FR2628109A1 - Amphireguline, glycoproteine bifonctionnelle regulatrice de la croissance et son procede de preparation - Google Patents

Abstract

La présente invention concerne une glycoprotéine bifonctionnelle régulatrice de la croissance, l'amphiréguline. Selon l'invention, cette protéine a un poids moléculaire d'environ 8 500 à 25 000 daltons et un point isoélectrique d'environ 7,6 à 8,0. L'invention trouve application notamment dans l'inhibition de la croissance des lignées cellulaires cancéreuses humaines.

Description

(i RÉPUBLIQUE FRAN AISE N de publication 2 628 109 (à n'utiliser que

pour les INSTITUT NATIONAL commandes de reproduction) DE LA PROPRIÉTÉ INDUSTRIELLE N d'enregistrement national 89 009 4 Q N d'enregistrament national: 89 VOO91 4 PARIS I int CI4: C 07 K 15/14, 7/10; A61 K 37/00; C 12 N

/00; C 12 P 21/02/ (C 12 N 15/00, C 12 R 1:19).

@ DEMANDE DE BREVET D'INVENTION A1

Date de dépôt: 25 janvier 1989. Q Demandeur(s): Société dite: ONCOGEN. US.

Priorité: US, 25 janvier 1988. n 148,327, 15 avril 1988,

n 181,884 et 17 janvier 1989, n 297,816.

O Inventeur(s): Mohammed Shoyab; Vicki L McDonald

James G. Bradley; Greg Plowman.

) Date de la mise à disposition du public de la

demande: BOPI " Brevets " n 36 du 8 septembre 1989.

( Références à d'autres documents nationaux appa-

rentés: (r) Titulaire(s)

( Mandataire(s): Cabinet Weinstein.

( Amphiréguline, glycoprotéine bifonctionnelle.régulatrice de la croissance et son procédé de préparation.

( La présente invention concerne une glycoprotéine bifonc-

tionnelle régulatrice de la croissance, I'amphiréguline.

Selon l'invention, cette protéine a un poids moléculaire d'environ 8 500 à 25 000 daltons et un point isoélectrique

d'environ 7,6 à 8,0.

L'invention trouve application notamment dans l'inhibition de

la croissance des lignées cellulaires cancéreuses humaines.

(o N N@ La présente invention a pour objet la production et les utilisations d'amphiréguline, une nouvelle glycoprotéine régulatrice de la croissance. Les protéines selon l'invention inhibent fortement la croissance de plusieurs lignées cellulaires dérivées de tumeurs alors qu'elles stimulent la croissance cellulaire de plusieurs autres lignées cellulaires. Un grand nombre d'applications thérapeutiques de ce régulateur de croissance bifonctionnel sont décrites, incluant mais n'étant pas limités au traitement des blessures et au

diagnostic et au traitement des cancers.

Il est connu que la croissance cellulaire et la différenciation cellulaire sont initiées, stimulées, maintenues et régulées par une multiplicité de facteurs stimulateurs, inhibiteurs et synergiques et d'hormones stimulatrices, inhibitrices et synergiques. L'altération et/ou la rupture du mécanisme cellulaire d'homéostasie semble être une cause essentielle des maladies relatives à la croissance, incluant la néoplasie. Des facteurs modulant la croissance sont impliqués dans une large gamme de processus physiologiques et pathologiques incluant la transduction signal, la communication

cellulaire, la croissance et le développement, l'embryo-

génèse, la réponse immunitaire, l'hématopolèse, la survie

cellulaire et la différentiation cellulaire, l'inflam-

mation, la réparation de tissu et le remodelage de tissu, l'athérosclérose et le cancer. De plus, l'acquisition de connaissances de ces facteurs aidera la compréhension des mécanismes de base derrière un contr8le de croissance normale et leurs disparitions dans les cellules cancéreuses. Le facteur de croissance épidermique (EGF), le facteur de croissance transformant (TGFO) le facteur de croissance dérivé des plaquettes (PDGF), le facteur de croissance de fibroblaste (FGF), le facteur de croissance du nerf (NGF), le facteur B de croissance transformant (TGFB), le facteur de croissance I et II de l'insuline

(IGF I, IGF II), les facteurs de croissance hématopolé-

tiques tels que l'érythropoiétine, des facteurs de stimulation de colonies (CSF 1 et 2), les interleukines (IL-1 à 6), les interférons (IFNo(,B,), le facteur de nécrose des tumeurs 0o et B (TNFc,B), la leukoréguline, l'oncostatine M, et d'autres facteurs moins définis, sont des protéines modulatrices de la différentiation et de la croissance produites par une variété de type cellulaire soit sous des conditions physiologiques normales soit en réponse à des stimuli exogènes. La plupart de ces

facteurs semble agir de manière autocrine et paracrine.

(Pour références voir: Goustin, et al., 1986, Cancer Res. 46: 1015-1029; Rozengurt, 1986, Science 234: 161-66; Pardee, 1987, Cancer Res. 47: 14881491; Sachs, 1986, Sci. Amer. 245: 40-47; Marshall, 1987, Cell 50: 5-6; Melcher and Anderson, 1987, Cell 30: 715-720; Clemens and McNurlan, 1985, Biochem. J. 226: 345-360; Nathan, 1987, J. Clin. Invest. 79:319-326; Sporn and Roberts, 1986, J. Clin. Invest. 78: 329-332; Old, 1987, Nature, 326: 330-331; Beutler and Cerami, 1987, New Eng. J. Med. 316: 379-385; Weinsteih, J. Cell. Biochem., 33: 213-224; Zarling, et al., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 83: 9739-9744; Sporn and Todaro, 1985, N. Eng. J. Med. 303:

878-880; Sporn and Roberts, 1985, Nature 313:, 745-747).

Des esters phorbol biologiquement actifs tels que le 12-0-tétradécanoylphorbol-13-acétate (TPA) sont

des promoteurs de tumeur potentiels in vivo et choisis-

sent et modulent une large gamme de réponses biochimiques et biologiques in vivo ainsi qu'in vitro (Blumberg, 1981,

Crit. Rev. Toxicol. 9: 153-197; Slaga, 1983, Cancer Surv.

2: 595-612). On sait depuis quelques temps que le TPA inhibe la croissance d'une lignée cellulaire MCF-7 d'adénocarcinome du sein humain. De plus, le TPA altère également la morphologie des cellules MCF-7 vu que les cellules traitées au TPA montrent les caractéristiques morphologiques des cellules sécrétrices (Osborne, et al., 1981, J. Clin. Invest. 67: 943951; Valette et al., 1987, Cancer Res. 47: 1615-1620). La présente invention a pour objet l'amphiréguline, AR, un nouveau facteur régulant la croissance cellulaire qui présente une activité inhabituelle bifonctionnelle régulatrice de la croissance cellulaire. L'amphiréguline inhibe la croissance des cellules néoplastiques, augmente cependant la croissance de certaines cellules normales. L'amphiréguline est une glycoprotéine très hydrophile ayant un poids moléculaire moyen de 22 500 daltons, qui existe sous deux formes distinctes cependant équivalentes fonctionnellement, une forme tronquée et une forme plus grande. Excepté pour les six résidus N-terminal trouvés sous la forme la plus grande, les deux formes sont parfaitement homologues sur le plan des acides aminés (figure 12). L'invention est partiellement basée sur la découverte des demandeurs du fait que les cellules MCF-7 traitées au TPA libèrent une glycoprotéine qui inhibe la croissance de la lignée cellulaire A431 de carcinome de kyste épidermique et d'autres lignées cellulaires de tumeur, mais qui augmentent la croissance des fibroblastes normaux humains

et de quelques autres lignées cellulaires.

L'invention est décrite au moyen d'exemple dans lesquels l'amphiréguline est identifiée, purifiée pour être homogène et profondément caractérisée dans sa structure et sa fonction. Dans d'autres exemples, l'isolation et le séquençage à la fois des clones du génome et de l'ADNc codant pour le précurseur d'amphiréguline, sont décrits. Ces clones sont utilisés pour préparer des vecteurs d'expression capables

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d'orienter la synthèse à un haut niveau d'amphiréguline active biologiquement dans des cellules h8tes eucaryotes

bactériennes transfectées et transformées.

Une large gamme d'utilisation de ce facteur unique est comprise dans l'invention décrite ci-dessous. L'invention sera mieux comprise, et d'autres buts, caractéristiques, détails et avantages de celle-ci

apparaîtront plus clairement au cours de la description

explicative qui va suivre faite en référence aux dessins schématiques annexés donnés uniquement à titre d'exemple et dans lesquels: - la figure 1 représente une HPLC de préparation à phase inverse de cassure et de lavage;

- la figure 2 représente une HPLC semi-

préparative à phase inverse de fractions regroupées 47 à 62, à partir de la figure 1; - la figure 3A représente une HPLC analytique à phase inverse du groupe I à partir du passage précédent; - la figure 3B représente une HPLC analytique à phase inverse analytiques du groupe II à partir du passage précédent; - la figure 4 représente une chromatographie d'exclusion sur gel des fractions à partir des figures 3A

et 3B sur des colonnes Bio-Sil TSK 250; la chromato-

graphie est réalisée comme décrit dans ce qui suit; (A) une HPLC de la fraction 35 concentrée (figure 3A); (B) une HPLC de la fraction 36 concentrée (figure 3A); (C) une HPLC de la fraction 37 concentrée (figure 3A); (D) une HPLC des fractions 41 et 42 ensemble concentrées (figure 3B); - la figure 5 représente une analyse de AR purifiée et de Spyridyléthylé-AR (SPE-AR) par une HPLC d'exclusion sur gel sur des colonnes Bio-Sil TSK 250; une chromatographie est réalisée comme décrit dans ce qui suit; les marqueurs de poids moléculaire utilisés sont l'ovalbumine, 43kD; la chymotrypsinogène A, 25kD; la ribonucléase, 14kD; et l'insuline, 6kD; (A) AR; (B)

SPE-AR;

- la figure 6 représente une analyse de AR et SPE-AR sur une colonne RPSC C3 à ultra pore à phase in- verse (4,6 X 75 mm); le gradient varie entre un solvant primaire 0,1% TFA et le solvant secondaire acétonitrile avec 0, 1% de TFA à une vitesse d'écoulement de 1 ml/min à température ambiante; des fractions de 1 ml sont récoltées; (A) AR; (B) SPE-AR; - la figure 7 représente une analyse SDS-PAGE des protéines AR; (A) un gel SDS-PAGE 15% (0,75 mm X 18 cm X 15 cm, Bio-Rad) avec un système tampon discontinu

sont mis en opération à un courant constant de 30 milli-

ampères. Les marqueurs de poids moléculaire utilisés sont la phosphorylase B, 92,5kD; BSA, 66,2kD; l'ovalbumine,

43kD; l'anhydrase carbonique, 31kD; la chymotryp-

sinogène A, 25,7kD; l'inhibiteur de trypsine de soja, 21,5kD; la lactoglobuline, 18,4kD; la lysozyme, 14,4kD ; l'aprotonine, 6,2kD; et une sous-unité de l'insuline, 3kD; couloir 1: AR; couloir 2: NG-AR; couloir 3: SPE-AR; couloir 4: NG-SPE-AR; (B) un minigel SDS-PAGE % (0,75 mm X 10 cm X 7 cm) est mis en opération sous un voltage constant de 200 volts. Les mêmes marqueurs de poids moléculaires cités ci-dessus sont utilisés; couloir 1: AR; couloir 2: NG-AR; couloir 3: NG-AR traité à la phospholipase séparée sur HPLC rp; - la figure 8 représente une analyse IEF de AR marquée au I125; les standards suivants ayant des valeurs de PI entre 4,65 et 9,6 sont utilisés: la I phycocyanine, 4,65; la Blactoglobuline B, 5,1; l'anhydrase carbonique bovine, 6, 1; l'anhydrase carbonique humaine, 6,5; la myoglobine chevaline, 7,0; la myoglobine de baleine, 8,05; O<-chymotrypsine, 8,8; et le cytochrome C, 9,6; - la figure 9 (A) représente une courbe de

réponse à une dose de AR sur l'inhibition de l'incor-

poration de désoxyuridine marquée au I125 dans de l'ADN de cellules A431; la figure 9 (B) représente lfeffet de AR sur la stimulation de l'incorporation de désoxyuridine marquée au 1125 dans de l'ADN de fibroblastes de prépuce humain (Sadamoto); - la figure 10 représente la compétition de la liaison de EGF marqué au I125 aux cellules A431 fixées ou aux membranes plasmatiques A431 par EGF murine et AR murine; des essais de liaison sont réalisés comme décrits ci-dessous; des échantillons de 100 il ou 50 >l

par puits sont utilisés pour des essais avec respecti-

vement des cellules fixées ou des membranes; Symbole Source réceptrice Agent de compétition * cellules fixées EGF *ú cellules fixées AR 0 membranes EGF membranes AR

- la figure 11 représente une analyse hydro-

thérapique de AR et EGF humain (Kyte and Doolittle); (A) AR (résidus 1 84); (B) AR (résidus 44 - 84); (C) EGF

(résidus i - 53); (D) précurseur de AR (résidus 1 -

252); (E) comparaison de AR humain (résidus 1 - 84) et de EGF (résidus 1 53) El'alignement selon la figure 13 est tel que la cystéine, résidu 46 de AR mature, correspond à la cystéine, résidu 6 de EGF matureU; - ia figure 1-2 représente une séquence d'acide aminé de AR mature et AR tronqué; l'unique lettre code standard pour les acides aminés, qui est utilisée est la

suivante: alanine (A); arginine (R); asparagine (N); -

acide aspartique (D); cystéine (C),; glutamine (Q); acide glutamique (E); glycine (G); histidine (H) isoleucine (I); leucine (L); lysine (K); méthionine (M); phénylalanine (F); proline (P); sérine (S); thréonine (T); tryptophane (W); tyrosine (Y); et valine (V); - la figure 13 est une comparaison des séquences d'acide aminé de l'amphiréguline (AR) et des membres de la super-famille EGF; - la figure 14 (A) représente la liaison de AR marquée au 125I à la cellulose (O--c), à la cellulose-ADN dénaturée (o-D), et à la cellulose ADN native (&-); la figure 14 (B) o la liaison de AR marquee au 125I à la cellulose (c--O) et à la cellulose-ADN (C --) est comparée à la liaison de EGF marqué au 125I à la cellulose (&-tA) et à la cellulose-ADN (v-.); - la figure 15 représente des peptides synthétiques de l'amphiréguline générés par une technique à phase solide; cinq peptides, correspondant aux résidus 166-184 (No. 259), 108-130 (No. 264), 31-50 (No. 279), 71-90 (No. 280) et 221-240 (No.281) sont produits par une synthèse à phase solide, puis purifiés par une HPLC à phase inverse; - la figure 16 représente une séquence de nucléotide et d'acide aminé déduite du clone ADNc pAR1, codant pour l'amphiréguline humaine; la figure 17 représente la séquence du génome de l'amphiréguline humaine; - la figure 18 est un diagramme schématique de la structure de l'exon et des domaines protéiniques de la molécule de AR, selon la séquence du génome; - la figure 19 représente une séquence de nucléotide du vecteur d'expression pDCHBAR1; - la figure 20 représente une séquence de nucléotide de pTacAPAR1; - la figure 21 représente une séquence de

nucléotide de pTacAPHILE.

La présente invention a pour objet l'amphiréguline (AR), les séquences de nucléotide codant pour AR et le précurseur de AR, et la production de AR par des méthodes traditionnelles ou des méthodes d'ADN recombinant. AR, un nouveau facteur régulateur de la croissance cellulaire, est exprimé et sécrété par des cellules MCF-7 traitées au TPA sous deux formes distinctes cependant équivalentes fonctionnellement. Les deux formes sont identiques structurellement excepté pour les six résidus supplémentaires N-terminal sous la forme la plus grande. AR présente une activité potentielle inhibitrice sur la synthèse d'ADN dans des cellules néoplastiques et donc a un potentiel comme composé puissant anti- tumorigène. La capacité de AR à stimuler la croissance dans les fibroblastes ou dans d'autres cellules normales est d'un intérêt particulier, suggérant que AR peut être utilisable dans des conditions de traitement qui nécessitent l'accélération de la croissance cellulaire, comme par exemple les brûlures et

les blessures.

AR, ou ses fragments et ses dérivés, ont une utilisation thérapeutique potentielle très large dans le traitement et le contrôle des néoplasies ainsi que dans le traitement des blessures. AR peut également trouver application dans la modulation de la résorption des os et la réponse immunitaire, et la stimulation de la cascade d'acide arachidonique. Le gène de l'amphiréguline et les produits de gène, les procédés pour leur production, leurs utilisations sont décrits dans plus détails dans la

partie descriptive et les exemples qui suivent.

L'amphiréguline est sécrétée par une lignée cellulaire MCF-7 de carcinome de sein humain lorsqu'elle est traitée avec l'agent stimulant la tumeur:

12-0-tétradécanoyle-phorbol-13-acétate (TPA).

L'amphiréguline peut être isolée à partir de milieux conditionnés de telles cellules MCF-7 cultivées traitées au TPA et ensuite purifiées à une haute activité spécifique. L'amphiréguline peut également être isolée à partir d'autres lignées cellulaires avec ou sans induction par un traitement avec du TPA ou d'autres agents stimulant la tumeur. De façon alternative, l'amphiréguline peut être produite par des techniques d'ADN recombinant, ou par une synthèse peptidique sous

phase solide.

L'amphiréguline peut être purifiée en utilisant différents procédés et techniques connus dans l'art, incluant mains n'étant pas limités à la chromatographie (tels que la chromatographie en phase liquide inverse, la chromatographie d'exclusion sur gel, la chromatographie par échange liquide, la chromatographie échangeuse d'ions, la chromatographie d'exclusion par taille, et la chromatographie d'affinité), à la centrifugation, aux

procédés électrophorétiques, à la solubilité différen-

tielle, ou par une quelconque autre technique standard

pour la purification de protéines.

Selon un mode de réalisation spécifique de l'invention, les cellules MCF7 sont traitées au TPA pendant 48 heures et sont mises en culture dans un milieu frais sans sérum pendant quatre jours. Le milieu conditionné résultant est récolté et utilisé pour

préparer de l'AR brute tel que décrit dans la description

qui suit. Une combinaison d'une chromatographie à phase liquide inverse et d'une chromatographie d'exclusion sur gel peut être utilisée pour purifier AR à une homogénéité

apparente, tel que décrit dans la description qui suit,

et aboutit à AR purifiée entre 1 842 fois et 2 270 fois par rapport au matériau de départ brut. La méthode est reproductible et produit des préparations de AR purifiée ayant des activités spécifiques entre 2,7 et 3,4 X 106 unités/mg de protéines. Dans l'application du procédé selon l'invention, la séquence codant pour le nucléotide pour l'amphiréguline humaine, ou son équivalent fonctionnel peut utilisée pour générer des molécules recombinantes qui conduiront à l'expression du produit amphiréguline humaine. La séquence codant pour le nucléotide pour AR peut être obtenue à partir de sources cellulaires qui produisent une activité telle que celle de AR. Par exemple, selon un mode de réalisation spécifique, la lignée cellulaire MCF-7 de carcinome de sein humain est utilisée comme source de la séquence codant pour le nucléotide AR. La séquence codante peut être obtenue par clonage de l'ADNc d'ARN isolé et purifié à partir de

telles sources cellulaires ou par clonage des génome.

Soit l'ADNc, soit des librairies'de gènes de clones, peuvent être préparés à partir de fragments d'ADN générés en utilisant des techniques connues dans l'art, incluant mais n'étant pas limitées à l'utilisation d'enzymes de restriction. Les fragments qui contiennent le gène pour AR, peuvent être identifiés suivant plusieurs manières connues dans l'art. Par exemple, une fraction de la séquence d'acide aminé de AR peut être utilisée pour déduire la séquence d'ADN, laquelle séquence d'ADN peut ensuite être synthétisée chimiquement, marquée

radio-activement, et utilisée comme sonde d'hybridation.

D'autres méthodes qui peuvent être utilisées pour isoler le gène AR incluent mais.ne sont pas limitées à la synthèse chimique de la séquence du gène lui-même à partir d'une séquence connue qui peut, par

exemple, être dérivée d'une séquence d'acide aminé de AR.

De façon alternative, une traduction in vitro de l'ARNm sélectionnée suivie par des essais fonctionnels ou immunologiques des produits traduits peuvent être utilisés. Le gène identifié et isolé peut ensuite être inséré dans un vecteur de clonage approprié. Un grand nombre de systèmes vecteur-hôte connus dans l'art peuvent être utilisés. Les vecteurs possibles incluent, mais ne sont pas limités aux plasmides ou aux virus modifiés, o

le système vecteur est compatible avec la cellule hôte.

De tels vecteurs incluent, mais ne sont pas limités aux bactériophages tels que des dérivés lambda, ou des plasmides tels que des dérivés de plasmides pUC ou PBR322. Des molécules recombinantes peuvent être introduites dans des cellules hôtes par transformation,

transfection ou électroporation, etc....

Selon un mode de réalisation particulier, le gène AR exprimé par des cellules MCF-7, est cloné en sélectionnant l'ARNm produit en réponse au traitement des cellules MCF-7 au TPA et en fabriquant une librairie d'ADNc dans le bactériophage AgtlO. Puisque des cellules MCF-7 non traitées ne synthétisent pas apparamment et ne secrètent pas de protéines AR, il est supposé que l'induction de AR par TPA peut également apparaître au niveau de la transcription et ceci de telle manière que la librairie d'ADNc pourrait être considérablement enrichie pour les séquences contenant AR. Le sondage de la librairie d'ADNc avec des oligonucléotides supposés les meilleurs et dégénérés basées sur la manipulation de codon humain (Lathe, 1985, J. Mol. Biol. 183:1-12 et tel que décrit dans le texte qui suit) résulte dans l'isolation de clones ADNc d'AR. Ces clones ADNc sont ensuite utilisés pour caractériser l'ARNm de AR et le gène AR. De plus, la

séquence du nucléotide de ADNc de AR (voir description

qui suit et figure 16) peut être utilisée pour déduire la

première séquence d'acide aminé de AR.

Du à la dégénérescence inhérente des séquences codant le nucléotide, d'autres séquences d'ADN qui codent sensiblement pour la même séquence d'acide aminé équivalente fonctionnellement peuvent être utilisées dans l'application des procédés selon l'invention. De telles alterations de la séquence des nucléotides de AR incluent les délétions, les additions ou les substitutions de différents nucléotides résultant dans une séquence qui code pour le même produit de gène ou son équivalent fonctionnel. Le produit de gène peut contenir des délétions, des additions, des substitutions de résidus d'acide aminé à l'intérieur de la séquence qui résulte dans des modifications silencieuses produisant ainsi un produit bioactif. De telles substitutions d'acide aminé peuvent être réalisées sur la base de similarité dans la polarité, les charges, la solubilité, l'hydrophobie, l'hydrophilie et/ou de la nature amphipathique des résidus entraînés. Par exemple, des acides aminés chargés négativement incluent l'acide aspartique et l'acide glutamique; des acides aminés chargés positivement incluent la lysine et l'arginine; des acides aminés avec des groupements non chargés polaires de tête ou des groupements de tête non polaires ayant des valeurs

similaires d'hydrophilie incluent la leucine, l'isoleu-

cine, la valine; la glycine, l'alanine; l'asparagine,

la glutamine; la sérine, la thréonine; la phényla-

lanine, la tyrosine.

L'ADNc de AR peut être utilisé comme sonde pour détecter l'ARNm de AR dans des cellules MCF-7 induites au TPA. L'ARNm de AR est approximativement de 1 400 bp en longueur. Comme décrit dans ce qui suit, l'ADNc de AR

peut être utilisé pour caractériser le gène de AR.

L'attribution du chromosome du gène de AR humain est déterminé par une hybridation in situ de ADNc de AR marqué au H à des chromosomes normaux en métaphase, révélant que le gène humain de AR réside sur la région 4q13- 21 du chromosome 4, région supposée être impliquée

dans la différentiation des lymphocytes (voir description

qui suit). L'ADNc est également utilisé pour isoler l'ADN du génome recouvrant le gène entier de AR, incluant la région de régulation 5'. On a trouvé que la longueur du gène de AR est d'environ lOkb, et que ce gène est réparti en 6 exons. La région de régulation 5' est incorporée dans un vecteur d'expression contenant un gène de

chloramphénicol acétyltransférase sans initiateur (CAT).

Cette construction est capable de stimuler la transcription du gène CAT lorsqu'il est introduit de manière transitoire dans des cellules MCF-7, et l'activité est stimulée 6 à 7 fois par l'addition de TPA

(voir description qui suit). Dans des modes de

réalisation spécifiques selon l'invention, la région de régulation 5' peut être utilisée dans des vecteurs d'expression pour contrôler la transcription du gène de AR ou d'autres gènes de structure. La construction chimérique AR-CAT peut également être utilisée pour rechercher des facteurs qui régulent l'expression de AR

comme décrit dans ce qui suit.

Pour exprimer une forme mature biologiquement active de AR, un système d'expression vecteur/hôte peut être choisi, qui fournit non seulement des niveaux élevés de transcription et de traduction mais également la construction correcte du produit de gène. Ceci est spécialement important lorsque l'on emploie la séquence entière codante du précurseur d'amphiréguline dans des constructions d'expression puisque la forme mature de l'amphiréguline semble être dérivée du produit précurseur par des événements cellulaires de fabrication. Par exemple, un système cellule hôte de mammifère peut être choisi pour sa capacité à fabriquer correctement et sécréter de l'amphiréguline dans un environnement extracellulaire. De manière spécifique, il apparaît que deux formes d'amphiréguline mature sont synthétisées comme la portion du milieu d'un précurseur commun de 252 acides aminés à partir duquel les deux formes matures sont libérées au moyen d'étapes ou opérations protéolytiques alternées. De plus, l'amphiréguline est glycosylée et peut subir une sulfatation à la tyrosine, soulignant de plus l'importance de la sélection d'un système d'expression qui est capable d'exécuter ces modifications post-traductionnelles si on le souhaite dans le produit fini. Une variété de systèmes de vecteur d'expression animal/h8te (tels que des vecteurs qui contiennent des éléments nécessaires pour conduire la réplication, la transcription et la traduction de la séquence codant l'AR dans une cellule hôte appropriée) peuvent être utilisés de manière ausssi bonne par l'homme de l'art. Ces systèmes incluent, mais ne sont pas limités aux systèmes virus de cellules hôtes vecteur/mammifère d'expression (tel que le cytomégalovirus, le virus de la vaccine, l'adénovirus, et leurs équivalents); les systèmes cellulaires de virus d'insectes vecteur/insecte d'expression (tel que le baculovirus); ou les systèmes non viraux d'initiateur d'expression dérivés des génomes de cellules de mammifères (tel que l'initiateur de souris métallothionine). Les éléments d'expression de ces vecteurs varient dans leur force et leurs spécificités. Selon le système vecteur/hôte utilisé, l'un quelconque du nombre d'éléments appropriés de transcription et de traduction peut être utilisé. Par exemple, lorsque l'on clone dans des systèmes cellulaires de mammifères, des initiateurs isolés à partir de génomes de cellules de mammifères (tel que l'initiateur métallothionine de souris) ou de virus qui grandissent dans ces cellules (tel que l'initiateur 7,5K du virus de la vaccine ou la longue terminaison répétée du virus de sarcome murin Moloney) peuvent être utilisés. Des initiateurs produits par des techniques synthétiques ou d'ADN recombinant peuvent également être utilisés pour réaliser la transcription des séquences insérées. Des signaux spécifiques d'initiation sont également nécessaires pour la traduction suffisante des séquences insérées codant pour la protéine. Ces signaux incluent le codon d'initiation ATG et les séquences adjacentes. Dans les cas o le gène entier de AR incluant son codon personnel d'initiation et ses séquences adjacentes sont insérées dans des vecteurs appropriés d'expression, aucun signaux supplémentaires de traduction de contr8le sont nécessaires. Cependant, dans les cas o uniquement une fraction de la séquence codante est insérée, des signaux exogènes de traduction de contr8le,

incluant le codon d'initiation ATG doivent être fournis. De plus, le codon d'initiation doit être en phase avec le cadre de lecture

des séquences codant pour AR pour assurer la traduction de l'élément inséré entier. Ces signaux exogènes de traduction de contr8le et les codons d'initiation peuvent être de plusieurs origines, à la fois naturelle et synthétique. L'efficacité de l'expression peut être améliorée par l'inclusion de séquences d'atténuation de transcription, d'éléments

enhancer, etc...

L'une quelconque des méthodes décrites précédemment pour l'insertion des fragments d'ADN dans un vecteur peut être utilisée pour construire des vecteurs d'expression contenant le gène AR et des signaux appropriés de contrôle de transcription/traduction. Ces méthodes peuvent inclure des techniques d'ADN recombinant

in vitro, des techniques synthétiques et des recombinai-

sons in vivo (recombinaison génétique).

Par exemple, dans les cas o un adénovirus est utilisé comme vecteur d'expression, la séquence codant pour AR peut être liée à un complexe adénovirus du contrôle de transcription/traduction, tel que le dernier initiateur et la séquence leader tripartite. Ce gène chimérique peut ensuite être inséré dans le génome

d'adénovirus par une recombinaison in vitro ou in vivo.

L'insertion d'une région non essentielle du génome viral (telle que la région El ou E3) peut résulter dans un virus recombinant qui est viable et capable d'exprimer AR dans des hôtes infectés. De façon similaire, l'initiateur

7,5K de la vaccine peut être utilisé.

Un système d'expression alternatif qui peut

être utilisé pour exprimer AR, est un système insecte.

Dans un tel système, le virus nucléaire de la polyhédrose Autographa californica (AcNPV) est utilisé comme vecteur pour exprimer des gènes étrangers. Le virus croit dans des cellules de Spodoptera frugiperda. La séquence codant

pour AR peut être clonée dans des régions non essentiel-

les (par exemple le gène polyhedrine) du virus et placée

sous contrôle d'un initiateur AcNPV (par exemple l'ini-

tiateur polyhedrine). L'insertion qui a réussi de la séquence codant pour AR pourra résulter dans l'inactivation du gène polyhedrine et la production d'un virus recombinant non-occlus (tel que le virus sans revêtement protéineux codé pour le gène polyhedrine). Ces virus recombinants sont ensuite utilisés pour infecter des cellules de Spodoptera frugiperda dans lesquelles le

gène inséré est exprimé.

Des vecteurs rétroviraux préparés dans des lignées cellulaires d'emballage amphotropique permet une expression de haute efficatité dans de nombreux types cellulaires. Cette méthode permet d'évaluer le processus spécifique de type cellulaire, la régulation ou la

fonction de la séquence insérée codant pour la protéine.

De plus, une souche de cellules hôtes peut être choisie, qui module l'expression des séquences insérées, ou qui modifie et fabrique le produit gène suivant la manière spécifique souhaitée. L'expression à partir de certains initiateurs peut être élevée en présence de certains inducteurs, (tel que le zinc'et des ions cadmium pour des initiateurs métallothionéines). Donc, l'expression de AR fabriquée génétiquement peut être contr8lée. Ceci est important si le produit protéine du

gène étranger cloné est léthal pour les cellules hôtes.

De plus, les modifications (tel que la glycosylation) et la fabrication des produits de protéine (tel que le

clivage) sont importants pour la fonction de la protéine.

Différentes cellules hôtes ont des mécanismes caractéristiques et spécifiques pour le processus post-traductionnel et la modification des protéines. Des lignées appropriées de cellules ou des systèmes hôtes peuvent être choisies pour assurer la modification correcte et la fabrication de la protéine étrangère exprimée. Des vecteurs d'expression qui peuvent être utilisés selon la présente invention incluent, mais ne sont pas limités aux vecteurs suivants: Plasmide pSV2Neo. Le plasmide pSV2Neo est décrit dans Southern et al., (1982) J. Mol. Applied Genetics

1,327-341.

Plasmide pSV2dhfr. Le plasmide pSV2dhfr (Subramani et al., 1981, Mol. Cell Biol. 1,854-864), contient le gène de la réductase dihydrofolate de la souris (dhfr) sous le

contr8le de l'initiateur SV40.

Plasmide pH3M. Le plasmide pH3M (Aruffo et al., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 84, 3365-3369), contient un initiateur chimérique composé d'un premier enhancer immédiat AD169 du cytomégalovirus humain (CMV) fusionné aux positions -67 à +80 de HIV LTR. Le LTR est suivi par un polylinker avec des sites 5'à 3': HindIII, XbaI, XhoI, BstXI, XhoI, PstI, et XbaI. Les petits signaux d'épissure/polyadénylation de l'antigène t à partir de pSV2 et une origine SV40 de réplication sont en aval du polylinker. Ce dernier permet l'amplication dans les cellules contenant le grand antigène T SV40 tel que les cellules COS et WOP. Un gène suppressif ARNt supporte la croissance dans des vecteurs basés pVX et des bactéries

portant le plasmide P3 tel que MC1061/P3.

Plasmide pH3M/b0ncM. Le plasmide pH3M/bOncM est obtenu à partir de Najma Malik, Oncogen. Il contient la séquence leader et non traduite simienne TGF-B 5' fusionnée avec la séquence codant pour l'Oncostatine M insérée dans pH3M aux sites (remplis) HindIII/XhoI. La séquence TGF-B consiste en une région non traduite 85 bp 5' commençant à un site HindIII (ayant pour origine le polylinker pSP65) et au site adjacent PstI à partir de i'ADNc de TGF-B, suivi par 87 bp codant pour la séquence signal de 29 acides aminés qui est normalement clivée entre une

séquence dipeptidique glycine-leucine.

Plasmide pH3ARP. Le plasmide pH3ARP est un vecteur sur la base de pH3M désigné pour l'expression transitoire du précurseur de AR dans des cellules COS. Il contient 13 bp de la région non traduite 5' de AR, et la région entière codante et les séquences non traduites 3'. Ce plasmide est généré par ligation du fragment 4 kb du vecteur pH3M digéré avec HindIII et XbaI, des oligonucléotides EVSAL3 et EVSAL4, et le fragment d'ADNc HgaI/XbaI 1,1 kb purifiés au gel à partir de pAR1. EVSAL3 et EVSAL4 sont complémentaires avec les sites 5' HindIII, EcoRV, SalI, et HgaI. La construction retient également les sites polylinker EcoRI à XbaI à partir de pEMBL18 suivant juste

la région non traduite 3'.

EcoRV HgaI HindIII SalI

EVSAL3 5' AGCTTGATATCGTCGA

EVSAL4 3' ACTATAGCAGCTGACGC

Plasmide pSVDR/bOM. Le plasmide pSVDR/bOM est obtenu à partir de Jeff Kallestad, Oncogen. C'est une fusion entre pSV2dhfr et pH3M/bOM et ceci fournit un vecteur avec un ADNc conduit par un initiateur CMV/HIV de pH3M bordé par une séquence signal TGF-B et des signaux de polyadénylation SV40 ajoutés au gène de souris dhfr conduit par un premier initiateur SV40. Ceci est généré par ligation de pH3m/bOM digéré au BamHI/NruI (rempli)

avec pSV2dhfr digéré au BamHI.

Plasmide pHras. Le palsmide pHras est un vecteur d'expression de mammifère développé par Stan McKnight,

Université de Washington, département de pharmacologie.

C'est un vecteur basé sur pML qui contient un fragment de 754 bp EcoRI à TthlllI de Harvey Ras LTR, un polylinker avec SmaI, BamHI, SalI, PstI, HindIII, et ClaI suivi par

un ADNc dhfr de souris et un signal de polyadényla-

tion/non traduit 3' du virus de l'hépatite B. La distance dans le polylinker à partir de BamHI au ATG de DHFR est

de 54 bp.

Plasmide pHLARGE. Le plasmide pHLARGE est une construction d'expression de mammifère qui contient les séquences du génome de AR 10 kb (SmaI à HindIII) conduit par le Harvey ras LTR et suivi par un gène non fonctionnel dhfr sans initiateur. I1 est formé par une ligation sous trois formes des fragments suivants: le fragment pHras SmaI/HindIII 4,6 kb; le fragment du génome de AR SmaI/HindIII 6,0 kb à partir de pARH12; et le fragment du génome de AR HindIII 6,4 kb à partir de pARH6. Plasmide phLARlpcD. Le plasmide phLARlpcD est une

construction polycistronique d'expression de mammifère.

Il contient la séquence d'ADNc du précurseur de AR suivie par le gène de souris dhfr conduit par un unique Harvey ras LTR. Le produit transcrit primaire est un message polycistronique avec 74 bp entre le codon stop de AR et le codon départ ATG de dhfr, permettant ainsi au ribosome de réinitier et à la traduction de continuer. pH3ARP est digéré avec EcoRV et le fragment 700 bp est isolé. Ce fragment contient une région non traduite 5' de AR 13 bp, la région complète codant pour le précurseur de AR, et 21 bp de la séquence non traduite 5'. Ce fragment est lié avec le vecteur pHras phosphatasé rempli et coupé au BamHI. Plasmide pLOSNL. Le plamide pLOSNL est obtenu à partir de 39 Dusty Miller, Fred Hutchison Cancer Research Center, Seattle, WA. Ce vecteur d'expression rétroviral est désigné pour la génération de stocks viraux sans aide amphotropique de haut titre, capable d'infecter mais non capable de répliquer dans une large gamme d'hôtes. Le vecteur contient: un virus LTR murin de leucémie muté Moloney avec conditionnement des signaux délétés; des séquences psi+; le gène de l'ornithine transcarbamylase (OTC) contenant deux sites XhoI pour l'insertion d'un ADNc et l'inactivation qui suit du gène OTC; SVENeo, un marqueur de sélection; le LTR 3'; et le squelette

résistant de Amp pBR322.

Plasmide pLARSNL. Le plasmide pLARSNL est une construction d'expression rétrovirale amphotropique contenant la région codant pour l'ADNc du précurseur de AR, avec une queue poly(A) manquante, conduit par le LTR viral. SV2Neo permet la sélection pour exprimer des transfectants. pLARSNL est généré par ligation du fragment SalI 800 bp à partir de pHLARGlpcD avec le fragment du vecteur pLOSNL phosphatasé et digéré avec

XhoI 7,7 kb.

Les cellules hôtes qui contiennent la séquence recombinante codant pour AR et qui exprime un produit mature biologiquement actif, peuvent être identifiées par au moins quatre approches générales: (a) une hybridation ADN-ADN, ADN-ARN ou ARN-antisens-ARN; (b) la présence ou l'absence de fonctions de gènes "marqueurs"; (c) l'évaluation du niveau de transcription comme mesuré par l'expression des transcrits ARNm de AR dans la cellule hôte; (d) la détection du produit de gène mature comme mesuré par immunoessai et, en dernière analyse par son

activité biologique.

Dans la première approche, la présence d'une séquence codant pour AR humaine insérée dans le vecteur d'expression peut 8tre détectée par une hybridation ADN-ADN en utilisant des sondes comprenant des séquences nucléotidiques qui sont homologues à la séquence codant

pour AR humaine.

Dans la seconde approche, le système d'expression recombinant vecteur/hôte peut être identifié et sélectionné sur la base de la présence ou de l'absence de certaines fonctions de gène "marqueur" (tel que l'activité thymidine kinase, la résistance aux antibiotiques, la résistance au méthotrexate, la transformation du phénotype, l'occlusion de la formation de corps dans un baculovirus, etc...). Par exemple, si la séquence codant pour AR est insérée à l'intérieur d'une séquence d'un gène marqueur du vecteur, des recombinants contenant la séquence codant pour AR peuvent être

identifiés par l'absence de la fonction du gène marqueur.

De façon alternative, un gène marqueur peut être placé en tandem avec la séquence AR sous le contr8le du même initiateur ou d'un initiateur différent utilisé pour

contr8ler l'expression de la séquence codant pour AR.

L'expressicn du marqueur en réponse à l'induction et à la sélection indique l'expression de la séquence codant pour AR. Dans la troisième approche, l'activité de transcription pour la région codant pour AR peut être évaluée par des essais d'hybridation. Par exemple, ARN polyadénylé peut être isolé et analysé par Northern blot utilisant une sonde homologue à la séquence codant pour

AR ou leurs fractions particulières. De façon alterna-

tive, les acides nucléiques totaux de la cellule hôte peuvent être extraits et testés pour l'hybridation à de

telles sondes.

Dans la quatrième approche, l'expression du produit de protéine mature peut être évalué de façon immunologique, par exemple par Western blots, par des

immunoessais, tels qu'une précipitation radio-

immunologique, des immunoessais de liaison aux enzymes et leurs équivalents. Le test final du succès du système d'expression, implique cependant la détection du produit de gène de AR actif biologiquement. Lorsque la cellule h8te secrète le produit de gène, les milieux sans cellules obtenus à partir de la cellule h8te cultivée du

transfectant peuvent être testés pour l'activité de AR.

Lorsque le produit du gène n'est pas secrété, les lysats

de cellules peuvent être testés pour une telle activité.

Dans d'autres cas, les essais biologiques tels que l'inhibition de la croissance et les essais de stimulation décrits ici ou leurs équivalents peuvent être utilisés. Le séquengage d'acide aminé de AR purifié révèle que la préparation comprend un'mélange inégal de

deux formes presque identiques de AR (voir figure 12).

Une forme, la plus large des deux, comprend grossièrement 16 % de la préparation. L'autre forme, une AR tronquée, comprend le restant et la plupart de la préparation, et diffère de sa forme correspondante plus longue uniquement par le fait qu'il manque'l'hexapeptide amino-terminal SVRVEQ. Les deux formes sont cependant parfaitement

homologues sur le plan des acides aminés.

AR est une glycoprotéine extrêmement hydrophile avec un poids moléculaire moyen relatif de 22 500 daltons. Un traitement N-Glycanase, qui retire le carbohydrate lié au N, provoque la migration de AR en une bande unique avec un poids moléculaire relatif de 14 000, en bon accord avec les calculs de poids moléculaire à partir des données d'une chromatographie d'exclusion sur gel. Sous des conditions non réductrices, AR migre de façon similaire. AR est par conséquent, une glycoprotéine

sous la forme d'une chaine unique.

La structure primaire AR est comparée avec de nombreuses séquences de protéines. Ces comparaisons montrent que AR est une protéine unique n'ayant pas une homologie de structure significative avec l'une quelconque des protéines comparées. La structure primaire de AR est cependant apparentée à plusieurs autres facteurs de croissance, dont la plupart appartienne à la superfamille des EGF. Il est raisonnable de classer AR comme un membre de ce groupe de protéines puisque plusieurs de ses propriétés de structure sont très proches des propriétés de structure hautement conservées trouvées parmi la famille de protéines EGF. Par exemple, la séquence N-terminal de AR ressemble aux séquences N-terminal de TGFO(, VGF, et MGF, en ce que cette région est riche en résidus de proline; sérine et thréonine. AR a également des sites de glycosylation marqués au N comme les régions précurseurs N-terminal des TGFs et VGF. AR montre de plus une homologie de séquence avec d'autres protéines comme EGF, avec la conservation de six résidus de cystéine.impliqués dans des ponts disulfure qui définissent la structure secondaire des formes matures de ces facteurs de croissance. Cependant, une analyse hydrothérapique révèle des différences significatives entre des séquences de EGF et AR homologues. Pour de plus amples comparaisons entre AR et d'autres membres de la super-famille de EGF, faire référence au tableau I, à la

figure 13 et à la description qui suit.

TABLEAU I

Protéines Espèces Région I Région # 2 EGF Humaine CLHDGVCMYIE CNCVVGYIGERC TGF-O Humaine CFH-GTCRFLV CVCHSGYVGARC VGF Vaccine CLH- GDCIHAR CRCSHGYTGIRC SGF Shope CLNNGTCFTIA CVCRINYEGSRC Facteur IX Humaine CLNXGSCKDDI CWCPFGFEGKNC Facteur X Humaine CQNXGKCKDGL CTCLEGFEGKNC Facteur XII Humaine CLHXGRCLEVE CHCPVGYTGPFC Protéine C Humaine CCGXGTCIDGI CDCRSGWEGRFC AR Humaine CIH-GECKYIE CKCQQEYFGERC Scores combinés homologues pour les régions 1 et # 2 Score EGF Score Score AR coagulation Famille de facteur de croissance >20 <20 440 Facteur de coagulation <25 >25 40 Sous-famille d'amphiréguline 420 <20 >40 Les séquences d'acide aminé de l'amphiréguline montrées dans la figures 12 ainsi que ses équivalents fonctionnels sont dans l'étendue de l'objet de l'invention. Par exemple, le produit amphiréguline peut contenir des délétions, des additions ou des

2 6 2 8 1 0 9

substitutions de résidus d'acide aminé à l'intérieur de la séquence qui résulte dans des modifications silencieuses produisant ainsi un produit bioactif. De telles substitutions d'acide aminé peuvent être réalisées sur la base de similarité dans la polarité, les charges, la solubilité, l'hydrophobie, l'hydrophilie et/ou la nature amphipatique des résidus impliqués. Par exemple, des acides aminés chargés négativement incluent l'acide aspartique et l'acide glutamique; des acides aminés chargés positivement incluent la lysine et l'arginine; des acides aminés avec des groupements de tête polaire non chargés ayant des valeurs d'hydrophilie similaire incluent: la leucine, l'isoleucine, la valine, la glycine, l'alanine; l'asparagine, la glutamine; la

sérine, la thréonine; la phénylalanine, et la tyrosine.

AR est une glycoprotéine à chaîne unique avec un poids moléculaire moyen d'environ 22500 daltons qui montre des activités bifonctionnelles modulant la

croissance sur une variété de cellules en culture.

Structurellement, AR est apparentée à la famille des EGF des facteurs de croissance et de plus, peut partager des similarités fonctionnelles avec d'autres membres de cette famille comme indiqué par la capacité de AR à effectivement entrer en compétition avec EGF pour la

liaison au récepteur.

AR est une protéine monomère qui nécessite des ponts disulfures intrachatne pour son activité, et qui ne nécessite pas de glycosylation pour ses activités biologiques, est stable sous des traitements acide et basique modérés et est stable sous des traitements à la chaleur à 56 C pendant 30 minutes. AR perd son entière activité biologique lorsqu'elle est réduite, lorsqu'elle est chauffée à 100 C pendant 5 minutes, lorsqu'elle est digérée avec la trypsine, l'endopeptidase de Lys-C,

l'endopeptidase de Arg, et l'endopeptidase de Glu.

Le clivage protéolytique par la phospholipase D semble convertir AR en un fragment actif ou en fragments avec un poids moléculaire relatif d'environ 5600, tel que déduit par une analyse SDS-PAGE. Des fragments actifs de AR font partie de la présente demande et sont discutés

plus loin.

AR a des effets potentiels anti-proliférants in vitro sur plusieurs lignées cellulaires humaines de cancer d'origine épithéliale. Par exemple, AR inhibe efficacement la synthèse d'ADN de carcinomes épidermiques de cellules de vulve A431, de cellules d'adénocarcinomes de sein HTB 132, de cellules cervicales de carcinomes de kystes épidermiques CRL 1550, de cellules d'adénomes

papillaires ovariens HTB 75, de cellules de tératocarci-

nomes ovariens HTB 1572, et de cellules d'adénocarcinomes de sein HTB 26. Une inhibition de 50% de la synthèse d'ADN est observée dans des cellules A431 traitées avec

0,13 nM de AR.

Des cellules normales de rein de rat NRK-SA6 normalement ne forment pas de colonies dans de l'agar mou. Cependant, la combinaison de EGF exogène et de TGF-B ajoutée au milieu de culture de ces cellules induit une croissance indépendante de l'ancrage, indiquant un phénotype transformé. Une combinaison de AR exogène et de TGF-B induit également une croissance indépendante de l'ancrage des cellules de NRK-SA6, bien que à un niveau plus faible (voir tableau V), une évidence directe du fait que AR et EGF sont fonctionnellement apparentées, ressort. L'action synergique de AR avec TGF-B implique fortement AR comme facteur important dans la régulation de la croissance cellulaire. Ainsi, la présente invention fournit des moyens de recherche qui n'étaient pas accessibles auparavant pour étudier l'histoire complexe et apparaissante du contr8le de la croissance cellulaire normale et de la perte caractéristique du contrôle de la

croissance dans des cellules néoplastiques.

AR induit également la prolifération de fibroblastes de prépuce humain (tableau IV). Une augmentation de deux fois dans la synthèse d'ADN dans ces cellules est observée à une concentration d'environ 50 pM de AR. Une stimulation maximum d'environ six fois

apparait à approximativement 5nM.

Le mécanisme par lequel AR signale l'inhibition de la croissance ou la prolifération cellulaire, n'est pas connu. Cependant, des études préliminaires visées à caractériser la liaison du récepteur à AR, suggèrent que AR peut avoir un récepteur spécifique. AR entre en compétition avec EGF pour se lier au récepteur-EGF et peut également entrer en compétition avec EGF pour se lier à d'autres récepteurs communs, incluant de façon possible le récepteur spécifique de AR lui-même. Il est connu que le ligant se liant au récepteur EGF initie un signal de stimulation de la croissance, en partie en activant l'activité de la tyrosine kinase. La liaison de AR au récepteur EGF peut initier de façon similaire une réponse proliférante ou, inversement, peut bloquer l'initiation d'un signal proliférant en limitant le nombre de récepteursEGF accessibles pour la liaison EGF

ou d'autres ligands générant un signal.

De façon alternative, un autre mécanisme par lequel AR inhibe la croissance cellulaire est possible et est suggéré par les données présentées par le tableau I. Quatre clones de la lignée cellulaire A431, ayant des sites de liaison variable EGF par cellule, sont testés pour la sensibilité à l'activité inhibitrice de AR. Le manque de corrélation observé entre la sensibilité de AR et le nombre de sites de liaison EGF par cellule suggère que le signal d'inhibition de la croissance générée par AR est initié par un évènement de liaison au récepteur qui n'implique pas le récepteur EGF. Un tel événement peut contrarier des signaux de prolifération de la croissance générée par d'autres facteurs de croissance tels que par exemple TGF-o. Ainsi, AR peut exercer son effet anti-proliférant en bloquant spécifiquement une réponse mitogène de cellule au TGF-d" ou aux autres

facteurs de croissance autocrines.

AR est une protéine extrêmement hydrophile, dont la séquence d'acide aminée génère un profil unique hydrothérapique ayant de petites similarités avec les profils des autres protéines de la famille EGF. (figure 11). AR est une protéine de base avec un point

isoélectrique (PI) de 7,6 à 8,0.

TPA induit une réponse pléiotrope sur les cellules, incluant des modifications dans la morphologie cellulaire, dans la prolifération cellulaire et la différenciation cellulaire, dans le transport membranaire, dans les interactions ligand-récepteur, dans la phosphorylation de la protéine, et dans le métabolisme phospholipidique. La protéine kinase C (PKC) est une 2+ protéine kinase dépendante des phospholipides et de Ca2+, qui fonctionne comme récepteur pour TPA. La liaison de TPA à PKC entraine la phosphorylation de nombreux substrats incluant des récepteurs de facteurs de croissance, des protéines du cytosquelette et des

protéines de régulation trans-activantes.

c-AMP est une autre molécule de régulation qui exerce des effets différents sur les cellules, principalement au travers de la protéine kinase A dépendante de cAMP. Des niveaux intracellulaires de cAMP sont régulés par une combinaison d'une activation d'un récepteur encastré et d'une inhibition de l'adénylate cyclase. Plusieurs études indiquent que l'expression de gène induit cAMP et TPA peut converger dans une voie commune. Pour étudier la régulation de l'expression du gène de AR, les demandeurs choisissent de rechercher l'effet de divers activateurs ou inhibiteurs de ces deux voies de régulation sur la production de l'ARN spécifique de AR dans des cellules MCF-7. La forskoline est un médicament qui active l'adénylate cyclase, résultant dans cAMP intracellulaire augmentée. Lorsqu'elle est administrée à des cellules MCF-7 à 25 >M pendant quatre heures, une stimulation marquée de l'ARN de AR est observée, suggérant que les voies de cAMP jouent également un r8le dans la régulation

de l'expression de AR.

La production et l'utilisation des dérivés, des analogues et des peptides apparentés à AR sont également envisagés et font partie de l'étendue de l'objet de l'invention. De tels dérivés, analogues et peptides qui montrent une activité modulant la croissance peuvent avoir des applications dans le diagnostic, le pronostic et le traitement d'une large gamme de néoplasies. De tels dérivés, analogues ou peptides.peuvent améliorer ou diminuer les activités biologiques en comparaison à AR native et/ou peuvent étendre ou limiter la gamme cellulaire sensible au GIA de AR et sont encore dans l'étendue de l'objet de l'invention. De façon similaire, la production et l'utilisation des dérivés, analogues et peptides apparentés à AR qui montrent une activité de stimulation de la croissance améliorée ou diminuée et/ou qui étendent ou limitent la gamme de cellules réagissant bien à l'activité de stimulation de la croissance de AR, peuvent trouver des applications utiles incluant, mais n'étant pas limitées au traitement des brûlures et des blessures. Les dérivés, les analogues, les peptides apparentés à AR selon l'invention, peuvent être produits par une large gamme de moyens connus dans l'art. Les procédés et les manipulations sur des plans génétiques et de protéine font partie de l'étendue de l'objet de l'invention. Sur le plan des protéines,- de nombreuses modifications chimiques peuvent être utilisées pour produire des dérivés comme AR, des analogues comme AR ou des peptides par des techniques connues dans l'art incluant mais n'étant pas limitées au clivage chimique spécifique par endopeptidases (tels que bromures de cyanogène, trypsine, chymotripsine, protéase V8 et leurs équivalents) ou par exopeptidases, acétylation,

formylatjon, oxydation etc...

La production d'anticorps polyclonaux et monoclonaux qui reconnaissent l'amphiréguline ou les protéines apparentées font également partie de l'objet de l'invention. Des procédés variés connus dans l'art peuvent être utilisés pour la production d'anticorps polyclonaux des épitopes de AR. Pour la production d'anticorps, divers animaux h8tes peuvent être immunisés par injection d'une protéine AR, ou d'un peptide synthétique de AR, incluant mais n'étant pas limités aux lapins, souris, rats etc.... Divers adjuvants peuvent être utilisés pour augmenter la réponse immunologique, dépendant des espèces h8tes, incluant mais n'étant pas limités aux adjuvants de Freund (complets ou incomplets) aux gels minéraux tels

que l'hydroxyde d'aluminium, aux substances tensio-

actives telles que la lysolécithine, des polyols pluroniques, des polyanions, des peptides, des émulsions d'huile, des hémocyanines de keyhole lympet, du dinitrophénol, et des adjuvants humains potentiellement utilisables tels que le BCG (bacille Calmette-Guerin) et

le Corynebacterium parvum.

* Un anticorps monoclonal d'un épitode de AR peut être préparé en utilisant une technique quelconque qui fournit la production de molécules anticorps au moyen de lignées cellulaires continues en culture. Celles-ci incluent mais ne sont pas limitées aux techniques d'hybridomes décrites à l'origine par Kohler et Milstein (1975, Nature 256, 495-497), et plus récemment pardes techniques d'hybridomes aux cellules humaines B (Kosbor et autres, 1983, Immunology Today 4:72) et par des techniques hybridomes- EBV (Cole et al, 1985, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp.

77-96).

Les fragments d'anticorps qui contiennent l'idiotype de la molécule peuvent être générés par des techniques connues. Par exemple, de tels fragments incluent mais ne sont pas limités aux fragments F (ab')2 qui peut être produit par la digestion par la pepsine de la molécule anticorps; les fragments Fab' qui peuvent être générés par réduction de ponts disulfures du fragment F(ab')2, et les deux Fab ou les fragments Fab qui peuvent être générés en traitant la molécule

anticorps avec de la papaine et un agent réducteur.

Des anticorps de AR peuvent trouver utilisation dans la détection quantitative et qualitative de AR mature et de ses formes précurseurs et sous-composés, dans la purification par affinité des protéines AR, et dans l'explication de la biosynthèse de AR, dans le métabolisme et la fonction de AR. Des anticorps de AR peuvent également être utilisés comme agents de

diagnostics et thérapeutiques.

La nature bifonctionnelle de AR fournit une large variété d'utilisations in vitro et in vivo. Un composé quelconque qui inclut AR, ou ses fragments ou ses dérivés qui montrent une activité inhibant la croissance et/ou stimulant la croissance, soit seul ou en

conjugaison avec d'autres facteurs de croissance biologi-

quement actifs, des inhibiteurs ou des agents immunomodulants, peut être employé dans la pratique et le

procédé selon l'invention.

La localisation du gène de AR à une région impliquée dans la différenciation des lymphocytes, suggère que AR peut jouer un rôle dans le développement cellulaire hématopoiétique, l'activation ou l'immunosuppression. Cette fonction est également supportée par l'homologie entre la région non traduite

AR3 et les régions similaires aux autres cytokines.

Les composés dont il s'agit peuvent être utilisés dans la modulation de l'angiogénèse, la résorption des os, la réponse immunitaire et les fonctions effectrices neuronales et synaptiques. AR peut également être utilisée dans la modulation de la cascade de l'acide arachidonique. L'oxydation enzymatique de l'acide arachidonique conduit à une multitude de produits importants tels que les prostaglandines, les thromboxanes, les prostacyclines, et des leucotriènes. De tels produits sont des agents extrêmement puissants omniprésents avec de nombreux effets physiologiques incluant, par exemple la contraction musculaire, l'aggrégation des plaquettes, la migration des leucocytes, et la sécrétion gastrique. AR, des molécules apparentées à AR, et leurs compositions peuvent être spécialement utilisées dans le traitement des blessures

et dans le diagnostic et le traitement du cancer.

AR peut être utilisée dans un procédé pour traiter les blessures, telles que des blessures cutanées, des blessures de la cornée, et diverses autres ruptures épithéliales stromales, telles que des ulcères chroniques, des brûlures, des incisions chirurgicales, des blessures traumatiques et des lésions des organes en cavités bordées d'épithélium, tels que l'oesophage,

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l'estomac, le petit et le gros intestin, la bouche, les conduits génitaux et urinaires. Le procédé dépend de l'application topique d'une composition de traitement

incluant AR dans un support acceptable physiologiquement.

Les compositions selon la présente invention peuvent être utilisées pour traiter une grande variété de blessures incluant pratiquement toutes les blessures cutanées, les blessures de la cornée et les lésions des organes en cavités bordées d'épithélium du corps. Les blessures appropriées pour le traitement incluent celles qui résultent des trauma, telles que les brûlures, les abrasions, les coupures et leurs équivalents ainsi que les opérations chirurgicales telles que les incisions chirurgicales et les greffes de la peau. D'autres conditions appropriées pour le traitement avec les compositions selon la présente invention incluent des conditions chroniques, telles que des ulcères chroniques, des ulcères diabétiques, et d'autres conditions non

cicatrisantes (trophiques).

AR peut être incorporée dans des supports acceptables physisologiquement pour l'application sur des surfaces affectées. La nature des supports peut varier largement et dépendra de la localisation recherchée de l'application. Pour appliquer sur la peau, une crème ou un onguent de base est habituellement préféré, les bases appropriées incluent la lanoline, le Silvadène (Marion) (particulièrement pour le traitement des brûlures), Aquaphor (Duke Laboratories, South Norwalk, Connecticut), et leurs équivalents. Si on le souhaite, il sera possible d'incorporer des compositions contenant AR sous la forme de bandages ou d'autres revêtements de blessure pour fournir une exposition continue de la blessure au peptide. Les applications aérosols peuvent également être utilisées. La concentration de AR dans une composition de traitement n'est pas critique mais pourrait être suffisante pour induire une prolifération cellulaire épithéliale. Les compositions peuvent être appliquées de façon topique sur les surfaces affectées, typiquement comme goutte pour l'oeil ou comme crèmes, onguents ou lotions pour la peau. Dans le cas des yeux, un traitement fréquent est souhaité, étant habituellement appliqué à des intervalles de quatre heures ou moins. Sur la peau, il est souhaitable de maintenir de façon continue la composition de traitement sur les surfaces affectées en cours de cicatrisation, avec des applications de la composition du traitement allant de deux à quatre fois

par jour ou plus fréquemment.

La quantité employée du polypeptide dont il s'agit variera avec la voie d'administration, l'emploi d'autres composés actifs et leurs équivalents, étant

généralement dans l'intervalle allant de 1 ig à 100 pg.

Le polypeptide dont il s'agit peut être utilisé avec un support acceptable physiologiquement, tel qu'une solution saline tampon phosphate, une solution saline ou l'équivalent. La quantité du composé employé sera déterminée de façon empirique sur la base de la réponse des cellules in vitro et la réponse des animaux expérimentaux aux polypeptides dont il s'agit ou des

formulations contenant les polypeptides dont il s'agit.

Les composés AR peuvent trouver une utilisation seuls ou en combinaison avec d'autres facteurs de

croissance, des inhibiteurs ou des immunomodulateurs.

Les compositions selon la présente invention peuvent être utilisées dans le diagnostic, le pronostic

et le traitement d'une large variété de néoplasies.

Un nombre d'utilisation comme diagnostic de AR et de molécules apparentées sont envisagées. Dans la pratique de l'invention, les polypeptides dont il s'agit

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sont liés à un marqueur tel qu'un radioisotope, une enzyme, un agent fluorescent, un agent chimique luminescent, un fragment d'enzyme, une particule, etc. De tels composés peuvent être utilisés pour titrer le nombre de récepteurs de AR sur une cellule. L'identification des récepteurs de AR est une indication de la bonne réaction potentielle de la cellule aux effets biologiques de AR et des molécules apparentées. AR, les molécules apparentées à AR et/ou leurs anticorps peuvent être utilisées dans des essais de compétition pour la détection de AR dans des milieux et plus particulièrement dans des milieux physiologiques. Une large variété d'essais de diagnostic

connus dans l'art peuvent être utilisés.

La présence et les niveaux de AR dans des fluides du corps et dans les tissus du corps peuvent directement ou inversement s'apparenter à la présence et à l'envahissement de certains cancers. Des essais qui peuvent détecter et/ou quantifier AR peuvent trouver une utilisation dans le diagnostic des cancers et leurs

pronostics (voir texte ci-dessous).

La présente invention a également pour objet la détection de l'ARNm de AR. Des essais qui utilisent des sondes d'acide nucléique pour détecter des séquences comprenant toute la séquence du gène ou une fraction de la séquence du gène connu sont bien connus dans l'art et peuvent être utilisés. Des niveaux de ARNm de AR peuvent indiquer l'émergence ou l'existence de néoplasies et, par conséquent, des essais qui peuvent quantifier des niveaux de ANRm de AR fournissent un moyen de diagnostic de

valeur.

De plus, des cellules malignes exprimant le récepteur de AR peuvent être détectées en utilisant une AR marquée ou des molécules apparentées à AR dans un essai de liaison au récepteur, ou par l'utilisation d'anticorps du récepteur AR lui-même. Des cellules peuvent être distinguées selon la présence et la densité des récepteurs de AR, fournissant ainsi des moyens pour prévoir la sensibilité de telles cellules aux activités

biologiques de AR.

AR peut être utilisée comme un composé antinéoplastique. Pour une utilisation in vivo, les compositions dont il s'agit peuvent être administrées selon une variété de voies, incluant mais n'étant pas limitées à l'injection, l'infusion, l'application

topique, l'appplication parentérale, etc...

L'administration peut être dans un support quelconque acceptable physiologiquement incluant les solutions salines à tampon phosphate, les solutions salines, l'eau stérilisée, etc.... AR et les molécules apparentées peuvent également être encapsulées dans des liposomes et peuvent être conjuguées à des anticorps qui reconnaissent et se lient à des antigènes spécifiques cellulaires ou de la tumeur, fournissant ainsi des moyens pour cibler les

compositions selon l'invention.

AR peut être utilisée in vivo pour induire la

différentiation terminale dans les cellules des tumeurs.

De telles cellules ont dévié de leur voie ordinaire de différentiation cellulaire caractéristique des cellules

normales et sont capables d'une prolifération continue.

Des cellules normales, au contraire, se différentient en cellules qui sont incapables, sous la plupart des

circonstances, de divisions cellulaires consécutives.

Ainsi, la capacité de AR à réactiver la différentiation de cellules normales dans des tumeurs et, à la fin à arrêter la croissance de tumeurs qui continue, peut trouver une utilisation de valeur dans des régiments

thérapeutiques des tumeurs.

AR et des dérivés apparentés, leurs analogues et leurs peptides peuvent être utilisés seuls ou avec au

moins un autre composé antiproliférant incluant, par -

exemple, un interféron, TGF-B1, TGF-B2, un facteur B de nécrose des tumeurs, un facteur- O de nécrose de tumeurs, etc., dans le traitement des carcinomes en réponse hormonale qui peuvent affecter une large variété d'organes tels que les poumons, le sein, la prostate, le colon, etc.... Des carcinomes en réponse hormonale peuvent également être traités par une production induite de AR dans des cellules de carcinomes. Les inducteurs incluent mais ne sont pas limités aux estrogènes tels que le 17-B estradiol, des composés avec une activité estrogène et des composés avec une activité anti-estrogène tel que le tamoxifène. Une combinaison quelconque de ces composés peut également être utilisée

comme inducteur.

Les composés selon l'invention peuvent être utilisés in vitro pour inhiber la croissance des cellules ou des lignées cellulaires sensibles à AR comme distingué à partir des cellules qui ne sont pas sensibles. Selon cette voie, des mélanges hétérogènes ou des lignées cellulaires peuvent être libérés des cellules non désirées, o les cellules non désirées sont sensibles à l'activité inhibitrice de la croissance de AR. Par exemple, les composés selon l'invention peuvent être utilisés in vitro pour éliminer des cellules malignes à partir de transplants de moelles autologues, et pour éliminer ou inhiber la prolifération des cellules

malignes dans le sang avant la réinfusion.

La concentration la plus efficace de AR pour la profilération inhibante d'une cellule donnée peut être déterminée en ajoutant différentes concentrations de AR à la cellule de la tumeur intéressée et en contrôlant la quantité d'inhibition de la prolifération cellulaire. La concentration la plus efficace des inducteurs individuels et/ou des combinaisons d'inducteurs peut être déterminée en contrôlant la production de AR dans les cellules de carcinomes. Les paragraphes ci- dessous décrivent la purification et la caractérisation de l'amphiréguline

produite par des cellules MCF-7 traitées au TPA.

Les procédés suivants sont utilisés pour induire la syntèse de AR dans des cellules MCF-7 et pour

préparer et caractériser une AR sensiblement pure.

Des protéines sont analysées sur des gels slab SDS-PAGE (système normal ou mini Bio-Rad) comme décrit (Laemmli, 1970, Nature 227: 680-685); et sont détectées par des tâches d'argent (Merril et al., 1981, Science

211:1437-1439).

La focalisation isoélectrique est réalisée essentiellement comme décrit par la feuille de données

de Isolab Technical pour des gels Resolve IEF.

Brièvement, des échantillons sont chargés sur des gels d'agarose préfabriqués (85 X 100 mm, pH 3-10) et sont focalisés sur une unité d'isoélectrofocalisation de modèle Resolve FR-2500 utilisant un appareil de puissance électrophorétique contr8lé par un ordinateur 3000 Xi de modèle Bio-Rad. Des standards Bio-Rad IEF sont focalisés le long de l'échantillon, tâchés, et le gel sec exposé à un film de AR, Kodak X-Omat, avec un écran renforçateur

et illuminant DuPont Cronex.

Des protéines sont marquées avec 125I utilisant

un procédé T chloramine (Barridge, 1978, Methods Enzymol.

: 54-65).

Des concentrations de protéines sont déterminées par absorption à différentes longueurs d'onde (210 à 280 nm). Les procédés de Lowry (Lowry et al., 1951, J. Biol. Chem. 193: 265-275) et de Bradford (1976, Anal. Biochem. 72: 248-252) sont utilisés avec une

albumine de sérum bovin comme standard.

Des essais de liaison sont réalisés soit dans des plaques de culture de tissu de 48 puits, lorsque des cellules A431 sont fixées à la formaline et/ou mises en croissance fraichement, sont utilisées comme décrit (Carpenter, et al., 1979, J. Biol. Chem. 254, 4484-4891; Shoyab, et al., 1979, Nature 279: 387-391; DeLarco, et al., 1980, J.Biol. Chem. 255: 36853690), soit en immobilisant des membranes du plasma sur des plaques de 96 puits de chlorure de polyvinyle comme décrit (Kimball

and Warren, 1984, Biochem. Biophys. Acta 771: 82-88).

Des cellules MCF-7 sont mises en culture dans des récipients de culture de tissu T 150 Corning dans un volume total de 25 ml de 50% IMDM (Iscove's Modified Dulbecco's Media) +50% DMEM contenant 0,6 jpg/ml d'insuline et 15% de sérum de bovin foetal inactivé à la chaleur (milieu complet MCF-7). Approximativement 1 X 106 cellules sont ensemencées par récipient et incubées à 37 C avec 5% de C 02. Le sixième jour, tous les milieux sont retirés et 20 ml de milieux frais complets de MCF-7 contenant 100 ng/ml de TPA sont ajoutés à chacun des récipients. 48 heures plus tard, les milieux sont retirés et cbaque récipient rincé avec 15 ml de 50% de IDMM + 50% de DMEM (milieu sans sérum) et 25 ml de milieu sans sérum frais sont ajoutés à chaque récipient et incubés à 370C avec 5% de C02. Quatre jours plus tard, les milieux sans sérum conditionnés sont récoltés centrifugés pour retirer les débris et conservés à -20 C. Les récipients sont à nouveau alimentés avec 25 ml de milieux sans sérum et les milieux sans sérum conditionnés sont récoltés tous les trois ou quatre jours. Un aliquoQt de milieux conditionnés de chaque récolte est testé pour l'activité inhibitrice de la croissance (GIA) sur des cellules de carcinome de kyste épidermique humain A431. Habituellement, trois à quatre échantillons de milieux conditionnés sont récoltés à partir de chaque bain de cellules de MCF-7 traitées au TPA. Environ 4 500 ml de milieux conditionnés sont dégelés et centrifugés à 4 C pendant 15 minutes à 3 500 tours par minute. Le surnageant est concentré dans un

concentrateur Amicon de 2 litres en utilisant une mem-

brane YM10 (Amicon) à 4 C. Lorsque le volume du rétentat devient environ 200 ml, 1000 ml d'eau froide Mili-E-Q

sont ajoutés et le mélange est reconcentré à 200 ml.

Le concentrat est retiré et transféré dans une

bouteille centrifuge prérefroidie de 250 ml Corning.

L'acide acétique concentré est ajouté doucement tout en agitant à la concentration finale de 1M en acide acétique. Le mélange peut rester une heure à 4 C et est centrifugé pendant 20 minutes à 40 000 X g à 4 C dans une centrifugeuse Sorval RC-5B. Le surnageant est retiré et conservé à 4 C. Les pastilles sont mises en suspension dans 30 ml d'acide acétique 1M et recentrifugées comme décrit ci-dessus.,Le surnageant est encore retiré avec précaution et est regroupé avec le premier surnageant et ensuite dialysé contre 17 litres d'acide acétique 0,1 M dans une canalisation de dialyse sprectrapore No. 3 (poids moléculaire coupé d'environ 3000). Le tampon de dialyse est changé trois fois sur une période de deux jours. Le rétentat est lyophilisé. Le matériau sec est retiré, regroupé, pesé et conservé à - 20 C jusqu'à une utilisation postérieure. Ce matériau est appelé poudre brute. 950 mg de poudre brute (à partir d'environ 9 litres de milieu conditionné sans sérum) sont mis en

suspension dans 300 ml de 0,1% TFA (acide trifluoro-

acétrique) et centrifugés pendant 20 minutes à 7000 X g.

Le surnageant est retiré avec précaution et appliqué sur une colonne de préparation C18 (2,54 cm X27 cm; -105 microns; Waters) équilibrée avec 0, 1 % de TFA dans l'eau. Le support chromatographique est mis en suspension dans de l'acétonitrile (MeCN) avec 0,1 % de TFA, la boue est versée dans une colonne d'un diamètre de 2,54 cm, et la colonne est lavée avec 400 ml de MeCN avec 0,1 % TFA, et ensuite équilibrée avec 600 ml de 0,1 % de TFA dans l'eau. La vitesse d'écoulement est de 4 ml/min et la chromatographie est réalisée à température ambiante. La colonne est lavée avec 650 ml de 0,1 % de TFA dans de l'eau. Le matériel brisé et le matériel de lavage sont récoltés ensemble. Ensuitel'1élution par étape est réalisée comme suit: (1) 650 ml de 20 % de MeCN/H20 avec 0,1% de TFA, (2) 650 ml de 40% de MeCN/H20 avec 0,1 % de TFA, (3) 650 ml de 60 % de MeCN/H20 avec 0,1 % de TFA, et (4) 650 ml de 100 % de MeCN avec 0,1 % de TFA. Un aliquot est pris dans chaque fraction et testé pour le GIA. Environ 77% de l'activité totale GIA

apparaît dans les fractions brisées et-de lavage.

Les fractions de brisure et de lavage sont injectées isocratiquement sur une colonne de préparation Partisil 10 ODS-3 (10 microns, 2,2 X 50 cm, Whatman) attaché à un système (HPLC) de chromatographie liquide à haute performance (Waters). La vitesse d'écoulement est établie à 4 ml/min. Seulement l'échantillon est passé sur la colonne, la colonne est lavée avec 250 ml de 0,1% de TFA dans l'eau. Le gradient linéaire est généré entre le solvant primaire, 0,1 % TFA dans l'eau, et le solvant secondaire, l'acétonitrile contenant 0,1 % de TFA. Les conditions de gradient sont de O à 15 % pendant 10 minutes, 15 à 15 % pendant 30 minutes, 15 à 25% pendant minutes, 25 à 65 % pendant 100 minutes, et 65 à 100 % pendant 10 minutes. L'ensemble des solvants sont échelonnés HPLC. Des fractions de 14 ml sont récoltées et des aliquots de chacune des fractions sont testés pour le

GIA. De larges pics d'activité sont observés (figure 1).

Le premier pic d'élution (élué entre 20 à 23 %

d'acétonitrile) est ensuite purifié et caractérisé.

Les fractions 47 à 62 sont regroupées. 224 ml de 0,1 % de TFA dans l'eau sont ajoutés à la fraction regroupée. Le mélange est injecté isocratiquement sur une colonne de semi-préparation y-Bondapak-C18 (7,8 X 300 mm, Waters) à une vitesse d'écoulement de 2 ml/min à température ambiante. Les conditions de gradient linéaire sont de 0 à 17 % pendant 10 minutes, 17 à 17 % pendant 30 minutes, 17 à 25 % pendant 320 minutes, et 25 à 100% pendant 40 minutes. La vitesse d'écoulement est de 1 ml/min pendant le gradient et des fractions de 4 ml sont

récoltées. Des aliquots sont pris et testés pour le GIA.

Deux pics majeurs d'activité sont observés en éluant à des concentrations en acétonitrile approximativement

d'environ 20 % et 21 % respectivement (figure 2).

Les fractions 49-53 sont regroupées. 20 ml de 0,1 % de TFA sont ajoutés à la fraction regroupée. Le mélange est appliqué isocratement sur une colonne y-Bondapak-C18 (3,9 X 300 mm, Waters) à une vitesse d'écoulement de 1 ml/min à température ambiante. Les conditions de gradient sont de 018 % pendant 10 minutes, 18-18% pendant 30 minutes, 18-25% pendant 280 minutes, et 25-100% pendant 20 minutes. La vitesse d'écoulement est de 0, 4 ml/min et des fractions de 2 ml sont récoltées. La plupart de l'activité apparait à partir de la colonne à une concentration d'acétronitrile d'environ 21,5% (figure 3A). Les fractions 54-59 (figure 2) sont regroupées et chromatographiées exactement comme décrit ci-dessus pour la figure 3A. La plupart de l'activité est éluée de la colonne à une concentration d'acétonitrile d'environ

22,5% (figure 3B).

Les fractions 35 à 38 (figure 3A) sont concentrées individuellement à environ 70 Pl en utilisant un concentrateur Speed-Vac (Savant), auquel est ajouté un

volume équivalent d'acétonitrile contenant 0,1% de TFA.

Cet échantillon de 140 P1l est injecté dans deux colonnes Bio-sil TSK-250 (7,4 X 300 mm chacune,Bio-Rad) arrangé en tandem. L'élution est réalisée de fagon isocratique sous une phase mobile de 50 % d'acétonitrile/H20 avec 0,1% de TFA à température ambiante. La vitesse d'écoulement est de 0, 4 ml/min et la vitesse d'entraînement du support de diagramme est de 0,25 cm/min; 0,4 ml de fraction sont récoltés et les aliquots sont évalués pour le GIA. Des profils chromatographiques des fractions 35, 36 et 37 (figure 3A) sont montrées dans les figures 4A, 4B et 4C

respectivement.

Les fractions 41 et 42 (figure 3B) sont regroupées ensemble et concentrées à 70 i1 et ensuite soumises à une chromatographie d'exclusion sur gel comme décrit ci-dessus. Le profil chromatographique est donné à

la figure 4D.

Les essais sont réalisés dans des plaques de 96 puits plats (Falcon 3072). Des carcinomes de kystes épidermiques humains de cellules de vulve (A431) sont utilisés comme cellules test pour l'activité d'inhibition de la croissance (GIA) et des fibroblastes de prépuce humain (Sadamoto) comme cellules indicatrices de l'activité stimulatrice de la croissance (GSA). 3,5 X 104 dans 50 il de DMEM supplémenté avec 5% de sérum de bovin foetal inactivé à la chaleur (FBS), avec de la pénicilline/streptomycine (PS) et avec de la glutamine (milieu test) sont placés dans tous les puits exceptés les puits périphériques. Les puits périphériques reçoivent 50 Pl de PBS. Trois heures plus tard, 50 P1 de l'échantillon test dans les milieux testés, sont ajoutés dans chaque puits, pendant que les puits de contr8le reçoivent uniquement 50 il du milieu test. Trois puits sont utilisés pour chaque concentration de l'échantillon test. Les plaques sont incubées à 37 C pendant deux à trois Jours. Après ceci, 10>al d'une solution de désoxyuridine marqués au 125I-iodo-2'-125I E4 Ci/mg-0,5 mCi/ml (2 Pl/ml dans le milieu test): sont ajoutés dans chaque puits et les plaques sont incubées à 37 C. Après quatre à six heures, le milieu est aspiré de chaque puits, lavé une fois avec 200 p1 de PBS. Ensuite, 200 y1 de méthanol sont ajoutés dans chaque puits, les plaques sont incubées pendant 10 minutes à température ambiante, et le méthanol est retiré par aspiration. 200 11 d'hydroxyde de sodium 1M sont ajoutés dans chaque puits,

les plaques sont incubées pendant 30 minutes à 37 C.

L'hydroxyde de sodium est retiré avec des tampons titertek (Flow Labs). Les tampons sont transférés dans des tubes plastiques de 12 X 75 mm et dénombrés dans un compteur gamma pour quantifier l'incorporation de IIUdR. Une couche de base de 0,5 ml'de 0,5 % d'agar (Agar Noble; Difco Laboratories, Detroit, Michigan) dans % de FBS inactivé à la chaleur contenant du DMEM est aJouté à des plaques de culture de tissu de 24 puits Costar. 0,5 ml de 0,3 % d'agar contenant le même mélange milieu-FBS, 5-10 X 103 cellules test, et les facteurs destinés à être testés à différentes concentrations sont appliqués sur la couche basale de l'agar. Les plaques sont incubées à 37 C dans une atmosphère humidifiée de 5% de CO2 dans l'air et réalimentées après sept jours par addition de 0,5 ml de 0,3% d'agar contenant le même milieu et des concentrations du matériau test. Les colonies sont dénombrées non fixées et non tachées et le nombre de colonies plus grandes que 20 cellules sont

répertoriées entre les jours 7 et 14.

Des cellules A431 sont mises sur des plaques à 2,1X 104 cellules par puits dans un milieu de 0,3 ml (DMEM avec 10% de FBS, P/S, glutamine) dans des plaques de 24 puits Costar (environ 2 cm2 par puits) et incubées pendant 2 heures à 37 C. Ensuite, les échantillons test à différentes concentrations en duplicata dans 0,3 ml de milieu sont introduits dans chaque puits. Les puits de contrôle reçoivent le milieu sans aucun échantillon. Les plaques sont incubées à 37 C pendant 72 heures. Le milieu est ensuite aspiré, les cellules sont lavées avec 1 ml PBS par puits, détachées avec 0,5 ml de trypsine (0,5%)-EDTA (0,5 mM) et dénombrées en utilisant un

compteur Coulter.

AR (20-30 yg) est séchée dans un tube polypropyline microfuge de 1,5 ml, mise en suspension dans 100 yl d'urée 3 M dans TRIS-HCl 0,05 M à un pH de 7,5. Quatre pl de 2-mercaptoéthanol sont ajoutés au mélange, les contenus mélangés, rincés avec de l'azote, et incubés à 25 C. Après 2,5 heures, 4, 5 "l de 4-vinylpyridine fra!chement distillée sont ajoutés au mélange, le tube est encore rincé avec de l'azote et incubé pendant 2 heures à 25 C. Le mélange réactionnel est acidifié à un pH de 2,0 avec 10% de TFA. AR pyridyléthylée-S est purifiée par une HPLC rp en utilisant une colonne "Bondapak C18 (3,9 X 300 mm, Waters). La concentration d'acétonitrile est augmentée de façon linéaire (1%/min) pendant 55 minutes à une vitesse d'écoulement de 1 ml/min. Le solvant primaire est de 0,1% de TFA. AR Spyridyléthylée (SPE-AR) est éluée à environ 26,5% d'acétonitrile, approximativement à une concentration 4% d'acétonitrile plus forte que AR non traitée. AR ou AR S-pyridyléthylée (10-20 pg) est séchée dans un tube microfuge de 1,5 ml-polypropylène, mis en suspension dans 80 il d'un tampon phosphate de 0,1M à un pH de 5,5, 10-20 pl de N-Glycanase (0,25 unité/ pl, Genzyme) sont ajoutés, le mélange est incubé pendant 16 heures à 37 C et 0,9 ml de 0,2% de TFA sont ajoutés au mélange réactionnel et l'échantillon est injecté sur une colonne HPLC rp ultrapore RPSC C3 (4,6 X 75 mm, Altex) à une vitesse d'écoulement de 1 ml/min préalablement

équilibrée avec un solvant primaire 0,1% de TFA.

L'acétonitrile avec 0,1% de TFA est utilisé comme solvant secondaire. La concentration d'acétonitrile est augmentée linéairement (0,4% par minute) pendant 85 minutes à température ambiante. AR-N-déglycosylée et AR Spyridyléthylée N-déglycosylée est éluée approximativement à uneconcentration respectivement de

16,5 et 20,5% d'acétonitrile.

Le clivage avec l'endopeptidase Lys-C est réalisé dans 60 pl d'un tampon acide TRIS-acétique O,1M, à un pH de 8,0 à 25 C pendant 16 heures. Le rapport enzyme/substrat est de 1 à 5 (poids/poids). Les digestions de l'endopeptidase-Arg et S. Aureus V8 protéase sont réalisées dans 80 1pl de TRIS-HCl 0,05 M, à pH 8,0 et de bicarbonate d'ammonium 0,1M à 37 C pendant 16 heures. Le rapport enzyme/substrat est encore

d'environ 1 à 5.

Pour le clivage CNBr au résidu méthionine, 5 ug de AR S-pyridyléthylée traitée au N-Glycanase sont séchés dans un tube microfuge de polypropylène de 1,5 ml, mis en suspension dans 75 j'l d'acide formique 70% puis 25 pl d'une solution de CNBr (25 mg/ml dans HCOOH 70%) sont

ajoutés, mélangés et le tube est rincé avec de l'azote.

La réaction est réalisée pendant 22 heures à 25 C dans l'obscurité. Le mélange réactionnel est dilué à 1,1 ml

avec de l'eau et séché dans un concentrateur Speed-Vac.

L'échantillon séché mis en suspension dans 20 pl de 2-aminoéthanol, est laissé au repos pendant 10 minutes à 22 C et ensuite séché sous vide. Le mélange est mis en

suspension dans 0,9 ml de 0,2% de TFA.

Les peptides sont séparés sur une colonne HPLC C8 à phase inverse (4,6 X 100 mm, Whatman) reliés à un système HPLC (Waters). Un échantillon acidifié (pH 2,0) est appliqué sur la colonne équilibrée avec 0,1% de TFA (solvant primaire) à une vitesse d'écoulement de 1 minutes/ml et la colonne est ensuite lavée avec environ 15 ml de 0,1% de TFA. Les gradients linéaires sont utilisés entre le solvant primaire et le solvant secondaire acétonitrile avec 0,1% de TFA. Les conditions de gradient sont de O à 50% pendant 125 minutes à une

vitesse d'écoulement de 0,5 ml/minute.

Les échantillons séchés sont hydrolysés avec HC1 en ébullition constante (5,7 M, Pierce) contenant du phénol à 1% (volume/volume) sous pression réduite dans une cuve d'hydrolyse en verre hermétique-Teflon (Pierce) à 105 C pendant 16 heures. Les hydrolysats sont séchés dans un concentrateur Speed Vac (Savant Instruments) et dérivés avec du phénylisothiocynate pendant 20 minutes à température ambiante. Les dérivés d'acide aminé phénylthiocarbamyle sont analysés par une HPLC rp sur une colonne Octadécyle (4,5 X 250 mm, IBM). Le gradient linéaire est situé entre le premier solvant acétate de sodium 0,15 M à pH 6,4, 0,05% de triéthylamine titré à pH 6,4 avec de l'acide acétique et le second solvant acétonitrile à 60% à une vitesse d'écoulement de 1 ml/min

à 38 C.

Les séquences peptidiques sont déterminées avec un séquenseur en phase gaseuse de modèle 475 Applied

Biosystem tel que décrit (Hewick et al., 1981, J. Biol.

Chem. 256: 7990-7997). Trois précycles de dégradation de Edman sont réalisés avant l'application de l'échantillon pour chaque essai. 25% de TFA sont utilisés pour convertir les dérivés de Triazoline en acides aminés phénylthiohydantoine. L'identification des acides aminés phényl thiohydantoine est réalisée, en ligne, sur un analyseur Model 120A PTH (Applied Biosystem) tel que décrit (Hunkapiller and Hood, 1983, Science 219:

650-659).

à 100 unités de soit AR semipure (étape de semi-préparation rp C18), soit AR apparamment pure sont utilisées pour ces expériences (tableau 1). NGlycanase et 0-Glycanase proviennent de Genzyme Corp., Boston; toutes les autres enzymes proviennent de Boehringer Mannheim Biochemicals ou Worthington Biochemicals. Les traitements sont réalisés dans 50 à 200 pl d'un tampon approprié. Un excès d'enzymes est utilisé, habituellement

5 à 20 % (poids/poids) de la concentration de substrat.

Après les traitements, les échantillons sont analysés pour le GIA en retirant les matériaux d'interférence par différents moyens analytiques. Dans la plupart des cas, le pH de l'échantillon est ajusté à environ 2 avec 10% de TFA. Les échantillons sont appliqués sur une colonne RPSC C3 ultra-pore à phase inverse (4,6 X 75 mm, Altex) équilibrée avec 0,1% de TFA. La colonne est lavée ensuite avec le solvant primaire 0,1% de TFA. Puis l'élution est commencée en utilisant de l'acétonitrile avec 0,1% de TFA comme solvant secondaire. Les conditions de gradient sont de 0 à 50% pendant 0,2 minute et de 50 à % pendant 19,8 minutes. La vitesse d'écoulement est de 0,5 ml/min et des fractions de 2 ml sont récoltées. Les aliquots sont pris et testés pour le GIA. L'activité de

AR est éluée habituellement dans la fraction 4.

La liaison de AR à la cellulose d'ADN natif de thymus de veau, à l'ADN de thymus de veau dénaturé, et à la cellulose est réalisée comme décrit (Herick and Alberts, 1971, Methods in Enzymology 21:198). Les celluloses (10 mg) sont réhydratées dans 50 1pl d'un tampon de chargement (20 mM Tris à pH 7,4, 10% de glycérol, 1 mM EDTA, lmM B-mercaptoéthanol, 100 "g/ml BSA et 50 mM de NaCl). Les réactions sont réalisées en double dans des tubes eppendorf avec 300 pl d'échantillon de celluloses hydratées (volume condensé), ces échantillons étant lavés 5 lois avec un tamhpon de chargement. Ensuite, 0,2 ng de l'activité spécifique de AR marquée 125I de 425 yCi/pg ou d'une autre protéine marquée au 125I dans 250

- l d'un tampon de chargement, est ajouté à chaque tube.

Les échantillons sont mélangés et incubés à 4 C pendant minutes avec une agitation périodique et ensuite lavés lois avec 200 pl d'un tampon de chargement par lavage. L'élution est réalisée par étape avec 0,1M, 0,15M, 0,25M, 0,6M, 1 M et 2 M de NaCl dans un tampon de

chargement (5 lois avec 200y1 à chaque concentration).

Un matériau spécifiquement lié est défini à cette élution à une concentration de 0,25M NaCl ou plus. Le matériau éluant à une concentration de 0,15M NaCl ou moins est

considéré comme n'étant pas spécifiquement lié.

Les cellules MCF-7 mises en croissance sur un substrat plastique montrent des propriétés éphithéloides typiques: les cellules sont petites et polygonales en forme. TPA induit des modifications morphologiques dramatiques dépendant des doses. Suivant le traitement au TPA, les cellules MCF-7 perdent leur morphologie bien définie, deviennent rondes, et se dispersent. TPA met à jour une réduction dépendant de la dose dans un nombre de cellules et une augmentation du volume cellulaire

comparée aux cellules non traitées.

Des milieux conditionnés sans sérum à partir de cellules MCF-7 ne contiennent pas d'activité détectable

inhibitrice de la croissance pour des cellules A431.

Cependant, des surnageants sans sérum récoltés à partir des cellules MCF7 traitées au TPA pendant 2 à 3 jours sont trouvés comme inhibant la prolifération des cellules de carcinome de kyste épidermique A431. L'induction optimum de l'activité inhibitrice est observée entre 25 à ng/ml de TPA. Même après le retrait de TPA, des cellules MCF-7 traitées au TPA secrètent cette activité dans un milieu sans sérum pendant au moins 8 Jours. Bien qu'1ne réduction dans l'activité d'inhibition de la croissance est remarquée avec le temps après le retrait de TPA, ces résultats indiquent que l'amphiréguline induit ou augmente en expression dans les cellules MCF-7

qui ont été traitées au TPA.

Le tableau I résume l'effet de ces divers traitements physiques, chimiques et enzymatiques sur l'activité antiproliférante de l'amphiréguline. Le GIA

(activité inhibitrice de la croissance) de l'amphiré-

guline est résistant au traitement d'acide acétique 1M,

d'hydroxyde d'ammonium 1M, d'urée 6M, de métapériodate de-

sodium 0,01M, au chauffage à 56 C pendant 30 minutes et aux traitements avec la neuraminidase, la N-Glycanase, la 0-Glycanase, la Lipase, la phospholipase A2, C ou D. Cependant, l'activité est sensible au chauffage à 100 C pendant 10 minutesâà la réduction, à la réduction et au traitement au 4-vinylpyridine, et à la digestion avec les protéinases telles que la Trypsine, l'endopeptidase

Lys-C, l'endopeptidase-Arg et l'endopeptidase-Glu (V-8).

Ces résultats suggèrent que l'amphiréguline est une protéine contenant des cystéines dans des liaisons disulfures qui sont essentielles pour son activité biologique. Cette protéine doit contenir des parties lipo et/ou oligosaccharides qui ne sont pas obligatoires pour

son activité biologique.

2628 109

TABLEAU II

Effets des différents traitements sur le GIA de l'amphiréguline Traitement Contr8le pourcentage Acide acétique 1M pendant 2 heures à 4 C 102 NH40H 1M pendant 2 heures à 4 C 97 560 pendant 30 minutes 96 pendant 10 minutes 5 Urée 6M (2 heures à 25 C) 82 2-mercaptoéthanol 0,2M (2,5 heures à 25 C) 6 2-mercaptoéthanol + 4-vinylpyridine (2,5 heures à 25 C) + (2 heures à 25 C) 1 Métapériodate de sodium 0,01M (6 heures à 4 C dans l'obscurité) 86 TPCK - trypsine (6 heures à 37 C) 3 TPCK-trypsine + inhibiteur de la trypsine de soja (6 heures à 37 C) 82 Inhibiteur de la trypsine de soja (6 heures à 37 C) 109 Endopeptidase Lys-C (20 heures à 25 C) 5 Endopeptidase Arg (16 heures à 37 C) 4 Endopeptidase Glu (16 heures à 37 C) 6 Neuraminidase (16 heures à 37 C) 103 N-Glycanase (16 heures à 37 C) 90 O0-Glycanase (16 heures à 37 C) 102 Neuraminidase + N- Glycanase (16 heures à 37 C) 94 Neuraminidase + 0-Glycanase' (16 heures - à 37 C) 105 Phospholipase A2 (6 heures à 37 C) 82 Phospholipase C (6 heures à 37 C) 95 Phospholipase D (6 heures à 37 C) 80 Lipase (6 heures à 37 C) 111 Un résumé de la purification de l'amphiréguline est présenté dans le tableau III. Une purification de 1 842 fois avec un rendement de 5,1 % est obtenue pour une fraction TSK 250-I et une purification de 2 270 fois avec un rendement de 1,7 % est obtenue pour une fraction TSK 250- II. La méthode est reproductible. Les demandeurs ont purifié l'amphiréguline en quatre occasions différentes avec des résultats similaires. L'activité spécifique de l'amphiréguline purifiée tombe dans la gamme de 2,7 à 3,4 X 106 unités/mg de protéine. L'amphiréguline purifiée à partir de la colonne TSK-250-I ayant une activité spécifique d'environ 3,0 x 106 est utilisée pour des déterminations de structure et d'autres études biochimiques.

TABTEAU TII

Résumé de la purification de l'amphiréguline (GIA)

Fraction Volume Protéine GIA* Activité rendement purifi-

(mL) (Jig) (unites spécifique3 % cation X 107) unitésX10 (nombre par mg de fois) Brute 300 916.600 1363 1,49 100 1 Préparation C18 écoulement - thru et lavage 950 532.000 1052 1,98 77,2 1,3

Prépara-

tion rp

ODS 225 2.281 286 125,43 21,0 84,2

Semi-

prépara-

tion rp.

C18-I 20 339 '97 286,14 7,1 192,0

-II 20 235 92 391,49 6,7 262,7

Anal rp.

Cl-I 6 242 50 206,61 3,7 138,7

-II 6 173 46 265,89 3,4 178,4

TSK 250-I 3,6 25,5 70 2.745,10 5,1 1.842,3

I-A 1,6 6,6 15 '2.272,73 1,1 1.525,3

I-B 1,2 11,4 33 2.894,74 2,4 1.942,8

I-C 0,8 7,5 22 2.933,33 1,6 1.968,7

TSK 250-II 1,2 6,8 23. 3.382,35 1,7 2.270,0

* Les détails sont donnés dans les paragraphes qui suivent. Une unité de GIA est définie comme la quantité du facteur nécessaire pour inhiber de 50% l'incorporation

de 125I désoxyuridine dans des cellules A431.

Une chromatographie d'exclusion sur gel de AR et de AR-SPE sur une colonne TSK 250 (7,5 X 600 mm

Bio-Rad) est montrée à la figure 5A et 5B respectivement.

L'activité est coéluée avec le pic de la protéine (SA).

Le poids moléculaire de AR et de AR-SPE est déterminé à partir des données de la figure 5 et trouvé comme étant approximativement de 14 000 et 17 000 respectivement. Les poids moléculaires calculés à partir des structures de AR tronquée et de AR montrés dans la figure 12 sont approximativement de 8 500 et 9 100 daltons respectivement. AR et AR-SPE sont éluées.à des pics uniques symétriques à partir d'une colonne HPLC rp ultrapore RPSC C3 (4,6 X 75 mm, Altex) (figures 6A et B). Le GIA est coélué avec le pic de la protéine (figure 6A). Le AR-SPE est éluée à environ 21% en concentration d'acétonitrile, approximativement à une concentration d'acétonitrile plus forte de 4% par rapport à la protéine non traitée. Ces résultats suggèrent que AR est riche en résidus cystéine qui sont modifiés par le 4-vinyl pyridine, rendant ainsi AR plus hydrophobe de façon concomittante à une élution à une concentration plus

forte d'acétonitrile.

La figure 7A montre une analyse de AR, AR traitée N-Glycanase (NG-AR), le SPE-AR, et de SPE-AR traité au N-Glycanase (NG-SPE-AR) dans de l'acrylamide % sous des conditions réductrices (figure 7A). AR et SPE-AR migrent dans le gel en une bande unique diffuse et large avec un poids moléculaire relatif moyen de 22 500 dans une gamme d'environ 20 000 à 25 000 (couloirs 1 à 3). Le traitement de AR et de SPE-AR avec N-Glycanase

résulte dans une migration plus rapide de ces protéines.

NG-AR et NG-SPE-AR migrent en une bande unique avec des poids moléculaires moyens de 14 000 et 14 500 daltons, respectivement. Des résultats similaires sont observés lorsque les protéines sont testées dans un gel à 15% sous des conditions non réductrices (données non représentées). Le traitement de AR avec la neuraminidase, la 0-Glycanase, ou la neuraminidase et la 0-glycanase ensemble, n'altère pas sa mobilité électrophorétique dans le gel soit dans des conditions réductrices soit dans des

conditions non réductrices. Ainsi, AR est une glycopro-

téine à chaine unique contenant des chaines oligo-

saccharide liées à l'azote qui ne sont pas nécessaires

pour le GIA de AR in vitro.

Le traitement de NG-AR ou de AR avec la phospholipase D (PLD) (chou) résulte dans la réduction de GIA de 80% du contr8le. NG-AR traité au PLD est soumis à une HPLC-rp sur une colonne C3 et les pics actifs

purifiés sont analysés sur un SDS-PAGE 20% (figure 7B).

Une bande unique de Mr 5600 est observée. Ces résultats indiquent que PLD ou quelques protéases contaminantes dans la préparation PLD, convertit AR en fragments actifs. Une analyse IEF de AR marquée au 125I est réalisée comme décrit dans ce qui suit. AR focalise en une bande large unique avec un PI entre 7,6 et 8 (point isoélectrique) (figure 8). NG-AR focalise en une bande unique avec un PI d'environ 8,05. Ainsi, AR est une glycoprotéine liée à l'azote en une chaine de base unique. L'inhibition de l'incorporation de I-désoxyuridine dans l'ADN des cellules A431 en différentes concentrations de AR purifiée est donnée dans la figure 9A. Une inhibition de 50% de la synthèse d'ADN est observée à environ 0,2 ng/puits. Ainsi, l'inhibition de la synthèse d'ADN de 50% dans des cellules de carcinome épidermique humaines A431 est observée à

environ une concentration de 0,13 nM de protéine pure.

Cependant, il est à noter que le GIA de AR dépend des

26Z8109

conditions expérimentales telles que le nombre de cellules par puits (densité cellulaire), le temps d'application du facteur, la durée du traitement, la

concentration du sérum et d'autres variables.

Lorsque les cellules A431 sont mises en croissance en l'absence et en la présence de diverses concentrations de AR, et lorsque la croissance cellulaire est contr8lée par un comptage direct cellulaire, on a trouvé que AR inhibe la prolifération de A431 d'une

manière dépendante de la dose (données non représentées).

Ainsi, l'étendue de l'incorporation de 125I désoxyuridine dans l'ADN est une bonne mesure de la croissance cellulaire. La stimulation de l'incorporation de 125I-désoxyuridine dans l'ADN de fibroblastes de prépuce humain (Sadamoto) à différentes concentrations de AR purifiée est représentée à la figure 9B. Une stimulation en deux fois de l'incorporation de 125I-désoxyuridine est

observée à approximativement 0,7 ng/ml ou approximative-

ment 0,05 nM de AR. La réponse maximum est approximati-

vement à six fois la stimulation de l'incorporation de I-désoxyuridine dans ces fibroblastes. Ainsi, AR agit comme un facteur de croissance pour les fibroblastes

humains même en présence de 5% de FBS.

L'effet de AR sur l'incorporation de 125I-

désoxyuridine dans l'ADN de différentes lignées cellulaires tumorigènes ou non-tumorigènes humaines, et

de quelques lignées cellulaires non humaines, est étudié.

Les données sont représentées dans le tableau IV. AR inhibe la croissance de divers clones de cellules A431, de cellules HTB 132 de carcinome de sein humain, de cellules HTB 1575 de tératocarcinome d'ovaires humains, de carcinome épidermique humain de cellules du col CRL , d'adénome papillaire de cellules ovariennes HTB 75, et d'adénocarcinome humain de cellules de sein HTB 26. Il ne montre pas d'effets significatifs sur une variété de cellules (Tableau 3). AR stimule l'incorporation de I- désoxyuridine sur plusieurs lignées cellulaires de fibroblastes humains, sur des cellules de tumeurs humaines hypophysaires CRL 7386, des cellules HTB 77 d'adénocarcinome ovarien humain, des cellules de reins de callitriche africain BSC 1 et de cellules SA6 de reins de

rat. AR n'affecte pas de façon significative la prolifé-

ration des cellules T, B, ou des cellules endothéliales.

AR ne suprime pas les réponses des cellules proliférantes humaines et les réponses des cellules T cytotoxiques dans des réactions mélangées dans des cultures de leucocytes

(MLC).

AR est une protéine monomère qui nécessite des ponts disulfures intrachaine pour son activité, qui ne nécessite pas de glycosylation pour son activité, qui est stable sous des traitements acides modérés et des traitements de bases modérés et qui est stable sous traitement à la chaleur à 56 C pendant 30 minutes. AR perd complètement son activité biologique sous réduction, sous chauffage à 100 C pendant 5 minutes, sous digestion

de la trypsine, de l'endopeptidase Lys-c, de l'endopep-

tidase ARG ou l'endopeptidase GLU.

2628 1 0 9

TABLEAU IV

Effets de l'amphiréguline sur la prolifération des cellulesa Cellules Activité Activité indicatrices inhibitrice stimulatrice de la crois- de la croissance sance (unités) c (unités)b

Humain Carcinome de kyste épi-

dermique de vulve A431 125 Humain Adénocarcinome du sein

HTB 132 240

Humain Carcinome de kyste épi-

dermique de col

CRL 1550 28

Humain Adénome papillaire d'ovaires HTB 75 19 Humain Tératocarcinome d'ovaires

HTB 1572 55.

Humain Adénocarcinome du sein

HTB 26 5

Humain Mélanome A375 N.D. N.D.

FHumain Adénocarcinome du sein

ZR 75 30 N.D. N.D.

Humain Adénocarcinome du sein

MCF-7 N.D. N.D.

Humain Adénocarcinome de poumons

A549 N.D. N.D.

*Humain Adénocarcinome de protaste

PC3 N.D. N.D.

Humain Carcinome de colon H3347 N.D. N.D.

Humain Lymphoblastoide (cellules T)

CEM N.D. N.D.

Humain Cellules B transformées

au EBV N.D. N.D.

Humain Carcinome épidermique

de larynx Hep 2 N.D. N.D.

Humain Carcinome cervical CRL 1594 N.D. N.D.

Humain Adénocarcinome d'ovaires

HTB 77 25

Humain Fibroblastes de prépuce (Sadamoto) 225 Humain Fibroblastes de prépuce (Goodwin) 70 Bovin Cellules endothéliales

de coeur foetal N.D. N.D.

Murin Balb/3T3 N.D. N.D.

Simien Cellules BSC-1 de reins de callitriche africain 65 Rat Cellules de reins SA6 45 a 125 unités (GIA sur des cellules A431) de AR sont mises en suspension dans des milieux de test de 250

il, diluées en série 5 fois avec des milieux du test.

Six dilutions sont utilisées pour chaque cellule. Les fractions sont testées pour l'activité modulatrice de la croissance et les unités de GIA et GSA sont calculées. b Une unité GIA est définie comme étant la quantité de facteurs nécessaires pour inhiber l'incorporation de

125I-désoxyuridine dans des cellules à 50 %.

c Une unité GSA est définie comme étant la quantité de facteurs nécessaires pour augmenter l'incorporation de

I-désoxyuridine dans des cellules de 100%.

N.D. = non détectable.

L'effet de AR et EGF sur la formation d'une colonie de cellules NRK-SA6 dans de l'agar mou en l'absence et en présence de TGF-B, est testé et les résultats sont représentés dans le tableau V. EGF induit la croissance indépendante de l'ancrage, des cellules SA6, selon une manière dépendante de la dose en présence de TFG-B tandis que, AR a été trouvé comme étant un bon inducteur de pic de formation de la colonie SA-G dans de

l'agar mou (Tableau V).

TABLEAU V

Effet de AR et EGF sur la formation d'une colonie de cellules NRK-SA6 dans de l'agar mou Addition (par mL) nombre de colonie par 6 ensemencements Rien O TGF-B (1 ng) O AR (2 ng) O AR (4 ng) O AR (2 ng) + TGF-B (1 ng) 7 AR (2 ng) + TGF-B (1 ng) 8 EGF (2 ng) O EGF (4 ng) 6 EGF (2 ng) + TGF-B (1 ng) 30 EGF (4 ng) + TGF-B (1 ng) 114

Les essais sont réalisés comme décrit dans ce paragraphe.

Les colonies sont définies comme un cluster d'au moins

six cellules.

On a trouvé que AR inhibe la liaison de 125I-EGF aux cellules A431 ainsi qu'aux membranes plasmatiques A431 (figure 10). Une inhibition de 50% de la liaison de 125I-EGF aux cellules fixées et aux membranes est observée à environ 1,1 nM et 1,8 nM de EGF respectivement alors qu'une réduction de 50% dans la liaison de EGF aux cellules et aux membranes est observée à environ 1,8 nM et 5,7 nM de AR respectivement. EGF non marqué inhibe complètement l'interaction du récepteur à I-EGF à de plus fortes concentrations dans les deux systèmes. Cependant, la compétition maximum avec AR est respectivement de 75% et 50% pour la liaison aux cellules

et aux membranes.

Les courbes de compétition pour AR ne sont pas non plus parallèles-à celles observées avec EGF. Ces résultats suggèrent que AR montre une affinité plus faible pour les récepteurs EGF que EGF. Egalement, AR peut avoir un récepteur spécifique plus proche apparenté

au récepteur de EGF.

Plusieurs clones de la lignée cellulaire A431 avec une sensibilité variable à l'inhibition de AR sont sélectionnés et un manque de corrélation entre la sensibilité de AR et le nombre de récepteur de EGF par

cellule ou KD est observé (tableau VI).

TABLEAU VI

Manque de corrélation entre la sensibilité de l'amphi-

réguline de différents clones A431 et le nombre de KD de EGF-récepteur paramètres de liaison EGF Sensibilité relative Clone A431 Sites de liaison KD (NM) (GIA) à AR par cellule

A-3 4,6 X 105 1,80 34

F-8 9,8 X 105 3,13 20

A-2 5,1 X 105 1,38 11

A-8 5,3 X 105 3,18 1

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Divers clones de A431 sont sélectionnés par la croissance dans l'agar mou. La liaison EGF est réalisée comme décrit dans le paragraphe ci-dessus. KD et les nombres de sites de liaison sont calculés à partir de points Scatchard (Scatchard et al., 1949, Ann. N.Y. Acad. Sci.

51:660-672).

La séquence d'acide aminé de AR est déduite de

l'analyse de micro-séquence de la protéine S-pyridyléthy-

lée (SPE-AR) et des fragments générés par l'endopro-

téinase Lys C, le Staphylococcal aureus V8 et l'endopep-

tidase Arg. Les séquences de protéines tronquées et de la protéine contenant six acides aminés complémentaires sont comme suit: AR tronquée

1 10 20

V V K P P Q N K T E S E N T S D K P K R K K K G G K N G K

40 50

N R R N R K K K N P C N A E F Q N F C I H G E C K Y I

70 78

E H L E A V T C K C Q Q EY F G E R C G E K

AR plus grand

1 10 20

S V R V E Q V V K P P Q N K T E S E N T S D K P K R K K K

40 50

G G K N G K N R R N R K K K N P C N A E F Q N F C I

70 80 84

H G E C K Y I E H L E A V T C K C Q Q E Y F G E R C G E K

La séquence ci-dessus utilise l'abbréviation standard des acides aminés par une lettre pour chaque acide aminé. Les résidus d'acide aminé pour lesquels il y a un doute quant à leur identité, sont indiqués entre parenthèses. La lettre "X" correspond à un acide aminé qui a une identité inconnue. La quantité de AR plus large a été trouvée comme étant d'environ 16% par rapport à

celle de AR tronquée.

La séquence de protéine de AR est comparée avec toutes les protéines dans les données du National Biomedical Research Foundation (PIR 13). La banque de données de séquences génétiques (Bolt Beranek and Newman, Inc., Los Alamos National Laboratory; Release # 50) et la librairie de séquence d'ADN du Laboratoire de Biologie Moléculaire Européen (Release % $ 12). Ces recherches révèlent que AR est une nouvelle protéine et un membre de la superfamille de EGF des facteurs de croissance. Cette famille inclue EGF (souris, humain, rat, bovin, etc...), TGF- t, facteurs de croissance viraux (vaccine, myxo, et fibrome Shope), activateur plasmúnogène humain, facteur bovin IX, facteur humain X, récepteur LDL, protéine C bovine, protéine du noyau protéoglycane humaine, produit du gène de Drosophila Notch, produit du gène de la lignée 12 de C. elegans et le produit du gène spécifique de formation linéaire de cellule de hérissons de mer S. purpuratus. L'alignement de la structure AR avec les structures des protéines de la superfamille EGF révèle que AR, comme les autres membres de la superfamille EGF, contient les résidus de marque de contr8le des six essentielles cystéines, maintient la conservation de l'espacement des résidus cystéines et contient quelques uns des acides aminés hautement conservés caractéristiques. Il apparaît que AR tombe dans les membres de la famille de facteurs de croissance qui ressemblent à EGF, TGF et ceux qui ressemblent à MGF, SFGF, spécialement en ce qui concerne l'utilisation de l'asparagine. Par exemple, en position 2 (première cystéine = 1) tous les TGFs et EGFs ont la proline, VGF a la glycine, et MGF, SFGF et AR ont l'asparagine. Dans la même boucle, en position 7, les EGFs, VGFs ont la glycine, TGFs ont la glutamine, et MGF, SFGF et AR ont l'asparagine. Cependant, dans la troisième boucle, AR n'a pas le virage beta conservé en position 34 (soit une asparagine dans MGF, SFGF, et une glycine dans les autres membres) mais a un acide glutamique (virage faible beta potentiel). AR a une structure différente pour la troisième boucle hautement conservée qui peut affecter la liaison au récepteur. AR n'a pas les résidus asparagine utilisés de façon possible dans MGF et SFGF comme site de glycosylation à l'intérieur de la structure propre du

facteur de croissance.

La séquence N-terminal de AR a quelques analogies avec les séquences Nterminal des TGFs, VGF, et MGF dans le fait qu'elle est riche en prolines, sérines et thréonines et comme TGFs et VGF, a des sites de glycosylation potentiels liés à l'azote (en fait a un tel site) ainsi que la possibilité d'une glycosylation liée à O dans cette région riche en sérines, thréonines et prolines. Cette région est hautement conservée entre le N-terminus des précurseurs de TGF et le N-terminus de VGF

et apparait comme étant une région fortement glycosylée.

AR est une protéine extrêmement hydrophile, spécialement dans la région contenant des acides aminés 8 à 45 (figure 2). Le profil hydrothérapique de AR montre une petite similarité à ceux des autres membres de la famille EGF. Le profil hydrothérapique de la fraction

C-terminal de AR, malgré le fait qu'il soit structurel-

lement apparenté aux autres membres de la famille EGF, n'est pas comme les profils des autres membres de cette

famille (figures 11B et C).

AR marquée au 125I est testée pour sa capacité à se lier la cellulose, lacellulose ADN dénaturé et la cellulose ADN natif en utilisant l'essai décrit dans le paragraphe précédent. Les résultats présentés dans la figure 14A indiquent que AR se lie spécifiquement à la fois à la cellulose dénaturée et à la cellulose ADN natif mais ne se lie pas à la cellulose. La liaison de l'ADN natif est de 3 à 4 fois plus grande que la liaison à

l'ADN dénaturé.

La capacité de AR à se lier spécifiquement à l'ADN différencie AR de l'ensemble de tous les autres membres de la superfamille EGF. Par exemple, EGF ne peut pas se lier à la cellulose ADN (figure 14B). Les résultats suggèrent fortement que le domaine N-terminal hydrophile de 45 acides aminés de AR, non présent dans EGF ou dans d'autres membres de cette famille EGF, peut être une séquence de localisation nucléaire impliquée dans le ciblage de AR au noyau o le facteur interagit

avec l'ADN.

La production d'anticorps de AR et de AR synthétique et des peptides de précurseurs de AR, est

décrite dans le texte qui suit.

L'amphiréguline est produite et purifiée comme décrit dans les paragraphes précédents. Cinq peptides

correspondant aux résidus 31-50 (No. 279), 71-90 (No.

280), 108-130 (No. 264), 166-184 (No. 259), et 221-240 (No. 281) de la structure primaire de AR (figure 15) sont synthétisés par des techniques en phase solide sur un synthétiseur automatique de peptide Applied Biosystems Inc. comme principalement décrit (Merrifield, 1963, J. Amer. Chem. Soc. 85:2149). Les peptides synthétisés sont clivés à partir de supports en résine en utilisant un processus de clivage à haut HF (Tam et al., 1988, J. Amer. Chem. Soc. 105:6442). Les peptides synthétiques

sont purifiés par une HPLC phase inverse.

Les anti-sérums polyclonaux AR mature et pour des peptides synthétiques de AR, conjugués chimiquement à de l'hémocyanine keyhole limpet (KLH) sont préparés dans de jeunes lapins blancs adultes New-Zealand. Les peptides synthétiques sont conjugués à KLH comme décrit (Ishikawa et al., 1983, Immunoassay 4:235); AR mature n'est pas couplée. Les conjugués peptide ou AR sont émulsifiés avec un système adjuvant Ribi (Ribi Immunochem. Research, Inc., Hamilton, MT.). Une dose totale de 1 ml est administrée à chaque lapin: 0,8 ml intramusculairement à deux endroits dans chaque patte postérieure et 0,2 ml de

façon subcutanée à un endroit. Pour générer des anti-

sérums contre AR mature, 30 pg de AR mature sont utilisés pour l'inoculation primaire et 15 fg sont utilisés pour des injections subséquentes en rappel. Pour générer des anti-sérums contre des peptides synthétiques de AR, 100 fg de peptides conjugués sont utilisés pour l'inoculation primaire et 50 pg pour les rappels suivants. Les inoculations de rappel sont administrées toutes les 3 ou 4 semaines et les lapins sont saignés 10 à 14 jours après

les injections de rappel.

AR est radiomarquée avec 125I en utilisant la

méthode T chloramine (Barridge, 1978, Methods Enzymol.

50:54-65). 10 1l de sérums polyclonaux (ou dilution dans PBS) sont combinés avec 10 p1 de AR marquée au 125I (50 ng/ml, activité spécifique 425 yCi/pg) et 30 pl de PBS et testés essentiellement comme décrit (LeBier et al., 1982,

J. Immunol. 129:2287-2292).

Des sérums polyclonaux sont dilués 1:50 dans du PBS. AR marquée au 125I (1 pg/ml, activité spécifique 425 pCi/pg) est diluée à 1:200 avec TNEN/0, 1% de BSA (20 mM Tris pH 7,4, 5mM EDTA, 150 mM NaCl, 0,05% NP-40, 0,1% BSA). 10 ul de AR non marquée (1 mg/ml), 10 jal de sérums polyclonaux dilués et 30 "l de AR marquée 125I dilués sont combinés et incubés à température ambiante pendant 45 minutes. Une solution de protéine A- sépharose est préparée comme suit: 200 mg de protéine sèche A-sépharose de Pharmacia sont réhydratées avec 1,4 ml de PBS et 80 y1 du produit réhydraté est lavé et dilué à 400 pl avec une solution contenant 100 mM de Tris à pH 8,1, mM de NaCl, 0,5% Triton X-100, 2nM PPMSF, 1% d'Aprotinine et 0,05 pg/ml de Levpeptine. 20 Pm d'une solution de protéine A sont ensuite ajoutés au mélange et

sont laissés à incuber pendant 30 minutes supplémen-

taires. Les bandes de sépharose sont ensuite lavées deux fois avec 500 pl de TNEN/0,1%p BSA, resuspendues dans 50 pi de SB (80 mM Tris à pH 6,8, 3% SDS, 15% de glycol, 0,01% de bleu bromophénole, 5% de B-mercaptoéthanol) et chauffées à 100 C pendant 5 minutes. les échantillons sont centrifugés et les surnageants testés pour leur radioactivité dans un compteur gamma. Ce procédé détecte

à des quantités aussi petites que 100 pg de AR.

- Le procédé en phase solide micro-ELISA est modifié à partir du brevet américain No. 740 124 déposé le 30 mai 1985. Des microplateaux Terasaki sont préparés en additionnant à chaque puits 5 pl de peptides synthétiques de AR dilués dans du PBS à différentes concentrations, et en mettant ensuite la solution à sécher toute la nuit à température ambiante. 5% de Blotto dans du PBS sont ajoutés aux plateaux et sont laissés à température ambiante pendant 1 heure. Ensuite, 10 pl de dilutions d'une solution d'anticorps polyclonaux (dilués dans PBS/1% Blotto/0,05% Triton X-100) sont ajoutés dans chaque puits, lesdits puits étant incubés pendant 1 heure à température ambiante et ensuite lavés quatre fois avec du PBS. 5 pl de IgG anti-lapin de chèvre conjugué avec de la péroxidase (Cappel) à une dilution de 1:1000 du PBS/1% -Blotto/0,05% Triton X-100 sont ajoutés dans chaque puits qui sont incubés pendant 1 heure à température ambiante, et ensuite lavés six fois avec du PBS. 10 pl d'une solution Chromogan MicroEIA (Genetic Systems Corp.) sont ajoutés à une dilution de 1:20, et l'absorbance est ensuite lue à OD492 après 20 minutes et 40 minutes selon

le protocole de Genetic Systems Micro-EIA.

Des échantillons sont mis sous électrophorèse sur un gel de polyacrylamide 15% ou sur un gel de polyacrylamide tricine 16% et un appareil mini-gel BioRad. Le gel est ensuite placé de fagon adjacente à une feuille de nitrocellulose et est pris en sandwich dans la cassette de telle façon que la nitrocellulose soit positionnée sur le c8té cathodique. Le transfert de la protéine est réalisée en utilisant un courant de 400 mA à une puissance constante pendant 30 minutes. La nitrocellulose est ensuite retirée et plongée dans 2,5%

Blotto/PBS/0,2% NP-40 pendant la nuit à 4 C.

Le filtre nitrocellulose est ensuite exposé à un anti-sérum dilué dans un tampon de réaction 2,5% Blotto/PBS/0,2% NP-40 pendant 90 minutes à température ambiante sur une plate-forme oscillatoire, suivie par quatre lavages (5 minutes pour chaque lavage) dans 2,5%

Blotto/PBS/0,2% NP-40.

La protéine A conjuguée à la phosphatase alcaline (Cappel) diluée à 1:500 dans 2,5 Blotto/PBS/0,25% NP-40 est ensuite aJoutée à la feuille de nitrocellulose, et incubée pendant 60 minutes à température ambiante sur un plateau oscillatoire. Le filtre est lavé ensuite quatre fois (3 minutes pour chaque lavage) avec PBS/0,2% NP-40, suivi par 5 minutes dans un tampon "APS" (100 mM Tris pH 9,5, 100 mM NaCi, 5 mM MgCl2). Le fitre est développé dans un réactif de couleur (40 ml de tampon APS, 12 mg de 5bromo-4-chloro-3 indoyle phosphate (Sigma), 6,8 mg de nitrobleu tétrazolium (Sigma), fabriqué Juste avant l'utilisation et filtré à travers un filtre de 0,2 Vm refroidi brusquement avec de l'eau et ensuite laissé à sécher à l'air. Des sérums polyclonaux contre AR mature et des peptides synthétiques de AR sont caractérisés par radioimmunoprécipitation, radio immunoessai, ELISA, et Western blotting. Les résultats sont donnés dans le

tableau VII.

TABLEAU VII

Caractérisation des anticorps de l'amphiréguline et des peptides synthétiques de AR Sérums polyclonaux Méthode de l'essai pour RIP RIA ELISA WB AR Mature 1:256a 1:250 ND 1:250 (0,100 pb)b (1 ng) Peptide 259 1:256 ND ND ND Peptide 264 1:256 1:250 1:100 1:100 (0,100 pb) (5 ng) (0,1 ng)

1:500

(1 ng) Peptide 279 ND ND 1:100 ND (5 ng) Peptide 280 ND ND 1:100 ND (5 ng) Peptide 281 ND ND 1:100 ND (5 ng) a

a Dilution des anti-sérums nécessaires.

b b Les valeurs entre parenthèses indiquent la sensibilité

de la méthode.

RIP = radioimmunoprécipitation RIA = radioimmunoessai ELISA = essai immunoabsorbant à liaison enzymatique WB = Western blot ND = indéterminé Les exemples suivants décrivent le clonage et les analyses des ADNc codant pour le précurseur de l'amphiréguline à partir de cellules de carcinome du sein

humain, MCF-7 traitées au TPA.

ARN est isolé à partir de cellules sous-confluentes mises en croissance dans des récipients de culture de tissu T150 ou à partir d'échantillons de tissu gelé frais en utilisant un procédé Guanidinium tel

que décrit par Chirgwin (1979, Biochemistry, 18, 5294).

Les cellules à partir de quatre T150s sont lavées dans du PBS, trypsinisées, relavées dans du PBS et la pastille est remise en suspension dans 8 ml d'une solution d'isothiocyanate de guanidium 4M. L'ADN est cisaillé en

passant la solution à travers une aiguille de calibre 18.

L'échantillon est recouvert de 2,4 ml de CsCl1 5,7M dans un tube Beckman SW41Ti et centrifugé à 32 000 tours par minute pendant 20 heures à 20 C. Les pastilles sont remises en suspension dans 300 yl de CsCl 2,5 M, et

précipitées avec 2 volumes EtOH à température ambiante.

Les pastilles sont remises en suspension dans 300 1l de H20 puis 35 "l d'acétate de sodium 3M (pH 5,2) et 800 yl EtOH sont ajoutés et l'ARN précipite à -70 C. La précipitation est répétée et l'ARN est ensuite séché rapidement, remis en suspension dans 100 Yl de H20,

quantifié à OD260, et conservé à -700C.

Des fragments spécifiques de la région codant pour AR sont excisés à partir d'un gel agarose sous faible température (BioRad) et marqués avec 32P-TTP (NEN, 3000 Ci/mmol) en utilisant une première méthode de

randomisation développée par Feinberg (1983, Anal.

Biochem., 137, 266). Les désoxyribonucléosides non incorporés sont retirés par chromatographie sur une colonne Sephadex 50 de 1,5 ml. Les activités spécifiques

sont de façon typique 0,5 - 2,5 X 109 cpm/,g.

/ A/ /,

2 6 28 1 0 9

ou 20 pg de l'ARN total sont passés sous électrophorèse sur des gels de 1, 2% agarose/formaldéhyde pour une analyse Northern. Les gels agarose/formaldéhyde

sont préparés dans 40 mM d'acide N-morpholinopropane-

sulfonique (MOPS), pH 7,0/1 mM EDTA/lOmM acétate de sodium/2/2 M formaldéhyde déionizé (pH 5,6) dans un appareil gel IBI VCV avec des plaques gelées. L'ARN est dénaturée dans le même tampon avec du formamide 50% à C et soumis à 1 X MOPS, à 20-30 mA pendant 3 à 5 heures. Le gel est rincé dans 10 X SSC pendant 30 minutes et transféré sur des membranes Hybond-N (Amersham), réticulé aux UV (1200 pJoules), préhybridé et hybridé dans 5x SSPE (lxSSPE qui correspond à 0,18 M NaCl/10 mM phosphate de sodium, pH 7,7, 0,1 mM EDTA) 5x de Denhardt, 0,5% SDS, et 20 jg/ml d'ADN dénaturé de sperme de saumon comme support. Les hybridations sont réalisées à 42 C pendant 16 heures avec 2 x 106 cmp/ml de 32P-ARBP1. Les blots (taches) sont lavés plusieurs fois dans 2x SSC avec 0,1% SDS, à température ambiante suivies par lx SSC/0,1% SDS, à 65 C et exposées sur Kodak X-OMAT avec deux écrans d'intensification Dupont Lightning Plus à 70 C. Les bandes sont répertoriées (+) si nettement visibles après exposition pendant la nuit, (+/-) si visibles après trois jours d'exposition, et (++) si détectables après

6 heures.

Les cellules MCF-7 sont récoltées pour l'ARN

après traitement avec 100,g/ml de 12-0-tétradécanoyl-

phorbol-13-acétate (TPA) pendant 24, 40 et 72 heures. Le poly (A) +ARN est isolé à partir d'aliquots regroupés de ces échantillons et utilisé comme traverse pour la synthèse de l'ADNc à double brin essentiellement comme décrit (Gubler and Hoffman, 1983, Gene 25:263). L'ADNc terminé par G est lié à l'intérieur du site EcoRi de N gtlO en utilisant des adaptateurs olignonucléotides BR1 (Rose et autres., 1986, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.

83:1261-1265).

De manière spécifique, 5 ?g de poly (A)+ARN MCF-7 traité au TPA sont dénaturés à la chaleur et primés avec pg de Oligo(dT) en utilisant 100 U de transcriptase inverse dans un volume de réaction de 45 pl. La synthèse du second brin est réalisée avec 4 U de RNase H et 115 U E. coli ADN pol I. 10 Fg de polymérase ADN T4 sont utilisés pour retirer les parties faisant saillie 3', créant des terminaisons en bords francs. Le 6,8 pg entier de l'ADNc à double brin est criblé sur une colonne Sephadex G50 pour sélectionner les ADNc au-delà de 500 bp et ensuite 150 ng d'ADNc est coupé en terminaison dG avec la désoxynucléotidyle transférase terminale. L'ADNc terminé en dG est lié au site EcoRI de, gtlO en utilisant des adaptateurs BR1 (AATTCCCCCCCCCCCC). L'ADN lié est conditionné in vitro (Grosveld et autres., 1981, Gene 13:227-237) et placé sur E. coli C600 rKmK hfl avec une efficacité de 106 recombinants/ig ADNc. Les levées de nitrocellulose dupliquées sont prises sur 2,5 X 105 recombinants, et les filtres sont criblés avec des sondes d'oligonucléotides dégénérées et devinées comme les - meilleures marquées au [ 32p](tableau VIII, cidessous) dérivés de la séquence primaire de AR telle que déterminée par une dégradation automatique de Edman de AR S-pyridyléthylée réduite et traitée au N-Glycanase (voir

texte descriptif qui précède).

Tableau VllI.

Longueur Sonde Séquence (dégénérescence) Dégénéré

C K C Q Q E (Y)

ARD41 3' ACA TTT ACA GTT GTT CTT AT 5' 20

G C G C C C (64- fois) E C K Y I E: (Il) ARI)D51 3' CTT ACA 'TT'l' ATA T'AA CTT (;T 5' 20) C G C (; C (32- fois) IDcvinés commlO Etantles-meil1 eues

K N P C N A E F Q N F C

ARK31 3' TTC TTG GGT ACG TTA CGA CTC AAG GTC TTG AAG ACG 53

I Il G E C (K)

TAG GTA CCG CTC ACG 'ITT 5'

(Y) T E il 1, E A V T C J< C ARK41 3' AG TAA CTC GTA GAC ('I'C CGA CAC 'l(;(; A((; 'ITC ACG 67 Q Q E Y F G l, eR C G ( 1:)

GTC GTC CTC ATG AAA CCG CT'C GCC ACA C('(CG C'T' 5'

V V K P P Q 1) K T E S E

ARNT 3' CAC CAC TTC GGG G(;G GTC C'TG TTC TGT CTC AG(; (;'C 59

N N T S D K P K (R) co

TTG TGG AGA CTC TTC GGG TTG TG -

c> "O L'analyse de restriction révèle un manque de sites dans le produit inséré ADNc de pAR1 avec des sites uniques pour BsmI, EcoRV, HgaI, NaeI, PvuII, SmaI, et SstI, et deux sites pour SspI. Aucune digestion à l'intérieur du produit inséré n'arrive avec BamHI, ClaI, EcoRI, HindIII, KpnI, PstI, PvuI, SphI, StuI, et XbaI. Un fragment de 170 bp de BsmI à PvuII est isolé et utilisé pour sonder une seconde librairie d'ADNc de 100 000 recombinants qui est fabriqué essentiellement comme ci-dessus. 13 clones positifs sont identifiés ayant des produits insérés à l'intérieur de 300 bp à 1,3 kb, six étant plus grands que 1 kb et cinq qui contiennent un site unique SstI connus comme étant à l'intérieur de bp à partir de la terminaison 5' de pAR1. Quatre des cinq derniers produits insérés sont sous-clonés (pAR3, pAR5, pAR9, pAR13) pour d'autres restrictions et une analyse de séquence. L'ensemble de ces clones ont des cartes de restriction identiques sur la base de BsmI, EcoRV, PvuII, SstI, et SmaI, excepté pAR9 qui a une troncature 3' de 100 bp et qui a'été trouvé plus tard comme prenant son origine dans la trajectoire A5 de façon

présumée suffisante pour amorcer avec oligo(dT).

Les initiateurs d'oligonucléotides exacts sont utilisés pour séquencer les deux brins du clone pAR1 1230 bp en utilisant la réaction de terminaison au didésoxy nucléotide (Sanger et autres., 1977, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 74:5463-5467). Les nucléotides complets et la séquence d'acide aminé déduite du clone pAR1 est représentée à la figure 16. Un cadre de lecture ouvert de 965 bp commence au nucléotide numéro 1. Le premier AUG se lit en position 210 mais n'est pas conforme au consensus optimal Kozak pour les sites d'initiation de la traduction (Kozak, 1984, Nucleic Acids Research 12:857-872; Kozak, 1986, Cell 44:283-292) dû à l'absence d'une purine en position -3. Cependant, de tels triplets AUG peuvent servir comme codon iniateur comme l'a observé Kozak dans quelques 3% des messages examinés et la présence d'une adénosine en position -1 est d'une importance possible dans l'ensemble de ces AUG moins favorable dans l'ARNm de la AR. Bien qu'une seconde méthionine est localisée au nucléotide 378 qui n'est pas conforme avec la séquence consensus d'initiation, on pense que le premier AUG est le véritable site d'initiation de la traduction puisqu'il est suivi par une étendue de 19 acides aminés prédite de résidus hydrophobes de fagon prédominante interrompue par 3 prolines, typique d'une séquence peptidique signal

(Heijne, 1983, J. Biochem. 133:17-21).

Le cadre de lecture le plus long ouvert débutant avec une méthionine code pour un polypeptide de

252 acides aminés qui inclut le peptide signal résidu 19.

La séquence codante est précédée par 209 nucléotides d'une séquence non traduite 5' et est suivie par un signal de terminaison de traduction, TAA, et de 262 nucléotides et d'une séquence non traduite 3'. Une séquence de signal supplémentaire potentielle poly(A), AATAA, est localisée à 64 nucléotides en aval à partir d'une étendue de 15 résidus adénylés présumés comme étant la queue poly(A). La région non traduite 3' de AR contient quatre copies de la séquence ATTTTA, qui est également présente dans certaines lymphokines, cytokines et proto oncogènes. Dans GM-CSF, cette séquence module la déstabilisation de l'ARN et sa dégradation (Shaw, 1986, Cell. 46: 659-667). La conservation de ce motif dans des modulécules similaires fonctionnellement suggère que AR peut également être apparentée à cette classe de lymphokines. La séquence d'ADNc confirme la séquence

peptidique de AR mature (voir description ci--dessus)

excepté à l'acide aminé position 113 (figure 15) qui est séquencé comme l'acide aspartique (D) par une analyse de protéine et est déduite comme l'asparagine (AAT=N) à partir des clones de ADNc. Sur les cinq ADNc examinés, l'ensemble ont leurs extrémités 5' à l'intérieur des

premiers 25 bp de la séquence pAR1.

La comparaison de la séquence ADNc avec les sondes supposées les meilleures montre l'homologie d'ensemble de 74% (ARK 41) et 77% (ARK 31). Aucune sonde n'a plus de 8 bp consécutifs égaux, mais sur l'ensemble, à 67 nucléotides alignés pour ARK41 produisent un signal détectable sous des conditions de très faibles rigueurs. L'utilisation du codon par une séquence ARNm de AR diffère considérablement de l'usage des fréquences

rapportées par Lathe (Lathe, 1985, J. Mol. Biol.

183:1-12), expliquant comment les oligonucléotides

dégénérés fournissent des signaux plus forts dans ce cas.

A partir des séquences de protéine et d'ADNc, deux protéines, de poids moléculaire 9772 et 9173, sont présumées comme étant les deux formes de AR mature sur la base de l'ADNc (figure 16) et de la séquence de la

protéine (voir description qui précède). Le profil

hydrothérapique du précurseur de AR est représenté à la

figure 11D.

Le précurseur de AR a trois sites potentiels de N-glycosylation, l'un dans le domaine N-terminal (position 30 sur la figure 16) et deux dans la région hydrophile de AR mature (positions 113 et 119). La glycosylation est connue pour contribuer à 10-12 kd au poids moléculaire de AR mature et il semble qu'il y ait une addition de carbohydrate à l'un ou aux deux de ces

sites dans le domaine hydrophile.

Le domaine riche en sérine N-terminal du précurseur de AR (figure 15) contient trois sites potentiels de tyrosine sulfatation à y81 y83 y87 sur la base de la présence de résidus acidiques, d'acides aminés induisant un virage, et l'absence de résidus qui pourraient-contribuer à l'encombrement stérique (Huttner, 1987, TIBS 12:301-303). La plupart des protéines

sulfatées à la tyrosine sont des protéines sécrétrices.

Les demandeurs croient que les modifications de sulfatation à la tyrosine impliquent l'activation, le transport ou un processus protéolytique des protéines précurseurs. Le domaine riche en sérine de AR peut également contenir des chaines carbohydrates liées à 0 donnant l'abondance de résidus sérine/thréonine (23 sur 81) dans cette région de la molécule, qui sont des sites pour de telles liaisons. De ce fait, les formes 0glycosylées d'un autre membre de la famille EGF, TGF-, sont identifiées (Ignotz et autres, 1986, PNAS,

83, 6307-6311).

Aucun des résidus de sérine dans le précurseur de AR correspond à la séquence consensus pour les sites de phosphorylation kinase dépendant de cAMP (Grima, et al., 1985, Proc. Natl.Acad.Sci. U.S.A. 82:617-621), et ne permet à aucun des résidus de tyrosine de montrer une similarité de séquence bordant pour connaître les résidus phosphotyrosine. Le domaine hydrophile de la protéine AR mature est composé des nombreux acides aminés chargés positivement (16 des 37 résidus sont lysine ou argine) incluant deux étendues consécutives de 4 à 5 résidus basiques chargés. Le signal de ciblage nucléaire du grand antigène T SV40 est similaire à cette région de AR et contient une séquence caractéristique KKKRK précédée par des petits acides aminés (glycine, alanine, proline) qui peuvent permettre la formation d'une structure en héliceo (Burglin et al., 1987, EMBO 6: 2617:2625; Dingwall et al, 1987, EMBO 6:69-74). Une analyse de mutation définit quatre résidus basiques consécutifs comme la propriété prédominante de la séquence de localisation nucléaire SV40 (Lanford, 1984, Cell, 37, 801-813). D'autres protéines nucléaires avec des étendues similaires d'acides aminés basiques estimées comme étant impliquées dans le ciblage nucléaire, incluent la nucléoplasmine, le grand T virus polyome, les histones, et c-myc. La fusion de diverses séquences signal nucléaire aux gènes pour la pyruvate kinase de poulet, l'albumine, l'immunoglobuline, la ferritine, et la B-galactosidase, résulte dans la localisation de ces protéines autres cytoplasmiques au noyau (Moreland, 1987, Mol. Cell. Biol. 7:4048-4057). Si les séquences hydrophiles dans AR sont impliquées dans le ciblage, ce modulateur de la croissance au noyau n'a pas été vérifié; cependant, la capacité de AR à se lier spécifiquement à l'ADN implique que AR a un rôle fonctionnel à l'intérieur du noyau. De ce fait, AR peut réguler la synthèse d'ADN, le cycle cellulaire et une

variété d'autres événements nucléaires.

Le précurseur TGF- oQ contient de multiples cystéines dans le domaine cytoplasmique C-terminal dont certaines sont soumises à un attachement palmitate covalent (Bringman, 1987, Cell, 48, 429-440). Au contraire, il manque quelques cystéines dans le précurseur de AR dans son domaine cytoplasmique et par conséquent les demandeurs ne s'attendent pas à ce qu'ils contiennent des résidus palmitates. Bien que la fonction biologique de l'attachement palmitate soit inconnue, ceci représente cependant une autre différence entre AR et

d'autres membres de la superfamille EGF.

Une analyse Northern blot (Thomas, 1980, PNAS, 77, 5201) en utilisant des fragments ADNc de AR marqués auoi 32P montre l'hybridation à des espèces uniques d'ARN 1,4 Kb à partir d'une variété de tissus humains normaux et de lignées cellulaires de tumeurs. Une bande unique est observée sur Northern blots, en utilisant soit AREB1 (un fragment 480 bp BstEII-Pvu II de pAR1 contenant la région codante entière de AR mature et une partie du

précurseur N-terminal et des domaines de transmembra-

naires) soit AR170 (un fragment de 170 bp BBsmI - PvuII de pAR1 contenant uniquement la moitié du C-terminal de AR mature) comme sondes marquées. Les résultats présentés dans le tableau IX ci-dessous montrent que l'expression à faible niveau (+) de ARN de AR est observée pour des tissus de pancréas et de poumons d'adultes normaux. Plus bas, cependant, une expression détectable (+/-) est observée pour des tissus de cerveaux et de foie, de reins normaux.

Tableau IX

Tissus humains normaux ARN de AR Poumon +

Foie +/-

Pancréas +

Rein +/-

Rate

Cerveau +/-

Placenta Intestin, foetus Puisque AR a été isolée à l'origine à partir de cellules MCF-7 traitées au TPA, il est intéressant de déterminer le temps d'opération pour l'induction au TPA de l'ARN de AR dans ces cellules. Les cellules MCF-7 sont traitées au TPA pendant 0, 1, 3, 6, 18, 24 et 48 heures, l'ARN total est isolé et 10 pg sont testés sur chaque couloir d'un gel d'agarose formaldéhyde 1,2%, transféré sur des membranes nylon et criblées avec une sonde ARBP1

complémentaire de la région codante entière de AR mature.

Une augmentation importante dans les espèces ARN de AR 1,4 kb est observée dès 1 heure après le traitement avec TPA, avec des niveaux maximum atteints entre 18 et 24 heures. Ensuite, des Northern blots, sondés avec 32P-ARBP1, montrent une simulation au TPA de la synthèse d'ARN de AR dans deux autres lignées cellulaires de

8- R268109

cancer du sein bien que des niveaux maximum n'arrivent jamais aussi hauts que dans des cellules MCF-7 induites

au TPA.

Un panel de lignées cellulaires de tumeur est testé pour les niveaux de ARN de AR à la fois avant et après une induction de 24 heures au TPA. Les résultats sont résumés dans le tableau X, ci-dessous. Avec mais quelques exceptions, les uniques sources de ARN de AR détectables sont dans des lignées de cancer du sein humain, traitées au TPA. Une telle exception est Caki-1, une lignée nette cellulaire de carcinome de rein humain qui exprime de manière constitutive de hauts niveaux de ARN de AR comparables aux quantités observées dans les cellules WCF-7 induites au TPA. Toutes les lignées cellulaires de cancer du sein traitées au TPA étudiées montrent une

hybridation spécifique au AR.

AR apparemment a un r8le quelconque fonctionnel donc le poumon, le pancréas, le rein, le foie et le cerveau de l'adulte en étant impliquée de manière possible dans une large gamme de processus incluant la cicatrisation des blessures, la regénération des tissus,

et la maintenance des cellules des neurones.

Tableau X.

Lignées cellu, laires humaines Origine Niveau d'ARN de AR __.Air hmie O neNon induit induit auTPA MCr-7 (IITI] 22) Adénocarcinome du sein. I++ III)Lt.-100(l11113 124)Sein, normal - i

BT-474(lIrTl 20) Carcinome de conduit du sein -.

bDJ)A-!I-157 (11'111 24) Carcinome médullaire du sein MDA-M13-361 (i'ril 27)Adénocarcinome du sein 1+ Métastase de cerveau Sl-!111-3 (11T11 30) Adénocarcinome du sein _ +

nT-476 Carcinome du sein -.

JI.G-3 (iTrB 36) Choriocarcinome, - /-

Caki -1 (1T111 16) Corcinomo C(Ilu!lllil'(r c dior lu roin,I,11 Métastase de peau

S-ltI!';P-(,1Tr) 52)Adénocarcinome d(e foie -

:-401 (ClII, 144.1) Tumeur de Wilm - -

IIEIFI (ClRI. l.Ofi) Mésenchyme Palatal embryonaire - 1/-

A-431 (CRI. 1555) Carcinome do kysle î,pidermiqtue -

IIBL-299 (CCL 137) Poumon embryonaire IIUF Fibroblaste de prépuce / r1% oe ru co o L'exemple suivant décrit le clonage du génome du gène de l'amphiréguline humaine, sa structure et son organisation intron/exon. Les implications fonctionnelles et d'évolution au regard de la superfamille EGF'des facteurs de croissance sont également discutées. L'ADN total du génome est isolé (Maniatis, 1982, In Molecular Cloning: A Laboratory Manual) à partir des cellules sousconfluentes dans desrécipients de culture de tissus T150. 20 pg d'ADN sont digérés avec des enzymes de restriction comme spécifié, mis sous électrophorèse sur un gel d'agarose 0,8%, soumis aux blots sur Hybond-N (Amersham) avec un tampon du bas 20X SSC (Southern, 1975, J. Mol Bio., 98, 503-517), et ADN liés par exposition à des vagues UV courtes à 1200}Joules. Les filtres sont hfiybridés à 65 C pendant la nuit dans un tampon d'hybridation (6X SSC, solution de Denhardt 5x 0,5% SDS et 20 pg/ml d'ADN dénaturé de sperme de saumon cisaillé) contenant 2 x 106 cpm d'un fragment spécifique de AR marqué au 32 P par ml. Des sondes ont été marquées par une première randomisation à une activité spécifique de 5-25 x 10 cpm/,g. Des filtres sont lavés de façon extensive dans lx SSC, à 65 C et

autoradiographiés toute la nuit à -70 C.

Le bactériophage lambda L47,1 est sélectionné comme vecteur de clonage et des branches traitées au phosphatase sont préparées après digestion avec BamHI, EcoRI, et HindIII. L'ADN de haut poids moléculaire à partir des cellules MCF-7 est digéré avec HindIII, mis sous électrophorèse sur un gel de faible température agarose 0,8% ( BioRad), et est fractionné en taille. La portion d'agarose enrichie au maximum pour le fragment de restriction souhaité est fondue à 65 C, l'ADN est extrait avec du phénol et NaOAc, puis l'éthanol est précipité et remis en suspension à 25-100 eg/ml. Les constructions de librairies consistent en une ligation pendant toute la nuit à 14 C de branches de 100'ng lambda L47,1 et de ng d'ADN fractionnês en taille extraits dans un volume de réaction de 5 pl, en utilisant la ligase ADN T4 (Biolabs). Le phage recombinant est conditionné in vitro avec des extraits (Grosveld, 1981, Gene, 13, 227-237) préparé avec des souches E. coli BHB2688 N205 recA (lambda imm434 cIts b2 red3 Eam4 Sam7) et BHB2690 N205 recA (lambda imm434 cIts b2 red3 Daml5 Sam7). Les librairies sont titrées sur E. coli LE392. Des clones du génome sont criblés avec des sondes ADN spécifiques de AR par une hybridation sur plaque in situ (Benton, 1977, Science 196, 180-182), et l'ADN est isolé des clones positifs purifés en plaques (Huynh, 1985, In DNA cloning

techniques: a practical approach, D. Glover, ed.

(Oxford:IRL Press), pp.49-78). Les produits d'insertion HindIII sont excisés et sous clonés dans pEMBL 18 pour

une analyse de restriction et de propagation.

ARN est isolé à partir des cellules MCF-7 comme

décrit dans les paragraphes précédents, Les oligonucléo-

tides synthétiques complémentaires des nucléotides 40 à 60 (ARAP) et des nucléotides 76 à 97-(ARCP) dans la séquence ADNc de AR sont marqués à la fin au p32 avec une polynucléotide kinase T4 à une activité spécifique de 2-5 X 108 cpm/ig. Un million cpm d'oligonucléotide marqué sont utiliséspour la synthèse de l'ADNc du premier brin sur 50.g d'ARN MCF-7 essentiellement comme dans les paragraphes décrits ci-dessus. Les produits sont traités avec une RNase A, extraits avec du phénol et du chloroforme, précipités à l'éthanol, dénaturés à la chaleur dans 80% de formamide à 100 C pendant 5 minutes et analysés par électrophorèse sur des gels standards de

séquençage en polyacrylamide-7M urée 8%.

Les cellules MCF-7 sont mises à croître comme décrit dans ce qui précède. Pour chaque essai, 1-2 x 106 cellules sont placées dans des assiettes de 100 mm dans des milieux de 10 ml et 24 heures plus tard, 20 yg d'ADN de plasmide superenroulé précipité au phosphate de calcium sont ajoutés aux cellules (Southern and Berg, 1982). Les cellules sont rincées avec des milieux frais 4 heures après la transfection et soumises à un choc de 25% glycérol pendant 90 secondes. 'Les cellules sont à nouveaux rincées et recouvertes avec 20 ml de milieu frais contenant O ou 100 ng/ml de TPA. Les cellules sont lavées et récoltées 40 heures après le choc au glycérol et lysées par sonication dans 100 F1 de Tris-HCl 0,25M(pH 7,8). L'activité CAT est testée essentiellement comme détaillé par Gorman et autres (1982). L'extrait cellulaire (3-50 pl) est ajouté au chloramphénicol (NEN), marqué au 1 C à 2,5 mCi, dans un volume de réaction de p1 de Tris 0,5 M (pH 7,8), 0,5 mM d'acétylcoA. Les produits de réaction sont incubés à 37 C pendant 2 heures, extraits avec 1 ml d'acétate éthylique et développés sur des plaques de gel de silice TLC avec CHC13:1-butanol (95:5). Des plaques TLC sont séchées et autoradiographiées. Le chloramphénicol marqué au 14 C acétylé et nonacétylé est quantifié par comptage des taches excisées dans Optifluor. Des unités d'activité enzymatique CAT sont calculées comme étant la quantité de pg de chloramphénicol acétylé par heure par pg de

protéine dans l'extrait cellulaire.

Le plasmide pAR9 est marqué par randomisation primaire avec 3H-TTP et utilisé pour l'hybridation des cellules humaines normales en métaphase préparées à partir de lymphocytes du sang périphérique stimulé à la phytohémaglutinine à l'étape 500-800 bandes. Cette sonde correspond à un ADNc de AR o manquent beaucoup de régions non traduites 3' et est insérée dans le site

EcoRI de pEMBL18.

L'hybridation a été décrite précédemment (Le Beau, 1985, PNAS, 82, 66926696) avec 2,4, 20 et 40 ng de

sonde par ml de mélange d'hybridation. Des autoradio-

graphies sont préparées en utilisant une émulsion de trajectoire nucléaire Kodak NTB-2 et des lames de verre sont exposées pendant 7 à 60 jours. La formation en bande du chromosome est visualisée au moyen de taches avec la

quinicrine moutarde.

L'attribution du chromosome du gène de AR humain est déterminée par une hybridation in situ d'ADNc

de AR marqué au H aux chromosomes normaux en métaphase.

Des grains d'argent sont répertoriés sur les 50 séquences en métaphase avec 30% qui ne sont pas distribuées au hasard aux bandes 4ql3-4q21. Le résultat est confirmé par la réaction en cha!ne polymérase (PCR) sur un ADN hybride de cellules somatiques hamster/humain contenant uniquement le chromosome 4 humain. Les initiateurs oligonucléotides dérivent de l'exon 3 de AR et l'intron adjacent génère un fragment PCR 220 bp uniquement dans l'ADN humain, et l'ADN hybride contenant le chromosome 4

* ainsi que l'ADN d'hamster ne donnent rien.

La région du chromosome 4ql3-4q21 contient également les gènes pour l'activité stimulatrice de la croissance de gro ou du Mélanome (Anisowicz, A., et al., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 84, 7188-7192; Richmond, A., et al., 1988, EMBO J. 7,2025-2033), un récepteur c-kit (Yarden et al. , 1987, EMB0 J. 6,3341-3351), le facteur 4 des plaquettes (PF4) (Griffin et al., 1987, Cytogenetic Cell Genet., 45, 43-73), le facteur IP-10 interféron-gamma qui peut être induit (Luster, A.D., et al., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 84, 1868-1871), la protéine se liant à la

vitamine D (composant spécifique de Group) (Cooke, N.E.

et al., 1986, Human Genetics 73, 225-229; McCombs J.L.

et al., 1986), Cytogenet Cell Genet, 42, 62-64), et la stathérine, une protéine de la salive régulatrice du calcium (Sabatini L.M. et al., 1987, Am. J. Hum. Genet., 41, 1048-1060). Le gène pour EGF est localisé de façon

distale à 4q25.

Gro, IP-10 et PF4 appartiennent à une classe de peptides apparentés structurellement qui peut constituer une famille de facteurs de croissance regroupés sur le chromosome 4. c-Kit code pour un récepteur de surface cellulaire qui est apparenté structurellement et fonctionnellement à plusieurs récepteurs de facteurs de croissance qui présentent une activité spécifique tyrosine-kinase, incluant le récepteur EGF, le Neu oncogène, le récepteur PDGF, et le récepteur de l'insuline. Généralement, les gènes pour les ligands et leurs récepteurs dressent la carte de chromosomes

distincts mais certains dressent la carte de localisa-

tions chromosomales communes (Groffin, 1983, Nucl. Acids Res. 11:63316339; Pettenati, 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 84:2970-2974). Le ligand pour c-kit n'a pas été identifié et AR doit être testée pour une telle activité. Les translocations spécifiques sont observées dans beaucoup de malignités. L'aberration la plus fréquente cytogénétique enregistrée dans la leucémie lymphobastique congénitale aigUe (ALL), t(4; 11) (q21; q23), nécessitent la région qui a dressé la carte de AR (Heim, S. et al., 1987, Leukemia, 1, 16-23). Alls sont maintenant classées par leur morphologie comme défini par le groupement coopératif françaisaméricain-anglais (FAB), par des-marqueurs de cellules T et B et par une analyse chromosomale. Ces classifications servent de base

pour le diagnostic, le pronostic et le traitement de ALL.

Un tiers de l'ensemble des cas de ALL implique des translocations spécifiques, et t(4; 11) correspond à un groupement de pronostic faible très fréquent chez les enfants de moins de 16 mois avec une survie moyenne de moins de 1 an (Kocova et al., 1985, Cancer Genetics and Cytogenetics 16, 21-32). Des translocations impliquant la région 4q21 sont également rapportées dans des lymphomes - T (Levine, E.G. et al., 1986, Cancer Res, 46, 6481-6488) et un cas de leucémie myéloblastique aiguë (AML)

(Selypes, A. et al., 1987, Human Genet, 76, 106-108).

Cette région contient également les gènes pour un syndrome de dysgénésie dentaire et le "piebald trait", un désordre inhérent se traduisant par une pigmentation de la peau inégale due à la différenciation et à la migration de mélanoblaste déficientes (Hoo, J.J., et al.,

1986, Human Genet., 73, 230-231).

Les études de liaison entre AR et les désordres génétiques localisés sur le chromosome 4q13-4q21 permettront au demandeur de déterminer la signification de cette co-localisation. Une analyse cytogénétique courante suggère que la région 4q21 contient des gènes

impliqués dans la différenciation des lymphocytes.

Finalement, ces associations peuvent suggérer d'autres activités biologiques ou d'autres applications biologiques pour cette molécule régulatrice de la croissance. Une analyse Southern blot (voir paragraphe ci-dessus) de l'ADN MCF-7 digéré avec HindIII, EcoRI ou BamHI montre des bandes uniques de 12kb, 8kb, et 20 kb respectivement, lorsqu'il est hybridé avec une sonde 830 bp (pAR1 digéré avec PvuII/BsmI marqué au 32p) contenant la fraction 5' du gène de AR, suggérant que AR est une gène de copie unique. Une sonde 170 bp (AR 170, BsmI-PvuII) à partir de la terminaison 3' de AR mature, incluant les régions codant pour le domaine cytoplasmique et transmembranaire, s'hybride au fragment identique HindIII, EcoRI et BamHI et également au fragment supplémentaire 7,5 kb HindIII-, impliquant que la majorité de la région codant pour AR est clivée entre deux fragments HindIII de 12 et 6,5 kb. Une formation de bande identique est observée par une analyse Southern de produits digérés à partir d'ADN de placenta humain, d'ADN de cerveau, d'ADN de mélanome (SK-MEL 28), d'ADN de cancer du sein (HTB36) d'ADN de carcinome de kyste épidermique (A431) et d'ADN de cancer du poumon et suggère que le gène de AR ne présente aucun réarrangement

brut ou d'amplification.

Les demandeurs choisissent de cloner deux fragments HindIII à partir de l'ADN MCF-7 car ils apparaissent comme contenant la plupart si ce n'est pas

l'ensemble des gènes de AR et leurs séquences adjacentes.

L'ADN de MCF-7 digéré au HindIII est fractionné en taille et les fractions appropriées sont liées dans / L47,1. Sur 1' ensemble des nombreux cas positifs, deux clones, >ARH12 et À ARH6, sont sélectionnés pour leur caractérisation plus détaillée. Les produits insérés de 12 et 6, 4 kb sont sous-clonés dans pEMBL18 et leur carte est dressée pour plusieurs sites de restriction. En utilisant les initiateurs exacts oligonucléotides et le séquençage direct de divers sous-clones plus petits, la séquence de tous les exons et leur jonction aux introns sont déterminées, révélant aucune contradiction avec la

séquence de l'ADNc.

Lq clonage du génome.de AR conduit à l'isolation de 6,5 kb de la séquence adjacente 5' contenue dans le fragment HindIII 12kb. Le fragment 688 bp du premier site 5' EcoRI de l'exon 1 au site SmaI dans l'exon 1 (position 40 dans l'ADNc) est sous cloné et séquencé sur les deux brins. Cette donnée est représentée

à la figure 17.

L'extension de l'initiateur est réalisée sur l'ARN de MCF-7 avec deux oligonucléotides séparés de l'exon 1. Un site d'initiation de transcription principal, confirmé par les deux oligonucléotides, est localisé à 1 bp 5' du clone le plus long d'ADNc. Deux sites mineurs sont observés à la position +1 et +2 dans la séquence d'ADNc confirmant que la plupart des clones ADNc sont presque de longueur totale. Afin de confirmer fonctionnellement la régulation du gène de AR, les demandeurs ont construit un gène chimérique (pXARElCAT) contenant la région adjacente 5' de AR 688 bp allant de EcoRI à SmaI (séquences 648 à +40, avec +1 étant le site principal d'initiation de la transcription) conduisant à l'expression d'un gène sans initiateur de chloramphénicol acétyltransférase (CAT). Ce gène construit est capable de stimuler la transcription du gène CAT lorsqu'il est introduit de façon transitoire dans les cellules MCF-7 et l'activité est stimulée six à sept fois par l'addition de TPA. Ceci confirme à la fois structurellement et fonctionnellement que les demandeurs ont cloné la terminaison 5' du gène de AR. Ensuite les demandeurs construisent une série de mutants de délétion 5' CAT contenant des séquences de AR -539 à +40 (Ela), -387 à + 40 (Elb), -277 à +40 (Elc), -148 à +40 (Eld), -77 à +40 (Ele), -79 à +40 (Elg), o +19 à +40 bp (Elh) dans le même vecteur. L'activité basale est perdue lorsqu'il y a délétion au-delà de la fraction -77, c'est-à-dire lorsque que Elh ne montre aucune activité mesurable et l'ensemble de ces produits construits montre une expression améliorée de 3,5 à 7 fois en réponse à 40 heures de traitement avec 100 ng/ml de TPA. Ces produits construits peuvent également être utilisés dans des essais transitoires pour évaluer les effets de quelconques morphogènes, mitogènes, facteurs de croissance, médicaments ou extraits de fermentation bruts sur la régulation de l'expression de AR, permettant à quelqu'un

d'identifier de nouveaux agents thérapeutiques.

Les expériences nucléaires réalisées montrent une transcription améliorée de 3 à 5 fois sur AR en réponse au TPA, suggérant que l'activité améliorée de l'initiateur est au moins partiellement responsable de l'induction au TPA de AR. L'analyse Northern des cellules MCF-7 traitée au TPA en présence ou en absence d'actinomycine D identifie AR comme un ARN relativement

stable avec une demi-vie au-del& de quatre'heures.

L'induction de l'expression de AR en réponse au TPA présente par conséquent de nombreux aspects impliquant

une transcription améliorée d'un ARNm plutôt stable.

La séquence complète du génome humain d'amphiréguline est représentée à la figure 17 et la relation entre les exons et les domaines de la protéine de la molécule AR est représentée schématiquement à la

figure 18.

L'analyse d'extension de l'initiateur de l'ARNm de AR et les études utilisant des produits construits d'initiateurs chimériques AR/CAT (CAT=chloramphénicol acétyltransférase, un gène marqueur) localisent un initiateur fonctionnel à l'intérieur de 64 bp 5' à la fin du clone le plus long d'ADNc. De plus, il y a une séquence consensus TATA 29 bp en aval de la terminaison ' de la séquence d'ADNc. La terminaison 3' du gène est précédée par une séquence consensus signal de polyadénylation, de 64 nucléotides à partir de la queue poly (A) dans l'ADNc. Le transcript primaire du gène AR

est approximativement de 10,2 kb.

Six exons codent pour le précurseur humain de AR et traversent 10,2 kb de l'ADN du génome. Les exons de AR sont dans l'intervalle de 112 à 270 bp en longueur et sont interrompus par des introns d'environ 1,25 kb et 2, lkb. Les cinq introns de AR interrompent la séquence de codage de telle façon que beaucoup de domaines de la protéine sont des produits d'un exon unique. L'exon 1 code pour les domaines non traduits 5' et les domaines du peptide signal, l'exon 2 code pour le précurseur N-terminal, l'exon 5 contient la région cytoplasmique, et l'exon 6 représente la région non traduite 3'. Ensemble, les exons 3 et 4 codent pour la protéine mature AR, incluant à la fois les séquences hydrophiles et les séquences ressemblant à EGF, ainsi que le domaine transmembranaire putatif. La Jonction entre les exons 3 et 4 a lieu entre la seconde et la troisième boucle de la

région ressemblant à EGF.

Lorsque les Jonctions d'exons sont recouvertes sur un alignement des séquences d'acide aminé de AR, de EGF et TGF-g&, il est évident que l'ensemble de ces protéines est codé par deux exons et que l'intron d'interruption est localisé dans la même position. De plus, l'exon 3' de chacun code également pour le domaine transmembranaire des protéines du précurseur correspondant. Au contraire, la région ressemblant à EGF est contenue dans un exon unique dans tous les autres homologues mammifères de EGF pour lesquels la structure exon a été déterminée: incluant les 9 répétitions ressemblant à EGF dans le précurseur de EGF; (Gray, 1983, Nature, 303, 722-725); les trois dans le récepteur LDL (Yamamoto, 1984, Cel, 39, 27-38); et une chacune dans la fibronectine de rat (Patel, 1987, Embo J., 6, 2565-2572) et le facteur humain XII de coagulation (Cool, 1987, J. Biol. Chem., 262, 13662-13673). Les homologues invertébrés tels que le gène de Drosophilia Notch et lin-12 C. elegans contiennent également de

nombreuses répétitions comme EGF (Kidd, 1986, Molec.

Cell. Biol., 6, 3094-3108; Greenwald, 1985, Cell, 43, 583-590). Non pas comme les gènes de mammifères, la plupart des répétitions ressemblant au EGF dans Notch sont contenus dans une région unique codante avec uniquement quatre des trente six motifs étant clivés par des séquences d'intervention. De façon notable, deux de ces quatre motifs montrent un alignement plus fort avec AR qu'avec le consensus répété de Notch et l'un est mSme interrompu par un intron à la mSme séquence CXC que EGF, TGFotet AR. Le gène de nématode lin-12 contient au moins 11 unités comme EGF, dont neuf sont contenues dans le premier exon et les deux restantes sont des exons séparés avec l'unité intacte comme EGF, adjacente aux introns. Les différences dans la structure des exons codant pour les répétitions comme EGF à partir de divers organismes suggèrent qu'elles ont des origines différentes. Un groupe contient le motif comme EGF lié par des introns et l'autre groupe dont est un membre, à un motif interrompu. La similarité de la séquence entre les deux groupes peut être le résultat d'une évolution convergente ou d'une insertion de l'intron après leur

divergenice à partir d'un gène ancestral commun.

La localisation de l'intron à l'intérieur de la même séquence CXC de EGF, TGF-, AR et l'une des répétitions de Notch, suggère une origine commune, mais un examen plus poussé révèle une organisation différente d'intron. L'organisation d'intron est attribuée au fait que l'intron interrompt le cadre de lecture soit après le premier nucléotide (I), le second (II) ou le troisième (0) nucléotide du codon. Les demandeurs estiment que l'organisation est d'une importance dans l'évolution en ce sens qu'elle peut permettre la réorganisation du domaine fonctionnel contenant les exons parmi les différentes protéines. EGF et TGF- i; ont un intron en phase II dans l'unité comme EGF, bien que AR et Notch aient des introns de phase I. Un glissement similaire d'un nucléotide est observé dans l'avant dernier intron à l'intérieur du domaine de la protéase du facteur B complémentaire et de l'élastase (Cambell, 1983, PNAS, 80, 4464; Swift, 1984, J. Biol. Chem. 259, 14271). Les positions non au hasard de ces introns peut impliquer qu'une séquence d'insertion spécifique d'intron est présente dans ces gènes. De façon alternative, ils peuvent avoir une pression de sélection pour diviser la région codante à ce site. La comparaison des séquences à la jonction exon-intron à l'intérieur de l'unité comme EGF pour EGF, TGF- ok, AR humain et la première répétition Notch, ne révèle aucune répétition directe

comme souvent observée avec des éléments transposables.

Cependant, toutes les quatre ont la séquence "gtaagt" bordant la jonction. Cette séquence peut également jouer

un r8le dans l'origine o l'épissage de cet intron.

Les homologues viraux de EGF ne contiennent pas

d'introns; cependant, un alignement entre VGF, EGF, TGF-

et AR montrent une homologie s'étendant à travers le domaine transmembranaire tandis que les facteurs de croissance à partir des virus de myxoma et de shope se terminent avant la région hydrophobe. Des études récentes montrent avec évidence que le précurseur TGF- est synthétisé comme une protéine transmembranaire et un clivage protéolytique différentiel résulte dans la sécrétion de plus grande forme qui peuvent être d'un type cellulaire spécifique (Teixido, 1987, Nature, 326,

883-885).

D'autres homologues EGF qui contiennent des domaines transmembranaires incluent les' facteurs de coagulation, LDL, et les gènes homéotiques Notch et lin-12 bien qu'aucun ne soit adjcent à une répétition comme EGF. La présence du motif EGF dans plusieurs précurseurs liés aux membranes suggèrent que dans quelques cas ils peuvent être fabriqués comme un facteur de croissance sécrété ou peuvent rester associés avec la membrane et peuvent jouer un rôle dans la communication

intercellulaire et/ou intracellulaire.

Certains des homologues de AR incluent des gènes homéotiques d'invertébrés. Des produits de gènes homéotiques sont impliqués dans la régulation du développement cellulaire. Par exemple, le produit de gène Notch module la progression correcte d'une cellule d'ectoderme dans un neuroblaste ou un dermoblaste. Dans des mutants de Notch, l'ensemble de ces cellules deviennent neuronales et la progéniture, tous avec un cerveau et sans peau, meurt. Un gène homéotique peut fonctionner selon un mode autocrine pour établir ou maintenir un état déterminé dans les cellules exprimant le produit du gène et peut être impliqué avec la régulation de telle étapes dans des cellules adjacentes par les interactions cellules-cellules. Si AR fonctionne également pour réguler l'état de développement de

certaines cellules, des types doivent être étudiés.

La caractérisation de l'ADNc de AR révèle que des formes de 78 à 84 acides aminés de AR sont synthétisés comme la fraction'du milieu d'un précurseur transmembranaire de 252 acides aminés (voir la

description qui précède). Les sites de clivage

protéolytique du précurseur de AR qui doivent résulter dans la libération de AR mature ne correspondent pas aux sites de clivage de l'une quelconque des protéases connues. Sur la terminaison N-terminal les sites sont Asp-Asp/Ser-Val et Glu-Gln/Val-Val tandis que le site C-terminal est Glu-Lys/Ser-Met. Les deux formes de AR apparaissent comme étant le résultat de procédés protéolytiques alternés à partir d'un précurseur commun puisque tous les ADNc et les clones du génome révèlent la même séquence dans cette région. De manière intéressante, un intron se situe entre les deux sites de clivage N-terminal et il est possible que le coupage de l'intron

pourrait intervenir dans ces différences.

Les cellules MCF-7 produisent 80% de leur AR dans la forme la plus large de 84 acides aminés tandis que la lignée cellulaire de choriocarcinome HTB-36 produit 80% de son AR sous sa forme la plus petite de 78 acides aminés. Pour déterminer si cette différence est liée aux altérations du niveau d'ADN, les demandeurs utilisent les techniques de réaction en chaîne de polymérase (Scharf, 1986, Science, 233, 1076-1078) pour isoler l'exon 3 de AR à partir des cellules MCF-7 et des cellules HTB-36, une lignée qui produit de façon constitutive de hauts niveaux d'ARN messagers de AR. Un oligonucléotide "sens" spécifique de l'intron de AR et un oligonucléotide "anti-sens" de la région codante de l'exon 3 sont utilisés pour amplifier de façon spécifique le fragment intervenant de 220bp du gène de AR à partir des deux sources d'ADN. L'analyse directe de la séquence montre aucune contradiction dans soit la jonction intron-exon, soit dans l'exon 3 codant la séquence entre ces deux sources d'ADN humaines, suggérant de plus que les deux formes de AR résultent de clivage protéolytique

alterné du précurseur.

AR montre clairement une homologie de séquence avec d'autres protéines telles que EGF, avec la conservation des six cystéines impliquées dans les trois ponts disulfures qui définissent la structure secondaire des facteurs de croissance matures. Les comparaisons précédentes (assistées d'un ordinateur) des séquences d'acides aminés a conduit au classement par catégorie des motifs comme EGF en deux groupes distincts: les facteurs de croissance et les facteurs de coagulation du sang (voir figure 13). Les demandeurs ont sélectionné deux modèles de séquence pour la comparaison avec AR et d'autres ADN connus ou séquences protéiniques. La sélection est basée sur la capacité apparente de ces séquences à se distinguer entre les deux groupes de protéines car très peu de lacunes sont nécessaires pour les alignements optimaux. Les séquences exactes sont représentées au tableau 1. La première région correspond aux onze premiers acides aminés de la seconde boucle de EGF et la seconde région correspond à la troisième boucle de cystéine de EGF. Quatre représentants de chacun des groupes de facteurs de croissance et de facteurs de coagulation du sang sont sélectionnés pour la génération des séquences consensus sur la base de leur homologie bien établie fonctionnelle et structurelle' Les séquences humaines sont sélectionnées quand c'est possible puisque les demandeurs ont cherché finalement à les comparer avec AR humaine. Les facteurs de croissance incluent: EGF humain, TGF- A VGF et le facteur de croissance de Shope, et les facteurs de coagulation incluent: le facteur humain IX, X, XIId et la protéine C. AR est également répertoriée par banque de données pour deux de ces groupes homologues. La séquence consensus est pesée sur la base de la fréquence d'apparition d'un résidu à une

position donnée.

L'analyse structure-fonction de divers dérivés de TGF- cD, VGF, et EGF ont récemment conduit à l'identification de plusieurs résidus qui sont nécessaires pour l'activité biologique de ces facteurs de croissance. Des protéines recombinantes, des peptides synthétiques, des dérivés chimiques spécifiques de sites et la dégradation protéolytique ont tous été utiles pour la génération de molécules altérées. Certaines généralisations incluent (les positions sont relatives à l'alignement dans la figure 15) :les 6 cystéines (positions 1, 19, 15, 26, 28 et 37) et leurs boucles disulfures(1-15, 9-26, 28-37) sont nécessaires pour l'activité biologique, les extensions N-terminal ont peu d'effet sur l'activité, un résidu aromatique (F, Y) est nécessaire à la position 8, un changement non

32 41 42

conservatif de y32 D41, ou L42 résulte dans une perte de l'activité et/ou dans une perte dramatique dans la

liaison en récepteur ou dans l'autophosphorylation.

AR correspond à tout sauf les deux derniers critères définissant les résidus est nécessaire pour la liaison au récepteur EGF et/ou l'activitémitogène. AR mature se tronque Juste avant D41 et manque complètement de ce dernier et de la leucine 42 "cruciale", cependant, il entre toujours en compétition pour la liaison au récepteur EGF et se substitue à EGF dans certains essais mitogènes. Cependant, ces différences peuvent être responsables des cinétiques de la liaison au récepteur qui ne se sature pas et de leurs différences fonctionnelles marquées par rapport à EGF dans certains essais tels que le synergisme de TGF-R, l'effet différentiel sur des sous-clones sélectionnés A431, la réticulation, des essais de phosphorylation, et sa capacité à se lier à l'ADN. L'étendue extrêmement hydrophile à l'extrémité N de AR mature peut également entraîner certaines de ces différences dans la liaison au

récepteur ou dans l'activité biologique.

Les demandeurs ont calculé une matrice des distances évolutionniste sur la base de l'alignement dans la figure 13 et d'une analyse par ordinateur sur la base du tableau I. Cette matrice est utilisée pour dériver un tableau en structure en étoile pour la superfamille de EGF. La recherche nécessite la présence des cystéines et ajoute un point pour chacun des résidus qui égalise la séquence consensus pesée. Cet arbre évolutionniste prédit que AR tombe à l'intérieur d'une nouvelle sous-catégorie de facteurs de croissance ressemblant à EGF, sur la base

de son homologie à la fois structurelle et fonctionnelle.

Un tel modèle prédit que d'autres membres de cette famille de facteurs de croissance peuvent exister et qu'ils peuvent être identifiés par homologie avec les motifs de séquence précédents sur la base de trois critères: un score combiné avec les deux régions du facteur de croissance de plus de 20, un score de régions de facteur de coagulation combiné de moins de 20, et un score de région AR combiné de plus de 20. Toutes les nouvelles molécules correspondant à ces critères sont espérées avoir également une certaine homologie fonctionnelle avec EGF, TGF-vd,, VGF ou AR. Les molécules avec un score de la région AR combiné de plus de 40 pourraient être classées comme membre de la famille AR à l'intérieur de la superfamille EGF et seraient à

l'intérieur de l'étendue de l'objet de l'invention.

Les plasmides sont construits de la fagon suivante. Plasmide pARD1. Le plasmide pARD1 contient un fragment ADNc EcoRI 1,4 kb (pARI) dans pEMBL18 avec un changement T à C à la position du nucléotide 532 dans l'ADNc correspondant à la séquence valine-valine à la terminaison amine du AR mature. Ce changement de base est réalisé par mutagénèse dirigé sur un site et confirmé par une analyse de séquence. Le produit construit permet

l'accès à la jonction entre le domaine du précur -

seur N-terminal de AR et la région hydrophile en créant

un site DdeI (CTAAG).

Plasmide pARSTOP. Le plasmide pARSTOP est une construction intermédiaire utilisée dans la préparation d'un vecteur de sécrétion de AR. pARD1 est digéré avec SspI et XbaI et le fragment 515 bp codant pour les 9 acides aminés carboxy terminal de AR mature, les domaines cytoplasmiques et transmembranaires et la région non traduite 3' sont isolés. Le fragment 4, 7 kb (SspI-XbaI) contenant la fraction restante am.'ne terminale de l'ADNc de AR est purifié sur gel et lié avec des oligonucléotides complémentaires cyclisés, soumis à l'action de kinase, ARSTOP1 et ARSTOP2 (représentés ci-dessous). Ces oligonucléotides ont une terminaison à bout franc 5' compatible avec un site SspI suivi par une séquence codant pour les 9 acides aminés carboxy terminal de la séquence de AR mature, un codon stop TAA et des

sites EcoRV et XbaI.

Y F G E R C G E K *EcoRV/XbaI

ARSTOP1 5' ATTTCGGTGAACGGTGTGGGGAAAAGTAAGATATCT

ARSTOP2 3' TAAAGCCACTTGCCACACCCCTTTTCATTCTATAGAGTC

Plasmide pbAR. Le plasmide pbAR contient un leader TGF-B sans initiateur attaché à la forme mature de 78 acides aminés de AR. Il est construit par ligation des oligonucléotides bLARN3 et bLARN4 avec le fragment de 240 bp de DdeI à XbaI à partir de pARSTOP dans pEMBL18 digéré au EcoRI/XbaI. bLARN3 et bLARN4 sont complémentaires, créant une saillie 5' EcoRI et 3' DdeI et un site unique interne NaeI compatible avec celui proche de l'extrémité carboxy-terminale de la séquence leader de TGF-B. La ligation détruira le site DdeI et regénèrera la séquence correcte d'acide aminé

valine-valine à la terminaison amine de AR mature.

SstII

A G V V K P P Q N K T E S E

PHIL1 5' GGGAGTAGTTAAGCCGCCCCAAAACAAGACGGAAAGTGA

PHIL2 3' CGCCCTCATCAATTCGGCGGGGTTTTGTTCTGCCTTTCACT

N T S D K P K R K K K G G

PHIL1 5' AAATACTTCAGATAAACCCAAAAGAAAGAAAAAGGGAGG

PHIL2 3' TTTATGAAGTCTATTTGGGTTTTCTTTCTTTTTCCCTCC

EcoRI

K N G K N R R N R K K K N

PHIL1 5' CAAAAATGGAAAAAATCGAAGAAACAGAAAGAAGAAG

PHIL2 3' GTTTTTACCTTTTTTAGCTTCTTTGTCTTTCTTCTTCTTAA

2 6 2 8 1 0 9

Plasmide pDCHBAR1. Le plasmide pDCHBAR1 est un vecteur d'expression de mammifère (figure 19) désigné pour la sécrétion de la forme mature fabriquée de AR de 78 acides aminés. Il contient la séquence AR mature/ leader TGF-B à partir de pbAR conduit par l'initiateur

CMV/HIV, encadré par un signal de polyadénylation SV40.

Le vecteur contient également SV2dhfr, dans la même orientation de transcription. PSVDR/bOM est digéré avec NaeI et XbaI, et le vecteur 6 kb est purifié de la séquence excisée codante pour OncoM. pbAR est également digéré avec NaeI et XbaI, et le fragment 260 bp codant pour les 5 acides aminés carboxy-terminal de la séquence signal TGF-B, et la séquence de AR mature de 78 acides aminés suivie par un codon de terminaison et des sites EcoRV et XbaI sont isolés. Les jonctions sont vérifiées

par une analyse de séquence.

Plasmide pDCHBPHILE. Le plasmide pDCHBPHILE est un vecteur d'expression de mammifère désigné pour la sécrétion d'une protéine chimérique AR/EGF. Le plasmide est également fabriqué pour faciliter des constructions de fusion futures entre le domaine hydrophile de AR et d'autres facteurs de croissance. Ce produit construit est créée par ligation du fragment du vecteur pDCHBAR1 digéré par SstII/XbaI de 6,5 kb, du fragment 175 bp EcoRI/XbaI contenant le gène synthétique humain EGF et les oligonucléotides PHIL1 et PHIL2. Ces oligonucléotides sont complémentaires avec des extensions 5' SstII et 3' EcoRI et codent pour le dernier résidu de la séquence

signal de TGF-B et le domaine entier hydrophile de AR.

pDCHBAR1 fournit l'initiateur CMV/HIV sauf le dernier acide aminé de la séquence signal TGF-B et la séquence de polyadénylation SV40. Le fragment EGF est obtenu par le Docteur Timothy M. Rose (Oncogen), et inclut des sites

convenants pour des manipulations futures.

1C3 Le plasmide TacPak/EGF est obtenu par le Docteur Timothy M. Rose (Oncogen) et est composé des unités suivantes: l'initiateur hybride trplac et la séquence Cro gène Shine-Delgarno isolé comme un fragment Bg1II/BamHI à partir du vecteur d'expression p135-1 qui à son tour est dérivé de mDR540 (Pharmacia); la séquence signal phosphatase alcaline dérivée des oligonucléotides synthétiques TacPakl et TacPak2 (Dr. Rose, Oncogen); la séquence EGF synthétique mise en navette à partir du plasmide pBM22/PAK/EGF;la région de terminaison de transcription; le squelette pBR322 avec le gène de résistance à la néomycine tous dérivés du plasmide p135-1. TacPak/EGF est digéré avec BamHI, rempli par 2 bases avec dATP et dGTP pour créer un site compatible avec SalI, rempli par 2 bases, et ensuite digéré avec PvuI. Cette digestion retire le gène synthétique EGF et la majorité de la séquence signal phosphatase alcaline, mais laisse l'initiateur Tac et les séquences Shine-Delgarno et ATG d'initiation intacts. Le fragment

2,8 kb est purifié sur gel.

Le plasmide pARSTOP est digéré avec SalI, rempli par 2 bases avec TTP et dCTP pour créer un site compatible avec une extension BamHI remplie par deux

bases (dATP, dGTP) et ensuite digéré avec DdeI et BglI.

Le dernier digestat est nécessaire pour retirer l'ADN comigrant à partir du fragment désiré 242 bp, qui code pour la petite forme de AR mature commençant avec VKPP et terminant avec CGEK, suivi par un codon stop introduit

synthétiquement. Le fragment 243bp est purifié sur gel.

Les oligonucléotides synthétiques complémentaires ALKPAR1 et ALKPAR2 sont désignés avec une saillie 5' PvuI compatible avec un fragment TacPak/EGF rempli partiellement par PvuI/BamHI et une extension 3' DdeI compatible avec le fragment pARSTOP rempli partiellement avec DdeI/SalI. Ils sont synthétisés sur un synthétiseur d'oligonucléotides de Applied Biosystems et purifiés sur un gel acrylamide. Des phosphates sont ajoutés aux oligonucléotides avec une T4 kinase et des quantités équimolaires sont cyclisées avec un faible

refroidissement après dénaturation par la chaleur.

PvuI DdeI

I A L A L L P L L F T P V T K A V V

ALKPAR1 5' CGCCCTCGCACTTCTCCCACTGCTGTTCACTCCAGTGACAAAAGCTGTAG 3'

ALKPAR2 3' TAGCGGGAGCGTGAAGAGGGTGACGACAAGTGAGGTCACTGTTTTCGACATCAAT 5'

Le fragment de AR de 243 bp partiellement rempli par DdeI à SalI, le fragment du vecteur TacPak/EGF partiellement rempli par PvuI/BamHI de 2,8 kb; et des oligonucléotides ALKPAR1+2 cyclisés et soumis à de la kinase sont ligaturés en utilisant de l'ADN ligase, sont transformés dans des cellules JM109 E. coli compétentes et sélectionnées sur des plaques LB/néomycine. Le produit construit correct est confirmé avec les digestats de restriction et le séquençage de l'ADN. La séquence de

pTacAPAR est représentée à la figure 20.

Le plasmide pDCHBPHILE est digéré avec SstII et XbaI pour générer le fragment 286 bp qui code pour les deux derniers résidus de la séquence signal de TGF-B (AG), pour les 37 résidus à partir du domaine hydrophile de AR (VVKP...RKKK) et la séquence synthétique de 53 résidus de la séquence humaine mature de EGF

(NSDS...WELR). Le fragment 286 bp est purifié sur gel.

Les oligonucléotides synthétiques complémentaires APAREGFI et APAREGF2 sont désignés avec une saillie 5' PvuI compatible avec le fragment pTacAPAR1 PvuI/XbaI et l'extension 3' SstII compatible avec le fragment pDCHBPHILE SstII/XbaI. Les oligonucléotides sont synthétisés sur un synthétiseur oligonucléotide Applied Biosystems et purifiés sur un gène acrylamide. Des phosphates sont ajoutés aux oligonucléotides avec une kinase T4 et des quantités équimolaires cyclisées avec un

refroidissement lent après dénaturation à la chaleur.

PvuI SstII

I A L A L L P L L F T P V T K

APAREGF1 5' CGCCCTCGCACTTCTCCCCCACTGCTGTTCACTCCAGTGACACC 3'

APAREGF2 3' TAGCGGGAGCGTGAAGAGGTGACGACAAGTGAGGTCACTGTGGCG 5'

Le fragment 286 bp SstII/XbaI codant pour le domaine hydrophile de AR attachée à la séquence mature de EGF, le fragment du vecteur pTacAPARl PvuI/XbaI de 2,8 kb et des oligonucléotides soumis à de la kinase et cyclisés, APAREGF1+2, sont ligaturés en utilisant une ADN ligase transformés dans E. coli JM109 compétent et sélectionnés sur des plaques LB/néomycine. La construction correcte est confirmée par les digestats de restriction et le séquençage à l'ADN. La séquence de nucléotide de pTacAPHILE est montrée à la figure 21. Le produit de traduction espéré doit être clivé entre le dipeptide Ala-Gly suivant juste la séquence signal phosphatase alcaline, ajoutant ainsi un résidu supplémentaire (glycine) au domaine hydrophile de AR. Les résidus de nucléotide qui diffèrent de la séquence humaine normale, sont montrés en caractères gras (figure ). Les plasmides pTacAPAR1 et pTacAPHILE sont transformés dans E. coli compétent JM109 et mis en croissance de manière confluente dans 10 ml LB à 370C à un A600 de 0,7. Les cultures sont ensuites induites avec 1OOuM de IPTG et laissées en croissance pendant 24 à 72 heures. Les cultures sont centrifugées deux fois à 5000 tours par minutes, 15 minutes chacune, la pastille est

gardée et la purification continue avec le surnageant.

Les échantillons sont concentrés 10 fois sur un appareil d'ultrafiltration Amicon avec des membranes YM5 (5000 MW découpées). Le concentrat est dilué avec 5 volumes MilliQ d'eau et reconstitué à 1/10 du volume originel de la culture. De l'acide acétique glaciale est ajouté à 1M et les échantillons sont placés à 4 C pendant 2 à 24 heures. Les échantillons sont centrifugés à 19000 tours par minute pendant 20 minutes à 4 C dans des tubes Oakridge dans le rotor SS34, la pastille est extraite avec 20 ml

d'acide acétique 1 M et les surnageants sont regroupés.

Les surnageants clarifiés sont ensuite dialysés avec de l'acide acétique 0,1 M pendant 2 jours, lyophilisés et conservés à -20 C, Les pastilles de cellules et les surnageants séchés bruts sont testés par des essais "immunoblotting'i et des essais d'inhibition à la croissance (GIAs) pour la protéine AR. La pastille de cellule à partir de la culture confluente de 50 ul ou du surnageant séché de 100 à 200 ul est testée sur un gel polylacrylamide Tricine 16%, tachée avec du "Fast Green" et transférée sur de la nitrocellulose. Les Western blots sont réalisés comme

décrits dans la description ci-dessus.

Les pastilles de cellules à partir de transformants transportant pTacAPAR1 montrent des quantités abondantes des protéines immunoréactives migrant à lOkD ainsi que certains produits de dégradation

et des dimères probables. Les surnageants ont approxima-

tivement 100-200 ng/ml de AR immunoréactive secrétée. GIA sur les surnageants mesure une activité à environ ng/ml de AR sur la lignée cellulaire indicatrice A431-A3, telle que comparée avec les standards de AR natives purifiées. De grandes quantités de protéines immunoréactives sont produites dans ce système, dont la plupart reste agrégée à l'intérieur de la cellule. Des essais sur des préparations périplasmiques et des surnageants montrent la sécrétion d'une protéine active

après croissance pendant 2 à 3 jours.

pTacAHILE fournit des moyens convenables au moyens desquels on peut attacher le domaine hydrophile de AR sur la term-naison N d'un gène quelconque cloné. Cette région peut intervenir dans les caractéristiques de liaison altérées au récepteur normal du ligand, peut fonctionner comme séquence de localisation nucléaire, peut se lier à l'ADN, ou permettre le transport au travers des lipides ou d'autres membranes normalement

imperméables au facteur attaché.

Les microorganismes suivants ont été déposés dahs la collection: Agricultural Research Culture Collection, Northern Regional Research Center (NRRL) et ont les numéros de dép8t suivants: Microorganismes Plasmides No. de déDot Escherichia coli HB101 pAR1 B 18438 Escherichia coll HB101 pARH12 B 18439 Escherichia coli HB101 pARH6 B 18440 Escherichia coli JM109 pTacAPAR1 B 18441 Escherichia coli JM109 pTacAPHILE B 18442 La présente invention n'est pas limitée aux lignées cellulaires déposées et aux modes de réalisation décrits ici qui sont de simples moyens d'illustration d'un aspect de l'invention et dans lesquels tous les équivalents fonctionnels font partie de l'étendue de l'objet de l'invention. En effet, diverses modifications de l'invention en addition de celles montrées et décrites ici découleront de manière apparente à partir de la

description qui précède pour l'homme du métier. De telles

modifications font partie de l'étendue des revendications

qui suivent.

26-28109

Claims (45)

REVENDICATIONS

1. Protéine, caractérisée en ce qu'elle a une séquence d'acide aminé comme suit:

1 10 20

V V K P P Q N K T E S E N T S D K P K R K K K G G K N G K

40 50

NR R N R K K K N P C N A E F Q N F C I H G E C K Y I

70 78

E H L E A V T C K C Q Q E Y F G E R C G E K

2. Protéine selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle a un poids moléculaire

d'environ 8500 à 25 000 daltons.

3. Protéine selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle a un pI (point isoélectrique)

dans l'intervalle allant d'environ 7,6 à 8,0.

4. Protéine selon la revendication 1,

caractérisée en ce qu'elle est glycosylée.

5. Protéine selon la revendication 1,

caractérisé en ce qu'elle est non glycosylée.

6. Protéine, caractérisée en ce qu'elle a une séquence d'acide aminé comme suit:

1 10 20

S V R V E Q V V K P P Q N K T E S E N T S D K P K R K K K

40 50

G G KN G K N R R N R K K K N P C NA E F Q N F C I

70 80 84

H G E C K Y I E H L E A V T C K C Q Q E Y F G E R C G E K

7. Protéine selon la revendication 6, caractérisée en ce qu'elle a un poids moléculaire d'environ 9100 à 25000 daltons. 8. Protéine selon la revendication 6, caractérisée en ce qu'elle a un pI (point isoélectrique)

dans l'intervalle allant d'environ 7,6 à 8,0.

9. Protéine selon la revendication 6,

caractérisée en ce qu'elle est glycosylée.

10. Protéine selon la revendication 6,

carctérisée en ce qu'elle est non glycosylée.

11. Protéine selon la revendication 1 ou un peptide ou un fragment de celle-ci, caractérisée en ce qu'elle inhibe la croissance de lignées cellulaires de

cancer humain d'origine épithéliale.

12. Protéine selon la revendication 11, caractérisée en ce que la lignée cellulaire de cancers humains d'origine épithéliale comprend des carcinomes d'épiderme de vulve A431 ou des adénocarcinomes du sein

HTB132.

13. Protéine selon la revendication 1 ou son peptide ou unn fragment de celle-ci, caractérisée en ce qu'elle stimule la croissance de fibroblastes de prépuce

humain cultivés in vitro.

14. Protéine selon la revendication 13, caractérisée en ce que les fibroblastes précités

comprennent les lignées cellulaires Sadamoto ou Goodwin.

15. Protéine selon la revendication 1 ou un peptide ou un fragment de celle-ci, caractérisée en ce qu'elle comprend un régulateur de la croissance cellulaire bifonctionnel qui inhibe la croissance des lignées cellulaires de cancer humain d'origine épithéliale et stimule la croissance de fibroblastes de

prépuce humain cultivés in vitro.

16. Protéine selon la revendication 15, caractérisée en ce que la lignée cellulaire cancéreuses humaines d'origine épithéliale comprend des carcinomes d'épiderme de vulve de A431 ou des adénocarcinomes du sein HTB132. 17. Protéine selon la revendication 15, caractérisée en ce que les fibroblastes de prépuce humain précités comprennent les lignées cellulaires Sadamoto ou Goodwin. 18. Protéine selon l'une quelconque des

revendications 11 à 17 ou un peptide ou un fragment de

celle-ci, caractérisée en ce que l'inhibition ou la stimulation de la croissance cellulaire est déterminée par les essais suivants: (a) des puits de microtitres contenant chacun 3,5 x104 cellules dans 50 Pl d'un milieu test comprenant DMEM supplémenté avec du sérum de bovin foetal inactivé à la chaleur à 5% (FBS), de la pénicilline/streptomycine et de la glutamine, sont incubés pendant 3 heures; (b) 50 Pl du milieu test contenant l'Amphiréguline sont ajoutés à chaque puits expérimental pendant que 50 Pl d'un milieu test sans Amphiréguline sont ajoutés à chaque puits de contr8le, lesdits puits étant incubés à 37 C pendant 2 à 3 jours; (c) 100 Ml d'une solution comprenant I-iodo-2'-125 I- désoxyuridine (I-UdR) sont ajoutés à chaque puits et lesdits puits étant incubés à 37 C pendant 4 à 6 heures; (d) le milieu est retiré et chaque puits est lavé une fois avec du PBS; (e) 200 pl de méthanol sont ajoutés dans chaque puits, lesdits puits étant incubés pendant 10 minutes à température ambiante et retirés; (f) 200 ul d'une solution d'hydroxyde de sodium 1M sont ajoutés dans chaque puits, lesdits puits étant incubés à 370C pendant 30 minutes; et (g) la solution d'hydroxyde de sodium 1M est retirée et dénombrée en utilisant un compteur gamma dans lequel la présence de coups radioactifs est une mesure de l'incorporation de I-IUdR et de la prolifération cellulaire tandis que l'absence de coups indique

l'inhibition de la prolifération cellulaire.

19. Protéine selon la revendication 6 ou un peptide ou un fragment de celle-ci, caractérisée en ce qu'elle inhibe la croissance des lignées cellulaires

cancéreuses humaines d'origine épithéliale.

20. Protéine selon la revendication 19, caractérisée en ce que la lignée cellulaire cancéreuses humaines précitée d'origine épithéliale comprend des carcinomes d'épiderme de vulve A431 ou des

adénocarcinomes du sein HTB132.

21. Protéine selon la revendication 6 ou un peptide ou un fragment de celle-ci,caractérisée en ce qu'elle stimule la croissance de fibroblastes de prépuce

humain cultivés in vitro.

22. Protéine selon la revendication 21, caractérisée en ce que les fibroblastes de prépuce précité comprennent les lignées cellulaires de Sadamoto

et de Goodwin.

23. Protéine selon la revendication 6 ou un peptide ou un fragment de celle-ci,caractérisée en ce qu'elle comprend un régulateur de la croissance cellulaire bifonctionnel qui inhibe la croissance des lignées cellulaires cancéreuses humaines d'origine épithéliale et stimule la croissance des fibroblastes de

prépuce humain cultivés in vitro.

24. Protéine selon la revendication 23, caractérisée en ce que la lignée cellulaire cancéreuses humaines d'origine épithéliale précitée comprend des carcinomes d'épiderme de vulve A431 ou d'adénocarcinomes

du sein HTB132.

25. Protéine selon la revendication 23, caractérisée en ce que les fibroblastes de prépuce humains comprennent les lignées cellulaires Sadamoto ou Goodwin.

26. Protéine selon l'une des revendications 19

à 25, un peptide ou un fragment de celle-ci, caractérisée en ce que l'inhibition ou la stimulation de la croissance cellulaire est déterminée par les essais suivants: (a) des puits de microtitres contenant chacun 3, 5 x104 cellules dans 50 ul d'un milieu test comprenant DMEM supplémenté avec du sérum bovin foetal inactivé à la chaleur à 5% (FBS), de la pénicilline/streptomycine et de la glutamine, sont incubés pendant 3 heures; (b) 50 M1 du milieu testé contenant de l'Amphiréguline est ajouté à chacun des puits expérimentaux tandis que 50 Fl du milieu test sans Amphiréguline sont ajoutés à chaque puits de contr8le et lesdits puits étant incubés à 370C pendant 2 à 3 jours; (c) 100 pl d'une solution comprenant îdo'2 125I-iodo-2- 25-I-désoxyuridine'(I-UdR) sont ajoutés à chacun des puits, lesdits puits étant incubés à 37 C pendant 4 à 6 heures; (d) le milieu est retiré et chaque puits est lavé une fois avec du PBS; (e) 200 M1 de méthanol sont ajoutés à chaque puits, lesdits puits étant incubés pendant 10 minutes à température ambiante et retirés; (f) 200 1l d'une solution d'hydroxyde de sodium 1M sont ajoutés dans chaque puits, lesdits puits étant incubés à 37 C pendant 30 minutes; et (g) la solution d'hydroxyde de sodium 1M est retirée et dénombrée en utilisant un compteur gamma dans lequel la présence de coups radioactifs est une mesure de l'incorporation de 125 I-IUdR et de la prolifération cellulaire tandis que l'absence de coups indique

l'inhibition de la prolifération cellulaire.

27. Procédé de préparation de l'Amphiréguline, facteur régulateur de la croissance bifonctionnel, caractérisé en ce qu'il consiste à: (a) cultiver des cellules MCF-7 en présence de 12-0-tétradécanoyl-phorbol-13- acétate (TPA); (b) récolter les milieux conditionnés à partir des cellules MCF-7; et (c) isoler l'Amphiréguline à partir des milieux conditionnés. 28. Séquence de nucléotide codant pour le précurseur de l'Amphiréguline, caractérisée en ce que la séquence codant pour le nucléotide telle que en grande partie représentée à la figure 16 à partir environ du nucléotide numéro i jusqu'à environ le nucléotide numéro

1243.

29. Précurseur d'Amphiréguline, caractérisé en ce qu'il comprend la séquence d'acide aminé en grande partie représentée à la figure 16 à partir de l'acide

aminé numéro 1 jusqu'à environ l'acide aminé numéro 252.

30. Procédé pour la production d'Amphiréguline caractérisé en ce qu'il cbnsiste à: (a) cultiver une cellule d'Eschericbia coli contenant une séquence de nucléotide codant pour l'Amphiréguline sous le contr8le d'une seconde séquence de nucléotide qui régule l'expression du gène de telle façon à ce qu'un peptide ou une protéine ayant une activité Amphiréguline est produite par la cellule Escherichia coli; et (b) retirer l'Amphiréguline à partir de la

culture.

31. Procédé selon la revendication 30, caractérisé en ce que la séquence de nucléotide codant pour l'Amphiréguline comprend la séquence de. nucléotide en grande partie représentée à la figure 16 à partir du

nucléotide numéro 1 jusqu'au numéro 1243.

2 6 2 8 1 0 9

32. Procédé selon la revendication 30, caractérisé en ce que la seconde séquence de nucléotide qui contrôle l'expression du gène comprend un initiateur Tac. 33. Procédé pour la production d'Amphiréguline caractérisé en ce qu'il consiste à: (a) cultiver une souche d'Escherichia coli JM109 transformée avec un plasmide pTacAPAR1 telle que déposée au NRRL sous le numéro de dépSt B-18441; et (b) récupérer l'Amphiréguline à partir de la culture. 34. Procédé pour la production d'Amphiréguline, caractérisé en ce qu'il consiste à: (a) cultiver une souche d'Escherichia coli JM109 transformée avec le plasmide pTacAPHILE telle que déposée au NRRL sous le numéro de dép8t B-18442; et (b) récupérer l'Amphiréguline à partir de la culture. 35. Cellule obtenue par génie génétique, caractérisée en ce qu'elle contient une séquence de nucléotide codant pour l'Amphiréguline sous le contr8le

d'une seconde séquence de nucléotide qui régule -

l'expression du gène de telle façon que la cellule

produise l'Amphiréguline.

36. Cellule obtenue par génie génétique selon la revendication 35, caractérisée en ce que la séquence de nucléotide codant pour l'Amphiréguline comprend la séquence du nucléotide en grande partie représentée à la figure 16 à partir du nucléotide numéro 528 au numéro

761.

37. Cellule obtenue par génie génétique selon la revendication 35, caractérisée en ce qu'elle comprend

une cellule Escherichia coli.

38. Cellule obtenue par génie génétique selon la revendication 35, caractérisée en ce que la seconde séquence de nucléotide précitée qui contrôle l'expression

du gène, comprend un initiateur Tac.

39. Plasmide pAR1, caractérisé en ce qu'il est contenu dans une lignée cellulaire Escherichia coli portant le plasmide, déposée au NRRL sous le numéro de

dépôt B-18438.

40. Plasmide pARH12, caractérisé en ce qu'il est contenu dans une lignée cellulaire Escherichia coli portant le plasmide, déposée au NRRL sous le numéro de

dépôt B-18439.

41. Plasmide pARH6, caractérisé en ce qu'il est contenu dans une lignée cellulaire d'Escherichia coli portant le plasmide, déposée au NRRL sous le numéro de

dépôt B-18440.

42. Plasmide pTacAPAR1, caractérisé en ce qu'il est contenu dans une lignée cellulaire d'Escherichia coli portant le plasmide, déposée au NRRL sous le numéro de

dépôt B-18441. -

43. Plasmide pTacAPHILE, caractérisé en ce qu'il est contenu dans une lignée cellulaire d'Escherichia coli portant le plasmide, déposée au NRRL

sous le numéro de dépôt B-18442.

44. Anticorps, caractérisé en ce qu'il

reconnait un épitope de l'Amphiréguline.

45. Anticorps selon la revendication 44, caractérisé en ce que l'épitope comprend la séquence d'acide aminé suivante:

D T Y S G K R E P F S G D H S A D G F E.

46. Anticorps selon la revendication 44, caractérisé en ce que l'épitope comprend la séquence en acide aminé suivante:

26 28109

S S S E P S S G AD Y D Y SE E Y D N E.

47. Anticorps selon la revendication 44, caractérisé en ce que l'épitope comprend la séquence en acide aminé suivante:

V K P P Q N K T E S E N T S D K P K R K K K G.

48. Anticorps selon la revendication 44, caractérisé en ce que l'épitope comprend la séquence en acide aminé suivante:

E A V T C K C Q Q E Y F G E R C G E K.

49. Anticorps selon la revendication 45, caractérisé en ce que l'épitope comprend la séquence en acide aminé suivante:

V Q L R R Q V Y R K Y E G E A E E R K K

50. Séquence de nucléotide du génome codant pour le gène de l'Amphiréguline, caractérisée en ce qu'elle comprend la séquence de nucléotide telle que

représentée en grande partie à la figure 17.

(U!W) UOI1qUa "p sdap O 5 OO oçZ ooZ OGI c)0, O- Ct o' Eo -9," 9t: IIOH

601.8Z9

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L 9 ú 9

3 2 6 22628109

FIG. 3 A

180 220 26 20

Temps de Répenlwion (min)

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I- H o

180 220 260

Temps de RiJ"pn/'i0n (min) (UjW)uo!4uaj8 ap sdwa 00ú09ZOZZ08tL 0) F-IZ D., rI D I g9H OOL9Z9t ozLt a8ú'91.=

601,8Z9Z 5

/35

FIG.4 A

1/0 0,6 O o 10>x

N 1

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28 36 44 52

Temps J"e RlenF-on (min)

6S 2 6 2 8 1 0 9

26281O9

6/35

FIG. 4B

2836 52

o,6 '( 0 -10 x C\J

0,2 -C

o

28 36 44 52

Temps Je RéKo-.kic (Min) (UlW) uo! ap sduul zS tp 9 eZ Oz

I I I

0- ^A1 9e0 oz o OZ

601,89Z3

nS

8 2 6 2 8 1 0 9

8/35

FIG.4D

1,0 106_

0,2 H

0 10 x

28 36 44 52

Temps je Ré4enFion (min)

X ---6210

FIG.5A

43K 25K 14K 6K

t $ft t 0,16 i i

0/12 N,

i o X o '.

N 102

<0,08 _

<: H 00o4

28 36 44 52 60

-,mps Je Ré-en F-on (min)

2 6 2 8 1 0 9

/3 5

FIG.5B

0,08 43K 25K 14K6K

o". o4

II I

28 36- 44 52

Temps ce Ré/enkion (min) (U!W) Uol:"U2- fap sdwl_ 9g 8e ot Zú bZ 9[ 0_ À2 o I" 8.OC ! 9 ci's -9t V9'11 1 8Z9z

12 262810 9

FIG; 6B

I

00810 40

7-;mns / q)in30 o O o,04 20 < Il o / ! 4i I I

816 24324048

T' ns_ ( _ L:_min)

2628 1 0 9

/35

FIG. 7A

KD 1 2 3 4 KD

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_-66,2

i

-45_,0

,7- -30

18,4- 21,5

14,4- -14

6,2- _,

tA- VS t- t'- a1>' ú

8VL-11

'OBL-Z

_ 7 6ok8z9

2 6 28 1 0 9

/35 FIG.8 pH -9,6 -8,05 -7,0 -6,5 -6,0 -5,1 -4,65 IEF

2 6 2 8 1 0 9

/35

FIG. 9 A

a 00 o n 80

OI 4/I

o,O1 10 Pro-éine ( ng/puis)

2 6 2 8 1 0 9

FIG.9B

o700 J600- 500- w300 0,01 0o,1 1 10 ProFéine (ng/puiFs)

18 2628109

FIG. 10

o80 - c B

0 I I II

0, 1 10 100

Pro-éine (ng/puiFs) FIG. l! A Amphiré jutine Humaine Hydro thé- ra pie H yaro phobe H r

D 0

R L

o Lni T H

E -2

R A P E E -4 4ydropYtile

I I...I I

0 20 40 60 80 100

Résidu 8VRVEQVVKP PQNKTESENT SDKPKRKKKG GKNGKNRRNR KKKNPCNAEF o rNJ

QNFCIHGECK YIEHLEAVTC KCQQEYFGER CGEK

C> o FIG. Il B Domnaine -el qe kR EGF hurnaine 2 Hyd rcV rapie Hydro phobe

H 1

y 0 An T H E R -1 A P -2 Hydropl-u1e -3

45 50 55 60 65 70 75 80 85

Résidu 44 NPCNAEFQNF CIHGECKYIE HLEAVTCKCQ QEYFGERCGE K 84 o C> EGF Humain HydroWhéra pie Hydrophobe Hy irc p h i b e H y

E -3 L

-' E HydrophiJe

0 10 20 30 40 50 60

Résidu

FIG. 11C

o Pr&curser le lf A=npirCc3 tine e Avmaine 4 H yrot O r'a ie 4 Hydro pob6e H y 2 D R T D \k a A, E

R -2,.

A 111

P

I -4

0 50 I00 150 200 250

Pepide Pr-curseur Hydro- hFLlque TM Cybo-

úiçnaL N1\. FerminatpiLe EGF pasiqe

FIG. 11D

FIG. 1 E

AR - EGF Humains 2 Hydro -hé ra pie Hydrophobe

ro '-

R R

T H E p-2 p E 3

R A

-4 4-4ydro phite EGF% Co,

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90

Résidu,o

*24 2628109

/35 A. AR hronRtée

1 10 2O

VVKPPQDKTE SENTSDKPKR KKKGGCKNGK

40 50

N R R N R X K X N P C N A EF Q NF C r H E C K Y I

70 780

EHLE A V T C K C Q Q EY. F GERCGEK

B. AR plus grande

1 10 20

8 V R V E Q V V X P PQDKTESENT S D X P K R K K K

40 50

G X GKNG K N R R N R X KKK N P C N AEF Q N F C I

70 80 84

HG E C K Y E HII LEAVTC X C Q Q E Y F C GER CG E K

FIG. 12

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6 0 1 Z9 Z

FIG. 14A mphiréygulne se lianF a t ADNceUluLSe o -O: AR- cetLlaose E-0: ADN de Rdénab-rée rooo-. - a: ADN deAR native E 0. 3000- o 0 -h iolA 9ls4des+ 96 + Go + 2y0 N

NaCI [M].

[I4] lODN oof+ ' 04O\ o 0Oq1 00f asD)Wv1)lD NCIVJOJ:,&-à,ov20 --10: -v09 o,? _ouRa/utv%..,, td -NOVI 28/ /35 Pricavseur de L'amph[ré uLine

MRAPLLPPAP VVLSLLILGS GHYAAGLDLN DTYSGKREPF SGDHSADGFE 50

VTSRSEMSSG SEISPVSEMP SSSEPSSGAD YDYSEEYDNE PQIPGYIVDD 100

SVRVEOVVKP PONKTESENT SDKPKRKKKG GKNGKNRRNR KKKNPCNAEF 150

ONFCIHGECK YIEHLEAVTC KCOOEYFGER CGEKSMKTHS MIDSSLSKIA 200

LAAIAAFMSA VILTAVAVIT VQLRRQYVRK YEGEAEERKK LRQENGNVHA 250

IA 252

Ampkhiriguine makFre I -

SVRVEQVVKP PQNKTESENT SDKPKRKKKG GKNGKNRRNR KKKNPCNAFF

QNFCIHGECK YIEHLEAVTC KCQQEYFGER CGEK

PepFide Résicu Longeur Rcgio

166 184

259 EAVTCKCQQEYFGERCGEK, 19 t'le lie EGF

108 130

264 VKPPQNKTESENTSDKPKRKKKG 23 Hydrophile

31 50

279 DTYSGKREPFSGDHSADGFE 20 N-Terminal tl

71 90

280 SSSEPSSGADYDYSEEYDNE 20 N-Terminal #2

221 240

281 VQLRRQYVRKYEGEAEERKK 20 CyoptLas miqAe

FIG. 15

- VVVV VVWVWVVVVVVV3VV.lUîln3W1V1393oV3VlllVl.V919vv9I1WiVVIVlVVIVViu Vi ivYlViO 1i9VV3111111viwV 9t1 1 VIO'JVV9SV999vIWIVLVO3IUVIV13V13"L11 3 I9VVL11W V1I9WllV119vi9vIii9l11133V99I W 3VVVlVal3V99ol9v3 901 o, S3111331993I19V91V3V IVi VlVVVV33D9VlV19WVV339.3V319V9IV3V31VIVO9V3VIIV WlVVVV913VVIW V39 VIV 139 1V3 VI9 IS6 pd4 V I V H A OS 1W V99 IVV 9V W3 V3 113 vvV 9W V93 VV9 9V9 139 VV9 V9 VV lVl VvW 9V 319 3V1 VVS VW V9V 113 9L8 N 9 N 3 b II 1 X à 3 3 V 3 9 3 A X 8 A b 0 d 1 ' OtZ OúU DJV3 319 V3V iV i9 139 19 139 V3V 313 31V 919 139 131 91V 111 339 139 VIV 3395 V39 VII V39 IV VVV 108 b A l A V AV1 1 A Vy 1A S V V I V V 1 V I X OZZ OlZ.UO V31 Vil 19V lSV 3V9 11V 91V 39V 3V3 13V VVV 91V 331 9W VV9 999 191 99U VV9 199 3u IVI W9 VV3 9V3 9ZL S 1 S S I N S H 1 X N S X 3 9 D d 3 9 3 A 3 b b 061 0ouI 191 WV 39I V3VVi9V39 w 9133V3 9V9 ViV ivi VVV 391 W9V99 3V3U IV391 3iil ivvW 3 111VV9 V39 IS9 V X 3 1 A V 3 1 H 3 I A À 3 9 H I 3 A N b A 3 V 0L1 091 OSl LW191 V33 WVW9W 9VV V3V VWVVVV VWWVV99 WVW39 9 V99 VVVV W9VVVVVVV 333VVV9gS n N 3 d N X X X H N t N b X 9 N X 9 9 X X H dX d IV9 V31 13V lVV VV9 9V W9 93V 9W 3W W3 333 333 9VV 119 V19 9V3 WV9 n V9V 319 V31 1V9 1V9 319 lOS 0 S 1 N 3 S 3 1 X N b d d X A A b 3 A à A S O0 A

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V I V H A

W.LVV V99 LVV 9V9 Wvv3 V53 113 WVVV 9VV V93 VW9 9V9 139 vW9s V99 W9 iVl VVV 99V 319 3V1 W3 V9V V9V /L3 999 N 9 N 3 b H 1 i x 3 3 V 3 9 3 A x d A À b H 1H un 96ee6;6lB o64ee6e5ueoeee6;p ee6e6ee6Ge e" *(q40q) oZ*eel; 66e666;eeeeeeeeolzeeeoee Lrn ' eLeDeâ;el6eeR;VD 319 V3V V i119 9 119 li 1359 V3V 313 31V 919 139 131 91V 111 339 135 VlV 339 V99 Vil 109 b A A i A V A V i I I A V S H A V V I V V i ozz OUZ V3s llV VVV V3il Vil 19V 19V 3V9 lV 91V 39V 3V3 13V VVV 51V 331 9W VV9 995 11 9953 VV9 199 311 lVl 9ZS V I X 1 S S a I W S H 1 i W S i 3 9 3 8 3 9 A A ooz 061 081 VV9 V3 9V3 151 vV6e6Vf6effee.lee.e leifef e 6oee (qI SZ') 66eoe6e 3 0 b 3 e6BRq; eBefieeBeeelollq 6ee16v 391 V3V V19 V35 W9 913 3V3 9V9 ViV lVl WVVV 391 VV9 V5599 3V3 1V E9t

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0L1 091

391 311 lVV VV3 111 VV9 V39 lVV 191 V33 1W VVVW 9W 9WVV V9V 3W VV VV 1W VVV V99 IVV VWv 399 V99 88ú 3 A N b 3 V N 3 d N X X X H N H 8 N M 9 N M 9 9

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33 2628109

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TCGCGATGTACGGGCCAGATATACGCGTTGACATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAAT

CAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTA

AATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGT

TCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGACTATTTACGGTAAA

NdeI

CTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAAT

GACGGTAAATG6CCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTG

GCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCA

ATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACRCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAAT

GGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCC

EcoRI HIV TATA-->

ATTGACGCAAATGGGCGGAATTCCTGGGCGGGACTGGGGAGTGGCGA6CCCTCAGATGCTGC

ATATAAGCAGCTGCTTTTTGCCTGTACTGGGTCTCTCTGGTTAGACCAGATCTGAGCCTGGG

HlndIII PstI

AGCTCTCTGGCTAACTAGA6AACCCACTGCTTAAGCCTCAATAAAGCTTGGGCTGCAGGGCG

GGGCCTCCCCACCAAACTAGCCCTGTTCGCGCTCTCTCGGCAGTGCCGGGGGGCGCCGCCTC

Sé"otcz Slrna. TGF-b -->

M P P S G L R L L P L L L P L L W L L V

CCCCATGCCGCCCTCCGGGCTGCGGCTGCTGCCGCTGCTGCTACCGCTGCTGTGGCTACTGG

HaeI SstI I AR -->

L T P S R P A A G V V K P P Q N K T E S

TGCTGACGCCTAGCCGGCCAGCCGCGGGAGTAGTTAAGCCCCCCCAAAACAAGACGGAAAGT

E N T S D K P K R K K K G G K N G K N R R

GAAAATACTTCAGATAAACCCAAAAGAAAGAAAAAGGGAGGCAAAAATGGAAAAAATAGAAG

N R K K K N P C N A E F Q N F C I H G E C

AAACAGAAAGAAGAAAAATCCATGTAATGCAGAATTTCAAAATTTCTGCATTCACGGAGAAT

K Y I E H L E A V T C K C Q Q E Y F G E

GCAAATATATAGAGCACCTGGAAGCAGTAACATGCAAATGTCAGCAAGAATATTTCGGTGAA

R C G E K * EcoRV/XbaI

CGGTGTGGGGAAMTAA G ATATCTAGA*

FIG. 19

FIG. 20

HincII trp-35 lac-10 ARN m 5' lac

G (TTGACA) ATTAATCATCGGCTCG {(TATAATG} TGTGG AATTGTGAGCG

Si-e de Liaison lacSD croSD BglII

GATAACAATTTCACAC (AGGA} AACAGGATCACTA (AGGA) GGTTCAGATCT

S igat Ak p PvuI siL p,k P ->

ATGAAACAATCTACGATCGCCCTCGCACTTCTCCCACTGCTGTTCACTCC

M K Q S T I A L A L L P L L F T P

AR->

AGTGACAAAAGCTGTAGTTAAGCCCCCCCAAAACAAGACGGAAAGTGAAAAV T K A V V K P P Q N K T E S E N

TACTTCAGATAAACCCAAAAGAAAGAAAAAGGGAGGCAAAAATGGAAAAAA

T S D K P K R K K K G G K N G K N

TAGAAGAAACAGAAAGAAGAAAAATCCATGTAATGCAGAATTTCAAAATTT

R R N R K K K N P C N A E F Q N F

CTGCATTCACGGAGAATGCAAATATATAGAGCACCTGGAAGCAGTAACATG

C I H G E C K Y I E H L E A V T C

SspI EcoRV

CAAATGTCAGCAAGAATATTTCGGTGAACGGTGTGGGGAAAAGTAAGATAT

K C Q Q E Y F G E R C G E K *

XbaI (SalI/BamHI)

CTAGAGTCGATCCGTGACTAATTGGGGACCCTAGAGGTCCCCT TTTTATTTTAAAA

2628109.

pTacAPHILE Hinc II trp-35 lac-10 ARNm 5' lac

G (TTGACA) ATTAATCATCGGCTCG (TATAATG) TGTGG AATTGTGAGCG

Sit- cde tiaison locSD croSD BglIl

GATAACAATTTCACAC (AGGA) AACAGGATCACTA (AGGA) GGTTCAGATCT

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ATGAAACAATCTACGATCGCCCTCGCACTTCTCCCACTGCTGTTCACTCC

M K O S T I A L A L L P L L F T P

Sstll domaine hyydr'phiLe cde AR ->

AGTGACCGCGGGAGTAGTTAAGCCGCCCCAAAACA4A.GGARA GAAA

V T A G V V K P P Q N K T E S E N

TACTTCAGATAAACCC3

T S D K P K R K K K G G K N G K N

EcoRI EGF->

TCGAAGAAACAGAAGAAGAAATTCTGACTCTGAATGCCCGCTGTCTCA

R R N R K K K N S D S E C P L S H

TGACGGCTACTGCCTGCATGACGGCGTATGCATGTACATCGAAGCTCTGGA

D G Y C L H D G V C M Y! E A L D

Sph

CAAGTACGCATGCAACTGCGTTGTGGTACATCGGCGAACGTTG CCAGTA

K Y A C N C V V G Y I G E R C Q Y

BaomI xba I

CCGTGACCTGAAATGGTGGGAACTGCGTTAAGGATCCTCTAGAGTCGATCC

GTGACTAATTGGGGACCCTAGAGGTCCCCTTTTTTATTTTAAAA

FIG.21