FI105825B - Pichia pastoris -kantoja - Google Patents

Description

105825

Pichia pastoris -kantoja Tämä hakemus on jakamalla erotettu hakemuksesta 893109.

Tämä keksintö koskee yhdistelmä-DNA-biotekniikan aluetta. Hakemuksessa esite-5 tään DNA-sekvenssejä, jotka säätelevät DNA:n kopiointia, sekä vektoreita, jotka sisältävät edellä kuvailtuja DNA-sekvenssejä. Keksintö koskee uusia soluja, jotka on transformoitu edellä kuvailluilla vektoreilla.

Yhdistelmä-DNA-biotekniikan kehittyminen viime vuosina on tehnyt mahdolliseksi hyvin monenlaisten käyttökelpoisten polypeptidien hallitun tuottamisen solujen 10 avulla. Monia eukarioottisia polypeptidejä, esimerkiksi ihmisen kasvuhormonia, leukosyytti-interferoneja, ihmisen insuliinia ja ihmisen proinsuliinia, on tuotettu eri mikro-organismien avulla. Jo käytettävissä olevan tekniikan jatkuvan soveltamisen odotetaan tulevaisuudessa mahdollistavan useiden muiden käyttökelpoisten poly-peptidituotteiden yhdistelmätekniikkaan perustuvan tuotannon.

15 Yhdistelmätekniikan alueella käytettävä perustekniikka on alaa tuntevien henkilöiden tiedossa. Yhdistelmä-DNA-biotekniikan käytäntöön soveltamisen kannalta edul- . lisesti läsnä oleviin perustekijöihin kuuluvat, mutta eivät rajoitu niihin: (1) yhtä tai • »* · useampaa tavoiteltavaa polypeptidiä koodittava geeni, joka on toiminnallisesti kyt-. keytynyt (toiminnallisesti kytkeytynyt tarkoittaa vierekkäin asettumista, jossa kom- t · · , ·". 20 ponenttien keskinäinen asema on niiden tavanomaisen toiminnan suorituksen mukai- • · · nen) riittävien kontrollisekvenssien kanssa, joita tarvitaan ilmentämistä varten isän- •;j.: täsolussa; (2) vektori, tavallisesti plasmidi, johon nukleotidisekvenssi voidaan liit- · * ' ·* * tää; vektori on mikä tahansa nukleotidisekvenssin sisältävä rakenne, jolla isäntä voi daan transformoida; (3) sopiva isäntä, johon tavoiteltava nukleotidisekvenssi voi- IM - --------------- - 25 daan siirtää, jossa yhteydessä isäntä sisältää myös sellulaarisen mekanismin, jonka *.., ϊ avulla on mahdollista ilmentää se informaatio, jota siirretty nukleotidisekvenssi koo- dittaa.

• · # .... — ......... - _ * • · ·

Yhdistelmätekniikassa käytettävä perustekijä on plasmidi, joka koostuu ympyrän m . . muotoisesta kaksijuosteisesta DNA:sta, jota ensiksi tavattiin mikro-organismeilla.

• · · : 30 Plasmidien on todettu esiintyvän moninkertaisilla kopioina solua kohti. Luonnollisi na esiintyvien plasmidien lisäksi on valmistettu monenlaisia tekoplasmideja. Plasmidi sisältää informaation, joka tarvitaan plasmidin lisääntymiseen, so. autonomisen replikointisekvenssin ja/tai replikoinnin aloituskohdan. Yksi tai useampi keino, valikoitaessa plasmidi fenotyyppisesti transformoiduista soluista, voidaan myös sisällyt- 2 105825 tää plasmidiin koodattuun informaatioon. Fenotyyppinen tai markkeriin perustuva valintaominaisuus, kuten esimerkiksi antibioottiresistenssi, mahdollistaa isäntäsolun kloonien, jotka sisältävät kiinnostuksen kohteena olevan plasmidin, tunnistamisen ja valikoinnin suosimalla solujen kasvua selektiivisissä alustoissa. Vektoreita tai plas-5 mideja voidaan katkaista yhdellä tai useammalla restriktioendonukleaasilla tai rest-riktioentsyymillä, joista kukin tunnistaa spesifisen nukleotidisekvenssin. Säätely-alue, joka on toiminnallisesti kytkeytynyt heterologiseen geeniin, so. geeniin, joka ei esiinny luonnollisena säätelyalueen yhteydessä, tai muita nukleotidisekvenssejä voidaan liittää sen jälkeen kytkemällä haluttu geneettinen materiaali toiminnallisesti 10 katkaisukohtaan tai katkaisukohdan molemminpuolin oleviin, uudelleen konstruoituihin päihin.

Vektori siirretään sen jälkeen isäntäsoluun, jossa sen nukleotidisekvenssi voi ohjata isäntää suorittamaan erilaisia prosesseja tai toimintoja. Joitakin esimerkkejä ovat heterologisten polypeptidien ilmentäminen tai homologisten tai heterologisten poly-15 peptidien yli-ilmentäminen. Nukleotidin siirtämisprosessia isäntäsoluun nimitetään yleisesti transformaatioksi. Suuria vektorimääriä voidaan saada aikaan siirtämällä vektori sopivaan isäntään vektorin kopioluvun lisäämiseksi. Vektorin kopioluvun lisäämiseen yleisesti käytetty isäntäsolu on E. coli. Vektorit eristetään sen jälkeen ensimmäisestä isännästä ja siirretään toiseen isäntäsoluun, jossa halutut vektorijoh-20 teiset aktiviteetit tapahtuvat, esimerkiksi polypeptidin tuottaminen. Lopputuotteen tuottamisesta tällä tavalla DNA:n avulla käytetään nimitystä ilmentäminen. Silloin kun geeni sijoitetaan oikein vektoriin, koskien niitä vektorin osia, jotka ohjaavat : koodittavan nukleotidisekvenssin kopiointia ja luentaa, muodostunutta vektoria voi- : * *.. daan käyttää sen polypeptidisekvenssin tuottamiseen, jota liitetty geeni koodittaa.

* · • · · 25 Ilmentymistä säätelee säätelyalue. Säätelyalueet ovat heterologisia nukleotidisekvenssejä, jotka reagoivat erilaisiin ärsykkeisiin ja vaikuttavat RNA:n kopioitumis- • · · : frekvenssiin. Ilmentyminen voidaan kytkeä päälle tai pois vasteessa ärsykkeeseen.

' Ilmentymistä, joka on kytkeytynyt päälle vasteessa ärsykkeeseen, nimitetään ylei sesti derepressioksi tai induktioksi. Joitakin esimerkkejä indusoituvista ilmentymis-

• M

•... * systeemeistä ovat AOX1 -systeemi Pichia pastoriksessa, estrogeenisysteemi Xenopus ·"*: laeviksessa, ja metallotioneiinisysteemit apinoissa, ihmisissä, hamstereissa, hiirissä . ja rotissa. Indusoituvat ilmentymissysteemit ovat tavallisesti tiukemmassa ohjauk- • · · sessa kuin konstitutiiviset systeemit. Nämä systeemit sopivat hyvin geenitekniikan ’··.·' tarkoituksiin.

· * • * • · ·

* · I

• « « • · • w 3 105825

Yhdistelmä-DNA-biotekniikan käyttö voi käytännössä saada aikaan soluja, jotka pystyvät ilmentämään heterologisia nukleotidisekvenssejä. Heterologiset nukleotidi-sekvenssit ovat nukleotidisekvenssejä, joita ei luonnostaan esiinny isännässä. Esimerkkejä niistä voisivat olla isännässä luonnostaan esiintyvien säätelyalueiden uudet 5 yhdistelmät rakennegeenien kanssa, jotka eivät luonnostaan liity tähän säätelyalueeseen. Toisena esimerkkinä voisi olla säätelyalueen yhdistelmä geenin kanssa, joka ei luonnostaan esiinny isännässä. Heterologinen polypeptidi voidaan tuottaa fuusiopo-lypeptidinä, so. heterologinen polypeptidi yhdistettynä homologisen tai heterologi-sen aminohapposekvenssin osaan. Alunperin saatu fuusiopolypeptidituote tuotetaan 10 joskus inaktiivisessa muodossa, kunnes fuusiopolypeptidi halkaistaan ekstrasellu-laarisessa ympäristössä.

Kuten aikaisemmin tuotiin esille EP-patenttihakemuksessa 86114700.7 (liitetty tässä yhteydessä viitteenä). Pichia pastoriksen genomi koodittaa kahta toiminnallista alko-holioksidaasigeeniä, AOX1 ja AOX2.

15 Keksinnön mukaisesti on nyt havaittu 5'-pään säätelyalue, joka on liittynyt AOX2-rakennegeeniin. Metanoli tai hiilenlähteen niukkuus indusoivat tämän säätelyalueen. Ilmentymisen maksimaalinen taso AOX2-säätelyalueelta on kuitenkin vain noin 5-11 % AOX1-säätelyalueen tasosta (AOX1-geeni tuotiin esille eurooppalaisessa patenttihakemuksessa 85201235.0, joka on liitetty tässä viitteenä).

20 AOX2-säätelyaluetta voidaan käyttää ilmentämään heterologisia geenejä, ja se on erityisen käyttökelpoinen niissä tilanteissa, joissa proteiinin korkea ilmenemistaso : on epäedullista.

» * • t < : Esillä olevan keksinnön mukaisesti on löydetty, eristettyjä karakterisoitu DNA-sek- • · · venssi, joka säätelee DNA:n kopiointifrekvenssiä RNA:ksi. Nämä DNA-sekvenssit m · : 25 ovat käyttökelpoisia polypeptidituotteiden tuottamisessa metylotrofisilla hiivoilla, kuten esimerkiksi Pichia pastoris.

• · ·

Kuvio 1 antaa käyttöön AOX1 (a)-ja AOX2 (b) -geenien restriktiokartat.

• · · :<t<: Kuvio 2 esittääpBR322:nrestriktiokarttaa.

Kuvio 3 esittääpYJ8:nrestriktiokarttaa.

30 Kuvio 4 esittää plasmidin pYM5 restriktiokarttaa.

Kuvio 5 esittää plasmidin pMR4 restriktiokarttaa.

’··.·’ Kuvio 6 esittää pMR4 :n konstruoinnin virtauskaaviota.

:' * *: Kuvio 7 esittää plasmidin pBPflrn restriktiokarttaa.

: ‘ : Kuvio 8 esittää plasmidin pYJ55 restriktiokarttaa.

4 105825

Kuvio 9 esittää plasmidin pYJ55 konstruoinnin virtauskaaviota.

Kuvio 10 esittää plasmidin pSAOH5 restriktiokarttaa.

Esillä olevassa hakemuksessa annetaan käyttöön uusi DNA-sekvenssi, joka sisältää säätelyalueen, joka reagoi vähintään yhteen seuraavista olosuhteista: metanolin läs-5 näolo isäntäympäristössä tai hiilenlähteen niukkuus, kun isäntäsolua kasvatetaan muilla substraateilla kuin metanolilla. Tämän keksinnön mukainen säätelyalue pystyy ohjaamaan RNA:n kopiointifrekvenssiä, kun se on toiminnallisesti kytketty DNA-sekvenssin 5'-päähän, joka koodittaa mRNA:n tuotantoa.

Esillä olevan keksinnön mukaisesti annetaan käyttöön plasmideja ja transformoituja 10 organismeja, jotka sisältävät edellä kuvailtuja DNA-sekvenssejä.

Nämä ja muut keksintöä koskevat kohteet tulevat selviksi tässä annettavassa selvityksessä. Keksinnön oleelliset tunnusmerkit on esitetty oheisissa patenttivaatimuksissa.

I. Alkoholioksidaasi-säätelyalueen karakterisointi 15 Täydellinen AOX2-geeni sisältyy kuviossa 1(b) annettavaan restriktiokarttaan. AOX2-säätelyalue sijaitsee 5'-pään ensimmäisen EcoRI-paikan ja AOX2-rakenne-geenin aloituskodonin välissä, kuten on esitetty restriktiokartassa kuviossa 1(b). Sitä osaa DNA-sekvenssistä, joka koodittaa alkoholioksidaasi II -proteiinia, ilmaistaan paksulla pylväällä restriktiokartan alla. Alkoholioksidaasi I -geenin restriktiokartta 20 annetaan kahden kyseisen geenin vertailun vuoksi, kuvio 1(a). Mitään merkittävää i · a : ·. sekvenssihomologiaa ei havaittu geemen proteiinia koodittavan osan ulkopuolella.

• · # *

Lisäkarakterisoinnin perusteella lacZ-fuusiorakenteen avulla AOX2-säätelyalue ei • tarvitse enempää kuin noin emäsparit 1500 - noin -1 säätelyaktiivisuuteen (kuten on i.: · osoitettu taulukossa 1). Taulukossa 1 annetaan AOX2-säätelyalueen sisältävän 25 DNA-palasen nukleotidisekvenssi.

... Taulukko 1 AOX2-säätelyalue ja 5'-pään ei-Iuettava alue « « · -1750 -1730 -1710

; GGATCTCAAAAACCTAAGTACTTCATTTGAATATAACTCTGCACCTAAATTTACACCTAA

-1690 -1670 -1650

‘ ' 30 CTCTCTATCTAGGCTCTAGATTTGATAGATTCTATAGCCTTTGGTTTGTTATAGTGTTCA

-1630 -1610 -1590

CCAACTGGATGTCCTAACGAAATGGTTCTGTGGTCTAGTTGGTTATGGCATATGCTTAAC

5 105825 -1570 -1550 -1530 ACGCATAACGTCCCCAGTTCGATCCTGGGCAGAATCATTATTTTTTGACCGAATTCTTTT -1510 -1490 -1470 TTT CAGAC CATATGAC CGGTC CATCTTCTACGGGGGGATTATCTATGCTTTGACCTCTAT 5 -1450 -1430 -1410 CTTGATTCTTTTATGATTCAAATCACTTTTACGTTATTTATTACTTACTGGTTATTTACT -1390 -1370 -1350 TAGCGCCTTTTCTGAAAAACATTTACTAAAAATCATACATCGGCACTCTCAAACACGACA -1330 -1310 -1290

10 GATTGTGATCAAGAAGCAGAGACAATCACCACTAAGGTTGCACATTTGAGCCAGTAGGCT

-1270 -1250 -1230 cctaatagaggttcgatacttattttgataatacgacatattgtcttacctctgaatgtg -1210 -1190 -1170 tcaatactctctcgttcttcgtctcgtcagctaaaaatataacacttcgagtaagatacg 15 -1150 -1130 -1110 CCCAATTGAAGGCTACGAGATACCAGACTATCACTAGTAGAACTTTGACATCTGCTAAAG -1090 -1070 -1050 CAGATCAAATATCCATTTATCCAGAATCAATTACCTTCCTTTAGCTTGTCGAAGGCATGA -1030 -1010 -990

20 AAAAGCTACATGAAAATCCCCATCCTTGAAGTTTTGTCAGCTTAAAGGACTCCATTTCCT

-970 -950 -930 AAAATTTCAAGCAGTCCTCTCAACTAAATTTTTTTCCATTCCTCTGCACCCAGCCCTCTT -910 -890 -870

;;· : CATCAACCGTCCAGCCTTCTCAAAAGTCCAATGTAAGTAGCCTGCAAATTCAGGTTACAA

:· 25 -850 -830 -810

:. ί.: CCCCTCAATTTTCCATCCAAGGGCGATCCTTACAAAGTTAATATCGAACAGCAGAGACTA

-790 -770 -750

j.;i AGCGAGTCATCATCACCACCCAACGAT GGTGAAAAACTTTAAGCATAGATTGATGGAGGG

:T: -730 -710 -690

3 0 TGTATGGCACTTGGCGGCTGCATTAGÄGTTTGAAACTATGGGGTAATACATCACATCCGG

' .*··. -670 -650 -630

.'··*. AACTGATCCGACTCCGAGATCATATGCAAAGCACGTGATGTACCCCGTAAACTGCTCGGA

-610 -590 -570

:.: : TTATCGTTGCAATTCATCGTCTTAAACAGTACAAGAAACTTTATTCATGGGTCATTGGAC

35 -550 -530 -510

. 1'* ’. TCTGATGAGGGGCACATTTCCCCAATGATTTTTTGGGAAAGAAAGCCGTAAGAGGACAGT

-490 -470 -450 6 105825 TAAGCGAAAGAGACAAGACAACGAACAGCAAAAGTGACAGCTGTCAGCTACCTAGTGGAC -430 -410 -390 AGTTGGGAGTTTCCAATTGGTTGGTTTTGAATTTTTACCCATGTTGAGTTGTCCTTGCTT -370 -350 -330 5 CTCCTTGCAAACAATGCAAGTTGATAAGACATCACCTTCCAAGATAGGCTATTTTTGTCG -310 -290 -270 CATAAATTTTTGTCTCGGAGTGAAAACCCCTTTTATGTGAACAGATTACAGAAGCGTCCT -250 -230 -210 ACCCTTCACCGGTTGAGATGGGGAGAAAATTAAGCGATGAGGAGACGATTATTGGTATAA 10 -190 -170 -150 AAGAAGCAACCAAAATCCCTTATTGTCCTTTTCTGATCAGCATCAAAGAATATTGTCTTA -130 -110 -90 AAACGGGCTTTTAACTACATTGTTCTTACACATTGCAAACCTCTTCCTTCTATTTCGGAT -70 -50 -30

15 CAACTGTATTGACTACATTGATCTTTTTTAACGAAGTTTACGACTTACTAAATCCCCACA

-10

AACAAATCAACTGAGAAAA

AOX2-säätelyalue reagoi vähintään yhteen seuraavista olosuhteista: metanolin läsnäolo ainoana hiilenlähteenä metylotrofisille hiivaisännille, kuten esimerkiksi Pichia 20 pastoris, tai hiilenlähteen niukkuus mainituilla isäntäsoluilla. AOX2-säätelyalue stimuloi lisäksi 5-11 % β-galaktosidaasiproteiinituotannosta kuten AOX1-säätelyalue.

.·. II. Alkoholioksidaasi Π -säätelyalueen eristäminen Pichia pastoriksesta * ·« · ί " AOX2-säätelyalue eristettiin transformoimalla Pichia-kanta MC100-3 (arg4 his4 aoxlA::SARG4 aox2A::Phis4). Tämä kanta sisältää Pichia HIS4-geenin mutantti- • » '.*·: 25 kopion liitettynä AOX2-geeniin. MC100-3 transformoitiin pYM5:llä plasmidilla, Ι#:*: joka koostuu 2,7 ke:tä sisältävästä Bglll-palasesta, joka sisältää Pichia HIS4 -geenin :T: liitettynä pBR322:n BamHI-paikassa. Usean MClOO-3 (pYM5) His+ -transforman- tin DNA:ta seulottiin Southem-suodinhybridisaation avulla, kohteena transforman-.···. tit, jotka sisälsivät pYM5:n yhdistyneenä HIS4-palaseen, sijoittuneena MC 100-3:n /···, 30 AOX2-lokukseen. DNA:ta yhdestä näistä kannoista hydrolysoitiin sen jälkeen

Hindlllilla, josta oli seurauksena noin 12 ke:tä sisältävän genomisen palasen vapau-: tuminen, joka sisälsi 5,3 keitä sekvenssiä AOX2 Kpnl -paikan 5-puolelta, 2,7 keitä

Pichia HIS4-geenistä, ja 4,0 keitä pBR322:sta. Hindlllilla katkaistu DNA ligoitiin ja .·*·. transformoitiin E. coliin. Transformantteja valikoitiin ampisilliiniresistenssin perus- i 7 105825 teella. Yksi plasmidi, pMR4, saatiin talteen, ja tämän plasmidin restriktiokartta esitetään kuviossa 5.

m. AOX2-säätelyalueen ominaisuuksia AOX2-säätelyalueen ilmenemisen vertailemiseksi AOXl:n ilmenemiseen, konstra-5 oitiin AOX2-lacZ-ekspressiovektori, joka oli mahdollisimman samanlainen kuin pSAOH5 (esitetty kuviossa 10), AOXl-lacZ-fuusiovektori. AOX2-lacZ-vektorin, pYJ55:n, konstruoinnin virtauskaavio esitetään kuviossa 9. Alustavat DNA-sekvens-situlokset AOX2:n 5'-päästä osoittivat, että AOX2 sisältää kaksi BamHI-paikkaa täysin samanlaisissa rakennegeenin asemissa kuin AOXl-rakennegeenistä tavatut. 10 pYJ55:n konstruoinnin ensimmäisessä vaiheessa liitettiin sen vuoksi 1,8 ke:tä sisältävä Bglll-BamHI -palanen, joka sisältää AOX2-säätelyalueen ja 45 emäsparia ami-noterminaalisesta proteiinia koodatavasta sekvenssistä, pBPfl:n BamHI-paikkaan pYJ38:n muodostamiseksi. Toisessa vaiheessa pYJ38 katkaistiin BamHIillä, ja sama adaptorioligonukleotidi liitettiin, kuin mikä liitettiin AOXl-lacZ-vektorin (5-' 15 GATCACCCGGGT-3') konstruoinnissa. Tämän adaptorin liittäminen tuhosi pYJ38:n BamHI-paikan ja sai aikaan uuden Smal-paikan liittämiskohdassa. Tämä plasmidi, pYJ45, hydrolysoitiin Smalillä, ja 1,6 ke:tä sisältävä Smal-palanen, joka sisälsi modifioidun AOX2-promoottorin, liitettiin pBPflieen plasmidin pYJ46 muodostamiseksi. Plasmidi pYJ4ö hydrolysoitiin EcoRIillä 0,3 keitä sisältävän palan 20 poistamiseksi AOX2-palasen 5'-päästä pYJ46:ssa. Plasmidi ligoitiin uudelleen plasmidin pYJ55 muodostamiseksi. Plasmidin pYJ55 restriktiokartta annetaan käyttöön kuviossa 8.

• · • · · '* " Plasmidi pYJ55 transformoitiin kantaan GS115 (his4), ja His+-transformanteista seulottiin pysyvä His+-fenotyyppi, jossa näkyi liittyneen plasmidin läsnäolo. Usean • · 25 pysyvän His+-kannan genominen DNA analysoitiin Southem-suodinhybridisaation : m\ \ avulla plasmidin läsnäolon varmistamiseksi ja sijainnin määrittämiseksi.

• · » • · · * · · AOX1- ja AOX2-promoottorien suhteellisten tehokkuuksien estimoimiseksi, β-ga-laktosidaasin tuotantoa pYJ55:n ja p$AOH5:n avulla vertailtiin, transformoimalla • a nämä plasmidit kantaan GS115. Transformoituja GS115-kantoja merkittiin koodeilla 30 GS115(pYJ55) ja GS115(pSAÖH5) vastaavasti. Kumpikin kanta sisältää plasmidin : kiinnittyneenä HIS4-lokuksessa. Kummankin kannan soluja kasvatettiin glyseroli- alustassa, siirrettiin alustaan, jossa ei ollut typpilähdettä 24 tunnin ajaksi, ja siirret- «« · tiin sen jälkeen metanolia sisältävään alustaan vielä 50 tunniksi. Näytteitä otettiin jokaisen viljelmän jokaisen kasvuvaiheen lopussa, ja uutteita valmistettiin, ja niistä : 35 määritettiin β-galaktosidaasi. Näiden määritysten tulokset esitetään taulukossa 2.

8 105825

Taulukko 2 AOX1- ja AOX2-fuusiovektoreista ilmenevän β-galaktosidaasin vertailu β-galaktosidaasin aktiivisuus (U^g) hiilenlähteessä Kanta Promoottori Glyseroli Ei hiiltä1 Metanoli1 5 GS115 (pSAOH5) AOX1 <10 955 6205 GS115(pYJ55) AOX2 <10 109 739 1) YNB-alusta

Merkittäviä määriä β-galaktosidaasia ei todettu glyserolissa kasvaneissa soluissa kummallakaan kannoista AOXl-lacZ tai AOX2-lacZ. Alustassa, jossa ei ollut lain-10 kaan hiilenlähdettä, aktiivisuustaso AOX2-lacZ-kannalla oli suunnilleen yksi kymmenesosa siitä tasosta, joka havaittiin AOXl-lacZ-kannalla. Metanolin lisääminen AOX2-lacZ:n sisältäviin soluihin johti β-galaktosidaasitasoihin, jotka saavuttivat noin yhden yhdeksäsosan AOXl-lacZ-solujen tasoista. AOX1- ja AOX2-geenejä säädellään siten samalla tavalla. Yksi erottuva ominaisuus on AOX2-säätelyaluee-15 seen liittyvä merkittävästi alhaisempi vaste metanolille ja hiilenlähteen niukkuuteen.

Vaikkakin AOX2-säätelyalue-3-galaktosidaasigeenifuusion saattamista isäntähiiva-soluun kuvailtiin tässä, alaa tuntevat tietävät, että tämän keksinnön käytäntöön soveltamisen kannalta ei ole välttämätöntä käyttää renkaan muotoisia plasmideja eikä β-galaktosidaasin rakennegeeniä. Muita vektoreita, joita pystytään säilyttämään hii-20 voissa, voidaan siten käyttää hyödynnettäessä tätä säätelyaluetta muiden heterologis-ten geenien kanssa. Tämä toiminnallisesti muihin heterologisiin geeneihin kytkeyty- ;;· : nyt säätelyalue voidaan vaihtoehtoisesti kiinnittää isäntähiivasolun kromosomiin • « '· y käyttäen liittäviä vektoreita. Tässä kuvaillun AOX2-säätelyalueen toiminnallisia mu- tantteja, jotka käsittävät lyhemmän DNA-sekvenssin 5'-päästä, voidaan lisäksi myös • · 25 käyttää heterologisen geenin ilmentymisen säätelemiseksi.

• · • ♦ * • ♦ · *···* Esimerkkejä • ♦ · * Esimerkkeihin liittyvä yleinen informaatio ... Kannat • · • · • · · ·**’: Pichia pastoris NRRL Y-11430 30 Pichia pastoris GS115 (his4) NRRL Y-15851

Pichia pastoris PPF1 (arg4 his4) NRRL Y-18017 ’··.·* Pichia pastoris KM7121 (arg4 his4 aoxlA::SARG4 aox2A: :PHIS4) NRRL Y-18019 * « · j*; E. coli MC 1061 [FaraD139 (ara ABDIC-leu) 7679 lacX74 galU galK rpsL hsdR] • « 9 105825

Alustat, puskurit ja liuokset 1 M Tris-puskuri 121,1 g Tris-emästä 800 ml:ssa H20; pH säädetään haluttuun arvoon lisäämällä väkevöityä (35 %) vedellistä HCl:a; liuoksen annetaan jäähtyä huoneen lämpötilaan ennen lopul-5 lista pH:n säätämistä, laimennetaan 1 l:n lopputilavuuteen.

TE-puskuri 1,0 mM EDTA 0,01 M (pH 7,4) Tris-puskurissa SSC 0,15 MNaCl 15 mM natriumsitraatti pH säädettynä 7,0:ksi NaOH.lla 10 TAE 40 mM etikkahappo

5 mM EDTA

0,02 M (pH 8,3) Tris-puskurissa

Denhardt'in liuos 5 g Ficoll (50x) 5 g polyvinyylipyrrolidoni 15 5 g naudan seerumin albumiini (BSA; Pentax Fraction V) lopputilavuus säädettynä 500 ml:ksi vedellä

20X SSPE 20 mM EDTA

0,16 MNaOH

0,2MNaH2PO4.H2O

20 3,6 MNaCl pH säädettynä 7,0:ksi NaOH:lla LB(Luria-Bertani)- 5 g Bacto-tryptonia . :': alusta 5 g Bacto-hiivauutetta 2,5 g NaCl.a ' ·.. 1 l:ssa vettä, pH säädettynä 7,5:ksi . 25 NaOH:lla « · : YPD-alusta 1 % Bacto-hiivauutetta • ·· .·' 2 % Bacto-peptonia **.*..* 2 % dekstroosia YNB-alusta 6,75 g hiivan typpiperusalustaa ilman aminohappoja 30 (DIFCO) 1 l:ssa vettä SED 1M sorbitoli

.O 25 mM EDTA

50 mM DTT

• I I

.· · ·. SCE-puskuri 9,1 g sorbitolia 35 1,47 g natriumsitraattia O 0,168 gEDTA:a F\: 50 ml H20:ta 10 105825 -pH 5,8:ksi HCl:llä CaS 1 M sorbitoli 10 mM CaCl2 —steriloidaan suodattamalla 5 PEG-liuos 20 % polyetyleeniglykoli-3350:a 10 mM CaCl2 10 mM Tris.HCl (pH 7,4) —steriloidaan suodattamalla SOS 1 M sorbitoli 10 0,3x YPD-alusta 10 mM CaCl2

Formamidiväriseos 0,1 % ksyleenisylenoli FF:a

0,2 % bromifenolisinistä 10 mM EDTA

15 95 % ionivaihdettua formamidia

Pintageeli 76,8 g ureaa 24 ml akryyliamidi-kantaliuosta 8 ml lOx TBE:a säädetään lopputilavuuteen 160 ml 20 Akryyliamidikanta- 38 g akryyliamidia liuos 2 g bis(N,N-metyleenibisakryyliamidi):a, lisätään vettä ko konaistilavuuteen 100 ml Pohjageeli 14,4 g ureaa : 390 g sakkaroosia " 25 7,5 ml lOx TBE:a 4,5 ml akryyliamidi-kantaliuosta 0,3 ml bromifenolisininen-liuosta (0,01 g/ml) lisätään vettä : kokonaistilavuuden saamiseksi 30 ml:ksi

IM

dideoksi:

30 ddATP 0,125 mM

ddCTP 0,10 mM

ddGTP 0,10mM

ddTTP 0,80 mM

i. i : DNTP-kantaliuokset 0,5 mM dGTP

35 0,5 mM dCTP

.·'··. 0,5mMTTP

0,5 mM dATP

• « · 7 • « • i n 105825 10X Klenow-laimen- 70 mM Tris.HCl, pH 7,5 nuspuskuri 200 mM NaCl

70 mM MgCl2 1 mM EDTA

5 10X TMD, pH 795 0,1 M Tris.HCl, pH 7,5

0,05MMgCl2 0,075 MDTT

Ellei toisin ole mainittu, edelliset liuokset tarkoittavat käytettyä peruspitoisuutta (Ix). Kautta esimerkkien, joissa käytetään erilaisia pitoisuustasoja, kyseinen seikka 10 osoitetaan viittaamalla liuokseen perus (lx) -pitoisuuden kerrannaiseen.

Regeneraatioagar 1) Agar-KCl: 9 g Bacto-agaria, 13,4 g kaliumkloridia, 240 ml H20:ta, autoklavoi-daan.

2) lOx glukoosi: 20 g dekstroosia, 100 ml H20:ta, autoklavoidaan.

15 3) lOx YNB: 6,75 g Yeast Nitrogen Base'a (hiivan typpiperusalusta) ilman amino happoja, 100 ml H20:ta, autoklavoidaan. (Lisätään mitä tahansa haluttua aminohappoa tai nukleiinihappoa pitoisuuteen 200 μg/ml saakka ennen tai jälkeen autoklavoi-nnin.) . 4) Lisätään 30 ml lOx glukoosia ja 30 ml lOx YNB:a 240 ml:aan sulatettua Agar-

I

j;' ’ 20 KCl-liuosta. Lisätään 0,6 ml biotiinia, 0,2 mg/ml, ja mitä tahansa haluttua amino- • " happoa tai nukleiinihappoa pitoisuudeksi 20 pg/ml. Pidetään sulatettua regeneraa- tioagaria 55-60°C:ssa.

• « • · · • ·· • · : Pichia pastoriksen kasvatus • · · · • · · ’ P. pastorista kasvatettiin YPD (rikas)- tai YNB (minimaalinen)-alustassa. Tarpeen 25 mukaan YNB-alustaan lisättiin hiilenlähde (2 % dekstroosia, 1 % glyserolia tai : 0,5 % metanolia) ja 50 μg/ml aminohappoa.

• · · ' Sekvensointi w f • · ·

• I I

I I « f

. · ·. DNA:n sekvensointi suoritettiin Sangerin et ai. ketjuterminaatiomenetelmällä, PNAS

;;; 74,5463 (1977).

• · • · • · · • · » • · · • · • · 12 105825

Seuraavia lyhenteitä käytetään kauttaaltaan esimerkeissä: EDTA etyleenidiamiinitetraetikkahappo TEMED Ν,Ν,Ν',Ν'-tetrametyleenidiamiini DTT ditiotreitoli 5 BSA naudan seerumin albumiini

EtBr etidiumbromidi

Ci Curie dATP deoksiadenosiinitrifosfaatti dGTP deoksiguanosiinitrifosfaatti 10 TTP tymidiinitrifosfaatti dCTP deoksisytidiinitrifosfaatti dXTP "yleis"deoksitrifosfaattinukleotidi oligo(dT)i2-i8 Lähde: Collaborative Research, Inc.

Zymolyase 60 000 Lähde: Miles Laboratories 15 Alkoholioksidaasi Π -säätelyalueen eristäminen

Esimerkki 1 PPF1 X KM7121 -pariuttaminen ja MC100-3:n kehittäminen

Pichia pastoris PPF1 (arg4 his4) (NRRL Y-18017), ja KM7121 (arg4 his4 aoxlA::SARG4 aox2A::PHIS4 (NRRL Y-18019) siirrettiin kumpikin vasta kasvate-20 tulta YPD-maljalta steriiliä vettä sisältävään putkeen. Noin 5 X 107 solua kumpaa- • i * !!' ’ kin kantaa sekoitettiin, sonikoitiin lyhytaikaisesti soluklimppien rikkomiseksi, ja • levitettiin GNAP-agarmaljalle (5 % dekstroosia, 2 % peptonia, 1 % hiivauutetta, • · · ’;··) 0,5 % agaria, 2,3 % ravintoagaria). Sekoittamatonta kontrollinäytettä kummastakin ||l n ·· ”· kannasta (suunnilleen 1 X 10 solua) käsiteltiin samalla tavalla. GNAP-maljoja in- : 25 kuboitiin 30 °C:ssa noin 24 tuntia ja toistomaljattiin sen jälkeen sporulointialusta- II» : agarmaljoille (0,5 % Na-asetaattia, 1 % KCl:a, 2 % agaria). Näitä maljoja inkuboi- tiin noin 20 tunnin ajan 30 °C:ssa ja toistomaljattiin sen jälkeen minimaalialusta-agarmaljoille, jotka eivät sisältäneet hiilenlähdettä. Metanoli syötettiin soluille mi- • · · .··*. nimaalimaljoilla kaasufaasissa.

• t · : 30 Viiden päivän kuluttua ilmestyi noin 200 pesäkettä minimaalimaljalle, jolle siirros- : tettiin soluseos. Pesäkkeitä ei kehittynyt lainkaan sekoittamattomia kontrolleja sisäl- täville maljoille, tulos, joka viittaa siihen, että Arg+ His+ Mut+ -pesäkkeet sekamal- • * jalla olivat diploidisia, mikä oli tuloksena PPF1- ja KM7121-solujen pariutumisista · * · i 13 105825 (Mut+ = metanolin käyttäminen). Näiden Arg+ His+ Mut+ -kantojen diploidisuus varmistettiin tarkastelemalla AQX-lokuksia neljällä näistä kannoista Southem-suodin-hybridisaation avulla. Spesifiset koettimet, joita käytettiin, olivat: pPG3,0 (NRRL B-18022), AOX2-spesifinen koetin; pYJ30 (NRRL B-15890), HIS4-spesifinen koe-5 tin; ja pPG4,0 (NRRL B-15868), AOXl-spesifinen koetin.

PPF1 X KM7121 -diploidien itiöimistä varten poimittiin ensin pesäke (MC100) metanolialustaa sisältävältä diploidinvalintamaljalta. Näistä soluista noin 1 X 106 levitettiin GNAP-maljoille, ja niitä käsiteltiin kuten on kuvailtu pariutumismenettelyn kohdalla, paitsi että itiöimismaljaa inkuboitiin neljän päivän ajan 30 °C:ssa, anta-10 maila solujen saattaa itiöinti päätökseen. Itiöt otettiin talteen maljoilta huuhtelemalla jokainen malja 5 ml:lla steriiliä vettä. Suspensio pestiin kahdesti 3 ml:lla fosfaatti-puskuria (0,1 M Na3P04, pH 7,5). Hiivaa hajottavien entsyymien seosta, Glusulase (Endo Laboratories, NY) ja Zymolyase (60 000 yksikköä/g; Miles Laboratories), ja β-merkaptoetanolia lisättiin loppupitoisuuksiin 2 % (v/v), 0,5 mg/ml, ja 0,1 %, vas-15 taavasti, vegetatiivisolujen tuhoamiseksi. Seosta inkuboitiin 5 tunnin ajan 30 °C:ssa.

Itiövalmistetta pestiin sen jälkeen kahdesti steriilissä vedessä, joka sisälsi 0,2 % Tween 80:ä (v/v), ja se resuspendoitiin fosfaattipuskuriin. Valmistetta käsiteltiin sen jälkeen kolmessa 20 sekuntia kestävässä sonikointisyklissä itiökokkareiden hajottamiseksi. Itiövalmistenäyte laimennettiin sen jälkeen ja levitettiin ei-valikoiville, 20 minimaalialustaa sisältäville esiviljelymaljoille, joka alusta sisälsi 2,0 % glukoosia ja 50 μg/ml sekä arginiinia että histidiiniä. Näitä inkuboitiin 48 tuntia 30°C:ssa. Jokainen esiviljelymalja toistomaljattiin sen jälkeen seuraavalle minimaalimaljasarjal- • I ·

Ml I f .. le: • * • · m 1) glukoosi, -arg, -his 2) glukoosi, -arg, +his 3) glukoosi, +arg, -his ja 4) glukoosi, :*··: 25 +arg, +his.

• · • · · • · · T..‘ Kahdenkymmenenneljän tunnin inkuboinnin jälkeen 30°C:ssa pesäkkeitä tarkastel tiin Arg- ja His-fenotyyppien suhteen. Pesäkkeet, jotka olivat Arg+ His*, testattiin sen jälkeen kasvun osalta metanolilla, levittämällä YNB-metanoliagarmaljoille. *···* Maljoja tarkasteltiin Mut-fenotyypin suhteen noin yhden viikon huoneen lämpöti- ’...: 30 lassa kuluttua. Yhtä Arg+ His" Mut -kantaa merkittiin koodilla MC 100-3.

m • « t » » • · · • · · » • a ...

• · • · • · * m • aa • * * * ♦ » · » · · * · I4 105825

Esimerkki II

Pichia pastoriksen transformointi

Hiivasoluja siirrostettiin noin 10 ml:aan YPD-alustaa, ja niitä viljeltiin ravistelussa 30 °C:ssa 12-20 tunnin ajan. Solut laimennettiin sen jälkeen Aöoo-arvoon noin 0,01-5 0,1, ja niitä pidettiin log-vaiheessa YPD-alustassa 30°C:ssa noin 6-8 tunnin ajan.

100 inkaan YPD-alustaa siirrostettiin 0,5 ml siirrosviljelmää Aöoo-tasolla noin 0,1, ja sitä viljeltiin ravistellen 30 °C:ssa noin 12-20 tuntia. Kasvusto otettiin sen jälkeen talteen sentrifugoimalla, kun Aöoo oli noin 0,2-0,3 (suunnilleen 16-20 tunnin kuluttua), käyttäen DAMON IEC DPR6-000 -sentrifugia nopeudella 1500 g 5 minuutin 10 aikana.

Sferoplastien valmistamiseksi soluja pestiin kerran 10 mklla steriiliä vettä (sentrifu-gointi suoritettiin jokaisen pesun jälkeen kuten edellä on kuvailtu), kerran 10 mklla juuri valmistettua SED:a, kerran 10 mklla steriiliä 1 M sorbitolia, ja ne suspendoi-tiin uudelleen 5 mkaan SCE-puskuria. 5 μΐ Zymolyase 60 000 -liuosta (Miles Labo-15 ratories), 4 mg/ml, lisättiin, ja soluja inkuboitiin 30 °C:ssa noin 30 minuutin ajan.

Sferoplastien muodostumista seurattiin seuraavasti. 100 pkn solueriä lisättiin 900 pkaan 5-%:ista SDS:a ja 900 pkaan 1 M sorbitolia ennen Zymolyase-lisäystä tai juuri sen jälkeen, ja eri ajankohtana inkubaatiojakson aikana. Inkubointi lopetettiin kohdassa, jolloin solut hajoavat SDS:ssä mutta eivät sorbitolissa. Muodostuneita 20 sferoplasteja pestiin kerran 10 mkssa steriiliä 1 M sorbitolia sentrifugoimalla nopeudessa 1000 g 5-10 minuutin aikana, niitä pestiin kerran 10 mkssa steriiliä CaS:a :.: ! sentrifugoimalla, ja ne suspendoitiin uudelleen 0,6 mkaan CaS:a.

i <

• I

I ' . ,·, Varsinaista transformaatiota varten, DNA-näytteitä vedessä tai TE-puskurissa lisät- tiin (20 μ1:η kokonaistilavuuteen saakka) 12 X 75 mm:n steriileihin polypropyleeni- i 1> ,1 .1 25 putkiin. (Pienillä DNA-määrillä tapahtuu maksimaalista transformaatiota, kun käy- tetään noin 1 μΐ E. colin sonikoitua DNA:ta, 5 mg/ml, kussakin näytteessä). 100 μΐ i « · *·1 1 sferoplasteja lisättiin jokaiseen DNA-näytteeseen ja inkuboitiin huoneen lämpötilas sa noin 20 minuutin ajan. 1 ml PEG-liuosta lisättiin kuhunkin näytteeseen ja inku- • · · boitiin huoneen lämpötilassa noin 15 minuuttia. Näytteitä sentrifugoitiin nopeudessa 30 1000 g 5-10 minuutin ajan, ja supematantti hylättiin. Pelletit resuspendoitiin ; .·. 150 pkaan SOS:a, ja niitä inkuboitiin huoneen lämpötilassa 30 minuutin ajan.

• · · *'.··1 850 μΐ steriiliä 1 M sorbitolia lisättiin jokaiseen, ja näytteet maljaviljeltiin kuten • · * 1 jäljempänä on kuvailtu.

• · 1 • · • · • · · · « • · • · • 15 105825 10 ml regeneraatioagaria kaadettiin kullekin maljalle vähintään 30 minuuttia ennen kuin transformaationäytteet olivat valmiit. 10 ml:n eriä regeneraatioagaria jaettiin myös putkiin 45-50-°C:isessa hauteessa sen ajanjakson aikana, kun transformaatio-näytteet olivat SOS:ssä. Näytteet lisättiin sen jälkeen putkiin, valettiin maljoille, jot-5 ka sisälsivät kiinteän pohja-agarkerroksen, ja niitä inkuboitiin 30 °C:ssa 3-5 päivän ajan.

Sferoplastien laatu eri kohdissa määritettiin seuraavasti. 10 μ1:η näyte poistettiin ja laimennettiin 100 X:ksi lisäämällä näyte 990 pl:aan 1 M sorbitolia. 10 pl:aa laimennusta poistettiin, ja 990 pl:n lisäerä 1 M sorbitolia lisättiin. 100 pl:aa kumpaakin lai-10 mennusta levity s viljeltiin YPD-agaralustan pinnalle valmisteeseen jääneiden ei-sferoplastisten ehjien solujen pitoisuuden määrittämiseksi. 100 pl.aa kutakin laimennusta lisättiin 10 ml:aan regeneraatioagaria, johon oli lisätty 40 pl/ml kaikkia isännän tarvitsemia aminohappoja, regeneroitavissa olevien kokonaissferoplastien määrittämiseksi. Hyviä arvoja transformaatiokokeeseen olivat 1-3 X 107 regeneroi-15 tavissa olevaa kokonaissferoplastia/ml, ja noin 1 X 103 kokonaista solua/ml.

Esimerkki III

MC100-3:n (pYM5) konstruointi

Noin 10 pg pBR322:ta hydrolysoitiin BamHIillä ja defosforyloitiin. Noin 50 pg pYJ8:aa (NRRL B-15889), joka sisältää Pichia HIS4-geenin, hydrolysoitiin 20 BglII:lla. 2,7 ke:tä sisältävä Bglll-palanen eristettiin 0,8-prosenttisesta preparatiivi-sesta agaroosigeelistä. 300 ng palasta ja 300 ng BamHI-hydrolysoitua pBR322:ta li-:. i : goitiin käyttäen 0,5 yksikköä T4 DNA -ligaasia 10 pl:n kokonaistilavuudessa, joka

; ''· sisälsi 66 mM Tris.HCha, pH 7,4, 6,6 mM MgCl2:a, 10 mM DTT:a, ja 0,4 mM

ATP:a, 24 tunnin aikana 4 °C:ssa.

• · * · · • ·· 25 Ligaatioseosta käytettiin transformoitaessa E. coli MC1061 ampisilliinille resisten- • · · **.j/ tiksi, kuten on kuvailtu esimerkissä V. Transformantit karakterisoitiin restriktiohyd- *·* * rolyysien avulla, ja liitännäisen oikea koko ja orientaatio varmistettiin agaroosigee- lielektroforeesin avulla. Tätä plasmidia nimitettiin pYM5:ksi, ja se otettiin talteen E. colista käyttäen alkaliseen hajotukseen perustuvaa plasmidinvalmistustekniikkaa, • t · 30 jota on kuvaillut Maniatis et ai. (1982) (Maniatis, T., Fritsch, E.F., ja Sambroox, J.

# : (1982). Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory, *,··, Cold Spring Harbor, NY.).

• ·

Noin 10 pg pYM5:a hydrolysoitiin Stul.llä ennen transformointia MC100-3:een. Tämä vaihe ohjasi plasmidin kiinnittymään MC 100-3:ssa läsnä olevaan toiseen

• V

I6 105825 HIS4-geenisekvensseistä, joko natiiviin HIS4-lokukseen tai modifioituun AOX2-lo-kukseen. Transformointi suoritettiin esimerkissä Π esitettyjen menettelyjen mukaisesti.

Usean MCI00-3(pYM5) His+ -transformantin DNA:ta eristettiin esimerkin IV mu-5 kaisesti, ja seulottiin Southem-suodinhybridisaation avulla transformanttien suhteen, jotka sisälsivät pYM5:n yhdistyneenä AOX2:ssa sijaitsevaan HIS4-palaseen. Spesifiset koettimet, joita käytettiin, olivat: pPG 3,0 (NRRL B-18022), AOX2-spesifi-nen koetin; pYJ30 (NRRL B-15890), HIS4-spesifinen koetin.

Alkoholioksidaasi II -säätelyalueen ominaisuuksia 10 Esimerkki IV

Hiiva-DNA:n preparointi

Hiivasoluja kasvatettiin 100 ml:ssa YNB-alustaa, joka sisälsi 2 % dekstroosia. 30 °C:ssa, kunnes A^oo-arvo oli 1-2, ja pelletoitiin sen jälkeen käyttäen Damon IEC DPR-6000 -sentrifiigia nopeudessa 2000 g 5 minuutin aikana. Pelletti pestiin kerran 15 tislatulla vedellä, kerran SED:llä, kerran 1 M sorbitolilla, ja resuspendoitiin sen jälkeen 5 mkaan liuosta, joka sisälsi 0,1 M Tris.HCka, pH 7,0, ja 1 M sorbitolia. Solut sekoitettiin sen jälkeen 50-100 μ1:η kanssa Zymolyase 60 000-liuosta, 4 mg/ml, (Miles Laboratories), ja niitä inkuboitiin 30 °C:ssa 1 tunti. Muodostuneita sferoplas-teja sentrifugoitiin sen jälkeen nopeudessa 1000 g 5-10 minuutin ajan, ja ne suspen-20 doitiin 5 mkaan hajotuspuskuria [0,1 % SDS:a, 10 mM Tris.HCka (pH 7,4), 5 mM EDTA:a ja 50 mM NaCka]. Proteinase K:ta (Boehringer Mannheim) ja RNase Aita :.i : (Sigma) lisättiin kumpaakin pitoisuuteen 100 μg/ml, ja liuosta inkuboitiin 37 °C:ssa

I I

! '· 30 minuutin ajan. DNA:sta poistettiin proteiini sekoittamalla valmistetta kevyesti ί ,ί,ϊ yhtä suuren kloroformitilavuuden kanssa, joka sisälsi isoamyylialkoholia (24:1, v/v), 25 ja faasit erotettiin sentrifugoimalla nopeudessa 12 000 g 20 minuutin aikana. Ylempi • ·*: (vedellinen) faasi imettiin pois uuteen putkeen ja uutettiin vastaavalla tilavuudella M* · fenoli/kloroformi/isoamyylialkoholia. Faasit erotettiin kuten edellä, ja pintafaasi laitettiin putkeen, joka sisälsi 2-3 tilavuutta kylmää 100-%:ista etanolia. Näytettä se-

..... koitettiin kevyesti, ja DNA kerättiin talteen kiertämällä muovisauvan pintaan. DNA

• · y.\' 30 liuotettiin välittömästi 1 mkaan TE-puskuria ja dialysoitiin yli yön 4 °C:ssa 100 tila- ';''' vuusosaa vastaan TE-puskuria.

• I

« I

« I · III · « I · • « « · < I · • « 1 • · • « I t t « · ·

• · V

• * • > „ 105825

Esimerkki V pMR4:n konstruointi DNA eristettiin esimerkissä TV olevan menetelmän mukaisesti esimerkissä ΠΙ muodostetusta MCI00-3(pYM5) His+ -transformantista. 10 pg tätä genomista DNA.ta 5 hydrolysoitiin HinddlLlla ja ligoitiin. Ligaatioreaktio suoritettiin 4 °C:ssa 24 tunnin aikana liuoksessa, joka sisälsi 66 raM Tris.HClia, pH 7,4, 6,6 mM MgCl2:a, 10 mM DTT:a, 0,4 mM ATP:a, ja 0,5 yksikköä T4 DNA -ligaasia.

Ligaatioseos transformoitiin suoraan E. coli MC 1061 -soluihin, jotka oli tehty kompetenteiksi transformaatiota varten ja transformoitiin kuten Maniatis et ai. on kuvail-10 lut (1982). Valikointi ampisilliiniresistenssin suhteen suoritettiin viljelemällä soluja joko LB-alustassa tai 2B-alustassa (0,2 % NHLtPO^a, 1,2 % Na2HP04:a, 0,013 % MgS04.7H20:a, 0,074 % CaCl2.2H20:a, 1 μg/ml tiamiinia, 0,4 % dekstroosia), joihin oli lisätty 50 pg/ml ampisilliiniä.

12,0 ke:tä sisältävä plasmidi, jota merkittiin koodilla pMR4, otettiin talteen Mania-15 tiksen et ai. mukaisesti (1982). Tämä plasmidi sisälsi 5,3 keitä DNAista AOX2 Kpnl -paikan 5'-puolelta, 2,7 keitä Pichia HIS4 -geenistä ja 4,0 keitä pBR322.sta.

Esimerkki VI pYJ55:n konstruointi AOX2-promoottorin säätelyn ja ilmentämisen määrittämiseksi, konstruoitiin vektori, * 20 joka sisältää AOX2 5'-sekvenssin yhteenliittyneenä E. colin lacZ-geeniin. 50 pg « '· *' plasmidia pMR4 (esimerkki V) hydrolysoitiin Bglllilla ja BamHIillä valmistajan :.i·' ohjeiden mukaisesti. 1,8 keitä sisältävä Bglll-BamHI-palanen, joka sisälsi AOX2- * ’·.*·: promoottorin, eristettiin 0,8-prösenttisesta preparatiivisesta agaroosigeelistä. 10 pg ·.· : pBPflia (NRRL B-15892) hydrolysoitiin BamHIillä, ja fosfori poistettiin käyttäen :T: 25 alkalista fosfataasia 50 pl:n reaktiotilavuudessa (1 U entsyymiä 37 °C:ssa 1 tunnin

aikana liuoksen sisältäessä 50 mM Tris.HClia, pH 9,0, 1 mM MgCl2:a, 100 pM

.··*: ZnCl2:a, 1 mM spermidiiniä).

• · · ·«· • · ·;· 300 ng 1,8 keitä sisältävää palasta ja 300 ng pBPflia ligoitiin T4-ligaasin kanssa • seuraavasti. Ligaatioreaktio suoritettiin 23 °C:ssa 1 tunnin aikana 10 pl:n reaktioti- ": 30 lavuudessa, joka sisälsi 66 mM Tris.HClia, pH 7,6, 5 mM MgCl2:a, 5 mM ditiotrei- • t · tolia, 1 mM ATP:a ja 1 Weissin yksikön T4-ligaasia. Muodostunutta vektoria nimitettiin koodilla pYJ3 8.

0 · 18 105825

Uusi Smal-katkaisupaikka muodostettiin pYJ38:ssa seuraavasti. Adaptorioligonu-kleotidi syntetisoitiin käyttäen Applied Biosystems'in DNA-synteesilaitetta, Model 380 A, käyttäen syaanietyylifosforamidiittikemiaa: 5' - GATCACCCGGGT -3' 5 10 pg plasmidia pYJ38 hydrolysoitiin BamHIillä ja käsiteltiin alkalisella fosfataasil- la kuten edellä. 1 pg edellä olevaa adaptoria ja 0,1 pg BamHIillä hydrolysoitua pYJ38:a ligoitiin käyttäen T4-ligaasia, kuten edellä on kuvailtu. Modifioitua vektoria nimitettiin koodilla pYJ45. 1,8 keitä sisältävä Smal-palanen, joka sisälsi modifioidun AOX2-promoottorin, saatiin hydrolysoimalla 50 pg pYJ45:a Smalillä. Pala-10 nen eristettiin 0,8-prosenttisesta preparatiivisesta agaroosigeelistä. 0,3 pg palasta ja 0,3 pg Smalillä hydrolysoitua pBPfl.a ligoitiin kuten edellä vektorin pYJ46 synnyttämiseksi. 0,3-ke:inen EcoRI-pala poistettiin AOX2-segmentin 5'-päästä plasmidissa pYJ46 seuraavasti. 10 pg plasmidia pYJ46 hydrolysoitiin EcoRIillä ja käsiteltiin al-kalisen fosfataasin kanssa, kuten edellä on kuvailtu. Erillinen 50 pgin erä pYJ46:a 15 hydrolysoitiin myös EcoRIillä, ja l,5-ke:inen pala eristettiin 0,8-prosenttisesta preparatiivisesta agaroosigeelistä. Noin 0,3 pg kumpaakin fosfataasilla käsiteltyä plasmidia pYJ46 ja eristetty pala ligoitiin ja transformoitiin E. coliin, kuten edellä on kuvailtu. Yksi plasmidi, jolla oli oikea rakenne, eristettiin, ja sitä merkittiin koodilla pYJ55.

20 Esimerkki VII

i Kannan GS115 (pYJ55) kehittäminen . Pichia pastoris GS115, histidiiniauksotrofi (NRRL Y15851; his4) transformoitiin ,·**: plasmidilla pYJ55 (esimerkki VI), kuten esimerkissä II on kuvailtu. Genomista « ♦ DNAita pysyvistä His+-kannoista analysoitiin Southem-suodinhybridisaation avulla : 1// 25 plasmidin sijainnin määrittämiseksi. Yhtä transformanttia, joka sisälsi pYJ55:n kiin nittyneenä HIS4-lokuksessa, merkittiin koodilla GS115(pYJ55).

♦/“: Esimerkki Vili ··· . 1 1 1; AOX1 ja AOX2-promoottorien vertailu ·«· · AOX1-ja AOX2-promoottorien säätelyä ja ilmenemistä on vertailtu määrittämällä 30 kantojen GS115(pSAOH5) ja GS115(pYJ55) β-galaktosidaasiaktiivisuus. 100 mlin viljehniä kummastakin kannasta kasvatettiin YNB-alustassa, johon oli lisätty 1 % //’. glyserolia, 24 tuntia 30 °C:ssa, ne siirrettiin YNB-alustaan, jossa ei ole hiilenlähdet- • · · i ** tä, 24 tunnin ajaksi 30 °C:ssa, sen jälkeen ne siirrettiin YNB-alustaan, joka sisälsi 19 105825 0,5 % metanolia, 50 tuimin ajaksi 30 °C:ssa. Näytteitä otettiin kummastakin viljelmästä seuraavina ajankohtina: 1) 24 tunnin kuluttua glyserolialustassa, 2) 24 tunnin kuluttua hiilettömässä alustassa, ja 3) 24 ja 50 tunnin kuluttua metanolialustassa. Uutteita valmistettiin, ja niistä määritettiin β-galaktosidaasin aktiivisuus, kuten jäl-5 jempänä on kuvailtu. Näiden määritysten tulokset esitetään taulukossa 2.

β-galaktosidaasimääritys 1) Tarvittava liuos: Z-puskuri: Loppupitoisuus

Na2HP04.7H20 16,1 g 0,06 M

10 NaH2P04 5,5 g 0,04 M

KC1 0,75 g 0,01 M

MgS04.7H20 0,246 g 0,001 M

2-merkaptoetanoli 2,7 ml 0,05 M

täytetään 1 l:ksi; pH:n tulisi olla 7.

15 O-nitrofenyyli^-D-galaktosid! (ONPG):

Liuotetaan 400 mg ONPG:tä (Sigma N-1127) 100 ml:aan tislattua vettä 4 mg/ml ONPG-liuoksen valmistamiseksi.

2) Soluvapaan proteiiniuutteen valmistaminen: • · · • · · ·

Kutakin näytettä pestiin kerran tislatussa vedessä, kerran hajotuspuskurissa, ja sus- ' .20 pendoitiin uudelleen hajotuspuskuriin pitoisuudessa 150 Aeoo/ml. 0,5 g lasihelmiä li- sättiin 350 μ1:η näyte-erään, ja seosta pyörresekoitettiin neljä kertaa 60 sekunnin , * .* ajan kerrallaan 1 minuutin välein jään päällä. Soluliete poistettiin lasihelmistä, ja ;;; suspensiota sentrifugoitiin 5 minuuttia mikrofugissa. Supematantti siirrettiin poly- « · * ‘ ’ propyleeniseen mikrofugiputkeen määritystä varten. Proteiinin kokonaismäärä jokai- 25 sesta uutteesta määritettiin Bradfordin määritysmenetelmällä (Bio-Rad). BSA toimi • · · proteiinistandardina.

• · · • · *·* 3) Määritysmenettely: • · ·

4 | I

• · · · 1-50 μΐ soluvapaata proteiiniuutetta lisättiin 1 ml:aan Z-puskuria. Seosta pyörrese-koitettiin sen jälkeen ja inkuboitiin 5 minuutin ajan 30 °C:ssa. Reaktio aloitettiin li-30 säämällä 0,2 ml ONPG:tä (4 mg/ml). 0,5 ml 1 M Na2C03-liuosta lisättiin reaktion ψ 4 9 105825 20 pysäyttämiseksi sopivana aikana (A420 <1). Absorbanssi luettiin sen jälkeen aallonpituudessa 420 nm.

4) β-galaktosidaasiaktiivisuusyksikköjen laskeminen 1 U = 1 nmooli muodostunutta ortonitrofenolia (ONP) minuutin aikana 30°C:ssa ja 5 ph:ssa 7. 1 nmooli ONP:tä antaa absorbanssiksi aallonpituudessa 420 nm (A420) 0,0045 1 cm:n valotiepituudessa. Sen vuoksi absorbanssin arvo 1 aallonpituudessa 420 nm tarkoittaa 222 nmoolia ONP;tä/ml, tai 378 nmoolia ONP:tä/l,7 ml (analysoitavan supematantin kokonaistilavuuden ollessa 1,7 ml). Taulukossa 2 ilmoitetut yksiköt laskettiin seuraavasti: 10 A420 U =-x 378 t(min) « « I 1

4 I

4 1 ' tl* • · • · c » t · · i · · . I I » • · · » * · > · ·

IM

• * M· • · · m • · · * * • · · • · · * « · · • · « * *

Claims (3)

1. 21 105825 Patenttivaatimus Olennaisesti puhdas Pichia pastoris -kanta, tunnettu siitä, että se on arginiinin suhteen prototrofinen, histidiinin suhteen auksotrofinen ja kykenemätön käyttämään hyväksi metanolia hiilenlähteenä, ja kanta on GS115, joka on talletettu talletusnume-5 rolla NRRL Y-15851, PPF1, joka on talletettu talletusnumerolla NRRL Y-18017, KM7121, joka on talletettu talletusnumerolla NRRL Y-18019, tai MC100-3, jonka konstruointi on esitetty esimerkeissä I, Ilja ΙΠ.
2. 10 En väsentligen ren Pichia pastoris-stam, kännetecknad av att den är prototrof med avseende pä arginin, auxotrof med avseende pä histidin och oförmögen att utnyttja metanol som kolkalla, och stammen GS115, som deponerats pä depositionsnummer NRRL Y-15851, PPFI, som deponerats pä depositionsnummer NRRL Y-18017, KM7121, som deponerats pä depositionsnummer NRRL Y-18019, eller MC100-3, 15 vars konstruering beskrivits i exempel I, Π och m. I « « < *
3. 1 I ' I · ··« I I I « · · • · • · • • · · * · · · • · · • · · • t · • · · f · a · • * · · · * • · • · * • · · 1 * * « , · a « · a · a « · « · · * *