JPH08503858A - 生物活性ポリペプチド融合ダイマー - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、２つ以上のモノマーサブユニットが単一のポリペプチド（「融合マルチマー」）として互いに連鎖している生物学的に活性なマルチマーポリペプチド分子を提供する。これらの融合マルチマーは、ポリペプチドの生物学的に活性なマルチマー形態を産生するために必要とされる反応が二次以上のものではなく一次反応速度で進行するために、非融合マルチマーに比べてより容易且つ速やかに折りたたまれる。融合マルチマーはさらに、復元の間に不要なポリペプチド副生成物が同時形成されることを防ぐ。本発明の融合マルチマーは特異的にＰＤＧＦ融合ダイマーを含む。

Description

【発明の詳細な説明】 生物活性ポリペプチド融合ダイマー 背景 ヒト血小板由来成長因子（“ＰＤＧＦ”）は、結合組織細胞に作用する主要な 血清中有糸分裂誘発性成長因子であると考えられる。ＰＤＧＦの有糸分裂誘発活 性は多くの研究で実証されており、その際ＰＤＧＦは動脈平滑筋細胞、線維芽細 胞系及びグリア細胞における有糸分裂生起に正の影響を及ぼすことが判明した。 Ｄｅｕｅｌ等，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５６（１７），ｐｐ．８８９６−８ ８９９，１９８１参照。Ｈｅｌｄｉｎ等，Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．１０ ５ ，ｐ．２３５，１９８０（脳グリア細胞）；Ｒａｉｎｅｓ及びＲｏｓｓ，Ｊ． Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５７ ，ｐ．５１５４，１９８２（サル動脈平滑筋細胞） なども参照されたい。ＰＤＧＦはまた、線維芽細胞、平滑筋細胞、単球及び顆粒 球に作用する化学走性誘因物質であるとも考えられる。ＰＤＧＦは、結合組織創 傷の部位において有糸分裂生起を誘発する能力も、また前記のような部位に線維 芽細胞を誘因する能力も明らかに有するので、損傷もしくは外傷を生じた結合組 織の修復における治療用途に適した特別の潜在能力 を有すると考えられる。 ＰＤＧＦ群に属する他の成長因子に、血管内皮細胞成長因子（“ＶＥＧＦ”； 時に“血管透過性因子”即ち“ＶＰＦ”とも呼称）及び胎盤成長因子（“ＰＬＧ Ｆ”）が含まれる。Ｔｉｓｃｈｅｒ等，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｅｏｐｈｙｓ．Ｒｅ ｓ．Ｃｏｍｍ．１６５（３） ，ｐｐ．１１９８−１２０６，１９８９及びＭａｇ ｌｉｏｎｅ等，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８８，ｐｐ． ９２６７−９２７１，１９９１をそれぞれ参照。ＶＥＧＦ及びＰＬＧＦはいずれ も、ＰＤＧＦ群に属するこれらの成長因子の各モノマー単位のＰＤＧＦ相同領域 に出現する、高度に保たれた８個のシステイン残基からジスルフィド結合ダイマ ーを構成する。Ｔｉｓｃｈｅｒ等及びＭａｇｌｉｏｎｅ等の上掲文献参照。また 、ＶＥＧＦ及びＰＬＧＦのレセプターはＰＤＧＦレセプターと同じレセプター亜 群に属する。従って、これらの“比較的新しい”ＰＤＧＦ群所属成長因子は、Ｐ ＤＧＦほど広範に研究されてはいないが、創傷修復において治療物質として潜在 的に有用であると考えられる。 天然ＰＤＧＦは２本のポリペプチド鎖、即ち“Ａ”鎖及 び“Ｂ”鎖を有するジスルフィド結合ダイマーであり、Ａ鎖はＢ鎖に対して約６ ０％相同である。天然ＰＤＧＦは３種のダイマー形態で見出され、即ちＰＤＧＦ −ＡＢヘテロダイマーか、ＰＤＧＦ−ＢＢホモダイマーか、またはＰＤＧＦ−Ａ Ａホモダイマーである。Ｈａｎｎｉｎｋ等， Ｍｏｌ．ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．６ ，ｐｐ．１３０４―１３１４，１９８６参照。主要な天然形態として同定された のはＰＤＧＦ−ＡＢであるが、創傷治癒研究において最も広く用いられているの はＰＤＧＦ−ＢＢホモダイマーである。生物活性ダイマーの各モノマーサブユニ ットは、Ａ鎖モノマーであろうとＢ鎖モノマーであろうと関係なく８個のシステ イン残基を有する。これらのシステイン残基のうちの幾つかが、ダイマーを一体 的に保持する鎖間ジスルフィド結合を形成する。 ヒト血小板中に見出されるＰＤＧＦ−Ｂは、２４１アミノ酸前駆ポリペプチド の１０９アミノ酸開裂物（ＰＤＧＦ−Ｂ₁₀₉）として同定された。Ｊｏｈｎｓｓ ｏｎ等，ＥＭＢＯ Ｊｏｕｒｎａｌ ３（５），ｐｐ．９２１−９２８，１９８ ４参照。この１０９アミノ酸相同配列は、ｃ−ｓｉｓによってコードされるＰＤ ＧＦ−Ｂ前駆タンパ ク質の１０９アミノ酸開裂物に一致し、ヒトのＰＤＧＦの成熟形態であると多く の人々によって考えられている。ｃ―ｓｉｓによってコードされる前駆タンパク 質との相同性は、２４１アミノ酸前駆タンパク質のアミノ酸８２から始まってア ミノ酸１０９個分続く。ｃ−ｓｉｓによってコードされるＰＤＧＦ−Ｂ前駆タン パク質の最初の１１９個のアミノ酸に対応する別の形態のＰＤＧＦ−Ｂ（ＰＤＧ Ｆ―Ｂ₁₁₉）も、トランスフェクト哺乳動物宿主においてｃ―ｓｉｓ遺伝子の全 体が発現する場合の、ｃ−ｓｉｓによってコードされる前駆タンパク質の主要な 開裂物として同定された。米国特許第５，１４９，７９２号参照。成熟形態のＰ ＤＧＦ−Ｂのアミノ酸１３〜９９に対応する領域は“ＰＤＧＦ相同領域”と呼称 されている。Ｔｉｓｃｈｅｒ等及びＭａｇｌｉｏｎｅ等の上掲文献を参照された い。 組み換えＰＤＧＦが哺乳動物、酵母及び細菌（大腸菌）宿主細胞において作製 された。ヨーロッパ特許第０２８２３１７号（哺乳動物宿主細胞）、米国特許第 ４，７６６，０７３号（酵母宿主細胞）及び同第５，１４９，７９２号（大腸菌 宿主細胞）を参照されたい。哺乳動物及び酵母宿主細胞はいずれもｉｎ ｖｉｖ ｏ でモノマーサブユニット からダイマー分子を、該タンパク質がその生物活性ダイマー形態で発現されるよ うに構成する。他方、大腸菌などの細菌宿主細胞はＰＤＧＦモノマーを合成する 。合成されたそれら個別のモノマーサブユニットは、所望のダイマー形態のポリ ペプチドを得るべく単離及び復元し、更にｉｎ ｖｉｔｒｏで加工しなければな らない。 より高度に発達した哺乳動物及び酵母宿主細胞系はマルチマーポリペプチドを その生物活性マルチマー形態で産生する能力を有するので望ましいが、所望の組 み換え産物の分泌レベルは細菌宿主細胞の分泌レベルに比較して低い。大腸菌な どの細菌系はより高発現性であるが、その代わりより高収量の組み換え産物を得 るために組み換えタンパク質を封入体から単離しなければならず、かつＰＤＧＦ のようなマルチマータンパク質の場合、生物活性産物を生じさせるべく復元しな ければならない。 ヨーロッパ特許第０４６０１８９号に開示されたものなど、最近開発された復 元方法は細菌宿主細胞でのＰＤＧＦ生産の望ましさを高めたが、（比較的高次の 反応速度に起因する）復元の間の収量低下、及びヘテロダイマー、または同じＰ ＤＧＦ鎖の異なる類似サブユニットを有するホモ ダイマーを復元する場合の望ましくないポリペプチド副産物の生成がなお障害と して残る。（例えば上掲ヨーロッパ特許第０４６０１８９号を参照されたい。こ の文献では、２個の異なるトランスフェクト細菌宿主細胞から得たＰＤＧＦ−Ａ 及びＰＤＧＦ−Ｂモノマーサブユニットの復元によってＰＤＧＦ−ＡＢヘテロダ イマーを生成させたが、ホモダイマーのＰＤＧＦ−ＡＡ及びＰＤＧＦ−ＢＢ副産 物も生成した）。 本発明は、改善された復元速度を有するマルチマーポリペプチドを提供するこ とを目的とする。 本発明はまた、望ましくないポリペプチド副産物の生成を伴わずに組み換え技 術によって生成させ得るマルチマーポリペプチドの提供も目的とする。発明の概要 本発明は、天然マルチマータンパク質の少なくとも２個のモノマーポリペプチ ドサブユニットを互いに連結して１個のポリペプチド（“融合マルチマー”）と した生物活性ポリペプチド分子を提供する。このポリペプチドは好ましくは、Ｐ ＤＧＦ群に由来するダイマーポリペプチドである。本発明の融合マルチマーは非 融合マルチマーより容易かつ 急速に復元され、なぜなら生物活性マルチマー形態のポリペプチドの生成に必要 な反応が二次以上ではなく一次の反応速度で進行するからである。本発明の融合 マルチマーはまた、復元時の望ましくないポリペプチド副産物の同時生成を排除 する。本発明の融合マルチマーの個々のサブユニットは互いに縦列式に連結され る。個々のサブユニットは互いに直接連結されても、スペーサー部分を介して連 結されてもよい。 本発明は、互いに縦列式に連結されて１個の連続するポリペプチドを構成する 融合マルチマーの各モノマーサブユニットそれぞれのコーディング配列を有する ＤＮＡ配列で宿主細胞をトランスフェクトすることにより生物活性融合マルチマ ーを作製する方法も提供する。図面の簡単な説明 図１は、ＰＤＧＦ−Ｂ₁₁₉サブユニットをＰＤＧＦ−Ｂ₁₀₉サブユニットに、Ｐ ＤＧＦ−Ｂ前駆タンパク質のプレプロ領域のアミノ酸−５４〜−１から成るスペ ーサーを介して連結したＰＤＧＦ融合ダイマーのアミノ酸配列である。 図２は図１に示したＰＤＧＦ−Ｂ₁₁₉Ｂ₁₀₉融合ダイマーの産生をコードする発 現プラスミドの構築に用いるステッ プの説明図である。 図３はＰＤＧＦ−Ｂ₁₁₉に関する核酸コーディング配列である。 図４はＰＤＧＦ−Ｂ前駆タンパク質の全プレプロ領域（８１アミノ酸）に後続 するＰＤＧＦ−Ｂ₁₀₉に関する核酸コーディング配列である。 図５はそのアミノ酸配列を図１に示したＰＤＧＦ−Ｂ₁₁₉Ｂ₁₀₉融合ダイマーの 電気泳動ゲルの写真である。 図６はＰＤＧＦ−Ｂ₁₁₉Ｂ₁₀₉融合ダイマーの活性をＰＤＧＦ−Ｂ₁₁₉と比較し て示すグラフである。発明の詳細な説明 本発明は、天然マルチマータンパク質の少なくとも２個のモノマーポリペプチ ドサブユニットを互いに連結して１個のポリペプチド（“融合マルチマー”）と した生物活性ポリペプチド分子を提供する。好ましくは、この融合マルチマーは ＰＤＧＦ群に属する。 本発明の理解の一助となるように、本明細書中に用いた幾つかの語を次のよう に定義する。 “マルチマー”もしくは“マルチマー”ポリペプチドという語は、その天然の 生物活性形態において２個以上の機 能性ポリペプチドサブユニットを有するポリペプチド分子を意味する。機能性モ ノマーサブユニットはジスルフィド結合などを介して互いに共有結合し得るが、 マルチマーポリペプチドを還元条件下に置く、即ちジスルフィド結合を開裂させ ることによって分離可能である。 “ダイマー”もしくは“ダイマー”ポリペプチドという語は、その天然の生物 活性形態において２個の機能性サブユニットを有するポリペプチド分子を意味す る。 “モノマー”及び“モノマー”ポリペプチドもしくは“モノマー”サブユニッ トという語はマルチマーポリペプチドの１個のサブユニットを意味する。モノマ ーサブユニットは天然モノマーサブユニットの正確なコピーであり得、あるいは また生物活性な類似体か、または生物不活性な（インヒビター）類似体であり得 る。“還元”ポリペプチドは、融合ダイマーでないかぎり必ずモノマーであると 理解される。 “融合マルチマー”という語は、その天然生物活性形態においてマルチマーと して存在するが、構成モノマーサブユニットが互いに直接、またはスペーサー部 分を介して連結されて１個の連続するポリペプチドを構成するように加 工されたポリペプチドを意味する。 “融合ダイマー”という語は、その天然生物活性形態においてダイマーとして 存在するが、２個の構成モノマーサブユニットが互いに直接、またはスペーサー 部分を介して連結されて１個の連続するポリペプチドを構成するように加工され たポリペプチドを意味する。 本明細書中に用いた“ホモダイマー”という語は、各モノマーサブユニットが 同じ天然モノマーサブユニットと同一であるか、または同じ天然モノマーサブユ ニットの類似体であるダイマー分子を意味する。例えば、ＰＤＧＦは幾つかの成 熟形態を有することが知られている。従って、ＰＤＧＦ−Ｂ₁₀₉Ｂ₁₁₉ダイマーは モノマーサブユニット同士が厳密に同じではないが、ＰＤＧＦ−ＢＢホモダイマ ーと看做される。 “スペーサー部分”という語は、融合マルチマーにおいて２個のモノマーサブ ユニットを互いに隔てるポリペプチドアミノ酸配列を意味する。 “生物活性”ポリペプチドという語は、対応する天然ポリペプチドと同じ有糸 分裂誘発性生物活性、化学走化性生物活性、酵素性生物活性、及び／または他の 検出可能な生 物活性を有するポリペプチドを意味する。 “インヒビター”類似体または“インヒビター”ポリペプチドという語は、対 応する天然ポリペプチドの有糸分裂誘発性生物活性、化学走化性生物活性、酵素 性生物活性、及び／または他の検出可能な生物活性を抑制する生物不活性ポリペ プチドを意味する。 本明細書中に用いた“復元”という語は、変性し、還元し、または部分還元し たポリペプチドを生物活性構造に戻すことを意味する。復元には、変性形態で産 生されたポリペプチドに実際上初めて生物活性構造を付与する場合が含まれる。 “復元”という語は“折り畳み（ｆｏｌｄｉｎｇ）”という語と交換可能に用い 得る。 本明細書中に用いた“鎖間ジスルフィド結合”という語は、ダイマーポリペプ チドの２個のシステイン部分間に形成されたジスルフィド結合であって、ジスル フィド結合を形成するシステイン部分が異なるモノマーサブユニットに由来する ものを意味する。 本明細書中に用いた“鎖内ジスルフィド結合”という語は、ダイマーポリペプ チドの２個のシステイン部分間に形成されたジスルフィド結合であって、ジスル フィド結合を 形成するシステイン部分が同じモノマーサブユニットに由来するものを意味する 。 特に断らないかぎり、ＰＤＧＦとは、還元または非還元、生物活性または生物 不活性、組み換えまたはそれ以外のＰＤＧＦモノマー及び／またはダイマー並び にその類似体の任意の組み合わせのこととする。“ＰＤＧＦ”という語は、天然 ＰＤＧＦのアミノ酸配列の数及び／または同等性に一つ以上の改変を有するＰＤ ＧＦ類似体を包含するものとする。 “ＰＤＧＦ相同領域”という語は、天然ＰＤＧＦ−Ｂのアミノ酸１３からアミ ノ酸９９までのアミノ酸配列を意味する。 “ＰＤＧＦ群”という語は、ＰＤＧＦ相同領域に対して少なくとも約２０％の アミノ酸配列相同性を有し、かつＰＤＧＦ相同領域内の全部で８個のシステイン 残基を、それらのシステイン残基が高度に保たれるように有する天然ダイマーポ リペプチドを意味する。 本明細書中で、ＰＤＧＦ群内で“高度に保たれる”システイン残基とは、多数 のアミノ酸の付加または欠損に関して、ＰＤＧＦ群に属するポリペプチドのＰＤ ＧＦ相同配列 内のシステイン残基を天然ＰＤＧＦ−ＢのＰＤＧＦ相同領域内のシステイン残基 に対して正確に整列させるのに五つ以下の調節しか必要でないようなＰＤＧＦ相 同領域内のシステイン残基のことである。 “ＰＤＧＦ前駆タンパク質”という語は、プロセッシングによってポリペプチ ドをより短い成熟形態（例えばＰＤＧＦ−Ｂ₁₀₉及びＰＤＧＦ−Ｂ₁₁₉）とする以 前の、ｃ−ｓｉｓによってコードされる完全な２４１アミノ酸前駆タンパク質を 意味する。 “プレプロ”領域という語はＰＤＧＦ前駆タンパク質の、成熟ＰＤＧＦタンパ ク質のアミノ末端側に位置する部分を意味する。Ｄｅｖａｒｅ等のナンバリング システム（Ｄｅｖａｒｅ等，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８０ ，ｐ．７３２，１９８３）を用いると、上記プレプロ領域はアミノ酸−８１ からアミノ酸−１まで伸長し、アミノ酸１からアミノ酸１６０までである残りの アミノ酸配列を表わすアミノ酸は様々な成熟形態のＰＤＧＦ中に見出されるもの で、そのような成熟形態のＰＤＧＦのうちで最も普通のものがＰＤＧＦ−Ｂ₁₀₉ （アミノ酸１〜１０９）及びＰＤＧＦ−Ｂ₁₁₉（アミノ酸１〜 １１９）である。 本発明の融合マルチマーは、その天然生物活性形態においてマルチマーとして 存在するが、構成モノマーサブユニットが互いに直接、またはスペーサー部分を 介して連結されて１個の連続するポリペプチドを構成するように本発明の教示に 従い加工された任意のポリペプチドであり得る。 本発明の融合マルチマーは、復元時の望ましくないポリペプチド副産物の同時 生成を実質的に排除する。このことは、組み換えマルチマータンパク質の発現に 高発現性の細菌宿主細胞を用いる場合特に重要である。例えば、二つの異なる大 腸菌宿主株から発生したＰＤＧＦ−Ａ及びＰＤＧＦ−Ｂモノマーサブユニットか らＰＤＧＦ−ＡＢヘテロダイマーを復元する場合、望ましくないＰＤＧＦ−ＡＡ 及びＰＤＧＦ−ＢＢホモダイマー形態を所望のＰＤＧＦ−ＡＢヘテロダイマー生 成物から分離しなければならない。（上掲のヨーロッパ特許第０４６０１８９号 参照）。これに対して、本発明の教示に従いＰＤＧＦ−ＡＢ融合ヘテロダイマー を１個の連続するポリペプチドとして大腸菌から発現させると、上記のようなポ リペプチド副産物は生成しない。このことは大量のマルチマータンパク質の商業 生産にきわ めて有益である。 哺乳動物及び酵母宿主細胞においても同じことが有益であり得、なぜならこれ らの高レベル発現系も、マルチマータンパク質を生成させたい場合に状況次第で は望ましくないポリペプチド副産物を分泌することが知られているからである。 本発明の融合マルチマーは、上記望ましくない副産物の生成を実質的に排除する 。 本発明の融合マルチマーは非融合マルチマーより容易かつ急速に復元されると 予測され、なぜなら生物活性マルチマー形態の融合ポリペプチドの生成に必要な 反応は一次の反応速度で進行するからである。他方、非融合マルチマーポリペプ チドは典型的には二次以上の反応速度に従い復元される。所望のマルチマータン パク質をその生物活性構造に復元するのに必要な２個以上のサブユニットの一体 化に必要な力を低減できれば、復元は著しく促進されるはずである。 本発明の融合マルチマーは、インヒビターポリペプチドとして機能するように 加工することもできる。このような加工が可能であるのは、多くのマルチマーポ リペプチドが何等かの方法で２個以上の標的分子と同時に相互作用する ことにより機能するからである。融合マルチマーを、モノマーサブユニットとし て少なくとも１個のインヒビター類似体を有するように設計した場合、得られる マルチマーインヒビターポリペプチドは一度に２個以上ではなく１個の有効標的 分子と相互作用し得る。実現する“非生産的”相互作用は、天然生物活性形態の マルチマータンパク質との生産的相互作用に有効な標的分子の数を減少させ、そ の結果前記タンパク質はその正常な生物学的応答を行なうべく機能し得なくなる 。 “スペーサー”もしくは“スペーサ一部分”とも呼称する介在領域は、或る種 の融合マルチマーでは適正な折り畳みに必要であり、または必要でない。スペー サー部分は普通、スペーサーの存在が融合マルチマーの構成モノマーサブユニッ ト同士のより自由な相互作用を可能にし、その結果生物活性形態の折り畳まれた マルチマータンパク質を生成させると考えられる場合に用いる。 融合マルチマーをヒト用の治療物質として用いるつもりであり、かつスペーサ ー部分を存在させたい場合はスペーサー部分をヒトポリペプチドの中から選択す ることが好ましく、なぜならヒトポリペプチド配列は異種ポリペプチド 配列に比べて免疫反応を誘起する恐れがはるかに小さいからである。スペーサー 部分として用いるポリペプチド配列は、融合ダイマーの構成モノマーサブユニッ ト同士の必要な相互作用を妨害するほど長く邪魔な存在とならなければ、任意の アミノ酸数の長さを有し得る。他の残基（例えばシステイン残基）と相互作用す ることが知られているアミノ酸残基、及びアミノ酸配列中に異常な捩じれや回転 を創出しかねないアミノ酸を回避することも好ましい。 本発明の融合マルチマーは好ましくは、ＰＤＧＦ群に属するダイマーである。 更に好ましくは、融合ダイマーはＰＤＧＦ、ＶＥＧＦまたはＰＬＧＦのダイマー 形態である。更に好ましくは、融合ダイマーはＰＤＧＦのダイマー形態である。 最も好ましくは、本発明の融合マルチマーはＰＤＧＦ−ＢＢ融合ダイマーである 。好ましいＰＤＧＦ−ＢＢ融合ダイマーは生物活性ポリペプチドまたはインヒビ ターポリペプチドである。 ＰＤＧＦ融合ダイマーの場合、スペーサー部分は必要とは考えられない。それ にもかかわらず、ＰＤＧＦ融合ダイマー中にスペーサー部分を存在させることが 所望である場合は、ｃ−ｓｉｓによってコードされるＰＤＧＦ前駆タン ク質の部分の中から選択したスペーサー部分を用いることが好ましい。更に好ま しくは、スペーサー部分の選択はＰＤＧＦ前駆タンパク質の“プレプロ”領域か ら行なう。ＰＤＧＦ前駆タンパク質のプレプロ領域は該タンパク質のアミノ末端 部において、アミノ酸−８１に始まりアミノ酸―１に終わる。これはＰＤＧＦ前 駆タンパク質の、普通完全なｖ−ｓｉｓまたはｃ−ｓｉｓコーディング配列でト ランスフェクトされた宿主細胞によるプロセッシングの間に切り落とされる領域 であり、ＰＤＧＦ融合ダイマーの復元を妨害したり、該領域自体の好ましくない 特性を融合ダイマーに付与したりするとは考えられない。ＰＤＧＦ前駆タンパク 質のプレプロ領域がシステイン残基を一切有しないことは重要である。 ２個のＰＤＧＦ−Ｂ鎖を用い、これらをＰＤＧＦ前駆タンパク質の“プレプロ ”領域の一部から成るスペーサー部分を介して結合して、生物活性融合ダイマー を本発明に従い作製した。生物活性ＰＤＧＦ−ＢＢ融合ダイマーの生成にスペー サー部分が必要とは考えられないが、この特別の融合ポリペプチドは入手可能な 出発物質から都合よく作製され、かつ生物活性を示した。 後述の実施例において証明した、ＰＤＧＦ−ＢＢ融合ダイマーなどの融合マル チマーに生物活性が存在するということは、生物活性融合ダイマーを作製した先 例が無いという事実に照らして幾分意外であった。（アミノ末端に高発現タンパ ク質を用いた）融合タンパク質が、抗体応答を誘起する目的で生成させるポリペ プチドの発現を促進するうえで有効であることは知られているが、この融合タン パク質は生物活性を有する必要は無く、抗体によって認識されるエピトープを有 しさえすればよい。また、二つの異なるが関連するタンパク質を結合して１個の 融合タンパク質とすると、前記二つのタンパク質がその天然非融合形態において 互いに独立に機能する場合には観察されない相乗作用が生起し得ることが示唆さ れている。（Ｗｉｌｌｉａｍｓ及びＰａｒｋ，Ｃａｎｃｅｒ ６７，ｐｐ．２７ ０５―２７０７，１９９１；顆粒球マクロファージコロニー剌激因子及びインタ ーロイキン−３を融合タンパク質として調製）。しかし、天然では直接相互作用 して生物活性を示すはずの２個のモノマーサブユニットを互いに連結して１個の 連続するポリペプチドとし得、その際前記サブユニットは得られる融合マルチマ ーの生物活性に必要な、同 じ必須の相互作用を行なう能力をなお維持し得ることは示唆されていない。 本発明は更に、単一連続ポリペプチドをコードするように次から次へと連結さ れた（即ち、サブユニットが開始及び終結コドンによって分離されていない）マ ルチマーポリペプチドの各モノマーサブユニットの個々のコーディング配列を有 するＤＮＡ配列を用いて宿主細胞をトランスフェクトすることにより、生物学的 に活性な融合マルチマーを製造する方法を提供する。融合ダイマー産物中にスペ ーサー部分が所望であれば、スペーサー部分のコーディング配列を、構成モノマ ーサブユニットのコーディング配列間に挿入する。 本発明の融合マルチマーは通常は、当業者には公知の多数の組換えタンパク質 生産方法のいずれかにより製造し得る。多くの場合、融合ダイマーのモノマーサ ブユニットのコーディング配列は既に入手可能である。かかるサブユニットは、 スペーサーを含んでまたは含まずに、当業者には公知の標準結合技術を使用して ＤＮＡリンカーを介して容易に相互に結合し得る。また、ＤＮＡシークエネータ ーを使用して所望の融合マルチマーコーディング配列を合成する こともできる。融合ダイマーのコーディング配列を生成するのに使用される特定 の方法は一般的には出発材料の入手可能性を含む多数の実施要件に左右される。 融合マルチマー産物のコーディング配列を構築したならばそれをベクター中に挿 入し、当業者には公知の標準的な技法により、得られたベクターを使用して適当 な宿主細胞をトランスフェクトする。 ＰＤＧＦ−ＢＢ融合ホモダイマーの場合では、例えばまずｖ−ｓｉｓ遺伝子を 修飾してヒトの対応物ｃ−ｓｉｓを得るか、またはｃ−ｓｉｓを出発材料として 使用することができる。次いで２つの修飾されたコーディング配列を相互に結合 し、適当な開始及び終結コドンを置き、適当なベクター中に挿入し、それを使用 して所望の宿主細胞をトランスフェクトする。 或いは、ＰＤＧＦ−ＢＢ融合ホモダイマーコーディング配列を合成するか、ま たは、まずｃ−ｓｉｓ遺伝子または修飾ｖ−ｓｉｓ遺伝子をカルボキシ末端に近 い適当な制限部位で切断し、次いでＰＤＧＦ前駆体タンパク質コーディング配列 のカルボキシ末端を、使用される特定のベクター及び宿主細胞に好ましいコドン を使用して所望の末端部分 に再構築する。ｃ−ｓｉｓ遺伝子または修飾ｖ−ｓｉｓ遺伝子をアミノ末端に近 い適当な制限部位で切断し、やはり選択したベクター及び宿主細胞系に好ましい コドンを使用してアミノ末端を所望の開始部位に再構築することもできる。即ち 、合成方法と天然出発材料のin vitro突然変異誘発とを任意の組合せで使用し、 ＰＤＧＦ−ＢＢ融合ダイマーのごとき融合マルチマーを生成することができる。 本発明のＰＤＧＦ−ＢＢ融合ダイマーを生成する好ましい方法においては、ｖ −ｓｉｓ遺伝子を修飾してｃ−ｓｉｓ遺伝子を得るが、これをＰＤＧＦ−Ｂ前駆 体タンパク質コーディング配列と称する。次いでＰＤＧＦ−Ｂ前駆体タンパク質 コーディング配列を修飾し、ＰＤＧＦ−ＢＢ融合ダイマーの２つのモノマーユニ ットに所望のコーディング配列を得る。各モノマーユニットは全体で２４１アミ ノ酸からなるＰＤＧＦ−Ｂ前駆体タンパク質より小さいのが好ましい。これらの ユニットは同一でもよいし、若干異なってもよい。例えば、一方のモノマーサブ ユニットが１１９アミノ酸形態のＰＤＧＦ−Ｂであり、他方のサブユニットが１ ０９アミノ酸形態のＰＤＧＦ−ＢであるＰＤＧＦ−Ｂ₁₁₉Ｂ₁₀₉融合ホモダイマー を構築することができる。ＰＤ ＧＦ−ＢＢ融合ホモダイマーのモノマーユニットはＰＤＧＦ前駆体タンパク質の おおよそアミノ酸１から始まり、おおよそアミノ酸１０９とアミノ酸１１９の間 で終わるのが、必須ではないが、一般的に好ましい。所望の２つのモノマーサブ ユニットのコーディング配列を、スペーサーを含んでまたは含まずに、所望の位 置で相互に結合する。 ｖ−ｓｉｓ遺伝子は、本発明のＰＤＧＦ−ＢＢ融合ホモダイマーの所望のモノ マーサブユニットのコーディング配列を生成するのに使用し得る前駆体タンパク 質コーディング配列を得るのに優れた出発材料を与える。例えば、アミノ酸１〜 １１９をコードする領域においては、ｖ−ｓｉｓ遺伝子によってコードされるタ ンパク質とｃ−ｓｉｓにコードされるＰＤＧＦ−Ｂ前駆体タンパク質との間では ５つのアミノ酸の相違しかない。ｖ−ｓｉｓ遺伝子中のこれら５つのアミノ酸の うち２つは、in vitro突然変異誘発法によって変更し、これら２つのアミノ酸が ＰＤＧＦ−Ｂ前駆体タンパク質の対応残基と同じであるタンパク質をコードする ＤＮＡ配列を生成することができる。多数のＤＮＡin vitro突然変異誘発方法を 、コドン１０１及び１０７に所望の変更を導入するために使用し得る。かかる方 法は当業 者には公知である。例えばＥｃｋｓｔｅｉｎ及び協同研究者（Ｔａｙｌｏｒら， Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１３，８７６４−８７８５（１９８５）；Ｎ ａｋａｍａｅ及びＥｃｋｓｔｅｉｎ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１４， ９６７９−９６９８（１９８６））の方法は、Ａｍｅｒｓｈａｍ（Ａｒｌｉｎｇ ｔｏｎ Ｈｅｉｇｈｔｓ，Ｉｌｌｉｎｏｉｓ）“Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄ ｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ Ｓｙｓｔ ｅｍ”キットの手引書に記載されているように、アミノ酸１０１にあるイソロイ シン残基をトレオニン残基に、アミノ酸１０７にあるアラニン残基をプロリン残 基に変換する上で特に有効である。 アミノ酸１０１及び１０７をin vitro突然変異誘発したのち、変更されたｖ− ｓｉｓＤＮＡを、アミノ酸２４に対応する位置で切断する制限酵素ＢｇｌIIを用 いてアミノ末端で切断することができる。最初の２４個のアミノ酸を含む遺伝子 の上流部分は、ＢｇｌIIで切断した下流の突然変異誘発ｖ−ｓｉｓＤＮＡを、（ １）ＡＴＧ翻訳開始コドン；（２）アミノ酸１にあるセリン残基；及び（３）ｃ −ｓｉｓにコードされる前駆体タンパク質の最初の２４個のア ミノ酸をコードする合成ＤＮＡフラグメントと連結することにより回復し得る。 このようにして、他の３つの変異アミノ酸のうちの２つ、即ちアミノ酸６にある セリン残基とアミノ酸７にあるバリン残基はヒトＰＤＧＦ−Ｂ形態（それぞれト レオニン及びイソロイシン）に変換され、ｖ−ｓｉｓによってコードされる上流 の前駆体アミノ酸は除去される。 ＰＤＧＦ−Ｂ前駆体タンパク質のアミノ酸１１３より長いＰＤＧＦ−Ｂモノマ ーユニットがＰＤＧＦ−Ｂ融合ダイマーに所望される場合、ｖ−ｓｉｓ遺伝子の アミノ酸位置１１４にあるコドンは、ＰＤＧＦ−Ｂ前駆体タンパク質中の適当な アミノ酸をコードするコドンで置換される必要がある。これは、アミノ酸１０１ 及び１０７に対するコドンを置換したときと同様の方法で、修飾ｖ−ｓｉｓ遺伝 子のカルボキシ末端から切断することにより行い得る。融合ダイマーにおける第 ２モノマーユニットとしてＰＤＧＦ−Ｂ₁₁₉形態が所望であるならば、アミノ酸 １１４の変更とアミノ酸１２０の終結コドンによる置換とを同時に行う合成フラ グメントでカルボキシ末端を置換することができる。この場合には突然変異誘発 ｖ−ｓｉｓＤＮＡを、アミノ酸 １１２に対応する位置で切断する制限酵素ＳｍａＩで切断することが好ましい。 ＰＤＧＦ−Ｂ前駆体タンパク質のアミノ酸１１２〜１１９をコードする合成ＤＮ Ａフラグメントと位置１２０にある翻訳終結コドンとを、ＳｍａＩで切断した突 然変異誘発ｖ−ｓｉｓＤＮＡに連結し得る。この合成ＤＮＡは更にアミノ酸１１ ４にトレオニン残基ではなくてグリシン残基をコードし、５番目の変異アミノ酸 が、ＰＤＧＦ−Ｂ前駆体タンパク質の対応アミノ酸に変換される。 本発明のＰＤＧＦ−ＢＢ融合ホモダイマーを製造するためには、任意の２つの 所望のＰＤＧＦ−Ｂモノマーサブユニットのコーディング配列を、スペーサーを 含んでまたは含まずに相互に連結し、完全な融合ダイマーコーディング配列を生 成する。次いで完全なコーディング配列を適当な発現ベクター、例えばｐＣＦＭ １１５６に連結し、適当な宿主細胞系、好ましくはＥ．ｃｏｌｉのごとき細菌宿 主中に形質転換またはトランスフェクトする。宿主細胞中ではＮ末端のメチオニ ンがin vivoで合成され、次いで除去されるが、ある種のＥ．ｃｏｌｉ株はＮ末 端メチオニンを除去できず、従ってアミノ末端に付加アミノ酸残基を含む組 換え産物が産生される。 本発明の融合ダイマーの製造に好ましい宿主細胞系は細菌宿主、好ましくはＥ ．ｃｏｌｉである。本明細書に記載した特定の発現系に加え、他の系も本発明に 考えられ、例えば、限定的ではないが、プロテアーゼ切断部位の修飾及び／また は本発明の融合ダイマーの宿主細胞の産生レベルを高めるための別の先導配列の 使用が挙げられる。 本発明の生物学的に活性な融合ダイマーの治療目的の施用では、外科医及び／ または獣医によって哺乳動物種の多様な創傷の治療に使用し得る。かかる治療に 使用される生物学的に活性なＰＤＧＦの量は、当然ながら、治療する創傷の重症 度、選択される投与経路、及び融合ダイマーの比活性または純度に従い、担当の 外科医または獣医によって決定される。「融合ダイマーの治療上有効な」量なる 用語は、哺乳動物において治療応答を生成するように決定される、外部から与え られた他の成長因子の不在下での融合ダイマーの量を指す。かかる治療上有効量 は当分野の常用技術により容易に確定される。 本発明に従って製造される融合ダイマーは、治療される創傷または病状に適し た任意の経路で投与し得る。ＰＤＧ Ｆ融合ダイマーを治療目的で施用して有利に治療される病状としては、上述の皮 膚開創、皮膚切創、及び胃腸切創が挙げられる。ＰＤＧＦ融合ダイマーは、骨、 軟骨、腱、靭帯、及び上皮（例えば腸壁、胃壁）の治癒、並びにグリア修復に使 用し得る。 ＰＤＧＦ融合ダイマーは創傷に外部から施用するのが好ましい。外部施用は、 一回だけ施用または服用してもよいし、指示された様々な間隔で複数回服用して もよい。本発明のＰＤＧＦ融合ダイマーを外部施用するための組成物は、当分野 の常用技術により容易に確定される。好ましい経路は治療される創傷または病状 によって変わることは当業者には容易に理解される。ＰＤＧＦ融合ダイマーは純 粋または実質的に純粋な化合物として投与し得るが、医薬組成物または製剤とし て与えるのが好ましい。 動物及びヒトに使用される本発明の組成物は、上述のごとき治療上有効量のＰ ＤＧＦを、１種以上の医薬上容認可能な担体及び必要によっては他の治療成分と 一緒に含む。担体は、組成物の他の成分と相容性であると共にそのレシピエント に対して不利でないという意味で「容認可能」であらねばならない。望ましくは 組成物は、酸化剤または還 元剤、及びペプチドが非相容性であることが公知の他の物質を含むべきではない 。該組成物は単位剤形で都合良く与えることができ、当分野において公知の任意 の方法で製造することができる。全ての方法が、有効成分を、１種以上の補助成 分を構成する担体と混合するステップを含む。通常は組成物は、融合ダイマーを 液体担体または微粉末固体担体または両方と均密に混合することにより製造され る。 本発明の理解の助けとなるように以下の実施例を与えるが、本発明の真の範囲 は付随の請求の範囲に示される。本発明の主旨から離れずとも、記載の方法には 変更を行い得ることが理解される。 実施例１ ＰＤＧＦ−Ｂ₁₁₉コーディング配列の構築 出発材料としてｖ−ｓｉｓ遺伝子を使用し、図３に示したＰＤＧＦ−Ｂ₁₉₉コ ーディング配列を構築した。 Ａ．アミノ酸１０１及び１０２の変換 サル肉腫（ｓｉｍｉａｎ ｓａｃｒｏｍａ）ウイルスのレトロウイルスゲノム のクローンであるプラスミドｐＣ６０（Ｗｏｎｇ−Ｓｔａａｌら，Ｓｃｉｅｎｃ ｅ，２１３，２２６−２２８（１９８１））１μｇを制限エンドヌクレ アーゼＳａｌＩ及びＸｂａＩを用いて消化し、得られた１１８３塩基対のフラグ メントを、Ｍａｎｉａｔｉｓら，Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ Ｌ ａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｒｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８２）に記載の方法に従って低融点アガロースゲ ル中で電気泳動分離することによって精製した。精製フラグメントをゲルから切 り出した。同時に、０．２μｇのＭ１３ｍｐ１９ ＤＮＡをＳａｌＩ及びＸｂａ Ｉで消化し、７２４５塩基対の大きなバンドを同様に低融点ゲルから単離した。 切り出した両ゲル薄片を６５℃で融解し、３７℃に冷却した。７２４５塩基対の Ｍ１３ｍｐ１９フラグメントを含むゲル全てと、１１８３塩基対のｖ−ｓｉｓフ ラグメントを含むゲルの１／４とを混合し、Ｓｔｒｕｈｌ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉ ｑｕｅｓ，３，４５２−４５３（１９８５）に従って連結した。連結したＤＮＡ をＥ．ｃｏｌｉ Ｋ１２株ＴＧ１中に形質転換し、透明なプラークを選択し、液 体培地中で増殖させた。Ｍ１３ｍｐ１９ベクター中の１１８３塩基対のｖ−ｓｉ ｓフラグメントの存在を、ファージＤＮＡのＲＦ形態の調製及び制限マップ分析 によて確認した。Ｍｅｓｓｉｎｇら， Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，９，３０９−３２１（１９８１）。 このように得られたＭ１３ｍｐ１９／ｖ−ｓｉｓファージを液体培地中で増殖 させ、一本鎖ＤＮＡを単離した。Ｍｅｓｓｉｎｇら，前出。このＤＮＡをオリゴ ヌクレオチドin vitro突然変異誘発用の鋳型として使用し、残基１０１及び１０ ７にあるアミノ酸をＰＤＧＦ−Ｂの対応アミノ酸に変換した。即ち、イソロイシ ン１０１をコードするＡＴＡコドンを（トレオニンをコードする）ＡＣＡに変換 し、アラニン１０７をコードするＧＣＴコドンを（プロリンをコードする）ＣＣ Ｔに変換した。 １０μｇのＭ１３ｍｐ１９／ｖ−ｓｉｓ一本鎖ＤＮＡを、配列： を有する８ｐｍｏｌのリン酸化オリゴヌクレオチドを用いてアニーリングした。 上記配列はｖ−ｓｉｓ遺伝子のヌクレオチド４２８３〜４３１６と相同である （Ｄｅｖａｒｅのナンバリングシステム，前出）。該オリゴヌクレオチドの下線 を引いた塩基 は、ｖ−ｓｉｓからヒトＰＤＧＦ−Ｂ配列への変更を示す。突然変異オリゴヌク レオチドにおいてＤＮＡ合成を開始し、完全突然変異鎖を、チオヌクレオチド三 リン酸を使用し、Ｅ．ｃｏｌｉＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウフラグメントに よって合成し、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを用いて連結した。残った全ての一本鎖鋳 型Ｍ１３ｍｐ１８／ｖ−ｓｉｓ ＤＮＡをニトロセルロースフィルターで濾過することにより除去した。非突然 変異鎖は、制限エンドヌクレアーゼIIIと一緒にインキュベートすることにより ニックした。次いでニックした非突然変異鎖を、突然変異鎖を鋳型として使用し てデオキシヌクレオチド三リン酸を用いて再度重合した。その結果、最終産物中 の両ＤＮＡ鎖は所望の突然変異を含んでいた。ＤＮＡをＥ．ｃｏｌｉ Ｋ１２株 ＴＧ１中に形質転換した。プラークを選択し、液体培地中で増殖させ、一本鎖Ｄ ＮＡを単離した。ＤＮＡの配列をＳａｎｇｅｒら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ ｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７４，５４６３−５４６７（１９７７）の方法で決定し、 所望の突然変異体が得られたことを確認した。 Ｂ．アミノ酸６及び７の変換 次のステップでは、突然変異ｖ−ｓｉｓ遺伝子の５’末 端を、アミノ酸６及び７をｖ−ｓｉｓからヒトＰＤＧＦ−Ｂ形態に変更する合成 ＤＮＡフラグメントで置換した。この合成フラグメントにより更に、ヒトＰＤＧ Ｆ−Ｂのセリン１のコドンの直前の翻訳開始ＡＴＧコドンが与えられると共に、 Ｅ．ｃｏｌｉリボソームに結合するための配列及び所望のＥ．ｃｏｌｉ発現ベク ター（後述）中に連結するための制限部位が与えられる。合成ＤＮＡフラグメン トを、ｖ−ｓｉｓ遺伝子のヌクレオチド４０６１（Ｄｅｖａｒｅらのナンバリン グシステム，前出）に位置するＢｇｌII部位に連結した。Ｍ１３ｍｐ１９中に存 在するＢｇｌII部位はこのステップを複雑にする上に妨害し得るので、突然変異 ｖ−ｓｉｓ遺伝子をまず、ＢｇｌII部位を含まない市販のプラスミドベクターｐ ＵＣ１８に移した。Ｍ１３ｍｐ１９／ｖ−ｓｉｓ突然変異体ＲＦ ＤＮＡをＳａ ｌＩ及びＢａｍＨ１で制限し、得られた１１３９塩基対のフラグメントを低融点 アガロースゲルを使用した電気泳動によって単離した。このフラグメントを、や はりＳａｌＩ及びＢａｍＨ１で制限しておいたプラスミドｐＵＣ１８に連結した 。連結したＤＮＡを市販のＥ．ｃｏｌｉ Ｋ１２株ＤＨ５中に形質転換し、形質 転換体をアンピシリン存在下で増殖さ せることにより選択した。コロニーを選択し、液体培地中で増殖させ、プラスミ ドＤＮＡを単離し、制限マッピングによってｖ−ｓｉｓ挿入物の存在について分 析した。 ｐＵＣ１８／ｖ−ｓｉｓ突然変異ＤＮＡを、ｐＵＣ１８のポリリンカーを突然 変異ｖ−ｓｉｓ挿入物のすぐ上流で切断するＨｉｎｄIIIと、成熟タンパク質産 物のアミノ酸番号２４に対応するヌクレオチド４０６１（Ｄｅｖａｒｅらのナン バリングシステム，前出）でｖ−ｓｉｓ ＤＮＡを切断するＢｇｌIIとで制限し た。この反応で得られた３３６５塩基対の大フラグメントを低融点アガロースゲ ル中で電気泳動することにより単離した。このフラグメントを、配列： を有する合成二本鎖ＤＮＡフラグメントに連結した。 上記合成ＤＮＡフラグメントは、上流（左側）末端にＨｉｎｄIII「付着」末 端を含み、下流（右側）末端にＢｇｌII「付着」末端を含んでいる。更に、Ｘｂ ａＩ部位（ＴＣＴＡＧＡ）が合成ＤＮＡのＨｉｎIII「付着」末端の すぐ下流に存在し、後述の発現ベクターのＸｂａＩ部位に連結するためのＸｂａ Ｉによる制限が可能になる。連結したＤＮＡをＥ．ｃｏｌｉ Ｋ１２株ＤＨ５中 に形質転換し、形質転換体をアンピシリン含有培地上で増殖させることにより選 択した。得られたコロニー由来のプラスミドＤＮＡにおける合成ＤＮＡフラグメ ントの存在を制限マッピングによって分析した。ここで、ｐＵＣ１８／ｖ−ｓｉ ｓ構築物は突然変異ｖ−ｓｉｓ遺伝子を含んでおり、アミノ酸番号６、６、１０ １及び１０７はヒトＰＤＧＦ形態に変更されており、５’末端は、セリン１の直 前のＡＴＧコドンから翻訳を開始するように変更されていた。 Ｃ．アミノ酸１１４の変換及びアミノ酸１２０にある終結コドンの置換 次のステップにおいては、アミノ酸番号１１４のコドンをＡＣＴからＧＧＴに 変更し、その結果として最終的なタンパク質産物においてグリシンをトレオニン に置換した。更に、ｖ−ｓｉｓにおいてはＧＣＣがアラニンをコードするコドン 番号１２０をＴＡＡ翻訳終結コドンに変更した。この構築物で得られたタンパク 質産物は、残基１１９のアルギニンを末端とする。両変更は、コドン番号１１２ に位 置するＳｍａＩ部位のあとに合成ＤＮＡフラグメントを挿入することにより１ス テップで行った。 上記で生成したｐＵＣ１８／ｖ−ｓｉｓ突然変異ＤＮＡを、ｖ−ｓｉｓ配列の ヌクレオチド４３２４（Ｄｅｖａｒｅらのナンバリングシステム，前出）で切断 するＳｍａＩと、ｐＵＣ１８のポリリンカーをｖ−ｓｉｓ挿入物のすぐ下流で切 断するＥｃｏＲＩとで制限した。ｖ−ｓｉｓタンパク質のＣ末端部分及び３’― 非翻訳配列をコードするＳｍａＩ部位とＥｃｏＲＩ部位の間の小フラグメント（ ５１０塩基対）を、低融点アガロースゲル上で電気泳動することにより除去した 。大フラグメント（約３５３０塩基対）を、配列： を有する合成ＤＮＡフラグメントに連結した。 上記配列には、位置１１４にある新たなグリシン残基をコードするＧＧＴコド ンと、位置１２０に導入されたＴＡＡ終結コドンとに下線が引いてある。この合 成ＤＮＡフラグメントは、ｖ−ｓｉｓ突然変異配列をＳｍａＩで制限することに より生成されるブラント末端に連結するためのブ ラント末端を上流（左側）に含んでおり、ｐＵＣ１８ポリリンカーをＥｃｏＲＩ で制限することにより生成されるＥｃｏＲＩ末端に連結するためのＥｃｏＲＩ「 付着」末端を下流（右側）末端に含んでいる。連結したＤＮＡをＥ．ｃｏｌｉ Ｋ１２株ＤＨ５中に形質転換し、形質転換体をアンピシリン含有培地上で増殖さ せることにより選択した。得られたコロニー由来のプラスミドＤＮＡにおける合 成ＤＮＡフラグメントの存在を制限マッピングによって分析した。 実施例２ ＰＤＧＦ−Ｂ₁₀₉前駆体コーディング配列の構築 ＰＤＧＦ−Ｂ前駆体タンパク質のプレ−プロ領域のアミノ−８４〜−１及び成 熟ＰＤＧＦ−Ｂ配列の最初の１０９個のアミノ酸を含む図４に示したＰＤＧＦ− Ｂ₁₀₉前駆体コーディング配列を、天然ｖ−ｓｉｓ遺伝子を出発材料として使用 し、天然及び合成核酸配列の組合せを使用して構築した。 特に、ＰＤＧＦ−Ｂ₁₀₉前駆体コーディング配列は以下のように誘導した。ヌ クレオチド１〜９８由来のＤＮＡは、ヌクレオチド１〜５が（完全コーディング 配列をプラスミ ドベクター中に連結することに使用するための）ＳａｌＩ制限部位をコードし、 ヌクレオチド６〜９８が、アミノ酸−８１の翻訳開始ＡＴＧから始まってアミノ 酸−５５の読み枠内ＳａｃＩ制限部位で終わるヒトＰＤＧＦ−Ｂの領域に全く一 致する合成ＤＮＡフラグメントであった。 ヌクレオチド９９〜２２０のＤＮＡは、ＰＤＧＦ−Ｂプレープロ領域のアミノ 酸−５４〜−１３に対応するｖ−ｓｉｓのプレープロ領域（サル肉腫ウイルスの ヌクレオチド３８３３〜３９５３，Ｄｅｖａｒｅら，前出）由来のＳａｃＩ−Ｂ ｓｔＸＩフラグメントから誘導した。ヌクレオチド２２１〜２６９の配列は、ヒ トＰＤＧＦ−Ｂ前駆体タンパク質のアミノ酸配列のアミノ酸−１２〜＋５をコー ドする、上流末端にＢｓｔＸＩ部位を有し且つ下流末端にＨｐａＩ半部位を有す る合成ＤＮＡフラグメントから誘導した。ヌクレオチド２７０〜３２６の配列は 、ヒトＰＤＧＦ−Ｂタンパク質のアミノ酸配列のアミノ酸＋６〜アミノ酸＋２４ をコードする、上流末端にＨｐａＩ半部位を有し且つ下流末端にＢｇｌII部位を 有する合成ＤＮＡフラグメントから誘導した。ヌクレオチド３２７〜１０８７の 配列は、ヒトＰＤＧＦ−Ｂのアミノ酸＋２５〜＋１６０に対応するｖ ―ｓｉｓのＢａｇII−ＸｂａＩフラグメント（サル肉腫ウイルスのヌクレオチド ４２２５〜４８２０，Ｄｅｖａｒｅら，前出）及び全３’非翻訳領域から誘導し た。この後者のｖ−ｓｉｓフラグメントの配列は（ＰＤＧＦ−Ｂ₁₁₉コーディン グ配列に関して実施例１に記載したような）in vitro突然変異誘発によって変更 してヌクレオチド５５７をＴからＣに変換し、それによってｖ−ｓｉｓのイソロ イシン−１０１をヒトＰＤＧＦ−Ｂにおけるようにトレオニンに変換し、且つヌ クレオチド５７４をＧからＣに変換し、それによってｖ−ｓｉｓのアラニン−１ ０７をヒトＰＤＧＦ−Ｂにおけるようにプロリンに変換した。更にin vitro突然 変異誘発を使用し、ヌクレオチド５８３をＣからＴに、ヌクレオチド５８６をＡ からＴに、ヌクレオチド５８７をＧからＡに、及びヌクレオチド５８８をＣから Ａに変換し、ＰＤＧＦ−Ｂのアミノ酸１０９のあとに縦列する２つの翻訳終結コ ドンを作製した。 ＰＤＧＦ−Ｂ前駆体タンパク質をコードする複合ＤＮＡ配列（ＰＤＧＦ前駆体 タンパク質の全プレープロ領域に続くＰＤＧＦ−Ｂ₁₀₉）をＳａｌＩ〜ＸｂａＩ フラグメントとして市販プラスミドｐＧＥＭ３中にクローニングした。 ｐＧＥＭ３プラスミドはＸｂａＩ部位のすぐ下流にＳａｃＩ制限部位を含む。以 下の実施例３に記載するようにＰＤＧＦ−Ｂ融合ダイマーＤＮＡ配列を構築する 際に、ＰＤＧＦ−Ｂプレ−プロ領域のアミノ酸−５４〜−１、成熟ＰＤＧＦ−Ｂ タンパク質のアミノ酸１〜１０９、及びｖ−ｓｉｓの３’非翻訳ＤＮＡ配列をコ ードするｐＧＥＭ３／ＰＤＧＦ−Ｂ109／前駆体プラスミドをＳａｃＩ−Ｓａｃ Ｉフラグメント源として使用した。 実施例３ ｐＵＣ１８ベクターにおけるＰＤＧＦ−Ｂ₁₁₉／プレ−プロ／₁₀₉プラスミドの構 築 Ａ．ＰＤＧＦ−Ｂ₁₁₉コード配列＋合成ＪリンカーのｐＵＣ１８への挿入 実施例１のＰＤＧＦ−Ｂ₁₁₉コード配列及び実施例２のＰＤＧＦ−Ｂ₁₀₉コード 配列をスペーサーコード配列を介して互いに連鎖させてＰＤＧＦ−Ｂ₁₁₉Ｂ₁₀₉融 合ホモダイマー用コード配列を形成した。 ＰＤＧＦ−Ｂ₁₁₉コード配列を含む前駆体ベクターはバクテリオファージＭ１ ３ｍｐ１９であった。Ｅ．ｃｏｌｉＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウフラグメン トを用い、標 準的な試験管内反応により一本鎖コード配列を二本鎖にした。この二本鎖コード 配列を制限酵素ＸｂａＩ及びＳｍａＩで消化して、アミノ酸１１２のＳｍａＩ部 位までのＰＤＧＦ−Ｂ₁₁₉コード配列を含む約３８０塩基対挿入体を遊離させた 。従って、最後の７アミノ酸をコードするＤＮＡはこのＤＮＡフラグメント中に は不在であった。該フラグメントを、Ｓｅａｐｌａｑｕｅブランドの低融解温度 アガロースゲルを介した電気泳動及び該ゲルからの抽出により精製した。分離し たＰＤＧＦ−Ｂ₁₁₉ＤＮＡフラグメントを、その上流末端にブラントエンドＳｍ ａＩ半部位を、またその下流末端にＳａｃＩアダプター部位を含む合成ＤＮＡリ ンカーと混合した。リンカー自身は、ＰＤＧＦ−Ｂ₁₁₉モノマーユニットのアミ ノ酸１１３〜１１９＋ＰＤＧＦ―Ｂ前駆体タンパク質のプレ−プロ領域のアミノ 酸番号−５４及び−５３をコードした。ＰＤＧＦ−Ｂ₁₁₉ＤＮＡフラグメント＋ リンカーをＸｂａＩ及びＳａｃＩで切断されたベクターｐＵＣ１８に連結した。 連結されたＤＮＡをＥ．ｃｏｌｉＫ−１２株ＤＨ５αに形質転換した（図２を参 照されたい）。 得られた形質転換細胞コロニーのいくつかからプラスミ ドＤＮＡを分離し、ＤＮＡ挿入体をアガロースゲル電気泳動により分析した。正 配向の挿入体を有する一つのプラスミドを同定し、次の段階に用いた。 Ｂ．スペーサー部分及びＰＤＧＦ−Ｂ₁₁₉サブユニットコード配列の下流のＰＤ ＧＦ−Ｂ₁₀₉サブユニット並びにリンカー用のコード配列の挿入 ＰＤＧＦ−Ｂ前駆体タンパク質のプレ−プロ領域のアミノ酸番号−５２〜−１ ＋成熟ＰＤＧＦ−Ｂ配列（ＰＤＧＦ−Ｂ₁₀₉）のアミノ酸番号１〜１０９、続く ２つの翻訳停止コドン及びｖ−ｓｉｓ遺伝子の３′―非翻訳配列をコードするＤ ＮＡセグメントを上記構築物のＳａｃＩ部位に挿入した。この挿入は、先ずＰＤ ＧＦ−Ｂ₁₁₉をコードするＤＮＡを含む上記ｐＵＣ１８構築物とリンカーとをＳ ａｃＩで線状化して行った。次いで、全ＰＤＧＦ−Ｂ前駆体タンパク質（アミノ 酸１０９に続く２つの停止コドンを含み、それによってタンパク質翻訳生成物が アミノ酸１０９の後で終端した）をコードするＤＮＡを含むプラスミド（ｐＧＥ Ｍ３／ＰＤＧＦ−Ｂ₁₀₉／前駆体）をＳａｃIIで制限した。この制限により、そ の上流末端がＰＤＧＦ−Ｂ前駆体タンパク質のプレ−プロ領域のアミノ酸番号− ５２用のコ ドンで始まり、その後にタンパク質コード領域の残りの部分及び３′―非翻訳領 域が続き且つその下流末端にｐＧＥＭ３の多重クローン化部位の一部を含む１０ １０塩基対フラグメントが遊離した。ＰＤＧＦ−Ｂ前駆体タンパク質のプレ−プ ロ領域の一部並びに成熟ＰＤＧＦ−Ｂの１０９アミノ酸形態をコードするこのフ ラグメントを、本実施例のＡ部に記載のＳａｃＩ−切断ｐＵＣ１８／ＰＤＧＦ− Ｂ₁₁₉構築物に連結した。連結反応混合物をＥ．ｃｏｌｉ株ＤＨ５αに形質転換 し、得られたコロニー由来のプラスミドを酵素Ｂｇ１IIを用いた制限分析により 分析した（図２を参照されたい）。 実施例４ Ｅ．ｃｏｌｉにおけるＰＤＧＦ−Ｂ₁₁₉Ｂ₁₀₉融合ダイマーの発現 プレ−プロスペーサーを含むＰＤＧＦ−Ｂ₁₁₉Ｂ₁₀₉融合ダイマーをコードする 実施例３に記載のｐＵＣ１８の挿入体をＸｂａＩを用いて制限することによりｐ ＵＣ１８から除去した。１３６９塩基対ＸｂａＩフラグメントをＳｅａｐｌａｑ ｕｅ低融解温度アガロースゲル上の電気泳動により精製し、Ｅ．ｃｏｌｉ発現ベ クターｐＣＦＭ１１５６に 連結した。プラスミドｐＣＦＭ１１５６ＰＬは公知のプラスミドｐＣＦＭ８３６ から調製する。プラスミドｐＣＦＭ８３６の調製は、米国特許第４，７１０，４ ７３号明細書に記載されており、該明細書中の関連部分、特に実施例１〜７はこ こに引用して本明細書の一部とする。ｐＣＦＭ１１５６及びｐＣＦＭ８３６を調 製するためには、２つの内在ＮｄｅＩ制限部位を切断し、露出した末端をＴ４ポ リメラーゼで充填し、充填した末端をブラントエンド連結する。 次いで得られたプラスミドをＣｌａＩ及びＫｐｎＩで消化し、切り出されたＤ ＮＡフラグメントを以下の配列のＤＮＡオリゴヌクレオチドで置換する： ５′→３′ ＣｌａＩ ＫｐｎＩ ３′→５′ ｐＣＦＭ１１５６ベクターは、上流のＸｂａＩ部位といくつかの下流制限部位 の一つとの間に外来遺伝子挿入用領域を含んでいる。この実施例の場合には、ち ょうどＸｂａＩ部位を用いた。 連結反応混合物をＥ．ｃｏｌｉ株ＦＭ−５（ＡＴＣＣ番 号６７５４５）に形質転換し、形質転換細胞を制限マッピングにより分析した。 正配向の挿入体フラグメントを含むクローンを同定した。次に、このプラスミド 中に存在するＤＮＡ挿入体の配列を検査したが、観察された配列は図１に記載の タンパク質をコードする予測配列と一致した。 この最終発現プラスミドは、開始メチオニンで始まり、ヒトＰＤＧＦ−Ｂ配列 のアミノ酸１〜１１９、次にヒトＰＤＧＦ−Ｂ前駆体タンパク質配列のプレ−プ ロ領域のアミノ酸−５４〜−１のスペーサー、次にヒトＰＤＧＦ−Ｂ配列のアミ ノ酸１〜１０９が続くタンパク質をコードする挿入ＤＮＡ配列を含んでいた。合 成後に原核Ｅ．ｃｏｌｉ宿主細胞からＮ−末端メチオニンが除去され、それによ って産生した最終タンパク質は、５４アミノ酸からなるスペーサーを有するＰＤ ＧＦ−Ｂ₁₁₉Ｂ₁₀₉融合ホモダイマーに相当する。 ＰＤＧＦ−Ｂ₁₁₉Ｂ₁₀₉融合ダイマー用挿入体を含むＥ．ｃｏｌｉクローンを、 ３０℃で２時間、次いで４２℃の誘導温度に変えて４時間、液体培養中で増殖さ せた。誘導の前と後の細胞のアリコートをＳＤＳ中で沸騰させて溶解反応させ、 タンパク質を、ＳＤＳゲル電気泳動、次いでクー マシーブルー染料で染色して分析した。誘導後の細胞由来のレーンにＰＤＧＦ− Ｂ₁₁₉Ｂ₁₀₉融合ダイマーのほぼ正確な予測サイズ（３１Ｋｄ）のバンドを認めた が、該バンドは非誘導細胞由来のレーンには存在しなかった。ウエスターン法に よりタンパク質をゲルからニトロセルロースメンブランに移し、ブロットをＰＤ ＧＦ−Ｂに対する抗体と共にインキュベートして分析した。ＰＤＧＦ−Ｂ₁₁₉Ｂ_{1 09} 融合ダイマープラスミドを含む誘導細胞中の新規なタンパク質は該抗体と特異 的に反応したが、これは、該タンパク質が実際にＰＤＧＦ−Ｂ₁₁₉Ｂ₁₀₉融合ダイ マーであることを実証している。 実施例５ 非精製ＰＤＧＦ−Ｂ₁₁₉Ｂ₁₀₉融合ダイマーのマイトジェン活性 ＰＤＧＦ−Ｂ₁₁₉Ｂ₁₀₉融合ダイマーの潜在的マイトジェン活性についての最初 の試験として、該タンパク質を発現するＥ．ｃｏｌｉ細胞をフレンチプレス中で 溶解させた。ＰＤＧＦ−Ｂ₁₁₉Ｂ₁₀₉融合ダイマータンパク質の殆どを含む不溶物 質を遠心によりペレット化した。ペレットを０．８ｍｌの６Ｍグアニジン−ＨＣ ｌに溶解し、次いで８ｍｌ の５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）に希釈した。電気泳動分析により 、この試料が約３０μｇ／ｍｌのＰＤＧＦ−Ｂ₁₁₉Ｂ₁₀₉融合ダイマーを含むもの と推定された。該物質をＮＲＫ線維芽細胞のマイトジェン刺激について数種の濃 度で分析した。用量依存性剌激は、約３４ｎｇ／ｍｌのＰＤＧＦ−Ｂ₁₁₉Ｂ₁₀₉融 合ダイマー用量を用いた場合に最大剌激が起こることが観察された。これは、該 タンパク質が生物学的に活性であり、この大ざっぱな手順で「折りたたまれた」 ときでさえ、活性レベルが野生型ＰＤＧＦ―ＢＢの活性に匹敵することを初めて 示した。 実施例６ ＰＤＧＦ−Ｂ₁₁₉Ｂ₁₀₉融合ダイマーの精製及び復元 ＰＤＧＦ−Ｂ₁₁₉Ｂ₁₀₉融合ホモダイマーを含む実施例５のＥ．ｃｏｌｉ発酵培 地由来の細胞を２つのバッチにわけて精製した。どちらの場合も、先ず細胞を約 １０容量（湿潤重量／容量）の水に懸濁し、次いで９０００ｐｓｉのＧａｕｌｉ ｎホモジナイザーに３回通した。次いでホモジナイズされた細胞を５０００×ｇ で１時間４℃で遠心し、上清を廃棄した。 得られた沈降物（ＰＤＧＦ−Ｂ₁₁₉Ｂ₁₀₉融合ホモダイマ ーを含む封入体）を、最初の細胞の懸濁に用いた水の容量の約６０％の容量の６ Ｍグアニジン−ＨＣｌ、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ塩化物（ｐＨ７．５）に懸濁した 。β−メルカプトエタノールを約０．０８％（ｖ／ｖ）の濃度になるまで加え、 懸濁液を９０分間周囲温度で混合した。５容量の水を約１５分かけてゆっくり加 え、約１６時間周囲温度で混合を継続した。水をゆっくり加えてグアニジン−Ｈ Ｃｌの濃度を０．６Ｍにした。酢酸を用いてｐＨを約３．５に調整し、４℃で約 ３時間混合した。次いで懸濁液を１７，７００×ｇで１５分間４℃で遠心し、混 合物を清澄にした。次いで得られた上清を、０．１Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ４） で平衡にしたＳ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（登録商標）カラム（Pharmacia Biotech ，Piscataway，New Jersey）に充填した。充填したカラムを、（１）２０ｍＭリ ン酸ナトリウム（ｐＨ７．５）、次いで（２）２０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ ７．５）、０．１Ｍ塩化ナトリウム、さらに（３）２０ｍＭリン酸ナトリウム（ ｐＨ７．５）、１．０Ｍ塩化ナトリウムで洗浄した。 ＰＤＧＦ−Ｂ₁₁₉Ｂ₁₀₉融合ホモダイマーを含む最終洗浄における分画をプール し、モノクローナル抗体認識ＰＤＧ Ｆ−ＢＢを含むイムノアフィニティーカラムに入れた。充填したアフィニティー カラムを、（１）０．５Ｍ塩化ナトリウム、２５ｍＭ Ｔｒｉｓ塩化物（ｐＨ７ ．５）、次いで（２）０．５Ｍ塩化ナトリウムで洗浄した。次いでＰＤＧＦ−Ｂ₁₁₉ Ｂ₁₀₉融合ホモダイマーを、１Ｍ酢酸、０．１５Ｍ塩化ナトリウムで溶離し、 溶媒を水と交換したＡｍｉｃｏｎ（登録商標）−ＹＭ１０（Amicon，Beverly，M assachusetts）メンブラン上で濃縮した。 次いでＰＤＧＦ−Ｂ₁₁₉Ｂ₁₀₉融合ホモダイマーをポリスルホエチルアスパルト アミドカラム（The Nest Group，South Boro，Massachusetts）に入れ、２０ｍ Ｍリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）中、０〜１Ｍ塩化ナトリウムの線勾配を用い て展開した。ＰＤＧＦ融合ダイマーを含む該分画をプールして濃縮し、次いで１ ０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ４）／０．１５Ｍ塩化ナトリウムに交換した。 実施例７ 精製且つ折りたたまれたＰＤＧＦ−Ｂ₁₁₉Ｂ₁₀₉融合ダイマーのマイトジェン活性 実施例６の精製ＰＤＧＦ−Ｂ₁₁₉Ｂ₁₀₉融合ダイマーの第１のバッチをＮＲＫ細 胞に関するマイトジェン活性につい て検定し、該ダイマーが野生型ＰＤＧＦ−ＢＢの活性に近似した活性を有するこ とを見いだした。 実施例６の精製ＰＤＧＦ−Ｂ₁₁₉Ｂ₁₀₉融合ダイマーの第２のバッチをゲル電気 泳動によりＮＲＫ細胞に関するマイトジェン活性について分析した。該タンパク 質は、還元の前と後で約３１Ｋｄのダイマーとして移動したが、これは、該タン パク質が図５に示されているような真正融合ダイマーであることを示している。 ＰＤＧＦ−Ｂ₁₁₉Ｂ₁₀₉融合ダイマー及び野生型ＰＤＧＦ−ＢＢホモダイマーのＮ ＲＫマイトジェン活性アッセイにおける用量応答曲線は、図６に示されているよ うに極めて近似したものであった。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ Ｃ０７Ｋ 19/00 8318−4Ｈ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｈ 9282−4Ｂ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ， ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，Ｇ Ｂ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＵ，ＬＶ ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＷ，ＮＬ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ， ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＫ，ＵＡ，ＶＮ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．天然産生マルチマータンパク質の２つ以上のポリペプチドサブユニットを含 む生物学的に活性なタンパク質であって、該サブユニットが単一の連続ポリペプ チドに組み込まれたタンパク質。 ２．前記ポリペプチドサブユニットがそれぞれＰＤＧＦファミリーのメンバーで ある請求項１に記載の生物学的に活性なタンパク質。 ３．前記ポリペプチドサブユニットがそれぞれ、ＰＤＧＦ−Ａ、ＰＤＧＦ−Ｂ、 ＶＥＧＦ及びＰＬＧＦアミノ酸配列からなる群から選択されたアミノ酸配列を含 む請求項２に記載の生物学的に活性なタンパク質。 ４．前記ポリペプチドサブユニットがそれぞれ、ＰＤＧＦ−Ａ及びＰＤＧＦ−Ｂ アミノ酸配列からなる群から選択されたアミノ酸配列を含む請求項３に記載の生 物学的に活性なタンパク質。 ５．前記ポリペプチドサブユニットがそれぞれヒトＰＤＧＦ−Ｂ配列である請求 項４に記載の生物学的に活性なタンパク質。 ６．前記サブユニットがスペーサー部分によって互いに分離されている請求項１ に記載の生物学的に活性なタンパク質。 ７．前記ポリペプチドサブユニットがそれぞれＰＤＧＦファミリーのメンバーで ある請求項６に記載の生物学的に活性なタンパク質。 ８．前記ポリペプチドサブユニットがそれぞれ、ＰＤＧＦ−Ａ、ＰＤＧＦ−Ｂ、 ＶＥＧＦ及びＰＬＧＦアミノ酸配列からなる群から選択されたアミノ酸配列を含 む請求項７に記載の生物学的に活性なタンパク質。 ９．前記ポリペプチドサブユニットがそれぞれ、ＰＤＧＦ―Ａ及びＰＤＧＦ−Ｂ アミノ酸配列からなる群から選択されたアミノ酸配列を含む請求項８に記載の生 物学的に活性なタンパク質。 １０．前記ポリペプチドサブユニットがそれぞれヒトＰＤＧＦ−Ｂ配列である請 求項９に記載の生物学的に活性なタンパク質。 １１．前記ポリペプチドサブユニットの中の一つがＰＤＧＦ−Ｂ₁₀₉であり、そ して前記ポリペプチドサブユニットの中の一つがＰＤＧＦ−Ｂ₁₁₉である請求項 １０に記載の 生物学的に活性なタンパク質。 １２．前記生物学的に活性なタンパク質が図１に示されているアミノ酸配列を有 する請求項１１に記載の生物学的に活性なタンパク質。 １３．天然産生マルチマータンパク質の２つ以上のポリペプチドサブユニット用 コード配列を含む生物学的に活性なタンパク質用のコード配列であって、該サブ ユニット用コード配列が単一の連続ポリペプチドをコードするように互いに連結 されているコード配列。 １４．前記コード配列がＰＤＧＦ−ＢＢ融合ダイマーをコードする請求項１３に 記載のコード配列。 １５．天然産生マルチマータンパク質の２つ以上のポリペプチドサブユニット用 コード配列を含む生物学的に活性なタンパク質用のコード配列であって、該サブ ユニット用コード配列が単一の連続ポリペプチドをコードするように互いに連結 されているコード配列を含有するトランスフェクト宿主細胞。 １６．前記コード配列がＰＤＧＦ−ＢＢ融合ダイマーをコードする請求項１５に 記載のトランスフェクト宿主細胞。 １７．請求項１に記載の生物学的に活性なタンパク質及び 医薬上許容可能な担体を含む医薬組成物。 １８．前記生物学的に活性なタンパク質がＰＤＧＦ−ＢＢ融合ダイマーである請 求項１７に記載の医薬組成物。 １９．前記生物学的に活性なタンパク質が図１に示されているアミノ酸配列を有 する請求項１８に記載の医薬組成物。 ２０．天然産生マルチマータンパク質の２つ以上のポリペプチドサブユニットを 含むポリペプチド性インヒビターであって、該サブユニットが単一の連続ポリペ プチドに組み込まれており且つ該サブユニットの少なくとも一つが生物学的に不 活性であるインヒビター。 ２１．前記ポリペプチドサブユニットの中の一つがＰＤＧＦファミリーの生物学 的に活性なメンバーであり且つ該サブユニットの中の一つがＰＤＧＦファミリー の生物学的に不活性なメンバーである請求項２０に記載のポリペプチド性インヒ ビター。