 95%-os etanolt tartalmazó csőbe helyezzük. A mintát enyhén keverjük, és a DNS-t összegyűjtjük egy műanyag rúdra feltekerve. A DNS-t azonnal feloldjuk 1 ml TE-pufferban és egy éjszakán át dializáljuk 4 °C hőmérsékleten 100 térfogat TE-puffer ellen.DNA preparation of both Pichia pastoris and S. cerevisiae was performed by growing yeast cells in 100 ml of minimal medium until Aqq 1-2 was achieved and the cells were harvested by centrifugation at 2000 g for 5 minutes. The cells were washed once in water, once in SED, once in 1 M sorbitol, and resuspended in 5 mL of 0.1 M TrisHCl, pH 7.0, in 1 M sorbitol. Cells were mixed with 50-100 µl of 4 mg / ml Zymolyase 60,000 (Miles Laboratories) and incubated at 30 ° C for 1 hour to analyze the cell walls. The spheroplast composition was then centrifuged at 1000 g for 5-10 minutes and resuspended in "lysis buffer" (0.1% SDS, 10 mM Tris-HCl, pH 7.4), 5 mM EDTA and 50 mM per liter of NaCl). Proteinase K (Boehringer Mannheim) and RNase A (Sigma) were added at 100-100 µg / ml and the mixture was incubated at 37 ° C for 30 minutes. The DNA was deprotected by gentle mixing with an equal volume of chloroform containing isoamyl alcohol (24: 1 v / v), and the phases were separated by centrifugation at 12,000 g for 20 minutes. The upper (aqueous) phase is aspirated into a fresh tube and extracted with an equal volume of phenol / chloroform / isoamyl alcohol. The phases are separated as above and the upper phase is placed in a 2-3 volume cold tube containing 95% ethanol. The sample is mixed gently and the DNA is collected by wrapping it on a plastic rod. The DNA was immediately dissolved in 1 mL of TE buffer and dialyzed overnight at 4 ° C against 100 volumes of TE buffer.
2. Az élesztő-DNS kis léptékű előállítása.2. Small-scale production of yeast DNA.
ml minimál tápközegben nőtt élesztőtenyészetet növesztünk, amíg az Α^θθ érték 1-5 lesz, és a sejteket 2000 g-vel 5 percen át végzett centrifugálással kinyerjük. A sejteket 1 ml SED-ben szuszpendáljuk és átvisszük 1,5 ml-es mikrocentrifuga-csőbe, egyszer mossuk 1 mól/literes szorbitoldattal és újra szuszpendáljuk 0,5 ml 0,1 mól/literes Trisz-HCl-dal (pH 7,4), amely szorbitra 1 mól/literes Zymolyase 60000-t (10 (il 4 mg/ml-es oldatból) adunk hozzá és a sejteket 3060 percig inkubáljuk 30 °C hőmérsékleten. A sejteket ezután centrifugáljuk 1 percig, „lizáló puffer”-ban szuszpendáljuk és 60-70 °C hőmérsékleten inkubáljuk. 15 perc múlva a mintákat 100 gl 5 mól/literes káliumacetáttal összekeverjük, jégfürdőben tartjuk 15 percen át, majd 5 percen át centrifugáljuk. A felülúszókat dekantáljuk egy friss mikrocentrifuga-csőbe, amely 1 ml 95%-os etanolt tartalmaz, összekeverjük és 10 másodpercig centrifugáljuk. Végül a DNS-üledéket levegőn szárítjuk 10-15 percig, majd 50 gl TE-pufferban oldjuk.ml of yeast culture in minimal medium was grown until the Α ^ θθ value was 1-5 and the cells were harvested by centrifugation at 2000 g for 5 minutes. Cells were resuspended in 1 ml SED and transferred to a 1.5 ml microcentrifuge tube, washed once with 1 M sorbitol solution, and resuspended in 0.5 ml 0.1 M Tris-HCl, pH 7.4 ), to which sorbitol was added 1 M Zymolyase 60,000 (10 (from 4 mg / ml solution)) and the cells were incubated for 3060 minutes at 30 [deg.] C. The cells were then centrifuged for 1 minute in "lysis buffer". resuspended and incubated at 60-70 C. After 15 minutes, the samples were mixed with 100 µl of 5 M potassium acetate, kept in an ice bath for 15 minutes and centrifuged for 5 minutes. The supernatants were decanted into a fresh microcentrifuge tube containing 1 ml of 95% ethanol, mixed and centrifuged for 10 seconds. Finally, the DNA pellet was air dried for 10-15 minutes and then dissolved in 50 µl of TE buffer.
3. E. coli-DNS nagy léptékű izolálása.3. Large-scale isolation of E. coli DNA.
A nagy léptékű (0,5-1 liter) plazmidkészítéshezE. coli-tenyészeteket növesztünk 37 °C hőmérsékleten 2B tápközegben rázatva, amely a fentiek szerinti és a megfelelő antibiotikummal van kiegészítve. Azokhoz a sejtekhez, amelyek pBR322 eredetű plazmidokat tartalmaznak, a tenyészeteket mintegy 0,7 A550 értékig növesztjük, ekkor megfelelő mennyiségű klóramfenikolt adunk hozzá, hogy koncentrációja 100 gg/ml legyen, és a sejteket mintegy 15 óra múlva kinyerjük. Azokat a törzseket, amelyek pBR325 eredetű plazmidokat tartalmaznak, kiegészített 2B tápközegbe inokuláljuk kb. 0,01-0,05 kiindulási A550 értéknél és rázatás mellett inkubáljuk 37 °C hőmérsékleten 20-24 órán át akinyerés előtt.For large scale (0.5 to 1 liter) plasmid preparationE. cultures were grown at 37 ° C in shaking medium 2B supplemented with the above antibiotic and the appropriate antibiotic. For cells containing plasmids derived from pBR322, the cultures are grown to about 0.7 A 550 , then sufficient chloramphenicol is added to give a concentration of 100 µg / ml and the cells are harvested after about 15 hours. Strains containing plasmids derived from pBR325 are inoculated into supplemented 2B medium for about 10 minutes. Incubate at 0.01-0.05 at A 550 and shake at 37 ° C for 20-24 hours before harvest.
4. E. coli-DNS kis léptékű előállítása4. Small-scale production of E. coli DNA
A kis léptékű gyors plazmidizoláláshoz 2 ml-es tenyészeteket növesztünk kiegészített 2B tápközegben antibiotikummal .együtt egy éjszakán át rázatással, majd centrifugálással kinyerjük a sejteket 1,5 ml-esFor small-scale rapid plasmid isolation, 2 ml cultures were grown in supplemented 2B medium with antibiotic, and overnight shaking followed by centrifugation yielded 1.5 ml cells.
HU 205 627 Β mikrocentrifuga-csövekben. A preparátumokból a plazmidokat a Bimbóim és Doly (1979 Nucl. Acids. Rés. 7, 1519-1523) által leírt alkalikus lízis módszer szerint izoláljuk.EN 205 627 Β in microcentrifuge tubes. Plasmids from the preparations were isolated according to the alkaline lysis method described by Bimboim and Doly (1979 Nucl. Acids. Res. 7, 1519-1523).
E) Restrikciós DNS-fragmens izolálásE) Isolation of restriction DNA fragment
A restrikciós enzimeket a New England Biolabs-tól és a Bethesda Research Laboratories-től szerezzük be és az emésztést a forgalmazó előírása szerint végezzük. A restrikciós térképezést beiktatott DNS-sel rendelkező és beiktatott DNS nélküli plazmidok párhuzamosan emésztett termékeit összehasonlítva hajtjuk végre. A restrikciós fragmenseket az agaróz-gélből Whatman 2MM papírcsíkokra történő elektroelucióval tisztítjuk. A fragmenseket a papírról 3-4 mosással nyerjük ki, a mosást 0,1-0,2 ml oldattal végezve, amelynek összetétele 0,1 mól/liter NaCl, 50 mmól/liter Trisz-HCI (pH 8,0) és 1 mmól/liter EDTA, Végül a fragmenseket fenol/kloroform/izoamll-alkohol keverékkel extraháljuk, etanollal kicsapjuk és újra feloldjuk kis mennyiségű TE-pufferban.Restriction enzymes were obtained from New England Biolabs and Bethesda Research Laboratories and digested as directed by the supplier. Restriction mapping is performed by comparing parallel-digested products of plasmids with inserted DNA and without inserted DNA. The restriction fragments were purified from the agarose gel by electroelution onto Whatman 2MM strips of paper. The fragments were recovered from the paper by 3-4 washes with 0.1-0.2 ml of 0.1M NaCl, 50 mM Tris-HCl pH 8.0 and 1 mM Finally, the fragments are extracted with phenol / chloroform / isoamyl alcohol, precipitated with ethanol and redissolved in a small amount of TE buffer.
F) P. pastoris-Jcönyvtár” megalkotása E. coliban.F) Creation of a P. pastoris Library "in E. coli.
A Pichia pastoris DNS-YEpl3-„könyvtár” megalkotásához 100 pg YEpl3-at emésztünk BamHI-el teljes mértékig, és borjúbél alkálikus foszfatázzal kezeljük, hogy eltávolítsuk a DNS-ről a terminális 5’ foszfátot. Pichia pastoris NRRL Y-ll 430-ból nyert vad típusú Pichia pastoris DNS egy 100 pg-os alikvotját részlegesen emésztjük 10 egység Sau3AI-gyel 5 percig inkubálva 37 °C hőmérsékleten 1 ml teljes térfogatban. Az 5 és 10 kilobázis közti fragmenseket méret szerint szelektáljuk centrifugálással 5-20% szacharóz gradiensen át végzett centrifugálással. A vektor 1 pg-ját és 2 pg Pichia Sau3AI-fragmenst összekeverünk 20 egység T4 DNS-ligázzal (Bethesda Research Laboratories) 200 pl teljes térfogatban és egy éjszakán át inkubáljuk 4 °C hőmérsékleten. A ligáit DNS-eket E. coliba transzformáljuk a teljes ligálási reakció keveréket hozzáadva 2 ml megfelelő E. coli 848 sejttenyészethez, és 15 percig inkubáljuk 0 °C hőmérsékleten. A keveréket 37 °C hőmérsékleten melegítjük 5 percen át, ezután 40 ml LB-tápközeget adunk hozzá, és a 37 °C hőmérsékleten végzett inkubálást folytatjuk további 1 órán át. Ezután ampicillint adunk olyan mennyiségben, hogy teljes koncentrációja 100 pg/ml legyen, majd az inkubálást újabb 1 órán át folytatjuk. Végül a sejteket 10 percen át centrifugáljuk 3000 g-nél, újra szuszpendáljuk 1 ml friss LB-tápközegben és egyenlő alikvotokban 10 LB agarlemezre szélesztjük, amely lemezek 10 pg/ml ampicillint is tartalmaznak. A mintegy 50 000 telepet, amely létrejön, a lemezekről lekaparjuk és a sejtek egy részletét 500 ml kiegészített 2B tápközegbe inokuláljuk, mintegy 0,1Α550 kiindulási értéknél. A tenyészetet növesztjük és a plazmidot a fentebb leírtak szerint extraháljuk. A telepekből, amelyeket a „könyvtárból kigyűjtjük, 100 vizsgált telepből 96 tetraciklin érzékeny és 10 vizsgált telepből 7 tartalmaz beiktatott DNSsel rendelkező plazmidot.For the construction of the Pichia pastoris DNA-YEpl3 "library", 100 µg of YEpl3 was completely digested with BamHI and treated with calf intestinal alkaline phosphatase to remove the terminal 5 'phosphate from the DNA. A 100 pg aliquot of wild-type Pichia pastoris DNA from Pichia pastoris NRRL Y-1130 was partially digested with 10 units of Sau3AI for 5 minutes at 37 ° C in a total volume of 1 ml. Fragments between 5 and 10 kilobases are sized by centrifugation by centrifugation at 5-20% sucrose. One µg of the vector and 2 µg of the Pichia Sau3AI fragment were mixed with 20 units of T4 DNA ligase (Bethesda Research Laboratories) in a total volume of 200 µl and incubated overnight at 4 ° C. The ligated DNAs were transformed into E. coli by adding the complete ligation reaction mixture to 2 ml of the appropriate E. coli 848 cell culture and incubating at 0 ° C for 15 minutes. The mixture was heated at 37 ° C for 5 minutes, then 40 ml of LB medium was added and incubation continued at 37 ° C for an additional 1 hour. Ampicillin was then added at a total concentration of 100 pg / ml and incubated for an additional 1 hour. Finally, the cells are centrifuged at 3000 g for 10 minutes, resuspended in 1 ml of fresh LB medium and plated in equal aliquots on 10 LB agar plates containing 10 pg / ml ampicillin. The approximately 50,000 colonies which resulted were scraped from the plates and a portion of the cells was inoculated with 500 ml of the supplemented 2B medium, about 550 0,1Α starting value. The culture was grown and the plasmid was extracted as described above. Of the colonies collected from the library, 96 of the 100 colonies tested contained tetracycline-sensitive and 7 of the 10 colonies tested contained plasmids with inserted DNA.
A Pichia pastoris DNS - pYJ8 Δ Cla-„könyvtár” megalkotásához 50 pg pYj8 Cla-t emésztünk teljes mértékben Clal-el és kezelünk borjúbél alkálikus foszfatázzal, hogy eltávolítsuk a DNS-ről a terminális 5’ foszfátot.For the construction of the Pichia pastoris DNA - pYJ8 ΔCla library, 50 pg pYj8Ca was completely digested with ClaI and treated with calf intestinal alkaline phosphatase to remove terminal 5 'phosphate from the DNA.
Pichia pastoris NRRL Y-15 851-ből származó DNS 100 pg-os alikvotját részben emésztjük 20 egység Taqlgyel, 5 percig inkubálva 65 °C hőmérsékleten 1 ml teljes térfogatban. Az 5-10 kilobázispár közti fragmenseket méret szerint szelektáljuk elektroelucióval 0,5% agarózgélről (lásd II. példa, E. fejezet). A vektor 1 pg-ját és 2 pg Pichia pastoris Taql-fragmenst összekeverünk 20 egység T4 DNS ligázzal (Bethesda Research Laboratories) 200 pl teljes térfogatban és egy éjszakán át inkubáljuk 4 °C hőmérsékleten. A ligáit DNS-eket E. coliba transzformáljuk a teljes ligálási reakciókeveréket hozzáadva 2 ml megfelelő E. coli 848 sejttenyészethez, és 15 percig inkubáljuk 0 °C hőmérsékleten. A keveréket 37 °C hőmérsékleten melegítjük 5 percen át, ezután 40 ml LBtápközeget adunk hozzá és az inkubálást további 1 órán át folytatjuk 37 °C hőmérsékleten. Ezután ampicillint adunk olyan mennyiségben, hogy annak koncentrációja 100 pg/ml legyen, és az inkubálást további egy órán át folytatjuk. Végül a sejteket 10 percen át centrifugáljuk 3000 g-nél, újra szuszpendáljuk 1 ml friss LB-tápközegben, és egyenlő alikvotokban 10 LB-agarlemezre szélesztjük, amely lemez 100 pg/ml ampicillint is tartalmaz. A mintegy 10 000 telepet, amely képződik, lekaparjuk a lemezekről és a sejtek egy részletét 500 ml kiegészített 2B tápközegbe inokuláljuk kb. 0,1 kiindulási A550 értéknél. A tenyészeteket növesztjük és a plazmidot a fentiekben leírtak szerint extraháljuk.A 100 pg aliquot of DNA from Pichia pastoris NRRL Y-15 851 was partially digested with 20 units of Taql for 5 minutes at 65 ° C in a total volume of 1 ml. Fragments between 5 and 10 kilobase pairs are sized by electroelution from a 0.5% agarose gel (see Example II, Chapter E). One pg of the vector and 2 pg of the Pichia pastoris Taq1 fragment were mixed with 20 units of T4 DNA ligase (Bethesda Research Laboratories) in a total volume of 200 µl and incubated overnight at 4 ° C. The ligated DNAs were transformed into E. coli by adding the complete ligation reaction mixture to 2 ml of the appropriate E. coli 848 cell culture and incubating for 15 minutes at 0 ° C. The mixture is heated at 37 ° C for 5 minutes, then 40 ml of LB medium is added and incubation is continued for 1 hour at 37 ° C. Ampicillin was then added at a concentration of 100 pg / ml and incubated for an additional hour. Finally, the cells are centrifuged at 3000 g for 10 minutes, resuspended in 1 ml of fresh LB medium and plated in equal aliquots on 10 LB agar plates containing 100 pg / ml ampicillin. Approximately 10,000 colonies that are formed are scraped from the plates and a portion of the cells are inoculated into 500 ml of supplemented 2B medium for about 1 hour. 0.1 at baseline A 550 . The cultures were grown and the plasmid was extracted as described above.
G) Southern-hibridizálásG) Southern hybridization
A nagy vagy nagyon feltekercselt DNS-molekulák nitrocellulózra való átviteléhez a DNS-t először részlegesen hidrolizáljuk úgy, hogy az agaróz gélt 0,25 mól/literes HCl-dal áztatjuk az alkálival végzett denaturálás előtt. Az S. cerevisiae HIS4 génből nyert jelzett fragmensek hibridizálását Pichis pastoris-DNShez 50% formamid, 6 x SSC, 5 x Denhardt-oldat, 0,1% SDS, 1 mmól/liter EDTA és 100 pg/ml denaturált heringsperma-DNS jelenlétében hajtjuk végre 42 °C hőmérsékleten. Az utóhibridizáló mosás 1 x SSC, 1 mmól/liter EDTA, 0,1% SDS és 1,0% nátrium-pirofoszfát oldatban történik 65 °C hőmérsékleten. A DNS-t 32P-vel jelezzük olyan módon, ahogyan ezt alV. példában leírtuk.To transfer large or highly coiled DNA molecules to nitrocellulose, the DNA is first partially hydrolyzed by soaking the agarose gel with 0.25 M HCl before denaturing with alkali. Hybridization of labeled fragments from the S. cerevisiae HIS4 gene to Pichis pastoris DNA was performed in the presence of 50% formamide, 6 x SSC, 5 x Denhardt's solution, 0.1% SDS, 1 mM EDTA and 100 pg / ml denatured herring sperm DNA. finally at 42 ° C. Post-hybridization washes were performed in 1 x SSC, 1 mM EDTA, 0.1% SDS and 1.0% sodium pyrophosphate at 65 ° C. The DNA is labeled with 32 P in the same way as for alV. example.
H) DNS-szekvencia-elemzésH) DNA sequence analysis
A DNS-szekvencia-elemzést a Sanger és munkatársai didezoxi-nukleotid-lánc befejezési módszerével végezzük (1980) (J, Mól. Bioi. 143,161-178).DNA sequence analysis was performed by the dideoxy nucleotide chain termination method of Sanger et al. (1980) (J. Mol. Biol. 143, 161-178).
I) Az élesztő transzformálásaI) Transformation of yeast
Az S. cerevisiae transzformálását Hinnen és munkatársai (1979) szferoplaszt-kialakítási módszerével hajtjuk végre, (Proc. Nat. Acad. Sci., USA 75,1929-1933).Transformation of S. cerevisiae is performed by the spheroplast-forming method of Hinnen et al., 1979 (Proc. Nat. Acad. Sci. USA 75,1929-1933).
A Pichia pastoris transzformálást a fentebb leírt eljárást követve hajtjuk végre.Transformation of Pichia pastoris is performed following the procedure described above.
J) A Pichia pastoris transzformánsok elemzéseJ) Analysis of Pichia pastoris transformants
Az egyes plazmidoknak azt a képességét, hogy autonóm elemként fennmaradnak Pichia pastoris-sejtekben, a következőképpen határozzuk meg: transzformáns telepet veszünk fel a regeneráló agarlemezről és SD-tápközeget tartalmazó agarlemezre szélesítjük, valamint folyékony IMG tápközegbe inokuláljuk. Az SD-lemezeket 30 °C hőmérsékleten inkubáljuk, ezután egy egyes telepet ve27The ability of each plasmid to survive as an autonomous element in Pichia pastoris cells was determined by picking a transformant colony from the regeneration agar plate and extending it onto SD IM medium and inoculating it into liquid IMG medium. The SD plates were incubated at 30 ° C and then plated on a single colony
HU 205 627 Β szünk fel erről a lemezről, szélesztjük egy második SDIemezre, valamint inokuláljuk egy második lombik 1MGtápközegbe. Ezt a folyamatot harmadszor is megismételjük. A három IMG-tenyészetet 30 °C hőmérsékleten növesztjük rázatással, amíg az Agoo érték kb. 1-2 lesz, majd a sejteket centrifugálással kinyerjük. Az élesztő tenyészetekből a DNS-t extraháljuk a fentebb leírtak szerint, elektroforézisnek vetjük alá 30 voltnál és 30 milliampernél 10-15 órán át 0,8% agaróz gélen, átvisszük nitrocellulózra és hibridizáljuk 32P-jelzett pBR322-höz vagy pBR325-höz, amint ezt fentebb leírtuk. Kontrollként egy mintát, amely 10 ng E. coliból izolált plazmidot és egy mintát, amely 1-2 pg nem transzformált GS115 DNS-t tartalmaz, a kísérleti mintával párhuzamosan vetünk alá elektroforézisnek.Dissolve from this plate, spread on a second SD plate and inoculate a second flask with 1MG medium. This process is repeated a third time. The three IMG cultures were grown by shaking at 30 ° C until the Agoo value was ca. 1-2 cells and the cells are harvested by centrifugation. DNA from yeast cultures was extracted as described above, subjected to electrophoresis at 30 volts and 30 milliamps for 10 to 15 hours on a 0.8% agarose gel, transferred to nitrocellulose and hybridized to 32 P-labeled pBR322 or pBR325, this is described above. As a control, a sample containing 10 ng of plasmid isolated from E. coli and a sample containing 1-2 pg of untransformed GS115 DNA were subjected to electrophoresis in parallel with the experimental sample.
K) Pichia DNS-szekvenciák izolálása.K) Isolation of Pichia DNA sequences.
DNS-fragmenseket, amelyek a Pichia HIS4 gént tartalmazzák, izolálunk egy Pichia DNS-„könyvtár”-bóI azon képességük alapján, hogy komplementerek az S. cerevisiae his4 törzsekkel. A könyvtár az YEpl3 S. cerevisiae-E. coli „ingázó”-vektor BamHI helyébe beiktatott, vad típusú Pichia DNS 5-20 kb-s Sau3 AI-gyel részlegesen emésztett fragmenseiből tevődik össze. Az S. cerevisiae NRRL Y-15 859 (5799-4D; his4ABO törzs) szferoplasztjait hozzuk létre Hinnen és munkatársai (1978) technikájával, összekeverjük a Pichia DNSkönyvtárral és regenerálódni hagyjuk egy hisztidinben hiányos tápközegben. A transzformálás mintegy 1 x 103 prototróf élesztőtelepet eredményez az 5 x 107 teljes regenerálható szferoplaszt-populációkból. A teljes élesztőDNS-t kivonjuk 20 His* telepből és E. coliba transzformáljuk. Az élesztő-DNS-készítmények közül 17 termel ampicillinrezisztens telepeket és mindegyik tartalmaz olyan plazmidot, amely YEpl3-ból + beiktatott DNS-ből áll. Annak igazolására, hogy a His* transzformáló gén tartalmazza a Pichia HIS4 gént és nem szupresszor-aktiviíással bíró DNS-fragmens, a plazmidok restrikciós emésztési termékeit hibridizáljuk az S. cerevisiae HIS4 gén nagy részletét tartalmazó jelzett DNS-fragmenshez, és mossuk kis erővel. A plazmidok mindegyike, amely komplementálja a his4 S. cerevisiae törzset, tartalmazza azokat a szekvenciákat, amelyek hibridizálódnak az S. cerevisiae HIS4 génhez.DNA fragments containing the Pichia HIS4 gene are isolated from a Pichia DNA "library" for their ability to be complementary to S. cerevisiae his4 strains. The library is YEpl3 S. cerevisiae-E. coli "commuter" vector consists of partially digested 5-20 kb Sau3 AI fragments of wild-type Pichia DNA inserted into BamHI. Spheroplasts of S. cerevisiae NRRL Y-15,859 (strain 5799-4D; his4ABO) were prepared by the method of Hinnen et al. (1978), mixed with the Pichia DNA library and allowed to regenerate in a histidine-deficient medium. Transformation results in approximately 1 x 10 3 prototrophic yeast colonies out of 5 x 10 7 total regenerable spheroplast populations. Total yeast DNA was extracted from 20 His * colonies and transformed into E. coli. Of the yeast DNA preparations, 17 produce ampicillin-resistant colonies and each contains a plasmid consisting of YEpl3 + inserted DNA. To confirm that the His * transforming gene contains the Pichia HIS4 gene and a non-suppressor activity DNA fragment, the restriction digestion products of the plasmids were hybridized to the labeled DNA fragment containing a large portion of the S. cerevisiae HIS4 gene and washed lightly. Each of the plasmids complementing his4 S. cerevisiae strain contains sequences that hybridize to the S. cerevisiae HIS4 gene.
Hogy megkeressük azokat a DNS-fragmenseket, amelyek Pichia ARS aktivitást tartalmaznak, Pichia pastoris GS115-ből (NRRL Y-15 851) származó DNS-t részlegesen emésztünk Taql-gyel és az 5 és 10 kilobázispár közti fragmenseket izoláljuk, és a pYJ8 Δ Cla egyedi Clal helyébe klónozzuk (lásd 26. ábra). A plazmid DNS-t a mintegy 10 000 His*4Pichia-telepből kinyerjük és E.coli transzformálására használjuk fel. A mintegy 10 000 ampicillinrezisztens telepből plazmidokat izolálunk, majd visszatranszformáljuk GS115-be. Ebből az „alkönyvtár-transzformálásból származó 40 His*élesztőtelepet külön-külön szelektív tápközegbe visszük és növesztjük külön tenyészetekben szelektív tápközegekben. Ennek a 40 tenyészetnek mindegyikéből a teljes élesztőDNS-t extraháljuk és E. coliba transzformáljuk. Két plazmidot, pYA63-at (PARS1) és pYA90-et (PARS2), amelyek élesztő-DNS készítményei leginkább ampicillinrezisztens E. coli telepeket produkálják, további elemzésre kiválasztjuk. Ezeknek a plazmidoknak mindegyike transzformálja a Pichia pastoris GS115-öt (NRRL Y-15To search for DNA fragments containing Pichia ARS activity, DNA from Pichia pastoris GS115 (NRRL Y-15,851) was partially digested with Taq1 and fragments between 5 and 10 kilobase pairs were isolated and pYJ8 Δ Cla. clal (see Figure 26). Plasmid DNA was recovered from approximately 10,000 His * 4 Pichia colonies and used to transform E. coli. Plasmids were isolated from approximately 10,000 ampicillin-resistant colonies and re-transformed into GS115. The 40 His * yeast colonies from this sub-library transformation were transferred to separate selective media and grown in separate cultures in selective media. Total yeast DNA from each of these 40 cultures was extracted and transformed into E. coli. Two plasmids, pYA63 (PARS1) and pYA90 (PARS2), whose yeast DNA preparations produce the most ampicillin-resistant colonies of E. coli, are selected for further analysis. Each of these plasmids transforms Pichia pastoris GS115 (NRRL Y-15).
851) igen nagy gyakorisággal és mindegyik tartalmaz egy idegen DNS-beiktatást.851) at very high frequencies and each one contains a foreign DNA insert.
XIV. példaXIV. example
Szabályozóterület lacZ gén fúziós termék megalkotásaRegulatory Area Creation of a lacZ gene fusion product
A) p72 (alkoholoxidáz) szabályozóterület konstrukciók. pPG 4.0 plazmidot, egy pBR322 vektort, amely tartalmazza a Pichia pastorisból származó, 4 kilobázispáros EcoRI-PvuII genomiális DNS-fragmenst, Pstl-gyel hasítunk, S1 nukleázzal kezelünk, hogy „tompa” végeket alakítsunk ki, ahol a hasítás történik, majd BamHI-vel hasítunk, így 1,12 kbp-s DNS-fragmenst nyerünk, amely tartalmazza az alkoholoxidáz szabályozóterületét és az alkoholoxidáz első 15 aminosavához tartozó kódoló információt. Ennek az 1,12 kbp-s DNS-fragmensnek a nukleotidszekvenciája a következő:A) p72 (alcohol oxidase) regulatory region constructs. Plasmid pPG 4.0, a vector pBR322 containing the 4 kb EcoRI-PvuII genomic DNA fragment from Pichia pastoris, was cleaved with Pstl, treated with S1 nuclease to form "blunt" ends where the cleavage occurs and then BamHI- cleavage to obtain a 1.12 kbp DNA fragment containing the alcohol oxidase regulatory region and coding information for the first 15 amino acids of the alcohol oxidase. This 1.12 kbp DNA fragment has the following nucleotide sequence:
BB
1,12 kbp , „S1 nukleáz”-zal....CTA GGT GGT G ’ kezelt vég...............GAT CCA CCA CCT AG |1.12 kbp, with "S1 nuclease" .... CTA GGT GGT G 'treated end ............... GAT CCA CCA CCT AG |
B alkoholoxidáz Leun GIy12Glyi3 Alcohol Oxidase B Leu n GIy 12 Glyi 3
Ezt az 1,12 kbp-t ligáljuk a pSEYlOl E. coli-S. cerevisiae „ingázó”-vektor EcoRI/Smal/BamHI kapcsolójába (BamHI-gyel és Smal-gyel hasítva) [Douglas és munkatársai (1984) Proc. Nat. Acad. Sci. U. S. 81, 3983-3987]. ApSEYlOl vektor tartalmazza az E. coli lacZ gént és egy, a következő nukleotidszekvenciával rendelkező ,,poli-linker”-t:This 1.12 kbp was ligated into pSEY101 E. coli-S. cerevisiae "shuttle" vector to EcoRI / Smal / BamHI (cleaved with BamHI and Smal) [Douglas et al. (1984) Proc. Nat. Acad. Sci. U.S. 81, 3983-3987]. The vector ApSEY101 contains the E. coli lacZ gene and a "poly-linker" having the following nucleotide sequence:
Rí Sm BRí Sm B
I IIII
Rt Sm B Val9 VaI10..pgalaktozidáz a fenti ligálással a pTAOll hibridplazmidot kapjuk (lásd 29. ábra)R t Sm B Val 9 Val 10 pgalactosidase The above ligation yields the pTAOll hybrid plasmid (see Figure 29).
A pTAOll szabályozó terület lacZ gén fúziós terméke a β-galaktozidáz termelése szempontjából fázison kívül van, amint ez az E szekvencia és az előbbi két szekvencia összehasonlításából látszik: ,The lacZ gene fusion product of the pTAOll regulatory region is out of phase with respect to β-galactosidase production, as can be seen from a comparison of the E sequence with the two sequences:
E szekvenciaThis is the sequence
R, B | 1,12 kbp jR, B | 1.12 kbp j
...GAATTCCG.....CTA GGT GGT GGA TCC CGT GGTT...... GAATTCCG ..... CTA GGT GGT GGA TCC CGT GGTT ...
...CrTAAGGG.....GATCCACCACCrAGGGCAGCAA...CrTAAGGG GATCCACCACCrAGGGCAGCAA ... ..... ...
f íf i
R, BR, B
Leu, ,Gly f2Gly,3Gly14Ser15Arg Arg A pTAOll plazmidot egyedi BamHI helyénél elhasítjuk és a következő Smal kapcsolót iktatjuk be:Leu,, Gly f2 Gly, 3 Gly 14 Ser 15 Arg Arg The plasmid pTAOll is cleaved at its unique BamHI site and the following Smal linker inserted:
HU 205 627 ΒHU 205 627 Β
Sm jSm j
GATCACCCGGGTGATCACCCGGGT
TGGGCCCACTAG íTGGGCCCACTAG i
Sm így hozzuk létre pTA012 hibridvektort, amelynek nukleotidszekvenciája a szabályozóterület lacZ fúziós termék tekintetében a következő:Sm thus creates a hybrid vector pTA012 having the nucleotide sequence of the regulatory region for the lacZ fusion product:
F szekvenciaF sequence
R[ SmR [Sm
1,12 kbp ί1.12 kbp ί
GAATTCCC.............CTA GGT GGT GGA TCA CCC GGG TGA TCC CGT CGTGAATTCCC ............. CTA GGT GGT GGA TCA CCC GGG TGA TCC CGT CGT
CITAAGGG...........GAT CCA CCA CCT AGT GGG CCC ACT AGG GCA GCACITAAGGG ........... GAT CCA CCA CCT AGT GGG CCC ACT AGG GCA GCA
I tI t
R[ SmR [Sm
LeuuGly12Gly13Gly14Ser15Pro Gly Ser Arg Arg és így a pTA012 szabályozó terület lacZ fúziós terméke még fázison kívül van a lacZ olvasókeret szempontjából. Abból a célból, hogy az alkoholoxidáz struktur- 20 génhez szolgáló N-terminális kódoló információt nyitott olvasókeretbe vigyük a lacZ strukturgénnel, a pTA012-t EcoRI-Smal-gyel kezeljük és az így létrejött DNS-fragmenseket pSEYlOl-hez ligáljuk, amelyeket előzőleg szintén kezeltünk EcoRI-gyel és Smal-gyel, így hozzuk létre a pTA013 hibridvektort (lásd a 30. ábrát és az alábbi nukleotidszekvenciát):Leu u Gly 12 Gly 1 3Gly 14 Ser 1 5Pro Gly Ser Arg Arg and thus the lacZ fusion product of the pTA012 regulatory region is still out of phase with respect to the lacZ reading frame. In order to introduce the N-terminal coding information for the alcohol oxidase structural gene into an open reading frame with the lacZ structural gene, pTA012 was treated with EcoRI-SmaI and the resulting DNA fragments ligated to pSEY101, which had also been previously treated. EcoRI and SmaI to generate the hybrid vector pTA013 (see Figure 30 and the following nucleotide sequence):
G szekvenciaG sequence
Rj Sm B ) 1,12 kbp | rRj Sm B) 1.12 kbp | r
GAATTCCC...CTA GGT GGT GGA TCA CCC GGG GAT CCC GTC GTT CITAAGGG...GAT CCC CCC CCT AGT GGG CCC CTA GGG CAG CAA t t fGAATTCCC ... CTA GGT GGT GGA TCA CCC GGG GAT CCC GTC GTT CITAAGGG ... GAT CCC CCC CCT AGT GGG CCC CTA GGG CAG CAA t t f
Rj Sm BRj Sm B
LeuuGly12Glyj3Gly14Ser15Pro Gly Asp Pro Val9Val10..β-galaktozidázLeuuGly 12 Glyj3Gly 14 Ser 15 Pro Gly Asp Pro Val 9 Val 10 ..β-Galactosidase
ApTA013 vektort használjuk ezután az S. cerevisiae SEY 2102 transzformálásához a XV. példában alább leírt további tanulmányokhoz.The vector pTA013 is then used to transform S. cerevisiae SEY 2102 as described in Figure XV. for further studies described below.
A pTA013 vektort azután elhasítjuk Pstl-gyel vagy Pstl-NruI-gyel és a szabályozóterület lacZ fúziós terméket, amelyet a hasított fregmens tartalmaz, ligáljuk a pTAFHl (lásd 28. ábra), pYJ30 (lásd 27. ábra), vagy pYA2 (lásd 23. ábra) „ingázó”-vektorok HIS4 géntartalmú fragmensével, a pSAOHl, pSAOH5, illetve pSAOHIO plazmldokat nyerve.The vector pTA013 is then cleaved with PstI or PstI-NruI and the regulatory region lacZ fusion product contained in the cleaved fragment is ligated into pTAFH1 (see Figure 28), pYJ30 (see Figure 27), or pYA2 (see Figure 23). Fig. 1A) with the HIS4 gene-containing fragment of "commuting" vectors, yielding plasmids pSAOH1, pSAOH5 and pSAOHIO.
szabályozóterülettel a következőképpen alkotjuk meg:with the control area, we create it as follows:
1. A pPG 6.0 teljes 5 ’ területét alkalmazva.1. Applying the entire 5 'region of pPG 6.0.
A pPG 6.0 1,35 kb-páros EcoRI fragmensét klónozzuk a pSEYlOl, egy E. coli-S. cerevisiae „ingázó”-vektor, egyedi EcoRI helyébe, a pT76Ul plazmidot nyerve (lásd 30a. ábra). A pT6Ul vektort azután elhasítjuk Pstl-NruI-gyel, és a nagyobb DNS-fragmenst ligáljuk a pTAFHl „ingázó”-vektor (28. ábra) HIS4 gén tartalmú fragmensével, amint ezt fentebb a pT76H3 készítésénél leírtuk, vagy a pBPfl (lásd 34. ábra) „ingázó”-vektor Pstl-EcoRI-fragmensben EcoRl-végen kitöltött fragmensével ligáljuk, a pT76H4et nyerve.The 1.35 kb EcoRI fragment of pPG 6.0 was cloned into pSEY101, an E. coli-S. cerevisiae "shuttle" vector, in place of the unique EcoRI, resulting in plasmid pT76U1 (see Figure 30a). The pT6U1 vector is then cleaved with PstI-NruI and the larger DNA fragment ligated with the HIS4 gene-containing fragment of the pTAFH1 "shuttle" vector (Figure 28), as described above for pT76H3 (see Figure 34). Fig. 1A) was ligated with an EcoRl-terminated fragment of the "commuter" vector in the PstI-EcoRI fragment to give pT76H4.
2. Az 5’-pPG 6.0 Bal31 emésztett terméket alkalmazva.2. 5'-pPG 6.0 Bal31 using a digested product.
pPG 6.0 1,35 kb-páros EcoRI fragmensét klónozzuk pSEY8, egy E. coli-S. cerevisiae „ingázó”-vektor, egyedi EcoRI helyére, amely vektornak van egy egyedi Sáli helye is az EcoRI hely szomszédságában, amelybe a Pichia DNS-t iktatjuk be, így nyerve a pTAlOl plazmidot (lásd 31. ábra). A pTAOl plazmidot Sall-gyel hasítjuk, Bal31 exonukleázzal kezeljük, hogy különböző hosszúságú, tompavégű p76 polipeptid szabályozószakasz-fragmenseket állítsunk elő. A tompa végű fragmenseket megszabadítjuk a pSEY8 plazmid megmaradt részétől EeoRI-vel végzett hasítással. Az így létrejött DNS-fragmenseket pSEYlOl EcoRI-Smal linkerjébe klónozzuk, így, többek között, a pTAF.85 plazmidot nyerve. A pTAF.85 plazmidot lacZ gén és ampicillinrezisztencia-gén alapján szelektáljuk. [A lacZ gén alapján történő szelekciót a Davis, Dibnes, Battey: Basic Methods is Molecular Biology, Elsevier New York (1986) irodalmi hely ismerteti].The 1.35 kb EcoRI fragment of pPG 6.0 was cloned into pSEY8, an E. coli-S. cerevisiae "shuttle" vector, to the unique EcoRI site, which vector also has a unique SalI site adjacent to the EcoRI site into which Pichia DNA was inserted to give plasmid pTA101 (see Figure 31). Plasmid pTAO1 was cleaved with SalI and treated with Bal31 exonuclease to generate regulatory fragment fragments of p76 polypeptide of various lengths. The blunt-ended fragments are freed from the remainder of the plasmid pSEY8 by digestion with EeoRI. The resulting DNA fragments were cloned into the EcoRI-SmaI linker of pSEY101, yielding, inter alia, plasmid pTAF.85. Plasmid pTAF.85 was selected on the basis of the lacZ gene and the ampicillin resistance gene. (Selection by the lacZ gene is described in Davis, Dibnes, Battey, Basic Methods in Molecular Biology, Elsevier New York, 1986).
A pTAF.85 plazmid analóg a 29. ábrában bemutatottThe plasmid analog of pTAF.85 is shown in Figure 29
HU 205 627 Β pTAOll-el, de p76 szabályozóterűletet tartalmaz a p72 (alkoholoxidáz) szabályozóterület helyett.However, it contains a p76 regulatory region instead of a p72 (alcohol oxidase) regulatory region.
A pTAF.85 vektort azután analóg módon kezeljük, mint a pTA013 vektort, a pTAFH.85, pT76Hl és pT76H2 plazmidokat nyerve. így a következő vektoro- 5 kát hasítjuk és ligáljuk:The pTAF.85 vector was then treated in an analogous manner to the pTA013 vector to obtain plasmids pTAFH.85, pT76H1 and pT76H2. Thus, the following vector is cleaved and ligated:
pTAF.85 plusz: Létrejött plazmidok pTAFHl pTAFH.85 pYJ30 pT76Hl pYA2 pT76H2 10pTAF.85 plus: Created plasmids pTAFH1 pTAFH.85 pYJ30 pT76Hl pYA2 pT76H2
XV. példaXV. example
A $-galaktozidáz-termelés szabályozása Pichia pastorisbanRegulation of $ galactosidase production in Pichia pastoris
A β-galaktozidáz-termelést vizsgáljuk számos, kü- 15 lönböző szénforrásban és különböző körülmények között nőtt Pichia pastoris GS115 (NRRL Y-15 851) transzformánsnál. A transzformált törzseket minimál tápközegen növesztjük, amely 0,5 pg/ml biotint és 0,1% glükózt tartalmaz, 30 °C hőmérsékleten, amíg a 20 tenyészet nem éri el a stacioner fázist. A sejteket ezután centrifugálással összegyűjtjük, és átvisszük olyan minimál tápközegbe, amely 0,5 pg/ml biotint és 0,5% metanolt tartalmaz, és növesztjük 3-5 generáción keresztül 30 °C hőmérsékleten. Ez után a me- 25 tanolon történt kezdeti növekedés után a sejteket centrifugálással összegyűjtjük és friss minimál tápközegre visszük át, amely 0,5 pg/ml biotint és szénforrásként vagy 0,1% glükózt, vagy 0,3% metanolt tartalmaz. A sejteket azután 30 °C hőmérsékleten inku- 30 báljuk 80 órán át, ebből időszakonként mintát veszünk ki, hogy meghatározzuk az alkoholoxidáz- és a β-galaktozidázszintet. Mintegy 20-50 óra múlva a szénforrás kimerül és azután a sejtek ebben a szénforráséhezéses állapotban maradnak fenn. Az eredmé- 35 nyékét az I, táblázat mutatja be: ·Β-galactosidase production is studied in Pichia pastoris GS115 (NRRL Y-15851) transformants grown in a variety of carbon sources and under different conditions. Transformed strains were grown on minimal medium containing 0.5 pg / ml biotin and 0.1% glucose at 30 ° C until the culture reached the stationary phase. The cells are then harvested by centrifugation and transferred to a minimal medium containing 0.5 pg / ml biotin and 0.5% methanol and grown for 3-5 generations at 30 ° C. Following this initial growth in methanol, the cells are harvested by centrifugation and transferred to fresh minimal medium containing 0.5 pg / ml biotin and either 0.1% glucose or 0.3% methanol as carbon source. Cells are then incubated at 30 ° C for 80 hours, periodically sampled to determine alcohol oxidase and β-galactosidase levels. After about 20-50 hours, the carbon source is depleted and then the cells remain in this carbon source-starved state. Its results are shown in Table I: ·
1. TÁBLÁZATTABLE 1
A β-galaktozidáz és alkoholoxidáz (egység/ODgoo) maximális szintjei (inkubációs idő, óra) Pichia pastoris NRRL Y-15 851 transzformánsaibanMaximum levels of β-galactosidase and alcohol oxidase (unit / ODgoo) (incubation time, hours) in Pichia pastoris NRRL Y-15 851 transformants
I. RÉSZPART I
aA sejteket különböző időpontokban vettük ki és a β-galaktozidáz és alkoholoxidáz aktivitás mérést a szövegben leírtak szerint végezzük.The cells were harvested at different times and assayed for β-galactosidase and alcohol oxidase activity as described in the text.
né - nem észleltük a zárójelben lévő számok az inkubálás idejét jelentik órában. 60no - numbers in parentheses indicate incubation time in hours. 60
II. RÉSZII. SECTION
aA sejtet különböző időpontokban vettük ki és a β-gaiaktozidáz és alkoholoxidáz aktivitást a szövegben leírtak szerint végeztük, né - nem észleltük a The cell was harvested at different times and β-galactosidase and alcohol oxidase activity was performed as described in the text.
Az alkoholoxidázt a festék-peroxidáz módszerrel határozzuk meg, amint ezt fentebb leírtuk (lásd VH. példa) és a β-galaktozidázt a következőképpen határozzuk meg:Alcohol oxidase is determined by the dye peroxidase method as described above (see Example VH) and β-galactosidase is determined as follows:
$-galaktozidázaktivitás-mérés$ -Galaktozidázaktivitás measurement
Végső koncentráció: 0,06 mól/liter 0,04 mól/liter 0,01 mól/liter 0,001 mól/liter 0,05 mól/literFinal concentration: 0.06 mol / liter 0.04 mol / liter 0.01 mol / liter 0.001 mol / liter 0.05 mol / liter
A) Szükséges oldatok:A) Required solutions:
Z puffer:Z buffer:
Na2HPO4.7H2O 16,1 g 'Na 2 HPO 4 .7H 2 O 16.1 g '
NaH2PO45,5g KC10,75g MgSO4.7H2O 0,246 g 2-merkapto-etanol 2,7 ml feltöltve 1 literre, a pH 7-re beállítva. O-rütrofenil-Q-D-galaktozid (ONPG):NaH 2 PO 4 5.5 g KC10.75 g MgSO 4 .7H 2 O 0.246 g 2-mercaptoethanol 2.7 ml was charged to 1 liter, adjusted to pH 7. O-Rytrophenyl-QD-Galactoside (ONPG):
400 mg ONPG-t (Sigma N-1127) feloldunk 100 ml desztillált vízzel, így 4 mg/ml-es ONPG-oldatot készítünk.400 mg of ONPG (Sigma N-1127) was dissolved in 100 ml of distilled water to make a 4 mg / ml ONPG solution.
B) Meghatározási eljárásB) Determination procedure
1. A tenyészet tápközegéből alikvotot veszünk ki (0,1-0,5 ODgoo értékű élesztősejt-tenyészetekből), centrifugáljuk és a sejtüledéket vízzel mossuk.1. An aliquot of the culture medium (yeast cell cultures with an OD 0 0-0.5 OD) is centrifuged and the cell pellet is washed with water.
2. 1 ml Z puffért adunk a sejtüledékhez, és 30 pl CHCl3-atés 30 pl 0,1%-os SDS-t, Vortex készülékkel keverjük, 5 percig inkubáljuk 30 °C hőmérsékleten.2. Add 1 ml of buffer Z to the cell pellet and mix with 30 µl CHCl 3 and 30 µl 0.1% SDS, vortex, and incubate for 5 min at 30 ° C.
3. Elindítjuk a reakciót 0,2 ml ONPG (4 mg/ml) hozzáadásával, Vortex berendezésben.3. Start the reaction by adding 0.2 mL of ONPG (4 mg / mL) in a Vortex.
4. A reakciót leállítjuk 0,1 ml 1 mól/literes Na2CO3 oldat hozzáadásával a megfelelő időpontban (A42O<1).4. Stop the reaction by adding 0.1 mL of 1 M Na 2 CO 3 at the appropriate time (A 42 O <1).
5. A felülúszó abszorbanciáját 420 nm-nél leolvassuk.5. Read the absorbance of the supernatant at 420 nm.
C) A ^-galaktozidáz aktivitás-egységek kiszámítása: 1 egység = 1 nmól orto-nitro-fenol (ONP), amely percenként keletkezik 30 °C hőmérsékleten és pH 7nél. 1 nmól ONP-nek 420 nm-nél (A420) 0,0045 abszorbanciája van 1 cm úthossznál; így az 1 abszorbancia 420 nm-nél 222 nmól ONP/ml-t jelent, vagy 378 nmól/l,7 ml-t, mível az analizálandó felülúszó teljes térfogata 1,7 ml. Ezáltal a táblázatokban kifejezett egységeket a következőképpen számoljuk ki:C) Calculation of units of β-galactosidase activity: 1 unit = 1 nmole orthonitrophenol (ONP) generated at 30 ° C and pH 7 per minute. 1 nm ONP at 420 nm (A 420 ) has an absorbance of 0.0045 at 1 cm path length; Thus, absorbance 1 at 420 nm is 222 nm ONP / ml or 378 nm / 1.7 ml, with a total volume of supernatant to be analyzed of 1.7 ml. The units expressed in the tables are thus calculated as follows:
A420A420
U =-X378 t (perc)U = -X378h (min)
HU 205 627 ΒHU 205 627 Β
Az I. táblázatban közölt eredmények azt jelzik, hogy egy élesztőben idegen fehérjét pl. a β-galaktozidázt lehet termelni Pichia pastorisban, a termelést vagy a tápközegben metanol jelenlétével szabályozva, vagy szénforráséhezéssel szabályozva katabolit-represszáló szénforráson történt növekedés után.The results in Table I indicate that a foreign protein in a yeast, e.g. β-galactosidase can be produced in Pichia pastoris, either controlled by the presence of methanol in the medium or by carbon starvation after growth on a catabolite-repressing carbon source.
XVI. PÉLDAXVI. EXAMPLE
A $-galaktozidáz termelésének szabályozása S. cervisiae-ban.Regulation of $ galactosidase production in S. cervisiae.
Saccharomyces cerevisiae SEY2102-t, amely túléléséhez uracil-, leucin- és hisztidinkiegészítést igénylő törzs, transzformálunk pTA013 és pT76Ul plazmidokkal. A transzformált organizmusokat könnyen izolálhatjuk azoknak a telepeknek a szelektálásával, amelyek nem igényelnek uracilkiegészjtést a növekedéshez. Az izolált transzformánsokat SEY2102-pTA013 illetve SEY2102-pT76Ul laboratóriumi jelzéssel láttuk el. Az SEY2102-pTA013-az deponáltuk a Northern Régiónál Research Center intézetnél (Peoris, Illinois) 1984. augusztus 31-én az NRRL Y-15 858 számon.Saccharomyces cerevisiae SEY2102, a strain requiring the addition of uracil, leucine and histidine, is transformed with plasmids pTA013 and pT76U1 to survive. Transformed organisms can be readily isolated by selecting colonies that do not require uracil supplementation for growth. Isolated transformants were labeled with SEY2102-pTA013 and SEY2102-pT76Ul. SEY2102-pTA013 was deposited with the Northern Region at the Research Center Institute (Peoris, Illinois) on August 31, 1984 under NRRL Y-15,858.
Az NRRL Y-15 858 és az SEY2102-pT76Ul sejtjeit 30 °C hőmérsékleten inkubáljuk 3-4 generáción át minimál tápközegen, amely 20-20 gg/ml hisztidint és leucint, valamint 5% glükózt is tartalmaz. A sejteket ezután áthelyezzük, vagyis centrifugálással összegyűjtjük és átvisszük YP tápközegbe, amely 3%, H. táblázatban jelzett szénforrással van kiegészítve, és növesztjük 30 °C hőmérsékleten 5 generáción keresztül. A sejteket azután további 50 órán át inkubáljuk a szénforráséhezés körülményei között, és időszakonként mintát veszünk β-galaktozidáz aktiválás-méréshez. Az eredményeket a II. táblázat foglalja össze.Cells of NRRL Y-15,858 and SEY2102-pT76U1 were incubated at 30 ° C for 3-4 generations in minimal medium containing 20-20 µg / ml histidine and leucine plus 5% glucose. The cells were then transferred, i.e. harvested by centrifugation, and transferred to YP medium supplemented with 3% carbon source in Table H and grown at 30 ° C for 5 generations. The cells are then incubated for another 50 hours under carbon source starvation conditions and periodically sampled for measurement of β-galactosidase activation. The results are shown in Table II. Table summarizes.
II. TÁBLÁZATII. SPREADSHEET
né = nem észleltükn = not detected
Ezek az eredmények azt jelzik, hogy az élesztő számára idegen fehérjét, vagyis a β-galaktozidázt lehet előállítani Saccharomyces cerevisiae-ban a p72 (alkoholoxidáz) és p76 szabályozóterületek irányítása alatt a szénforráséhezés körülményei között, amikor valamilyen katabolitrepresszáló szénforrást alkalmazunk a növesztéshez, vagy a transzformált S. cerevisiae-sejtek növesztésével viszonylag nem katabolitrepresszáló szénforrásokon, mint pl. glicerinen vagy galaktózon.These results indicate that a yeast foreign protein, i.e., β-galactosidase, can be produced in Saccharomyces cerevisiae under the control of the p72 (alcohol oxidase) and p76 regulatory sites under carbon source conditions and when using a catabolite-repressing carbon source or growth, By growth of S. cerevisiae cells on relatively non-catabolite-repressing carbon sources, e.g. glycerol or galactose.
A β-galaktozidáz kifejeződési szintjét az S. cerevisiae-ban a jelen találmány szerinti szabályozóterületek irányítása alatt össze lehet hasonlítani azokkal a kifejeződési szintekkel, amelyek más S. cerevisiae szabályozott promotorokkal lehetségesek.The level of β-galactosidase expression in S. cerevisiae under the control of the regulatory regions of the present invention can be compared to the expression levels that are possible with other S. cerevisiae regulated promoters.
Látható, hogy a találmány szerinti szabályozóterület legalább olyan hatásos, vagy hatásosabb S. cerevisiae promotorként, mint az S. cerevisiae-ban „benszülött” promotorok.It will be seen that the regulatory region of the invention is at least as effective or more effective as a S. cerevisiae promoter than the "native" promoter in S. cerevisiae.
XVII. PÉLDAXVII. EXAMPLE
Southern-hibridizálás élesztő genomiális DNS-selSouthern hybridization with yeast genomic DNA
Kilenc különböző metanolt asszimiláló törzset és egy metanolt nem asszimiláló törzset növesztünk minimál tápközegen (IMI, lásd 1. példa), amely még 0,75% metanolt, illetve 1% glükózt tartalmaz. A teljes kromoszomális DNS-t izoláljuk, ahogyan ezt a VI. példában leírtuk, azaz a teljes nukleinsavat izoláljuk, RN-áz A-val kezeljük, extraháljuk először fenol-kloroform/izoamil-alkohol keverékkel, majd kloroform/izoamil-alkohol keverékkel, végül etanollal kicsapjuk. A kicsapott DNS-t újra szuszpendáljuk minimális térfogatú TE-pufferban és centrifugáljuk, hogy derítsük a DNS-oldatot.Nine different methanol assimilating strains and one methanol non-assimilating strain were grown on minimal medium (IMI, see Example 1) containing 0.75% methanol and 1% glucose, respectively. Total chromosomal DNA was isolated as described in Figure VI. Thus, the whole nucleic acid was isolated, treated with RNase A, extracted first with phenol-chloroform / isoamyl alcohol, then with chloroform / isoamyl alcohol and finally ethanol precipitated. The precipitated DNA was resuspended in minimal volume of TE buffer and centrifuged to clarify the DNA solution.
Southem-hibridizáló szűrőket készítünk, amint ezt aSouthem hybridization filters are prepared as described in
VI. példában leírtuk, azaz 10 pg, különböző élesztő fajtákból származó teljes DNS-t emésztünk Hindlll fölöslegével, elektroforézisnek vetjük alá, a DNS-t denaturáljuk, a gélt semlegesítjük, és a DNS-t átvisszük nitrocellulóz szűrőkre. Ezekhez a szűrőkhöz az előhibridizálás körülményei a következők: egy éjszakán át kezeljük egy olyan oldattal, amely 50% ionmentesített formamidot, 6 x SSC-t, 5 x Denhardt-oldatot, 1 mmól/liter EDTA-t, 0,1% SDS-t és 100 pg/ml denaturált lazacsperma-DNS-t tartalmaz. Ugyanezeket a körülményeket alkalmazzuk a hibridizáló tápközeghez is, 32P-vel jelölt nick-transzlációnak alávetett vizsgáló mintákat alkalmazva, 106 beütés/perc/ml végső koncentrációt alkalmazva. A vizsgáló minták magukbanVI. Thus, 10 µg of total DNA from various yeast species were digested with excess HindIII, electrophoresed, the DNA denatured, the gel neutralized, and the DNA transferred to nitrocellulose filters. The pre-hybridization conditions for these filters are as follows: treated overnight with a solution of 50% deionized formamide, 6 x SSC, 5 x Denhardt's solution, 1 mM EDTA, 0.1% SDS and 100 pg / ml of denatured salmon sperm DNA. The same conditions were applied to the hybridization medium using 32 P-labeled nick translation assays at a final concentration of 10 6 bpm / ml. The test samples include
HU 205 627 Β foglalják a pPC 8.3, pPC 15.0 és pPC 6.7 klónokból származó cDNS-beiktatásokat (PstI fragmensek), valamint a P. pastoris HIS4 gén 2,7 kbp-s BglII DNS-fragmensét. Ezeknek a vizsgáló mintáknak mindegyikét külön alkalmazzuk azonos szűrőkön a hibridizáláshoz, amely 24 órán keresztül tart 42 °C hőmérsékleten. Hibridizálás után a szűrőket kétszer mossuk 15 percen át szobahőmérsékleten, és háromszor 65 °C hőmérsékleten 15 percen át egy olyan oldatban, amely 2 X SSC-t, 1 mmól/liter EDTA-t, 0,1% SDS-t és 0,1% nátrium-pirofoszfátot tartalmaz. További mosásokat is próbálunk kisebb intenzitással, pl. 55 °C és 42 °C hőmérsékleten, hogy igazoljuk a hibridizálási eredményeket. Ezeknek a hibridizálásoknak az eredményeit a ÜL táblázat foglalja össze.These include cDNA inserts (PstI fragments) from clones pPC 8.3, pPC 15.0 and pPC 6.7, as well as the 2.7 kbp BglII DNA fragment of the P. pastoris HIS4 gene. Each of these assay samples is applied separately to the same filters for hybridization, which lasts 24 hours at 42 ° C. After hybridization, the filters were washed twice for 15 minutes at room temperature and three times at 65 ° C for 15 minutes in a solution of 2 X SSC, 1 mM EDTA, 0.1% SDS and 0.1 Contains% sodium pyrophosphate. We also try more washes at a lower intensity, for example. At 55 ° C and 42 ° C to confirm the hybridization results. The results of these hybridizations are summarized in Table ÜL.
III. TÁBLÁZATIII. SPREADSHEET
P. pastoris gének hibridizálása különböző élesztő kromoszomális DNS-ekhezx Hybridization of P. pastoris genes to various yeast chromosomal DNA x
*Megjegyzés: + hibridizálás (+) gyenge hibridizálás* Note: + Hybridization (+) Weak Hybridization
- hibridizálás netn figyelhető meg az alkalmazott körülmények között- Hybridization can be observed on the net under the conditions used
A ΠΙ. táblázatban megadott eredmények azt jelzik, hogy a p76, p72 és p40-hez analóg polipeptidek génjei gyakorlatilag jelen vannak minden metanolt asszimiláló törzsben. Megjegyzésre érdemes, hogy ennek a három génnek egyikét sem figyeljük meg egy metanolt nem asszimiláló törzs, az S. cerevisiae DNS-ével való hibridizálásnál, míg homológia a P. pastoris HIS4 gén és az S. cerevisiae-ból származó HIS4 gén között könnyen megfigyelhető.The ΠΙ. The results in Table 1A show that the genes of the polypeptides analogous to p76, p72 and p40 are present in virtually all methanol assimilating strains. It is noteworthy that none of these three genes are observed when hybridizing with the methanol non-assimilating strain of S. cerevisiae DNA, whereas homology between the P. pastoris HIS4 gene and the S. cerevisiae HIS4 gene is easily observed.
BibliográfiaBibliography
Bimbóim és Doly (1979): Nucl. Acids Rés. 7, 15311523.Nipples and Doly (1979): Nucl. Acids Slit. 7, 15311523.
M. G. Douglas és munkatársai (1984): Proc. Nat. Acad. Sci. USA 81,3983-3987.Douglas M. G. et al. (1984) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 81,3983-3987.
Hinnen és munkatársai (1978). Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 75,1928-1933.Hinnen et al. (1978). Proc. Nat. Acad. Sci. USA 75,1928-1933.
Z. A. Janowicz és munkatársai (1985): Nucl. Acids. Rés. 13,3043-3062.Z. A. Janowicz et al. (1985) Nucl. Acids. Gap. 13.3043-3062.
A. M. Ledeboerés munkatársai (1985): Nucl. Acids. Rés. 13,3063-3082.A. M. Ledeboerés (1985) Nucl. Acids. Gap. 13.3063-3082.
Maxam és Gilbert (1980): Methods in EnzymologyMaxam and Gilbert (1980) Methods in Enzymology
65, 499-560.65, 499-560.
Southern (1975): J. Mól. Bioi. 98,503-517.Southern (1975) J. Mol. Biol. 98.503-517.
Sanger és munkatársai (1980): J. Mól. Bioi. 143,Sanger et al. (1980) J. Mol. Biol. 143
Claims (16)
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US06/666,391 US4808537A (en) | 1984-10-30 | 1984-10-30 | Methanol inducible genes obtained from pichia and methods of use |
US06/780,102 US4855231A (en) | 1984-10-30 | 1985-09-25 | Regulatory region for heterologous gene expression in yeast |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
HUT38678A HUT38678A (en) | 1986-06-30 |
HU205627B true HU205627B (en) | 1992-05-28 |
Family
ID=27099454
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
HU854160A HU205627B (en) | 1984-10-30 | 1985-10-30 | Process for producing polypeptides by yeasts containing area for controlling gen expression |
Country Status (23)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US4855231A (en) |
EP (2) | EP0183071B1 (en) |
JP (5) | JP2502508B2 (en) |
KR (1) | KR930001117B1 (en) |
CN (1) | CN1011243B (en) |
AR (1) | AR242988A1 (en) |
AT (1) | ATE83263T1 (en) |
AU (1) | AU572002B2 (en) |
CA (1) | CA1340733C (en) |
DD (1) | DD254211A5 (en) |
DE (1) | DE3586889T2 (en) |
DK (1) | DK496385A (en) |
ES (1) | ES8609458A1 (en) |
FI (1) | FI94427C (en) |
GR (1) | GR852611B (en) |
HU (1) | HU205627B (en) |
IE (1) | IE930804L (en) |
IL (1) | IL76765A (en) |
NO (1) | NO178076C (en) |
NZ (1) | NZ213842A (en) |
PL (1) | PL158965B1 (en) |
PT (1) | PT81399B (en) |
YU (1) | YU46695B (en) |
Families Citing this family (115)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5741672A (en) * | 1984-07-27 | 1998-04-21 | Unilever Patent Holdings B.V. | Expression and production of polypeptides using the promoters of the hansenula polymorpha MOX and DAS genes |
US4879231A (en) * | 1984-10-30 | 1989-11-07 | Phillips Petroleum Company | Transformation of yeasts of the genus pichia |
US4882279A (en) * | 1985-10-25 | 1989-11-21 | Phillips Petroleum Company | Site selective genomic modification of yeast of the genus pichia |
US4818700A (en) * | 1985-10-25 | 1989-04-04 | Phillips Petroleum Company | Pichia pastoris argininosuccinate lyase gene and uses thereof |
US5032516A (en) * | 1985-10-25 | 1991-07-16 | Phillips Petroleum Company | Pichia pastoris alcohol oxidase II regulatory region |
US4895800A (en) * | 1985-11-26 | 1990-01-23 | Phillips Petroleum Company | Yeast production of hepatitis B surface antigen |
IL81817A0 (en) * | 1986-03-14 | 1987-10-20 | Phillips Petroleum Co | Methanol and glucose responsive yeast regulatory regions |
ZA872534B (en) * | 1986-05-08 | 1987-11-25 | Phillips Petroleum Co | Yeast production of streptokinase |
IL82935A0 (en) * | 1986-08-12 | 1987-12-20 | Phillips Petroleum Co | Secretion of heterologous proteins from yeast |
US5002876A (en) * | 1986-09-22 | 1991-03-26 | Phillips Petroleum Company | Yeast production of human tumor necrosis factor |
ES2056799T3 (en) * | 1987-07-17 | 1994-10-16 | Rhein Biotech Ges Fur Biotechn | CODANT DNA MOLECULES FOR THE FMDH CONTROL AND STRUCTURAL GENE REGIONS FOR A PROTEIN THAT HAS AN FMDH ACTIVITY AND ITS USE. |
ATE248925T1 (en) * | 1988-01-05 | 2003-09-15 | Roche Diagnostics Gmbh | METHOD FOR PRODUCING PROTEINS OR PROTEIN-CONTAINING GENE PRODUCTS |
SE8901264L (en) * | 1988-04-11 | 1989-10-12 | Phillips Petroleum Co | EXPRESSION OF SALMON GROWTH HORMON IN METYLOTROPIC JAEST OF GENERATION PICHIA |
IL89991A0 (en) * | 1988-04-25 | 1989-12-15 | Phillips Petroleum Co | Expression of hepatitis b pres2 protein in methylotrophic yeasts |
IL90021A0 (en) * | 1988-04-25 | 1989-12-15 | Phillips Petroleum Co | Process for the production of interferon |
IL89993A0 (en) * | 1988-04-25 | 1989-12-15 | Phillips Petroleum Co | Expression of the hiv 24kda gag protein in methylotrophic yeasts |
IL89989A0 (en) * | 1988-04-25 | 1989-12-15 | Phillips Petroleum Co | Expression of human interleukin-2 in methylotrophic yeasts |
IL89992A0 (en) * | 1988-04-25 | 1989-12-15 | Phillips Petroleum Co | Expression of human serum albumin in methylotrophic yeasts |
DE3851535T2 (en) * | 1988-12-20 | 1995-02-02 | Rhein Biotech Proz & Prod Gmbh | Mutant strain of a methylotrophic organism and process for producing a protein in a methylotrophic organism. |
WO1990009434A1 (en) * | 1989-02-13 | 1990-08-23 | The Salk Institute Biotechnology/Industrial Associates, Inc. | Production of superoxide dismutase in pichia pastoris yeast cells |
GB8924883D0 (en) * | 1989-11-03 | 1989-12-20 | Shell Int Research | Expression vector and polypeptide synthesis |
US5264554A (en) * | 1990-01-19 | 1993-11-23 | The Blood Center Of Southeastern Wisconsin, Inc. | Platelet cell adhesion molecule and variants thereof |
US5369028A (en) * | 1990-04-03 | 1994-11-29 | The Salk Institute Biotechnology/Industrial Associates, Inc. | DNA and mRNA encoding human neuronal nicotinic acetylcholine receptor compositions and cells transformed with same |
US6440681B1 (en) | 1990-04-03 | 2002-08-27 | Merck & Co., Inc. | Methods for identifying agonists and antagonists for human neuronal nicotinic acetylcholine receptors |
US5258302A (en) * | 1990-07-03 | 1993-11-02 | The Salk Institute Biotechnology/Industrial Associates, Inc. | DNA for expression of aprotinin in methylotrophic yeast cells |
JPH06500470A (en) * | 1990-09-04 | 1994-01-20 | メルク エンド カンパニー インコーポレーテッド | Production of insulin-like growth factors in methylotrophic yeast cells |
US5612198A (en) * | 1990-09-04 | 1997-03-18 | The Salk Institute | Production of insulin-like growth factor-1 in methylotrophic yeast cells |
US5268273A (en) * | 1990-12-14 | 1993-12-07 | Phillips Petroleum Company | Pichia pastoris acid phosphatase gene, gene regions, signal sequence and expression vectors comprising same |
WO1992013951A1 (en) * | 1991-02-04 | 1992-08-20 | The Salk Institute Biotechnology/Industrial Associates, Inc. | Production of human serum albumin in methylotrophic yeast cells |
DE69232666T2 (en) * | 1991-04-01 | 2003-03-20 | Merck & Co., Inc. | GENES INFLUENCING AND USING THE PROTEOLYTIC ACTIVITY OF PICHIA |
CA2058820C (en) * | 1991-04-25 | 2003-07-15 | Kotikanyad Sreekrishna | Expression cassettes and vectors for the secretion of human serum albumin in pichia pastoris cells |
US5330901A (en) * | 1991-04-26 | 1994-07-19 | Research Corporation Technologies, Inc. | Expression of human serum albumin in Pichia pastoris |
US5834262A (en) * | 1992-01-06 | 1998-11-10 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Oxidation of glycolic acid to glyoxylic acid using a microbial cell transformant as catalyst |
ATE141330T1 (en) * | 1992-02-28 | 1996-08-15 | Suntory Ltd | NEW VECTOR CONTAINING A PROMOTER INDUCIBLE BY METHANOL AND/OR GLYCEROL |
US5708141A (en) * | 1992-05-11 | 1998-01-13 | Corvas International, Inc. | Neutrophil inhibitors |
CZ225795A3 (en) * | 1993-03-03 | 1996-02-14 | Du Pont | Enzymatically active glycolate oxidase, process for preparing thereof, transformed methylotropic yeast, nucleic acid sequence and plasmid |
EP1508614A1 (en) | 1993-03-08 | 2005-02-23 | MERCK & CO. INC. | Human neuronal nicotinic acetylcholine receptor compositions and methods employing same |
AU6415594A (en) * | 1993-03-25 | 1994-10-11 | Biosource Genetics Corporation | (pichia pastoris) alcohol oxidase (zza1) and (zza2) |
ATE224952T1 (en) * | 1993-04-20 | 2002-10-15 | Merck & Co Inc | SUBUNITS OF HUMAN N-METHYL-D-ASPARTATE RECEPTORS, NUCLEIC ACID ENCODING THESE AND THEIR USE |
US5912122A (en) | 1993-06-04 | 1999-06-15 | Sibia Neurosciences, Inc. | Nucleic acids encoding and method for detecting nucleic acid encoding human metabotropic glutamate receptor subtype mGluR6 |
US5521297A (en) | 1993-06-04 | 1996-05-28 | Salk Institute Biotechnology/Industrial Associates | Nucleic acids encoding human metabotropic glutamate receptors |
US6001581A (en) | 1993-06-04 | 1999-12-14 | Sibia Neurosciences, Inc. | Cation-based bioassay using human metabotropic glutamate receptors |
US6638905B2 (en) | 1993-06-18 | 2003-10-28 | The Salk Institute For Biological Studies | Cloning and recombinant production of CFR receptor(s) |
US6495343B1 (en) | 1993-06-18 | 2002-12-17 | The Salk Institute For Biological Studies | Cloning and recombinant production of CRF receptor(s) |
WO1995013299A1 (en) * | 1993-11-08 | 1995-05-18 | The Salk Institute Biotechnology/Industrial Associates, Inc. | Human neuronal nicotinic acetylcholine receptor compositions and methods employing same |
US5453161A (en) * | 1993-11-12 | 1995-09-26 | Enichem S.P.A. | Polyamic acid to polyimide conversion by microwave heating |
US5872098A (en) * | 1995-06-05 | 1999-02-16 | Corvas International, Inc. | Nematode-extracted anticoagulant protein |
CA2202351A1 (en) * | 1994-10-18 | 1996-04-25 | George Phillip Vlasuk | Nematode-extracted serine protease inhibitors and anticoagulant proteins |
US5866543A (en) * | 1995-06-05 | 1999-02-02 | Corvas International, Inc. | Nematode-extracted anticoagulant protein |
US5863894A (en) * | 1995-06-05 | 1999-01-26 | Corvas International, Inc. | Nematode-extracted anticoagulant protein |
EP0788546B9 (en) * | 1994-10-18 | 2007-06-13 | Dendreon Corporation | Nematode-extracted serine protease inhibitors and anticoagulant proteins |
US5866542A (en) * | 1994-10-18 | 1999-02-02 | Corvas International, Inc. | Nematode-extracted anticoagulant protein |
US5945275A (en) * | 1994-10-18 | 1999-08-31 | Corvas International, Inc. | Nematode-extracted anticoagulant protein |
US6143557A (en) * | 1995-06-07 | 2000-11-07 | Life Technologies, Inc. | Recombination cloning using engineered recombination sites |
US6720140B1 (en) * | 1995-06-07 | 2004-04-13 | Invitrogen Corporation | Recombinational cloning using engineered recombination sites |
US6485967B1 (en) | 1995-06-07 | 2002-11-26 | Merck & Co., Inc. | Human neuronal nicotinic acetylcholine receptor α6 and β3 nucleic acid |
US5965389A (en) * | 1995-11-09 | 1999-10-12 | Zymogenetics, Inc. | Production of GAD65 in methylotrophic yeast |
MX9605082A (en) | 1996-10-24 | 1998-04-30 | Univ Autonoma De Nuevo Leon | Genetically modified methylotrophic yeasts for human growth hormone secretion production. |
ES2264181T3 (en) | 1997-10-01 | 2006-12-16 | Dsm Ip Assets B.V. | PROCEDURE FOR THE PRODUCTION OF PROTEINS. |
US7351578B2 (en) * | 1999-12-10 | 2008-04-01 | Invitrogen Corp. | Use of multiple recombination sites with unique specificity in recombinational cloning |
AU752704B2 (en) * | 1997-10-24 | 2002-09-26 | Invitrogen Corporation | Recombinational cloning using nucleic acids having recombination sites |
CN101125873A (en) * | 1997-10-24 | 2008-02-20 | 茵维特罗根公司 | Recombinational cloning using nucleic acids having recombination sites |
DE69941406D1 (en) * | 1998-07-06 | 2009-10-22 | Tosoh Corp | IL-6 receptor IL-6-coupled fusion protein |
WO2000012687A1 (en) * | 1998-08-28 | 2000-03-09 | Invitrogen Corporation | System for the rapid manipulation of nucleic acid sequences |
US6780615B1 (en) | 1998-12-31 | 2004-08-24 | Genway Biotech Inc. | Production of recombinant monellin using methylotrophic yeast expression system |
US6720174B1 (en) | 1999-01-28 | 2004-04-13 | Novozymes A/S | Phytases |
NZ525134A (en) | 1999-03-02 | 2004-09-24 | Invitrogen Corp | Compositions and methods for use in recombinational cloning of nucleic acids |
US7504253B2 (en) * | 1999-06-11 | 2009-03-17 | The Burnham Institute For Medical Research | Nucleic acid encoding proteins involved in protein degradation, products and methods related thereof |
US6440414B1 (en) * | 1999-10-01 | 2002-08-27 | Amgen Inc. | Pharmaceutical compositions of fibrinolytic agent |
US6261820B1 (en) * | 1999-10-01 | 2001-07-17 | Amgen Inc. | Fibronolytically active polypeptide |
IL149459A0 (en) | 1999-11-12 | 2002-11-10 | Fibrogen Inc | Recombinant gelatins |
AU785483B2 (en) | 1999-12-10 | 2007-09-20 | Invitrogen Corporation | Use of multiple recombination sites with unique specificity in recombinational cloning |
US7033776B2 (en) * | 1999-12-17 | 2006-04-25 | Amgen Inc. | Method for treatment of indwelling catheter occlusion using fibrinolytic metalloproteinases |
WO2001077351A1 (en) * | 2000-04-07 | 2001-10-18 | MAX-PLANCK-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. | Vectors and methods for dual protein expression in pichia pastoris and escherichia coli |
US7244560B2 (en) * | 2000-05-21 | 2007-07-17 | Invitrogen Corporation | Methods and compositions for synthesis of nucleic acid molecules using multiple recognition sites |
US7598055B2 (en) * | 2000-06-28 | 2009-10-06 | Glycofi, Inc. | N-acetylglucosaminyltransferase III expression in lower eukaryotes |
US7625756B2 (en) | 2000-06-28 | 2009-12-01 | GycoFi, Inc. | Expression of class 2 mannosidase and class III mannosidase in lower eukaryotic cells |
US8697394B2 (en) * | 2000-06-28 | 2014-04-15 | Glycofi, Inc. | Production of modified glycoproteins having multiple antennary structures |
US7863020B2 (en) * | 2000-06-28 | 2011-01-04 | Glycofi, Inc. | Production of sialylated N-glycans in lower eukaryotes |
ATE309385T1 (en) | 2000-06-28 | 2005-11-15 | Glycofi Inc | METHOD FOR PRODUCING MODIFIED GLYCOPROTEINS |
US7449308B2 (en) | 2000-06-28 | 2008-11-11 | Glycofi, Inc. | Combinatorial DNA library for producing modified N-glycans in lower eukaryotes |
DK1294910T3 (en) | 2000-06-30 | 2009-03-02 | Vib Vzw | Protein glycosylation modification in Pichia Pastoris |
US7009045B2 (en) * | 2000-07-14 | 2006-03-07 | Archer-Daniels-Midland Company | Transformation systems for flavinogenic yeast |
US7198924B2 (en) | 2000-12-11 | 2007-04-03 | Invitrogen Corporation | Methods and compositions for synthesis of nucleic acid molecules using multiple recognition sites |
EP1385866A4 (en) | 2001-04-05 | 2006-03-29 | Univ Nebraska | Alcohol oxidase 1 regulatory nucleotide sequences for heterologous gene expression in yeast |
CA2448505A1 (en) * | 2001-05-21 | 2002-11-28 | Invitrogen Corporation | Compositions and methods for use in isolation of nucleic acid molecules |
US6645739B2 (en) | 2001-07-26 | 2003-11-11 | Phoenix Pharmacologies, Inc. | Yeast expression systems, methods of producing polypeptides in yeast, and compositions relating to same |
WO2003089589A2 (en) * | 2002-04-15 | 2003-10-30 | Merck & Co., Inc. | Matrix analysis of gene expression in cells (magec) |
IL165717A0 (en) | 2002-06-26 | 2006-01-15 | Flanders Interuniversity Inst | A strain of methylotrophic yeast for producing proteins |
US20040204953A1 (en) * | 2002-07-17 | 2004-10-14 | Lincoln Muir | Subscription based systems, methods and components for providing genomic and proteomic products and services |
US7118901B2 (en) * | 2002-12-18 | 2006-10-10 | Roche Diagnostics Operations, Inc. | Recombinant bovine pancreatic desoxyribonuclease I with high specific activity |
ATE387494T1 (en) * | 2002-12-20 | 2008-03-15 | Hoffmann La Roche | HEAT-LASABLE DESOXYRIBONUCLEASE I VARIANTS |
US7332299B2 (en) * | 2003-02-20 | 2008-02-19 | Glycofi, Inc. | Endomannosidases in the modification of glycoproteins in eukaryotes |
EP1460425A1 (en) * | 2003-03-17 | 2004-09-22 | Boehringer Mannheim Gmbh | Deglycosylated enzymes for conjugates |
US7468267B2 (en) * | 2003-08-25 | 2008-12-23 | Funzyme Biotechnologies Sa | Fungal proteins and nucleic acids encoding same |
US8293503B2 (en) | 2003-10-03 | 2012-10-23 | Promega Corporation | Vectors for directional cloning |
JP2007512838A (en) | 2003-12-01 | 2007-05-24 | インヴィトロジェン コーポレーション | Nucleic acid molecules containing recombination sites and methods of use thereof |
DE602004025192D1 (en) * | 2003-12-05 | 2010-03-11 | Roche Diagnostics Gmbh | Recombinant carboxypeptidase B and its purification |
ES2370657T3 (en) * | 2005-09-14 | 2011-12-21 | Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh | EXCISION OF INSULIN PRECURSORS THROUGH A VARIANT OF TRIPSINE. |
AT504588B1 (en) * | 2006-11-16 | 2008-08-15 | Univ Graz Tech | Nucleic Acid Promoter |
SG188846A1 (en) | 2008-03-03 | 2013-04-30 | Abbott Lab | Methods for transforming yeast |
WO2010068904A2 (en) | 2008-12-12 | 2010-06-17 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Process for making linear dicarboxylic acids from renewable resources |
EP2258855A1 (en) | 2009-05-28 | 2010-12-08 | Universität für Bodenkultur Wien | Expression sequences |
CA2784944A1 (en) | 2009-12-21 | 2011-06-30 | Centre Hospitalier Universitaire Vaudois | Synergic action of a prolyl protease and tripeptidyl proteases |
LT2710114T (en) | 2011-05-20 | 2021-12-10 | H. Lundbeck A/S | High-purity production of multi-subunit proteins such as antibodies in transformed microbes such as pichia pastoris |
SG10201609752YA (en) | 2011-08-19 | 2017-01-27 | Alderbio Holdings Llc | Multi-copy strategy for high-titer and high-purity production of multi-subunit proteins such as antibodies in transformed microbes such as pichia pastoris |
EP3508494B1 (en) | 2011-10-07 | 2022-02-23 | Lonza Ltd | Regulatable promoter |
TWI670279B (en) | 2013-03-15 | 2019-09-01 | 美商艾爾德生物製藥股份有限公司 | Antibody purification and purity monitoring |
PL2970994T3 (en) | 2013-03-15 | 2020-03-31 | Lonza Ltd | Constitutive promoter |
CA2905180C (en) | 2013-03-15 | 2023-03-07 | Alder Biopharmaceuticals, Inc. | Temperature shift for high yield expression of polypeptides in yeast and other transformed cells |
US9150870B2 (en) | 2013-03-15 | 2015-10-06 | Lonza Ltd. | Constitutive promoter |
BR112015023447A2 (en) | 2013-03-21 | 2017-12-05 | Commw Scient Ind Res Org | triple helical protein purification |
KR101957550B1 (en) | 2013-04-30 | 2019-06-28 | 도널드 댄포스 플랜트 사이언스 센터 | Antifungal plant proteins, peptides, and methods of use |
US10155793B2 (en) | 2013-09-09 | 2018-12-18 | Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation | Modified bacterial collagen-like proteins |
WO2016120764A1 (en) | 2015-01-26 | 2016-08-04 | Centre Hospitalier Universitaire Vaudois (Chuv) | Aspergillus oryzae prolyl endopeptidases and use thereof in degradation of polypeptides |
Family Cites Families (8)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
AU560472B2 (en) * | 1981-08-25 | 1987-04-09 | Celltech Limited | Yeast expression vectors |
IE54592B1 (en) * | 1982-03-08 | 1989-12-06 | Genentech Inc | Anumal interferons, processes involved in their production, compositions containing them, dna sequences coding therefor and espression vehicles containing such sequences and cells transformed thereby |
ATE42338T1 (en) * | 1982-05-19 | 1989-05-15 | Unilever Nv | YEAST OF THE GENUS KLUYVEROMYCES MODIFIED FOR THE EXPRESSION OF PREPROTHAUMATIN OR ITS VARIOUS ALLELIC AND MODIFIED FORMS OR MATURATION FORMS. |
WO1984001153A1 (en) * | 1982-09-15 | 1984-03-29 | Collaborative Res Inc | Production of interferon in yeast by use of invertase promoter |
DE3583194D1 (en) * | 1984-07-27 | 1991-07-18 | Unilever Nv | METHOD FOR THE PRODUCTION OF A POLYPEPTIDE BY MEANS OF A TRANSFORMED MICROORGANISM, A TRANSFORMED MICROORGANISM SUITABLE FOR THIS, AND DNA SEQUENCES SUITABLE FOR THE PRODUCTION OF THESE MICROORGANISMS. |
US4837148A (en) * | 1984-10-30 | 1989-06-06 | Phillips Petroleum Company | Autonomous replication sequences for yeast strains of the genus pichia |
US4879231A (en) * | 1984-10-30 | 1989-11-07 | Phillips Petroleum Company | Transformation of yeasts of the genus pichia |
US4885242A (en) * | 1984-10-30 | 1989-12-05 | Phillips Petroleum Company | Genes from pichia histidine pathway and uses thereof |
-
1985
- 1985-09-25 US US06/780,102 patent/US4855231A/en not_active Expired - Lifetime
- 1985-10-16 AU AU48752/85A patent/AU572002B2/en not_active Expired
- 1985-10-16 NZ NZ213842A patent/NZ213842A/en unknown
- 1985-10-20 IL IL76765A patent/IL76765A/en not_active IP Right Cessation
- 1985-10-23 FI FI854142A patent/FI94427C/en not_active IP Right Cessation
- 1985-10-28 CA CA000494002A patent/CA1340733C/en not_active Expired - Lifetime
- 1985-10-28 YU YU169585A patent/YU46695B/en unknown
- 1985-10-29 KR KR1019850008020A patent/KR930001117B1/en not_active IP Right Cessation
- 1985-10-29 EP EP85113737A patent/EP0183071B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1985-10-29 DE DE8585113737T patent/DE3586889T2/en not_active Expired - Lifetime
- 1985-10-29 GR GR852611A patent/GR852611B/el unknown
- 1985-10-29 IE IE930804A patent/IE930804L/en unknown
- 1985-10-29 EP EP19920101285 patent/EP0483115A3/en not_active Withdrawn
- 1985-10-29 AT AT85113737T patent/ATE83263T1/en not_active IP Right Cessation
- 1985-10-29 DK DK496385A patent/DK496385A/en not_active Application Discontinuation
- 1985-10-29 DD DD28216385A patent/DD254211A5/en unknown
- 1985-10-29 ES ES548307A patent/ES8609458A1/en not_active Expired
- 1985-10-29 NO NO854312A patent/NO178076C/en not_active IP Right Cessation
- 1985-10-30 HU HU854160A patent/HU205627B/en not_active IP Right Cessation
- 1985-10-30 PL PL1985256012A patent/PL158965B1/en unknown
- 1985-10-30 PT PT81399A patent/PT81399B/en not_active IP Right Cessation
- 1985-10-30 CN CN85109718A patent/CN1011243B/en not_active Expired
- 1985-10-30 JP JP60243784A patent/JP2502508B2/en not_active Expired - Lifetime
- 1985-10-30 AR AR85302123A patent/AR242988A1/en active
-
1993
- 1993-06-22 JP JP5150894A patent/JP2552807B2/en not_active Expired - Fee Related
- 1993-06-22 JP JP5150895A patent/JP2552808B2/en not_active Expired - Lifetime
-
1995
- 1995-10-04 JP JP7257798A patent/JPH08196275A/en active Pending
- 1995-10-04 JP JP7257799A patent/JPH08173161A/en active Pending
Also Published As
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US4855231A (en) | Regulatory region for heterologous gene expression in yeast | |
US4808537A (en) | Methanol inducible genes obtained from pichia and methods of use | |
CA1273882A (en) | Autonomous replication sequences for yeast strains of the genus pichia | |
US5032516A (en) | Pichia pastoris alcohol oxidase II regulatory region | |
EP0263311A2 (en) | Yeast production of human tumor necrosis factor | |
US5670630A (en) | Expression of hepatitis B S and preS2 proteins in methylotrophic | |
JPH07163354A (en) | Dna fragment containing function gene | |
EP0118551A1 (en) | Production of interferon in yeast by use of invertase promoter | |
US5310660A (en) | Method and a hybrid promoter for controlling exogenous gene transcription | |
AU605036B2 (en) | Expression of hepatitis B2 pres protein in methylothrophic yeasts | |
EP0339569A2 (en) | Expression of the HIV 24 KDA GAG protein in methylotrophic yeasts | |
IE67053B1 (en) | Pichia pastoris alcohol oxidase II regulatory region |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
HMM4 | Cancellation of final prot. due to non-payment of fee |