HUT52545A - Genetic process for production of amphiregulin - Google Patents

Description

A találmány tárgya eljárás egy uj, kettős funkciójú növekedésszabályozó glikoprotein, az amfiregulin előállítására és felhasználására egyes rákos sejtvonalak növekedésének gátlására, illetve több más sejtvonal növekedésének serkentésére.

Úgy járnak,el, hogy az MCE-7 jelű emlő adenokarcinóma sejteket 12-0-tetradekanoil-forbol-13-acetát (TPA) jelenlétében tenyésztik, és a sejtek kondicionált táptalaját összegyűjtve elkülönítik az amfiregulint a táptalajból;.illetve az MCP-7 jelű emlő adenokarcinóma sejtekből cDNS vagy genomiális klónozás utján nyert amfiregulin gént megfelelő szabályozó DNS-szakaszokkal kapcsolva bakteriális sejtekbe juttatják, és elkülönítik a bakteriális sejtek által termelt amfiregulint; majd a tisztított

_Μ amfiregulint a kezelendő sejtvonalhoz adagolva vizsgálják a sejtnövekedés gátlását, illetve serkentését.

BUDAPESTI NEMZETKÖZI , , ÜGYVÉDI MUNKAKÖZÖSSÉG

49.124/SZE SZABADALMI IRODA

DALSZÍNHÁZ U 10 Í533-73

KÖZZÉTÉTELI PÉLDÁNY

Ctztu tAzTíl/oo

GENETIKAI ELJÁRÁSBA! ELŐÁLLÍTOTT AMFIREGULIN

ONCOGEN, SEATTLE, Washington, AMERIKAI EGYESÜLT ÁLLAMOK

Feltalálóké

SHOYAB MohammecL,

McDONALD Vicki L.,

ELOWMAN Greg,

BRADLEY James,

AMERIKAI

SEATTLE,

KENT,.

SEATTLE,

WOODINVILLE,

EGYESÜLT ÁLLAMOK

Bejelentés napja; 1989. 01. 24.

Elsőbbségei;

1988. 01.	25.	(148,327),
1988. 04.	15.	(181,884),
1989. 01.	17.	( .$&)>

AMERIKAI EGYESÜLT ÁLLAMOK • · ·· ···· ···· ··«· • · ··· · · · · • · · · · ····««· ·«« « ··« jelen találmány az 1988. április 15-én benyujtott, 181,884 számú szabadalmi leírás részbeni •1 folytatása, amely pedig az 1988. január 25-én benyuj tott, 148,327 számú szabadalmi leírás részbeni folyta tása. Az alábbiakban mindkét szabadalomra teljes egé szűkben hivatkozunk.

A találmány tárgya eljárás egy uj növekedésszabályozó glikoprotein, az amfiregulin előállitá erőtelj esen lak növeked szabályozó

gátolják	egyes
ését, mig	több,
továbbial	boán e
hatóanyag	számo

daganatos eredetű sejtvona kettős funkciójú növekedéss, különböző terápiás felkizárólag

A sejtosztódást és a -differentációt a serkentő, hormonok sokasága kezdeményezi, segíti elő, tartja fenn, illetve szabályozza. A sejtszintü homeosztázist fenntartó mechanizmusok megváltozása és/vagy hibás működése tekinthető a sejtosztódással kapcsolatos be tegségek, igy a neoplázia alapvető okának. A növekedés szabályozó faktorok, számos patologikus és fiziológiás • ·· · ···· ···· • · · · folyamatban játszanak szerepet, igy a szignál transzdukcióban, a sejtek közötti kommunikációban, a növekedésben és fejlődésben, az embriógenezisben, az linmunválaszban, a vérsejtek képződésében és fejlődésében, a sejtek túlélésében és differentációjában, a gyulladásokban, a szövetek ujraképzésében és javító mechanizmasaiban, az atheroszklerózisban, valamint a rákos lőly ama tokban. Minthogy potenciálisan f elhasználhatok a rák diagnózisára, előrejelzésére illetve kezelésére, éi jogosan igen nagy az érdeklődés a növekedésszabályozó faktorok elkülönítése, jellemzése, továbbá működési mechanizmusuk meghatározása iránt. Λζ e faktorokról szerzett ismeretek elősegíthetik továbbá a normális sejtekben a szabályozás megszűnése mögött álló alapvető iá a transz fon:

náló növekedési faktor-m-t lemezkékből fibrobiaszt növekedési faktort (FGJ?), az idegi nőve ked esi faktort (ÍGF), a transzformáló növekedési fakaz inzulin-szerű növekedési faktor inövekedési faktorokat, igy az eritropoetint, a telepképződést serkentő faktorokat (CSF 1 és 2), • · · · · ·· · «··· • · · · · • · · • · · · ··«· ···

az interleukinokat (IL-1-tol IL-6-ig), az interferonokat (IStT a, B, gamma), a tumor nekrózis faktor-α- és -B-t (TNP ε, B), a leukoregulint, az onkosztatin Li-t és a többi, kevésbé definiált, a növekedést és differentációt szabályozó fehérjét különféle sej ttípusok

akár normál fiziológiás körülmények között, akár külső ingerekre válaszolva.

fenti faktorok legtöbbje autokrin, illetve parakrin módokon hat

[összefoglalót közölnek: Bor	revieus	see: Goustin és
munkatársai, Cancer Rés., 46,	1015 -	1029. (1986);
Rozengurt, Science, 234, 161	- 166.	(1986); Pardee,
Cancer Rés., 47, 1488 - 1491.	(1987)	; Sachs, Sci.

Amer., 254, 40 - 47. (1986); ilarshall, Cell, 50,

5-6. (1987); Helcher és Anderson, Gell, 30_t

715 - 720. (1987); Clemens és HcNurlan, Biochem. J., 226, 345 - 360. (1985); Náthán, J. Clin. Invest., 79, 319 - 326. (1987); Spóra és Roberts, J. Clin. Invest., 78, 329 - 332. (1986); Old, natúré, 326, 330 - 331· (1987); Beutler és Cerami, New Eng. J. l.Ied., 316, 379 - 385. (1987); Weinstein, J. Cell. Biochem., 33, 213 - 224. (1987); Zarling és munkatársai, Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A., 83, 9739 - 9744. (1987); Sporn és Todaro, N. Eng. J. Bed., 303, 878 - 880. (1985); Sporn és Roberts, Natúré, 313, 745 - 747. (1985).

• · · · · · ···· ···· ·· • · · · · · · • · ··· · ··· • · · · · ···· ···· ··· · ··· biológiailag aktív forbol-észterek, igy a 12-0-tetradekanoil-forbol-13acetát (TPA) hatékony daganatkeltő szerek in vivő, továbbá igen sokféle biológiai és biokémiai válaszreakciót váltanak ki, illetve befolyásolnak in vivő és in vitro [Blumberg,

Őrit. Rév. Toxicol., 9, 153 hogy a TPA gátolja az 1101-7 jelű, emberi emlő-adenokarcinóma sejtvonal növekedését.

kezelt látják [üsbome ;; Valette (1937)] .

módon kettős sejtosztódás-szabályozó aktivitással ren.-Ζ plasztikus sejtek osztódását, ám serkenti néhány normál sejttípus növekedését. A különlegesen hidrofil, közepes (22,500 dalion) molekulatömegü glikoprotein, az amfi regulin két különböző (egy rövidebb és egy hosszabb), de hatását tekintve azonos molekula formájában létezik

A hosszabb variáns hat további, a molekula amino-végén elhelyezkedő aminosavától eltekintve a két variáns képezi, aO r?

az és más, fibroblasztol serpéldákban ismertetjük az amfiregulin azonosításé afiregulin sex illetve transzfektált eukarióta

E maga nemében páratlan faktor számos felhasználását is bemutatjuk az alábbi leírásban ···· ···· ···· • · · · • · · · • · • · • · · · · · · · • · · ··· • · · ···

Az alábbiakban röviden ismertetjük a kisérőnagynyornásu folyadék-kromatográfiás kromatogram áttöegyesítésével nyert minta szemipreparativ, fordított fázisú, nagynyomású f oly ad ék-kr oma tográfiás vizsga lat a

3A. ábra: az előző kromatográfiás lépés

I jelű egyesitett frakcióinak analitikai, fordított fázisú, nagynyomásu folyadék-kromatográfiás tiszti33. ábra: az előző kromatográfiás lépés lazisu, nagynyomású folyadék-krornatográfiás tisztitása.

ig. ábra: a 3A. és a 33. frakcióinak gélszűrési lopon. A kromatográfiát az í. példa 3/2. pontjában /3A. ábra/ nagynyomású folyadék-kromatográfiája; (B) a betöményitett 36« frakció /3A. ábra/ nagynyomásu folyadék-kromatográfiája; (C): a betöményitett 37 frakció /3A. ábra/ nagynyomású folyacLék-kroraatográfiája; (D): a betömenyitett, egyesitett •··· · · · · ···· ·· · ♦ • · · · · · · • ···· · ·«« • · · · · ···· ···· ··· · ···

41. és 42. frakció /3B. ábra/ nagynyomású folyadék

-krómat ográ fiá ja.

5. ábra: a tisztított amfiregulin (AR) és nagynyomásu folyadék-kromatográfiás vizsgálata Bio-Sil

TSK 250 oszlopon pontjában leírtak szerint eljárva végezzük. Molekula suly-markerként ovalbumint (43kD), kimotripszinogén-A-t (25kD), ribonukleázt (14kD) és inzulint (6kD) haszná jy lunk. [(A): amfiregulin (AR); (B): S-piridil-etil-amfi6. ábra: az amfiregulin és az S-piridil

-etil-amfiregulin vizsgálata fordított fázisú ultra pórusos RISC 0'3 oszlopon (4,6 x 75 mm). A gradienshez kiindulási oldószerként 0,1 -%-os trifluor-ecetsavat, végső oldószerként pedig 0,1 £ trifluor-ecetsavat tar talmazó acetonitrilt használunk, szobahőmérsékleten, kát gyüjtiinl· [μ)

S-piridil-etil-amfiregulin.] az amfiregulin fehérjék nátrium-dodecil-szulfát jelenlétében végzett poliakril-amid gélelektroforézises vizsgálata. [(A): a futtatást nátrium-dodecil-szulfát jelenlétében, 15 $~os poliakril-amid • · · · • · · · • · • · •··· ·««· ··«« • · « ··· gélen-(0,75 mm 2c 18 cm 2c 15 cm, Bio-Rad), összeköttetésben nem levő alsó- és felső-pufferekkel, 30 mA-es állandó áramerősség mellett végezzük e ku 1 a s u 1 y -m a r k e r e k:

marha szérum albumán (66,2kD), ovalbumin (43kD), szénsav-anhidráz (31 kD), kimotripszinogén-A (25,70), szójabab-tripszin-inhibitor (21, 5kD), laktoglobulin aprótonin (6,2>j) és insáv:

amfiregulin (AB),

SrE-mk, negyed!

• (B) n á t r ium-do de ci1-s z u 1 /“OS poliakril-amid minigélen cm), foszfolipázzal kezelt, fordított fázisú, nagynyomású

8. ábra folyadék-kromatográfiával e 1 k ül ö a 125-ös tömegszámú jód-izotóppal jelölt amfiregulin izoelektroraos fókuszálása. A követ kező, 4,65 es 9,6 közötti P_T értékű standardokat használjuk: íikocianin (^,65), B-laktoglobulin-B (5,1), szarvasmarha szénsav-anhidráz (6,1), emberi szénsav

-anhidráz (6,5), ló mioglobin (7,0), bálna mioglobin (8,05), a-kimotripszin (8,8) és citokrón-C (9,6) ·· ·· ···· • · · · · • · · ·· • · · ···· ···· ·«« ···· »··· ··· ···

9. ábra: (á): az amfiregulin dózis-hatásgörbéje: a 125-ös tömegszámú jódizotóppal jelölt dez oxi-uridin beépülésének gátlása az A431 sejtek DKS-ébe.

(B): az amfregulin serkentő hatása a 125-ös tömegszámú jódizotóppal jelölt dezoxi-uridin beépülésére az em beri előbőr fibroblasztok (Sadamoto) DkS-ébe

10. ábra: a 125-ös tömegszámú jódizotóppal fixált A431 sejtekhez, vagy A431 plazmamembránokhoz való kötődés során. A kötődési vizsgálatokat az

1. példa 1/5. pontjában leírtak szerint eljárva vé gezzük. A fixált sejtekkel, illetve a membránokkal végzett mérésekhez reakciónként 100 /ul illetve 50 yul térfogatú mintákat használunk

J elölés

A receptor forrása

Korapetitor fixált sejtek fixált sejtek membránok membránok

A P m t

PGF

AR ·· «· ···· • · · · · • · ··· • · · ···· ···· ··· ···· ·*·· • · * ··· • · • ··· es az (A): AR fi. - 84 aminosav); (B): AR (44 - 84. aminosav); (C): BG1 sav); (;,): az emberi a két görbét úgy hozzuk fedésbe, hogy a 13. ábránál megfelelően, az érett AR 46. aminosava, egy cisztein, tozat aminosav-sorrendje. Az egyes aminosavakat a szo-

alanin	β)
arginin	συ
aszparagin	(N)
aszparaginsav	(3)
cisztein	(G)
glutamin	(Q)
glutaminsav	(E)
glicin	(G)
hisztidin	(H)
izoleucin	(Ϊ)
leucin	(L)
lizin	(K)

• ·

metionin	(?)
f enil-alanin	(?)
prolin	(?)
szerin	(S)
treonin	(?)
♦ · 1 -Ί s
τηρτοιεη	(?)
tirozin	(?)
valin	(?)

13.

telemben

Λ (--):

125-ös tömegszámú jódizotóppal jelzett anfiregulin kötődése cellulózhoz (o—-ο), denaturált DilS-cellulózhoz (a—o), és natív DiS-cellulózhoz (Δ---Δ). (3): a 125-ös tömegszámú jódizotóppal jelzett anfiregulin cellulózhoz (o—-o), valamint Dl“S-cel-

125-ös tömegszámú jódizotóppal jelzett EGE cellulózhoz (A—A), valamint DNS-cellulózhoz (V—KJ) való kötődésével.

szilárd fázisú eljárással előállított szintetikus amfiregulin peptidek. A 166 - 184.

aminosavaiénak (No. 259.), a 108 - 130. amino savaiénak (ITo. 264.), a 31 - 50. aminosavaknak (No. 279.), a

- 90. aminosavaknak (No. 280.), és a 221 - 240. amino (No. 281.) megfelelő öt pepiidet szilárd fázisú elő

···· ··· • · ·

• · · · • · · ·

A találmány tárgya eljárás az amf'iregulint (AR-t) és az AR prekurzort kódoló nukleotid-szekvenciák előállítására, valamint az amfiregulin fehérje hagyományos vagy rekombináns DNS-technikai módszerekkel történő előállítására.

Az uj sejtnövekedést szabályozó faktort, az amfiregulint a TPA-val kezelt MGF-7 sejtek fejezik ki és választják ki két különböző, ám hatásukat tekintve egyenértékű variáns formájában. A két variáns szerkezete, a hosszabb változat amino-terminális végén található hat további aminosavtól eltekintve azonos.

Az AR hatékonyan gátolja a neoplasztikus sejtek DNS-szintézisét, igy potenciálisan hathatós tumorellenes szerként alkalmazható. Különösen érdekes az AR azon tulajdonsága, hogy elősegíti a fibroblasztok, és más normál sejtek növekedését; az AR igy esetleg olyan kórképek kezelésében is alkáfaiazható, melyekben a sejtosztódás gyorsítása szükséges, például az égéseknél és a sebeknél.

Az AR vagy az AR-fragmensek és AR-származékok terapeutikus felhasználási lehetőségei a neopláziák kezelésében, és nyomonkövetésében, valamint a sebek kezelésében egyaránt széleskörűek. Az AR felhasználási területe kiterjedhet a csontfelszivódás és az immunválasz befolyásolására, továbbá az arachidonsav-kaszkád serkentésére. Az amfiregulin gént és géntermékeket, ·· ·· ···· ···· ···· • · · · · · · • · · · · · · ·· • · · · · ···· ···· ··· · ··· az ezek előállítására szolgáló eljárásokat, valamint felhasználásukat az alábbi pontokban, illetve a példákban ismertetjük részletesebben.

1) AZ AMFIREGULIN ELŐÁLLÍTÁSA ÉS TISZTÍTÁSA

Az amfiregulint az MCF-7 jelű, emberi emlő-karcinóma sejtvonal választja ki a 12-0-tetracLekanoil-forbol-13-acetát (TPA) daganatkeltő szerrel végzett kezelés hatására. Az amfiregulin a TPA-val kezelt, majd tenyésztett MCF-7 jelű sejtek kondicionált táptalajából különíthető el, majd az elkülönített nyerstermék nagy specifikus aktivitású termékké tisztítható tovább. Az amfiregulin más sejtvonalakból is elkülöníthető, TPA-val, vagy más daganatkeltő szerrel végzett kezelést követően, vagy anélkül. Az amfiregulin előállítható továbbá a rekombináns DNS-technikák felhasználásával, vagy szilárd, fázisú peptidszintézissel.

Az amfiregulint a szakirodalomból ismert igen sokféle módszerrel illetve eljárással tisztíthatjuk, ideértve - ám nem kizárólagos jelleggel - a kromatográfiát (például fordított fázisú folyadék-, gélszürési-, folyadékcserés-, ioncserélő-, méret szerinti kizárásiés affinitás-kromatográfia), a centrifugálást, az elektrofóretikus eljárásokat, a differenciált oldhatóságot, vagy bármely más, ismert fehérjetisztitási eljárást.

A találmány szerinti eljárás egy jellemző kivitelezési változata során az MCF-7 sejteket 48 órán át TPA-val kezeljük, majd, friss, szérummentes táptalajban 4 napon át tenyésztjük. Az igy nyert, kondicionált táptalajt összegyűjtjük, és nyers AR előállítására használjuk fel, az 1. példa 2/ pontjában leírtak szerint eljárva. Fordított fázisú folyadék-, majd gélszürési kromatográfiával látszólag homogén termékké tisztítjuk az AR-t az 1. példa 3) pontjában leírtak szerint eljárva: a nyers kiindulási anyaghoz képest 1,842 - 2,270-szeresére tisztított AR-t nyerünk. Az eljárás reprodukálható; az eljárás eredményeként 2,7 - 3,4 · 10^ egység/mg fehérje specifikus aktivitású, tisztított AR preparátumot állítunk elő.

2) AZ AMFIREGULIN GÉN

2/1) Az amfiregulin gén elkülönítése és klónozása

A találmány szerinti eljárás kivitelezése során az emberi amfiregulint kódoló nukleinsav-szakaszt, vagy annak funkcionális megfelelőjét használjuk fel az emberi amfiregulin fehérjetermék kifejeztetésére szolgáló rekombináns DNS-molekulák előállítására. Az amfiregulint kódoló nukleinsav-szakaszt az ·· ···· ···· ···♦ • · · · • ··· · ··· • · · · · ···· ···· ··· · ···

- 17 amfiregulin-szerü aktivitást mutató fehérjéket termelő sejtekből különíthetjük el. A találmány szerinti eljárás egy jellemző kivitelezési változatában például az MCF-7 jelű emberi emlő-karcinóma sejtvonalat használjuk az AR-t kódoló nukleinsav-szakasz forrásaként. A kódoló szakaszt akár a fenti sejtekből elkülönített és tisztított RNS-ből cDNS-klónozással, akár pedig genomiális klónozással különíthetjük el. A cDNS vagy a genomiális DNS génkönyvtárat a szakirodalomból ismert módszerek szerint eljárva nyert DNS-fragmensékből állítjuk elő, ideértve - bár nem kizárólagos jelleggel - a restrikciós endonukleáz enzimek alkalmazását.

Az AR gént tartalmazó DNS-fragmenseket számos, a szakirodalomból ismert módon azonosíthatjuk, így például az AR aminosav-sorrendjének egy részletéből levezetjük a DNS nukleotid-sorrendjét, ezt a DNS-szakaszt kémiai szintézissel előállítjuk, radioaktív izotóppal jelöljük, majd hibridizációs próbaként használjuk fel.

Az AR gén elkülönítésére alkalmas egyéb módszerek közé tartozik például a gén DNS-szekvenciájának kémiai szintézise az ismert, például az AR aminosav-sorrendje alapján levezetett nukleinsav-sorrend alapján. További lehetőség az egyes kiválasztott mRNS ·· ·· ···· ···· ···· • · · · · · · • · ··· · ·«· • · · · · ··«······· · ···

- 18 molekulák in vitro transzlációja, majd, a transzlációs termékek biológiai hatás alapján, vagy immunológiai módszerekkel végzett vizsgálata. Az azonosított és elkülönített gént ezután megfelelő klónozó DNS-vektorba építjük be. Igen sok, a szakirodalomból ismert DNS-vektor - DNS-befogadó gazdasejt rendszer - használható erre a célra. A lehetséges DNS-vektorok közé tartoznak azok a plazmidok vagy módosított vírusok (bár nem kizárólag), melyek a DNS-befogadó gazdasejttel összeférhetőek. Ilyen vektorok például - bár nem kizárólag - a bakteriofágok, igy a lambda-származékok, vagy a plazmidok; igy a pBR322 vagy a pUC plazmid-származékok.

A rekombináns DNS-molekulákat transzformációval, transzfekcióval, infekcióval, e1ektropőrációval, vagy egyéb más módon juttathatjuk be a DNS-befogadó gazdasejtbe.

A találmány szerinti eljárás egy előnyös kivitelezési módozatában úgy klónozzuk az MCF-7 sejtekben kifejeződő AR gént, hogy az MCF-7 sejtek által a TPA kezelésre válaszként termelt mRNS-eket kiválasztjuk, majd lambdagtlO bakteriofág felhasználásával cDNS génbankot állítunk elő. Minthogy a kezeletlen MCF-7 sejtek gyakorlatilag nem termelnek és nem választanak ki AR fehérjét, feltételezzük, hogy az AR TPA-indukciója a transzkripció szintjén is észlelhető, és • ·· · egy ilyen cDNS-génbankban az AR-t kódoló szekvenciák jelentősen feldúsulnak. A cDNS-génbankot az emberi kodonhasználat [Lathe, J. Mól. Bioi., 183, 1 - 12. (1985); valamint 3. példa 1) pont] ismeretében a várhatóan a legjobb egyezést biztositó, degenerált oligonukleotid-próbákkal hibridizálva elkülönítjük az AR-t kódoló cDNS-kiónokat. E cDNS-klónok segítségével azonosítjuk az AR mRNS-t, és az AR gént. Az AR cDNS nukleotid-sorrendjének [3. példa 2) pont] ismerete lehetővé teszi továbbá az AR elsődleges aminosav-sorrendjének levezetését is.

A genetikai kód természetes degeneráltsága folytán a találmány szerinti eljárás kivitelezése során más nukleotid-sorrendü, de lényegében ugyanazt, vagy funkcionálisan azzal egyenértékű aminosav-sorrendet kódoló DNS-szakaszokat is felhasználhatunk. Ilyen, az AR nukleotid-sorrendjét érintő eltérések az ugyanazt, vagy az eredetivel funkcionálisan egyenértékű génterméket kódoló szekvenciát eredményező deléciók, addiciók vagy különböző nukleotidok helyettesítése. A géntérmék hordozhat úgynevezett csendes”, azaz a termék biológiai aktivitását nem befolyásoló deléciókat, addiciókat, vagy aminosav-cseréket. Az aminosav-cserék az illető aminosavak hasonló polaritása, töltése, oldhatósága, hidrofób-, hidrofil- vagy amfipatikus természete alapján történhetnek. Negatív töltésű «· ·· ···· ···· ···· • · · · · · » • ···· » · ·· • · ο · · ««·· ···· ··· · ··· aminosavak például az aszparaginsav és a glutaminsav; pozitív töltésű aminosavak a lizin és az arginin; töltés nélküli, poláros illetve nem-poláros végcsoportu, hasonló hidrofilicitási értékkel jellemezhető aminosavak a leucin, az izoleucin és a valin; a glioin és az alanin; az aszparagin és a glutamin; a szerin és a treonin; a fenilalanin és a tirozin.

Az AR cDNS-ét próbaként használva kimutathatjuk a TPA-val indukált MCP-7 sejtekben az AR mRNS-t. Az AR mRNS-ének mérete mintegy 1400 bázispár.

Amint azt a 4. példában leírjuk, az AR cDNS-e felhasználható az AR gén jellemzésére is. Az emberi AR gén kromoszómális helyzetét a triciummal jelzett AR cDNS metafázisos kromoszómákhoz történő in situ hibridizációjával határozzuk meg. A vizsgálat szerint az emberi AR gén a 4-es számú kromoszóma 4ql3-21 régiójában helyezkedik elí e régióról feltételezik, hogy a limfociták differentációjában játszik szerepet [lásd a

4. példa 2) pontját]. A cDNS-t felhasználjuk a teljes AR gént, valamint az 5’ irányban található szabályozó szakaszt tartalmazó genomiális DNS elkülönítésére is. Az AR gén mintegy 10 kb méretű, 6 exont tartalmaz.

Az 5* szabályozó szakaszt beépítjük egy, a promoter nélküli kloramfenikol-acetil-transzferáz (CAT) gént hordozó expressziós vektorba is. Az igy előállított ·· ·· w··· ···· ···· • · · · · · · • · ··· · ··· • · · · · ···· ···· ··· · ··♦

DNS-vektort tranziensen MCF-7 sejtekbe juttatva a CAT gén átiródik, a TPA-adagolás pedig hat - hétszeresére növeli a CAT-aktivitást [lásd a 4. példa 4) pontját] . A találmány szerinti eljárás egy jellemző kivitelezési változatában ezt az 5’ irányban elhelyezkedő szabályozó régiót expressziós vektorokban az AR gén vagy más strukturgének transzkripciójának szabályozására használjuk fel. Az AR-CAT kiméra DNS-molekulák segítségével az AR expresszióját szabályozó faktorok is vizsgálhatók, amint azt a 9a.) pontban, leírjuk.

2/2) Az amfiregulin kódoló DNS-szakaszát tartalmazó expressziós DNS-vektorok előállítása

Annak érdekében, hogy az AR-t biológiailag aktiv, érett alakban fejeztethessük ki, olyan expreszsziós DNS-vektor - DNS-befogadó gazdasejt rendszert kell választanunk, amely nemcsak a gén erőteljes transzkripcióját és transzlációját, hanem a géntermék megfelelő utólagos módosítását is biztosítja. Ez különösen fontos akkor, ha az expressziós DNS-vektor az amfiregulin prekurzor teljes kódoló szakaszát hordozza, minthogy az érett amfiregulin sejtszintü utóérési folyamatok eredményeként keletkezik a prekurzorból. Az emlős DNS-befogadó gazdasejtekben például az amfiregulin utóérése megfelelő, sőt; az amfiregulin a sejten • · ·· · ···· ···· · ·· ·· · · , · ··· · ··· • · · · · ···· ···· ··· · ···

- 22 kívüli térbe szekretálódik.

Az érett amfiregulin két eltérő alakja valószínűleg egy közös, 252 aminosavból álló prekurzor molekula középső részeként szintébizálódik, és a két érett variáns e prekurzorból alternáló proteolitikus utóérés során szabadul fel. Az amfiregulin glikozilált fehérje, hordozhat továbbá szulfátéit tirozin-csoportokat is: ez is aláhúzza a végtermék szempontjából kívánatos poszt-transzlációs módosítások elvégzésére alkalmas expressziós rendszer kiválasztásának fontosságát.

Az e területen járatos szakemberek számos DNS-befogadó gazdasejt - expressziós DNS vektor rendszert (vagyis az AR kódoló szakasz egy alkalmas DNS-befogadó gazdasejtben való replikációját, transzkripcióját és transzlációját biztosító DNS-szekvenciákat hordozó DNS-vektorokat) alkalmazhatnak egyaránt eredményesen. Ezek közé tartoznak, bár nem kizárólagos jelleggel a vírus expressziós vektor/emlős DNS-befogadó gazdasejt rendszerek (például a oitomegalo vírus, a vakcinia vírus, az adenovirus és a hasonlók); a rovar-virus expressziós vektor/rovarsejt rendszerek (például a baculovirus); vagy éppen a nem-virus eredetű, hanem emlős sejtek genomiális DNS-éből származó, promoteít hordozó expressziós rendszerek (például az egér metallotiotiin promoter).

·· ·· ···· ···· • · · · · · • · · · · · • · · · ···· · · ·· ··· · • · ·

E DNS-vektorok expressziós szabályozó elemei erősségükben és spécititásukban egyaránt különbözőek. A felhasznált DNS-befogacLó gazdasejt/DNS-vektor rendszertől függően a számos megfelelő transzkripciós és transzlációs szabályozó DNS-szakasz bármelyike alkalmazható. Ha például emlőssejt-rendszerekben klónozunk, akkor emlős sejtek genomjából elkülönített promotereket (például az egér metallotionin promoterét) vagy a felhasznált sejtekben szaporodni képes vírusokból elkülönített promotereket (például a vakcinia virus 7.5K promoterét, vagy a Moloney rágcsáló-szarkóma virus hosszú terminális ismétlődő DNS-szakaszait) alkalmazhatjuk. Rekombináns DNS-technikával vagy szintetikus eljárásokkal előállított promoterekkel is biztosíthatjuk a beépített DNS-szakaszok transzkripcióját.

Specifikus kezdőpont-jelző DNS-szakaszok is szükségesek a beépített fehérjekódoló DNS-szakaszok megfelelő mértékű transzlációjához. E kezdőpont-jelző szakaszok az ATG iniciációs kodonból és az ezzel szomszédos szekvenciákból állnak. Ha a teljes AR gént, annak saját iniciációs kodonjával, és azzal szomszédos szekvenciáival együtt építjük be egy megfelelő expreszsziós vektorba, további transzlációs szabályozó jelzőszakaszokra nincs szükség. Ha azonban csak a kódoló DNS-szakasz egy részét építjük be a vektorba, akkor idegen eredetű transzlációs szabályozó szakaszokról is gondoskodnunk kell, ideértve az ATG inieiációs kodont is . A kezdőpont-jelző kodonnak mindezeken felül az AR kódoló szakaszával azonos leolvasási fázisba kell esnie ahhoz, hogy a teljes inszert transzlációját biztosítsa. A fenti, idegen eredetű transzlációs szabályozó szakaszok és az inieiációs kodon egyaránt származhatnak a legkülönfélébb természetes forrásokból, de előállíthatok szintetikusan is. Az expresszió hatékonysága transzkripciós attenuátor szakaszok, átírást fokozó DNS-szakaszok és számos más, szabályozó DNS-szakasz beépítésével is fokozható.

Bármely korábban leirt, DNS-fragmensek DNS-vektorba való építésére szolgáló eljárás alkalmas az AR gént és a megfelelő transzkripciós-transzlációs szabályozó DNS-szakaszokat hordozó expressziós vektorok előállítására. Ilyen eljárások például az in vitro rekombináns DNS-technikák, a szintetikus eljárások és az in vivő rekombináció (genetikai rekombináció).

Ha például az adenovirust használjuk expressziós vektorként, akkor az amfiregulint kódoló DNS-szakaszt egy adenovirus transzkripciós és transzlációs szabályozó szakasz-együtteshez, például a késői promoterhez és a három részből álló szekréciós szabályozó szakaszhoz ligálhatjuk. Ezt kiméra-gént • · ···· «

···· ···· ··· • ···· • · • · · építjük be azután az adenovírus-genomba in vitro vagy in vivő rekombinációval. A virusgenom nem létfontosságú szakaszába (például az El vagy az E3 szakaszba) történő inszerció életképes, és a fertőzött sejtekben AR-t expresszáló, rekombináns vírust eredményez. Hasonló módon a vakcinia vírus 7.5K promoterét is felhasználhatjuk.

Az AR expressziójára alkalmasak az előzőek mellett a rovarsejt expressziós rendszerek is. Az egyik ilyen expressziós rendszerben az Autographa californica sejtmag-polihedrózis vírust (AcNPV) használják idegen gének expressziós vektoraként. A vírus Spodoptera frugiperda sejtekben tenyészthető. Az AR kódoló szakaszt a vírus nem létfontosságú szakaszaiba (például a polihedrin génbe), egy AcNPV promoter (például a polihedrin promoter) mögé klónozzuk. Az AR kódoló szakasz sikeres beépítése a polihedrin gén inaktiváoiójához és be nem pakolt rekombináns vírusok (vagyis a polihedrin gén által kódolt fehérje-természetű köpenyréteget nélkülöző vírus) létrejöttéhez vezet. Ezekkel a rekombináns vírusokkal fertőzzük meg azután a Spodoptera frugiperda sejteket, aholis a beépített gén expresszálódik. Számos sejtvonalban tesznek lehetővé igen hatékony expressziót az amfotróp pakoló sejtvonalakban előállított retrovirus-vektorok. Ezzel az eljárással elérhető • · ·· ···· ···· ··· • · · · • ··· · ··· • · · «····« · ···

- 26 a beépített f ehérj ekéddé DNS-szakasz sejttípustól függő utóérése, szabályozása vagy működése.

Választhatunk továbbá a beépített DNS-szakasz expresszióját a kívánt, jellegzetes módon befolyásoló, illetve a génterméket igy módosító vagy utóérlelő DNS-befogadó sejtvonalat is. Bizonyos promoterek esetében az expresszió néhány indukáló hatású vegyület jelenlétében (például a metallotionein promotemél cink- és kadmium-ionok jelenlétében) fokozódik. így tehát a rekombináns AR expressziója szabályozható. Ez igen fontos abban az esetben, ha a klónozott idegen eredetű gén fehérjeterméke letális a DNS-befogadó gazdasejtre. A fehérjetermék módosítása (például glikozilálása), valamint utóérése (például hasítása), továbbá igen fontos a fehérje aktivitása szempontjából. A különféle DNS-befogadó gazdasejtek jellemző, specifikus poszt-transzlációs fehérjemódositó és utóérési rendszerekkel rendelkeznek. Megfelelő sejtvonalak illetve expressziós rendszerek kiválasztásával biztosítható az expresszált idegen eredetű fehérje pontos módosítása·és utóérése.

A találmány szerinti eljárás kivitelezése során felhasználható expressziós DNS-vektorok közé tartoznak - bár nem kizárólagos jelleggel - a következők:

• · • · · ···· pSV2Neo plazmid:

A pSV2Neo plazmidot Southem és munkatársai írják le közleményükben [J. Mól. Applied Genetics, 1, 327 - 341. (1982)].

pSV2dhfr plazmid:

A pSV2dh.fr plazmid [Subramani és munkatársai, Mól. Cell Bioi., 1, 854 - 864. (1981)] az SV4O promoter szabályozása alatt álló egér dihidrofolát-reduktáz (dhfr) gént hordozza.

pH3M plazmid:

A pH3M plazmid [Aruffo és munkatársai, Proc. Natl. Acad. Sói., USA, 84, 3365 - 3369 (1987)] az AD169 emberi citomegalovirus (CMV) azonnali-korai átírást fokozó DNS-szakaszából, valamint az ehhez kapcsolt HÍV hosszú végállásu, ismétlődő DNS-szakasznak (LTR) a -67-estől a +80-as számú nukleotidig terjedő szakaszából felépülő kiméra-promotért hordoz. Az LTR-t követő polilinker szakaszban, 5’-3’ irányban a következő hasitóhelyek találhatók: Hindin, Xbal, Xhol, BstXI, Xhol, PstI és Xbal. A polilinkertől az átírás irányában a pSV2 eredetű kis t antigén hasítási és poliadenilációs szakasza, valamint az SV4O replikációs kezdőpontja helyezkedik el. Ez utóbbi lehetővé teszi a plazmid sejtenkénti példányszámának megsokszorozását ·· ·« ··«· ···♦ • · · · · ·

V · · · · · • · · · *··« ·«·· ··· · az SV40 nagy T antigénjét tartalmazó sejtekben, igy például a COS és a WOP sejtekben is. Egy szupresszor-tRNS gén biztosítja a plazmid fennmaradását a pVX alapú gazdasejt-vektor-rendszerekben, továbbá a P3 plazmidot hordozó baktériumsejtekben; igy az MC1O61/P3 sejtekben is.

PH3M/b0ncM plazmid:

A PH3M/b0ncM plazmidot Najma Malik, az Oncogen munkatársa állította elő. Ez a plazmid a majom TGF-β génje 5’ irányban elhelyezkedő, át nem íródó szakaszát és szekréciós peptid szakaszának kódoló DNS-szekvenciáját, valamint ehhez kapcsoltan az onkosztatin M kódoló DNS-szakaszát hordozó a pH3M plazmid HindlII/XhoI hasitóhelyeire klónozva. A TGF-B szekvencia első részét a pSPő5 polilinkerből származó Hindin hellyel, és a rögtön emellett található, a TGF-β cDNS-éből származó PstI hellyel kezdődő, az 5’ irányban elhelyezkedő át nem íródó DNS-szakasz első 85 bázispárja alkotja, a fennmaradó szakasz pedig a 29 aminosav hosszúságú szignálpeptidet kódoló 87 bázispárból áll: a szignálpeptid hasítása rendesen egy glicin-leucin dipeptidnél, a glicin után történik.

pH3ARP plazmidi

A pH3ARP plazmid az AR prekurzor COS sejtekben történő tranziens kifejezésére szolgáló pH3M-származék. Ez a vektor az AR 5’ irányban elhelyezkedő, át nem Íródó szakaszának bázispárját, a teljes kódoló szakaszt és a 3’ irányban elhelyezkedő át nem íródó szekvenciákat hordozza. A plazmidot a Hindin és Xbal enzimekkel emésztett pH3M vektor 4 kb méretű fragmenséből, az EVSAL3 és az EVSAL4 oligonukleotidokból, valamint a pARl plazmidból származó 1,1 kb méretű Hgal/Xbal cDNS fragmensből, ligálással állítjuk elő. A komplementer EVSAL3 és EVSAL4 oligonukleotidok 5’-3’ irányban HindlII, EcoRV, Sáli és Hgal felismerőhelyeket kódolnak. A plazmidokban változatlanul megtalálható a pEMBLl8-ból származó polilinker EcoRI é.s Xbal helyek közé eső szakasza a 3’ irányban elhelyezkedő át nem íródó rész közvetlen folytatásaként.

EcoRV Hgal

HindlII Sáli

EVSAL3 5’ AGCTTGATATCGTCGA EVSAL4 3’ ACTATAGCAGCTGACGC.

pSVDR/bOM plazmid:

A pSVDR/bOM plazmidot Jeff Kallestad, az

Oncogen munkatársa állította elő a pSV2dh.fr és a pH3M/b0M plazmidok fúziójával. Az ebben a vektorban található cDNS átirását a pH3M vektorból származó CMV/HIV promoter, az ehhez kapcsolt TGE-B szignálszakasz és az SV40 poliadenilációs jelzőszakasza biztosítja. A vektor hordozza továbbá az SV40 korai promoterének szabályozása alatt álló egér dhfr gént is. A plazmidot a pH3M/bOM BamHI-feltöltött Nrul fragmense, és a BamHI enzimmel emésztett pSV2 dhfr plazmid ligálásával állíthatjuk elő.

pHras plazmid:

A pHras emlős expressziós DNS-vektort Stan McKnight, a Washington Egyetem Farmakológiai Osztályának munkatársa fejlesztette ki. Ez a pML-származék DNS-vektor a Harvey Ras hosszú végállásu ismétlődő DNS-szakaszának (LTR) 754 bázispár méretű EcoRI-TthlllI fragmenséből, egy Smal, BamHI, Sáli, PstI, Hindin és Clal hasitóhelyeket tartalmazó polilinkerből, az ezt követő egér dhfr cDNS-ből, valamint a hepatitisz-B vírus 3’ irányban elhelyezkedő át nem Íródó szakaszából és poliadenilációs jelzőszakaszából épül fel. A polilinker BamHI • · ·· ···· ···· ···· • · · · · · · • · · · · · ··· • · · · · ········ ··· · ··· hasitóhelye és a dhfr ATG kodonja közötti távolság 54 bázispár.

pHLARGE plazmid:

A pHLARGE emlős expressziós DNS-vektor a Harvey Ras LTR szabályozása alatt álló, 10 kb méretű genomiális amfiregulin szakaszt, majd ezt követően egy nem működő, promoter nélküli dhfr gént hordoz. Ezt a plazmidot a pHras 4,6 kb méretű Smal/HindlII fragmense, a pARH12 plazmidból származó, 6,0 kb méretű Smal/HindlII amfiregulin genomiális DNS-fragmens, valamint a pARH6 plazmidból származó 6,4 kb méretű, Hindin-végű AR genomiális fragmens ligálásával állítjuk elő.

pHLARGlpoD plazmid:

A pHLARGlpoD egy policisztronos expressziós DNS-vektor. Ebben a plazmidban az AR prekurzor cDNS-szakasza és az ezt követő egér dhfr gén egyetlen Harvey Ras LTR promoter szabályozása alatt áll. Az igy keletkező elsődleges RNS-átirat policisztronos: az AR stop kodonja és a dhfr start kodonja között található 74 bázispár lehetővé teszi a riboszómák újbóli megkötődését és a transzláció folytatódását. A plazmid előállításakor a pH3ARP plazmidot EcoRV enzimmel emésztjük, és a 700 bázispár méretű fragmenst

elkülönítjük. Ez a fragmens az AR 5* irányban elhelyezkedő át nem Íródó szakaszának 13 bázispárját, a teljes amfiregulin prekurzor kódoló szakaszát és az 5’ irányban elhelyezkedő át nem íródó szakasza 21 bázispárját tartalmazza. Ezt a fragmenst a BamHI enzimmel emésztett, feltöltött, majd foszfátázzál kezelt pHras vektorral ligáljuk.

pLOSNL plazmid:

A pLOSNL plazmidot Dusty Miller, a Ered

Hutchison Cancer Research Center, Seattle, V/A. munkatársa állította elő. Ezt a retrovirus expressziós DNS-vektort nagy koncentrációjú, amfotróp, segítő vírustól mentes, igen sokféle DNS-befogadó gazdasejt fertőzésére alkalmas, ám az azokban való replikádéra nem képes virusszuszpenziók előállítása céljából hozták létre. A vektor a következő DNS-szakaszokból épül fel: a Moloney kisrágcsáló leukémia vírus mutáns LTR szakasza, melyből a pakoláshoz szükséges szignálszakaszokat kiejtették; psi+ DNS-szakaszok; két Xhol restrikciós hasitóhelyet tartalmazó ornitin-transzkarbamiláz (OTC) gén (az Xhol helyekre beépíthető cDNS egyben inaktiválja az OTC gént); szelekciós markerként az SV2Neo; a 3’ irányban elhelyezkedő LTR; továbbá a vektor alapjául szolgáló pBR322 plazmid ampicillin rezisztenciát biztositó szakasza.

pLARSNL plazmid:

A pLARSNL amfotróp retrovirus expressziós plazmid. vektor az amfiregulin prekurzor cDNS-ének a poli-A farok nélküli kódoló szakaszát hordozza, a vírus LTR szakaszának szabályozása alatt. Az SV2Neo lehetővé teszi az expresszáló transzfektánsok kiválasztását. A pLARSNL plazmiclot a pHLARGlpcD plazmid 800 bázispár méretű Sáli fragmensének és a pLOSNL vektor 7,7 kb méretű, Xhol enzimmel emésztett és foszfátázzál kezelt fragmensének ligálásával nyerjük.

• · · ·· ···· ···· ♦··· • · · · · · • ··* « ··· • · · · ········ · ·· ·

- 34 2/3) Az amfiregulin génterméket kifejező transzfektánsok, illetve transzformánsok azonosítása

A rekombináns amfiregulin kódoló szakaszokat hordozó, és az érett, biológiailag aktív terméket kifejező DNS-befogadó gazdasejteket legalább négy, általános jellegű megközelítést alkalmazva azonosíthatjuk:

a/ DNS-DNS, DNS-RNS vagy RNS-komplementer RNS hibridizációval;

b/ markergének termékeinek jelenléte, vagy hiánya alapján;

c/ az amfiregulin mRNS-átirat gazdasejtben való kifejeződése alapján becsülve a transzkripció mértékét; valamint d/ az éretlent érmékét immunológiai módszerekkel, illetve végül biológiai aktivitása alapján kimutatva.

Az első megközelítést alkalmazva, az expreszsziós DNS-vektorba épített emberi AR kódoló szakasz jelenlétét DNS-DNS hibridizációval, az emberi AR kódoló szakaszával homológ nukleotid sorrendű próbákat használva mutatjuk ki.

• ·· ·

A második megközelítés során a rekombináns expressziós DNS-vektor - DNS-befogadó gazdasejtrendszert bizonyos marker gének géntermékeinek hatása, vagy ennek hiánya (például timidin-kináz aktivitás, antibiotikum-rezisztencia, metotrexát-rezisztencia, transzformációs fenotipus, zárványtest-képződés a baculovirusoknál, és igy tovább) alapján azonosítjuk, illetve választjuk ki. Például, ha az amfiregulint kódoló szakaszt a vektor egy marker génszakaszába építjük be, akkor az amfiregulint kódoló szakaszt hordozó rekombinánsokát a marker gén által kódolt tulajdonság hiánya alapján azonosítjuk. Lehetőség van arra is, hogy a marker gént az AR szekvencia szomszédságába, azzal azonos átírási irányban építsük be, az amfiregulint kódoló szakasz expresszióját is szabályozó, vagy egy attól különböző promoter szabályozását terjesztve ki rá. A marker indukció vagy szelekció hatására bekövetkező kifejeződése jelzi az AR kódoló szakasz kifejeződését.

A harmadik megközelítés során az AR kódoló szakasz transzkripciós aktivitását hibridizációval vizsgáljuk. így például az AR kódoló szakaszával, vagy annak adott részeivel homológ próbával úgynevezett Northern hibridizációt végezve vizsgáljuk a megelőzőleg elkülönített poliadenilált RNS-t. Lehetséges továbbá az is, hogy a DNS-befogadó gazdasejt teljes ·· ·· ···· ···· ···· • · · · · · · • · · ♦ · · · ·· • · · · ♦ ···· ···· ··· · ··· nukleinsav-tartalmát kivonjuk, és ezt vizsgáljuk a fenti próbákkal hibridizálva.

A negyedik megközelítést alkalmazva, az érett fehérjetermék kifejeződését immunológiai módszerekkel, például az elektroforetizált, majd szűrőpapírhoz kötött fehérjék ellenanyaggal történő vizsgálatával (Western biot”), radio-immunprecipitáoióval, kapcsolt enzimes immunvizsgálattal és más, hasonló módszerekkel mérhetjük. Az expressziós rendszer eredményességének végső próbája azonban a biológiailag aktív amfiregulin géntermék kimutatása. Ha a DNS-befogadó gazdasejt kiválasztja a génterméket, akkor a transzfektáns gazdasejt-tenyészet sejtmentesitett táptalajában mérjük az AR aktivitást. Ha a géntennék nem szekretálódik, a sejtlizátumokban mérjük a fenti aktivitást. Mindkét esetben az itt leirt, vagy az ezekhez hasonló, növekedés-gátláson vagy növekedés-serkentésen alapuló biológiai vizsgálatokat alkalmazunk.

··· ···· • · ·· ·· ···· · • · · · · • · ··· · ··· • · · « · ···· ···· ··· · ···

- 37 3) · AZ AMFIREGULIN SZERKEZETE

A tisztított amfiregulin aminosav-sorrendjének meghatározása alapján a készítmény az amfiregulin két, közelítőleg azonos változatának nem egyenlő arányú keverékéből áll (lásd a 12. ábrát). A nagyobbik változat a preparátum körülbelül 16 $-át alkotja. A másik forma, a rövidebb AR a preparátum fennmaradó részét, azaz többségét adja: ez a változat a hosszabb variánstól mindössze abban különbözik, hogy amino-terminális végéről hiányzik egy SVRVEQ aminosav-sorrendü hexapeptid. A két forma ettől eltekintve teljesen azonos aminosav-sorrendü.

Az amfiregulin rendkívül hidrofil, közepes (22.500 dalton) relatív molekulátömegü glikoprotein. Az N-hez kötött szénhidrátokat eltávolító N-glükanáz kezelés eredményeként az amfiregulin elektroforezise során egyetlen, 14.000-es relatív molekulatömegü ősik jelenik meg; ez jó egyezésben van az amfiregulin gélszürési kromatográfiás adatokból számított molekulatömegével. Nem redukáló körülmények között az amfiregulin hasonlóan vándorol. Az amfiregulin mindezek alapján egyláncu glikoprotein.

Az amfiregulin elsődleges szerkezetét számos más fehérje aminosav-sorrendjével hasonlítjuk össze.

·· ·· ···· ··>·· ···· • · · · · · · • · ··· · ··· • · · · · ···· ·♦·· ··· · ···

Az összevetések tanulsága szerint az amfiregulin nem mutat szignifikáns szerkezeti homológiát egyetlen, az összehasonlításba vont fehérjével sem. Az amfiregulin elsődleges szerkezete azonban hasonlít néhány más, leginkább a tágan vett EGF-családba tartozó növekedési faktor elsődleges szerkezetére. Indokolt tehát az amfiregulint e fehérje-család tagjai közé sorolni, hiszen néhány szerkezeti jellemzője szoros hasonlóságot mutat az EGF-családba tartozó fehérjék erősen konzervatív szerkezetű szakaszaival. így például az amfiregulin N-terminális szakasza, akárcsak a TGF-a, a VGF és az MGF N-terminális vég felöli szakasza, számos prolint, szerint és treonint tartalmaz.

Az amfiregulin, hasonlóan a TGF-ok és a VGF N-terminális prekurzor szakaszaihoz, N-glikozilációs helyeket is hordoz. Az amfiregulin és más EGF-szerü proteinek szekvenciája továbbá homológ abban is, hogy mindegyikükben megtalálható az ezen növekedési faktorok érett formáinak másodlagos szerkezetét meghatározó, 3-diszulfid-hidat alkotó 6-cisztein is. A homológ AR és EGF szekvenciák hidropátiás analízise azonban lényeges eltéréseket mutat.

Az amfiregulin és a tágan vett EGF fehérje-család más tagjainak további összehasonlításait az I. táblázatban és a 13. ábrán mutatjuk be, illetve • · · · * · · ·· ·· ·*·· · • · · · · · · • · ··· · ··« • · · · · ··«· ···· ··· ♦ ···

- 39 a 4. példa 7) és 8) pontjában részletezzük.

I. TÁBLA-ZAT

FEHÉRJE FAJ ELSŐ SZAKASZ MÁSODIK SZAKASZ

EGF	ember	CLHDGVCMYIE	CNCWGYIGERC
TGF-a	ember	CFH-GTCRFLV	CVCHSGYVGARC
VGF	vakciniavirus	CLH-GDCIHAR	CRCSHGYTGIRC
SGF	nyúl fibróma- -virus	CLNNGTCFTIA	CVCRINYEGSRC
IX. faktor	ember	CLNXGSCKDDI	CWCPFGFEGKNC
X. faktor	ember	CQNXGKCKDGL	CTCLEGFEGKNC
XII. faktor	ember	CLHXGRCLEVE	CHCPVGYTGPFG
protein-S	ember	CCGXGTCIDGI	CDCRSGWEGRFC
amfiregulin	ember	CIH-GECKYIE	CKCQQEYFGERC
Összevont	homológia-pontszám az 1. és 2. Font	szakaszra: szám

növekedési faktor fehérj e-család	EGF Véralvadási	AR < 40
> 20	faktorok <20
véralvadási faktorok	< 25	>25	40
amfiregulin alcsalád	< 20	<20	> 40

·· ·· ···· ···· ···· • · · · · · · • · ··· · · · · • · ♦ · · ··«· ···· ··· · ···

- 40 A 12. ábrán bemutatott amfiregulin aminosav-szekvenciák, valamint azok funkcionális megfelelői egyaránt a találmány oltalmi körébe tartoznak. így például az amfiregulin termék hordozhat a működést nem befolyásoló, és igy biológiailag aktív termék keletkezéséhez vezető deléciókat, addiciókat vagy aminosav-cseréket a szekvencián belül. Ilyen aminosav-cseréket az illető aminosavak hasonló polaritása, töltése, oldhatósága, hidrofób-, hidrofil- és/vagy amfipatikus természete alapján hozhatunk létre. Negatív töltésű aminosavak például az aszparaginsav és a glutaminsav; pozitív töltésű aminosavak a lizin és az arginin; hasonló hidrofilicitási értékkel jellemezhető, töltés nélküli poláros végcsoporttal rendelkező aminosavak a leucin, az izoleucin és a valin; a glicin és az alanin; az aszparagin és a glutamin; a szerin és a treonin; és végül a fenilalanin és a tirozin.

·· ·· 99·· *··· 9999 • · · · · · · • « ··· 9 9 99 • · · · · ···· ·««· ··* · ···

4) AZ AMFIREGULIN JELLEMZŐI

A közepes, mintegy 22.500 dalton molekulatömegei, egyláncú glikoprotein, az amfiregulin számos sejttenyészete kettős szerepű növekedésszabályozóként hat. Szerkezetét tekintve az amfiregulin az EGF növekedési faktor-családdal rokonítható, sőt; e fehérje-család más tagjaival közös funkcionális sajátságokkal is rendelkezhet, minthogy az amfiregulin hatékonyan képes az EGF-fel versengeni a receptorhoz való kötődésért.

Az amfiregulin monomer fehérje; biológiai aktivitásához a láncon belüli diszulficL-hidak kialakulása igen, a glikoziláció azonban nem szükséges. Mérsékelten savas, illetve bázikus körülmények között, továbbá 30 percen át, 5ó°C hőmérsékleten végzett hőkezelés mellett is egyaránt stabil. Az amfiregulin teljes mértékben elveszti biológiai aktivitását, ha redukáljuk; 5 percen át 100°C hőmérsékleten hevítjük; tripszinnel, Lys-C-endopeptidázzal, Arg-endopeptidázzal, illetve Glu-endopeptidázzal emésztjük.

A foszfolipáz-D enzimmel végzett, proteolitikus hasítás eredményeként az amfiregulinból egy biológiailag aktiv fragmens vagy fragmensek keletkeznek, mely (vagy melyek) relatív molekulatömege a nátrium-dodecil-szulfát jelenlétében végzett poliakril-amid-gélelektroforezis (SDS-PAGE) tanulsága szerint mintegy ·· ···· ···· ····

9 9 ·· · · • 9 9 9 9 · * ·· • · · (I · ···· ···· ··» · ···

- 42 5600. .Az amfiregulin 'biológiailag aktív fragmensei is a találmány oltalmi körébe tartoznak; részletesebb leírásuk az 5« pont alatt található.

Az amfiregulin erőteljes sejtosztódás-ellenes hatást fejt ki némely epitéliális eredetű emberi rákos sejtvonalra in vitro. Az amfiregulin hatékonyan gátolja például az A431 jelű, vulva epidermális karcinómasejtek, a HTB132 jelű emlő adenokarcinóma-sejtek, a CRL1550 jelű méhnyakból származó epidermisz-szerű karcinómasejtek, a HTB75 jelű, petefészek-szemölcsből származó adenómasejtek, a HTB 1572 jelű, petefészek teratokarcinómase jtek, valamint a HTB26 jelű emlő adenokarcinóma-sejtek DNS-szintézisét. 0,13 nM amfiregulinnal kezelt A431 sejteknél a DNS-szintézis 50 $-os gátlását figyelték meg.

Az NRK-SAő jelű, normál patkányvese-sejtek rendes körülmények között nem képeznek lágyagarban telepeket. A sejtek táptalajához együttesen adagolt, külső eredetű EGE és TGE-B azonban a transzformált fenotipusra jellemző, lehorgonyzástól független növekedést vált ki. Külső eredeti! amfiregulin és TGF-B együttes alkalmazása, habár kisebb mértékben, de szintén kiváltja az NRK-SAó sejtek lehorganyzástól független növekedését (lásd az V. táblázatot), közvetlen

- 43 bizonyítékát nyújtva ezzel az amfiregulin és az EGF ' funkcionális hasonlóságának.

Az amfiregulin és a TGF-β szinergisztikus hatása erőteljesen alátámasztja, hogy az amfiregulin fontos szerepet játszik a sejtosztódás szabályozásában. így a találmány korábban hozzáférhetetlen kísérleti lehetőségeket nyit meg a normál sejtosztódás összetett, és egyre teljesebben ismertté váló folyamatának, továbbá a neoplasztikus sejtek jellegzetesen sérült növekedésszabályozásának vizsgálatára.

Az amfiregulin serkenti az emberi előbőr fibroblasztok osztódását (IV. táblázat). Mintegy 50 pmólos amfiregulin koncentráció mellett ezen sejtek DNS-szintézise kétszeresére növekszik. A mintegy hatszoros maximális serkentés 5 nM koncentrációnál jelentkezik.

Az amfiregulin sejtosztódás-serkentésben vagy növekedés-gátlásban jelentkező hatásának mechanizmusa ismeretlen. Az amfiregulin-receptor kötődés jellemzését célul kitűző előkisérletek azonban arra utalnak, hogy az amfiregulin specifikus.receptorral rendelkezik. Az amfiregulin verseng az EGF-ral az EGF-receptorhoz, és valószínűleg más, közös receptorokhoz; igy talán magához az AR-specifikus receptorhoz való kötődésért is, Ismert, hogy ligandum kötődése ·· ·· ···· ···· ···* • · · · · · · • · ··· · ··· • · · · · ···· ···· ··· · ··· az EGF-receptorhoz növekedést serkentő jelzést vált ki, részben a tirozin-kináz aktivitás serkentése révén. Az amfiregulin kötődése az EGF-receptorhoz hasonló módon proliferativ választ válthat ki, vagy éppen ellenkezőleg; megakadályozhatja a proliferativ jelzés keletkezését, csökkentve az EGE vagy a más osztódási jelzést létrehozó ligandumok számára hozzáférhető EGF-receptorok számát. Az amfiregulin sejtnövekedés-gátlásának azonban egy másik mechanizmusa is lehetséges: ezt támasztják alá az I. táblázatban ismertetett adatok.

Az A431 jelű sejtvonal négy, eltérő sejtenként! EGE kötőhely-számmal jellemezhető kiónját az amfiregulin gátló hatására való érzékenységük szempontjából vizsgáljuk. Az amfiregulin-szenzitivitás és a sejtenként! EGE-kötőhelyek száma közti összefüggés hiánya sírra enged következtetni, hogy az amfiregulin által kiváltott növekedésgátló jelzés létrehozásában egy, az EGF-receptőrtól független receptorhoz való kötődés játszik szerepet. Egy ilyen kötődés antagonista módon hathat más növekedési faktorok, igy például a TGF-α által kiváltott növekedésserkentési jelzésekkel szemben. így az amfiregulin úgy is kifejtheti anti-proliferativ hatását, hogy specifikusan gátolja a sejtek TGF-α-ra, vagy más, autokrin növekedési faktorra adott mitogén válaszát.

·· ·· ···· ···· ···· • · · · · · · • · ··· · ··· • · · · · ···· ···· ··· · ···

Az amfiregulin rendki vili hidrofil fehérje: aminosav-sorrendjéből olyan jellegzetes hidropátiás görbe vezethető le, amely kevés hasonlóságot mutat az EGF-f ehérje-családba tartozó más proteinek görbéivel (11. ábra). Az amfiregulin bázikus protein, izoelektromos pontja 7,6 - 8,0.

4/1) Az amfiregulin TPA-val történő indukciójának jellemzése

A TPA szerteágazó válaszreakciókat vált ki a sejtekből, ideértve a sejtmorfológia, a sejtosztódás és -differentáoió, a membrántranszport, a receptor-ligandum kölcsönhatások, a fehérjék foszforilálása és a foszfolipid-metabolizmus megváltozását. A protein-kináz-C (PKC) a TPA receptorául szolgáló, kalciumionés foszfolipid-függő protein-kináz. A TPA PKC-hoz való kötődése számos szubsztrát, igy növekedési faktor-receptorok, citoszkeletális fehérjék és transz-aktiváló szabályozó fehérjék foszforilálását eredményezi.

Egy másik szabályozó molekula, a cAMP, elsődlegesen a cAMP-függő protein-kináz-A közvetítésével fejt ki igen különféle hatásokat a sejtekre. A cAMP sejten belüli koncentrációját a receptorközvetitéssel ·· ·· ···· ···· *··· • · · · · · · • · ··· · *·· • · · · · ···· ···· ··· · ···

- 46 létrejövő aktiválás és az adenilát-cikláz gátlása együttesen szabályozza. Néhány vizsgálat arra utal, hogy a TPA, illetve a cAMP indukálta génexpresszió közös reakcióutak beindulását eredményezheti. Az amfiregulin gén kifejeződése szabályozásának vizsgálata érdekében tanulmányozzuk a fenti két szabályozó reakcióutban szerepet játszó különféle aktivátorok és inhibitorok hatását az amfiregulin-specifikus RNS-ek MCF-7 sejtekben való keletkezésére.

Egy, az adenilát-cikláz enzimet aktiváló gyógyszer, a Forskolin nagyobb sejten belüli cAMP koncentrációt eredményez. MCF-7 sejtekhez 25 /umól koncentrációban, 4 órán át adagolva az amfiregulin mRNS koncentrációja jelentősen emelkedik: ez arra utal, hogy a cAMP-reakcióutak az amfiregulin kifejeződésének szabályozásában is szerepet játszanak.

·· ·· ···· ···· ···· • · · · · · · • · ··· · ··· • · · · · ···· ···· ··· · ···

5) AZ AMFIREGULIN SZÁRMAZÉKAI, ANALÓGJAI ÉS AZ

AMFIREGULIN-PEPTIDEK

Felmértük az amfiregulin származékainak, analógjainak, illetve az amfiregulin-peptideknek az előállítását és felhasználását is: ezek az eljárások szintén a találmány oltalmi körébe tartoznak. A növekedésszabályozó hatást kifejtő fenti származékok, analógok és peptidek igen sokféle neoplázia diagnózisában, kórjóslatában, illetve kezelésében használhatók fel. A fenti származékok, analógok és peptidek a természetes amfiregulinhoz képest megnövekedett, vagy éppen csökkent biológiai aktivitással rendelkezhetnek, és/vagy kiterjeszthetik, esetleg éppen szűkíthetik az amfiregulin növekedésgátlására érzékeny sejttípusok körét. Ezek az eljárások is a találmány oltalmi körébe tartoznak. A megnövekedett vagy csökkent növekedésserkentő aktivitással rendelkező és/vagy az amfiregulin növekedésserkentő hatására érzékeny sejttípusok körét bővitő, vagy éppen szűkítő amfiregulin-származékok, analógok és peptidek számos területen használhatók fel eredményesen, ideértve, bár nem kizárólagosan a sérülések és az égési sebek kezelését.

A találmány szerinti amfiregulin-származékokat, analógokat és amfiregulin-peptideket számos, a szakirodalomból ismert eljárással állíthatjuk elő.

- 48 A talá-lmány oltalmi körébe a genetikai illetve a protein-kémiai eljárások és módszerek tartoznak.

A protein-kémiai eljárások közül számos, kémiai módosításon alapuló eljárást alkalmazva állíthatunk elő amfiregulin-származékokat, analógokat vagy peptideket a szakirodalomból ismert módszereket követve, ideértve, bár nem kizárólagosan az endopeptidázokkal (igy például a cianogén bromidokkal, a tripszinnel, a kimotripszinnel, a V8-proteázzal és a más, hasonló endopeptidázokkal), vagy az exopeptidázokkal végzett specifikus kémiai hasítást, az acetilációt, a formilációt, az oxidációt és igy tovább.

6) _ ANTI-AMFIREGULIN ANTITEST ELŐÁLLÍTÁSA

A találmány oltalmi körébe tartozik az amfiregulint vagy amfiregulinnal rokon proteineket felismerő poliklonális és monoklonális antitestek előállítására szolgáló eljárás is.

Számos, a szakirodalomból ismert módszer szerint eljárva állíthatunk elő az amfiregulin epitopjai ellen poliklonális antitesteket. Az antitestek előállítása céljából igen sokféle kísérleti állatot immunizálhatunk az amfiregulin fehérje, vagy egy szintetikus amfiregulin-peptid injektálásával: ilyen kísérleti állatok például - bár nem kizárólagosan - a nyulak, az egerek, a patkányok és igy tovább. Az immunizálandó állat fajától függően különféle adjuvánsokat használva serkenthetjük az immunválaszt: ilyen adjuvánsok például - bár nem kizárólagosan - a Freund-féle (komplett vagy nem komplett) adjuváns; a szervetlen gélek, mint például az aluminium-hidroxid; a felületaktív anyagok, mint például a lizolecitin, a pluronikus polialkoholok, a polianionok, a peotidok, az olajos emulziók, a csigák testnedvéből elkülönített hemocianin, a dinitro-fenol, valamint a potenciálisan hatékony emberi adjuvánsok, igy a BCG (Calmette-Guerin bacillus), és a Corynebacterium parvum.

·· ·· ···· ···· ···· • · · · · · · • · ··« · · ·· • · · · · ···· ···· ··· · ···

- 50 Monoklonális antitestet az amfiregulin egy epitopja ellen bármely, az antitest folyamatos sejttenyészetben való termelését biztositó eljárással előállíthatunk. Ilyen eljárás, bár nem kizárólagos jelleggel, az eredetileg Kohler és Milstein által közölt [Natúré, 256, 495 - 497· (1975)1 hibridóma-technika, illetve az újabb eljárások közül az emberi B-sejt hibridóma-technika [Kosbor és munkatársai, Immunology Today, 4, 72. (1983 U, valamint az EBV-hibridóma-technika [Colé és munkatársai, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alán R. Liss, Inc., pp. 77 - 96.

(1985)].

A molekula idiotipus-részét tartalmazó antitest -fragmenseket is előállíthatunk az ismert módszerek szerint eljárva. Ilyen fragmensek például, bár nem kizárólagosan, az antitest-molekula pepszines emésztésével előállítható ^(ab’jg fragmens; az F(ab’)₂ diszulfid-hid-kötéseinek redukálásával előállítható Fab’ fragmensek; valamint az antitest-molekula papainnal és redukálószerrel végzett kezelésével előállítható két Fab vagy Fab fragmens.

Az amfiregulin elleni antitesteket az érett amfiregulin, az amfiregulin prekurzor és az amfiregulin szubkomponens alakjainak kvalitatív illetve kvantitatív kimutatására, az amfiregulin fehérjék affinitás-kromatográfiás tisztítására, továbbá az amfiregulin bioszintézisének, metabolizmusának és működési mechanizmusának felderítésére használhatjuk. Az amfiregulin elleni antitestek diagnosztikumként és terápiás szerként is hasznosak lehetnek.

7) AZ AMFIREGULIN FELHASZNÁLÁSA

Az amfiregulin kettős biológiai funkciója számos in vitro és in vivő felhasználást tesz lehetővé. Az amfiregulint, annak fragmenseit illetve származékait tartalmazó, növekedésgátló és/vagy növekedésserkentő hatást kifejtő bármely vegyűlet, akár önállóan, akár más, biológiailag aktív növekedési faktorral, inhibitorral vagy, immunválaszt befolyásoló szerrel együtt alkalmazva felhasználható a találmány szerinti eljárás kivitelezése során.

Az a tény, hogy az amfiregulin gén a limfociták differenciálódásában szerepet játszó régióban helyezkedik el, arra enged következtetni, hogy az amfiregulin a hematopoetikus sejtek fejlődésében, aktiválásában vagy immunszuppressziójában vesz részt. Az AR3-nem transzlálódó szakasz és más citokinek homológ szakaszainak hasonlósága is alátámasztja ezt a szerepet.

• · ··· · · ·· • · · · · ···« ···· ··· · ·♦·

- 52 A találmány szerinti vegyületeket felhasználhatjuk az angiogenezis, a csontfelszivódás, az immunválasz, valamint a szinaptikus és neuronális efíektor működések befolyásolására. Az amfiregulin felhasználható az arachidonsav-kaszkád befolyásolására is. Az arachidonsav enzimatikus oxidációja számos fontos terméket eredményez, igy a prosztaglandinokat, a tromboxánokat, a prosztaciklineket és a leukotriéneket. Ezek a termékek rendkívül hatékony, mindenütt megtalálható, számos fiziológiai hatással rendelkező hatóanyagok: hatókörük kiterjed az izomösszehuzódásra, a vérlemezkék aggregéciójára, a leukociták vándorlására, valamint a gyomor kiválasztó működésére. Az amfiregulin, az amfiregulinhoz hasonló molekulák és az ezeket tartalmazó készítmények különösen a sebek kezelésére, valamint a rák diagnózisára és kezelésére használhatók.

·· ·· ···· ···· ···· • · « · · · « • · «·« · «·· • · · · · ··*· ···· ··· · ···

- 53 7/1) Az amfiregulin felhasználása sebek kezelésére

Az amfiregulin felhasználható sebek, igy bőrsérülések, szaruhártya-sérülések, valamint számos más, epitéliális és a kötőszöveti alapvázt érintő sebek, igy a krónikus fekélyek, égések, műtéti metszések, traumás sebek; továbbá a testüregi, epitéliás eredetű szervek, igy a nyelőcső, a gyomor, a vastag- és vékonybelek, a szájüreg, a genitális és a kiválasztó szervek sérüléseinek kezelésére. A kezelés az amfiregulint, valamint egy élettanilag megfelelő hordozóanyagot tartalmazó gyógyszerkészítmény helyi alkalmazásán alapul.

A találmány szerinti készítményeket igen sokféle seb kezelésére használhatjuk, ideértve lényegében valamennyi bőrsérülést, szaruhártya-sérülést, valamint a testüreg epitéliás eredetű szerveit ért sérüléseket. A kezelhető sebek közé tartoznak a traumákból, igy az égésekből, horzsolásokból, vágásokból és a hasonlókból eredő' sebek éppúgy, mint a sebészeti eljárások során keletkező műtéti metszések, illetve a bőrátültetések sebei. A találmány szerinti készítményekkel olyan krónikus állapotok is kezelhetők, mint a krónikus fekélyek, a cukorbetegségből adódó fekélyek és egyéb más, nem gyógyuló (trophikus) kórképek.

·«·· ·4·· ··· ···· ···· • · • · ·· • · «·

- 54 Az amfiregulint élettani szempontból megfelelő hordozóanyagokhoz adagolva használhatjuk az érintett területek kezelésére. Igen sokféle hordozóanyag alkalmazható: ezek megválasztása a kezelendő terület elhelyezkedésétől függ. A bőr kezelésére krém vagy kenőcs hordozóanyagok a legelőnyösebbek: ilyenek például a lanolin, a Silvadene (Marion) /különösen az égések kezelésére/, az Aquaphor (Duke Laboratories, South Norwalk, Connecticut), és a hasonlók. Ha szükséges, az amfiregulint tartalmazó készítményeket sebpólyákba és más sebkötöző anyagokba inkorporálhatjuk, hogy biztosítsuk a fehérje folyamatos hatását a sebre. Az aeroszolos készítmények is igen hasznosak lehetnek.

Az amfiregulin koncentrációja a gyógyszerkészítményben nem kritikus, de elegendő kell legyen ahhoz, hogy az epitéliális sejtek osztódását serkentse. A készítményeket helyileg alkalmazzuk a kezelendő területen, jellemző módon szemcseppként a szemre vagy krémként, kenőcsként, borogatóvizként a bőrre. A szem esetében gyakori, általában 4 óránkénti, vagy még gyakrabban ismételt kezelés szükséges. A bőr esetében kívánatos a gyógyszerkészítmény folyamatos jelenlétét biztosítani a sebgyógyulás során a kezelendő területen, naponta 2-4 alkalommal, vagy még gyakrabban kezelve a sebet.

·· ··· ····

- 55 A találmány szerinti fehérje felhasznált menynyisége a kezelés móüLjától, az alkalmazott más hatóanyagoktól és más, hasonló tényezőktől függően általában az 1 - 100 /ug-os tartományba esik. A találmány szerinti fehérjét élettanilag megfelelő hordozóanyaggal, igy például sóval, foszfáttal pufferőit sóval és más, hasonló anyagokkal együtt alkalmazzuk. A találmány szerinti vegyület felhasználandó mennyiségét empirikusan, a sejtek in vitro, továbbá a kísérleti állatok in vivő a találmány szerinti polipeptidekre, vagy a találmány szerinti polipeptideket tartalmazó készítményekre adott válaszreakciói alapján határozzuk meg.

Az amfiregulin felhasználható egyedüli hatóanyagként, vagy más növekedési faktorokkal, inhibitorokkal vagy immunválaszt módosító hatóanyagokkal együtt.

·· ·· ···· ···· ···· • · · « · · · • · ··· * ···

9 9 9 · ···· ···· ··· · ···

7/2) Az amfiregulin felhasználása neopláziák kimutatására és kezelésére

A találmány szerinti vegyületek igen sokféle neoplázia kimutatására, kérjóslatára illetve kezelésére használhatók.

Az amfiregulin és ajrokon molekulák számos diagnosztikai felhasználása lehetséges. A találmány kivitelezése során a találmány szerinti polipeptideket valamilyen jelzőanyaghoz, például radioaktív izotóphoz, enzimhez, fluoreszcens anyaghoz, kemilumineszcens vegyülethez, enzimfragmenshez, illetve részecskéhez és más, hasonló anyagokhoz kapcsolhatjuk. Az ilyen vegyületekkel a sejtek amfiregulin-receptorait titrálva a receptorok száma meghatározható. Az amfiregulin-receptorok azonosítása jelzi a sejt feltételezhető válaszkészségét az amfiregulin és a rokon molekulák biológiai hatásaira. Az amfiregulin, az amfiregulinhoz hasonló molekulák és/vagy az ezek elleni antitestek felhasználhatók az amfiregulin táptalajokban, különösen fiziológiás táptalajokban való kimutatására, kompetíciós vizsgálatok során. Számos, a szakirodalomból ismert diagnosztikai eljárás alkalmazható.

Az amfiregulin testfolyadékokban és szövetekben való jelenléte, illetve koncentrációja egyenes ·» «· ···· ···· ··*· • · · « · · · • · ··· · ♦ ·♦

V · · · · ···· ···· ··· · ··· vagy fordított arányban állhat némely ráktipus jelenlétével, illetve áthatoló-képességével. Az amfiregulin kimutatására és/vagy mennyiségi meghatározására alkalmas vizsgálati eljárások a rák diagnózisában és kórjóslatában játszhatnak szerepet [lásd még a 6) pontot] .

A találmány tárgya az amfiregulin mRNS kimutatása is. E célra felhasználhatók a szakirodalomban részletesen ismertetett, egy ismert génszekvencia egészét vagy annak egy részét tartalmazó nukleinsav-szakaszok kimutatására alkalmas, nukleinsav-próbákat alkalmazó vizsgálati eljárások. Az amfiregulin mRNS koncentrációja jelezheti a kifejlődő, illetve a már létező neopláziákat, igy az AR mRNS koncentrációjának meghatározására alkalmas eljárások igen hasznos diagnosztikai módszerekké válhatnak.

Jelölt amfiregulint vagy amfiregulinhoz hasonló molekulákat, vagy éppen az amfiregulin-receptor elleni antitesteket felhasználva az amfiregulin-receptort expresszáló rákos sejteket receptorkötési vizsgálattal is kimutathatjuk. A sejteket osztályozhatjuk az amfiregulin-receptorok jelenléte, illetve száma szerint: ez az osztályozás módot ad arra, hogy megjósoljuk az adott sejt érzékenységét az amfiregulin biológiai hatásaira.

···· ···· *·· • · ··« · ·*· • · · · · ··········· · · · ·

- 58 Az amfiregulint anti-neoplasztikus vegyületként is felhasználhatjuk. A találmány szerinti készítményeket igen sokféle módon alkalmazhatjuk in vivő: adagolhatjuk például -bár nem kizárólag - injekció, infúzió formájában, helyileg.vagy parenterálisan alkalmazva, és igy tovább. Az amfiregulint adagolhatjuk bármilyen, élettani szempontból megfelelő hordozóanyaghoz keverve, igy foszfáttal pufferőit sóoldatban, sóoldatban, steril vízben, stb. Az amfiregulint és az amfiregulinhoz hasonló molekulákat liposzómákba is zárhatjuk, ^vagy tumor- illetve sejtspecifikus antigéneket felismerő, és azokhoz kötődő antitestekhez köthetjük, igy biztosítva a találmány szerinti készítmény célzott” eljuttatását a megfelelő sejtekig.

Az amfiregulin felhasználható a tumorsejtek végső differenciálódásának serkentésére in vivő. A tumorsejtek letértek a normál sejtekre jellemző sejtdifferenciálódás útjáról, és megtartják a folyamatos osztódás képességét is. A normál sejtek ezzel ellentétben olyan sejtekké differenciálódnak, melyek a szokásos körülmények között nem képesek a továbbijsejtosztódásra. Az amfiregulin azon tulajdonsága tehát, hogy újra indíthatja a rendes sejtdifferenciálódást a tumorsejtekben, és végül megállíthatja a tumor folyamatos növekedését, igen értékes lehet a daganatos megbetegedések kezelésében.

• ·

- 59 Az amfiregulint és az amfiregulin származékait, analógjait, illetve az amfiregulin-peptideket egyedüli hatóanyagként, vagy legalább egy másik, sejtosztódást gátló hatóanyaggal, igy például valamely interferonnal, a TGF-fil-gyel, a TGF-B2-vel, a tumor nekrózis faktor-B-val, a tumor nekrózis faktor-a-val, stb. együtt használhatjuk fel a hormonálisán befolyásolható karoinómák kezelésére. Ezek a karcinómák számos szervet, igy például a tüdőt, az emlőt, a prosztatát vagy a vastagbelet is megtámadhatják. A hormonálisán befolyásolható karcinómák kezelhetők úgy is, hogy indukáljuk a karcinóma-sejtek amfiregulin-termelését. Indukálószerként például - bár nem kizárólag - ösztrogéneket, igy 17-B-ösztradiolt; ösztrogén-aktivitással rendelkező vegyületeket; továbbá anti-ösztrogén-aktivitásu vegyületeket, igy például Tamoxifent használhatunk. A fenti vegyületeket tetszőleges kombinációban is felhasználhatjuk indukálószerként.

A találmány szerinti vegyületekkel az amfiregulinra érzékeny sejtek vagy sejtvonalak növekedését gátolhatjuk in vitro anélkül, hogy befolyásolnánk az amfiregulinra nem érzékeny sejtek osztódását. Ily módon heterogén sejtkeverékekből kiszűrhetjük a nem kívánatos, az amfiregulin növekedésgátló hatására érzékeny sejteket. A találmány szerinti vegyületekkel tehát • · • · · · ·· · · ····

Μ .

> >

βο in vitro eltávolíthatjuk a csontvelő rákos sejtjeit az autológ csontvelő-átültetés során, illetve kiszűrhetjük a vér rákos sejtjeit, vagy meggátolhatjuk azok osztódását a reinfuziót megelőzően.

Az egy adott sejttípus osztódásának gátlására legelőnyösebb amfiregulin koncentrációt úgy állapíthatjuk meg, hogy az illető tumorsejtekhez különböző koncentrációkban amfiregulint adagolunk, és meghatározzuk a sejtosztódás gátlásának mértékét. Az amfiregulin-termelést serkentő indukálószerek és/vagy azok kombinációinak legelőnyösebb koncentrációja pe^u dig a karcinóma-sejtek amfiregulin-termelésének mérésével határozható meg.

1. példa

Az emberi amfiregulin előállítása, tisztítása és jellemzése

Az alábbiakban részletesen ismertetjük a TPAval kezelt MCF-7 sejtek által termelt amfiregulin tisztítására és jellemzésére szolgáló eljárásokat.

1.1. Az emberi amfiregulin előállítására, tisztítá- sára és jellemzésére szolgáló módszerek

1·1·1. Nátrium-dodecil-szulfát jelenlétében végzett poliakril-amid gél-elektroforézis

A fehérjéket nátrium-dodecil-szulfát jelenlétében, poliakril-amid géllemezben végzett elektroforézissel (a Bio-Rad normál, illetve mini elektroforézis készülékét felhasználva), Laemmli módszerét követve [Natúré, 227, 680 - 685· (1970)] vizsgáljuk. A futtatás után a fehérjéket ezüstfestéssel [Merril és munkatársai, Science, 211, 1437 - 1439. (1981)] tesszük láthatóvá.

·· ·· ···· ···· ···· • · · · · · · • · · ·· · ··· • · · · · ···· ···· ··· · ···

1.1.2, Izoelektromos fókuszálás

Az izoelektromos fókuszálást lényegében a Resolve IEF géljeihez mellékelt Isolab felhasználási utasítás szerint végezzük. Röviden, a mintákat az előre elkészített agaróz gélekre (85 x 100 mm, pH = 3 - 10) visszük, majd Resolve FR-2500 izoelektromos fókuszáló készülékben, áramforrásként Bio-Rád 3000 Xi, számítógép-vezérlésű elektroforézis-tápegységet csatlakoztatva elektroforetizáljuk. Bio-Rad IEF-standardokat is futtatunk a minták mellett, a festést követően pedig a megszáritott géleket Kodak X-Omat AR filmre, DuPont Cronex Lightening Plus érzékenységnövelő szűrőt használva lefényképezzük.

1·1·3. A fehérjék jódizotoppal történő jelölése

A fehérjéket 125-ös tömegszámú jódizotóppal jelöljük, a klóramin-T módszer szerint eljárva [Barridge, Methods Enzymol., 50, 54 - 65. (1978)].

1.1.4. Fehérjekoncentráoió-meghatározás

A fehérjék koncentrációját a különböző hullámhosszakon (210 - 280 nm) mért fényelnyelés alapján állapítjuk meg. Lowry és munkatársai [J. Bioi. Chem., 193, 265 - 275. (1.951)], illetve Bradford [Anal. Biochem., 72, 248 - 252. (1976)] módszere szerint ·· ·· ···· ···· ···· • · · · · · · • · ··« · ··· • · · · · ···· ···· ··· · ··· járunk el; standardként szarvasmarha szérum albumint használunk.

I. 1·5· A 125-ös tömegszámú jódizotóppal jelölt EGF (¹²^I-EGF) kötődési vizsgálata

A kötődési vizsgálatot akár 48 kamrás szövettenyésztő lemezben frissen nőtt és/vagy formaiinnal fixált A431 jelű sejtekkel [Carpenter és munkatársai,

J. Bioi. Chem., 254, 4484 - 4891.(1979); Shoyab és munkatársai, Natúré, 279. 387 - 391. (1979); DeLarco és munkatársai, J. Bioi. Chem.,· 255, 3685 - 3690. (1980)], akár 96 lyuku polivinil-klorid lemezekre kikötött plazmamembránokkal [Kimball és Warren, Biochem. Biophys. Aota, 771, 82 - 88. (1984)] végezhetjük.

1.2. Az amfiregulin előállítása

1.2.1. A TPA-val kezelt MCF-7 sejtek kondicionált táptalajának összegyűjtése

Az MCF-7 sejteket Coming T 150 szövettenyésztő edényekben, 25 ml végtérfogatu, 50 $ IMDM táptalajból (Iscove-féle módosított Dulbecco-féle táptalaj) és 50 DMEM táptalajból összeállított, 0,6 /ug/ml inzulinnal és 15 % hővel inaktivált szarvasmarha magzati szérummal kiegészített táptalajban ti 9· ···· ···· ···· • · · « · · · • · ··· · ··« • · · · · ···· ···· ··· ♦ ··· (MCF-7 komplett táptalaj) tenyésztjük. A tényészedényeket 1 x lO^ sejttel oltjuk, majd 37°C hőmérsékleten, 5 % széndioxidot tartalmazó atmoszférában inkubáljuk. A hatodik napon a táptalajt teljes egészében eltávolítjuk, és minden egyes tenyészedényhez 20 ml friss,

100 ng/ml TPA-val kiegészített MCF-7 komplett táptalajt adunk. 48 óra elteltével a táptalajt eltávolítjuk, a tényészedényekben levő sejteket 15 ml, 50 $ IDMM-et és 50 % DMEM-et tartalmazó, szérummentes táptalajjal mossuk, majd a fenti összetételű szérummentes táptalajból 25 ml-t mérve minden tenyészedényhez, 37°C hőmérsékleten 5 $ széndioxid-koncentrációjú atmoszférában inkubálunk. Négy nappal később a kondicionált, szérummentes táptalajt összegyűjtjük, a törmelék eltávolítása érdekében centrifugáljuk, majd -20°C hőmérsékleten tároljuk. A tenyészedényekben maradt sejtekhez újra 25 ml szérummentes táptalajt mérünk, és minden harmadikfvagy negyedik napon összegyűjtjük a kondicionált, szérummentes táptalajt. Minden adag kondicionált táptalajból mintát veszünk, és A431 jelű, emberi epidermisz-szerű karcinómasejtek felhasználásával mérjük a növekedésgátló aktivitást (GIA). Rendszerint három-négy adag kondicionált táptalajt gyűjtünk minden egyes TPAval kezelt MCF-7 sejttenyészetről.

·· ·4 444« «««« 444· • · · · 4 · · • · 4 4 4 4 · · 4 • · · · 4 ···» ···· 444 · «44

1.2.2«· A nyers amfiregulin elkülönítése

Mintegy 4500 ml kondicionált táptalajt felolvasztunk, majd 3500 fordulat/perc fordulatszámon, 4°C hőmérsékleten 15 percen át centrifugálunk. A felüluszót Amicon 2 l~es koncentrátorral, YM10 (Amicon) szűrőt használva 4°C hőmérsékleten betöményitjük. Amikor a betöményitési maradék térfogata eléri a 200 ml-t, 1000 ml hideg Mili-E-Q vizet adagolunk, és az elegyet újra betöményitjük 200 ml térfogatig.

A koncentrátumot lehűtött, 250 ml térfogatú Corning centrifugacsőbe töltjük. Keverés közben lassan tömény ecetsavat adagolunk 1 M végkoncentráció eléréséig. A keveréket 1 órán át 4°C hőmérsékleten állni hagyjuk, majd 20 percen át 40.000 g-n 4°C hőmérsékleten, Sorval RC-5B centrifugával centrifugáljuk. A felüluszói^éltávolitjuk, és 4°C hőmérsékleten tároljuk. Az üledéket 30 ml 1 M koncentrációjú ecetsav-oldatban feloldjuk, majd a fentiek szerint újra centrifugáljuk. A felüluszót ismét gondosan eltávolítjuk, egyesitjük az előző centrifugálásból származó felüluszóval, majd 17 1 0,1 M koncentrációjú ecetsav-oldattal szemben dializáljuk, Spectrapore dialízis-zacskóban (amely csak a 3000 daltonnál kisebb molekulákat ereszti át). A dializáló puffért 2 nap alatt három alkalommal cserélj ük. A dializált oldatot liofilezzük. A szárazanyagot • · ·· ·· «··« · ·· · • · · · · · · • · ··· · ··· • · · · * »··· ··*· ··· · ···

- 66 összegyűjtjük, súlyát megmérjük, majd -20°C hőmérsékleten tároljuk a további felhasználásig. A fentiek szerint eljárva előállított terméket nevezzük nyersterméknek,

1.3. Az amfiregulin tisztítása

1.3.1. Fordított fázisú folyadék-krömatográfia

950 mg (körülbeül 9 1 szérummentes kondicionált táptalajból származó) nyersterméket 300 ml, 0,1 $ koncentrációjú trifluor-ecetsav-oldatban feloldunk, és az oldatot 20 percen át, 7000 g-n centrifugáljuk. A felüluszót óvatosan eltávolítjuk, és 0,1 ¢0 koncentrációjú vizes trifluor-ecetsav-oldattal ekvilibrált, preparativ 018 oszlopra (2,54 cm x 27 cm; 55 - 105 /um; Waters) visszük. A kromatográfiás töltetet 0,1 $ trifluor-ecetsawal kiegészített acetonitrilben szuszpendáljuk fel, és a szuszpenziót egy 2,54 cm átmérőjű kromatografáló oszlopba töltjük. Az oszlopot 400 ml, 0,1 % trifluor-ecetsavval kiegészített acetonitrillel mossuk, majd 600 ml, 0,1 $ koncentrációjú vizes trifluor-ecetsav-oldattal ekvilibráljuk. Az átfolyási sebességet 4 ml/perc értékre állítjuk be;: a kromatográfiát szobahőmérsékleten végezzük. Az oszlopot 650 ml, 0,1 $ koncentrációjú vizes trifluor-ecetsav-oldattal mossuk. Az áttörési és a mosási eluátumot egybegyüjtjük.

- 67 Ezután többlépcsős eluciót végzünk az alábbiak szerint:

1) 650 ml, 0,1 $ trifluor-ecetsawal kiegészített, 20 $ koncentrációjú, vizes acetonitril-oldat,

2) 650 ml, 0,1 trifluor-ecetsawal kiegészített, 40 % koncentrációjú, vizes acetonitril-oldat,

3) 650 ml, 0,1 $ trifluor-ecetsawal kiegészített, 60 $ koncentrációjú, vizes acetonitril-oldat, és végül

4) 650 ml, 0,1 % trifluor-ecetsawal kiegészített, 100 % koncentrációjú acetonitril.

Minden frakcióból mintát veszünk, és vizsgáljuk a minták növekedésgátló hatását. A teljes növekedésgátló aktivitás mintegy 77 $-a az áttörési és a mosási frakciókban jelenik meg.

Az áttörési és a mosási frakciókat izokratikusan egy nagynyomású folyadék-kromatográfiás készülékhez (Waters) csatolt, preparativ Partisii 10 0DS-3 oszlopra (10 /um; 2,2 x 50 cm, Y/hatman) injektáljuk.

Az átfolyási sebességet 4 ml/perc értékre állítjuk be. Amint a minta belépett az oszlopba, az oszlopot 250 ml, 0,1 $ koncentrációjú, vizes trifluor-ecetsav-oldattal ·· ··«· ···· ····

- 68 mossuk. Lineáris gradienst állítunk elő a kiindulási oldószer, a 0,1 koncentrációjú, vizes trifluor-ecetsav-oldat és a végső oldószer, a 0,1 $ trifluor-ecetsavval kiegészített acetonitril között. A gradienst úgy állítjuk elő, hogy 0-15 $-ig 10 perc alatt, 15 - 15 #-ig 30 perc alatt, 15 - 25 $-ig 150 perc alatt, 25 - 65 $-ig 100 perc alatt, végül 65 - 100-ig 10 perc alatt jussunk el. Valamennyi oldószer nagynyomású folyadék-kromatográfiás minőségű. 14 ml-es frakciókat szedünk, és minden frakció növekedésgátló hatását megvizsgáljuk. Két széles aktivitási csúcsot találunk (lásd az 1. ábrát). A korai eluciós csúcshoz (ez 20 - 23 $ acetonitril-koncentráció mellett jelentkezik) tartozó frakciókat tovább tisztítjuk és jellemezzük.

A 47 - 62. frakciókat egyesitjük. 224 ml, 0,1 % koncentrációjú, vizes trifluor-ecetsav-oldatot mérünk az egyesített frakciókhoz. Az elegyet izokratikusan egy szemipreparativ mü-Bondapak-Cl8 oszlopra (7,8 x 300 mm, Waters) injektáljuk, 2 ml/perc átfolyási sebességgel, szobahőmérsékleten. A lineáris gradienst úgy állítjuk elő, hogy 0-17 $-ig 10 perc alatt, 17-17 $-ig 30 perc alatt, 17 - 25 $-ig 320 perc alatt, végül 25 - 100 $-ig 40 perc alatt jussunk el. A gradiens átfolyási sebességét 1 ml/perc értékre állítjuk, és 4 ml-es frakciókat szedünk.

«· ···· · · · · · · · ♦ • · · · • ··· · ··· • · · · ······ · *··

- 69 A frakciókból mintát veszünk, és mérjük a növekedésgátló hatást. Két nagyobb aktivitási csúcs jelentkezik: ezek körülbelül 20 $ illetve 21 % acetonitril-koncentráció mellett eluálódnak (lásd a 2. ábrát).

A 49 - 53. frakciókat egyesítjük. 20 ml,

0,1 os trifluor-ecetsav-oldatot mérünk az egyesített frakciókhoz. Az elegyet izokratikusan egy mü-Bondapak-C18 oszlopra (3,9 x 300 mm, Waters) visszük, 1 ml/perc átfolyási sebesség mellett, szobahőmérsékleten. A gradienst úgy állítjuk elő, hogy 0-18 $-ig 10 perc alatt, 18 - 18 $-ig 30 perc alatt, 18 - 25 $-ig 280 perc alatt, végül 25 - 100 %-ig 20 perc alatt jussunk el. Az átfolyási sebességet 0,4 ml/perc értéken tartjuk, és 2 ml-es frakciókat gyűjtünk. Az aktivitás legnagyobb része 21,5 $-os acetonitril-koncentráció mellett eluálódik az oszlopról (lásd a 3/A. ábrát).

Az 54-59. frakciókat (lásd a 2. ábrát) egyesitjük, és az előzőekben leírtak szerint (3/A. ábra) kromatografáljuk. Az aktivitás döntő többsége 22,2 $-os acetonitril-koncentráció mellett eluálódik az oszlopról (lásd a 3/B. ábrát).

• · ·

1.3.2, Gélszürési kromatográfia

A 35 - 38. frakciókat (3/A. ábra) külön-külön, mintegy 70 /ul térfogatra töményitjük be Speed-Vac koncentrátort (Savant) használva, majd az oldathoz azonos térfogatú, 0,1 $ trifluor-ecetsavat tartalmazó acetonitrilt mérünk. Az igy nyert, 140 /ul térfogatú mintákat két, egymás után kapcsolt Bio-sil TSK-250 oszlopra (egyenként 7,5 x 300 mm, Bio-Rad) injektáljuk. Az eluciót izokratikusan, 0,1 $ trifluor-ecetsawal kiegészített, 50 $ koncentrációjú, vizes acetonitril-oldattal, mint mozgó fázissal, szobahőmérsékleten végezzük. Az átfolyási sebességet 0,4 ml/perc, a regisztráló papír sebességét 0,25 cm/perc értékre állítjuk be; 0,4 ml-es frakciókat szedünk, és a frakciókból vett minták növekedésgátló hatását mérjük. A 35., 36. és 37. frakciók (3/A. ábra) kromatográfiás görbéit a 4/A., 4/B. illetve a 4/C. ábrákon mutatjuk be.

A 41. és a 42. frakciót (3/B. ábra) egyesítjük, 70 /ul térfogatra betöményitjük, majd gélszürési kromatográfiát végzünk, a fentiek szerint eljárva. A kromatográfiás görbét a 4/D. ábrán mutatjuk be.

• · · · · ··········· * ···

- 71 1.4. A sejtnövekedés vizsgálata

1.4.1. A 125-ös tömegszámú jódizotóppal jelölt dezoxi-uridin, DNS-be való beépülésének mérésén alapuló, a sejtnövekedés gátlásának illetve serkentésének kimutatására szolgáló eljárás

A vizsgálatot 96 mérőlyuku mikrotiter lemezben (Falcon 3072) végezzük. A növekedésgátló aktivitást emberi epidermisz-szerű vulva-karcinóma sejteken (A431), a növel® dést serkentő aktivitást pedig emberi előbőr fibroblasztokon (Sadamoto), mint indikátorsejteken vizsgáljuk. A külső mérőlyukak kivételével valamennyi mérőlyukba 3,5 x 10^ sejtet mérünk, 50 /ul, 5 % hővel inaktivált szarvasmarha magzati szérummal (FBS), penicillinnel, sztreptomicinnel, valamint glutaminnal kiegészített DMEM táptalajban (teszt-táptalaj) felszuszpendálva. A külső lyukakba 50 /ul PBS puffért mérünk.

órával később a vizsgálandó minta és a teszt-táptalaj keverékének 50 /ul-ét mérjük valamennyi mérőlyukba, a kontroli-lyukakba pedig 50 /ul teszt-táptalajt adagolunk. A vizsgálandó minta minden egyes koncentrációját 3 - 3 mérőlyukba mérjük. A lemezeket 37°C hőmérsékleten, 2-3 napon át inkubáljuk. 100 /ul, ¹²^I-jo125 do-2’- I-dezoxi-uridin-oldatot [4 Ci/mg - 0,5 mCi/ml (2 /ul/ml koncentrációban a teszt-táptalajhoz keverve)] «· ·· ···· ···· ···· • · · · · ♦ · « · ··· · ··· adagolunk ezután valamennyi mérőlyukba, és a lemezeket 37°C hőmérsékleten inkubáljuk. 4-6 óra után a táptalajt leszivatjuk a mérőlyukakból, és minden egyes mérőlyukat egyszer, 200 ml PBS pufferral mosunk. Ezután 200 /ul metanolt mérünk minden mérőlyukba, a lemezeket 10 percen át szobahőmérsékleten inkubáljuk, majd a metanolt leszivatással eltávolítjuk. 200 /ul, 1 mól koncentrációjú nátrium-hidroxid-oldatot adagolunk minden mérőlyukba, és a lemezeket 30 percen át 37°C hőmérsékleten inkubáljuk. A nátrium-hidroxidot Titertek tamponokkal (Elow Labs) távolitjuk el. A tamponokat x 75 mm-es műanyag csövekbe helyezzük, és gamma-számlálóban mérjük a 125-ös tömegszámú jóddal jelölt jód-dezoxiuridin beépülését.

1.4.2. Telepszám-vizsgálat lágyagarban hővel inaktivált szarvasmarha magzati szérummal kiegészített DMEM táptalajhoz 0,5 $ agart (Agár Noble; Difco Laboratories, Detroit, Michigan) mérünk, és az igy nyert oldatból 0,5 ml-es alapagar-rétegeket öntünk egy 24 lyuku Costar szövettenyésztő lemez lyukaiba. A fenti táptalaj-szarvasmarha magzati szérum oldathoz 0,3 $ agart, 5 - 10 x 10^ indikátor sejtet, és a vizsgálandó hatóanyagok különböző hígításait mérjük; az igy nyert szuszpenzió 0,5 ml-ét

- 73 az alápagar-rétegekre rétegezzük. A lemezeket 37°C hőmérsékleten, nedves, 5 $ széndioxidot tartalmazó atmoszférában inkubáljuk, majd 7 nap elteltével újra felülrétegezzük a fenti, 0,3 % agarral, és a vizsgált anyag megfelelő higitásaival kiegészített táptalaj 0,5 ml-eivel. A 7. és a 14. nap között a telepeket fixálás és festés nélkül megszámláljuk, és a több mint 20 sejtből álló telepek számát feljegyezzük.

1*4.3. A sejtnövekedés gátlásának vizsgálata

Lyukanként 0,3 ml, 2,1 x ΙΟ²* A431 sejtet tartalmazó táptalajt (DMEM táptalaj 10 % szarvasmarha magzati szérummal, penicillinnel, sztreptomicinnel és glutaminnal kiegészítve) mérünk egy 24 lyuku Costar o szövettenyésztő lemez lyukaiba (mintegy 2 cm /lyuk), és a sejteket 2 órán át, 37°C hőmérsékleten inkubáljuk. Ekkor 0,3 ml, a vizsgálandó minták különböző higitásaival kiegészített táptalajt mérünk minden lyukba. Minden hígítással két párhuzamost készítünk. A kontrolltenyészetekhez csak táptalajt mérünk, vizsgálandó anyagot nem. A lemezeket 37°C hőmérsékleten, 72 órán át inkubáljuk. A táptalajt ezután leszivatjuk, a sejteket pedig lyukanként 1 ml PBS-oldattal mossuk, majd 0,5 ml, 0,5 % tripszin enzimet és 0,5 mmól koncentrációban etilén-diamino-tetraecetsavat tartalmazó oldattal

- 74 $ leválasztjuk a lemezről, és Coulter számlálóval megszámoljuk.

1.5. Az amfiregulin elsődleges szerkezetének vizsgálata

1·5.1. Redukálás és S-piridil-etilálás

- 30 /ug amfiregulint 1,5 ml-es polipropilén mikrocentrifuga-csőben beszáritunk, majd 100 /ul, 3 mól koncentrációjú urea-oldatban (az ureát 0,05 mól koncentrációjú, pH = 7,5 vegyhatásu Trisz-hidroklorid-oldatban oldjuk fel) felszuszpendáljuk. 4 /ul 2-merkapto-etanolt adunk az elegyhez, az olcetot összekeverjük, a mikrocentrifuga-csőbe nitrogéngázt fuvatunk, majd 25°C hőmérsékleten inkubálunk. 2,5 óra után 4,5 /ul frissen desztillált 4-vinil-piridint mérünk az elegyhez, a mikrocentrifuga-csövet újra nitrogéngázzal töltjük fel, majd 2 órán át 25°C hőmérsékleten inkubálunk. A reakcióelegyet 10 %-os trifluor-ecetsav-oldattal pH = 2,0 értékig savanyítjuk. Az S-piridil-etilált amfiregulint fordított fázisú, nagynyomású folyadék-krómatográfiával, mü-Bondapak Cl8 oszlopon (3,9 x 300 mm, Waters) tisztítjuk. Az acetonitril koncentrációját lineárisan (1 % percenként), • · « • · ·*·· « ··· · · · • «ί · percen át növeljük, az átfolyási sebességet 1 ml/perc értékre állitjuk. Kiindulási oldószerként 0,1 %-os trifluor-ecetsav-oldatot használunk. Az S-piridil-etilált amfiregulin (SPE-AR) mintegy 26,5 $-os acetonitril-koncentráció mellett eluálódik: ez az érték mintegy 4 $-kal magasabb, mint az amfiregulin eluciójakor mért acetonitril-koncentráció.

1.5.2. N-glükanáz enzimkezelés

- 20 /ug arnfiregulint vagy S-piridil-etilált amfiregulint 1,5 ml-es polipropilén mikrocentrifuga-csőben beszáritunk, majd 80 /ul, 0,1 mól koncentrációjú, pH = 5,5 vegyhatásu foszfát-pufferban feloldunk. 10 - 20 /ul N-glükanáz enzimoldatot (0,25 egység//ul, Genzyme) adagolunk, az elegyet 16 órán át 37°C hőmérsékleten inkubáljuk, majd 0,9 ml, 0,2 koncentrációjú trifluor-ecetsav-oldatot mérünk a reakcióelegyhez. Az igy nyert mintát ultrapórusos RPSG 03 fordított fázisú, nagynyomású folyadék-kromatográfiás oszlopra (4,6 x 75 mm, Altex) injektáljuk 1 ml/perc átfolyási sebesség mellett. Az oszlopot előzőleg 0,1 $-os trifluor-ecetsav-oldattal, mint kiindulási oldószerrel ekvilibráljuk. Végső oldószerként 0,1 $ trifluor-ecetsawal kiegészített acetonitrilt használunk. Az acetonitril koncentrációját lineárisan • « · ·

- 76 (0,4 $/-perc), 85 pero alatt, szobahőmérsékleten növeljük. Az N-deglikozilált amfiregulin, illetve az N-deglikozilált, S-pirid.il-etilált amfiregulin sorrendben mintegy 16,5 illetve 20,5 $-os acetonitril-koncentráció mellett eluáIható.

1.5.3. Az N-glükanázzal kezelt, S-piridil-etilált amfiregulin enzimatikus hasítása

A Lys-C-endopeptidázzal történő hasítást /ul, 0,1 mól koncentrációjú, pH = 8,0 vegyhatásu Trisz-ecetsav-pufferban, 16 órán át, 25°C hőmérsékleten végezzük. Az enzim : szubsztrát térfogatarányt 1 : 5 értékre állítjuk be.

Az Arg-endopeptidázzal, valamint a S. aureus V8-proteázzal történő emésztéseket 80 /ul, 0,05 mól koncentrációban pH = 8,0 vegyhatásu Trisz-sósavat és 0,1 mól koncentrációban ammóniura-bikarbonátot tartalmazó oldatban, 16 órán át, 37°C hőmérsékleten végezzük. Az enzim j szubsztrát térfogatarányt újra 1 s 5 értékre állítjuk be.

«· ·«··· ··** «··· • · « · · · · • · ··· · ··· • · · · · ·«········· · · · ·

-77-.

1.5.4. Kémiai hasítás

A bróm-cianiddal végzett, metionin mellett történő hasítás érdekében 5 /ug, N-glükanázzal kezelt, S-?-piridil-etilált amfiregulint beszáritunk egy 1,5 ml-es polipropilén mikrocentrifuga-csőben, majd. 75 /ul 70 #-os hangyasav-oldatban feloldjuk. 25 /ul brómcianid-oldatot (25 mg/ml koncentrációban 70 $-os hangyasavban feloldva) adagolunk, az elegyet összekeverjük, és a mikrocentrifuga-csövet feltöltjük nitrogéngázzal. A reakciót 22 órán át, 25°C hőmérsékleten, sötétben végezzük. A reakcióelegyet 1,1 ml végtérfogatra hígítjuk vízzel, majd Speed-Vac koncentrátorban beszorítjuk. A szárított mintát 20 /ul 2-amino-etanolban szuszpendáljuk fel, 10 percen át 22°C hőmérsékleten inkubáljuk, majd vákuumban beszáritjuk. A beszáritott keveréket 0,9 ml, 0,2 $-os trifluor-ecetsav-oldatban oldjuk fel.

1.5.5. Peptidizolálás

A peptideket nagynyomású folyadék-kromatográfiás készülékhez (Waters) kapcsolt 08 fordított fázisú, nagynyomású folyadék-kromatográfiás oszlopon (4,6 x 100 mm, Whatman) választjuk el. A lesavanyitott (pH = 2,0) mintákat 1 ml/perc átfolyási sebesség mellett a 0,1 #-os trifluor-ecetsav-oldattal mint kiindulási oldószerrel ekvilibrált oszlopra visszük, és az oszlopot további 15 ml, 0,1 #-os trifluor-ecetsav-oldattal mossuk. A kiindulási oldószer és a végső oldószer, a 0,1 % trifluor-ecetsawal kiegészített acetonitril között lineáris gradienst állítunk elő. A gradienst úgy állítjuk elő, hogy 0 - 50 % acetonitril-koncentrációig 125 perc alatt jussunk el, 0,5 ml/perc átfolyási sebesség mellett.

1.5.6. Aminosav-analízis

A beszáritott mintákat 1 térfogat# fenolt tartalmazó sósavban (5,7 mól, Pierce) felszuszpendálva, csökkentett nyomáson, teflonnal lezárt üveg hidrolizis-gömbben (Pierce), 105°G hőmérsékleten, 16 órán át végzett folyamatos forralássaj^iidrolizáljuk. A hidrolizált mintákat Speed-Vac koncentrátorban (Savant Instruments) beszáritjuk, majd fenil-izotiocianáttal reagáltatva előállítjuk a megfelelő származékokat. A reakciót 20 percen át szobahőmérsékleten végezzük. A fenil-tiokarbamoil-aminosav-származékokat fordított fázisú folyadék-kromatográfiával, Octadecyl oszlopon (4,5 x 250 mm, IBM) vizsgáljuk. Az első oldószer, a 0,15 mól koncentrációban pH = 6,4 vegyhatásu nátrium-acet.átot és 0,05 # koncentrációban ecetsavval pH = 6,4 vegyhatás-érték eléréséig titrált trietil-amint tartalmazó ·· ·· ···· • · · ♦ · • · ··· • · · ···· ···· ··« oldat; illetve a végső oldószer, a 60 $-os acetonitril-oldat között a lineáris gradienst 1 ml/perc átfolyási sebesség mellett, 38°C hőmérsékleten állítjuk elő.

1.5.7. A fehérjék aminosav-sorrendjének meghatározása

A fehérjék aminosav-sorrendjét az Applied Biosystem Model 475 gázfázisú aminosav-szekvenáló készülékével határozzuk meg, Hewick és munkatársai leírását követve [J. Bioi. Chem., 256, 7990 - 7997. (1981)]. Valamennyi futtatás során, a mintabevitelt megelőzően három Edman-degradációs ciklust végzünk a mintákkal.

$-os trifluor-ecetsav-oldattal alakítjuk át a triazolin-származékokat fenil-tiohidantoin-aminosav-származékokká. A fenil-tiohidantoin aminosav-származékokat az Applied Biosystems Ivlodel 120A fenil-tiohidantoin-analizátor készülékével, on-line üzemmódban azonosítjuk, Hunkapiller és Hood leírása szerint eljárva [Science, 219, 650 - 659. (1983)].

1.5.8· További enzimes kezelések

- 100 egység félig tisztított (a fordított fázisú, 018 oszlopon történt nagynyomású folyadék-kromatográfiás lépés terméke), illetve lényegében tiszta amfiregulint használunk ezekhez a kísérletekhez • · «·* · ··· • · · · ···· ···· · · · · ··· (I. táblázat). Az N-glükanáz és az 0-glükanáz a Genzyme Corp., Boston terméke; valamennyi egyéb enzimet a Boehringer Mannheim Biochemicals vagy a Worthington Biochemicals állította elő. A kezeléseket 50 - 200 /ul végtérfogatban, a megfelelő pufferban végezzük. Az enzimeket feleslegben használjuk, rendszerint a szubsztrát koncentrációjának 5-20 %-át (térfogati) adva a reakcióelegyhez. A kezelések után vizsgáljuk a minták növekedésgátló hatását, előzőleg azonban a zavaró vegyületeket különböző analitikai módszerekkel eltávolítjuk. A legtöbb esetben a minta vegyhatását 10 %-os trifluor-ecetsavval körülbelül pH = 2-re állítjuk. A mintákat 0,1 $-os trifluor-ecetsav-oldattal ekvilibrált, fordított fázisú, ultrapórusos RPSC 03 oszlopra (4,6 x 75 mm, Altex) visszük. Az oszlopot 0,1 #-os trifluor-ecetsavval mint első oldószerrel mossuk. Az elució során végső oldószerként 0,1 % trifluor-ecetsavval kiegészített acetonitrilt használunk. A gradienst úgy állítjuk elő, hogy 0 - 50 % acetonitril-koncentrációig 0,2 perc alatt, 50 - 50 % acetonitril-koncentrációig pedig 19,8 perc alatt jussunk el. Az átfolyási sebességet 0,5 ml/perc értékre állítjuk, és 2 ml-es frakciókat szedünk. A frakciókból mintákat veszünk, és vizsgáljuk a növekedésgátló hatás megjelenését. Az amfiregulin-aktivitás rendszerint a negyedik frakcióban eluálódik.

• ·

1.6. · Az amfiregulin DNS-hez való kötődésének vizsgálata

Az amfiregulin cellulózhoz kötött, natív borju-csecsemőmirigy DNS-hez, denaturált borju-csecsemőmirigy DNS-hez, továbbá cellulózhoz való kötődését Herrick és Alberts módszere [Methods in Enzymology, 21, 198. (1971)] szerint eljárva vizsgáljuk. A cellulózt (10 mg) 500 /ul mintafelvivő pufferban (20 mmól Trisz, pH = 7,4; 10 $ glicerin; 1 mmól etilén-diamino-tetraecetsav; 1 mmól B-merkapto-etanol;' 100 /ug/ml szarvasmarha szérum albumin és 50 mmól nátrium-klorid) rehidratáljuk. A reakciókat, 2-2 párhuzamost indítva, 1,5 ml-es Eppendorf-csövekben végezzük. Minden Eppendorf-csőbe mintafelvivő pufferral ötször mosott, 300 /ul térfogatba összetömöritett, hidratált cellulóz-mintát helyezünk. Ezután minden csőhöz 0,2 ng, 125-ös tömegszámú jódizotóppal jelölt amfiregulint (specifikus aktivitását 425 müCi//ug) vagy más, 125-ös tömegszámú jódizotóppal jelölt fehérjét mérünk 250 /ul mintafelvivő pufferban feloldva. A mintákat összekeverjük, 4°C hőmérsékleten, 20 percen át, időnként felkeverve inkubáljuk, majd ötször 200 - 200 /ul mintafelvivő pufferral mossuk. Az eluciót lépésenként, 0,1 mól, 0,15 mól, ·· ·· ···· ···· ···· • · · · · · · • · ··· · · · · • · · · · ···· ···· ··· · ···

0,25 mól, 0,6 mól, 1 mól, majd 2 mól koncentrációjú nátrium-klorid-oldattal (a nátrium-kloridot mintafelvivő pufferban oldjuk fel) végezzük. Minden egyes koncentráció-értékmél ötször 200 - 200 yul oldattal eluálunk. Specifikusan kötöttnek tekintjük azt az anyagot, amely 0,25 mól vagy annál nagyobb nátrium-klorid koncentráció mellett eluálódik. A 0,15 mól vagy annál kisebb nátrium-klorid koncentráció mellett eluálódó anyagot nem-specifikusan kötöttnek tekintjük.

1.7· Az amfiregulin előállitása, tisztítása és jellemzése

- 1.7.1· Az amfiregulin előállitása TPA-val kezelt

MCT-7 sejtekkel

A műanyag aljzaton növő MCF-7 sejtek az epitélium-szerü sejtekre jellemző tulajdonságokat mutatják: a sejtek kis méretűek és sokszög alakúak. A TPA-kezelés, dózisától függően, drámai morfológiai változásokat vált ki. A TPA-kezelés után az MCF7 sejtek elvesztik jól meghatározott alakjukat, lekerekednek és szétterülnek. A TPA-kezelés, dózisától függően, a nem-kezeit sejtekhez viszonyítva sejtszám-csökkenést és sejttérfogat-növekedést okoz.

• · ·

- 83 Az MCF-7 sejtek szérummentes, kondicionált táptalaja nem tartalmaz kimutatható mennyiségben az A431 sejtek növekedését gátló hatóanyagot. A két-három napon át TPA-val kezelt MCF-7 sejtek szérummentes felülúszó ja azonban gátolja az A431 jelű, epidermisz-szerű karcinómasejtek osztódását. A sejtosztódás-gátló aktivitás legelőnyösebben 25 - 100 ng/ml TPA-val indukálható. A TPA-val kezelt MCF-7 sejtek szérummentes táptalajban még a TPA eltávolítása után is legalább nyolc napig kiválasztják ezt a hatóanyagot. Habár a növekedésgátló aktivitás a TPA eltávolítása után az eltelt idővel arányosan csökken, a fenti eredmények arra utalnak, hogy az amfiregulin indukálódik, vagy legalábbis erőteljesebben fejeződik ki a TPA-val kezelt MCF-7 sejtekben.

1.7.2. Az amfiregulin jellemzői

Az I. táblázatban különböző fizikai, kémiai és enzimatikus kezeléseknek az amfiregulin sejtosztódást gátló aktivitására gyakorolt hatását mutatjuk be. Az amfiregulin sejtnövekedés-gátlási aktivitása változatlan marad 1 mól koncentrációjú ecetsav-, 1 mól koncentrációjú ammónium-hidroxid-, 6 mól koncentrációjú urea-, 0,01 mól koncentrációjú nátrium-metaperjodát oldatokkal végzett kezelések;' 30 percen át 5ó°C hőmérsékleten végzett hőkezelés; neuraminidáz, N-glükanáz, ·· ···· ···· ···· • · · · · · · • · ··· · ··· • · · · · ···· ·*·· ··♦ · ···

- 84 O-glükanáz, lipáz, foszfolipáz A2, -C vagy -D enzimekkel végzett kezelések után is. Az amfiregulin azonban a 10 percen át 100°C hőmérsékleten végzett hőkezelésre; a redukálásra; a redukálásra és a 4-vinil-piridin kezelésre; valamint a proteináz enzimekkel, igy a tripszinnel, a Lys-C-endopeptidázzal, az Arg-endopeptidázzal és a Glu-endopeptidázzal (V-8) végzett kezelésekre érzékenynek bizonyul. Ezek azferedmények arra utalnak, hogy az amfiregulin-molekulában a biológiai aktivitás szempontjából nélkülözhetetlen diszulfidhid-kötés(ek) találhatók. Az amfiregulin-fehérjéhez kapcsolódhatnak oligoszacharid- és/vagy lipid-oldalláncok, ezek jelenléte azonban nem feltétele a biológiai aktivitásnak.

II. TÁBLÁZAT

Különböző kezelések hatása az amfiregulin növekedés-gátlási aktivitására

Kezelés

Aktivitás a kontroll $-ában mólos ecetsav-oldat, 2 órán át, 4°G hőmérsékleten mólos ammónium-hidroxid-oldat, 2 órán át, 4°C hőmérsékleten

56°C hőmérséklet, 30 percen át

100°C hőmérséklet, 10 percen át mólos urea-oldat, 2 órán át, 25°C hőmérsékleten

0,2 mólos 2-merkapto-etanol-oldat,

2,5 órán át, 25°C hőmérsékleten

2-merkapto-etanol (2,5 órán át, 25°C hőmérsékleten) + 4-vinil-piridin (2 órán át, 25°C hőmérsékleten)

0,01 mólos nátrium-metaperjodát-oldat, órán át, 4°C hőmérsékleten, sötétben TPCK-tripszin, 6 órán át, 37°C hőmérsékleten

TPCK-tripszin + szójabab-tripszin-inhibitor, 6 órán át, 37°C hőmérsékleten szójabab tripszin-inhibitor, 6 órán át, 37°C hőmérsékleten

102

109

II. TÁBLÁZAT (folytatás)

Lys-C-endopeptidáz, 20 órán át,

25°C hőmérsékleten5

Arg-endopeptidáz, 16 órán át,

37°C hőmérsékleten4

Glu-endopeptidáz, 16 órán át,

37°C hőmérsékleten6 neuraminidáz, 16 órán át, 37°C hőmérsékleten103

N-glükanáz, 16 órán át, 37°C hőmérsékleten90

0-glükanáz, 16 órán át, 37°C hőmérsékleten102 neuraminidáz + N-glükanáz, 16 órán át,

37°C hőmérsékleten94 neuraminidáz + 0-glukanáz, 16 órán át,

37°C hőmérsékleten105 foszfolipáz-A2, 6 órán át, 37°C hőmérsékleten82 foszfolipáz-C, 6 órán át, 37°C hőmérsékleten95 foszfolipáz-D, 6 órán át, 37°C hőmérsékleten80 lipáz, 6 órán át, 37°C hőmérsékleten111 « · « · · ···· ···« · · · · · · ·

- 87 1.7.3·' Az amfiregulin tisztítása

Az amfiregulin tisztítására szolgáló eljárást a III. táblázatban foglaljuk össze. A TSK 250-1 oszlopról nyert frakcióban 1,842-szeres tisztítást érünk el 5,1 $-os kitermeléssel, mig a TSK 250-11 oszlopról nyert frakcióban 2,270-szeres tisztítást kapunk 1,7 $-os kitermeléssel. Az eljárás reprodukálható; az elvégzett négy független kísérletben hasonló eredményeket érünk el az amfiregulin tisztítása során. A tisztított amfiregulin specifikus aktivitása a 2,7 - 3,4 x x 10^ egység/mg fehérje értéktartományba esik. Szerkezet-meghatározásra és más, biokémiai vizsgálatokra a TSK 250-1 oszlopról származó, 3,0 x 10θ egység/mg fehérje specifikus aktivitású tisztított amfiregulint használunk fel.

• ·

- 88 III. TÁBLÁZAT

Az amfiregulin tisztítására szolgáló eljárás összefoglalása ι

Φ	'CO
!h	-P	-P	14
HO	r4	vi	o
'Φ	'CO	-P	44
οι	8	N
		W	•ri
w	O	•H	ra
	fl	-P

ι φ P ri ra ό r-Η

Φ

S

φ
S	ra	•
Λ4	'co		no
•ri	•P	HŰ	8
44	•ri	'Φ
•H	>	CQ m
O	•ri	>>	1
Φ	•P	Hű	o
&	14	Φ	Ή
CQ	cd		•

Ό		cn
r4		1
P	H4	o
'CO	*H
no	Q
Ö2	'CO	•
ό	-P
	•ri	no
Φ	>	ό
14	•ri	w
Φ	•P	t>>
!>	14	no
:o	cd	φ

+» c3 tű o

Fi 'Φ EH r—!

Ό •ri

O CÖ Fi ή

CM

O

t-

-7·

cn

m

co

o

1

·*

A

•K

a

*

·*

-d·

CM

CM

co

CO

CM

in

CM

co

o

1

CO

ch

KO

cn

t-

•3·

CM

KO

t-

vd

CM

r4

v4

CO

m

CTl

CH

CM

1

•

♦

*

•

•

vd

v1

v4

vd

CM

1

!

ül

•ri

t-

1

cd

'co

í>>

M

o

vd

t-

-d·

vd

vd

kO

t-

-P

no

o

e.

•k

Λ

•X

λ

•t

·»

1

nd

•ri

o

tq

vd

O-

κο

cn

cn

CM

vd

vd

r4

>

Λ4

φ

CM

1

'Φ

•ri

'd

•P

I

1

14

N

T4

«

cd

O

Ό

1

v4

•ri

•ro

1

N

CQ

co

-P

cd

'CO

r-i

CH

co

cn

-3-

cn

vH

σ\

o

cn

cn

in

1

-P

Cn

•H

•ct

KO

co

ví

t-

t-

cn

cn

1

•ri

•s

Λ

Λ

·%

Λ

·*

·*

Λ

Φ

vd

v4

m

KO

vd

KO

m

in

CM

cn

CM

1

•P

CM

CO

cn

o

KO

t-

cn

m

co

Φ

vd

CM

Cn

CM

CM

c—

CM

co

σκ

cn

1

r—i

•

•

•

•

•

N

CM

CM

CM

CM

cn

I

ta

cn

CM

KO

t-

CM

o

kő

o

m

m

CM

cn

1

KO

m

co

cn

cn

m

-7

vd

cn

CM

CM

cn

o

CM

1

o	o	r4	cn	m	CM	cn	m	KO
o	o	CO	cn	cn			CM
kő	o	CM	cn	CM	CM	v4		•
Λ	•X							kO
KO	CM	CM

	in
o	o	CM
o	in	CM
cn	cn

íjtOd	*H vd		1	1	1	H
d tí o	cd o	H	H	H	H	H
Pj n	14	1		1
Φ'£θ	•rí	o				o
P 44	•P p	m				in
Ά ·	•ri M	CM				CM
1	r~4 -ri
r-i Í4	cd tSJ					M
'Φ O	Ö'CO	co				co
44 44	3 44	EH				Eh

• · · · ···· · · · · ···· • · · •·· · ··· • · · •·· · ··«

- 89 1.7.4.' Az amfiregulin (AR) és az S-piridil-etilált amfiregulin (SPE-AR) nagynyomású folyadék-kromatográfiás vizsgálata

Az amfiregulin, illetve az S-piridil-etilált amfiregulin TSK 250 oszlopon 7,5 x 600 mm, Bio-Rad) végzett gélszürési kromatográfiásának eredményét mutatjuk be sorrendben az 5/A. illetve az 5/B. ábrákon. Az aktivitás a fehérje-csúccsal együtt eluálható. Az

5. ábrán vázolt adatok alapján az amfiregulin, illetve az S-piridil-etilált amfiregulin molekulatömege sorrendben 14.000, illetve 17.000 daltonnak adódik. Az amfiregulin, illetve az amfiregulin rövidebb alakjának aminosav-sorrendje (az amfiregulin, illetve az amfiregulih rövidebb alakjának aminosav-sorrendjét a 12. ábrán mutatjuk be) alapján kiszámított molekulatömeg-értékek 9.100, illetve 8.500 dalton.

Az amfiregulin és az S-piridil-etilált amfiregulin az ultrapórusos, fordított fázisú RPSC 03 nagynyomású folyadék-kromatográfiás oszlopról (4,6 x 75 mm, Altex) szimmetrikus, élesen elkülönülő csúcsokként eluálódnak (lásd a 6/A. és a 6/B. ábrát). A növekedésgátlás! aktivitás a fehérje-csúccsal együtt eluálható (6/A. ábra). Az S-piridil-etilált amfiregulin 21 % acetonitril-koncentráció mellett eluálódik: ez az érték • · · · mintegy 4 $-kal meghaladja a kezeletlen fehérje eladójakor mért acetonitril-koncentrációt. A fenti eredmények arra utalnak, hogy az amfiregulin molekulájában több cisztein található: a oiszteineket 4-vinil-piridinnel módosítva az amfiregulin hidrofóbabbá válik, következésképpen magasabb acetonitril-koncentráció mellett eluálható.

1.7*5. Az amfiregulin nátrium-dodecil-szulfát jelenlétében, poliakril-amid-gél-elektroforezissel történő vizsgálata

Az amfiregulin, az N-glükanázzal kezelt amfiregulin (NG-AR); az S-piridil-etilált amfiregulin (SPE-AR); és az N-glukanázzal kezelt S-piridil-etilált amfiregulin (NG-SPE-AR) redukáló közegben, 15 $-os akrilamid-gélben végzett elektroforetikus vizsgálatának eredményét mutatjuk be a 7/A. ábrán. Az amfiregulin és az S-piridil-etilált amfiregulin egyetlen széles, elmosódott sáv formájában, a 20.000 - 25.000-ig terjedő molekulatömeg-tartományban, 22.500 közepes molekulatömeggel jellemezhetően vándorol a gélben. Az amfiregulin és az S-piridil-etilált amfiregulin N-glükanázos kezelése megnöveli e fehérjék futási sebességét. Az N-glükanázzal kezelt amfiregulin és az ···

- 91 N-glükanázzal kezelt S-piridil-etilált amfiregulin egyetlen sávként, sorrendben 14.000 illetve 14.500 dalton közepes molekulatömeggel jellemezhetően vándorol a gélben. A fehérjéket 15 $-os gélben, nem-redukáló közegben elektroforetizálva hasonló eredmények adódnak. Az amfiregulin neuraminidázzal, O-glükanázzal vagy neuraminidázzal és O-glükanázzal együttesen végzett kezelése sem redukáló, sem nem-redukáló körülmények között nem változtatja meg az amfiregulin elektroforetikus mobilitását. Az amfiregulin tehát egyszálu, az in vitro növekecLésgátlási aktivitás szempontjából nem feltétlenül szükséges N-hez kapcsolódó oligoszacharid lánco(ka)t tartalmazó glikoprotein.

Az N-glükanázzal kezelt amfiregulint, illetve az amfiregulint (káposztából származó) foszfolipáz-D (PLD) enzimmel kezelve a növekedésgátlási aktivitás a kontrolihoz képest 20 $-kal csökken. Fordított fázisú, nagynyomású folyadék-kromatográfiával, 03 oszlopon tisztítjuk a foszfolipáz-D-vel kezelt N-glükanázzal kezelt amfiregulint, és az aktív csúcsokat 20 $ nátrium-dodecil-szulfátot tartalmazó poliakril-amid gélben, elektroforezissel vizsgáljuk (7/B. ábra):: egyetlen, 5.600 dalton molekulatömeggel jellemezhető fehérjesávot kapunk. Arra következtetünk, hogy a foszfolipáz-D, vagy valamely más, a foszfolipáz-D preparátumban szennyezésként jelenlevő proteáz az amfiregulint aktív fragmens(ek)ké alakítja át.

1.7.6. Az amfiregulin izoelektromos fókuszálással (IEF) történő vizsgálata

A 125-ös tömegszámú jódizotóppal jelölt amfiregulin izoelektromos fókuszálását az 1. példa 1.2. pontjában leírtak szerint eljárva végezzük. Az amfiregulin egyetlen, 7,6 és 8 közötti P^-értékkel jellemezhető, széles sávba fókuszálható (lásd a 8. ábrát). Az N-glükanázzal kezelt amfiregulin egyetlen, 8,05 Pj-értékü sávba fókuszálható. Az amfiregulin tehát N-hez kapcsolódó oligoszacharid-láncokat hordozó, bázikus, egyszálu glikoprotein.

1.7.7. Az amfiregulin biológiai tulajdonságai

A tisztított amfiregulin különböző koncentrációinak a 125-ös tömegszámú jódizotóppal jelölt jód-dezoxi-uridin A431 sejtek DNS-ébe történő beépülésére gyakorolt gátló hatását mutatjuk be a 9/A. ábrán.

A DNS-szintézis 50 $-os gátlását mintegy 0,2 ng • · • · · · ···· ···· ··· ·

- 93 amfiregulin/mintalyuk értéknél tapasztaljuk. Az A431 emberi epidermális karcinómasejtek DNS-szintézisének 50 $-os gátlását tehát 0,13 nmólos, tiszta fehérjére vonatkoztatott koncentráció mellett érjük el. Figyelembe kell vennünk azonban, hogy az amfiregulin növekedésgátlási aktivitása függ a kísérleti elrendezéstől, igy a mintalyukban levő sejtek számától (a sejtsürüségtől), a hatóanyag alkalmazásának időtartamától, a kezelés hosszától, áj^zérum-koncentrációtól és számos más változótól is.

Ha az A431 sejteket amfiregulin nélkül, illetve az amfiregulin különböző koncentrációi jelenlétében tenyésztjük, és a sejtnövekedést közvetlenül sejtszámlálással követjük, úgy találjuk, hogy az amfiregulin dózis-függő módon gátolja az A431 sejtek osztódását (az adatokat itt nem közöljük). A 125-ös tömegszámú jódizotóppal jelzett jód-dezoxi-uridin DNS-be való beépülésének mértéke tehát jól használható a sejtnövekedés mérőszámaként.

A tisztított amfiregulin különböző koncentrációinak a 125-ös tömegszámú jódizotóppal jelölt jód-dezoxi-uridin emberi előbőr fibroblasztok (Sadamoto) DNS-ébe való beépülésére gyakorolt serkentő hatását mutatjuk be a 9/B. ábrán. A 125-ös tömegszámú jódizotóppal jelölt jód-dezoxi-uridin beépülése kétszeresére fokozódik 0,7 ng/ml, azaz 0,05 nmól amfiregulin-koncentráció hatására. Az amfiregulin maximálisan hatszorosára növeli a 125-ös tömegszámú jódizotóppal jelölt jód-dezoxi-uridin beépülését a fenti fibroblaszt-sejtekbe. Az amfiregulin tehát még 5 $ szarvasmarha magzati szérum jelenlétében is növekedési faktorként hat az emberi fibroblasztokra.

Különböző tumoros, illetve nem-tumoros emberi sejtvonalak esetében megvizsgáljuk az amfiregulinnak a 125-ös tömegszámú jódizotóppal jelölt jód-dezoxi-uridin beépülésére gyakorolt hatását. A vizsgálat eredményeit a IV. táblázatban mutatjuk be. Az amfiregulin gátolja az A431 sejtek, a HTB132 jelű, emberi emlőkarcinóma-sejtek, a HTB1575 jelű, emberi petefészek-teratokarcinóma-sejtek, a CRL155 jelű, emberi epidermális méhnyakkarcinóma-sejtek, a HTB75 jelű, emberi petefészekszemölcsből származó adenómasejtek, valamint a HTB jelű, emberi emlő-adenokaroinómasejtek különféle klánjainak növekedését. Számos sejttípusra az amfiregulin semmiféle lényeges hatást nem gyakorol. Serkenti viszont az amfiregulin a 125-ös tömegszámú jódizotóppal jelölt jód-dezoxi-uridin beépülését néhány emberi fibroblaszt-sejtvonal, a CRL738Ó jelű, emberi agyalapi mirigy-tumorsejtek, a HTB77 jelű, •· ·· ···· ♦ ··· ···· • · · · · · · · ··· · ··· • · · · · ···· ···· ··· · ♦·· emberi petefészek-adenokarcinóma-sejtek, a BSC1 jelű, afrikai zöldmajom vesesejtek, valamint az SA6 jelű, patkány vesesejtek esetében. Az amfiregulin nem befolyásolja lényeges mértékben a T, a B, illetve az endotéliális sejtek osztódását. Az amfiregulin nem gátolja az emberi proliferativ illetve citotoxikus T-sejtek válaszreakcióit kevert leukocita-tenyészetekben (MLC).

Az amfiregulin monomer fehérje; aktivitásának megőrzéséhez a láncon belül kialakuló diszulfidhid-kötések igen, a glikoziláció azonban nem szükséges. Mérsékelt savas illetve lúgos kezelések, továbbá a 30 percen át 5ó°C hőmérsékleten végzett hőkezelés során stabilnak bizonyul. Az amfiregulin teljesen elveszti biológiai aktivitását a redukálás, az 5 percen át 100°C hőmérsékleten végzett hőkezelés, a tripszinnel, Lys-C-endopeptidázzal, Arg-endopeptidázzal illetve Glu-endopeptidázzal végzett emésztések eredményeként· • · ···· ··«· « · · · · • · · · · • · • •·· · ♦ · β · ··

- 96 IV. TÁBLÁZAT

Az amfiregulin'hatása a sejt oszt <5cLásra^a)

	CQ 'CO •P
1	•rl
rt
Φ	•rí	O
CQ	P	z—»
CQ	tó	to
'Φ	cJ	'Φ
tó		CQ
Φ	•rí	í>s
tó	CQ	t»0
Φ	'Φ	Φ
>	P	'—*
:o	S
irt	Φ
	tó
	CQ
1	'CŰ
•P	-p z-S
'CQ	•H<ű
tíű	>
CQ	•rí	fcO
'Φ	-P	'Φ
tó	tó	CQ
Φ	Gj
tó		feO
Φ		Φ
>	•rí
:o	CQ
irt	'CQ
	r—1

• · ·

PAP ® ♦ · írt Ért

m	o	CO	σ\
CM	•3-	CM	vH
v4	CM

P irt

p irt

-P •Γ3

Φ

CQ rt O

P 'co •rl tó rt

H cd

rí

s

CQ

o

cd

8

cd

p

Ό

:rt

O

-P

S

Ό

s

rt

rt

rí

rt

Ό

rt

Ό

•rí

φ

:o

rt

rt

•rí

rt

O

N

S

Φ

•H

O

•a

rt

Í4

CQ

Φ

P

o

rt

o rt

Φ

cő

1

bí

I

rt

Gj

N

tó

N

CQ

tó

cd

tó

8

CQ

o

CQ

1

Φ

tó

O

tó

l

£4

•rí

tó

N

o

rt

o

N

Φ

s

Φ

CQ

ö

φ

rt

CQ

tó

rt

N

'Φ

φ

tó

φ

•rí

CtJ

φ

CQ

A

tó

cd

cd

tó

S

1

tó

Ό

Φ

rt

S

I

aj

H

Ό

•rí

P

I

Ό

Ό

1

Φ

rí

P<

Φ

Φ

*o

rt

rí

tó

s

Φ

rt

-P

tó

rí

8

s

rí

•rí

Φ

S

Φ

8

rí

Φ

g

PU

•rí

Ό

P

•rí

Φ

Φ

Φ

Φ

•rí

rt

rt

rt

s

•rí

rt

φ

•H

•rí

Φ

•rí

rt

•rí

•rí

Φ

A

o

rt

tó

rt

•rl

φ

rt

Fi

cd

£

S

rt

Φ

8

Φ

rt

P

Φ

Φ

8

φ

8 tó

tó

φ

tó

Φ

8

p

P

8

Φ

B

rt

B

tó

Φ

s

Ό

•t

1

Φ

S

Φ

8

Φ

Φ

rt

o

tó

cd

CM

Ό

Φ

•H

CM

m

ro

•t

g

t-

rt

o

O

en

m

m

Ό

m

•H

CD

·,

en

ο-

rí

rt

Ή

tó

yí

r-

rt

Ή

O

CM

in

in

ι

cn

tó

pq

A

w

Φ

pq

rt

pq

ír-

ir-

tó

-3·

E4

írt

'Φ

Eí

tó

Eí

rt

Eí

en

tó

ö

<ί

l

w

O

S

M

cd

K

tó

M

<

CrM

g

• · ·

IV. TÁBLÁZAT (folytatás)

•	•	•	•	•	•	•
fi	fi	Q	fi	fii	fi	fi	m	m
•	•	»		•	•	•	C\)	CM
fi	fi		fi	fi	fi	fi		CM

o t•·

Ofi •· fifi •· fifi •· fifi fi

d g Ό Ö

d

fi φ fi •ro

•H

d

d

•rl

g

φ

Ph

g

d

g

O

Ό

ül

φ

Ό

g

Ό

P

Ö

1

fi

I

Ö

Ό

Cu

•H

EH

g

Φ

•H

Ö

•H

fi

O

Φ

bű

O

•H

o

O

Pj

ό

Ph

O

fi

fi

p

S

cd

•d

fi

HŰ

3

Ph

O

o

{Π

Φ

fi

•rl

H

fi

d

fi

fi

fi

«d

1

O

'd

CQ

fi

N

N

o

d

r-1

fi

g

•rl

fi

o

ül

Ül

ö

1

'Φ

N

Ph

ifi

d

Pl

d

d

Φ

d

fi

CQ

o

'CO

r*J

φ

fi

fi

fi

w

d

fi

ö

ö

«d

fi

fi

d

d

d

rH

N

fi

d

o

o

1

fi

fi

fi

Ώ

Φ

'Φ

1

Ph

Ph

10

N

di

o

tí

«d

g

fi

fi

fi

«d

ra

d

d

•rl

φ

•H

•rl

:d

o

t>

E

Ph

P<

•rl

n

fi

fi

+3

Ph

•rl

fi

Φ

Ph

Ül

1

1

fi

•rl

H

φ

'Φ

Ph

Ph

•rl

Ph

tfi

•rl

fi

fi

*o

*o

Ph

•rl

φ

•rl

d

Ph

g

Φ

fi

fi

Φ

Ph

fi

Ph

Q

φ

Φ

fi

*o

*o

fi

Φ

g

Φ

ro

fi

cö

Φ

fi

o

r—1

g

fi

o

fi

d

fi

g

g

r»

fii

φ

fi

Φ

Φ

g

g

Ph

Φ

Φ

KO

-3-

o

Φ

•t

Φ

•rí

fi

á

cn

·*

•rl

tí

•rl

·»

t—

>

•ra

•A

m

t-

Ph

d

Ph

σι

-3·

Φ

CM

o

t-

φ

>d

Φ

cn

cn

g

ül

fi

H

fi

pq

fi

d

fi

in

o

cn

fi

W

1

Φ

cn

fti

EH

g

ω

g

<1

fi

fi

O

fi

ffl

fi

rM

o

fi

Φ

Φ

(Goodwill)

IV. TÁBLÁZAT (folytatás)

ül

41

Tj

t

'CO

41

P3

tí

•ro

tí

P

tí

to

1

tí

tí

Φ

I

•rl

s

o

•rl

r4

g

41

r-

rH

34

34

'CO

fi

1

•rl

'CO

to

·*

Φ

P

áj

Φ

CQ

P

ül

•

•

1

41

tí

fi

N

'CO

ül

P)

Q

in

in

aJ

Φ

tű

'Φ

•rl

ül

'Φ

<»

•

KO

1

Pj

tí

CQ

'to

tíJ

ϊξ;

&

•rl

tSJ

:o

P

Φ

I

ül

ül

Λ4

fi

P

aj

41

'co

3

ö

:o

CQ

34

Φ

I

Hl

N

:3

tSJ

'CO

>

P

CQ

P

CQ

P

Ό

:o

•

•

1

'CO

rH

•rl

P

•rl

H

tí

Q

Q

tű

Φ

t4

:o

tű

O

•

•

í

CQ

H

CQ

•rl

CQ

aJ

&

'(D

'CD

tí

34

'CO

1

ni

tí

φ

>>

φ

Φ

CO

32

P

H

1

41

32

P

Ül

cd

O

P

Φ

•rs

h

'CD

34

H

Φ

1

ί>

aJ

O

P<

Φ

H

:o

rH

ül

'CD

tí

32

H

1

£

aj

H

φ

•rl

1

P

•rl

32

P

'CO

1

-P

pu

CQ

•rl

'CD

CQ

•rl

•H

F-!

'CO

'CO

CQ

P

'CŰ

ül

r—1

l

K(D

P

P

'CO

Φ

tíl

'CO

'CD

s

1

•rl

P

ül

Ό

H

P

J

P

to

•rl

Φ

P

P

o

tí

N

•rl

tű

ISI

'CO

nj

0)

l

Φ

CQ

34

•rl

CQ

CQ

tű

tí

41

ül

4i

Φ

34

tí

o

CQ

CD

0)

φ

l

Φ

P

H

P4

P

'0

P

>

P

tí

tí

•rl

•ro

Hj

t>

•ra

1

1

•ro

Hl

•Γ3

©

P

Φ

Φ

•rl

Φ

8

Φ

tí

•rs

P

oi

41

ta

CQ

o

1

ül

X

aJ

tí

•Γ3

Φ

CQ

•ts

H

•H

Φ

41

Ό

ej

I

rH

o

tí

g

01

Ό

:o

•

•rl

rH

s

m

in

P

•rí

tí

P

P

'CO

'S

1

•d·

OJ

Pt

tí

tí

O

ül

aj

CQ

rH

'CO

•ri

Φ

41

aJ

'co

N

O

:o

1

-P

P

H

tíJ

tí

P

tű

tű

N

φ

Ö

1

tí

tí

fi

41

•rl

tí

'£0

Ώ

I

tű

•ÍH

P

tű

•rn

«H

tí

!>

S

fi

•rl

φ

'CD

H

N

Φ

•n

•rl

CQ

tí

!>

1

CQ

tí

ül

fi

tí

P

P

aJ

tí

41

pj

r*i

tű

Φ

•rl

•

•rl

41

34

41

•rl

jg

1

to

Φ

P

tí

Λ4

s

aj

fi

41

fi

'CO

Φ

fi

gs

O

S

'CO

g

CD

•h

«Η

41

1

•rl

Tj

CJ

•ro

•rs

N

•rl

g

P

CT

tí

P

m

CH

•ra

H

fi

ül

01

Dl

•Γ3

EH

tí

1

OJ

g

tí

N

tí

'CD

•rl

'CD

aJ

Φ

cn

λ

P<

•H

CO

g

aj

tű

41

P

!>

CQ

vi

1

rQ

1

Λ

11

d

<a

rH

o

kO

1

•H

aJ

C/2

<4

z—s

w

H

W

ffl

CQ

1

aj

·· ·· ···· ···· ···· • · · · · · · • · ··· · ··· • · · · · ··········· · · · ·

···· ···· ··· • · ·

IV. TÁBLÁZAT (folytatás)

b) = Egy egységnyi növekedésgátlási aktivitás alatt azt a hatóanyag-mennyiséget értjük, amely 50 $-ban gátolja a 125-ös tömegszámú jódizotóppal jelzett jód-dezoxi-uridin beépülését a sejtekbe· ^c) = Egy egységnyi növekedésserkentési aktivitás a hatóanyag-mennyiséget értjük, amely alatt azt szükséges ahhoz, hogy a 125-ös tömegszámú jódizotóppal való beépülése 100 $-kal megnövekedjen jelzett jód-dezoxi-uridin sejtekbe

N.D = Nem mérhető • · • · « · · · ···· ···· • · · · · • ··· · · · · • · · · ······· · ···

100

Megvizsgáljuk az amfiregulin és az EGF TGF-B jelenlétében, illetve anélkül jelentkező, az NRK-SAő sejtek lágyagarban történő telepképzésére gyakorolt hatását. Az eredményeket az V. táblázatban foglaljuk öszsze. Az EGE TGF-β jelenlétében, dózisától függően serkenti az SAó sejtek lehorgonyzástól független növekedését, mig az amfiregulin csak igen gyangén serkenti az SA6 sejtek telepképzését a lágyagarban (V. táblázat).

V. TÁBLÁZAT

Az amfiregulin és az EGE NRK-SA6 sejtek lágyagarban való telepképzésére gyakorolt hatása

Hatóanyag Telepszám hat mezőben (ml-enként)

nincs	0
TGF-β (1 ng)	0
AR (2 ng)	0
AR (4 ng)	0
AR (2 ng) + TGF-β (1 ng)	7
AR (4 ng) + TGF-β (1 ng)	8
EGE (2 ng)	0
EGF (4 ng)	6
EGF (2 ng) + TGF-β (1 ng)	30
EGF (4 ng) + TGF-β (1 ng)	114

A vizsgálatokat az 1. példa 1.1.5. pontjában leírtak szerint eljárva végezzük.

- 101 Telepnek tekintjük a legalább hat sejtből álló sejtcsoportokat.

1·7.8· Az amfiregulin hatása az EGF-nak a specifikus

EGF-receptorhoz való kötődésére

Az amfiregulin gátolja a 125-ös tömegszámú jódizotóppal jelölt EGF kötődését az A431 sejtekhez, illetve az A431 plazmamembránokhoz (10. ábra). A 125-ös tömegszámú jódizotóppal jelzett EGF rögzített sejtekhez illetve membránokhoz való kötődésének 50 #-os gátlása sorrendben 1,1 nmól illetve 1,8 nmól EGF-ral érhető el, mig az EGF sejtekhez.illetve membránokhoz való kötődésének 50 $-os csökkenését 1,8 nmól illetve 5,7 nmól amfiregulin váltja ki. A jelzetlen EGF nagyobb koncentrációban mindkét rendszerben teljes mértékben meggátolja a 125-ös tömegszámú jódizotóppal jelölt EGF és a receptor kapcsolódását. Az amfiregulin azonban legfeljebb 75 #-ban illetve 50 %-ban gátolja a sejtekhez illetve a membránokhoz való kötődést. Az amfiregulin kompetíciós görbéje szintén nem párhuzamos az EGF görbéjével. Ezek az eredmények arra utalnak, hogy az amfiregulin affinitása kisebb az EGF-receptor iránt, mint az EGF affinitása. Az amfiregulin specifikus receptora azonban szoros hasonlóságot mutat az EGF receptorral.

102

Az amfiregulin gátló hatására különböző mértékben érzékeny A431 sejtklónokat választunk ki: az amfiregulin-érzékenyeég és az EGF-receptorok sejtenként! száma, vagy a Kp-érték között nem találunk öszszefüggést (lásd, a VI. táblázatot).

VI. TÁBLÁZAT

A különböző A431 kiónok amfiregulin-érzékenysége, és az EGF-receptoruk Kp-értéke közötti összefüggés hiánya

A431 klón	EGF-kötési paraméterek	Relatív amfiregulin érzékenység (növekedésgátlási aktivitás)
Sejtenként! kötőhely-szám	KD (NM)
A-3	4,6 x 10^	1,80	34
F-8	9,0 x 105	3,13	20
A-2	5,1 x 105	1,38	11
A-8	5,3 x 105	3,18	1

Az A431 sejtvonal különböző kiónjait a lágyagarban való növekedés alapján választjuk ki. Az EGF-kötési vizsgálatot az 1.1.5. pontjában leírtak szerint eljárva végezzük. A Kp-értéket illetve a kötőhelyek számát a Scatchard-összefüggés alapján [Scatchard és munkatársai, Ann.N.Y.Acad.Sci., 51, 660 - 672. (1949)] számítjuk ki.

···· ···· ···· ··· *··· ····

- 103 1.7.9; Az amfiregulin kémiai szerkezete

Az amfiregulin aminosav-sorrendjét az S-piridil-etilált fehérje (SPE-AR), valamint a Lys-C- és a Staphylococcus aureus V8-endoproteinázzal, illetve az Arg-endopeptidázzal előállított fragmensek mikroszekvencia-analizisével határozzuk meg. A rövidebb amfiregulin-változat, valamint a hat további aminosavat tartalmazó amfiregulin aminosav-sorrendje a következő: a rövidebb amfiregulin-változat:

1			10		20
V V	K	P P Q N	K T E S	E N T S D	K P K R	K	KKGGKNGK
30				40			50
N R	R	N R K K	K N P C	N A E F	Q N F C I	H	G E C K Y I
		60		70		78
E H	L	E A V 1	T C K 0 Q	Q E Y F	G E R C G	E	K

a hosszabb amfiregulin-változat:

10 20

S V

R

V

E Q

V

V

K

P

P Q N

K T

E

S

E

N

T S

D K

P K

R

K K K

30

40

50

G G

K

N

G K

N

R

R

N

R K K

K N

P

c

N

A

E F

Q N

F C

I

60

70

80

84

HGECKYIEHLEAVTC KCQQEYFGERCGEK ·· ·· ···· ···· *·· • · · · · · · • · · · · · · · · • · · · ···· «·*· ··♦ · ···

- 104 A fenti szekvenciák felírásakor az egyes aminosavak jelölésére az ismert egybetüs rövidítéseket használjuk. Zárójelbe tesszük azoknak az aminosavaknak a rövidítéseit, melyek azonosítása során kétségek merültek fel. Az ”X” a nem azonosított aminosavakat jelöli. A hosszabb amfiregulin-változat mennyisége a rövidebb amfiregulin-változat mennyiségének mintegy 16 $-át éri el.

Az amfiregulin aminosav-szekvenciáját összehasonlítjuk a National Biomedical Research Foundation adatbankjában (PÍR 13) szereplő valamennyi fehérje aminosav-sorrendjével, továbbá a Bolt Beranek and Newman, Inc., Los Alamos National Laboratory genetikai szekvencia-adatbankjában (50-es számú kiadás), illetve az European Molecular Biology Laboratory DNS-szekvencia-adatbankjában (12-es számú kiadás) fellelhető nukleotid-sorrendeknek megfelelő aminosav-sorrendekkel. Ezek a vizsgálatok bizonyítják, hogy az amfiregulin uj tipusu fehérje, továbbá, hogy az amfiregulin a növekedési faktorok széles értelemben vett EGF-családjába tartozik. Ebbe a fehérjecsaládba tartozik az EGE (egér, emberi, patkány, szarvasmarha, stb., EGE); a TGF-α; a virus-eredetü növekedési faktorok (vakcinia-, myxoilletve a nyúl fibróma-virusok növekedési faktorai);

az emberi plazminogén aktivátor; a szarvasmarha IX véralvadási faktora; az emberi X véralvadási faktor;

• ·

- 105 az LDL-receptor; a szarvasmarha protein-C; az emberi proteoglikán központi fehérje; a Drosophila Notch génjének fehérjeterméke; a C. elegáns lin 12 génjének fehérjeterméke; valamint az S. purpuratus tengeri sün sejt-leszármazási sorra jellemző génjének terméke. Az amfiregulin szerkezetének, illetve a széles értelemben vett EGF-proteincsaládba tartozó fehérjék szerkezetének összehasonlításával kimutatható, hogy akárcsak a széles értelemben vett EGF-proteincsalád többi tagja, az amfiregulin is tartalmazza a fehérjecsaládra oly jellemző hat elengedhetetlen fontosságú ciszteint, az egyes ciszteinek távolsága is konzervatív, továbbá a jellemző, és erősen konzervatív aminosavak közül is néhány megtalálható az amfiregulin fehérjéjében. Nyilvánvaló, hogy az amfiregulin az EGF- illetve TGF-szerü növekedési faktorok családja, valamint az MGFilletve SFGF-szerü növekedési faktorok családja között helyezkedik el, elsősorban az aszparagin aminosav felhasználása tekintetében. így például a 2-es pozícióban (az első cisztein =1) valamennyi TGF és EGF prolint, a VGF glicint, míg az MGF, az SFGF és az amfiregulin aszparagint tartalmaz. Ugyanebben a hurokban, a 7-es pozícióban az EGF-ok és a VGF-ok glicint, a TGF-ok glutamint, míg az MGF, az SFGF és az amfiregulin aszparagint tartalmaz. A harmadik hurokban azonban az « · ·· ··*· *«·« ···· • · · · • ··· · ··* • · · · ··· ··· · ···

- 106 amfiregulinban nem található meg a konzervált β-lemez a 34-es pozícióban (aszparagin az MGF-ban és az SFGF-ban, illetve glicin a proteincsalád valamennyi más tagjában): mindezek helyett glutaminsavat (gyenge β-lemez-képző aminosav) tartalmaz. Az amfiregulin szerkezete lényegesen eltér a harmadik, erősen konzervatív hurokban: ez a receptor-kötést is befolyásolhatja. Az amfiregulinból hiányoznak Az MGF-ban illetve az SFGF-ban a tulajdonképpeni növekedési faktor-strukturában feltehetően glikozilációs helyként szolgáló aszparaginok.

Az amfiregulin N-terminális aminosav-sorrendje bizonyosáértékben hasonló a TGF-ok, a VGF és az MGF N-terminális aminosav-sorrendjéhez: mindegyik több prolint, szerint és treonint tartalmaz, továbbá, akárcsak a TGF-ok és a VGF, lehetséges N-glikozilációs helyeket (valójában egyetlen ilyen helyet), valamint lehetséges O-glikozilációs helyeket hordoz a fenti, szerin-, treonin- és prolin-gazdag régióban. A TGF prekurzorok, illetve a VGF fent említett N-terminális szakasza erősen konzervatív, továbbá erőteljesen glikozilált.

Az amfiregulin, különösen a 8. és a 45. aminosav közötti szakaszán rendkívül hidrofil fehérje(lásd a 2. ábrát). Az amfiregulin hidropátiás görbéje ····

107 kevésáé hasonlít az EGE-fehérjecsalád más tagjainak görbéihez» Az amfiregulin C-terminális részének hidropátiás görbéje sem hasonlít az EGF-fehérjecsalád többi tagjának görbéihez, habár szerkezeti szempontból e szakasz hasonló az EGF-családba tartozó fehérjék megfelelő szakaszaihoz (lásd a 11/B. és a 11/C. ábrát).

1.7.10. Az amfiregulin DNS-hez való specifikus kötődésének vizsgálata

A 125-ös tömegszámú jódizotóppal jelölt amfiregulin cellulózhoz, denaturált DNS-cellulózhoz illetve natív DNS-cellulózhoz való kötődését az 1.6. pontiban leírtak szerint eljárva vizsgáljuk. A 14/A. ábrán bemutatott eredmények azt jelzik, hogy az amfiregulin specifikusan kötődik mind a denaturált, mind a natív DNS-cellulózhoz, nem kötődik azonban a cellulózhoz. A natív DNS-hez való kötődés mértéke 3-4-szerese a denaturált DNS-hez való kötődésnek.

Az amfiregulin azon tulajdonsága,.hogy specifikusan kötődik a DNS-hez, megkülönbözteti az amfiregulint a széles értelemben vett EGF-fehérjecsalád valamennyi más tagjától. Az EGF például nem kötődik a DNS-cellulózhoz (lásd a 14/B. ábrát). A vizsgálatok eredményei alátámasztják azt a feltételezést, hogy az

- 108 amfiregulin 45 aminosavból álló, hidrofil, az EGF-ból illetve az EGF-fehérjecsalád más tagjaiból egyaránt hiányzó N-terminális dóménje a fehérjének a sejtmagba való juttatásában (aholis az amfiregulin kölcsönhatásba lép a DNS-sel) vesz részt.

·· «V··· • * · · · «··· • · ···· ···· ···

- 1092. példa

Az amfiregulin elleni antitestek előállítása

Az alábbi példában ismertetjük az amfiregulin, a szintetikus amfiregulin, valamint az amfiregulin prekurzor ellleni antitestek előállítására szolgáló eljárásokat.

2.1. Az amfiregulin elleni antitestek előállítására szolgáló eljárások

2.1.1. Szilárd fázisú peptidszintézis

Az amfiregulint az 1. példában leírtak szerint eljárva állítjuk elő, illetve tisztítjuk. Az amfiregulin 31 - 50. (No. 279), 71 - 90. (No. 280), 108 - 130. (No. 264), 166 - 184 (No. 259) és 221 - 240. (No. 281) aminosavának megfelelő (az amfiregulin elsődleges szerkezetét a 15. ábrán mutatjuk be) öt peptidet szilárd fázisú peptidszintézissel, egy Applied Biosystems Inc. automata peptidszintetizáló készülékkel, Merrifield módszere [J. Amer. Chem. Soc., 85, 2149. (1963)] szerint eljárva állítjuk elő. A szintézis után a peptideket a gyantahordozóról Tam és munkatársai módszere [J. Amer. Chem. Soc., χ

110

105» 6442. (1988)] szerint eljárva, hidrogén-fluoriddal hasítjuk le.

2.1.2. Az antitestek előállítása

Az érett amfiregulin, valamint a csigák testnedvéből származó hemocianinnal kémiai utón konjugált szintetikus amfiregulin-peptidek elleni, poliklonális antitesteket fiatal, ivarérett New Zealand fehér nyálakban állítjuk elő. A szintetikus peptideket Ishikawa és munkatársai módszere [Immunoassay, 4, 235. (1983)] szerint eljárva konjugáljuk a csigák testnedvéből származó hemocianinnal; azérett amfiregulint konjugálás nélkül alkalmazzuk.

Az amfiregulinból illetve a peptid-konjugátumokból Ribi adjuvánssal (Ribi Immunochem. Research, Inc., Hamilton, MT.) emulziót állítunk elő. Minden nyulat összességében 1 ml-es dózissal immunizálunk:; 0,8 ml-rel intramuszkulárisan, mindkét hátsó lábba kettő helyen, 0,2 ml-rel pedig szubkután, egyetlen ponton. Az érett amfiregulin elleni antiszérum előállítása során az első beoltáshoz 30 /ug, az ezt követő ismételt injekciókhoz pedig 15 /ug érett amfiregulint használtnak fel. A szintetikus amfiregulin-peptidek elleni antiszérum előállításakor az első beoltáshoz 100 /ug, az ezt követő ismételt injekciókhoz ·· ·· ···· ···· ···· • · · · · · · • · ··· · · ·· • · · · · ···· ···· ··· · ···

111 pedig.50 /ug konjugált peptidet használunk. Az antitestek termelését fokozó oltásokat 3-4 hetenként ismételjük, és a beoltást követő 10 - 14. napon veszünk vért a nyulakból.

1.1.3. Immunprecipitálás

Az amfiregulint a klóramin-T módszer [Barridge, Methods Enzymol., 50, 54 - 65. (1978)] szerint eljárva, 125-ös tömegszámú jódizotóppal jelöljük. 10 /ul poliklonális szérumot (vagy annak PBS pufferral készített hígítását), 10 /ul, 125-ös tömegszámú jódizotóppal jelölt amfiregulint (50 ng/ml, specifikus aktivitása 425 müCi//ug) és 30 /ul PBS puffért összekeverünk, és az elegyet LeBier és munkatársai módszere [J. Immunoi., 129, 2287 - 2292. (1982)] szerint eljárva vizsgáljuk.

1.1.4. Radioimmun·? vizsgálat

A poliklonális szérumot 1 : 50 arányban, PBS-pufferral; a 125-ös tömegszámú jódizotóppal jelölt amfiregulin oldatát (1 /ug/ml, specifikus aktivitása 425 /uCi//ug) pedig TNEN/0,1 $ szarvasmarha szérum albumin pufferral (20 mmól Trisz, pH = 7,4;

mmól etilén-diamino-tetraecetsav; 150 mmól nátrium-klorid; 0,05 % Honidét P40, 0,1 $ szarvasmarha szérum albumin) hígítjuk. 10 /ul nem jelölt amfiregulin ·· ·· ···· ···· ···· • · · · · · · « · ··· « · ·· • · · · · ···· ···· ··· · ···

112 oldatot (1 mg/ml), 10 /ul hígított poliklonális szérum-oldatot és a 125-ös tömegszámú jódizotóppal jelzett amfiregulin hígított oldatának 30 /ul-ét összekeverjük, és szobahőmérsékleten, 45 percen át inkubáljuk. Protein-A - sepharose oldatot állítunk elő, az alábbiak szerint: 200 mg szárított protein-A-sepharose-t (Pharmacia) 1,4 ml PBS pufferban rehidratálunk, az igy nyert elegy 80 /ul-ét mossuk, majd 400 /ul-re )

hígítjuk 100 mmól pH = 8,1 vegyhatásu Trisz-t, 150 mmól nátrium-kloridot, 0,5 % Triton XlOO-at, 2 mmól fenil-metil-szulfonil-fluoridot, 1 % aprotinint és 0,5 /ug/ml levpeptint tartalmazó oldattal. Az igy nyert protein-A-oldatból ezután 20 /ul-t mérünk az amfiregulint tartalmazó elegyhez, és további 30 percen át inkubálunk. A sepharose-gyöngyöket ezután kétszer mossuk 500 /ul TNEN/0,1 szarvasmarha szérum albumin oldattal, majd 50 /ul SB pufferban (80 mmól Trisz, pH = 6,8, 3 $ nátrium-dodecil-szulfát, 15 $ glikol, 0,01 $ bróm-fenolkék, 5 $ B-merkapto-etanol) felszuszpendálva 100°C hőmérsékleten, 5 percen át forraljuk. A mintákat centrifugáljuk, és a felüluszók radioaktivitását gamma-számlálóval megmérjük. A fentiek szerint eljárva még 100 pg amfiregulin is kimutatható.

·· ·· ···· ···· ···« • · · · · · · • · ··· · ··· • · β · · ···· ···· ··· · ···

113

2.1.5. Enzimmel kapcsolt immunabszorpciós vizsgálat

Az alábbi, szilárd fázisú, enzimmel kapcsolt mikro-immunabszorpciós (mikro-ÉLISA) vizsgálati eljárás az 1985. május 30-án benyújtott, 740.124 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalomban közölt eljárás módosítása. A Terasaki mikrotitráló lemezeket előkészítjük úgy, hogy minden mintalyukba 5 /ul, különböző koncentrációjú, PBS pufferral hígított, szintetikus arafiregulin-peptidet tartalmazó oldatot mérünk, és az oldatot szobahőmérsékleten, egy éjszaka alatt beszorítjuk. PBS pufferral elkészített 5 $-os /

”Blotto” oldatot mérünk a lemezhez, és szobahőmérsékleten, egy órán át inkubálunk. Ezután a poliklonális antitesteket tartalmazó oldatból (a poliklonális antitest-törzsoldatot 1 $ ”Blotto”-val és 0,05 $ Triton XlOO-zal kiegészített PBS pufferral hígítjuk) 10 /ul-t mérünk minden mintalyukba, szobahőmérsékleten egy órán át inkubálunk, majd PBS pufferral négyszer mossuk a lemezeket. 5 /ul, 1 : 1000 arányban 1 ”Blotto-val és 0,05 $ Triton XlOO-zal kiegészített PBS pufferral hígított, peroxidáz enzimmel konjugált, kecskéből származó, nyúl IgG elleni antitestet (Cappel) tartalmazó oldatot mérünk minden mintalyukba, 1 órán át szobahőmérsékleten inkubálunk, majd PBS pufferral hatszor mossuk a lemezt. 10 /ul, 1 : 20 arányban ·· ·♦·♦♦· ········ • · · · · · · • · ··· · ·*· • · · · · ···· ···· ··· · ···

114 higitőtt MicroEIA Chromogan oldatot (Genetic Systems Corp.) adagolunk, majd 20 és 40 perc után leolvassuk a 492 nm hullámhosszon mért optikai denzitás-értéket a Genetic Systems Micro-EIA” felhasználási útmutatójában leírtak szerint eljárva.

2.1.6. A poliakril-amid gélben elektroforetizált, majd nitrocellulóz szűrőpapírhoz kötött fehérjék immunológiai vizsgálata (We stern biot)

A mintákat 15 $-os poliakril-amid vagy #-os tricin-poliakril-amid gélben elektroforetizáljuk, a Bio-Rad minigél-készülékében. A gélt ezután egy nitrocellulóz szürőpapir-lapra fektetjük, majd a gélt és a szűrőpapírt egy elektroforezis-kazettába helyezzük úgy, hogy a nitrocellulóz szűrőpapír kerüljön a katód oldalára. A fehérjéket 400 mA áramerősség és konstans feszültség mellett, 30 percen át elektroforetizálva átfuttatjuk a szűrőpapírra. A nitrocellulóz szűrőpapírt ezután 2,5 % Blotto-val és 0,2 Honidét P40-nel kiegészített PBS pufferban, egy éjszakán át, 4°C hőmérsékleten áztatjuk.

------------- —.....- --------- --------------------- - --------------- —..... ·· ··—-···· ··♦·♦»·· * · · · · · · • · ··· · ··· • · · · · ···· ···· ··· · ·♦·

- 115 A szűrőpapírt ezután 2,5 $ ”Blotto-val és

0,2 $ Honidét P40-nel kiegészített PBS pufferral (reakciópuffer) hígított antiszérum-oldatban, 90 percen át, szobahőmérsékleten, rázóasztalon inkubáljuk, majd 2,5 % ”Blotto”-val és 0,2 $ Honidét P40-nel kiegészített PBS pufferral, négyszer mossuk (minden mosást 5 percen át végzünk).

2,5 $ ”Blotto”-val és 0,25 % Honidét P40-nel kiegészített PBS pufferral 1 : 500 arányban hígított, alkalikus foszfatázzal konjugált Protein-A-t (Cappel) tartalmazó oldatot mérünk a nitrocellulóz szűrőpapírra, és 60 percen át, szobahőmérsékleten, rázóasztalon inkubálunk. A szűrőpapírt 0,2 Honidét P40-nel kiegészített PBS pufferral, négyszer mossuk (minden mosást 3 percen át végzünk), majd 5 percen át APS pufferban (100 mmól Trisz, pH = 9,5, 100 mmól nátrium-klorid, 5 mmól magnézium-klorid) inkubáljuk. A szűrőpapírt szinreagenssel (40 ml APS puffer, 12 mg 5-bromo-4-kloro-3-indolil-foszfát [Sigma]; 6,8 mg tetrazólium-nitrokék [Sigma]: a szinreagenst közvetlenül a felhasználás előtt készítjük el, és egy 0,2 yum pórusméretű szűrőn átszűrjük) előhívjuk: a hívást vízzel állítjuk le, majd a szűrőpapírt levegőn megszáritjuk — - ------------- ------------- - ............. - --------- ' ·· ·· ···· ········ • · · · · · · • · ··· · ··· • · · ♦ · ···· ···· ··· · ···

- 116 2.2. Az antitestek jellemzése

Az érett amfiregulinnal és a szintetikus amfiregulin-peptietekkel szembeni poliklonális szérumokat rádió-immunprecipitációval, radi oimmun-vizs gálattal, enzimmel kapcsolt immunabszorpciós vizsgálattal, valamint az elektroforetizált, majd szűrőpapírhoz kötött fehérjék immunológiai vizsgálatával (WESTERN biot”) jellemezzük. Az eredményeket a VII. táblázatban mutatjuk be.

•4 ·· 4444 4444 4444

4 4 4 4 4 4

4 4·· 4»·· • ♦ 4 44

4444 4444 444 44··

- 117VII. TÁBLÁZAT

Az amfiregulin, illetve a szintetikus amfiregulin-peptidek elleni antitestek jellemzése

A poliklonális szérum vizsgálatára

Antigén használt módszer

-	RIP	RIA	ELISA	WB
érett AR	l:256a	1:250 (1.100 pb)b	ND	1:250 (1 ng)
259.sz.	peptid	1:256	ND	ND	ND
264.sz.	peptid	1:256	1:250 (1.100 pb)	1:100 (5 ng) /	1:100 (0,1 ng) 1:500 (1 ng)
279.sz.	peptid	ND	ND	1:100 (5 ng)	ND
280.sz.	peptid	ND'	ND	1:100 (5 ng)	ND
281.sz.	peptid	ND	ND	1:100 (5 ng)	. ND

= A szükséges antiszérum-higitás.

= A zárójelben levő számok a módszer érzékenységét jelzik.

···· ···· • · • ··· • · • ··· ·· ♦· ···· • · · · · • · ··· • ♦ · ···· ··♦· ···

118

RIP =-Radio-immunprecipitáció.

RIA = Radioimmun-vizsgálat.

ELISA = Enzimmel kapcsolt immunabszorpciós vizsgálat.

WB = Elektroforetizált, majd nitrocellulóz szűrőpapírhoz kötött fehérjék immunológiai vizsgálata (Western biot).

ND = Nem határozzuk meg.

•4 »·»· ··♦· ♦···

................................ .........................................................-...........................

• 4 · · ·· · · ··· *··· • · · · · 4444 ···· ··· ····

- 1193. példa

Az amfiregulin prekurzor cDNS-klónozása

Az alábbi példában ismertetjük az amfiregulin prekurzort kódoló cDNS-ek TPA-val kezelt, MCP-7 jelű emberi emlőkarcinóma-sejtékből történő klónozását és vizsgálatát.

3.1. Az amfiregulin prekurzort kódoló cDNS-nek klónozására használt eljárások

3.1.1. Az RNS elkülönítése

Az RNS-t T150 szövettenyésztő edényekben tenyésztett, a tenyésztőedény felületét majdnem összefüggően boritó szövettenyészetekből vagy friss, fagyasztott szövetmintákból állítjuk elő Chirgwin guanidiniumos módszere [Biochemistry, 18, 5294. (1979)] szerint eljárva. A négy darab T150 szövettenyésztő edényből összegyűjtött sejteket PBS pufferral mossuk, tripszinnel kezeljük, ujramossuk, majd az üledéket 8 ml 4 mól koncentrációjú guanidinium-izotiocianát-oldatban szuszpendáljuk fel. Az oldatot egy 18-as méretű injekcióstün átpréselve összetörjük a DNS-t.

A mintát egy Beckman SW41TÍ centrifuga-csőben 2,4 ml, 5,7 mól koncentrációjú cézium-klorid-oldatra rétegezzük, majd 20 órán át, 32.000 fordulat/perc fordulat számon, «· ·· ···· ····«··.

• · · · · · · • · ··· · ··· β · · · · ««·· ···· ··· · ···

- 120 20°C Hőmérsékleten centrifugálunk. Az üledéket 300 /ul, 2,5 mól koncentrációjú cézium-klorid-oldatban szuszpendáljuk fel, majd 2 térfogatnyi etanollal, szobahőmérsékleten kicsapjuk. A csapadékot 300 /ul vízben szuszpendáljuk fel, 35 /ul, 3 mól koncentrációjú nátrium-acetát-oldatot (pH = 5,2) és 800 /ul etanolt adagolunk, és az RNS-t -70°G hőmérsékleten kicsapjuk. A kicsapást megismételjük. Az RNS-t végül rövid ideig szárítjuk, 100 /ul vízben felszuszpendáljuk, koncentrációját a 260 nm hullámhosszon mért optikai denzitás-érték alapján meghatározzuk, majd -70°C hőmérsékleten tároljuk.

3.1.2. A DNS jelölése 32-es tömegszámú foszforizotópot tartalmazó timidin-trifoszfáttal, random oligonukleotid-primereket felhasználva

Alacsony olvadáspontu agarózból (Bio-Rad) készült gélből elkülönítjük az amfiregulin kódoló régióját hordozó specifikus DNS-fragmenst, majd 32-es tömegszámú foszforizotópot tartalmazó timidin-trifoszfáttal (NEN, 3000 Ci/mmól), random oligonukleotidokat primerként felhasználva jelöljük, Feinberg módszere [Anal. Biochem., 137, 266. (1983)] szerint eljárva.

• ··· ···

- 121 A be nem épült dezoxi-ribonukleotidokat 1,5 ml-es Sephadex 50 oszlopon kromatografálva távolitjuk el.

Q A specifikus aktivitás a legtöbb esetben 0,5 - 2,5 x 10 cpm//ug.

3.1.3» Az RNS gél-elektroforezise, valamint az elektpofonét izéit, majd szűrőpapírhoz kötött RNS-molekulék hibridizációs vizsgálata (Northern biot”) A sejtek össz-RNS-ének 10 - 20 /ug-ját Northern hibridizációs vizsgálat céljából 1,2 $-os agaróz/formaidehid-gélen elektroforetizáljuk. Az agaróz/formaidehid gélek előállításakor az agarózt 40 mmól koncentrációban pH = 7,0 vegyhatásu, N-morfolin-propán-szulfonsavat, 1 mmól koncentrációban etilén-diamino-tetraecetsavat, 10 mmól koncentrációban nátrium-acetátot és 2 mól koncentrációban ionmentesitett, pH = 5,6 vegyhatásu formaldehidet tartalmazó oldatban szuszpendáljuk, és a gélt egy hütött géltálcáju IBI VCV gél-elektroforezis-kádba öntjük. Az RNS-t a fenti, 50 $ formamiddal kiegészített pufferban, 65°C hőmérsékleten denaturáljuk, majd 1 x IvIOPS pufferban, 20 - 30 mA áramerősség mellett,

3-5 órán át elektroforetizáljuk. A gélt 30 percen át 10 x SSC pufferban mossuk, az RNS-t Hybond-N szűrőpapírra (Amersham) visszük át, majd ultraibolya fénnyel —·· '— ·· ··©· • · · · · · • · ··· · • · · · · ···· ·«<·· ··♦ · ··« ···

- 122 (1200'/u Joules) keresztkötéseket hozunk létre az RNS és a szűrőpapír között, A szűrőpapírhoz kötött RNS-t 5 x SSPE puffért (az 1 x SSPE puffer összetétel a következő: 0,18 mól nátrium-klorid, 10 mmól, pH = 7,7 vegyhatásu nátrium-foszfát, 0,1 mmól etilén-diamino-tetraecetsav), 5 x Denhardt-oldatot, 0,5 $ nátrium-dodecil-szulfátot és hordozóként 20 /ug/ml denaturált heringsperma-DNS-t tartalmazó oldatban előhibridizáljuk, majd hibridizáljuk. A hibridizálást 2 x 10 cpm/ml aktivitású, 32-es tömegszámú foszforizotóppal jelölt ARBP1 DNS-sel, 42°C hőmérsékleten, 16 órán át végezzük. A hibridizálás után a szűrőpapírokat néhányszor 0,1 $ nátrium-dodecil-szulfáttal kiegészített 2 x SSC pufferral, szobahőmérsékleten, majd 0,1 $ nátrium-dodecil-szulfáttal kiegészített 1 x SSC pufferral, 65°C hőmérsékleten mossuk, végül Kodak X-OMAT filmre, Dupont Lightning Plus érzékenységnövelő szűrővel, -70°C hőmérsékleten exponálva lefényképezzük. Az autoradiogramon megjelenő foltokat, erősségük szerint, a következőképpen osztályozzuk: +, ha egy éjszakán át tartó exponálás után világosan látható a jel; +/-, ha három napon át tartó exponálás után látható a jel; végül ++, ha a jel hat órás exponálás után észlelhető.

·· ·· ··«· ···· ···· • · « · · · ·

123

3.1.4.. cDNS klónozás

RNS-izolálás céljából összegyűjtjük a 24, a 40, illetve a 72 órán át 100 /ug/ml koncentrációjú 12-0-tetradekanoil-forbol-13-acetáttal (TPA) kezelt MCP-7 sejteket. E minták egyesített alikvotjaiból poli(A)⁺ RNS-t izolálunk, és ezt kettősszálu cDNS előállítására használjuk, lényegében Gubler és Hoffman módszere [Gene, 25, 263. (1983)] szerint eljárva. A poli(G)-farku cDNS-eket a lambdagtlO DNS-vektor EcoRI hasítási helyére ligáljuk, BR1 oligonukleotid adaptereket felhasználva [Rose és munkatársai, Proo. Natl. Acad. Sci., USA, 8£, 1261 - 1265. (1986)].

Részletesebben, 5 /ug, TPA-val kezelt MCF-7 sejtekből származó poli(A)⁺ RNS-t. hőkezeléssel denaturálunk, 5 /ug oligo-dezoxi-timidin prímért, valamint 100 egység reverz transzkriptáz enzimet mérünk hozzá, és a reakcióelegyet 45 /ul végtérfogatra egészítjük ki. A második szál szintézisét 4 egység RNázH és 115 egység E. coli DNS-polimeráz I enzimmel végezzük. 10 egység T4 DNS-polimerázzal eltávolítjuk a 3* túlnyúló végeket, tompa végű DNS-molekulákat állítva elő. A 6,8 /ug kettősszálu cDNS-t tartalmazó oldat egészét Sephadex G50 oszlopon kromatografáljuk, és elkülönítjük az 500 bázispárnál hosszabb cDNS-molekulákat. Az igy nyert, • · • · · — 124 — • · · · · · · • · • ·♦

500 bázispárnál nagyobb méretű cDNS 150 ng-ját poli(G)-farokkal látjuk el terminális dezoxi-nukleotid.il-transzferáz enzim felhasználásával. A poli(G)-farkú cDNS-eket BR1 adapterek (AATTCCCCCCCCCCCC) segítségével a lambdagtlO DNS-vektor EcoRI helyére ligáljuk. A ligáit DNS-t in vitro pakoljuk [Grosveld és munkatársai, Gene, 12, 227 - 237. (1981)] és a rekombináns fágokkal E. coli C600 rK”mK hfl sejteket fertőzve a sejteket kiszélesztjük. 1 /ug cDNS-re számítva 10 rekombináns e

fágot nyerünk. 2,5 x 10^ rekombinánsról nitrocellulóz szűrőpapírra két-két másolatot készítünk, az N-glükanázzal kezelt, redukált, majd S-piridil-etilált amfiregulin automatikus Edman-féle degradálásával meghatározott amfiregulin-aminosav-sorrend (lásd az 1. példát) alapján levezethető, 32-es tömegszámú foszforizotóppal jelölt, a feltételezett legjobb egyezést biztosító, illetve degenerált oligonukleotid-próbákkal (lásd az alábbi, VIII. táblázatot) hibridizálva vizsgáljuk.

- 125 «'-'Χ tó

Λ4

W

02

Ο

φ

Φ

=Η

fi

rt ’ .

ζ

bj

φ

Ρ

Ν

&

'3

ra

Q

Q

Ο

I

ο

1

m

X

σχ

•Ρ

CM

xr

CM

CM

ιη

ΙΟ

ιη

r-4

ιο

m

•p'ca

ο F4

Fh ο ό rt

S φ

U0

φ

tJ

___-

0

0

0

0 0

0 0

Ö Εη

<

<

-

0

ιη

0

0

0

fa <

tó Επ

fa Εη

ω 0

Εη

— 0

<

0

0

0

0

EH

Ζ Εη

Ο Ο

0 0

Η Εη

Εη

<

0

Ο

<1

0

0

<

Εη

Ο Εη

Εη 0

0 0

Εη 0

0

Επ

<

Εη

'<

0

0

Ο

0

faj

fa <

> <

tó 0

tó Εη

tó 0

-

-

<

0

0

Εη

Eh

η

ιη

ιη

—.

0

<

0

0

0

X Εη

Εη

Η Εη

< 0

Μ Εη

Q Εη

tó

tn

— <

—

0

0

-

0

0

0

EH

EH

tó

Εη

υ

Εη

υ

<

ιη

0

0

0

0

Μ Ε<

Η

Εη

< 0

Μ Εη

Η Εη

0 Ο

ο εη

fa

0

•

•Η Ο

Ο

υ

0

— Εη

0

0

0

0

Η

S

Εη

υ

<

<

0

0

<

0

0

H Η t>

Φ

Ο Η

1-Η

<

2 Εη

0 0

3 <

fa <

fa 0

tó

Eh

> Α4

0

Εη

Εη

<

0

<

0

Eh

Φ

Εη

υ

<

ο

0

0

<

0

0

0

Ν

Οί Εη

X

Εη

0 Ο

Η Επ

Ζ Εη

X Εη

fa 0

Q

Eh

Μ

Ο

<

<

0

0

<

0

0

<

υ

Η

υ

Εη

0

0

0

0

<c

Ο Ο

tó

Εη

fa 0

0 0

Η Εη

Μ Εη

tó Eh

ω

0

<

Εη

0

Ο

0

0

Eh

<

Ε-·

υ

<

ο

0

<

. <

0

0 .

0

tó Η

υ

υ

Ζ Εη

Ζ Εη

Η <

Ο Εη

> <

Eh

0

Εη

<

Εη

0

Εη

0

0

Eh

<

ο

Εη

υ

0

0

X 0

0

0

0

Ο 0

W

Εη

tó Εη

1—i <

— <

Ο Εη

> <

2

Eh

<

Ο

Εη

Εη

0

0

Eh

ο

m

<η

η

n

I

	'cű	rH	00	Φ -p r-4 N
tó	&		m	•rt
&	Ό	Q ry*	Q	-PrQ,tó
Ό	rt	l-rt -rt	-rt	-P 'CŰ
Fi	P<			φ-ρ,α
PH				N CQ'O
	-P			Φ'Φ ÍH
	r-1			r-4 N PU
	'CÚ			Φ Φ
	rt			-P >»KO
	Φ			'Φ bŰ-P
				ρ Φ-Η
	Φ			t-H <3
	bO			Φ .Q
	Φ			FH^
	n			O
				< -ra

η tó tó

-s* tó §

Ει

Ζ tó • · ♦ · · · · • · ··· · ··« • · · · ···· ···· ··· · ···

126

A pARl DNS-vektor cDNS inszertjében viszonylag kevés restrikciós hasítási hely található: egyetlen hasítási helye van a BsmI, az EcoRV, Hgal, Nael, PvuII, Smal és SstI enzimeknek, az Sspl pedig két helyen hasit. A BamHI, Glal, EcoRI, Hindin, KpnI, PstI, Pvul, Sphl, Stul és Xbal nem hasítja az inszertet. Elkülönítjük, és egymásodik, 100.000 rekombinánst tartalmazó, lényegében a fentiek szerint eljárva előállított cDNS-génbank átvizsgálása során próbaként használjuk a pARl inszertjének 170 bázispár méretű Bsml-PvuII DNS-fragmensét. 13, 300 bázispártól 1,3 kb-ig terjedő méretű inszertet hordozó kiónt találunk homológnak a próbával. 6 klón inszertje nagyobb mint 1 kb; 5 klón inszertjében pedig egy egyszeres SstI hasítási hely található: ez a hasítási hely a pARl inszertjének 5’-végétől 100 bp-nyira helyezkedik el. Az utóbbi öt inszert közül négyet a további restrikciós és nukleotid sorrend-vizsgálatok céljából szubklónozunk (pAR3, pAR5, pAR9, pAR13). E kiónok BsmI, EcoRV, PvuII, SstI.és Smal emésztések alapján meghatározott restrikciós térképe a pAR9 kivételével azonos: ez utóbbi inszertje a 3’-vég felöl mintegy 100 bázispárral rövidebb. A szekvenciában a deléció kezdőpontja előtt 5, egymást követő adenin helyezkedik el; feltételezhetően az oligo(dT) primer ehhez hibridizálva kezdeményezte a DNS-szintézist.

127

3.2. · Az amfiregulint kódoló cDNS-klónok nukleotid sorrendjének vizsgálata

Pontos ólig onukleoticL-primerek felhasználásával meghatározzuk a pARl klón 1230 bp méretű DNS-szakasza mindkét szálának nukleotid-sorrendjét, Sanger és munkatársai didezoxi-szekvenálási módszere [Proo.

Natl. Acad. Sci., USA, 74, 5463 - 5467. (1977)] szerint eljárva. A pARl klón teljes nukleotid-sorrendjét, valamint az abból levezetett aminosav-sorrendet a 16. ábrán mutatjuk be. Az 1-essel jelölt nukleotidnál egy 965 bp méretű, nyitott leolvasási keret (ORF) található. Az első AUG kodon a 210. nukleotidnál található, ám, minthogy a -3~as helyzetben nem egy purin helyezkedik el, ez az AUG kodon nem felel meg a Kozák által leirt optimális, konszenzus transzlációs kezdőpontok követelményeinek [Kozák, Nucleic Acids Research, 12, 857 - 872. (1984); Kozák, Cell, 44, 283,- 292. (1986)]. Az ilyen AUG tripletek is szolgálhatnak azonban transzlációs kezdőpontként, amint azt Kozák a vizsgált gének mintegy 3 #-ánál megfigyelte: igen jelentős lehet továbbá a valamennyi ilyen kevéssé előnyös AUG-kezdőpont előtt és az amfiregulin mRNS-ében is megtalálható -1-es helyzetű adenozin. Habár a 378. nukleotidnál egy második, a konszenzus transzlációs kezdőpont követelményeinek megfelelő

- ·♦ -··♦· -··«· -·»«·_ • · · · · • ··· · ··· • · · · ···· ··· · ···

128 metionin-kocLon található, mégis valószínűleg az első AUG-kodon a valódi transzlációs kezdőpont, minthogy ezt a kezdőpontot az előre jelzett 19, elsősorban hidrofób aminosavakból álló, 3 prolinnal megszakított peptidszakaszt kódoló, jellegzetes szignálpeptid-szekvencia [Heijne, J. Biochem., 133, 17 - 21. (1983)] · követi.

A leghosszabb, metioninnal kezdődő nyitott leolvasási keret egy 252 aminosavból álló, 19 aminosavas szignálpepticL-szakaszt is tartalmazó fehérjét kódol. A kódoló szakaszt 209 nukleotidból álló, 5’ irányban elhelyezkedő, nem-transzlálódó DNS-szakasz előzi meg, továbbá egy TAA transzlációs stop jel, és 262 nukleotidból álló, 3’ irányban elhelyezkedő, nem-transzlálódó DNS-szakasz követi. Egy lehetséges poliadenilációs jelzőszakasz (AATAA) található a 15 egymást követő adeninből álló, valószínűleg a poli(A)-farkot alkotó szekvenciától az átírás irányával ellentétes irányban, 64 nukleotid távolságra. Az amfiregulin 3’ irányban elhelyezkedő, nem-transzlálódó szakaszában megtalálható az ATTTTA szekvencia négy példánya is: ez a szekvencia néhány limfokinben, citokinben és proto-onkogénben is előfordul. A GM-CSF esetében ez a szekvencia felelős az RNS destabilizálásáért,és lebomlásáért [Shaw, Cell, 46, 659 - 667. (1986)]. E szerkezeti rész egy funkció szempontjából hasonló molekulában való fennmaradása arra utal, hogy az amfiregulin ···· ···· • · ··· · ··· • · · · · ···· ···· ··· · ···

- 129 szintén e limfokin-családba tartozhat.

A cDNS nukleotid-sorrendje alapján levezethető aminosav-sorrend azonos az érett amfiregulin-fehérje aminosav-sorrendjével (lásd az 1. példát) a 113. aminosav kivételével (lásd a 15. ábrát): a fehérje aminosav-sorrendjének meghatározásakor ez aszparaginsavnak (D), a cDNS-klón nukleotid-sorrendje alapján pedig aszpapaginnak (AAT = N) adódik. Mind az öt vizsgált cDNS 5’-vége a pARl szekvencia első 25 bázispárjának valamelyikével volt azonosítható.

A cDNS és a várhatóan legjobb egyezést biztositó próbák nukleotid-sorrendjeinek összehasonlításakor az ARK41 jelű próbánál összességében 74 $-os, az ARK31 jelű próbánál pedig összességében 77 $-os homológiát találunk. Egyik próba esetében sem találunk nyolc egymást követő nukleotidnál hosszabb szakaszon homológiát, de a 67 nukleotid hosszúságú, ARK41 jelű próbánál az összesen 50 homológ nukleotid elegendőnek bizonyul az észlelhető jel kialakulásához a nem túl szigorú körülmények között végzett hibridizálás során. Az amfiregulin mRNS kodon használata lényegesen különbözik a Lathe által ismertetett [Lathe, J. Mól. Bioi., 183, 1 -12, (1985)] kodonhasználati gyakoriságoktól; ez magyarázza azt a tényt, hogy a degenerált óligonukleotid-próbákkal erősebb jelet kapunk.

130

A cDNS nukleotid- (16. ábra), illetve a fehérje aminosav-sorrendje (1. példa 1.9. pont) alapján az érett amfiregulin fehérje két változatának molekulatömege 9772 illetve 9173 dalton. Az amfiregulin prekurzor hidropátiás görbéjét a 11/D. ábrán mutatjuk be.

Az amfiregulin prekurzor három lehetséges N-glikozilációs helyet hordoz: egyet az N-terminális vég felöli doménben (a 30-as helyzetben, lásd a 16. ábrát), és kettőt az érett amfiregulin hidrofil részében (a 113-as illetve a 119-es helyzetben). A glikozilálás 10 - 12 kd-nal járul hozzá az érett amfiregulin molekulatömegéhez. A szénhidrátcsoportok a hidrofil dómén egyik, vagy mindkét glikozilációs helyéhez kapcsolódnak.

Az amfiregulin prekurzor N-terminális vég felöli, szeringazdag doménje (lásd a 15. ábrát) a savas jellegű, és a fehérjelánc csavarodását okozó aminosavak jelenléte, valamint a szférikus gátlásért felelős aminosavak hiánya alapján [Huttner, TIBS, 12, 301 - 303. (1987)] három lehetséges tirozin-szulfatálási helyet hordoz az Y⁸¹, Y⁸^ illetve Y⁸^ helyzetben. A legtöbb, szulfátéit tirozint tartalmazó fehérje a szekretált fehérjék közé tartozik. A tirozin-szulfatálás valószínűleg a prekurzor-fehérjék aktiválásában, szállításában

131 vagy proteolitikus utóérésében játszik szerepet. Az amfiregulin szeringazdag dóménje oxigénhez kapcsolt szénhidrát-láncokat is hordozhat, minthogy a molekula ezen részében a fenti kötésű szénhidrát-láncok kapcsolódását lehetővé tevő szerin/treonin aminosavak (a 23-as és a 81-es helyzetben) gyakoriak. Az EGF-fehérjecsalád egy másik tagjának, a TGF-a-nak O-glikozilált alakját Ignotz és munkatársai azonosították [PNAS, 83, 6307 - 6311. (1986)].

Az amfiregulin prekurzor szerinjei közül egyetlen egy sem felel meg a cAMP-függő kináz konszenzus foszforilációs helye követelményeinek [Grima és munkatársai, Proc. Háti. Acad. Sci., USA, 82, 617 - 621. (1985)], továbbá egyetlen, tirozin körül elhelyezkedő szekvencia sem hasonlít a foszforilált tirozinok körüli ismert szakaszokhoz.

Az érett amfiregulin fehérje hidrofil doménjében számos pozitív töltésű aminosav (a 37-ből 16 lizin vagy arginin), sőt két, négy-öt egymást követő, bázikus, töltött aminosavból álló peptidszakasz is található. Az amfiregulin fenti szakaszához igen hasonló az SV40 vírus nagy T antigénjének a sejtmagba való szállításért felelős szakasza: az e szakaszban található kis aminosavak (glicin, alanin, prolin) után ·· ·· ···· ···· ···· • · · · · · · • · · · · · ··· • · · · * ···«······· · · · ·

132 következő, jellegzetes KKKRK szekvencia a-helikális szerkezet kialakulását teszi lehetővé [Burglin és munkatársai, EMBO, 6, 2617 - 2625. (1987), Dingwall és munkatársai, EMBO, 6, 69 - 74. (1987)]. Mutációs vizsgálatokkal megállapítható, hogy az SV40 fehérje sejtmagba való szállításért felelős szakaszának leglényegesebb jellemzője egy négy egymást követő bázikus aminosavból álló szekvencia [Lanford, Gell, 37, 801 - 813· (1984)]. Egymást követő bázikus aminosavakból álló, feltételezhetően a sejtmagba való szállításért felelős hasonló peptidszakaszokkal más sejtmag-fehérjék, igy a nukleoplazmin, a polióma vírus nagy T antigénje, a hisztonok és a c-myc fehérje is rendelkezik. A sejtmagba való szállításért felelős, különböző peptidszakaszokat a csirkéből származó piruvát-kináz, az albumin, az immunoglobulin, a ferritin, és a B-galaktozidáz génekhez kapcsolva a fenti, rendes körülmények között a citoplazmában előforduló fehérjék a sejtmagba szállítódnak [Moreland, Mól. Cell. Bioi., 7, 4048 - 4057. (1987)]. Az még nem bizonyított, hogy az amfiregulin hidrofil szakasza valóban e növekedést befolyásoló fehérje sejtmagba való juttatásában játszik szerepet; azonban az a tény, hogy az amfiregulin specifikusan kötődik a DNS-hez, jelzi, hogy az amfiregulin valamiféle funkcionális szerepet játszik a sejtmagban. így az amfiregulin szabályozhatja a DNS-szintézist, ·· ·· ···· ···· ···· • · · · · · · • · · ·· ···· • · · · · ··*· ···· ··· · ···

133 a sejtciklust, vagy számos más, a sejtmagban lejátszódó folyamatot.

A TGF-α prekurzor C-terminális vég felöli, citoplazmás doménjében számos cisztein található; ezek közül néhányhoz palmitinsav kapcsolódik kovalens módon [Bringman, Cell, 48, 429 - 440. (1987)]. Az amfiregulin _vezzel szemben., prekurzor citoplazmás d ómén jéb'en/egyá Italán nem fordul elő cisztein, igy palmitinsav kapcsolódása sem várható. Habár a palmitinsav-kötődés biológiai szerepét nem ismerjük, a palmitinsav hiánya újabb különbség az amfiregulin és az EGF-fehérjecsalád más tagjai között.

3.3. Különböző sejttípusok amfiregulin-szintézise

Az elektroforetizált, majd szűrőpapírhoz kötött RNS-minták 32-es tömegszámú foszforizotóppal jelölt amfiregulin cDNS-fragmensekkel mint próbával végzett hibridizációs vizsgálata [Northem biot vizsgálat, Thomas, PNAS, 77, 5201. (1980)] során az amfiregulin cDNS-próba egyetlen, 1,4 kb méretű RNS-fajtához hibridizál a különféle normál emberi szövetekből illetve tumoros sejtvonalakból nyert RNS-mintákban. Egyetlen hibridizációs esik látható a Northem biot” vizsgálat során nyert autoradiogramon, akár az AREB1 jelű ···· ·«·· • · · · · · · • · · · · « · · · • · · · · ·♦·· ···· ··· · ···

- 134 (a pARl az érett amfiregulin teljes kódoló részét, valamint az N-terminális prekurzor- és transzmembrán-domének egy részét tartalmazó, 480 bázispár méretű, BstEII- PvuII fragmense), akár az ARI70 jelű (a pARl az érett amfiregulinnak mindössze a C-terminális vég felöli részét tartalmazó, 170 bázispár méretű, BsmI - PvuII fragmense) fragmenst használjuk jelölt próbaként. A IX. táblázatban közölt eredmények szerint az amfiregulin RNS gyengén expresszálódik (+) a felnőtt normál tüdő- és hasnyálmirigy-szöveteiben. Még gyengébb, de még észlelhető (+/-) expressziét tapasztalunk a normál vese-, máj- és agyszövetekben.

·· ·· ···· ···· ····

- 135IX. TÁBLÁZAT

Normál emberi szövet Amfiregulin RNS tüdő+ máj+/hasnyálmirigy ·+ vese+/lép agy+/méhlepény magzati bél ·· ·· ···· ···· ···· • · · · · · ·

136

Minthogy az amfiregulint eredetileg TPA-val kezelt MCF-7 sejtekből különítjük el, érdemesnek tűnik megvizsgálni e sejttípus esetében az amfiregulin RNS TPA-val történő indukciójának időbeli lefolyását.

0, 1, 3, 6, 18, 24 illetve 48 órán át TPA-val kezelünk MCP-7 sejteket, majd elkülönítjük a sejtek össz-RNS-ét. Az igy nyert RNS 10 - 10 /ug-ját 1,2 $-os formaldehid/ agaróz gélben elektroforetizáljuk, majd nylon szűrőpapírra visszük át, végül hibridizáljuk az érett amfiregulin teljes kódoló régiójával szemben komplementer ARBP1 próbával. Az 1,4 kb méretű amfiregulin RNS menynyisége már egy órával a TPA-kezelés után is nagymértékben megnövekszik, maximumát pedig a 18. és a 24. óra között éri el. Az elektroforetizált, majd szűrőpapírhoz kötött RNS-minták 32-es tömegszámú foszforizotóppal jelölt ARBP1 próbával való hibridizálásával kimutatható, hogy az amfiregulin RNS szintézise más emlőrák-sejtvonalak esetében is serkenthető TPA-val, bár az amfiregulin RNS maximális mennyisége nem éri el a TPA-val indukált MCF-7 sejteknél tapasztaltat.

órás TPA-indukciót megelőzően, illetve azt követően megmérjük számos tumoros sejtvonal amfiregulin RNS-koncentrációját. Az eredményeket az alábbi, X. táblázatban foglaljuk össze. Néhány kivételtől

- 137 eltekintve az amfiregulin RNS csak a TPA-val kezelt emberi emlőrák-sejtvonalakban található kimutatható menynyiségben. Az egyik kivétel, a Caki-1 jelű, emberi viztiszta sejtes vesekarcinóma-sejtvonal konstitutív módon, nagy (a TPA-val indukált MCP-7 sejtekkel összemérhető) mennyiségben fejezi ki az amfiregulin RNS-t. A TPA-kezelést túlélő valamennyi emlőrák-sejtvonallal kaphatunk amfiregulin-specifikus hibridizációt.

Az amfiregulin nyilvánvalóan valamiféle funkcionális szerepet tölt be a felnőtt tüdő-, hasnyálmirigy-, vese-, máj- és agyszöveteiben, feltételezhetően a sebgyógyulásban, a szöveti regenerálódásban, a neuronsejtek fenntartásában, illetve számos más, egyéb folyamatban működve közre.

- 138

-Ρ γ4

+ + + + ι

+ + X.

+

Ν •Ρ ι—I 'C0

Λ4 g

α> Α

I II

Α <4

Ν '<4

Α

Α '<

Α

Α

Α

Μ

Ο

Α

Α

Α

		8		•H					q
		Ό							aj
		Ő		tíO					A
		•H	aJ	ai				r-4
		O	8					Ό	Q
		fi	Ό	Λ				A	Φ
cö		aj	Ö	ai		aj		•rl	-P
8		A	•H	8		8		aj	•t~3
Ό		1	O	Ό		Ό		A	Φ
Ö		aj	fi	Ö		fi		>>	02
•ri		£	aj	•H		•rl		A ai
O		fi	A	O		O	aJ	o S	aj
fi		o	1	fi		H	8	A Ό	-P
aj	r-i	-P	aj	aj		ra	Ό	d	01
A	'CO	cö	A	A	02	A	q	A ·Η	02
o	8	KI	A	o	•rl	o	•H	o o	•ri
	Í4	o	0	fi	N	q	o	fi *5	-P
φ	o	•rs	*d	φ	'CO	φ	ÍH	P CÖ	01
•d		Φ	Φ	•d	-P	•d	3	A A	•H
aj		-P	8	aj	01	cö	A	-P	t>
	«*				a			aj *o
	*o			*o	ai		*o	oi A	Φ
A	A	A	A	A	-P	A	A	tsű φ	02
8	8	8	8	8	φ	8	s	aj q	Φ
a>	Φ	Φ	Φ	Φ	8	Φ	Φ	8 Φ	>

cinóma, bőr metasztázis

<t IX

	Z~X	CM	CM
	-Ϊ		A	A
	CM	z~s	A	A	o
X	A	O	A,	A,	CO			co
CM	A	CM			A		Ά	-3-
CM	A	A			A		CO	A
A	A,	A	C-	vH	A,		A	A
A		A,	20	k0			A	A
A			vH	<Λ			S
	O		!	f	co
	o	A-	cg	cg	1	CO		vH
Ο-	A	t-	*5»	§	A	t-	co	1
Ι	I	A·	1	1	A		1	•ri
A	A	l		<í	1	I	üs	A
o	A	A			A	A	A	aj
S	A	A		§	CQ	A	>α>	o

·· ·· ···· ···· ···· • · · · ♦ « · • · ··· · ··· • · · · · ···· ···· ··· · ···

- 139 EH (folytatás)

§ c?

aj	01	ü	-P
8		Φ			N
Ό		S	:d		ra
Π	R		Pi		cJ
•rl	o	tJ	Φ		A
O	g	cö	N		A
fj	p	PU	01		O
m	-P	•Γ-3	1	*o	Pd
		'CÖ	N		&
o	Φ	«	01		•rl
ö	r~1	01	•rl	-P	A
φ	'Φ		8
ná	A	Ό	Pl	-o	Pd
cö	1	•rl	Φ	rl	40
	s	Pl	'ó	Pd	A
•Γ3	r4	A	•rl	A	*O
'CO	•rl	s	P.	8	r—d
6	&	Φ	Φ	Φ	Φ

CM	ζΛ	Z-\	n-
1Π	A	z-\	m	cn
	3-	VO	m	A
EH		CO	in	A
S	A	-d-	r4	O
	A	A	A	O
		A
A	O	P4	o
1		O	z	σι
Pd		z		σι
μ	Ή		A	CM
w	O	S	cn	<
1	4-	Pd	-á-	A
M	1	pq	1	W
ω	0	M		M

···· ···· ···· • · · · · · · • · ··· · ··· • · · · · ···· ···· ··· · ···

- 140 4. példa

Az amfiregulin genomiális génjének klónozása.és vizsgálata

Az alábbi példában az emberi amfiregulin genomiális génjének klónozására szolgáló eljárást, továbbá a gén felépítését és intron-exon szerkezetét ismertetjük. Funkcionális és evolúciós következtetéseket is levonunk a növekedési faktorok tág értelemben vett EGF-fehérjecsaládjával összefüggésben.

4.1. Az amfiregulin genomiális génjének klóno- zására és vizsgálatára szolgáló eljárások

4.1.1. Az elektroforetizált, majd szűrőpapírhoz kötött DNS hibridizációs vizsgálata (Southern biot hibridizáció)

Genomiális össz-DNS-t izolálunk T150 szövettenyésztő edényekben nőtt, majdnem összefüggő sejttenyészetekből, Maniatis módszere szerint eljárva [Maniatis, Molecular Cloning, A Laboratory Manual (1982)]. 20 /ug DNS-t restrikciós endonukleáz enzimekkel emésztünk a korábban leírtak szerin^eljárva, a •V reakcióelegyet 0,8 $-os agaróz gélben elektroforetizáljuk,

- 141 a DNS*t Hybond-N (Amersham) szűrőpapírra visszük x tömény SSC puffer felhasználásával [Southem, J. Mól. Bioi., 98, 503 - 517. (1975)], végűi 1200 /uJoule teljesítményű, rövidhullámú ultraibolya fénynyel megvilágítva a szűrőpapírhoz kötjük a DNS-t.

A szűrőpapírhoz kötött DNS-t 32-es tömegszámú foszforizotóppal jelölt, amfiregulin-specifikus DNS-fragmenssel kiegészített, ml-enként 2 x 10^ cpm aktivitású hibridizációs pufferral (6 x tömény SSC puffer, x tömény Denhardt-oldat, 0,5 $ nátrium-dodecil-szulfát, és 20 /ug/ml, összetört, denaturált heringsperma-DNS elegye) 65°C hőmérsékleten, 1 éjszakán át hibridizáljuk. A próbát random primerek felhasználásával jelöljük; specifikus aktivitása igy

Q

- 25 x 10 cpm//ug. A szűrőpapírokat egyszer tömény SSC pufferban, 65°C hőmérsékleten alaposan mossuk, majd -70°C hőmérsékleten, 1 éjszakán át autoradiografáljuk.

·· 44 ···· 4»·· 4444 • · 4 9 · 4 4 • 4 444 4 444 • 4 4 4 · •444 4··· 444 · 444

142

4.1.2. Genomiális génbank előállítása

Klónozó DNS-vektornak az L47.1 jelű lambda-bakteriofágot választjuk. BamHI, EcoRI és Hindui enzimekkel emésztve elkülönítjük a fágvektor-karokat, majd ezeket foszfatáz enzimmel kezeljük. Az MCF-7 sejtekből származó nagy molekulatömegü DNS-t HindlII enzimmel emésztjük, majd a reakcióelegyet 0,8 $-os, alacsony olvadáspontu agaróz (Bio-Rad) gélben elek troforetizálva méret szerint frakcionáljuk a DNS-fragmenseket. A kívánt restrikciós fragmenst a legnagyobb mennyiségben tartalmazó gélszeletet 65°C hőmérsékleten megolvasztjuk, a DNS-t fenollal extraháljuk, nátrium-acetáttal és etanollal kicsapjuk, majd 25 - 100 /ug/ml koncentrációban felszuszpendáljuk. Génbankot állítunk elő úgy, hogy 100 ng lambda L47.1 fágkarokát és 40 ng extrahált, méret szerint frakcionált DNS-t 5 /ul végtérfogatu reakcióelegyben, T4 DNS-ligáz (Biolabs) enzim segítségével, 14°C hőmérsékleten ligálunk. A rekombináns fágokat in vitro pakoljuk, az E. coli BHB2Ő88 N205 recA törzsből (lambda imm^^ clts b2 red3 Eam4 Sam7), valamint a EHB 2690 N205 recA (lambda imm^³^ olts b2 red3 Daml5Sam7) törzsből készült sejtkivonatok felhasználásával, Grosveld módszere [Gene, 13.

227 - 237. (1981)] szerint eljárva. A fág-génbankot ·♦ ·· ···· ···· ···· • · · · · · · • · · ·· · ··· • · · · · ···· ···· ·«« · ···

143 az E. .coli LE392 törzs sejtjein titráljuk. A genomiális kiónokat in situ plakk hibridizációval [Benton, Science, 196, 180 - 182. (1977)1, amfiregulin-specinikus DNS-próbákkal vizsgáljuk, és a hibridizáció, során pozitívnak mutatkozó, tisztított plakkok fágjaiból DNS-t izolálunk [Huynh, DNA cloning techniques: a practical approach, D. Glover, ed., Oxford, IRL Press, pp. 49 - 78. (1985)]. A Hindii! inszerteket kihasítjuk a DNS-vektorból, majd pEMBL18 DNS-vektorba szubklónozva fenntartjuk, és restrikciós analízissel vizsgáljuk azokat.

4.1.3« Oligonukleotid primer enzimes DNS-szintézissel történő meghosszabbítása

A 3. példában leírtak szerint eljárva RNS-t izolálunk az MCF-7 sejtekből. Az amfiregulin cDNS 40 - 60. (ARAP) illetve 76 - 97. (ARCP) nukleotidjaival komplementer két szintetikus oligonukleotidot 32-es tömegszámú foszforizotóppal, T4 polinukleotid kináz enzim segítségével végjelöljük. Az oligonukleotidok

Q specifikus aktivitása 2 - 5 x 10 cpm//ug. Egy millió cpm jelölt oligonukleotiddal kezdeményezzük a cDNS első szálának szintézisét 50 yug MCF-7 RNS-ről, lényegében a 3· példa 3.1.4. pontjában leírtak szerint • · ··· · ··· • · · · · ···· ···· ·♦· · ···

- 144 eljárva. A reakciótermékeket RNázA-val kezeljük, majd fenollal és kloroformmal extraháljuk, etanollal kicsapjuk, 80 % formamid jelenlétében, 5 percen át 100°C hőmérsékleten végzett hőkezeléssel denaturáljuk, végül a szokásos 8 poliakril-amid-7 mól urea szekvenáló gélekben elektroforetizálva vizsgáljuk,

4.1.4. A kloramfenikol-acetil-transzferáz (CAT) aktivitás mérése

MCF-7 sejteket tenyésztünk az 1, példa 2.1. pontjában leírtak szerinteljárva. Minden egyes méréshez 1 - 2 x 10^ sejtet szélesztünk 10 - 10 ml táptalajban felszuszpendálva, egy - egy 100 mm átmérőjű petricsészére, majd 24 óra elteltével 20 /ug, kalcium-foszfáttal kicsapott szuperhelikális plazmid DNS-t adagolunk a sejtekhez [Southem és Berg (1982)]. A sejteket a transzfekció után 4 órával friss táptalajjal mossuk, majd 90 mp-en át 25 $-os glicerinnel ozmotikusán sokkoljuk. A sejteket újra mossuk, majd 20 ml, 0 vagy 100 ng/ml TPA-val kiegészített friss táptalajjal felülrétegezzük. A glicerines sokk után 40 órával a sejteket mossuk, összegyűjtjük, majd 100 /ul, 0,25 mólos Trisz-sósav (pH = 7,8) oldatban felszuszpendálva ultrahanggal féltárjuk. A kloramfenikol-acetil-transzferáz (CAT) aktivitást lényegében ·· ···· ···· ···· • · · · • · ··· · ··· • · · · · ···· ···· ··· · ···

145

Gorman és munkatársai módszere (1982) szerint eljárva mérjük. 150 /ul végtérfogatu reakcióelegyet állítunk össze úgy, hogy 2,5 mCi aktivitású, 0,5 mól koncentrációban Triszt (pH = 7,8) és 0,5 mmól koncentrációban acetil-koenzimA-t tartalmazó oldatban oldott, 14-es tömegszámú szénizotóppal jelölt kloramfenikolt (HEH) és 3 - 50 /ul sejtkivonatot összekeverünk. A reakcióelegyeket 37°C hőmérsékleten, 2 órán át inkubáljuk, ezután 1 ml etil-acetáttal extraháljuk, majd szilikagél vékonyrétegykromatográfiás lemezekben, mozgófázisként kloroform:1-butanol (95 : 5) elegyet használva kromatografáljuk. A vékonyréteg-kromatográfiás lemezeket megszorítjuk, majd autoradiografáljuk. Az acetilált, illetve a nem-acetilált, 14-es tömegszámú szénizotóppal jelölt kloramfenikol mennyiségét Optifluor oldatban, a kivágott foltok aktivitásának mérésével határozzuk meg. Egy egységnyi kloramfenikol-acetil-transzferáz enzimaktivitásról beszélünk akkor, ha /ug kloramfenikol acetilálódik 1 óra alatt, a sejtkivonat -fehérje 1 /ug-jára számítva.

·· ·· ···· ···· ···· • · · · · · · • · ··· · ··♦ • · · · · ···· ···· ··· · ···

- 146 4.1.5, In situ kromoszóma-hibridizáció

Triciummal jelölt timidin-trifoszfáttal, random primerek felhasználásával jelöljük a pAR9 plazmidot, és az igy nyert DNS-t fitohemagglutininnal serkentett, perifériás, vérből származó, 500 - 800 sávos stádiumban levő, normál emberi metafázisos limfocita-sejtek kromoszómáihoz hibridizáljuk. A fenti próba a pEMBLie DNS-vektor EcoRI helyére inszertált, a 3’-vég felöli nem-transzlálódó szakasz legnagyobb részét nem tartalmazó amfiregulin cDNS-nek felel meg.

A hibridizációt a korábban leírtak szerint [LeBeau, PNAS, 82, 6692 - 6696. (1985)] eljárva, 2, 4, 20 illetve 40 ng/ml próbát tartalmazó hibridizációs elegyben végezzük. Az autoradiográfiához Kodak NTB-2 Nuclear track emulziót használunk; a lemezeket 7 - 60 napon át exponáljuk. A kromoszóma-sávokat quinacrin-mustárral festve tesszük láthatóvá.

·· ·· ···· ···· ···· • · · · · · · • · ··· · ··· • · · · · ···· ···· ··· · ···

- 147 4.2. Az amfiregulin gén kromoszómális helyzetének vizsgálata

Az emberi amfiregulin gén kromoszómális elhelyezkedését a triciummal jelölt amfiregulin cDNS és a normál metafázisos kromoszómák in situ hibridizációjával határozzuk meg. 50 metafázist vizsgálva az autoradiogramon megjelenő ezlístszemcsék 30 $-a nem random eloszlásban a 4ql3 - 4q21 sávoknál helyezkedik el. Ezt az eredményt a csak a 4. emberi kromoszómát hordozó, hörcsög/ember szomatikus sejthibrid DNS-ével végzett polimeráz DNS-lánc reakció (POR) megerősíti. Az amfiregulin harmadik exonjából és az ezzel szomszédos intronból álló oligonukleotid primerekkel csak az emberi DNS, valamint a 4. kromoszómát hordozó hibrid DNS esetében kapunk egy 220 bázispár méretű POR fragmenst, a hörcsög-DNS esetében azonban nem.

A 4ql3 - 4q21 kromoszómaszakaszban található a gro, vagy melanóma növekedésserkentő aktivitás [Anisowicz, A. és munkatársai, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 84, 7188 - 71921 (1987)]; Richmond, A. és munkatársai, EMBO J., 7, 2025 - 2033. (1988)], a c-kit receptor [Yardén és munkatársai, EMBO J.,‘6, 3341 - 3351. (1987)], a 4-es vérlemezke-faktor (PF4) [Griffin és munkatársai, Cytogenetic Cell Génét., 45, 43 - 73. (1987)], ·· ·· ···· ···· ···· • · · · · · · • · ··· · ··· • · · · · ···· ···· ··· · ···

- 148 a gamma-interferónnal indukáIható IP-1O faktor [Luster, A. D. és munkatársai, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 84, 1868 - 1871. (1987)], a D-vitamin-kötő protein (csoportspecifikus komponens) [Cooke, N. E. és munkatársai, Humán Genetics, 225 - 229. (1986); McCombs J. L. és munkatársai, Gytogenet Cell, Génét, 42, 62 - 64. (1986)] és a statherin, egy kalciumszint-szabályozó, nyálban előforduló fehérje génje [Sabatini, L. M. és munkatársai, Am. J. Hűm. Génét., 41, 1048 - 1060. (1987)].

Az EGF génje disztálisan, a 4q25 kromoszómaszakaszban helyezkedik el.

A gro, az IP-10 és a PF4 a szerkezetüket tekintve hasonló, a k· kromoszómán csoportosuló növekedési faktor fehérjecsalid tagjai. A c-kit egy sejtfelszíni, néhány tirozinspecifikus kinéz aktivitással rendelkező növekedési faktor-receptorral, igy az EGF-receptorral, a Neu onkogénnel, a PDGF-receptorral és .az inzulin-receptorral szerkezetét és funkcióját tekintve rokon receptort kódol. A ligandumok és azok receptorainak génjei általában külön kromoszómákon helyezkednek el, bár néhány ligandum és receptora azonos kromoszómás helyzetben térképezhető [Gróffin, Nucl. Acids Rés., 11, 6331 - 6339. (1983); Pettenati, Proc. Háti. Acad. Sci., USA, 84, 2970 - 2974. (1987)]· A c-kit receptor ligandumát mindmáig nem azonosították, igy az amfiregulint ·· ···· ··«· ···· • · · · • ··· · ··· • · · · · ···· ···· ··· · ···

- 149 ebből a szempontból is jellemezni szükséges.

Számos malignus sejtvonalban specifikus transzlokációkat figyelhetünk meg. A veleszületett akut limfoblasztos leukémia (ALL) esetében fellépő leggyakoribb citogenetikai rendellenesség, a t(4;ll) (q21;q23), azt a régiót érinti, ahová az amfiregulin is térképezhető [Heim, S. és munkatársai, Leukémia, 1., 16 - 23. (1987)]. Az akut limfoblasztos leukémiás eseteket jelenleg morfológiai szempontból a French-American-British Cooperative Group (FAB) ajánlásai alapján, valamint a B és a T sejt-markerek, továbbá kromoszóma-vizsgálatok alapján csoportosítják. Ez az osztályozás az alapja az akut limfoblasztos leukémiás esetek diagnózisának, kórjóslatának, továbbá kezelésének. Az akut limfoblasztos leukémiás esetek egyharmadánál mutathatók ki specifikus transzlokációk; a leggyakrabban a 16 hónapnál fiatalabb gyermekeknél előforduló t(4;ll) transzlokáció kórjóslata igen rossz: az átlagos túlélési idő kevesebb mint egy év [Kocova és munkatársai, Cancer Genetics and Cytogenetics, 16, 21 - 32. (1985)]. A 4q21 régiót érintő transzlokációk T-limfómák [Levine, E. G. és munkatársai, Cancer Rés., 46, 6481 - 6488. (1986)], és akut mieloblasztos leukémiák (AML) esetében [Selypes, A. és munkatársai, Humán Génét, 76, 106 - 108. (1987)] is előfordulnak.

·· ·· ···· ···· ···· ······· • · ··· · ··· • · · · · ···· ···· ··· · ···

- 150 Ebben a régióban találhatók a fogak fejlődési zavaráért, valamint a hiányos melanoblaszt-differentáció és -vándorlás következtében foltos bőrpigmentációt (úgynevezett tarkafoltos bőr) okozó örökletes betegségért felelős gének is [Hoo, J. J. és munkatársai, Humán Génét., £3, ²3° - 231. (1986)].

Az amfiregulin, illetve a 4ql3-4q21 kromoszóma-szakaszra lokalizálható genetikai betegségek genetikai kapcsoltságának vizsgálata lehetővé teszi a közeli elhelyezkedés jelentőségének tisztázását. A legújabb citogenetikai vizsgálatok szerint a 4q21 kromoszómaszakasz a limfociták differentációjában szerepet játszó géneket hordozza. Végül, a fenti kapcsolódások a növekedésszabályozó amfiregulin molekula további lehetséges biológiai aktivitásaira illetve további lehetséges alkalmazásaira hívják fel a figyelmet.

«· 444« «··· ··«« • · · · · · · • · 4·· · «·· • · 4 4 4 ···· ···* ··· · ···

- 150 Ebben a régióban találhatók a fogak fejlődési zavaráért, valamint a hiányos melanoblaszt-differentáció és -vándorlás következtében foltos bőrpigmentációt (úgynevezett tarkafoltos bőr) okozó örökletes betegségért felelős gének is [Hoo, J. J. és munkatársai, Humán Génét., 22, ²30 “ ²31. (1986)].

Az amfiregulin, illetve a 4ql3-4q21 kromoszóma-szakaszra lokalizálható genetikai betegségek genetikai kapcsoltságának vizsgálata lehetővé teszi a közeli elhelyezkedés jelentőségének tisztázását. A legújabb citogenetikai vizsgálatok szerint a 4q21 kromoszómaszakasz a limfociták differentációjában szerepet játszó géneket hordozza. Végül, a fenti kapcsolódások a növekedésszabályozó amfiregulin molekula további lehetséges biológiai aktivitásaira illetve további lehetséges alkalmazásaira hívják fel a figyelmet.

- 152 gén tehát nem rendeződik át jelentős mértékben, illetve nem amplifikálódik ezekben a sejttípusokban.

Minthogy az amfiregulin gén, és az azt körülvevő DNS-szakaszok legnagyobb részét, vagy éppen egészét az MCF-7 DNS fenti két Hindin fragmense tartalmazza, e két DNS-fragmens klónozása tűnik előnyösnek. A HindlII enzimmel emésztett MCF-7 DNS-t méret szerint frakcionáljuk, és a megfelelő frakciók DNS-tartalmát lambdaL47.1 DNS-vektorba ligáijuk. A pozitív kiónok közül kettőt kiválasztunk (lambdaARHő és lambdaARH12), és részletesebben jellemzőnk. A 12 illetve 6,4 kb méretű inszerteket pEMBL18 DNS-vektorba szubklónozzuk, és néhány restrikciós endonukleáz felhasználásával elkészítjük a restrikciós térképüket. Pontos oligonukleotid primereket felhasználva, a különböző kisebb méretű szubklónokat közvetlenül szekvenáljuk, és az összes exon, valamint az exon-intron kapcsoló szakaszok nukleotid-sorrendjét meghatározzuk. Az igy nyert nukleotid-sorrend nem tér el a cDNS nukleotid-sorrendjétől.

·· ···· ·♦·· ···· • » · · • ··· * ··· • · · · ······ · ···

- 153 4.4. Az amfiregulin 5’-vég felöli szabályozó szakaszának vizsgálata

Az amfiregulin genomiális klónozása során nyert, 12 kb méretű Hindin fragmens az amfiregulinnal szomszédos, az 5’-vég irányában elhelyezkedő 6,5 kb méretű DNS-szakasz is hordozza. Az első exontól 5’-irányban elhelyezkedő EcoRI hasitóhelytől az első exonban található Smal hasitóhelyig (40. nukleotid a cDNS-ben) terjedő, 688 bázispár méretű fragmenst szubklónozzuk, és mindkét szál nukleotid sorrendjét meghatározzuk. Az adatokat a 17. ábrán mutatjuk be.

Az első exonból származó két különböző oligonukleotidot primerként használva enzimes utón DNS-t szintetizálunk az MCF-7 sejtekből izolált RNS-ről.. A mindkét oligonukleotiddal elvégzett vizsgálat megerősíti, hogy a leggyakrabban használt transzkripciós kezdőpont a leghosszabb cDNS klón 5’-végétől 1 bázispámyira 5’ -irányban található. Két másik, ritkábban használt transzkripciós kezdőpont található a cDNS-szekvencia +l-es illetve +2-es helyzetében; mindez megerősíti, hogy igen sok cDNS klón majdnem teljes hosszúságú. Annak érdekében, hogy az amfiregulin gén szabályozó szakaszát funkcionális szempontból is vizsgálhassuk, előállítjuk az amfiregulin kódoló szakaszától

- 154 5’-irányban elhelyezkedő, 688 bázispár méretű. EcoRI-Smal fragmensből (nukleotid-sorrendje a -648-tól a +40-ig terjed; a +1 a leggyakrabban használt transzkripciós kezdőpont, és az ehhez kapcsolt, promoter nélküli kloramfenikol-acetil-transzferáz (CAT) génből álló kiméra-gént (pXARElCAT). A fenti plazmidot tranziens módon MCF-7 sejtekbe juttatva az EcoRI-Smal fragmens serkenti a CAT gén transzkripcióját, és az aktivitás TPA hozzáadásával 6 - 7-szeresére növelhető. Mindez strukturális és funkcionális szempontból egyaránt bizonyítja, hogy az amfiregulin gén 5’-vég felöli szakaszát klónoztuk. Deléciós mutánssorozatot állítunk elő a fenti kiméra-génből: az Ela jelű mutáns az amfiregulin-szekvencia -539 - + 40. nukleotidjait, az Elb jelű mutáns a -387 - + 40. nukleotidokat, az Ele jelű mutáns a -227 - +40. nukleotidokat, az Éld jelű mutáns a -148 - +40. nukleotidokat, az Ele jelű mutáns a -77 - +40. nukleotidokat, az Elg jelű mutáns a -79 - +40. nukleotidokat, az Elh jelű mutáns pedig a +19 - +40. nukleotidokat hordozza a CAT gén 5’-vége előtt, ugyanabban a DNS-vektorban. Az alapaktivitás elveszik, ha a -77. nukleotidtól 3’-irányban elhelyezkedő szakaszokat is kiejtjük, igy például az Elh jelű mutáns génnek nincs mérhető CAT-aktivitása. Valamenynyi CAT-aktivitással rendelkező mutáns gén expressziója

155 ·· ·· ···· ···· ···· • · · · · · · • · · · · · ··· • · · · · ···· ♦ ··· ··· * ···

3,5 - 7-szeresére nő a 40 órán át, 100 ng/ml TPA koncentráció mellett végzett kezelés hatására. A fenti génkonstrukciókat felhasználva vizsgálhatjuk bármely morfogén vagy mitogén hatású anyagnak, bármely növekedési faktornak, gyógyszernek vagy fermentációs nyerskivonatnak az amfiregulin-expresszió szabályozására gyakorolt hatását tranziens vizsgálatok során: igy uj tipusu terápiás hatóanyagok azonosítására nyílik lehetőség.

Izotópos RNS-átirási kísérletekben az amfiregulin transzkripciója TPA hatására 3 - 5-szörösére nő, vagyis az amfiregulin TPA-val való serkenthetőségéért, legalábbis részben a megnövekedett promoter-aktivitás a felelős. Aktinomicin-D jelenlétében, vagy annak hiányában TPA-val kezelt MCF-7 sejtek RNS-ét elektroforezis után szűrőpapírhoz kötve, és hibridizációval vizsgálva az amfiregulin RNS viszonylag stabilnak bizonyul; félélet ideje meghaladja a 4 órát. Az amfiregulin expressziójának TPA-val történő indukálása tehát elég sokoldalú jelenség, egy meglehetősen stabil mRNS megnövekedett transzkripciójával jár.

• » · · · · · • · ··· · ··· • · · · · ···· ···· ··· ♦ ···

- 156 4.5. Az amfiregulin gén intron/exon szerveződésének és az amfiregulin fehérje doménjeinek vizsgálata evolúciós és funkcionális szempontból

Az emberi amfiregulin teljes genomiális nukleotid-sorrendjét a 17. ábrán ismertetjük, az exonok és az amfiregulin.fehérje molekula doménjei közötti kapcsolatot pedig a 18. ábrán vázoljuk sematikusan.

Az amfiregulin mRNS-sel végzett, oligonukleotid primer enzimes meghosszabbítási vizsgálatokkal, továbbá a kiméra amfiregulin/CAT promoterekkel (CAT = kloramfenikol-acetil-transzferáz, marker gén) végzett vizsgálatokkal a funkcionális promotert a leghosszabb cDNS klón 5’-végével szomszédos, 64 bázispár méretű DNS-szakaszon határoljuk be. Egy konszenzus TATA box is található továbbá a cDNS-szakasz 5’-végétől 29 bázispámyira, az átírás irányával ellentétes irányban. A gén 3’-végét a cDNS poli(A)-fárkától 64 nukleotid távolságra egy konszenzus poliadenilációs jelzőszakasz előzi meg. Az amfiregulin gén elsődleges mRlTS-átirata mintegy 10,2 kb méretű.

·· ·· ···· ···· ···· • · · · · · · • · ··· · ··« • · · · · ···· ···· ··· · ···

- 157 Az emberi amfiregulin prekurzort 6 exon kódolja, a genomiális gén mérete 10,2 kb. Az amfiregulin exonok 112 - 270 bázispár méretűek; az exonokat 1,25 - 2,1 kb méreti! intronok választják el. Az amfiregulin 5 intronja úgy tagolja a kódoló szakaszt, hogy a fehérje számos doménje egy-egy exon terméke. Az első exon kódolja az 5*-irányú, nem-transzlálódó, és a szignálpeptid-doméneket, a második exon kódolja az N-terminális vég felöli prekurzor-szakaszt, az ötödik exon határozza meg a citoplazmás régiót, végül a hatodik exon a 3’-irányú, nem-transzlálódó szakaszt kódolja. A harmadik és a negyedik exon együttesen kódolja az érett amfiregulin fehérjét, beleértve mind a hidrofil- és EGF-szerü szakaszokat, mind pedig a feltételezett transzmembrán domént. A harmadik és a negyedik exon kapcsoló szakasza a fehérjében az EGF-szerü szakasz második és harmadik hurka közötti résznek felel meg.

Ha az amfiregulin, az EGE és a TGF-α aminosav-sorrendjelnek összevetésén bejelöljük az exonok kapcsolódási helyeit, nyilvánvalóvá válik, hogy valamennyi fenti proteint 2-2 exon kódolja, és hogy az elválasztó intron ugyanabban a helyzetben található. Mindhárom fehérje 3’-irányban elhelyezkedő exonja továbbá a megfelelő prekurzor fehérje transzmembrán doménjét is kódolja. Az EGF-szerü szakaszt ezekkel ·· ·· ···· ···· ···· • · · · ♦ ♦ · • · ··· · ··♦ • · · · · ···· ···· ··· · ··♦

158 ellentétben egyetlen exon kódolja minden más, ismert exon/intron szerkezetű, emlős EGF-homolágban, igy az EGF prekurzor kilenc EGF-szerü ismétlődő szakaszában [Gray, Natúré, 303, 722 - 725. (1983)], az BDL-receptor három [Yamamoto, Cell., 39» 27 - 38. (1984)] és a patkány fibronektin [Patél, Embo J,, 6, 2565 - 2572. (1987)], valamint az emberi XII. véralvadásifaktor [Cool, J. Bioi. Chem., 262, 1362 - 1373. (1987)] egy-egy EGF-szerii ismétlődő szakaszában. A gerinctelenekből izolált homológok, igy a Drosophilia Notch génje és a C. elegáns lin-12 génje is tartalmaz EGF-szerii, többszörösen ismétlődő szakaszokat [Kidd, Molec. Cell. Bioi., 6, 3094 - 3108. (1986); Greenwald, Cell, 43, 583 - 590. (1985)]. Az emlős génektől eltérően a Notch gén legtöbb EGF-szerü ismétlődő szakasza az intronokkal 36 exonra tagolt gén egyetlen, négy exonból álló kódoló szakaszán található. Figyelemreméltó, hogy a fenti négy exonból kettő pontosabb egyezést mutat az amfiregulinnal, mint a Notch gén konszenzus ismétlődő szakaszával; sőt, az egyik exont pontosan ugyanannál a CXC szekvenciánál szakítja meg egy intron, mint az EGF, a TGF-α és az amfiregulin exonját. A fonálféreg eredetii lin-12 gén legalább 11 EGF-szerü szakaszt hordoz, ezek közül kilencet az első exon, további két, intronokkal határolt intakt ·· ·· ···· ···· ···· • · · · · · · • · ··· ·' tfit • · · · · ···· ···· ··· · ···

159

EGF-szerü egységet pedig külön-külön exonok kódolnak.

A különböző élőlények EGF-szerü ismétlődő szakaszait kódoló exonok szerkezetének különbségei arra utalnak, hogy ezek különböző eredetűek lehetnek. Az' egyik csoportban az EGF-szerü szakaszokat intronok határolják, a másik csoportban pedig, ahová az amfiregulin is tartozik, az egyes EGF-szerü szakaszokat az intronok több részre tagolják. A két csoportba tartozó szekvenciák hasonlósága lehet konvergens evolúció eredménye, de lehetséges, hogy egy ősi közös génből kiinduló divergens fejlődés során épültek be az intronok mai helyükre.

A közös eredetre utal az, hogy az EGF-ban, a TGF-a-ban, az amfiregulinban és a Notch gén egyik EGF-szerü ismétlődő szakaszában ugyanabban a CXC szekvenciában található az intron, ám a részletesebb vizsgálat jelzi, hogy az intron eltérő leolvasási fázisban van. Az eltérő leolvasási fázis alatt azt értjük, hogy az intron a gén leolvasási fázisát a kodon első (I), második (II) vagy harmadik (0) nukleotidja után szakítja meg. Az intron leolvasási fázisa evolúciós jelentőségű, amennyiben a leolvasási fázis változása lehetővé teheti a funkcionális doméneket kódoló exonok különböző fehérjék közötti cserélődését.

• ·

- 160

Az EGF és a TGF-α intronja II fázisban, mig az amfiregulin és a Notch gén intronja I fázisban van. Hasonló, egy nukleotidnyi eltolódás figyelhető meg a B-komplement faktor, illetve az elasztáz proteáz-doménjében taláLható utolsó előtti intron esetében[Cambell, PHAS, 80, 4464 (1983); Swift, J. Bioi. Chem., 259, 14271. (1984)]. A fenti intronok nem véletlenszerű elhelyezkedése arra utal, hogy specifikus intron-beépülési szekvenciák találhatók ezekben a génekben. Lehetséges az is, hogy szelekciós nyomás irányul arra, hogy a kódoló szakasz ezen a helyen megszakadjon. Az emberi EGF, TGF-α és az amfiregulin EGF-szerü egységei, valamint a Notch ismétlődő szakasza exon/intron kapcsolódási helyeinek összehasonlítása során nem találunk a transzpozonokra jellemző direkt ismétlődéseket a szekvenciákban. Mind a négy szekvenciában megtalálható azonban a kapcsolódási helyeket határoló gta agt nukleotid-sorrend.

Ez a szekvencia az intron eredetében, vagy az RNS-ből való kivágódásában játszhat szerepet.

A vírus-eredetű EGF-homológok nem tartalmaznak ugyan intronokat, ám a VGF, az EGF, a TGF-a, és az amfiregulin összehasonlítása során a transzmembrán doménre is kiterjedő homológiát· állapítunk meg, mig a mixóma- és a nyúl fibróma-virusok növekedési faktorai már az előbbi hidrofób szakasz előtt befejeződnek.

- 161 -

A legújabb vizsgálatok bizonyotják, hogy a TGF-α prekurzora transzmembrán proteinként szintetizálódik, és eltérő proteolitikus hasitási lépések során alakul át a nagyobb, kiválasztásra kerülő, valószínűleg a sejttípusra jellemző TGF-a-variánsokká [Teixido, Natúré, 326, 883 - 885. (1987)].

Transzmembrán doméneket más EGF-homológok, igy a véralvadási faktorok, az LDL, valamint a Iiotch és a lin-12 homeotikus gének is tartalmaznak, habár ezek transzmembrán doménjeinek egyike sem szomszédos EGF-szerü ismétlődő szakaszokkal. Az EGF-szerkezet jelenléte néhány membránhoz kötött prekurzor fehérjében azt jelzi, hogy bizonyos körülmények között, szekretált növekedési faktorként proteolitikus hasításon mehetnek keresztül, vagy pedig továbbra is a membránhoz kötődve a sejtek közötti és/vagy a sejten belüli információ-továbbításban játszhatnak szerepet.

Az amfiregulin homológjai közé gerinctelenekből származó homeotikus gének is' tartoznak. A homeotikus gének termékei a sejtek fejlődésének szabályozásában vesznek részt. A Notch gén terméke pólóul az ektodermális sejtek megfelelő továbbfejlődését biztosítja neuroblasztokká, vagy pedig dermoblasztokká.

- 162 A Nőt eh mutánsokban valamennyi ektodermális sejt neuronná alakul, és a csak idegsejtekkel, de bőrrel nem rendelkező utódok elpusztulnak. A homeotikus gének autokrin módon hatnak: a génterméket kifejező sejtek meghatározott fejlődési állapotát hozzák létre, vagy tartják fenn; esetleg közvetlen sejt-sejt kölcsönhatások révén befolyásolhatják a szomszédos sejtek hasonló fejlődési állapotainak szabályozását. További vizsgálatok tisztázhatják azt a kérdést, hogy az amfiregulin szintén bizonyos sejttípusok fejlődési állapotainak szabályozásán keresztül hat-e.

··«···· • · «·· 1) 999

9 9 9 9 :··· «··· ··· · ·*·

- 163 -

4.6. Az amfiregulin fehérje utóérése

Az amfiregulin cDNS nukleotid-sorrendje alapján a 78 és a 84 aminosavból álló amfiregulin-variáns egy 252 aminosavból álló transzmembrán prekurzor-fehérje középső részeként szintetizálódik (lásd a 3. példa 2. pontját). Az amfiregulin prekurzorból proteolitikus hasítás révén szabadul fel az érett amfiregulin; a proteolitikus hasítási helyek nem azonosak egyetlen ismert proteáz hasítási helyeivel sem. Az N-terminális vég hasítási helye Asp-Asp/Ser-val illetve Glu-Gln/Val-Val, a C-terminális végé pedig Glu-Lys/Ser-Met. Az amfiregulin két variánsa egy közös prekurzor alternatív proteolitikus hasításának eredménye, minthogy minden cDNSilletve genomiális klón nukleotid-sorrendje azonos ezen a szakaszon. Érdekes módon, egy intron található a két N-terminális vég felöli hasítási hely között: lehetséges tehát, hogy az N-terminális végek különbözőségéért az intron elcsúszása” a felelős.

Az MCF-7 sejtek által termelt amfiregulin 80 $-a a 84 aminosavból álló, míg a HTB-36 jelű Méhlepény -boholy karcinóma sejtvonal termelte amfiregulin 80 $-a a kisebb, 78 aminosavból álló amfiregulin-változat. Annak érdekében, hogy meghatározzuk, hogy a fenti különbség DNS-szinten jelentkező eltérés következménye-e, ···· ···· ···· • · · · • · • · ···· ····

- 164 polimeráz enzimmel végzett DNS-lánc hosszabbítási reakcióval elkülönítjük az amfiregulin harmadik exonját az MCF-7 sejtekből, illetve az amfiregulin mRNS-t konstitutív módon, nagy mennyiségben termelő HTB-36 sejtekből. Az amfiregulin-intron értelmes” szálával megegyező, valamint a harmadik exon kódoló részének ”nem értelmes szálával megegyező oligonukleotidot felhasználva specifikusan amplifikáljuk a köztes 220 bázispár méretű amfiregulin génfragmenst mindkét sejtvonalból származó DNS esetében. A nukleotid-sorrendek közvetlen meghatározásával bizonyítjuk, hogy a DNS-forrásként szolgáló fenti két emberi sejtvonal amfiregulin génjeiben sem az intron/exon kapcsolódási helyek, sem a harmadik exon kódoló szakasza nem különbözik: ezek a tények is alátámasztják, hogy az amfiregulin két változata a prekurzor molekula alternatív proteolitikus hasításából származik.

• · · ·· ·· ···· ···· • · · · · · • · · · · · • · · · ···· ···« ··· ·

- 165 -

4.7. Az amfiregulin és az EGF-szerü növele dési faktorok szerkezetének összehasonlítása

Az amfiregulin és az EGF-szerü fehérjék aminosav-sorrendje jól felismerhetően homológ: az érett növekedési faktorok másodlagos szerkezetét meghatározó három diszulfidhid-kötést alkotó hat cisztein is megőrződik. Az aminosav-sorrendek számitógép segítségével végzett előzetes összehasonlítása alapján az EGF-szerü molekulákat két különálló csoportba sorolhatjuk: növekedési faktorok, illetve véralvadási faktorok (lásd a 13. ábrát). Két rövid szekvenciát választunk ki az amfiregulinnal és más, ismert DNS- illetve fehérje-szekvenciákkal való összehasonlítás céljából. A két rövid szekvenciát úgy választjuk ki, hogy a fenti két proteincsoportot megkülönböztethessük ezek segítségével, illetve, hogy az optimális egyezésekhez igen kevés nukleotidot kelljen kihagynunk az összehasonlítás során. A pontos szekvenciákat az I. táblázatban mutatjuk be. Az első szakasz az EGE második hurka első 11 aminosavának, a második pedig az EGF harmadik ciszten hurkának felel meg. A növekedési faktorok, illetve a véralvadási faktorok csoportjából négy-négy reprezentatív fehérjét választunk, majd jól meghatározható funkcionális és szerkezeti homológiájuk alapján megállapítjuk

166 ·· ·· ···· ···· ···· • · · · · · · • · ··« · ··· • · · · · ···« ···* ··· · ··· a konszenzus nukleoticL-sorrendeket. Emberi eredetű nukleotid-sorrendeket választunk, ha csak lehetséges, hiszen végűi az emberi amfiregulinnal kívánjuk ezeket összehasonlítani. A növekedési faktorok közül az emberi EGF, TGF-α, VGF, továbbá a nyúl fibróma vírus növekedési faktora; a véralvadási faktorok közül a IX, X, XII emberi véralvadási faktor, és a protein-C szerepel az összehasonlításban. Az amfiregulint szintén összehasonlítjuk a homológja alapján nyert fenti két szekvenciával. A konszenzus szekvenciát az adott aminosav adott helyzetben való előfordulási gyakorisága alapján súlyozzuk.

A különböző TGF-α-, VGF- és EGF-származékok szerkezet és funkció szempontjából végzett vizsgálata néhány, a fenti növekedési faktorok biológiai aktivitásához szükséges aminosav azonosításához vezet. A megváltoztatott aminosav-sorrendü származék-molekulák között rekombináns fehérjék, szintetikus peptidek, továbbá helyspecifikus kémiai származékképzéssel, illetve proteolitikus lebontással előállított fehérjék egyaránt megtalálhatók. A vizsgálatokból többek között a következő következtetések vonhatók le (a számozás a 15. ábrán közölt összehasonlításra vonatkozik’:

·· ·· ···· ···· ···· • · « · · · · • Ο ··· · ··· • · · · · ···· ···· ··· · ···

167

- a hat cisztein (1., 19., 15., 26., 28. és

37.), valamint az általuk alkotott diszulfidhidak (1 - 15., 9 - 26., 28 - 37.) révén létrejövő hurkok szükségesek a biológiai aktivitás megjelenéséhez;

- az N-terminális vég felöli aminosav-addiciók kevéssé befolyásolják az aktivitást;

- a 8-as helyzetben egy aromás aminosav (F, Y) szükséges;

41 42

- az ϊ , a D vagy az L aminosavak nem konzervatív cseréje az aktivitás elvesztéséhez és/vagy a receptorkötés, illetve az autofoszforiláció drámai megszűnéséhez vezet.

Az amfiregulin az utolsó két, az EGF-receptor kötődéshez és/vagy a mitogén aktivitáshoz szükséges aminosavakra vonatkozó feltétel kivételével valamennyi kritériumnak megfelel. Az érett amfiregulin aminosav-sorrendje éppen a D előtt fejeződik be, igy a D és a döntő fontosságú, 42-es helyzetű leucin egyaránt hiányzik a molekulából, bár az amfiregulin még igy is verseng az EGF-receptor kötődésért, és bizonyos mitogenitási vizsgálatokban helyettesítheti az EGF-et.

« · ····

- 168 Ezek a különbségek azonban felelősek lehetnek a receptorkötődés nem telitési jellegű kinetikájáért, az EGF és az amfiregulin feltűnően különböző hatásaiért például a TGF-β szinergizmus-, a keresztkötési-, a foszforilációs- illetve a DNS-kötési vizsgálatokban, valamint a szelektált A431 szubklónokkal szembeni hatásvizsgálat során tapasztalt eltérésekért. Az érett amfiregulin N-terminális végén található, különösen hidrofil szakasz szintén közrejátszhat a receptorkötésben, vagy a biológiai aktivitásban megfigyelhető különbségek kialakulásában.

·· ·· 4··· 4444 4444 • · · · 44 4·' • · 444 4444 • · · 4· • 444 4444 444 ·444

- 169-

4.8. A tág értelemben vett EGF-fehérjecsalád amfi- regulin alcsoportja

A 13» ábrán bemutatott összehasonlítás, illetve az I. táblázatban ismertetett számitógépes elemzés eredményei alapján kiszámítjuk az evolúciós távolság mátrixát. A mátrix felhasználásával megszerkesztjük a tág értelemben vett EGE--fehérjecsalád törzsfáját. A törzsfa összeállítása során megköveteljük a ciszteinek jelenlétét a molekulákban, és egy pontot számítunk minden, a súlyozott konszenzus-szekvenciával fedésbe hozható aminosavért. Az igy nyert evolúciós törzsfa jelzi, hogy az amfiregulin, mind szerkezeti, mind funkcionális homológiája alapján az EGF-szerü növekedési faktorok egy uj alcsoportjába tartozik. E modell szerint a fenti növekedési faktor-családnak más tagjai is létezhetnek, és ezeket a fenti konszenzus szekvenciákkal való homológra alapján, három feltételt figyelembevéve azonosíthatjuk:

- a két növekedési faktor-régióval szembeni homológia összesített pontszáma haladja meg * a 20-at,

- a koagulációs faktor-szakasszal szembeni homológia összesített pontszáma legyen kevesebb mint 20, és

169 ·· ·· ···· ···· «··· • · · · · · · • · ··· 9 ··♦ • · · · · ···· ···· ··· · ···

4.8. A tág értelemben vett EGF-fehérjecsalád amfi- regulin alcsoportja

A 13. ábrán bemutatott összehasonlítás, illetve az I. táblázatban ismertetett számitógépes elemzés eredményei alapján kiszámítjuk az evolúciós távolság mátrixát. A mátrix felhasználásával megszerkesztjük a tág értelemben vett EGF-fehérjecsalád törzsfáját, A törzsfa összeállítása során megköveteljük a ciszteinek jelenlétét a molekulákban, és egy pontot számítunk minden, a súlyozott konszenzus-szekvenciával fedésbe hozható aminosavért. Az igy nyert evolúciós törzsfa jelzi, hogy az amfiregulin, mind szerkezeti, mind funkcionális homológiája alapján az EGF-szerű növekedési faktorok egy uj alcsoportjába tartozik. E modell szerint a fenti növekedési faktor-családnak más tagjai is létezhetnek, és ezeket a fenti konszenzus szekvenciákkal való homológra alapján, három feltételt figyelembevéve azonosíthatjuk:

- a két növekedési faktor-régióval szembeni homológra összesített pontszáma haladja meg , a 20-at,

- a koagulációs faktor-szakasszal szembeni homológra összesített pontszáma legyen kevesebb mint 20, és ·· ···· ···· ···· • · · · · · · • · ··· · ··· • · · · · ···· ···· ··· β ···

- 170 - az amfiregulin régióval szembeni homológia összesített pontszáma haladja meg a 20-at.

A fenti kritériumoknak megfelelő valamennyi uj molekula várhatóan funkcionális homológiát mutat az EGF-ral, a TGF-a-val, a VGE-ral, vagy éppen az amfiregulinnal. Azok a molekulák, melyeknek az amfiregulin régióval szembeni homológiája összesített pontszáma meghaladja a 40-et, a tág értelemben vett EGF-fehérjecsalád amfiregulin alcsoportjába sorolhatók, és a találmány oltalmi körébe tartoznak.

·· ···· ···· ···· ·· « · · · · · · • · ··· · ··· • · · · · ···· ···· ··· « ···

- 171 5. példa

Az amfiregulin expressziója bakteriális sejtekkel

5.1. Az amfiregulin bakteriális expressziójára szolgáló eljárások

5.1.1. Plazmid DNS-ek előállítása

A pARDl plazmid előállítása:

A pARDl plazmid a pARDl 1,4 kb méretű EcoRI cDNS-fragmensét hordozza a pEMBL18 DNS-vektorba építve. Az érett amfiregulin amino-terminális végénél levő valin-valin szakaszt kódoló cDNS-szakaszban, az 532-es helyzetben levő timint citozinra cseréljük a pARDl előállítása során. A báziscserét helyspecifikus mutagenezissel végezzük, és a csere megtörténtét a nukleotid-sorrend meghatározásával ellenőrizzük. A nukleotid-cserével létrehozott Dde hasitóhely (CTAAG) lehetővé teszi, hogy az amfiregulin amino-terminális vége felöli prekurzor dómén és a hidrofil régió közötti kapcsoló szakaszban további átalakításokat végezhessünk.

• · ·

- 172 A pARSTOP plazmid előállítása:

A pARSTOP plazmidot egy amfiregulin szekréciós DNS-vektor létrehozása során, köztes plazmádként állítjuk elő. A pARDl plazmidot Sspl és Xbal restrikciós enzimekkel emésztjük, és az érett amfiregulin karboxil-vég felöli kilenc aminosavát, a transzmembrán és citoplazmás doméneket, valamint a 3’-irányú nem transzlálódó szakaszt kódoló, 515 bázispár méretű

DNS-fragmenst elkülönítjük. Az amfiregulin cDNS fennmaradó amino-terminális vég felöli szakaszát kódoló, 4,7 kb méretű Sspl-Xbal fragmenst agaróz gélben tisztítjuk, és a kinéz enzimmel kezelt, összeolvasztott ARST0P1 és ARSTOP2 komplementer oligonukleotidokkal (lásd alább) ligáljuk. Az oligonukleotidok 5’-felöli vége az Sspl enzimmel hasított DNS végeivel ligálható tompa vég, melyet az érett amfiregulin karboxil-vég felöli 9 aminosavát kódoló nukleotidok, egy TAA stop kodon, valamint EcoRV és Xbal hasitóhelyek követnek:

Y EGERCGEKjc EcoRV/Xbal

ARSTOP1 5*

ATTTCGGTGAACGGTGTGGGGAAAAGTAAGATATCT

ARSTOP2

3’

TAAAGCCACTTGCCACACCCCTTTTCATTCTATAGAGTC ·· ···· ··«* ····

- 173 A pbAR plazmid előállítása:

A pbAR plazmicL az érett amfiregulin 78 aminosavas változatához kapcsolva a promoter nélküli TGF-β szekréciós kivezető szakaszt hordozza. A pbAR plazmidot úgy állítjuk elő, hogy a bLARN3 és pLARN4 oligonukleotidokat, a pARSTOP plazmid 240 bázispár méretű Ddel-Xbal fragmensét és az EcoRI/Xbal enzimekkel emésztett pEMBL18 plazmidot összeligáljuk.

A bLARN3 és a bLARN4 komplementer oligonukleotidokat összeolvasztva az 5*-vég felöl egy EcoRI, a 3’-vég felöl pedig egy Ddel túlnyúló vég jön létre, a kétszálu oligonukleotid közbülső részében pedig egy, a TGF-β szekréciós'kivezető szekvenciája karboxil-végéhez közeli Nael hasitóhellyel ligálható Nael felismerő hely található. Ez a ligálás megszünteti a Ddel hasitóhelyet, és helyreállítja az érett amfiregulin amino-terminális végének helyes aminosav-sorrendjét (valin-valin).

- 174 -

PHIL1	5'
PHIL2	3'
20
	K

sstn AGVVKPPQNKTESE PHIL1 5· GGGAGTAGTTAAGCCGCCCCAAAACAAGACGGAAAGTGA

PHIL2 3' CGCCCTCATCAATTCGGCGGGGTTTTGTTCTGCCTTTCACT

NTSDKPKRKKKGG

AAATACTTCAGATAAACCCAAAAGAAAGAAAAAGGGAGG TTTATGAAGTCTATTTGGGTTTTCTTTCTTTTTCCCTCC

EcoRI NGKNRRNRKKKN

PHIL1 5' CAAAAATGGAAAAAATCGAAGAAACAGAAAGAAGAAG

PHIL2 3· GTTTTTACCTTTTTTAGCTTCTTTGTCTTTCTTCTTCTTAA ·· ·· ···· ···· ···· • « · · · · · • · ··· 9 ··· • · · · · ···· «··« ··· · ···

175

A pDCHBARl plazmid előállítása:

A pDCHBARl emlős expressziós DNS-vektor (lásd a 19. ábrát) az érett amfiregulin 78 aminosavas változatának emlős sejtekből való szekrécióját szolgálja. A pDCHBARl DNS-vektor a pBAR plazmid TGF-B szekréciós kivezető szignál - érett amfiregulin hibrid DNS-szakaszát hordozza a CMV/HIV promoter szabályozása alatt, egy SV4O poliadenilációs szignál előtt. A vektor tartalmazza az amfiregulinnal azonos transzkripciós irányultságú SV2dh.fr gént is. A PSVDR/bom plazmidot Nael és Xbal enzimekkel emésztjük, majd a 6 kb méretű vektor fragmenst elválasztjuk a kihasított OncoM kódoló szekvenciától. A pbAR plazmidot szintén Nael és Xbal enzimekkel emésztjük, majd a TGF-β szignál szakasza karboxil-vég felöli öt aminosavát, és az érett amfiregulin 78 aminosavas változatának aminosavait kódoló, az amfiregulin-kodonok után egy stop kodont, egy EcoRV és egy Xbal restrikciós felismerő helyet hordozó 260 bázispár méretű fragmenst elkülönítjük. A fragmensek összekapcsolódási helyénél szekvenálással ellenőrizzük a nukleotid-sorrendet.

• · ·· ···« ···· ···· • « · · · · · • · ··· 9 ··· · 9 9 9 • 999 9999 999 9 999

- 176

A pDCHBFHILE plazmád előállítása:

Az emlős expressziós vektor pDCHBFHILE plazmid az amfiregulin/EGF hibrid fehérje szekréciójára szolgál. A plazmid lehetővé teszi az amfiregulin hidrofil dóménje és más, egyéb növekedési faktorok közötti fúziók létrehozását is. A plazmidot úgy állítjuk elő, hogy a pDCHBARl DNS-vektor 6,5 kb méretű Sstl/Xbal fragmensét, a kémiai szintézissel előállított emberi EGF gént hordozó, 175 bázispár méretű EcoRI/Xbal fragmenst, valamint a PHILl és a FHIL2 oligonukleotidokat összeligáljuk. A komplementer oligonukleotidok összeolvasztása után az 5’-végen SstlI, a 3’-végen pedig EcoRI túlnyúló végek jönnek létre, a komplementer szakasz pedig a TGF-B szignál szakaszának utolsó aminosavát, és a teljes amfiregulin hidrofil domént kódolja. A pDCHBARl plazmádból származik a CMV/HIV promoter, az utolsó aminosav kivételével a teljes TGF-β szignál szakaszt kódoló DHS-szakasz és az SV4O poliadenilációs jelzőszakasz. Az EGF-fragmenst dr. Timothy M. Rose (Oncogen) állította elő; a DNS-fragmens a további átalakításokhoz szükséges hasitóhelyeket is tartalmazza.

• · ·· • · · « · • <• · « ···« ·· ·

- 177

5.1.2, A pTAC DNS-vektor előállítása

A TacPak/EGF plazmidot dr. Timothy M. Rose (az Oncogen munkatársa) állította elő. Ez a plazmid a következő részekből áll: a pl35-l expressziós vektor (a pDR540 DNS-vektor [Pharmacia] származéka) trp-lac hibrid promotert és a Gro gén Shine-Dalgarno szakaszát hordozó BglII/BamHI fragmense; a TacPakl és a TacPak2 szintetikus oligonukleotidokból (dr. Rose, Oncogen) összeállított alkalikus foszfatáz szignál szakasz; a pBM22/PAK/EGF plazmidból kiemelt szintetikus EGF szakasz; egy transzkripciós terminátor szakasz; a p!35-l plazmidból származó, a neomicin rezisztencia gént és a pBR322 eredetű vektor fragmenseket tartalmazó DNS szakasz. A TacPak/EGF plazmidot BamHI enzimmel emésztjük, majd két bázist dezoxi-adenozin-trifoszfát és dezoxi-guanozin-trifoszfát felhasználásával feltöltünk, a Sáli enzimmel emésztett, két feltöltött bázist tartalmazó .végekkel ligálható DNS-t nyerve; végül pedig Pvul enzimmel emésztjük a DNS-t. Ezzel az emésztéssel eltávolítjuk ^szintetikus EGF gént, és az alkalikus foszfatáz szignál szakaszának túlnyomó részét; változatlanul marad azonban a Tac promoter, a Shine-Dalgarno szakasz és az ATG kezdő kodon. A 2,8 kb méretű DNS-fragmenst gél-elektroforezissel tisztítjuk.

···· ···· *··« • « · · · · ··· • · · · «··· ···« ··· V ···

- 178 5.1.3.. A módosított amfiregulin cDNS-fragmens előállítása'

A pARSTOP plazmidot Sáli enzimmel emésztjük, két bázist timidin-trifoszfát és dezoxi-citidin-trifoszfát felhasználásával feltöltünk, a BamHI enzimmel emésztett, 2-(dezoxi-adenozin-trifoszfáttal és dezoxi-guanozin-trifoszfáttal) feltöltött bázist tartalmazó végekkel ligálható DNS-t nyerve; végül pedig Ddel és BglI enzimekkel emésztjük a DNS-t. Ez utóbbi emésztéssel távolitjuk el a 242 bázispár méretű fragmenssel azonos elektroforetikus mobilitásu egyéb DNS-fragmenseket. A 243 bázispár méüEüü, az érett amfiregulin rövidebb VKPP aminosavakkal kezdődő, és CGEK aminosavakkal végződő változatát, és az azt követő, szintetikus utón kialakított stop kodont kódoló DNS-fragmenst gél-elektroforezissel tisztítjuk.

5.1.4. Az AIKPAR1 és az ALKPAR2 szintetikus oligonukleotidok előállítása

Kémiai szintézissel előállítjuk az ALKPAR1 és az ALKPAR2 komplementer oligonukleotidokat úgy, hogy az 5’-vég felöli Pvul- túlnyúló vég a TacPak/EGF Pvul/BamHI (részlegesen feltöltött) fragmensével, a 3’-vég felöldi Ddel túlnyúló vég pedig a pARSTOP

- 179 plazmid Ddel/részlegesen feltöltött Sáli fragmensével legyen ligálható. Az oligonukleotidokat egy Applied Biosystems oligonukleotid-szintetizáló készülékkel állítjuk elő, és akrilamid-gélen tisztítjuk. Az oligonukleotidokat T4 kináz enzimmel foszforiláljuk, és a két oligonukleotid ekvimoláris mennyiségét hődenaturálással, majd lassú hűtéssel összeolvasztjuk.

PvrűA

Ddel

IALALLPLLPTPVTKAVV

ALKPAR1 5’ CGCCCTCGCACTTGTCCCACTGCTGTTCACTCCAGTGACAAAAGCTGTAG 3’

ALKPAR2 3’ TAGCGGGAGCGTGAAGAGGGTGACGACAAGTGAGGTCACTGTTTTCGACATCAAT 5’.

180

5.1.5« A pTacAPARl plazmid ligálása és elkülönítése

A amfiregulin 243 bázispár méretű, Ddel-részlegesen feltöltött Sáli fragmensét; a TacPak/EGF vektor 2,8 kb méretű Pvul-részlegesen feltöltött BamHI fragmensét, és a kinázzal kezelt, összeolvasztott ALKPAR1+2 oligonukleotidokat DNS ligáz enzimmel ligáljuk. A ligációs reakcióeleggyel E. coli JM109 kompetens sejteket transzformálunk, és a transzformánsoM; neomicin antibiotikumot tartalmazó DB táptalaj-lemezeken szelektáljuk. A kívánt plazmidkonstrukció létrejöttét restrikciós emésztésekkel és DNS-szekvenálással bizonyítjuk. A pTacAPAR plazmid-DNS nukleotid sorrendjét a 20. ábrán mutatjuk be.

5.1.6. Az amfiregulin hidrofil doménjéből és az

EGF génből összeállított kiméra gént kódoló DNS-fragmens előállítása

A pDCHBPHILE plazmidot SstlI és Xbal enzimekkel emésztjük, majd a TGF-β szignál szakasz utolsó két aminosavát (AG) és az amfiregulin hidrofil domén•jének 37 aminosavból álló szakaszát (VVKP...RKKK) kódoló DNS-szakaszt, valamint az érett emberi EGF 53 aminosavból álló szakaszát (NSDS...WELR) kódoló szintetikus DNS-szakaszt hordozó, 286 bázispár méretű

181 fragmenst gél-elektroforezissel tisztítjuk.

5.1.7· Az APAREGF1 és az APAREGF2 szintetikus oligonukleotid előállítása

Kémiai szintézissel előállítjuk az APAREGF1 és az APAREGF2 komplementer oligonukleotidokat úgy, hogy az 5’-vég felöli Pvul túlnyúló vég a pTacAPARl plazmid Pvul-Xbal fragmensével, a 3’-vég felöli SstlI túlnyúló vég pedig a pDCHBPHILE plazmid SstlI/Xbal fragmensével legyen ligálható. Az oligonukleotidokat egy Applied Biosystems oligonukleotid-szintetizáló készülékkel állítjuk elő, és akrilamid-gélen tisztítjuk. Az oligonukleotidokat T4 kináz enzimmel foszforiláljuk, és a két oligonukleotid ekvimoláris mennyiségét hődenaturálással, majd lassú hűtéssel összeolvasztjuk.

Pvul SstlI

IALALLPLLFTPVTK APAREGF1 5’ CGCCCTCGCACTTCTCCCACTGCTGTTCACTCCAGTGACACC 3’ APAREGF2 3’ TAGCGGGAGCGTGAAGAGGGTGACGACAAGTGAGGTCACTGTGGCG 5’ .

·· ·· ···· ···· ···· • · · · · · · • · · ·· 9 • · · · · ···· ···· 999 · 999

182

5.1.8. A pTACAPHILE plazmid ligálása és elkülönítése

Az érett EGF szekvenciájához kapcsolt amfiregulin hidrofil domént kódoló, 286 bázispár méretű, SstlI/Xbal fragmenst; a pTacAPARl DNS-vektor 2,8 kb méretű Pvul/Xbal fragmensét, valamint a kinázzal kezelt, összeolvasztott APAREGF1+2 oligonukleotidokat DNS ligáz enzimmel ligáljuk, a ligációs eleggyel E. coli JM109 kompetens sejteket transzformálunk, és a transzformánsokat neomicinnel kiegészített LB táptalaj-lemezeken szelektáljuk. A DNS-fragmensek megfelelő összeépülését restrikciós emésztésekkel és DNS-szekvenálással ellenőrizzük. A pTACAPHILE nukleotid-sorrendjét a 21. ábrán mutatjuk be. A várt transzlációs terméket a szignál peptidáz enzim a közvetlenül az alkalikus foszfatáz szignál szakasza után található Ala-Gly dipeptidben hasítja, igy az amfiregulin hidrofil doménje egy aminosawal (glicin) hosszabb lesz. A 20. ábrán a normál emberi nukleotid-sorrendtől eltérő nukleotidokat vastag betűkkel jelöljük.

• « * · ♦ · • ··· · ♦·· • · ·· ··· « ···

- 183 5.1.9« A rekombináns amfiregulin tisztítása

A pTacAPARl és a pTacAPHILE plazmidokat

E. coli JM109 kompetens sejtekbe transzforrnáÍjuk, és a transzformánsokat 10 ml LB folyékony táptalajban, 37°C hőmérsékleten a 600 nm-en mért 0,7-es abszorbancia-érték eléréséig növesztjük. Ekkor a tenyészeteket 100 /űrnél izopropil-B, D-tiogalaktozid adagolásával indukáljuk, majd további 24 - 72 órán át növesztjük. A tenyészeteket 5000 fordulat/perc fordulatszámon, kétszer, egyenként 15 percen át centrifugáljuk, az üledéket félretesszük, és a tisztítást a felüluszóval folytatjuk. A mintákat Amicon ultrafiltrációs készülékben, YM5 szűrőt (áteresztési határa 5000 halton) használva, tízszeresükre betöményitjük. A betöményitett mintákat 5 térfogatnyi MilliQ vízzel hifolyadékx gitva, az eredeti*Y fogátának egytizedét állítjuk be. Jégecetet adagolunk 1 mól végkoncentráció eléréséig, majd a mintákat 4°C hőmérsékleten 2-24 órán át inkubáljuk. Ezután a mintákat Oakridge-csövékben, 19.000 fordulat/perc fordulatszámmal, 20 percen át, 4°C hőmérsékleten, SS34 rotorban centrifugáljuk, az üledéket 20 ml 1 mólos ecetsavval extraháljuk, és a felüluszókat egyesitjük. A tisztított felüluszókat 0,1 mólos ecetsavval szemben, 2 napon át dializáljuk, • · · * · · · • · ··· · ··· • · · · · ···· ···· ··· · ···

- 184 majd liofilezzük, és -20°C hőmérsékleten tároljuk.

Az. amfiregulin fehérje kimutatása céljából a sejtüledékeket és a nyers,,szárított felüluszókat a fehérjék elektroforezise és szűrőpapírhoz kötése után ellenanyagokkal vizsgáljuk, illetve mérjük az üledékek és a felüluszók növekedésgátló hatását.

/ul tenyészetből származó sejtüledéket, illetve 100 - 200 /ul szárított felüluszót 16 $-os tricin-poliakril-amid gélben elektroforetizálunk, a gélt Fást Green festékkel festjük, és a fehérjéket mikrocellulóz szűrőpapírra visszük. Az elektroforetizált, majd szűrőpapírhoz kötött fehérjék ellenanyagokká, végzett immunológiai vizsgálatát (Western biot) a korábbiakban (2.1.6.) leírtak szerint eljárva végezzük.

»··· ···· ···

- 185 5.2. . Az amfiregulin expressziója bakteriális sejtekkel

A pTAcAPARl plazmid DNS-t hordozó transzformánsok tenyészeteiben, a sejtűledékben nagy mennyiségű, elektroforetikus vándorlási sebessége alapén 10 kdalton molekulatömegű, immunológiai módszerekkel pozitívnak mutatkozó fehérjét, illetve kisebb mennyiségű lebontási terméket, és valószínűleg dimer fehérjéket mutatunk ki. A tenyészetek felűluszóiban 100 - 200 ng/ml szekretált, immunológiai reakciókban pozitívnak mutatkozó amfiregulin fehérjét találunk. A felűluszók növekedésgátló aktivitását A431-A3 indikátor sejtvonalon, tisztított, nativ amfiregulin standardokkal szemben mérve az amfiregulin koncentrációját mintegy 150 ng/mlnek találjuk. Nagy mennyiségű, immunológiai reakciókban pozitívnak mutatkozó fehérjét állítunk elő ebben az expressziós rendszerben: a fehérje nagyrészt a sejten belül, aggregált formában található. A periplazmás preparátumok, illetve a felűluszók vizsgálatajalapján az aktív fehérje két-három napos tenyésztés után választódik ki.

A pTacAEHILE felhasználásával bármely klónozott gén N-terminális végéhez egyszerű módon hozzákapcsolható az amfiregulin hidrofil doménje. E szakasz hozzákapcsolásával megváltozhatnak a ligandumnak a saját ·· 44 ···· 4444 ·444 • · · 4 ·· · • 4 444 <444

4 4 44 • 444 4444 444 ····

186 receptorához való kötődési sajátságai; ez a szakasz irányíthatja a fehérje sejtmagba való szállítását, DNS-hez való kötődését, illetve lehetővé teheti a lipid- illetve az egyéb, rendes körülmények között a fehérje számára átjárhatatlan membránokon való átjutást.

A MIKROORGANIZMUS TÖRZSEK LETÉTBE HELYEZÉSE

Az alábbi mikroorganizmus törzseket az Agricultural Research Gulture Collection, Northern Régiónál Research Center (NRRL) törzsgyüjteményében, a következő azonosítási számok alatt helyezzük letétbe:

Mikroorganizmus törzsek

Plazmid Azonosítási szám

Escherichia coli HB101

Escherichia coli HB101

Escherichia coli HB101

Escherichia coli JM1O9

Escherichia coli JM109 pARl pARA12 pARHő pTacAPARl pTacAPHILE

A fenti, letétbe helyezett mikroorganizmus törzsek, illetve a találmány szerinti eljárás fentebb ismertetett kivitelezési változatai a találmány oltalmi körét

- 187 nem korlátozzák; a fenti törzsek, illetve kivitelezési változatok mindössze szemléltetik a találmány szerinti eljárást. Minden olyan mikroorganizmus törzs illetve eljárás, amely a fentiekkel funkcionális értelemben azonosnak tekinthető, a találmány oltalmi körébe tartozik. A fentebb leirt, illetve bemutatott kivitelezési változatok mellett a találmány szerinti eljárás számos módosítása válik nyilvánvalóvá az e területen járatos szakemberek számára a fenti leírás alapján. Ezek a módosítások, a mellékelt szabadalmi igénypontok alapján a találmány oltalmi körébe tartoznak.

A fenti leírásban szereplő valamennyi bázispár- illetve aminosav-szám, illetve a nukleotidok és a peptidek mérete egyaránt közelitő érték; ezek csak a leírás megkönnyítését szolgálják.

«· ·· ···· «*·· ···« • 99·· · · • · ··· · ··· • · · · · ···· ···· ··· 9 ···

188

SZABADALMI IGÉNYPONTOK

Claims (27)

1. Eljárás fehérje előállítására, azzal jellemezve, hogy a nevezett fehérje aminosav-sorrendje a következő:

1 10 20 V V K P P Q N K T E S E N T S D KPKRKKKG G K N G K 30 40 50 N R R N R K K K N P C N A E FQNFCIHGE C K Y I 60 70 78

EHLE AVTCKCQQEY EGERCGEK.

2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a nevezett fehérje molekulatömege 8500 - 25000 dalton.

3. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a nevezett fehérje izoelektromos pontja a 7,6 - 8,0 tartományba esik.

4. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a nevezett fehérje glikozilált.

5. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a nevezett fehérje nem glikozilált.

·· ·· ···· ···· ·*·· • · · · · · · • · ··· · ···

V · · · · ···· ···· ··· · ···

189

6. Eljárás fehérje előállítására, azzal jel- lemezve, hogy a nevezett fehérje aminosav-sorrendje a következő:

1 10 20

s V R V E Q V V K P P Q N K T E S Ε N T S D K P K R K K K 30' 40 50 G G K N G K N R R N R K K KNPCNAEF Q N F C I 60 70 80 84 H G E C K Y I E H L I 3 A V T C KCQQEYFG E R C G Ε K .

7. A 6. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a nevezett fehérje molekulatömege

9100 - 25000 dalton.

8. A 6. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a nevezett fehérje izoelektromos pontja a 7,6 - 8,0 tartományba esik.

9. A 6. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a nevezett fehérje’glikozilált.

10. A 6. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a nevezett fehérje nem glikozilált·

11. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a nevezett fehérje, vagy az abból származó peptid, illetve peptid-fragmens az epitéliá.ii_s ·· ·· ···· ··»· ···· • · · · · · · • 4 ··· ® ··· • · · · · • ••4 ··«· ··· 9 ···

190 eredetű emberi rákos sejtvonalak növekedését gátolja.

12. A 11. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a nevezett epitéliális eredetű emberi rákos sejtvonal az A431 jelű, epidermális vulva-karcinóma, illetve a HTB132 jelű, emlő adenokarcinóma sejtvonal bármelyike.

13. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a nevezett fehérje, vagy az abból származó peptid, illetve peptid-fragmens az in vitro tenyésztett emberi előbőr fibroblasztok növekedését serkenti.

14. A 13. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a nevezett, in vitro tenyésztett emberi előbőr fibroblaszt sejtvonal a Sadamoto vagy a Goodwin sejtvonalak bármelyike.

15. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a nevezett fehérje vagy az abbi származó peptid illetve peptid-fragmens kettős funkciójú sejtnövekedés-szabályozó hatóanyagként működve gátolja az epitéliális eredetű emberi rákos sejtvonalak növekedését és serkenti az in vitro tenyésztett emberi előbőr fibroblasztok osztódását.

·· ·· ···· ···· ♦··· • · · # · · · * · ··· * «·· • · · · · ··*« ···· ·»· · ···

- 191 -

16. A 15. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a nevezett epitéliális eredetű emberi rákos sejtvonal az A431 jelű, epidermális vulva-karcinóma illetve a HTB132 jelű, emlő adenokarcinóma sejtvonal bármelyike.

17. A 15. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a nevezett in vitro tenyésztett emberi előbőr fibroblaszt-sejtvonal a Sadamoto illetve a Goodwin sejtvonal bármelyike.

18. A 11- 17. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a nevezett fehérje vagy az abból származó peptid illetve peptid-fragmens sejtnövekedést gátló, illetve serkentő hatását a következő módszer szerint eljárva határozzuk meg:

a) a mérőlyukanként 50 /ul, 5 % hővel inakti- vált magzati szarvasmarha szérummal (FBS), penicillinnel, sztreptomicinnel és glutaminnal kiegészített DMEM táptalajból álló teszt-táptalajban felszuszpendál, 3,5 x 10²* sejtet tartalmazó mikrotitráló lemezeket 3 órán át inkubáljuk, ·· • · · * · · · • · ··♦ · ··· • · · · · ·*«· ···· ··· · ···

- 192 -

b) - 50 /ul, amfiregulint tartalmazó teszt-táp- talajt adagolunk minden mérőlyukba, a kontroll mérőlyukakba pedig 50 /ul, amfiregulint nem tartalmazó teszt-táptalajt mérünk, majd 37°C hőmérsékleten, 2-3 napon át inkubáljuk a lemezeket,

c) minden mérőlyukba 100 /ul, 125-ös tömegszámú jódizotóppal jelölt ^’^^I-jodo-P’-^^^I-dezoxi-uridint (I-UdR) tartalmazó oldatot adagolunk, és 37°C hőmérsékleten, 4-6 órán át inkubálunk,

d) a táptalajt eltávolítjuk, és minden mérőlyukat egyszer PBS jelű pufferral mosunk,

e) 200 /Ul metanolt mérünk minden mérőlyukba,

10 percen át, szobahőmérsékleten inkubálunk, majL eltávolítjuk a metanolt,

f) 200 /ul, 1 mól koncentrációjú nátrium-hidroxid-oldatot adagolunk minden mérőlyukba, majd 37°C hőmérsékleten 30 percen át inkubálunk,

g) az 1 mólos nátrium-hidroxid-oldatot eltávolítjuk, majd gamma-számlálóval mérjük:

···· «··· ···· • · · · ·· ·· • · · ··· · ··· ···· ···· ··· · ···

193 a radioaktív beütések száma arányos a 125-ös tömegszámú jódizotóppal jelölt jód-dezoxi-uridin beépülésével, és igy a sejtosztódással, mig a radioaktív beütések hiánya a sejtosztódás gátlását jelzi.

19. A 6. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a nevezett fehérje, vagy az abból származó peptid vagy peptid-fragmens gátolja az epitéliális eredetű emberi rákos sejtvonalak növekedését.

20. A 19. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a nevezett epitéliális eredetű emberi rákos sejtvonal az A431 jelű, epidermális vulva-karcinóma, illetve a HTB132 jelű, emlő adenokarcinóma sejtvonal bármelyike.

21. A 6. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a nevezett fehérje, vagy az abból származó peptid vagy peptid-fragmens serkenti az in vitro tenyésztett emberi előbőr fibroblasztok növekedését..

22. A 21. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a nevezett in vitro tenyésztett emberi előbőr fibroblaszt-sejtvonal a Sadamoto illetve a Goodwin sejtvonal bármelyike.

·· ·· ···· ···· ···♦ · «··· · · _ • · ··· · ··· • · · · · ···· «··· ··· * ···

194

23. A 6. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a nevezett fehérje, vagy az abból származó peptid vagy peptid-fragmens kettős funkciójú sejtnövekedést szabályozó hatóanyagként működve gátolja az epitéliális eredeti! emberi rákos sejtvonalak növekedését, valamint serkenti az in vitro tenyésztett emberi előbőr fibroblasztok osztódását.

24. A 23. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a nevezett epitéliális eredetű emberi rákos sejtvonal az A431 jelű epidermális vulva-karcinóma, illetve a HTB132 emlő adenokarcinóma sejtvonal bármelyike.

25. A 23. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a nevezett emberi előbőr fibroblaszt sejtvonal a Sadamoto, illetve a Goodwin sejtvonal bármelyike.

26. A 19 - 25. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a nevezett fehérje, vagy az abból származó bármely peptid illetve peptid-fragmens sejtnövekedést gátló, illetve serkentő hatását a következő módszer szerint eljárva határozzuk meg:

a) a mérőlyukanként 50 /ul, 5 / hővel inaktivált magzati szarvasmarha szérummal (FBS), penicillinnel, sztreptomicinnel és glutaminnal kiegészített DMEM táptalajból álló teszt-táptalajban • ·

• - 195 - felszuszpendált, 3,5 x 10^ sejtet tartalmazó mikrotitráló lemezeket 3 órán át inkubáljuk, b) 50 /ul, amfiregulint tartalmazó teszt-táptalajt adagolunk minden mérőlyukba, a kontroll mérőlyukakba pedig 50 /ul, amfiregulint nem tartalmazó teszt-táptalajt mérünk, majd 37°C hőmérsékleten, 2-3 napon át inkubá^uk a lemezeket, c) minden mérőlyukba 100 /ul, 125-ös tömegszámú jódizotóppal jelölt ¹²^I-jodo-2’-¹²^I-dezoxi-uridint (I-UdR) tartalmazó oldatot adagolunk, és 37°C hőmérsékleten, 4-6 órán át inkubálunk, <υ a táptalajt eltávolítjuk, és minden mérőlyu- kat PBS jelű pufferral egyszer mosunk, e) 200 /ul metanolt mérünk minden mérőlyukba, 10 percen át, szobahőmérsékleten inkubÉLunk, majd eltávolítjuk a metanolt, f) 200 /ul, 1 mól koncentrációjú nátrium-hidroxid-oldatot adagolunk minden mérőlyukba, majd 37°0 hőmérsékleten, 30 percen át inkubálunk,

·· ···· ···· ···· ····

- 196 g) . az 1 mólos nátrium-hidroxid-oldatot eltávolítjuk, majd gamma-számlálóval mérjük: a radioaktív beütések száma arányos a 125-ös tömegszámú jódizotóppal jelölt jód-dezoxi-uridin beépülésével, és igy a sejtosztódással, mig a radioaktív beütések hiánya a sejtosztódás gátlását jelzi.

27. Eljárás egy kettős funkciójú növekedésszabályozó hatóanyag, az amfiregulin előállítására, azzal jellemezve, hogy: