JP2609367B2 - プロセッシング部位に隣接する負に帯電したアミノ酸からなる酵母プロセッシングシステム - Google Patents

プロセッシング部位に隣接する負に帯電したアミノ酸からなる酵母プロセッシングシステム

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Description

【発明の詳細な説明】 発明の分野 本発明は酵母において発現されそしてプロセス化され
たポリペプチド、このようなポリペプチドをコードする
DNA配列を含むDNA構築物、このようなDNAフラグメント
を有するベクターおよびベクターで形質転換された酵母
細胞ならびに酵母における異種タンパク質の産生方法に
関する。
本発明の背景 酵母微生物は細胞内で合成されるが細胞外で機能を有
する多数のタンパク質を産生する。このような細胞外タ
ンパク質は分泌タンパク質と呼ばれてる。これらの分泌
タンパク質は最初に、小胞体（ER）の膜を発現物質が通
過する効果的方向性を確実にする予備配列を含む前駆体
またはプレータンパク質形にて細胞内で発現される。普
通シグナルペプチドと呼ばれる予備配列は、一般に移動
する間に所望の生成物から切断される。一度分泌経路に
入ると、タンパク質はゴルジ装置へ運ばれる。ゴルジ体
からタンパク質はたとえば細胞の液胞または細胞膜のよ
うな小室へ導びく異なった経路をたどるか、または細胞
外への経路を通って外側培地へ分泌される（ペッファ
ー，エス．アール.Pfeffer,S.R.およびロスマン，ジェ
イ．イー.Rothman,J.E.Ann.Rev.Biochem.56（1987）,82
9−852）。
酵母と異なるタンパク質の酵母における発現および分
泌について幾つかのアプローチが提案されてきている。
ヨーロッパ公開特許出願第0088632A号には、酵母微生物
を所望のタンパク質およびシグナルペプチドをコードす
るDNAを有する発現ビヒクルで形質転換し、形質転換さ
れた微生物の培養物の培養物を調製し、培養物を増殖
し、培地からタンパク質を回収することにより、酵母と
異なるタンパク質を発現し、プロセス化しそして分泌す
る方法が記載されている。シグナルペプチドは所望する
タンパク質自身のシグナルペプチド、異種シグナルペプ
チドまたは天然および異種シグナルペプチドのハイブリ
ッドでもよい。
酵母と異なるシグナルペプチドを使用すると遭遇する
問題は、異種シグナルペプチドが有効な移動および／ま
たはシグナルペプチド後の切断を保証しないということ
である。
サッカロミセス セレヴィシアエ（S.cerevisiae）MF
α１（α−ファクター）は、19個のアミノ酸長さのシグ
ナルまたはプレペプチドとこれに続く64個のアミノ長さ
の“リーダー”またはプロペプチドからなり、３つのＮ
−結合グリコシル化部位とこれに続く（LysArg（Asp/Gl
u,Ala）2-3α−ファクター）４を包含する165個のアミ
ノ酸のプレプロ形として合成される（クルジャン，ジェ
イ.Kurjan,J.およびヘルスコウィッツ，アイ.Herskowit
z,I.Cell 30（1982）,933−943）。プレプロMFα１のシ
グナル−リーダー部は、サッカロミセス セレヴィシア
エにおける異種タンパク質の合成および分泌を得るのに
広く使用されている。
酵母と同じシグナル／リーダーペプチドの使用は別の
米国特許第4,546,082号明細書、ヨーロッパ公開特許出
願第0116201A号、同第0123294A号、同第0123544A号、同
第0163529A号および同第0123289A号およびDK特許第2484
/84号および同第3614/83号明細書から公知である。
EP 0123289A号では、サッカロミセス セレヴィシア
エａ−ファクター前駆体の使用が記載されており、一方
DK 2584/84号にはサッカロミセス セレヴィシアエ イ
ンベルターゼシグナルペプチドの利用について記載され
ており、DK 3614/83号には外来タンパク質の分泌のため
にサッカロミセス セレヴィシアエPH05シグナルペプチ
ドの利用が記載されている。
米国特許第4,546,082号明細書、EP第0016201A号、同
第0123294A号、同第0123544A号および同第0163529A号に
は、サッカロミセス セレヴィシアエからのα−ファク
ター シグナル−リーダー（MFα１またはMFα２）を酵
母において発現される異種タンパク質の分泌方法に利用
する方法が記載されている。所望タンパク質に対する遺
伝子の５′末端にサッカロミセス セレヴィシアエ MF
α１ シグナル／リーダー配列をコードするDNA配列を
融合することにより所望タンパク質の分泌およびプロセ
ッシングが示された。
EP 206,783号にはサッカロミセス セレヴィシアエか
らのポリペプチドの分泌システムについて記載されてお
り、これによればα−ファクターリーダー配列の一部を
切断して天然リーダー配列に存在する４つのα−ファク
ターペプチドを除きこれによりα−ファクタープロセッ
シング部位LysArgGluAlaGluAlaを介して異種ポリペプチ
ドが融合したリーダーペプチド自体を残しておく。この
構築は、より小さいペプチド（アミノ酸50個未満）の有
効なプロセスを導びくことを示唆する。より大きなポリ
ペプチドの分泌およびプロセッシングについては、天然
α−ファクターリーダー配列の一部を切断してリーダー
ペプチドとポリペプチド間の１または２個のα−ファク
ターペプチドをそのままにしておく。
多数の分泌されたタンパク質は、連続する２つの塩基
性アミノ酸のカルボキシ末端でペプチド結合を切断する
タンパク質分解プロセッシング系にさらされるような経
路を通る。この酵素活性はサッカロミセス セレヴィシ
アエにおいてKEX2遺伝子によりコード化される（ジュリ
ウス，ディー．エー．らJulius,D.A.et al.,Cell 37（1
984b）,1075）。KEX2遺伝子生成物による生成物のプロ
セッシングは、活性なサッカロミセス セレヴィシアエ
成熟ファクターα１（MFα１またはα−ファクター）の
分泌に必要であるがしかし活性サッカロミセス セレヴ
ィシアエ成熟ファクターａの分泌には関連しない。
分泌が意図されるポリペプチドの分泌および正しいプ
ロセッシングは、上述の参考文献に示したように構築さ
れたベクターで形質転換された酵母微生物を培養すると
得られる場合もある。多くの場合、しかしながら、分泌
レベルが非常に低いかもしくは分泌されず、またはタン
パク質分解プロセッシングが正しくないかもしくは不完
全である。本発明者らは最近、これはある程度はリーダ
ーペプチドのＣの末端と異種タンパク質のＮ末端の間に
存在するプロセッシング部位が十分にさらされておらず
このためタンパク質分解切断が容易に行なわれないかま
たは少なくとも不十分に行なわれているためであると考
えている。
発明の概略 驚くべきことに、リーダーペプチドのＣ末端および／
またはリーダーペプチドに融合する異種ポリペプチドの
Ｎ末端におけるプロセッシング部位の近くに特定の修飾
を施こすことにより、未修飾リーダーペプチド−異種ポ
リペプチド構築物で得られうるものより正しくプロセス
化されたタンパク質が高い収率で得られることがわかっ
た。
したがって、本発明はシグナルペプチド、リーダーペ
プチドおよび異種タンパク質またはポリペプチドの融合
物からなるポリペプチドに関するものであり、その際ポ
リペプチドはリーダーペプチドのＣ末端と異種タンパク
質のＮ末端の間に位置する酵母プロセッシング部位に隣
接するそのアミノ酸配列において修飾されこれによりタ
ンパク質分解切断を受け入れやすくするプロセッシング
部位を提供するものであり、該ポリペプチドは次の構造
式： シグナルペプチド−リーダーペプチド−X1−X2−X3−X4
−異種タンパク質 （式中、X1はペプチド結合であるかまたは同一もしくは
異なった１つ以上のアミノ酸を表わし、 X2およびX3は同一または異なってもよく、LysおよびA
rgからなる群から選択される塩基性アミノ酸を表わし、 X2およびX3は一緒になって酵母プロセッシング部位を
限定し、そして X4はペプチド結合であるかまたは同一もしくは異なっ
た１つ以上のアミノ酸を表わし、 ただしX1および／またはX4は１つ以上のアミノ酸を表
わしそしてX1および／またはX4で表わされるアミノ酸の
少なくとも１つはGluおよびAspからなる群から選択され
る負に帯電したアミノ酸である） を有するものである。
この関係において、用語“シグナルペプチド”は現実
には主として疎水性であり酵母において発現された細胞
外タンパク質の前駆体におけるＮ末端配列として存在す
る予備配列を意味するものと理解される。シグナルペプ
チドの機能は、分泌されるべき異種タンパク質を小胞体
へ入れさせることである。シグナルペプチドはこの方法
の過程において通常は切断除去される。シグナルペプチ
ドはタンパク質産生酵母微生物と異なるかまたは同じで
もよいが、しかし上記したように、当該酵母微生物とこ
れが同じである場合により効率的なシグナルペプチドの
切断が得られうる。
語句“リーダーペプチド”とは、主に親水性ペプチド
であってその機能が分泌されるべき異種タンパク質を小
胞体からゴルジ装置へおよびさらに培地への分泌のため
の分泌小胞へ向かわせる（すなわち、細胞壁または少な
くとも細胞膜を貫通して細胞の周辺腔へ発現タンパク質
またはポリペプチドを輸送すること）ものを示唆すると
理解されたい。
語句“異種タンパク質またはポリペプチド”とは、実
際には宿主酵母微生物により作られないタンパク質また
はポリペプチドを示すものと意図される。用語“タンパ
ク質”および“ポリペプチド”は以下の記載においてほ
とんど交換可能に使用される。
プロセッシング部位（酵母タンパク質分解酵素により
与えられるタンパク質分解切断によりリーダーペプチド
が異種タンパク質から除去される部位）でのポリペプチ
ドの修飾であってX1および／またはX4により表わされる
修飾は、リーダーペプチドのＣ末端および／または異種
タンパク質のＮ末端における１つ以上のアミノ酸の延
長、置換または欠失の形である。
本発明によれば、驚くべきことに、ポリペプチドの配
列が延長されるかまたは配列における天然アミノ酸の１
つ以上が置換される少なくとも１つのアミノ酸が負に帯
電したアミノ酸たとえば上述のようなものである場合、
異種タンパク質のより効率的で正しいプロセッシングが
得られうることが見出された。同様な効果は、負に帯電
したアミノ酸を欠失によりプロセッシング部位に近接し
て与えた場合、すなわち負に帯電したアミノ酸がプロセ
ッシング部位に隣接して存在するまでリーダーのＣ末端
またはタンパク質配列のＮ末端から１個以上のアミノ酸
を欠失させる場合に見られる。
いかなる特定理論にも限定されることを望むものでは
ないが、この効果は、プロセッシング部位に隣接する負
に帯電されたアミノ酸により増加した親水性が賦課され
その結果水性細胞内環境においてプロセッシング部位で
のポリペプチドの三次構造の曝露が強められこれにより
プロセッシング酵素によるタンパク質分解切断をより受
けやすくなることに帰因するものと推測される。正に帯
電されまたは中性のアミノ酸と対照的に、負に帯電され
たアミノ酸の有利な効果は、プロセッシング酵素のいか
なる強力な阻害を生ずることなくプロセッシング部位に
おける三次構造の親水性に寄与するこれらアミノ酸の負
に帯電された側鎖によるものである。
負に帯電されたアミノ酸が他の手段たとえばポリペプ
チドにおける他のアミノ酸残基と相互反応することによ
りプロセッシング部位での三次構造（たとえば回転、ヘ
アピンまたはループ構造）を作り出しそして維持するこ
とに寄与することも可能である。さらに、負に帯電され
たアミノ酸とプロセッシング酵素間の直接の相互反応も
起こり得る。すなわち、プロセッシング部位の２つの塩
基性アミノ酸に隣接して位置する負に帯電されたアミノ
酸がプロセッシング酵素に対しタンパク質間および／ま
たはタンパク質と溶媒間で帯電相互反応により正しくそ
して有効な切断を起こすように指示するものと信じられ
る。
別の見地において、本発明は上記定義のポリペプチド
をコードするDNA配列からなるDNA構築物に関する。
さらに別の見地において、本発明は酵母において複製
することができ上記定義のポリペプチドをコードするDN
A構築物を有する組換体発現ベクター、ならびに異種タ
ンパク質またはポリペプチドを発現しうるそしてこのベ
クターで形質転換された酵母菌株に関する。
さらに別の見地において、本発明は、適当な培地にお
いて形質転換された酵母菌株を培養し異種タンパク質ま
たはポリペプチドの発現および分泌を得、その後で培地
からタンパク質またはポリペプチドを単離することから
なる酵母における異種タンパク質またはポリペプチドの
産生方法に関する。
発明の詳細な開示 上記説明と矛盾せず、X1が１つのアミノ酸を表わす場
合、これはGluまたはAspである。
X1および／またはX4はアミノ酸１〜６個を表わすのが
適当である。
X1が２つのアミノ酸の配列を表わす場合、構造式BAで
あり、その際式中ＡはGluまたはAspであり、ＢはGlu,As
p,Val,Gly、またはLeuでありたとえばLeuGluである。
X1が３つのアミノ酸の配列を表わす場合、構造式CBA
であり、その際式中ＡおよびＢは前記定義のものであ
り、ＣはGlu,Asp,Pro,Gly,Val,Leu,ArgまたはLysであり
たとえばAspLeuGluである。
X1が３個以上のアミノ酸の配列を表わす場合、追加の
アミノ酸の１つは適当にはProまたGlyであり、これらの
アミノ酸はタンパク質分解酵素に対するプロセッシング
部位の影響の受け易さを促進しそうな回転、ヘアピンお
よびループ構造を導入するかおよび／またはこれらの一
部を形成することが知られているからである。
X1が４つのアミノ酸の配列を表わす場合、構造式DCBA
を有し、その際A,BおよびＣは前記定義のものであり、
ＤはＣと同じ意味を有し、たとえばGluArgLeuGlu,LysGl
uLeuGluまたはLeuAspLeuGluである。
X1が５つのアミノ酸の配列を表わす場合、構造式EDCB
Aを有し、その際A,B,CおよびＤは前記定義のものであ
り、ＥはＣと同じ意味を有し、たとえばLeuGluArgLeuGl
uである。
X1が６個のアミノ酸の配列を表わす場合、構造式FEDC
BAを有し、その際その際A,B,C,DおよびＥは前記定義の
ものであり、ＦはＣと同じ意味を有し、たとえばValLeu
GluArgLeuGluである。
本発明範囲から離れることなくX1の意味としてアミノ
酸の他の組合せも可能であり、ただし配列におけるアミ
ノ酸の少なくとも１つが上記説明のように負に帯電した
アミノ酸であることは理解されるであろう。
X4の適当な意味はX1について上記で示したものである
が、アミノ酸の順序は一般に逆である（すなわちCBAよ
りむしろABC、等）。
１個以上の正に帯電したまたは疎水性アミノ酸により
異種タンパク質が開始する本発明ポリペプチドの実施態
様において、タンパク質分解酵素に対しプロセッシング
部位のより受入れ易さを確保すると思われるので、X4は
ペプチド結合よりむしろ１つ以上のアミノ酸を表わすの
が有利である。
X4がアミノ酸１〜６個のＮ末端延長を表わす場合、X4
で表わされるアミノ酸および異種タンパク質のＮ末端の
間に追加のプロセッシング部位を提供するのが適当であ
る。これは、タンパク質がＮ末端延長部のないタンパク
質の存在を必要とする目的に対し使用される場合に特に
重要である。追加のＮ末端アミノ酸はインビトロで適当
タンパク質分解酵素たとえばトリプシン様プロテアーゼ
を用いてまたは臭化シアンのような薬品で処理すること
によりタンパク質分解切断して除去される。また、別の
酵母タンパク質分解酵素に特異的なプロセッシング部位
を選択する宿主酵母微生物により追加のプロセッシング
部位における切断を効果的に行なうこともできる。
しかしながら、いくつかの目的に対し、特異的目的に
適合するようにＮ末端延長部をデザインすることも有利
である。すなわち、延長部はタンパク質の検出のための
マーカーとして、タンパク質を精製するための助剤とし
てまたはインビボで薬剤の作用を調節する、たとえば薬
剤の半減期を遅らせたりもしくは身体の特異的位置へこ
れを攻撃する手段としての役目をする。
本発明ポリペプチドの好ましい実施態様において、X1
および／またはX4はアミノ酸１〜４個のアミノ酸配列を
表わす。この実施態様において、先きにさらに詳細に説
明したように、これらのアミノ酸の親水性の性質のため
にプロセッシング部位の好ましい供与を備えるので、X2
に直接隣接するアミノ酸はGluまたはAspであるのが好ま
しく、X3に直接隣接するアミノ酸はGluまたはAspである
のが好ましく、または両方ともGluまたはAspである。X1
またはX4で表わされるアミノ酸配列は２個以上のGluま
たはAspからなるのが適する。
本発明のポリペプチドの別の興味深い実施態様におい
て、X1およびX4の両方ともが１つ以上のアミノ酸を表わ
し、換言すれば、ポリペプチドはリーダーペプチドのＣ
末端と異種タンパク質のＮ末端の両方ともで修飾されて
いる。この実施態様において、X1およびX4は対称的同一
であり、すなわちX1およびX4により表わされるアミノ酸
はそれぞれX2およびX3から外へ向かって同じ延長部を有
する。
本発明ポリペプチドのシグナルペプチド配列は、細胞
の分泌経路へ発現されたポリペプチドを効果的に向けさ
せることを保証するいずれかのシグナルペプチドであ
る。シグナルペプチドは天然に生ずるシグナルペプチド
もしくはその機能的部分であるか、または合成ペプチド
でよい。適当なシグナルペプチドはα−ファクターシグ
ナルペプチド、マウス唾液アミラーゼのシグナルペプチ
ド、修飾されたカルボキシペプチドーゼシグナルペプチ
ドまたは酵母BAR1シグナルペプチドであることが見出さ
れた。マウス唾液アミラーゼシグナル配列は、オー．ハ
ーゲンブュヒル O.Hagenbら、Nature 289,1981,P643
−646に記載されている。カルボキシペプチダーゼシグ
ナル配列は、エル．エー．ヴァルス L.A.Vallsら、Cell
48,1987,p887−897により記載されている。BAR1シグナ
ルペプチドはWO第87/02670号に記載されている。
本発明ポリペプチドのリーダーペプチド配列は、発現
されたポリペプチドを小胞体およびさらに分泌経路へ向
けさせる機能のいずれかのリーダーペプチドである。こ
の目的に適する可能性のあるリーダー配列は、酵母また
は他の微生物由来の天然リーダーペプチドであり、たと
えばα−ファクターリーダーまたはその機能的類似物質
である。リーダーペプチドは合成リーダーペプチドでも
よく、たとえば次のアミノ酸配列を有する国際特許出願
公開第WO 89/02463号に記載されている合成リーダーま
たはその誘導体の１つである： 本発明方法により作られる異種タンパク質は酵母で作
られるのが有利なタンパク質である。このようなタンパ
ク質の例は、アプロチニンまたは他のプロテアーゼ阻害
剤、インシュリン（インシュリン前駆体を含む）、ヒト
またはウシ成長ホルモン、インターロイキン、グルカゴ
ン、組織プラスミノーゲンアクチベーター、VII因子、V
III因子、XIII因子、血小板由来増殖因子、酵素等、ま
たはこれらの機能的類似物質である。この関係におい
て、用語“機能的類似物質”とは天然タンパク質として
同様の機能を有するポリペプチドを示すことを意味する
（これは天然タンパク質の生物学的活性のレベルよりむ
しろ天然に関するものと理解されることを意図する）。
ポリペプチドは天然タンパク質と構造的に類似であり、
天然タンパク質のＣ末端およびＮ末端のいずれかもしく
は両方へ１つ以上のアミノ酸を追加するか、天然アミノ
酸配列の１つまたは多数の部位で１つ以上のアミノ酸を
置換するか、天然タンパク質のいずれかもしくは両端部
またはアミノ酸配列における１つもしくは幾つかの部位
で１つ以上のアミノ酸を欠失するか、または天然アミノ
酸配列における１つ以上の部位で１つ以上のアミノ酸を
挿入することにより天然タンパク質から由来する。この
ような修飾は上述の幾つかのタンパク質についてよく知
られている。
本発明によれば、驚くべきことに上述したようなリー
ダーペプチドのＣ末端または異種タンパク質のＮ末端で
の修飾が正しくプロセス化さたアプロチニン（または、
上述したような機能的類似物質）の高収率での産生を許
すことが見出された。アプロチニンはプロテアーゼ阻害
タンパク質であり、その特性により様々な医療目的に有
用である（たとえば、膵炎、敗血性ショック症候群、高
線維素溶解性出血および心筋梗塞の治療）。高い投与量
のアプロチニン投与は心臓手術または他の主な手術と関
係する血液損失を著しく減らす。アプロチニンはまた、
これが発現されたタンパク質の不所望なタンパク質分解
切断を起こすかもしれない宿主細胞プロテアーゼを阻害
するので培地への添加剤としても有用である。公知の天
然リーダー配列たとえばα−ファクターリーダーを用い
て酵母中で正しくプロセスされたアプロチニンを高収率
で得る際に困難を経験した。天然アプロチニンは塩基性
アミノ酸（Arg）によりＮ末端で開始し、そしてこの理
由のために公知リーダーペプチド（たとえばα−ファク
ターリーダー）の１つを本発明による修飾することなく
使用する場合、先行するプロセッシング部位がタンパク
質分解切断（上述のような）を受け入れにくくなり、そ
の結果もしあったとしても正しくプロセスされたアプロ
チニンが低収率で得られることになる。
本発明によれば、X1およびX4が他の意味を有しただし
アミノ酸の少なくとも１つ最も好ましくはプロセッシン
グ部位に対し最も近い１つが上述のように負に帯電した
アミノ酸であるアプロチニンの有利な収率が得られるこ
とが期待されるとはいえ、特に良好な結果はX1がGluArg
LeuGluを表わすかまたはX4がGluLeuもしくはGluLeuAspL
euを表わすアプロチニン（以下の例を参照）の生産に関
し得らる。
また本発明によれば、上述のようにリーダーペプチド
のＣ末端または異種タンパク質のＮ末端での修飾が正し
くプロセス化されたインシュリン前駆体（または上記定
義のような機能的類似物質）の高収率の産生を許すこと
が見出された。本発明のこの実施態様において、X1はGl
u−Arg−Leu−GluまたはLys−Glu−Leu−Gluを表わし、
その場合X4は通常ペプチド結合を表わすものである。こ
れに代わり、X4はGluを表わし、その場合X1は通常ペプ
チド結合を表わすものである。特に、インシュリン類似
物質前駆体Ｂ（１−29）−AlaAlaLys−Ａ（１−29）で
あってX1がLysGluLeuGluを表わす場合またはX4がインシ
ュリン前駆体の最初のアミノ酸としてのPheのGluによる
置換を表わす場合（以下の例を参照）の発現に関し有利
な結果が得られる。X1がLys−Glu−Leu−Gluを表わす場
合インシュリン類似物質前駆体Ｂ（１−29）SerAspAspA
laLys−Ａ（１−29）の妥当な収率もまた得られる。さ
らに、X1およびX4は他の意味を表わしただし少なくとも
１つのアミノ酸、最も好ましくはプロセッシング部位に
最も近い１つが上述のように負に帯電したアミノ酸であ
るインシュリン前駆体の高収率も期待される。
本発明ポリペプチドをコードする本発明のDNA構築物
は、確立された標準的方法により、たとえばエス．エ
ル．ビューケージ S.L.Beaucageおよびエム．エイチ．
カルーサーズ M.H.Caruthers,Tetra−hedron Letters 2
2,1981,p.1859−1869により記載されたホスホアミダイ
ト法またはマッセスらMatthes et al.EMBO Journal 3,1
984,p801−805により記載された方法により合成されう
る。ホスホアミダイト法によれば、オリゴヌクレオチド
はたとえば自動DNA合成機中で合成され、精製され、重
複化されそして連結されて合成DNA構築物を形成する。
本発明によるDNA構築物はまた、たとえば一般的技術
（ティ．マニアティスらT.Maniatis et al.,Molecular
Cloning:A Laboratory Manual,コールドスプリング ハ
ーバー,1982）にしたがって、たとえばゲノムまたはcDN
Aライブラリィを作りそして本発明ポリペプチドの全部
または一部をコードするDNA配列を合成オリゴヌクレオ
チドプローブを用いたハイブリッド化によりスクリーニ
ングすることにより得られるゲノムまたはcDNA起源から
なる。この場合、シグナルおよびリーダーペプチドをコ
ードするゲノムまたはcDNA配列を異種タンパク質をコー
ドするゲノムまたはcDNA配列と結合し、その後で、たと
えば公知手法にしたがって相同組換体の所望のアミノ酸
配列をコードする合成オリゴヌクレオチドを用いてたと
えば特定部位の突然変異誘発によりポリペプチドのアミ
ノ酸配列X1−X2−X3−X4に相当する部位でDNA配列を修
飾してもよい。
最後に、DNA構築物は、（適切に）合成、ゲノムまた
はcDNA起源のフラグメントをアニーリングすることによ
り調製された混合された合成およびゲノム性、混合され
た合成およびcDNAまたは混合されたゲノムおよびcDNA起
源からなり、前記フラグメントは標準的技術にしたがっ
て全DNA構築物の様々な部分に相当する。すなわち、非
相同タンパク質をコードするDNA配列はゲノム起源であ
り一方リーダーペプチドをコードする配列は合成的に調
製されうるということが観察される。
アプロチニンをコードする好ましいDNA構築物は添付
された第４図、第７図、第９図、第11図および第12図に
示されるものであり、またはアプロチニンもしくはその
機能的類似物質をコードする適当に修飾されたものであ
る。DNA配列の適当な修飾の例は、タンパク質の別のア
ミノ酸配列を起こさないがしかしDNA構築物が挿入され
る酵母微生物のコドン使用に相当するヌクレオチド置換
であるかまたは異なったアミノ酸配列を起こし場合によ
っては異なったタンパク質構造を生ずるかもしれないが
しかしながら天然アプロチニンの抗プロテアーゼ特性を
損なうことのないヌクレオチド置換である。可能性のあ
る修飾の別の例は、１個以上のヌクレオチドの配列への
挿入、１個以上のヌクレオチドの配列のいずれかの末端
への追加および配列範囲内でのいずれかの末端での１個
以上のヌクレオチドの欠失である。特異的アプロチニン
類似物質の例はヨーロッパ特許出願公開第339942号に記
載されているものである。
インシュリン前駆体をコードする好ましいDNA構築物
は添付の第16図および第17図に示されるものまたは上述
のように適当に修飾されたものである。
本発明ポリペプチドをコードするDNA配列を有する組
換体発現ベクターは酵母微生物中で複数可能ないずれか
のベクターである。ベクターにおいて、本発明ポリペプ
チドをコードするDNA配列は適当なプロモーター配列に
操作可能に接続するべきである。プロモーターは酵母に
おいて転写活性を示すいずれかのDNA配列および酵母と
相同または非相同のいずれかのタンパク質をコードする
遺伝子から由来する。プロモーターは酵母と相同なタン
パク質をコードする遺伝子から由来するのが好ましい。
適当なプロモーターの例はサッカロミセス セレヴィシ
アエＭα1,TPI,ADHまたはPGKプロモーターである。
本発明ポリペプチドをコードするDNA配列は、適当な
ターミネーターたとえばTPIターミネーター（たとえ
ば、タイ．アルバーおよびジィ．カワサキ,J.Mol.Appl.
Genet.1,1982,p419−434）に操作可能に接続してもよ
い。
本発明の組換体発現ベクターはさらにベクターが酵母
における複製を可能にするDNA配列からなる。このよう
な配列の例は酵母プラスミドＺμ複製遺伝子REP1−３お
よび複製の開始点である。ベクターはまた選択可能なマ
ーカー、たとえばピィ．アール．ラッセルP.R.Russell,
Gene 40,1985,p125−130に記載されているようにシゾサ
ッカロミセス ポンベTPI遺伝子を含んでもよい。
本発明ポリペプチドをコードするDNA配列、プロモー
ターおよびターミネーターをそれぞれ連結するために使
用される手段および酵母複製に必要な情報を含む適当な
酵母ベクターへこれらを挿入するために使用される手段
は、当業者によく知られている（たとえば、マニアティ
スら、前出）。ベクターは、最初に本発明ポリペプチド
をコードする全DNA配列を含むDNA構築物を調製し続いて
このフラグメントを適当な発現ベクターへ挿入するか、
または個々の要素（たとえばシグナル、リーダーまたは
異種タンパク質）に対する遺伝子情報を含むDNAフラグ
メントを逐次挿入し続いて連結するかのいずれかの方法
により構築されることは理解されるであろう。
本発明方法で使用される酵母微生物は、培養時に当該
異種タンパク質またはポリペプチドを多量に産生する適
当な酵母微生物のいずれかである。適当な酵母微生物の
例は、酵母種たとえばサッカロミセス セレヴィシア
エ、サッカロミセス クルイベリ（S.Kluyveri）．シゾ
サッカロミセス ポンベまたはサッカロミセス ウヴァ
ラム（S.uvarum）ａ菌株である。酵母細胞の形質転換
は、たとえば原形質体形成（たとえば以下の例１）とこ
れに続くそれ自体公知の方法で形質転換することにより
行われる。細胞を培養するために使用される培地は酵母
微生物増殖に適する通常の培地のいずれかである。分泌
された異種タンパク質であってその十分な割合が正しく
プロセスされた形で培地中に存在するものを、常法によ
りたとえば遠心分離または濾過により培地から酵母細胞
を分離し、たとえば硫酸アンモニウムのような塩を用い
て上澄または瀘液の水性タンパク質成分を沈んでさせ、
続いて様々なクロマトグラフィ手段たとえばイオン交換
クロマトグラフィ、アフィニティクロマトグラフィ等に
より精製することにより、培地から回収する。
さらに別の見地において、本発明は一般式X4−アプロ
チニン（１−58）（式中、X4は、少なくもそのうちの１
つがGluおよびAspからなる群から選択される負に帯電し
たアミノ酸である１つ以上のアミノ酸によるＮ末端延長
部を表わす）で表わされる新規アプロチニン類似物質に
関する。X4はアミノ酸１〜６個、特にアミノ酸１〜４個
の配列を表わし、上述の意味のいずれかを有する。X4で
表わされる特に好ましい意味はGlu−LeuおよびGlu−Leu
−Asp−Leuである。
図面の簡単な説明 本発明をさらに添付の図面を参照しながら以下の例に
おいて説明するが、図において 第１図はアプロチニン（１−58）のDNAおよびアミノ
酸配列を示す。DNA配列において示される食い違い線は
合成オリゴヌクレオチドから形成される二重鎖が連結さ
れた部位を示す。
第２図はプラスミドpKFN−802とpKFN−803の構築を示
す。
第３図はプラスミドpKFN−849とpKFN−855の構築を示
す。
第４図はpKFN−849とpKFN−855からの406bp EcoR I−
Xba IフラグメントのDNA配列を示す。
矢印はタンパク質分解が分泌の間に起こる部位を示
す。
第5A図および5B図はそれぞれアプロチニンによるトリ
プシンとプラスミンの阻害を示す；●はウシ膵臓アプロ
チニンを示し、ＸはGluLeu−アプロチニンを示し、Δは
GluLeuAspLeu−アプロチニンを示す。
第６図はプラスミドpKFN−852とpKFN−858の構築を示
す。
第７図はpKFN−852とpKFN−858からの412bp EcoR I−
Xba IフラグメントのDNA配列を示す。矢印は分泌の間に
タンパク質分解切断が生ずる部位を示す。
第８図はプラスミドpKFN−995とpKFN−998の構築を示
す。
第９図はpKFN−995とpKFN−998からの412bp EcoR I−
Xba IフラグメントのDNA配列を示す。
第10図はプラスミドpKFN−1000とpKFN−1003の構築を
示す。
第11図はpKFN−1000とpKFN−1003からの412bp EcoR I
−Xba IフラグメントのDNA配列を示す。矢印は分泌の間
にタンパク質分解切断が起こる部位を示す。
第12図は合成アプロチニン（３−58）遺伝子のDNA配
列を示す。配列内の食い違い線は10個の合成されたオリ
ゴヌクレオチドから形成された５つの二重鎖が連結され
る部位を示す。
第13図はプラスミドpKFN−305とpKFN−374/375の構築
を示す。
第14図はプラスミドpMT−636の構築を示す。
第15図はプラスミドpLaC−240の構築を示す。
第16図はpLaC−240からの修飾されたリーダー−イン
シュリン前駆体のDNA配列を示す。
第17図はMFα１−シグナルリーダー（１−85）とイン
シュリン類似物質前駆体Ｂ（１−29,1Glu＋27Glu）−Al
aAlaLys−Ａ（１−21）をコードするpKFN−458からの50
8bp EcoR I−Xba IフラグメントのDNA配列を示す。
例 例１ 酵母菌株KFN−837からのGlu−Leu−アプロチニン（１−
58）の産生 ａ）プラスミドpKFN−802の構築 アプロチニン（１−58）をコードする合成遺伝子を、
連結により10個のオリゴヌクレチドから構築した。
オリゴヌクレオチドは、調節された極性ガラス支持体
上でホスホルアミダイト化学を用いて自動DNA合成機中
で合成された（ビューケージ，エス．エル.Beaucage,S.
L.,およびカーサーズ，エム．エイチ.Caruthers,M.H.,T
etrahedron Letters 22,（1981）1859−1869）。
次の10個のオリゴヌクレオチドが合成された： ５つの二重鎖Ａ−Ｅを第１図に示すように上記10個の
オリゴヌクレオチドから形成した。
二重鎖Ａ−Ｅの各々20ピコモルを、５′−ホスホリル
化オリゴヌクレオチドの相当する対から、90℃にて５分
間続いて75分間にわたって室温まで冷却することにより
形成した。５つの二重鎖を混合し、T4DNAリガーゼで処
理した。合成遺伝子は、２％アガロースゲル中での連結
混合物の電気泳動後191bpバンドとして単離された。得
られた合成遺伝子を第１図に示す。
合成遺伝子を、pLaC212spx3から209bp EcoR I−Nco I
フラグメントとプラスミドpUC19（ヤーニッシューペロ
ン，シィ.Yanisch−Perron,C.ヴイエイラ，ジェイ.Viei
ra,J.およびメシッヒ，ジェイ.Messing,J.,Gene 33（19
85）,103−119）の2.7kb EcoR I−Xba Iフラグメントと
連結した。プラスミドpLaC212spx3は国際特許出願WO 89
/02463号の例３に記載されている。
pLaC212spx3からの209bp EcoR I−Nco Iフラグメント
は合成酵母リーダーペプチドをコードする。
連結混合物を用いて、アンピシリン耐性について選択
されたコンピテント大腸菌株γ-,m+）を形質転換した。
32P−Xba I−EcoR Iフラグメントの配列決定（マクサ
ム，エー.Maxam.Aおよびギルバート，ダブリュ.Gilber
t,W.,Methods Enzymol.65（1980）,499−560）によれば
得られたコロニーからのプラスミドはアプロチニン（１
−58）についての正しいDNA配列を含んでいた。
１つのプラスミドpKFN802が別の用途に選択された。
プラスミドpKFN802の構築を第２図に示す。
ｂ）プラスミドpKFN−849,pKFN−855および酵母菌株KFN
−837の構築 pKFN−802の3.0kb Nco I−Stu IフラグメントをT4DNA
リガーゼを有する合成フラグメントNOR−790/791と連結
した： 連結混合物を制限酵素Stu Iで消化しpKFN−802のバッ
クグラウンドを減少させ、得られた混合物を使用してア
ンピシリン耐性を選択するコンピテント大腸菌株（γ-,
m+）を形質転換した。得られるコロニーの１つからのプ
ラスミドpKFN−849はDNA配列決定より示され（サンガ
ー，エフ.Sanger,F.,ミクレン，エス.Micklen,S.,およ
びカウルソン，エー．アール.Coulson,A.R.,Proc,Natl.
Acad.Sci.USA74（1977）,5463−5467）、合成酵母リー
ダー遺伝子に正しく融合したGlu−Leu−アプロチニン
（１−58）に対するDNA配列を含む。プラスミドpKFN−8
49の構築を第３図に示す。
pKFN−849はEcoR IとXba Iで切断され、460bpフラグ
メントをpMT636からの9.5kb Nco I−Xba Iフラグメント
とpMT636からの1.4kb Nco I−EcoR Iフラグメントに連
結し、その結果としてプラスミドpKFN−855が得られ
た。第３図参照。プラスミドpMT636は国際特許出願第PC
T/DK88/00138号に記載されている。
pMT636は、シゾサッカロミセス ポンベSchizosaccha
romycespombe TPI遺伝子（POT）（ラッセル，ピィ．ア
ール.Russell,P.R.,Gene 40（1985）,125−130）、サッ
カロミセス セレヴィシアエ トリオース ホスフェー
ト イソメラーゼプロモーターおよびターミネーターTP
IPおよびTPIT（アルバー，ティ.Alber,T.およびカワサ
キ，ジィ.Kawasaki,G.J.Mol.Appl.Gen.1（1982）,419−
434）を含む大腸菌−サッカロミセスセレヴィシアエ
シャトルベクターである。プラスミドpKFN−855は以下
の配列を有する： TPIP−LaC212spx3シグナルリーダー−Glu−Leu−アプロ
チニン（１−58）−TPIT （式中、LaC212spx3シグナル−リーダーは、国際特許出
願公開第WO 89/02463号に記載された合成酵母リーダー
である。pKFN−849およびpKFN−855からの406bp EcoR I
−Xba IフラグメントのDNA配列を第４図に示す。
サッカロミセス セレヴィシアエ菌株MT663（E2−7B
XE 11−36a/α，Δtpi Δtpi,pep4−3/pep4−３）をY P
GaL（１％バクト酵母抽出物、２％バクトペプトン、２
％ガラクトース、１％ラクテート）上でO.D.600nmが0.6
まで増殖した。
培養物100μを遠心分離により採取し、水10mlで洗
い、1.2Mソルビトール、25mM Na2EDTA pH＝8.0および6.
7mg/mlジチオトレイトールを含む溶液10ml中に再懸濁し
た。懸濁液を15分間30℃でインキュベートし、遠心分離
し、1.2Mソルビトール、10mM Na2EDTA、0.1Mクエン酸ナ
トリウム、pH＝5.8および2mgノボザイム（Novozym）登
録商標234を含む溶液10ml中に細胞を再懸濁した。懸濁
液を30℃で30分間インキュベートし、遠心分離により細
胞を集め、1.2Mソルビトール10mlおよびCAS（1.2Mソル
ビトール、10mM CaCl2、10mMトリスHCl（トリス＝トリ
ス（ヒドロキシメチル）アミノメタン）pH＝7.5）10ml
中で洗浄し、CAS2ml中に再懸濁した。形質転換のため
に、CAS−再懸濁細胞0.1mlをプラスミドpKFN−855ほぼ
１μｇと混合し、室温で15分間放置した。（20％ポリエ
チレングリコール4000,20mM CaCl2,10mM CaCl2,10mMト
リスHCl、pH＝7.5）1mlを加え、そして混合物をさらに3
0分間室温で放置した。混合物を遠心分離し、ペレット
をSOS（1.2Mソルビトール、33％ v/v YPD、6.7mM CaC
l2、14μg/mlロイシン）0.1ml中に再懸濁させ、30℃で
２時間インキュベートした。次いで懸濁液を遠心分離
し、ペレットを1.2Mソルビトール0.5ml中に再懸濁させ
た。次いで、52℃でトップ寒天（シャーマンらSherman
et al.,のSC培地（Methods in Yeast Genetics,コール
ド スプリング ハーバーラボラトリィ（1981））1.2M
ソルビトール＋2.5％寒天含有）6mlを添加し、懸濁液
を、同じ寒天固化ソルビトール含有培地を含む皿のトッ
プへ注入した。30℃で３日後に形質転換体コロニーを選
び、再度単離しそしてこれを用いて液体培養を始めた。
このような形質転換体の１つKFN−837をさらに特定決定
化のため選択した。
酵母菌株KFN−837をYPD培地（１％酵母抽出物、２％
ペプトン（ディフコ ラボラトリィズ Difco Laborator
ies製）および６％グルコース）上で増殖した。菌株の
培養物200mlを３日間30℃で250rpmにて振とうしてO.D.6
00nm20とした（乾燥酵母バイオマス 18.8g/）。遠心
分離後、上澄をFPLCイオン交換クロマトグラフィにより
分析した。0.22μｍミレックスMillex GVフィルターユ
ニットを通して酵母上澄を濾過し、1mlを、20mMバイシ
ンBicine,pH＝8.7で平衡化したモノエスMonos陽イオン
交換カラム（0.5×5cm）に施こした。平衡緩衝液で洗浄
後、カラムを直線NaCl勾配（０−1M）平衡緩衝液で溶出
した。トリプシン阻害活性は、分光分析（カッセル，ビ
ィ.Kassel,B.,Methods Enzymol.19（1970）,844−852）
によりそしてさらに次式 からの280nmでの吸収量の積算により溶出されたフラク
ション中で定量化された。
収量はGlu−Leu−アプロチニン（１−58）120mg/で
あった。
アミノ酸分析およびＮ末端配列決定のために、勾配溶
出されたGlu−Leu−アプロチニン（１−58）の濃縮およ
びさらに精製を、逆相カラム（バイダクVydac C4,4.6×
250mm）中HPLCより行なった。0.1％TFA中のCH3CN勾配液
で溶出を行なった。集めたフラクションを減圧遠心分離
により約100μまで濃縮し、サンプルをＮ末端配列決
定とアミノ酸分析のために採取した。
Ｎ末端配列決定により、以下の配列： であることがわかり、Ｎ末端が正しいことが確認され
た。半分のシステイン残基がこの方法では測定できず、
これは残基No.7およびno.16で得られるブランクサイク
ル（Ｘ）による。
アミノ酸分析を第１表に示す。この表から生成物が予
期されたアミノ酸組成、すなわちさらにGluおよびLeuを
有することが明らかである。Ileの若干低い含有量は、
ほとんどIle（18）−Ile（19）の不完全な加水分解のせ
いであろう（これは当業界で公知である）。また、Arg
が予想より若干高い。しかしながら、これもまた天然ア
プロチニンでも見られる（第１表、第３欄）。
上述のカッセル法と比較して、Glu−Leu−アプロチニ
ン（１−58）の特異的活性が天然アプロチニンの特異性
活性と実験誤差の範囲内で同一であることが見出され
た。下記のように測定された滴定曲線の結果におけるGl
u−Leu−アプロチニン（１−58）によるトリプシンおよ
びプラスミン阻害はウシ膵臓アプロチニン（アプロチニ
ン ノボ）のものと区別できなかった。アプロチニンま
たはその類似物質と酵素の30分間のインキュベーション
後、0.6mM S 2251（カビビトラムkabiVitrum）を添加
し、活性をニトロアニリン産生の割合として測定した。
アプロチニン濃度の関数としての活性を第5A図および第
5B図にプロットした。３つすべての阻害剤による両方の
完全な阻害が観察された。
例２ 酵母菌株KFN−840からのGlu−Leu−Asp−Leu−アプロチ
ニン（１−58）の産生 Glu−Leu−Asp−Leu−アプロチニン（１−58）をコー
ドする合成遺伝子を例１に記載のように構築した。合成
フラグメントNOR−793/794をNOR−790/791の代わりに使
用した： プラスミドpKFN−852由来のpUC19は、pKFN−849と同
様にして構築された。
例１の手順にしたがって、プラスミドpKFN−858が次
の構築物TPIP−LaC212spx3シグナルリーダー−GluLeuAs
pLeu−アプロチニン（１−58）−TPITを含んで得られ
た。
プラスミドpKFN−852およびpKFN−858の構築物を第６
図に示す。pKFN−852とpKFN−858からの412bp EcoR I−
Xba IフラグメントのDNA配列を第７図に示す。
プラスミドpKFN−858を上述のように酵母菌株MT663へ
形質転換すると酵母菌株KFN−840が得られた。
YPD培地中のKFN−840培養物200mlを、３日間30℃で25
0rpmにて振とうしてO.D.600mmを18とした（乾燥バイオ
マス16.7mg/）。上述のような上澄液のFPLCイオンク
ロマトグラフィによりGlu−Leu−Asp−Leu−アプロチニ
ン（１−58）90mg/の収率が得られた。
第１表からアミノ酸分析が明らかであり、予期したア
ミノ酸組成と一致する。
Glu−Leu−Asp−Leu−アプロチニン（１−58）のトリ
プシンおよびプラスミン阻害滴定曲線はウシ膵臓アプロ
チニン（アプロチニン ノボ）のものと区別がつかなか
った（第5A図および第5B図参照）。
例３ 酵母菌株KFN−1006からのアプロチニン（１−58）の産
生 プラスミドpKFN−995は合成フラグメントNOR−848/84
9へ3.0kb Nco I−Stu Iフラグメントを連結することに
よりpKFN−802から構築された： 連結混合物を制限酵素Bal Iで消化し、pKFN−802のい
かなるバックグラウンドをも減らした。
酵母発現プラスミドpKFN−998は実質的に例１に記載
のように構築され、第８図に示される： TPIP−LaC212spx3シグナル−リーダー（１−47）Lys−G
lu−Leu−Glu（Lys−Arg）−アプロチニン（１−58）−
TPIT pKFN−995およびpKFN−998からの412bp EcoR I−Xba
IフラグメントのDNA配列を第９図に示す。
例１に記載のようにプラスミドpKFN−998を酵母菌株M
T663へ形質転換して酵母菌株KFN−1006を得た。YPD培地
中の形質転換菌株KFN−1006の培養と上澄中のアプロチ
ニン（１−58）の分析を上述のように行なった。
収量はアプロチニン（１−58）30mg/であった。
精製した物質のアミノ酸分析は予期したアミノ酸組成
を確認した。
例４ 酵母菌株KFN−1008からアプロチニン（１−58）の産生 pUC由来プラスミドpKFN−1000を、pKFN−802の3.0kb
Nco I−stu Iフラグメントを合成フラグメントNOR−850
/851と連結することにより例１に記載のように構築し
た： 例１および例３の手順にしたがって、次の構築物TPIP
−LaC212spx3シグナル−リーダー（１−47）−GluArgLe
uGlu（Lys−Arg）アプロチニン（１−58）−TPITを含む
酵母発現プラスミドpKFN−1003が得られた。
プラスミドpKFN−1000およびpKFN−1003の構築物を第
10図に示す。pKFN−1000およびpKFN−1003からの412bp
EcoR I−Xba IフラグメントのDNA配列を第11図に示す。
プラスミドpKFN−1003を上述のように酵母菌株MT663
に形質転換すると酵母菌株KFN−1008が得られた。
形質転換菌株KFN−1008のYPD培地中での培養および上
澄におけるアプロチニン（１−58）の分析を上述のよう
に実施した。収量はアプロチニン（１−58）120mg/で
あった。
精製した物質のアミノ酸分析は予期されるアミノ酸組
成と一致した。さらに、還元したピリジルエチル化ポリ
ペプチドのガス相配列決定により完全な一次構造の確認
が得られた。
さらに、トリプシンに対する組換体アプロチニン（１
−58）の特異的阻害活性はウシ膵臓アプロチニンのもの
と区別がつかなかった。
例５ 酵母菌株KFN−783からアプロチニン（１−58）の産生 プラスミドpKFN−802（たとえば例１）を、EcoR IとX
ba Iで切断し、400bpフラグメントをpMT636からの9.5kb
Nco I−Xba IフラグメントとpMT636からの1.4kb Nco I
−EcoR Iフラグメントに連結すると、プラスミドpKFN−
803が得られた（例２参照）。pKFN−803は次の構造を有
する： TPIP−LaC212spx3シグナルリーダー−アプロチニン（１
−58）−TPIT プラスミドpKFN−803を上記のように酵母菌株MT663中
で形質転換した。形質転換菌株KFN−783のYPD培地中で
の培養および上澄のFPLCイオンクロマトグラフィを上述
のように実施した。アプロチニン（１−58）を、ウシ膵
臓から精製した真正アプロチニンの標準化溶液のクロマ
トグラフィと比較して定量化した。アプロチニン（１−
58）の収量は1mg/未満であった。
例６ アプロチニン（３−58）の調製 アプロチニン（３−58）に対する合成遺伝子を多数の
オリゴヌクレオチドから連結により構築された。
次の10個のオリゴヌクレオチドが例１に記載のように
合成された： ５つの二本鎖Ａ−Ｅが第12図に示すように上記10個の
オリゴヌクレオチドから形成された。
二本鎖Ａ−Ｅの各々20ピコモルは、５′−ホスホリル
化オリゴヌクレオチドＩ−Ｘの相当する対から、90℃に
て５分間加熱し次いで75分間にわたって室温まで冷却す
ることにより形成された。５つの二本鎖を混合し、T4リ
ガーゼで処理した。連結混合物の２％アガロースゲル中
の電気泳動後、合成遺伝子が176bpバンドとして単離さ
れた。得られた合成遺伝子を第12図に示す。
合成176bp遺伝子は、サッカロミセス セレヴィシア
エ成熟因子α１シグナル−リーダー（１−85）配列（マ
ルクッセン，ジェイ.Markussen,Jら、Protein−Enginee
ring 1 （1987）,215−233）をコードするプラスミドpK
FN−９からの330bp EcoR I−Hga IフラグメントとpUC19
（ヤーニッシューペロン，シイ.Yanish−Perron,C.,ヴ
イエイラ，ジェイ.Vieira,J.およびメシッヒ，ジェイ.M
essing,J.,Gene 33（1985）,103−119）からの2.7kb Ec
oR I−Xba Iフラグメントと連結した。MFα１リーダー
配列の直後にHga I部位を含むpKFN−９の構築物はヨー
ロッパ特許第214826号に記載されている。
連結混合物を用いてアンピシリン耐性を選択するコン
ピテント大腸菌株（γ-,m+）を形質転換した。32P−Xba
I−EcoR Iフラグメントの配列決定（マクサム，エー．
およびギルバート，ダブリュ.,Methods Enzymol.65（19
80）,499−560）により、得られたコロニーからのプラ
スミドがアプロチニン（３−58）についての正しいDNA
配列を含むことがわかった。
１つのプラスミドpKNF305が別の用途のために選択さ
れた。プラスミドpKNF305の構築物を第13図に示す。
pKFN305をEcoR IとXba Iで切断し、0.5kbフラグメン
トをpMT636からの9.5kb Nco I−Xba Iフラグメントおよ
びpMT636からの1.4kb Nco I−EcoR Iフラグメントと連
結し、その結果プラスミドpKFN374が得られ、第13図を
参照せよ。プラスミドpMT636は、LEU−２遺伝子の欠失
後のpMT608およびpMT479から構築され、第14図を参照せ
よ。pMT608はヨーロッパ特許第195691号に記載されてい
る。pMT479はヨーロッパ特許第163529号に記載されてい
る。pMT479はシゾサッカロミセス ポンベTPI遺伝子（P
OT）、サッカロミセス セレヴィシアエ トリオースホ
スフェート イソメラーゼ プロモーターおよびターミ
ネーター、TPIPおよびTPIT（アルバー，ティ．およびカ
ワサキ，ジィ.J.Mol.Appl.Gen.1（1982）,419−434）を
含む。プラスミドpKFN374は次の配列を含む： TPIP−MFα１−シグナルリーダー（１−85）−アプロチ
ニン（３−58）−TPIT （式中、MFα１はサッカロミセス セレヴィシアエ成熟
ファクターα１をコードする配列（クルジャン，ジェス
およびヘルスコウィッツ，アイ.,Cell 30（1982）,933
−943）であり、シグナル−リーダー（１−85）は配列
がMFα１シグナル−リーダー配列の最初の85個のアミノ
酸残基を含むことを意味し、アプロチニン（３−58）は
最初の２つのアミノ酸残基が欠除しているアプロチニン
誘導体をコードする合成配列である。
サッカロミセス セレヴィシアエ菌株MT663（E2−7B,
XE11−36a/α，Δtpi Δtpi,pep4−3/pep4−３）はYPGa
L（１％バクト酵母抽出物、２％バクトペプトン、２％
ガラクトース、１％ラクテート）中で増殖してO.D.600n
m 0.6までにした。
得られた培養物100mlを遠心分離により採取し、水10m
lで洗い、再度遠心分離し、1.2Mソルビトール、25mM Na
2EDTA pH＝8.0および6.7mg/mlジチオトレイトールを含
む溶液10ml中に再度懸濁した。懸濁液を15分間30℃でイ
ンキュベートし、遠心分離し、そして細胞を1.2Mソルビ
トール、10mM Na2EDTA、0.1Mクエン酸ナトリウム、pH＝
5.8および2mgのノボザイム 234を含む溶液10ml中に再
度懸濁した。懸濁液を30℃で30分間インキュベートし、
細胞を遠心分離により細胞を集め、1.2Mソルビトール10
mlおよびCAS（1.2Mソルビトール、10mM CaCl2、10mMト
リスHCl（トリス＝トリス（ヒドロキシメチル）アミノ
メタン）pH＝7.5）10ml中で洗浄し、CAS2ml中で再懸濁
した。形質転換のためCAS再懸濁化細胞0.1mlをプラスミ
ドpKFN374ほぼ１μｇと混合し、室温で15分間放置し
た。（20％ポリエチレングリコール4000、10mM CaCl2,1
0mMトリスHCl、pH＝7.5）1mlを添加し、混合物をさらに
30分間室温で放置した。混合物を遠心分離し、ペレット
をSOS（1.2Mソルビトール、33％ v/v YPD、6.7mM CaC
l2、14μg/mlロイシン）0.1ml中に再度懸濁し、30℃で
２時間インキュベートした。次いで懸濁液を遠心分離
し、ペレットを1.2Mソルビトール0.5ml中に再度懸濁し
た。次いで、52℃でトップ寒天（シェアマンらのSC培地
（Methods in Yeast Genetics,コールド スプリング
ハーバー ラボラトリィ,1981）1.2Mソルビトール＋2.5
％寒天を含む）6mlを添加し、懸濁液を同種の寒天固化
ソルビトール含有培地を含むプレートのトップへ注入し
た。30℃で３日後に形質転換体コロニーを選び、再度単
離しそしてこれを用いて液体培養を開始した。このよう
な形質転換体KFN322の１つがさらに特定決定のため選択
された。
酵母菌株KFN322をYPD培地（１％酵母抽出物、２％ペ
プトン（ディフコ ラボラトリィズから）および２％グ
ルコース）上で増殖した。菌株の培養液10mlをO.D.600n
mが32になるまで30℃で振とうした。遠心分離後、上澄
をFPLCイオン交換クロマトグラフィにより分析した。酵
母上澄を0.22μｍミレックスMillex GVフィルターユニ
ットに通過させ、1mlを20mMバイシンBicine、pH＝8.7で
平衡化したモノエスMonoS陽イオン交換カラム（0.5×5c
m）に施こした。平衡緩衝液で洗浄後、カラムを直線状N
aCl勾配（０−1M）平衡緩衝液で溶出した。溶出された
フラクションにおける分光光度分析およびさらに次式 からの280nmにおける吸収量の積算によりトリプシン阻
害活性を定量化した。
収率はアプロチニン（３−58）約3mg/であった。
例７ 酵母菌株LaC1667からのインシュリン前駆体Ｂ（１−2
9）−AlaAlaLys−Ａ（１−21）の産生 589bp Sph I−Nco Iおよび172bp Hpa I−Xba Iフラグ
メントをpLaC212spx3（国際特許出願第WO 89/02463号に
記載）から単離した。これらのフラグメントは合成アダ
プター およびpMT743（国際特許出願第89/02463号に記載）か
らの10kb Xba I−Sph Iフラグメントと結合し、その結
果プラスミドpLaC240が得られた（第15図参照）。pLaC2
40からの修飾されたリーダー−インシュリン前駆体のDN
A配列を第16図に示す。
酵母菌株MT663のプラスミドpLaC240を用いた形質転換
によりインシュリン前駆体分泌菌株、LaC1667（MT663/p
LaC240）が生じ、その産生率は国際出願第89/02463号に
記載の未修飾リーダー−インシュリン前駆体についての
遺伝子を含む菌株LaC1414（MT663/pLaC212spx3）と比較
して165％である。
例８ 酵母菌株KFN−470からのインシュリン類似物質前駆体Ｂ
（１−29,1Glu＋27Glu）−AlaAlaLys−Ａ（１−21）の
産生 10個のオリゴヌクレオチドの連結によりインシュリン
類似物質前駆体Ｂ（１−29,1Glu＋27Glu）−AlaAlaLys
−Ａ（１−21）をコードする合成遺伝子を構築した。Ｂ
（１−29,1Glu＋27Glu）は、ヒトインシュリンのＢ鎖の
最初の29のアミノ酸残基であってその際Glu残基がB1Phe
およびB27Thr残基で置換された基を含むポリペプチドを
表わす。Ａ（１−21）はヒトインシュリンのＡ鎖でる。
トリペプチド、AlaAlaLysはB29Lys残基をA1Gly残基へ結
合する。
次の10個のオリゴヌクレオチドが合成された： ５つの二本鎖が上記10個のオリゴヌクレオチドから形
成され、二本鎖は例１に記載されたと同様の方法で連結
された。
合成178bp遺伝子は、サッカロミセス セレヴィシア
エ成熟ファクターα１シグナル−リーダー（１−85）配
列（マルクッセン，ジェイ．ら、Protein Engineering
1（1987）,215−223）をコードするpKFN−９からの330b
p EcoR I−Hga IフラグメントとプラスミドpUC19（ヤー
ニッシュペロン，シィ.,ヴィェイラ，ジェイ.Vieira,J.
およびメシッヒ，ジェイ.Messing,J.,Gene 33（1985）,
103−119）の2.7kb EcoR I−Xba Iフラグメントとに連
結した。
連結混合物を用いてアンピシリン耐性を選択するコン
ピテント大腸菌部γ-,m+）を形質転換した。32P−Xba I
−EcoR Iフラグメントの配列決定（マキサム．エーおよ
びギルバート，ダブリュ.,Methods Enzymol.65（198
0）,499−560）により、得られたコロニーからのプラス
ミドがインシュリン類似物質前駆体についての正しいDN
A配列を含むことがわかった。
１つのプラスミドpKFN−456が別の用途のために選択
された。
例１の手順にしたがって酵母発現プラスミドpKFN−45
8が次の発現カセットを含んで得られた： TPIP−MFα１−シグナル−リーダー（１−85）−Ｂ（１
−29,1Glu＋27Glu）−AlaAlaLys−Ａ（１−21）−TPIT pKFN−456およびpKFN−458からの508bp EcoR I−Xba
IフラグメントのDNA配列を第17図に示す。
プラスミドpKFN−458を上述のように酵母株MT−663へ
形質転換しその結果酵母菌株KFN−470が得られた。
YPD培地中での形質転換された菌株KFN−470の培養を
上述のように実施した。上澄におけるインシュリン類似
物質前駆体の収率は上述のようにHPLCにより測定した
（エル．スネルL.Snelら、Chromatographia 24（198
7）,329−332）。
第２表において、インシュリン類似物質前駆体Ｂ（１
−29,1Glu＋27Glu）−AlaAlaLys−Ａ（１−21）とＢ
（１−29,27Glu）−AlaAlaLys−Ａ（１−21）およびイ
ンシュリン前駆体Ｂ（１−29）−AlaAlaLys−Ａ（１−2
1）の発現レベルを比較する。発現カセットを有するプ
ラスミドを含むサッカロミセス ポンベTPI遺伝子で形
質転換された同じ宿主菌株MT−663においてすべての３
つの前駆体が発現された。
TPIP−MFα１−シグナル−リーダー（１−85）前駆体−
TPIT 第２表 酵母形質転換体におけるインシュリンおよびインシュリ
ン類似物質の前駆体の発現レベル 前 駆 体 発現レベル＊ B(1-29)-AlaAlaLys-A(1-21) 100％ B(1-29),27GLu)-AlaAlaLys-A(1-21) 148％ B(1-29,1Glu+27Glu)-AlaAlaLys-A(1-21) 479％ ＊ 発現レベルはインシュリン前駆体Ｂ（１−29）−Al
aAlaLys−Ａ（１−21）の発現レベルのパーセントとし
て示され、これは任意に100％とされる。
フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｐ 21/02 9162−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ //(Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｒ 1:865） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:865）

Claims (44)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】ポリペプチドがリーダーペプチドのＣ末端
    と異種タンパク質のＮ末端の間に位置する酵母プロセッ
    シング部位に隣接するそのアミノ酸配列において修飾さ
    れ、これによりタンパク質分解切断を受入れやすくした
    プロセッシング部位が提供され、該ポリペプチドが次の
    構造式： シグナルペプチド−リーダーペプチド−X1−X2−X3−X4
    −異種タンパク質 （式中、X1はペプチド結合であるかまたは同一もしくは
    異なっていてもよい１つ以上のアミノ酸を表わし、 X2およびX3は同一または異なってもよく、LysおよびArg
    からなる群から選択される塩基性アミノ酸を表わし、X2
    およびX3は一緒になって酵母プロセッシング部位を限定
    し、そして X4はペプチド結合であるかまたは同一もしくは異なって
    もよい１つ以上のアミノ酸を表わし、 ただしX1および／またはX4は１つ以上のアミノ酸を表わ
    しX1および／またはX4で表わされるアミノ酸の少なくと
    も１つはGluおよびAspからなる群から選択される負に帯
    電したアミノ酸であり、そしてさらにただしX1がペプチ
    ド結合である場合X4はGlu−Ala−Glu−AlaまたはGlu−A
    la−Glu−Ala−Ser−Leu−AspでなくX4がペプチド結合
    である場合X1はSer−Leu−Aspでない） を有することからなるシグナルペプチド、リーダーペプ
    チドおよび異種タンパク質またはポリペプチドの融合物
    からなるポリペプチド。
  2. 【請求項２】X1がGluまたはAspを表わす請求の範囲第１
    項に記載のポリペプチド。
  3. 【請求項３】X1が構造式BAで表わされる２つのアミノ酸
    の配列を表わし、その際ＡがGluまたはAspであり、Ｂが
    Glu,Asp,Val,GlyまたはLeuである請求の範囲第１項に記
    載のポリペプチド。
  4. 【請求項４】X1が構造式CBAで表わされる３つのアミノ
    酸の配列を表わし、その際ＡおよびＢは前記定義のもの
    であり、ＣはGlu,Asp,Pro,Gly,Val,Leu,ArgまたはLysで
    ある請求の範囲第１項に記載のポリペプチド。
  5. 【請求項５】X1が構造式DCBAで表わされる４つのアミノ
    酸の配列を表わし、その際A,BおよびＣは前記定義のも
    のであり、ＤはＣと同じ意味を有する請求の範囲第１項
    に記載のポリペプチド。
  6. 【請求項６】X1が構造式EDCBAで表わされる５つのアミ
    ノ酸の配列を表わし、その際A,B,CおよびＤは前記定義
    のものであり、ＥはＣと同じ意味を有する請求の範囲第
    １項に記載のポリペプチド。
  7. 【請求項７】X1が構造式FEDCBAで表わされる６つのアミ
    ノ酸の配列を表わし、その際A,B,C,DおよびＥは前記定
    義のものであり、ＦはＣと同じ意味を有する請求の範囲
    第１項に記載のポリペプチド。
  8. 【請求項８】X4がGluまたはAspである請求の範囲第１項
    に記載のポリペプチド。
  9. 【請求項９】X4が構造式ABで表わされる２つのアミノ酸
    の配列を表わし、その際ＡはGluまたはAspでありＢはGl
    u,Asp,Val,GlyまたはLeuである請求の範囲第１項に記載
    のポリペプチド。
  10. 【請求項１０】X4が構造式ABCで表わされる３つのアミ
    ノ酸の配列を表わし、その際ＡおよびＢは前記定義のも
    のであり、ＣはGlu,Asp,Pro,Gly,Val,Leu,ArgまたはLys
    である請求の範囲第１項に記載のポリペプチド。
  11. 【請求項１１】X4が構造式ABCDで表わされる４つのアミ
    ノ酸の配列を表わし、その際A,BおよびＣは前記定義の
    ものであり、ＤはＣと同じ意味を有する請求の範囲第１
    項に記載のポリペプチド。
  12. 【請求項１２】X4が構造式ABCDEで表わされる５つのア
    ミノ酸の配列を表わし、その際A,B,CおよびＤは前記定
    義のものであり、ＥはＣと同じ意味を有する請求の範囲
    第１項に記載のポリペプチド。
  13. 【請求項１３】X4が構造式ABCDEFで表わされる６つのア
    ミノ酸の配列を表わし、その際A,B,C,DおよびＥは前記
    定義のものであり、ＦはＣと同じ意味を有する請求の範
    囲第１項に記載のポリペプチド。
  14. 【請求項１４】X1および／またはX4が２個以上のアミノ
    酸を表わし、X2に直接隣接するアミノ酸がGluまたはAsp
    であり、X3に直接隣接するアミノ酸がGluまたはAspであ
    り、または両方ともがGluもしくはAspである請求の範囲
    第１項に記載のポリペプチド。
  15. 【請求項１５】X1および／またはX4が２個以上のアミノ
    酸を表わし、X1もしくはX4のいずれかまたは両方ともが
    ２個以上のGluまたはAspからなる請求の範囲第１項に記
    載のポリペプチド。
  16. 【請求項１６】X1およびX4の両方ともが１個以上のアミ
    ノ酸を表わす請求の範囲第１項に記載のポリペプチド。
  17. 【請求項１７】X1およびX4が対称的同一である請求の範
    囲第16項に記載のポリペプチド。
  18. 【請求項１８】X4が１個以上のアミノ酸を表わし、さら
    に別のプロセッシング部位がX4と異種タンパク質のＮ−
    末端の間にもたらされる請求の範囲第１項に記載のポリ
    ペプチド。
  19. 【請求項１９】シグナルペプチドがα−ファクターシグ
    ナルペプチド、マウス唾液アミラーゼのシグナルペプチ
    ド、カルボキシペプチターゼ シグナルペプチドまたは
    酵母BAR1シグナルペプチドである請求の範囲第１項に記
    載のポリペプチド。
  20. 【請求項２０】リーダーペプチドが天然リーダーペプチ
    ドたとえばα−ファクターリーダーペプチドである請求
    の範囲第１項に記載のポリペプチド。
  21. 【請求項２１】リーダーペプチドがたとえば A.Ala−Pro−Val−Thr−Gly−Asp−Glu−Ser−Ser−Val
    −Glu−Ile−Pro−Glu−Glu−Ser−Leu−Ile−Gly−Phe
    −Leu−Asp−Leu−Ala−Gly−Glu−Glu−Ile−Ala−Glu
    −Asn−Thr−Thr−Leu−Ala B.Ala−Pro−Val−Thr−Gly−Asp−Glu−Ser−Ser−Val
    −Glu−Ile−Pro−Glu−Glu−Ser−Leu−Ile−Ile−Ala
    −Glu−Asn−Thr−Thr−Leu−Ala C.Ala−Pro−Val−Thr−Gly−Asp−Glu−Ser−Ser−Val
    −Glu−Ile−Pro−Ile−Ala−Glu−Asn−Thr−Thr−Leu
    −Ala D.Ala−Pro−Val−Thr−Gly−Asp−Glu−Ser−Ser−Val
    −Glu−Ile−Pro−Glu−Glu−Ser−Leu−Ile−Ile−Ala
    −Glu−Asn−Thr−Thr−Leu−Ala−Asn−Val−Ala−Met
    −Alaおよび E.Gln−Pro−Val−Thr−Gly−Asp−Glu−Ser−Ser−Val
    −Glu−Ile−Pro−Glu−Glu−Ser−Leu−Ile−Ile−Ala
    −Glu−Asn−Thr−Thr−Leu−Ala−Asn−Val−Ala−Met
    −Ala のような合成リーダーペプチドである請求の範囲第１項
    に記載のポリペプチド。
  22. 【請求項２２】異種タンパク質またはポリペプチドが、
    アプロチニンまたは他のプロテアーゼ阻害剤、インシュ
    リンおよびインシュリン前駆体、ヒトまたはウシ成長ホ
    ルモン、インターロイキン、組織プラスミノーゲンアク
    チベーター、グルカゴン、VII因子、VIII因子、XIII因
    子、血小板由来増殖因子、酵素およびこれらタンパク質
    のいずれかの機能的類似物質からなる群から選択される
    請求の範囲第１項に記載のポリペプチド。
  23. 【請求項２３】異種タンパク質またはポリペプチドがア
    プロチニンまたはその機能的類似物質である請求の範囲
    第22項に記載のポリペプチド。
  24. 【請求項２４】X1がGlu−Arg−Leu−GluまたはLys−Glu
    −Leu−Gluである請求の範囲第23項に記載のポリペプチ
    ド。
  25. 【請求項２５】X4がGlu−LeuまたはGlu−Leu−Asp−Leu
    である請求の範囲第23項に記載のポリペプチド。
  26. 【請求項２６】異種タンパク質またはポリペプチドがイ
    ンシュリンもしくはインシュリン前駆体またはその機能
    的類似物質である請求の範囲第22項に記載のポリペプチ
    ド。
  27. 【請求項２７】X1がGlu−Arg−Leu−GluまたはLys−Glu
    −Leu−Gluである請求の範囲第26項に記載のポリペプチ
    ド。
  28. 【請求項２８】X4がGluである請求の範囲第26項に記載
    のポリペプチド。
  29. 【請求項２９】異種タンパク質またはポリペプチドがイ
    ンシュリン類似物質前駆体Ｂ（１−29）−AlaAlaLys−
    Ａ（１−29）でありX1がLys−Glu−Leu−Gluである請求
    の範囲第26項〜第28項のいずれか１に記載のポリペプチ
    ド。
  30. 【請求項３０】異種タンパク質またはポリペプチドがイ
    ンシュリン類似物質前駆体Ｂ（１−29）−SerAspAspAla
    Lys−Ａ（１−29）であり、X1がLys−Glu−Leu−Gluで
    ある請求の範囲第26項〜第28項のいずれか１に記載のポ
    リペプチド。
  31. 【請求項３１】請求の範囲第１項〜第30項のいずれか１
    に記載のポリペプチドをコードするDNA配列からなるDNA
    構築物。
  32. 【請求項３２】図4,7,9または11に示すDNA配列またはそ
    の適当な修飾物からなる請求の範囲第31項に記載のDNA
    構築物。
  33. 【請求項３３】酵母において複製することができ請求の
    範囲第31項または同第32項に記載のDNA構築物を保持す
    る組換体発現ベクター。
  34. 【請求項３４】異種タンパク質またはポリペプチドを発
    現することができ請求の範囲第33項に記載のベクターで
    形質転換される酵母菌株。
  35. 【請求項３５】適当な培地中で請求の範囲第34項記載の
    酵母菌株を培養して異種タンパク質またはポリペプチド
    の発現および分泌／プロセッシングを得、その後タンパ
    ク質またはポリペプチドを培地から単離することからな
    る酵母における異種タンパク質またはポリペプチドの製
    造方法。
  36. 【請求項３６】一般式X4−アプロチニン（１−58）で表
    わされ、その際X4が少なくとも１つがGluおよびAspから
    なる群から選択される負に帯電されたアミノ酸である１
    個以上のアミノ酸によるＮ末端延長部を表わすアプロチ
    ニン類似物質。
  37. 【請求項３７】X4がGluまたはAspである請求の範囲第36
    項に記載の類似物質。
  38. 【請求項３８】X4が構造式ABで表わされる２つのアミノ
    酸の配列を表わし、その際ＡはGluまたはAspであり、Ｂ
    はGlu,Asp,Val,GlyまたはLeuである請求の範囲第36項記
    載の類似物質。
  39. 【請求項３９】X4が構造式ABCで表わされる３つのアミ
    ノ酸の配列を表わし、その際ＡおよびＢは前記定義のも
    のであり、ＣはGlu,Asp,Pro,Gly,Val,Leu,ArgまたはLys
    である請求の範囲第36項に記載の類似物質。
  40. 【請求項４０】X4が構造式ABCDで表わされる４つのアミ
    ノ酸の配列を表わし、その際A,BおよびＣは前記定義の
    ものであり、ＤはＣと同じ意味を有する請求の範囲第36
    項に記載の類似物質。
  41. 【請求項４１】X4が構造式ABCDEで表わされる５つのア
    ミノ酸の配列を表わし、その際A,B,CおよびＤは前記定
    義のものであり、ＥはＣと同じ意味を有する請求の範囲
    第36項に記載の類似物質。
  42. 【請求項４２】X4が構造式ABCDEFで表わされる６つのア
    ミノ酸の配列を表わし、その際A,B,C,DおよびＥは前記
    定義のものであり、ＦはＣと同じ意味を有する請求の範
    囲第36項に記載の類似物質。
  43. 【請求項４３】X4が２個以上のアミノ酸を表わし、X4が
    GluまたはAsp2個以上からなる請求の範囲第36項に記載
    のポリペプチド。
  44. 【請求項４４】X4がGlu−LeuまたはGlu−Leu−Asp−Leu
    である請求の範囲第36項に記載の類似物質。
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