PL158965B1 - Sposób wytwarzania polipeptydów PL PL - Google Patents

Sposób wytwarzania polipeptydów PL PL

Info

Publication number
PL158965B1
PL158965B1 PL1985256012A PL25601285A PL158965B1 PL 158965 B1 PL158965 B1 PL 158965B1 PL 1985256012 A PL1985256012 A PL 1985256012A PL 25601285 A PL25601285 A PL 25601285A PL 158965 B1 PL158965 B1 PL 158965B1
Authority
PL
Poland
Prior art keywords
dna
gene
polypeptide
host
regulatory region
Prior art date
Application number
PL1985256012A
Other languages
English (en)
Other versions
PL256012A1 (en
Original Assignee
Phillips Petroleum Co
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from US06/666,391 external-priority patent/US4808537A/en
Application filed by Phillips Petroleum Co filed Critical Phillips Petroleum Co
Publication of PL256012A1 publication Critical patent/PL256012A1/xx
Publication of PL158965B1 publication Critical patent/PL158965B1/pl

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
    • C12N9/0006—Oxidoreductases (1.) acting on CH-OH groups as donors (1.1)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/67—General methods for enhancing the expression
    • C12N15/68—Stabilisation of the vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
    • C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
    • C12N15/815—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts for yeasts other than Saccharomyces

Abstract

1. Sposób wytwarzania polipeptydów, znamienny tym, ze (a) transform uje sie gospodarza wektorem ekspresyjnym zawierajacym region regulatorow y 5' pochodzacy z Pichia pastoris, który to wspom niany region regulatorowy jest wrazliwy na obecnosc m etanolu w podlozu hodowlanym, z którym organizm gospodarza dla tego w ektora ekspresyjnego pozostaje w kontakcie i który to wspom niany region regulatorowy jest zdolny do kontrolow ania transkrypcji informacyjnego RN A, jesli jest umiejscowiony w kierunku w góre od konca 5' kodujacej sekwencji D N A , która koduje wytwarzanie wspomnianego informacyjnego RNA, oraz region kodujacej polipeptyd; (b) hoduje sie tak otrzym anego stransform ow anego gospodarza i (c) odzyskuje sie eksprym owany polipeptyd. P L 158965 B 1 PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania polipeptydów.
Wynalazek należy do dziedziny biotechnologii rekombinantowego DNA. W sposobie według wynalazku stosuje się fragmenty DNA, które regulują transkrypcję DNA do informacyjnego RNA oraz inicjację i terminację translacji informacyjnego RNA do białka. Ponadto stosuje się wektory ekspresyjne, które zawierają takie fragmenty DNA. Wykorzystuje się również nowe drobnoustroje stransformowane wspomnianymi wektorami ekspresyjnymi.
Wraz z rozwojem w ostatnich latach technologii rekombinacji DNA stało się możliwe kontrolowane wytwarzanie za pomocą drobnoustrojów ogromnej liczby użytecznych polipeptydów. Liczne eukariotyczne polipeptydy, takie jak ludzki hormon wzrostu, interferony leukocytarne, insulina ludzka i proinsulina ludzka, zostały już wytworzone przez różne drobnoustroje. Oczekuje się, że w przyszłości kontynuacja zastosowania technik, które już są do dyspozycji pozwoli na wytwarzanie za pomocą drobnoustrojów innych użytecznych produktów polipeptydowych w dużej różnorodności.
Podstawowe techniki stosowane w dziedzinie technologii rekombinacji DNA są fachowcom znane. Elementy, których obecność jest pożądana, aby gospodarz - drobnoustrój był użyteczny w praktycznym zastosowaniu technologii rekombinacji DNA, obejmują (chociaż nie są ograniczone tylko do nich): 1) gen kodujący jeden, lub więcej, pożądanych polipeptydów, zaopatrzony w odpowiednie sekwencje kontrolne wymagane do ekspresji w gospodarzu - drobnoustroju, 2) wektor, zazwyczaj plazmid, do którego można włączyć gen. Wektor służy do zabezpieczenia wprowadzenia genu do komórki i utrzymania sekwencji DNA w komórce, jak również osiągnięcia wysokiego poziomu ekspresji wyżej wspomnianego genu, oraz 3) odpowiedni gospodarz - drobnoustrój, który można transformować wektorem będącym nośnikiem pożądanego genu, który to gospodarz - drobnoustrój posiada również aparat komórkowy pozwalający na ekspresję informacji kodowanej przez wprowadzony gen.
Podstawowym elementem stosowanym w technologii rekombinacji DNA jest plazmid, który stanowi pozachromosomalny, dwuniciowy DNA, znajdowany w niektórych drobnoustrojach. Gdy stwierdzono, że plazmidy w naturalny sposób występują w drobnoustrojach, często znajdowano je w wielokrotnych kopiach na komórkę. Oprócz naturalnie występujących plazmidów wytworzono różnorodne syntetyczne plazmidy lub wektory hybrydowe. Informacja wymagana do reprodukcji plazmidu w komórkach potomnych jest włączona do informacji kodowanej przez plazmidowy DNA i jest to autonomicznie replikująca się sekwencja lub początek replikacji. Do informacji kodowanej przez -plazmidowy DNA musi również być włączona jedna, lub więcej fenotypowych selekcyjnych cech charakterystycznych. Fenotypowe selekcyjne cechy charakterystyczne pozwalają na rozpoznanie klonów komórek gospodarza zawierających dany plazmid i selekcję przez preferencyjny wzrost komórek w podłożach wybiórczych.
Użyteczność plazmidów polega na tym, że mogą one być specyficznie rozszczepione przez taką czy inną endonukleazę restrykcyjną czyli enzym restrykcyjny, z których każdy rozpoznaje specyficzne, unikalne miejsce w plazmidowym DNA. Następnie geny homologiczne, geny heterologiczne, to jest geny otrzymane z organizmów innych niż gospodarz, albo fragmenty genów można włączyć do plazmidu przez połączenie końców rozszczepionego plazmidu i pożądanego materiału genetycznego w miejscu rozszczepienia lub przyłączenia do zrekonstruowanych końców przylegający do miejsca rozszczepienia. Powstały maieru) stanowiący hybrydowy DNA można określić jako wektor hybrydowy.
Rekombinację DNA przeprowadza się na zewnątrz gospodarza - drobnoustroju. Powstały wektor hybrydowy można wprowadzić do drobnoustroju - gospodarza przeprowadzając proces znany jako transformacja. Duże ilości wektora hybrydowego można otrzymać przez hodowlę transformowanego drobnoustroju. Gdy genjest prawidłowo wprowadzony w odniesieniu do części plazmidu, które kierują transkrypcją i translacją zakodowanej w DNA informacji, powstałego wektora hybrydowego można użyć do bezpośredniego wytwarzania sekwencji polipeptydowej, którą wprowadzony gen koduje. Wytwarzanie polipeptydu w ten sposób określa się jako ekspresję genu.
Ekspresja genu inicjowana jest w regionie DNA znanym jako region promotorowy. W transkrypcyjnej fazie ekspresji DNA rozwija się, co prowadzi do ekspozycji jego jako matrycy do
158 965 syntezy informacyjnego RNA. Polimeraza RNA przełącza się do regionu promotorowego i przesuwa się wzdłuż odwiniętego DNA od jego końca 3' do końca 5', transkrybując informację zawartą w kodującej nici DNA do informacyjnego RNA (mRNA) od końca mRNA 5' do końca 3'. Informacyjny RNA jest z kolei przyłączany przez rybosomy, gdzie następuje translacja mRNA do łańcucha polipeptydowego. Każdy aminokwas jest kodowany przez tryplet nukleotydowy czyli kodon w strukturze, którą można określić jako gen strukturalny, to jest część genu, która koduje sekwencję aminokwasów produktu, który ulega ekspresji. Ponieważ włączania każdego aminokwasu kodują trzy nukleotydy, możliwe jest odczytywanie sekwencji nukleotydów trzema różnymi sposobami. Specyficzną fazę odczytu, w ramach której zakodowany jest żądany produkt polipeptydowy, określa się jako prawidłową fazę odczytu.
Po przyłączeniu do promotora polimeraza RNA najpierw transkrybuje 5' - liderowy region mRNA, a następnie kodon inicjacji translacji czyli kodon start, po którym następują kodony nukleotydowe w samym genie strukturalnym. W celu otrzymania żądanego produktu genowego, niezbędne jest, aby kodonicjacji czyli kodon start prawidłowo inicjował translację informacyjnego RNA przez rybosom w prawidłowej fazie odczytywania. Ostatecznie transkrybowane są kodony stop na końcu genu strukturalnego, które powodują, że jakiekolwiek dodatkowe sekwencje mRNA nie ulegają translacji przez rybosomy do peptydu, nawet jeśli zostały utworzone dodatkowe sekwencje mRNA na drodze oddziaływania polimerazy RNA z matrycą DNA. Tak więc kodony stop określają koniec translacji i przez to zakończenie dalszego włączania aminokwasów do produktu polipeptydowego. Produkt polipeptydowy można otrzymać na drodze lizy komórki gospodarza i odzyskania produktu za pomocą odpowiedniego oczyszczania od innego białka bakteryjnego, względnie, w niektórych okolicznościach, przez oczyszczanie podłoża fermentacyjnego, w którym kodowano komórki gospodarza i do którego produkt polipeptydowy został wydzielony.
W praktyce, zastosowanie technologii rekombinantowego DNA pozwala tworzyć drobnoustroje zdolne do ekspresji całkowicie heterologicznych polipeptydów, to jest polipeptydów, które zwykle nie są znajdowane lub tworzone przez dany drobnoustrój - na drodze tak zwanej ekspresji bezpośredniej. Alternatywnie może ulegać ekspresji białko fuzyjne to jest heterologiczny polipeptyd sprzężony z częścią sekwencji aminokwasów polipeptydu homologicznego, to jest należącego do polipeptydów znajdowanych lub tworzonych przez gospodarza stanowiącego drobnoustrój typu dzikiego (nie transformowanego) - na drodze tak zwanej ekspresji niebezpośredniej. W przypadku ekspresji niebezpośredniej otrzymany początkowo produkt stanowiący białko fuzyjne pozostaje czasem nieaktywny, pod względem jego przewidywanego zastosowania, aż do rozszczepienia sprzężonego homologiczno/heterologicznego polipeptydu w zewnątrzkomórkowym otoczeniu. Tak np. odszczepienie reszt metioniny za pomocą bromocyjanu pozwala uzyskać somatostatynę, tymozynę al i komponenty stanowiące łańcuchy A i B insuliny ludzkiej ze sprężonych homologiczno/heterologicznych polipeptydów, podczas gdy enzymatyczne odszczepienie określonych reszt pozwala uzyskać /ł-endorfinę.
Jak dotychczas, usiłowania przemysłowego zastosowania technologii rekombinantowego DNA w celu wytworzenia różnych polipeptydów koncentrowały się na użyciu Escherichia Coli jako organizmu-gospodarza. Tym niemniej, w niektórych sytuacjach E. coli może okazać się nieodpowiednia jako gospodarz. Np. E. coli zawiera pewną ilość toksycznych pirogennych czynników, które trzeba wyeliminować z każdego polipeptydu użytecznego jako produkt farmaceutyczny. Skuteczność, z jaką to oczyszczenie można przeprowadzić, będzie oczywiście różna odnosząc się do określonego polipeptydu. Oprócz tego, proteolityczna aktywność E. coli może w znaczny sposób ograniczyć wydajność niektórych użytecznych produktów. Te i inne rozważania doprowadziły do zwiększonego zainteresowania innymi gospodarzami, a w szczególności zwrócenie się w kierunku zastosowania organizmów eukariotycznych w celu wytwarzania produktów ' polipeptydowych.
Dostępność i środki do wytwarzania produktów polipeptydowych w układach eukariotycznych, np. w drożdżach, mogą zapewnić znaczące korzyści w stosunku do użycia układów prokariotycznych takich jak E. coli w celu wytwarzania polipeptydów kodowanych przez rekombinantowy DNA. Drożdże stosowano w fermentacjach na wielką skalę od stuleci, w porównaniu ze względnie niedawnym pojawieniem się fermentacji na wielką skalę z użyciem E. coli. Drożdże na
158 965 ogół można hodować do wyższej gęstości komórek niż bakterie i łatwo je można adoptować do prowadzenia fermentacji ciągłej. I rzeczywiście, hodowla drożdży takich jak Pichia pastoris do bardzo wysokiej gęstości komórek, to jest gęstości komórek przekraczającej 100 g/litr, została ujawniona przez Wegnera w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4 414 329. Dodatkowe korzyści z zastosowania drożdży jako gospodarzy wynikają z tego, że wiele z krytycznych funkcji organizmu, np. fosforylacja oksydatywna, mają miejsce w organellach i nie są przez to narażone na ewentualne szkodliwe wpływy wynika z wytwarzania w organiźmie polipeptydów obcych dla komórek gospodarza typu dzikiego. Jako organizm eukariotyczny drożdże mogą okazać się zdolne do glikozylacji ulegających ekspresji produktów polipeptydowych, gdy ta glikozylacja jest ważna w odniesieniu do bioaktywności produktu polipeptydowego. Możliwe jest także, że jako organizm eukariotyczny, drożdże będą przejawiać te same preferencje co do kodonów co wyższe organizmy, przyczyniając się przez to do skuteczniejszego wytwarzania produktów ekspresji genów ssaków lub komplementarnego DNA (cDNA) otrzymanego przez odwrotną transkrypcję np. mRNA ssaków.
Znaczną przeszkodą w eksploatacji słabo scharakteryzowanych gatunków drożdży jako układów gospodarz/wektor jest niewystarczająca wiedza o warunkach transformacji i odpowiednich wektorach. Oprócz tego mutacje auksotroficzne są często nieosiągalne, co wyklucza bezpośrednią selekcję transformantów przez auksotroficzne uzupełnienie. Jeśli technologia rekombinantowego DNA ma całkowicie spełnić swoje obietnice, należy wynaleźć nowe układy gospodarrywektor ułatwiający manipulowanie DNA, jak również optymalizujące ekspresję wprowadzonych sekwencji DNA, tak aby można było otrzymywać żądany produkt polipeptydowy w kontrolowanych warunkach i z wysoką wydajnością.
Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania polipeptydów z zastosowaniem szczepu drożdży, zwłaszcza rodzaju Pichia i Saccharomyces. Realizację wynalazku umożliwiło otrzymanie transformowanego szczepu drożdży zawierającego określone fragmenty DNA.
W sposobie według wynalazku stosuje się nowy region regulatorowy wrażliwy na obecność metanolu.
Zgodnie z wynalazkiem, odkryto, wyodrębniono i scharakteryzowano sekwencje DNA kontrolujące transkrypcję DNA do informacyjnego RNA i translację informacyjnego RNA z otrzymaniem produktu polipeptydowego. Nowe sekwencje DNA wytworzone w ramach sposobu według wynalazku są użyteczne przy wytwarzaniu produktów polipeptydowych przez szczepy drożdży zdolne do wzrostu na metanolu jako źródle węgla i energii.
Figura 1 przedstawia korelację zależności między klonem genowym (pPG 6,0) i klonem cDNA (pPC 15,0) dla białka p76. Fig. 2 przedstawia korelację zależności między klonem genomowym (pPG4,0) i klonami cDNA (pPC8,3 i pPC8,0) dla białka p72 (oksydaza alkoholowa). Fig. 3 przedstawia korelację zależności między klonem genomowym (pPC 4,8) i klonem cDNA (pPC 6,7) dla białka p40. Fig. 4 przedstawia mapy restrykcyjne regionów regulatorowych wytworzonych sposobem według wynalazku z klonu pPG6,0. Fig. 5 przedstawia mapę restrykcyjną regionu regulatorowego wytworzonego sposobem według wynalazku z klonu pPG 4,0. Fig. 6 przedstawia mapę restrykcyjną regionu regulatorowego wytworzonego sposobem według wynalazku z klonu pPG 4,8. Fig. 7 przedstawia mapę restrykcyjną sekwencji DNA otrzymanej z końca 3' genu strukturalnego p76. Fig. 8 przedstawia mapy restrykcyjne sek-weneci DNA otrzymanych z końca 3' genu strukturalnego p72 (oksydaza alkoholowa). Fig. 9 przedstawia mapę restrykcyjną sekwencji DNA otrzymanej z końca 3' genu strukturalnego p40. Fig. 10 przedstawia mapę restrykcyjną genu strukturalnego białka p76 i jego 5'-regionu regulatorowego. Fig. 11 przedstawia mapę restrykcyjną genu strukturalnego białka p40 i jego 5 -regionu regulatorowego. Fig. 12 przedstawia mapę restrykcyjną cDNA białka p76. Fig. 13 przedstawia mapę resuykcyjną cDNA białka p72 (oksydaza alkoholowa). Fig. 14 przedstawia mapę restrykcyjną cDNA białka p40. Fig. 15 przedstawia mapy restrykcyjne dwóch nowych konstrukcji lacZ DNA-regionów regulatorowych p76 wytworzonych sposobem według wynalazku. Fig. 16 przedstawia mapę resU^ykcyjną nowej konstrukcji lacZ DNA-regionu regulatorowego p72 (oksydaza alkoholowa) wytworzonej sposobem według wynalazku. Fig. 17 przedstawia mapę restrykcyjną plazmidu pSAOHl. Fig. 18 przedstawia mapę restrykcyjną plazmidu pSAOH5. Fig. 19 przedstawia mapę restrykcyjną plazmidu pSAOHlO. Fig. 20 przedstawia mapę restrykcyjną plazmidu pTAFH.85. Fig. 21 przedstawia mapę ressrykcyjną plaż6
158 965 midu pT76Hl. Fig. 22 przedstawia mapę restrykcyjną plazmidu pT76H2. Fig. 22a przedstawia mapę restrykcyjną plazmidu pT76H3. Fig. 22b przedstawia mapę restrykcyjną plazmidu pT76H4. Fig. 23 przedstawia mapę restrykcyjną plazmidu pYA2. Fig. 24 przedstawia mapę restrykcyjną plazmidu pYA4. Fig. 25 przedstawia mapę restrykcyjną plazmidu pYJ8. Fig. 26 przedstawia mapę restrykcyjną plazmidu pYJ8 Cla. Fig. 27 przedstawia mapę restrykcyjną plazmidu pYJ30. Fig. 28 przedstawia mapę restrykcyjną plazmidu pTAFHl i pokazuje jak plazmid ten został otrzymany. Fig. 29 przedstawia mapę restrykcyjną plazmidu pTA012 i pokazuje jak plazmid ten został otrzymany. Fig. 30 przedstawia mapę restrykcyjną plazmidu pTA013. Fig. 30a przedstawia mapę restrykcyjną plazmidu pT76Ul. Fig. 31 przedstawia mapę restrykcyjną plazmidu pTAOl i pokazuje jak plazmid ten został otrzymany. Fig. 32 przedstawia mapę restrykcyjną plazmidu pTAF.85 i pokazuje jak plazmid ten został otrzymany. Fig. 33 przedstawia mapę restrykcyjną plazmidu YEpl3. Fig. 34 przedstawia mapę restrykcyjną plazmidu pBPfl.
W niniejszym opisie, w celu przedstawienia zastosowanych enzymów ress^irykcyjnych, użyto następujących skrótów:
A = AsuH Rs = EcoRV
B = BamHI Rs = RsaI
b2 = BgllI S = SalI
Bc = BcII S3 = Sau3AI
C = Ciał Sc = SacI
H2 = Hincłl Sm = Smal
Ha = HindHl sp = SphI
K = KpnI Ss = Sstl
Ndi = Ndeł St = StuI
Nr = Nrul T = TaqI
Ps = Pstl Th = ThaI
Pv, = PvuI Xb = XbaI
PV2 = PvuII Xh = HhoI
Rt = EcoRI Xm = XmaI
W załączonych figurach, miejsca restrykcyjne zastosowane w manipulacjach fragmentami DNA, ale zniszczone przy ligowaniu, zostały wskazane przez zamknięcie skrótów zniszczonego miejsca nawiasami.
Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania polipeptydów polegający na tym, że (a) transformuje się gospodarza wektorem ekspresyjnym zawierającym region regulatorowy 5' pochodzący z Pichia pastoris, który to wspomniany region regulatorowy jest wrażliwy na obecność metanolu w podłożu hodowlanym, z którym organizm gospodarza dla tego wektora ekspresyjnego pozostaje w kontakcie i który to wspomniany region regulatorowy jest zdolny do kontrolowania transkrypcji informacyjnego RNA, jeśli jest umiejscowiony w kierunku w górę od końca 5' kodującej sekwencji DNA, która koduje wytwarzanie wspomnianego informacyjnego RNA, oraz region kodujący polipeptyd; (b) hoduje się tak otrzymanego stransformowanego gospodarza i (c) odzyskuje się eksprymowany polipeptyd.
W sposobie według wynalazku stosuje się fragment DNA zawierający region regulatorowy wrażliwy na obecność metanolu. Region regulatorowy fragmentu DNA wytworzonego w sposobie według wynalazku jest zdolny do kontrolowania transkrypcji informacyjnego RNA, gdy umiejscowiony jest na końcu 5'DNA, który koduje wytwarzanie informacyjnego RNA. Wynalazek obejmuje swym zakresem także stosowanie mutantów powyższego opisanego fragmentu DNA.
Ponadto, w sposobie według wynalazku stosuje się fragment DNA zawierający region regulatorowy zdolny do kontrolowania poliadenylacji, terminacji transkrypcji i terminacji translacji informacyjnego RNA, gdy umiejscowiony jest na końcu 3' regionu kodującego polipeptyd, który to region koduje wytwarzanie informacyjnego RNA i w którym transkrypcja i translacja informacyjnego RNA jest kontrolowana przez region regulatorowy reagujący na obecność metanolu. Wynalazek obejmuje swym zakresem także stosowanie mutantów powyżej opisanego fragmentu DNA.
158 965
W korzystnej postaci sposobu według wynalazku stosuje się fragmenty DNA, które kierują włączaniem kodowanego polipeptydu do peroksysomów. Peroksysomy są to wewnątrzkomórkowe ciała obecne w dużej ilości w komórkach drożdży wyhodowanych na metanolu. Te wewnątrzkomórkowe ciała służą do izolowania włączonego produktu polipeptydowego od płynów wewnątrzkomórkowych i enzymów takich jak proteazy.
W sposobie według wynalazku stosuje się geny kodujące wytwarzanie oksydazy alkoholowej, białka o około 40 kilodaltonach i białka o około 76 kilodaltonach, plazmidy i ^transformowane organizmy zawierające powyżej opisane fragmenty DNA.
Sposobem według wynalazku wytwarza się również polipeptydy heterologiczne, to jest ' polipeptydy nie będące natywnymi względem organizmów gospodarzy.
Wyodrębnianie zdolnych do regulacji genów z Pichia pastoris. Otrzymano około 20-tysięczny zbiór cDNA w E. coli z użyciem poli A+ RNA wyodrębnionego z komórek Pichia pastoris wyhodowanych na metanolu jako jedynym źródle węgla (patrz przykład III). Zbiór poddano screeningowi przez hybrydyzację z użyciem poddanego działaniu kinazy poli A+ RNA wyodrębnionego z Pichia pastoris wyhodowanych w obecności metanolu albo etanolu. Po kilku cyklach tego screeningu plus - minus zidentyfikowano trzy różne niehomologiczne klony cDNA jako kopie specyficznych wobec metanolu informacyjnych RNA. Klony te oznaczono jako pPC 6,4, pPC 8,0 i pPC 15,0 i ustalono, że zawierają inserty o długości, odpowiednio 470, 750 i 1100 nukleotydów.
W próbach otrzymywania cDNA o większej długości sporządzono drugi zbiór cDNA stosując łagodniejsze warunki trawienia nukleazą SI aniżeli stosowane przy otrzymywaniu pierwszego zbioru i elementy tego nowego zbioru poddano indywidualnie screeningowi ze znakowanymi 32P klonami cDNA pPC6,4, pPC8,0 i pPC 15,0. W rezultacie, wyodrębniono większe klony cDNA odpowiadające klonom cDNA pPC 6,4 i pPC 8,0. Stwierdzono, że większe klony, pPC 6,7 i pPC 8,3 zawierają inserty o odpowiednio, 1200 i 2100 nukleotydach (patrz fig. 2 i 3). Po screeningu 40000 klonów nie zaobserwowano klonów cDNA z insertem dłuższym niż 1100 nukleotydów odpowiadającym pPC 15,0.
Wyodrębnienia genomowych fragmentów DNA odpowiadających każdemu z tych klonów cDNA dokonano najpierw przez wycięcie i poddanie elektroelucji z żelów agarozowych fragmentów DNA z Pichia pastoris po potraktowaniu endonukleazą restrykcyjną chromosomalnego DNA, który hybrydyzował ze znaczonymi 32p pPC15, pPC8,0 lub pPC6,4. Następnie wyeluowane fragmenty genomowego DNA klonowano w Escherichia coli i odpowiednie klony genomowe identyfikowano za pomocą kilkakrotnego poddawania screenmgowi z każdą z powyższych sond cDNA.
Zależność między każdym klonem cDNA a odpowiadającym mu klonem genomowym przedstawiono na fig. 1, 2 i 3. pPC 15,0 jest kodowany w 6000-nukleotydowym fragmencie genomowym Hindlll obecnym w klonie pPG6,0 (fig. 1). Koniec 5' genu kodowanego przez pPC15,0 jest zorientowany blisko fragmentu HindII--EcoRI o 1300 parach zasad zawartego w pPC 6,0, podczas gdy koniec 3' genu jest najbliżej miejsc Pstl w pPG 6,0.
Klon cDNA pPC8,3 jest zawarty w klonie genomowym pPG4,0 (fig. 2). pPG4,0 zawiera insert EcoRI-PvuII o 4000 nukleotydach sąsiedniego genomowego DNA. Orientacja pPC8,3 w pPG 4,0 jest taka, że koniec 5' genu dla tego klonu cDNA jest bliski miejsc BamHI, podczas gdy koniec 3' tego genu jest położony blisko miejsca PvuII. Orientacja pPC 8,0 (pokrewny klon cDNA) w pPG 4,0 jest taka, że koniec 5' tego klonu cDNA jest bliski miejsca KpnI w pPG 4,0, a koniec 3' klonu cDNA jest położony blisko miejsca PvuII.
Klon cDNA pPC 6,7 jest całkowicie zlokalizowany w genomowym fragmencie EcoRI-BamHI o 4800 nukleotydach (fig. 3). Klon pPC 6,4 jest z kolei całkowicie zlokalizowany w klonie cDNA pPC 6,7. Ponieważ pPC 6,7 był bardziej kompletną kopią niż pPC 6,4, tego ostatniego nie badano dalej. Koniec 5' genu jest umiejscowiony bliżej końca BamHI aniżeli końca EcoRI genomowego klonu pPC4,8 (fig. 3).
We wszystkich spośród powyżej opisanych klonów genomowych istnieją flankujące sekwencje genomowego DNA co najmniej 1,2 kilopary zasad jako 5' w stosunku do genów strukturalnych kopiowanych w każdym z klonów cDNA.
Każdy z klonów genomowych i cDNA powyżej opisanych został zdeponowany w kolekcji Northern Regional Research Center of the United States of America, Peoria, Illinois.
158 965
Wszystkie klony zdepowanowano w E. coli jako gospodarzu:
Plazmid Gospodarz Nr rejestracyjny w kolekcji
pPG 6,0 E. coli LE392-pPC 6,0 NRRL B-15867
pPG 4,0 E. coli LE392-pPG 4,0 NRRL B-15868
pPG 4,8 E. coli LE392-pPG 4,8 NRRL B-15869
pPC 15,0 E. coli LE392-pPC 15,0 NRRL B-15870
pPC 8,3 E. coli LR392-pPC 8,3 NRRL B-15871
pPC 6,7 E. coli LE392-pPC 6,7 NRRL B-15872
pPC 8,0 E. coli MM294-pPC 8,0 NRRL B-15873
Wszystkie powyższe organizmy zostały nieodwołalnie zdeponowane i udostępnione z dniem 31 sierpnia 1984.
Wyłączność pPG6,0, pPG4,0 i pPG4,8 w stosunku do drożdży asymilujących metanol. Każdy z powyżej opisanych klonów cDNA znakowano i zastosowano jako sondy chromosomalnych sekwencji DNA z pewnej ilości drożdży asymilujących metanol i nie asymilujących metanolu. Stwierdzono, że zasadniczo we wszystkich drożdżach asymilujących metanol istnieją geny homologiczne do wszystkich trzech cDNA, które to geny są wyraźnie nieobecne we wszystkich drożdżach nie asymilujących metanolu (s. cerevisiae). Uważa się, więc, że geny te są wyłącznie w drożdżach asymilujących metanol. Oprócz tego, doświadczenia na hybrydyzację metodą Southerna wyszczególnione w przykładzie XVII wykazują, że istnieje wysoki stopień homologii między tymi unikalnymi wrażliwymi na metanol genami z różnych drożdży asymilujących metanol.
Charakteryzacja transkryptów RNA z genów pPG 6,0, pPG 4,0 i pPG 4,8. Wpływ metanolu na ekspresję każdego z trzech klonowanych genów można obserwować badając wyniki transkrypcji tych genów. Poli A + RNA wyodrębniony z komórek Pichia pastoris wyhodowanych na etanolu lub metanolu jako jedynym źródle węgla użyto do otrzymania filtrów hybrydyzacyjnych Northerna (patrz przykład IV). Trzy identyczne pary filtrów otrzymanych z. komórek wyhodowanych na metanolu i etanolu (patrz przykład I) sondowano oddzielnie za pomocą pPC 15,0, pPC8,0 i pPC 6,4 znakowanych 32P. Klony pPC 15,0, pPC 8,0 i pPC 6,4 hybrydyzowały z cząsteczkami RNA (o około, odpowiednio, 2400,2300 i 1300 nukleotydach) z komórek rozwijających się na metanolu. Nie obserwowano hybrydyzacji klonów pPC 15,0 i pPC 8,0 z sondami hybrydyzacyjnymi z RNA otrzymanego z komórek wyhodowanych w obecności etanolu. Tym niemniej, gdy RNA wyodrębniony z komórek wyhodowanych na etanolu był sondowany pPC6,4, klon hybrydyzował z cząsteczką RNA o 1300 nukleotydach identyczną z cząsteczką, którą obserwowano w komórkach wyhodowanych na metanolu lecz na pięciokrotnie wyższym poziomie jak to wynika z oznaczenia ilościowego.
Oznaczenie wielkości produktów białkowych kodowanych przez pPG 6,0, pPG 4,0 i pPG 4,8. W celu określenia, jakie produkty białkowe są kodowane przez każdy z powyżej zidentyfikowanych klonów cDNA, poli A 4-RNA z komórek Pichia pastoris wyhodowanych na metanolu poddawano selektywnie hybrydyzacji z każdym z klonów cDNA. Hybrydowo wyselekcjonowany mRNA, to jest mRNA hybrydyzujący z każdym z klonów cDNA, poddano następnie translacji in vitro i każdy z produktów białkowych poddano rozdziałowi elektroforetycznemu w warunkach denaturujących w obecności SDS (patrz przykład V). Wyniki tych in vitro pozytywnych hybrydyzacyjno-translacyjnych prób wykazały, że klony pPC 15,0, pPC 8,3 i pPC 6,7 selekcconują mRNA, które kodują informację dla polipeptydów o, odpowiednio, 76000 (p76), 72000 (p72) i 40000 (p40) daltonów. Te same białka obserwuje się, gdy całkowity poli A + RNA (to jest nie selekcjonowany hybrydowo) z komórek Pichia pastoris wyhodowanych na metanolu poddaje się translacji w tym samym układzie in vitro.
Identyfikacja p72 jako oksydazy alkoholowej.
A. Porównane masy cząsteczkowej. Próbkę białka w wysokim stopniu wzbogaconego pod względem dehydrogenazy alkoholowej otrzymano przez dializę wobec wody oczyszczonych lizatów komórkowych (patrz przykład VII). Za pomocą SDS-elektroforezy wykazano, że krystaliczny osad będący wynikiem tej dializy zawierał głównie dwa polipeptydy o, odpowiednio, 76000 i 72000 daltonów. Osad poddano dodatkowemu oczyszczaniu za pomocą chromatografii na Sepharyl 200
158 965 (patrz przykład VII), wykazując w ten sposób, że aktywność oksydazy alkoholowej odpowiada aktywności oczyszczonego polipeptydu o 72000 daltonów. Wielkość tego polipeptydu była identyczna z wielkością produktu polipeptydowego wyselekcjonowanego przez klon cDNA pPC8,3 (patrz przykład X).
B. Immunoprecypitacja. Dodatkowe potwierdzenie faktu, że klony pPC8,3 i pPG4,0 mają zakodowany gen strukturalny oksydazy alkoholowej, uzyskano za pomocą metod immunologicznych (przykład XI). Preparatów białkowych wyodrębnionych z Pichia patoris zawierających polipeptydy zarówno o 76000 jak i o 72000 daltonów użyto do wywołania powstawania u królików immunosurowic swoistych wobec tych polipeptydów. Gdy hybrydowo wyselekcjonowany poli A + RNA z klonu pPC 8,3 poddano translacji in vitro, tylko produkt translacji o 72000 daltonów precypitował z immunosurowicami wytworzonymi przeciw preparatom białkowym z komórek Pichia pastoris.
C. Porównanie przewidywanej i aktualnej sekwencji aminokwasów. Do dalszego zweryfikowania stwierdzenia, że klon pPC 8,3 jest rzeczywiście klonem cDNA kodującego oksydazę alkoholową Pichia pastoris, porównano sekwencję aminokwasów aminowego końca białka z przewidywaną sekwencją aminokwasów kodowaną przez pPC8,3. Tak więc, NH2-końcową sekwencję aminokwasów (sekwencja A) wyodrębnionego białka o 72000 daltonów oznaczono (przykład VIII) jako:
Ala-Ile-Pro-Glu-Glu-Phe-Asp-lle-Leu-Val-Leu-Gly-Gly-Gly-Se--Ser-Gly-Ser
Sekwencja A. Równolegle oznaczono sekwencję nukleotydów końca 5' genu zakodowanego w pPC 8,3ipPG 4,0. Przewidywana sekwencja aminokwasów dla aminokwasów 2-19 (patrz sekwencja b) otrzymana z sekwencji DNA klonów, zarówno genomowego jak i cDNA, zgadzała się doskonale z pierwszymi 18 aminokwasami powyższej oznaczonej sekwencji aminokwasów (sekwencja A) wyodrębnionej oksydazy alkoholowej Pichia pastoris.
P rz e wi ćy · ν/ana s e kwe n c j a
amin o kwa. sów: Net Ala Ile Pro Glu Glu Phe
Sekw encja nuk! eotyćów 5 '-ATG GCT ATC CCC Gł-~i GAG TTT
/ PPC 3,5 i p?G Λ,Ο/: 3'-TAC r r· λ •w» Lirt TAG GGG CTT CTC AAA
Asp Ile Len Val Leu Gly Gly Gly Ser Ser Gly Ser
GAT ATC CTA GTT CTA GGT GGT GGA TCC AGT GGA TCC-3'
CTA TAG GAT CAA GAT CCA CCA CCT AGG TCA CCT AGG-5*
Sekwencja B. Oprócz tego oznaczono całkowitą sekwencję nukleotydów kodującego regionu genu oksydazy alkoholowej. Oznaczoną sekwencję aminokwasów i przewidywaną sekwencję aminokwasów przedstawiono w sekwencji B' i uważa się, że stanowi ona:
Prze wi aywana sekwencja aminokwasów: Ket Ala He Pro Glu Glu Phe
Sekwencja nu kle o tyćów C'z -ATG GCT ATC CCC GAA GAG TTT
/pPC 8,3 i p?G 4,0/: 3' -TAC CGA TAG GGG CTT CTC AAA
Asp Ile Leu Val Leu Gly Gly Gly Ser Ser Gly Ser
GAT ATC CTA LTT CTA GGT GGT GGA TTC AGT GGA TCC
CTA TAG GAT CAA GAT CCA ΓΓ’Φ AGG TCA CCT AGG
Cys Ile Ser Gly Arg Leu Ala Asn Leu Asp His Ser
TGT ATT TCC GGA AGA TTG GCA AAC TTG GAC CAC TCC
ACA TAA AGG CCT TCT AAC CGT TTG AAC CTG GTG AGG
Leu lys Val Gly Leu Ile Glu Ala Gly Glu Asn Gin
TTG AAA GTT GGT CTT ATC GAA GCA GGT GAG AAC CAA
AAC TTT CAA CCA GAA TAG CTT CGT CCA CTC TTG GTT
Pro Gin Gin Pro Met Gly Leu Pro Ser Arg Tyr Leu
CCT CAA CAA CCC ATG GGT CTA CCT TCC AGG TAT TTA
GGA GTT GTT GGG TAC CCA GAT GGA AGG TCC ATA AAT
Pro Lys Lys Gin Lys Leu Asp Ser Lys Thr Ala Ser
CCC AAC A · ’· CAG AAG TTG GAC TCC AAG ACT GCT TCC
GGG TTC rprprp A 1 1 GTC TTC AAC CTG AGG TTC TGA CGA AGG
Phe Tyr Thr Ser Ann Pro Ser Pro His Leu Asn Gly
TTC TAC s /-»rn Λ v 1 TCT AAC CCA i CCT CAC TTG AAT GGT
aAG ATG TGA AGA TTG GGT AGA GGA GTG AAC TTA CCA
Arg Arg Ala Ile Val Pro Cys Ala A οΠ Val Leu Gly
AGA AGA GCC ATC GTT CCA TGT GCT AAC GTC TTG GGT
TCT TCT CGG TAG CAA GGT ACA CGA TTG CAG AAC CCA
Gly Gly Ser Ser Ile Asn Phe Met Met Tyr Thr Arg
GGT GGT TCT TCT ATC AAC TTC ATG ATG TAC ACC AGA
CCA CCA AGA AGA TAG TTG AAG TAC TAC ATG TGG TCT
Gly Ser Ala Ser Asp Ser Asp Asp 9 • Gin Ala Glu
GGT TCT GCT TCT GAT TCT GAT GAC TTN CAA GCC GAG
CCA AGA CGA AGA CTA AGA CTA CTG AAN GTT CGG CTC
Gly Ser Lys Thr Glu Asp Leu Leu Pro Leu Met Lys
GGC TCG AAA ACA GAG GAC TTG CTT CCA TTG ATG AAA
CCG AGC TTT TGT CTC CTG AAC GAA GGT AAC TAC TTT
Lys Thr Glu Thr Tyr Gin Arg Ala 9 • Gin ? Tyr
AAG ACT GAG ACC TAC CAA AGA GCT TGN CAA CNA TAC
TTC TGA CTC TGG ATG GTT TCT CGA ACN GTT CNT ATG
Pro Asp Ile His Gly Phe Glu Gly Pro Ile Lys Val
Γπφ GAC ATT CAC IajI TTC GAA GGT CCA ATC AAG GTT
GGA CTG TAA GTG CCA AAG CTT CCA GGT TAG TTC CAA
Ser Phe Gly Asn Tyr Thr Tyr P±o Val Cys Gin Asp
158 965
TCT mrnrs iL· GGT AAC TAC ACC TAC CCA GTT TGC CAG GAC
AGA AAG CCA TTG ATG TGG ATG GGT CAA ACG GTC CTG
Phe Leu Arg Ala Ser Glu Ser Gin Gly Ile Pro Tyr
TTC TTG AGG GCT TCT GAG TCC CAA GGT ATT CCA TAC
AAG AAC TCC CGA AGA CTC AGG GTT CCA TAA CGT ATG
Vai Asp Asp Leu Glu Asp Leu Val Leu Thr His Gly
GTT GAC GAT CTG GAA GAC TTG GTA CTG ACT CAC GGT
CAA CTG CTA GAC CTT CTG AAC CAT GAC TGA GTG CCA
Ala Glu His Trp Leu Lys Trp Ile Asn Arg Asp Thr
GCT GAA CAC TGG TTC AAG TGG ATC AAC AGA GAC ACT
CGA CTT GTG AAC TTC ACC TAG TTG TCT CTG TGA
Gly Arg Arg Ser Asp Ser Ala His Ala Phe Val His
CC-T CC-T A GAC TCT GCT CAT GCA TTT GTC CAC TCT
GCA GCA AGG CTG AGA CGA GTA CGT AAA CAG GTG AGA
Ser Thr Het Arg Asn His Asp Asn Leu Tyr Leu Ile
TCT ACT ATG AGA AAC CAC GAC AAC TTG TAC TTG ATC
AGA TGA TAC TCT TTG GTG CTG TTG AAC ATG AAC TAG
Cys Asn Thr Lys Val Asp Lys Ile Ile Val Glu Asp
TGT AAC ACG AAG GTC GAC AAA ATT ATT GTC GAA GAC
A CA TTG TGC TTC CAG CTG TTT TAA TAA CAG CTT CTG
Gly Arg Ala Ala Ala Val Arg Thr Val Pro Ser Lys
GGA AGA GCT GCT GCT GTT AGA ACC GTT CCA AGC AAG
CCT TCT CCA CGA CGA CAA TCT TGG CAA GGT TCG TTC
Pro Leu Asn Pro Lys Lys Pro Ser His Lys Ile Tyr
CCT TTG AAC CCA AAG AAG CCA AGT CAC AAG ATC TAC
GCA AAC TTG GGT TTC TTC GGT TCA GTG TTC TAG ATG
Arg Ala Arg Lys Gin Ile Phe Leu Ser Cys Gly Thr
GGT GCT AGA AAG CAA ATC ii! TTG TCT TGT GGT ACC
GCA CGA TCT TTC GTT TAG HsA AAC AGA ACA CCA TGG
Ile Ser Ser Pro Leu Val Leu Gin Arg Ser Gly Phe
ATC TCC TCT CCA TTG GTT TTG CAA AGA TCC GGT TTT
TAG AGG AGA GGT AAC CAA AAC GTT TCT AGG CCA AAA
158 965
Gly Asp Pro Ile Lys Leu Arg Ala Ala Gly Val Lys
GGT GAC CCA ATC AAG TTG AGA GCC GCT GGT GTT AAG
CCA CTG GGT TAG TTC AAC TCT CGG CGA CCA CAA TTC
Pro Leu Val Asn Leu Pro Gly Val Gly Arg Asn Phe
CCT TTG GTC AAC TTG CCA GGT GTC GGA AGA AAC TTC
GGA AAC CAG TTG AAC GGT CCA CAG CCT TCT TTG AAG
Gin Asp His Tyr Cys Phe Phe Ser Pro Tyr Arg Ile
CAA GAC CAT TAT TGT TTC TTC AGT CCT TAC AGA ATC
GTT CTG GTA ATA ACA MnG AAG TCA GGA ATG TCT TAG
Lys Pro Gin Tyr Glu Ser Phe Asp Asp Phe Val Arg
AAG CCT CAG TAC GAG TCT TTC GAT GAC TTC GTC CGT
TTC GCA GTC ATG CTC AGA AAG CTA CTG AAG CAG GCA
Gly Asp Ala Glu He Gin Lys Arg Val Val Asp Gin
GGT GAT GCT GAG ATT CAA AAG AGA GTC GTT GAC CAA
CCA CTA CGA CTC TAA GTT TTC TCT CAG CAA CTG GTT
Trp Tyr Ala Asn Gly Thr Gly Pro Leu Ala Thr Asn
TGG TAC GCC AAT GGT η^χ GGT CCT CTT GCC ACT AAC
ACC ATG CGG TTA CCA TGA /“Ί p * GGA GAA CGG TGA TTG
Gly •He Glu Ala Gly Val Lys Ile Arg Pro Thr Pro
GGT ATC GAA GCT GGT GTC AAG ATC AGA CCA ACA CCA
CCA TA G CTT CGA CCA CAG TTC TAG TCT GGT TGT GGT
Glu Glu Leu Ser Gin Met Asp Glu Ser Phe Gin Glu
GMA GAA » j. TCT CAA ATG GAC r» ą > MirUn. r y.zX TTC PA P Ca G
CTT CTT GAG AGA GTT TAC CTG CTT AGG AAG GTC CTC
Gly Tyr Arg Glu Tyr Phe Glu Asp Lys Pro Asp Lys
GGT TAC AGA GAA TAC TTC GAA GAC MIG CCA GAC AAG
CCA ATG rn -»m lvi CTT ATG Aa g CTT m u Lj TTC GGT CTG TTC
Pro Val Met His Tyr Ser Ile Ile Ala Gly Phe Phe
CCA GTT ATG CAC TAC TCC ATC ATT GCT GGT TTC TTC
GGT CAA TAC GTG ATG AC-G TAG TAA CGA CCA MAG AAG
Gly Asp His Thr Lys Ile Pro Pro Gly Lys Tyr Met
GGT GAC CAC ACC AAG ATT CCT CCT GGA AAG TAC ATG
158 965 13
CCA CTG GTG TGG TTC TAA GGA GGA CCT TTC ATG TAC
Thr Ket Phe His Phe Leu Glu Tyr Pro Phe Ser Arg
ACT ATG TTC CAC TTC TTG GAh TAC CCA TTC TCC AGA
TGA TAC AAG GTG AA G AAC CTT ATG GGT AAG AGG TCT
Gly Ser Ile His Ile Thr Ser Pro Asp Pro Tyr Ala
GGT ATT CAC ATT ACC TCC CCA GAC CCA TAC GCA
CCA 5 Γ' n Λ Liki TAA GTG TAA TGG AGG GGT CTG GGT ATG CGT
Ala Pro Asp Phe Asp Arg Gly Fhe Met Asn A sp Glu
GCT CCA GAC rppnn 11^ GAC CGA GGT TTC ATG AAC GAT GAA
CGA GGT CTG AAG CTG GCT CCA AAG TAC TTG CTA CTT
Arg Asp Ket Ala Pro Met Val Trp Ala Tyr Lys Ser
AGA GAC ATG GCT CCT ATG GTT TGG GCT TAC AAG TCT
TCT CTG TAC CGA GGA TAC CAA ACC CGA ATG TTC TTC
Ser Arg Glu Thr Ala Arg Arg Ser Asp His Phe Ala
mnrn ±^1 AGA GAA ACC GCT AGA AGA AGT GAC CAC TTT GCC
AGA TCT CTT TGG CGA TCT TCT TCA CTG GTG AAA CGG
Gly Glu Val Thr Ser His His Pro Leu Phe Pro Tyr
GGT GAG GTC ACT TCT CAC CAC CCT CTG TTC CCA TAC
CCA CTC CAG TGA AGA GTG GTG GGA GAC AAG GGT ATG
^er Ser Glu Ala Arg Ala Leu Glu Met Asp Leu Glu
TCA m/i-· 1 GaG ?. ρ'λ rm TTG GAA ATG GAT TTG GAG
AGT Kr- π HUU dmr J. V CGG TCT CC-G AAG CTT TAC CTA AAC CTC
Thr Ser Asn Ala Tyr Gly Gly Pro Leu Asn Leu Ser
ACC TCT AAT GCC TAC GGT GGA CCT TTG AAC TTG TCT
TGG AGA TTA CGG ATG CCA CCT GGA AAC TTG AAC AGA
Ala Gly Leu Ala His Gly Ser Trp Thr Gin Pro Leu
GCT GGT CTT GCT CAC GGT TCT TGG ACT CAA CCT TTG
CGA CCA GAA CGA GTG CCA AGA ACC TGA GTT GGA AAC
Lys Lys Pro Thr Ala Lys Asn Glu Gly His Val Thr
AAG AAG CCA ACT GCA AAG AAC GAA GGC CAC GIT ACT
TTC TTC GGT TGA CGT TTC TTG CTT CCG GTG CAA TGA
Ser Asn Gin Pal Glu Leu His Pro Asp Ile Glu Tyr
158 965
TCG AAC CAG GTC GAG CTT CAT CCA GAC ATC GAG TAC
AGC TTG GTC CAG CTC GAA GTA GGT CGT TAG CTC ATG
Asp Glu Glu Asp Asp Lys Ala Ile Glu Asn Tyr Ile
GAT GAG GAG GAT GAC AAG GCC ATT GAG ACC TAC ATT
'“rp a Uiri CTC CTC <ι<·η ,1 CTG TTC CGG Taa CTC TTG ATC- TAA
Arg Glu il i s Thr Glu Thr Thr Trp His Cys Leu Gly
CGT GAG CAC ACT GAG ACC ACA TGG CAC TGT CTG GGA
CTC GTG TGA CTC TGG TGT GTG ACA CCA GGT
Thr Cys Ser Ile Cly Pro Arg Glu Gly Ser Lys Ile
ACC mpm X Ul TCC ATC GGT ris> a AGA GAA GGT TCC AAG ATC
TGG ACA AGG TAG CCA GGT TCT CTT CCA AGG TTC TAG
Val Lys Trp Gly Gly Val Leu Asp His Arg Ser Asn
UiL· AAA TGG GGT GGT GTT TIG GAC CAC AGA TCC AAC
CAG TTT ACC CCA CCA CAA AAC CTG GTG TCT AGG TGG
Val Tyr Gly Val Lys Gly Leu Lys Val Gly Asp Leu
GTT TAC GGA GTC AAG GGC TIG AAG GTT GGT GAC TTG
ATG CCT CAG TTC CCG AAC TTC CAA CCA CTG AAC
Ser Val Cys Pro Asp Asn Val Gly Cys Asn Thr Tyr
rn *“,*> X j-η rs Lx TGC CCA r»*o AAT GTT GGT TGT AAC ACC TAC
A r '•ί ACG GGT CTG TTA Cr-A CCA Λ PA λ TTG TGG t, mr> AxL
Thr Thr Ala Leu Leu He Gly Glu Lys Thr Ala Thr
ACC GCT CTT TTG ATC GGT GAA AAG ACT GCC ACT
TGG TGG CGA GAA AAC TAG CTT TTC TGA CGG TGA
Len Val Gly Glu Asp Leu Gly Tyr Ser Gly Glu Ala
TTG GTT GGA GAA CAT TTA GGA TAC TCT GGT GAG GCC
rtA < CAA CCT TTC CTA AAT CCT ATG AGA CCA CTC CGG
Lem Asp Met Thr Val Pro Gin Fhe Lys Leu Gly Thr
TTA GAC ATG ACT GTT CCT CAG TTC AAG TTG GGC ACT
AAT CTG TAC TGA CAA GGA GTC AAG TTC AAC CCG TGA
Tyr du Lys Thr Gly Leu Ala Arg Phe Stop
TAC uA G AAG ACC GGT CTT r*r»rp νν X AGA TTC TAA- y
a tg CTC TTC TGG CCA GAk CGA TCT AAG ATT- 5'
158 965 15
Sekwencja B'. Porównanie powyższej sekwencji nukleotydów z opublikowaną (Lederboer i wsp.) sekwencją nukleotydów dla uprzednio opisanej oksydazy alkoholowej z Hansenula polymorpha ujawnia liczne znaczące różnice, w tym dotyczące przewidywanej sekwencji aminokwasów, aktualnej wielkości genu (i powstającego białka) użycia kodonu bias itp.
Identyfikacja p76 jako syntezy dwuhydroksyacetonowej. Sekwencję pierwszych nukleotydów genu p76 oznaczono metodami standardowymi. Na podstawie tej sekwen^^ sekwencję aminokwasów aminowego końca białka p76 można przewidzieć jako:
Sekwencja aminokwasów/: Met Ala Arg Ile Pro Lys
Sekwencjar nukleotydów: 5>AATG GCT AGA ATT CCA AAA
'-TAC CGA TCT TAA GGT TTT
Pro Val Ser Thr Gin Asp Asp IZS^e His Gly Leu
CCA GTA TCG AGA Zkk GAT GAG ATT CAT GAA TTG-p
GGT CAT AGG TGT GTT CTA CTG TAA BTA CTT AAC-5
Tę przewidywaną sekwencję dla p76 można porównać z opublikowaną sekwencją aminokwasów dla białka syntezy dwuhydroksyacetonowej (DHAS) z Hansenula polymorpha (Manowicz i wsp.). Aczkolwiek kilka różnic między sekwencjami jest oczywistych, istnieją podobieństwa między tymi dwoma białkami, które można zauważyć:
Pichia DHAS:
Hansenula DHAS: Met-Ala- Arg-Ile-Pro-Lys-ProMet-Ser-Met-Argglle-Pro-Lys-AlaVal-Ser-Thr- Gln-Asp-Asp-Ile-Hi s-Glu- -LeuAla-Ser-Yal-Asn-A sp-Glu-Gln-His-Gln-Arg-IleW oparciu o znaczny stopień homologii i podobną wielkość białka (około 76000 daltonów) z p76 Pichia oraz DHAS Hensenula, p76 tymczasowo zidentyfikowano jako DHAS z Pichia.
Jak wyżej w odniesieniu do genu oksydazy alkoholowej, porównanie si^lcwenci nukleotydów dla pierwszych 51 nukleotydów białka DHAS Pichia z poprzednio opublikowaną (Janowicz i wsp.) sekwencją nukleotydów DHAS Hansenula sugeruje liczne różnice dotyczące użycia kodonu bias, przewidywanej sekwencji aminokwasów, całkowitej wielkości genu itp.
Fragmenty DNA zawierające zdolne do regulacji promotory z Pichia pastoris. 5'-regiony regulatorowe wytworzone sposobem według wynalazku wyszczególniono na mapach restrykcyjnych przedstawionych na fig. 4, 5 i 6. 5'-region regulatorowy kontrolujący ekspresję polipeptydu p76 zlokalizowany jest we fragmencie DNA przedstawionym na fig. 4a. Wyraźnie wykazano, że fragment HindIII-Xhol o 2,9 kilopary zasad obejmuje funkcję regulatorową, jak to pełniej wyszczególniono powyżej. Ponieważ klon cDNA pPC 15,0 nie jest pełną kopią cDN A, najprawdopodobniej co najmniej część fragmentu DNA przedstawionego na fig. 4a obejmuje strukturalne sekwencje kodujące polipeptyd p76. Tak więc uważa się, że funkcja regulatorowa znajduje się we fragmencie HindII--EcoRI o około 1300 parach zasad przedstawionym na fig. 4b. Nowe konstrukcje zawierające gen /3-galaktozydazy, które zostaną bardziej szczegółowo przedyskutowane w poniższej części niniejszego opisu, podtrzymują tę sugestię.
5'-regulatorowy region kontrolujący ekspresję polipeptydu p72 (oksydaza alkoholowa) jest zlokalizowany we fragmencie DNA EcoRI-EcoRV o około 2000 par zasad, przedstawionym na fig. 5. Nowe konstrukcje zawierające gen /3-gaaaktozydazy dyskutowane poniżej wykazują zdolny do regulacji charakter tego fragmentu DNA.
158 965
Figura 6 przedstawia mapę restrykcyjną fragmentu DNA BamHI-Sall o około 3 kiloparach zasad obejmujący 5'-region regulatorowy kontrolujący wytwarzanie polipeptydu p40. Fragment ten jest wyraźnie odróżnialny od 5'-regionów regulatorowych przedstawionych szczegółowo na fig. 4 i 5 na podstawie, między innymi, różniących się miejsc restrykcyjnych zlokalizowanych we fragmencie DNA.
Figura 10, 2a i 11 przedstawiają dane dotyczące enzymów restrykcyjnych dla regionów regulatorowych + geny--trukturalne dla polipeptydów, odpowiednio, p76, p72 (oksydaza alkoholowa) i p40. Fig. 10 przedstawia szczegótowo fragment Hindlll-Pstl genomowego DNA Pichia pastoris EcoRI-PVuII o 3,8 kilopary zasad kontrolujący i kodujący wytwarzanie polipeptydu p76. Fig. 2a dotyczy fragmentu genomowego DNA Pichia pastoris EcoRI-PvuII o 4,0 kilopary zasad kontrolującego i kodującego wytwarzanie polipeptydu p72 (oksydaza alkoholowa). Fig. 11 przedstawia fragment genomowego DNA Pichia pastoris BamHI-EcoRV o 3,7 kilopary zasad kontrolującego i kodującego wytwarzanie polipeptydu p40.
Klony genomowe pPG 6,0, pPC 4,0 i pPG 4,8 również zostały scharakteryzowane za pomocą mapowania restrykcyjnego. Tak więc klon pPG6,0 szczegótowo przedstawiono na fig. la. Za punkt odniesienia końca 5' fragmentu DNA uważany jest początek. Klon pPG 6,0 jest fragmentem chromosomalnego DNA Pichia pastoris, Hindlll - długości około 6 kilopar zasad i przez różne enzymy restrykcyjne jest rozszczepiany w następujący sposób:
Enzym restrykcyjny Ilość miejsc rozszczepienia Odległość od początku (pary zasad)
Hincll 5 1070, 1740, 1890, 3320 5520
EcoRI 2 1300,3450
Xhcl 1 2860
Pstl 2 3820, 4200
PvuII 1 4120
Pvul 1 4950
Klon pPG 4,0 szczegótowo objaśniono na fig. 2a. Klon jest fragmentem chromosomalnego DNA EcoRT-HindTII o długości około 4 kilopar zasad. Odnosząc się do końca 5' klonu jako początku, dla pPG 4,0 otrzymano następujące dane restrykcyjne:
Enzym restrykcyjny Ilość miejsc rozszczepienia Odległość od początku (pary zasad)
Hindlll 3 400, 600, 1840
Pstl 1 850
BamHI 2 1960,1970
SA1I 1 2620
Bglll 2 1040, 2700
KpnI 2 500, 2730
Xbal 1 3330
Stul 1 3880
Ndcl 1 420
HincII 2 870, 2430
Sstl 1 1200
Bell 2 1710, 4080
AsuII 2 1900, 2300
EcoRV 1 1930
PvuII 1 4120
Klon pPG 4,8 szczegółowo objaśniono na fig. 3a. Klon jest fragmentem chromosomalnego DNA Pichia pastoris BamHI-EcoRl o 4,8 kilopary zasad z następującymi dodatkowymi miejscami restrykcyjnymi:
158 965 17
Ilość Odległość od początku
Enzym restrykcyjny miejsc rozszczepienia (pary zasad)
Ciał 1 410
KpnI 3 500, 3890, 4280
Pvul l 1120
Sali 1 2900
PvuII 1 4135
EcoRV 2 3690, 3890
BglH 1 4500
Xmal 1 4800
Genomowe klony pPG6,0, pPG4,0 i pPG4,8 poddano manipulacji za pomocą insercji do unikalnych miejsc restrykcyjnych w plazmidzie E. coli pBR322. Klon pPG6,0, który stanowi fragment Hindlll, dogodnie klonowano do miejsca Hindlll w pBR322. Klon pPG4,0 klonowano do miejsc EcoRI-BamHI w pBR322. (patrz przykład VI). Szczepy E. coli transformowane tymi plazmidami zdeponowano w kolekcji Northern Regional Research Center, Paoria, Illinois. Zdeponowane szczepy oznaczono następującymi numerami rejestracyjnymi:
Klasa genomu PPG 6,0 pPG 4,0 pPG 4,8
Oznaczenie laboratoryjne LE392p>PG 6,0 LE392-pPG 4,0 LE392 pPG 4,8
Nr rejestracyjny w kolekcji NRRL B-15867 NRRL B-15868 NRRL B-15869
Figury 7, 8 i 9 przedstawiają dane dotyczące map restrykcyjnych 3'-regionów regulatorowych polipeptydów, odpowiednio, p76, p72 (oksydaza alkoholowa) i p40. 3'-regiony regulatorowe są użyteczne w kontrolowaniu poliadenylacji, terminacji, transkrypcji i terminacji translacji informacyjnego RNA, który jest kodowany przez poprzedzające sekwencje nukleotydów. Tak więc, 3'-region regulatorowy z genu polipeptydu p76, fragment EcoRIiHindlll o 2,7 kilopar zasad, przedstawiony na fig. 7 jest użyteczny w kontrolowaniu poliadenylacji, jak również terminacji transkrypcji i terminacji translacji mRNA kodującego polipeptyd p76, lub jakiegokolwiek innego mRNA otrzymywanego z genu wprowadzonego w kierunku w górę od 3'-regionu regulatorowego. Fragment z genu p72 StuI-PvuII o 0,2 kilopary zasad przedstawiony szczegółowo na fig. 8a, fragment z genu p72 StuI-HindUI o 0,3 kilopary zasad przedstawiony szczegółowo na fig. 8b, fragment z genu p72 Sall-EcoRI o 3,2 kilopary zasad i fragment z genu p40 Sall-EcoRI o 1,9 kilopary zasad przedstawione szczegóóowo na fig. 9 mają podobną użyteczność, zarówno w odniesieniu do genów strukturalnych, z którymi sąsśadują w Pichia pastoris typu dzikiego, jak i w odniesieniu do jakichkolwiek obcych (to jest heterologicznych) genów, które można wprowadzić w kierunku w górę do tych 3'-regionów regulatorowych.
Ponieważ gen oksydazy alkoholowej w pPG 4,0 kończy się w kilku set parach zasad miejscem terminacji transkrypcji genu AO, dodatkową sekwencję 3' wyszczególnioną na fig. 8c otrzymano jak następuje. Pierwszym stadium było strawienie chromosomalnego DNA Pichia za pomocą EcoRI i Sali i hybrydyzacja strawionego DNA z fragmentem genu AO BamHI-HinclIII o 2,0 kilopary zasad znakowanym 32P metodą Southerna. Wśród fragmentów Pichia po strawieniu EcoRI-Sall, które hybrydyzowaly z sondą z genu AO był fragment o długości 3,2 kilopary zasad kodujący część 3' genu AO i sekwencje flankujące 3' genu.
Fragment 3' genu AO klonowano następnie przez odzyskanie fragmentów DNA Pichia pociętych EcoRI-Sall o około kilopary zasad na drodze elucji z żelu i wprowadzenie fragmentów do pBR322 strawionego EcoRI i Sali. Ostatecznie, rekombinantowy plazmid pPG 3,2, zawierający fragment 3' genu AO, zidentyfikowano za pomocą hybrydyzacji kolonii stosując znakowany fragment genu AO jako sondę. Szczep E. coli transformowany plazmidem pPG 3,2 zdeponowano w kolekcji Northern Regional Research Center, Peoria, Illinois. Zdeponowany szczep otrzymał numer rejestracyjny NRRL B-15999. Fig. 8c przedstawia mapę miejsc rozszczepienia endonukleazami ressirykcyjnymi fragmentu DNA Pichia z pPG 3,2. Fragment zawiera około 1,5 kilopary zasad kodując część 3' genu AO (od Sali do HindIH) i sekwencję 3' genu AO o około - ,7 kilopary zasad.
Charakteryzacja klonów cDNA. Klony cDNA dla zdolnych do regulacji genów z Pichia pastoris również charakteryzowano za pomocą mapowania restrykcyjnego. Na fig. 12 szczegółowo
158 965 przedstawiono fragment cDNA p76 o 1,1 kilopary zasad. Odnosząc się do końca 5' sekwencji DNA jako początku, enzym restrykcyjny Xhol rozszczepia cDNA p76 w odległości około 500 par zasad od początku, HincII- około 950 par zasad od początku i EcoRI - około 1050—1100 par zasad od początku. Klon cDNA pokazany na fig. 12, jak również klony cDNA pokazane na fig. 13 i 14 zostały wszystkie pokazane z zakończeniami Pstl. Są to sztucznie utworzone miejsca restrykcyjne wytworzone przez ogonowanie G-C początkowo otrzymanego komplementarnego DNA w celu ułatwienia klonowania fragmentów DNA do pBR322. W oparciu o hybrydyzację metodą Northerna i wielkość produktu polipeptydowego ocenia się, że klon cDNA pPC 15,0 jest niecałkowitą kopią mRNA p76, reprezentując tylko około połowę całkowitej sekwencji informacyjnego RNA.
Na figurze 13 przedstawiono złożoną mapę restrykcyjną cDNA p72 (oksydaza alkoholowa) skonstruowaną przez zachodzenie na siebie klonów pPC8,3 i pPC8,0. Jak wyżej, koniec 5' sekwencji DNA przedstawiony jest jako początek. Tak więc, traktowanie cDNA oksydazy alkoholowej różnymi enzymami restrykcyjnymi daje fragmenty następującej wielkości:
Ilość Odległość od początku
Enzym restrykcyjny miejsc rozszczepienia (pary zasad)
AsuII 2 20, 420
EcoRV 1 50
BamHI 2 80, 90
HincII 1 550
Sali 1 820
BgUI 1 820
KpnI 1 850
Xbal 1 1450
Rsal 1 1760
Stul 1 2000
Mapowanie enzymami restrykcyjnymi końca 3' genu oksydazy alkoholowej w klonach pPC 8,0 i pPC 8,3 wykazuje, że w cDNA klonu pPC 8,3 stracono około 250 nukleotydów sekwencji mRNA oksydazy alkoholowej (fig. 2). Sekwencje obecne na końcu 3' mRNA oksydazy alkoholowej są w cDNA klonu pPC8,0, który zachodzi na pPC8,3 około 500 nukleotydami.
Figura 14 przedstawia mapę restrykcyjną cDNA polipeptydu p40, fragment o około 1,2 kilopary zasad. Odnosząc się do końca 5' klonu cDNA jako początku, klon pPC 6,7 jest rozszczepiany przez Sali (i HincII) w odległości około 1000 zasad od początku.
Każdy z fragmentów cDNA klonowano do pBR322, którym następnie transformowano E. coli. Transformowane szczepy zdepowano w Northern Regional Research Center, Paoria, Illinois. Zdeponowane szczepy oznaczono następującymi numerami rejess:rac^jnymi:
Klon cDNA Oznaczenie laboratoryjne Nr rejestracyjny
pPC 15,0 LE392-pPC 15,0 NRRL B-15870
pPC 8,3 LE392-pPC 8,3 NRRL B-15871
pPC 8,0 MM294-pPC 8,0 NRRL B-15873
pPC 6,7 LE392-pPC 6,7 NRRL B-15872
Każdy z powyżej opisanych klonów cDNA jest użyteczny jako sonda do identyfikacji i wyodrębniania chromosomalnego DNA kodującego wytwarzanie polipeptydu unikalnego w odniesieniu do wzrostu drożdży na metanolu jako źródła węgla i energii. Stąd też, jak to już opisano, klonów tych użyto do zidentyfikowania fragmentów chromosomalnego DNA P. pastoris zawierających regiony regulatorowe i struktury kodujące informację dotyczącą unikalnych polipeptydów, które obserwuje się, gdy P. pastoris wyhodowane są na metanolu. W podobny sposób te klony DNA wykazują użyteczność jako sondy do identyfikacji i wyodrębniania analogicznych genów z innych drożdży asj^ymilujących metanol, takich jak np. Torulopsis molischiana, Hansenula capsulatum, H. monfermantens itp. (patrz przykład XVI).
Szczegółowa analiza genu oksydazy alkoholowej. 5'-region reguDtorowy klonu pPG4,0 scharakteryzowano dalej za pomocą oznaczenia sekwencji nukleotydów w górę (5') od punktu, w którym zakodowana jest strukturalna informacja dotycząca p72 (oksydaza alkoholowa). Pier158 965 19 wszych 250 nukleotydów przed miejscem start translacji mRNA (kodon ATG), są to jak się uważa, nukleotydy następujące:
ATGCTTCCAA GATTCTGGTO GGAATACTGO TGATAGCCTA
ACGTTCATGA TCAAAATTTA ACTGTTCTAA CCCCTACTTG
GACAGGCAAT ATATAAACAG AAGCAAGCTG CCCTGTCTTA
AAGCTTTTTT TTTATCATCA TTATTAGCTT ACTTTCATAA
TTGCGACTGG TTCCAATTGA CAAGCTTTTG ATTTTAACGA
CTTTTAACGA CAACTTGAGA AGATCAAAAA ACAACTAATT
ATTCGAAACG-3 •
Sekwencja C. Uważa się, że promotorowa funkcja klonu pPG 4,0 jest zawarta w tej sekwencji zasad nukleotydowych.
W celu pełniejszego opisania tego nowego fragmentu DNA oznaczono dodatkowych 301 nukleotydów dalej w górę od sekwencji wyszczególnionej jako sekwencja C powyżej. Tak więc, 531 nukleotydów przed miejscem start translacji mRNA są to, jak się uważa, nukleotydy następujące:
AATGGCCCAAA CTGACAGTTT AAACGCTGTC TTGGAACOTA
ATATGACAAA AGCGTGATCT CATCCAAGAT GAACTAAGTT
TGGTTCGTTG AAATCCTAAC GGCCAGTTGG TCAAAAAGAA
ACTTCOAAAA GTCGCCATAC CGTTTGTCTT GTTTGGTATT
GATTGAGGAA TGCTCAAAAA TAATCTCATT AATGCTTAGG
GCAGTCTCTC TATCGOTTCT GAACCCGGTG GCACCTGTGC
CGAAACGCAA ATGGGGAAAC AACCCGCTTT TTGGATGATT
ATGCATTGTC CTCCACATTGT ATGCTTCCAA GATTCTGGTG
GGAATAC-TGC TGATAGCCTA ACGTTCATGA TCAAAATTTA
ACTGTTCTAA CCCCTACTTG GACAGGCAAT ATATAAACAG
AAGGAABCTG CCCTGTCTTA AACCTTTTTT TTTATCATCA
TTATTAGCTT ACTTTCATAA TTCCGACTGG TTCCAATTGA
CAAGCTTTTG ATTTTAACGA CTTTTAACGA CAACTTGAGA
AGATCAAAAA ACAACTAATT ATTCGAAACG-3 •
Sekwencja D. Dodatkowe nukleotydy zawarte w sekwencji D (w porównaniu do sekwencji C) są uważane za nukleotydy przekazujące, na drodze nieznanego mechanizmu, dodatkowe funkcje regulatorowe do regionu promotora zawartego w sekwencji C. Należy zauważyć, że sekwencja D jest wynikiem jedynie częściowej analizy sekwencji DNA odnoszącej się do fragmentu DNA o 1,1 kilopary zasad, co do którego wykazano w przykładach XIV i XV, że jest zdolny do kontrolowania ekspresji genowej w drożdżach. Możliwe, że dodatkowe funkcje kontrolne są zakodowane w części fragmentu DNA o 1,1 kilopary zasad nie wyszczególnionego- w sekwencj D.
158 965
W celu dalszego opisania tego nowego fragmentu DNA o 1,1 kilopary zasad przeprowadzono dodatkową analizę sekwencji w celu pełnego opisania sekwencji nukleotydów całkowitego fragmentu DNA o 1,1 kilopary zasad, co do którego wykazano, w przykładach XIV i XV, że jest zdolny do kontrolowania ekspresji genowej w drożdżach. Sekwencja ta jest przedstawiona jako sekwencja D':
5 '-ACA.TCTAA r* h φ . ·, λ /« L*C 1 C Ufir.;! ITii
CGAAAGGTTG AATGAAACCT TTTTGCCATC CGCCATCCAC
AGGTCCATTC TCACACATAA GTGCCAAACG CACCAGGCGG
GGATACACTA GCAGCAGACG TTGCAAACGC AGGACTCATC
CTCTTCTCTA ACACCATTTT GCATGAAAAC AGCCAGTTAT
GGGCTTGATG GAGCTCGCTC ATTCCAATTC CTTCTATTAG
GCTACTAACA CCATGACTTT ATTAGCCTGT CTATCCTGGC
CCCCCTGGCG AGGTCATGTT TGTTTATTTC CGAATGCAAC
AAGCTCCGCA TTACACCCGA ACATCACTCC AGATGAGGGC
TTTCTGAGTG TGGGGTCAAA TAGTTTCATG TTCCCAAATG
GCCCAAAACT GACAGTTTAA ACGCTGTCTT GGCCCCTAAT
atgacaaaag CGTGATCTCA TCCAAGATGA ACTAAGTTTG
GtTCGTTGAA ATCCTAACGG CCAGTTGGTC AACACGAAAC
TTCGAAAAGT CGCCATACCG TTTGTCTTGT TTGGTATTGA
TTGACGAATG CTCAAAAATA ATĆTCATTAA TGCTTAGCGC
λ /τη,-ΊΓηοΓΓϊ'-’Γ'» > Λΐιΐυΐϋί TCGCTTCTGC ACCCGGTGGC ACCTGTGCCG
AAACGCAAAT GGGGAAACAA CCCGCTTTTT GGCTGCTTAT
GCATTGTCCT CCACATTGTA TCCTTCCAAG ATTCTGGTC-G
GAATACTGCT GCTAGCCTAA CGTTCATGAT CAaAATTTaA
CTGTTCTAAC CCCTACTTGG AGAGGCAATA TATCAAĆAGA
AGGAAGCTGC Lei CT L 1 1ΛΛ ACCTTTTTTT TTATCATCAT
TATTAGCTTA nm.-prrif* f rn i * m ctt tCATaat TGCCACTGGT TCCAATTGAC
AAGCTTTTGA TTTTAACGAG TTTTAACGAC AACTTGAGAA
GATCAAAAAA CAACTAATTA TTCGAACO3'.
Fachowcy są zdania, że dodatkowe funkcje kontrolne, odnoszące się do sekwencji C i D mogą być zakodowane w tej części sekwencji D', która jest położona dalej w górę (to jest w kierunku 5') od sekwencji nukleotydów wyszczególnionych w sekwencjach C i D.
158 965 21
W celu ustalenia, gdzie inicjowana jest transkrypcja RNA odnosząca się do genu oksydazy alkoholowy, porównano sekwencje DNA wokół 5' tego genu z genomowego klonu pPG 4,0 i klonu cDNA pPC8,3. cDNA klonu pPC8,3 zawiera około 100 nukleotydów nie ulegającego translacji regionu 5' sięgającego do genu oksydazy alkoholowej. W oparciu o tę sekwencję zsyntetyzowano (patrz przykład IX) oligonukleotyd składający się z 15 zasad (5'-CTTCTCaAgTTGTCG-3'), komplementarny w odniesieniu do nukleotydów -29 do -43, gdzie A miejsca startu translacji (kodon ATG) jest wskazana jako +1 i G w kierunku 5'jest wskazana jako -1. Użyto go jako primera w celu wydłużenia mRNA oksydazy alkoholowej do osiągnięcia końca 5'. Sekwencja cDNA otrzymana w tym eksperymencie.wydłużenia z użyciem primera ujawnia trzy różne punkty inicjacji transkrypcji mRNA, oksydazy alkoholowej Pichia pastoris. Większy transkrypt zaczyna się w odległości 114 nukleotydów od kodonu inicjacji translacji. Dwa mniejsze alternatywne transkrypty zaczynają się o 117 i 111 nukleotydów w górę (5') od kodonu AUG oksydazy alkoholowej.
nukleotydów poprzedzających start mRNA oksydazy alkoholowej zawiera przypuszczalny Goldgerg-Hognessbox · (TATAAbox). Sekwencja TATAAA znajduje się w pozycji-40 od końca 5' dominuj ącego transkryptii ,dla mRNA oksydazy alkoholowej, zatem 165 nukleotydów w górę od kodonu inicjacyjnego dla tego, białka.
3'-region regulatorowy genu oksydazy alkoholowej scharakteryzowano dalej przez oznaczenie sekwencji około 120 nukleotydów w dół od punktu, w którym zakodowana jest strukturalna informacja odnosząca się do p72 (oksydaza alkoholowa). Sekwencja ta jest przedstawiona poniżej jako sekwencja D: .
5 '-tcaagaggAt GTCAGAATGC catttgcctg agagatgcag
GCTTCATTTT TGATACTTTT TTATTTGTAA CCTATATAGT
ATAGGATTTT TTTTGTCAAA AA AAAaAAaA aAAAAAAAA.A a-5
Sekwencja D. Szczegółowa analiza genu p76. 5'-region regulatorowy klonu pPG 6,0 scharakteryzowano dalej przez oznaczenie selcwe^ci nukleotydów klonu w górę (5') od punktu, w którym zakodowana jest>triikturalna informacja dotycząca p76. Pierwszych 622 nukleotydów, przed miejscem start translacji mRNA (kodon ATG) są to, jak się uważa, nukleotydy następujące:
5'-TT
cacccataca ACTATAAACC TTAGCAATTG AAATAACCCC
AATTCATTGT TCCGAGTTTA ATATACTTGC CCCTATAAGA
AACCAAGGGA TTTCAGCTTC CTTACCCCAT GAACAGAATC
TTCCATTTAC Γ'ηηηη ·. γφγγ V szL/rtkz X AGAGATCCGC CCAAACGAAC
AGATAATAGA aaaaaacaat TCGGACAAAT AGAACACTTT
CTCAGCCAAT TAAAGTCATT CCATGCACTC CCTTTAGCTG
CCGTTCCATC CCTTTGTTGA GCAACACCAT CGTTAGCCAG
TACGAAAGAG GAAACTTAAC CGATACCTTG GAGAAATCTA
AGGCGCGAAT GAGTTTAGCC TAGATATCCT Ta GT Gzła GGG
TGTCCGATAC TTCTCCACAT TGAGTCATAG ATGGGCAGCT
TGTATCATGA AGA GAC GGA A ACGGGCATAA GGGTAACGGC
CAAATTATAT AAAGACAACA T GCC CCA GTT TAAAGTTTTT
158 965
GTTTCGTATT CTTGTATCCT GAGTGACCGT TGTGTTTAAT
ATAAAAAGTT CGTTTTAACT T ίχΑ GA l C aAa ACCAGTTACA
agaaattata /i L ν ί./ ί ’β» 1 AGACTAAAGT TCACTCTTAT
CAAACTATCA Λ Λ^Λ TP *· ΛΚ X '
Sekwencja D'. Uważa się, że promotorowa funkcja klonu pPG 6,0 jest zawarta w tej sekwencji zasad nukleotydowych, aczkolwiek fachowcy są zdania, że dodatkowe właściwości regulatorowe mogą być zawarte w tej części sekwencji, która jest położona dalej w górę od sekwencji przedstawionej jako sekwencja D'.
3'-region regulatorowy klonu pPG 6,0 scharakteryzowano dalej przez oznaczenie sekwencji około 180 nukleotydów w dół (3') od punktu, w którym zakodowana jest strukturalna informacja dla p76. Sekwencja ta została przedstawiona poniżej jako sekwencja D.
/-GICAGCAGTĆ ttTcctgcca AAGCCATCAA GAGGACGTAC
ATGGTCTGAT TTTTTGGTTT TCTATGTCCG ACGGGGTTCG
TAAACTGGCT TCCTCCTTTT CCTTTCOTGT TGCATTTTAT
TTGGTCAAAC AAAACTAGGG TCTTTTCCTA AAACCTTATG
TCAATGGACC TAGCkCkATA-3'
Sekwencja D. Ekspresja w drożdżach transformowanych. Opisane powyżej plazmidy wytworzone sposobem według wynalazku wykazują użyteczność w tych szczepach drożdży, które można transformować. Regulację ekspresji genu w drożdżach można osiągnąć za pomocą nowych fragmentów DNA przez podanie transformowanych organizmów głodzeniu pod względem źródeł węgla. Głodzenie pod względem źródeł węgla po hodowli na różnych źródłach węgla, zarówno wywierających represję kataboliczną jak i nie wywierających tej represji, indukuje ekspresję produktu genowego utrzymywanego pod kontrolą regionów regulatorowych.
Według wynalazku, środkiem uzyskania do ekspresji żądanego produktu genowego w odpowiednich gatunkach transformowanych drożdży jest prowadzenie hodowli transformowanych drożdży na metanolu.
Regiony regulatorowe wytworzone w sposobie według wynalazku są użyteczne, jeśli chodzi o ekspresję, we wszystkich szczepach drożdży, ponieważ wykazano, że regiony regulatorowe indukowane są w różnych warunkach. Tak więc, według wynalazku można spowodować bezpośrednie wytwarzanie obcych, to jest heterologicznych polipeptydów przez drożdże zdolne do wzrostu na metanolu. W przypadku drożdży zdolnych do wzrostu na źródłach węgla wywierających respresję kataboliczną można spowodować wytwarzanie obcych polipeptydów, przez poddanie tak wyhodowanych komórek drożdżowych warunkom głodowym pod względem źródeł, węgla.
Drożdże z rodzajów wymienionych poniżej są korzystne z powodu bezpieczeństwa przy posługiwaniu się nimi, jeśli chodzi o ustalenie warunków wzrostu itp., oraz dlatego, że są dobrze znane fachowcom.
Szczepami drożdży nadającymi się do użycia w sposobie według wynalazku są te szczepy drożdży, które są zdolne do wzrostu na metanolu jako źródle węgla i energii. Drożdże zdolne do wzrostu na metanolu obejmują szczepy należące do rodzajów: Candida, Kloeckera, Saccharomyces, Rhodotorula, Hansenula, Torulopsis i Pichia.
Oprócz tego, ponieważ regiony regulatorowe wytworzone-w sposobie według wynalazku reagują na różne warunki wzrostu, zarówno w odniesieniu do indukcji, jak i do represji ekspresji, można osiągnąć regulowaną ekspresję produktu genowego pod kontrolą regionów regulatorowych. Tak więc, np. komórki można hodować na źródle węgla, które indukują jedynie niski poziom ekspresji obcego genu, a następnie przenieść je do metanolu, który będzie silnie indukował
158 965 ekspresję genu. Alternatywnie, regulowaną ekspresję genu można osiągnąć przez zastosowanie mieszanin środków pokarmowych indukujących/wywierających represję. Jako jeszcze dalszą alternatywę, wysoki poziom ekspresji powodowanej przez hodowlę na metanolu można zmniejszyć według życzenia za pomocą dodania do podłoża wzrostowego wywierającego represję źródła węgla, takiego jak glukoza lub etanol. Oczywiście, fachowcy stwierdzają, że inne warianty mieszanin pokarmowych lub inny porządek wprowadzania środków pokarmowych wchodzą tu w grę, co umożliwia kontrolę na znacznie wyższym poziomie, aniżeli poziom ekspresji genu otrzymywanej przy zastosowaniu regionów regulatorowych wytworzonych sposobem według wynalazku.
Specjalnie korzystnym szczepem drożdży jako gospodarzy jest mutant Pichia pastoris GS115, defektywny pod względem zdolności do tworzenia histydyny i z tego powodu oznaczony jako posiadający genotyp mutanta, his4. GS115 otrzymany jest z Pichia pastoris NRRL Y-l 1430 i został zdeponowany w kolekcji w Northern Regional Research Center of the United States Departament od Agriculture, Peoria, Illinois. Pichia pastoris GS115 oznaczono numerem rejestracyjnym NRRL Y-15851 z dniem 31 sierpnia 1984. Ten szczególny gospodarz jest użyteczny, gdyż stanowi on mutant auksotroficzny z deficytem pod względem dróg metabolicznych histydyny. Transformacja tego gospodarza wektorem zawierającym wśród innych sekwencji DNA funkcję genu HIS4 pozwala na łatwą selekcję transformowanego gospodarza.
Wobec tego, regiony regulatorowe wytworzone sposobem według wynalazku są użyteczne, jak wykazano, w regulowanej ekspresji heterologicznych produktów genowych w szczepach drożdży rodzaju Saccharomyces, wśród których znana jest duża liczba mutantów auksotroficznych, dodatkowe korzystne, jako gospodarze, szczepy drożdży obejmują: ATCC 24683 (trpl, adel, his2, leul, gali, ural mutant), ATCC24684 (trpl, adel, his7, gali, ural mutant), ATcC 32810 (trp5, arg4, his5, łysi, ade2, gal2 mutant), ATcC 34182 (ade3, his, ura mutant), ATCC 34352 (ura2 mutant), ATCC 34353 (ura2 mutant), ATCC 38523 (argl, thrl mutant), ATCC 38626 (leu2, his4 mutant), ATCC 38660 (his4, leu2, thr4 mutant), ATCC 42243 (ura 3 mutant), ATCC42363 (adel, his4, thr mutant), ATCC42403 (arg4, lys7 mutant), ATCC42404 (adel, his4, leu2 mutant), ATCC42564 (ural, his6 mutant), ATCC42596 (his4, leu2, lysl mutant), ATCC42957 (his4, leu2, thr4, trp5 mutant), ATCC 42950 (ade mutant), ATCC 42951 (ade, leu mutant), ATCC 44069 (ural mutant), ATCC 44070 (leu2, his4 mutant), ATCC 44222 (his4 mutant), ATCC 44376 (his4, ade2 mutant), ATCC44377 (his4, leul mutant) itp. łatwo dostępne.
Fachowcy rozpoznają, że szczepy użyteczne jako gospodarze nie są ograniczone do mutantów auksotropowych. Tak więc, transformacja szczepów prototrofćcznych z pozytywnymi markerami selekcji takimi jak geny oporności na antybiotyki również dostarcza użytecznych środków do wykrycia i wyodrębnienia transformowanych szczepów.
Escherichia coli jest także użytecznym gospodarzem dla plazmidów wytworzonych sposobem według wynalazku. Fachowcy zorientują się, że wiele szczepów E. coli jest odpowiednimi gospodarzami. Kilka szczepów zastosowanych w niniejszej pracy zestawiono poniżej:
Oznaczenie szczepu Nr rejestracyjny
MC 1061 Nieznany
LE 392 ATCC nr 333572
MM 794 ATCC nt r 33755
Sposób prowadzenia transformacji Pichia pastoris. Transformacja Pichia pastoris nie była uprzednio opisana. Metody eksperymentalne transformacji Pichia pastoris przedstawione są bardziej szczegółowo poniżej (przykład XII). W celu wytworzenia układu transformacyjnego dla P. pastoris wyodrębniono auksotroficznego mutanta GS115 (NRRL Y-15851) i ustalono, że jest on defektywny pod względem szlaku metabolicznego histydyny w tym sensie, że szczep nie wykazuje wykrywalnej aktywności dehydrogenezy histydynolowej.
GS115 (NRRL Y-15851) można transformować za pomocą enzymatycznego trawienia ścian komórkowych z otrzymaniem sferoplastów. Następnie sferoplasty miesza się z transformującym DNA i inkubuje w obecności jonów wapnia i glikolu polietylenowego, a po tym regeneruje w wybiórczym podłożu wzrostowym, deficytowym pod względem histydyny. Transformujący DNA zawiera gen HIS4, pod względem którego szczep gospodarza jest defektywny, tak więc tylko komórki transformowane przeżywają na zastosowanym wybiórczym podłożu wzrostowym.
158 965
Wyodrębnienie genu HIS4 Pichia pastoris. Gen HIS4 wyodrębniono ze szczepu P. pastoris NRRLY-11430 za pomocą częściowego trawienia całkowitego chromosomalnego DNA przy użyciu Sau3A z następującym po tym wirowaniem w gradientach sacharozy. (Patrz przykład XIII). Fragmenty o 5 do 20 kilopar zasad klonowano do miejsca rozszczepienia BAmHI wektora wahadłowego S. Serevisiae-E. coli YEpl3 (ATCC 37115, fig. 33) i transformowano nim E. coli. Połączono około 50000 kolonii i ekstrahowano całkowity plazmidowy DNA. Sferoplasty S. cerevisiae szczep 5799-4D (NRRL Y -15859) mutant his4ABC, zmieszano z około 1 //g zbioru DNA Pichia YEpl3 metodą Hinnena i wsp. (1978) pozwalając na regenerację w podłożu deficytowym pod względem histydyny. W wyniku transformacji otrzymano około 1.103 prototroficznych kolonii drożdży z populacji około 5· 107 wszystkich sferoplastów zdolnych do regeneracji. Równoległa próbka kontrolna inkubowana bez DNA nie wytworzyła kolonii. Całkowity drożdżowy DNA ekstrahowano z 20 kolonii His+ i powtórnie transformowano nim E. coli. Siedemnaście prepararów drożdżowego DNA wytworzyło kolonie oporne na ampicylinę. Te klonowane fragmenty scharakteryzowano dalej przez mapowanie i badanie wielkości za pomocą enzymów restrykcyjnych jak również wykorzystując ich zdolność do krzyżowego hybrydyzowania ze znakowym fragmentem HIS4 S. cerevisiae w łagodnych warunkach (po hybrydyzacji przemycia w 2 X SSC w temperaturze 55°C) w metodzie opisanej w przykładzie XIII § G. Z plazmidów zawierających HIS4 każdy zawierałjeden, albo więcej, fragmentów hybrydyzujących z genem HIS4 S. cerevisiae. Jeden z tych plazmidów zawierających HIS4 reklonowano z otrzymaniem plazmidu oznaczonego pYJ8 i pokazano na fig. 25. Plazmid pYJ8 zawiera sekwencję pBR325, w tym geny oporności na chloramfenikol i ampicylinę, jak również gen HIS4 Pichia.
Gen ARG4 wyodrębniono z P. pastoris NRRL Y11430 stosując analogiczny sposób postępowania i szczep Arg~S. cerevisiae S2072A (arg4 leu2 trpl mutant ga!2, otrzymany z Yeast Genetic Stock Center, Berkely, CA).
Wiadomo, że podobnie można wyodrębniać z Pichia inne geny markerowe, stosując odpowiednio defektywne szczepy S. cerevisiae.
Wyodrębnienie autonomicznie replikujących się sekwencp z Pichia pastoris. Innym użytecznym składnikiem wektorów wytworzonych w sposobie według wynalazku są autonomicznie replikujące się sekwencje (PARS) otrzymane z Pichia, które wzmagają zarówno częstość transformacji GS115 jak również utrzymywanie się plazmidu jako stabilnego elementu pozachromosomalnego.
Przy poszukiwaniu ARS Pichia, DNA z Pichia pastoris GS115 (NRRL Y-15851) strawione częścćowo Taql i wyodrębniono fragmenty o 5 do 10 kilopar zasad oraz klonowano do unikalnego miejsca Clal w pYJSACla (patrz fig. 26). Plazmidowy DNA odzyskano z około 10000 kolonii Pichia His + i użyto do transformowania E. coli. Z około 10000 kolonii opornych na ampicylinę wyodrębniono plazmidy i powtórnie transformowano nimi GS115. Czterdzieści kolonii drożdży His+ z tej podzbiorowej transformacji oddzielnie rozprowadzono na podłożu wybiórczym i hodowano jako oddzielne hodowle w podłożu wybiórczym. Z każdej z tych 40 hodowli ekstrahowano całkowity DNA i transformowano nim E. coli. Do dalszej analizy wybrano 2 plazmidy, pYA63 (PARS1) i pYA90 (PARS2), w których preparaty DNA wytworzyły najwięcej kolonii E. coli opornych na ampicylinę. Obydwoma tymi plazmidami transformowano GS 115 Pichia pastoris (NRRL Y-15851) przy bardzo wysokiej częstości transformacji i każdy zawierał insert z obcego DNA.
Jako miarę zdolności ARS do utrz.ymywania plazmidów jako autonomicznych elementów w Pichia zastosowano transformację komórek drożdży każdym plazmidem, prowadzono hodowlę w podłożu wybiórczym i okresowo pobierano próbki. Stan sekwencji plazmidowych w komórkach określano za pomocą hybrydyzacji Southerna nie poddanych działaniu enzymów restrykcyjnych drożdżowych DNA z promieniotwórczo znakowanym pBR325. Plazmidy pYA63 i pYA90 utrzymywały się w Pichia przez co najmniej 10 generacp w podłożu wybiórczym (ale w ciągu 50 generacji zostały zintegrowane).
Jedna z tych przypuszczalnych autonomicznie replikujących się sekwencji Pichia (PARS1) klonowano do kilku innych wektorów Pichia w celu zbadania ich zdolności do utrzymywania
158 965 transformującego DNA jako elementu autonomicznego. Plazmidy pYJ30 (fig. 27) i pBPfl (fig. 34) były ciągle obecne jako autonomiczne elementy po 20 generacjach wzrostu na podłożach wybiórczych (His-) i były obecne w postaci licznych kopii na komórkę. Analiza komórek transformowanych pYJ30 za pomocą hybrydyzacji metodą Sotherna wykazało około 10 kopii na komórkę.
W celu ustalenia, czy plazmidy pSAOH5 (patrz fig. 18) i pT76H4 (patrz fig. 22b) zawierające PARS1, wniesioną przez, odpowiednio, pYJ30 i pBWl, przejawiają stabilność podobną do plazmidów, z których zostały otrzymane, komórki zawierające te wektory hodowano w warunkach selektywnych przez około 50 generacji w warunkach selektywnych (His-) w obecności glukozy. Następnie komórki przeniesiono w warunki niesdektywne (His+) i śledzono utratę prototroficzności. Stabilność tych plazmidów była porównywalna ze stabilnością pYJ30 włącznie z szybką utratą prototroficzności His po przeniesieniu do podłoży nieselektywnych. Tak więc, uważa się, że eksperymenty przeprowadzone z plazmidami zawierającymi autonomicznie replikującą się sekwencję PARS1 wykazały w wyniku ekspresję genu z autonomicznego plazmidowego DNA.
Nowe konstrukcje zawierające gen /3-galaktozydazy. W celu wykazania zdolności regionów regulatorowych wytworzonych sposobem według wynalazku do kontrolowania wytwarzania produktów białkowych, wyprodukowano nowe konstrukcje DNA. Tak więc gen lacZ E. coli umieszczono w kilku plazmidach pod kontrolą regionów regulatorowych genów kodujących polipeptyd p72 (oksydaza alkoholowa) lub p76. Otrzymanie plazmidów pSAOHl, pSAOH5, pSAoHlO, pTAFHO85, pT76Hl, pT76H2, pT76H3 i pT76H4 opisano w przykładzie XIV.
Aczkolwiek wprowadzenie konstrukcji region regulatorowy-gen J-gataktozydaz wytworzonych ' sposobem według wynalazku-opisano w niniejszym opisie z zastosowaniem plazmidów jako nośnika do wprowadzania, fachowcy zorientują się, że do wprowadzenia do komórek konstrukcji region regulatorowy-gen strukturalny plazmid nie jest konieczny. Można więc użyć jakiejkolwiek cząsteczki zdolnej do utrzymywania się w drożdżach. Przeto można manipulować konstrukcjami region regulatorowy-gen strukturalny, stosując do tego wektory inne niż plazmidy. Alternatywnie, konstrukcja region regulatorowy-gen strukturalny może zostać zintegrowana z chromosomem komórki drożdży jako gospodarza.
Zakres niniejszego wynalazku nie jest ograniczony do wytwarzania j3-gaaaktozydazy w sposób regulowany przez regiony regulatorowe ujawnione w niniejszym opisie. Różnorodność polipeptydów, które można wytwarzać w sposób regulowany przez regiony regulatorowe wytworzone sposobem według wynalazku, ograniczona jest jedynie wyobraźnią cz^tdnika. Istnieje wiele metod otrzymywania sekwencji DNA kodujących żądane polipeptydy. I tak np. można metodami znanymi syntetyzować oligonukleotydy o różnej długości. Kilka takich oligonukleotydów można zmontować, wykorzystując ich właściwości polegające na specyficznym parowaniu zasad, otrzymując dłuższe, dwuniciowe cząsteczki. Oligonukleotydy stanowiące składnik tych dwuniciowych cząsteczek można łączyć (ligować) za pomocą enzymu-ligazy DNA. Alternatywnie, cząsteczki DNA o żądanej sekwencji kodującej można syntetyzować stosując enzym - odwrotną transkryptazę przy użyciu informacyjnego RNA odpowiadającego żądanemu polipeptydowi jako matrycy będącej podstawą działania odwrotnej transkryptazy. Jeszcze inną możliwością jest klonowanie fragmentów genomowego DNA i obserwowanie, czy zachodzi bezpośrednia ekspresja żądanego produktu.
Sekwencję DNA kodującą żądany polipeptyd można .zmodyfikować w celu wytworzenia konstrukcji region reguUtorowy - gen strukturalny różnymi metodami. Np. końce DNA otrzymanego jak wyżej opisano można ligować za pomocą enzymu ligazy DNA z krótkimi dwuniciowymi cząsteczkami DNA zawierającymi sekwencję nukleotydów rozpoznawaną przez speccficzne endonukleazy restrykcyjne, tak zwanymi cząsteeckami'łącznikowymi. Trawienie tych cząsteczek specyficzną endonukleazą restrykcyjną po ligowaniu utworzy zakończenia odpowiadające specyficznemu miejscu rozpoznawania endonukleazy restrykcyjnej na końcach otrzymywanej sekwencji DNA.
Trzy otrzymane specyiczne konstrukcje region regulatorowy - gen /3-galaktokydazy opisano w terminach dotyczących mapowania restrykcyjnego przedstawionego na fig. 15 i 16. Mapa restrykcyjna przedstawiona na fig. 15a opisuje konstrukcję zawierającą część Hindlll - BamHI o 0,85 kilopary zasad otrzymaną z 5'-regionu regulatorowego pPG 6,0 i genu ' lacZ z E. coli (pokazano
158 965 fragment BamHI - Nrul o 3,6 kilopary zasad). Ta sama konstrukcja jest obecna w każdym z plazmidów pTAFH0,85, pT76Hl i pT76H2, które dalej będą opisane bardziej szczegółowo (patrz przykład XIV). Mapa restrykcyjna przedstawiona na fig. 15b opisuje konstrukcję zawierającą część Hindlll -EcoRI o 1,3 kilopary zasad otrzymaną z 5'-regionu regulatorowego pPG 6,0 i genu lacZ z E. coli. Ta sama konstrukcja obecna jest w każdym z plazmidów pT76U 1, pT76H3 i pT76H4, które dalej będą opisane bardziej szczegółowo (patrz przykład XIV).
Figura 16 jest mapą restrykcyjną konstrukcji zawierającej fragment EcoRI-BamHI o 1,1 kilopary zasad otrzymany z części 5'-regionu regulatorowego pPG4,0 i genu lacZ z E. coli. Konstrukcja ta jest obecna w każdym z plazmidów pSAOHl, pSAOH5 i pSAOHlO, które dalej opisane będą bardziej szczegółowo (patrz przykład XIV).
Plazmid pSAOH 1 objaśniono schematycznie na fig. 17. W uzupełnieniu do konstrukcji region regulatorowy-gen J-galaktozydazy wyszczególnionej na fig. 16 pokazano, że plazmid zawiera:
a) sekwencje pBR322, w tym gen Amp ,
b) gen HIS4 Pichia pastoris,
c) 2μ kolisty DNA S. cerevisiae, oraz
d) przerwany gen URA3 z S. cerevisiae.
Tak więc plazmid ten wykazuje zdolność do transformowania i replikowania się w E. coli jako gospodarzu i drożdżach jako gospodarzu. Obecne są markery selekcyjne do manipulowania DNA albo w E. coli, albo w drożdżach, jako gospodarzu.
Plazmid pSAOH5 objaśniono schematycznie na fig. 18. Plazmid jest podobny do wyżej opisanego pSAOHl, z tą różnicą, że 2μ kolisty DNA i nieco DNA flankującego gen HIS4 Pichia pastoris uległo delecji, podczas gdy dodano autonomicznie replikującą się sekwencję Pichia pastoris PARS1 zpYA63.
Plazmid pSAOHlO objaśniono schematycznie na fig. 19. Plazmid zawiera:
a) konstrukcję region regulatorowy-gen J-gatektozydazy,
b) sekwencje pBR325, w tym geny nadające oporność na tetracyklinę, oporność na chloramfenikol i oporność na ampicylinę (odpowiednio, tet , cam i amp I), oraz
c) gen HIS4 S. cerevisiae (otrzymany z plazmidu pYA2, jak opisano w poniższej części niniejszego opisu).
Plazmidy pTAFH0,85 i pT76H2 są analogiczne do powyżej opisanych trzech plazmidów, z tym wyjątkiem, że zastosowaną konstrukcją region regulatorowy-gen J-galaktozydazy jest konstrukcja taka, jaką opisano na fig. 15a (zamiast konstrukcji opisanej na fig. 16).
Plazmidy pT76H3 i pT76H4 są analogiczne do, odpowiednio, pSAOHl i pSAOH5, z tą różnicą, że zastosowaną konstrukcją region regulatorowy-gen J-gataktozydazy jest konstrukcja taka, jaką opisano na fig. 15b (zamiast konstrukcji opisanej na fig. 16).
Plazmid pTAFH0,85 objaśniono schematycznie na fig. 20 i obejmuje on:
a) konstrukcję region regulatorowy-gen /3-galaktozydazy, przedstawioną na fig. 15a,
b) sekwencje pBR322, w tym gen ampR
c) gen HIS4 Pichia pastoris,
d) 2μ kolisty DNA S. cerevisiae, oraz
e) przerwany gen URA3 z S. cerevisiae.
Plazmid pT76Hl objaśniono schematycznie na fig. 21 i obejmuje on:
a) konstrukcję region regulatorowy-gen J-gaUktozydazy, przedstawioną na fig. 15a,
b) sekwencje pBR322, w tym gen amp”, oraz
c) gen HIS4 Pichia pastoris i autonomicznie replikującą się sekwencję (PARS1).
Plazmid pT76H2 objaśniono schematycznie na fig. 22 i obejmuje on:
a) konstrukcję region regulatorowy-gen /3-galaktozydazy, przedstawioną na fig. 15a,
b) Sekwencje pBR325, w tym geny nadające oporność na tetracyklinę, oporność na chloramfenikol i oporność na ampicylinę, oraz
c) gen HIS4 S. cerevisiae.
Plazmid pT76H3 objaśniono schematycznie na fig. 22a i obejmuje on:
a) konstrukcję region regulatorowy-gen J-gahiktozydazy przedstawioną na fig. 15b,
b) sekwencje pBR322, w tym gen amp”,
158 965
c) gen HIS4 P. pastoris,
d) 2μ kolisty DNA S. cerevisiae, oraz
e) przerwany gen URA3 z S. cerevisiae.
Plazmid pT76H4 objaśniono schematycznie na fig. 22b i obejmuje on:
a) konstrukcję region regulatorowy-gen /3-galaktozydazy, przedstawioną na fig. 15b,
b) sekwencje pBR322, w tym gen ampR
c) gen HIS4 Pichia pastoris, oraz
d) autonomicznie replikującą się sekwencję Pichia pastoris (PARS1).
Ekspresja J-galaktozydazy w drożdżach. Pichia pastoris GS115 (NRRL Y-15851) transformowane nowymi konstrukcjami zawierającymi gen /J-gidaktozydazy powyżej opisanymi. Kilka otrzymanych transformowanych szczepów drożdży zdeponowano w kolekcji w Northern Regional Research Center of the United States Departament of Agriculture i nadano im depozytowe numery rejestracyjne jak następuje:
Nr rejestracyjny
Gospodarz Plazmid transformowanego szczepu
GS 115 pSAOHl NRRL Y-15852
GS115 pSAOH5 NRRL Y-15853
GS115 pSAOHl O NRRL Y-15854
GS115 pTAFH.85 NRRLY-15855
GS115 pT76Hl NRRL Y-15856
GS115 pT76H2 NRRL Y-15857
Nowych konstrukcji zawierających gen /3-galaktozydazy użyto również do transformowania E. coli. Transformowano szczepy bakteryjne również zdeponowano w Northern Regional Research Center, Peoria, Illinois. Transformowanym szczepom nadano następujące numery rejestracyjne:
Nr rejestracyjny
Gospodarz Plazmid transformowanego szczepu
MC1061 pSAOHl NRRL B-15861
MC1061 pSAOH5 NRRL B-15862
MC1061 pSAOHl O NRRL B-15863
MC1061 pTAFH,85 NRRL B-15864
MC1061 pT76Hl NRRL B-15865
MC1061 pT76H2 NRRL B-15866
MC1061 pTAO13 NRRL B-15875
MC1061 pT76H3 NRRL B-18000
MC1061 pT76H4 NRRL B-18001
MC1061 pT76Ul NRRL B-18002
Pichia pastoris GS 115 (NRRL Y-15851) transformowano każdym z pierwszych ośmiu plazmidów powyżej opisanych, które zawierają konstrukcje region regulatorowy oksydazy alkoholowej p76-gen lacZ wytworzone sposobem według wynalazku hodowano do fazy stacjonarnej na podłożu minimalnym uzupełnionym biotyną, z glukozą jako źródłem węgla. Gdy komórki osiągały fazę stacjonarną przeniesiono je do podłoża minimalnego uzupełnionego biotyną, z metanolem jako źródłem węgla. Po hodowaniu komórek przez około 3-5 generacji w temperaturze 30°C, przeniesiono je do świeżego podłoża minimalnego uzupełnionego biotyną i hodowano na glukozie lub metanolu jako źródle węgla. W różnych odstępach czasu odsysano próbki hodowli i analizowano pod względem obecności j3-galaktozydazy i oksydazy alkoholowej metodami wyszczególnionymi w przykładach VII i XV.
Stwierdzono, że komórki hodowane na glukozie jako źródle węgla wytwarzały /^^g^^^^tozydazy lub oksydazy alkoholowej na wykrywalnym poziomie, podczas gdy komórki hodowane na metanolu jako jedynym źródle węgla wykazywały ekspresję zarówno oksydazy alkoholowej jak i /3-gaIaktozydazy na znacznym poziomie. Stwierdzono również, że komórki hodowane na glukozie, gdy poddano je głodzeniu pod względem źródeł węgla, również wykazywały ekspresję mierzalnych
158 965 ilości oksydazy alkoholowej jak i J-galaktozydazy. Tak więc jest jasne, że regiony regulatorowe wytworzone sposobem według wynalazku reagują zarówno na obecność metanolu, jak i w warunkach głodzenia pod względem źródeł węgla.
Wynalazek objaśniają następujące przykłady.
Bufory i roztwory stosowane w następujących dalej przykładach mają skład podany poniżej 1 M bufor Tris: 121,1 g Tris (zasada) w 800 ml H2O. Wodę doprowadzić do żądanej wartości pH za pomocą dodania stężonego (35%) wodnego HC1, pozwolić na ochłodzenie się roztworu do temperatury pokojowej, po czym doprowadzić pH do wartości końcowej, rozcieńczyć do końcowej objętości 1 litra.
S-bufor: 1,5 M sorbit w 0,04 M buforze z fosforanem sodowym o pH 6,6;
Bufor ΡΚ:Ό, 14M NaCl; 1 % siarczan sodowo-dodecylowy (SDS); 0,0.1 M DTA; w 0,05 (pH 8,4) buforze Tris.
Bufor ETS: 10 mM EDTA; 0,2% SDS w 0,01 M (pH 7,4) buforze Tris;
Bufor TE: 1,0 mM EDTA w 0,01 M (pH 7,4) buforze Tris;
SSC: 0,15 M NaCl. 15 mM cytrynian sodowy doprowadzony NaOH do pH7,0;
TAE: 40 mM kwas octowy; 5 mM EDTA w 0,02 M (pH 8,3) buforze Tris;
PBS (roztwór soli buforowany fosforanami): 10 mM fosforan sodowy (pH 7,0); 0,15 M NaCl;
Bufor do nanoszenia Laemmli: 62,5 mM Tris-HCl (pH6,8); 2% SDS; 10% gliceryna; 5%
2-merkaptoetanol; 0,01% błękit bromofenolowy;
Bufor RIPA: 1% NP40 (sigma); 1% dezoksycholan sodowy; 0,1% SDS w PBS;
X SSPE: 20 mM EDTA; 0,16 M NaOH; 0,2 M NaH2PO · H2O; 3,6M NaCl; doprowadzony NaOH do 7,0;
Roztwór Denhardta (50 x): 5 g Ficoll; 5 g poliwinylopirolidonu; 5 g bydlęcej albuminy surowiczej (BSA; Pentax Fraction V); doprowadzić wodę do całkowitej objętości 500 mL;
Bufor przedhybrydyzacyjny: 5 X SSPE; 5 X roztwór Denhardta; 50% dejonizowany formamid; 0,2% SDS; 200/<g/ml pocięty i zdenaturowany DNA; ze spermy śledzia;
Podłoże LB (Luria-Bertani): 5 g Bacto-tryptone; 5 g Bacto-yeast extract; 2,5 g NaCl w litrze wody doprowadzonej NaOH do pH7,5;
Podłoże YPD: 1% Bacto-yeast extract; 2% Bacto-peptone; 2% glukoza;
Podłoże SD: 6,75 g yeast nitrogen base without amino acids (DIFCO); 2% glukoza w 1 litrze wody;
SED: 1 M sorbit; 25 mM EDTA; 50 mM DTT;
Bufor SCE: 9,1 g sorbitu; 1,47 g cytrynianu sodowego; 0,168 g EDTA; 50 ml H2O doprowadzić HC1 do pH5,8;
CaS: 1 M sorbit; 10 mM CaCl2 wyjałowić przez sączenie;
Roztwór PRG: 20% glikol, polietylenowy-3350; ,10 mM CaCh; 10 mM Tris-HCl (pH7,4) wyjałowić przez sączenie;
SOS: 1 M sorbit; 0,3 X podłoże YPD; 10 mM CaCk;
Formamidowa mieszanina barwiąca: 0,1% cyjanoksylen FF; 0,2% błękit bromofenolowy; 10 mM EDTA; 95% dejonizowany formamid;
Żel górny: 76,8 g mocznika; 24 ml akryloamidu macierzystego; 8 ml 10 X TBE doprowadzić . do końcowej objętości 160 ml;
Akryloamid macierzysty: 38 g akryloamidu; 2 g bis/N,N-metylenobisakry!oamidu/ dodać do wody do końcowej objętości 100 ml;
Żel dolny: 14,4 g mocznika; 3,0 g sacharozy; 7,5 ml 10 X TBE; 4,5 ml akryloamidu macierzystego; 0,3 ml roztworu błękitu bromofenolowego (0,01 g/ml) dodać wody do całkowitej objętości 30 ml;
Bufor przedhybrydyzacyjny do selekcji hybrydyzacyjnej: 50% formamidu; 0,75% M NaCl; 0,1 M Tris, pH 7,4; 0,008 M EDTA; 0,5% SDS; 200pg/ml tRNA z wątroby królika (Sigma);
0,5 M bufor NETS: 0,5 M . NaCl; 10 mM EDTA; 10 mM Tris, pH7,4; 0,2% SDS;
X bufor RT: 500' mM‘NaCl; 340 mM Tris, pH8,3; 60 mM MgCb 50 mM DTT (dwutiotreitol);
Rozcieńczony RT: 4μ1 H2O; 1μ1 10 X buforu RT; 5μ1 odwrotnej transkryptazy 15 jeden/μΙ (Life Sciensces, Inc.);
158 965 dwudezoksy: dd ATP 0,49 mM; dd CTP 0,1165 mM; dd GTP 0,369 mM; dd TTP 0,82 mM;
Mieszanina dNTP: 0,625 mM dGTP; 0,625 mM dATP; 0,625 mM TTP;
Zestaw: 1,125 mM dATP; 1,125 mM dCTP; 1,125 mM dGTP; 1,125 mM TTP; w buforze 1XRT.
Jeżeli tego inaczej nie wyszczególniono, powyższe roztwory reprezentują zasadniczo (IX) zastosowane stężenie. Gdy w przykładach stosuje się różne stężenia, fakt ten wskazuje się odnosząc się do roztworu jako wielokrotności stężenia podstawowego (IX).
W przykładach stosuje się następujące skróty o podanym poniżej znaczeniu:
EDTA kwas wersenowy
TEMED N,N,N',N'-czt8rom8tyl8nodwuamina
DDT dwutiotreitol
BSA bydlęca albumina surowicza
EtBr bromek etydyny
Ci Curie
dATP dezoksyadenozynotrójfosforan
dGTP dezoksyguanozynotrójfosforan
TTP tymidynotrójfosforan
dCTP dezoksycytydynotrójfosforan
dXTP „ogólny dezoksynukleozydotrójfosforan
oligo/dT/i2-i8 Źródło: Collaborative Research, Inc.
Zymoliaza 60000 Źródło: Miles Laboratories
Kilka sposobów postępowania prowadzonych w sposób rutynowy realizuje się według standardowego trybu postępowania, który zostanie poniżej omówiony szczegółowo.
Wirowanie prowadzi się w czasie i przy szybkości obrotów wystarczających do uzyskania klarownego supernatantu. Na ogół, wirowanie komórek drożdży prowadzi się przy co najmniej 1500g w ciągu co najmniej 5 minut.
Ekstrakcja kwasów nukleinowych układem fenol/chloroform/alkohol izoamylowy obejmuje kontaktowanie roztworu zawierającego kwas nukleinowy z taką samą objętością mieszaniny 50:48: 2, odpowiednio, fenolu, chloroformu i alkoholu izoamylowego w stosunku objętościowym. Ekstrakcja układem chloroform/alkohol izoamylowy obejmuje kontaktowanie roztworu, na który ma się działać, z taką samą objętością mieszaniny 48 : 2 w stosunku objętościowym chloroformu i alkoholu izoamylowego.
Gdy opisuje się żele, filtry itp. jako przemywane lub namaczane w wyszczegóónionym roztworze, całkowity kawałek żelu, filtr itp. zanurzano w odpowiednim naczyniu (miseczka, wanienka, fiolka itp.) w celu skontaktowania całkowitej powierzchni żelu, filtra itp. z danym roztworem.
Wytrącanie kwasów nukleinowych etanolem obejmuje najpierw uzupełnienie zawartości soli w roztworze zawierającym kwas nukleinowy, a następnie skontaktowanie tego roztworu z dwoma objętościami zimnego etanolu.
Przykład I. Hodowla i przygotowanie komórek drożdży.
Pichia pastoris NRRL Y-l 1430 hodowano w warunkach ograniczenia węgla w hodowli ciągłej w temperaturze 30°C, albo z metanolem, albo z etanolem jako pojedyńczym źródłem węgla w solnym podłożu minimalnym IM1 opisanym przez Wegnera w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4 414 329. Podłoże minimalne IM1 zawierało w 1 litrze; 36 mM KH2PO4, 23 mM (NH4)2SO4, 2 mM MgSO4, 6,7 mM KC1, 0,7 mM CaCl2, 0,2μΜ CuSO4 · 5 H2O, 1,25 μΜ KJ, 4,5 μΜ MnSO4, 2μΜ Na2MoO4, 0,75μΜ H3BO3, 17,5μ MZnSO4, 44,5μΜ FeCL i 1,6μΜ biotynę. Komórki wzrastające na metanolu hodowane są do gęstości komórek 140 g/litr (sucha waga) z czasem retencji około 12 godzin. Komórki wzrastające na etanolu hodowane są do gęstości komórek 90 g/litr z czasem retencji 11 1/2 godziny. Gdy kadź fermentacyjną zasilano metanolem lub etanolem, używano zasilających roztworów macierzystych o stężeniu, odpowiednio, 20 i 45% alkoholu.
g komórek Pichia pastoris wyhodowanych w kadzi fermentacyjnej zbierano za pomocą odwirowania i ponownie zawieszano przy gęstości około 108 komórek/ml w 0,1 M Tris (pH 8,0) zawierającym 1% 2-merkaptoetanolu. Komórki te inkubowano w ciągu 5 do 10 minut w tempera30
158 965 turze 37°C i zbierano za pomocą odwirowania. Osad przemywano raz 30 ml S-buforu i ponownie zawieszano w 5 ml S-buforu/g komórek. Do zawiesiny komórek dodano zymoliazę (Miles Biochemicals) do końcowego stężenia 500 /rg/ml. Komórki inkubowano w temperaturze 37°C w ciągu 20 minut, a następnie odwirowano, odrzucano supernatant i zebrano osad komórek. Osad ten zamrożono w ciekłym azocie i przechowywano w temperaturze -70°C do dalszego użycia.
Przykład II. Wyodrębnianie drożdżowego RNA.
Całkowity komórkowy RNA otrzymano przez sproszkowanie zamrożonego osadu otrzymanego jak opisano w przykładzie I za pomocą moździerza i tłuczka, z dalszym rozbiciem zamrożonego osadu w ciągu około 2-5 minut w mieszarce Waring Blender w obecności ciekłego azotu. Sproszkowany osad dodano do buforu PK w ilości 7,5 ml/g komórek. Do ponownie zawieszonego osadu dodano proteinazę K (Boehringer Mannheim) do końcowego stężenia 400//g/ml i inkubowano zawiesinę w temperaturze pokojowej w ciągu 10 minut. Mieszaninę tę poddano ekstrakcji układem fenol/chloroform/alkohol izoamylowy, a następnie układem chloroform/alkohol izoamylowy. Kwasy nukleinowe wytrącano za pomocą doprowadzenia stężenia NaCl w roztworze do 0,25 M NaCl i dodania etanolu. Osad zawieszono ponownie w minimalnej ilości buforu ETS, to jest w objętości buforu wystarczającej do rozpuszczenia kwasów nukleinowych (zwykle około K^0/g do 1 mg DNA/ml roztworu). Roztwór ten poddano powtórnej ekstrakcji układem fenoo/chloroform/alkohol izoamylowy, a następnie chloroform/alkohol izoamylowy, z końcowym wytrąceniem etanolem.
Kwasy nukleinowe rozpuszczono ponownie w minimalnej ilości buforu TE. RNA obecny w tym roztworze wzbogacono albo za pomocą wirowania przez 4 ml CsCl-podkładkę [1 g CsCl/ml, 1 mM EDTA, w 10 mM buforze Tris (pH7,4)], lub za pomocą wytrącenia przez doprowadzenie LiCl w roztworze do stężenia 2 M, utrzymywania w temperaturze 4-8°C przez noc i zebrania przez odwirowanie. PoHA + RNA selekcjonowano z roztworu za pomocą chromatografii powinowactwa na kolumnach oligo/c^T/^i^t^h^k^^y. Ogólnie, 0,25 g oligo/dT/celulozy typ 3 (Collaborative Research) przygotowano do chromatografii na 5 do 10 mg całkowitego RNA. 0,25 g oligo/dT/celulozy zawieszono w 2 ml buforu ETS i wprowadzono do małej silikonowanej kolumny szklanej. Tę małą kolumnę oligo/dT/celulozy przemyto za pomocą nawarstwienia 10ml 0,1 M NaOH na oligo/dT/celulozę i pozwolenia przemywającemu roztworowi na przepływ przez matrycę oligo/dT/ce!uo)zową. Następnie oligo/dT/celulozę przemyto w ten sam sposób 10 ml buforu ETS i w końcu 10 ml 0,5 M buforu NETS.
Całkowity RNA (5 do 10 mg) zawieszono ponownie w buforze ETS w stężeniu nie wyższym niż około 10 mg/ml, umieszczono w łaźni wodnej o temperaturze 65°C na 2 minuty i natychmiast po tym na lodzie. Roztworowi RNA pozwolono następnie ogrzać do temperatury pokojowej i dodano macierzysty 5 M roztwór NaCl do końcowego stężenia soli w roztworze RNA 0,5 M NaCl. Powstały roztwór RNA nawarstwiono na przygotowaną kolumnę oligo/dT/celulozy i pozwolono na powolny przepływ przez kolumnę z szybkością 1 kropla/5 sekund. Materiał przepływający przez dno kolumny zebrano do probówki i ponownie naniesiono na wierzch kolumny. Materiał zebrany z dna kolumny naniesiono ponownie na wierzch kolumny, otrzymując w końcu roztwór RNA przeprowadzony przez kolumnę oligo/dT/celulozy w całości 3 razy. Po ostatnim przeprowadzeniu przez kolumnę materiał zebrano i oznakowano jako poli A-, to jest RNA nie będący poli A. Następnie kolumnę przemyto 30 ml 0,5 M NETS i w końcu poli A + RNA ekuowano z kolumny za pomocą naniesienia 5 ml buforu ETS na kolumnę i pozwolenia na powolne spływanie tego buforu przez kolumnę, ze zbieraniem frakcji poli A + RNA w 5 ml frakcji wypływającej z dna kolumny. Przyjmując, że we frakcji poli A + RNA nie ma NaCl, doprowadzono stężenie NaCl wtej frakcji do 0,25 M i wytrącono RNA etanolem.
Przykład III. Konstrukcja zbioru cDNA.
Klony komplementarnego DNA (cDNA) syntetyzowano w następujący sposób. 10pg poli A + RNA otrzymanego jak opisano w przykładzieI zawieszono ponownie w 7μ1 H2O i doprowadzono do końcowego stężenia 2,7 mM CHOHgOH, a następnie inkubowano w temperaturze pokojowej wciągu 5 minut. Pierwszą nić cDNA syntetyzowano w temperaturze 42°C w ciągu 15 minut w 50/1 roztworu zawierającego 50 mM Tris (pH 8,3 w temperaturze 42°C), 10 mM MgCb, 30 mM 2-merkaptoetanol, 70 mM KC1, 500/Μ każdy z dATP, dGTP i TTP, 200/Μ dCTP,
158 965
25//g/ml oligo/dT/ 60//g/ml aktynomycyny D, 25 jednostek RNazyny (Biotec., Inc.), 25pCia32P dCTP (32,5 pmoli) i 120 jednostek odwrotnej transkryptazy (Life Sciences Inc.). Tę mieszaninę reakcyjną inkubowano w temperaturze 37°C w ciągu dodatkowych 15 minut. Reakcję zakończono za pomocą dodania 2μ1 0,5 M EDTA i 0,5μ1 20% SDS. Mieszaninę reakcyjną doprowadzono NaOH do stężenia 0,3 M i inkubowano w temperaturze 65°C w ciągu 30 minut. Mieszaninę reakcyjną zobojętniono następnie za pomocą dodania 10μ11 M Tris (pH 7,4) i doprowadzenia HC1 do stężenia 0,21 M. Mieszaninę reakcyjną ekstrahowano układem fenol/chloroform/alkohol izoamylowy, a następnie chloroform/alkohol izoamylowy i ostatecznie poddano chromatografii na kolumnie z Sephadex G50 w buforze TE. Promieniotwórczy jednonicowy cDNA połączono w jedną frakcję i zagęszczono do 100μΐ albo za pomocą ekstracji butanolem, albo odparowania przez wirowanie pod zmniejszonym ciśnieniem. Jednoniciowy cDNA wytrącono etanolem ze stężonego roztworu, cDNA zebrano za pomocą odwirowania i zawieszono ponownie w 100μΐ wody.
Wodny roztwór jednoniciowego cDNA doprowadzono octanem amonu do stężenia 2,5 M, wytrącono etanolem, zebrano za pomocą odwirowania i ponownie zawieszono w 20μΐ wody. Ten roztwór jednoniciowego DNA doprowadzono do końcowej objętości 50/1 50 mM buforem z fosforanem potasowym (pH7,4) zawierającym 5mM MgCb, ImM 2-merkaptoetanol, 250μΜ każdego z dATP, dGTP i TTP, 125μΜ dCTP, 25 μα-α-32Ρ-άσΤΡ (32,5 pmoli) i 8 jednostek fragmentu Klenowa polimerazy DNA I (New England Biolabs). Utworzoną mieszaninę reakcyjną inkubowano w temperaturze 37°C w ciągu godziny w celu syntezy drugiej nici DNA komplementarnej do jednoniciowego cDNA. Reakcję zakończono za pomocą dodania 2μ1 0,5 M EDTA. Dwuniciowy cDNA poddano ekstrakcji układem fenol/chloroform/alkohol izoamylowy, a następnie chloroform/alkohol izoamylowy i chromatografii na kolumnie z Sephadex G50 w buforze TE. Frakcje z dwuniciowym cDNA połączono i pulę zatężono oraz wytrącono, jak to opisano w przypadku jednoniciowego cDNA.
Po końcowej precypitacji etanolem i zebraniu dwuniciowego cDNA przez odwirowanie, osad zawieszono ponownie w 20,25μ1 wody, doprowadzono do końcowej objętości 50μ1 za pomocą 50 mM Tris (pH8,3 w temperaturze 42°C) zawierającym 10 mM MgCU, 30 mM 2-merkaptoetanolu, 70 mM KC1, 500μΜ dXTP i 150 jednostek odwrotnej transkryptazy. Powstały roztwór inkubowano w temperaturze 42°C w ciągu 15 minut w celu zapewnienia kompletności syntezy drugiej nici cDNA. Reakcję zakończono za pomocą dodania 2μ10,5 M EDTA, poczym mieszaninę zatężono i wytrącania dokonano jak opisano w przypadku reakcji jednoniciowego cDNA.
Osad dwuniciowego cDNA zawieszono ponownie w 42/z1 wody i roztwór doprowadzono do końcowej objętości 47μ1 za pomocą dodania 5μ1 roztworu macierzystego zawierającego 2,8 M NaCl, 200 mM octanu sodowego i 45 mM ZnSO4, a następnie doprowadzono HC1 do pH 4,5 w temperaturze 22°C. W celu strawienia pętli szpilkowej dokonano trzech oddzielnych reakcji z trzema różnymi stężeniami nukleazy Si (Sigma). Dodano jedną jednostkę, 10 jednostek lub 100 jednostek nukleazy Si z doprowadzeniem objętości mieszaniny reakcyjnej do końcowej objętości 50μ1 i inkubowano w temperaturze 22°C w ciągu 30 minut. Reakcję zakończono za pomocą dodania 2μ10,5 M EDTA i 2,67 μ1 2 M Tris (zasada). Dodano 6μg tRNA z wątroby królika jako nośnik, po czym prowadzono zatężanie mieszaniny reakcyjnej i wytrącanie sposobem jak wyżej opisano, z tą różnicą, że osady DNA ponownie zawieszono w buforze TE zamiast wody. Po końcowym wytrąceniu osad zawieszono ponownie w 20μ1 buforu TE i doprowadzono do końcowej objętości 50μ1 w buforze dla transferazy terminalnej (BRL) zawierającym 10 pmoli a-32PdCTP, 2μΜ dCTP i 21 jednostek transferazy terminalnej (Ratliff Biochem). Powstały roztwór inkubowano w temperaturze 37°C w ciągu 30 minut w celu dodania poli d/C/-ogona do końca' 3'-OH dwuniciowego cDNA. Reakcję zakończono za pomocą dodania 5 μ1 0,5 M EDTA, poddano mieszaninę reakcyjną ekstrakcji i chromatografii i przechowywano osad wytrącony etanolem.
Dwuniciowy d/C/-ogonowy cDNA albo włączono bezpośrednio do pli d/G/-ogonowego pBR322 otwartego w miejscu PatI, albo najpierw frakcjonowano pod względem wielkości na kolumnie z Depharose CL4B-200 (frakcje 25μ1). W przypadku zbioru nie frakcjonowanego, włączono 150ng dwuniciowego poli d/C/-ogonowego cDNA, w 180μ1 lOmM Tris (pH7,4), doprowadzonego NaCl do stężenia 0,1 M i EDTA do 1 mM, do 900 ng d/G/-ogonowego pBR322 otwartego w miejscu Pstl. Każdą 25μ1 frakcję frakcjonowanego zbioru włączono do 125 ng poli
158 965 d/G/-ogonowego pBR322 w końcowej objętości 50 μ\ w tej samej mieszaninie do łączenia, opisanej w powyższej części opisu. Mieszaniny reakcyjne do łączenia inkubowano w temperaturze 65°C w ciągu 3 minut, a następnie w temperaturze 42°C w ciągu 2 godzin i pozwolono na powolne ochłodzenie do temperatury pokojowej.
Zbiorem cDNA po łączeniu transformowano kompetentną E. coli LE392 (ATCC 33572) przygotowaną jak następuje. Inokulum LE392 hodowano przez noc w temperaturze 37°C w podłożu 2 X LB. 5 ml tej całonocnej hodowli posiano 200 ml świeżego podłoża 2 X LB i hodowano do osiągnięcia ODeoo 0,2-0,3 w temperaturze 37°C. Hodowlę tę umieszczono na lodzie na 10 minut następnie zebrano komórki za pomocą odwirowania w temperaturze 4°C. Osad komórek zawieszono ponownie w 80μ1 0,1 M CaCU o temperaturze lodu i inkubowano w ciągu 25 minut w temperaturze 4°C. Komórki zebrano za pomocą odwirowania wuemperaturze 4°C, osad komórek ponownie zawieszono w 2 ml 0,i M CaCh o temperaturzelodu i inkubowano w ciągu co najmniej 2 godzin w temperaturze 4°C przed użyciem. Następnie stosowano do transformacji 200 μ1 kompetentnych komórek na 50μ1 mieszaniny do łączenia. Kompetentne komórki i DNA połączono i inkubowano w temperaturze około 4°C w ciągu 10 minut, następnie w 37°C w ciągu 5 minut i ostatecznie umieszczono na lodzie na 10 minut. Do mieszaniny transformacyjnej dodano taką samą ilość podłoża 2 X LB i inkubowano w temperaturze 37°C w ciągu 45 minut. Transformowane komórki wysiano na płytki przy 250μ1/ρ^1^ 150mm z 2XLB zawierającym ^^^tig/ml tetracykliny. Płytki inkubowano w temperaturze 37°C w ciągu 24 godzin i przechowywano w temperaturze 4°C.
Filtry-repliki przygotowano przez przyciśnięcie filtrów nitrocelulozowych do oryginalnych filtrów użytych do podniesienia kolonii z płytki. Te filtry-repliki inkubowano na płytkach z
X LB-Tet (15gg/ml tetracykliny). Kolonie na filtrach przygotowano do sondowania przez przeniesienie filtrów na płytki z 2 X LB-Tet zawierającym ^^(^y/fg//ml chloramfenikolu, inkubację filtrów w temperaturze 37°C przez co najmniej 12 godzin, a następnie lizowanie kolonii przy unoszeniu się filtrów, w zbiorniku, na roztworze wodnym stanowiącym 1,5 M NaCl i 0,5 M NaOH w ciągu 10 minut. Następnie filtry zobojętniono przy unoszeniu się ich, w zbiorniku, na roztworze wodnym stanowiącym 1,5 M NaCl i 0,5 M Tris (pH 7,4) w ciągu 15 minut, powtarzając tę neutralizację. Następnie filtry osuszono na powietrzu i ostatecznie pod zmniejszonym ciśnieniem w ciągu 2 godzin w temperaturze 70°C.
Przykład IV. Hybrydyzacja kolonii.
Filtry nitrocelulozowe wysuszono pod zmniejszonym ciśnieniem zawierające zbiór cDNA (otrzymany jak opisano w poprzednim przykładzie) przygotowano do hybrydyzacji w temperaturze 42°C w ciągu 5 godzin w buforze przedhybrydyzacyjnym. Filtry wyjęto z buforu przedhybrydyzacyjnego i lekko potarto ręką w rękawiczce, w 5 X SSPE w celu usunięcia komórkowego debris. Filtry umieszczono w buforze do hybrydyzacji (taki sam jak bufor przedhybrydyzacyjny z wyjątkiem 1 X roztworu Denhardta). Albo jednoniciowy cDNA znakowany 32P (106 zliczeń/min/ml) albo końcowo-znakowany poliA + RNA poddano hybrydyzacji z filtrami w ciągu 17 godzin w temperaturze 42°C. Po hybrydyzacji filtry przemyto krótko 2 X SSPE w temperaturze 22°C, a następnie dwukrotnie 0,1 XSSPE w 'temperaturze 65°C, każdorazowo w ciągu 10 minut.
Końcowo-znakowany poli A + mRN A otrzymano za pomocą dodania do 2pg poli A + RN A 50 mM Tris (pH 9,5) do objętości 50μ1, po czym całość ogrzewano do temperatury 100°C w ciągu 3 minut i szybko ochłodzono na lodzie. Ten roztwór RNA rozcieńczono do końcowej objętości 200μ1 i doprowadzono do stężenia 5)mM TriS^(pH9,5), 10 mM MgCL, 10 mM DTT z 50pmolami 32P-<a-ATP. Dodano 10 jednostek kinazy polinukleotydowej T4 (Boehringer Mannheim), po czym mieszaninę inkubowano w temperaturze 37°C w ciągu godziny. Reakcję z zastosowaniem kinazy zakończono za pomocą dodania 10 μ1 0,5 M EDTA, ekstrahowano układem fenoL/chloroform/alkohol izoamylowy i poddano chromatografii na Sephadex G50 w celu usunięcia nie włączonego promieniotwórczego piętna.
Przykład V. Hybrydyzacja Northerna.
Dwa do pięciu mikrogramów poliA + mRNA ogrzewano w temperaturze 65°C w ciągu 5 minut w 10 mM buforze z fosforanem sodowym (pH7,4) zawierającym 50% formamidu, 2,2M formaldehyd i 0,5 mM EDTA. Powstały roztwór ochłodzono do temperatury pokojowej i dodano
158 965 odpowiednią ilość (na ogół około 0,2 objętości w odniesieniu do objętości potraktowanej próbki) w 5 X buforze dla próbki (0,5% SDS, 0,025% błękit bromofenolowy, 25% gliceryna, 25 mM EDTA). Próbki naniesiono na 1,5% żel agarozowy przygotowany w 10 mM buforze zfosforanem sodowym (pH7,4) zawierającym 1,1 M formaldehyd i poddano elektroforezie w tym samym buforze. Żel zabarwiono oranżem akrydynowym (33 pg/ml) w 10 mM buforze z fosforanem sodowym (pH 7,4), odbarwiono i namoczono że w tym samym buforze w ciągu 10 minut, namoczono w 10XSSPE przez co najmniej 10 minut i przeniesiono RNA na nitrocelulozę jak opisano w przykładzie VI.
Przykład VI. Wyodrębnianie genomowego DNA i klony.
Genomowy DNA Pichia wyodrębniono stosując metodę opisaną w przykładzie II, dotyczącą wyodrębniania RNA Pichia. Osad kwasu nukleinowego zawieszono ponownie w minimalnej ilości buforu TE i inkubowano z RNAazą A w stężeniu 20pg/ml w ciągu 30 minut w temperaturze 37°C. Roztwór doprowadzono NaCl do stężenia 0,14 M i działano na niego proteinazą K w stężeniu 200pg/ml w ciągu 15 minut w temperaturze 22°C. Powstały roztwór najpierw wyekstrahowano układem fenol/chloroform/alkohol izoamylowy, następnie układem chłoroform/alkohol izoamylowy i ostatecznie poddano wytrąceniu etanolem. Wytrącony DNA zawieszono ponownie w minimalnej ilości buforu TE i wirowano w celu sklarowania roztworu DNA.
Λ/g genomowego DNA Pichia, otrzymanego jak opisano w uprzednim paragrafie, trawiono różnymi enzymami restrykcyjnymi (BRL) i poddano elektroforezie w 1% żelu agarozowym zawierającym TAE. Fragmenty DNA w żelu denaturowano za pomocą namaczania żelu w 1,5 M NaCl, 0,5 M NaOH w ciągu 20 minut. Żel zobojętniono za pomocą namaczania żelu w 1,5 M NaCl, 0,5 M Tris (pH7,4) w ciągu 20 minut. Przed przeniesieniem żel namoczono w 10XSSPE w ciągu co najmniej 5 minut. Arkusz celulozy pocięto dopasowując do wielkości żelu, zwilżono wodą i namoczono krótko w 10XSSPE. Filtr położono na wierzchu żelu, który z kolei położono na kawałku parafilmu. Arkusz bibuły Whatmana i stos papierowych ręczników położono na wierzchu nitrocelulozy w celu wyciągnięcia DNA z żelu i przeniesienia go na nitrocelulozę. Na stosie umieszczono ciężarek w celu ułatwienia przeniesienia. Pozwolono na przenoszenie się DNA w ten sposób w ciągu co najmniej 3 godzin. Po przeniesieniu namoczono krótko filtr w 5X SSPE, suszono na powietrzu, a następnie pod zmniejszonym ciśnieniem w temperaturze 70°C w ciągu 2 godzin. Komplementarne fragmenty genomowe identyfikowano przez hybrydyzację z klonami cDNA pPC 8,0, pPC 6,4 i pPC 15,0 poddanymi translacji typu nick, stosując te same bufory: przedhybrydyzacyjny, hybrydyzacyjny i do przemywania, co opisano w przykładzie IV.
200 ng klonów cDNA poddano translacji typu nick w ciągu 90 minut w temperaturze 14°C w 30 pl roztworu zawierającego 50 mM Tris-HCl (pH 7,4), 10 mM MgSO4, 100pM DTT, 50pg/ml BSA, 20pM każdy z dGTP, TTP i dATP, 31,25 pmoli 32P-a-dCTP (320 Ci/mmol, NEN), 2 jednostki PoUDNA E. coli (BRL) i 0,02 ngDNAazy I. Reakcję zakończono za pomocą dodania 1 pl 0,5 M EDTA i 1pl 20% SDS. Znakowany roztwór DNA doprowadzono NaOH do końcowego stężenia 0,3 i umieszczono we wrzącej wodzie na 3 minuty. Mieszaninę tę poddano chromatografii na kolumnie Sephadex G50. Znakowane frakcje DNA połączono, oznaczono aktywność właściwą i użyto sondy w eksperymentach hybrydyzacyjnych.
Fragmenty genomowe hybrydyzujące z sondami cDNA wyodrębniono za pomocą trawienia 200pg genomowego DNA Pichia różnymi enzymami restrykcyjnymi (BRL) i produkt trawienia poddano elektroforezie w 1% żelu agarozowym w buforze TAE. Pasmo odpowiedniej wielkości wycięto z żelu, DNA poddano elektroelucji, przeprowadzono przez kolumnę Elutip (Schleicher i Schuell) i poddano wytrąceniu etanolem.
Fragmenty po elektroelucji zawieszono ponownie w wodzie i 200 ng fragmentów ligowano z 500 ng pBR322 rozszczepionego w odpowiednim miejscu restrykcyjnym i defosforylowancgo, gdy było to niezbędne. Reakcję ligowania prowadzono w 300pl 66 mM Tris (pH7,4) zawierającym 6j5mM MgCL, lOmM DTT, 0,4mM ATP, 25pg/ml BSA i 40-80 jednostek ligazy DNA T4, a następnie inkubowano w temperaturze 4°C w ciągu 24 godzin. Mieszaninę po ligacji transformowano bezpośrednio kompetentne komórki E. coli LE392. Komórkom nadano kompetencję i transformację przeprowadzono tak, jak to opisano w powyższym przykładzie III. Przeprowadzono serie trzech transformacji z 10, 40 i 100 ng pBR322 (plus insert), każda transformacja w 100pl kompetentnych komórek. Komórki wysiano na płytki sposobem opisanym w przykładzie III, z tą
158 965 różnicą, że selekcję antybiotyczną przeprowadzono z 50 pg/ml ampicyliny. Klony przeniesiono na nitrocelulozę·, 'wykonano repliki i przygotowano do hybrydyzacji jak opisano w przykładzie III. Filtry sondowano z odpowiednimi fragmentami cDNA poddanymi translacji typu nick. Kolonie oczyszczone przez rozrysowanie, które okazały się pozytywne w hybrydyzacji, stosowano do otrzymywania dodatkowych plazmidów jak następuje:
E. coli LE392 niosącą plazmid hodowano do Οϋεοο 1,0 w 1 X podłożu LB, zawierającym 50£g/ml ampicyliny i amplifikowano przez noc za pomocą dodania chloramfenikolu do końcowego stężenia 200pg/ml. Komórki przemyto 0,8% NaCl, 20 mM Tris (pH 8,0) mM EDTA, a następnie poddano działaniu lizozymu w 25% sacharozie, 50 mM Tris (pH7,4) i 20 mM EDTA z 450//g/ml lizozymu. Lizę osiągnięto za pomocą dodania 5M NaCl do końcowego stężenia 2M, dodając następnie taką samą objętość 0,2% Triton-X-100 i 40 mM EDTA. Preparat klarowano za pomocą odwirowania przy 20000 obr/min w ciągu 45 minut. Supernatant ekstrahowano układem fenol/chloroform/alkohol izoamylowy, a następnie układem chloroform/alkohol izoamylowy. Dodano stały CsCl do końcowego stężenia 800pg/ml, a EtBr do końcowego stężenia 1 mg/ml. Powstały roztwór wirowano w wirniku Vti przy 49000 obr/min w ciągu 18-20 godzin, w temperaturze 20°C. .
Pasmo plazmidu uwidoczniono przez fluorescencję UV i odciągnięto z probówki stosując igłę i strzykawkę. Roztwór plazmidu wyekstrahowano n-butanolem czterokrotnie i poddano wytrąceniu etanolem w temperaturze -20°C. Wvtrącanie etanolem powtórzono co najmniej dwukrotnie w celu usunięcia całego CsCl. Plazmid przechowywano w temperaturze -20°C i wytrącono etanolem.
Przykład VII. Oczyszczanie oksydazy alkoholowej.
Próbki białka z komórek Pichia pastoris wyhodowanych na metanolu, jak opisano w przykładzie I przygotowano za pomocą lizy komórek drożdży, w następnie klarującego wirowania w celu usunięcia komórkowego debris, jak następuje. Część wycieku z k,ądzi fermentacyjnej pobrano i doprowadzono wodorotlenkiem amonowym do pH7,5, homogenizowano w Dyno-Mill model KDL stosując 0,61 naczynie., w operacji ciągłej, w temperaturze 30?C, z zastosowaniem kombinacji pasów nr 3 i przepływu 20-30 ml/godz. Jako kulki w młynie stosowano wolne kulki szklane o średnicy 0,3-0,5 mm. Otrzymany homogenat wirowano w temperaturze 5°C, 20000 X g, w ciągu 30 minut, do uzyskania supernatantu wolnego od komórek.
Sześć 130 ml porcji supernatantu wolnego od komórek umieszczono w woreczkach dializacyjnych z octanu celulozy i dializowano w temperaturze 5°C wobec 8 litrów wody destylowanej. Po 4 dniach zdekantowano fazę wodną z każdego woreczka. Na materiały stałe pozostające w każdym woreczku składały się dwa typy materiału stałego. Cienką górną warstwę starannie usuwano i odrzucano. Osad z dna miał barwę brunatno-żóltą i stanowił krystaliczną oksydazę alkoholową. Część krystalicznej oksydazy alkoholowej rozpuszczono w wodzie destylowanej (około dziesięciokrotna objętość materiału stałego). Badanie metodą barwnik-paroksydaza wykazało aktywność 94 jednostek enzymatycznych/ml. Aktywność właściwa oksydazy alkoholowej wyniosła 10,4 jednostek enzymatycznych bialka/mg.
Krystaliczny osad otrzymany w wyniku dializy wyżej opisanej, dializowano znowu wobec 0,05 m buforu z fosforanem potasowym (pH7,5) i naniesiono na kolumnę 2X200 cm z Sepharyl 200 (Pharmacia) zrównoważoną tym samym buforem. Zebrano frakcje 3,5 ml przy szybkości przepływu 10 ml/godz i badano pod względem aktywności oksydazy alkoholowej.
Aktywność oksydazy alkoholowej w odniesieniu do reakcji z metanolem oznaczono metodą następującą (metoda barwnik-peroksydaza). Mieszaninę barwnikrbufor przygotowano przez zmieszanie 0,1 ml roztworu odwuanizydyny (1% wagowy odwuanizydyny w wodzie) z 12ml napowietrzonego 0,1 M buforu z fosforanem sodowym (pH 7,5). Mieszaninę reakcyjną przygotowano z 2,5 ml mieszaniny barwnik-bufor, 50μ1 metanolu, , 10μ1 roztworu peroksydazy (lmg peroksydazy z chrzanu, Sigma, typ II) i 25μ1 roztworu oksydazy alkoholowej. Mieszaninę reakcyjną utrzymywano w temperaturze 25°C w kuwecie 4· X 1X 1cm i-rejestrowano wzrost absorbancji barwnika przy 460 mm w ciągu 2-4 minut. Aktywność enzymu obliczono ze wzoru:
ΔΑ
Aktywnośc/Amole/rnin/ml lub jednostki enzymatyczne/ml = _ XI 1,5 min
158 965 35 w którym 11,5 oznacza czynnik oparty o krzywą standardową otrzymaną z użyciem znanych próbek H2O2, a ΔΑ oznacza zmianę, absorbancji w czasie trwania eksperymentu.
Badano również ogółem 0,1 j/g białka całkowitego z każdej frakcji pod względem zawartości oksydazy alkoholowej za pomocą elektroforezy żelowej w SDS-poliakryloamidzie (12%).
Przykład VIII. Oznaczanie sekwencji DNA i białka.
Oznaczanie sekwencji DNA przeprowadzono metodą dwudezoksy-zakończenia łańcucha stosując bakteriofag M13 (Sanger i wsp., 1980), albo metodą chemicznej modyfikacji (Maxam i Gilbert, 1980). Fragmenty DNA odpowiadające końcowi 5' genu oksydazy alkoholowej wprowadzono do wektorów M13mp8 i M13mp9, lub znakowano końcowo do metody modyfikacji chemicznej, używając miejsc enzymów restrykcyjnych dostępnych w tym regionie.
Fragment Hindlll/Sall o 710 parach zasad z pPG4,0 znakowano końcowo do analizy sekwencji metodą Maxama-Gilberta najpierw przez strawienie 33 pg plazmidu za pomocą Hindlll. Mieszaninę reakcyjną ekstrahowano układem fenol/chloroform/alkohol izoamylowy, a następnie chloroform/alkohol izoamylowy i poddano wytrącaniu etanolem. DNA zebrano przez odwirowanie i zawieszono ponownie w 31 μΐ wody. 10(^Ci32P-a-dCTP (3200 Ci/mmol) i 2 jednostki fragmentu Klenowa Poll DNA dodano do mieszaniny reakcyjnej, w końcowej objętości 50/1, zawierającej 40(^MdATP, 400μΜ dGTP, 50 mM Tris (pH7,4), 1mM MgsO4 i 1mM DTT. Mieszaninę reakcyjną inkubowano w temperaturze 37°C w ciągu godziny i reakcję zatrzymano za pomocą dodania 2μ1 0,5 M EDTA. Mieszaninę wyekstrahowano układem fenGo/chloroform/alkohol izoamylowy, a następnie układem chloroform/alkohol izoamylowy poddano chromatografii na kolumnie z Sephadex G-50, połączono frakcje zawierające znakowany kwas nukleinowy i poddano wytrącaniu etanolem. Po odwirowaniu osad DNA zawieszono ponownie w wodzie i trawiono Sali. Mieszaninę po trawieniu poddano elektroforezie w 1% żelu agarozowym w buforze TAE, wycięto z żelu pasmo o 710 parach zasad i poddano DNA elektroelucji i wytrącaniu etanolem. Fragment zawieszono ponownie w 100μΙ buforu TE, doprowadzono octanem amonu do stężenia 2,5 M i poddano wytrącaniu etanolem. Utworzony fragment DNA zawieszono ponownie w buforze TE w stężeniu 50000 zliczeń/min/μΐ.
Cztery reakcje modyfikacji zasad przeprowadzono jak następuje: a) Mieszaninę reakcyjną G (guanina) inkubowano w ciągu 8 minut w temperaturze 22°C. Zawierała ona 1 μΐ (50000 zliczeń/min) znakowanego fragmentu .DNA, 4/1 wody, 200μΐ 50 mM kakodylanu sodowego, pH8,0 i 1 mM EDTA bufor DMS i 1/1 siarczanu metylu. Reakcję zakończono za pomocą dodania 50/1 buforu stop DMS zawierającego 1,5 M octan sodowy (pH 7,0) i 1 M 2-merkaptoetanol i tRNA, następnie dodano 750/1 etanolu i mieszaninę reakcyjną utrzymywano w temperaturze -70°C w ciągu co najmniej 15 minut, b) Mieszaninę reakcyjną G/A (guanina/adenina) inkubowano w ciągu 10 minut w temperaturze 22°C. Zawierała ona 2/1 (100000 zliczeń/min) znakowanego fragmentu DNA, 8/1 wody i 30/1 kwasu mrówkowego. Reakcję zakończono za pomocą dodania 200μΐ buforu stop Hz (0,3 M octan sodowy pH 5,5,0,1 M EDTA i 25/1 tRNA), następnie dodano 750/1 etanolu i utrzymywano mieszaninę reakcyjną w temperaturze -70°C w ciągu co najmniej 15 minut, c) Mieszaninę reakcyjną T/C (tymina/cytozyna) inkubowano w ciągu 10 minut w temperaturze 22°C. Zawierała ona 2/1 (100000 zliczeń/min) znakowanego fragmentu DNA, 18/1 wody i 30/1 hydrazyny. Reakcję zakończono jak to opisano w p. b) powyżej, d) Mieszaninę reakcyjną C (cytozyna) inkubowano w ciągu 10 minut w temperaturze 22°C. Zawierała ona 1 /1 (50000 zliczeń/min) znakowanego fragmentu DNA, 4/1 wody, 15/1 5 M NaCl i 30/fhydrazyny. Reakcję zakończono w sposób opisany w p. b) powyżej.
Osady DNA zebrano za pomocą odwirowania, ponownie zawieszono w 250/1 0,3 M octanu sodowego, pH 5,5 i poddano wytrącaniu etanolem za pomocą 750/195% etanolu. Osady zebrano za pomocą odwirowania, osuszono pod zmniejszonym ciśnieniem w ciągu 5 minut i rozszczepiono DNA za pomocą ponownego zawieszenia osadów w 100/1 piperydyny rozcieńczonej w stosunku objętościowym ł do 10. Mieszaninę reakcyjną do rozszczepienia inkubowano w temperaturze 90°C w ciągu,30 minut i reakcję zakończono za pomocą dodania 500/1 98% etanolu, 60 mM octanu sodowego (pH 5,5) i 1^)^j^^ml tRNA. Mieszaninę reakcyjną umieszczono w łaźni suchy lód/etanol (około -70°C) na około 5 minut i fragmenty DNA zebrano za pomocą odwirowania. Fragmenty zawieszono ponownie w 50/1 0,3 M octanu sodowego (pH5,5) i poddano wytrącaniu etanolem
158 965 przy użyciu ΙΟΟμΙ 95% etanolu. To wytrącanie etanolem powtórzono, osady przemyto 95% etanolem i odparowano pod zmniejszonym ciśnieniem w trakcie wirowania. Osad zawieszono ponownie w ΙΟμΙ 80%formamidu, lOmMNaOH, 1 mMEDTA,0,l% xylenecyanol i 0,1% błękitu bromofenolowego. 2-3 μΐ poddano elektroforezie w 10% żelu poliakryloamidowym o grubości 0,4 mm, w buforze TBE.
Sekwencję aminokwasów oksydazy alkoholowej oznaczono przy użyciu Sequemat, Inc. (Watertown, Mass.) z zastosowaniem 2 mg oczyszczonej oksydazy alkoholowej z Pichia pastoris. Pierwszych 18 aminokwasów dojrzałego białka oznaczono jako:
Ala-Ile-Pro-Glu-Glu-Phe-Asp-Ile-Leu-Val-Leu-Gly-Gly-Gly-Ser-Gly-Ser.
Przykład IX. Oznaczenie miejsca inicjacji transkrypcji oksydazy alkoholowej.
W celu ustalenia, gdzie umiejscowiony jest start mRNA oksydazy alkoholowej, przeprowadzono ekspryment wydłużania z użyciem primera, stosując syntetyczny oligonukleotyd, skopiowany z sekwencji DNA końca 5' genu oksydazy alkoholowej jako primer i 10pg poli A + mRNA Pichia pastoris jako matrycę. 10μg poli A + mRNA Pichia pastoris połączono z 3μg primera (5' -CTT CTC AAG TTG TCG-3') w końcowej objętości 9,3 μ\ 43 mM NaCl, 29,2 mM Tris (pH 8,3), 5,2 mM MgCb i 4,3 mM DTT. Kwasy nukleinowe denaturowano w temperaturze 70°C w ciągu 5 minut i połączono ponownie dopuszczając do powolnego ochłodzenia do temperatury 22°C. Mieszaninę po ponownym połączeniu dodano do probówki zawierającej 4μ1 mieszaniny dNTP, 0,8μ1 buforu RT i 1μΐ 32P-a-dCTP (800 Ci/mmol). 3μ1 tej mieszaniny dodano do Ιμΐ każdego odpowiedniego dNTP. 3 μΐ końcowej mieszaniny dodano do 1 μΐ wody. Reakcje rozpoczęto przez dodanie 1μΐ rozcieńczonego RT i inkubowano w temperaturze 42°C w ciągu 15 minut. Reakcje przyspieszono za pomocą 3 μΐ zestawu RT i prowadzono w temperaturze 42°C w ciągu 15 minut. Reakcje zatrzymano za pomocą dodania 7,5 μΐ formamidowej mieszaniny barwiącej i 4-5 μΐ poddano elektroforezie w żelu‘gradientowym o grubości 0,4 mm w 1 ΧΤΒΕ. Po elektroforezie żel utrwalono w 10% kwasie octowym w 10% metanolu w ciągu 20 minut. Żel osuszono pod zmniejszonym ciśnieniem i stosowano do ekspozycji na film rentgenowski XAR.
Żel gradientowy przygotowano w sposób następujący: 300μΐ 10% nadsiarczanu amonowego i 14μΐ TEMED dodano do 30 ml żelu górnego; 75 μΐ 10% nadsiarczanu amonowego i 3,5 μΐ TEMED dodano do 7 ml żelu dolnego, 6 ml żelu górnego wessano do pipety, a następnie 6 ml żelu dolnego wessano do tej samej pipety. Żel wprowadzono między dwie płytki żelowe, a następnie 22 ml żelu górnego.
Przykład X. Hybrydyzacja-selekcja mRNA i translacja in vitro.
Pozytywne eksperymenty hybrydyzacji-translacji wykonano przez przeprowadzenie 12μg klonowanego genomoweggONA Pichia (otrzymanego sposobem opisanym w powyższym przykładzie VI) w postać liniową za pomocą -trawienia rozmaitymi endonukleazami restrykcyjnymi. DNA ten zdenaturowano za pomocą - doprowadzenia roztworu przy użyciu NaOH do stężenia 0,3 M i inkubacji w temperaturze 65°Ć w ciągu 10 minut. Roztwór zawierający zdenaturowany DNA oziębionoszybko na lodzie i zobojętniono za pomocą doprowadzenia Tris-HCl do stężenia 0,5 M (pH 7,4). Do zdenaturowanego DNA, bezpośrednio przed związaniem DNA z filtrami nitrocelulozowymi, dodano taką samą ilość 20 X SSPE. Przed naniesieniem DNA na filtry nitrocelulozowe (Schleicher i Schuell BA83, średnica 9 mm) filtry te przygotowano za pomocą zwilżenia wodą, gotowania w ciągu 10 minut i trzykrotnego przemycia 10 X SSPE. Następnie doprowadzono do związania z każdym filtrem 11^g DNA za pomocą naniesienia DNA na filtr, suszenia na powietrzu i ostatecznego wysuszenia filtrów pod zmniejszonym ciśnieniem w temperaturze 70°C w ciągu 2 godzin.
Przed prehybrydyzacją filtry ze związanym DNA umieszczono w 1 ml jałowej wody i ogrzewano w ciągu 1 minuty w temperaturze 100°C, po czym oziębiono na lodzie, przemyto przez obracanie w l ml jałowej wody i przemyto 1 ml buforu przedhybrydyzacyjnego. Filtry poddano prehybrydyzacji w 1 ml buforu przedhybrydyzacyjnego, po czym dodano bezpośrednio do buforu przedhybrydyzacyjnggo 40μg (2μg/ml ETS)poli A + mRNA. Mieszaninę hybrydyzacyjną ogrzewano w temperaturze 65°C w ciągu 10 minut, a następnie inkubowano w temperaturze 42°C w ciągu 24 godzin.
Po hybrydyzacji filtry przemyto krótko, dwukrotnie 1 XSSPE zawierającym 0,5% SDS w temperaturze 22°C, siedmiokrotnie 1 X SSPE zawierającym 0,5% SDS w temperaturze 50°C w
158 965 37 ciągu 5 minut za każdym razem, trzykrotnie 0,1 X SSPE w temperaturze 50°C w ciągu 5 minut za każdym razem i raz 0,1 X SSPE w temperaturze 65°C w ciągu 10 minut. RNA eluowano z filtrów za pomocą gotowania w ciągu 1 minuty w 300μ1 H2O zawierającej 15 ^g tRNA z wątroby królika. Wyeluowany RNA szybko zamrożono w łaźni suchy lód/etanol. Dopuszczono do ogrzania się mieszaniny RNA do temperatury pokojowej i usunięto filtry. Następnie poddano mieszaninę RNA precypitacji za pomocą doprowadzenia podłoża octanem amonowym do stężenia 2,5 M i dwukrotnego wytrącenia etanolem i ostatecznie zawieszono ponownie w 100μ1 H2O po czym dokonano liofilizacji.
Translację przeprowadzono technikami standardowymi znanymi fachowcom, takimi jak podane w instrukcjach załączonych do zestawów do translacji in vitro z zastosowaniem lizatu króliczych retikulocytów (New England Nuclear). Produkty białkowe poddano elektroforezie w 8% żelach poliakryloamidowych zawierających 4,5% żel zagęszczający.
Przykład XI. Otrzymywanie immunosurowic i immunoprecypitacja.
Immunosurowice powstające u królików przeciw ek^t^i^^l^towi z komórek Pichia pastoris zawierających polipeptydy zarówno p72 (dehydrogenaza alkoholowa) jak i p76, otrzymano stosując standardowe sposoby postępowania. Ekstrakty dializowano przed wstrzyknięciem wobec PBS. W okresie 8 tygodni każdy królik otrzymał 3 wstrzyknięcia składające się z 1 mg białka całkowitego w objętości 0,1 ml wraz z 0,2 ml kompletnego adiuwantu Freunda. Wstrzyknięcie przeprowadzono śródskórnie w 6-10 miejscach ciała królika. Przy końcu 8 tygodnia króliki skrwawiono i surowice ich badano wobec oczyszczonej oksydazy alkoholowej Pichia pastoris metodą podwójnej dyfuzji Ouchterlonny'ego.
Oczyszczone przeciwciała królika przeciw p72 (oksydaza alkoholowa) i przeciw białku p76 otrzymano za pomocą chromatografii powinowactwa pełnych immunosurowic na kolumnach z Sepharose 4B (Pharmacia) ze związanym przez zastosowanie CNBr p72 (oksydaza alkoholowa) i p76. 1 g żelu aktywowanego CNBr przygotowano za pomocą uwodnienia żelu w ciągu 15 minut w 200 ml 1 mM HC1, a następnie przemyto 3 razy po 50 ml buforu wiążącego [0,1 mM węglan sodowy (pH 8,0) i 0,5 M NaCl]. 5 ml roztworu p72-p76 w stężeniu 6 mg/ml w buforze wiążącym dodano do żelu i łagodnie mieszano przez noc w temperaturze 4°C. Nie związane białko usunięto za pomocą przemycia 3 razy po 50 ml buforu wiążącego. Pozostałe grupy aktywne eliminowano za pomocą 2-godzinnej inkubacji w 1 M etanoloaminie (pH 8). Materiał nie związany kowalencyjnie usunięto z żelu za pomocą przemycia 50 ml 2 M tiocyjanianu w PBS. Przed chromatografią immunosurowic, żel ostatecznie przemyto 3 razy po 50 ml PBS. 5 ml sklarowanych immunosurowic przeciw p72-p76 mieszano z żelem i inkubowano z łagodnym mieszaniem w ciągu 2 godzin w temperaturze 4°C. Mieszaninę immunosurowice-żel wpipetowano następnie do kolumny 1X 8 cm i przemyto 150 ml PBS. Oczyszczone przeciwciało eluowano z kolumny 6 ml 2 M tiocyjanianu sodowego w PBS. Po elucji z żelu oczyszczone przeciwciało dializowano ekstensywnie wobec PBS, który zawarto 0,02% azydku sodowego.
Immunosurowice oczyszczone przez powinowactwo dodano do mieszaniny do translacji in vitro w PBS, 1% NP40 i inkubowano przez noc w temperaturze 40°C. Kompleks antygenprzeciwciało wytrącono przy użyciu Pansorbin (Calbiochem) na lodzie w ciągu 2 1/2 godziny. Pansorbin przygotowano za pomocą przemycia w buforze RIPA. Precypitaty pansorbinowe przemyto 4 razy buforem RIPA i rozpuszczono przed elektroforezą w buforze do nanoszenia Laemmli.
Przykład XII. Sposób postępowania przy transformacji Pichia pastoris.
A. Wzrost komórki.
1. Kolonią Pichia pastoris GS115 (NRRL Y-15851) inokulowano około 10 ml podłoża YPD i prowadzono hodowlę wstrząsaną w ciągu 12-20 godzin w temperaturze 30°C.
2. Po upływie około 12-20 godzin komórki rozcieńczono do Οϋβοο około 0,01-0,1 i utrzymywano je w logarytmicznej fazie wzrostu w podłożu YPD w ciągu około 6-8 godzin w temperaturze 30°C.
3. Po upływie około 6-8 godzin 100 ml podłoża YPD inokulowano około 0,5 ml hodowli posiewowej do Οϋεοο około 0,1 (lub ilości równoważnej). Prowadzono hodowlę wstrząsaną w ciągu około .12-20 godzin w temperaturze 30°C.
158 965
4. Zebrano komórki przy uzyskaniu OD6oo około 0,2-0,3 (po upływie około 16-20 godzin) za pomocą oZwizownnin paay 1500 X o, w ciągu 5 minzt.
B. Otaaymywnnib sferoplnstów.
1. Komórki przemyto zna 60 ml jnłowej wody. (Wszystkie opeancje wizownnin w ktnZinch 6-5 paownZaono paay 1500 Xg, w ciągu 5 minzt).
0. Komórki przemyto zna 10 ml świeżo pzayoktkwnneok SED.
3. Komórki przemyto 0 X 10 ml jnłoweoo 1 M sorbitu.
4. Znwiekaono komórki ponownie w 10 ml buforu SCE.
5. DoZnno 5- 10μ1 4mo/ml aymkliaay -0000 (Miles Larkzntkribk). Komórki inkprkwnnk w tempernlui^ae 30°C w ciągu około 30--0 minut.
Poniewnż ktraymywnnib sferoplnstów jest krytycanym stnZium w procesie trnnsformncji, tworaeme się ich nnleżnlo śleZaić w nnstępujący sposób. 100pl próbki komórek ZoZnno Zo 900/6 5% SDS i 900μΙ 1 M sorbitu, praeZ, lub beapośrednio po ZoZnniu aymoiińay w różnych cansnch poZcans okresu inkubncji. Inkubn-cję antraymnno w momencie, gZy komórki uległy liaie w SDS, nle nie w sorbicie (anawycanj mięZay 30 n -0 minutą inapbacji).
-. Praemyto sferkplasty 0 rnay po 10 ml jnłoweoo 1 M sorbitu an pomocą wirkwania pray 1000 X g w ciągu 5-10 minut. (Cans i szybkość wizkwnnia mogą się różnić, oZwirowywnć nnleży w stopniu wystarcanjącym Zo ksnZabnin sferoplnstów, nle nie naZmibrnym, powodującym pęknnie sferoplnstów poZ wpływem siły).
7. Komórki pzabmytk rna 10 ml jnlowego CnS.
8. Komórki anwiesaono w cnlości w 0,- ml CnS.
C. Transformncjn.
1. Do jnłowych probówek polipropylenowych ZoZnno próbki DNA (o objętości Zo 00/6). (DNA powinien anajZkwnć się w woZaie lub buforae TE, Zln paysannia maksymalnej caęstości tznnsfkrmacji mnlymi ilościnmi DNA. Wsknanne jest ZkZani& Zo aażZej próbki około 1//15 mg/ml nnZźwięakwikneok DNA E. coli).
0. DoZnno Zo knżZej próbki DNA 100//I sferoplnstów i prownZaono inkubncję w tempernturae pokojowej w ciągu około 00 minut.
3. Do knżZej próbki ZoZnno 1 ml akatwkap PEG i prownZaono inkubn^ę w temperatura pokojowej w ciągu około 15 minut.
4. OZwiakwank próbki pray 1000 Xg w ciągu 5-10 minut i aZekantkwank akatwór PEG.
5. Znwiesaono próbki w 150/1 SOS i prownZaono inkubn^ę w ciągu 30 minut w temperatura pokojowej.
-. DoZnno 850/1 jnłowego 1 M sorbitu i określone caęści próbek wysiewnno nn płytki jnk wyżej opisnno.
D. Regeneracjn sferoplnstów.
1. Prapis nn poZłoże: Agnr regeneracyjny
n. Agm-sorbit: 9g Bactk-agaz, 54,- g sorbitu, 040 ml H0O, nutkklawkwnnk.
b. 10 g glukoan: 00 g glpakyy, 100 ml woZy, nptkalnwkwank.
c. 10XSC: -,75 g Yenst Nitrogen Bnse bea nminokwnsów, 100 ml H0O, nutkalawkwank. (PraeZ, nlbo po autkalnwkwnnip ZoZnno jaaiaklwiek żąZnny aminkkwns lub kwns nukleinowy Zo stężenin ^^(^/Lłg^ml).
Z. DoZnno 30 ml 10 X Giukoay i 30 ml 10 X SC Zo 040 ml akatkpikneok rkatwkzp noar-sorbit. DoZnno 0,- ml 0,0 mg/ml biotyny i jnaiaklwiea inny pożąZnny nminkawas lub kwns nukleinowy Zo stężenin ^^/ιο·//01. Roatopiony ngnr regeneracyjny ptzaymywank w tempernturae 55--0°C.
0. Wysiewnnie próbek transformncyjnych nn płytki.
Nn co najmnibj 30 minut paaeZ gotowością próbek transformncyjnych, nn knżZą płytkę wylnno wnrstwę ngnru Zolnego jnko 10 ml nomu regeneracyjnego. RoaZaielono 10 ml próbki nomu regeneracyjnego Zo probówek w łnźni woZnej o temperatpzab 45-50°C w okresie, gZy próbki transform^yj^ poaostnwnly w SOS. Określone caęści wyżej opisnnych próbek transformncyjnych ZoZnno Zo probówek a nonrem regeneracyjnym i wylnno nn wnrstwę ngm^u Zolnego nn płytknch. Objętość aażZej próbki uaupbłniknk Zo 10 ml stopionym ng^em regeneracyjnym utraymywanym w temperatur^ae 45-50°C i knżZą próbkę wylnno nn płytkę a aestaloną 10 ml wnrstwą ngn^ Zolnego.
158 965
3. Określenie jakości preparatu sferoplastów.
Pobrano lOplzjednej próbki i rozcieńczono 100Χ za pomocą dodania do 990p11 Msorbitu. Pobrano 10 μΐ ze stukrotnego rozcieńczenia i dodatkowo rozcieńczono 100 X za pomocą dodania do drugiej 990μ1 próbki 1 M sorbitu. Na płytce rozprowadzono 100μΐ próbki obydwu rozcieńczeń na podłożu YPD z agarem w celu określenia stężenia całych komórek pozostałych w preparacie, które nie zostały przeprowadzone w sferoplasty. Dodano 100μ/1 każdego rozcieńczenia do 10 ml agaru regeneracyjnego uzupełnionego histydyną w stężeniu 40μg/ml w celu określenia całej ilości sferoplastów zdolnych do regeneracji. Dobrymi wartościami dla eksperymentów z transformacją są: 1-3 X 107 zdolnych do regeneracji sferoplassów/ml i około 1 X 103 całych komórek/ml.
4. Inkubowano płytki w ciągu 3-5 dni w temperaturze 30°C.
Przykład XIII. Wyodrębnianie genu HIS4 Pichia pastoris i autonomicznie replikujących się sekwencji.
A. Szczepy.
Zastosowane szczepy obejmują:
a) Pichia pastoris szczep NRRL Y-l 1430
b) Pichia pastoris GS 115 (his4, NRRL Y-15851)
c) S. cerevisiae szczep 5799-4D (a his4-260 his4-39, NRLL Y-15859) oraz
d) E. coli szczep 848 (7' met thi gal TiR0 80s hsdR' hsdH+)
Plazmidy.
pYA2 (patrz fig. 23, zawiera gen HIS4 C. cerevisiae we fragmencie Pstl o 9,3 kilopary zasad wprowadzonym do miejsca PsU w pBR325) jest źródłem fragmentów z genem HIS4 S. cerevisiae i jest zdeponowany w E. coli jako gospodarzu oraz ogólnie dostępny jako NRRL B-15874.
YEpl3 jest dostępny w American Type Culture Colection pod nadanym mu numerem rejestracyjnym ATCC37115.
C. Podłoża.
Pichia pastoris hodowano w podłożu YPD (bogate) lub IMG (minimalne). IMG, podłoże minimalne, zawierało następujące składniki:
1. Sole IMi jako (stężenie końcowe) 36,7 mM KH2PO4, 22,7 mM (NH4)2SO4, 2,0 mM MgSO 7H20,6,7 mM KCl, 0,7 mM CaCL · 2H2O, przygotowane jako roztwór macierzysty 10 X i autoklawowane.
2. Sole śladowe jako (stężenie końcowe) 0,2μΜ CuSO4’5H2O, 1,25μΜ KJ, 4,5μΜ MnSO4-H2O, 2,0μΜ NaMoO4-2H2O, 0,75μΜ H3BO3, 17,5μΜ ZnSO4-7H2O, 44,5μΜ FeCl3 · 6H2O, przygotowane jako roztwór macierzysty 400 X i wyjałowione przez sączenie.
3. 0,4pg/ml biotyna, oraz
4. 2% glukoza.
E. coli hodowano albo w podłożu LB, albo w 2B (0,2% NH4PO4, 1,2% Na2HPO4, 0,013% MgSO4'7H2O,0,074% CaCL · 2H2O,1 pg/ml tiamina i 0,4% glukoza) uzupełnionym tryptofanem w stężeniu 100pg/ml i 0,2% kwasów Casamino.
D. Wyodrębnianie DNA.
1. Wyodrębnianie DNA drożdży w dużej skali.
Preparaty DNA zarówno z Pichia pastoris jak i S. cerevisiae otrzymywano za pomocą prowadzenia hodowli drożdży w 100 ml podłoża minimalnego do Αβοο = 1-2, a następnie zebrania komórek za pomocą odwirowania przy 2000 x g w ciągu 5 minut. Komórki przemyto raz wodą, raz SED, raz 1 M sorbitem, a następnie zawieszono w 5 ml 0,1 mM Tris-HCl (pH 7,0) zawierającego 1 M sorbit. Komórki mieszano z 50-100μΐ roztworu zymoliazy 60000 o stężeniu 4 mg/ml (Miles Laboratories) i inkubowano w temperaturze 30°C w ciągu 1 godziny w celu strawienia ścian komórkowych. Następnie preparat ^^^iroplastów wirowano przy 1000 Xg w ciągu 5-10 minut i zawieszono w buforze do lizy [0,1% SDS, 10 mM Tris-HCl (pH 7,4), 5 mM EDTA i 50 mM NaCl]. Dodano proteinazę K (Boehringer Mannheim) i RNAazę A (Sigma), każdą do stężenia 100pjg/mI mieszaniny inkubowano w temperaturze 37°C w ciągu 30 minut. DNA odbiałczono za pomocą łagodnego mieszania preparatu z taką samą ilością chloroformu zawierającego alkohol izoamylowy (24: 1 w stosunku objętościowym). Fazy rozdzielono za pomocą wirowania przy 12000 X g w ciągu 20 minut. Górną (wodną) fazę odciągnięto do świeżej probówki i ekstrahowano taką samą
158 965 ilością układu fenol/chloroform/alkohol izoamylowy. Fazy rozdzielono jak poprzednio i fazę górną umieszczono w probówce zawierającej 2-3 objętości zimnego 95% etanolu. Próbkę łagodnie zmieszano i zebrano DNA za pomocą łagodnego nawijania go na pręcik z tworzywa sztucznego. DNA natychmiast rozpuszczono w 1ml buforu TE i dializowano przez noc w temperaturze 4°C wobec 100 objętości buforu TE.
2. Otrzymywanie DNA drożdży w małej skali.
Drożdże hodowano w 5 ml porcjach podłoża minimalnego do Αβοο = 1-5 i zebrano za pomocą odwirowania przy 2000 Xg w ciągu 5 minut. Komórki zawieszono w 1 ml SED i przeniesiono do
1,5 ml probówki mikrowirówkowej, przemyto raz 1 IM sorbitem i ponownie zawieszono w 0,5 ml 0,1 M Tris-HCl (pH7,4) w IM sorbitolu. Dodano zymoliazę 60000 (10pl roztworu o stężeniu 4 mg/ml) i komórki inkubowano w ciągu 30-60 minut w temperaturze 30°C. Następnie komórki odwirowano w ciągu 1 minuty, zawieszono w buforze do lizy i inkubowano w temperaturze 65-70°C. Po upływie 15 minut próbki mieszano ze 100p15 M octanu potasowego, trzymano w łaźni lodowej w ciągu 15 minut i odwirowano w ciągu 5 minut. Supernatanty zdekantowano do świeżej probówki mikrowirówkowej zawierającej 1 ml 95% etanolu, mieszano i wirowano w ciągu 10 sekund. Ostatecznie osad DN A osuszono na powietrzu w ciągu 10-15 minut i rozpuszczono w 50 pl buforu TE.
3. Wyodrębnianie DNA E. coli w dużej skali.
Hodowle E. coli przeznaczone do otrzymywania plazmidów w dużej skali (0,5 litra-1 litra) prowadzono w temperaturze 37°C ze wstrząsaniem w podłożu 2B uzupełnionym jak wyżej opisano odpowiednim antybiotykiem. W przypadku komórek zawierających plazmidy pochodzące z pBR322, hodowle prowadzono do A550 około 0,7. W tym czasie dodano chloramfenikol w ilości wystarczającej do uzyskania stężenia 100 pg/ml i po upływie około 15 godzin komórki zebrano. Szczepami zawierającymi plazmidy pochodzące z pBR322 inokulowano uzupełnione podłoże 2B przy wyjściowej wartości A550 około 0,01-0,05 i prowadzono inkubację ze wstrząsaniem w ciągu 20-24 godzin w temperaturze 37°C, po czym dokonano zbioru.
4. Otrzymywanie DNA E. coli w małej skali.
W celu szybkiego wyodrębnienia plazmidu w małej skali, 2 ml hodowli w podłożu 2B uzupełnionym antybiotykiem hodowano przez noc ze wstrząsaniem w temperaturze 37°C, po czym komórki zebrano za pomocą odwirowania w 1,5 ml probówkach mikrowirówkowych. Plazmidy ze wszystkich preparatyk wyodrębniono metodą alkalicznej lizy opisaną przez Birnboima i Doly'ego (1979).
E. Działanie na DNA enzymami res^trykcyjnymi i wyodrębnianie fragmentów.
Enzymy restrykcyjne otrzymano z New England Biolabs i Bethesda Research Laboratories i trawienie prowadzono metodami rutynowymi. Mapowania restrykcyjnego dokonano za pomocą porównania równoległych procesów trawienia plazmidów z insertem DNA lub bez niego. Fragmenty restrykcyjne oczyszczono za pomocą elektroelucji z żeli agarozowych do pasków bibuły Whatman 3 MM na wężu dializacyjnym. Fragmenty odzyskano z bibuły i węża za pomocą 3-4 przemyć roztworem używanym w objętości 0,1-0,2 ml, zawierającym 0,1 M NaCl, 50 mM Tris-HCl (pH8,0) i 1 mM EDTA. Wreszcie, fragmenty ekstrahowano układem fenol/chloroform/alkohol izoamylowy, poddano wytrącaniu etanolem i ponownie rozpuszczono w małej objętości buforu TE.
F. Tworzenie zbioru P. pastoris w E. coli.
W celu utworzenia zbioru DNA-YEpl3 Pichia pastoris 100pg YEpl3 trawiono całkowicie BamHI i działano cielęcą jelitową fosfatazą alkaliczną w celu usunięcia końcowego 5' fosforanu z DNA. 100 pg próbki DNA Pichia pastoris typu dzikiego z Pichia pastoris NRRLY-11430 trawiono częściowo 10 jednostkami Sau3AI za pomocą inkubacji w ciągu 5 minut w temperaturze 37°C w całkowitej objętości 1 ml. Fragmenty o 5-10 kilopar zasad selekcjonowano pod względem wielkości za pomocą wirowania przez 5-20% gradienty sacharozy. \.μ% nośnika i 2pg fragmentów Sau3AI Pichia mieszano z 20 jednostkami ligazy DNA T4 (Bethesda Research Laboratories) w całkowitej objętości 200p1 i inkubowano przez noc w temperaturze 4°C. Ligowanymi DNA transformowano E. coli za pomocą dodania całkowitej mieszaniny reakcyjnej do ligacji do 2 ml kompetentnych komórek E. coli 848 i inkubowano w ciągu 15 minut w temperaturze 0°C. Miesza158 965 41 ninę ogrzewano w temperaturze 37°C w ciągu 5 minut, po czym dodano 40 ml podłoża LB i inkubację w temperaturze 37°C kontynuuje jeszcze w ciągu dodatkowej godziny. Następnie dodano ampicylinę do końcowego stężenia H^f^^j^/Zml i inkubację kontynuowano w ciągu drugiej godziny. Ostatecznie komórki wirowano w ciągu 10 minut przy 3000 X g, ponownie zawieszono w 1 ml świeżego podłoża LB i rozprowadzono w równych porcjach na 10 płytkach z agarem LB zawierającym 100ampicyliny. Około 50000 kolonii, które się utworzyły, zdrapano z płytek i częścią komórek inokulowano 500 ml uzupełnionego podłoża LB przy wyjściowej wartości A550 około 0,1. Hodowlę prowadzono i plazmid ekstrahowano sposobem opisanym w powyższej części niniejszego opisu. Z kolonii, które spulowano w celu utworzenia zbioru, 96 na 100 badanych wykazało wrażliwość na tetracyklinę, a 7 na 10 badanych zawierało plazmid z insertem DNA.
W celu skonstruowania zbioru DNA-pYJ8A Cla Pichia pastoris, ^^///gpYJ8A Cla trawiono całkowicie Ciał i poddano działaniu cielęcej jelitowej fosfatazy alkalicznej w celu usunięcia końcowego 5' fosforanu z DNA. 10(0/rg próbkę DNA z Pichia pastoris NRRL Y-15851 trawiono częściowo 20 jednostkami Taql za pomocą inkubacji w ciągu 5 minut w temperaturze 65°C w całkowitej objętości 1 ml. Fragmenty 5-10 kilopar zasad selekcćonowano pod względem wielkości za pomocą elektroelucji z 0,5% żelu agarozowego (patrz przykład II, punkt E). 1 //g wektora i 2pg fragmentów Taql Pichia mieszano z 20 jednostkami ligazy DNA T4 (Bethesda Research Laboratories) w całkowitej objętości 200 μ! i inkubowano przez noc w temperaturze 4°C. Ligowanym DNA transformowano E. coli za pomocą dodania całkowitej mieszaniny reakcyjnej po ligacji do2ml kompetentnych komórek E. coli 848 i inkubowano w ciągu 15 minut w temperaturze 0°C. Mieszaninę ogrzewano w temperaturze 32°C w ciągu 5 minut, po czym dodano 40 ml podłoża LB i inkubację kontynuowano w temperaturze 37°C w ciągu dodatkowej godziny. Następnie dodano ampicylinę do końcowego stężenia H^(^y^g^ml i inkubację kontynuowano w ciągu drugiej godziny. Ostateczenie, komórki wirowano w ciągu 10 minut przy 3000 Xg, zawieszono ponownie w 1 ml świeżego podłoża LB i rozprowadzono jako równe porcje na 10 płytkach z agarem LB zawierającym H^^0ig-'/ml ampicyliny. Około 10000 kolonii, które się utworzyły, zdrapano z płytek i częścią komórek inkubowano 500 ml uzupełnionego podłoża LB przy wyjściowej wartości A550 około 0,1. Hodowlę prowadzono i plazmid ekstrahowano sposobem opisanym w powyższej części niniejszego opisu.
G. Hybrydyzacja metodą Southerna.
W celu przeniesienia dużych superzwojowych cząsteczek DNA na nitrocelulozę, DNA najpierw poddano częścćowej hydrolizie za pomocą namaczania żelów agarozowych w 0,25 M HC1 w ciągu 10 minut przed denaturacją alkaliczną. Hybrydyzacji znakowanych fragmentów z genu HIS4
S. cerevisiae z DNA Pichia pastoris dokonano w obecności 50% formamidu, 6 X SSC, 5 X roztworu Denhardt'a,0,l% SDS, 1 mMEDTAi 100/Ug/ml zdenaturowanego ze spermy śledzia, w temperaturze 42°C. Przemycia pohybrydyzacyjne przeprowadzono z użyciem 1 X SSC, 1 mM EDTA, 0,1% SDS i 1,0% pirofosforanu sodowego, w temperaturze 65°C. DNA znakowano 32P jak opisano w powyższym przykładzie IV.
H. Analiza sekwencp DNA.
Analizy sekwencji DNA dokonano metodą Sangera i wsp. (1980).
I. Transformacja drożdży.
Transformację S.cerevisiae prowadzono z zastosowaniem metody Hinnena i wsp. (1978) tworzenia sferoplastów. Transformację Pichia pastoris prowadzono według sposobu postępowania opisanego w powyższej części niniejszego opisu.
J. Analiza transformantów Pichia pastoris.
Zdolność każdego plazmidu do utrzymywania się jako autonomicznego elementu w komórkach Pichia pastoris określano w sposób następujący. Kolonię transformanta pobierano z płytki z agarem regeneracyjnym, rozprowadzano na płytce z agarowym podłożem SD oraz inokulowano nią płynne podłoże IMG. Płytkę SD inkubowano w ciągu 3 dni w temperaturze 30°C, po czym pobierano z tej płytki pojedyńczą kolonię, rozprowadzono na drugiej płytce SD i inokulowano nią drugą butlę podłoża IMG. Proces ten powtarzano trzykrotnie. Trzy hodowle IMG prowadzono w temperaturze 30°C ze wstrząsaniem do Αβοο około 1-2 i komórki zebrano za pomocą odwirowania. DNA z hodowli drożdży ekstrahowano w sposób jak wyżej opisano i poddano elektroforezie przy
158 965
30V i 30 mA w ciągu 10-15 godzin w 0,8% żelach agarozowych, po czym przeniesiono na nitrocelulozę i hybrydyzowano ze znakowanym 32p pBR322 lub pBR325 sposobem opisanym w powyższej części niniejszego opisu. Jako kontrole, równolegle z próbkami eksperymentalnymi poddano elektroforezie próbkę zawierającą lOng plazmidu wyodrębnionego z E. coli i próbkę zawierającą 1—2//g nie transformowanego DNA Pichia pastorisGS115.
K. Wyodrębnianie sekwencji DNA Pichia.
Fragmenty DNA zawierające gen HIS4 Pichia wyodrębniono ze zbioru DNA Pichia na podstawie ich właściwości komplementarnych wobec szczepów his4 S. cerevisiae. Zbiór był złożony z fragmentów z częściowego trawienia Sau3AI, o 5-20 kilopar zasad, DNA z Pichia typu dzikiego, wprowadzonego do miejsca BamHI wahadłowego wektora YEpl3 S. cerevisiae-E. coli. Sferoplasty S. cerevisiae NRRL Y-15859 (57859-4D, szczep his4ABC-) tworzono metodą Hinnena i wsp. (1978), mieszano ze zbiorem DNA Pichia i dopuszczono do ich regeneracy w podłożu deficytowym pod względem histydyny. W wyniku transformacji powstało około 1, K)3 prototroficznych kolonii drożdży z populacji składającej się w całości z 5T07 zdolnych do regeneracy sferoplastów. Całkowity drożdżowy DNA ekstrahowano z 20 kolonii His+ i transformowano nim E. coli. 17 preparatów drożdżowego DNA wytworzyło kolonie oporne na ampicylinę i każdy z nich zawierał plazmid obejmujący YEpl3 i insert DNA. W celu potwierdzenia, że His+ transformującego plazmidy zawierają gen HIS4 Pichia i nie zawierają fragmentu DNA o aktywności supresorowej, mieszaniny po trawieniu plazmidów enzymami restrykcyjnymi poddano hybrydyzacji ze znakowanym fragmentem DNA zawierającym dużą część genu HIS4 S. cerevisiae i przemywanym w łagodnych warunkach. Każdy z plazmidów komplementarnych wobec szczepów his4 S. cerevisiae zawierał sekwencje, które hybrydyzowano z genem HIS4 S. cerevisiae.
W celu zbadania fragmentów DNA wykazujących aktywność ARS Pichia, DNA z Pichia pastoris GS115 (NRRL Y-15851) trawiono częścćowo Taql, wyodrębniono fragmenty o 5-10 kilopar zasad i klonowano je do unikalnego miejsca Ciał w pYJ8ACla (patrz fig. 26). Plazmidowy DNA odzyskano z około 10000 His+ kolonii Pichia i używano go do transformowania E. coli. Plazmidy z około 10000 opornych na ampicylinę kolonii wyodrębniono i transformowano nimi znowu GS115. Czterdzieści spośród His+ kolonii drożdży z tej podzbiorowej transformacji rozprowadzono na wybiórczym podłożu i poddano hodowli w wybiórczym podłożu oddzielnie każdą hodowlę. Z każdej z tych 40 hodowli ekstrahowano całkowity DNA i transformowano nim E. coli. Dwa plazmidy, pYA63 (PARS1) i pYA90 (PARS2), w których zawarte były preparaty drożdżowego DNA tworzące najwięcej opornych na ampicylinę kolonii E. coli, wybrano do dalszej analizy. Obydwa te plazmidy transformowały Pichia pastoris GS 115 (NRRL Y-15851) przy dużej częstości i każdy zawiera insert obcego.DNA.
Przykład XIV. Konstrukcja region regulatorowy-gen lacZ.
A. Konstrukcje regionu.regulatorowego p72 (oksydaza alkoholowa).
Plazmid pPG 4,0, wektor pBR322 zawierający fragment genomowego DNA EcoRI-PvuII o 4 kiloparach zasad z Pichia pastoris, cięto Pstl, działano na niego nukleazą SI w celu wytworzenia tępych końców gdy nastąpiło rozszczepienie, a następnie przecinano BamHI w celu otrzymania fragmentu DN A o 1,12 kilopary zasad zawierającego region regulatorowy oksydazy alkoholowej i kodującego informację dla pierwszych 15 aminokwasów aksydazy alkoholowej. Ten fragment DNA o 1,12 kilopary; zasad ma następującą sekwencję nukleotydów:
S i
1,12 kilopary zasad !
V
koniec, na który......... ......CTA GGT GGT G
działano nukleazą Sy..... ......GAT CCA CCA GCT AG,
oksydaza alkoholowa Leu,, Gly)2 Glył3 i
158 965 43
Ten fragment o 1,12 kilopary zasad ligowano z łącznikiem EcoRI/Smal/BamHI (rozszczepionym BamHI i Smal) z wektora wahadłowego E. coli-S.cerevisiae pSEYlOl, Douglas i wsp. (1984). Wektor pSEYlOl zawierał gen lacZ E. coli i poliłącznik o następującej sekwencji nukleotydów:
R, Sm B i' i I
y I * . . . .GAATTCCCGGGGATCCC GTC GTC · · · o
CTTAAGGGCCCCTAGGG GAG C AA · ·«·
1 1 1 Sm B Va].5 Val.Q.. -galaktozydasa
z otrzymaniem hybrydowego plazmidu pTAOll (patrz fig. 29).
Konstrukcja region regulatorowy-gen lacZ jest poza fazą w odniesieniu do wytwarzania
J-galaktozydazy, jak pokazano w sekwencji E:
1,12 kilopary zasad
...GAATTCCC........... ...........CTA GGT GGT GGA CCC CGT CG? T . . .
...CTTAAGGG........... ...........GAT CCA CCA CCT AGG GCA GCA T...
ΐ i
R1 3
Leu11 Giy,2 Giyl3 ^y,4 sei>15 Arg Arg
Sekwencja E
Wektor pTAOl 1 rozszczepiano w unikalnym miejscu BamHI i wprowadzano następujący łącznik Smal:
Sm
GATCACCCGGGT
TGGGCCCACTAG
T
Sm tworząc przez to wektor hybrydowy pTA012, który miał następującą sekwencję nukleotydów w odniesieniu do konstrukcji region regulatorowy-lacZ:
R, Sb
1,12 kilopary zasad
...GAATTCCC.......... ..........CTA GGT GGT GC-A TCA CCC GGG TGA TCC CGT CGT...
.. .CTTAACG3G.......... ..........GAT CCA CCA CCT AGT λ CCC ACT AGG GCA GCA...
R1 I
Lettu Gly,2 Gly,? Gly,4 Ser15 ?ro Stop Ser Arg Arg
i tak, konstrukcja region regulatorowy-lacZ pTA012 była ciągle poza fazą w odniesieniu do fazy odczytu LacZ. W celu dostarczenia informacji kodującej N-koniec genu strukturalnego oksydazy alkoholowej do otwartej fazy odczytu w strukturalnym genie lacZ, na pTA012 działano EcoRISmal i powstały fragment DNA ligowano do pSEYlOl, na który podobnie podziałano EcoRI i Smal, tworząc w ten sposób wektor hybrydowy pTA013. Patrz fig. 30 i sekwencja nukleotydów poniżej:
158 965
Ri GGT Sb l GGT GGA TCA CCC B CCC GIC GTT...
1 GAATTCCC. ,12 kilopar. zasad ..................CTA
GGG uAT
CTTAAGGG. ..................GAT CCC CCC CCT AGT GGG ~ CCC CTA GGG CAG CAA...
T Ri Leu11 Glył2 T Sn Gly13 Gly14 Ser,5 Pro Gly Asp t, Pr# Val9 Vall0,
β -gal
Sekwencja G
Wektora pTA013 używano następnie do transformowania S. cerevisiae SEY2102 do dalszych badań opisanych poniżej w przykładzie XV.
Wektor pTA013 rozszczepiano następnie Pstl lub Pstl-Nrul i konstrukcję region regulatorowy-lacZ zawartą w rozszczepionym fragmencie ligowano z fragmentem zawierającym gen HIS4 z wahadłowego wektora pTAFHl (patrz fig. 28), pYJ30 (patrz fig. 27) lub pYA2 (patrz fig. 23), w wyniku czego otrzymano plazmidy, odpowiednio, pSAOH 1, pSAOH5 i pSAOH W.
pTA013plus Powstające plazmidy pTAFHl pSAOHl pYJ30 pSAOH5 pYA2 pSAOH 10
B. Konstrukcje regionu regulatorowego p76.
Konstrukcje region regulatorowy-gen lacZ otrzymano z regionem regulatorowym p76 jak następuje:
1. Z zastosowaniem całej części 5' pPG 6,0.
Fragment EcoRI o 1,35 kilopary zasad z pPG 6,0 klonowano do unikalnego miejsca EcoRI w pSEYlOl, wektorze wahadłowym E. coli-S.cerevisiae, w wyniku czego otrzymuje się plazmid pT76Ul (patrz fig. 30a). Wektor pT76Ul rozszczepiano następnie Psd-Nrul i większy fragment DNA ligowano z fragmentem wahadłowego wektora pTAFHl (fig. 28) zawierającym gen HIS4jak wyżej opisano, w wyniku czego otrzymano pT76H3, albo z uzupełnionym końcem EcoRI we fragmencie PsH-EcoRI wektora wahadłowego pBPfl (patrz fig. 34) w wyniku czego otrzymano pT76H4.
2. Z zastosowaniem mieszaniny po trawieniu 5'-pPG 6,0 przy użyciu Bal31.
Fragment EcoRI o 1,35 kilopary zasad i pPG 6,0 klonowano do unikalnego miejsca EcoRI w pSEY8, wektorze wahadłowym E. coli-S. cerevisiae, który zawiera także unikalne miejsce Sali przyległe do miejsca EcoRI, do którego włączono DNA Pichia, otrzymując tak plazmid pTAOl (patrz fig. 31). Plazmid pTAOl rozszczepiano SaH i działano na niego egzonukleazą Bal31 w celu wytworzenia tępo zakończonych fragmentów regionu regulatorowego polipeptydu p76 o różnej długości. Tępo zakończone fragmenty uwalniano od pozostałości plazmidu pSEY8 za pomocą rozszczepienia przy użyciu EcoRI. Powstałe fragmenty DNA klonowano do łącznika EcoRI-Smal z pSEYlOl z otrzymaniem, wśród innych, plazmidu pTAFo,85 (patrz fig. 32). Plazmid pTAF0,85 był analogiczny do pTAOl 1 przedstawionego na fig. 29, z regionem regulatorowym p7ó zamiast regionu regulatorowego p72 (oksydaza alkoholowa).
Na wektor pTAF0,85 działano następnie w taki sam sposób jak na wektor pTAOl 3, w wyniku czego otrzymano plazmidy pTAFHO,85, pT76Hl i pT76H2. Tak więc, następujące wektory rozszczepiano i ligowano:
pTAFO,85 plus Powstający plazmid pTAFHl pYJ30 pYA2 pTAFH0,85 pT76Hl pT76H2
158 965 45
Przykład XV. Regulacja wytwarzania /3-galaktozydazy w Pichia pastoris.
Badano wytwarzanie /ł-gabklozydazy przez kilka transformantów Pichia pastoris GS115 (NRRL Y-15851) wyhodowanych na różnych źródłach węgla i w różnych warunkach. Transformowane szczepy hodowano w podłożu minimalnym zawierającym 0,5pg/ml biotyny i 0,1% glukozy, w temperaturze 30°C, do osiągnięcia fazy stacjonarnej. Następnie komórki zbierano za pomocą odwirowania, przenoszono do podłoża minimalnego zawierającego 0,5yu/ml biotyny i 0,5% metanolu i prowadzono hodowlę przez około 3-5 generacji w temperaturze 30°C. Po tym początkowym wzroście na metanolu komórki zbierano za pomocą odwirowania i przeniesiono do świeżego podłoża minimalnego zawierającego 0,5pg/ml biotyny i albo 0,1% glukozy, albo 0,3% metanolu jako źródła węgla. Komórki następnie inkubowano w ciągu około 10 godzin w temperaturze 30°C z okresowym odciąganiem próbek w celu określenia poziomu oksydazy alkoholowej i /J-gaaaktozydazy. Po upływie około 20-50 godzin źródło węgla usuwano i komórki utrzymywano w warunkach głodowych pod względem tegoż źródła węgla. Wyniki zebrano w tabeli 1.
Tabela 1
Maksymalny poziom (czas inkubacji, godziny) /3-galaktozydazy i oksydazy alkoholowej (jednostki/OE>6oo) w transformantach Pichia pastoris NRRL Y-15851
plazmid /3-gaiaklozydaza“ oksydaza alkoholowa0
1% glukoza głodzenie pod względem glokozy 0,3% metanol 1% glukoza głodzenie pod względem glukozy 0,3% metanol
pSAOHl 0 660 /20/ 1361 /0/ 0 35 530
pSAOHS 0.1-0,2 567 /20/ 1166/0/ 0 60 550
pSAOHlO 0 886 /20/ 1559/0/ 0 167 425
pTAFH,85 0 0,17 /80/ 0,5 0 nd nd
pT76Hl 0 3,20 /80/ 0 0 nd nd
pT76H2 0 nd nd 0 nd nd
pT76H3 0 20 781 0 nd nd
pT76H4 0,3-0,6 40 /80/ 3100 0 nd nd
W powyższej tabeli 1 użyto następujących oznacz.eń “Komórki odciągano w różnych okresach czasu i badano aktywność /J-galaktozydazy i oksydazy alkoholowej jak opisano w tekście, nd nie oznaczono.
Oksydazę alkoholową oznaczano metodą barwnik-peroksydaza powyżej opisaną (patrz przykład VII), a /3-galaktozydazę oznaczono sposobem następującym.
Badanie /3-galaktozydazy A. Wymagane roztwory
Z-bufor
Na2HPO2-7H2O
NaH2PO4
KC1
MgSOa · 7H2O 2-Merkaptoetanol uzupełnić do 1 litra, pH
16,1 g 5,5 g 0,75 g
0,246 g 2,7 ml powinno wynosić 7,
Stężenie końcowe 0,06 M 0,04 M 0,01 M 0,01 M 0,05 M
O-nitrofenylo-/3-D-galaktozyd (ONPG): Rozpuszczano 400 mg ONPG (Sigma N-1127) w 100 ml wody destylowanej w celu sporządzenia roztworu ONPG o stężeniu 4mg/ml.
B. Sposób badania.
1. Odciągano próbkę z prowadzonej w podłożu hodowli (Οϋβοο komórek drożdży 0,1-0,5), wirowano i przemyto osad komórek drożdży wodą.
2. Do osadu komórek dodano l ml Z-buforu, 30μΙ CHCI3 i 30 μΐ 0,1% SDS, mieszano i inkubowano w ciągu 5 minut w temperaturze 30°C.
3. Reakcję rozpoczęto za pomocą dodania 0,2 ml ONPG (4mg/ml), całość mieszano.
4. Reakcję zatrzymano za pomocą dodania 0,5 ml 1M roztworu Na2CO3 w odpowiednich okresach czasu, Aą2o<L
5. Odczytywano absorbancję supernatantu przy 420 nm.
158 965
C. Obliczenie aktywności J-galaktozydazy (jednostki) jednostka = 1 nmol o-nitrofenolu (ONP) tworzonego w 1 minucie w temperaturze 30°C i w pH 7. 1 nmol ONP wykazał absorbancję przy 420 nm (A42o) 0,0045 przy długości ścieżki 1 cm, tak więc absorbancją 1 przy 420nm odpowiadała 222nmolom ONP/ml lub 378 nmolom/l,7ml, ponieważ całkowita ilość oznaczanego supernatantu wynosiła 1,7 ml. Tak więc, ilość jednostek przedstawioną w tabelach oznaczano:
U = A420 X 378 t/min/
Wyniki przedstawione w tabeli 1 wskazują, że białko obce dla drożdży, to jest jS-ga^ktozydaza, może być wytwarzane przez Pichia pastoris ulegające regulacji albo pod wpływem obecności metanolu w podłożu odżywczym, albo pod wpływem wzrostu w warunkach głodzenia pod względem źródła węgla wywierającego represję kataboliczną.
Przykład XVI. Hybrydyzacja metodą Southerna z genowym DNA drożdży.
Prowadzono hodowlę dziewięciu rozmaitych szczepów drożdży asymilujących metanol i jednego nie asymilującego metanolu na podłożu minimalnym (IM 1, patrz przykład I) z, odpowiednio, 0,75% metanolem lub 1,0% glukozą. Całkowity chromosomalny DNA wyodrębniano jak opisano w przykładzie VI, to jest, kwasy nukleinowe wyodrębniono w całości, po czym działano na nie RNAaząA, a następnie ekstrahowano wpierw układem fenoo/chloroform/alkohol izoamylowy, a potem układem chloroform/alkohol izoamylowy, a ostatecznie poddano wytrąceniu etanolem. Wytrącony DNA zawieszono ponownie w minimalnej ilości buforu TE' i wirowano w celu sklarowania roztworu DNA.
Filtry do hybrydyzacji metodą Sotherna przygotowano sposobem opisanym w powyższym przykładzie VI, to jest, 10/yg DNA z rozmaitych gatunków drożdży trawiono nadmiarem Hindlll, poddano elektroforezie, denaturowano DNA, zobojętniono żel i przeniesienio na filtry nitrocelulozowe. Warunki prehybrydyzacji dla tych filtrów obejmowały działanie 50% dejonizowanym formamidem, 6XSSC, 5 X roztworem Denhardt'a, 1 mM EDTA, 0,1% SDS i H^(0/^i^/ml zdenaturowanym DNA ze spermy łososia, przez noc, w temperaturze 42°C. Te same warunki odpowiadały podłożu hybrydyzacyjnemu przy zastosowaniu sond poddanych translacji typu nick z P w końcowym stężeniu 106 zliczeń/min/ml. Sondy obejmowały inserty cDNA (fragmenty Pstl) z klonów pPC 8,3, pPC 15,0 i pPC 6,7, jak również fragment DNA Bglll o 2,7 kilopary zasad, z genu HIS4 Pichia pastoris. Każdą z tych sond stosowano oddzielnie na identycznych filt^^ach do hybrydyzacji utrzymywanych w ciągu 24 godzin w temperaturze 42°C. Po hybrydyzacji filtry przemyto 2 razy po 15 minut w temperaturze pokojowej i 3 razy po 15 minut w temperaturze 65°C roztworem zawierającym 2 X SSC, 1 mM EDTA, 0,1% SDS i 0,1% pirofosforanu sodowego. Inne przemycia prowadzono w łagodnych warunkach, to jest w temperaturze 55°C i 42°C, w celu potwierdzenia wyników hybrydyzacji. Filtry poddano następnie autoradiografii w ciągu 72 godzin. Wyniki tych procesów hybrydyzacji przedstawiono w tabeli 3.
Tabela 3
Hybrydyzacja genów P. pastoris z chromosomalnym DNA rozmaitych drożdży*
P. pastoris
HIS4 pPC 8,3 pPC 15,0 pPC 6,7
P. pastoris NRRL Y-l 1430 + + + +
P. pastoris NRRL Y-1603 + + + +
Hansenula capsulatum + + + +
H. henncii + + /+/ +
H. nonfermcntans + + + +
H. polymorpha /+/ + /+/ +
H wickerhamii + + + +
Torulopsis molischiana + + + +
Saccharomyces cerevisiac /+/ — — —
P. pastoris NRRL Y-15851 + _u + +
W tabeli 3 użyto następujących oznaczeń. + hybrydyzacja;/+/ słaba hybrydyzacja; — nic zaobserwowano hybrydyzacji w zastosowanych warunkach.
158 965
Wyniki przedstawione w tabeli 3 wskazują, że geny polipeptydów analogicznych do p76, p72 i p40 są obecne rzeczywiście we wszystkich drożdżach asymilujących metanol. Należy zauważyć, że żadnego z tych trzech genów nie zaobserwowano przy hybrydyzacji DNA z drożdży nie asymilujących metanolu, S. cerevisiae, podczas gdy hoinologia między genem HIS4 P. pastoris a genem HIS4
S. cerevisiae jest łatwa do zaobserwowania.
Przykłady zostały załączone jedynie w celu objaśnienia praktycznego zastosowania wynalazku i nie powinny być rozumiane jako ograniczające zakres wynalazku lub załączonych zastrzeżeń. Racjonalne warianty i modyfikacje, które nie są sprzeczne z istotą i duchem wynalazku, uważa się za będące w zakresie ochrony patentowej wskazanej i żądanej.
FIG. 33
2u
t s+ f FIG. 31
FIG. 32
8t ρ»
FIG. 27
FIG. 26
FIG. 25
FIG. 22
FIG. 21
FIG. 20
FIG. 17
FIG. 18
Ρβ Xh HaRt Ρβ
Ha
p76-S ‘
500 bp
IbcZ
FIG. 12 | -> 900bp |
FIG. 15
Rs Θ Ha A I |b a
Ba
Xb St Pa
6e Ha* • R* /
-W p p
Sb i -M00 bp ,
FIG. 13 | ^750bp |
AO-5*
Pb
-700bp
FIG. 16
Ha Ri Ha Ha
Xh Ha
Pt
CK Pvi | ^600 bp |
FIG. 10
FIG. 11 | 500 bp. |
FIG. 14
Pi Pb Pva
Pvt Ha | ->500 bp |
FIG. 7
Rb
Pva •1
St
b) j -~100 bp |
Re
Pva Ra Ha
FIG. 8
K Pva
S RB Rn/ K Ba Xb Ri | -500 bp |
FIG. 3
Ha Ha Rt Ha Ha Xh
Ha Ha Rt | _ 500 bp |
FIG. 4
Ndi K Ha A
R> Ha i? TT Sb Bc Ha Rb
i 400 bp i II II 1 1 ' 1
I 1 FIG. 5
C K Ρνχ
500 bp i 1
1 FIG. 6
) pPO 6.0 pVa
Ha Ha Rt HaHa Xh HaRt Pa Pe P*t Ha Ha blpPC 15.0 |—
1.2 kb
FIG. 1
Pva ) pPO 4.0
i Ha 1 Ϊ KHa P« 1 1 1 Ba Sa BcHaA I I i I II Ζβ A Ha S K Xb S* 1 1 1
1 1 1 ll— I II 1 11 1 l l l 1
b) pPC 8.3
c) pPC 8.0
2.1kb
FIG. 2
0.75 kb ) pPO 4.8 C K
Pvt
K Pwa
Rb R«j K Ba
b) pPC 6.7 H
1.2 kb
FIG. 3
Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 90 egz. Cena 10 000 zł

Claims (16)

  1. Zastrzeżenia patentowe
    1. Sposób wytwarzania polipeptydów, znamienny tym, że (a) transformuje się gospodarza wektorem ekspresyjnym zawierającym region regulatorowy 5'pochodzący z Pichiapastoris, który to wspomniany region regulatorowy jest wrażliwy na obecność metanolu w podłożu hodowlanym, z którym organizm gospodarza dla tego wektora ekspresyjnego pozostaje w kontakcie i który to wspomniany region regulatorowy jest zdolny do kontrolowania transkrypcji informacyjnego RNA, jeśli jest umiejscowiony w kierunku w górę od końca 5' kodującej sekwencji DNA, która koduje wytwarzanie wspomnianego informacyjnego RNA, oraz region kodującej polipeptyd; (b) hoduje się tak otrzymanego stransformowanego gospodarza i (c) odzyskuje się eksprymowany polipeptyd.
  2. 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako wspomnianego gospodarza stosuje się drożdże.
  3. 3. Sposób według zastrz. ł albo zastrz. 2, znamienny tym, że jako wspomnianego gospodarza stosuje się szczep drożdży zdolny do wzrostu na metanolu jako źródle węgla i energii.
  4. 4. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako wspomnianego gospodarza stosuje się szczep drożdży z rodzaju Pichia.
  5. 5. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako wspomnianego gospodarza stosuje się Pichia pastoris GS115 (NRRLY-15851).
  6. 6. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako wspomniany wektor ekspresyjny stosuje się wektor ekspresyjny, który dodatkowo zawiera dodatkowy region regulatorowy 3' zdolny do kontrolowania poliadenylacji oraz terminacji transkrypcji informacyjnego RNA.
  7. 7. Sposób według zastrz. 1 albo zastrz. 6, znamienny tym, że jako wspomniany wektor ekspresyjny stosuje się wektor ekspresyjny, który dodatkowo zawiera jedną lub większą liczbę dodatkowych sekwencji DNA pochodzących z grupy obejmującej DNA plazmidu bakteryjnego, DNA bakteriofaga, DNA plazmidu drożdżowego i drożdżowy chromosomalny DNA.
  8. 8. Sposób według zastrz. 1 albo zastrz. 6, znamienny tym, że jako wspomniany wektor ekspresyjny stosuje się wektor ekspresyjny zawierający dodatkowo sekwencję genu markerowego.
  9. 9. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako region regulatorowy stosuje się region regulatorowy pochodzący z Pichia pastoris NRRL Y-11430.
  10. 10. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako wspomniany region kodujący polipeptyd stosuje się region kodujący wytwarzanie oksydazy alkoholowej.
  11. 11. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako wspomniany region kodujący polipeptyd stosuje się region kodujący wytwarzanie polipeptydu p76.
  12. 12. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako region kodujący polipeptyd stosuje się region kodujący wytwarzanie polipeptydu heterologicznego.
  13. 13. Sposób według zastrz. 12, znamienny tym, że jako region kodujący polipeptyd heterologiczny stosuje się region kodujący /3-galaktozydazę.
  14. 14. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako wspomniany region regulatorowy 5' stosuje się region regulatorowy, który kontroluje transkrypcję informacyjnego RNA kodującego wytwarzanie oksydazy alkoholowej.
  15. 15. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako wspomniany region regutatorowy 5' stosuje się region regutatorowy, który kontroluje transkrypcję informacyjnego RNA kodującego wytwarzanie polipeptydu p76.
  16. 16. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako wspomniany region regulatorowy 5' stosuje się region regulatorowy, który kontroluje transkrypcję informacyjnego RNA kodującego wytwarzanie polipeptydu p40.
    158 965
PL1985256012A 1984-10-30 1985-10-30 Sposób wytwarzania polipeptydów PL PL PL158965B1 (pl)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US06/666,391 US4808537A (en) 1984-10-30 1984-10-30 Methanol inducible genes obtained from pichia and methods of use
US06/780,102 US4855231A (en) 1984-10-30 1985-09-25 Regulatory region for heterologous gene expression in yeast

Publications (2)

Publication Number Publication Date
PL256012A1 PL256012A1 (en) 1986-09-23
PL158965B1 true PL158965B1 (pl) 1992-10-30

Family

ID=27099454

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL1985256012A PL158965B1 (pl) 1984-10-30 1985-10-30 Sposób wytwarzania polipeptydów PL PL

Country Status (23)

Country Link
US (1) US4855231A (pl)
EP (2) EP0183071B1 (pl)
JP (5) JP2502508B2 (pl)
KR (1) KR930001117B1 (pl)
CN (1) CN1011243B (pl)
AR (1) AR242988A1 (pl)
AT (1) ATE83263T1 (pl)
AU (1) AU572002B2 (pl)
CA (1) CA1340733C (pl)
DD (1) DD254211A5 (pl)
DE (1) DE3586889T2 (pl)
DK (1) DK496385A (pl)
ES (1) ES8609458A1 (pl)
FI (1) FI94427C (pl)
GR (1) GR852611B (pl)
HU (1) HU205627B (pl)
IE (1) IE930804L (pl)
IL (1) IL76765A (pl)
NO (1) NO178076C (pl)
NZ (1) NZ213842A (pl)
PL (1) PL158965B1 (pl)
PT (1) PT81399B (pl)
YU (1) YU46695B (pl)

Families Citing this family (115)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5741672A (en) * 1984-07-27 1998-04-21 Unilever Patent Holdings B.V. Expression and production of polypeptides using the promoters of the hansenula polymorpha MOX and DAS genes
US4879231A (en) * 1984-10-30 1989-11-07 Phillips Petroleum Company Transformation of yeasts of the genus pichia
US5032516A (en) * 1985-10-25 1991-07-16 Phillips Petroleum Company Pichia pastoris alcohol oxidase II regulatory region
US4882279A (en) * 1985-10-25 1989-11-21 Phillips Petroleum Company Site selective genomic modification of yeast of the genus pichia
US4818700A (en) * 1985-10-25 1989-04-04 Phillips Petroleum Company Pichia pastoris argininosuccinate lyase gene and uses thereof
US4895800A (en) * 1985-11-26 1990-01-23 Phillips Petroleum Company Yeast production of hepatitis B surface antigen
IL81817A0 (en) * 1986-03-14 1987-10-20 Phillips Petroleum Co Methanol and glucose responsive yeast regulatory regions
ZA872534B (en) * 1986-05-08 1987-11-25 Phillips Petroleum Co Yeast production of streptokinase
IL82935A0 (en) * 1986-08-12 1987-12-20 Phillips Petroleum Co Secretion of heterologous proteins from yeast
US5002876A (en) * 1986-09-22 1991-03-26 Phillips Petroleum Company Yeast production of human tumor necrosis factor
ATE105858T1 (de) * 1987-07-17 1994-06-15 Rhein Biotech Ges Fuer Biotech Dna-moleküle, die für fmdh-kontrollabschnitte und strukturgene für ein protein mit fmdh-aktivität kodieren, sowie deren anwendung.
US5179003A (en) * 1988-01-05 1993-01-12 Boehringer Mannheim Gmbh Process for the production of proteins or protein-containing gene products
SE8901264L (sv) * 1988-04-11 1989-10-12 Phillips Petroleum Co Uttryck av laxtillvaexthormon i metylotropisk jaest av slaektet pichia
IL90021A0 (en) * 1988-04-25 1989-12-15 Phillips Petroleum Co Process for the production of interferon
IL89991A0 (en) * 1988-04-25 1989-12-15 Phillips Petroleum Co Expression of hepatitis b pres2 protein in methylotrophic yeasts
IL89989A0 (en) * 1988-04-25 1989-12-15 Phillips Petroleum Co Expression of human interleukin-2 in methylotrophic yeasts
IL89992A0 (en) * 1988-04-25 1989-12-15 Phillips Petroleum Co Expression of human serum albumin in methylotrophic yeasts
IL89993A0 (en) * 1988-04-25 1989-12-15 Phillips Petroleum Co Expression of the hiv 24kda gag protein in methylotrophic yeasts
EP0374282B1 (en) * 1988-12-20 1994-09-14 Rhein Biotech Gesellschaft für biotechnologische Prozesse und Produkte mbH A mutant strain of a methylotrophic organism and a process for the production of a protein in a methylotrophic organism
DD297841A5 (de) * 1989-02-13 1992-01-23 The Salk Institute Biotechnology/Industrial Associates,Us Herstellung von superoxiddismutase in pichia pastoris hefezellen
GB8924883D0 (en) * 1989-11-03 1989-12-20 Shell Int Research Expression vector and polypeptide synthesis
US5264554A (en) * 1990-01-19 1993-11-23 The Blood Center Of Southeastern Wisconsin, Inc. Platelet cell adhesion molecule and variants thereof
US6440681B1 (en) 1990-04-03 2002-08-27 Merck & Co., Inc. Methods for identifying agonists and antagonists for human neuronal nicotinic acetylcholine receptors
US5369028A (en) * 1990-04-03 1994-11-29 The Salk Institute Biotechnology/Industrial Associates, Inc. DNA and mRNA encoding human neuronal nicotinic acetylcholine receptor compositions and cells transformed with same
US5258302A (en) * 1990-07-03 1993-11-02 The Salk Institute Biotechnology/Industrial Associates, Inc. DNA for expression of aprotinin in methylotrophic yeast cells
WO1992004363A1 (en) * 1990-09-04 1992-03-19 The Salk Institute Biotechnology/Industrial Associates, Inc. Production of insulin-like growth factor-1 in methylotrophic yeast cells
US5612198A (en) * 1990-09-04 1997-03-18 The Salk Institute Production of insulin-like growth factor-1 in methylotrophic yeast cells
US5268273A (en) * 1990-12-14 1993-12-07 Phillips Petroleum Company Pichia pastoris acid phosphatase gene, gene regions, signal sequence and expression vectors comprising same
WO1992013951A1 (en) * 1991-02-04 1992-08-20 The Salk Institute Biotechnology/Industrial Associates, Inc. Production of human serum albumin in methylotrophic yeast cells
EP0578746B1 (en) * 1991-04-01 2002-07-03 Merck &amp; Co., Inc. GENES WHICH INFLUENCE $i(PICHIA) PROTEOLYTIC ACTIVITY, AND USES THEREFOR
CA2058820C (en) * 1991-04-25 2003-07-15 Kotikanyad Sreekrishna Expression cassettes and vectors for the secretion of human serum albumin in pichia pastoris cells
US5330901A (en) * 1991-04-26 1994-07-19 Research Corporation Technologies, Inc. Expression of human serum albumin in Pichia pastoris
US5834262A (en) * 1992-01-06 1998-11-10 E. I. Du Pont De Nemours And Company Oxidation of glycolic acid to glyoxylic acid using a microbial cell transformant as catalyst
DK0558024T3 (da) * 1992-02-28 1996-11-18 Suntory Ltd Ny vektor med en ved hjælp af methanol og/eller glycerol inducerbar promotor
US5708141A (en) * 1992-05-11 1998-01-13 Corvas International, Inc. Neutrophil inhibitors
WO1994020631A2 (en) * 1993-03-03 1994-09-15 E.I. Du Pont De Nemours And Company Production of glycolate oxidase in methylotrophic yeast
GB2286397B (en) * 1993-03-08 1997-09-10 Salk Inst Biotech Ind Human neuronal nicotinic acetylcholine receptor compositions and methods of employing same
AU6415594A (en) * 1993-03-25 1994-10-11 Biosource Genetics Corporation (pichia pastoris) alcohol oxidase (zza1) and (zza2)
EP0696320B1 (en) 1993-04-20 2002-09-25 Merck &amp; Co., Inc. Human n-methyl-d-aspartate receptor subunits, nucleic acids encoding same and uses therefor
US6001581A (en) 1993-06-04 1999-12-14 Sibia Neurosciences, Inc. Cation-based bioassay using human metabotropic glutamate receptors
US5912122A (en) 1993-06-04 1999-06-15 Sibia Neurosciences, Inc. Nucleic acids encoding and method for detecting nucleic acid encoding human metabotropic glutamate receptor subtype mGluR6
US5521297A (en) 1993-06-04 1996-05-28 Salk Institute Biotechnology/Industrial Associates Nucleic acids encoding human metabotropic glutamate receptors
US6638905B2 (en) * 1993-06-18 2003-10-28 The Salk Institute For Biological Studies Cloning and recombinant production of CFR receptor(s)
US6495343B1 (en) 1993-06-18 2002-12-17 The Salk Institute For Biological Studies Cloning and recombinant production of CRF receptor(s)
AU1091595A (en) * 1993-11-08 1995-05-29 Salk Institute Biotechnology/Industrial Associates, Inc., The Human neuronal nicotinic acetylcholine receptor compositions and methods employing same
US5453161A (en) * 1993-11-12 1995-09-26 Enichem S.P.A. Polyamic acid to polyimide conversion by microwave heating
US5866542A (en) * 1994-10-18 1999-02-02 Corvas International, Inc. Nematode-extracted anticoagulant protein
CA2202351A1 (en) * 1994-10-18 1996-04-25 George Phillip Vlasuk Nematode-extracted serine protease inhibitors and anticoagulant proteins
DK0788546T3 (da) * 1994-10-18 2007-04-10 Dendreon Corp Nematode-ekstraherede serinproteaseinhibitorer og antikoagulerende proteiner
US5866543A (en) * 1995-06-05 1999-02-02 Corvas International, Inc. Nematode-extracted anticoagulant protein
US5872098A (en) * 1995-06-05 1999-02-16 Corvas International, Inc. Nematode-extracted anticoagulant protein
US5863894A (en) * 1995-06-05 1999-01-26 Corvas International, Inc. Nematode-extracted anticoagulant protein
US5945275A (en) * 1994-10-18 1999-08-31 Corvas International, Inc. Nematode-extracted anticoagulant protein
US6485967B1 (en) 1995-06-07 2002-11-26 Merck & Co., Inc. Human neuronal nicotinic acetylcholine receptor α6 and β3 nucleic acid
US6720140B1 (en) * 1995-06-07 2004-04-13 Invitrogen Corporation Recombinational cloning using engineered recombination sites
US6143557A (en) * 1995-06-07 2000-11-07 Life Technologies, Inc. Recombination cloning using engineered recombination sites
EP0862640A2 (en) * 1995-11-09 1998-09-09 ZymoGenetics, Inc. Production of gad65 in methylotrophic yeast
MX9605082A (es) 1996-10-24 1998-04-30 Univ Autonoma De Nuevo Leon Levaduras metilotroficas modificadas geneticamente para la produccion y secrecion de hormona de crecimiento humano.
EP0911416B1 (en) 1997-10-01 2006-05-17 DSM IP Assets B.V. Protein production process
US20030124555A1 (en) * 2001-05-21 2003-07-03 Invitrogen Corporation Compositions and methods for use in isolation of nucleic acid molecules
CA2307016A1 (en) * 1997-10-24 1999-05-06 Life Technologies, Inc. Recombinational cloning using nucleic acids having recombination sites
US7351578B2 (en) * 1999-12-10 2008-04-01 Invitrogen Corp. Use of multiple recombination sites with unique specificity in recombinational cloning
CN101125873A (zh) * 1997-10-24 2008-02-20 茵维特罗根公司 利用具重组位点的核酸进行重组克隆
EP1094081B1 (en) * 1998-07-06 2005-09-21 Tosoh Corporation Fused protein with direct bond of il-6-receptor to il-6
WO2000012687A1 (en) * 1998-08-28 2000-03-09 Invitrogen Corporation System for the rapid manipulation of nucleic acid sequences
US6780615B1 (en) 1998-12-31 2004-08-24 Genway Biotech Inc. Production of recombinant monellin using methylotrophic yeast expression system
US6720174B1 (en) 1999-01-28 2004-04-13 Novozymes A/S Phytases
AU774643B2 (en) 1999-03-02 2004-07-01 Invitrogen Corporation Compositions and methods for use in recombinational cloning of nucleic acids
US7504253B2 (en) * 1999-06-11 2009-03-17 The Burnham Institute For Medical Research Nucleic acid encoding proteins involved in protein degradation, products and methods related thereof
US6261820B1 (en) * 1999-10-01 2001-07-17 Amgen Inc. Fibronolytically active polypeptide
US6440414B1 (en) * 1999-10-01 2002-08-27 Amgen Inc. Pharmaceutical compositions of fibrinolytic agent
MXPA02004666A (es) 1999-11-12 2003-06-24 Fibrogen Inc Gelatinas recombinantes.
ATE391789T1 (de) 1999-12-10 2008-04-15 Invitrogen Corp Verwendung einer vielzahl von rekombinationsstellen mit einzigartiger spezifität beim rekombinatorischen klonen
US7033776B2 (en) * 1999-12-17 2006-04-25 Amgen Inc. Method for treatment of indwelling catheter occlusion using fibrinolytic metalloproteinases
WO2001077351A1 (en) * 2000-04-07 2001-10-18 MAX-PLANCK-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Vectors and methods for dual protein expression in pichia pastoris and escherichia coli
US7244560B2 (en) * 2000-05-21 2007-07-17 Invitrogen Corporation Methods and compositions for synthesis of nucleic acid molecules using multiple recognition sites
US7449308B2 (en) 2000-06-28 2008-11-11 Glycofi, Inc. Combinatorial DNA library for producing modified N-glycans in lower eukaryotes
US7598055B2 (en) * 2000-06-28 2009-10-06 Glycofi, Inc. N-acetylglucosaminyltransferase III expression in lower eukaryotes
US7863020B2 (en) * 2000-06-28 2011-01-04 Glycofi, Inc. Production of sialylated N-glycans in lower eukaryotes
US7625756B2 (en) * 2000-06-28 2009-12-01 GycoFi, Inc. Expression of class 2 mannosidase and class III mannosidase in lower eukaryotic cells
DE60139720D1 (de) * 2000-06-28 2009-10-08 Glycofi Inc Verfahren für die Herstellung modifizierter Glykoproteine
US8697394B2 (en) * 2000-06-28 2014-04-15 Glycofi, Inc. Production of modified glycoproteins having multiple antennary structures
DK1294910T3 (da) 2000-06-30 2009-03-02 Vib Vzw Protein glykosyleringsmodifikation i Pichia Pastoris
US7009045B2 (en) * 2000-07-14 2006-03-07 Archer-Daniels-Midland Company Transformation systems for flavinogenic yeast
US7198924B2 (en) * 2000-12-11 2007-04-03 Invitrogen Corporation Methods and compositions for synthesis of nucleic acid molecules using multiple recognition sites
MXPA03009059A (es) * 2001-04-05 2004-10-15 Univ Nebraska Secuencias de nucleotidos reguladoras de alcohol oxidasa 1 para expresion de genes heterologos en levadura.
US6645739B2 (en) 2001-07-26 2003-11-11 Phoenix Pharmacologies, Inc. Yeast expression systems, methods of producing polypeptides in yeast, and compositions relating to same
EP1497434A4 (en) * 2002-04-15 2005-08-24 Merck & Co Inc MATRIX ANALYSIS OF GENE EXPRESSION IN CELLS
US7252933B2 (en) 2002-06-26 2007-08-07 Flanders Interuniversity Institute For Biotechnology Protein glycosylation modification in methylotrophic yeast
US20040204953A1 (en) * 2002-07-17 2004-10-14 Lincoln Muir Subscription based systems, methods and components for providing genomic and proteomic products and services
DE60335602D1 (de) * 2002-12-18 2011-02-17 Roche Diagnostics Gmbh Rekombinante Desoxyribonuclease I aus Rinder-Pankreas mit hoher spezifischer Aktivität
ATE387494T1 (de) * 2002-12-20 2008-03-15 Hoffmann La Roche Hitzelabile desoxyribonuklease i-varianten
US7332299B2 (en) 2003-02-20 2008-02-19 Glycofi, Inc. Endomannosidases in the modification of glycoproteins in eukaryotes
EP1460425A1 (en) * 2003-03-17 2004-09-22 Boehringer Mannheim Gmbh Deglycosylated enzymes for conjugates
CA2536635C (en) * 2003-08-25 2015-05-12 Funzyme Biotechnologies Sa Novel fungal proteins and nucleic acids encoding same
US8293503B2 (en) 2003-10-03 2012-10-23 Promega Corporation Vectors for directional cloning
ATE469984T1 (de) 2003-12-01 2010-06-15 Life Technologies Corp Rekombinationsstellen enthaltende nukleinsäuremoleküle und verfahren zur verwendung davon
CA2486195C (en) * 2003-12-05 2012-03-06 Stephan Glaser Recombinantly expressed carboxypeptidase b and purification thereof
PL1926749T3 (pl) * 2005-09-14 2011-12-30 Sanofi Aventis Deutschland Cięcie prekursorów insuliny przez wariant trypsyny
AT504588B1 (de) * 2006-11-16 2008-08-15 Univ Graz Tech Nukleinsäure-promotor
WO2009114093A2 (en) * 2008-03-03 2009-09-17 Abbott Laboratories Methods for transforming yeast
US8753853B2 (en) 2008-12-12 2014-06-17 E I Du Pont De Nemours And Company Process for making linear dicarboxylic acids from renewable resources
EP2258855A1 (en) 2009-05-28 2010-12-08 Universität für Bodenkultur Wien Expression sequences
WO2011077359A2 (en) 2009-12-21 2011-06-30 Centre Hospitalier Universitaire Vaudois (Chuv) Synergic action of a prolyl protease and tripeptidyl proteases
DK2710114T3 (da) 2011-05-20 2021-12-06 H Lundbeck As Fremstilling med høj renhed af proteiner med multi-underenheder såsom antistoffer i transformerede mikrober såsom pichia pastoris
MX355890B (es) 2011-08-19 2018-05-03 Alderbio Holdings Llc Estrategia de múltiples copias para producción de alto título y alta pureza de proteínas de multi-subunidades tales como anticuerpos en microbios transformados tal como pichia pastoris.
KR102128957B1 (ko) 2011-10-07 2020-07-02 론자 리미티드 조절가능한 프로모터
EP2970865B1 (en) 2013-03-15 2020-09-02 Alder Biopharmaceuticals, Inc. Antibody purification and purity monitoring
WO2014139608A1 (en) 2013-03-15 2014-09-18 Lonza Ltd Constitutive promoter
US9150870B2 (en) 2013-03-15 2015-10-06 Lonza Ltd. Constitutive promoter
US10138294B2 (en) 2013-03-15 2018-11-27 Alderbio Holdings Llc Temperature shift for high yield expression of polypeptides in yeast and other transformed cells
KR102351839B1 (ko) 2013-03-21 2022-01-18 에보닉 오퍼레이션스 게엠베하 삼중 나선 단백질의 정제
AU2014260123B2 (en) 2013-04-30 2018-10-11 Donald Danforth Plant Science Center Antifungal plant proteins, peptides, and methods of use
KR102384622B1 (ko) 2013-09-09 2022-04-11 에보닉 오퍼레이션스 게엠베하 변형된 세균 콜라겐-유사 단백질
WO2016120764A1 (en) 2015-01-26 2016-08-04 Centre Hospitalier Universitaire Vaudois (Chuv) Aspergillus oryzae prolyl endopeptidases and use thereof in degradation of polypeptides

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4615974A (en) * 1981-08-25 1986-10-07 Celltech Limited Yeast expression vectors
IE54592B1 (en) * 1982-03-08 1989-12-06 Genentech Inc Anumal interferons, processes involved in their production, compositions containing them, dna sequences coding therefor and espression vehicles containing such sequences and cells transformed thereby
HU204097B (en) * 1982-05-19 1991-11-28 Gist Brocades Nv Process for producing cloning system relating to kluyveromyces species
WO1984001153A1 (en) * 1982-09-15 1984-03-29 Collaborative Res Inc Production of interferon in yeast by use of invertase promoter
CA1341130C (en) * 1984-07-27 2000-10-31 Adrianus Marinus Ledeboer Use of oxidoreductases in bleaching and/or detergent compositions and their preparation by microorganisms engineered by recombinant dna technology
US4879231A (en) * 1984-10-30 1989-11-07 Phillips Petroleum Company Transformation of yeasts of the genus pichia
US4885242A (en) * 1984-10-30 1989-12-05 Phillips Petroleum Company Genes from pichia histidine pathway and uses thereof
US4837148A (en) * 1984-10-30 1989-06-06 Phillips Petroleum Company Autonomous replication sequences for yeast strains of the genus pichia

Also Published As

Publication number Publication date
YU169585A (en) 1991-04-30
DD254211A5 (de) 1988-02-17
DE3586889D1 (de) 1993-01-21
JPS61173781A (ja) 1986-08-05
NO854312L (no) 1986-05-02
CA1340733C (en) 1999-09-14
AU4875285A (en) 1986-06-12
EP0183071B1 (en) 1992-12-09
HU205627B (en) 1992-05-28
PL256012A1 (en) 1986-09-23
EP0483115A2 (en) 1992-04-29
YU46695B (sh) 1994-04-05
NO178076C (no) 1996-01-17
EP0483115A3 (en) 1992-05-06
JPH0698789A (ja) 1994-04-12
NZ213842A (en) 1991-11-26
IL76765A (en) 1991-06-30
JPH08196275A (ja) 1996-08-06
JP2552807B2 (ja) 1996-11-13
ATE83263T1 (de) 1992-12-15
CN1011243B (zh) 1991-01-16
JPH08173161A (ja) 1996-07-09
FI854142A0 (fi) 1985-10-23
AR242988A1 (es) 1993-06-30
FI854142L (fi) 1986-05-01
PT81399A (en) 1985-11-01
DK496385A (da) 1986-05-01
KR930001117B1 (ko) 1993-02-18
JP2552808B2 (ja) 1996-11-13
AU572002B2 (en) 1988-04-28
PT81399B (pt) 1987-11-11
KR870003197A (ko) 1987-04-15
DE3586889T2 (de) 1993-04-15
US4855231A (en) 1989-08-08
HUT38678A (en) 1986-06-30
IE930804L (en) 1986-04-30
JP2502508B2 (ja) 1996-05-29
CN85109718A (zh) 1986-08-20
NO178076B (no) 1995-10-09
FI94427C (fi) 1995-09-11
GR852611B (pl) 1986-03-04
ES8609458A1 (es) 1986-09-01
DK496385D0 (da) 1985-10-29
FI94427B (fi) 1995-05-31
ES548307A0 (es) 1986-09-01
JPH06233686A (ja) 1994-08-23
EP0183071A2 (en) 1986-06-04
EP0183071A3 (en) 1987-09-23

Similar Documents

Publication Publication Date Title
PL158965B1 (pl) Sposób wytwarzania polipeptydów PL PL
US4808537A (en) Methanol inducible genes obtained from pichia and methods of use
EP0460716B2 (en) Yeast expression systems with vectors having GAPDH promoters, and synthesis of HBsAg
Broach et al. Vectors for high-level, inducible expression of cloned genes in yeast
FI94426B (fi) Itsenäisiä replikointisekvenssejä Pichia-hiivakannoille
AU613030B2 (en) Yeast vector
FI104497B (fi) DNA-sekvenssi, joka koodittaa hiivan alkoholioksidaasi II:n säätelyaluetta
Partaledis et al. Structure and regulation of a nuclear gene in Saccharomyces cerevisiae that specifies MRP13, a protein of the small subunit of the mitochondrial ribosome
PL152882B1 (en) Method of producing a type b hepatitis antigen
JPH09168388A (ja) 機能遺伝子を含むｄｎａ断片
JP2614314B2 (ja) メチロトロフィック酵母におけるＢ型肝炎ＳおよびｐｒｅＳ▲下２▼タンパク質の発現
US4966841A (en) Enhanced vector production and expression of recombinant DNA products
EP0118551A1 (en) Production of interferon in yeast by use of invertase promoter
JP3238476B2 (ja) 新規なピチア パストリスの線状プラスミドおよびそのｄｎａ断片
GB2217332A (en) Expression of salmon growth hormone in methylotrophic yeast of genus pichia
FI105825B (fi) Pichia pastoris -kantoja
Fettes Design and characterization of a system to test synthetic DNA sequences for telomere function in the yeast Saccharomyces cerevisiae
IE67053B1 (en) Pichia pastoris alcohol oxidase II regulatory region
JPH066060B2 (ja) 新規なプロモ−タ−