JPH02167095A - 異種蛋白質の製造方法、組換えｄｎａ、形質転換体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔利用分野） 本発明は血清アルブミンシグナルペプチドをコードする
ＤＮＡ、及びこのＤＮＡを含む組換えＤＮＡを用いるこ
とによる酵母における異種蛋白質の製造方法に関する。

〔従来技術・発明が解決しようとする課題〕組み換えＤ
ＮＡ技術により、目的蛋白質を組み換え宿主に産生させ
る場合、その宿主が目的蛋白質を分泌発現することに多
くの利点が見出される。

即ち、目的蛋白質が宿主細胞内に直接発現されると宿主
の増殖、生存に不都合な毒性を示す場合、目的蛋白質を
分泌発現することでこの毒性を回避することができる。

また、毒性を持たない場合でも、目的蛋白質が宿主細胞
内に多量に蓄積すると宿主の増殖を抑制する場合がある
が、分泌発現ではこれを避けることが可能である。また
、目的蛋白質が宿主細胞内に蓄積するような発現系では
、目的蛋白質が宿主細胞内で変性し、不溶化する現象が
よく見られるが、分？ｙ発現の系ではこれを回避できる
。また、商業的に組み換えＤＮＡ技術を用いて目的蛋白
質を生産する場合、目的蛋白質が細胞内に蓄積する系で
は目的蛋白質を精製する為に、細胞を破壊し、その破壊
液中から目的蛋白質を精製する必要がある。このような
精製では組み）桑え宿主由来の不純物が多く混入し、高
純度の目的蛋白質を得ることが困難である。一方、分泌
発現系で目的蛋白質を生産する場合には、培！！液から
目的蛋白質を精製すればよく、組み換え宿主由来の不純
物の混入は最小限に防ぐことができ、大きなメリットと
なる。また、蛋白質の多くは、糖鎖の付加、ジスルフィ
ド結合の形成、不活性な前駆体蛋白質の限定氷解による
活性化、特定のアミノ酸のリン酸化、カルボキシル化等
の修飾を受けるが、これらの中には各種細胞で共通に備
わった機能もあり、これらの修飾のいくつかは分泌の過
程で生じる。従って、目的蛋白質を分泌発現で生産する
場合、細胞内に蓄積する系に比較して、より自然な蛋白
質に近い機能および構造を持った蛋白質の生産が期待さ
れる。

シグナルペプチドの性状についてはい（つかの知見があ
り、そのアミノ酸配列の特徴は以下のようである。Ｎ末
端近傍に塩基性アミノ酸が多（、またＣ末端側のシグナ
ルペプチダーゼに消化される部位近傍には極性を有する
アミノ酸が多く、また、その間は疎水性のアミノ酸が連
続する。Ｎ末端近傍の塩基性アミノ酸は、細胞内部表面
のリン脂質と相互作用し、中央部の疎水性アミノ酸の連
続は細胞膜通過に重要な役割を果たし、Ｃ末端の極性ア
ミノ酸はシグナルペプチダーゼに消化される時の認識部
位の役割を演していると推定されている。このような特
徴は原核生物から高等動物に到るまで掻めて類似してお
り、共通の蛋白質分泌メカニズムを推定させる。（Ｍ、
Ｓ、Ｂｒ１ｇｇ５　ａｎｄ　Ｌ、Ｍ。

Ｇｉｅｒａｓｃｈ（１９８６）　Ａｄｖ、　Ｐｒｏｔｅ
ｉｎ　Ｃｈｅｍ、＋３ル１０９−１８０；Ｇ、ｖｏｎ　
Ｈｅ１ｊｎｅ　（１９８４）　ＥＭＢＯＪ、、　３．２
３１５−２３１８）ヒト血清アルブミン蛋白質はプレプ
ロ型蛋白質として遺伝子上にコードされている〔特開昭
６２−２９９８５号公報、　Ａ、Ｄｕｇａｉｃｚｙｋ等
（１９８２）　Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ。

Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵＳＡ、、７９．７１−７５）参照
〕０分泌に必須なシグナルペプチドから成熟ヒト血清ア
ルブミンのＮ末端近傍のアミノ酸配列、およびそれをコ
ードするＤＮＡ配列を第１表に示した。

Ｃ以下余白〕 ｙ） このうち、　１８アミノ酸から成るシグナルペプチドは
分泌時に除去され、また、６アミノ酸から成るプロペプ
チドはプロセッシングにより除去されて、Ａｓｐ−Ａｌ
ａ−Ｈｉｓ−Ｌｙｓ−５ｅｒ・−・　のＮ末端アミノ酸
配列を有し、５８５アミノ酸から成る成熟ヒト血清アル
ブミン蛋白質となる。

ところで、酵母は菌体外プロテアーゼの分泌も少なく、
さらに分泌物にｉｌ鎖を付加することもできるという理
由により異種蛋白質の分泌発現にとって優れたものであ
る。

しかして、酵母以外の細胞で分泌発現に寄与するシグナ
ルペプチドが、酵母においても機能する例がいくつか報
告されている。例えば、卵白リゾチームシグナルペプチ
ドを用いたヒトリゾチームの酵母における分泌発現（地
神（１９８７）　８１０１Ｎ１）ＩＩｓＴＲＹ、　４　
　ＬＩＴ−１２３，）　、植物蛋白質タウマチンのシグ
ナルペプチドを用いたタウマチンの酵母における分泌発
現（Ｌ、Ｅｄｅｎｓ、　１．Ｂｏ＋ｗ、＾、Ｍ、Ｌｅｄ
ｅｂｏｓｒ＋Ｊ、門ＢＢｔ、　［、Ｙ、７０ＨＨ，（：
、ｖｉｓｓｅｒ　ａｎｄ　Ｃ，Ｔ、Ｖｅｒｒｉｐｓ（１
９８４）　Ｃｅ１１＋、ｉｌ、６２９−６３３）、ヒト
インターフェロンαのシグナルペプチドを用いたヒトイ
ンターフェロンの酵母における分泌発現（Ｒ，Ａ、）Ｉ
ｉｔｚｅｍａｎ。

Ｄ、Ｗ、Ｌｅｕｎｇ＋　Ｌ、Ｊ、Ｐｅｒｒｙ、　１１．
Ｊ、Ｋｏｈｒ＋　Ｈ，Ｌ、ＬｅｖｉｎｅａｎｄＤ、Ｖ、
Ｇｏｅｄｄｅｌ　（１９８３）　５ｃｉｅｎｃｅ、　Ａ
囲ヨ６２０−６２５）などである。

しかしながら、酵母以外の細胞で本来分泌発現に寄与す
るシグナルペプチドが、酵母においても機能するとはか
ぎらないのが実情である。

従って、本発明の目的は酵母から異種蛋白質を効率よく
分泌発現させる方法、当該方法に使用されるベクター、
および当該ベクターにて形質転換された形質転換体壱提
供することである。

〔課題を解決するための手段］ このような背景のもとに、本発明者らは酵母による蛋白
質の分泌発現に必須なシグナルペプチドについて研究を
重ねて来たところ、ヒト血清アルブミンのシグナルペプ
チドが酵母におけるシグナルペプチドとしてｉｔするこ
とを見出し、さらに研究を重ねて本発明を完成させるに
至った。

即ち、本発明は下記（１）〜（４）に関するものである
。

（１）血清アルブミンシグナルペプチド遺伝子及びその
誘導体。

（２）前記血清アルブミンシグナルペプチド遺伝子を含
むＨＡえＤＮＡを用いて形質転換した酵母から異種蛋白
質を分泌発現させることを特徴とする異種蛋白質の製造
方法。

（３）前記血清アルブミンシグナルペプチドをコードす
るＤＮＡを含む酵母を形質転換するための組換えＤＮＡ
。

（４）前記血清アルブミンシグナルペプチドをコードす
るＤＮＡを含む組換えＤＮＡにて形質転換された酵母。

本発明に関する組換えＤＮＡは、血清アルブミンシグナ
ルペプチド遺伝子、異種蛋白質遺伝子、プロモーター、
ターミネータ−およびプラスミドＤＮＡ又は染色体ＤＮ
Ａからなる。

血清アルブミンシグナルペプチド遺伝子は、例えば哺乳
動物に由来するものが好適に使用される。

具体的にはヒト由来、ラット由来、ウシ由来のものなど
が用いられる。また、その遺伝子は主要部を残して変異
させたものであってもよい。

ヒト由来のものとしては、 Ｍｅ　ＬＬｙｓＴｒｐｌ／ａ　ｌＴｈ　ｒＰｈｅ　Ｉ　
ｌ　ｅＳｅｒＬｅｕＬｅｕＰｈｅＬｅｕＰｈｅＳｅｒＳ
ｅｒ　−ＡｌａＴｙｒＳｅｒ ラット由来のものとしては、 Ｍｅ　ｔＬｙｓＴｒｐＶａ　１ＴｈｒＰｈｅＬｅｕＬｅ
ｕＬｅｕＬｅｕＰｈｅ　ｌ　１ｅｓｅｒＧ　１ｙｓｅｒ
＾１ａＰｈｅｓｅｒ ウシ由来のものとしては、 Ｍｅ　ｔＬｙｓＴｒｐＶａ　ｌＴｈ　ｒＰｈｅ　Ｉ　ｌ
　ｅＳｅｒＬｅｕＬｅｕＬｅｕＬｅｕＰｈｅＳｅｒＳｅ
ｒＡｌａＴｙｒＳｅｒ などのアミノ酸配列で表わされるＤＮＡが例示される。

当該血清アルブミンシグナルペプチド遺伝子器よ好まし
くは、ヒト由来のものが使用される。

さらに、本シグナルペプチド遺伝子は、一部変更するこ
とによって、より効率的な効果を得ることができ、それ
は次の一般式で示されるアミノ酸配列をコードする遺伝
子からなる。

〔以下余白〕

Ｍｅ　ｔＹＴｒｐＶａ　Ｉ　ＴｈｒＰｈｅ　Ｉ　１ｅＳ
ｅｒＬｅｕＬｅｕＰｈｅＬｅｕＰｈｅＸｓＸ　ａ　Ｘ　
Ｊ　Ｊ　＋好ましい組合わせとしては第２表のごときも
のが例示される。

第２表 血清アルブミンシグナルペプチド遺伝子は上述したアミ
ノ酸配列で表現できるＤＮＡ配列を有していればよいが
、各アミノ酸のコドンとして好ましいものは次の通りで
ある。

八Ｉａ：ＧＣＴ又はＧＣＣ，Ｃｙｓ：ＴＧＴ、　Ａｓｐ
：ＧＡＣ，Ｇｌｕ：ＧＡＡ。

Ｐｈｅ４ＴＣ，Ｇｌｙ：ＧＧＴ、　Ｈｉｓ：ＧＡＣ，ｌ
ｉｅ：ＡＴＴ又はＡＴＣＬｙｓ：ＡＡＧ、　Ｌｅｕ：Ｔ
ＴＧ、　Ｍｅｔ：＾ＴＧ、　Ａｓｎ：ＡＡＣ，Ｐｒｏ：
ＣＣＡ。

Ｇｌｎ：ＣＡＡ、　Ａｒｇ：ＡＧＡ、　Ｓｅｒ：ＴＣＴ
又はＴＣＣ，Ｔｈｒ：ＡＣ？又はＡＣＣ，Ｖａｌ：ＧＴ
Ｔ又はＧＴＣ，Ｔｒｐ：ＴＧＧ、　Ｔｙｒ：ＴＡＣ本発
明における異種蛋白質としては、ヒト血清アルブミン、
インターフェロン−α、βあるいはＴ、ウロキナーゼ、
成長ホルモン、インツユリン、各種リンホカイン、ｈ　
−ＡＮ　Ｐ、血液凝固第■因子、各種Ｃ３Ｆ、エリスロ
ボエチンなどが挙げられるが、特に限定されるものでは
ない。

ヒト血清アルブミンの場合はプレ型、プロ型、プレプロ
型を、ウロキナーゼの場合はプロ型などのいずれであっ
ても産生は可能である。異種蛋白質中特に、成熟型のヒ
ト血清アルブミン遺伝子が好ましい。本発明の特徴の一
つは、シグナル配列と成熟型構造遺伝子、特に成熟型ヒ
ト血清アルブミン遺伝子を直接つないだことにあり、こ
れにより驚異的なアルブミンの産生量を達成したのであ
る。

このような異種蛋白質遺伝子は、特開昭６２＝２９９８
５号公報（ヒト血清アルブミン）、特開昭６１−１８５
１８９号公報（インターフェロンα）、特開昭６１−１
０８３９７号公報（インターフェロン−Ｔ）、特開昭６
０−１８０５９１号公報（ウロキナーゼ）などに記載さ
れている。

上述の文献中では、異種蛋白質遺伝子を含むプラスミド
として開示されている。

本発明の酵母を形質転換するための組換えＤＮＡは、血
清アルブミンシグナルペプチド遺伝子の下流に異種蛋白
質遺伝子を自体既知の手段で連結し、さらに自体既知の
手段にてプラスミド又は染色体内に導入し、調製される
。

プロモーターおよびターミネータ−は酵母で機能するも
のであれば特に限定されない。

プロモーターとしては、ＰＧＫプロモーター（Ｎｕｃｌ
ｅｉｃ　Ａｃ１ｄ　Ｒｅｓ、　　１０　　（２３）　　
７７９１　　（１９８２））、ＡＤＨプロモーター（Ｎ
ｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄ　Ｒｅｓ、ＩＯ（２３）　７７
９１（１９８２））　、ｐ　ｈ　ｏ　Ｅ（５）プロモー
ター（Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ。

月穣−（４）　５１３　（１９８３））　、ＧＡ　Ｌ　
ｌプロモーター（Ｍｏ１．　　Ｃｅ１１．　　Ｂｉｏｌ
、　　４　　（１１）　　２４６７　　（１９８４））
　　、ＧＡＬＩＯプロモーター（Ｍｏ１．　Ｃｅ１１．
　Ｂｉｏｌ、　、１（１１）２４６７　（１９８４））
、ＧＡＰ−ＤＨプロモーター（Ｊ。

Ｒｉｏｔ、　Ｃｈｅｗ、　２５８５２９１　（１９８３
））などが好適に使用される。特にＣＡＬＩプロモータ
ーとの組み合わせが好ましい。

プロモーターは血清アルブミンシグナルペプチド遺伝子
の上流に位置する。

ターミネータ−としてはｐｈｏＥ（５）ターミネータ−
（Ｃｅ１１．１２．７２１−７３２　（１９７７））、
ＧＡＰＤＨターミネータ−〇、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｆ
ｆｉ、、　２５４　９８３９−９８４５（１９７９））
などが好適に使用される。

ターミネータ−は異種蛋白質遺伝子の下流に位置する。

プロモーター、ターミネータ−は各々プラスミドに組み
込まれた形で入手される。

プラスミドＤＮＡは酵母中で自律複製可能なものであれ
ば特に限定されない。

具体的には、ｐＪＤＢ２０７　（アマージャム社。

製）、ρＪＤＢ２１９（アマ−ジャム社製）などが例示
される。

本発明のｍｔａえプラスミドは、上述したプラスミド群
から各々、血清アルブミンシグナルペプチド遺伝子−異
種蛋白質遺伝子からなるＤＮＡ配列、プロモーターを含
むＤＮＡ配列およびターミネータ−を含むＤＮＡ配列を
制限酵素により切り出した後に連結（接続）して適当な
プラスミドに組み込むか、または、一方のＤＮＡ配列を
切り出した後に他方のプラスミド中に組み込むかのいず
れかの方法により得られる。また、本発明の組換え染色
体は、以下の文献に記載された方法で酵母染色体中にプ
ロモーター、血清アルブミンシグナルペプチド遺伝子、
異種蛋白質遺伝子、ターミネータ−を挿入して得られる
。（Ｐｒｏｃ、　Ｎａｅｌ、＾ｃａｄ、　Ｓｃｉ。

（口、Ｓ、Ａ、）、　　ヱ８．　６３５４−６３５８　
　（１９８１））、　　（ＭｅｔｈｏｄＥｎｚｙｍｏｌ
、、　１０１　２２８−２４５　（１９８３））その際
、配列の順序は上流から下流に向かって、プロモーター
、血清アルブミンシグナルペプチド遺伝子、異種蛋白質
遺伝子、ターミネータ−となるように調製する。

また、選別時のマーカーとして、抗生′！！ｙＪ質〔テ
トラサイタリン、アンピシリン、カナマイシン］耐性遺
伝子あるいは宿主の栄養要求性を補う遺伝子を組み込む
ことも可能である。

この１ｔＡえプラスミドを用いて形質転換体を製作する
方法ひいては異種蛋白質を製造する方法は以下の通りで
ある。

組換えプラスミドを宿主細胞に導入する。宿主細胞とし
ては酵母が用いられる。具体的には挿入されるプラスミ
ドが担持する選択マーカー遺伝子によって相補する変異
をもった変異株、たとえばロイシン要求性変異株である
サン力ロミセス・セレビシｓ　（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙ
ｃｅＳｃｅｒｅｖｉＳｉａｅ）　ＡｌＩ２２（ａｈｉｓ
４．　　ｌｅｕ　２．　ｃａｎ　ｌ）等が好適に用いら
れる。

宿主細胞（酵母）の形質転換は公知の方法、たとえば、
リン酸カルシウム沈澱法、プロトプラストポリエチレン
グリコール融合法、エレクトロポレーション法などによ
り行う。

必要な形質転換体を選択する。

形質転換株は、宿主細胞の自体公知の培地で培養する。

培地としてはＹＮＢ液体培地〔０，７％Ｙｅａｓｔ　Ｎ
ｉｔｒｏｇｅｎ　Ｂａ５ｅ　（Ｄｉｆｃｏ社）、２％グ
ルコース〕、およびＹＰＤ液体培地（１％イーストエキ
ストラクト（Ｄｉｆｃｏ社）、２％ポリペプトン（大五
栄養社）２％グルコース〕などが例示される。

培養は、通常１５〜４３°Ｃ（好適には３０’Ｃ程度）
で２０〜１００時間程度行い、必要により通気や攪拌を
加えることもできる。

培養後、培養上清を回収し、自体公知の方法、たとえば
アフィニティクロマトグラフィー、分画法などにより異
種蛋白質を精製する。

〔効果〕

本発明の方法により、目的とする異種蛋白質を分泌発現
で生産することができ、細胞内で蓄積する系に比較して
、より自然な蛋白質に近い機能および構造を有する異種
蛋白質の生産が期待できる。

また、目的蛋白質が細胞内に蓄積する系では目的蛋白質
を精製する為に、細胞を破壊し、その破壊液中から目的
蛋白質を精製する必要があが、本発明の方法によればか
かる精製の必要がない。

特に蛋白質の分泌発現に必須なシグナルペプチドについ
て血清アルブミンシグナルペプチドを選択したことによ
り、新たな発現系が確立でき、異種蛋白質の効率的な発
現に対しても有用と考えられる。さらに本発明の系は、
成熟型ヒトアルブミン遺伝子の発現・産生糸において、
約１６０■／ｌのアルブミンの産生という驚異的な成果
を得た。

また、適宜アルブミンシグナル配列を変異（例えば第２
表）することにより、産生させるアルブミンのＮ末端部
が正確に切断された。

〔実施例〕

本発明をより詳細に説明するために、実施例を挙げるが
、本発明はこれらによって何ら限定されるものではない
。

なお、本発明において多くの技法、反応および分析方法
は当業界においてよく知られている。特にことわらない
限り、全ての酵素は商業的供給源、たとえば宝酒造；ニ
ューイングランド　バイオラプス（ＮＥＢ）　（Ｎｅｗ
　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ（ＮＥＢ））マサチ
ューセッツ、米国ニアマージャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）
、英国およびベセスダ　リサーチ　ラボラトリーズ（Ｂ
ｅＬｈｅｓｄａ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｌａｔｏ
ｒｉｅｓ（ＢＲＬ）　）　、メリーランド、米国から入
手することができる。

酵素反応のための緩衝液および反応条件は特に断らない
限り各酵素の製造元の推奨にしたがって使用した。

プラスミドを用いた大腸菌の形質転換法、プラークハイ
ブリダイゼーション法、電気泳動法およびＤＮＡのゲル
からの回収法は、［モレキュラークローニングＪコール
ドスプリングハーバ−ラボラトリ−（ｒＭｏｌｅｃｕｌ
ｅｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｊ　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇｔ
ｌａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　（１９８２））
に記載されている方法により行った。酵母の形質転換法
は、［メソッド・イン・イースト・ジエネティクス」コ
ールドスプリングハーバ−ラボラトリ−（ｒＭｅｔｈｏ
ｄ　１ｎＹｅａｓｔ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ」）　　（Ｃｏ
ｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　ｌ１ａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏ−ｒａ
ｔｏｒｙ）　（１９８１）に記載されている方法で行っ
た。

１、酵母ＧＡＬＩ　、　１０プロモーターのクローニン
グ１−１．酵母染色体ＤＮＡライブラリーの作製酵母サ
ツカロミセスセレビシェＧＲＦ１８　ＰＨ０８０ｃｉｒ
’株（特開昭６１−２６８１８４号）の染色体ＤＮＡを
Ｒ，Ｃｒｙｅｒ等の方法（Ｒ，Ｃｒｙｅｒ　ｅｔ　ａｌ
、（１９７５）門ｅｔｈｏｄεｎｚｙｓ＋ｏ１．＋［＋
　３９）で抽出精製した。

Ｍ、Ｊｏｈｎｓｏｎ　ａｎｄ　Ｒ，Ｗ、Ｄａｖｒｓ　（
Ｍ、Ｊｏｈｎｓｏｎ　ａｎｄ　ｌ？、Ｗ。

Ｄａｖｉｓ　（１９８４）　Ｍｏ１．Ｃｅ１１．Ｂｉｏ
ｌ、、　４．１４４０−１４４８．）によれば、酵母Ｇ
ＡＬＩ　、　１０プロモーター領域は酵母染色体上にあ
り制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＸｂａ　ｌで消化すると約１
　ｋｂのＤＮＡ断片として得られる。

そこで上記のように抽出精製した酵母染色体ＤＮＡをＥ
ｃｏＲｌ及びＸｂａ　Ｉで消化し、電気泳動により約１
　ｋｂのＤＮＡ断片を単離した。これをＥｃｏＲ１及び
Ｘｂａ　ｌ消化し、子牛小腸由来アルカリホスファター
ゼ（ＣＩＰ）で５゛末端のリン酸基を除いたプラスミド
ｐＵｃ１９　（ベセスダ・リサーチ・ラボラトリ−社製
）と混合し、ライゲーシッンキソト（宝酒造社製）で連
結した。これを大腸菌ニジエリシアコリＪＭ１０９コン
ピテントセルに導入した。トランスフォーマントを０．
００４χＸ−ｇａｌ　（５−ｂｒｏａ＋ｏ−４ｃｈ１ｏ
ｒｏ−３−ｉｎｄｏｌｙｌ−β−Ｌｈ　ｉｏｇａ　ｌａ
ｃ　ｔｏｓ　ｉｄｅ　）及び１ｍＭＩＰＴＧ　（ｉｓｏ
ｐｒｏｐｙｌ−β、Ｄ−ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒ
ａｎｏｓｉｄｅ）含有ＹＴアガープレート（ポリペプト
ン８ｇ、イーストエキストラクト５ｇ、塩化ナトリウム
５ｇを水に溶解し、１！としだ後１２ｇの寒天束を加え
てオートクレーブ滅菌後、プラスチックシャーレに分注
、固化する。　Ｘ−ｇａｌ、　ＩＰＴＧはオートクレー
ブ後、培地が冷えてから添加する。）に塗布し、３７”
Ｃ１−夜培養した。白色及び青色のコロニーが出現する
が、このうちＤＮＡインサートを有するｌａｃ　Ｚ遺伝
子欠損の白色コロニーのみを１００個ずつ４０μｇｉｒ
ｄアンピシリン含有しアガープレート（トリスペース０
．６２ｇ、ポリペプトン１０ｇ、イーストエキストラク
ト５ｇ、塩化ナトリウム５ｇを水に熔解し、１２とした
後１２ｇの寒天束を加えてオートクレーブ滅菌し、プラ
スチックシャーレに分注、固化する。アンピシリンはオ
ートクレーブ後、培地が冷えてから添加する。）に滅菌
した爪楊枝にて接種した。このＬアガープレートを３７
°Ｃ１−夜培養した。このような方法で、約５０００個
から成るライブラリーを作製した。形成したコロニーを
ニトロセルロースフィルターに移し、０．５門水酸化ナ
トリウム−１，５１’ｌ塩化ナトリウムから成る溶液に
浸しＤＮＡを変性させ、次いで１．５Ｍ塩化ナトリウム
−０，５Ｍ）リス−塩酸、　ｐＨ７，５から成る溶液で
中和した。大腸菌の残渣を２ｘＳＳＣ（０，３Ｍ塩化ナ
トリウム−０，０３Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ７，０
）で洗浄、除去しフィルターを風乾後、更に８０°Ｃ１
２時間減圧乾燥した。

１−２．プローブの作製 ＧＡＬＬ、１０プロモーターをコードする遺伝子の塩基
配列の一部をアプライドバイオシステム社製ＤＮＡ合成
装置モデル３８１Ａを用い、ホスホアミダイト法にて合
成した。その配列を以下に示す。

５’−ＣＴＣＴＡＴＡＣＴＴＴＡＡＣＧＴＣＡＡＧ　−
３’これを７Ｍ尿素−２０χポリアクリルアミドゲルで
電気泳動し、精製した。精製したＤＮＡ配列の５“末端
を、［Ｔ　−”Ｐ］　ＡＴＰ及びＴ４ポリヌクレオチド
キナーゼを用いて放射能ラベルした。　合成りＮＡ　１
０　ｐｍｏｌｅｓ、　　［ｙ−”Ｐ］　ＡＴＰ　２５０
μｃｉ、　Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ８ユニットを
用いた反応により３ｔｐで末端ラベルされた合成りＮＡ
プローブが、２　ｘ　１０’　ＣｐＯＩ　　（セレンコ
フコウント）得られた。合成りＮＡプローブの精製はＮ
ＥＮＳＯＲＢ２０（デュポン社製）を用いて行った。

１−３．　ＧＡＬＩ、ｔｏプロモーターのスクリーニン
グ１−１項でＤＮＡを固定したニトロセルロースフィル
ターを１０枚ずつ一組にしてビニール袋に入れ、以下の
処理をした。６　ｘ　ＳＳＣ，０，１Ｘ　ＳＯ５，及び
１００°Ｃ１５分間加熱後氷上で冷却したサケ精子ＤＮ
Ａ２０μｇ／Ｉｄから成るプレハイブリダイゼーション
溶液１０　ｄをビニール袋に入れ、シール後、４０℃。

３時間インキュベートした。プレハイブリダイゼーショ
ン液を廃棄し、ハイブリダイゼーション溶ｌ夜ｌＯ−を
入れて、４０°Ｃ１−夜インキユベートした。

ハイブリダイゼーション溶液の組成は６　ｘ　ＳＳＣ。

０．１χＳ０５．１００μｇ／Ｉｄサケ精子ＤＮＡ、　
？、５　ｘ　１０’ＣｐＩｌ／−の！ｐ−プローブとし
た。インキュベート・終了後、フィルターをビーカーに
移し、６　ｘ　５ＳＣＯ，１χＳＤＳで５０”Ｃ，３０
分間、２　ｘ　ＳＳＣ，０，１χＳＯＳで５０”Ｃ，３
０分間、２　ｘ　ＳＳＣ，０，１χＳＯＳで５０°Ｃ，
３０分間、最後に０．１　ｘ　ＳＳＣ，０，１χＳＤＳ
で５０’Ｃ，３０分間の順に洗浄した。洗浄したフィル
ターは風乾し、１００−２００　ｃｐ−のマークをスポ
ットした後オートラジオグラフィーした。その結果、２
個のポジティブクローンが得られた。このうちの１クロ
ーンを４０ｇｇ／ａＪｉアンピシリン含有スーパーブロ
ス（バタトトリプトン１２ｇ、イーストエキストラクト
２４ｇ、グリセロール５Ｉｄを水に溶解し９００Ｉｄと
してオートクレーブ滅菌したＡ？＆、及びリン酸２水素
カリウム３．８１ｇ、　　リン酸ｌ水素カリウム１２．
５　ｇを水に溶解し１０（ｌｄとしてオートクレーブ滅
菌したＢ？ａを９：Ｈｖ／ｖ）の割合で混合したもの）
中３７°Ｃ１−夜振盪培養し、アルカリＳＤＳ法にてプ
ラスミドＤＮＡを抽出精製した。このプラスミドＤ　Ｎ
　Ａ　（ｐＧＡＬｌｌ、図１）について−部塩基配列を
ダイデオキシ法にて調べたところ、報告されている配列
（Ｍ、Ｊｏｈｎｓｔｏｎ　ａｎｄ　Ｒ，Ｗ、Ｄａｖｉｓ
（１９８４）　Ｍｏ１．　Ｃｅ１１．Ｂｉｏｌ、、４．
１４４０−１４４８．）と一致した。　ｐＧＡＬｌｌは
ＥｃｏＲ１部位からＸｂａ　１部位の方向にＧＡＬＩプ
ロモーター、逆の方向にＧＡＬＩＯプロモーターを有し
ている。

１−４．　ｐＧＡＬｌｌ　Ｘｂａ　１部位の［ｌａｍ８
１部位への変換ｐＧＡＬｌｌ上のプロモーター配列を、
シグナルペプチド及びヒト血清アルブミン蛍白質をコー
ドするＤＮＡ配列と連結する場合に、Ｘｂａ　１部位を
介する事はヒト血清アルブミン遺伝子上にＸｂａ　１部
位が存在するので不都合である。そこで、Ｘｂａ　１部
位をＢａｍ１ｌ　Ｉ部位に変換した。ｐＧＡＬｌｌをＸ
ｂａ　１消化後、ｄＧＴＰ、　ｄＡＴＰ、　ｄＴＴＰ、
　ｄＣＴＰ存在下、大腸菌由来ＤＮＡポリメラーゼＩ、
クレノウ断片により付着末端を修復した。このＤＮＡ断
片に５°末端がリン酸化されたＢａｍＨＩリンカ−、Ｃ
ＧＧＡＴＣＣＧを加え、Ｔ４　ＤＮＡリガーゼにより連
結した。これをＢａｍＨＩで消化後、再度Ｔ４　［ＩＮ
Ａ　リガーゼにより連結し大腸菌ニジエリシアコリ　Ｉ
Ｉ　８１０１に導入した。

得られたトランスフォーマントより図１に示したプラス
ミドｐＧＡＬＩ２を有するクローンを得た。

ｐＧＡＬ１２をＥｃｏＲｒ及びＦ３ａｍＨＩで消化する
事により、約１ｋｂのＤＮＡ断片としてＧＡＬＬ及びＧ
ＡＬＩＯプロモーターを単離できる。

２、酵母ｐｈｏ５ターミネータ−を有する大腸菌・酵母
シャトルベクターｐＰ丁２０作製 特開昭６２−１５１１８３号公報に述べられた酵母サツ
カロミセスセレビシェρｈｏ５遺伝子をコードしたプラ
スミドｐＡＰ５を制限酵素５ａｕ３Ａ　Ｉ及びＰｓｔｌ
で消化し、約３７０　ｂｐのｐｈｏ５ターミネータ−を
コードしたＤＮＡ断片を電気泳動で単離した（図２）。

市販のプラスミドｐＵｃ９をＢａｎ＋）ｌ　Ｉ及びＰｓ
ｔｆで消化し、アルカリホスファターゼで処理後、上記
３７０　ｂｐ断片と連結した。　３７０　ｂｐ断片の５
ａｕ３Ａ　Ｉ切断部位の塩基配列は ＧＡＴＣＣ・・・・ Ｇ　・・・・ であり、これはＢａｌ１ｌ（ｒ付着末端と連結するとＢ
ａｍ）１　１部位が再生される。従って、上記連結反応
で得られたプラスミドｐＰＴ１をＢａｍＨＩ及びＰｓｔ
　　Ｅで消化する事により、あるいはＢａｇ）ｌ　Ｉ及
び１１ｉｎｄ　ｍで消化する事により３７０ｂｐのｐｈ
ｏ５ターミネークーを有するＤＮＡ断片が得られる（図
２）。

市販のシャトルベクターｐＪＤＢ２０１　（図３）は大
腸菌及び酵母中で自律複製が可能である。これをＢａｍ
ｔｌ　ＩおよびＨｒｎｄ　ＩＩＩで消化後、アルカリホ
スファターゼ処理した。ＰＰＴｌをＢａａ）ｌ　Ｉ及び
旧ｎｄｌｌｌで消化後、約３７０　ｂｐのρｈｏ５ター
ミネーターを有するＤＮＡ断片を電気泳動で単離し、上
記ｐＪ［１Ｂ２０７　と連結した。得られたトランスフ
ォーマントより、図３に示したプラスミドｐＰＴ２を有
するクローンを得た。ｐＰＴ２はｐｈｏ５ターミネータ
−を有する大腸菌・酵母シャトルベクターであり、大腸
菌においてはβラクタマーゼによるアンピシリン耐性の
マーカー、酵母においてはロイシン栄養要求性を補うマ
ーカーをそれぞれ有している。

３、ヒト血清アルブミン遺伝子 ヒト血清アルブミンをコードするＤＮＡ配列は特開昭６
２−２９９８５に述べられたプラスミドｐｃｘ４ｏｉ（
図４．５）に由来し、以下のように誘導した。

プラスミドｐＧＸ４０１を制限酵素Ｘｂａ　Ｉ及び旧ｎ
ｄ　［［で消化し、ヒト血清アルブミン蛋白質のアミノ
酸配列Ｃ末端側２５７１ｅｕ、、　５８％１８．及び３
“非翻訳領域をコードする、約７５０　ｂｐ（７）　Ｄ
　Ｎ　Ａ断片（ＤＮＡ２）を電気泳動で単離した。市販
のプラスミドＰＵＣ１９をＸｂａ　Ｉ及びＨｉｎｄ　Ｉ
［［で消化し更にアルカリホスファターゼで処理し、５
゛末端のリン酸基を除去した後、Ｔ４　ＤＮＡリガーゼ
により１ＩｓＡ２と連結した。

これを大腸菌ニジエリシアコリ）ＩＢＩＯＩに導入し、
得られたトランスフォーマントより図６に示したプラス
ミドｐＨｓＡ２を有するクローンを得た。

ｐＧＸ４旧をＤｒａ　Ｉ及びＸｂａ　Ｉで消化し、約１
　ｋｂのＤＮＡ断片を電気泳動で単離した。このＤＮＡ
断片はヒト血清アルブミン蛋白質のアミノ酸配列Ｎ末端
側＋ｚｌｙｓ、％　Ｓ”ＴｈｒをコードするＤＮＡ配列
である。

アプライドバイオシステム社製ＤＮＡ合成機モデル３８
１Ａを用いてホスホアミダイト法にて成熟ヒト血清アル
ブミン蛋白質のアミノ酸配列Ｎ末端Ａｓｐ〜”Ｐｈｅを
コードする以下のＤＮＡ配列を合成した。

Ａｓｐ　Ａｌａ　Ｈｉｓ　Ｌｙｓ　Ｓｅｒ　Ｇｌｕ　Ｖ
ａｌ　Ａｌａ　Ｈｉｓ　Ａｒｇ　ＰｈｅＴＣＧＡＣＧＣ
Ａ　　ＣＡＣＡＡＧ　　ＡＧＴ　　ＧＡＧ　　ＧＴＴ　
　ＧＣＴ　　ＣＡＴ　　ＣＧＧ　　ＴＴＴＧ　　ＣＧＴ
　　ＧＴＧ　　ＴＴＣＴＣＡ　　ＣＴＣＣＡＡ　　ＣＧ
Ａ　　ＧＴＡ　　ＧＣＣＡＡＡアスパラギン酸（Ａｓｐ
）をコードするコドンはｐＧＸ４０１ではＧＡＴであっ
たが、ここではＧＡＣとした。

その結果、上記合成りＮＡを前記ｐＧＸ４０１由来の約
１ｋｂ　ＤＮＡ断片と連結後、ｐＵｃ１９のＳａｌ　ｌ
　−Ｘｂａ　１部位に挿入するとＳａｌ１部位が再生さ
れる。しかも、１１ｉｎｃｌｌで消化すれば成熟ヒト血
清アルブミンのＮ末端’Ａｓｐから始まるアミノ酸配列
をコードしたＤＮＡ配列が得られる。

上記合成りＮＡの５゛末端をＡＴＰ及びＴ４ポリヌクレ
オチドキナーゼによりリン酸化し、上記ｐＧＸ４０１を
Ｄｒａ　Ｉ及びＸｂａ　Ｉで消化し電気泳動で単離した
約１ｋｂのＤＮＡ断片と７４　ＤＮＡ　リガーゼで連結
した。これを大腸菌ニジエリシアコリ　ＨＢＩＯＩに導
入し、得られたトランスフォーマントから、図７に示し
たプラスミドｐＨｓＡ１を有するクローンを得た。

４、酵母にヒト血清アルブミンを分泌発現させる為のプ
ラスミドＤＮＡの作製 ヒト血清アルブミンのシグナルペプチドをコードする第
３表のようなりＮＡ配列をアプライドバイオシステム社
製ＤＮＡ合成機モデル３８１＾を用いホスフォアミダイ
ト法にて合成した。

また、同様に−１７，−５，−４，−３，−２，−１の
部位を各々ＬｙｓまたはＡｒｇまたは旧Ｓ、＾１ａまた
はＰｒｏ。

ＬｙｓまたはＧｌｙ、　ＶａｌまたはＣｙＳ＋　Ｔｒｐ
またはＳｅｒ。

＾１ａまたはｃｒｙをコードするＤＮＡ配列も合成した
。具体例は第２表に示した。これら天然型のアミノ酸を
変更させたアミノ酸をコードするＤＮＡ配列を導入した
場合、後述するアルブミンの生産において、産生量を落
とすことなくＮ末の切断部が、より正値なアルブミンの
発現分泌が達成できた。

〔以下余白〕

上記合成りＮＡの５１末端をＡＴＰ及びＴ４ポリヌクレ
オチドキナーゼによりリン酸化した。一方、ｐＨ５Ａｌ
をＸｂａ　ｒ及びＨｉｎｃ［Ｉで消化しヒト血清アルブ
ミン蛋白質のＮ末端側をコードする約１ｋｂのＤＮＡ断
片ＨＳＡＩを電気泳動で単離した。上記リン酸化した合
成りＮＡとＨ５ＡＩを混合し、↑４ポリヌクレオチドキ
ナーゼを用いて連結し、更にＸｂａ［及びＢａｍ１ｌ　
Ｉで消化した。　ｐＨ３Ａ２をＸｂａ　Ｉ及びＢａ５Ｈ
Ｅで消化後、アルカリホスファターゼで処理した。

これらのＤＮＡを混合し、Ｔ４　ＤＮＡリガーゼで連結
後、大腸菌ニジエリシアコリ８８１０１　コンピテント
セルに導入した。得られたトランスフォーマントのうち
、図８に示したプラスミドρＮＨＯＯＩを有するクロー
ンを得た。

ｐＮＩｌｏｏｌをＥｃｏＲＩ及びＢａｗｌ　Ｉで消化後
、アルカリホスファターゼで処理した。ｐＧＡＬ１２を
ＥｃｏＲｌ及びＢａｍＨＩで消化後、電気泳動によりＧ
ＡＬＩプロモーターを有する１　ｋｂのＤＮＡ断片を単
離し、上記処理をしたｐＮＩＩｏｏｌと混合し、Ｔ４　
ＤＮＡリガーゼにより連結した。得られたトランスフォ
ーマントより、図９に示したプラスミド９ＮＩＩ００７
を有するクローンを得た。ｐＮＨＯＯ７はＧＡＬＩプロ
モーター下流にヒト血清アルブミンシグナルペプチドを
コードするＤＮＡ配列、及びその直後に成熟ヒト血清ア
ルブミン蛋白質をコードするＤＮＡ配列、及びその直後
のヒト血清アルブミンｃＤＮＡ由来３゜非翻訳領域がｐ
Ｕｃ１９のＥｃｏＲｒ−Ｈｉｎｄｌ［１部位に挿入され
たプラスミドＤＮＡである。

ｐＮＩＩｏ０７をＢｃｏＲＩ及び旧ｎｄＩＩＩで消化し
、電気泳動により２．７　ｋｂのＧＡＬＩ　プロモータ
ー、シグナルペプチド、成熟ヒト血清アルブミン蛋白質
、非翻訳領域をコードしたＤＮＡ断片を単離した。又、
ｐＰＴ２をＢａｍＨＩ消化し、更にアルカリホスファタ
ーゼで処理した。これと上記２．７　ｋｂ　ＤＮＡ断片
を混合し、ｄＡＴＰ、　ｄＧＴＰ、　ｄＴＴＰ、及びｄ
ＣＴＰ存在下、ＤＮＡポリメラーゼ１．フレノウ断片に
て付着末端を修復した。更に、↑４　ＤＮＡリガーゼに
より連結し、大腸菌ニジエリシアコリ　ＩＩＢＩＯＩに
導入した。

得られたトランスフォーマントより、図１Ｏに示したプ
ラスミドｐＮＩ＋００８を有するクローンを得た。

ｐＮＨＯＯ８は大腸菌及び酵母中で自律増殖可能なプラ
スミドで、酵母において機能するＧＡＬＩプロモーター
の支配下にヒト血清アルブミンシグナルペブチドとそれ
に続いて成熟ヒト血清アルブミン蛋白質をコードするＤ
ＮＡ配列を有している。更に、ρＮ）１００８は大腸菌
においてアンピシリン耐性を付与する遺伝子、及び酵母
においてロイシン栄養要求性を補う遺伝子を有しており
、これらの遺伝子はトランスフォーマントの選択マーカ
ーとして使用可能である。

５、プラスミドｐＮＨＯＯ８の酵母への導入とヒト血清
アルブミンの分泌発現 ５−１プラスミドｐＮＨＯＯ８の酵母への導入ヒト血清
アルブミン分泌発現用プラスミドｐＮＨ００８ヲ酵母サ
ツカロミセスセレビシェＡＨ２２（Ｐｒｏｃ、　Ｎａ１
１．　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ＵＳＡ　７５．１９２９
−１９３３（１９７８））に以下の方法により導入した
。

ＹＰＤメディウム（イーストエキストラクト１０ｇ。

バタトベプトン２０　ｇを水に溶解し９００　ｍとした
後オートクレーブ滅菌し、別にオートクレーブ滅菌した
２０χグルコース１００ｄと混合した。）５０戒中３０
°Ｃ１−夜振盪培養したサツカロミセスセレビシェＡＨ
２２を遠心し、得られた細胞を水２０ｍ１に懸／！！ｉ
ｉ後、再度遠心して細胞を得た。これを１０ｄの５０　
ｉＭジチオスレイトール、１．２Ｍソルビトール、　２
５　ＩＩＩＭＥＤＴＡ、　ｐＨ８，５に懸濁し、３０°
Ｃで１０分分間中かに振盪した。遠心により細胞を集め
、１．２　Ｍソルビトール１０Ｉｄに懸濁し、再度遠心
により細胞を集めた。細胞をＩＯ−の１．２　Ｍソルビ
トールに懸濁し、遠心により細胞を集めた。細胞をｌＯ
−の０．２髄ｇ／ｄザイモリアーゼ１００Ｔ、　１．２
−ソルビトール、　１０ｍＭ　ＥＤＴＡ、　０．１１ク
エン酸ナトリウム、　ｐＨ５，８に懸濁後、３０’Ｃで
１時間穏やかに振盪した。遠心で細胞を集め、１．２Ｍ
ソルビトール、次いで１０　ｍＭ塩化カルシウム、　１
．２　Ｍソルビトール各１０　ｍｌで洗浄し、遠心で細
胞を集めた。

細胞を１−の１０　ｍＭ塩化カルシウム、　１．２　Ｍ
ソルビトールに懸濁した。懸濁液１００μｌを滅菌試験
管にとり、５μｌｃ５μｇ）のｐＮＨＯＯ８と混合し１
．室温に１５分間静置した。更に、１．２−の２０χポ
リエチレングリコール４０００．１０　ｓ＋Ｍ塩化カル
シウム、　１０　ｍＭ　　トリス−塩酸、　ｐｎ　７．
５を加え穏やかに混合後、室温で２０分間静置した。遠
心で細胞を集め、０．１−の１．２Ｍソルビトール、　
１０ｍＭ塩化カルシウム含有ＹＰＤメディウムに懸濁し
、３０°Ｃで３０分分間中かに振盪した。懸濁液１．５
．１０．２０．及び５０μｌをそれぞれ４５°Ｃに保温
したＩＯ−の１．２Ｍソルビトール、３χノープルアガ
ー、２χグルコース、０．７χイ一ストナイト口ジエン
ベースに懸濁し、１．２１１ソルビトール、３χバクト
アガー２χグルコース、０．７χイ一ストナイト口ジェ
ンヘースから成るプレートに拡げた。　プレートが固化
したら、３０’Ｃで３日間静置培養した。形成したコロ
ニーを爪楊枝で採取し、３Ｈ１の０．７χイ一ストナイ
ト口ジェンベース、２χグルコースに懸濁後、３０°Ｃ
で２日間振盪培養した。そのうちの１，５−を遠心し、
細胞を集め３ｄのｖＰＧメディウム（イーストエキスト
ラクト　１０　ｇ、バタトペプトン２０ｇを水に溶解し
９００−とした後オートクレーブ滅菌し、別にオートク
レーブ滅菌した２０χガラクトース１０（ｌｄと混合し
た。）に懸濁し、３０℃で振盪培養した。培養上清のヒ
ト血清アルブミン濃度をＲＰＨＡ法（ＥＰ特許第１２２
６２０号）にて測定したところ、１日日で最高ＩＯμｇ
／ａｔのヒト血清アルブミンが検出された。

５−２．ヒト血清アルブミン分泌発現酵母の培養５−１
項で述べたρＮＨＯＯ８で形質転換されヒト血清アルブ
ミン蛋白質を分泌発現する酵母サツカロミセスセレビシ
ェＡＨ２２を以下のように培養した。

０．７χイ一ストナイト口ジェンベース、２χグルコー
ス３３χバクトアガーから成るプレートで生育した上記
組み換え酵母を白金耳で採取し、５０ｍ１ｌの０．７χ
イ一ストナイト口ジエンベース、２χグルコースから成
るＹＮＢメディウムに接種し、３０°Ｃで２日間培養し
た。これを、更に５００　ｍのＹＮＢメディウムに全量
接種し、３０°Ｃで２日間培養した。

遠心により細胞を集め、５００ｄのＹＰＧメディウムに
懸濁し、３０°Ｃで振盪培養した。０．３．６．２４．
４８時間毎に培養液の一部を採取し、遠心で培養上清を
得、ＲＰＨＡ法にて培養液中に分泌されたヒト血清アル
ブミン濃度を測定した。その結果、培養開始３時間目か
ら僅かにヒト血清アルブミンの分泌発現が検出され、６
時間目で０．２５■／ｌ、２４時間目で２０ｍｇ／ｊ！
、４８時間目で１６０ｍｇ、ｌのヒト血清アルブミンの
分泌発現が検出された。

【図面の簡単な説明】

図１はＧＡＬＩ、１０プロモーターを有するプラスミド
ｐＧＡＬ１１からｐＧＡＬ１２を構築する手順を示す。 図２はｐｈｏ５遺伝子全体を有するプラスミドｐＡｐｓ
とｐＵｃ９から、ｐｈｏ５ターミネータ−だけを有する
ｐＰＴｌを構築する手順を示す。 図３はｐｈｏ５ターミネータ−を有するプラスミドとｐ
ＪＤＢ２０７からｐＰＴ２を構築する手順を示す。 図４および５はプレプロヒト血清アルブミン遺伝子を有
すプラスミドｐＧＸ４０１の制限酵素地図を示す。 図６はプラスミドｐＧＸ４０１とｐＵｃ９からヒト血清
アルブミン遺伝子Ｃ末端側を有するｐＨ３Ａ２を構築す
る手順を示す。 図７はプラスミドｐＧＸ４０１とρυＣ９からヒト血清
アルブミン遺伝子Ｎ末端側を有するＴｌｌｌ５ＡＩを構
築する手順を示す。 図８は、ｐＨ５Ａ１　、ｐＨｓＡ２および合成したシグ
ナルペプチド遺伝子からシグナルペプチド遺伝子および
成熟ヒト血清アルブミン遺伝子を有するプラスミドｐＮ
Ｉ１００１を構築する手順を示す。 図９はｐＮ＋１００１とｐＧＡＬ１２から、ＧａＬｌプ
ロモーターシグナルペプチド遺伝子および成熟ヒト血清
アルブミン遺伝子を有するプラスミドｐＮＨＯＯ７を構
築する手順を示す。 図１０はｐＮＨＯＯ７とｐＰＴ２から、ＧＡＬＩプロモ
ーターシグナルペプチド遺伝子、成熟ヒト血清アルブミ
ン遺伝子およびｐｈｏ５ターミネータ−を有するプラス
ミドｐＮＩＩ００８を構築する手順を示す。 目 手続（市正書（自発） 昭和６３年９月１４日 １、事件の表示 昭和６３年特許願第１０３３３９号 ２、発明の名称 異種蛋白質の製造方法、組換えＤＮＡ、形質転換体 ３、補正をする者 事件との関係　特許出願人 氏名（名称）　株式会社　ミドリ十字 ４代理人■５４１ 住所　大阪市東区平野町４丁目５６番地（場末ビル） Ｔａ　（０６）　２２７−１１５６ ５、補正の対象 簡単な説明」の欄および「図面」 ６、補正の内容 （１）明細書第３９頁第５行の次行に以下の記載を加入
する。 「実験例 ヒト血清アルブミン（以下、Ｈ３Ａという）シグナルペ
プチド遺伝子および成熟型）ＩＳＡ遺伝子からなるプラ
スミド（ｐＨＨＯＯ８）と、プレプロＩＳＡ遺伝子（Ｈ
５＾シグナルペプチド遺伝子（プレ配列）、ＩＳＡプロ
配列および成熟型ＩＳＡ遺伝子を存する〕からなるプラ
スミド（ｐＮｌ１００６）を用いてＨ３Ａ発現量を比較
した。 （ｐＮＨＯＯ６の調製） 実施例において、プレプロｌｌ５Ａ遺伝子を有するプラ
スミドｐＧＸ４０１からプレプロｌｌ５Ａ遺伝子全体を
切り出す（実施例では成熟型）１ｓＡ遺伝子のみを切り
出した）以外はほぼ実施例に準じて行い、ＧＡＬＩＯプ
ロモーター、ｌｌ５Ａシグナルペプチド遺伝子、ｌｌ５
Ａプロ配列、成熟型＋１５Ａ遺伝子およびｐｈｏ５ター
ミネータ−を有するＩＳＡ発現用プラスミドｐＮＨＯＯ
６を構築した。詳細を以下に示す。 １　、　ｐＮＩＩ００４の構築 ＧＡＬＩプロモーター／ＧＡＬＩＯプロモーターを有す
るｐＧＡＬ１２　（３，７ｋｂ）およびｐＬｌｃ１９　
（２，７ｋｂ）からＧＡＬｌＯプロモーターを有するｐ
Ｎｌｌｏ０４　（２，７ｋｂ）を構築した。 （＋）　　ｐＧＡＬ１２をＥｃｏＲｌおよびＫｐｎ　Ｉ
で消化してＧＡＬＩＯプロモーター断片（６９０ｂｐ）
を回収（２）合成リンカ− をカイネーション処理 （３）　（ｉ　）　（２）の合成リンカ−と（１）の断
片を混合（ｉｉ）　　Ｔ４ＤＮ八リガーゼ処理 （ｉｊ　）　ＢａｍＨＩおよびＸｂａ　Ｉで消化（４）
　（ｉ　）　ｐＬＩｃ１９をＢａＩＩＩＨＩおよびＸｂ
ａ　Ｉで消化（ｉｉ）アルカリホスファターゼ処理 （５）　（ｉ　）　（３）の断片と（４）のベクターを
混合（ｉｉ）　Ｔ４　ＤＮＡリガーゼ処理 ２、　ｐＮＩＩ００５の構築 ｐＮＩＩ００４およびプレプＣ）ＩＩｓＡ遺伝子を有す
るＰＧＸ４０１（６，３ｋｂ）から、ＧＡＬＩＯプロモ
ーター−プレプロｌｌ５Ａ遺伝子を有するｐＮＨＯＯ５
（４，５ｋｂ）を構築した。 （１）　　ｐＧＸ４０１を旧ｎｄｌ［［およびＢｓｔＥ
Ｉ［で消化してブレブＯＨ５Ａ遺伝子断片（１，８ｋｂ
）を回収（２１（ｉ　）　ｐＮｌ＋００４を旧ｎｄ［Ｉ
ＩおよびＢｓｔＥＩＩで消化（１１）アルカリホスファ
ターゼ処理 （３）　（ｉ　）　（２）の断片と（３）のベクターを
混合（ｉｉ）　Ｔ４　ＤＮＡリガーゼ処理 ３、　ｐＮＩＩｏ０６の構築 ｐＮＨＯＯ５およびｐｈｏ５ターミネータ−を有するｐ
ＰＴ２（７，３ｋｂ）から、ＧＡＬＩＯプロモーター−
プレプロＨ５Ａ遺伝子＝ｐｈｏ５ターミネータ−を有す
るｐＮＨＯＯ６（１０ｋｂ）を構築した。 （１）　　ｐＮＨＯＯ５をＢａｍＨ＋およびｔｌｉｎｄ
ｌ［Ｉで消化してＧＡＬＩＯプロモーター−プレプロｌ
５Ａ遺伝子断片（２，７ｋｂ）を回収 （２）　（ｉ　）　ｐＰＴ２をＢａｗｌ　Ｉで消化（ｉ
ｉ）アルカリホスファターゼ処理 （３）　（ｉ　）　（１）の断片と（２）のベクターを
混合（ｉｉ）　ｄＮＴＰおよびフレノウ断片を添加し、
１）ＮＡポリメラーゼＩで処理 （ｉｉｉ）　７４　ＯＮへりガーゼ処理（酵母への導入
と発現） 実施例に準じて行った。 （結果） 両プラスミドを用いた場合のＨ５Ａ発現量（■／ｌ）を
第１表に示す。 第１表 Ｔｉｍｅ（ｈｒ）　　　　　　０　　　　２４スミドｐ
ＮＨＯＯ５を構築する手順を示す。 図Ｂ　ハｐＮＩｌｏＯ５トｐＰＴ２カラ、ＧＡＬ１０７
’　ｌ：ｌ　−Ｔ−−タブレプロヒト血清アルブミン遺
伝子およびρｈｏ５ターミネーターを有するプラスミド
ｐＮ１１００６を構築する手順を示す、」 （３）図面の図Ａおよび図Ｂを別紙の通り加入する。 １１５Ａ　（ｍｇ／　ｌ　）　　　　００．００３９　
０．０６２５ １１５Ａ（ａｇ／ｆ）　　　０　　　２０　　　　１６
０（２）明細書第４０頁第１４行の次行に以下の記載を
加入する。 ｒ図Ａは７”　ラス：、　ｔ’　ｐＧＡＬ１２とｐＵｃ
１９がらＧＡＬＩＯプロモーターを有するプラスミドｐ
ＮＩ＋００４を構築した後に、ｐＮ１１００４とｐＧＸ
４０１がらＧＡＬＩＯプロモータープレプロヒト血清ア
ルブミン遺伝子を有するプラ」 手続補正書 １゜事件の表示 昭和６３年特許願第１０３３３９号 ２、発明の名称 異種蛋白質の製造方法、組換えＤＮＡ、形質転換体 ３、補正をする者 事件との関係　特許出願人 住所　大阪市中央区今橋−丁目３番３号（平成１年２月
１３日住居表示変更実施）氏名（名称）　株式会社　ミ
ドリ十字 ４、代理人　■５４１ 住所　大阪市中央区平野町三丁目３番９号（場末ビル） Ｔａ　　（０６）　２２７−１１５６ ６、補正の対象 昭和６３年９月１４日提出の手続補正書の補正の内容の
欄 ７、補正の内容 （＋）　　昭和６３年９月１４日提出の手続補正書（以
下、原補正書という）第５真下から第４行に「図Ａはプ
ラスミド」とあるのを［第１１図はプラスミド」と補正
する。 ０）　原補正書第６頁第２行に「図Ｂは」とあるのを「
第１２図は」と補正する。 （３）原補正書第６頁第６行〜最下行に「（３）　　図
面の図Ａおよび図Ｂを別紙の通り加入する。」とあるの
を ｒ（３）図面の第１１図および第１２図を別紙の通り加
入する。」と補正する。 （４）　　別紙の通り、原補正書に添付の図Ａを第１１
図に、図Ｂを第１２図に差し替える。

Claims (8)

【特許請求の範囲】
1. （１）血清アルブミンシグナルペプチド遺伝子を含む組
   換えＤＮＡを用いて形質転換した酵母から異種蛋白質を
   分泌発現させることを特徴とする異種蛋白質の製造方法
   。
2. （２）血清アルブミンシグナルペプチド遺伝子が以下の
   アミノ酸配列で表わされる請求項（１）記載の製造方法
   。 【アミノ酸配列があります】 〔Ｘ＿５：Ａｌａ又はＰｒｏ又はＳｅｒ Ｘ＿４：Ｌｙｓ又はＧｌｙ又はＳｅｒ Ｘ＿３：Ａｌａ又はＶａｌ又はＣｙｓ Ｘ＿２：Ｔｙｒ又はＴｒｐ又はＳｅｒ Ｘ＿１：Ｓｅｒ又はＡｌａ又はＧｌｙ Ｙ：Ｌｙｓ又はＡｒｇ又はＨｉｓ〕
3. （３）異種蛋白質がヒト血清アルブミンであり、成熟型
   ヒト血清アルブミン遺伝子とシグナルペプチド遺伝子を
   直接結合したことを特徴とする請求項（１）又は（２）
   記載の製造方法。
4. （４）以下のアミノ酸配列で示されるアルブミンシグナ
   ル遺伝子。 【アミノ酸配列があります】 〔Ｘ＿５：Ａｌａ又はＰｒｏ又はＳｅｒ Ｘ＿４：Ｌｙｓ又はＧｌｙ又はＳｅｒ Ｘ＿３：Ａｌａ又はＶａｌ又はＣｙｓ Ｘ＿２：Ｔｙｒ又はＴｒｐ又はＳｅｒ Ｘ＿１：Ｓｅｒ又はＡｌａ又はＧｌｙ Ｙ：Ｌｙｓ又はＡｒｇ又はＨｉｓ〕
5. （５）血清アルブミンシグナルペプチドをコードするＤ
   ＮＡを含む組換えＤＮＡ。
6. （６）血清アルブミンシグナルペプチド遺伝子が請求項
   （４）記載の遺伝子である請求項（５）記載のＤＮＡ。
7. （７）異種蛋白質がヒト血清アルブミンであり、成熟型
   ヒト血清アルブミン遺伝子とシグナルペプチド遺伝子を
   直接結合したことを特徴とする請求項（５）又は（６）
   記載のＤＮＡ。
8. （８）請求項（５）又は（６）又は（７）記載のＤＮＡ
   によって形質転換された酵母。