PL163532B1 - Sposób wytwarzania heterologicznych bialek lub polipeptydów PL PL PL PL PL PL PL - Google Patents

Sposób wytwarzania heterologicznych bialek lub polipeptydów PL PL PL PL PL PL PL

Info

Publication number
PL163532B1
PL163532B1 PL90284146A PL28414690A PL163532B1 PL 163532 B1 PL163532 B1 PL 163532B1 PL 90284146 A PL90284146 A PL 90284146A PL 28414690 A PL28414690 A PL 28414690A PL 163532 B1 PL163532 B1 PL 163532B1
Authority
PL
Poland
Prior art keywords
glu
leu
amino acids
polypeptide
sequence
Prior art date
Application number
PL90284146A
Other languages
English (en)
Inventor
Soren Bjorn
Kjeld Norris
Fanny Norris
Original Assignee
Novo Nordisk As
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=26065137&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=PL163532(B1) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Priority claimed from DK494189A external-priority patent/DK494189D0/da
Application filed by Novo Nordisk As filed Critical Novo Nordisk As
Publication of PL163532B1 publication Critical patent/PL163532B1/pl

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
    • C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
    • C12N15/625—DNA sequences coding for fusion proteins containing a sequence coding for a signal sequence
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/575—Hormones
    • C07K14/62—Insulins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/81—Protease inhibitors
    • C07K14/8107—Endopeptidase (E.C. 3.4.21-99) inhibitors
    • C07K14/811—Serine protease (E.C. 3.4.21) inhibitors
    • C07K14/8114—Kunitz type inhibitors
    • C07K14/8117—Bovine/basic pancreatic trypsin inhibitor (BPTI, aprotinin)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/14—Fungi; Culture media therefor
    • C12N1/16—Yeasts; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/033—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a motif for targeting to the internal surface of the plasma membrane, e.g. containing a myristoylation motif
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/036—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif targeting to the medium outside of the cell, e.g. type III secretion
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/04—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing an ER retention signal such as a C-terminal HDEL motif
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/61—Fusion polypeptide containing an enzyme fusion for detection (lacZ, luciferase)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
    • C07K2319/74—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor
    • C07K2319/75—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor containing a fusion for activation of a cell surface receptor, e.g. thrombopoeitin, NPY and other peptide hormones

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Chemical Or Physical Treatment Of Fibers (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Processing Of Solid Wastes (AREA)
  • Silver Salt Photography Or Processing Solution Therefor (AREA)
  • Steroid Compounds (AREA)
  • Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
  • Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

1. Sposób wytwarzania heterologicznych bialek lub polipeptydów, zn a m ien n y tym , ze (a) wbudowuje sie w odpowiednim wektorze ekspresyjnym, zdolnym do replikacji w droz- dzach, sekwencje DNA kodujaca polipeptyd o nastepujacej strukturze: peptyd sygnalowy - peptyd liderowy -X'-X2-X3 -X4 - bialko heterologiczne, gdzie X 1 oznacza wiazanie peptydo- we, wzglednie jeden lub wieksza liczbe aminokwasów, które moga byc jednakowe lub rózne, X i X sa jednakowe lub rózne i oznaczaja aminokwasy zasadowe wybrane z grupy obejmujacej Lys i Agr, X2 i X3 razem okreslaja drozdzowe miejsce procesowania, a X4 oznacza wiazanie peptydowe, wzglednie jeden lub wieksza liczbe aminokwasów, które moga byc jednakowe lub rózne, przy czym X1 i/lub X4 oznacza jeden lub wieksza liczbe amino- kwasów, a co najmniej jeden z aminokwasów stanowiacych X 1 i/lub X4 jest aminokwasem o ladunku ujemnym, wybranym z grupy obejmujacej Glu i Asp; (b) transformuje sie wektorem szczep drozdzy, który jest zdolny do ekspresji heterologicznego bialka lub polipeptydu; (c) hoduje sie stransformowany szczep drozdzy w odpowiednim podlozu do uzyskania ekspresji polipeptydu i jego procesowania, a w rezultacie sekrecji heterologicznego bialka lub polipep- tydu; i (d) izoluje sie heterologiczne bialko lub polipeptyd z podloza. R Z E C Z P O S P O L I T A P O L S K A Urzad Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej PL PL PL PL PL PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania ^teologicznych białek lub polipeptydów drogą biologiczną z użyciem drożdży.
Organizmy drożdży wytwarzają liczne białka syntetyzowane wewnątrzkomórkowe, lecz spełniające swoje funkcje na zewnątrz komórki. Takie zewnąttrkomórkodt białka opisywane są jako białka sekcyjne, Te białka sekrec^ne eksprymodane są początkowo wewnątrz komórki w formie prekursora albo pre-blałka, zawierającego pre-sekwencję zapewniającą właściwy kierunek eksprymowanego produktu w błonie retikulum endoplarmαttcrnego /ER/. Pre-sekwencja, zazwyczaj nazywana peptydem sygnałowym, na ogół jest ods^^puna od pożądanego produktu podczas przemieszczania. Po wkroczeniu na drogę sekrecyjnę białko transportowane jest do aparatu Golgiego. Od aparatu Golgiego białko może występować na różne drogi, prowadzące albo do takich kompartmentów komórki jak wakuola lub błona komórkowa albo z komórki do środowiska zewnętrznego fs.R.Pfeffer i J.E.Rothman, Ann. Rav. Biochem. 56 /1987/,829-852/.
Sugerowano kilka sposobów podejścia do ekspresji i sekrecj przez drożdże białek do nich hetttklogicrnych, W opublikowanym europejskim zgłoszeniu patentowym nr 0088632A opisano sposób, dzięki któremu białka httttkloglcrnt do drożdży są tksprymowαnt, procesowane i ulegają sekrecj przez drożdże stransformowane nośnikowym ONA kodującym żądane białko i peptyd sygnałowy, przygotowywanie hodowli sttansformowαntch organizmów, wzrost tych hodowli i odzyskiwanie białka z podłoża hodowlanego. Peptyd sygnałowy może być własnym peptydem sygnałowym żądanego białka, htttrologicrnym peptydem sygnałowym lub hybrydę peptydów sygnałowych natywnego i heterklogicznegoz
Przy stosowaniu peptydów sygnałowych heettologiczny do drożdży możne spotkać się z problemem, że homologiczny peptyd sygnałowy nie zapewnia skutecznego przemieszczania i/lub odsrcrtpiania po peptydzie sygnałowym.
163 532
MF Κ 1 /czynnik 1 / s. cerevleiae syntetyzowany jest w formie prepro o długości 165 ani nokwasów obejaującej peptyd sygnałowy czyli prepeptyd o długości 19 aminokwasów, po którym następuje lider czyli propeptyd o długości 64 aminokwasów zawierający trzy miejsca N-glikozylacji, po którym następuje [~LyeArg/Aap/Glu, Ala/j-g czynnika 0^_74 «Kurjan i I.Herskowitz, Cell 30 /1982/, 933-943Część sygnałowo-liderowa preproMF 1 1 była szeroko stosowana do uzyskiwania syntezy i sekrecji białek heterologicznych w S. cerevisiae.
Użycie peptydów sygnałowych Udarowych homologicznych do drożdży znane jest z opisu patentowego St. Zjedn. Ameryki nr 4 546 082, opublikowanych europejskich zgłoszeń patentowych nr 0 116 201A, 0 123 294A, 0 123544A, 0 163 529A i 0 123 289A oraz z duńskich opisów patentowych nr 2484/84 i 3614/83.
W europejskim opisie patentowym nr 0 123 289A opisano wykorzystanie do sekrecji obcych białek prekursora czynnika 1 s. caravisiae, w duńskim opisie patentowym nr 2484/84 wykorzystanie peptydu sygnałowego inwertazy Saccharomyces cereyistae, a w duńskim opisie patentowym nr 3614/83 wykorzystanie peptydu sygnałowego PH05Saccharomycea cerevisiae.
W opisie patentowym St.Zjedn. Ameryki nr 4 516 082 oraz europejskich opisach patentowych nr 0 016 201A, 0 123 294A, 0 123 544A i 0 163 529A przedstawiono sposoby, dzięki którym sekwencja sygnałowo-liderowa czynnika Saccharomyces caravisiae /MF ck 1 lub MF 1 2/ wykorzystywana jest w procesie sekrecji białek heterologicznych eksprymowanych w drożdżach. Wykazano sekrecję i procesowanie żądanego białka dzięki połączeniu sekwencji DNA kodującej sekwencję sygnałowo-liderową MF<1 1 S. caravisiae z końcem 5' genu żądanego białka.
Europejski opis patentowy nr 206 783 ujawnia układ do sekrecji polipeptydów z S. cerevisiae, dzięki któremu sekwencja liderowa czynnika 1 została skrócona w celu eliminacji czterech peptydów tego czynnika obecnych za natywnę sekwencję liderową, co umożliwia połączenie samego peptydu liderowego z heterologicznym pollpeptydem poprzez miejsce procesowania czynnika <1 LyeArgGluAlaGluAla. Konstrukcja taka wskazana jest do prowadzenia wydajnej sekrecji peptydów mniejszych niż 50 aminokwasów. Dla sekrecji i procesowania większych polipeptydów skrócono sekwencję liderową netywnego czynnika <1 pozostawiając jeden lub dwa peptydy czynnika 1 pomiędzy peptydem liderowym a polipeptydem.
Liczne, ulegające sekrecji białka są kierowane na taką drogę aby byc wystawione na działanie układu procesowania proteolitycznego, mogącego rozcinać wiązanie peptydowe przy końcu karboksylowym dwóch kolejnych zasadowych aminokwasów. Ta aktywność enzymatyczna jest u S. ι^μυιβ^ kodowana przez gen KEX 2 [ _D.A. Julius i inni, Cell 37 /1984b/,
1075]. Procesowanie produktu przez produkt genu KEX 2 potrzebne do sekrecji aktywnego czynnika rozrodczego 1 1 /MF 1 1 lub czynnik 1 / S. carevisiae, lecz nie jest zaangażowane w sekrecji aktywnego czynnika rozrodczego a S. cerevlsiaa.
Sekrecję i poprawne procesowanie polipeptydu mającego ulegać sekrecji uzyskuje się w pewnych przypadkach, gdy hoduje się drożdże stransformowane wektorem skonstruowanym jak wskazano w literaturze podanej powyżej. Jednak w wielu przypadkach, poziom sekrecji jest bardzo niski lub w ogóle brak jest sekrecji, bądź też proteolityczne procesowanie może być niewłaściwe lub niekompletne. Przypuszcza się, ze można to, w pewnym stopniu, przypisać niewystarczającej ekspozycji miejsca procesowania obecnego pomiędzy C-końcem peptydu liderowego a N-końcem heterologicznego białka, co czyni je niedostępnym, lub przynajmniej, mniej dostępnym dla rozcięcia proteolitycznego.
Obecnie nieoczekiwanie stwierdzono, że dzięki pewnym modyfikacjom wprowadzonym w pobliżu miejsca procesowania przy C-końcu peptydu liderowego i/lub N-końcu hatarologlcznago polipeptydu połączonego z peptydem liderowym, możliwe jest uzyskanie wyższej wydajności białka poddanego procesowaniu w poprawny sposób, niz w przypadku zastosowania niezmodyfikowanej konstrukcji peptyd liderowy-polipeptyd heterologiczny.
Użyteczne są polipeptydy stanowiące połączenie peptydu sygnałowego, peptydu liderowego i białka lub polipeptydu hetarologicznago, które posiadają zmodyfikowaną sekwencję aminokwasową przyległą do drożdżowego miejsca procesowania umiejscowionego pomiędzy C-końcem peptydu liderowego a N-końcem haterologlcznago białka, co zapewnia prezentację miejsca
163 532 procesowani·, czyniąc je dostępnym dla rozcięcia proteolitycznego· Te polipeptydy posiadające następującą strukturę peptyd sygnałowy-peptyd liderowy-X1-X2-X3-X4 - białko heterologiczne gdzie X* oznacza wiązanie peptydowe względnie jeden lub większą liczbę aminokwasów, które mogą być jednakowe lub różne, X2 i X3 są jednakowe lub różne i oznaczają aminokwasy zasadowe wybrane z grupy obejmującej Lys i Arg, i χ3 razem określają drożdżowe miejsca procesowania, a χ4 oznacza wiązanie peptydowe względnie jeden lub większą liczbę aminokwasów, które mogą być jednakowe lub różne, przy czyn X* i/lub χ4 oznacza jeden lub większą liczbę aminokwasów, a co najmniej jeden z aminokwasów stanowiących X* i/lub x4 jest aminokwasea o ładunku ujemnym, wybranym z grupy obejmującej Glu i Asp·
W niniejszym opisie termin peptyd sygnałowy oznacza presekwencję, która ma charakter w przeważającym stopniu hydrofobowy i występuje Jako N-końcowa sekwencja formy prekursorowej białka zewnętrzkomórkowego akaprymowanego w drożdżach· Funkcją peptydu sygnałowego jest umożliwienie białku heterologicznemu, które ma ulec sekrecji, wejścia do retikulum endoplazmatycznego· Peptyd sygnałowy ulega normalnie odszczepieniu w trakcie tego procesu· Peptyd sygnałowy może być heterologiczny lub homologiczny do drożdży wytwarzających białko lecz, jak wyjaśniono powyżej, bardziej wydajne rozszczepienie można uzyskać jeśli jest on homologiczny do drożdży·
Termin peptyd liderowy oznacza peptyd w przeważającym stopniu hydrofilowy, którego funkcją jest umożliwienie mającemu ulec sekrecji heterologicznemu białku skierowanie z retikulum endoplazmatycznego do aparatu Golgiego, a następnie do pęcherzyków sekrecyjnych w celu sekrecji do środowiska /tj· transport eksprymowanego białka lub polipeptydu przez ścianę komórkową lub przynajmniej przez błonę komórkową do przestrzeni periplazmatycznej komórki/·
Termin heterologlczne białko lub polipeptyd oznacza białko lub polipeptyd, który nie jest wytwarzany przez drozdżowy organizm gospodarza w naturze· Terminy białko i polipeptyd zasadniczo są używane w tym opisie wymiennie·
Modyfikacja polipeptydu w miejscu procesowania /miejscu, w którym peptyd liderowy jest usuwany z białka heterologicznego przez proteolityczne rozcięcie umożliwiane przez enzymy proteolityczne drożdży/, która reprezentowana jest przez X* i/lub χ4, może polegać na wydłużeniu, substytucji lub delecji jednego lub większej liczby aminokwasów w C-końcu peptydu liderowego i/lub N-końcu białka heterologicznego·
Zgodnie z wynalazkiem stwierdzono, że bardziej wydajne i poprawne procesowanie białka heterologicznego uzyskać można jeśli co najmniej jeden z aminokwasów, o które wydłużono sekwencję polipeptydu lub którymi zastąpiono natywny aminokwas w sekwencji, jest aminokwasem o ładunku ujemnym, takim jak aminokwasy wskazane powyżej· Podobny efekt obserwuje się, jeśli aminokwas o ładunku ujemnym jest dostarczony w pobliże miejsca procesowania poprzez delecję, to jest usunięcie jednego lub większej liczby aminokwasów z C-końca lidera lub z N-końca sekwencji białka, dopóki aminokwas o ładunku ujemnym nie znajdzie się w pobliżu miejsca procesowania·
Bez zamiaru ograniczania się do żadnej określonej teorii, przyjmuje się, ze efekt ten przypisany być może wzrostowi hydrofilowości wywołanemu przez aminokwasy o ładunku ujemnym, przylegające do miejsca procesowania, co powoduje wzmocnienie odsłonięcia struktury trzeciorzędowej polipeptydu w miejscu procesowania w wodnym środowisku wewnętrz komórkowym, a więc większą dostępność dla proteolitycznego rozcięcie przez enzym procesujęcy· Korzystny wpływ aminokwasów o ładunku ujemnym, w przeciwieństwie do aminokwasów o ładunku dodatnim lub obojętnym, przypisać można obdarzonym ładunkami ujemnymi łańcuchom bocznym tych aminokwasów, które przyczyniają się do hydrofilowości struktury trzeciorzędowej w miejscu procesowania, nie zwiększając potencjalnego hamowania enzymu procesującego·
Jest także możliwe, że aminokwasy o ładunku ujemnym przyczyniają się do tworzenia lub utrzymywania struktury trzeciorzędowej w miejscu procesowania /np· struktury zwrotne, spięcia Ή 1 pętle/ innymi sposobami, takimi jak oddziaływania z innymi resztami aminokwa163 532 sów polipeptydu. Ponadto, mogłyby zaistnieć bezpośrednia oddziaływanie pomiędzy aminokwasami o ładunku ujemnym a enzymem procesującym. A zatem sądzi się, że aminokwasy o ładunku ujemnym umiejscowione w pobliżu dwóch zasadowych aminokwasów miejsca procesowania mogą kierować enzym procesujący do przeprowadzania poprawnego i wydajnego rozcięcia poprzez oddziaływania elektrostatyczne pomiędzy białkami i/lub pomiędzy białkiem a rozpuszczalnikiem.
W sposobie według wynalazku użyteczna jest konstrukcja DNA obejmująca sekwencje DNA kodujące polipeptydy określone powyżej.
Użyteczne są także ^kombinowane wektory ekspresyjne, zdolne do replikacji w drożdżach i przenoszące powyżej określony polipeptyd. Jak również szczep drożdży zdolny do ekspresji białka lub polipeptydu hetarologlcznego, które transformuje się tym wektorem.
Sposób wytwarzania heterologlcznych białek lub polipeptydów w drożdżach, polega na prowadzeniu hodowli stransformowanego szczepu drożdży w odpowiednim podłożu dla uzyskania ekspresji i sekrecji białka lub polipeptydu l^te^logicznego, a następnie wyizolowaniu białka lub polipeptydu z podłoża.
Dokładniej, sposób według wynalazku polega na tym, że /a/ wbudowuje się w odpowiednim wektorze ekspresyjnym, zdolnym do replikacji w drożdżach, sekwencję ONA kodującą polipeptyd o następującej strukturze
3 4 peptyd sygnałowy-peptyd liderowy-X -X -X -X -białko haterologiczna, gdzie χ1 oznacza wiązanie peptydowe względnie jeden lub większą liczbę aminokwasów, które 2 3 mogą być jednakowe lub różne, X i X są jednakowe lub różne i oznaczają aminokwasy zasadowe wybrane z grupy obejmującej Lys i Arg, X‘ i XJ razem określają drożdżowe miejsce procesowania, a X4 oznacza wiązanie peptydowe, względnie jeden lub większą liczbę aminokwasów, które mogę być jednakowe lub różne, przy czym χ1 i/lub X4 oznacza jeden lub więk1 4 szą liczbą aminokwasów, a co najmniej jeden z aminokwasów stanowiących X i/lub X jest aminokwasem o ładunku ujemnym, wybranym z grupy obejmującej Glu i Asp, /b/ transformuje się wektorem szczep drożdży, który jest zdolny do ekspresji hetarologlcznago białka lub polipeptydu] /c/ hoduje się stransformowany szczep drożdży w odpowiednim podłożu do uzyskania ekspresji polipeptydu i jego procesowania, a w rezultacie sekrecji heterologicznego białka lub polipeptydu, i /d/ izoluje się heteroUogiczna białko lub polipeptydy z podłoża.
Zgodnie z wyjaśnieniem podanym powyżej, jeśli χ1 oznacza pojedyńczy aminokwas, to jest nim Glu lub Asp.
χ1 i/lub X4 korzystnie oznaczają 1-6 aminokwasów. Jeśli X1 oznacza sekwencję dwóch aminokwasów, to może mieć strukturę BA, gdzie A jest Glu lub Asp, a B jest Glu, Asp, Val, Gly lub Leu np. LeuGlu.
Jeśli x1 oznacza sekwencję trzech aminokwasów, to może mieć strukturę CBA, gdzie A i B ss Jak określono ppwyżej, a C Jest Glu, Pro, Gly, Val, Leu, Arg lub Lys, nf>. AspLeuGlu.
Jeśli χ1 oznacza sekwencję więcej niż dwóch aminokwasów. Jeden z dodatkowych aminokwasów może być, korzystnie, Pro lub Gly, ponieważ wiadomo, że aminokwasy te wprowadzają i/lub tworzą część struktur zwrotnych, spięć β i pętli, które prawdopodobnie ułatwiają dostępność miejsca procesowania dla enzymu proteolitycznego.
Jeśli χ1 oznacza sekwencję czterech aminokwasów, to może mieć strukturę DCBA, gdzie
A, B, i C są jak określono powyżej, a D ma to samo znaczenie jak C, np. GluArgLeuGlu, LysGluLeuGlu lub eauAspLeuGUu.
Jeśli χ1 oznacza sekwencję pięciu aminokwasów, to może mieć strukturę EDCBA, gdzie A,
B, C i D są jak o k r e s 1 o no powyżjj, a E me to samo znaczenie Jek C, np, LeuGluArgLeuGlu.
Jeśli χ1 oznacza sekwencję sześciu aminokwasów, to może mieć strukturę FEDCBA, gdzie A, B, C, D i E są jak określono powyżej, a F ma to samo znaczenie jak C, np. VkULauGluArgLeuGlu.
Jest zrozumiałe, że χ1 może oznaczać inne kombinacje eminokwasów, bez odstępowania od zakresu wynalazku, przy czym co najmniej jeden z aminokwasów w sekwencji jest aminokwasem o ładunku ujemnym, jak to wyjaśniono powyżej.
Korzystne znaczenia χ4 mogą być takie jak przedstawiono powyżej dla Xł, jakkolwiek kolejność aminokwasów będzie typowo odwrócona /to jest raczej ABC niż CBA, itp./.
163 532
W przypadku polipeptydów, w których heterologlczrna białka się od jednego lub większej liczby aminokwasów o ładunku dodatnia lub hydrofobowych, korzystna j^^t jeśli X ozAłcze raczej jeden lub większą liczbę aminokwasów niż wiązanie peptydowe, ponieważ sądzi się, że zapewnia to większą dostępność miejsca procesowania dla enzymów proteolitycznych
W przypadku gdy χ4 oznacza N-końcowe wydłużanie o 1-6 aminokwasów, może być korzystne dostarczanie dodatkowego miejsca procesowania pomiędzy aminokwasem lub aminokwasami stanowiącymi χ4, a N-końcem białka heterologicrntgoz Jest to szczególnie ważne, jeśli białko ma zostać wykorzystane do celów wymagających białka z N-końcowym wydłużaniem. Dodatkowe aminokwasy N-końcowe można usunąć in vitro poprzez rozcięcia proteolityczne za pomocą odpowiedniego enzymu proteolitycznego, takiego jak proteaza typu trypsyny, lub za pomocą traktowania odczynnikiem, takim jak bromek cyjanu. Możliwe jest także dokonania rozcięcia przy dodatkowym miejscu procesowania przez drożdżowy organizm gospodarza, wybierając miejsce procesowania specyficzne dla innseo drożdżiwe|o eezzyu proteeklietznθgo.
Ola pewnych celów korzystne oożo yyb prtrzaaczθntb wygłitβnlb N-kortcdnβgb IIo osią-nięcia specyficznego celu. A zatem, wydłużenie służyć może jako marker do wykrywania białka, jako pomoc w oczyszczaniu białka lub jako sposób kontrolowania działania środka farmaceutycznego in vivo, np. przedłużania okresu półtrwania leku lub kierowania go do określonego miejsca w organizmie.
W korzystnych poliptptydech wytwarzanych sposobem według wynalazku χ1 i/lub χ4 oznaczają sekwencję 1-4 aminokwasów. Korzystna jest, jeśli aminokwasem bezpośrednio przylegają2 3 cym do χ2 jest Glu lub Asp, aminokwasem bezpośrednio przylegającym do χ jest Glu lub Asp, względnie oba są Glu lub Asp, ponieważ zapewnia to korzystną prezentację miejsca procesowania na skutek hydrofilowego charakteru tych aminokwasów, jak wyjaśniono to bardziej szczegółowo powyżej. Sekwencja eminokwasoda stanowiąca χ lub χ może korzystnie zawierać więcej niż jeden Glu lub Asp.
4
W innych inttttsbjęcych polipeptydech zarówno χ jak i χ oznaczają jeden luo większą liczbę aminokwasów. Innymi słowy modyfikują się zarówno C-koniec peptydu lid^owego, jak i N-koniec białka htttrologicznego. χ1 i χ4 mogą być symetrycznie identyczne, to znaczy 1 4 aminokwas lub aminokwasy stanowiące χ i χ są jednakowe, rozpatrując kolejno odpowiednio od χ2 i χ3.
Sekwencja peptydu sygnałowego polipeptydu może być każdym peptydem sygnałowym, który zapewnia w komórce skuteczne kierowanie eksprymowanego peptydu na drogę sekrtcyJną. Peptyd sygnałowy może być peptydem sygnałowym występującym naturalnie lub jego funkcyjną częścią, lub też może być peptydem syntetycznym. Stwierdzono, że odpowiednim peptydem sygnałowym jest peptyd sygnałowy czynnika α , peptyd sygnałowy amylezy śliny myszy, zmodyfikowany peptyd sygnałowy ketboksypepeydezy lub peptyd sygnałowy genu BAR1 drożdży. Sekwencję sygnałową amylazy śliny myszy opisali OzHegenbkchle i inni. Nature 289, 1981, str. 643-646. Sekwencję sygnałową katOoksypeptydazy opisali L.A.Vails i inni, Cell 48,
1987, str. 887-897. Peptyd sygnałowy BARI ujawniono w międzynarodowej publikacji patentowej WO 87/02670.
Sekwencja peptydu liderowego polipeptydu może być każdym peptydem liderowi, który funkcjonalnie kieruje eksprymowany polipeptyd do ^^kulum tndkplarmaeyczntgo i dalej na drogę stkttcyCnąz Możliwymi sekwencjami lid^owymi odpowiednimi do tego celu są ntturalnt peptydy liderowe otrzymane z drożdży lub innych organizmów, takie Jak lider czynnika α lub jego funkcyjny analog. Peptyd lid^owy może być także syntetycznym peptydem liderowym, np. jednym z syntetycznych liderów ujawnionych w opublikowanym międzynarodowym zgłoszeniu patentowym nr WO 89/02463, o następujących sekwencjach aminokwasowychi
A. AllyPrk-Vll-Thry^lt-AspyGlb-StΓyStr-Ve|yGlbyIltPro-Glu-Glu-Ser-Le u-Ile-Gly-Phe-Le u-Asp-Le u-AIiGltyGlbyGlbyIltyAllyGluyAsn-Thr-ThΓyLtb-All
163 532
B. Ala-Pro-Val-Tlr-Gjl;y-Asp-Glu-Ser-Ser-ValGilu-IlePro-Glu-Glu-Ser-Leu-Ile-Ile-Ala-Glu-Asn-Thr-ThrLeu-Ala
C. Ala-Pro-Val-Tln[-GJyy-Asp^alu-sSer^3er-ValGłlu-IlePro-Ile-Ala-Glu-Asn-Thr-Thr-Leu-Ala
D. Ala-Pro-VaJ.-TNrr-G»ł;y-Asp«Glu-S>er-S5er-Val.'Glu-IlePro-Glu-Glu-Ser-Leu-Ile-Ile-Ala-Glu-Asn-Thr-ThrLeu-Ala-Asn-Val-Ala-Met-Ala- i
E. Gln-Pro-Val-Thr-Gly-Asp-Glu-Ser-Ser-Vad.-Glu-IlePro -G1 u-Glu-Ser-Leu-I1 e -II e-Ala-G 1 u-As n-Thr-Tłu?Leu-Ala-Asn-Val-Ala-Me t-Ala lub jego pochodną·
Heterologicznym białkiem wytwarzanym sposobem według wynalazku może Dyc każde białko, które można w korzystny sposób wytwarzać w drożdżach· Przykładami takich białek są aprotynina lub inne inhibitory proteaz, insulina /włącznie z jej prekursorami/, ludzki lub bydlęcy hormon wzrostu - inter^u^na, glukagon, tkankowy aktywator plazminogenu, czynnik VII, czynnik VIII, czynnik XIII, płytkowy czynnik wzrostu, enzymy itp· lub ich funkcyjne analogi· W niniejszym opisie termin -funkcyjny analog* oznacza polipeptyd o funkcji podobnej do natywnego białka /co powinno być rozumiane jako dotyczące raczej charakteru niż poziomu aktywności biologicznej natywnego białka//· Polipeptyd może być strukturalnie podobny do natywnego białka i może zostać z niego otrzymany poprzez dodanie jednego lub większej liczby aminokwasów do jego jednego lub obu końców, substytucję jednego lub większej liczby aminokwasów w jednym lub licznych różnych miejscach sekwencji aminokwasowej, delację jednego lub większej liczby aminokwasów z jednego lub obu końców natywnego białka lub w jednym lub kilku miejscach sekwencji aminokwasowej, bądź insercją jednego lub większej liczby aminokwasów w jednym lub większej liczbie miejsc natywnej sekwencji aminokwesowej· Modyfikacje są dobrze znane dla kilku spośród wspomnianych wyżej białek·
Zgodnie z wynalazkiem nieoczekiwanie stwierdzono, że modyfikacje w C-końcu peptydu liderowego lub N-końcu heterologicznego białka. Jak opisano powyżej, pozwalają na wytwarzanie z dużą wydajnością poprawnie sprocesowanej aprotyniny /lub jej funkcyjnego, według określenia podanego powyżej, analogu/. Aprotynina jest białkiem hamującym aktywność pro— teaz, która to właściwość czyni ją użyteczną dla różnych celów medycznych /np, leczenia zapalenia trzustki, zespołu wstrząsu posocznicowego, krwotoków hiperfibrynolitycznych i uszkodzeniach mięśnia sercowego/· Podawanie wysokich dawek aprotyniny znacząco obniża utratę krwi towarzyszącą zabiegom chirurgicznym serca i innym poważnym zabiegom chirurgicznym· Aprotynina użyteczna jest także jako dodatek do podłóż hodowlanych, ponieważ hamuje aktywność proteaz komórek gospodarza, które mogłyby w przeciwnym razie powodować niepożądane proteolityczne rozcięcia eksprymowanych białek· Stosując znane sekwencje Udarowe takie jak lider czynnika O , napotkano na znaczne trudności w otrzymywaniu z dużą wydajnością poprawnie sprocesowanej aprotyniny· Natywna aprotynina zaczyna się od N-końca aminokwasem zasadowym /Arg/, i z tego powodu poprzedzające go miejsce procesowania może być mniej odpowiednie do proteolitycznego rozcięcia /jak wyjaśniono powyżej/, jeśli jeden ze
163 532 znanych peptydów Udarowych /np. lider czynnika O / wykorzystywany Jest bez modyfikacji według niniejszego wynalazku, co powoduje uzyskiwanie niskich, jeśli w ogóle, wydajności poprawnie sprocesowanej aprotyniny.
Zgodnie z niniejszym wynalazkiem, szczególnie dobre rezultaty pod względem wytwarzania 1 4 aprotyniny osiąga się gdy X* oznacza GluArgLeuGlu, lub gdy X oznacza GluLeu lub GluLeuAspLeu /patrz przykłady/, chociaż oczekuje się, że korzystne wydajności aprotyniny uzys» 1 4 kac można przy innych znaczeniach X i X , przy czym co najmniej jeden aminokwas, najkorzystniej najbliższy miejsca procesowania, jest aminokwasem o ładunku ujemnym, jak wyjaśniono powyżej.
Także zgodnie z wynalazkiem stwierdzono, że modyfikacje C-końca peptydu liderowego lub N-końca białka heterologlcznego, jak opisano powyżej, umożliwiają uzyskanie dużych wydajności poprawnie sprocesowanego prekursora insuliny /lub jego funkcyjnego, jak określono powyżej, analogu/. W tym wariancie X* może oznaczać Glu-Arg-Leu-Glu lub Lys-Glu-Leu4 4
-Glu, w którym to przypadku X oznacza wiązanie peptydowe. Alternatywnie, X może oznaczać Glu, w którym to przypadku X* zazwyczaj oznacza wiązanie peptydowe. W szczególności osiąga się korzystne rezultaty pod względem ekspresji prekursora analogu insuliny B/1-29/-AlaAłaLys-A-/1-29/, gdy X oznacza LysGluLeuGlu lub gdy X oznacza substytucję Phe, jako pierwszego aminokwasu prekursora insuliny, na Glu /patrz przykłady/. Uzyskano także zadowalające wydajności prekursora analogu insuliny B/1-29/SerAspAspAlaLye-A/1-29/, gdy X* oznaczał Lys-Glu-Leu-Glu. Ponadto oczekuje się, że można otrzymać wysokie wydajności pre1 4 kursora insuliny dla innych znaczeń X i X , przy czym co najmniej jeden aminokwas, a najkorzystniej, jeden najbliższy miejsca procesowania będzie aminokwasem o ładunku ujemnym. Jak wyjaśniono powyżej.
Konstrukcję DNA kodującą polipeptyd przygotować można syntetycznie znanymi metodami, np. metodą z zastosowaniem fosfoamidu opisaną przez S .L .Beaucag'a i M.H.Caruthers'a, Tetrahedron Letters 22, 1981, str. 1859-1869, lub metodą opisaną przez Matthes^ i innych, EMBO Journal 3, 1984, str. 801-805. Według metody z zastosowaniem fosfoamidynu syntetyzuje się oligonukleotydy, np. w automatycznym syntetyzerze DNA, oczyszcza, tworzy dupleksy i liguje tworząc syntetyczną konstrukcję DNA.
Konstrukcja DNA może także pochodzić z genomu lub cDNA, np. może zostać otrzymana przez przygotowanie zbioru genomowego lub cDNA i testowania go pod kątem sekwencji kodujących całość lub część polipeptydu, poprzez hybrydyzację z zastosowaniem syntetycznych sond oligonukleotydowych zgodnie ze znanymi metodami /patrz T. Maniatis i inni, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, 1982/. W tym przypadku, połączyć można sekwencję genomową lub cDNA kodującą peptyd sygnałowy lub liderowy z sekwencją genomową lub cDNA kodującą białko hetarologiczna, a następnie modyfikować sekwencję DNA w miejscu 12 3 4 odpowiadającym sekwencji aminokwasowej X -X -X3-X polipeptydu, np. poprzez ukierunkowaną mutagenezę, stosując syntetyczne oligonukleotydy kodująca żądaną sekwencję aminokwasową do rekombinacji homologicznej, zgodnie z dobrze znanymi metodami.
Wreszcie, konstrukcje DNA mogę mieć pochodzenie mieszane: syntstyczno-genomowe, syntetyczno-CDNA lub genomowo-cDNA i być przygotowane przez łączenie fragmentów pochodzenia syntetycznego, genomowego lub cDNA /w zależności od potrzeb/, fragmentów odpowiadających różnym wewnętrznym częściom konstrukcji DNA, zgodnie ze znanymi metodami. A zatem, można sobie wyobrazić, że sekwencja DNA kodująca białko heterologiczne ma pochodzenie genomowe, podczas gdy sekwencja kodująca peptyd liderowy może zostać przygotowana syntetycznie.
Korzystnymi konstrukcjami DNA kodującymi aprotyninę są takie jak te przedstawione na fig. 4, 7, 9, 11 i 12 lub ich odpowiednie modyfikacje kodującę aprotyninę lub jej funkcyjny analog. Przykładami odpowiednich modyfikacji sekwencji DNA są substytucje nukleotydów, które nie powodują zmiany sekwencji aminokwasowej białka, ale które mogą odpowiadać wykorzystaniu kodonów w organiźmie drożdży, do którego włącza się konstrukcję DNA, lub substytucje nukleotydów, które powoduję zmianę sekwencji aminokwesowej i które dlatego prawdopodobnie zmieniają strukturę białka. Jednak bez zmniejszania antyproteazowych
163 532 właściwości natywnaj aprotyniny. Innymi przykładami możliwych modyfikacji są insarcje do sekwencji jednego lub większej liczby nukleotydów, dodania jednego lub więcej nukleotydów przy każdym końcu sekwencji oraz delecja jednego lub więcej nukleotydów przy każdym końcu lub wewnątrz sekwencji. Przykłady specyficznych analogów aprotyniny opisano w opublikowanym europejskim zgłoszeniu patentowym nr 339 942.
Korzystnymi konstrukcjami DNA kodującymi prekursory insuliny są takie jak te przedstawione na fig. 16 i 17 lub odpowiednie ich modyfikacje. Jak określono powyżej.
Rekombinowanym wektorem ekspresyjnym niosącym sekwencję DNA kodującą polipeptyd może być każdy wektor, który zdolny jest do replikacji w organiźmie drożdży. Sekwencja kodujęca polipeptyd według wynalazku powinna być w wektorze w funkcjonalny sposób połączona z odpowiednią sekwencję promotorową. Promotorem może być każda sekwencja DNA przejawiająca aktywność tranakrypcyjną w drożdżach, którą można otrzymać z genów kodujących białka homologiczne bądź heterologiczne dla drożdży. Korzystna jest otrzymanie promotora z genu kodującego białko homologiczne do drożdży. Przykładami odpowiednich promotorów są proootory genów M O< 1, TPI, ADH lub PGK Saccharomyces caraviβlae.
Sekwencja DNA kodująca polipeptyd powinna zostać także w funkcjonalny sposób połączona z odpowiednim terminatorem np. terminatorem genu TPI /patrz T-Alber i G.Kawasaki, J. Mol. Appl.Genet. 1, 1982, str. 419-434/.
Rekombinowany wektor ekspresyjny ponadto zawiera sekwencję DNA umożliwiającą replikację wektora w drożdżach. Przykładami takich sekwencji są geny REP 1-3 i początku replikacji plazmidu drożdżowego 2 yu. Wakror żezz zaerarot tżeże meres lelckcyjny, np. gen TPI Schizosaccharomyces pomba, jak opisał P.R.Russell, Gens 40, 1985, str. 125-130.
Procedury stosowane do ligacji sekwencji DNA kodujących, odpowiednio, pklapapćyd, promotor i terminator, i do wbudowania ich do odpowiednich wektorów drożdżowych zawierających informację niezbędną do replikacji w drożdżach są dobrze znane fachowcom w tej dziedzinie /patrz np. Mayaaćie i inni, publikacja wspomniana powyżej. Jest zrozumiałe, ze wektor konstruować można albo przez uprzednie przygotowanie konstrukcji DNA zawierających kompletną sekwencję DNA kodującą pklapapćyd i następnie wbudowanie tego fragmentu do odpowiedniego wektora ekspresyjnego albo przez kolejne wbudowanie fragmentów DNA zawierających informację genetyczną o pojedyńczych elementach /takich jak sekwencja sygnałowa, lider lub białko heterologiczne/, po czym następuje ligacja.
Organizmem drożdżowym wykorzystywanym w sposobie według wynalazku może być każdy odpowiedni organizm drożdżowy, który w hodowli wytwarza duże ilości l^te^logicznego białka. Przykładami odpowiednich organizmów drożdżowych mogą być szczepy gatunków Saccharomjcee ceravisaaa, Saccharorycee klujverl, Schizosaccharomycae pomba lub Saccharkrjces uvarum. Transformację komórek drożdży można np. przeprowadzić przez utworzenie protoplastów /patrz przykład I poniżej/ i następnie transformację w znany sposób. Podłożem zastosowanym do hodowli komórek może być każde standardowe podłoże odpowiednie do hodowli drożdży. Ulegające sekre^i białko haćerologacznθ, którego znaczna część będzie w podłożu w formie poprawnie sprkceekwayej odzyskiwać można z podłoża znanymi metodami, obejmującymi oddzielenie komórek drożdży od podłoża przez wirowanie lub sączenie, wytrącanie składników białkowych eupernaćayću lub przesączu za pomocą soli np. siarczanu amonu, a następnie oczyszczania różnymi metodami chromatograficznymi, stosując np. chromatografię jonowymienną, chromatografię powinowactwa itp.
Sposobem według wynalazku otrzymano nowy analog apro^^ny o ogólnym wzorze X -aprotynaya/1-58/, w którym χ4 oznacza N-końcowe wydłużenie o jeden lub większą liczbę aminokwasów, z których co najmniej jeden jest aminokwasem o ładunku ujemnym, wybranym z grupy obejmującej Glu i Asp. X może oznaczać sekwencję 1-6 aminokwasów, szczególnie 1-4 aminokwasów i może mieć każde ze znaczeń podanych powyżej. Szczególnie korzystnymi zyaczayiari
X są Glu-Leu i Glu-Leu-Asp-Leu.
Wynalazek opisano bardziej szczegółowo w poniższych przykładach, powołując się na załączone rysunki objaśnione poniżej.
163 532
Fig. 1 przedstawia sekwencję ONA i sekwencję eminokwasową aρootyniny/2-50/z Linie łamane przedstawione w sekwencji DNA wskazują miejsca, w których łączono dupleksy tworzone przez syntetyczne oligonukleotydy.
Fig. 2 przsdstawwe o konstruornanla oluzzldów 0KFN--02 b pKFN-803.
Fig. 3 przsdstsuwa opooób konstruowania olozziddw 0Κ^Ν--89 b piFN-855.
Fig. 4 przθdβladlo βθdwnncJo DNA fragmetto rββtrykccJeβgb ^coRyχχea0 o dtuoośdb 406 par zzaad z plazmiuo PKF-844O o ^1^^-855. o Strαgłlb wθlructo mtcSato pkotθodetyrzeegb γοζcięcia mającego miejsce podczas
Fig. 5A i 5B przedstawiają hamowanie, odpowiednio, trypsyny i plaminy przez apooeyninę: o oznacza aprotyninę z trzustki bydlęcej, x oznacza GluyLtu-pρroeyninę, a Δ oznacza GluLtbAppLeu-βprotyninę.
Fig. 6 przedstawia ssposó Oonstruowania pl^azmidw pKFN--05 O piFN-858.
Fig. 7 przedstawia βsekwencj ONA broamitre rotseotcytcnto 0coRI-yXba o biguokcC 442 opa zasad z plazmidu pFNN-052 i pFFA-050z Strzałka wskazuje miejsce proteolitycznego rozcięcia mającego miejsce podczas sekoacCiz
Fig. 8 przedstawia sposób konstruowania plazmidów pFFN-995 i pFNAy990.
Fig. 9 przedstawia sekwenijję 0ΙΆ fragmenu restrykcyjnego £coRI-Xbal o długości 414 par zz^a z plazmidu pKFN-995 i Strzałka wskazuje mijjsce pirotβο 1 itycznago tozz cięcia mającego miejsce podczas μ^ι^Ι.
Fig. 10 przedstawia sposób konstruowania plazmidów pFNAy2000 i pFFN-1003.
Fig. 11 przedstawia sekwencję DNA fragmentu restrykcyjnego EcoRI-χΟιΙ o długości 412 par zasad z plazmidu pFFN-1000 i pFNA-l003. Strzałka wskazuje miejsce proteolitycznego rozcięcia mającego miejsce podczas
Fig. 12 przedstawia sekwencję DNA syntetycznego genu aprotyniny /3-58/. Linie geiene w sekwencji wskazują gdzie łączono pięc dupleksów tworzonych przez 10 rsyntttyrkwantch kligonukltottdód.
Fig. H orzedstawia sposób kon9ttuowβdlo plazmidów pKFN-305 i f^--374/375.
Fig. 11 orzθdata*wxa sposób konatruowania plazmidu pMT-63..
Fig. H orzedstawia sposób konstruowai^ plazmidu pLaC-240.
Fig. H orzedstawia sekwencję DNA genu zmodyfikowany lider-insulina z plazmidu pLaCy240.
Fig. 17 przedstawia sekwencję ONA fragmentu restrykcyjnego EcoRI-χΟιΙ o długości 508 par zasad kodującego MF ^sekwencję pygnagowoy|idtrkwą/2-85/ i prekursor analogu insuliny B/1-29,1Glu♦27Glu/yAlaAlaLysyA/2-21/.
Przykład I. Wytwarzania Glu-Leu-Aprotyniny/2y58/ przez szczep drożdży FFA-037 a/ Sposób konstruowania plazmidu pFFN-802
Poprzez łączenie 10 oligknukltoet'.dód skonstruowano syntetyczny gen kodujący aprotyninę/2-58/.
Oligkntkltkttdt rstnttttrkdank w attkiattcrnti stnttttrttrt ONA stosując metodę z restopowandtm fksfoaiiitnu na nośniku o kontrolowanej wielkości porów [S.L. B^unge i M.H.Cartthβts, Tttrahtiron L^tars 22, /1981/ 2059y2868 J.
/syntetyzowano 10 następujących nukltkttiWdi
NOR-76O: CAIGGCCAAAAGAAGGCCTGATTTCTGTTTGGAACCTCCATACACTGGGTCC NOR-754: TTACATGGACCAGTGTATGGAGGTTCCAAACAAATCAGGCCTTCTTTTGGC
NOR-354: ATGTAAAGCTAGAATCATCAGATACTTCTACAACG NOR-355: CTTGGCGTTGTAGAAGTATCTGATGATTCTAGCT NOR-356: CCAAGGCTGGTTTGTGTCAAACTTTCGTTTACGOTGGCT
163 632
NOR—3 57 ϊ GTCTGGAGGCAGGGTAAACGAAAGT'ΓTGACACAAACGAGC
NOR-558: GGAGAGCTAAGAGAAACAATTTGAAGT
NOR-359: AGCAGACGTTGAAjTTTKPT!TO'TCTIA.G
NOR-56O: GTGGTGAAGAGTGGATGAGAACTTGTGGTGGTGCGTAAT
NOR-561: GTAGATTAGGGAGCACCACAA<GTI?CTCAT«JAGTCTTG
Z powyższych 10 oligonukleotydów utworzono 5 dupleksów A-E jak przedstawiono na fig· 1· pmoli każdego z dupleksów utworzono z odpowiadających par 5' -eulfoeforylomanych oligonukleotydów przez ogrzewanie przez 5 minut w temperaturze 90°C, a następnie ochłodzenie do temperatury pokojowej przez 75 minut· Zmieszano pięć dupleksów i potraktowano ligazą DNA T4 · Syntetyczny gen wyizolowano jako prążek o długości 191 par zasad po elektroforezie mieszaniny ligacyjnej w % żelu agarozowym· Otrzymany syntetyczny gen przedstawiono na fig· 1·
Syntetyczny gen połączono z fragmentem restrykcyjnym EcoRI-NcoI z plazmidu pLaC2l2spx3 o długości 209 par zasad i z fragmentem restrykcyjnym EcoRI^bal plazmidu pvcl9 [G /Yanisch -Perron, J^ieira i J· Messing, Gene 33 /1985/, 103-119] o długości 2,7 tysięcy par zasad· Plazmid pLa212-spx3 opisano w przykładzie 3 opublikowanego międzynarodowego zgłoszenia patentowego nr WO 89/02463·
Fragment restrykcyjny EcoRI-NcoI plazmidu pLe292spx3 o długości 209 par zasad koduje syntetyczny drożdżowy peptyd liderowy·
Stosowano mieszaninę ligacyjną do transformacji kompetentnego szczepu E^coli /r~, m*/ selekcjonowanego na oporność na ampicylinę· Zsekwencjonowanie fragmentu restrykcyjnego 32P_xbaI-EcoRI /'A^M^am i W^Gilbert, Methods Enzymol· 65 /1980/, 499-560_/ wykazało, ze plazmidy z powstałych kolonii zawierają poprawną sekwencję DNA dla aprotyniny /1-58/·
Do dalszego wykorzystania wybrano jeden plazmid pKFN802· Sposób konstruowania tego plazmidu zilustrowano na fig· 2· b/ Sposób konstruowania plazmidów pKFN-849, ph^Kh^^-3i5i5 i szczepu drżżż±K NF8-837
Fragment restrykcyjny NcoI-StuI o długości 3,0 tysięcy par asadd pKFN-802 połączono z syntetycznym fragmentem OR-799d 99d llgeaz DNA T4 :
M A K R E LR
CATGGCTAAGAGAGAATTGAGA
CGATTCTCTCTTAACTCT
Mieszaninę ligacyjną strawiono enzymem restrykcyjnym w celu obniżenia tła plazmidu pKFN-802 i powstałą mieszaniną wykorzystano do transformacji kompetentnego szczepu E^oli /r-, m+/ selekcjonowanego na oporność na ampicylinę· Wykazano poprzez sekwencjonowanie DNA /“F^anger, S^Micklen i A^^oulson, Proc .Nati,Acβż·Sci,USA 74 /1977/, 5463-5467], że plazmid pKFN-849 z jednej z powstałych kolonii zawiera sekwencję DNA GiuFLeu-Apdotyniny/lF58/ poprawnie połączoną z syntetycznym genem lidera drożdżowego· Sposób konstruowania pllarn^u ppKN-849 fig· 3.
Plazmid pKFN-849 trefiono ^31^^828:01 EcoRI i i frdegθet o długości 406 par zasad połączono z fragmentem restrykcyjnym NcoI-KbaI o długości 9,5 tysięcy par zasad plazmidu pMT636 oraz frramentern rretrykcyjnym NcgU-coRI o bdugoiSci 1,4 tysięcy per zasad plazmidu MT636, otrzymując plazmid lFFNF855, patrz fig· 3· Plazmid pMT636 opisano w międzynarodowym zgłoszeniu patentowym nr PCT DK88 00138·
163 532
Plazmid pMT636 jest wektorem wahadłowym E.coll - S. carevaeaae zawierającym gen TPI Schazoeaccharkrjcae pombe /POT/ [^^.Russell, Gena 40 /1985/, 125-130J, promotor i terminator izome^zy trakzkfkafkrayowec Sncerevieiae, TPIp i TP^ [^.Alber i 'GnKawaeaki, □ nMklnApplnGayn 1 /1982/, 419-434J. Plazmid pKFN-865 zawiera następującą sekwencję, nPTp-ealwaycCa ejgyałkwk-lidarowa z LaC2l2epx3-Glu-Lθu-aproćjyaya/1-58/-TPTnn gdzie sekwencja eygyałkwo-laderowa LaC212spx3 jest syntetycznym liderem drożdżowym opisanym w opublikowanym międzynarodowym zgłoszeniu patentowym nr WO 89/02463. Sekwencję DNA fragmentu restrykcyjnego EcoRI-XbaI o długości 406 par zasad z plazmidów pKFN-849 i pKFN-855 przedstawiono na fig. 4.
Szczep MT663 /E2-78 XE11-36 a/ 1 .ótpi Δtpi, pep 4-3/pep 4-3/ Sncaravaeiaa hodowano na podłożu YPGal /1% ekstrakt drożdżowy Bacto, 2% Bacto-pepton, 2% galaktoza, 1% mleczan/ do uzyskania gęstości optycznej /O.O./ równej 0,6 przy długości fali 600 nm,
100 ml hodowli zebrano przez wirowanie, przemyto 10 ml wody, ponownie odwirowano i zawieszono w 10 ml roztworu zawierającego 1,2 M sorbit, 25 mM Na^EDTA o pH 8,0 i 6,7 mg/ml dićlktraaćolun Zawiesinę iylubkwayk w temperaturze 30°C przez 15 minut, poddano wirowaniu i komórki zawieszono ponownie w 10 ml roztworu zawierającego 1,2 M sorbit, 10 nM Na2EDTA, 0,1 M cytrynian sodowy o pH 5,8 i 2 mg Novkzymu 234. Zawiesinę iykubowayo w temperaturze 30°C przez 30 minut, komórki zebrano przez wirowanie, przemyto 10 ml 1,2 M sorbitolu i 10 ml roztworu CAS [1,2 M sorbit, 10 mM Ca-Cl2, 10 mM Tris-HCl, Tras-ćróC/hydrokejmaćylo/-arayoratay, pH 1,5j 1 zawieszono ponownie w 2 ml CAS. Do transformacji zmieszano 0,1 ml komórek zawieszonych w CAS z około 1 pg plazmidu pKFN-855 i pozostawiono w temperaturze pokojowej na 15 minut. Dodawano 1 ml roztworu o składzie 20% glikol polietylenowy 4000, 20 mM CaCl2, 10 mM CaCl2, 10 mM nrie-HCl, pH 7,5, i mieszaninę pozostawiono na dalsze 30 minut w temperaturze pokojowej. Mieszaninę poddano wirowaniu a osad zawieszono w 0,1 ml roztworu SOS /1,2 M skroatkl, 33% obj. YPD, 6,7 mM CaCl?, 14 μg/ml leucyny* i ankubkwayk w temperaturze 30°C przez 2 godziny. Zawiesinę następnie poddano wirowaniu, a osad ponownie zawieszono w 0,5 ml 1,2 M sorbicie. Następnie dodano w temperaturze 52°C 6 ml agaru [“podłoże SC według Shermana i innych /Metnods in Yeast Gayetacs, Cold Spring Harbor Laboratory, 1981/ zawierające 1,2 M sorbit i 2,5% agar_/ i zawiesinę wlano na powierzchnię płytek zawierających to samo, zestalone agarem, zawierające sorbit podłoża. Po trzech dniach w temperaturze 30°C kolonie ćrayefkrraytów replikowano, ponownie izolowano i wykorzystywano do założenia hodowli płynnych. Do dalszej charakteryzacji wyselekcjonowano jeden taki ćrayefkrrant - KFN-837.
Szczep drożdży KFN-837 hodowano na podłożu YPD [1% ekstrakt drożdżowy, 2% pepton /Difco Laboratories/ i 6% glukoza^. Hodowle o objętości 200 ml wytrząsano przy 250 obrotach na minutę w temperaturze 30°C przez 3 dni do uzyskania wartości O.D. równej 20, przy długości fali 600 nm /sucha biomasa drożdży 18,8 g/litr/. Po wirowaniu superyatayć zanalizowano metodę chromatografii jonowymiennej FPLC. Superyaćayć drożdżowy przesączono przez sączek Millex GV o średnicy porów 0,22 μm i 1 ml przesączu naniesiono na kolumnę kationowjriannj Monos /0,5 x 5 cm/ zrównoważoną 20 mM Bacina, pH 8,7. Po przemyciu buforem do równoważenia, prowadzono elucję stosując liniowy gradient /0-1 M/ NaCl do równoważenia.
W wyeluowanych frakcjach oznaczono aktywność inhibitora trypsyny metodą spekćrkfoćoratryczną [’BnKaseal, Methods Enzymol. 19 /1979/, 8—-852a następnie integrację absorpcji przy długości fali 280 nm ze wzoru
1%
E /aprotynina/ 8,3
280
Uzyskano wydajność Glu-Lau-aprotyniny/1-58/ 120 mg/litr.
Dla analizy aminokwasów i eakwaycjonowania N-końca dokonano zatężenie i dalszego oczyszczenia wyaluowayej gradientowo /Glu-Leu-aprotyniyy/1-58/ metodą HPLC z odwróconymi fazami /kolumna Vydac C4, 4,6 x 150 mm/. Elucję prowadzono stosując gradient CH3CN w 0,1% TFA. Zebrane frakcje zatężono do około 100 μl przez wirowania pod obniżonym ciśnieniem
163 632 i pobrano próbki do dakwαmcakmkwkmlα N-końca i analizy aminokwasów.
Dzięki sakwemcaknowamlu N-końca stwierdzono następującą sekwencję ,
G lu-Leu-Arg-Pro -Asp-Phe-X-Leu-G lu-Pro -Pr o -Ty r-Thr-Gly-Pro-XLy s -Al a-Arg -I le -I le -Arg-(yy r-Phe Ty r-Asn-Ly s -Ala potwierdzającą poprawność N-końca. Metoda ta nie pozwala na oznaczenie reszt cysteiny, co zgodne jest z pustymi cyklami /X/ otrzymanymi dla reszt numer 7 i 16.
Wyniki analizy aminokwasów przedstawiono w tabeli 1. Z tabeli tej wynika, że produkt ma oczekiwany skład aminokwasowy, to jest więcej Glu niż Leu. Nieznacznie obniżoną zawartość Ile najprawdopodobniej przypisać można niecałkowitej hydrolizie wiązania Ι1ι/18-Ι1ι/ /19/ /co jest dobrze znana specjalistom w tej dziedzinie/. Zawartość Arg jest także nieco wyższa od oczekiwanej. Jest to jednak także widoczne dla nat^/wnej aprotyniny /tabela 1, trzecia kolumna/.
Przy porównywaniu wspomnianą powyżej metodą Kassela aktywności właściwej Glu-Leu-kprktyminy/1-58/ stwierdzono, że jest ona identyczna, w granicach błędu doświadczalnego, z aktywnością protyniny. Hamowanie aktywności trypsyny i plazminy pod względem krzywych miareczkowania, wyznaczonych jak opisano poniżej, było nlerozróZnlalna od hamowania przez aprotyninę z trzustki bydlęcej /Aprotinin Novo/. Po inkubacji enzymu z aprotyninę lub jej analogami przez 30 minut dodawano 0,6 mM S 2251 /KabiVitrum/ i mierzono aktywność jako szybkość powstawania nitroaniliny. Aktywność w funkcji stężenia aprotyniny przedstawia wykres na fig. 5A i 5B. Zaobserwowano całkowite hamowanie obu enzymów wszystkimi trzema inhibitorami.
Przykład II. Wytwarzanie Glu-Lau-Asp-Leu-kprktymlmy/1-58/ przez szczep drożdży KFN-840
Syntetyczny gen kodujący GUu-Lau-Asp-Leu-aprotynlmę/1-58/ skonstruowano jak opisano w przykładzie I. Zastosowano syntetyczny fragment NOR-793/794 w miejscu NOR-79/791;
M A K R ELDLR
CATGGCTAAGAGAGgAATTGGACTTGAGA
AGATTCTCTCTTAACCTGAACTCT
Plazmid pKFN-852 pochodzący od pUC19 skonstruowano w podobny sposób jak plazmid pKFN-849.
Analogicznie jak w przykładzie I otrzymano plazmid pKFN-858 zawierający następującą konstrukcję: TP^-sekwencja sygnkłkwo-UldarkWk z LkC212spx3-GUueauAspeau-kprktymlmk//1-58/-TPIT.
Sposób konstruowania plazmidów pKFN-852 i pKFN-858 zilustrowano na fig. 6. Sekwencję DNA fragmentu restrykcyjnego EcoRI-Kkal z plazmidów pKFN-852 i pKFN-858 o długości 412 par zasad podano na fig. 7.
Plazmidem pKFN-858 strkmsfkrmowkno szczep drożdży MT663 jak opisano powyżej, otrzymując szczep drożdży KFN-840.
Hodowlę KFN-840 o objętości 200 ml w podłożu YPD wytrząsano przy 250 obrotach na minutę w temperaturze 30°C przez 3 dni do uzyskania wartości O.D. równej 18 przy długości fali 600 nm /sucha biomasa 16,7 mg/litr/. Po dodaniu supernatantu opisanej powyżej chromatografii FPLC uzyskano wydajność GUu-Lsu-Asp-Lau-kprotynlny/1-58/ 90 mg/litr.
Wyniki analizy aminokwasów pokazane są w tabeli 1. Potwierdzają ona oczekiwany skład aminokwasowy.
Krzywe miareczkowania hamowania trypsyny i plazminy przez GUu-Lau-Asp-eau-dprktyniną /1-58/ nieodróżnialne były od krzywych dla aprotyniny z trzustki bydlęcej /Aprotinin Novo/, patrz fig. 5A i 5B.
Przykład III. Wytwarzanie kprktymlny/1-58/ przez szczep drożdży KFN-1006.
163 532 plazmid pKFN-995 Skonstruowano z plazmidu pKFN-802 przez połączenia fragmentu reetryk cyjnego Ncol-Stul o długości 3,0 tysięcy par zasad z syntetycznym fragmentem NOR-848/849:
MAKELEKRR gatgggtaaggaattggagaagagaagg
GGATTGCTTAACCTGTTCTCTTCC
Mieszaniną llgacyjną strawiono enzymem restrykcyjnym Bali w calu redukcji tła plazmidu pKFN-802.
Drożdżowy plazmid ekspresyjny pKFN-990 skonstruowano zasadniczo Jak opisano w przykładzie I i przedstawiono na fig. Bg
TPlp - sekwencja sygnałowo-liderowa/1-47/ z LeC212spx3-Lys-Glu-Leu-6lu /Lys-Arg/-aprotynina/158/-TPΙγ
Sekwencję DNA fragmentu restrykcyjnego EcoRl-xbeI o długości 412 par zasad z plazmidów pKFN-995 1 pKFN-998 podano na fig. 9.
Plazmidem pKFN-998 trans formowano szczep drożdży MT663 Jak opisano w przykładzie I, otrzymując szczep KFN-1006. Hodowlą strensformowenego szczepu KFN-1006 w podłożu YPO oraz analizę zawartości aprotyniny/1-58/ w supernatancie prowadzono Jak opisano powyżej.
Wydajność aprotyniny/1-58/ wynosiła 30 mg/litr. Wyniki aminokwasów oczyszczonego materiału potwierdziły oczekiwany skład amlnokwasowy.
Przykład IV. Wytwarzanie aprotyniny/1-58/ przez szczep drożdży KFN-1008.
Plazmid pKFN-1000, pochodzący z plazmidu pUC skonstruowano jak opisano w przykładzie I, przez łączenie fragmentu restrykcyjnego Ncol-stul o długości 3,0 tysięcy par zasad plazmidu pKFN-802 z syntetycznym fragmentem N0R-850 851:
MABRLBKRR
CATGGCTGAGAGATTGGAGAAGAGAAGG
CGACTCTCTAACCTCTTCTCTTCC
Postępując analogicznie Jak w przykładach I 1 ΠΙ otrzymano drotdżowy wektor ekspresyjny pKFN-1003, zawierający następującą konstrukcję:
TPIp-sskwencja sygnsłowo-liderowa/1-47/ z LeC212apx3-Glu-ArgLsuGlu/Lys-Arg/-sprotynina/l-58/-TPIT.
Sposób konstruowania plazmidów pKFN-1000 i pKFN-1003 zilustrowano na fig. 10. Sekwencją ONA fragmentu restrykcyjnego EcoRI-XbsI o długości 412 par zasad z plazmidów pKFN-1000 i pKFN-1003 podano na fig. 11.
Plazmidem pKFN-1003 stransformowano szczep drożdży MT663 Jak opisano powyżej, otrzymując szczep KFN-1008.
Hodowlę stransformowanego szczepu KFN-1008 w podłożu YPD orez analizę zawartości aprotyniny/1-58/ w supernatancie prowadzono jak opisano powyżej. Wydajność aprotyniny/1-58/ wynosiła 120 mg/litr.
Wyniki analizy aminokwasów oczyszczonego materiału potwierdziły oczekiwany skład aminokwasowy. Ponadto, potwierdzenie kompletności struktury pierwszorzędowej uzyskano przez eekwencjonowanie w fazie gazowej zredukowanego, pirydyloetylowanego polipeptydu.
Ponadto, aktywność właściwa hamowania trypayny przez rekombinowaną aprotyninę/1-58/ nierozróżmalne była od aktywności właściwej aprotyniny bydlęcej.
Przykład V. Wytwarzanie aprotyniny/1-58/ przez szczep drożdży KFN-783.
Plazmid pKFN-802 /patrz przykład 1/ strawiono restryktezemi EcoRl i Xbal i fragment o długości 400 per zasad połączono z fragmentem restrykcyjnym Ncol-Xbel o długości 9,5 tysięcy par zasad z plazmidu pMT636 i fragmentem restrykcyjnym Ncol-EcoRI z plazmidu
163 532
PMT636, zr-de®ując plazmid pKFN-803, patrz fig. 2. Plazmid pKFN-803 dcwisrc następującą konstrukcję,
TP^-sekwencjc rygnagowz-ligezoda z LaC2X2ryx3-ay-ztynZna/1-58/-TPI.r.
Plazmidem pKFN-803 rrrcnsfo-Bzwanz szczep drożdży MT663 jak opisano powyżej. Hodowlę ct-ancfo-mowcnsgo szczepu KFN-783 w podłożu YPD oraz chrzmarzg-cfZę jonową FPLC ruye-naranru prowadzono jak opisano powyżej. Ap-zrenZnę/X-58/ oznaczono p-zez porównanie z ch-omcrzgramami stanga-ezodanech roztworów autentycznej aprztenZne oczyszczonej z Ι^^ιΡΙ bydlęcej. Wydajność aprorynine/1-58/ wynosiła poniżej 1 mg/lirr.
Tabel a 1
Skład amZnzkdarowy
I--——— — J Amino* kwas i 1 1 1 1 Ap-otenina teo-erycd- nie ---------- , Aprorynina [ stwierdzono 1 » 1 1 1 1 _ J KFN-837 rrdis-gdzno —-fr.1 1 1 1 1 1 KFN-840 stwierdzono ....J
ł ....... - 1 ...p. w *1
! 1 1 2 1 3 1 4 1 5
' Asp i 1 1 5 J 5,00 1 1 1 4,95 1 1 1 5,93 /+1/
J Th- 1 1 3 ! 2,86 1 1 2,84 1 1 2,85
i Se- 1 1 1 1 0,94 1 1 | 0,92 I | 0,93
J Glu 1 1 3 J 3,04 1 1 3,97 /+c/ 1 1 3,99 /+1/
! P-o 1 1 4 ! 4,18 1 1 3,90 1 | 3,86
• Gly 1 1 6 ί 5,95 1 1 5,91 1 1 5,94
! Alc 1 1 6 '. 5,85 1 1 5,92 1 1 5,94
J Cys 1 1 6 J 5,20 1 1 5,21 1 1 5,22
j vcl 1 1 1 0,99 1 1 1,00 1 1 1,01
1 Met t 1 1 ; 0,83 1 ł 0,65 1 1 0,67
J Ile 1 I 2 I 1,39 1 1 1,58 I 1 1,58
1 Leu 1 1 2 ! 1,97 1 1 1 3,00 /+1/ 1 1 | 4,00 /+2/
' Tyr 1 1 4 ! 3,84 1 1 3,74 I 1 3,71
1 Phe 1 1 4 i 3,98 1 1 3,94 1 1 3,92
J Lys 1 1 4 j 3,92 1 1 3,99 1 1 3,99
! Arg 1 1 6 ! 6,39 1 1 6,35 1 « 6,34
____J 4 . L
! Radsm 1 t 1 58 1 ! 56,33 f 1 1 57,87 r 1 1 59,88
U.—........ ....u. .^L——————————————— —J.. —Ł-
Przykład VI. Wetdczzcnie cprotyniny/3-58/
Syntetyczny gen cpzotynzny/3-58/ skonstruowano poprzez łączenie wielu oligonuklsotydów.
nasttujocyyc ollςgzuΓPeezyegw ,syntrłyezzdco ,oC ozyzrcn , ,rzykłedgdz
I: AUUGG AGATTTCTGTTCGGGAUICCTCC ATAC ACCTCiGTCC
37-mer
II: TTACATCGjrACCAGiGjrTAIGGAGGT ?CCAALACAGAAACT
38-mer
III: ATGTAAlGCTAGjAlTCATCAGATACTTCTACiAlCG 35-mer
IV: CTCKGiCGriOTAGAAkGiATCIGAiGA ITCTAGCT?
34-mer
V: CCAAGGT1GGT'TTGTGTCAAALCTT'.lCGTTTACGGT.GGCT
39-mer
163 532
VI s CTCTGCAGCCACCGTAAACGAAAGTTTGACACAAACCAGC
40-mer
VII: GCAGkGCTAAGAGAAACkACTTCAAGT
27-mer
VIII: AGCAGACTTGAAGTTGTTTCTCTTAG
26-mer
IX: CTGKTKAAGłAC TGCA1TAGAACTTCTGGTGGT TGKCTAALT
39-mer
X: CTAGATTAGGCACCACCACAAGiTCTCATGCAGTCTTC
38-mer
Z powyższych 10 olegoluklentnUóe utworzono 5 dupleksów A-E, jak przedstawiono na fig. 12.
Z odpowiednich par 5'-sfnsfnryloeanych nlegoluPlentyUóe utworzono 20 każdego z dupleksów A-E przez ogrzewanie przez 5 minut w temperaturze 90°C, po którym następowało schłodzenie do temperatury pokojowej przez 75 minut. Pięć dupleksów zmieszano i traktowano ligazą T4. Po elektroforezie meeszanenn legacnjnej w 2% żelu agamzowym wyizolowano syntetyczny gen jako prążek o długości 176 par zasad. Otrzymany syntetyczny gen przedstawiono na fig. 12.
Syntetyczny gen o długości 176 par zasad połączono z fragmentem restrykcyjnym EcoRI-Hga1 o długości 330 par zasad z plazmidu pKFN-9 kodującym sekwencję tygnałowo-ledezoeę/1-85/ czynnika rozrodczego C< 1 S.cdzevetiae [ □ . MarPustel i inni, Pzordin-Englndezenz 1 /1987/, 215-223J i fragmentem restrykcyjnym EcnRI-XbaI o długości 2,7 tysięcy par zasad z plazmidu pUC19 [~C. Yalesh-Perzon, □.Vieeza i □.Messing. Gene 33 /1985/, 103 - 119]. Sposób konstruowania plazmidu pKFN-9, zawierającego miejsce restrykcyjne HgaI bezpośrednio po sekwencji leUeroeej, opisano w europejskim opisie patentowym numer 214 826.
Oo transformowania kompetentnego szczepu /r , m+/ E.coli selekcjonowanego na oporność 32 na ampicylinę stosowano mieszaninę ligacyjną. Zsekwencjnnoealie fragmentu P-XbaI-EcoRI [~A. Maxam i ^Gilbert, Methods Enzymol. 65 /1980/, 499-560] wykazało, że plazmidy z otrzy, manych kolonii zawierały poprawną sekwencję ONA apzotynely/3-58/.
□eden plazmid, pKFN305, wybrano do dalszego wykorzystywania. Sposób konstruowania tego plazmidu zilustrowano na fig. 13.
Plazmid pKFN305 trawiono zestrykrazami EcoRI i XbaI i fragment o długości 0,5 tysięcy par zasad połączono z fragmentem restrykcyj^n NcoI-XbaI o długości 9,5 tysięcy par zasad z plazmidu pMTóSe i fragmentem restrykcyjnym NcoI-ecoRI o długości 1,4 tysięcy par zasad z plazmidu pMT636, otrzymując plazmid PKFN374, patrz fig. 13. Plazmid pMT636 skonstruowano z plazmidu pMT608 po dele^i genu LEU-2 oraz plazmidu yMTP79, patrz fig. 14. Plazmid PI1T608 opisano w europejskim opisie patentowym numer 195 691. Plazmid pMT479 opisano w europejskim opisie patentowym numer 163 529. Plazmid pMT 479 zawiera gen TPI Schezosacchaznmncds pombe /POT/ oraz promotor i terminator izomezazy rzenznfotfnzaloedj S. cereveseae, TPIp i TPIt /^.Alber i G.Kaeasake,□ .Mol. PyyO.Gen. 1 /1982/, 419-434J. Plazmid PKFN374 zawedra następującą sekwencję:
TP^-sekwencja sygnałowo-lide rowa/1-85/ -IMF O 1-ayrorynena/3-58/-TPIτ gdzie: MF 1 1 oznacza sekwencję kodującą czynnik rozrodczy alfa 1 S. cezeveseae [□.Kurjan i I^erskowi-tZi Cell, 30 /1982/, 933-943J, sekwencja sygnaUoen-ledeznwa/6-85/ oznacza sekwencję zawierającą pierwszych 85 reszt aminnPeasnwnch sekwencji sygnałowo-lide163 532 rowej MFα 1, a aprotyndne/3y58/ oznacza syntetyczną sekwencję kodującą pochodną aprotyniny pozbawiony pierwszych dwóch reszt aiinokwaskdychz
Szczep MT663 /E2-7B χΕ11-36 a/α , Δ tpi Δ tpi, pep 4-3/pep 4-3/ Szctrtvisiat hodowano w podłożu YPGal /1% ekstrakt drożdżowy Bacto, 2% Bacto-pepton, 2% galaktoza, 1% mleczan/ do uzyskania wartości O.O. równej 0,6 przy długości fali 600 nm.
100 ml hodowli zebrano przez wirowanie, ρτζη^ OO om owo^ 0Pkowdid oOidiowdαo i zz. wieszono w 10 ml roztworu zawitreCąctgo 1,2 M osorbit 25 mM NigEOTA o pH 8,0 i 6,7 mg/ml ditlotttitklt. Zawiesinę ^k^owino w temperaturze 30°C przez 15 minut, poddano wirowaniu i kc^c^^^łci zawieszano ponownie w 10 ml roztworu zawiara.jęcago 1,:2 M sorloit, 10 nM Na2EDTA, 0,1 H cytrynian sodowy o pH 5,8 i 2 mg Novozymt 234. Zawiesinę inkubodlno w temperaturze 3O°C przez 30 minut, komórki zebrano przez wirowanie, przemyto 10 ml 1,2 M sorbitu i 10 ml roztworu CAS [ 1,2 M sorbit, 10 mM CaCl2, 10 mM Tris-HCli TodpytoóJ/hyirkkstmteylo/y lminkittln, pH = 7,5J i zlwdtszono ponownie w 2 ml CAS. Oo transformacji zmieszano 0,1 ml komórek zawieszonych w CAS z około 1 fig plazmidu pFNA379 i pozostawiono w ttiperltuoze pokojowej na 15 minut. Oodano 1 ml roztworu o składzie 201% glikol polietylenowy 4000, 10 mM CaClj, 10 mM Ttis-HCl, pH 7,5 i mieszaninę pozostawiono na dalsze 30 minut w tβmptοι^οπ pokojowej. Mieszaninę poddano wirowaniu, a osad zawieszono w 0,1 ml roztworu SOS /1,2 M sorbit, 33% oOj. YPO, 6,7 mM CaC^, 14 μg/ml l^cyny/ i inkubowano w temperaturze 30°C przez 2 godziny. Zawiesinę następnie poddano wirowlndu, a osad ponownie rlwitpronk w 0,5 ml 1,2 M sorbitu. Następnie dodano w temperaturze 52°C 6 ml agaru [podłoże SC według Snerilnl i innych /Mtthkis mn Yeast Genetics, Colo Spring Haobor Llbktlektt, 1981/ zldity tające 1,2 M sorbit i 2,5% agarJ i zawiesinę wlano na powierzchnię płytek ztditOlJicych to samo, zestalone agarem, zawierające sotbit podłoże. Po trzech dniach w temperaturze 30°C kolonie erlnsformlntWd replikowano i wykorzystywano do założenia hodowli płynnycn.
Oo Iis^c j nlrlketrtrlθCi i wptltakcJnnoweno o tai i traneOlrp^ar^: - KF- 3F2.
Szczep drożdży FFN322 hodowano na podłożu YPO [1Γό tastolat drożdżowy, 2% pepton /Oifco Laboratories/ i 2% glukoza^. Hodowle o objętości 10 ml wytrząsano w ttipettttoze 30°C do uzyskania O.O. o wlotkści 32, pozy długości fali 600 nm. Po wirowaniu stptreltlnt zanalizowano metodę chromatogγοΙ^ jonowymiennej FALC. Supeonltlet drożdżowy ptrtpicrkeo przez sęczek Milltx GV o średnicy potów 0,22 μm i 1 ml przesączu nlndtpikno na kolumnę aleiknodtmienni Mkeks /0,5 x 5 cm/ zrównoważony 20 mM Bicine, pH 8,7. Po portitcit buforem do równoważenia, prowadzono eltcJę stosując liniowy gradient /0-1 M/ NaCl do równoważenia. W dttltkdleycn frakcjach ornlcrknk aktywność inhibitora ttypsyny metodą spektrofktkittrtcrei, a następnie integrację absorpcji pozy długości fali 280 nm ze wzoru
1% E280 /0Protynlne/ n 8»3
Uzyskano wydajność apootyniny /3-58/ około 3 mg/lito.
Przykład VII. Wytwarzanie potatopktl insuliny B/2y29/yAllAllLtpyA/2y22/ przez szczep drożdży LaCl667.
Z plazmidu pLlC222spx3/kpiPleego w mięirtelOkiodti opisie peetntodti no WO 89/02463/ wyizolowano fragmenty restrykcyjne SphIyAckI o długości 589 pat rllli i Hpi1-xOiI o długości 172 pat zasad. Fragmenty te połączono z syeeettcreti ldlpekoti
M A K ELSKRFV N OR-962 CATGGCTAAGGAATTGGAAAAGAGATTCGTT NOR-964 CGATTCCTTAACCTTTTCTCTALAGCAA i fragmentem restrykcyjnym Xtoal—SphI o długości 10 tysięcy par zasad z plazmidu pMT743 /opisanym w międzynarodowym opisie patentowym nr WO 89/02463/, otrzymując plazmid pLaC240 /patrz fig. 25/.StkdencJę ONA zmodyfikowanego lideta-genu prekursora insuliny z plazmidu pLaC24O przedstawiono na fig. 16.
163 532
Dzięki transformacji szczepu drożdży MT663 plazmidem pLeC24O otrzymano szczep wydzielający prekursor insuliny, LaCl667 /MT663/lLaC240/, którego produktywność wynosi 165% w sro sunku do szczepu LaC414 /MT663/pLeC212tpx3/ zawierającego gen dla niezmodyf .kowanego lideraprekursora insuliny, opisany w międzynarodowym opisie patentowym nr WO 89/02463·
Przykład VIII· Wytwarzanie prekursora analogu insuliny B/1-29, 1Giu♦27Glu/F FAiaAieLktFA/lF29/ przez szczep drożdży KFN-470·
Poprzez połączenie 10 riigonukieotkżów skonstruowano syntetyczny gen kodujący prekursor analogu insuliny B/1-29, 1Giu + 27GllJ/-AieAia-LkSFA/lF21/· B/1-29, 1Glu+27Glg oznacza polipeptyd zawierający pierwsze 29 reszt aminokwas^ych łańcucha B insuliny ludzkiej, w którym reszty B9Pn3 i B27Thr zastąpiono resztami Glu· A/1-21/ jest łańcuchem A insuliny ludzkiej· Trójpeptyd AiaAieLkS łączy resztę B29Lys z resztę A1Gly,
Ztknt3tkzowenr następujących 10 riigonukl3rtydów:
NOR-^42: AkkGAGkkGTTSAGGkkGkGTTGTGGGGTTOCOAC
NOR-543: AkGGAAGTGGGkAGGGGAGkAGTGTTGGTTAkGTTC!
NOR-69: TTGGTTGkAGCTTTGTAGTTGGTTTGGGGTGk-kkGkGGTTTGT
NOR-73: GTAGkkGkkkGGTCTWTGkGCGGkkkGGAkGlkGkAkGGTTG
NOR-315: TCTACGGAGGTSkGGGTGGTAkGGGTkTTGGT
N OR-316: ATTGtTCGAGAATAGGGTTAGGAGGGTTAGGTTC
NOR-7O: GAAGkkiGGTGTkGGTGGATGTGGTGGTTGTACCkkT , A
NOR-71: ttttccattggtagaa.ggaggagatggaggtagagg;
NOR-78: TGGkAkkGTkGTGGkkGTkGAGGGAGGGGGGkGGGT
NOR-72: GTkGAGGGTGGGGGGTGGGTGTkGTTGGAGlkG
Z powyższycn 10 riigongki3rtkżów utworzono 5 dupleksów i połączono je w podobny sposób jak opisano w przykładzie I·
Syntetyczny cen o długości 176 par zasad połączono z fragmentem restrykcyjnym EcoRI-Hgal o długości 330 par zasad z plazmidu pKFN-9 kodującym sekwencję sygnałowo-lider^ą /1-85/ czynnika rozrodczego 1 S· cerevisiae / J· Harkusen i inni, Prot3ln-Engln3erlng /1987/, 215-223 / i fragmentem restrykcyjnym EcoRIFχbeI o długości 2,7 tysięcy par zasad z plazmidu pUC19 /_C .Yenish-Perron, J· i J· M3tsing, Gene 33 /1985/, 903F999 J·
Stosowano mieszaninę ligacyjną do transformowania kompetentnego szczepu E^coli /r~, m + selekcjonowanego na oporność na ampicylinę· Zt3kwencnonrwenie fragmentu restrykcyjnego 32pFχDeIFEcrRI / A· Mexem i W^i^ert, He^ods Enzymol· 55 /1980/, 499-560_/ wykazało, że plazmidy z powstałych kolonu zawierają poprawną sekwencję DNA dla prekursora analogu insuliny·
Do dalszego wykorzystania wybrano jeden plazmid lFF^|F456·
Postępując analogicznie jak w przykładzie I otrzymano drożdżowy plazmid ekspresyjny lKFN-458 zawierający następującą kasetkę ekspresyjną:
TPIlFS3kw3ncne tkgnełrwr-ilż3drwe/lF58/FMF dO 1-8/1-29, 1Gig + 27Giu/FAiαAiαLkt-A/1-29/FTPI.r ·
Sekwencję DNA fragmentu restrykcyjnego EcoRIFχbeI z plazmidu pKFN-456 i lKFNF458 przedstawiono na fig· 17·
Plazmidem pKFN-458 stdansrormrwaπr szczep drożdży MT-663 w sposób opisany powyżej, otrzymując szczep drożdży FFNF479·
Hodowlę ttdentrormrwenegr szczepu KFN-470 w podłożu YPD prowadzono jak opisano powyżej· Wydajność prekursora analogu insuliny w tgp3dnetencie oznaczano metody HPLC jak opisano /L^nel i inni, Chromatografia 24, /1987/, 329-332_/.
W tabeli 2 porównano poziomy ekspresji prekursorów analogów insuliny B/1-29, Ulu* + 27Giu/F1AieAieLytF-^F/lF2l/ i B/1-29, 27Gig/FAieAieLytFA/1F21/ oraz prekursora insuliny
163 532
8/4-29/-AlaAleLys-A/1-2l/. Wszystkie trzy prekursory eksprymowano w tym samym gospodarzu, szczepie MT-663, stransformowanym plazmidami zawierającymi gen TPI S. pombe, z kasetką ekspresyj ną.
TPIp-sekwencja sygnałowo-liderowa/1-85/-MFO -1-prekursor-TPlT Tabele 2
Poziomy ekspresji prekursorów insuliny i analogów insuliny w transformantach drożdżowych
Γ“· 1 1 1 l___ Prekursor •—Τ- ι 1 1 -- 4 - --------------------------------------, Poziom ekspresji *
r Τ’
1 1 B/1-29/-AlaAlaLys-A/1-21/ I 100%
1 1 1 | B/1-29/, 27Glu/-AlaAlaLys-A/1-21/ 1 1 144%
B/1-29/, 1Glu+27Glu/-AlaAlaLys-A/1-21/ 1 1 1 1 47<9ś
1
n Poziomy ekspresji podano jako procent poziomu ekspresji prekursora B/1-2S/AlaAlaLys-A/ /1-21/, który przyjęto arbitralnie za 100%.
MetAlaLysArgArcjProAspPheCys LeuGluProProTyrThrGlyProCysLysAlaArg
Nc
CATGGCCAAAAGAAGGCCTGATTTCTGTTTGGAACCTCCATACACTGGTCdĄTGTAAAGCTAGA
CGGTTnCTTCCGGACTAAAGACAAACCTTGGAGGTATGTGACCAGGiACATT|TCGATCT
IleIleArgTyrPheTyrAsnAlaLysAlaGlyLeuCysGlnThrPheVal TyrGlyGlyCys
ATCATCAGATACTTCTACAACGbꥥGGCTGGTTTGTGTCAAACTTTCGTTTACGGTGGCTtGC
TAGTAGTCTATGAAGATGTTGCGGTTĆ|CGACCAAACACAGTTTGAAAGCAAATGCCACCGACG
45 50 55 58
ArgAlaLysArgAsnAsnPheLysSerAlaGluAspCysMetArgThrCysGlyGlyAlaStop
Xbal
A^GCTAAGAGAAACAACTTCAAGltęTGęTCAAGACTGCATGAGAACTTGTGGTGGTGCCTAAT
TCr^GATTCTCTTTGTTGAAGTTCAGAĆ^nCTGACGTACTCTTGAACACCACCACGGATTAGATC
Fig. 1
163 532
Ncol
Xbal
EcoRI
Xbal
EcoRI*
Xbal
Ncol
EcoR: Ncol
EcoRI >r \ ^l5col* Xbal Xbol
EcoRI Ncol QProtyn,r«=xbal
Fig.2
163 532
EcoRI
Fig.3
163 532
20 3Q 40 5Q 6ę
GAATTCCATtCAAGAATAGtTCAAACAAGAAGATTACAAACTATCAATTtCATACACAAt
80 90 100 110 12Q
ATAAACGACĆAAAAGAATGAAGGCTGTTTTCTTGGTTTTGTCCTTGATCGGATTCTGCTG METLysAl aVa l Phe LeuVa l Leu SerLeu 11 eG l yPheCysTrp
130 HO ISę 160 170 18Q
GGCCCAACCAGTCACTGGCGATGAATCATĆTGTTGAGATtCCGGAAGAG+CTCTGATCAT Al aGl nProVal ThrGlyAspGl uSerSerVal Gl ul l eProGl uGl u SerLeu 11 el le
190 200 210 220 230 24ę
CGCTGAAAAĆACCACTTTGGCTAACGTCGCCATGGCTAAGAGAGAATTGAGACCTGATTt AlaGl uAsnThrThrLeuAlaAsnVal AlaMETAl a LysArg^Gl uLeuArgProAspPhe
250 260 270 280 290 300
I I I 1 1 »
CTGTTTGGAACCTCCATACACTGGTCCATÓTAAAGCTAGAATCATCAGATACTTCTACAA CysLeuGl uProProTyrThrGlyProCysLysAlaArgIlel l eArgTyrPheTyrAsn
Fig. 4 (1)
310 320 330 340 35Q 36Q
CGCCAAGGCTGGTTTGTGTĆAAACTTTCGTTTACGGTGGĆTGCAGAGCTAAGAGAAACAA Al aLysAl aGlyLeuCysGl n ThrPheValTyrGl yGl yCysArgAlaLysArgAsnAsn
370 380 390 400 41Q
CTTCAAGTCTGCTGAAGACTGCATGAGAAĆTTGTGGTGGTGCCTAATCTAGA PheLysSerAlaGl uAspCysMETArgThrCysGl yGl yAla
Fig. 4 (2)
163 532 % aktywności plazminy % aktywności trypsyny
Fig. 5B
163 532
Fig.6
163 532
7ę 8p 90 100 110 120
ATAAACGACĆAAAAGAATGAAGGCTG TTTtCTTGGTT TTÓTCCTTGATCÓGATTCTGCTÓ METLysAlaVal PheLeuVal LeuSerLeuIleGlyPheCysTrp nę 140 150 160 170 180
GGCCCAACCAGTCACTGGCÓATGAATCATĆTGTTGAGATtCCGGAAGAGtCTCTGATCAt AlaGlnProValThrGlyAspGluSerSerValGluIl eProGl uGl uSerLeultełle
190 200 210 220 230 240
CGCTGAAAAĆACCACTTTGÓCTAACGTCGĆCATGGCTAAÓAGAGAATTGÓACTTGAGACC AlaGl uAsnThrThrLeuAlaAsnVal Al aMETAIaLysArg^Gl uLeuAspLeuArgPro
Fig.7 (1)
25ę 26ę 270 280 299 309
TGATTTCTGTTTGGAACCTĆCATACACTGGTCCATGTAAAGCTAGAATCATCAGATACTT AspPheCysLeuGluProProTyrThrGlyProCysLysAl aArgllell eArgTyrPhe
310 32ę 339 340 350 360
CTACAACGCĆAAGGCTGGTTTGTGTCAAACTTTCGTTTAĆGGTGGCTGCAGAGCTAAGAG TyrAsnAlaLysAlaGlyLeuCysGl nThrPheVal Tyr GlyGlyCysArgAtaLysArg
370 380 390 400 410 lilii
AAACAACTTCAAGTCTGCTGAAGACTGCATGAGAACTTGTGGTGGTGCCTAATCTAGA AsnAsnPheLysSerAlaGl uAspCysMETArgThrCysGl yGl yAla
Fig. 7 (2)
163 532
Fig. 8
163 532
20 30 40 50 60
GAATTCCATTCAAGAATAGTTCAAACAAGAAGATTACAAACTATCAATTTCATACACAAT
80 90 100 110 120
ATAAACGACCAAAAGAATGAAGGCTGTTTTCTTGGTTTTGTCCTTGATCGGATTCTGCTG METLysAlaVal PheLeuVal Leu Ser Leu II eGlyPheCysTrp
130 140 150 160 170 180
GGCCCAACCAGTCACTGGCGATGAATCATCTGTTGAGATTCCGGAAGAGTCTCTGATCAT AlaGl nProValThrGI yAspGl uSerSerVal Gl uIleProGI uGl uSerLeuIl elle
190 200 210 220 230 240
CGCTGAAAACACCACTTTGGCTAACGTCGCCATGGCTAAGGAATTGGAGAAGAGAAGGCC AlaGl u Asn Thr Thr Leu Al aAsnVal AlaMETAl a LysGl u LeuGl uLysArę^ArgPro
Fig. 9 (1)
250 26ę 279 289 299 3O9
TGATTTCTG+TTGGAACCTĆCATACACTGÓTCCATGTAAAGCTAGAATCATCAGATACT+ AspPheCysLeuGl uProProTyrThrGl yProCysLysAlaArg Ilel l eArgTyrPhe
3ię 329 339 340 350 360
CTACAACGCCAAGGCTGGTtTGTGTCAAAĆTTTCGTTTAtGGTGGCTGCAGAGCTAAGAG Ty r Asn Al a LysAl aGlyLeuCysGl nThrPheVal TyrGl yGl yCysArgAla LysArg
370 380 390 400 410
I I I · I
AAACAACTTĆAAGTCTGCTGAAGACTGCAtGAGAACTTGTGGTGGTGCCtAATCTAGA AsnAsnPheLysSerAlaGl uAspCysMETArgThrCysGlyGlyAla
Fig.9 (2)
163 532
Fig.10
163 532
8ę 99 109 110 129
ATAAACGACĆAAAAGAATGAAGGCTGTTTTCTTGGTTTTGTCCTTGATCÓGATTCTGCTG METLysAlaVal PheLeuVal Leu SerLeuIl eGl yPheCysTrp
139 140 159 160 170 1&9
GGCCCAACCAGTCACTGGCGATGAATCATĆTGTTGAGATTCCGGAAGAGtCTCTGATCAt AlaGl nProVal ThrGlyAspGluSerSerValGl u II eProGl uGl uSerLeuIl e Ile
199 200 210 229 239 249
CGCTGAAAAĆACCACTTTGGCTAACGTCGĆCATGGCTGAGAGATTGGAGAAGAGAAGGCC
AlaGl uAsnThrThrLeuAlaAsnVal Al aMETAlaGl u *
ArgLeuGl uLysArg^ArgPro
Fig. 11 (1)
259 269 279 289 299
TGATTTCTGtTTGGAACCTĆCATACACTGÓTCCATGTAAAGCTAGAATCATCAGATACTt AspPheCysLeuGluProProTyrThrGI y ProCysLysAlaArg 11 el l eArgTyrPhe
310 320 330 340 3 50 360
CTACAACGCĆAAGGCTGGTtTGTGTCAAAĆTTTCGTTTAĆGGTGGCTGCAGAGCTAAGAÓ TyrAsnAla LysAlaGlyLeuCysGl nThrPheValTyrGl yGl y Cys Arg Al a Ly sArg
370 380 390 400 410 iii>i
AAACAACTTĆAAGTCTGCTĆAAGACTGCAtGAGAACTTGTGGTGGTGCCTAATCTAGA AsnAsnPheLysSerAlaGl uAspCysMETArg ThrCysGl yGlyAl a
Fig. 11 (2)
163 532
5 10 15 20
AspPheCysLeuGl uProProTyrThrGl yProCysLysAlaArgll el I eArg AAAGAGATTTCTÓTTTGGAACCTCCATACACTGGTCCIĄIGTAAAGCTAGAATCATCAGA ctaaagacaaaccttggaggtatgtgaccaggtacATt]tcgatcttagtagtct
30 35 40
Tyr PheTy rAsnAl aLysAlaGl y LeuCysGl nThr PheVal TyrGl yGI yCysArgAla TACTTCTACAACGlCCAAGGCTGGTTTGTGTCAAACTTTCGTTTACGGTGGCTlGCAGAGCT ATGAAGATGTTGCGGTrĆICGACCAAACACAGTTTGAAAGCAAATGCCACCGACGTCTigGA
50 55 58
LysArgAsnAsnPheLysSerAlaGl u AspCysMetArgThrCysGl yGlyAlaStopXbaI
AAGAGAAACAACTTCAAGltieęTGAAGACTGCATGAGAACTTGTGGTGGTGCCTAAT
TTCTCTTTGTTGAAGTTCAGACG^CTTCTGACGTACTCTTGAACACCACCACGGATTAGATC
Hgąl A B , C D , E Xbal
Fig. 12
163 532
EcoRI*
Xbol
Fi g.13
163 532
Fig.4
163 532
Fi g. 15
163 532
20 30 40 50 60
I I 1 I I |
GAATTCCATtCAAGAATAG+TCAAACAAGAAGATTACAAACTATCAATTTCATACACAAt
80 90 100 110 120
I II|I|
ATAAACGACĆAAAAGAATGAAGGCTGTTTtCTTGGTTTTGTCCTTGATCGGATTCTGCTG METLysAlaVal PheLeuVal LeuSer Leull eGlyPheCysTrp
130 140 150 160 170 180
I I I i I |
GGCCCAACCAGTCACTGGCGATGAATCATĆTGTTGAGATTCCGGAAGAGtCTCTGATCAt AlaGlnProVal ThrGl yAspGluSerSerValGl uli eProGl uGIuSerLeullelle
190 200 210 220 230 240
CGCTGAAAAĆACCACTTTGGCTAACGTCGĆCATGGCTAAGGAATTGGAAAAGAGATTCGT AlaGluAsnThrThrLeuAlaAsnVal AlaMETAlaLy sGl uLeuGl uLysArqPheVal
Fig. 16 (1)
250 269 270 280 290 3O9
TAACCAACAĆTTGTGCGGTTCCCACTTGGTTGAAGCTTTGTACTTGGTTtGCGGTGAAAG AsnGl nHi sLeuCysGlySerHi sLeuValGl uAlaLeuTyrLeuVal CysGlyGluArg
310 320 330 340 350 360
I i i l i T
AGGTTTCTTĆTACACTCCTAAGGCTGCTAAGGGTATTGTĆGAACAATGCTGTACCTCCAT GlyPhePheTyrThrProLysAlaAlaLysGl ylleVal Gl uGlnCysCysThrSer11e
370 380 390 400 410
I I i I l
CTGCTCCTTGTACCAAKGÓAAAACTACTGCAACTAGACGCAGCCCGCAGGCTCTAGA CysSerLeuTyrGl nLeuGl uAsnTyrCysAsn
Fig. 16 (2)
163 532
80 90 100 110 120
II I ι I 1
ATAAACGATTAAAAGAATGAGATTTCCTTĆAATTTTTAC+GCAGTTTTAtTCGCAGCATĆ METArg PheProSer I lePheThrAlaVal LeuPheAlaAlaSer
130 40 15φ 160 170 18Q
CTCCGCATTAGCTGCTCCAÓTCAACACTAĆAACAGAAGATGAAACGGCAĆAAATTCCGGĆ SerAlaLeuAlaAlaProVal AsnThrThr ThrGl uAspGluThr Al aGl η II e Pro Ala
190 200 210 220 230 240 i I I ł I I
TGAAGCTGTĆATCGGTTACtTAGATTTAGAAGGGGATTTĆGATGTTGCTGTTTTGCCATT Gl uAlaVal 11 eGlyTyrLeuAspLeuGl uGl yAspPheAspVal AlaVal LeuProPhe
25(J 260 270 280 290 300
TTCCAACAGCACAAATAACĆGGTTATTGTtTATAAATACTACTATTGCCAGCATTGCTGĆ SerAsnSerThrAsnAsnGlyLeuLeuPhell eAsnThrThrlleAla Serii eAlaAla
Fig. 17 (1)
3ię 320 330 340 35Q 36Q
TAAAGAAGAAGGGGTATCTtTGGATAAAAGAGAAGTTAAĆCAACACTTGiGCGGTTCCCA LysGl uGl uGl y Val SerLeuAspLysArgGl uVal AsnGl nHi sLeuCysGlySerHis ł
37Q 380 390 400 41Q 420
CTTGGTTGAAGCTTTGTACTTGGTTTGCGĆTGAAAGAGGT TTCTTCTACGAACCTAAGGC LeuVal G l u Ala LeuTyrLeuVal CysGI yGluArgGlyPhePheTyr Gl u ProLysAla
430 440 450 460 470 480
I > 1 I I 1
TGCTAAGGG TATTGTCGAACAATGCTGTAĆCTCCATCTGĆTCCTTGTACĆAATTGGAAAA A la LysGl y 11 e Val Gl uGl nCysCysThrSer 11 eCysSerLeuTyrGl nLeuGlu Asn
499
500
510
CTACTGCAAĆTAGACGCAGĆCCGCAGGCTCTAGA TyrCysAsn
Fig. 17 (2)
163 532
Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 90 egz. Cena 10 000 zł

Claims (30)

  1. Zastrzeżenia patentowe
    1. Sposób wytwarzania heterologicznych białek lub pollpeptydów, znamienny tym, że /s/ wbudowuje się w odpowiednim wektorze ekspresyjnym, zdolnym do replikacji w drożdżach, sekwencję DNA kodującą polipeptyd o następującej strukturze: peptyd sygnałowypeptyd liderowy-x1-X2-x3_X4_ białko heterologiczne, gdzie x1 oznacza wiązanie peptydowe, względnie jeden lub większą liczbę aminokwasów, które mogą być jednakowe lub różne, X
    O i Χ^ są jednakowe lub różne i oznaczają aminokwasy zasadowe wybrane z grupy obejmujęcej 2 3 4
    Lys i Arg, X* i X razem określają drożdżowe miejsce procesowania, a X oznacza wiązanie peptydowe względnie jeden lub większą liczbę aminokwasów, które mogę być jednakowe lub różne, przy czym χ1 i/lub χ4 oznacza jeden lub większą liczbę aminokwasów, a co najmniej jeden z aminokwasów stanowiących χ1 i/lub X4 jest aminokwasem o ładunku ujemnym, wybranym z grupy obejmującej Glu i Asp, /b/ transformuje się wektorem szczep drożdży, który jest zdolny do ekspresji heterologicznego białka lub polipeptydu, /c/ hoduje się stransformowany szczep drożdży w odpowiednim podłożu do uzyskania ekspresji polipeptydu i jego procesowania, a w rezultacie sekrocji heterologicznego białka lub polipeptydu, i /d/ izoluje się heterologiczne białko lub polipeptyd z podłoża.
  2. 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że χ1 w polipeptydzie eksprymowcnym w etapie /c/ ozzacze Glu lub Asp.
  3. 3. Sposób wedeug zzcsi--. 1, znamienny tym, że X* w yzllyeytydzis θ^ρ^mowanym w etapie /c/ oznacza sekwencję dwóch aminokwasów o struPru-ze BA, gdzie A jest Glu lub Asp, a 8 jest Glu, Asp, Val, Gly lub Leu.
  4. 4. Sposób gzctr-. 1, znamienny tym, ^e χ1 w poliyeptydzis okłpsymowanym w etapie /c/ oznacza sekwencję trzech aminokwasów o srrupturzs CBA, gdzie A i B są jck określono powyżej, a C jest Glu, Asp, Pro, Gly, Vcl, Leu, Arg lub Lys.
  5. 5. Sposób według 1, znamienny tym, że w polipsptydzis eksprymowanym w etapie /c/ Dont^t^i^a sekwencję czterech aminokwasów o θΙγρΙι-^θ CBBA, gdzee A , B i C są jak określono a O ma trCie ssme JoC C.
  6. 6. Sposób według zdctrz. 1, znamienny tym, żeX^w pzliyeptyddie eepprymowanym w etapie /c/ oznacza sekwencję pięciu aminokwasów o rtruktu-ds EDCBA, gdzie A, B,
    C i D są jck określono powyżej, c E ma tckie scme znaczenie jak Co
  7. 7. Sposób New^ł gdctr-r 1, znamienny tym, że xw o zySyregdzSołP pre-rymowcnym w etapie /c/ oznacza sekwencję sześciu aminokwasów o rr-uPturds FEDCBA, gdzie A,
    B, C, D i E są jck określono powyżej, a F ma rckie same znaczenie jak C.
  8. 8. Sposób według zdctr-. 1, znamienny tym, że X4 w poliyeptyddis θSρryzmowcnym w etapie /c/ ozzaccz Olu lub Asp.
  9. 9. Sposób według zzcsi-. L znamienny ty1· ze X w polZpsyreddzs θSkry-mowcnym w etapie /c/ oznacza sekwencję dwóch aminokwasów o struPturzs AB, gdzie A jest Glu lub Asp, a B jest Glu, Asp, Val, Gly lub Leu.
  10. 10. Sposób wdSggu odsI-z. 1, znamienny tym, że χΧ w OPZizy^yt^(^2^r^θ ekspremodanym w etapie /c/ oznacza sekwencję trzech aminokwasów o strΓkrΓZds ABC, gdzie A i B są jck określono powyżej, a C jest Glu, Asp, Pro, Gly, Vcl, Leu, Arg lub Lys.
    Ą
  11. 11. Sposób «wedłu oastrz. 1, znamienny tym, że X w OPZlZyeyredde sPsprymodcnem w etapie /c/ oznacza sekwencję czterech aminokwasów o rt-uktΓ-ds ABCD, gdzie A, B i C są jck określone powyżej, a D ma tckie same Jak C.
  12. 12. Sposób weedłu oostrz. 1, znamienny tym, że X w deyzpzpłpregz ePrp-emodcnem w s^pIs /c/ oznacza sekwencję pięciu aminokwasów o st-ukru-ze ABCDE, gdzie A, B, C i D są jck określono powyżej, a E ma takie same znaczenie jck C.
    163 532
  13. 13. Sposób według zastrz. 1. znemianny ty a, że X4 w polipeptydzie ekspry aowanyo w etapie /c/ oznacza sekwencję sześciu βBinokeatóe o strukturze ABCOEF, gdzie A, B C, O Z Z zę Z oS n kkreionn nowyyoj» n Z na n ełcka n aae n nacczele ,ok A.
    1 4
  14. 14. Sposób według zastrz. 1, znamienny ryt, że jeśli X i/lub X w polipeptydzie eksprynowany· w etapie /c/ oznacza więcej niż jeden aninokwas, to aminokwasem bezpośrednio przylegającym do X jest Glu lub Aep, a aminokwasem bezpośrednio przylegającyn do χ3 jest G1o Zou Aep, zezgoęnle noa ns ZIo Zou ZsPs « 4
  15. 15. Sposób «we^u Zzastrz 1, znamienny ty m, ζβχΐ i/lub X xp po lipepty1 4 dzie ektpzynneanyn w etapie /c/ oznacza więcej niż jeden aminokwas, to X lub X , względnie też obydwa, zawierają więcej niż jeden Glu lub Asp.
  16. 16. Sposób według zezartrl, znarniannn ty,, że e1 1 i4w ezlnoeptprzlz dktprymoeanyn w etapie /c/ oba oznaczają co najmniej jeden aminokwas.
    1 4
  17. 17. Sposób według zaztrz. 16, znamienny tym, żaX i Z w nonieβetrnzie ektpzynowalyn w etapie /c/ są symetrycznie identyczne.
    16. Sposób według za^trt^l. znarniannn t y ,, że Jaśli ś4 a pnwZpolipe dzie eksprymowanym w etapie /c/ oznacza jeden lub większą liczbę aminokwasów, to zapewnia się dodatkowe miejsce procesowanie pomiędzy X i N-końcem białka heternlngiczlegn.
  18. 19. Sposób waweił gszcst. 1t znarnienn, ty,, że e enlnoeptyrnlz eZepsyr mowcnym w etapie /c/ peptyd sygnałowy jest peptydem sygnałowym czynnika O , peptydem sygnałowym amylazy ze śliny myszy, peptydem sygnałowym karbnksnpeptyUezn lub peptydem sygnałowym genu BAR1 drożdży.
  19. 20. Sposób wawłuł zazast. 1 . znamienny y y (n , że w nynleyetrnule z^spry mowanym w etapie /c/ peptyd ledezowy jest naturalnym peptydem l^e^wym, taPem jak peptyd ledeznwy czynnika O ·
  20. 21. Sposób z nat^, 1 1 znamienny ty,, ze w polipże teZynl ekspzynnealym w etapie /c/ peptyd leUdznwn jest syntetycznym yeptyUem lideznenm taPem jak ,
    A. Al a-Pro -V a l -Tiu-G ly -As p -G lu-Se r-Ser-V al -Glu-Il e -Pr o -G luGlu-Ser-Leu-Ile—Gly-Phe-Leu-Asp-Leu-Ala-Gly-Glu-Glu-IleAla-Glu-Asn-Thr-Thr-Leu-Ala
    B. Ala-Ho-Yal-rh^-Gly “Asp-Glu-Ser-eSer-Yal-Gilu-Ile-Pro-GluGlu-Ser-Leu-Ile-Ile-Ala-Glu-Asn-Tłir-Thr-Leu-Ala
    C. Ala-Pro-Val-Thr-Gly-Asp-Glu-Ser-Ser-Val-Glu-Ile-Pro-IleAla-Glu-Asn-Thr-Thr-Leu-Ala
    D. Ala-Pro-Yal-TT-h-Gll-Asp-G lu-Serr-er-Val--lu-He-Pro-GluGlu-Ser-Leu-Ile-Ile-Ala-Glu-Asn-Thr-Thr-Leu-Ala-Asn-ValAla-Met-Ala i
    E. GlnsPΓOsVal-ThrsGly-AspsGluseer-SersValsGlu-Ile-Pro-GluGlu-Sθr-LeusIle-Ile-AlaSGlus-4s ·^'^)hIsf^lar-]LeusAlasAsnsVals
    Ala-Met-Ala.
    163 532
  21. 22. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że białko lub peptyd heterologiczny wybrany Jest z grupy obejmującej aprotyninę lub inne inhibitory proteaz, insuliny i Jej prekursory ludzkie lub bydlęcy hormon wzrostu, interleukinę, tkankowy aktywator plazminogenu, glukagony, czynnik VII, czynnik VIII, czynnik XIII, płytkowy czynnik wzrostu, enzymy i funkcyjne analogi każdego z tych białek.
  22. 23. Sposób według zastrz. 22, znamienny tym, że białko lub peptyb het-rologiczny jest aprotyning lub jej funkcyjnym analogem..
  23. 24. Sposób według ^^^trz. 23, znamienny tym, że χ. w polipeptydzie w etapie /c/ jest Glu-Arg-Leu-Glu lub Lys-Glu-Leu-Glu.
  24. 25. Sposób według zz8te^r 03, znamienny tym, e. X Jeet Gto-Leu eub Glu-Leu-Asp-Lau.
  25. 26. Sposób według zas^z. 22, znamienny -bym, że Diałkee. lub polipeptydea hatarologicznym jest insulina, prekursor insuliny lub ich funkcyjny analog.
  26. 27. Sposób weweug g rstezr .62 znamienny ty”, e. χ1 w poli eksprymkdanym w etapie /c/ jest Glu-Arg-Leu-Glu lub Lys-Glu-Leu-Glu.
  27. 28. Sposób weclług zratezr .62 znamienny t y m, zo 4 Jest Glu.
  28. 29. Sposób według zastrz. 26 albo 27 albo 28, znamienny tym, że białkiem lub polipeptydem heterologicmym jest prekursor analogu insuliny B/1-29/yAlaAlaLysyA/ 1-29/, w którym χ1 jest Lys-Glu-Leu-Glu.
  29. 30. Sposób według zast^. 26 albo 27 albo 28, znamienny tym, że białkiem lub polipeptydem hete^^gicm^ jest prekursor analogu insuliny B/1-29/ySerAspAsp AlαLtβ-A/1y29/, w którym χ1 jest Lys-Glu-Leu-Glu.
  30. 31. Sposób wewedg g zastrz b, znamienny tym, zo sekwencja ONA. włączona do wektora w etapie /a/ jest sekwencją ONA przedstawiony na fig. 4, 7, 9 lub 11 lub ich odpowiednią modyfikacją.
PL90284146A 1989-03-03 1990-03-02 Sposób wytwarzania heterologicznych bialek lub polipeptydów PL PL PL PL PL PL PL PL163532B1 (pl)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DK105489A DK105489D0 (da) 1989-03-03 1989-03-03 Polypeptid
DK494189A DK494189D0 (da) 1989-10-06 1989-10-06 Polypeptid

Publications (1)

Publication Number Publication Date
PL163532B1 true PL163532B1 (pl) 1994-04-29

Family

ID=26065137

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL90284146A PL163532B1 (pl) 1989-03-03 1990-03-02 Sposób wytwarzania heterologicznych bialek lub polipeptydów PL PL PL PL PL PL PL

Country Status (23)

Country Link
US (3) US5395922A (pl)
EP (1) EP0461165B2 (pl)
JP (1) JP2609367B2 (pl)
KR (1) KR970005928B1 (pl)
AT (1) ATE110414T1 (pl)
AU (1) AU624694B2 (pl)
CA (1) CA2050336C (pl)
CZ (1) CZ285239B6 (pl)
DD (1) DD296965A5 (pl)
DE (1) DE69011853T3 (pl)
DK (2) DK105489D0 (pl)
ES (1) ES2062514T5 (pl)
FI (1) FI104985B (pl)
HU (2) HU215538B (pl)
IE (1) IE66469B1 (pl)
IL (1) IL93609A (pl)
NO (2) NO304236B1 (pl)
NZ (1) NZ232742A (pl)
PL (1) PL163532B1 (pl)
RU (1) RU2194758C2 (pl)
UA (1) UA27706C2 (pl)
WO (1) WO1990010075A1 (pl)
ZA (1) ZA901476B (pl)

Families Citing this family (72)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5591603A (en) * 1987-08-28 1997-01-07 Novo Nordisk A/S Process for preparing aprotinin and aprotinin analogs in yeast cells
DK105489D0 (da) * 1989-03-03 1989-03-03 Novo Nordisk As Polypeptid
EP0472658A4 (en) * 1989-05-19 1992-08-26 Biotechnology Res & Dev Fusion proteins having an in vivo post-translational modification site and methods of manufacture and purification
GB9015825D0 (en) * 1990-07-18 1990-09-05 Ciba Geigy Ag In vitro processing of fusion proteins
DK300090D0 (da) * 1990-12-19 1990-12-19 Novo Nordisk As Fremgangsmaade til fremstilling af leadersekvenser
GB9106185D0 (en) * 1991-03-22 1991-05-08 Wellcome Found Biological control agents
FR2686899B1 (fr) * 1992-01-31 1995-09-01 Rhone Poulenc Rorer Sa Nouveaux polypeptides biologiquement actifs, leur preparation et compositions pharmaceutiques les contenant.
FI92601C (fi) * 1992-03-11 1994-12-12 Marja Makarow Menetelmä hyötyproteiinien erittämiseksi hiivoista
US5521086A (en) * 1993-09-16 1996-05-28 Cephalon, Inc. Secretion sequence for the production of a heterologous protein in yeast
DE4417353A1 (de) * 1994-05-18 1996-01-25 Bayer Ag Verfahren zur Herstellung von rekombinantem Aprotinin und rekombinanten Aprotinin Varianten mit der natürlichen N-terminlaen Sequenz
US6500645B1 (en) 1994-06-17 2002-12-31 Novo Nordisk A/S N-terminally extended proteins expressed in yeast
ZA954983B (en) * 1994-06-17 1996-02-14 Novo Nordisk As N-terminally extended proteins expressed in yeast
US5861267A (en) * 1995-05-01 1999-01-19 Vertex Pharmaceuticals Incorporated Methods, nucleotide sequences and host cells for assaying exogenous and endogenous protease activity
ZA9610456B (en) * 1995-12-20 1997-06-20 Novo Nordisk As N-terminally extended proteins expressed in yeast
US5851800A (en) * 1996-05-14 1998-12-22 Pharmacia & Upjohn Ab Process for producing a protein
DE19629982A1 (de) 1996-07-25 1998-01-29 Bayer Ag Aprotinin-Varianten mit verbesserten Eigenschaften
JP4341859B2 (ja) 1996-12-13 2009-10-14 ノバルティス バクシンズ アンド ダイアグノスティックス， インコーポレーテッド 酵母での異種タンパク質の発現の方法
AU7873798A (en) * 1996-12-20 1998-07-17 Novo Nordisk A/S N-terminally extended proteins expressed in yeast
AU5549998A (en) * 1997-01-24 1998-08-18 Novo Nordisk A/S Synthetic leader peptide sequences
US6046000A (en) * 1997-11-07 2000-04-04 Millennium Biotherapeutics, Inc. Method for identifying genes encoding signal sequences
EP1049790A1 (en) 1998-01-23 2000-11-08 Novo Nordisk A/S Process for making desired polypeptides in yeast
RU2002120513A (ru) 1999-12-29 2004-03-27 Ново Нордиск А/С (DK) Способ производства предшественников инсулина и аналогов предшественников инсулина с повышенным выходом ферментации у дрожжей
US20050100991A1 (en) * 2001-04-12 2005-05-12 Human Genome Sciences, Inc. Albumin fusion proteins
US6926898B2 (en) * 2000-04-12 2005-08-09 Human Genome Sciences, Inc. Albumin fusion proteins
US20050054051A1 (en) * 2001-04-12 2005-03-10 Human Genome Sciences, Inc. Albumin fusion proteins
US7507413B2 (en) * 2001-04-12 2009-03-24 Human Genome Sciences, Inc. Albumin fusion proteins
US7595172B2 (en) 2001-07-24 2009-09-29 Novo Nordisk A/S Method for making acylated polypeptides
ES2500918T3 (es) * 2001-12-21 2014-10-01 Human Genome Sciences, Inc. Proteínas de fusión de albúmina e interferón beta
EP1463752A4 (en) 2001-12-21 2005-07-13 Human Genome Sciences Inc ALBUMIN FUSION PROTEINS
EP1604008B1 (en) 2002-09-13 2010-12-22 Cornell Research Foundation, Inc. Using mutations to improve aspergillus phytases
CA2513213C (en) 2003-01-22 2013-07-30 Human Genome Sciences, Inc. Albumin fusion proteins
WO2005047508A1 (en) 2003-11-14 2005-05-26 Novo Nordisk A/S Processes for making acylated insulin
JP5697831B2 (ja) 2003-12-03 2015-04-08 ノヴォ ノルディスク アー／エス 単鎖インシュリン
EP1917363B1 (en) 2005-08-16 2011-06-22 Novo Nordisk A/S Method for making mature insulin polypeptides
DE602007009496D1 (de) 2006-02-27 2010-11-11 Novo Nordisk As Insulinderivate
US8198046B2 (en) 2006-07-11 2012-06-12 Danisco Us Inc. KEX2 cleavage regions of recombinant fusion proteins
US20080026376A1 (en) * 2006-07-11 2008-01-31 Huaming Wang KEX2 cleavage regions of recombinant fusion proteins
WO2008034881A1 (en) 2006-09-22 2008-03-27 Novo Nordisk A/S Protease resistant insulin analogues
EP2069502B1 (en) 2006-09-27 2014-02-26 Novo Nordisk A/S Method for making maturated insulin polypeptides
ES2425413T3 (es) 2006-11-22 2013-10-15 Novo Nordisk A/S Método para preparar carboxipeptidasa activada
CN101743252A (zh) 2007-07-16 2010-06-16 诺沃-诺迪斯克有限公司 蛋白酶稳定化的、peg化的胰岛素类似物
EP2178909B1 (en) 2007-08-13 2015-10-21 Novo Nordisk A/S Rapid acting insulin analogues
JP5721432B2 (ja) 2007-08-15 2015-05-20 ノボ・ノルデイスク・エー／エス アミノ酸含有アルキレングリコール反復単位を含むアシル部を有するインスリン
EP2178912B1 (en) 2007-08-15 2015-07-08 Novo Nordisk A/S Insulin analogues with an acyl and aklylene glycol moiety
US8501449B2 (en) 2007-12-04 2013-08-06 Proteon Therapeutics, Inc. Recombinant elastase proteins and methods of manufacturing and use thereof
JP5749155B2 (ja) 2008-03-18 2015-07-15 ノボ・ノルデイスク・エー／エス プロテアーゼ安定化アシル化インスリンアナログ
EP2262539B1 (en) 2008-04-01 2015-07-15 Novo Nordisk A/S Insulin albumin conjugates
US8575322B2 (en) * 2009-03-12 2013-11-05 Bigtec Private Limited Polynucleotide and polypeptide sequence and methods thereof
ES2440289T3 (es) 2009-06-26 2014-01-28 Novo Nordisk A/S Preparación que comprende insulina, nicotinamida y arginina
US8815541B2 (en) 2009-11-25 2014-08-26 Novo Nordisk A/S Method for making polypeptides
CN102791730A (zh) 2010-01-22 2012-11-21 诺沃—诺迪斯克有限公司 低度o-糖基化的fgf21的制备方法
US8853155B2 (en) 2010-06-23 2014-10-07 Novo Nordisk A/S Insulin derivatives containing additional disulfide bonds
EP2585484A1 (en) 2010-06-23 2013-05-01 Novo Nordisk A/S Insulin analogues containing additional disulfide bonds
EP2585483A1 (en) 2010-06-23 2013-05-01 Novo Nordisk A/S Human insulin containing additional disulfide bonds
CN103249427A (zh) 2010-12-14 2013-08-14 诺沃—诺迪斯克有限公司 速效胰岛素联合长效胰岛素
RU2013130374A (ru) 2010-12-14 2015-01-20 Ново Нордиск А/С Препарат, содержащий инсулин, никотинамид и аминокислоту
US9260503B2 (en) 2011-06-15 2016-02-16 Novo Nordisk A/S Multi-substituted insulins
RU2460795C1 (ru) * 2011-07-06 2012-09-10 Федеральное государственное унитарное предприятие "Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов" (ФГУП "ГосНИИгенетика") Способ микробиологического синтеза секретируемого соматотропина человека и штамм дрожжей saccharomyces cerevisiae - продуцент секретируемого соматотропина человека
WO2013186138A1 (en) 2012-06-14 2013-12-19 Novo Nordisk A/S Preparation comprising insulin, nicotinamide and arginine
CA2890048C (en) 2012-12-03 2022-05-03 Merck Sharp & Dohme Corp. O-glycosylated carboxy terminal portion (ctp) peptide-based insulin and insulin analogues
CN103254277B (zh) 2013-05-03 2017-02-08 南京工业大学 强分泌性信号肽增强小肽模序及其应用
EP3004156A1 (en) 2013-06-07 2016-04-13 Novo Nordisk A/S Method for making mature insulin polypeptides
PL233560B1 (pl) 2014-12-05 2019-10-31 Mabion Spolka Akcyjna Sposób otrzymywania insuliny lub analogu insuliny z prekursora rekombinowanego białka
WO2016144658A1 (en) 2015-03-10 2016-09-15 Merck Sharp & Dohme Corp. Process for preparing recombinant insulin using microfiltration
CN107743494B (zh) 2015-06-02 2022-04-29 诺和诺德股份有限公司 具有极性重组延伸体的胰岛素
CN108026156A (zh) 2015-08-25 2018-05-11 诺和诺德股份有限公司 新型胰岛素衍生物及其医学用途
US20180244743A1 (en) 2015-08-25 2018-08-30 Novo Nordisk A/S Novel Insulin Derivatives and the Medical Uses Hereof
EP3341403B1 (en) 2015-08-25 2022-01-05 Novo Nordisk A/S Novel insulin derivatives and the medical uses hereof
KR102043067B1 (ko) * 2017-08-08 2019-11-11 엘지전자 주식회사 차량용 사이드 미러 및 차량
BR112020002364A2 (pt) 2017-08-17 2020-09-01 Novo Nordisk A/S derivado de insulina, produto intermediário, uso de um derivado de insulina, e, métodos para o tratamento ou prevenção de diabetes, diabetes do tipo 1, diabetes do tipo 2, tolerância à glicose comprometida, hiperglicemia, dislipidemia, obesidade, síndrome metabólica, hipertensão, distúrbios cognitivos, aterosclerose, infarto do miocárdio, acidente vascular cerebral, distúrbios cardiovasculares, doença cardíaca coronariana, síndrome intestinal inflamatória, dispepsia, hipotensão ou úlceras gástricas, e para determinar a seletividade de um composto de insulina
RS65822B1 (sr) 2019-12-11 2024-09-30 Novo Nordisk As Novi insulinski analozi i njihova upotreba
WO2023144240A1 (en) 2022-01-26 2023-08-03 Novo Nordisk Research Centre Oxford Limited Glucose sensitive insulin derivatives and uses thereof

Family Cites Families (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU5712580A (en) * 1979-04-05 1980-10-09 James Joseph Connell Engine charging and scavenging
US4546082A (en) * 1982-06-17 1985-10-08 Regents Of The Univ. Of California E. coli/Saccharomyces cerevisiae plasmid cloning vector containing the alpha-factor gene for secretion and processing of hybrid proteins
JPS60501140A (ja) * 1983-04-22 1985-07-25 アムジエン 酵母による外因性ポリペプチドの分泌
US4588684A (en) * 1983-04-26 1986-05-13 Chiron Corporation a-Factor and its processing signals
DK58285D0 (da) * 1984-05-30 1985-02-08 Novo Industri As Peptider samt fremstilling og anvendelse deraf
JPS61264000A (ja) * 1985-03-21 1986-11-21 イミユネツクス　コ−ポレイシヨン 標識ペプチドによるタンパク質の合成
AU5912586A (en) * 1985-06-20 1986-12-24 Salk Institute Biotechnology/Industrial Associates, Inc., The Alpha-factor leader peptide-facilitated secretion from transformed s cerevisiae
MC1834A1 (fr) * 1986-07-10 1988-06-03 Transgene Sa Bloc fonctionnel d'adn et plasmide codant pour l'hirudine,levure transformee,procede de preparation de l'hirudine,hirudine obtenue et son utilisation
DK175535B1 (da) * 1987-03-04 2004-11-29 Daiichi Suntory Pharma Co Ltd Fremgangsmåde til fremstilling af et fysiologisk aktivt cysteinholdigt peptid
EP0371041A1 (en) * 1987-06-24 1990-06-06 Novo Nordisk A/S A process for preparing a protein or polypeptide, a dna sequence coding for the polypeptide, a microorganism containing the dna sequence as well as the polypeptide and its use as a pharmaceutical preparation
DK450187D0 (da) * 1987-08-28 1987-08-28 Novo Industri As Fremgangsmaade til fremstilling af proteiner
DK463887D0 (da) * 1987-09-07 1987-09-07 Novo Industri As Gaerleader
JPH01240191A (ja) * 1988-02-16 1989-09-25 Green Cross Corp:The 酵母で機能する新規シグナルペプチドおよびこれを用いた異種蛋白質の分泌発現
DK336188D0 (da) * 1988-06-20 1988-06-20 Nordisk Gentofte Propeptider
WO1990001063A1 (en) * 1988-07-23 1990-02-08 Delta Biotechnology Limited New secretory leader sequences
DK105489D0 (da) * 1989-03-03 1989-03-03 Novo Nordisk As Polypeptid

Also Published As

Publication number Publication date
HU211600A9 (en) 1995-12-28
IE900749L (en) 1990-09-03
US5395922A (en) 1995-03-07
CA2050336A1 (en) 1990-09-04
ES2062514T3 (es) 1994-12-16
HU215538B (hu) 1999-01-28
NZ232742A (en) 1991-10-25
NO974899L (no) 1997-10-23
FI104985B (fi) 2000-05-15
IE66469B1 (en) 1995-12-27
FI914125A0 (fi) 1991-09-02
JPH04504846A (ja) 1992-08-27
WO1990010075A1 (en) 1990-09-07
HUT58370A (en) 1992-02-28
CZ285239B6 (cs) 1999-06-16
ES2062514T5 (es) 1998-06-01
IL93609A (en) 2001-11-25
CA2050336C (en) 2000-01-18
EP0461165A1 (en) 1991-12-18
DE69011853D1 (de) 1994-09-29
JP2609367B2 (ja) 1997-05-14
US5510249A (en) 1996-04-23
EP0461165B2 (en) 1998-03-25
UA27706C2 (uk) 2000-10-16
ZA901476B (en) 1990-11-28
AU624694B2 (en) 1992-06-18
NO304236B1 (no) 1998-11-16
EP0461165B1 (en) 1994-08-24
DK105489D0 (da) 1989-03-03
DK0461165T3 (da) 1994-11-21
ATE110414T1 (de) 1994-09-15
IL93609A0 (en) 1990-12-23
NO913427D0 (no) 1991-09-02
DE69011853T3 (de) 1998-06-25
KR970005928B1 (ko) 1997-04-22
HU902376D0 (en) 1991-11-28
KR920701452A (ko) 1992-08-11
DD296965A5 (de) 1991-12-19
DE69011853T2 (de) 1994-12-15
US5514585A (en) 1996-05-07
CZ103990A3 (cs) 1999-03-17
NO974899D0 (no) 1997-10-23
NO913427L (no) 1991-11-01
AU5261290A (en) 1990-09-26
RU2194758C2 (ru) 2002-12-20

Similar Documents

Publication Publication Date Title
PL163532B1 (pl) Sposób wytwarzania heterologicznych bialek lub polipeptydów PL PL PL PL PL PL PL
JP3730255B2 (ja) イーストにおいて発現されたｎ末端に伸長した蛋白質
JP3676369B2 (ja) 合成リーダーペプチド配列類
FI104564B (fi) Peptidi ja DNA-sekvenssit
JP2001527387A (ja) 合成リーダーペプチド配列
PL178924B1 (pl) Konstrukt DNA, zrekombinowany wektor ekspresji, komórka transformowana i sposób wytwarzania heterologicznego polipeptydu
HU206518B (en) Process for producing new insuline analogues and pharmaceutical compositions containing them
JPH08503858A (ja) 生物活性ポリペプチド融合ダイマー
ES2258797T3 (es) Proteinas con extension n-terminal expresadas en la levadura.
ZA200305867B (en) Supersecretable peptides, processes for their production, and parallel improvement of the secreted form of one or more other polypeptides.
AU2002247696A1 (en) Use of supersecretable peptides in processes for their production and for parallel improvement of the exported forms of one or more other polypeptides
EP0868523B1 (en) Vector for expression of n-terminally extended proteins in yeast cell
PT96310B (pt) Processo para a preparacao do promotor de transcricao da piruvato-cinase de a.niger, vectores hibridos que o contem e hospedeiros transformados com estes vectores
CA2047119C (en) Vitro processing of fusion proteins
PL201350B1 (pl) Sposób wytwarzania pożądanego polipeptydu lub białka w drożdżach
CZ20015A3 (cs) Rekombinantní exprimovaný kvasinkový vektor, způsob jeho získávání a transformovaná kvasinková buňka
JPH0383586A (ja) 新規生理活性ポリペプチド

Legal Events

Date Code Title Description
LAPS Decisions on the lapse of the protection rights

Effective date: 20060302