JPH02104596A - アムフイレグリン - Google Patents

アムフイレグリン

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JPH02104596A
JPH02104596A JP1014232A JP1423289A JPH02104596A JP H02104596 A JPH02104596 A JP H02104596A JP 1014232 A JP1014232 A JP 1014232A JP 1423289 A JP1423289 A JP 1423289A JP H02104596 A JPH02104596 A JP H02104596A
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amphiregulin
protein
cells
growth
cell
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JP1014232A
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Mohammed Shoyab
モハメド　ソーヤフ
Vicki L Mcdonald
ビツキー　エル　マクドナルド
James G Bradley
ジエームス　ジー　ブラドレイ
Greg Plowman
グレグ　プローマン
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Oncogen LP
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Oncogen LP
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    • C12N2800/108—Plasmid DNA episomal vectors

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】
〔１，緒論〕 本発明は、新規な生長調節糖蛋白であるアムフイレグリ
ン（Ａ判ｉ（デーｇ％Ｌ４％）の製造及び用途に関する
。本発明の蛋白は、三、四の腫瘍由来の細胞株の生長を
強（阻害する一方、三、四の他の細胞株の細胞生長を促
進する。この二機能性生長調節剤の広い治療上の応用が
記載され、傷の治療並びに癌の診断及び治療を含むがそ
れに限定されない。 〔２９発明の背景〕 細胞の生長及び分化は、多くの刺激、阻害及び共生の因
子及びホルモンにより開始、促進、維持そして調節され
るようにみえる。細胞のホメオスタシスメカニズムの転
換及び／又は分解が、＠瘍生成を含む生長に関する疾患
の基本的な原因と思われる。生長修飾因子は、広範囲の
病理学上及び生理学上のプロセス（信号導入、細胞伝達
、生長及び発育、胚形成、免疫反応、造血、細胞の生存
及び分化、炎症、組織の補修及びリモデリング、動脈硬
化及び癌を含む）に関係がある。もつともなことと思わ
れるように、癌の診断、予後及び治療における使用の可
能性のために、生長修飾因子な単離、確認しそしてその
機能的メカニズムを規定することに大きな関心がある。 その上、これらの因子の知識を得ることは、正常な生長
のコントロールの背後の基本的なメカニズム及び癌細胞
におけるその損失の理解を助げろだろう。 上皮生長因子（ＥＧＰ’）、形質転換生長因子−α（Ｔ
ＧＦα）、血小板由来生長因子（ＰＤＧＦ）、線維芽細
胞生長因子（ＦＧＦ）、神経生長因子（ＮＧＦ）、形質
転換生長因子β（ＴＧＦβ）、インスリン生長因子Ｉ及
び■（ＩＧＦＩ、ＩＧＦＴＩ）、造血生長因子例えばエ
リスロポイエチン、コロニー刺激因子（Ｃ５Ｆ１及び２
）、インターロイキン類（ＩＬ−１〜６）、インターフ
ェロン類（ＩＦＮα、β、γ）、腫瘍壊死因子α及びβ
（ＴＮＦα、β）、ロイコレグリン、オニコスタチンに
並に他の駆足のより明確でない因子は、正常な生理学上
の条件又は外因性の刺激への反応の何れかで種々の細胞
のタイプにより生成される生長及び分化の修飾蛋白であ
る。これらの因子の多（は、オートクリン（α％ｔｏｅ
デｉｓａ　）及びバラクリン（ＰＧｒＧ６−デ４ｓｓ　
）のやり方で働（ように思われる。（論説として次のも
のをか照。 Ｇｏ１＆ａｔｉｎ、　ａｔ　ａｌ、、　１９８６、Ｃ’
ａ％ａｓｒ　Ｒａｍ　、　４６　：１０１５−１０２９
；　Ｒｏｇ−％＜Ｆ％デｔ、１９８６、５ｅｉａ−ｎｃ
ａ　　２３４　：　１６１−６６　；Ｐａｒｄａａｒ　
　１９８７、Ｃａｓ−ｃｍｒＲａａ、４７：１４Ｂ８　
１４９１；、５ＩＳｃＡａ、１９８６、Ｓａｔ、　Ａｔ
ｐｈｍｒ、　２５４　：４０−４７　：ＭａｒａｈａＬ
Ｌ、　１９８７、Ｃａ１ｌ　　５０　：　５−６　；Ｍ
ａｌａｈｍｒ　ａｓｄ　Ａｎｄｇｒａｏｓ。 １９８７、Ｃａ１ｌ　　３０ニア１５−７２０：Ｃｒａ
ｍｉｎｇ　ａｓｄＭｔｒＮｓｒｌａｓ、　１９８５、Ｂ
ｔｏｅｈａｍ、　Ｊ、２２６　：３４５−３６０　；ｌ
１ａｔｈａｓ、　１９８７、／、　Ｃ１４％、　ｌ５ｖ
ａｓｔ、　７９　：３１９−３２６　；５ｐｏｒｓ　　
ａｓｄ　　Ｒｏｂｅｒｔｓ、１９８６、Ｊ。 ＣＨ外、Ｉ外νａａｔ、７８：３２９　３３２；ＣＪｊ
ｄ、１９８７、Ｎａｔ％ｒｅ、３２６　：　３３０−３
３１　；Ｈａｓｔｌａｒ　　ａｓｄ　　Ｃａｒ−ａｍｉ
、１９８７、ＩＶｅｖ　Ｅｇｇ、Ｊ、Ｍａｄ、３１６　
：　３７９−３８５　ｆａｔｓａｔａｉｓ、Ｊ、Ｃａ１
１．Ｂｉｏｃｈｇｍ、、３３：２１３−２２４；Ｚａｒ
ｌｉｓｇ、ａｔ　　ａｌ、、１９８７、ｐｒｏｏ。 Ｎａｔｌ、Ａａａｄ、Ｓａｉ、Ｕ、Ｓ、Ａ、８３；９７
３９−９７４４；５ｐｏｔｓ　ａｎｄ　Ｔｏｄａｒｏ、
１９８５、Ｎ、Ｅｇｇ、Ｊ、ＭａｒＬ。 ３０３　：８７８−８８０　；５ｐｏｒｎ　　ａｓｄ　
　Ｒｏｂｅｒｔｓ、１９８５、Ｎａｔｓｒａ　　３１３
　　二　７４５−７４７）　。 生物学上活性なホルボール（ｐｈｏｒｂｏｌ）エステル
例えば１２−（、Ｊ−テトラデカノイル−ホルポール−
１３−アセテート（ＴＰＡ）は、生体内における腫瘍プ
ロモーターの可能性がありそして生体外釜に生体内にお
ける広範囲の生物学的及び生化学的反応を明らかにしそ
して調節する（Ｂｌｓｍｂｍｒｇ、１９８１、Ｃｒｔｔ
、Ｒａｗ、Ｔｏｘｉｃｅｒ、９　：１５３−１９７；Ｓ
ｌａｇａ、１９８３、Ｃａｎｃｅｒ　　５ｓｒｖ、２　
：５９５−６１２）。ＴＰＡがヒト胸部腺癌細胞株ＭＣ
Ｆ−７の生長を阻害することは、かなり長い間知られて
きている。 さらに、ＴＰＡは、又ＴＰＡが処理した細胞が分泌細胞
の形態学的特徴を示す限り、ＭＣＦ−７細胞の形態を変
える（Ｏｓｈｏｒｎａ、　ａｔ　ａｌ、、　１９８１、
Ｊ、　Ｃｌ１ｎ、　ｌ５ｖａａｔ。 ６７：９４３　９５１；Ｖａｌａｔｔａ　　ａｔ　ｔＬ
ｊ、、１９８７、Ｃａｎｃｅｒ　　Ｅｇｇ、４７：１６
１５−１６２０）。 〔３１発明の要約〕 本発明は、異常な二機能性細胞生長調節活性を示す新規
な細胞生長調節因子であるアムフイレグリンに関する。 アムフイレグリンは、腫瘍細胞の生長を阻害ししかも成
る正常な細胞の生長を増強する。アムフイレグリンは、
平均分子量２２，５００ダルトンを有する非常に親水性
の糖蛋白であり、２種の明確に異るが機能的に同等な形
である先端を切った形及びより大きな形で生ずる。大き
な形で見いだされる追加の６個のＮ末端残基以外に、２
ａの形はアミノ酸レベルで完全に同等である（第１２図
）。本発明は、ＴＰＡ処理ＭＣＦ−７細胞が糖蛋白（，
４４３１扁平上皮癌細胞株及び他の肺癌細胞株の生長を
阻害するばかりか正常のヒト線維子細胞及び成る他の細
胞株の生長を増強する）を放出するという本発明者の発
見に一部基く。 本発明は、アムフイレグリンが同定され均一になるまで
精製されそして十分に構造的且機能的に特徴付けられる
実施例により記載される。他の実施例では、アムフイレ
グリンプレカーサーをエンコードするｅＤ　ＮＡ及びゲ
ノムクローンの単離及び配列化が記載される。これらの
クローンは、形質転換された細菌及びトランスフェクシ
ョンされた真核宿主の細胞に生物学的に活性なアムフイ
レグリンの高いレベルの合成を導きうる発現ベクターを
製造するのに用いられた。 このユニークな因子に関する広範囲の用途は、下記の本
発明により包含される。 〔４、図面の簡単な記述〕 第１図は、製品及び洗液の標品逆相ＨＰＬＣである。 第２図は、第１図からのプールされた画分４７〜６２の
半標品逆相ＨＰＬＣである。 第３Ａ図は、先の工程からのブール■の分析逆相ＨＰＬ
Ｃである。 第３Ｂ図は、先の工程からのプール璽の分析逆相ＨＰＬ
Ｃである。 第４図は、バイオ・シル（Ｂイ＠−：３ｔＬ）ＴＳＫ２
５０カラムの第３Ａ及び３Ｂ図からの両分のゲル浸透ク
ロマトグラフィである。クロマトグラフィは以下の（６
，３，２，）項で記載したように行われた。（Ａ）濃縮
した両分３５０ＨＰＬＣ（第３Ａ図）　；　（Ｂ）濃縮
した両分３６のＨＰＬＣ（第３Ａ図）；（ｃ’）ａ縮し
た画分３７のＨＰＬＣ（第３Ａ図）　；　（Ｄ＞濃縮し
た画分４１及び４２を一緒にしたもののＨＰＬＣ（第３
Ｂ図）。 第５図は、バイオ−シルＴＳＫ２５０カラムのゲル浸透
ＨＰＬＣによる精製ＡＲ及びＳ−ピリジルエチル化−Ａ
Ｅ（ＳＰＥ−ＡＲ）の分析である。クロマトグラフィは
、下記の（６、３、２，）項に記載されたように行われ
た。用いた分子量マーカーは、オポアルブミン、４３ｋ
Ｄ’、キモトリプシノーゲンＡ、２５ｋＤ；リボヌクレ
アーゼ、１４ｋＤ；そしてインスリン、６ｋＤ、（Ａ）
ＡＲ；　（Ｂ）ＳＰＥ−ＡＲ０第６図は、逆相ウルトラ
ボアＲＰＦＩＣ０３カラム（４，６×７５圃）のＡＥ及
び５ＰＥ−ＡＲの分析である。勾配は、室温で１ｊＥ７
！／分の流速で一次溶媒０．１％ＴＦＡと第二次溶媒ア
セトニトリル（０，１％ＴＦＡを含む）との間で行われ
た。１１の両分を集めた。（Ａ）ＡＲ；　（Ｂ）ＳＰＥ
−ＡＲ０第７図は、ＡＲ蛋白のｆｉＤＦｌ−ＰＡＧＥ分
析である。（Ａ）不連続なバッファー系を有する１５％
５ＤＳ−ＰＡＧＥゲル（０，７５ＷＸ　１８ｃｔｎＸ　
１５−バイオ・ラッド）を３０ミリアンペアの一定電流
で操作した。用いた分子量マーカーは、ホスホリラーゼ
Ｅ、９２．５ｋＤ：ＢＳＡ、６６．２ｋＤ：オボアルブ
ミン、４３ｋＤ；炭酸脱水酵素、３１ｋＤ：キモトリプ
シノーゲンＡ、２５．７ｋＤ：大豆トリプシンインヒビ
ター、２１．５ｋＤ：ラクトグロブリン、１８．４＆ｊ
）；リゾチーム、１４．４０）；アプロトニン、６．２
０）；インスリンサブユニット、３ｋＤｏＶ−ン１：Ａ
Ｒ；レーン２：ＮＧ−ＡＲ；レーン３：！ＩＰＥ−ＡＲ
；レーン４：ＮＧ−８ＰＥ−ＡＥ、（Ｅ）２０チ５ＤＳ
−ＰＡＧＥミニゲル（０，７５ｍＸ　１０ｃｍＸ　７　
ｔｓｎ　）を２００ボルトの一定電圧で操作した。前記
と同じ分子量マーカーを用いた。Ｖ−ン１：ＡＲ：レー
ン２　：ＮＧ−ＡＲ；レーン３：ホスホリノｆ−ゼ処理
ＮＧ−ＡＥ、デｐ　ＨＰＬＣで分離。 第８図は、＋！′Ｉ標識ＡＲのＩＥＦ分析である。４．
６５〜９．６のＰＩ値を有する下記の標準を用いた。フ
ィコシアニン、４．６５；β−ラクトグロブリンＢ、　
５．１　；ウシ炭酸脱水酵素、６．ｌ：ヒト炭酸脱水酵
素、６．５；ウマミオグロビン、７．０；クジラミオグ
ロビン、８．０５；α−キモトリプシン、８．８；チト
クロームＣ，９，６゜ 第９図で、（Ａ）Ａ４３Ｌ細胞のＤＮＡへの１２５１−
デオキシウリジン添加の阻害に関するＡＥの投与量・反
応曲線であり、ω）ヒト包皮線維芽細胞（サカモト）の
ＤＮＡへのＩｆ！　／−デオキシウリジン添加の刺激に
関するＡＲの作用である。 第１０図は、ネズミＥＧＦ及びＡＲによる固定化Ａ４３
１細胞又はＡ４３１血漿膜への”Ｉ−ＥＧＦ結合の競合
である。結合アッセイ＋Ｌ下記の［：６．１．５．］項
に記載したように行われた。１穴当り１００μを又は５
０μｔのサンプルがそれぞれ固定化細胞又は膜とのアッ
セイに用いられた。 記号　　　レセプター源　　　競合物 ・　　　　　固定化細胞　　　　　ＥＧＦム　　　　　
固定化細胞　　　　　ＡＲｏ　　　　　　　　１［ＥＧ
Ｆ Δ　　　　　　　膜　　　　　　　　ＡＲ第１１図は、
ＡＲ及びヒトＥＧＦ〔カイト（Ｋｙｌ）及びドーリット
ル（Ｄａｏｌｉｔｔｌｍ））のヒトロバシー分析である
。 （Ａ）ＡＲ（残基１〜８４）；（Ｂ）ＡＲ（残基４４〜
８４）；（Ｃ）ＥＧＦ（残基１〜５３）；（Ｄ）ＡＲプ
レカーサー（残基１〜２５２　）　；　（Ｅ）ヒトＡＲ
（残基１〜８４）及びＥＧＦ（残基１〜５３）の比較〔
アライメントは第１３図により、七のため成熟ＡＲの残
基４６であるシスティンは成熟ＥＧＦの残基６のシステ
ィンに一致する〕。 第１２図は、成熟ＡＲ及び先を切られたＡＲのアミノ酸
配列である。アミノ酸に関する標準の単一の字コードが
用いられている。アラニン（Ａ）　；アルギニン（Ｒ）
；アスパラギン（Ｎ）；アスパラギン酸ＣＤ）　；シス
ティン（の；グルタミン（Ｑ）　；グルタミン酸（Ｅ）
；グリシンＣＧ）　；ヒスチジン（Ｈ）；イソロイシン
（Ｉ）；ロイシン（Ｌ）；リジン（Ｋ）　；メチオニン
億）；フェニルアラニンＣＦ）；−ｆロリン＜ｐ＞　；
セリンＣ３）　；スレオニン（Ｔ）；トリプトファン（
イ）；チロシンＣＹ）及びバリン＜Ｖ＞。 第１３図は、アムフイレグリン（ＡＲ）及びＥＧＦスー
パーファミリーのメンバーのアミノ酸配列の比較である
。 第１４図では、（Ａ）セルロース（○−○）、変性ＤＮ
Ａセルロース（ローロ）、　天然ＤＮＡセルロース（Δ
−Δ）へのＩｔｓ　（−ＡＢ結合である。（Ｂ）セルロ
ース（Ｏ−○）及びＤＮＡ−セルロース（ローロ）への
ｌ２ＳＩ−ＡＲ結合をセルロース（Δ−Δ）及びＤＮＡ
−セルロース（−）への”’Ｉ−ＥＧＦ結合と比較して
いる。 第１５図は、固相技術により生じた合成アムフイレグリ
ンペプチドである。残基１６６〜１８４（４２５９）、
１０８〜１３０（Ａ２６４）、３１〜５０（屋２７９）
、７１〜９０　（４２８０）及び２２１〜２４０（屋２
８１）に相当する５種のペプチドが固相合成により生成
され次に逆相ＨＰＬＣにより精製された。 第１６図は、ヒトアムフイレグリンをエンコードしたａ
ＤＮＡクローンｐＡＲ１のヌクレオチド及び演鐸アミノ
醗配列である。 第１７図は、ヒトアムフイレグリンゲノム配列である。 第１８図は、ゲノム配列に関するＡＲ分子のエクンン構
造及び蛋白ドメインの概略図である。 第１９図は、ｐＤｃＨＥＡＲ１発現ベクターのヌクレオ
チド配列である。 第２０図は、ｐＴａｃＡＰＡＲｌのヌクレオチド配列で
ある。 第２１図は、ｐＴａｃＡＰＨＩＬＥのヌクレオチド配列
である。 〔５０発明の詳細な記述〕 本発明は、アムフイレグリン（ＡＲ）、さらにヌクレオ
チド配列二ンコーディングＡＲ及びＡＲプレカーサー、
さらに従来又は組換えＤＮＡ法によるＡＨの製造に関す
る。 新規な細胞生長調節因子であるＡＲは、２種の異るしか
し機能的に等しい形としてＴＰＡ処理ＭＣＦ−７細胞に
より発現且分泌される。２種の形は、構造的に同一であ
るが、ただし大きな形では追加の６個のアミノ末端残基
がある。 ＡＲは腫瘍細胞におけるＤＮＡ合成に対する阻害活性の
可能性を示しそれ故有力な抗癌化合物としての可能性を
有する。特別な興味として線維芽細胞及び他の正常な細
胞における生長を促進するＡＨの能力があり、それはＡ
Ｒが細胞の生長の加速を必要とする症状即ち火傷及び創
傷を治療するのに有用であろうことを示唆している。 ＡＲ又はそのフラグメント及び誘導体は、創傷の治療に
おけろと同じく腫瘍の治療及びモニターにおいて広範囲
な治療上の用途の可能性を有する。ＡＲは又骨の吸収の
調節及び免疫反応並にアラキドン酸カスケードの刺激に
おける用途があるだろう。アムフイレグリン遺伝子及び
遺伝子生成物、その製法さらにその用途は、以下の記述
及び実施例に詳しく記述される。 ［：５．１．アムフイＶグリンの生成及び精製〕アムフ
イＶグリンは、ヒトの乳癌細胞株ＭＣＦ−７により、腫
瘍促進剤１２−Ｑ−テトラデカノイル−ホルポール−１
３−アセテート（ＴＰＡ）Ｋより処理されるとき分泌さ
れる。アムフイレグリン＋Ｌ　このように培養されたＴ
ＰＡ処理ＭＣＦ−７Ｍｆ胞の調整された培地から単離さ
れ次に高い特異的な活性にｍ製される。アムフイレグリ
ンは、又ＴＰＡ又は他の腫瘍促進剤による処理による誘
導により又はなしに他の細胞株から単離される。一方、
アムフイレグリンは、組換えＤＮＡ法により又は固相ペ
プチド合成により生成される。 アムフイレグリンは、当業者に周知の種々の方法及び技
術を用いて精製され、クロマトグラフィ（例えば、逆相
液体、ゲル浸透、液体交換、イオン交換、サイズ排除、
アフイニテイクロマトグラフイ）、遠心分離、電気泳動
法、溶解度の差を含むがそれに限定されず、さらに又は
蛋白の精製に関する任意の他の標準的な方法により精製
される。 本発明の特定の轢様では、ＭＣＦ−７細胞は、４８時間
ＴＰＡにより処理されそして４日間新鮮な無血清培地で
生長する。得られた調整された培地を集めそして下記の
〔６゜２、〕項に記載されたよ５に粗ＡＢを製造するの
に用いる。 逆相液体及びゲル浸透クロマトグラフィの組合せが用い
られてＡＲを下記の（６，３，）項に記載するように見
掛は上の均一性まで精製し、そして粗原料の１，８４２
倍〜２，２７０倍の間に精製したＡＥを得る。方法は再
現可能であり、２．７〜３．４Ｘ１０”単位／■蛋白の
特異的活性を有する精製したＡＲ製品を生ずる。 （５，２，アムフィＶグリン遺伝子〕 （５，２，１，７ムフイレグリンの単離及びクローニン
ク〕本発明の方法の実施では、ヒトアムフイレグリンに
関する配列をコードするヌクレオチド又はその機能的同
等物を用いて、ヒトアムフイレグリン生成物の発現を導
（組換え分子を発生させる。ＡＲに関する配列をコード
するヌクレオチドは、ＡＨ様の活性を生ずる細胞源から
得る。例えば特定の態様では、ヒト乳癌細胞株ＭＣＦ−
７をＡＲヌクレオチドコーディング配列の源として用い
る。コーディング配列は、このような細胞源から単離且
精製されたＲＮＡのｅＤＮＡクローニングにより父はゲ
ノムクローニングにより得ることができる。クローンの
ｅＤＮＡ又はゲノムライブラリィの何れかは、制限酵素
の使用を含む（しかしそれに限定されないが）当業者に
周知の技術を用いて生ずるＤＮＡフラグメントから製造
される。 ＡＨのための遺伝子を含むフラグメントは、当業者に周
知の多数のやり方で同定される。例えば一部のＡＲアミ
ノ酸配列が用いられてＤＮＡ配列を演縄するのに用いら
れ、そのＤＮＡ配列は次に化学的に合成され、放射症を
ラベルされそしてハイブリッド化グローブとして用いら
れる。 ＡＲ遺伝子を単離するのに用いられる他の方法は、例え
ばＡＨのアミノ酸配列から由来する周知の配列から遺伝
子配列それ自体を化学的に合成することを含むがそれに
限定されない。一方、選択されたｓ　ＲＮ　Ａの生体外
翻訳次に翻訳生成物の機能的又は免疫学的アッセイが用
いられる。同定且単離された遺伝子は次に適切なりロー
ニングベクターにそう人される。当業者に周知の多数の
ベクター・宿主系が用いられる。可能なベクターは、プ
ラスミド又は修飾ウィルスを含み（それに限定されない
が）、ベクター系は宿主細胞と共存できる。このような
ベクターは、バクテリオファージ例えばラムダ誘導体又
はプラスミド例えばＰＢＲ３２２又はｐＵＣプラスミド
誘導体を含むがそれに限定されない。組換え分子は、形
質転換、トランスフェクション。 感染、エレクトロポレーションなどにより宿主細胞に導
入される。 特別な態様において、ＭＣＦ−７細胞により発現された
ＡＲ遺伝子は、ＴＰＡによるＭＣＦ−７細胞の処理に応
じて生成されろｍ　ＲＮＡを選択しそしてバクテリオフ
ァージ入ｇｔ１０中にｅＤＮＡライブラリィを構築する
ことによりクロー・ンされる。未処理ＭＣＦ−７ａ胞は
明らかにＡＲ蛋白を合成且分泌しないので、ＴＰＡによ
るＡＲの誘導は又転写のレベルで注目され、そしてこの
ようなａＤＮＡライブラリィがかなりＡＲ含有配列に関
して富んでいることが予想された。ヒトコドン使用に基
く同義性のしかも熾良の推測のオリゴヌクレオチドによ
りｃＤＮＡライブラリィをプローブすること（Ｌａｔｈ
ｅｒ　１９８５　ｙ　Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ。 １８３　：　１〜１２並に下記の８．１項の記述）は、
　ＡＲｃＤＮＡクローンの単離をもたらした。これらの
ａＤＮＡクローンは次にＡＲｍＲＮＡ及びＡＥ遺伝子の
特徴を知ることに用いられた。その上、ＡＲｃＤＮＡの
ヌクレオチド配列（下記の８．２項及び第１６図）は、
ＡＲ第一次アミノ酸配列を演鐸するのに用いる。 ヌクレオチドコーディング配列の固有の同義性のため、
実質的に同−又は機能的に同等なアミノ酸配列をエンコ
ードする他のＤＮＡ配列は、本発明の方法の実施に用い
られる。ＡＲヌクレオチド配列のこのような変更は、異
るヌクレオチドの欠失、付加又は置換を含み、同−又は
機能的に同等な遺伝子生成物をエンコードする配列をも
たらす。遺伝子生成物は、配列内にアミノ酸残基の欠失
、付加又は置換を含み、サイＶント変化をもたらし従っ
て生物学上活性な生成物を生成する。このようなアミノ
酸の置換は、極性、電荷、溶解性、疎水性、親水性及び
／又は関係のある残基の両親媒性における類似性に基づ
いてなされる。例えば負に荷電したアミノ酸は、アスパ
ラギン酸及びグルタミン酸を含み、正に荷電したアミノ
酸はリジン及びアルギニンを含み、同様な親水性の値を
有する未荷電の極性ヘッド基又は非極性ヘッド基を有す
るアミノ酸は下記のものを含む。 ロイシン、イソロイシン、バリン；グリシン、アラニン
：アスパラギン、クルタミン；セリン、スレオニン；フ
ェニルアラニン、チロシンヲ含ム。 ＡＲｃＤＮＡをプローブとして用いてＴＰＡ誘導ＭＣＦ
−７細胞におけるＡＲ惰ＲＮＡを検出する。ＡＲｆＩＬ
ＲＮＡは長さ約１４００６ｊｌである。 下記の
〔９〕項に記載するように、ＡＲａＤＮＡを用い
てＡＲ遺伝子の特徴付けをする。ヒトＡＲ遺伝子の染色
体アサイメントは、正常な分裂中期の染色体への３Ｈ標
識ＡＲｃＤＮＡのその場のハイブリッド化により決定さ
お、ヒトＡＲ遺伝子が染色体４領域４ｑ１３−２１に在
ることが明らかにされ、その領域はリンパ球の分化に関
係があると思われる（下記の（９，２）項診照）。ｅ　
Ｄ　ＮＡは又５′調節領域を含む全ＡＲ遺伝子に及ぶゲ
ノムＤＮＡを単離するのに用いられた。ＡＲ遺伝子は長
さ約１０４６であることが分り、６エクソンに分配され
る。５′調節領域は、・プロモーターの少いクロラムフ
ェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴＱ伝子
な含む発現ベクターに加えられた。この構築は、ＭＣＦ
−７細胞に一時的に導入されたときＣＡＴ遺伝子の転写
を刺激することができ、そして活性はＴＰＡの添加によ
り６〜７倍刺激された（下記の「９．４　Ｊ項参照）。 本発明の特定の態様では、この５′調節領域は発現ベク
ターで用いられてＡＲ遺伝子又は他の構造遺伝子の転写
をコントロールする。キメラＡＲ−ＣＡＴ構築物は父用
いられて〔９Ａ〕項に記載されるようなＡＲの発現を調
節する因子について探すことになる。 （５，２，２，アムフイレグリンコーディング配列を含
む発現ベクターの構築〕 生物学的に活性な成熟した形のＡＲを発現するために、
発現ベクター／宿主系は選択されねばならず、高いレベ
ルの転写及び翻訳のみならず遺伝子生成物の正確な処理
をもたらす。これは、成熟した形のアムフイレグリンは
細胞処理を経てプレカーサー生成物から由来するように
見えるので、発現構築物にアムフイレグリンプレカーサ
ーの全コーディング配列を用いるとき、特に重要である
。例えば、哺乳動物の宿主細胞系がその能力について選
択されて、正確に処理し細胞外の環境にアムフイレグリ
ンを分泌する。 特に、２橿の形の成熟アムフイレグリンが共通２５２ア
ミノ酸プレカーサーの中間部分（それから２８の成熟し
た形が交互の蛋白分解処理を経て遊離する）として合成
されるように見える。さらに、アムフイレグリンはグリ
コジル化されそしてチロシンするファ化を行い、さらに
最終の生成物中にもし望むならばこれらの翻訳後の修飾
を行い５る発現系を選択する重要性を強調する。 種々の動物／宿主発現ベクター系（即ち適切な宿主細胞
でＡＲココ−ィング配列の複製、転写及び翻訳を行うの
に必要な要素を含むベクター）は、当業者により等しく
うま（利用できる。これらは、タイルス発現ベクター／
＃Ｉ乳動物宿王細胞系（例えばサイトメガロフィルス、
ワクシニアウィルス、アデノウィルスなど）：昆虫ウィ
ルス発現ベクター／昆虫細胞系（例えばバキュロウィル
ス）；又は哺乳動物細胞のゲノムから由来する非ウィル
ス性プロモーター発現系（例えばマウスメタロチオニン
プロモーター）ヲ含むがこれらに限定されない。 これらのベクターの発現要素は、それらの強さ及び特異
性において変化する。利用される宿主／ベクター系に応
じて、多数の好適な転写及び翻訳要素の任意の一つが用
いられる。例えば哺乳動物細胞系にクローニングすると
き、哺乳動物細胞のゲノムから単離されたプロモーター
（例えばマウスメタロチオニンプロモーター）又はこれ
らの細胞中で生長したウィルスからのプロモーター（例
えばワクシニアウィルス７．５にプロモーター又はモロ
ニーネズミ肉腫つィルス長端宋の繰返し）が用いられう
る。組換えＤＮＡ又は合成技術により生成したプロモー
ターも又用いられてそう人された配列の転写をもたらす
。 特異的な開始信号も又そ５人された蛋白コーティング配
列の十分な翻訳罠要求される。これらの信号はＡＴＧ開
始コドン及び隣接配列を含む。それ自身の開始コドン及
び隣接配列を含む全ＡＥ遺伝子が、適切な発現ベクター
にそう人される場合、追加の翻訳コントロール信号は不
必要である。しかし、コーディング配列の部分のみがそ
う人されるとき、ＡＴＧ開始コドンを含む外因性の翻訳
コントロール信号が提供されねばならない。その上、開
始コドンは全そう人物の翻訳を完全にするために、ＡＲ
ココ−ィング配列の読みフレームと動きが同期しなけれ
ばならない。これらの外因性の翻訳コントロール信号及
び開始コドンは、種々の起源（天然及び合成の両方）の
ものである。発現の能率は、転写減少配列、エンノ・ン
サー要素などの包含により増大される。 ベクターへのＤＮＡフラグメントのそう入について前述
した方法の任意のものが用いられて、ＡＲ遺伝子及び適
切な転写／翻訳コントロール信号を含む発現ベクターを
構築する。これらの方法は生体外組換えＤＮＡ技術、合
成技術及び生体内組換え（遺伝的組換え）を含む。 例えばアデノウィルスが発現ベクターとして用いられる
とき、ＡＲココ−ィング配列はアデノフィルス転写／翻
訳コントロールコンプレックス例えば後のプロモーター
及び三つに分れたリーダー配列にリゲートする。このキ
メラ遺伝子は次に生体外又は生体内の組換えによりアデ
ノウィルスゲノムにそう人される。ウィルスゲノムの非
必須領域のそう入（例えば領域Ｅ１又はＥ３）は、生存
可能でしかも感染した宿主ＫＡｆｆを発現しうる組換え
ウィルスを生ずる。 同様Ｋ、ワクシニア７．５にプロモーターが用いられる
。 ＡＥを発現するのく用いた交互の発現系は、昆虫系であ
る。一つのこのような系では、オートグラファ・カリホ
ルニカ（Ａｓｔｏｇｒａｐｈａ　ｅａｌｔｆｏｒｓｉｃ
ａ）核ポリへドロシスウィルス（ＡａＮＦＦ）が外来の
遺伝子を発現するベクターとして用いられる。ウィルス
はスボドプテラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄ＊ｐｔｍｒａ
　ｆｒｓｇｉｐｇデｄａ）細旭で生長する。 ＡＲココ−ィング配列はウィルスの非必須領域（例えば
ポリヘトリン遺伝子）にクローンされセしてＡｅＮＰＶ
プロモーター（例えばポリへドリンプロモーター）のコ
ントロールの下に置かれるだろう。ＡＲココ−ィング配
列の成功するそう人は、ポリヘトリン遺伝子の不活性イ
ヒ及び非吸蔵組換えウィルス（即ちポリヘトリン遺伝子
によりコードされた蛋白様被覆を欠くウィルス）の生成
を生じよう。これらの組換えウィルスは、次にそう人さ
れた遺伝子が発現されるスボドプテラ・フルギペルダ細
胞を感染するのに用いられる。 自画性（α９１％ｐｈｏｔデｏｐ（ｅ）パッケージング
細胞株で生成されたレトロウィルスベクターは、多くの
細胞タイプに高い能率の発現を生じさせる。この方法は
、細亀タイプの特異性処理、そう人された蛋白コーディ
ング配列の調節又は機能を評価させる。 さらに、宿主細胞株は選ばれ、それはそう人された配列
の発現を調節するか又は所望の特異的なやり方で遺伝子
生成物を修飾且処理する。成るプロモーターからの発現
は、成る誘導物質（例えばメタロチオネインプロモータ
ーの亜鉛及θカドミウムイオン）の存在下上昇される。 それ故、遺伝子工学ＡＲの発現はコントロールされる。 これは、もしクローンされた外来の遺伝子の蛋白生成物
が宿主細胞にとり致死的であるならば、重要である。そ
の上、蛋白生成物の修飾（例えばグリコジル化）及び処
理（例えば開裂）は、蛋白の機能にとり重要である。異
る宿主細胞は、蛋白の翻訳後の処理及び修飾にとり特徴
のあるしかも特異的なメカニズムを有する。適切な細胞
株又は宿主系が選ばれて、発現された外来の蛋白の正確
な修飾及び処理を確実にする。 本発明により用いられる発現ベクターは以下のものを含
むがしかしそれに限定されない。 プラスミドｐＳＶ２Ｎｍｏ０　プラスミドｐｓＶ２Ｎｇ
ｏは５ｏｓｔｈａｒｎ　ａｔ　　ａｌ（１９８２）Ｊ、
Ｍｏ１．ＡｐｐｌｉｅｄＧａｕｎｔイａｓ　１．３２７
〜３４１に記載されている。 プラスミドｐｓＶＺｄｈｆｒ。プラスミドｐｓＶ２ｄｈ
ｆｒ（Ｓｓｈｒａ惧ａｓｉ　　ａｔ　　ａｌ、　　１９
８１、Ｍｏ１．Ｃａ１ｌ　　Ｂぜａｌ。 １１８５４〜８６４）は、ＳＶ４０プロモーターのコン
トロールの下マウスジヒドロ集散還元酵素（ｄｈｆｒ逮
伝子な含む。 プラスミドｐ　Ｈａ　Ｍｏ　　プラスミドｐＨ３Ｍ　（
Ａデ％ｆｆｏ　　ａｔａｌ、１９８７、Ｐｒｏ　ａ、　
Ｈａ　ｔ　ｌ　、　Ａｅａｄ、　Ｓｔ：　ｉ、　ＵＪ、
Ａ、、８４．３３６５〜３３６９）は、ＨＩＶ　ＬＴＲ
位置−６７〜＋８０に融合したヒトサイトメガロウィル
ス（ＣＭＶ）ＡＤ１６９即時型エ即時型エン−よりなる
キメラプロモーターを含む。ＬＴＲは５′−位〜３′−
位によりポリリンカーをともなう。Ｈ４５ｄ　ｌ、Ｘｂ
ａ　　Ｉ、Ｘｈｏ　　Ｉ、Ｂａｔ　Ｍ。 Ｘｈｏ　　１．　Ｐａｔ　　Ｉ及びＸｂａＩｏ　ｐｓＶ
２からの小さなｔ抗原切り継ぎ／ポリアデニル化信号及
び複製のＳＶ４０起源は、ポリリンカーからのダウンス
トリームである。後者は、ＳＶ４０の大きなＴ抗原例え
ばＣＯＳ及びＷＯＰ細胞を含む細胞中に拡大を生じさせ
る。サプレッサーｔＲＮＡ遺伝子は、ｐＶＸに基づくベ
クター及びＰ３プラスミド例えばＭＣ１０６１／Ｐ３を
有する細菌における生長を助ける。 プラスミドｐＨ３Ｍ／ｂＯｓｅＭ０　プラスミドｐＨ３
Ｍ／ｂＯ％ｃＭは、Ｎａｊｆｉａ　Ｍａｒ　ｉｋ、　Ｏ
ｓｅｏｇａｎから得られた。 それは、Ｈｉｓｄ　ｍ／Ｘｈｏ　　Ｉ（充填された）部
位でｐＨ３Ｍにそう人されたオンコスタチンＭコーディ
ング配列に融合したサルＴＧＦ−β５′未翻訳且リーダ
ー配列を含む。 ＴＧＦ−β配列は、Ｈｉｓｄ　ＩＨ（ｐｓＰ６５ポリリ
ンカーから生ずる）で始まる８５ｂｐ５’未翻訳領域並
にＴＧＦ−βｅＤＮＡからの隣接Ｐａｔ　　Ｉ部位より
なり、２９アミノ酸信号配列（通常はグリシン・ロイシ
ンのジペプチド配列間で開裂）をエンコードする８７ｂ
ｐをともなう。 プラスミドｐＨ３ＡＲＰ０プラスミドｐＨ３ＡＲＰは、
ＣＯＳ細胞中のＡＲプレカーサーの一時的発現にデザイ
ンされたｐＨ３Ｍに基づくベクターである。それはＡＲ
５’未翻訳領域の１３ｂｐ並に全コーディング領域及び
３′未翻訳配列を含む。このプラスミドは、ｆｆ（％ｄ
ｍ及びＸｂａＩ　により消化されたｐＨ３Ｍベクターの
４１６７ラグメント、オリゴヌクＶオチドＥＶＳＡＬ　
３及びＥＶＳＡＬ　４、並にｐＡＲＬからのゲル精製１
．１　ｋｂ　　Ｈｇａ　Ｉ／Ｘｂａ　Ｉ　　ｅＤＮＡフ
ラグメントのリゲーションにより生ずる。ＥＶＳＡＬ　
３及びＥＶＳＡＬ　４は、５’Ｈ（ｓｄｌｌｌ、Ｈ：ｃ
ｏ　ＥＶ、　Ｓａｇ　Ｉ及びＨｇａｌ　部位と相補的で
ある。構築物は、又３′未翻訳領域をともな５ｐＥＭＥ
Ｌ　１８からＥ６ｏ　Ｒ１−Ｘｂａ　Ｉポリリンカーを
保持する。 Ｅ６ｏ　ＲＶ　　　　Ｈｇａ　Ｉ Ｈ（悴ｄｍ　　　　　Ｓａｉ■ ＥＶＳＡＬ３　　５’　　ＡＧＣＴＴＧＡＴＡＴＣＧＴ
ＣＧＡＥＶＳＡＬ４　　３’　　　　　ＡＣＴＡＴＡＧ
ＣＡＧＣＴＧＡＣＧＣプラスミドｐＳＶＤＥｌｂＯＭ０
　プラスミドｐｓＶＤＲ１ｂＯＭはＪａｆｆ　Ｋａｌｌ
ａａｔａｄ、　Ｏ％ａｎｙ−％′ｂ′−ら得た。それは
ｐＳＶＺｄｈｆｒとｐＨ３Ｍ／ｂＯＭとの融合物であり
、ＳＶ４０初期プロモーターにより動かされるマウスｄ
ｈｆｒ遺伝子に加えてＴＧＦ−β信号配列及び！１Ｖ４
０ポリアデニル化信号を側面に有するｐＨ３ＭのＣＭＶ
／Ｈ１１／プロモーターにより動かされるｅＤＮＡによ
りベクターを提供する。 それは、Ｅａｍ　Ｈ１消化ｐｓＶ２ｄｈｆｒＫよるＥａ
％Ｈ■／Ｎｒｓ　　Ｉ　　（充填）消化ｐＨ３ｔｌＬ／
ｂＯＭのリゲーションにより生じた。 プラスミドｐＨｒａ１゜プラスミドｐＨｒａａは、Ｅｔ
ａ％Ｍｃｋｎｉｇｈｔ、　　Ｕｓｉｖ、　　げ　Ｗａｓ
ｈイｎｇｔｏｓ、　Ｄａｐｔ、　　ｏｆＰｈａｒｍａａ
ｏｌｏｇｙにより開発された哺乳動物発現ベクターであ
る。それはｐＭＬに基づくベクターであって、マウスＤ
ＨＦＲｅＤＮＡ及びＢ型肝炎３′未翻訳／ポリアデニル
側面号をともなうＳｍａ　　Ｉ、ＢａｍＨＩ、Ｓａｌ　
　ｌ、Ｐａｔｌ、Ｈ４％ｄｍ及びＣ１ａ　Ｉ　を有する
ポリリンカー、ハーベイｒａｍ　ＬＴＲの７５４　ｈ　
ｐ　Ｈ：ｏｏ　Ｒ■〜Ｔｔｈｌ　ｌ　ｌ　ｍフラグメン
トを含む。ポリリンカー中のＥａｔｙ＋ＨＩかうＤＨＰ
ＲのＡＴＧまでの距離は５４＆ｊである。 プラスミドｐＨＬＡＲＧＥ０　プラスミドｐＨＬＡＲＧ
Ｅは、ハーベイｒａｍ　ＬＴＲＫより動かされしかも非
機能性のプロモーターのないＤＨＦＲ遺伝子をともなう
１０ｋｂＡＲゲノム配列（Ｓ５ｓｉｌ〜Ｈ４％ｄｍ）を
含む。それは下記の７ラグメントの王者間のリゲーショ
ンにより形成された。４．６ｋｂ　　ｐＨｒａａ　Ｂａ
ａ　Ｉ／Ｈ（ｓｄ　ｍフラグメント；　ｐＡＲＨ１２か
らの６．Ｏｋｂ　　Ｓ９％ａ　Ｉ／Ｈ（ｇｔｄ　ｌ　Ａ
Ｒゲノムフラグメント；及びｐＡＲＨ６からの６．４ｋ
ｂＨ４％ｄｌＡＲゲノムフラグメント。 プラスミドｐＨＬＡＲＧｌｐａｄ０　プラスミドｐＨＬ
ＡＲＧｌｐｅｄは多シストロン性哨乳動物発現構築物で
ある。それはシングルハーベイｒａｍ　ＬＴＲＫより動
かされるマウスｄｈｆｒ遺伝子をともなうＡＥプレカー
サーｅＤＮＡ配列を含む。 主要な転写物は、ＡＲの停止コドンとｄルｆデのＡＴＧ
開始コドンとの間の７４ｂｐの多シストロン性メツセー
ジであり、それＫよりリポソームをして再開始させそし
て翻訳を続けさせる。ｐＨ３ＡＲＰなＥａｏＲＶにより
消化しそして７００ｂｐの７ラグメントを単離した。こ
のフラグメントは１３ｂｐＡＲ５’未翻訳領域、完全Ａ
Ｒプレカーサーコーディング領域及び２１６ｐの５′未
翻訳配列を含んだ。このフラグメントはＪ？８ｍＨＩカ
ットとリゲートし、充填しそしてベクターｐＨデα１を
ホスファターゼした。 プ５　スミ）−ｐＬＯ８ＮＬ０ブ、ＦスミＹｐＬＯ８Ｎ
Ｌは、ＤｕｓｔｙＭｉｌｌｅｒ、Ｆｒａｄ　Ｈｓｔｅｋ
ｉａｏ％　Ｃａｎｃｅｒ　　Ｒｅ５ｅａｒｃｈＣ−％ｔ
ａｒ、！Ｉｇａｔｔｌ、ＷＡから得た。このレトロウィ
ルス発現ベクターは、広い宿主の範囲を感染できるがし
かし複製できない高力価の自画性ヘルパーのないウィル
ス株の発生についてデザインされた。ベクターは以下の
ものを含む。 欠失されたパッケージング信号を有する突然変異モロニ
ーネズミ白血病ウィルスＬＴＲ；　ｐａｔ　十配列；ａ
ＤＮＡのそう人そして次のＯＴＣ遺伝子の不活性化のた
めの２個のＸｈｏｌ　部位を含むオルニチントランスカ
ルバミラーゼ　　。 （ＯＴＣｇ伝子；　ＳＶ２Ｎｇｏ、選択可能なマーカー
；３′ＬＴＲ；そしてｐＢＲ３２２Ａ偽ｐ抵抗性骨格。 プラスミドｐ　Ｌ　Ａ　ＲＳ　ＮＬｏ　プラスミドｐＬ
ＡＲＩＮＬは、ウィルス性ＬＴＥＫより動かさね、ポリ
（７ｔ）尾部を欠＜ＡＲプレカーサーａＤＮＡコーディ
ング領域を含む自画性レトロウィルス性発現構築物であ
る。ＳＶ２Ｎｇｏは、トランスフエクタントを発現する
ための選択をさせる。ｐＬＭｌｓＮＬは、ｐ　ＨＬ　Ａ
　Ｅ　ＩＰｅ　Ｄ　カら（１）８００ｋｐ　Ｓａｇ　Ｉ
　７ラグメントと７．７＆６のＸｋ・■　消化及びホス
ファターゼ化ｐＬｏ！ＪＮＬベクターフラグメントとの
リゲーションにより生じた。 （５，２，３，アムフイレグリン遺伝子生成物を発現す
るトランスフエクタント又は形質転換体の同定１組換え
ＡＲココ−ィング配列を含みそして生物学的に活性な成
熟生成物を発現する宿主細胞は、少くとも４種の一般的
なアプローチにより同定できる。（ａ）ＤＮＡ−ＤＮＡ
。 ＤＮＡ−ＲＮＡ又はＲＮＡ−アンプセンスＲＮＡハイブ
リッド化；　（＆）ｒマーカー」遺伝子機能の存在又は
不存在：（６）宿主細胞中のＡＲｔｙ＋ＲＮＡ転写物の
発現により測定される転写のレベルの評価：そして（ｄ
）イムノアッセイそして最後にはその生物学的活性によ
り測定される成熟遺伝子生成物の検出。 第一のアプローチにおいて、発現ベクターにそう人され
たヒトＡｇコーディング配列の存在は、ヒトＡｇコーデ
ィング配列に同等なヌクレオチド配列よりなるプローブ
を用いてＤＮＡ−ＤＮＡハイブリッド化により検出でき
る。 第二のアプローチでは、組換え発現ベクター／宿主系は
、成る「マーカー」遺伝子機能（例えばチミジンキナー
ゼ活性、抗生物質に対する抵抗性、メトトレキセー）Ｋ
対する抵抗性、形質転換表現梨、バキュロウィルス中の
吸蔵体形成など）の存在又は不存在に基づいて同定且選
択される。 例えばもしＡＲココ−ィング配列がベクターのマーカー
遺伝子配列内にそう人されるならば、ＡＲココ−ィング
配列を含む組換え体は、マーカー遺伝子機能の不存在に
より同定される。一方、マーカー遺伝子は、ＡＲココ−
ィング配列の発現をコントロールするのに用いられる同
−又は異るプロモーターのコントロールの下ＡＲ配列と
縦に一列に並んで置かれる。誘導又は選択に応するマー
カーの発現は、ＡＲココ−ィング配列の発現を示す。 第三のアプローチでは、ＡＲココ−ィング領域に関する
転写活性は、ハイブリッド化アッセイにより評価される
。 例えば、ポリアデニル化ＲＮＡは、ＡＲココ−ィング配
列又はその特別な部分と相同のプローブを用いてノーザ
ン・プロットにより単離且分析できる。一方、宿主細胞
の全核醗は、抽出されそしてこのようなプローブへのハ
イブリッド化について分析される。 第四のアプローチでは、成熟蛋白生成物の発現は、例え
ばウェスタン・プロット、イムノアッセイ例えば放射能
免疫法でん、酵素結合イムノアッセイなどにより免疫学
的に評価できる。しかし発現系の成功の最終のテストは
、生物学的に活性なＡＲ遺伝子生成物の検出を含む。宿
主細胞が遺伝子生成物を分泌するとき、培養したトラン
ス７エクタント宿主ａｆＲから得られた細胞のない培地
は、ＡＲ活性についてアッセイされうる。遺伝子生成物
が分泌されないとき、細胞分解物はこのような活性につ
いてアッセイされうる。両方の場合、生物学的アッセイ
例えば本明細書で記載された生長阻害及び刺激アッセイ
などが用いられうる。 （５，３，アムフイレグリンの構造〕 精製ＡＲのアミノ酸配列化は、標品が２種の殆んど同一
の型のＡＲの不均一な混合物よりなることを示していた
（第１２図参照）。２種の中でより大きい方の一つの凰
は、標品の約１６％を占める。先を切った形のＡＲであ
る他の型は、標品の残りでしかも大部分を占め、それが
アミノ末端へキサペプチド５ＶＲＶＥＱを欠くことだけ
でそのより長い方と異る。２種の型は、さもなければア
ミノａＶペルで完全に相同である。 ＡＥは平均相対分子量２２，５００ダルトンの非常に親
水性の糖蛋白である。Ｎ結合炭水化物を除（Ｎ−グリカ
ナーゼ処理により、ＡＲは、ＡＲゲル浸透クロマトグラ
フイのデータからの分子量計算と良く合う１４，０００
の相対分子量を有する単一のバンドとして泳動する。非
還元条件下で、ＡＲは同様に泳動する。そのため、ＡＲ
は一本鎖の糖蛋白である。 ＡＲの一次構造り多くの蛋白配列と比べられた。これら
の比較は、ＡＥがすべての比較した蛋白と明白な構造上
の相同を有しないユニークな蛋白であることを示す。し
かしＡＲの一次構造は、三、四の他の生長因子に関連し
ており、その多（はＥＧＦ−スーパーファミリーに属す
る。 ＡＲをこの群の蛋白の一員と分類することは理由のある
ことであり、それはその構造上の特徴のあるものがＥＧ
Ｆ−７アミリー蛋白の中に見い出される非常に保存され
た構造上の特徴と碩めて近似しているからである。例え
ばＮ末端ＡＲ配列は、ＴＧＦα、ＶＧＦ及びＭＧＦのＮ
末端配列（この領域はプロリン、セリン及びスレオニン
残基に富む）と似ている。ＡＲは又ＴＧＦ及びＶＧＦの
Ｎ末端プレカーサー領域と同じく、Ｎ結合糖蛋白に関す
る部位を有する。 ＡＲはさらに他のＥＧＦ様蛋白と配列の相同性を示し、
これらの生長因子の成熟型の二次構造を限定する３個の
ジするフィド結合に含まれる６個のシスティン残基を保
存している。しかし、バイトロバシー分析は、相同的な
ＡＲ及びＥＧＦ配列の間に顕著な差を示している。ＡＥ
とＥＧＦの他のメンバーとの他の比較については、第１
表、第１３図及び（９，７）及び（９，８〕項参照。 ＥＧＦスコア　凝固スコア　ＡＲスコア生長因子ファミ
リー　　　＞２０　　　　＜２０　　（４０凝固因子　
　　　　　　　く２５　　　〉２５　　く４０アムフイ
レグリン　　　　＜２０　　　　（２０＞４０サブフア
ミリー 機能性同等物とともに第１２図に示されたアムフイレグ
リンアミノ酸配列は、本発明の範囲内にある。例えば、
アムフイレグリン生成物は配列内にアミノ酸残基の欠失
、付加又は置換を含み、それはサイレント変化をもたら
し従ってバイオアクチブ生成物を生ずる。このようなア
ミノ酸の置換は、関係のある残基の両極性、極性、電荷
、俗解性、疎水性及び７文は親水性における類似性に基
づいてなされる。例えば、負に荷電されたアミノ酸はア
スパラギン醒及びグルタミン酸を含み、正に荷電された
アミノ酸はリジン及びアルギニンを含み、同様な親水性
の値を有する非荷電の極性ヘッド基を有するアミノ酸は
以下のものを含む。ロイシン、インロイシン、バリン；
グリシン、アラニン；アスハラキ／、クルタミン；セリ
ン、スレオニン；フェニルアラニン及ヒチロシン。 （５，４，アムフイレグリンの性質〕 ＡＲは、中位分子量約２２．５００ダルトンを有する一
本鎖糖蛋白であって、培養中の種々の細胞に二機能性生
長調節活性を示す。構造上、ＡＲは生長因子のＥＧＦフ
ァミリーに属し、さらにレセプター結合に関しＥＧＦと
有効に競合するＡＲの能力により示されるように、この
ファミリーの他のメンバーと機能的な類似性を一緒にも
つ。 ＡＲは、単量体状蛋白であり、活性のために鎖内ジする
フィド結合を要し、その生物学的活性のためにグリコジ
ル化は必要とせず、温和な鍍及び塩基の処理の下で安定
でありそして３０分間５６℃で加熱されたとき安定であ
る。 ＡＲは、還元されたとき、１００℃で５分間加熱された
とキ、トリフシン、エンドペプチダーゼＬｙ１−Ｃ１エ
ンドペプチダーゼＡｒｇ及びエンドペプチダーゼＧｌｄ
Ｃより消化されたとき完全な生物学上の活性を失う。 ホスホリパーゼＤによる蛋白分解開裂Ｔｔ％　５ＤＳ−
ＰＡＧＥ分析から演鐸されるように、約５６００の相対
分子量を有する１個以上の活性フラグメントにＡＲを転
化するように見える。ＡＨの活性７ラグメントは、本発
明に含まれ、そして下記の（５，５）項でさらに記述さ
れる。 ＡＲは、上皮起源の王、四のヒト癌細胞株について生体
外で抗増殖作用の可能性を有する。例えば、ＡＲは外陰
の上皮癌Ａ４３１、胸部腺癌ＨＴＢ　１３２、頚部扁平
上皮癌Ｃｌ、１５５０、卵巣乳頭状腺腫ＨＴＥ７５、卵
巣奇形癌ＨＴＢ１５７２及び胸部腺癌ＨＴＥ２６の細胞
のＤＮＡ合成を有効に阻害する。ＤＮＡ合成の５０％阻
害が、０．１３％ＭのＡＲにより処理された。（４３１
細胞で認められる。 正常のラット腎ＮＲＫ−５Ａ６細胞ｒよ、元来ソフトア
ガーにコロニーを形成しない。しかしこれらの細胞の培
養培地に加えられた外因性のＥＧＦ及びＴＧＦ−βの組
合わせは、形質転換された表現型を示す固足独立性生長
を誘発する。外因性ＡＲ及びＴＧＦ−βの組合わせは、
又低いレベルでも（第Ｖ表参照）、ＮＨＫ−５Ａ６細胞
の固定独立性の生長を誘発し、ＡＲ及びＥＧＦが機能的
に関連があるという直接の証拠をもたらす。 ＴＧＦ−βによるＡＲの相乗作用は、細胞生長の調節に
２ける重要な因子としてＡＲを強く示す。従って、本発
明は、正常な細胞生長のコントロールの複雑なしかも発
生する様相並に腫瘍形成細胞に２ける生長コントロール
の特徴的な損失を調べるのに今迄利用できなかった研究
手段を提供する。 ＡＲは又ヒト包皮線維芽細胞の増殖を誘発する（第■表
）。 これらの細胞に８ける１ＪＮＡ付成の２倍の項部は、Ａ
Ｒの約５０ｐＭ（１度で認められた。約６倍の最大の刺
激が約５％Ｍで生ずる。 ＡＲが細胞の増殖又は生長阻害を命するメカニズムは未
知である。しかし、ＡＲレセプター結合を特徴づけるこ
とを目的とする予備的な研究は、ＡＲが特異的なレセプ
ターを有することを示唆している。ＡＲはＥＧＦレセプ
ターへの結合についてＥＧＦと競合し、そし℃又他の共
通のレセプター（恐ら（ＡＲｔＰ！ｆ異性レセプターそ
れ自身）への結合につい′ｃＥＧＦと競合する。ＥＧＦ
レセプターへのリガ／ドＭ会が、一部テロジンキナーゼ
活性を活性化することにより生長刺激信号を開始するこ
とは知られている。ＥＧＦレセプターへのＡＲの結合は
、同様に増殖反応を開始し、又は逆にＥＧＦ又は池の信
号発生リガンドを結合するのに用いられるＥＧＦレセプ
ターの数を制限することにより増殖信号の開始をブロッ
クするだろう。 −万、ＡＲが細胞生長を阻害する他のメカニズムは可能
であり、第１表に示されたデータにより示唆されろ。細
胞当り可変のＥＧＦ結合部位を有するＡ４３１細胞株の
４個のクローンは、ＡＲ阻害活性に対する感度について
テストされた。ＡＲ感度と細胞当りＥＧＦ結合部位の数
との間に関係がないことが認められたことは、ＡＲによ
り発生した生長阻害信号が、ＥＧＦレセプターを含まな
いレセプター結合発生により開始することを示唆してい
る。このような発生は他の生長因子例えはＴＧＦ−αに
より生ずる生長増殖（ｇ号と拮抗しよう。従って、ＡＲ
は、１°ＧＦ−α又は他のオートタリン生長因子に対す
る細胞のミトゲン性反応を特異的にブロックすることに
よりその抗増殖作用を働かすことになろう。 ＡＲは非常に親水性の蛋白であり、そのアミノ酸配列は
、他のＥＧＦファミリー蛋白のプロフィルとは殆んど類
似性のないユニークなバイトロバジ−プロフィルを生ず
る（第１１図）。ＡＲはＰＩＴ、６〜８．０の塩基性蛋
白である。 Ｃ５，４，１，ＴＰＡによるＡＲ誘導の特徴付け〕ＴＰ
Ａは細胞に多面発現反応を誘導し、それは細胞の形態、
細胞の増殖及び分化、膜移動、レセプター・リガンド相
互反応、蛋白ホスホリル化、燐脂質の代謝の変化を含む
。 蛋白キナーゼｃ　（ｐｘｃ　）はＣａｔ←及び燐脂質依
存蛋白キナーゼであり、ＴＰＡのレセプターとし″′Ｃ
機能する。ＰＫＣへのＩ″ＰＡ、の結合は、生長因子レ
セプター、サイトスケレタル蛋白及びトランス活性化調
節蛋白を含む多くの基質のホスホリル化をもたらす。 ６ＡＭＰは他の調節分子であり、それは王としてｏＡＩ
ｄＰ依存蛋白キナーゼＡを経て細胞に櫨々の作用を働か
せる。 ｅ　Ａ　Ｍ　Ｐの細胞内のレベルは、レセプター仲介活
性化及びアデニレートサイクラーゼ阻害化によシ調節さ
れる。成る研究は、ＴＰＡ及びｃ　Ａ　Ａｆ　Ｐ誘導遺
伝子発現が共通の経路として集まることを示している。 ＡＲ遺伝子発現の調節を研究するために、ＭＣＦ−７細
胞中のＡＲ特異性ＲＮＡの製造についてこれらの調節経
路の両方の種々の活性剤又は阻害剤の作用を見ることを
選んだ。 フォアスコリ／はアデニレートサイクラーゼを活性化す
る薬剤であって、増大した細胞内ａ　Ａ　Ａｆ　／’　
Ｙもたらす。４時間２５％ＭでＭＣＦ−７細胞に投与さ
れたとき、ＡＲｍＲＮＡの明白な刺激が認められ、セし
てｅ　、４　Ｍ　Ｐ経路も又ＡＲ発現の調節に役割を果
していることを示唆する。 ［５，５，７ムフイレグリン関連誘導体、類似体及びペ
プチド〕 ＡＲに関する誘導体、類似体及びペプチドの製造及び使
用も又考えられセし℃本発明の範囲内である。生長調節
活性を示すこのような誘導体、類似体及びペプチドは、
広範囲の腫瘍の診断、予後及び治療に応用を見いだす。 このような誘導体、類似体又はペプチドに、天然のＡＲ
に比べて増大した又は減少した生物学的活性を有する及
び／又はＡＲＧＩＡ関遅細胞関連囲を拡大又は制限して
、なお本発明の範囲内にある。同様に、増大又は減少し
た生長刺激活性を示す及び／又はＡＲの生長刺激活性に
反応する細胞の範囲を拡大又は制限する、ＡＲに関する
誘導体、類似体及びペプチドの製造及び使用は、創傷及
び火傷の治療を含むがそれに限定されない有用な応用を
見い出す。 本発明のＡＲ関遵藺導体、類似体及びペプチドは、当業
者に周知の檀々の手段により製造できる。遺伝子及び蛋
白のレベルの方法及び増殖に本発明の範囲内にある。 蛋白のレベルで、植々の化学的修飾が用いられて、工ン
ドペブテターゼ（例えば臭化シアノゲ／、トリジン／、
キモトリプシン、Ｖ８プロテアーゼなど）又はエキソペ
プチダーゼによる特異的な化学的開裂、アセチル化、ホ
ルミル化、酸化などを含むがそれに限定されない当業者
に周知の技術によりＡＲ様誘導体、類似体又はペプチド
を製造する。 （５，６，抗アムフイレグリン抗体製造〕本発明の範囲
に又アムフイレグリ７又は関連蛋白を認識するポリクロ
ナール及びモノクロナール抗体の製造がある。 当業者に周知の種々の方法が、ＡＲのエピトープに対す
るポリクロナール抗体の製造に用いられる。抗体の製造
には、糧々の宿主動物がＡＲ蛋白又は甘酸ＡＲペプチド
による注射により免疫化され、それはウサギ、マウス、
ラットなどを含むがそれに限定されない。種々のアジュ
バントが、宿主の種類に応じて免疫学的反応な増大する
のに用いられ、フロイント（完全及び不完全）１．ミネ
ラルゲル例えば水酸化アルミニウム、界面活性剤例えば
リゾレシチ／、プルロニックポリオール、ポリアニオン
、ペオテド、油エマルショ／、キーホーリムペットヘモ
シアニン、ジニトフェノール及び潜在的に有用なヒトア
ジュバント例えばＢＣＧ（バシル・カルメット・ゲラ／
）及びＣＯｔνｓａｂＧａｔａｒｉｓｍｐａｒｖｕｔｎ
　を含むがそれに限定されない。 ＡＲのエピトープに対するモノクローナル抗体は、培養
　　−物中に連続細胞株による抗体分子の製造をもたら
す任意の技術を用い℃製造できる。これらはコーラ−及
びミルシュティア（１９７５、Ｎａｔｓｒａ　　２５６
．４９５〜４９７　）により初めて記載されたハイブリ
ドーマ技術、そしてさらに最近のヒトＢ細胞ハイブリド
ーマ技術（ｆｏｓ＆ａｒ　　ａｔａＬ１９８３　ｅ　Ｉ
ｍｌｍｍ５ｎａＬｏ　Ｔａｄａｙ　４　：　７２　）及
びＥＢＶハイプリドーマ技術（Ｃｏ１ｇ　　ａｔ　ａＬ
１９８５ｅＭｏｓｏｏｌｏｎａＬ　Ａｎｔｉｂｏｄｉｅ
ｓ　　ａｓｄ　Ｃａｖｓａｇｒ　Ｔｈｇｒａｐｙ＋Ａｌ
ａｎ　Ｒ，１Ａｓａ＋）ｓａ、ｐｐ　　７７〜９６　）
’に含むがそれに限定されない。 分子のイディオタイプを含む抗体７ラグメントは、周知
の技術により発生できる。例えばこのようなフラグメン
トは以下のものを宮むがそれに限定されない。Ｆ（ａｈ
’）、　フラグメント（抗体分子のペプシン消化により
生成）ｐＦａｂ’フラグメン）　（Ｆ、（ａ６’）ｔフ
ラグメントのジするフィド橋を還元することにより生ず
る）；２個のＦａｂ又ｆ＠Ｆｔｓｈ７ラグメ／ト（パパ
イン及び還元剤による抗体分子の処理により生ずる）。 ＡＲに対する抗体は、ＡＲ蛋白りアフイニテイ精製及び
ＡＲ生合成、代謝及び機能の明確化に２いて成熟ＡＲ及
びそのプレカーサー及びサプコンボーネ／トの形の定性
及び定量の検出に用いられる。ＡＲに対する抗体は又診
断及び治療の薬剤とし℃有用である。 （５，７，７ムフイレグリ／の用途〕 ＡＲの三機能性は、生体外及び生体内で広い用途をもた
らす。単独で又は他の生物学上活性な生長因子、阻害剤
又は免疫調節剤とともに、生長阻害及び／又は生長刺激
活性を示すＡＲ又はその７ラグメント及び誘導体を含む
すべての化合物は、本発明の実施及び方法に用いられる
。 す７３球分化に含まれる領域へのＡＲ遺伝子の局在化は
、ＡＲが造血細胞の発達、活性化又は免疫サプレッショ
ンに役割を果していることを示唆する。この機能は又Ａ
Ｒ３禾翻訳領域と他のサイトカインからの同様な領域と
の間の同一性により支持される。 本発明の化合物は、血管発生、骨吸収、免疫反応及びシ
ナプシス及びニューロンエフェクター機能の調節に用い
られよう。ＡＲｄ又アラキドン酸カスケードの調節に用
いられよう。アラキト／酸の酵素的酸化は、多数の重要
な生成物例えばプロスタグランデイン、トロンボキサン
、プロスタサイクリ／、ロイコトリエンに導かれる。こ
のような生成物は、例えば筋肉収縮、血小板凝集、白血
球泳動、胃分泌を含む多くの生理学上の作用を有する非
常に有力且多様的な剤である。ＡＲ，ＡＲ関連分子及び
その組成物は創傷の治療及び癌の診断及び治療に特に有
用である。 （５，７，１，創傷の治療〕 ＡＲＦｉ創傷例えば皮膚の創傷、角膜の創傷並に他の種
々の上皮性及び基質性の破壊例えば慢性潰瘍、火傷、手
術の切断、外傷性の創傷、及び中空の上皮の並んだ器管
例えば食道、胃、大腸、小腸、口及び性器及び尿の管へ
の損傷を治療する方法で用いられる。方法は生理学的に
許容できる担体中にＡＲを含む治療組成物の局所的適用
による。 本発明の組成物は、実質的にすべての皮膚の創傷、角膜
の創傷そして体の上皮が並んだ中空の器管への損傷を含
む多くの創傷を治療するのに用いられる。治療に好適な
創傷は、外傷により生ずるもの例えば火傷、擦り傷、切
シ傷など並に手術から生ずるもの例えば手術の切断及び
皮膚移植を含む。本発明の組成物による治療に好適な他
の症状は、慢性の症状例えば慢性潰瘍、塘尿病潰瘍、他
の非油ゆ性（栄養上）の症状を含む。 ＡＲは、病気に２かされた領域への適用のための生理学
上許容できる担体に混入される。担体の性質は広く変化
しそして適用の目的とする位置に依存する。皮膚への適
用では、クリーム又は軟膏のペースが通常は好ましくは
、好適なベースはラノリン、シルバブ／（マリオン）（
％に火傷の治療）、アクアフォア（デユークーラボラｌ
ｊ　）リーズ。 サウス・ノーウオーク、コネテカット）などを含む。所
望ならは、ＡＲ含有組成物をほう帯及び他の創傷ドレッ
シングに混入してペプチドに創傷を連続的にさらすこと
ができる。エロゾルの適用も又用いられる。 治療組成物中のＡＲの濃度は厳密を要しないが、上皮細
胞の増殖を誘導するのに十分でなければならない。組成
物は病気におかされた領域に局所的に適用され、例えば
目には点眼として又は皮膚にはクリーム、軟膏又はロー
ションとして用いられる。目の場合、頻繁な治療が望ま
しく、通常４時間以内の間隔で適用される。皮膚では、
１日２〜４回又はそれよりしばしば治療組成物を適用し
て、治ゆ中病気に２かされた領域に治療組成物を常に維
持するのが望ましい。 本発明のポリペプチドに用いられる量は、投与のやり方
、他の活性化合物の使用などによシ変化し、一般に約１
μｔ〜１００μｍの範囲にある。本発明のポリペプチド
は、生理学上許容できる担体例えは塩水、ホスフェート
バッファー塩水などともに用いることができる。用いら
れる化合物の量は、生体外の細胞の反応及び本発明のポ
リペプチドへの実験動物の反応又は本発明のポリペプチ
ドを含む処方に基づいて実験的に決足されよ５゜ ＡＲ化合物はそれ自体だけ又は他の生長因子、阻害剤又
は免疫調節剤とともに用いられる。 ［５，７，２，腫瘍の診断及び治療］ 本発明の組成物は広範囲の腫瘍の診断、予後及び治療に
有用である。 ＡＲ及び関連分子の多数の診断の用途が考えられる。本
発明の実施において、本発明のポリペプチドは、ラベル
例えばラジオアイソトープ、酵素、フルオレサー、ケミ
イルミネサ−１酵素フラグメント、粒子などと結合され
る。このような化合物は、細胞に８けるＡＲに関するレ
セプターの数をタイターするのに用いられる。ＡＲに関
するレセプターの同定は、ＡＲ及び関連分子の生物学的
作用に対する細胞の潜在的な反応性の指標である。ＡＲ
，ＡＲ関遅遅分子び／又はそれに対する抗体は、培地特
に生理学的な培地に２けるＡＲの検出のための競合的ア
ッセイに用いられる。 当業者に周知の多くの診断アッセイが用いられる。 体液及び組織におけるＡＲの存在及びレベルは、直接又
は逆比例し１或る癌の存在及び浸透に関する。ＡＲを検
出及び／又は定量するアッセイは、癌の診断及び予後に
用いられる（上記の［５，６］項参照）。 本発明は又ＡＲｍＲＮＡの検出に関する。周知の遺伝子
配列の全て又は一部よりなる配列を検出する核酸プロー
ブを利用するアッセイは、当業者にとり周知であシそし
て用いられる。ＡＲｔｇＲＩＶＡレベルは現れ′Ｃぎた
又は存在する腫瘍を示し、それ故ＡＲｍＲＮＡレベルを
定：！ｌするアッセイは価値のある診断手段を提供する
。 さらに、ＡＲレセプターを発現する悪性細胞は、レセプ
ター結合アッセイにおいてラベルしたＡＲ又はＡＲＲ連
分子を用いることにより、又１４ＡＲレセプターそれ自
体に対する抗体の使用により検出される。細胞は、ＡＲ
に関するレセプターの存在及び密度に従って区別され、
それによりＡＲの生物学的活性へのこのような細胞の影
響を予想する手段を提供する。 ＡＲは抗腫瘍化合物として使用できる。生体内の使用の
ために、本発明の組成物は、種々のやシ万で投与され、
注射、注入、局所、非経口などを含むがしかし限定され
ない。 投与は、ホスフェートバッファー塩水、塩水、滅菌水な
どを含む任意の生理学上許容できる担体中である。ＡＲ
及び関連分子は又リポソームにカプセル化され、そして
腫瘍又は細胞特異的抗原を認識且結合する抗体に共役し
、それによシ本発明の組成物の「ターゲツティング」の
ための手段を提供する。 ＡＲは、膿瘍細胞に２い℃末端分化を誘導するのに生体
内で有用である。このような細胞は、正常な細胞の細胞
分化の特徴の普通のコースから離れそして連続した増殖
を行うことができる。対照的に正常な細胞は、多くの環
境の下で次の細胞分裂のできない細胞へ分化する。従っ
て、腫瘍中に正常な細胞分化を再開させそして結局連続
する腫瘍生長を阻止するＡＲの能力は、腫瘍治療の処方
に有用に用いられる。 ＡＲ及び関連誘導体、類似体及びそのペプチドは、それ
単独又は少（ともｌａｌの他の抗腫瘍化合物（例えばイ
ンター７エロ／、ＴＧＦ−βｌ、ＴＧＦ−β２、腫瘍壊
死因子−β、腫瘍壊死因子−αなどを含む）とともに、
広範囲の容管例えば肺、胸、前立腺、直腸などに影響す
るホルモン的に反応性の癌の治療に用いられる。ホルモ
ン的に反応性の癌は、又癌細胞に２けるＡＲの生成を誘
導することにより治療される。誘導剤は、エストロゲン
例えば１７−βエストラジオール、エストロゲン性活性
を有する化合物及び抗エストロゲン性活性を有する化合
物例えはタモキシフエ／を含むがしかしそれに限定され
ない。これらの化合物の任意の組合わせも又誘導剤とし
て用いられる。 本発明の化合物は生体外で用いられて、感度が高くない
細胞から区別されるように、ＡＲに対して感度の高い細
胞又は細胞株の生長を阻害する。このやり方で、不均一
な混合物又は細胞株は望ましくない細胞を有せず、望ま
しくない細胞は、ＡＲの生長阻害活性に対して感度が高
い。例えば、本発明の化合物は、生体外で用いられて自
己由来の骨髄の移植に２いて骨髄から悪性の細胞を排除
し、そして再注入前に血液中の悪性細胞の増殖の排除又
は阻害を行う。 成る細胞の増殖を阻害するＡＲの最も有効な濃度は、間
係のある膿瘍細胞へ楕々の濃度のＡＲを加え、細胞増殖
の阻害量をモニターすることによシ求められる。最も有
効な濃度の個々の誘導剤及び／又は誘導剤の組合わせは
、癌細胞中のＡＲの生成をモニターすることにより求め
られる。 〔６，実施例：ヒトアムフイレグリ／の生成、精製及び
性質〕 下記の項は、ＴＰＡにより処理されたＭＣＦ−７細胞に
よシ生成するアムフイレグリンの精製及び性質を記載す
る。 〔６，１、原料及び方法〕 下記の方法は、ＭＣＦ−７細胞にＡＲ合成を誘導しそし
て実質的に純粋なＡＲを製造しそして特徴付けを行うの
に用いられた。 ［６，１，１，５１）Ｓ−ポリアクリルアミド・ゲル・
電気泳動〕蛋白は、記載（Ｌａａｔｐｕｎｌ　ｉｔ　　
１９７０　＃　Ｎａ！ｓｒｓ　２２７：６８０〜６８５
）されたように、５ＤＳ−ＰＡＧＥスラブゲル（通常又
はミニのバイオラッド−システム）で分析し、そして銀
染色（Ｍａｒｒｉｌ　　ａｔ　　ａＬ＋１９８１ｍｓｅ
ｉｍｓａｍ＋２１１：１４３７〜１４３９）により検出
した。 （６，１，２，等電点電気泳動〕 等電点電気泳動は、Ｒｅ５ｏｌｖｅ　ＩＥＦゲルに関す
るｌ５ｏｌαｂ　Ｔｅａん５ｔｃａｌデータシートによ
り主として記載されたように行われた。簡単には、す／
プルはプレキャスト・アガロース・ゲル（８５Ｘ１００
酊、ｐＨ３〜１０）に置かれ、そし℃バイオ・ラッド・
モデル−３０００Ｘｉコンピユーター制御電気泳動動力
供給を用いＲａｍｂｌｇ−モデルＦ７？−２５００等電
点電気泳動ユニットでフォーカスした。バイオ・ランド
ＩＥＦ標準をサンプルとともにフォーカスし、染色し、
そして乾燥したゲルをデュポンｃｒｏ％ａｓ照明プラス
桶カスクリ−／によりコダックＸ　−Ｏｍａ　ｔ　ＡＲ
フィルムに露出した。 （６，１，３，蛋白のヨード化〕 蛋白をクロラミンＴ法（Ｂａｒｒｔｄｇａ　、　１９７
８　ａＭａｔｈｏｄｓＥｓｚｙｍｏｌ　、５０　：　５
４〜６５　）を用いで！ｓＩにより標識した。 （６，１，４，蛋白の測定〕 蛋白の濃度を種々の波長（２１０〜２８０引→の吸収に
より求めた。Ｌｏｗｒｙ（Ｌｏｔｎｒｌ　ａｇ　　（！
Ｊ、１９５１．　Ｊ、Ｂｉｏｌ。 Ｃｈａｒｍ、１９３：２６５〜２７５）及びＢｒａｄｆ
ｏｒｄ（１９７６ｅ　Ａｎａｌ　、Ｂｉｏａｋａ嘱、７
２　：　２４８〜２５２）の方法が標準としてのウシ血
清アルブミンとともに用いられた。 （６，１，５，”Ｉ−ＥＧＦ結合７ツセイ）結合アッセ
イは、記載（Ｃａｒｐｅｎｔｅｒ　ａｔ　ａｌ　、＊１
９７９＊Ｊ、ＢｉｏＥ、Ｃｈａｔｎ、２５４．４４８４
　４８９１；５ｈｏｙａｂ、ａｔａｊ、１９７９．Ａ’
ａｔ＠ｒｖ　　２７９：３８７　３９１；ＤｅＬａｒｅ
ｏ、ａｔ　　ａｌ−ｍ１９８０　ｅ）、Ｂｉｏｌ　、Ｃ
ｈ＃偽、２５５：３６８５−３６９０）されたように、
新しく生長した及び／又はホルマリン固定Ａ４３１細胞
を用いたとき、４８穴組織培養プレート中、又は記載（
ｆｓ％ｂａｌｌ　５％ｄｌｌ’ａデデ鱈。 １９８４　＃　Ｂｉｏｅｋｍｍ、Ｂｉｏｐｈｙａ、Ａｃ
ｔａ　７７１　：　８２〜８８）されたように９６穴塩
化ポリビニルプレート上に血漿膜を不動化することＫよ
シ行われた。 （６，２，７ムフイレグリンの製造〕 ［６，２，１，ＴＰＡ処理ＭＣＦ−７細胞からの調整培
地の採集］ ＭＣＦ−７細胞を、Ｔ１５０コ一ニング組織培養フラス
コ中で、合計２５１の５０％ＩＭＤＭ（Ｉａａｏ＊−の
Ｍｏｄｉｆｉｅｄ　ＤｓｌｂａｅｅａのＡｆ＊ｄ（ａ）
＋５０％ＤＭＥＭ（０，６μｆ／Ｋｌのインスリン及び
１５％加熱不活性化ウシ胎児血清を含む）（ＭＣＦ−７
完全培地）で培養した。約ｌＸｌ０’細胞を各フラスコ
に接種し、５％ＣＯ８とともに３７℃でインキュベート
した。６日目に、すべての培地を除キ２０１１Ｌｔ（ｒ
）新シイＭＣＦ　−７完全培地（１００＊ｆ／ｇｆ）Ｔ
ＰＡを含む）を各フラスコに加えた。４８時間後、培地
を除き、各フラスコを１５μの５０％ＩＤＡｆ＆＋５Ｑ
％ＤＭＥＭ（無血清培地）で洗い、２５耐の新しい無血
清培地を各フラスコに加えそして５％ＣＯｔとともに３
７℃でインキュベートした。４日後、調整した無血清培
地を集め、遠心分離してかすを除きそして一２０’Ｃで
貯蔵した。フラスコに再び２５ｍの無血清培地を加え、
そして調整した無血清培地を３又は４日毎に集めた。各
採取分からの調整された培地からの一部を、Ａ４３１ヒ
ト扁平上皮癌の細胞について生長阻害活性（ＧＩＡ）を
アッセイした。通常、３〜４回の調整された培地を、Ｔ
ＰＡ処理ＭｃＦ−７１１ｆＪ胞の各バッチから集めた。 （６，２，２，粗ＡＲの単離〕 約４５００ｍの調整培地を解凍し、３５００　ｒｙｎで
１５分間４℃で遠心分離した。上澄みを４℃で３’Ｊ４
１０ｉ（ア　　−ミコン）を用いアミコンｚｔｍ、縮器
中で濃縮した。保持物の容量が約２００１になったとき
、１０００１１Ｌｔの冷Ａｆ４ｇ（−Ｅ−Ｑ水を加えそ
して混合物を２００Ｒ１に再濃縮した。 濃縮物を除きそして予め冷した２５０ゴのコー二／グ遠
沈ビンに移した。濃酢酸を撹拌しつつ徐々に加えて最終
濃度を１Ｍ酢酸とした。混合物を４℃で１時間放置し、
５ｏｒｖａＬ　ＲＣ−５Ｂ遠心分離機で４℃で４０，０
００　ＸＰで２０分間遠心分離した。上澄みを除きそし
て４℃で貯蔵した。ペレットを３０ゴの１Ｍ酢酸に懸濁
し、そして前述のように再遠心分離した。上澄みを再び
注意深（除きそして第一の上澄みとともにプールし、次
に／１６３スペクトラポア透析管（約３０００の分子量
をカットオフ）中で１７１！の０．１Ｍ酢酸に対して透
析した。透析バッファーを２日間にわたって３回変えた
。保持液を凍結乾燥した。乾燥物を除き、プールし、計
量しそしてさらに用いるまで一２０’Ｃで貯麓した。こ
の材料な粗粉末と呼、じ。 （６，３，アムフイレグリンの覆製〕 ［６，３，１，逆相液体クロマトグラフィ〕９５０■の
粗粉末（約９）の無血清調整培地から）を３００−の０
．１％ＴＦＡ（トリフルオロ酢酸）に懸濁し、７．００
０＞１で２０分間遠心分離した。上澄みを注意深く取り
出し、そして水中０．１％ＴＦＡにより平衡した標品Ｃ
１ＢのカラＡ　（２，５４ｃｌＬＸ　２７ａＩＬ；　５
５〜１０５ミクロン；クオターズンに適用した。クロマ
トグラフィ・サポートをアセトニトリルＣＭｍＣＮ）（
０，１％ＴＦＡを含む）に懸濁し、スラリーを２．５４
ａａの直径のカラムに注ぎ、カラムを０．１％ＴＦＡ含
有ＭｅＣＮ　４００−により洗い次に水中０．１％ＴＦ
Ａ６００ｄ、により平衡化した。流速は４Ｗ１ｔ／分で
ありそしてクロマトグラフィな室温で行った。カラムを
水中０，１％ＴＦＡ６５０−により洗った。ブレークす
るー及び洗液をともに集めた。次に段階毎の溶離を次の
ように行った。（１）０．１％ＴＦＡ含有２０％ＭａＣ
Ｎ／Ｉｆ、０６５０ｍ、　　（２）　０．１％ＴＦＡ含
有４０％ｊｆ　ａ　ＣＮ／Ｅ、０６５０−１（３）０．
１％ＴＦＡ含有６０％ＭａＣＮ／Ｈ，０６５０−及び（
４）０．１％ＴＦＡ含有１００％ＭｇＣＮ６５Ｏ−０一
部な各画分から取ってＧＩＡについてテストし亀約７７
％の全ＧＩＡ活性がブレークするー及び洗液の画分に生
じた。 ブレークするー及び洗液の両分を高速液体クロマトグラ
フィ（ＨＰＬＣ）システム（ウォターズ）に付属した標
品Ｐａｒｔｔａｉｌ　　１００ＤＳ　−３カラム（１０
ミクａｙ、２．２Ｘ　５０ｔｘ、ウオットマン）にイソ
クラティック的に注入した。流速は４Ｗｔ／分にセット
された。−度サンプルがカラムを通ると、カラムを水中
０．１％ＴＦＡ２５０ｄにより洗つへ直線の勾配が一次
溶媒（水中０．１％ＴＦＡ）及び二次溶媒（０，１％Ｔ
ＦＡ含有アセトニトリル）の間に生じた。 勾配条件は次の通りであった。０〜１５％１０分、１５
〜１５％３０分、１５〜２５％１５０分、２５〜６５％
１００分及び６５〜１００％１０分。すべての溶媒はＨ
ＰＬＣグレードであった。１４−の画分な集め、各両分
の一部なＧＩＡについてアッセイした。活性の２個の広
いピークが見られた（第１図几初めの溶離ピーク（２０
〜２３％のアセトニトリルで溶離）をさらに精製しそし
て特徴を研究した。 画分４７〜６２をプールした。水中０．１％ＴＦＡ２２
４ｄをプールした両分に加えた。混合物を室温で２−７
分の流速で半標品μｍＢｎ＊ｄａｐａｋ　−ＣＩ　８カ
ラム（７，８Ｘ３００簡、ウオターズ）にインクラティ
ック的に注入した。 線状勾配条件は、１０分で０〜１７％、３０分で１７〜
１７％、３２０分で１７〜２５％及び４０分で２５〜１
００％であった。流速は勾配中ｌＷｄ／分であり、セし
て４−の画分を集めた。一部を取りＧＩＡについてアッ
セイした。 ２個の主なピークの活性がそれぞれ約２０％及び２１％
のアセトニトリル濃度で溶離するとき認められた（第２
図）。 画分４９〜５３をプールした。２０−の０，１％ＴＦＡ
をプールした一分に加えた。混合物を室温で１−７分の
流速でμｍＢｏｓｄａｐａｋ−Ｃ１Ｂカラム（３，９Ｘ
３００Ｍ、ウオーターズ）にインクラティック的に適用
した。勾配条件は、１０分で０〜１８％、３０分で１８
〜１８％、２８０分で１８〜２５％そして２０分で２５
〜１００％であった。流速は０．４　ｄ／分でありモし
て２−の画分な集めた。活性の多くは、約２１．５％の
アセトニトリル濃度でカラムから生じた（第３Ａ図）。 画分５４〜５９（第２図）をプールしそして第３Ａ図に
おいて上述したのと全く同様にクロマトグラフィした。 活性の多くは、約２２．２％のアセトニトリル濃度でカ
ラムから溶離した（第３Ｂ図）。 Ｃ６，３，２，ゲル浸透クロマトグラフ４３画分３５〜
３８（第３Ａ図）を５ｐｅｅｄ−Ｖａｎ濃縮器（Ｓａｇ
ａ％ｔ）な用いて約７０μ！に個々に濃縮し、それに０
．１％ＴＦＡを含む等容量のアセトニトリルを加えた。 この１４０μｌのサンプルを、縦に一列にした２本のＢ
ｉｂ−ａ４１７’５ｆ−２５０カラム（それぞれ７．５
Ｘ３００ｆｉ＃バイオ・ラッド）に注入した。溶離は、
室温で０．１％ＴＦＡを含む５０％アセトニトリル／Ｈ
，０の移動相によりインクラティック的に行われた。流
速は０．４Ｂｇ／分であり、チャート速度は０．２５ａ
ａ／分であり、０．４１１１を画分を集めそして一部な
ＧＩＡについてアッセイした。画分３５．３６及び３７
のクロマトグラフィ・プロフィル（第３Ａ図）を第４Ａ
、４Ｂ及び４Ｃ図にそれぞれ示す。 画分４１及び４２（第３Ｂ図）をともにプールし７０μ
１Ｋｆｌｋ縮して次に前述のようにゲル浸透クロマトグ
ラフィにかけた。クロマトグラフィのプロフィルを第４
Ｄ図に示す。 （６，４，細胞生長アッセイ〕 （６，４，１，ＤＮＡへの１２リープオキシウリジン付
加を用いる細胞生長調節アッセイ〕 アッセイを９６個の平木プレート（Ｆａ１６ｅ％３０７
２）で行った。外陰細胞のヒト扁平上皮＠（Ａ４３１　
）を生長阻害活性（ＧＩＡ）のためのテスト細胞として
用い、ヒト包皮線維芽細胞（サダモト）を生長刺激活性
（ＧＳＡ）用の指標細胞として用いた。５％加熱不活性
化ウつ胎児血清（ＦＢＳ）、ペニシリン／ストレプトマ
イシン＜ｐｓ）及びグルタミンを添加されたＤＭＥＭ（
テスト培地）５０μｌ中の３．５　Ｘ　１０’細胞をす
べての穴に入れ、ただし回りの穴には除いた。回りの穴
には５０μｌＰＢＳを入れた。 ３時間後、テスト培地中のテストサンプル５０μｌを各
人に加、ｔ、　一方コントロール穴にはテスト培地５０
μｌのみを加えた。３個の穴をテストサンプルの各濃度
に用いた。 プレートを２〜３日間３７℃でインキュベートした。こ
の後、１２１　／−ヨード−２′−五”Ｉ−デオキシウ
リジンの溶液１００μｌ〔４ｃ４７〜〜０．５惰Ｃ＝　
／Ｗｔ　（テスト培地中２μｌ／ｗ））を各人に加えそ
してプレートを３７℃でインキュベートした。４〜６時
間後、培地を穴から吸引し、２００μＥのＰＢＳＶｃよ
り１回洗った。次に２００μｌのメタノールを各人に加
え、プレートを室温で１０分間インキュベートした。次
にメタノールを吸引により除いた。 ２００μｌの１Ｍ水酸化ナトリウムを各人に加え、プレ
ートを３７℃で３０分間インキュベートした。水酸化ナ
トリウムをタイターチック・プラグ（ＦＬｏｗ　Ｌａｂ
ａ　）により除いた。プラグを１２Ｘ７５Ｍプラスチッ
ク管に移し、そしてガンマカウンターによりカウントし
て＋ｔｓｌ−（ＵｄＲ付加の定量をした。 ［６，４，２，ソフトアガーコロニーブツセ４３１０％
加熱不活性化ＦＢＳを含むＤＭＥＭ中の０．５％アガー
（ＡσαｙＮｍｂｌａ；デイフコ・ラボラトリーズ、デ
トロイト、ミシガン）の０．５ｍのベース層を２４穴コ
スタ−組織培養プレートに加えた。同じ培地・ＦＢＳ混
合物、５〜ｌ０ＸＩＯ”テスト細胞及び種々の濃度のテ
ストすべき因子を含む０．３％アガー０．５−を、アガ
ーのベース層上に重ねた。プレートを空気中５％ＣＯ２
の含湿雰囲気中で３７℃でインキュベートし、そして７
日後同−の培地及びテスト材料の濃度を含む０．３％の
アガー０．５ｄを加えた。 コロニーを固定且染色せずに計算し、２０細胞より太き
いコロニーの数を７日と１４日との間に数えた。 ［６，４，３，細胞生長阻害アッセイ〕Ａ４３１細胞を
、２４穴＝ｒ、ｒ、タープレート（約２ｃｍ”／穴）中
の０．３−の培地（１０％ＦＢＳ、Ｐ／Ｓ　、グルタミ
ンを含むＤＭＥＭ）中に１穴当り２．Ｉ　Ｘ　１０’細
胞で入れそして３７℃で２時間インキュベートした。次
に０．３−の培地中の種々の濃度のテストサンプル（２
個ずつ）を各人に入れた。コントロールの穴にはサンプ
ルのない培地を入れた。 プレートを７２時間３７℃でインキュベートした。培地
を次に吸引し、細胞を１４ＰＢＳ／穴により洗い、０．
５ｍｇのトリジンｙ（０，５％）−ＥＤＴＡ（０，５ｓ
Ｊｆ）により離しモしてＣ・ｓｉｇ−デカランターを用
いてカウントし瓢（６，Ｌ　　ＡＲ−一次構造の分析〕 （６，５，１，還元及びＳ−ピリジルエチル化〕ＡＢＣ
２０〜３０μｔ）を１．５　ｍのミクロフユージ・ポリ
プロピレン管で乾燥し、０．０５＆）リス−ＨＣｌ％　
、Ｈ７，５中の３Ｍ尿素ｌＯＯμｌ中に懸濁した。４μ
ｌの２−メルカプトエタノールを混合物に加え、内容物
を混合し、窒素をフラッシュしそして２５℃でインキュ
ベートした。 ２．５時間後、４，５μｌの新しく蒸留した４−ビニル
ピリジンを混合物に加え、管を再び窒素でフラッシュし
、２５℃で２時間インキュベートした。反応混合物を１
０％ＴＦＡによりｐＨ２，０に酸性化し？Ｑｌ　ｓ−ピ
リジルエチル化ＡＲを、ｐ　−Ｂｏｎｄａｐａｈ　Ｃ１
８カラム（３，９Ｘ３００ｆｉ、ウオターズ）を用いて
デ、ＨＰＬＣにより精製した。アセトニトリルの濃度を
ＩＷＩｔＺ分の流速で５５分間で直線的に上昇させた（
１％／分）。−次溶媒は０．１％ＴＦＡであった。 Ｓ−ピリジルエチル化ＡＲ（ＳＰＥ−ＡＲ）は約２６．
５％のアセトニトリルで溶離し、未処理ＡＲより約４％
高いアセトニトリル濃度であった。 Ｃ６，５，２，Ｎ−グリカナーゼ処理〕ＡＲ又はＳ−ピ
リジルエチル化ＡＲ（１０〜２０μ？）を１．５−のポ
リプロピレン・ミクロフユージ管で乾燥し、８０μｌの
０．１ＭホスフェートバッファーｐＨ５，５中に懸濁し
、ｌＯ〜２０μｌのＮ−グリカナーゼ（０，２５単位／
μｌ、Ｇａｎｇシ愼−）を加え、混合物を３７℃で１６
時間インキュベートし、０．９ｍの０．２％ＴＦＡを反
応混合物に加え、そして−次溶媒０．１％ＴＦＡにより
予め平衡させた流速１−７分のウルトラポアＲＰＳＣ３
３デ、ＨＰＬＣカラＡ（４−６Ｘ７５ｍ、、４ｊｔｇｚ
）ＩＩＣ注入した。０．１％のＴＦＡを含むアセトニト
リルを二次溶媒として用いた。アセトニトリルの濃度を
、室温で８５分間直線的に（０，４％／分）増大させた
。Ｎ−デグリコシル化−ＡＲ及びＮ−デグリコシル化Ｓ
−ピリジルエチル化ＡＲは、それぞれ約１．６．５及び
２０，５％のアセトニトリル濃度で溶離した。 〔６，５゜３．Ｎ−グリカナーゼ処理Ｓ−ピリジルエチ
ル化ＡＲの酵素的開裂〕 エンドペプチターゼＬｙｅ−Ｃによる開裂は、１６時間
２５℃で６０μｌの０．１＆）リス酢酸バッファーｐＨ
８，０中で行われた。酵素／基質の比は１対５（Ｗ／Ｗ
）であった。 エンドペプチターゼーＡｒｇ及びＳ、ａ％デー５ｘＶ８
　　プロテアーゼ消化は、１６時間３７℃で８０μｌの
０．０５Ｍトリス−ＭＣＩ　、ｐＨ８，０及び０．１　
Ｍ重炭酸アンモニウム中で行われた。酵素／基質の比は
、再び１対５であった。 （６，５，４，化学的開裂〕 メチオニン残基のＣＮＨｒ開裂では、５μＶのＮ−グリ
カナーゼ処理Ｓ−ピリジルエチル化ＡＲを１．５−のポ
リプロピレンミクロフユージ管中で乾燥し、７５μｌの
７０％ギ酸中に懸濁し、次に２５μｌのＣＮＢｒ溶液（
７０％ＥＣ０ＯＨ中の２５〜／−）を加え、混合しそし
て管を窒素によりフラッシュした。反応を暗所で２５℃
で２２時間行った。反応混合物を水により１．１−に希
釈しそしてＳアーａｄ−Ｖａｎ濃縮器中で乾燥した。乾
燥したサンプルを２０μｌの２−７ミノエタノールに懸
濁し、２２℃で１０分間放置し、次に真空乾燥した。混
合物を０．９−の０．２％ＴＦＡに懸濁した。 ［６，５，５，ペプチドの単離〕 ペプチドを、ＥＰＬＣシステム（ウォーターズ）に付着
した逆相ＨＰＬＣＣ８カラム（４−６Ｘ１００謳、ウオ
ットマン）で分離した。酸性化したサンプル（ｐＨ２，
０）を、流速ｌａｇ／分で０６１％ＴＦＡ（−次溶媒）
により平衡したカラムに適用し、カラムをさらに約１５
ｍの０．１％ＴＦＡにより洗った。直線状の勾配を、−
次溶媒と二次溶媒（０，１％ＴＦＡ含有アセトニトリル
）との間で用いた。勾配条件は、流速０．５１Ｒｔ／分
で１２５分間で０〜５０％であつた。 （６，５，６，アミノ酸分析〕 乾燥したサンプルを、１６時間１０５℃でテフロンシー
ルのガラス加水分解バルブ（ＰｉｇＴｅａ）中で減圧下
１％（Ｖ／リフエノールを含む一定に沸騰するｌ１Ｃ１
（５，７Ｍ。 Ｐｔａｒａｍ）により加水分解しへ加水分解物を５ｐｅ
ｅｄＶｅｘ−濃縮器（Ｓａ豐ｔｓｖｓｔ　Ｉｎａｔｒｓ
ｓｍ算ｔ）中で乾燥し、そして室温で２０分間フェニル
イソチオシアナートにより誘導体とした。フェニルチオ
カルバミルアミノ酸誘導体を゛、０ａｔａｄａａｙＬカ
ラム（４，５Ｘ　２５０ｍ　、　ＩＢＭ）上でｒｐＨＰ
ＬＣにより分析した。直線的勾配を、−次溶媒（酢酸に
よりｐＨ６，４に処理された０、１５Ｍ酢酸ナトリウム
ｐＨ６，４，０，０５％トリエチルアミン）及び二次溶
媒（６０％アセトニトリル）の間で３８℃で流速１−７
分で行った。 （６，５，７，アミノ酸配列の決定〕 ペプチド配列を、記載（Ｈａｗｉａｋら、１９８１、Ｊ
。 Ｂｔｏｌ、Ｃｈａｍ、２５６：７９９０〜７９９７）さ
れたように、Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｔｏａｙａｔａｍモデ
ル４７５気相シークエンサーにより決定した。各実験に
ついてサンプルの適用前Ｅｄｓａ％の３回のプレサイク
ルを行った。２５％ＴＦＡを用いて、トリアゾリン誘導
体をフェニルチオヒダントインアミノ酸に転換した。フ
ェニルチオヒダントインアミノ酸の同定は、記載（Ｈｍ
％ｋａｐ４１Ｌａｒ及びＨｏｏｄ　、　１９８３！ＩＳ
ｅｉａｎａｍ、２１９：６５Ｃ）〜６５９）されたよう
にモデに１２０Ａ　　ＰＴＨアナライザー（Ａｐｐｌｉ
ｅｄ　Ｂｉｏａｙａ−ｔａｔｎ）でオンラインで行われ
た。 （６，５，８，種々の処理〕 ５０〜１００単位の半ば純粋（セミ製品デｐ　Ｃ１Ｂ工
程）又は明らかに純粋なＡＲの何れかをこれらの実験に
用いた（第１表）。Ｎ−グリカナーゼ及びＯ−グリカナ
ーゼはＧ−％ｚｙｍａ　ｃｏｒｐ、ボストンから得られ
、すべての他の酵素ハ、ペーリンガー・マンノ１イム・
バイオケミカルズ又はＷｏｒｔｈｉ％ｇｔｏ％バイオケ
ミカルズから得た。処置は、５０〜２００μｌの適切な
バッファー中で行われた。過剰の酵素、通常基質濃度の
５〜２０％（Ｗ／Ｗ）を用いた。処理後、サンプルを、
種々の分析手段により、干渉する物質を除くことにより
ＧＩＡについて分析した。多くの場合、サンプルの、Ｈ
を１０％ＴＦＡにより約２に調節した。サンプルを、０
．１％ＴＦＡにより平衡にした逆相ウルトラポアＲＰＳ
ＣＣ３カラＡ　（４，６Ｘ　７５ｍ　、　Ａｌ　ｔａｍ
　）に適用した。カラムをさらに一次溶媒０，１％ＴＦ
Ａにより洗った。次に二次溶媒として０．１％ＴＦＡ含
有アセトニトリルを用いて開始した。勾配条件は、０．
２分で０〜５０％、１９．８分で５０〜５０％であった
。流速は０．５−７分であり、２−画分を集めた。一部
を取りＧＩＡについてアッセイした。ＡＲ活性は通常画
分４で溶離した。 〔６，６，Ｉ）ＮＡ結合の研究〕 天然のウシ胸腺ＤＮＡセルロース、変性ウシ胸腺ＤＮＡ
及びセルロースへのＡＲの結合を、記載（Ｒａｖｉｓｈ
及びＡｌｂａｒｔａ、　１９７１　、　Ｍａｔｈｏｄｓ
ｉｓ　Ｅｓｇｙｖｘ＠ｊｏ１７ｙ。 ２１：１９８）されたように行つ九セルロース（１ｏＩ
ＩＭｉ）を５００μｌのローディングバッファー（２０
＋ｓ＃）リスｐＨ７，４，１０％グリセロール、１愼Ｊ
ｆ　ＥＤＴＡ、１ｍＭｌ−メルカプトエタノール、１０
０μｙ／ｍｌ　Ｅ　Ｓ　Ａ及び５０％Ｍ　ＮａＣノ）中
で再水和した。反応を、２回１．５艷のエペンドルフ管
中で、ローディングバッファーにより５回洗りた３００
μｌの水和（パックした容積）セルロースサンプルによ
り行った。次に、０゜２％ｆの＋ｔｓＩ−、４Ｒ％異性
活性の４２５μＣｉ／μを又は他の１１１　ｌ標識蛋白
（２５０μ）のローディングバッファー中）を各管に加
えた。サンプルを混合しそして周期的に攪拌しつつ２０
分間４℃でインキュベートし、次に各洗滌毎２００μｌ
のローディングバッファーにより５回洗った。溶離をロ
ーディングバッファー中００、ＩＭ、０．１５Ｍ、０．
２５Ｍ、０．６Ｍ、　ＩＭ及び２ＭのＮａＣノにより段
階的に行った（各濃度で２００μｌで５回）。特異的に
結合した材料を、０．２５ＭＮａＣ１以上の濃度で溶離
するものとして規定した。０．１５　Ｍ　ＮａＣ１以下
の濃度で溶離する材料を非特異的結合と考えち（６，７
，結果〕 （６，７，１，ＴＰＡ処理ＭＣＦ−７細胞によるＡＲの
生成〕プラスチック基体上で生長したＭＣＦ−７細胞は
、代表的な上皮細胞の特徴を示す。細胞は小さ（形は多
角形である。ＴＰＡは、投与量に依存する形で非常な形
態学上の変化を誘導する。ＴＰＡ処理にともなって、Ｍ
ＣＦ−７細胞はそのうまく規定された形態を失い、丸く
なりそして拡がる。ＴＰＡは、未処理細胞に比べて細胞
の数における投与量依存の減少及び細胞の容積の増大を
生ずる。 ＭＣＦ−７細抱からの無血清調整培地は、Ａ４３１細胞
について検出可能な生長阻害活性を含まなかった。しか
し、２〜３日間ＴＰＡにより処理されたＭＣＦ−７細胞
から集めた無血清上澄みは、Ａ４３１扁平上皮癌細胞の
増殖を阻害することが分った。阻害活性の最適な誘導は
、２５〜１０（ｌｓｓソーのＴＰＡ除去後でも、ＴＰＡ
処理ＭＣＦ−７細胞は、少くとも８日間無血清培地にこ
の活性を分泌した。 生長阻害活性の減少はＴＰＡ除去後でも認められるが、
これらの結果は、ＴＰＡにより処理されたＭＣＦ−７細
胞における発現を誘導又は増大したアムフイレグリンを
示す。 ［６，７，２，、ｉ初の特徴付け］ 第■表は、アムフイレグリンの抗増殖活性に対する株々
の物理的、化学的及び酵素的処理の作用ヲ要約している
。 ァムフイレグリンのＧＩＡ（生長阻害活性は、３０分間
５６℃で加熱された１Ｍ酢酸、１Ｍ水酸化アンモニウム
、６Ｍ尿素、ｏ、ｏｉｎメタ過ヨーデートによる処理、
並にノイラミニダーゼ、Ｎ−グリカナーゼ、Ｏ−グリカ
ナーゼ、リパーゼ、ホスホリパーゼＡ２、Ｃ又はＤによ
る処理に対して抵抗した。しかし、活性は、１０分間１
００℃の加熱、還元、還元且４−ビニルピリジン処理、
蛋白分解酵素例えばトリプシン、エンドペプチダーゼＬ
ｙｅ−Ｃ，エンドペプチダーゼ−Ａデｌ及びエンドペプ
チダーゼ−〇１ｓ（Ｖ−８）による消化に対して感度が
高かった。これらの結果は、アムフイレグリンが、その
生物学的活性に必須のジするフィド結合にシスティンを
含む蛋白であることを示唆している。 この蛋白は、生物学上の活性に必須ではない多糖類及び
／又はリポ部分を含む。 第■表 アムフイレグリンのＧＩＡＫ対する種々の処理の効果４
℃で２時間ＩＭ酢酸　　　　　　　　　　　１０２４℃
で２時間ＩＭＮＨ４０Ｈ９７ ５６℃で３０分　　　　　　　　　　　　　　９６１０
０℃で１０分　　　　　　　　　　　　　　５６Ｍ尿素
（２５℃で２時間）８２ ０．２Ｍ２−メルカプトエタノール　　　　　　　　　
６（２５℃で２゜５時間） ２−メルカプトエタノール＋４ビニルピリジン　　　１
（２５℃２．５時間）　　　　　（２５℃２時間）０．
０１Ｍナトリウムメタ過ヨーデート８６（暗所、４℃６
時間） ｒｐｃｘ−）リプシン（３７℃６時間）　　　　　　３
ｒｐｃｘ−トリプシン十大豆トリプシン　　　　８２イ
ンヒビター （６時間３７℃） 大豆トリプシンインヒビター　　　　　　　　　１０９
（６時間３７℃） ノイラミニダーゼ（１６時間３７℃）　　　　　１０３
Ｎ−グリカナーゼ（１６時間３７℃）９００−グリカナ
ーゼ（１６時間３７℃）　　　　１０２ホスホリパーゼ
Ａ２（６時間３７℃）８２ホスホリパーゼＣ（６時間３
７℃）９５ホスホリパーゼ〃（６時間３７℃）８０リパ
ーゼ（６時間３７℃）　　　　　　　　　１１１（６，
７，３，アムフイレグリンの精製〕アムフイレグリン精
製の要約は、第■表に示される。 ５．１％収率の１，８４２倍の精製が、ＴＳＫ２５０−
１画分について達成され、そして１．７％収率の２，２
７０倍の精製が、ＴＳＫ２５０−Ｕ画分について得られ
た。方法は再現可能である。本発明者は、４種の異る場
合にアムフイレグリンを精製して同様な結果を得た。精
製したアムフイレグリンの特異性活性は、２．７〜３．
４　Ｘ　１０’単位／■蛋白の範囲内に入る。約３．Ｏ
Ｘ　１０’の特異性活性を有するＴＳＫ−２５０−１カ
ラムからの精製したアムフイレグリンを、構造上の決定
及び他の生化学的研究に用いた。 費　詳細は［６，１，３，３項及びその項内に示されて
いる。 ＣＩＡの１単位は、Ａ４３１細胞への１２１１−デオキ
シウリジン付加を５０％阻害するのに必要な因子の量と
して定義された。 （６，７，４，ＨＰＬＣによるアムフイレグリン（ＡＲ
）及びＳ−ピリジルエチル化アムフイレグリン（ＳＰＥ
−ＡＲ）の分析〕 ＴＳＫ２５０カラム（７，５×６００１１ＩＢ、バイオ
・ラッド）上のＡＲ及び５ＰＥ−ＡＲのゲル浸透クロマ
トグラフィは、それぞれ第５Ａ及び５Ｂ図に示される。 活性は蛋白のピークとともに溶離した（５Ａ）。ＡＲ及
び５ＰＥ−ＡＲの分子量は、第５図のデータから求めら
れそしてそれぞれ約１４．０００及び１７，０００であ
ることが分った。第１２図に示される先端を切ったＡＲ
及びＡＲの構造に関する計算された分子量は、それぞれ
約８５００及び９１００ダルトンである。 ＡＲ及びＳＰ、Ｅ−ＡＲは、ウルトラポアＲＰＳＣＣ３
、ｐＥＰＬＣカラム（４，６Ｘ　７５ｎ＋　、　Ａｌ　
ｔａｍ　）から対称の一本のピークとして溶離した（第
６Ａ及びＢ図）。ＧＩＡは、蛋白のピークとともに溶離
した（第６Ａ図〕。５ＰＥ−ＡＲは約２１％のアセトニ
トリル濃度で溶離し、未処理蛋白より約４％高いアセト
ニトリル濃度であった。これらの結果は、ＡＲが４−ビ
ニルピリジンにより修飾されるシスティン残基が多いこ
とを示唆し、従ってＡＲをさらに疎水性にし、アセトニ
トリルの高い濃度で同時Ｋｇ離させる。 （６，７，５，ＡＲの５ＤＳ−ＰＡＧＥ分析〕第７Ａ図
は、還元条件下１５％アクリルアミド中のＡＲｌＮ−グ
リカナーゼ処理ＡＲ（ＮＧ−ＡＲ）、５ＰＥ−ＡＲｌＮ
−グリカナーゼ処理５ＰＥ−ＡＲ（ＮＧ−５ＰＥ−ＡＲ
）の分析を示している。ＡＲ及び５ＰＥ−ＡＲは、約２
０．０００〜２５，０００の範囲内で２２，５００の中
位相対分子量を有する広い拡散した一本のバンドとして
ゲル中を泳動した（レーン１及び３）。Ｎ−グリカナー
ゼによるＡＲ及び５ＰＥ−ＡＲの処理は、これらの蛋白
のより早い泳動をもたらした。ＮＧ−＃及びＮＧ−５Ｐ
Ｅ−ＡＲは、それぞれ１４，０００及び１４，５００の
中位分子量を有する一本のバンドとして泳動した。同様
な結果は、蛋白が非還元条件（データは示されていない
）の下１５％ゲル中を動くときに認められた。ノイラミ
ニダーゼ、０−グリカナーゼ又はノイラミニダーゼ十〇
−グリカナーゼによるＡＲの処理は、還元又は非還元の
何れの条件でもゲル中のその電気泳動的運動性を変えな
かった。従って、ＡＲは、生体外でＡＲのＧＩＡについ
て要求されないＮ結合オリゴ糖鎖を含む一本鎖の糖蛋白
である。 ホスホリパーゼＤＣＰＬＤ）（キャベツ）ＫよるＮＧ−
′ＡＲ又はＡＲの処理は、ＧＩＡをコントロールの８０
％に低下させた。ＰＬＤ処理ＮＧ−ＡＲは、Ｃ３カラム
上でデ、−ＨＰＬＣにかけられ、そして精製された活性
ピークは２０％５ＤＳ−ＰＡＧＥで分析された（第７Ｂ
図）。Ｍｒ５６００の一本のバンドが認められた。これ
らの結果は、ＰＬＤ又はＰＬＤ製品中の成る混入プロテ
アーゼがＡＲを活性フラグメントに転化することを示す
。 （６，７，６，ＡＲの等電点電気泳動（ＩＥＦ）分析〕
５ｔｓ４標識ＡＲ二つＩＥＦ分析は、上記の［６，１，
１，２，］項に記載されたように行った。ＡＲは、７．
６〜８間のＰ工で一本の広いバンドとしてフォーカスし
た（第８図）。ＮＧ−ＡＲは、約８．０５のＰｌの一本
のバンドとしてフォーカスした。従ってＡＲは塩基性の
一本鎖のＮ結合糖蛋白である。 （６，７，７，生物学上の性質〕 異る濃度の精製したＡＲによる。４４３１細胞のＤＮＡ
へのｌ！１１−デオキシウリジン付加の阻害は、第９Ａ
図に示される。ＤＮＡ合成の５０チ阻害は、約０，２％
ｆ／穴で認められた。従って、Ａ４３１ヒト扁平上皮癌
細胞の５０％ＤＮＡ合成阻害は、純粋な蛋白の約０．１
３％Ｍ濃度で認められた。 しかし、ＡＲのＧＩＡは、実験条件例えば細胞数／穴（
細胞密度）、因子適用の時間、処理時間、血清濃度及び
他の変数に依存することに注意すべきである。 Ａ４３１細胞が種々の濃度のＡＨの存在及び不存在で生
長しそして細胞生長が直接の細胞カウントによりモニタ
ーされたとき、ＡＲがＡ４３１増殖を投与量に依存する
やシ万で阻害したことが見い出された（データは示さす
）。従って、ＤＮＡへのＩｔａｌ−デオキシウリジン付
加の程度は、細胞生長の良い目安である。 桟々の濃度の精製したＡＲによるヒト包皮繊維芽細胞（
サダモト）のＤＮＡへの１２５１−デオキシウリジン付
加の刺激は、第９Ｂ図に示される。１”Ｉ−デオキシウ
リジン付加の２倍の刺激は、約０．７％Ｖ／紅又は約０
．０５％ＭＡＲで見られる。最大の反応は、これらの線
維芽細胞へのＩｔａｌ−デオキシウリジンの約６倍の刺
激であった。従って、ＡＲは、たとえ５％ＦＢＳの存在
下であってもヒト線維芽細胞に関する生長因子として働
（。 種々の腫瘍及び非腫瘍ヒト細胞株及び成るヒト以外の細
胞株のＤＮＡへの１！５Ｉ−デオキシウリジンのそう人
に対するＡＲの効果を検討した。データは、第■表に示
される。 ＡＲはＡ４３１細胞、ヒト乳癌細胞ＨＴＢ１３２、ヒト
卵巣奇形癌細胞ＨＴＢ１５７５、ヒト頚部の上皮癌細胞
ＣＲＬ１５５、ヒト卵巣の乳頭状腺癌細胞ＨＴＢ７５及
びヒト胸部の腺癌細胞ＨＴＥ２６の植々のクローンの生
長を阻害した。それは種々の細胞に対して顕著な作用を
示さなかった（第■表）。Ａ、Ｒは、三、四のヒト線維
芽細胞株、ヒト下垂体腫瘍細胞ＣＲＬ　７３８６、ヒト
卵巣腺癌細胞ＨＴＢ７７、アフリカミドリザル腎細胞Ｅ
ＳＣ１及びラット腎細胞ＳＡ６への１２５１−デオキシ
ウリジンのそう入を刺激した。 ＡＲは、Ｔ、Ｂ又は内皮性の細胞の増殖には顕著に影響
しなかった。ＡＲは、混合白血球培養反応（ＭＬＣ）に
２いてヒト増殖性又は細胞毒性Ｔ細胞を抑制しなかった
。 ＡＲは、活性のために銀白のジするフィド結合を必要と
し、活性のためのグリコジル化を必要とせず、温和な酸
及び塩基処理で安定でありそして３０分間５６℃で加熱
処理したとき安定な単量体状蛋白である。ＡＲは、還元
されたとき、５分間１００℃で加熱されたとき、トリプ
シン、二′ントペブチダーゼＬｙｅ−Ｃ，工／ドペプテ
ダーゼＡｙｇ又はエンドペプチダーゼＧ１％により消化
されたとき生物学上の活性を完全に失う。 第　　　■　　　表 細胞の増殖に対するアムフイレグリ／の効果（６）ヒト
外陰の扁平上皮癌、（４３１１２５ヒト胸部腺癌ＨＴＥ
１３２　　　　２４０ヒト頚部の扁平上皮癌ＣＲＬ　　
　　　２８ヒト卵巣の乳頭状腺癌ＨＴＢ７５　　　１９
ヒト卵巣の奇形癌ＨＴＢ１５７２　　　５５ヒト胸部の
腺癌ＨＴＢ２６　　　　　　５ヒト黒色ｍＡ３７５　　
　　　　　　Ｎ、Ｄ、　　　　Ｉｌ、Ｄ。 ヒト胸部の腺癌ＺＲ７５３０Ｎ、Ｄ、　　　　Ｎ、ｌ）
。 ヒト胸部の腺癌ＭＣＦ−７Ｎ、Ｄ、　　　　Ｎ、Ｄ。 ヒ）肺１ｉ’）［癌、４５４９　　　　　　１１．Ｄ、
　　　　Ｎ、Ｄ。 ヒト前立腺の腺癌ＰＣ３Ｎ、Ｄ、　　　　Ｎ、Ｄ。 ヒト直腸の癌Ｈ３３４７Ｎ、Ｄ、　　　　Ｎ、Ｄ。 ヒトリンパ芽球様（Ｔ細胞）　　　　Ｎ、Ｄ、　　　　
Ｎ、Ｄ。 ＥＭ ヒトＥＢＶ形５５転換Ｂ細胞　　　　Ｎ、Ｄ、　　　　
Ｎ、Ｄ。 ヒト喉頭の上皮癌Ｒａｐ　２　　　　　　Ｎ、Ｄ、　　
　　Ｎ、Ｄ。 ヒト頸管癌ＣＲＬ１５９４　　　　　Ｎ、Ｄ、　　　　
Ｎ、Ｄ。 ヒト卵巣の腺癌ＨＴＢ７７　　　　　　　　　　　２５
ヒト包皮線維芽細胞（サダモ））　　　　　　　　　２
２５ヒト包皮線維芽細胞　　　　　　　　　　　　　　
７。 （グツトウィン） ウシ胎児心臓上皮細胞　　　　　　Ｎ、Ｄ−Ｎ−Ｄ・ネ
ズミ　ＢａＪｈ／　３　Ｔ　３　　　　　　　Ｎ、Ｄ、
　　　　Ｎ、Ｄ。 サル　アフリカミドリザル　　　　　　　　　　　６５
腎Ｂ５Ｃ−１ ラット腎　ＳＡ６　　　　　　　　　　　　　　　　４
５（ａ）１２５単位（，４４３１細胞上のＧＩＡ）のＡ
Ｒを２５０μｌのテスト培地に懸濁し、テスト培地によ
り５倍に連続的に希釈した。６個の希釈物を各細胞に用
いた。両分を生長調節活性についてアッセイし、ＧＩＡ
及びＧＳＡ単位を計算した。 （６）　　Ｉ　Ｇ　Ｉ　Ａ単位を、細胞への１２１１１
−デオキシウリジン付加を５０％阻害するのに要する因
子の量として規定した。 （１）　　１ＧｓＡ単位を、細胞へのＩｘ′ａ１−デオ
キシウリジン付加を１００％増大させるのに必要な因子
の量として規定した。 Ｎ、１）、−検出されず。 ＴＧＦ−βの存在及び不存在でソフトアガーにおけるＮ
ＲＫ−５Ａ６細胞コロニー形成に対するＡＲ及びＥＧＦ
の作用を行い、結果を第Ｖ表に示す。ＥＧＦは、ＴＧＦ
−βの存在下投与量依存のやり方でＳＡ６細胞の固定独
立性生長を誘導したが、ＡＧはソフトアガー中で５Ａ−
Ｇコロニー形成の非常に弱い誘導剤であることが分った
。 に対するＡＲ及びＥＧＦの作用 なし　　　　　　　　　０ ＴＧＦ−β（１％？）０ 、［（２％１）　　　　　　　　　　　　　　　　　　
０ＡＲ（４％１＞　　　　　　　　０ ＡＲ（２％？）＋ＴＧＦ−β（１％？）　　　　　　７
ＡＲ（４％？）＋ＴＧＦ−β（１％？）　　　　　　　
　　８ＥＧＦ（２ｓｊリ　　　　　　　　　　　　　　
　　０ＥＧＦ（４％？）　　　　　　　　　　　　　　
　　　６ＥＧＦ（２ｎ９つ＋ＴＧＦ−β（１％？）　　
　　　　３０ＥＧＦ（４ｍｋつ＋ＴＧＦ−β（ｈげ）　
　　　　　１１４アツセイはこの項で記載されたように
して行われた。コロニーは、少くとも６細胞の群として
規定された。 （６，７，８，その特異的レセプターへのＥＧＦの結合
に対するＡＲの作用〕 ＡＲは１，４４３１血漿膜に対すると同じくＡ４３１細
胞に対する＝Ｉ−ＥＧＦの結合を阻害することが分った
（第１θ図）。固定した細胞及び膜に対する””Ｉ−Ｅ
ＧＦ結合の５０％阻害は、それぞれ約１．１％Ｍ及び１
．８％ＭＥＧＦで見られたが、一方細胞及び膜に対する
ＥＧＦ結合における５０チ低下はそれぞれ１．８％Ｍ及
び５．７％ＭＡＲで見られた。未標識ＥＧＦは、両方の
システムにおいて高い濃度で１ｘｓＩ−ＥＧＦ−レセプ
ター相互作用を完全に阻害した。 しかし、ＡＲとの最大の競合は、細胞及び膜への結合に
ついてそれぞれ７５％及び５０％であった。ＡＲに関す
る競合曲線は、又ＥＧＦＫついて見られるのと似ていな
かった。 これらの結果は、ＡＲがＥＧＦよりＥＧＦレセプターに
関してより低いアフイニテイを示すことを教示する。又
、ＡＲは、ＥＧＦレセプターに密接に関しているその特
異性レセプターを有する。 ＡＲ阻害に対する感度が変化するＡ４３１細胞株の三、
四のクローンを選択し、セしてＡＲの感度と細胞当シの
ＥＧＦレセプターの数又はＫＤとの相関関係がないこと
が認められた（第■表）。 第　　■　　　表 ＥＧＦレセプターのＫＤの数との関係の欠除Ａ−３４，
６Ｘ１０’　　　　　１．８０　　　　　３４Ｆ−８９
，０Ｘ１０’　　　　　３．１３　　　　　２ＯＡ−２
５，１Ｘ１０’　　　　　１．３８　　　　　１１Ａ−
８５，３Ｘ１０’　　　　　３．１３　　　　　　１Ａ
４３１の種々のクロー／は、ソフトアガーにおける生長
により選択された。ＥＧＦ結合は、上記の［６，６，１
，５，’］項に記載されたように行われた。ＫＤ及び結
合部位の数を５ａａｔｅｈａｒｄプロツト（Ｓｃａｔｃ
ｈａｒｄら、１９４９゜Ａｔｎ、Ｎ、Ｙ、Ａｃａｄ、Ｓ
ａｉ、　５１　：　６６０〜６７２　）から計算した。 （６，７，９，７ムフイレグリ／の化学上の構造〕ＡＲ
のアミノ酸配列を、Ｓ−ピリジルエチル化蛋白（ＳＰＥ
−ＡＲ）並に二ノドブロテインナーゼ”１８　ｓ　スタ
ヒロコツカス・アラレスＶ８及びエントヘフチダーゼｋ
ｆにより発生したフラグメントのミタロ配列分析から演
澤した。先を切った蛋白及び６個の追加のアミノ酸を含
む蛋白の配列は、次の通シである。 先を切ったＡＲ １’１０　　　　　　　２０ ＶＶＫＰＰＱＮＫＴＥ　５ＥＮＴＳＤＫＰＫＲＫＫＫＧ
ＧＫＮＧＫ３０　　　　　　　　４０　　　　　　　　
５ＯＮＲＲＮＲＫＫＫＮＰＣＮＡＥＦＱＮＦＣＩＨＧＥ
ＣＫＹＩ６０　　　　　　　　７０　　　　　　７ＢＥ
ＨＬＥ　ＡＶＴＣＫＣＱＱＥＹ　ＦＧＥＲＣＧＥＫ大き
なＡＲ ＳＶＲＶＥＱＶＶＫＰ　ＰＱＮＫＴＥＳＥＮＴ　５ＤＫ
ＰＫＲＫＫＫＧＧＫＮＧＫＮＲＲｆｉｌＲＫＫＫＩＶＰ
ＣＮＡＥＦ　　Ｑ　ＮＦＣＩＨＧＥＣＫＹＩＥＥＬＥＡ
ＶＴＣＫＣＱＱＥＹＦＧＥＲＣＧＥＫ上記の配列は、各
アミノ酸に関して標準の一文字アミノ酸の略称を用いる
。それらの存在について疑いのあるアミノ酸残基は、か
っこ内に示される。ｒＸＪは未知のアミノ酸を示す。大
きなＡＲの量は、先を切ったＡＲのそれの約１６ｑ／ｂ
であることが分った。 ’ＡＲの蛋白配列は、Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｂｉｏｔｎａ
ｄｉｃｍｌＲｍａａａｒａｈ　／’ｏｓｓｄａｔｓｏｓ
データベース（ＰＩＲ１３）のすべての蛋白と比較され
た。又、遺伝子Ｄａｇａ　Ｂ６％ｋ（Ｂｏｌｔ　Ｂａｒ
ａｓｍｋ　ａｓｄ　Ｎａｗｍａｓｍｌｓａ、、ＬｏａＡ
ｌａｍｏａ　　Ｎａｔｉｏｎａｌ　　Ｌａｂｏｒａｔｏ
ｒｙ；Ｒｅ１ｅａｓｅ　　＃５０）１に−Ｅｓｒｏｐｍ
ａｓ　　ＭｏＬｍｅｓＬａｒ　　ＢｉｏＬｏｇｙ　　Ｌ
ａｂｏｒａｔｏｒｙＤＮＡ　ａａｑｓｇ＊ｅａ　１ｉｂ
ｒａｒｙ（Ｒｅｌｅａｓｅ　ｒ　＄１２）とも比較され
た。これらの研究は、ＡＲが新規な蛋白であシそして生
長因子のＥＧＦスーパーファミリーの一員であることが
分った。このファミリーは、ＥＧＦ（マウス、ヒト、ラ
ット、ウシなど）、ＴＧＦ−α、ウィルス生長因子（ワ
クシニア、粘液腫及びショープ線維腫）、ヒトプラスミ
ノーゲン活性体、ウシファクター■、ヒトファクターＸ
１ＬＤＬレセプター、ウシ蛋白Ｃ，ヒトプロテオグリカ
／・コア蛋白、Ｄｒｏａｏｐｈｉａ　Ｎｏｔｃｈ遺伝子
の生成物、０３ｇ１ａσα外８株１２遺伝子の生成物釜
にウニＳ、ｐｖ、ｒｐｘｒａｔｓａの細胞系統特異性遺
伝子の生成物を含む。ＥＧＦスーパーファミリーの蛋白
の構造とＡＲの構造とを並べると、ＥＧＦスーパー７ア
ミリーの他のメンバーと同じ＜、ＡＲは顕著な特徴であ
る６個の必須のシスティン残基を含み、システィン残基
のスペーシングの保存を維持しそして特徴的なしかも非
常に保存されたアミノ酸のあるものを含むことな明らか
にしている。ＡＲがＥＧＦ、ＴＧＦのような生長因子の
ファミリーのノンバーと、ＭＧＦ、５ＦＧＦのようなも
のとの間に、特にアスパラギンの使用の点で入ることは
明らかである。例えば位置２（第１のシスティン−１）
において、すべてのＴＧＦ及びＥＧＦはプロリンを有し
、ＶＧＦはグリシ／を有しそしてＭＧＦ、５ＦＧＦ及び
ＡＲはアスパラギンを有する。同じループで、位置７で
、ＥＧＦ及びＶＧＦはグリシンを有し、ＴＧＦはグルタ
ミンを有しそしてＭＧＦ、５ＦＧＦ及びＡＲはアスパラ
ギンを有する。しかし、第三のループでは、ＡＲは位ｔ
Ｒ３４で保存されたベータ・ターンを有せず（ｉｄＧＦ
、５ＦＧＦではアスパラギン、すべての他のノンバーで
はグリシン〕、グルタミン酸を有する（低いベータ・タ
ー／のポテンシャル）。ＡＲは、レセプター結合に影響
する高（保存された第三のループについて異る構造を有
する。ＡＲは、生長因子の構造上〇ものの内にグリコジ
ル化部位として、’ｄＧＦ及び５ＦＧＦに恐らく用いら
れているアスパラギン残基な有しない。 ＡＲのＮ床層配列は、それがプロリン、セリン及びスレ
オニンに富み、そしてＴＧＦ及びＶＧＦがセリン、スレ
オニン及びプロリンに富むこの領域でＯ結合グリコジル
化の可能性とともに潜在的なＮ結合グリコジル化部位を
有する（事実−つのこのような部位を有する）点で、Ｔ
ＧＦ、ＶＧＦ及びＡｔ　Ｇ　ＦのＮ宋鴻配列と成る類似
性を有する。この領域は、ＴＧＦプレカーサーのＮ末端
とＶＧＦのＮ末端との間に非常に保存されており、そし
て非常にグリコジル化された領域のように見える。 ＡＲは非常に親水性の蛋白であフ、特にアミノ酸８〜４
５を含む領域でそうである（第２図）。ＡＲのバイトロ
バシー・プロフィルは、ＥＧＦファミリーの他のメンバ
ーのそれらと類似性がほとんどない。ＡＲのＣ末端部分
のバイトロバシー・プロフィルは、ＥＧＦファミリーの
他のメンバーに構造的に関連しているが、このファミリ
ーの池のメンバーのプロフィルとは似℃いない（第１Ｉ
Ｂ及び０図）。 ［６，７，１０，ＡＲ特異的結合ＤＮＡ］ｍｌ−ｉＲを
、上記のＣ６，６，：１項に記載したアッセイを用いて
、セルロース、変性ＤＮＡセルロース及び天然ＤＮＡセ
ルロースと結合するその能力についてテストした。第１
４Ａ図に示された結果は、ＡＲが変性及び天然の両方の
ＤＮＡセルロースに特異的に結合するが、セルロースに
は結合しないことを示す。天然ＤＮＡとの結合は、変性
ＤＮＡへの結合よ９３〜４倍大きかった。 ＤＮＡと特異的に結合するＡＲの能力は、ＥＧＦスーパ
ーファミリーのすべての他のメンバーからＡＲを区別す
る。 例えば、ＥＧＦはＤＮＡセルロースと結合することがで
きない（第１４Ｂ図）。結果は、ＥＧＦ又はＥＧＩ’ｙ
アミリ−の他のメンバーには存在しないＡＲの親水性４
５アミノ酸Ｎ末端ドメイ／が、ＡＲを核（因子がＤＮＡ
と相互作用する〕へ向けることに関する核局在配列であ
ることを強（示唆している。 〔７，実施例：アムフィレグリ／に対する抗体〕ＡＲ及
び合成ＡＲ及びＡＲ−プレカーサーペプチドに対する抗
体の生成は、下記に記述される。 （７，１，原料及び方法〕 ［７，ｘ、１．　　同相ペプチド合成〕アムフイレグリ
／は、上記の〔６〕項に記載したよ５に生成且精製され
た。ＡＲ−次構造（第１５図）の残基３１〜５０（／１
６２７９）、７１〜９０　（４２８０）、ｌｏ８〜１３
０（４２６４）、１６６〜１８４（鷹２５９）及び２２
１〜２４０（４２８１）に相当する５個のペプチドを、
主として記載（Ｍａｒｒｉｆｉｍｌｄ、１９６３　、Ｊ
、Ａｍａｒ。 Ｃｈａｍ、Ｓｏａ　、８５　：　２１４９　）されたよ
５なＡｐｐｌ（ｅｄＢｉｏａｙａｔａｔｎａ　Ｉ％ａ泪
動ベプデド合成装置の固相技術によシ合成された。合成
されたペプチドは、高ＨＦ開裂法（７’ｅＬｓら、１９
８８　、　Ｊ、Ａｍａｒ、Ｃｋａｔｎ、Ｓｏｏ　、１０
５　：６４４２）を用いて樹脂支持体から開裂された。 合成ペプチドは逆相ＨＰＬＣにより精製された。 （７，１，２，抗体の生成〕 キーホール・カサガイ・ヘモシアニン（ＫＬＨ）に化学
的に共役した成熟ＡＲ及び合成ＡＲペプチドへのポリク
ローナル抗血清を、若い成熟ニューシーラント白色ウサ
ギで製造した。合成ペプチドを記載（イシカワら、１９
８３゜Ｉｍｍｘｓｏｔｓｓｚａｌ　４　：　２３５　）
されたようにＫＬＥに共役され、成熟ＡＲはカップリン
グされなかった。 ＡＲ又はペプチド共役物をＲ４ｂｉアジュバントシステ
ム（Ｒｉｂｉ　　ｌｍｍ５ｎｏａルーｔｎ、Ｒｇａｍａ
ｒｃｈ、Ｉｎｃ、ＨａｍｔｌｔｏｎｒＭＴ、）により乳
化された。１ｍの全投与物を各ウサギに投与し、即ち０
．８１は各後肢の２個所に筋肉内に、　０．２に／は１
個所に皮下に投与した。成熟ＡＲに対する抗血清を発生
させるために、３０μ？の成熟ＡＲを一次の注入に用い
、そして１５Ｍ汁次のブースター注射に用いた。合成Ａ
Ｒペプチドに対する抗血清を生じさせるために、１００
μ２の共役ペプチドを一次の注入に用いそして５０μ？
を次のブースターに用いた。ブースター注入は、３〜４
週毎に投与しそしてウサギはブースター注射ｌＯ〜１４
目抜採血された。 （７，１，３，免疫沈でん〕 ＡＲをクロラミンＴ法（Ｂａｒｒｔｄｇａ　、　１９７
８　。 Ｍｅ　ｔｈｏｒｎｓ　Ｅｎｇｙｍｏｌ　、　５０　：　
５・４〜６５　）を用いてＩｘｓｌにより放射標識され
た。ｌＯμｌのポリクローナル抗血清（又はＰＢＳ中の
希釈物）を、１０μｌのＩｘｓｌ　、４７？（５０％ｙ
７ｎｔ、比活性４２５μＣ４／μｆ）並に３０μｌのＰ
ＢＳと組合わせそして主とし℃記載（ＬｇＢｉａｒら、
１９８２゜Ｊ、ｌｍｍ５ｎｏ１．１２９　：　２２８７
〜２２９２　）に記載されたようにアッセイした。 （７，１，４，放射免疫検定〕 ポリクローナル血清をＰＢＳ中で１：５０に希釈した。 ””Ｉ　−ＡＲ（１μＰ／Ｑ比活性４２５μＣｄ／μ？
）をＴＨＥＮ７０．１％ＢＳＡ（２０ｍＭ　　）リスｐ
Ｈ７，４，５ｍＭ　ＥＤＴＡ、１５０ｍＭ　ＮａＣ１１
０，０５％ＮＦ−４０゜０．１チＢＳＡ）によシ１：２
００に希釈した。ｌＯμｌの未標識ＡＲ（ｌダ／コ）、
ｌＯμｌの希釈ポリクローナル血清及び３０μｌの希釈
′ｔＩＩＩ−ＪＲを組合せそして４５分間室温でインキ
ュベートした。蛋白Ａ−セファロース溶液を次のように
製造した。２００ダの乾燥ファルマシア蛋白Ａ・セファ
ロースを１．４１ＭのＰＢＳによシ再水和しそして８０
μｌの再水和物を洗いそして１００　ｍＭのトリスｐＨ
８．１．　１５０　ｔｎＭ　０）ＮａＣ１，０，５４（
’）　）　！Ｊ　）７ｘ−１００゜２ｒｐｃＨのＰＭＳ
Ｆ、１％のアプロチニン及び０．５μ２７成のレブペブ
チンを含む溶液によ勺４００μｌに希釈した。２０μｌ
の蛋白Ａ浴液を次に混合物に加えそしてさらに３０分間
インキュベートした。セファロースのビーズを次に２回
５００　ｐｉのＴＮＥＮｌｏ、１％ＢＳＡにより洗い、
５０ｐｌのＳ　Ｂ　（８０ｍＭのトリｙ、ｐＨ６，８，
３％ＳＤＳ、１５％クリコール、０．０１％ブロモフェ
ノールブルー、５％β−メルカプトエタノール）に再悪
濁し、そして上澄みなガンマカウンターによシ放射能に
ついてアッセイした。このやり万は約１００９ｆのＡＲ
を検出した。 ［７，１，５，＃素結合免疫吸着アッセイ］固相ミクロ
ＥＬＩＳＡ法を米国特許出願第７４０，１２４号から修
飾した。テラサキ・マイクロトレイを、各人に５μｌの
ＡＲ合成ペプチドを添加することにより調整し、ＰＢＳ
を１々の濃度に希釈し、次に溶液を室温で１晩おいて乾
燥させた。ＰＢＳ中５％Ｂ　ｌ　ｏ　ｇ　ｔ　ｏをプレ
ートに加え、１時間室温で放置した。次に、ポリクロー
ナル抗体溶液（ＰＢＳ７１％Ｂ１ｏｔｔｏ７０．０５％
トリトンＸ−１００中で希釈）の１０μｌ希釈物を各人
に加え、室温で１時間インキュベートしそして次にＰＢ
Ｓにより４回洗った。ＰＢＳ／　１％Ｂｌｏｔｔｏ／　
０．０５％トリトンＸ−１００中の１：１０００の希釈
でのパーオキシダーゼ共役ヤギ抗ウサギＩＱＧ（Ｃ峠ｐ
ａｌ）　５μｌを各人に加え、室温で１時間インキュベ
ートし、次にＰＢＳにより６回洗った。１０μｌのｒ’
Ｋ　ｉ　ｃ　ｒ　ｏ　Ｅ　Ｉ　、４　Ｃんｒｏｍｏｇａ
ｎ浴Ｗ（Ｇｅｎｇｔ＝ｃ　ＳｙｓｔｅｍｓＣｏｒｐ、）
を１＝２０の希釈で加え、吸収を次にＧｕｎ−百Ｃ５ｙ
ｓｔｅｍｓ　Ｍｉｃｒｏ　ＥＩＡプロトコールに従って
２０分及び４０分後にＵＤｃｑｔで読んだ。 ［７，１，６，ウェスタン・ブロツテインク〕サンプル
をバイオ・ランドのミニ・ゲル装置で１５％ポリアクリ
ルアミドゲル又は１６％トリシンポリアクリルアミドゲ
ルで電気泳動させた。ゲルを次にニトロセルロースのシ
ートに隣接して置きそしてカセット中にサンドイッチさ
せて、ニトロセルロースをカソード側に置いた。蛋白の
移動を、３０分間一定の電力で４００ｍＡの電流を用い
て行った。ニトロセルロースを次に取り出し、４℃で１
晩２．５％ＢＬｏｔｔａ／ＰＢＳ１０．２％７ｖｐ　−
４ｏ　中に＆ｔＪ、：。 ニトロセルロースのフィルターを次にロッキングプラッ
トフォームで室温で９０分間２．５チｌＪｔ　ｏ　ｔ　
ｔ　ｏ／Ｐ　Ｂ　５’０．２％ＮＦ−４０反応バッファ
ー中で希釈した抗血清にさらし、そして２．５％Ｂ　ｌ
　ｏ　ｇ　ｔ　ｏ　／　Ｐ　Ｓ　Ｅ　／　０．２％ＮＰ
−４０で４回洗った（各洗滌は５分間）。 ２．５％Ｂ　ｌ　６　ｔ　ｔ　ｏ　／　Ｐ　ＨＳ　／　
０．２５％ＮＦ　−４０中で１＝５００に希釈されたア
ルカリ性ホスファターゼ共役蛋白Ａ（Ｃａｐｐａｌ）　
ヲ次ニニトロセルロースのシートに加工、ソしてロッキ
ングトレイで室温で６０分間インキュベートした。フィ
ルターを次にＰＥ５１０．２％　ＮＰ−４Ｑによシ４回
（各洗滌は３分間）況い、次に「Ａ　Ｐ　、５Ｊバツフ
アー（１００ｙｘＭ）リス’ｐｆｌ　９．５．１００ｍ
Ｍ　ＮａＣ１，５ｍＭＭｙＣ１ｌｘ）中で５分間洗った
。フィルターを、使用直前に作成した着色試薬〔４０１
のＡＰＥバッファー、１２１Ｒｇの５−ブロモ−４−ク
ロロ−３−インドイルホスフェート（シグマ）並に６．
８〜のニトロブルー・テトラゾリウム（シグマ））（０
，２μｓフイルターを通した）中で現像し、Ｈ！０によ
シ停止し、次に風乾した。 ［７，２，ＡＲ抗体の特徴〕 成熟ＡＲ及び合成ＡＰペプチドに対して生じたポリクロ
ーナル血清の％徴は、放射免疫法でん、放射免疫アッセ
イ、ＥＬＩＳＡ及びウェスターン・プロティングにより
求められた。結果を第■表に示す。 （Ｇ）　　必要な抗血清の希釈 （ｂ）　　かっこ内の値は方法の感度を示す。 ＲＩＰ−放射免疫比でん ＲＩＡ−放射免疫アッセイ ＥＬＩＳＡ−酵素結合免疫吸着アッセイＷＢ−’）ニス
タン・プロット ＮＤ−測定せず 〔８，実施例：アムフイレグリンプレカーサーのｅＤＮ
Ａクローニング〕 下記の実施例は、ＴＰＡ処理ＭＣＦ−７ヒト乳癌細胞か
らのアムフイレグリンプレカーサーを工／コートするａ
ＤＮＡのクロー二／グ及び分析を示す。 〔８，１゜材料及び方法〕 ［８，１，１，ＲＮＡの製造〕 ＲＮＡを、Ｃｈｉｒｇｗｉｎ（１９７９、Ｂｔｓｅｈ＃
ｍ１ｓｔｒｙ１１８．５２９４）によｐ記載されたグア
ニジニウム法を用いて新しい凍結した組織サンプルから
又はＴ１５０組織培養フラスコに生長したサブコンフル
エント細胞から単離した。４個の１１５０からの細胞を
ＰＢＳにより洗い、トリプシン処理し、ＰＢＳにより再
洗滌し、ペレットを８ゴの４Ｍグアニジニウムイソチオ
シアナー１液に再懸濁した。 ＤＮＡに、溶液を１８ゲージ針を通すことによシ、シェ
アをかけた。サンプルをベックマン５Ｆ４１　ｒｔ　ｌ
ｉＦ中の２．４威の５．７ＭＣｓＣ１の上に重ねそして
２０℃で２０時間・　　　３２．００　Ｏｒｐｍで遠心
分離した。ペレットを３００μｌの２．５Ｍ　ＣａＣ１
に再懸濁させ、室温で２容量のＥｔＯＨにより沈でんさ
せた。ペレットを３００μｌの１１．０に再懸濁させ、
次に３５μｌの３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５，２）及び
８００μｌのＥｔＯＨを加えセしてＲＮＡが一７０℃で
沈でんした。 、　　沈でんを繰返しセしてＲＮＡを僅かに乾燥し、１
００μｌのＨ，Ｏに再懸濁し、０ｆ）２６゜で定量しそ
して一７０℃で貯蔵した。 〔８，１，２，”Ｐ−ＴＴＰによるランダム・プライム
ド・ラベリング〕 ＡＲココ−ィング領域特異性フラグメントを低ゲル温度
アガロース（バイオラッド）から切り出し、そしてＦａ
ｔｘｂｍｒｇ（１９８３、Ａｓａｌ、Ｂｉｏｅｈａｔｎ
、、１３７　。 ２６６）によ）開発されたランダム・プライムド法を用
いて、３リーＴＴＰ（ＭＥＮ、３０００（’＜／倶モル
）をラベルした。未混入デオキシリボヌクレオシドを、
１．５ｍのセファデックス５０カラムのクロマトグラフ
ィにより除いた。比活性は大体０．５〜２．５　Ｘ　１
０’　ｅｐｍ／μ２であった。 ［８，１，３，ＲＮＡゲル及びノーザ／φプロット分析
］１０又は２０μ？の全ＲＮＡをノーザ／分析について
１．２％アガロース／ホルムアルデヒドゲルで電気泳動
させた。アガロース／ホルムアルデヒドゲルな、フロス
ティングしたプレートを有するＩＥＩ　　ＶＣＶゲル装
置で４０５ＭＮ−モルホリノプロパンするホン酸（ＭＯ
ＰＳ）１．Ｈ７，０ｆ１洛Ｍ　ＥＤＴＡ／１０５Ｍ酢酸
ナトリウム／２／２Ｍ脱イオン化ホルムアルデヒド（ｐ
Ｈ５，６）中で製造した。 ＲＮＡを６５℃で５０％ホルムアミドによシ同一のバッ
ファー中で変性し、そして３〜５時間２０〜３０ｍ＆で
１Ｍ０ＰＳ中で処理した。ゲルを３０分間ＩＱｘＳＳＣ
中に浸しそしてＨｙｂｏ％ｔ−Ｎ膜（アマ−ジャム）に
移し、ＵＶ橋かけ結合させ（１２００μジユール）、予
備ノ・イブリッド化しそして５ｘＳＳＰＥ（１ｘＳＳＰ
ＥはＱ、１８ＭＮａＣ１／　１０　ｔｐ＋Ｍ　　燐酸ナ
トリウム、ｐＨ７，７，０，１ｍＭＥＤＴＡ）、５Ｘデ
ンハート、０．５％５ｌ）Ｓ並に担体として２０μ？／
紅の変性サケ精子ＤＮＡ中でハイブリッド化した。ハイ
ブリッド化は、Ｓ”Ｐ−ＡＲＢＲｌの２Ｘ１０’ｃｐｍ
／ｒｒＬｔにより１６時間４２℃で行われた。プロット
を、数回室温テＯ，１％ＳＤＳを含む２ｘｓｓｃ次に６
５℃で１ｘＳＳＣ７０，１％ＳＤＳ中で洗い、そして−
７０℃で２枚のデュボ／・ライトニング・プラス補強ス
クリーンとともにコダックＸ−ＯＭＡＴで露出した。バ
ンドを、もし１晩の露出後明らかに見られるならば田、
もし３日の露出後見られるならば（＋／−）、もし６時
間後検出可能ならば（廿）と評価した。 （８，１，４，ａ　ＤＮＡクローニング〕ＭＣＦ−７細
胞を、２４．４０及び７２時間１００μｍ７Ｎの１２−
〇−テトラデカノイルーホルボール−１３−アセテート
（ＴＰＡ）による処理後ＲＮＡについてハーベストした
。ポＩ７　（、ＯＲＮＡをこれらのサンプルのプールし
た部分から単離し、そして主として記載（ＧｓｋＥａｒ
及びＨｏｆｆｍａｎ、１９８９　、Ｇａ５ｈ、２５　：
　２６３　）されたように二本鎖６ＤＮＡに関するテン
プレートとして用いた。Ｇ足部ａＤＮＡを、ＢＲ１オリ
ゴヌクレオチドアダプター（７？ｏｇ−ら倉１９８６　
、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｅａｄ、５ｃｉ−Ｕ、Ｓ。 、４．８３：１２６１−１２６５）を用いてλ？ｔ１０
の４４Ｒ１部位にリゲートした。 特に、５μ？のＴＰＡ処理ＭＣＦ−７ポリ（７ｆ）＋Ｒ
ＮＡを加熱変性しそして４５μｌの反応容量における１
００Ｕの逆転写酵素を用いて５ｐ？のオリゴ（ｄＴ）に
よりプライムした。第二の鎖合成を、４ＵＲＮアーゼＨ
及び１１５ＵＥ、コリＤＮＡ　ｐｏｌ　Ｉによシ行った
。１ａｐｔのＴ　４　ＤＮＡポリメラーゼを用いて３′
オーパーツ〜ングを除き、プラント末端を生じた。全６
．８μ２の二本鎖ａＤＮＡをセファデックスＧ５０カラ
ム上に分類して５００６ｐ以上のｏ　ＤＮＡを選択し、
次に１５０％１０ａ　Ｉ）ＮＡを末端デオキシヌクレオ
チジルトランスフエラーゼによＦ）ｄＧデテールた。 ｄＧ尾部ｅＩ）ＮＡをＢＲ１アダプター（，４ＡＴＴＣ
ＣＣＣＣＣｃｃｃｃｃｃ）を用いてλｔｔ１０のＬすＲ
１とリゲートした。 リゲートしたＤＮＡを生体外でパッケージしくＧｒｏｗ
τａｉｄら、１９８１．Ｇａ５５，１３：２２７〜２３
７）、そして１０６組換え体／　ｐｆ　ｅｌ）ＮＡの能
率でＥ、コリＣ６００ｒＫ−ｒＪｃ　Ａ　ｆ　ｌ　Ｋ　
フレートシた。二重のニトロセルロースのリフトを２．
５Ｘ１０’組換え体にとられ、そしてフィルターを、Ｎ
−グリカナーゼ処理・還元且Ｓ−ピリジルエチル化ＡＲ
の自動化エドマン劣化により測定されるようＫ。 ＡＲの一次配列から由来する〔ａｌｐ）標識のベスト・
ゲス及び同義性のオリゴヌクレオチドプローブ（下記の
第１表）によりスクリーンされた（上記の〔６〕項）。 １１Ｊ［分析ハ、旦す！、Ｅｓｏ　ＲＶ、　Ｈｇａ　ｌ
　、Ｈａｍ　ｌ　。 ／’ｖｓ　ｌ、Ｓテ■及び王ａｔ　ｌについて単一の部
位、色セ■について２個の部位のｐＡＲｌのａＤＮ　Ａ
インサートにおける少数の部位を示した。インサート内
の消化は、ｈＥ■、Ｃ１ａ１．Ｅ山Ｒｌ、　Ｈｉｖｗｌ
　［［，５斐！・Ｌす■・？ｗｓＩ、Σ１■、Σｔｓ　
■及びＸ６ａｌＫついて生じなかったｏ１７０ｂｐＢａ
ｔｐｈ！〜Ｌ背■フラグメ／トを単離且用いて、主とし
て前述したように作られた１　００，０００組換え体の
第二〇ｅＤＮＡ　ライブラリーをプローブした。１３個
の正のクローンが同定され、３００　ｈｐ〜１．３ｋｂ
に及ぶインサートを有し、６１１！ｉ１は１ｈｂより大
ぎ（，５個はｐＡＲｌの５′末端からの１００　ｈｐ以
内にあることが知られている単一のＳｍｇ　１　部位を
含んだ。後者の５個のインサートの４個は、次の制限及
び配列分析のためにサブクローンした（ｐＡＲ３、ｐＡ
Ｒ５、ｐＡＲ９、ｐＡＲｌ３）。すべてのこれらのクロ
ーンは、ｐａ９（１００＆ｐの３′トラ７ケーシヨンを
有しそして恐らくオリゴ（ｆ北プライムするのく十分な
Ａ、）ラックから始まることが後で分った）を除いて１
．ｈ二■、互りＲｖ、Ｐ本ｎ、ΣすＩ及びＳｔ墾Ｉに基
づく同じ制限マツプを有した。 ＣＢ、２．ＡＲｅＤＮＡクローンのヌクレオチド配列分
析〕正確なオリゴヌクレオチドプライマーを用いて、ジ
デオキシ鎖停止法（Ｓａｎｇｅｒらｐ　ｌ　９７７１Ｐ
ｒｏａ、Ｎａｔｌ　。 Ａｃａｄ、Ｓｅｔ、Ｕ、Ｓ、Ａ、７４　：　５４６３〜
５４６７　）を用いて１，２３０　ｈｐ　ｐＡＲｌ　　
クローンの両方の鎖を配列化した。 クローｙ５＋、ｔＲ１の完全なヌクレオチド及び演鐸し
たアミノ酸配列を第１６図に示す。９６５ｂｐのオープ
ン読みとシフレームは、ヌクレオチド数１で始まる。第
一のＡＵＧは位置２１０に在るが、位置−３のプリンの
不存在のため、翻訳開始部位に関するＫｏｇｅＬｋ最適
コ／センサス（Ｋｏｚａｋ。 １９８４　ｅＮｘｃＬａｉｅ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｍａａａ
ｒｅ五　１２：８５７〜８７２；Ｋｏπａｋ、１９８６
．ＣｍＬＬ　　４４：２８３〜２９２）と一致しない。 しかし、このようなＡＵＧ）リブレットは、Ｋ、ｔ６１
が約３−の調べたメツセージで認めたように、イニシエ
ーターコドンとして働き、そして可能な重要性としてす
べてのこれらの「より好ましくないＪＡＵＧ及びＡＲの
ｍ　Ｒ＃Ａ　中で位置−１でアデノシンの存在である。 第二のメチオニ／はイニシエーター・コ／セ／サス配列
と一致するヌクレオチド３７８に位置するが、第一のＡ
ＵＧは真の翻訳開始部位であると信じられる。それはそ
れが信号ペプチド配列の代表的な、３個のプロリンをは
さむ主として疎水性の残基の予期された１９アミノ酸群
をともな５　（Ｈａｉｊｎｍ、１９８３　ｅ）、Ｅｉｏ
ａｈａｍ、１３３：１７〜２１）。 メテオ＝７ＶＣよシ開始する最長のオープン読みとＱ７
レームは、１９残基信号ペプチドを含む２５２アミノ酸
ポリペフチドをエンコードする。コーティング配列は、
５′−未翻訳配列の２０９ヌクレオチドに先立たれそし
て翻訳停止信号ＴＡＡ及び３′−未翻訳配列の２６２ヌ
クレオチドをともなう。潜在的なボ！Ｊ　ＣＡ）付加信
号配列ＡＡＴＡＡは、ポＩＪ　（，４）足部と思われる
一列の１５アデニレート残基から６４ヌクレオチド・ア
ップストリームに位置する。、［３’未翻訳領域は、配
列ＡＴＴＴＴＡ（又成るリンホカイン、１サイトカイン
及びプロトオンコージ／に存在する）の４個のコピーを
含む。ＧＭ−Ｃ５Ｆにおいて、この配列はＲＮＡ脱安定
化及び劣化を仲介する（Ｓｈａψ、１９８６，０ｇＨ４
６：　６５９〜６６７）。機能的に類似の分子中のこの
モチーフの保存は、ＡＲも又この群のリンホヵイ／に関
係を有することを示唆する。 ａＤＮＡ配列は、アミノ酸位置１１３（第１５図）（こ
れは蛋白分析によジアスパラギン酸ＣＤ）として配列さ
れモしてａＤＮＡクローンからアスパラギ：ｙ（ＡＡＴ
−Ｎ）として演鐸された）を除いて、成熟ＡＲペプチド
配列（上述の〔６Ｄ項）と一致する。調べた５個のａＤ
ＮＡの中、すべてはｐＡＲｌ　配列の初めの２５ｂｐ内
に５′末端を有した。 ａ　Ｄ　Ａ’　Ａ配列とベスト・ゲス・プローブとの比
較は、７４チ（ＡＲＫ４１　）及び７７チ（ＡＲＫ３１
　）の全体の同一性を示した。プローブは何れも８個の
連続したｈｐマツチ以上を有したが、全体で、ＡＲＫ４
１について整列したら７ヌクレオチドの５０が、非常に
低い厳密さの条件下で検出可能な信号を生じた。ＡＲｍ
ＲＮＡ配列によるコドンの使用は、Ｌａｔｈｓ（Ｌａｔ
ｈｅ、　１９８５　、）、Ｍｙ！　、ＥｉｏＬ。 １８３：１〜１２）により報告された使用頻度とはかな
り異り、同義性のオリゴヌクレオチドがこの場合により
強い信号を生じた理由を説明している。ｃ　Ｄ　Ａ’　
Ａ及び蛋白の配列から、分子量９７７２及び９１７３の
２種の蛋白は、ｅＤＮＡ　（第１６図）及び蛋白（前記
の（６，７，９，：１項）の配列に基づ＜２８の形の成
熟ＡＲを予言している。ＡＲプレカーサーのハイ　ドロ
パシー・プロフィルは、第１１Ｄ図に示される。 ＡＲプレカーサーは、３個の潜在的なＮ−グリコジル化
部位を有し、一つはＮ末端ドメイン（第１６図の位置３
０）Ｋあシそして二つは成熟ＡＲの親水性領域（位置１
１３及び１１９）に在る。グリコジル化は、成熟ＡＲの
分子量に１０〜１２　ｋｄをもたらし、そして親水性ド
メインでこれらの部位の一つ又は両方で炭水化物付加か
ら生ずるようである。 ＡＲプレカーサー（第１５図）のＮ末端のセリ／の多い
ドメインは、酸性残基、ター／誘導アミノ酸の存在さら
に立体障害を生ずる残基の不存在に基いてＹ８１、Ｙ８
３、Ｙ８？で３個の潜在的なチロシンするホ化部位を含
む（Ｈｓｔｔｍｒ。 １ｇＢ７．ＴＩＢ、５，１２：３０１〜３０３）。多（
のチロシン−するホ化蛋白は、分泌蛋白である。チロシ
ン・するホ化修飾は、プレカーサー蛋白の活性化、移動
又は蛋白分解処理に含まれるものと信じられる。ＡＲの
セリンの多いドメイ／は、又このよ５な結合の部位であ
る分子のこの領域に、多（のセリン／スレオニン残基（
８１の２３）を与えるＯ結合炭水化物鎖を含む。この点
で、ＥＧＦファミリーの他のメンバー００−グリコジル
化型、ＴＧＦ−αは、同定されてきた（Ｉβｏｔｚら、
１９８６．Ｐ＃、４，５゜８３．６３０７〜６３１１）
。 ＡＲプレカーサー中のセリン残基のどれも、６ＡＭＰ依
存キナーゼホスホリル化部位のコンセンサス配列に適合
せず（Ｇｒｉｍａらｐ　１９８５　、　Ｐｒｏｅ、Ｎａ
ｔｌ　、ＡａａｔＬ、Ｓａｉ。 Ｕ、Ｓ、Ａ、８２　：　６　：ｌ　７〜６２１）、又は
チロシン残基のいずれも周知のホスホロチロシン残基に
対するフランキング配列の類似性を示さない。 成熟ＡＲ蛋白の親水性ドメインは、２本の連続する列の
４〜５の塩基性の荷電した残基を含む多数の正に荷電し
たアミノ酸（３７残基の１６がリジン又はアルギニンで
ある）よりなあ。ＳＶ４０の大きなＴ抗原の核ターゲテ
イング信号は、ＡＲのこの領域と類似してお夛、そして
小さなアミノｒＲ（グリシン、アラニン、プロリン）に
先立たれる特徴的なＫＫＲＫＫ配列を含み、それはα−
らせん構造の形成を行わせる（Ｂｓｒｇｌｉｓら、１９
８７．ＥＭＢｏ、６：２６１　’７〜２６２５　；　Ｄ
ｉｓｇｖａｌ　ｌら、　工９８７．ＥＭＢ０゜６：６９
〜７４）。突然変異分析は、ＳＶ４０核局在配列の主な
特徴として４個の連続する塩基性残基を規定した（Ｌａ
ｎｆｔｓｒｄ、１９８４　、Ｃａ１ｌ、３７．８０１〜
８１３）。 核ターゲツティングに含まれると信じられる同様な列の
塩基性アミノ酸を有する他の核蛋白は、ニュクレオプラ
スミン、ポリオームウィルス・ラージＴ１ヒスト／及び
ｃ−一μを含む。ニワトリピルベートキナーゼ、アルブ
ミン、イムノグロブリン、フェリチン及びβ−ガラクト
シダーゼに関する遺伝子への種々の核信号配列の融合は
、これらのさもなければ細胞質蛋白の核への局在化をも
たらす（Ｍｏｒｍｌａｎｄ、　　１９８７．Ｍｏ１．Ｃ
ａ１１．Ｂｔｏｌ、７：４０４Ｂ〜４０５７）。ＡＲの
親水性配列がこの生長調節剤の核へのターゲテイングに
関係があるかと５かは、証明されていないが、しかし、
ＤＮＡに特異的に結合するＡＲの能力は、ＡＲが核内に
機能的な役割を有することを意味する。この点で、ＡＲ
はＤＮＡ合成、細胞サイクル又は種々の他の核の事象を
調節しているのだろう。 ＴＧＦ−αプレカーサーは、Ｃ−末端細胞質ドメインに
多（のシスティンを含み、そのあるものは共有結合パル
ミテート付加を行う（Ｂｒｉｓｇｎ＋ａｓ、　１９８７
　、　Ｃａ１ｌ。 ４８．４２９〜４４０〕。対照的に、ＡＲプレカーサー
はその細胞質ドメインにシスティンを欠きそれ故パルミ
テート残基を含むことを予想できない。パルミテート付
加の生物学的機能は未知であるが、これはＡＲとＥＧＦ
スーパーファミリーの他のメンバーとの間の他の差を示
す。 （８，３，７ムフイレグリン合成の細胞源〕αｓｔｐ標
識ＡＲａｌ）ＨＡフラグメントを用いるノーザン嗜プロ
ット分析（Ｔんｏｍａｇ、１９８０．ＰＮＡＳ、７７＋
５２０１）は、徨々の正常のヒトの組織及び腫瘍細胞株
からの単一の１．４　ｋｂ　ＲＮＡへのハイブリッド化
を示した。−本のバンドが、ＡＲＥＢｌ（成熟ＡＲの全
コーティング領域並にＮ−末端プレカーサー及びトラン
スメンブレン・ドメインを含むｐＡＲｌ　の４８０　ｂ
ｐＢａｔＥ［−Ｐｕｓ　■７ラグメント）又はＡＲ１７
０（成熟ＡＲのＣ末端の半分のみを含むｐＡＲｌ　の１
７０ｂｐＢａ惰１−ｐ９襲「フラグメント）の何れかを
標識プローブとして用いて、ノーザン・プロットに見ら
れた。下記の第１１１に示される結果は、ＡＲＲＮＡの
低レベルの発現（１）が正常の成人の肺及び膵臓の組織
に認められたことを示す。低いが検出可能な発現（＋／
−）が正常の腎、肝及び脳組織に認められた。 肺　　　　　　　　　　　　　　十 肝　　　　　　　　　　　　十／− 膵　　　　　　　　　　　　　十 腎　　　　　　　　　　　　　十／− 牌　　　　　　　　　　　　　− 脳　　　　　　　　　　　　十／− 胎盤　　　　　　　　　　　− 冑、胎児　　　　　　　　　− ＡＲが元来ＴＰＡ処理ｔＷ　（：’　Ｆ　−７処理ＭＣ
Ｆ−７細胞から単離されたので、これらの細胞中のＡＲ
ＲＮＡｆ）ＴＰＡ誘導のための時間の経過を測るのは興
味がある。ＭＣＦ−７細胞はＴＰＡによりＯ，ｌ、３．
６．１８．２４及び４８時間処理され、全ＲＮＡを単離
しそして１０μｍを１．２％ホルムアルデヒドアガロー
スゲルの各レーンで移動させ、ナイロン膜に移しそして
成熟ＡＲの全コーティング領域に相補的なＡＲＢＰｌプ
ローブによりスクリー７シた。 １４ｋｂＡＲＲＮＡ　Ｋｉ３ける認めうる増加がＴＰＡ
による処理後１時間で見られ、最大のレベルは１８〜２
４時間の間に達した。”Ｐ−ＡＲＢＰｌによシブロープ
された次のラージ／・プロットは、他の乳癌細胞株に２
けるＡＲＲＮＡ合成のＴＰＡ刺激を示したが、最大のレ
ベルはＴＰＡ誘導ＭＣＦ−７ａ胞に３けるのとは決して
高（なかった。 −遍の腫瘍細胞株をＡＲＲＩＶＡレベルについてＴＰＡ
による誘導の２４時間前及び後についてテストした。結
果を下記の第Ｘ表に要約する。少しばかりの例外がある
が、検出可能なＡＲＲＮＡの唯一の源は、ＴＰＡによシ
処理されたヒト乳癌株であった。一つのこのような例外
はＣａＪｔ−１１ヒトの明細胞胃癌株であり、それはＴ
ＰＡ誘導ＭＣＦ−７細胞に見られる量と匹敵しうる高い
レベルのＡＲＲＮＡを本質的に発現する。調査したＴＰ
Ａ処理乳癌細胞株のすべ又は、ＡＲ％異性異性ハイソリ
ッド化した。 ＡＲは明らかに成人の肺、膵臓、腎、肝及び脳で成る機
能的な役割を果して２９、恐ら＜′ＡＩＵ湯治ゆ、組腋
貴生及びニューロン細胞の維持を含む広いプロセスに関
連があるだろう。 第　　Ｘ　　　表 ＭＣＦ−７（ＨＴＢ２２）　　　　　胸部腺癌　　　　
　十　　−Ｈ−１十ＨＢＬ−１００（ＨＴＢ１２４＞　
　　胸部、正常　　　　−十Ｂｒ−＋ｒ４（ｇｒＢｚｏ
　）　　　　胸部胃癌　　　　　−十ＭＤＡ−ＭＢ−１
５７（ＨＴＢ２４　）　　胸部髄癌　　　　　＋　　什
５Ｋ−ＢＲ−３（ＨＴＢ３０）　　　　胸部腺癌　　　
　　−＋ＢＴ−４７６乳癌　　　　　　　−十 ＪＥＧ−３（ＢＴＢ３６）　　　　　Ｍ、毛癌　　　　
　　−十／−５Ｋ−ＨＥＰ−１（ｔｌＴＢ５２　）　　
　肝腺癌　　　　　　−−Ｇ−４０１（ＣＲＬ　１４４
１）　　　ｉｌ’を篇腫瘍　　　　−−ＨＥＰＭ（ＣＲ
Ｌ　１４８６）　　　　胎児口蓋の開業　　−十／−Ａ
−４３１（ＣＲＬ１５５５）　　　扁平上皮癌　　　　
−−ＢＢＬ−２９９（ＣＣＬ　１３７）　　胎児肺　　
　　　　−−ＢＵＰ　　　　　　　　　　　包皮線維芽
細胞　　−十／−〔９，実施例：アムフイレグリンの遺
伝子のゲノムクロー二／グ及び分析〕 下記の実施例は、ヒトアムフイレグリン遺伝子のゲノム
クローニング、その構造及びイントロン／エキソ／機構
を記述する。生長因子のＥＧＦスーパーファミリーに関
する機能的及び進化的意味も又検討される。 （９，１，材料及び方法〕 （９，１，１，サーザン自プロット・）１イブリツド化
〕全ゲノムＤＮＡを、１１５０組織培養フラスコ中のサ
ブコンフルエント細胞から単離した（　Ｈａ％（ａｔ（
ｇ、１９８２゜Ｉｓ　　ＭｏＬｍａｓｌａｒ　　Ｃｌｏ
ｎｉｓｇ；Ａ　　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｓｓａｌ
）。 ２０μ２のＤＮＡを特定の制限酵素により消化し、０，
８チアガロースゲル上で電気泳動し、２０ＸＳＳＣボト
ムバツフアーによりＨｙｂｏ％ｄ−Ａ’（アマ−ジャム
）にプロットしく　５ｏｓｔｈｅｒ＊、１９７５　、　
Ｊ、ＭｏＬ、ＢｔｏＬ、、９８　、５０３〜５１７　）
　ソＩ、ＣＤＮＡヲ１２００　ｐ　シ：＝−−ル短波Ｕ
Ｖニ露出することによ）結合した。フィルターを、１尼
当シ２Ｘ　１０’　ａｙｓのｓｔｐ標識ＡＲ＠異性７ラ
グメ／トを含むハイブリッド化バッファー（６ｘＳＳＣ
，５ｘデンハートの溶液、０．５％ＳＤＳ及び２０μｆ
／ｄのシェアされた変性サケ精子ＤＮＡ）中で１晩６５
℃でハイブリッド化した。 プローブを５〜２５　Ｘ　Ｉ　Ｑ’　ｅｐｍ／μＶの比
活性にランダム・プライム標識した。フィルターを６５
℃で１ｘＳＳＣで十分に洗いそして一７０℃で１晩オー
トラジオグラフイした。 １：９．１．２．　　ゲノムライブラリーの構築〕バク
テリオファージラムダＬ４７．１をクローニングベクタ
ーとして選びそしてホスファターゼ処理アームをＢα惰
Ｅ１．ＥｅｏＲｌ及びＨ４５ｄ［ｌＩによる消化後製造
シタ。ＭＣＦ−７細胞からの高分子量ＤＮＡなＨ４ｎ４
ｍにより消化し、０．８％低ゲル温度アガロース（バイ
オラッド）上で電気泳動しそしてサイズ分別をした。ア
ガロース画分（所望の制限フラグメントを最高に含む）
を６５℃で融解し、ＤＮＡをフェノール及びＮｔｓＯＡ
　ｅにより抽出し、次にエタノール沈でんし、２５〜１
００μｍ７ばで再懸濁した。ライブラリー構築物は、Ｔ
４　１）ＨＡリガーゼ（Ｂｉｏｌａｂａ）を用いて、５
μｌの反応容量中に１００％ｆのラムダＬ４７．１アー
ム並に４０１％ｙの抽出されたサイズ分別のＤＮＡより
なった（１４℃の１晩のリゲーショ／）。　組換えファ
ージな、Ｂ、コ＋）株ＢＨＥ２６８８Ｎ２０５ｒａａＡ
　　（ラムダｉｍｍ”０１ｔａ　　ｂ２　　ｒａｄ３　
　Ｅａｍ４　　Ｓａｇ７　）並にＢＨＢ２６９０　　Ｊ
’／２０５　　ｒａａＡ−（ラムダｔｔｎｔｎ”　ｄ　
ｔ　ｚ　　ｂ　２ｒｅｄ　３　　Ｄａｗｎ　１５　　Ｓ
ａｇ　７　）により製造された抽出物（Ｇｒｏａ＊ａｌ
ｄ、１９８１　＃　Ｇａ１％ｇ、１３ｒ２２７〜２３７
）とともに生体外でパッケージした。ライブラリーをＥ
、コリＬＥ３９２でクイターした。ゲノムクローンをそ
の場のプラークハイブリッド化（Ｂｍｓｔｏ％、１９７
７．５ｅｉａｎａ−リ１９６．１８０〜１８２）により
ＡＲ特異性ＤＮＡプローブによりスクリーンし、そして
ＤＮＡをプラーク精製ポジティブクローンから単離した
（Ｂす％に、Ｉ％ＤＮＡＣｒｏ％（ｎｇ　　ｔｅｃｈ％
１ｑｕｅｓ：　ａ　ｐｒａａｔｉｅａｌ　　ａｐｐｒｏ
ａｃル。 Ｄ、Ｇｌｏｖｇｒ　編（０ｘｆｏｒｄ　　：　ＩＲＬ　
　Ｐｒｅｓｓ　）ｐｐ、４９〜７８）。Ｂｉ％ｄｆｍイ
／サートを切シ取シそして制限分析及び拡大のため、Ｅ
ＭＢＬ　１Ｂにサブクローンした。 （９，１，３，プライマー畠エキステンショ／・アッセ
イ〕ＲＮＡを上記の〔８〕項に記載されたようにＭＣＦ
−７細胞から単離した。ＡＲｃＤＮＡ配列に８けるヌク
レオチド４０〜６０（ＡＲＡＰ）及び７６〜９７（ＡＲ
ＣＰ）に相補的な合成オリゴヌクレオチドを、２〜５　
Ｘ　１０’　ｅｐｍ／μ？の比活性に１４ポリヌクレオ
チドキナーゼによｙｔｐ末端標識した。１００万ａｐｍ
の標識オリゴヌクレオチドを用いて、主として（８，１
，４：１項のように５０μＶのＭＣＦ−７ＲＮＡＫプラ
イム−本領ａＤＮＡ合成を行った。生成物をＲＮアーゼ
Ａによシ処理し、フェノール及びクロロホルムによシ抽
出し、エタノール沈でんし、１００℃で５分間８０％ホ
ルムアミド中で熱変性しそして標準８％ポリアクリルア
ミド・７Ｍ尿尿素列ゲル上の電気泳動により分析した。 〔９，１，４，ＣＡＴアッセイ〕 ＭＣＦ−７細胞を上記の（６，２，１，：］項に記載し
たように生長させた。各アッセイについ℃、１〜２×１
０４細胞をｌＯａの培地で１００１１皿に植え、そして
２４時間後２０μｍの燐酸カルシウム沈でんスーパーコ
イルプラスミドＤＮＡを細胞に加えた（Ｓｏｓｔｈｇｒ
＊及びＢｅｒｇ、１９Ｂ２）。 細胞をトランス７工クシヨ／４時間後に新しい培地に浸
しそして９０秒間２５％グリセロールショックにかけた
。細胞ヲ再ヒ浸シソＩ、　テＯ−１０Ｏｎ？／ｍｌのＴ
ＰＡを含む２０ａの新しい培地を重ねた。細胞を洗いそ
してグリセロールショック４０時間後ハーベストしそし
て１００μｌの０．２５Ｍトリス−ＭＣＩ　（ｐＨ７，
８）中の超音波処理により分解した。ＣＡＴ活性を主と
しく　Ｇｏ　ｒｍａｎら（１９８２）により記述された
よ５にアッセイした。細胞抽出物（３〜５０μｌ）を、
１５０μｌの反応容量の０．５Ｍ）リスＣｐＨ７，８）
、０．５愼ＭアセチルＣｏＡ中の２．５ｍＣｌ’Ｃ−ク
ロラムフェニコール（ＭＥＮ）Ｋ加えた。反応物を２時
間３７℃でインキエペートし１１の酢酸エチルにより抽
出しそしてＣＨＣｌ、：１−ブタノール（９５：５）に
よりシリカゲルＴＬＣプレートに展開した。ＴＬＣプレ
ートを乾燥しそしてオートラジオグラフィにかけた。ア
セチル化及び未アセチル化１’Ｃ−クロラムフエニコー
ルをＯｐ　ｔ　（ｆ　１ｘｏｒ　　中の切シ取ったスポ
ットをカウントすることによシ定量した。ＣＡＴ酵素活
性の単位を、細胞抽出物中の蛋白１μｍ当り毎時アセチ
ル化クロラムフェニコールのμ２として計算された。 ［９，１，５，その場の染色体ハイブリッド化］プラス
ミドｐＡＲ９を３８−ＴＴＰによりランダム・プライム
標識され、そして５００〜８００バンド段階でフィトヘ
マグルチニン刺激末梢血液り７２球から得られた正常の
ヒト分裂中期細胞へのハイブリッド化のために用いた。 このプローブは、３′未翻訳領域の多（を欠きしかもｐ
ＥＭＥＬ１８のＥａｏＲ■部位へのそう人したＡＲｃＤ
ＮＡに相当する。 ハイブリッド化は、ハイブリッド化混合物１ａ当ジ２．
４．２０及び４０　ｎｔのプローブにより、先に記載（
ＬｍＢｇａｓ、１９８５．Ｐ＃Ａ５，８２．６６９２〜
６６９６）した通りであった。オートラジオグラフは、
コダックＮＴＥ−２核トラックエマルション並に７〜６
０日間露出したスライドな用いて製造した。染色体バン
ディングは、キニクリン・マスタードによ）染色するこ
とにより視覚化した。 〔９，２，ＡＲ遺伝子の染色体の位置〕ヒトＡＲ遺伝子
の染色体の割り当ては、正常の分裂中期の染色体に対す
る３Ｂ標＠ＡＲａＤＮＡのその場のハイブリッド化によ
ｐ求められた。銀粒子は、５０分裂中期の広がりについ
てスコアし、３０％がバンド４ｑ１３−４ｑ２１でラン
ダムでなく分布していた。結果は、ヒト染色体４のみを
含むハムスター／ヒト体細胞ハイブリッドＤＮＡに対す
るポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）により確認された。 ＡＲエキソン３由来のオリゴヌクレオチドプライマー及
び側面のイントロンはと）ＤＭＡ並に染色体４を含むハ
イブリッドＤＮＡのみに２２０ｂｐＰＣＲフラグメント
を生じ、一方、ハムスターＤＮＡは負であった。 染色体領域４ｑ１３−４ｑ２１も又σデｏ又は黒色腫生
長刺激活性の遺伝子を含む（Ａ％４ａｏｗｔａｇ、Ａ、
、ａｔ　ａＬ、。 １９８７　、　Ｐｒｏａ、ＮａｔＬ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ
、Ｕ、Ｓ、Ａ、、８４　。 ７１８８　７１９２　；　Ｒ４ａｈｍｏｓｄ、Ａ、、ｍ
ｔ　ａｊ、、１９８８゜ＥＭＢＯＪ、７．２０２５−２
０３３）、ｅ−ｂｉｔレセプター（Ｙａｒｄｍｓ　　ａ
ｔ　　ａｌ、、１９８７．ＥＭＢＯ／、Ｌ３３４１−３
３５１）、血小板因子４　（ＰＦ４　）　（Ｇｒｉｆｆ
ｉ＊　ａｔａＬ、、１９８７．（４ｔｏｇａｎａｔｉｃ
　Ｃｅ１ｌ　Ｇａｎｅｔ、、４５゜４３−７３）、イン
ターフェロン−ガンマ誘導因子ＩＰ−１０（Ｌ％５ｔｅ
ｒ、Ａ、Ｄ、、ａｔ　ａｌ、、１９８７．Ｐｒｏｅ、Ｎ
ａｔｌ。 Ａｃａｄ、Ｓｅｔ、Ｕ、Ｓ、Ａ、、８４，１８６８　１
８７１）、ビタミンＤ結合蛋白（グループ特異性成分）
　（Ｃｏｏｋａ、Ｎ、Ｅ。 ａｔ　ａｔ、、１９８６　、Ｈｓｍａｎ　Ｇａｓｍｔｉ
ｃｍ　７３，２２５−２２９　：ＭａＣｏｎ＊ｂａ　Ｊ
、Ｌ、ａｔ　ａｌ、、１９８６）ＣｙｔｏｇａｎａｔＣ
ａｌｌ　Ｇ−１ｓｔ、４２．６２−６４）、並にスタセ
リン、カルシウム調節唾液蛋白（Ｓａｂａｔｔｎｉ　Ｌ
、Ｍ、ａｔ　　ａＬ、ｅｌ　９８７　、　Ａｍ、Ｊ、Ｈ
ｓｔｎ、Ｇｇｎａｔ、、　４１　、１０４８　１０６０
）。 ＥＧＦの遺伝子は、４９２５に遠位に存在する。 σデ・、ＩＰ−ＩＱ及びＰＦ４は一群の構造的に関係の
あるペプチド（それは染色体４上に群っている生長因子
のファミリーを構成している）に属する。６−　ｋｉｔ
は、ＥＧＦレセプター、Ｎ＃ｓオンコージン、ＰＤＧＦ
レセプター及ヒインスリンリセブターを含むチロジノ特
異性キナーゼ活性を含む三、四の生長因子レセプターに
構造上及び機能的に関連している細胞表面レセプターを
エンコードする。一般に、リガンド及びそれらのレセプ
ターの遺伝子は明確な染色体にマツプするが、あるもの
は共通の染色体の位置にマツプする（Ｇ−ｒげ／ｓｓ、
１９８３　、Ｎｕｃｌ、Ａａｉｄａ　Ｒａｇ。 １１　：　６３３１〜６３３９；Ｐａｔｔａｎａｔｉ、
１９８７　。 Ｐｒｏａ　、Ｎａｔ　１　、Ａａａｄ、ＳａＣ，Ｕ、５
．Ａ、８４　　：　　２７９０〜２９７４）。ｃ　−ｋ
ｉｔのリガンドは同定されずそし”’ＣＡＲはこのよう
な活性についてテストすべきである。 特異的なトランスロケーションが多（の悪性腫瘍に見ら
れる。先天性急性リンパ芽球白血病（ＡＬＬ）に２ける
最も頻繁に記録される細胞遺伝学的染色体異常ｔ（４；
１１）（ｑ２１；ｑ２３）は、ＡＲがマツプされた領域
を含む（Ｈａｔｍ、Ｓ−ら＊　１９８７　、　Ｌａｕｋ
ａｔｎｉａ、　１　、１６〜２３）。 ＡＬＬは、現在フランス・アメリカ・英国Ｃｏｏｐｅｒ
ａｔｉｖｅＧデｏｖｐ（ＦＡＢ）により規定されたよう
に、形態学上、Ｂ及びＴ細胞マーカー及び染色体の分析
に分類される。これらの分類は、ＡＬＬの診断、予後及
び治療の基礎として働（。ＡＬＬのすべてのケースの三
分の−は、特異的なトランスロケーションを含み、そし
てｔ（４；ｘｘ）は、１年以下の中位生存の１６箇月以
下の幼児に最も多い予後の悪いグループに相当する（ｆ
ｏＣｏｗａら＊　１９８５　、ＣｅＬ％ｃｅｒＧａ％ａ
ｔ＜ｃｍ　ａｎｄＣｙｔｏｇｅｎｅｔｉｃｍ、１６　＊
　２１〜３２）。 領域４ｑ２１を含むトランスロケーションは、又Ｔ−リ
ンパ腫（Ｌａｇｉｎｇ、Ｅ、Ｇ、ら＊　１９８６　、　
Ｃａｎｃｅｒ　Ｒａｇ。 ４６．６４８１〜６４８Ｂ）並に急性骨髄芽球性白血病
（ＡＭＬ）のケース（ＳｍｌｙｐｍａｒＡ−ら、１９８
７゜８１１５０１％−ｃ、７６．１０６〜１０８）に報
告されている。この領域も又歯の発育不全症候群及び［
ピエバルト・トレイト（ｐｉａｂａＬｄ　　ｔｒａｉｔ
　）Ｊ即ち欠乏メラニン芽細胞の移動及び分化によるま
ばらな皮膚の染色をもたらす先天性の障害の遺伝子を含
む（Ｈｏｏ、Ｊ−１−ら、１９８６゜ＨｓｍａｎＧａ％
ａｔ、、７３，２３０〜２３１）。 ＡＲと染色体４ｑ１３−４ｑ２１に存在する遺伝子的障
害との間の結合の研究は、この共存の重要性を示す。最
近の細胞遺伝学上の分析は、領域４ｑ２１がリンパ芽球
の分化に関している遺伝子を含むことを示唆している。 結局、これらの結合はさらＫこの生長調節分子の生物学
上の活性又は適用を示唆している。 ［９，３，ゲノムクローニング］ 互すリ■、ＥｃｏＲＩ又はＢａｒｎ　ＨＩによフ消化さ
れたＭＣＦ−７ＤＮＡのサーザン・プロット分析（上記
の〔９゜１．１項）！−！、、ＡＲ遺伝子の５′部分を
含む８３０　ｂ、プローブ（Ｓｔｐ標識り上「／、愚！
■消化ｐＡＲｘ）によりハイブリット化したとぎ、それ
ぞれ１２ｋｂ、８ｋｂ及び２゜ｋｂの一本のバンドを示
し、ＡＲが一本のコピー遺伝子であることを示唆した。 トランスメンブレン及び細胞質ドメインコーディング領
域を含む成熟ＡＲの３′末端からの１７０６ｐプローブ
（ＡＲ１０，Ｂａｗ＜　１−１’■■）は、同じＨ４ｎ
ｄ　ＩＩＩ、ＥａｏＲｌ及びＥ、、Ｈｌフラグメント並
に又は追加の７．５ｋｈＨΩす■７ラグメントにハイブ
リッド化して、ＡＲココ−ィング領域の大部分が１２及
び６．５ｋｂの２個のＨｉｎｄｍフラグメントの間に分
裂することを示した。同じバンディングが、ヒト胎盤、
脳、黒色腫（ＳＫ−ＭＥＬｚｓ）、乳癌（ＨＴＢ３６）
、扁平上皮癌（Ａ４３１）及び肺癌ＤＮＡからの消化物
のサーザン分析により認められ、そしてＡＲ遺伝子が大
きな転位又は増殖を経験し【いないことを示唆する。 本発明者はＭＣＦ−７ＤＮＡから２個のＨｉ％ａｍフラ
グメントをクローンのため選び、それはそれらがすべて
ではないにしても多（のＡＲ遺伝子及びその側面の配列
を含む・ように思われるからである。Ｈ４＊ｄｆｆｌ消
化ＭＣＦ−７ＤＮＡは、サイズ分別されそして適切な画
分をλＬ４’１．１にリゲートした。多（のポジティブ
の中、２個のクローン即ちλＡＲＥ１２及びλＡＲＨ６
をさらに詳しい特徴付けに選んだ。１２及び６．４に＆
のインサートを、ＥＭＢＬｌＢにサブクローンし、そし
て三、四の制限部位をマツプした。 正確なオリゴヌクレオチドプライマーを用いさらに種々
の小さなサブクローンの直接配列化して、全エクソン及
びそれらのイントロン接点の配列を求め、ｃＤＮＡ配列
と不一致がないことが分った。 （９，４，ＡＲ５’調節領域の特徴付け〕ＡＲのゲノム
クローニングは、１２ｋｂｌｌｔ％ｔｍフラグメントに
含まれる５′側面配列の６．５＆＆の単離に導いた。 エクソン１の第一〇ＥｅｏＲ１部位５′からエクソンｌ
のＳｍａ　１部位の６８８６ｐフラグメント（，１）Ｈ
Ａの位置４０）は、サブクローンされそして両方の鎖に
配列された。 このデータは第１７図に示される。 ブライマー拡張はエクソン１からの２個の別々のオリゴ
ヌクレオチドによりＭＣＦ−７ＲＮＡに行われた。両方
のオリゴヌクレオチドにより確認される主な転写開始部
位は、１６ｐ５’から最長のａＤＮＡクローンに位置し
た。２個の小さな部位がｅ　１）、Ｉ’／Ａ配列の位置
＋１及び＋２に認められ、多（のａＤＮＡクローンがほ
とんど短縮していないことを確認した。ＡＲ遺伝子の調
節領域を機能的に確認するために、本発明者は６８８　
ｈｐ　Ｅｇｏ　Ｒｌ　−Ｓｍａ　ｌ　　ＡＲ５’側面領
域（配列６４８〜＋４０、＋１は主な転写開始部位を含
むキメラ遺伝子（ｐＸＡＲＥＩ　ＣＡＴ）を構築し、プ
ロモーターのないクロラムフェニコールアセチル転移酵
素（ＣＡＴ）遺伝子の発現を行った。この構築物は、Ｍ
　Ｃ’　Ｆ−７細胞に一時的に導入されるときＣＡＴ遺
伝子の転写を刺激することが可能で、活性はＴＰＡのゐ
加により６〜７倍刺激された。これは、本発明者がＡＲ
遺伝子の５′末端をクローンしたことを構造上及び機能
上の両方で確認する。 本発明者は、次に同じベクターにＡＲ配列−５３９〜＋
４０（Ｅｌｄ）、−３８７〜＋４ｏ（Ｅｔｂ）、−２７
７〜＋４０（Ｅｔａ）、−１４８〜＋４０　（Ｅｌｄ　
）、−７７〜＋４０（Ｅｔａ）、−７９〜＋４０（Ａ’
ｊｇ）又は→−１９〜＋４０ｂｐ（Ｅｔｈ）を含む一連
の５　’ＣＡ　Ｔ欠失突然変異体を構築した。 部分−７７を超えて欠失したとき基本的な活性は失われ
、即ちＥｔｈは測定可能な活性を示さず、そしてすべて
のこれらの構築物は、１００％ｆ／ＩＴＩのＴＰＡによ
る４０時間の処理に応じて３．５〜７倍の増大した発現
を示した。これらの構築物は又トランジェントアッセイ
に用いられて、ＡＲの発現の調節に対する任意のモルホ
ゲン、ミトゲン、生長因子、医薬又は粗醗酵抽出物の作
用を評価し、新しい治療剤を同定させる。 核ラン・オフ実験は、ＴＰＡに応じ″ｃＡＲの３〜５倍
に増大した転写を示し、増大したプロモーター活性が少
くとも部分的にＡＲのＴＰＡ銹導に関係があることを示
唆する。 アクテノマイシンＤの存在又は不存在下ＴＰＡＩＩＣよ
ｐ処理されたＭＣＦ−７細胞のノーザン分析は、４時間
よシ長い半減期の比較的安定なＲＮＡとしてＡＲを同定
する。ＴＰＡに応じるＡＲ発現の誘導は、それ故より安
定なｍＲＡ’Ａの増大した転写を含み、多面的である。 （９，５，ＡＲ遺伝子、ＡＲ蛋白ドメインのイントロン
／エクソン機構、進化的及び機能的意味〕 完全なヒトアムフイレグリンゲノム配列は第１７図に示
され、そしてエクソン及びＡＲ分子の蛋白ドメインの間
の関係は第１８図で概略的に示される。 ＡＲｍＲＮＡのプライマー拡張分析並にキメラＡＲ／Ｃ
ＡＴ”：プロモーター（ＣＡＴ−クロラムフェニコール
アセチル転移酵素、マーカー遺伝子）構築物を用いる研
究は、最長のａＤＮＡクローンの６４ｂｐ５’−末端内
に機能的プロモーターが存在する。その上、ｅＤＮＡ配
列の５′末端のコンセンサスＴＡＴＡボックス２９ｂｐ
アップストリームが存在する。遺伝子の３′末端の先に
、ｃＤＮＡ中のボＩＪ　ＣＡ）足部からの６４ヌクレオ
チド、コンセンサスボリアデニル化信号配列がある。Ａ
Ｒ遺伝子の一次転写物は、約１０．２＆６である。 ６エクソンは、ヒトＡＲプレカーサーをエンコードしセ
してゲノムＤＮＡの１０．２ｋｂに及ぶ。ＡＲエクソン
は長さ１１２〜２７０ｂｐであり、１．２５　ｋｋ及び
２．Ｌｋｂ。 間にイントロンをはさむ。ＡＲの５イントロンは、コー
ディング配列にわシ込み、多くの蛋白ドメインは単一の
エクソンの生成物である。エクソン１は、５′未翻訳及
び単一のペプチドドメインをエンコードし、エクソン２
はＮ末痛プレカーサーをエンコードし、エクソン５は細
胞質領域を含みそしてエクソン６は３′未翻訳領域を示
す。ともに、エクソン３及び４は成熟ＡＲ蛋白をエンコ
ードし、推定のトランスメンブレンドメインとともに親
水性及びＥＧＦ様配列の両方を含む。エクソン３及び４
の間の接点は、ＥＧＦ様領域の第二及び第三のループの
間に生ずる。 エクソン接点がＡＲｌＥＧＦ及びＴＧＦ−αのアミノ酸
配列の上に重なるとき、これらの蛋白のすべてが２個の
エクソンによりエンコードされそして間にはさまったイ
ントロンが同じ位置にあることは明らかである。その上
、それぞれの３′エクンンも又対抗するプレカーサー蛋
白のトランスメンブレンドメインをエンコードする。対
照的に１ＥＧＦ様領域は、エクソン構造が決定されたす
べての他の哺乳動物ＥＧＦ同族体中の単一のエクソンに
含まれ、それらはＥＧＦプレカーサー中の９ＥＧＦ様リ
ビー）（ＧデαＶ。 １９８３　、Ｎａｔｔｓｒａ、３０３．７２２〜７２５
）、ＬＤＬレセプター中の三つ（ヤマモト１１９８４．
Ｃ＃Ｈ，３９１２７〜３８）；そしてラットフィブロネ
クチン中のそれぞれの一つ（ＰａｔｍＬ、１９８７　、
　Ｅｔｎｂｏ、Ｊ、６　、２５６５〜２５７２）及びヒ
ト凝固因子Ｘ１ｌ（Ｃｏａｊ、１９８７　、　Ｊ。 Ｂｉｏｌ、Ｃｈｇｔｎ、２６２．１３６６２〜１３７２
）を含む。 無を推動物の同族体例えばＤｒｏａｏｐｈｉｌｉａ　Ｎ
ｏｔｃｈ遺伝子及びＣ”、ａｌ−ζα１　からのＬｉ％
−１２も又多数のＥＧＦ様リピリピート（ｄｄ、１９８
６　、Ｍｏ１ａｃ、Ｃａ１１．Ｂｔｏ、６゜３０９４〜
３１０Ｂ”、Ｇｒａｍｓｓｎａｌｄ、１９８５．Ｃａ１
ｌ。 ４３．５８３〜５９０）を含む。哺乳動物の遺伝子と異
り、Ｎｏｔｅル中のＥＧＦ様リピリピート（は、単一の
コーディング領域に含まれ、セして３６モチーフ中の四
つのみが介入する配列によシ分裂される。注目されるこ
とは、これらの四つの中の二つがＮｏｇ、ルリピートコ
ンセンサンスよシもＡＲと強いアラインメントな示し、
そして一つはＥＧＦ。 ＴＧＦ−α、ＡＲと同じＣＸＣ配列でイントロンによシ
介入される。ネマトード１１ｍ−１２遺伝子は、少（と
も１１ＥＧＦ様蛋白を含み、その９個が第一のエクソン
に含まれそして残シの２個が別々のエクソンにあシ、生
のＥＧＦ様単位はイントロンを側面に有する。 種々の生物からのＥＧＦ様リピリピートンコードするエ
クソンの構造における差は、それらが異る起源を有する
ことを示唆している。一つのグループはイントロンによ
り結合されたＥＧＦ様モチーフを含みセしてＡＲがメン
バーである他のグループは介入されたモチーフを有する
。二つのグループ間の配列の類似は、共通の祖先の遺伝
子からのそれらの分岐後の収束性の進化又はイントロン
そう入の結果であろう。 ・　ＥＧＦ、ＴＧＦ−ａ、ＡＲの同一のＣｘＣ配列及び
Ｎｏ１ａｋ　リピートのそれ内のイントロンの位置は、
共通の起源を示唆するが、詳細な審査は異るインドロン
・フェージングを明らかにする。イントロン・フェーシ
ングは、イントロンはコドンの第一（１）、第二（…）
又は第三（皿のヌクレオチド後読み取シフレームをわシ
込ませるかどうかく関する。 フェージングは、それが異る蛋白中のエクソンを含む機
能的ドメインの混乱を生じさせる限り、進化の重要性を
信じさせる。ＥＧＦ及びＴＧＦ−αはＥＧＦ様単位中に
７エーズＩイントロンを有し、一方ＡＲ及びＮｏｔｃｈ
はフェーズ！イントロンを有する。一つのヌクレオチド
の同様なシフトは、相補因子Ｂのプロテアーゼドメイン
及びエラスターゼ内の終りから２番目のイントロンに見
られる（ＣａｎｃｂａＬｌｅ１９８３、ＰＮＡＳ、８０
．４４６４；Ｓ替ｉ／ｌ、１９８４゜Ｊ、Ｂｉｏｌ　、
Ｃｈａｍ、２５９　、１４２７１　）ｏこれらのイント
ロンの非ランダム位置は、特異的なイントロンそう入配
列がこれらの遺伝子に存在することを示す。−万、この
部位でコーディング領域を分割する選択的な圧力が存在
したのであろう。ヒトＥＧＦ、ＴＧＦ−α、ＡＲ及び第
一のＮｏｔｃｈ　リピートのＥＧＦ様単位内のエクソン
・イントロン接点部位の配列の比較は、転移可能な要素
にしばしば見られる直接のリピートを明らかＫしていな
い。しかし、すべての四つは、接点に接する配列「ｇｔ
ａαｇｔＪを有する。 この配列は、このイントロンの起源又はスプライシング
に成る役割をしているものと思われる。 ウィルスＥＧＦ同族体はイントロンを含まないが、しか
しＶＧＦ％ＥＧＦＳＴＧＦ−α及びＡＲ間のアラインメ
ントは、トランスメンブレンドメインを通して延在する
同族性を示す一方、粘液腫及びショーブウイルからの生
長因子はこの疎水性領域の前で停止する。最近の研究は
、ＴＧＦ−αプレカーサーがトランスメンブレン蛋白と
して合成されそして異る蛋白分解開裂が特異的な細胞タ
イプである大きな形の分泌をもたらす証拠を提供してい
る（　Ｔ　ｇ　ｉ　ｚｉｄｏ。 １９８７　、Ｎａｔｓｒａ、３２６．８８３〜８８５）
。 トランスメンブレンドメインを含む他のＥＧＦ同族体は
、凝血因子、ＬＤＬ及びホメオティツク遺伝子Ａ’ｏｔ
ａん及びｊｓｓ−１２を含むが、そのいずれもＥＧＦ様
リピリピート接していない。三、四のメンブレン結合プ
レカーサーのＥＧＦモチーフの存在は、成る場合にはそ
れらは分泌された生長因子として処理されるか又はメン
ブレンと結合して存在しそして細胞内／細胞間のコミュ
ニケーションに役割を果していることを示唆している。 ＡＲ同族体のあるものは無を椎動物のホメオテイツク遺
伝子を含む。ホメオテイツク遺伝子生成物は、細胞の発
達の調節に関係する。例えばＮｏｔａｈ遺伝子生成物は
、神経芽細胞又は皮膚芽細胞への外胚芽細胞の正確な発
達を仲介する。Ｎｏｔａｂ突然変異体では、すべてのこ
れらの細胞はニューロン的となシそし℃子孫、すべての
脳そして皮膚以外は死んでしまう。ホメオテイツク遺伝
子は、オートクリンのや夕方で機能して、遺伝子生成物
を発現する細胞中に決定した状態を確立又は維持し、そ
して細胞・細胞の相互作用を経て隣接する細胞にこのよ
うな状態を調節することに関する。ＡＲが又成る細胞の
タイプの発達状態を調節するのに機能するかどうかは、
検討されねばならない。 ［９，６，成熟アムフイレグリンの処理〕ＡＲｅＤＮＡ
の特徴付けは、ＡＲの７８及び８４アミノ酸の形が２５
２アミノ酸トランスメンブレンプレカーサーの中段とし
て合成されることを明らかにしているし前記の（８，２
，）項参照）。成熟ＡＲの放出をもたらすＡＲプレカー
サーの蛋白分解の開裂のための部位は、任意の周知のプ
ロテアーゼの開裂部位に適合していない。Ｎ末端におい
て部位はＡｓ　ｐ−Ａｓ　ｐ／　Ｓ　ａ　ｒ　−Ｖａ　
Ｌ及びＧｌ　５−ＧＬ　ｎ／Ｖｔｓ　ｌ　−Ｖａｌであ
るが、Ｃ末端部位はＧＬｌＬ−Ｌｙｅ／Ｓａｔ−Ｍｅｔ
である。 ＡＲの二つの形は、共通のプレカーサーからの交互の蛋
白−分解処理の結果と思われ、それはすべてのｃＤＮＡ
及びゲノムクローンがこの領域で同一の配列を明らかに
したからである。興味深いことには、イントロンは２個
のＮ末端開裂部位の間に存し、そして「イントロン・ス
ライプイン列が又これらの相違に関係があることは確実
である。 ＭＣＦ−７細胞は大きな８４アミノ酸の形でそれらのＡ
Ｈの８０％を生成するが、絨毛癌細胞株ＨＴＢ−３６は
小さな７８アミノ酸の形でそのＡＨの８０％を生成する
。 この差がＤＮＡレベルのアルタ−Ｖ−ジョンに結びつく
かどうかをきめるために、本発明者はポリメラーゼ鎖反
応技術（５ｅｈａｒｆ、１９８６．Ｓｃ１ｇ％ａｍ、２
３３ｅ　１０７６〜１０７８）を利用して、ＭＣＦ−７
ＭＢ胞及びＨＴＢ−３６細胞からＡＲエクソン３を単離
し、その株は高いレベルのＡＲｍｌ？ＮＡを本質的に生
成する。エクソン３のコーディング領域からの「アンチ
センス」オリゴヌクレオチド並にＡＲイントロン特異性
「センス」オリゴヌクレオチドを用いて、両方のＤＮＡ
源からＡＲ遺伝子の介入Ｚ２０ｂｐフラグメントを特異
的に増殖した。直接の配列分析は、これら二つのヒトＩ
）ＨＡ源の間にイントロン−エクソン接点又はエクソン
３コーデイング配列において不一致を示さず、さらに二
つの形のＡＲがプレカーサーの交互の蛋白分解開裂によ
シ生ずることを示唆した。 ［９，７，ＡＲ及びＥＧＦ様生長因子の構造上の比較］
ＡＲは他のＥＧＦ様蛋白と配列の同一性を明らかに示し
、成熟生長因子の二次構造を規定する３ジするフィド結
合に含まれる６システインを保存する。アミノ酸配列の
先の（コンピューターによる）比較は、二つの異る群へ
のＥＧＦ樺モチーフのカテゴリー化に導く。生長因子及
び血液凝固因子（第１３図参照）。本発明者は、ＡＲ及
び他の周知のＤＮＡ又は蛋白配列との比較のため二つの
配列のパターンを選んだ。選択は、これらの配列の見掛
けの能力に基づいて二つの群の蛋白の間を区別し、そし
工非常に少いギャップが最適のアラインメン）Ｋ必要と
された。正確な配列は第１表に示される。第一の領域は
、ＥＧＦの第二のループの第一の１１アミノ酸に相当し
、第二はＥＧＦの第三のシスティンループに相当する。 生長因子及び血液凝固因子の各グループの四つの代表例
は、それらの十分に確立された機能上及び構造上の同一
性に基づいてコンセンサス配列の発生について選択され
た。ヒトの配列は、本発明者が最終的にそれらをヒトＡ
Ｒと比較したいので、可能な限シ選択゛された。生長因
子は、ヒトＥＧＦ、ＴＧＦ−α、ＶＧＦ及びショープ生
長因子を含み、凝固因子はヒト因子■、ＸｌＸＭ及び蛋
白Ｃを含む。ＡＲは又これらの同一のブロックの両方に
ついてデータベースに対して数えられた。コンセンサス
配列は、残基が成る位置に生じた頻度に基づいて評価さ
れた。 槓々のＴＧＦ−α、ＶＧＦ％ＥＧＦ誘導体の構造・機能
分析は、最近これら生長因子の生物学上の活性に必要な
三、四の残基の同定に導いた。組換え蛋白、脅威ペプチ
ド、部位特異性化学誘導体及び蛋白分解物は、すべて変
化した分子を生ずるのに有用であった。ある−膜化は次
のものを含む（位置は第１５図の配列に相当する）。６
システイン（位ｆｉ１１．１９．１５．２６．２８及び
３７）及びそれらのジするフィドループ（１−１５，９
−２６，２８−３７）は生物学上の活性に必要であり、
Ｎ末趨拡張は活性にほとんど影響がなく、芳香族残基（
Ｆ、Ｙ）は位置８で要求され、７Ｒ’ｔ、ｆ）４Ｊ又は
Ｌ４！の非保存性変化は活性の損失及び／又はレセプタ
ー結合又は自動燐酸化の大きな損失をもたらす。 ＡＲは最後の二つの基準、即ちＥＧＦレセプター結会及
び／又はミトゲン性活性に必戟な残基を規定する基準以
外゛のすべてに適合する。成熟ＡＲはＤ４′直前で先が
な（そしてこれら及び「必須の」ロイシン４２を完全に
欠き、そしてそれはＥＧＦレセプター結合と競合しそし
であるミトゲンアッセイでＥＧＦを置換する。しかし、
これらの相違は、非飽和レセプター結合カイネテイツク
ス及びあるアッセイ例えばＴＧＦ−β相乗作用に２げる
ＥＧＦからのその顕著な機能上の差、選択されたＡ４３
１サブクローン上の相違する作用、橋かけ結合、燐酸化
アッセイ及びＤＮＡを結合するその能力に関係があるだ
ろう。成熟ＡＲのＮ末端の非常に親水性の列は、又レセ
プター結合又は生物学上の活性に２けるこれらの相違の
あるものを与える。 （９，８，ＥＧＦスーパーファミリーのＡＲのサブカテ
ゴリー〕 本発明者は、第夏表に基づ（コンピューター分析並に第
１３図のアラインメントに基づいて進化上の距離のマト
リックスを計算した。このマトリックスを用いて、ＥＧ
Ｆスーパーファミリーの系統図を誘導した。研究はシス
ティンの存在を要し、そして重量づけをされたコンセン
サス配列にマツチする各残基について点を加えた。この
進化樹はＱ仏が構造上及び機能上の同一性に基づいてＥ
ＧＦ様生長因子の新しいサブカテゴリーの内に入ること
を予言している。 このようなモデルは、この生長因子ファミリーの他のメ
ンバーが存在しそしてそれらが以下の三つの基準に基づ
いて上述の配列パターンとの同一性によル同定され５る
ことを予言している。２０より多い２種の生長因子領域
による合わせたスコア、２０以下の合わせた凝固因子領
域のスコアセして２０よシ多い合わせたＡＲ領領域スコ
ア。これらの基準に適合するすべての新しい分子は、又
ＥＧＦ、ＴＧＦ−α、ＶＧＦ又はＡＲとある機能上の同
一性を有することが予想されよう。４０よシ多い合わせ
たＡＲ領領域スコアをもつ分子は、ＥＧＦスーパーファ
ミリー内のＡＲスコアリーの一員として分類されるだろ
うしそして本発明の範囲内にあるだろう。 ［１０，実施例：アムフイレグリンの細菌上の発現〕（
１０，１，材料及び方法］ （１０，１，１，プラスミドの構築〕 プラスミドｐＡＲＤ１０プラスミドｐＡＲＤ１はｐＥＭ
ＥＬ１Ｂ内に１．４　ｋｂ　Ｅｇｏ　Ｒ１ｔＪｌ）ＮＡ
フラグメント（ｊ、４７？１）を含み、成熟ＡＲのアミ
ノ末端でバリン・バリン配列に相当するａＤＮＡ中のヌ
クレオチド位置５３２にＴ−Ｓ−Ｃ弯化を有する。この
塩基の変化は部位に向う突然変異によシ達成され、配列
分析によシ確認された。構築物は、ＡＲアミノ末肩痛プ
レカーサードメイン親水性領域との間の接点にＤｄａ■
部位（ＣＴＡＡＧ）を生ずる午とにより近づ（ことがで
きる。 分泌ベクターの製造に用いられる中間体構築物である。 ｐＡＲＤｌはＳａｐ　ｌ及びＸ６ａｌにより分解され、
そして成熟ＡＲのカルボキシ本店９アミノ酸をエンコー
ドする５１５ｈｐフラグメント、ト、ランスメンブレン
並に細胞質ドメイン並に３′未翻訳領域を単離した。Ａ
ＲａＤＮＡの残りのアミノ末端部分を含む４．７　ｋｂ
　　（担１−Ｘｂａ　Ｉ　）フラグメントをゲル精製し
そして、キナーゼ化且アンニール化相補性オリゴヌクレ
オチドＡＲ５ＴＯＰ１及びＡＲ５ＴＯＰ２（下記に示す
）とリゲートーした。これらのオリゴヌクレオチドは５
′プラント末端（Ｓｓｐ１部位と共存しうる）、次に成
熟ＡＲ配列の〃ルボキシ床端９アミノ酸をエンコードす
る配列、ＴＡＡ停止コドン及（ＪＥｃｏＲ’Ｊ及びＸｂ
ａ■部位を有する。 肩　　３ プラスミドｐｂＡＲ０プラスミドｐｂＡＲは、ＡＲの成
熟７８アミノ酸の形に付着したプロモーターのないＴＧ
Ｆ−βリーダーを含む。それは、オリゴヌクレオチド６
ＬＡＲＮ３及び６ＬＡＲＮ４の、ｐＡＲ５ＴＯＴからＥ
　ｃ　ｏ　Ｒｌ　／Ｘｂ　ａＩ消化、ＥＭＥＬ１８への
２４０ｂｐｌ）ｄａ■〜Ｘｂａｌ　フラグメントによる
リゲーションにより構築された。ｂＬＡＲＲ３及びｂＬ
ＡＲＮ４は相補的であシ、ＴＧＦ−βリーダー配列のカ
ルボキシ宋１に近い一つと共存しつる単一の四部必ソ！
部位並に５′１丘ｏＲ１及び３１ｐむ■オーツ（−）・
ングを生ずる。リゲーションは１．粘ム！部位を破壊し
そして成熟ＡＲのアミノ宋ノーで正確なアミノ酸配列ノ
くリン・ノくリンを再生するだろう。 梢　吟　　　　　　　　　膿　の　　　　　　　　　　
　　の　ηプラスミドル　Ｄ　ＣＩＩ　Ｂ　Ｊ　Ｒｌ　
ｏプラスミドｐＤｃＨＢＡＲ１はＡＲの処理した成熟７
８アミノ酸の形の分泌のためにデザインされた哺乳動物
の発現ベクター（第１９図）である。 それは、ＳＶ４０ポリアデニル化信号を側面に有する、
ＣＭＶ／ＨＩＶプロモーターによシ動かされるｐｂＡＲ
からのＴＧＦ−βリーダー／成熟ＡＲ配列を含む。ベク
ターは又同−の転写配向で５Ｖ２ｄｈｆｒを苫む。ＰＳ
ＶＤＲ／ｈＯＭはＮａｇｌ及びＸｈａｌによシ消化され
、そして６ｋｋベクターｉ□ま切り取られた（７ｓａ・
Ｍコーディング配列よ夕離れて精製された。ｐｈＡＲは
又＃ａｓｌ及びＪ（６ａｌにより消化され、そし″′Ｃ
７’ＯＦ−β信号配列のカルボキシ末ｊｌｉ５アミノ酸
をエンコードする２６０ｈｐ７ラグメント並に７８アミ
ノ酸成熟ＡＲ配列次に停止コドン及びＥｅｏＲ’ｉ及び
担！部位となりｔ−、接点は配列分析により確められた
。 プラスミド、ＤＣＩＩＢＰｆｉｌＬＥ、プ２スミドνＤ
ＣＩｉＥＰ１１１ＬＥは、キメラＡＲ／ＥＧＦ蛋白の分
泌のためにデザインされた呻乳動物の発現ベクターであ
る。プラスミドは、又ＡＲ栽氷水性ドメイン他の生長因
子との間の将来の融合構築物を助けるために形成される
。この構築物は、６．５　ｋｂ　５ａｔ１／Ｘｂａｌ消
化、Ｌ）ＣｆｌＢＡＲ１ベクターフラクメント、１７５
　ｈｐ　Ｅｇｏ　Ｒｌ　／Ｘｂａ　Ｉフラグメント（合
成ヒトＥＧＦ遺伝子を含む）及びオリゴヌクレオチドＦ
ｕＩＬ１及びＰＨＩＬ２のリゲーションにより生成され
た。これらのオリゴヌクレオチドは、５′互り…及び３
’ＡｃｏＲ１拡張と相補的であり、そしてＴＧＦ−β信
号配列の最後の残基及び全ＡＲ親水性ドメインをエンコ
ードする。ｐ　ｌ）ＣＨＢ　ＡＲ１はＣＭＶ／ＨＩＶプ
ロモーター、ＴＧＦ−β信号配列の最後のアミノ酸を除
（すべて及びＳＶ４０ポリアデニル化配列を提供する。 ＥＧＦフラグメントは、Ｔｉｍ。１４９Ｍ。 ＲＯｎ博士（０％ｃｏｇｓ％）から得られ、そして将来
の増殖のための都合の良い部位を含む。 ＣＩｏ、１．２．　　ｐｒＡｃベクターの製造〕プラス
ミドＴａｃＰａｋ／ＥＧＦをＴｉｔｎｏｔルｙＭ、Ｒｏ
ａｇ博士（０％ｃｏｇａｓ）から得℃、下記の単位よシ
なる。次に、ＤＲｓ４ｏ（アルファマシア）よシ由来し
た発現ベクターｊｌ１３５−１からのＥｇｇ　ＩＩ　／
　ＢａｍＨＩ　　７ラグメントトして単離されたＣｒｏ
遺伝子Ｓｈｉ％−−Ｄｇ１ｇａｒｏ配列及びｔｒｐ−１
ａｇハイブリッドプロモーター；合成オリゴヌクレオチ
ドＴａｃ　Ｐａ＆　１及びＴａｋＰａｋ２　（Ｒｏａｍ
博士、Ｏｓｃｏｇａｎ）由来のアルカリホスファターゼ
信号配列；プラスミドｐＥＭ２２／ＰＡＫ／ＥＧＦから
シャトルされた合成ＥＧＦ配列；転写停止領域；プラス
ミドｐ１３５−１からすべて由来のネオマイシン耐性遺
伝子を有するｐＢＲ３２２骨格。ＴａｇＰａｋ／ＥＧＦ
をＢａ５ａｌにょシ消化し、２塩基をｄＡＴＰ及びｄＧ
ＴＰによシ光填して２塩基光填５ａｌｌと共存しうる部
位を作シ、久１１ＣＰ＊ｓｌにょシ消化した。この消化
は合成ＥＧＦ遺伝子及び多くのアルカリホスファターゼ
信号配列を除（が、Ｔａｃプロモーター及びＳｋ４％−
−１）ｍｌｇａｒ％Ｏ配列並に開ＡＴＧをそのままで残
す。 ２．８ｋｂ７ラグメントをゲル精製した。 ［１０，１，３，修飾アムフイレグリン、ＤＮＡ７ラグ
メントの製造］ プラスミドｐＡＲ５ＴＯＰ−４（多畦Ｉにより消化し、
２−塩基なｒｒｐ及びｄｃＴＦにより充填してＢａｔｓ
ｈＥ１２−塩基充填（ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ）拡張と共存
しうる部位を作シ、次にμｄａｌ及びＢｆｌｌにより消
化した。後者の消化物は所望の２４２　ｈｐフラグメン
トから共存するＤＮＡを除くのに必要であり、七扛はＶ
ＫＰＰから始まりそしてＣＧＥＫで終り次に合成的に導
入された停止コドンを有する成熟ＡＲの短い形をエンコ
ードする。２４３ｋｐフラグメントなゲルｆＩＷ裂した
。 （１０゜１．４．ＡＬＫＰＡＲｌ及びＡＬＫＰＡＲ２合
成オリゴヌクレオチドの製造〕 相補性合成オリゴヌクレオチドＡＩＩＰＡＲ１及びＡＬ
ＫＰＡＲ２は、Ｔａ　ｅ　Ｐａｋ／Ｅ　Ｇ　Ｆ　Ｐｕｓ
　Ｉ　／　ＢａｗｈＨＩ一部分的充填フラグメントと共
存しうる５’　Ｐｕｓ　ｌオーバーハング並にｐＡＲ５
ＴＯＰ　Ｄｄａ　ｌ／Ｓａｇ　Ｉ一部分的充填７ラグメ
ントと共存しうる３’Ｄｄａｌ拡張によシデザインされ
た０それらはＡｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏａｙａｔｇｔｍａ
　ＯＬｉｇｏ％藝ｅ１ｇ−ｏｔ（ｄｓ　、Ｓｙ％ｔｈｍ
ａｉｚａデで合成されそしてアクリルアミドゲルから精
製された。ホスフェートをＴＫキナーゼとともにオリゴ
ヌクレオチドに加え、そして等モル量を熱変性後徐冷に
よシアンニールした。 ＣＩＯ，１，５，ｐＴａｏＡＰＡＲｌのリゲーション友
び単離〕２４３ｂｐ些１−７互１１一部分的充填ＡＲ７
ラグメント、２．８　ｈｋ　Ｐ、墾［に色ｕ＋ａＨ■一
部分的光填ＴａｃＰ畠に／ＥＧＦベクター７ラグメント
；及びキナーゼ化且アンニール化ＡＬＫＰＡＲ１＋２オ
リゴヌクレオチドをＤＮＡリガーゼを用いてリゲートシ
、適当なＥ、コリ１Ｍ１０９細胞に形質転換しそしてＬ
Ｂ／ネオマイシンプレートで選択した。 正確な構築物は制限消化物及びＤＮＡ配列と一致した。 ｐＴａｃＡＰＡＲの配列は第２０図に示される。 （１０，１，６，キメラＡＲ親水性ドメイン／ＥＧＦ遺
伝子フラグメントの製造〕 ７”ラスミド”ｐｉ）ＣＨＢＰＨＩ　ＬＥヲＳａｔ　ｌ
ｌ及ヒＸｂａ　Ｉによシ消化して２８６！ｐ７ラグメン
トを生成し、それはＴＧＦ−β信号配列の最後の２残基
（，４Ｇ）、ＡＲの親水性ドメインからの３７残基（Ｖ
ＶＫＰ・・・、ＲＫＫＫ）及び成熟ヒトＥＧＦ配列の５
３残基合成配列（ＮＳｆ）Ｓ・・ｉＰ’ＥＬＲ）をエン
コードする。２８６ｂｐ７ラグメントをゲル精製した。 ［１０，１，７，ＡＰＡＲＥＧＦｌ及びＡＰＡＭＥＧＦ
２合成オリゴヌクレオチドの製造〕 相補性合成オリゴヌクレオチドＡＰＡＲＥＧＦ１及びＡ
ＰＡＲＥＧＦ２を、ｐＴａｃＡＦＡＲ１’Ｐｕ５ｌ／Ｘ
ｂａ　Ｉ７ラグメントと共存し５る５’Ｐ２１オーバー
ハング並にｐＤｃＨＢＰＢＩＬＥ　　Ｓａｔ　Ｈ／Ｘｂ
ａ　Ｉフラグメントと共存し５る３’５５ｇｍ拡張によ
タデザインした。オリゴヌクレオチドをＡｐｐｌｉｅｄ
　Ｅｔｏａｙａｔａｔｎａ　Ｃ）ｌｉｇｏ＊ｓａＬａｏ
ｇｉｄｅｓｙ％ｔｈａｇｉｚｍｒで合成しそしてアクリ
ルアミドゲルから精製した。ホスファターゼを１４キナ
ーゼとともにオリゴヌクレオチドに加え、等モル量を熱
変性後徐冷によシアンニールした。 ａ）　　　ば） ｃｈ （ｌｏ、１．８．ＴＡＣ’ＡＰＨＩＬＥのリゲーション
及び単離〕成熟ＥＧＦ配列に何着したＡＲ（１）親水性
ドメインをエンコードする２　８６　ｈｐ　Ｓａｔ　ｌ
　／Ｘ６ａ　ｌ　　７ラグメント、２．８ｋｂＰ二１１
乙４ツ１ｐＴαａＡＰＡＲ１ベクターフラグメント及び
キナーゼ化且アンニール化ＡＰＡＲＥＧＦｌ＋２オリゴ
ヌクレオチドをＤＮＡリパーゼを用いてリゲートし、適
当なＥ、コリ＃ｆ１０９に形質転換しそしてＬＢ／ネオ
マイシンプレート上で選択した。正確な構築物は、制限
消化物並ｔｌｃＤＮＡ配列と一致した。ｐＴａｃＡＰＥ
ＩＬＥのヌクレオチド配列を第２１図に示す。予想され
た翻訳生成物は、アルカリホスファターゼ信号配列直前
のジペプチドＡｌａ−Ｇｔｙの間で開裂し、それにより
ＡＲ親水性ドメインに一つの追加の残基（グリシン）を
加えるべきである。正常のヒト配列とは異るヌクレオチ
ド残基は、ボールド（ｂｏｌｄ　）型で示される（第２
０図）。 （１０，１，９、組換えアムフイレグリンの精製〕プラ
スミドｐＴａｃＡＰＡＲ１及びｐＴ、ａａＡＰＨＩＬＥ
　を適当なＥ、コ１７　Ｊ　Ｍ　１０９に形質転換しそ
して０．７の為。。 に３７℃で１ＱｒｎｔＬＢ中で；ンフルエンシーに生長
させた。 培養物を次に１００５Ｍ　ＩＰＴＧにより誘導しそして
２４〜７２時間生長させた。培養物をそれぞれ１５分間
５０００デｐｓで２回遠心分離し、ペレットを回収しセ
してｉａを上澄みについて行った。サンプルをＦＪｆ５
１１（５０００ｍＦカットオフ）を用いてＡｇ％１ｅｏ
ｓ　超ｐ過装置で１０倍に濃縮した。＠縮物な５容量の
ＭｉｌｌｉＱ水によフ希釈しそして初めの培養容量のイ
。にした。氷酢酸をＩＭに加え、サンプルを２〜２４時
間４℃に置いた。サンプルを５Ｓ３４０一ター中テＯａ
ｋｒｉｔＬｇ−管中で４℃で２０分間１９．０００デｐ
講で遠心分離し、ペレットを２０Ｍｔの１Ｍ酢酸によル
抽出しそして上澄みをプールした。透明な上澄みを次に
２日間０．　ｌ　Ｍ酢酸について透析し、凍結乾燥しそ
して一２０℃に貯蔵した。 細胞のペレット及び乾燥した上澄みを免疫プロテッング
によシアツセイし、ＡＲ蛋白について生長阻害アッセイ
（ＧＩＡｂ）によファツセイした。５０％ｌのコンフル
エント培養物からの細胞ペレット又は１００〜２００　
ｓｌの乾燥上澄みを１６％トリシンポリアクリルアミド
ゲルに流し、ファーストグリーンによシ染めそしてニト
ロセルロースに移した。クエスターン・プロットを上述
の〔７゜１．６．３項に記載したように行った。 Ｃｌ　Ｏ，２，結果及び検討〕 ｐＴａｏＡＰＡＲ１を有する形質転換体からの細胞ペレ
ットは、劣化生成物及び存在すると思われるダイマーと
ともに１０ＫＤで泳動する多量の免疫活性のある蛋白を
示した。 上澄みは、約１００〜２００　ｎｔ／ｌＬｔの分泌した
免疫活性ＡＲを有する。上澄みのＧＩＡは、精製した天
然のＡＲ標準品に比べて、Ａ４３ｌ−Ａ３インデイケー
タ−細胞株で約１５０％ｆ／ＩＬｔのＡＲの活性を示し
た。多量の免疫活性蛋白は、このシステムで生成され、
その多くは細胞内に凝集されていた。ペリプラスミック
物及び上置みのアッセイは、２〜３日間の生長後活性蛋
白の分泌を示した。 ｐＴａｇＡＰＨＩＬＥは、任意のクローンした遺伝子の
Ｎ肩痛にＡＲの親水性ドメインを付着する好都合な手段
を提供する。この領域は、リガンドの正常のレセプター
へ変化した結合特性を与え、核存在配列として働き、Ｄ
ＮＡに結合し、又は付着した因子にとり通常は不浸透性
である脂質又は他の膜を通して移動する。 〔１１，微生物の寄託〕 下記の微生物がＡｇｒｉｃｓｌｔｓｒａＬ　Ｒｍａａａ
デａｈ　ＣｓｌｔｓｒｍＣｏｌＣ５１ｔｓｒ％、Ｎｏｒ
ｔルーｒｓ　　Ｒａｇｉｏ＊ａｌ　　Ｃａ５ｔｅｒ（Ｎ
ＲＲＬ）に寄託されそして下記の寄託番号を付された。 Ｅａｃｈａｒｉｃｈイａ　ａｏＬｉ　ＨＢＩＯｌ　　ｐ
ＪｉＲＩＥａｃｈｍｒｉｅｋｉａ　　ａｏＬｉ　　ＨＢ
ｌｏｌ　　ｐＡＲＨ１２Ｅａｃｈｇｒｉｃｈｉａ　　ａ
ａＪ（ＲＢｔｏｘ　　ｐＡＲｆ１６Ｅｍａｈｍｒｉｅｈ
ｉａ　　ｃｏｌｉ　　１Ｍ１０９　　ｐＴａｃＡＰＡＲ
ｌ　　　　　　　□Ｅａａｈａｒｉｅｈｔａ　　ａｏＬ
ｉ　　）Ｍ２Ｏ３ｐＴａｃＡＰＨＩＬＥ本発明は寄託さ
れた細胞株又は開示された態様により範囲を制限されず
、それらは本発明の一つの面の単なる説明を目的としそ
して任意の機能上回等なものは本発明の範囲内にある。 事実、本明細書で記載し示されたものに加えて、本発明
の糧々の変化は、本明細書の記載から当業者にとり明ら
かであろう。このような変化は、特許請求の範囲内に入
ることを目的としている。 又、ヌクレオチド及びペプチドに示されたすべての塩基
対及びアミノ酸残基数及びサイズは凡そであシ、記述の
目的のため用いられる。 ４、図面の簡単な説明〕　　　　− 第１図は、製品及び洗液の標品逆相ＨＰＬＣである。 第２図は、第１図からのプールされた画分４７〜６２の
半標品逆相ＨＰＬＣである。　　゛ 第３Ａ図は、先の工程からのプールＩの分析逆相Ｅ　Ｐ
ＬＣである。 第３Ｂ図は、先の工程からのブール璽の分析逆相ＨＰＬ
Ｃである。 第４図は、バイオ・シ＃（Ｂｉｂ−５ｉｒ　）　Ｔ　Ｓ
ｒ　２５０カラムの第３Ａ及び３Ｂ図からの画分のゲル
浸透クロマトグラフィである。クロマトグラフィは以下
の［６，３，２，’］項で記載したように行われた。Ｃ
／ｇ）　　濃縮した画分３５のＢＰＬＣ（第３Ａ図）　
；　ＣＢ）　　濃縮した画分３６のＨＰＬＣ（第３Ａ図
）　；　ＣＣ）　　濃縮した画分３７のＨＰＬＣ（第３
Ａ図）　；　ＣＤ）　　濃縮した画分４１及び４２を一
緒にしたもののＨＰＬＣ（第３Ｂ図）。 第５図は、バイオ・シルＴＳＫ２５０カラムのゲル浸透
ＨＰＬＣによる精ｇＡＲ及びＳ−ピリジルエチル化−Ａ
Ｒ（ＳＰＥ−ＡＲ）の分析である。クロマトグラフィは
、下記の［：６．３．２．”１項に記載されたように行
われた。用いた分子量マーカーは、オボアルブミン、４
３ｋＤ；キモトリプシノーゲンＡ、２５ｈＤ；リボヌク
レアーゼ、１４ｋＤ；そしてインスリン、６ｋＤ０　（
Ａ）　　ＡＲ；　（Ｂ）　　ＳＰＥＡＲ０ 第６図は、逆相ウルトラボアＲＰＳＣＣ３カラ′ム（４
，６ｘ７５ｇ）のＡＲ及び５ＰＥ−ＡＲの分析である。 勾配は、室温で１１／分の流速で一次溶媒０．１％ＴＦ
４と第二次溶媒アセトニトリル（０，１％ＴＦＡを含む
）との間で行われた。１継の両分を集めた。（Ａ）　　
ＡＲ；　（Ｂ）　　ＳＰＥ＝ＡＲｏ 第７図は、ＡＲ蛋白の５ＤＳ−ＰＡＧＥ分析である。（
，４）不連続なバッファー系を有する１５％５ＤＳ−Ｐ
ＡＧＥゲル（０，７５龍Ｘ　１８ｃｍｘ　１５ｃｍ、バ
イオ・ラッド）を３０ミリアンペアの一定電流で操作し
た。用いた分子量マーカーは、ホスホリラーゼＢ、９２
．５ｋＤ；ＢＳＡ、６６．２ｈＤ；オボアルブミン、４
３ｈＤ：炭酸脱水酵素、３１ｋＤ；キモトリプシノーゲ
ンＡ、２５．７ｈＤ；大豆トリプシンインヒビター、２
１．５＆Ｄ；ラクトグロブリン、１８．４ｋＤ；リゾチ
ーム、１４．４ｋＤ；アプロトニン、６．２ｋＬ）；イ
ンスリ／サブユニット、３ｋｌ）。レーン１：ＡＲ；ｖ
−ン２：ＮＧ−ＡＲ；レーン３：５ＰＥ−ＡＲ；レーン
４：ＮＧ−５ＰＥ−ＡＲｏ　（Ｂ）２０％５ＤＳ−ＰＡ
ＧＥミニゲル（０，７５＊ｔＸ　１０ｃｍｘ　７ｃｍ）
を２００ボルトの一足電圧で操作した。前記と同じ分子
量マーカーを用いた。レーン１：ＪＲ；レーン２：ＮＧ
−ＡＲ；レーン３：ホスホリパーゼ処理ＮＧ−ＡＲ１ｒ
ｐ　ＨＰＬＣで分離。 第８図は、１１＠ｌ標ＲＡＲのＩＥＦ分析である。４，
６５〜９．６のＰ□値を有する下記の標準を用いた。フ
ィコシアニン、４．６５；β−ラクトグロブリンＢ、５
．１：ウシ炭酸脱水酵素、６．１；ヒト炭酸脱水酵素、
６．５；ウマミオグロビン、７．０；クジラミオグロビ
ン、８．０５；α−キモトリプシン、８．８；チトクロ
ームＣ，９，６゜第９図で、（Ａ）Ａ４３１細胞のＩ）
ＮＡへの１２５１−デオキシウリジン添加の阻筈に関す
るＡＲの投与蓋、反応曲線であり、（Ｂ）　　ヒト包皮
線維芽細胞（サカモト）のＤＮＡへの１２５１−デオキ
シウリジン添加の刺激に関するＡＲの作用である。 第１０図は、ネズミＥＧＦ及びＡＲＫよる固定化Ａ４３
１細胞又はＡ４３１血漿膜へのＩ”１−ＥＧＦ結合の競
合である。結合アッセイは、下記のＣ６，１，５，３項
に記載したように行われた。１穴当りｌＯＯμ！又は５
０μｌのサンプルがそれぞれ固定化細胞又は膜とのアッ
セイに用いられた。 固定化細胞　　　　ＥＧＦ 固定化細胞　　　　ＡＲ 膜　　　　　　　　ＥＧＦ 膜　　　　　　　　　ＡＲ 第１１図は、ＡＲ及びヒトＥＧＦ〔カイト（ｆｙｔ＊）
及びドーリットル＜ｎｏｏｔｔｔｔｔｍ）　）のヒトロ
バシー分析である。（ｓ４）ＡＲＣ残基ｌ〜ｓ４ｄ；Ｃ
Ｂ）　　ＡＲ（残基４４〜８４）；（（：’）　　ＥＧ
Ｆ（残基ｌ〜ｓ　３　）　；　（Ｄ）ＡＲプレカーサー
（残基ｌ〜２５２）；（Ｅ）　　ヒト、（７？（残基１
〜８４）及びＥＧＦ（残基ｌ〜５３）の比較〔アライン
メントは第１３図により、そのため成熟ＡＲの残基４６
であるシスティンは成熟ＥＧＦの残基６のシスティン罠
一致する〕。 第１２図は、成熟ＡＲ及び先を切られたＡＲのアミノ酸
配列である。アミノｆｆＫ関する標準の単一の字コード
が用いられている。アラニン（１）；アルギニン（Ｒ）
；アスパラギン（菊；アスパラギン酸（Ｄ）；システィ
ン（の；グルタミン（Ｑ）；グルタミン識（Ｅ：）；グ
リシン（Ｇ）；ヒスチジン（力；イソロイシン（１）　
；ロイシン（Ｌ）；リシン（イ）；メチオニン（イ）；
フェニルアラニン（Ｆ）；７”ロリン（Ｐ）；セリン（
Ｓ）　；スレオニン（Ｔ）；ドリフト７７ン０；チロシ
ン（１’）及びバリンＶ）。 第１３図は、アムフイレグリン（ＡＲ）及びＥＧＦスー
パーファミリーのメンバーのアミノ酸配列の比較である
。 第１４図では、（Ａ）セルロース（０−０）、変性ＤＮ
Ａセルロース（ローロ）、天然ＤＮＡセルロース（Δ−
Δ）へのＩ！ｌ　ｌ　＋　Ａ／？結合である。ＣＢ）セ
ルロース（０−０）及びＤＮＡ−セルロース（ローロ）
への”’Ｉ−ＡＲ結合をセルロース（Δ−Δ）及びＤＮ
Ａ−セルロース（−Ｖ）への＋１５１−ＥＧＦ結合と比
較している。 第１５図は、固相技術によシ生じた合成アムフイレグリ
ンペプテドである。残基１６６〜１８４　（４２５９）
、１０８〜１３０（魔２６４）、３１〜５０（４２７９
）、７１〜９０（屑２８０）及び２２１〜２４０（４２
８１）に相当する５種のペプチドが固相合成により生成
され次に逆相ＨＰＬＣにより精製された。 第１６図は、ヒトアムフイレグリンをエンコードしたｃ
ＤＮＡクローンｐＡＲ１のヌクレオチド及び演鐸アミノ
酸配列である。 第１７図は、ヒトアムフイレグリンゲノム配列である。 区画の浄書（内容（：変更なし） 第１８図は、ゲノム配列に関するＡＲ分子のエクソン構
造及び蛋白ドメインの概略図である。 第１９図は、ｐＤｃＩＩＥＡＲ１発現ベクターのヌクレ
オチド配列である。 ＷＪ２０図は、ｐＴａｎＡＰＡＲｌのヌクレオチド配列
である。 第２１図は、ｐＴａｃＡＰＨＩＬＥのヌクレオチド配列
である。 ゝ・パ・１３．−シ ＦＩＧ、　ｌ Ａ２８０　（−） Ｇ工Ａ、填イ１ｘｌｏ　　　　（） ＦＩＧ、　２ Ａ２２０　（−） ＦＩＧ、３Ａ へ２２０　（−） ＦＩＧ、３Ｂ Ａ２２０　（−） ＦＩＧ、４Ａ ”　　持　Ｂｉ　ｔ＠　　　（ｍｉｎ）ＦＩＧ、４Ｂ 係　才件　θキ（’ｉｉ　　（ｍｉｎ）ＦＩＧ、４Ｃ ４’ｊｒ−１’：ｒ　ａｉ　Ｇ′１（ｍｉｎ）ＦＩＧ、
４Ｄ イｊ−持　日キ＠　　　（ｍｉｎ） ＦＩＧ、　５　Ａ イ〒、持８−！Ｆ面（ｍｉｎ） ＦＩＧ、５Ｂ 係持時１阿　（ｍｉｎ） ＦＩＧ、６Ａ イ茶　　ａ　　ｆｌ＋Ｈ（ｍｉｎ） ＦＩＧ、　６　Ｂ 係ｆＦ　ｅｆｒ　ｒＦＮ　　（ｍｉｎ）Ｆｆｏ、７８ 工ＥＦ ＦＩＧ、　９　Ａ 量　白　（ｎ９／箋） ＦＩＧ、９Ｂ ＧＳＡ　　コントロー１しり％ ＦＩＧ、　１０ ＦＩＧ、　１１　Ａ 八・　蟇 ５ＶＲＶＥＱＶＶＫＰ　ＰＱＮＫＴＥＳＥＮＴ　５ＤＫ
ＰＫＲＫＫＫＧ　ＧＫＮＧＫＮＲＲＮＲＫＫＫＮＰＣＮ
ＡεＦＯＮＦＣＩＨＧＥＣＫ　　ＹＩＥＨＬＥＡＶＴＣ
ＫＣＯＯＥＹＦＧＥＲＣＧεに一 一！″ＬｏとΔ− 戊　壓 ＦＩＧ、　１１０ Ａ、　’ｉｃ　ｔ　ｖ）ッｒ−，ＡＲ ｅ−丸ｔ’１ｎ ＦＩＧ、　１２ ？４フイレク°１１ン７’！／７＞−ナーＭＲＡＰＬＬ
ＰＰＡＰ　ＶＶＬＳＬＬＩＬＧＳ　ＧＩ４ＹＡＡＧＬＤ
ＬＮ　ＤＴＹＳＧＫＲＥＰＦ　５ＧＤＨ５ＡＤＧＦＥ　
　５０ＶＴＳＲ５Ｅ）４ＳＳＧ　ＳＥＩＳＰＶＳＥＭＰ
　５ＳＳＥＰＳＳＧＡＤ　ＹＯＹＳＥＥＹＤＮＥ　ＰＱ
ＩＰＧＹＩＶＤＤ　　１００Ｓ８にＴＨ５ＭＩＤＳＳＬ
ＳＫＩＡ　　２００ＬＡＡＩＡＡＦＭＳＡ　　ＶｒＬＴ
ＡＶＡＶｒ丁　ＶＱＬＲＲＱＹＶＲＫ　ＹＥＧＥＡＥＥ
ｆｉＫ　　ＬＩＩＱＥＮＧＮＶＨＡ　　２５０ＩＡ　　
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
　　　　　　２５２ＳＶＲＶＥＱＶＶＫＰ　ＰＱＮＫＴ
ＥＳＥＮＴ　ＳＤにＰＫＲＫににＧ　ＧＫＮＧＫＮＲＲ
ＮＲＫににＮＰＣＮＡＦＦＱＮＦＣＩ）ＩＧＥｃＫ　Ｙ
ＩＥ）ＩＬＥＡＶＴｃ　ＫＣＱＱＥＹＦＧＥＲＣＧＥに
２６４　　　　　　　　　　ｖｘｐｐｑｓｘｙＥｓＥＮ
ｖｓｏｘｐｘＲｘｘｘａ　　　　　　　　２３　　　　
　　＊Ｉ２．ｐｔｅ−イ°１２７９　　　　ＤＴＹＳＧ
ＫＲＥＰＦＳＧＤＨ５ＡＤＧＦＥ　　　　２０　　Ｎ−
１鳴５ｔ２８１　　　ｖｑｕＲｑｙｖＲｘｙＥａ［ＡＥ
Ｅｕｘｘ　　　　ｚｏ　　９ｅＦＩｉ背ＦＩＧ、　１５ （〕 （Ｄ Ｊ　梠に＝２３ｐ尤＝　　　で　　　１　　　　　　　
■　　　−呼　　　　　−１）　　　の　　　　　　　
　　リ　　　　−１〜の　　　　　１　　　　　　　　
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ＣＭＶＬン＋＆’Ａ・＞ ＴＣＧＣＧＡＴＧＴＡＣＧＧＧＣＣＡＧＡＴＡＴＡＣＧ
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＾丁ＴＡＡＴＡＧＴＡＡＴＦＩＧ、　２０ ’−；ＫＡｕＡ（ｊＴ’Ｊ−ｉＡＴＣＣＧｈ’ＧＡＣＴ
ＡＡ’ＹＸ’ＧＧＧＧＡＣＣ１？丁ＡＧＡＧＧＴＣＣＣ
ＣＴＴＴＴｒＴＡＴＴｒＴＡＡＡＡ手続補正書（方式） 平成１年６月１３日 特許庁長官　吉　１）文　毅　殴 １、事件の表示 平成１年特許願第１４２３２号 ２発明の名称 アムフイレグリン ３補正をする者 事件との関係　　特許出願人 名称　オンコシエン ４代理人 平成１年５月３０日 別紙のとおり、但し明細書および図面の内容の補正はな
い。 手続補正書（方式） ％式％ １、事件の表示 平成１年特許願第１４２３２号 ２発明の名称 アムフイレグリン ３補正をする者 事件との関係　　特許出願人 名称　オンコシエン ４代理人 止する。

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 （１） 【遺伝子配列があります】 よりなるアミノ酸配列を有する蛋白。 （２）約８，５００〜２５，０００ダルトンの分子量を
    有する請求項１記載の蛋白。 （３）約７．６〜８．０に及ぶｐＩを有する請求項１記
    載の蛋白。 （４）請求項１記載のグリコシル化蛋白。 （５）請求項１記載の非グリコシル化蛋白。 （６） 【遺伝子配列があります】 よりなるアミノ酸配列を有する蛋白。 （７）約９，１００〜２５，０００ダルトンの分子量を
    有する請求項６記載の蛋白。 （８）約７．６〜８．０に及ぶｐＩ有する請求項６記載
    の蛋白。 （９）請求項６記載のグリコシル化蛋白。 （１０）請求項６記載の非グリコシル化蛋白。 （１１）上皮起源のヒト癌細胞株の成長を阻害する請求
    項１記載の蛋白又はそのペプチド又はフラグメント。 （１２）上皮起源のヒト癌細胞株が外陰の表皮癌Ａ４３
    １又は胸部の腺癌ＨＴＢ１３２よりなる請求項１１記載
    の蛋白。 （１３）生体外で培養されたヒト包皮線維芽細胞の生長
    を刺激する請求項１記載の蛋白又はそのペプチド又はフ
    ラグメント。 （１４）ヒト包皮線維芽細胞がサカモト又はグツドウイ
    ン細胞株よりなる請求項１３記載の蛋白。 （１５）上皮起源のヒト癌細胞株の生長を阻害しそして
    生体外で培養されたヒト包皮線維芽細胞の生長を刺激す
    る二機能性細胞生長調節剤よりなる請求項１記載の蛋白
    又はそのペプチド又はフラグメント。 （１６）上皮起源のヒト癌細胞株が外陰の表皮癌Ａ４３
    １又は胸部の腺癌ＨＴＢ１３２よりなる請求項１５記載
    の蛋白。 （１７）ヒト包皮線維芽細胞がサカモト又はグツドウイ
    ン細胞株よりなる請求項１５記載の蛋白。 （１８）細胞の生長の阻害又は刺激が、下記のアツセイ
    即ち （ａ）５％熱不活性化ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、ペニシ
    リン／ストレプトマイシン及びグルタミンを補強された
    ＤＭＥＭよりなる５０μｌのテスト培地中に３．５×１
    ０＾４細胞をそれぞれ含むマイクロタイター穴を３時間
    インキュベートし； （ｂ）アムフイレグリンを含む５０μｌのテスト培地を
    各実験穴に加え、一方アムフイレグリンを含まない５０
    μｌのテスト培地を各コントロール穴に加えそして２〜
    ３日間３７℃でインキュベートし； （ｃ）＾１＾２＾５Ｉ−ヨード−２′−＾１＾２＾５Ｉ
    −デオキシウリジン（Ｉ−ＵｄＲ）を含む１００μｌの
    溶液を各穴に加えそして４〜６時間３７℃でインキュベ
    ートし； （ｄ）培地を除きそして各穴をＰＢＳにより１回洗い； （ｅ）２００μｌのメタノールを各穴に加え室温で１０
    分間インキュベートしそして除き； （ｆ）２００μｌの１Ｍ水酸化ナトリウム溶液を各穴に
    加え３０分間３７℃でインキュベートし；そして （ｇ）１Ｍ水酸化ナトリウム溶液を除きそしてガンマカ
    ウンターを用いてカウントし、放射能カウントの存在は
    ＾１＾２＾５Ｉ−ＩＵｄＲ添加及び細胞増殖の目安であ
    り、一方カウントの不存在は細胞増殖の阻害を示す により求められる請求項１１、１２、１３、１４、１５
    、１６及び１７の何れか一つの項記載の蛋白又はその任
    意のペプチド又はフラグメント。 （１９）上皮起源のヒト癌細胞株の生長を阻害する請求
    項６記載の蛋白又はそのペプチド又はフラグメント。 （２０）上皮起源のヒト癌細胞株が外陰の表皮癌Ａ４３
    １又は胸部の腺癌ＨＴＢ１３２よりなる請求項１９記載
    の蛋白。 （２１）生体外で培養されたヒト包皮線維芽細胞を促進
    する請求項６記載の蛋白又はそのペプチド又はフラグメ
    ント。 （２２）ヒト包皮線維芽細胞がサカモト又はグツドウイ
    ン細胞株よりなる請求項２１記載の蛋白。 （２３）上皮起源のヒト癌細胞株の生長を阻害しそして
    生体外で培養されたヒト包皮線維芽細胞の生長を刺激す
    る二機能性細胞生長調節剤よりなる請求項６記載の蛋白
    又はそのペプチド又はフラグメント。 （２４）上皮起源のヒト癌細胞株が外陰の表皮癌Ａ４３
    １又は胸部の腺癌ＨＴＢ１３２よりなる請求項２３記載
    の蛋白。 （２５）ヒト包皮線維芽細胞がサカモト又はグツドウイ
    ン細胞株よりなる請求項２３記載の蛋白。 （２６）細胞生長の阻害又は刺激が下記のアツセイ即ち （ａ）５％熱不活性化ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、ペニシ
    リン／ストレプトマイシン及びグルタミンを補強された
    ＤＭＥＭよりなる５０μｌのテスト培地中に３．５×１
    ０＾４細胞をそれぞれ含むマイクロタイター穴を３時間
    インキュベートし； （ｂ）アムフイレグリンを含む５０μｌのテスト培地を
    各実験穴に加え、一方アムフイレグリンを含まない５０
    μｌのテスト培地を各コントロール穴に加えそして２〜
    ３日間３７℃でインキュベートし； （ｃ）＾１＾２＾５Ｉ−ヨード−２′−＾１＾２＾５Ｉ
    −デオキシウリジン（Ｉ−ＵｄＲ）を含む１００μｌの
    溶液を各穴に加えそして４〜６時間３７℃でインキュベ
    ートし； （ｄ）培地を除きそして各穴をＰＢＳにより１回洗い； （ｅ）２００μｌのメタノールを各穴に加え室温で１０
    分間インキュベートしそして除き； （ｆ）２００μｌの１Ｍ水酸化ナトリウム浴液を各穴に
    加え３０分間３７℃でインキュベートし；そして （ｇ）１Ｍ水酸化ナトリウム溶液を除きそしてガンマカ
    ウンターを用いてカウントし、放射能カウントの存在は
    ＾１＾２＾５Ｉ−ＩＵｄＲ添加及び細胞増殖の目安であ
    り、一方カウントの不存在は細胞増殖の阻害を示す により求められる請求項１９、２０、２１、２２、２３
    、２４又は２５記載の蛋白又はその任意のペプチド又は
    フラグメント。 （２７）（ａ）１２−ｏ−テトラデカノイル−ホルポー
    ル−１３−アセテート（ＴＰＡ）の存在下ＭＣＦ−７細
    胞を培養し； （ｂ）ＭＣＦ−７細胞から調整された培地を集め；そし
    て （ｃ）調整された培地からアムフイレグリンを単離する
    ことよりなる方法により得られた二機能性生長調節因子
    であるアムフイレグリン。 （２８）約ヌクレオチド残基数１〜約ヌクレオチド残基
    １２４３の第１６図に実験的に示されたヌクレオチドコ
    ーディング配列よりなるアムフイレグリンプレカーサー
    をエンコードするヌクレオチド配列。 （２９）約アミノ酸残基数１〜約アミノ酸残基数２５２
    の第１６図に実質的に示されたアミノ酸配列よりなるア
    ムフイレグリンプレカーサー。 （３０）（ａ）遺伝子発現を調節する第二のヌクレオチ
    ド配列のコントロールの下アムフイレグリンをエンコー
    ドするヌクレオチド配列を含むエシエリシア・コリ細胞
    を培養してアムフイレグリン活性を有するペプチド又は
    蛋白がエシエリシア・コリ細胞により生成され；そして （ｂ）培養物からアムフイレグリンを回収することより
    なるアムフイレグリンを製造する方法。 （３１）アムフイレグリンをエンコードするヌクレオチ
    ド配列が、ヌクレオチド数１〜１２４３の第１６図に実
    質的に示されたヌクレオチド配列よりなる請求項３０記
    載の方法。（３２）遺伝子発現をコントロールする第二
    のヌクレオチド配列がＴａｃプロモーターよりなる請求
    項３０記載の方法。 （３３）（ａ）ＮＲＲＬに寄託されそして寄託番号を付
    されたプラスミドｐＴａｃＡＰＡＲ１により形質転換さ
    れたエシエリシア・コリ菌株ＪＭ１０９を培養し；そし
    て（ｂ）培養物からアムフイレグリンを回収することよ
    りなるアムフイレグリンを製造する方法。 （３４）（ａ）ＮＲＲＬに寄託されそして寄託番号を付
    されたプラスミドｐＴａｃＡＰＨＩＬＥにより形質転換
    されたエシエリシア・コリ菌株ＪＭ１０９を培養し；そ
    して（ｂ）培養物からアムフイレグリンを回収すること
    よりなるアムフイレグリンを製造する方法。（３５）細
    胞がアムフイレグリンを生成するように遺伝子発現を調
    節する第二のヌクレオチド配列のコントロールの下、ア
    ムフイレグリンをエンコードするヌクレオチド配列を含
    む遺伝子工学処理された細胞。 （３６）アムフイレグリンをエンコードするヌクレオチ
    ド配列が、ヌクレオチド数の第１６図に実質的に示され
    たヌクレオチド配列よりなる請求項３５記載の遺伝子工
    学処理された細胞。 （３７）エシエリシア・コリ細胞よりなる請求項３５記
    載の遺伝子工学処理された細胞。（３８）遺伝子発現を
    コントロールする第二のヌクレオチド配列がＴａｃプロ
    モーターよりなる請求項３５記載の遺伝子工学処理され
    た細胞。 （３９）ＮＲＲＬに寄託されそして寄託番号を付された
    プラスミドを有するエシエリシア・コリ細胞株中に含ま
    れるプラスミドｐＡＲ１。 （４０）ＮＲＲＬに寄託されそして寄託番号を付された
    プラスミドを有するエシエリシア・コリ細胞株中に含ま
    れるプラスミドｐＡＲＨ１２。 （４１）ＮＲＲＬに寄託されそして寄託番号を付された
    プラスミドを有するエシエリシア・コリ細胞株中に含ま
    れるプラスミドｐＡＲＨ６。 （４２）ＮＲＲＬに寄託されそして寄託番号を付された
    プラスミドを有するエシエリシア・コリ細胞株中に含ま
    れるプラミドｐＴａｃＡＰＡＲ１。 （４３）ＮＲＲＬに寄託されそして寄託番号を付された
    プラスミドを有するエシエリシア・コリ細胞株中に含ま
    れるプラスミドｐＴａｃＡＰＨＩＬＥ。 （４４）アムフイレグリンのエピトープを認識する抗体
    。 （４５）エピトープはアミノ酸配列 【遺伝子配列があります】 よりなる請求項４４記載の抗体。 （４６）エピトープはアミノ酸配列 【遺伝子配列があります】 よりなる請求項４４記載の抗体。 （４７）エピトープはアミノ酸配列 【遺伝子配列があります】 よりなる請求項４４記載の抗体。 （４８）エピトープはアミノ酸配列 【遺伝子配列があります】 よりなる請求項４４記載の抗体。 （４９）エピトープはアミノ酸配列 【遺伝子配列があります】 よりなる請求項４４記載の抗体。 （５０）第１７図に実質的に示されるヌクレオチド配列
    よりなるアムフイレグリン遺伝子をエンコードするゲノ
    ムヌクレオチド配列。
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