KR20200000438A - 골수이형성 증후군을 치료하기 위한 인슐린양 성장 인자-화학치료학적 접합체 - Google Patents

골수이형성 증후군을 치료하기 위한 인슐린양 성장 인자-화학치료학적 접합체 Download PDF

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아이쥐에프 온콜로지, 엘엘씨
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Abstract

765IGF-MTX 및 다른 IGF-수용체 표적화된 물질을 사용하여 골수이형성 증후군(MDS), 희소아구성 급성 골수성 백혈병(O-AML) 또는 만성 골수단핵구성 백혈병(CMML)을 치료하는 방법, 및 765IGF-MTX 및 다른 IGF-수용체 표적화된 물질을 환자에게 전달하기 위한 제제가 제공된다. MDS, O-AML 및 CMML을 치료하는 데 사용하기 위한 약제학적 조성물이 또한 제공된다.

Description

골수이형성 증후군을 치료하기 위한 인슐린양 성장 인자-화학치료학적 접합체
골수이형성 증후군(myelodysplastic syndrome: MDS)은 비효과적인 조혈작용, 골수 부전, 말초 혈액 혈구감소증 및 생존율 감소를 특징으로 하는 비정상 다능성 선구체 세포로부터 유래된 조혈 장애이다. 이것은 MDS의 하위유형으로서의 만성 골수단핵구성 백혈병(myelomonocytic leukemia: CMML)을 포함한다. 그리고 이것은 대개 희소아구성 급성 골수성 백혈병(oligoblastic acute myeloid leukemia: O-AML)으로 진행한다. MDS, CMML 및 O-AML은 골수증식성 장애의 유형으로 생각될 수 있다. CMML 및 O-AML은 MDS와 밀접히 관련된 MDS 질환의 하위유형으로 또한 생각될 수 있다[Schanz J, Tuchler H, Sole F, et al. New comprehensive cytogenetic scoring system for primary myelodysplastic syndromes (MDS) and oligoblastic acute myeloid leukemia after MDS derived from an international database merge. J Clin Oncol 2012; 30:820-829. J Clin Oncol 2012; 30:820-829. http://www.clevelandclinicmeded.com/medicalpubs/diseasemanagement/hematology-oncology/myelodysplastic-syndromes/].
오직 3개의 약물이 미국에서 MDS의 치료에 대해 허가되었다. 주요한 2개는 아자시티딘(5-AZA, VIDAZA) 및 데시타빈(DACOGEN)인 탈메틸화 물질이다. 이들 저메틸화제는 알려진 대로라면 종양 억제자 유전자를 재활성화함으로써 그리고 직접적인 세포독성 기전을 통해 일하고, 조혈 선구체 세포 분화를 유도할 수 있다. 더 높은 위험의 환자에서의 최근의 III상 실험에서, 환자의 대략 50%에서 반응은 발생했고, 생존율은 최고의 보조적인 관리 또는 화학요법을 포함하여 관습적인 관리에 의해 치료된 환자와 비교하여 아자시티딘을 받는 환자에서 추적관찰의 2년에 배가되었다. 데시타빈은 다기관 III상 연구에서 조사되었고, 여기서 완전 및 부분 관해 비율이 17%로 환자의 30%에서 반응은 달성되었지만, 전체 생존 이점은 최고의 보조적인 관리와 비교되어 입증되지 않았다. 탈리도마이드와 관련된 레날리도마이드(REVLIMID)는 또한 MDS에 대해 허가되고, MDS의 모든 유형이 아니라 몇몇에서 효율을 나타냈다.
DNA 복제와 약간의 방식으로 간섭하는 표준 화학요법 약물은 혈액 세포수를 감소(혈구감소증을 야기)시키므로 MDS에서 일반적으로 사용되지 않고, MDS 환자는 이의 질환의 결과로서 혈구감소증을 이미 갖고, 혈액 세포수의 추가의 감소를 견딜 수 없다. 레날리도마이드는 또한 혈구감소증을 야기하는 부작용을 가져서, MDS에서의 이의 이용성이 제한된다.
MDS, O-AML 및 CMML에 대한 기존의 약물은 불충분하게 효과적이다.
MDS에 의한 진단 시 기대 수명은 약 24개월의 중앙치로 4개월 내지 85개월에 있다[Bennett JM, Catovsky D, Daniel MT, et al. Proposals for the classification of the myelodysplastic syndromes. Br J Haematol 1982; 51:189-199. http://www.clevelandclinicmeded.com/medicalpubs/diseasemanagement/hematology-oncology/myelodysplastic-syndromes/]. MDS, O-AML 및 CMML에 대한 새로운 약물 및 치료가 필요하다.
본 발명자들은 여기서 메토트렉세이트(MTX)에 공유 부착된 인슐린양 성장 인자-1(insulin like growth factor-1: IGF-1 또는 IGF), 또는 IGF의 변이체, 예컨대, 765IGF의 접합체(IGF-MTX)를 기재한다. 메토트렉세이트와 같은 접합체는 시험관내 암 세포에 세포독성이다. MTX와 같은 IGF-MTX 접합체는 다이하이드로폴레이트 환원효소를 저해한다. IGF-MTX 접합체는 시험관내 유리 MTX보다 암 세포의 성장을 저해하기 위해 더 높은 IC50(50% 저해제 농도)을 갖는다. 그러나 이것은 마우스 모델에서 생체내 종양 성장을 저해하는 데 MTX보다 6배 초과 더 효과적이다. 즉, IGF-MTX는 1㎏당 투약된 MTX기의 몰의 면에서 6배 더 낮은 용량에서도 MTX보다 더 효과적이다.
본 발명자들은 인간 임상 실험에서 765IGF-MTX가 1㎏당 0.2 마이크로Eq의 놀랍게도 낮은 용량에서 몇몇 고형 종양 환자에서 종양 성장을 지연시키는 데 있어서 효과적이라는 것을 이제 보여준다. 1명의 재발성 호지킨 림프종 환자는 0.2 마이크로Eq/㎏의 765IGF-MTX에 의한 주마다의 치료 후 암이 없는 것으로 또한 발견되었다. 0.8 마이크로Eq/㎏ 이하에서 이 임상 실험에서 인간에서 용량 제한 독성을 보이지 않았다. 0.8 마이크로Eq/㎏의 시험된 가장 높은 용량을 포함하여 임의의 용량에서 혈구감소증이 결코 보이지 않았다. 반대로, 혈구감소증은 메토트렉세이트에 의한 치료에 의해 보편적이고, 아마도 메토트렉세이트에 의해 보이는 가장 심각한 흔한 부작용이다.
개에서의 5주 반복 용량 연구에서, 0.5, 2.0 및 4.0 마이크로Eq/㎏의 765IGF-MTX의 주마다의 투약에 의해, 정상 범위 아래의 수준까지 아니지만 적혈구 덩어리의 약간의 감소가 보였지만, 림프구 또는 호중구의 감소는 보이지 않았다. 0.5, 5 또는 8 마이크로Eq/㎏에서의 6주 동안 주마다 투약된 래트에서의 반복 용량 연구에서, 0.5 마이크로Eq/㎏에서 혈구감소증이 보이지 않았고, 5 마이크로Eq/㎏에서 적혈구 덩어리 및 백혈구의 오직 미미한 감소가 있었고, 이는 3주 회복 기간 후 정상으로 되돌아갔다.
혈구감소증이 이 질환의 결과이므로, 인간 및 동물 독성학 연구에서의 IGF-MTX에 의한 혈구감소증의 결여는 백혈병, 특히 급성 골수성 백혈병(AML)을 포함하는 골수성 백혈병을 치료하는 데 IGF-MTX가 매력적이게 만든다. 인간 및 동물 독성학에서의 IGF-MTX에 의한 혈구감소증의 결여는, 골수에서의 골수성 클론의 성장을 특징으로 하고, 다른 혈액 세포의 생성을 몰아내서 강한 혈구감소증을 발생시키는, 골수이형성 증후군(MDS)(밀접히 관련된 질환 희소아구성 급성 골수성 백혈병(O-AML) 및 만성 골수단핵구성 백혈병(CMML) 포함)을 치료하는 데 이것이 특히 매력적이게 만든다. 환자는 수혈에 의존하게 된다.
본 발명자들은 여기서 MDS 세포주 및 3개의 AML 세포주가 모두, 생체내 IGF-MTX에 또한 민감한, MCF7과 거의 동일한 농도에서 시험관내 765IGF-MTX에 민감하다는 것을 보여준다. 본 발명자들은 또한 MDS 세포주가 MCF7과 유사한 높은 수준에서 1형 IGF 막 수용체(IGF-1R)를 발현한다는 것을 보여준다. 이는 인간에서의 MDS가 IGF-MTX에 민감할 것이고, MDS 환자가 효과적이지만 혈구감소증을 야기하지 않는 용량에서 IGF-MTX에 의해 치료될 수 있다는 것을 제안한다.
따라서, 본 발명의 일 실시형태는, 항암 화학요법 약물에 접합된 인슐린양 성장 인자 1형 수용체(IGF-1R) 리간드를 포함하는 물질을 O-AML, MDS 또는 CMML에 대한 치료의 인식된 필요의 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 희소아구성 급성 골수성 백혈병(O-AML) 또는 골수이형성 증후군(MDS) 또는 만성 골수단핵구성 백혈병(CMML)에 대해 환자를 치료하는 방법을 제공한다. O-AML 및 MDS는 MDS와 매우 유사한 질환으로 인식된다.
또 다른 실시형태는, (a) 저메틸화제(예를 들어, 아자시티딘 또는 데시타빈) 및 (b) 메토트렉세이트에 접합된 인슐린양 성장 인자 1형 수용체(IGF-1R) 리간드를 포함하는 물질(여기서, IGF-1R 리간드는 인슐린양 성장 인자 1(IGF-1) 또는 이의 변이체 또는 인슐린임)을 AML, CML, O-AML, CMML 또는 MDS에 대한 치료의 인식된 필요의 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 급성 골수성 백혈병(AML), 만성 골수성 백혈병(CML), O-AML, CMML 또는 MDS에 대해 환자를 치료하는 방법을 제공한다.
765IGF-MTX, 인슐린-MTX 및 긴-R3IGF-MTX가 각각 포스페이트 완충 식염수, 또는 염, 예를 들어, 약 50mM 초과의 NaCl을 함유하는 임의의 천연 pH 용액 중에 낮은 용해도를 갖는 경향이 있다고 발견되었다. 따라서, 765IGF-MTX는 10mM HCl 중에 4 mEq/ℓ 용액으로서 현재 저장된다. 환자에 대한 점적주사을 위해, 이것은 물 중의 250㎖의 5% 덱스트로스 또는 10% 덱스트로스로 희석된다. IGF-MTX는 저혈당증을 야기하여서, 5% 덱스트로스 중의 점적주사가 예상된 경증 저혈당증에 대응하도록 덱스트로스를 투여하는 것의 이익을 가지면서 이것을 전달한다. 그리고 765IGF-MTX는 임의의 농도의 덱스트로스에 의해 물 중에 완전히 가용성인 한편, 이것은 중성 pH에서 약 150mM NaCl에서 침전하는 경향이 있다.
따라서, 본 발명의 또 다른 실시형태는 (b) 물 중의 100㎖ 내지 1리터의 5% 내지 10%(w/v) 덱스트로스의 중에 용해된 (a) 메토트렉세이트에 공유 접합된 IGF-1R 리간드인 공유 접합체(여기서, IGF-1R 리간드는 인슐린양 성장 인자 1(IGF-1) 또는 이의 변이체 또는 인슐린임)로 이루어진 물질을 포함하는 점적주사용 용액인 약제학적 조성물을 제공하고, 여기서 조성물은 5mM 초과의 NaCl 또는 2mM 초과의 포스페이트를 포함하지 않고; 용액은 점적주사 백에 있고, 100㎖ 내지 1리터의 용적을 갖는다.
또 다른 실시형태는 메토트렉세이트에 공유 접합된 IGF-1R 리간드인 공유 접합체로 이루어진 물질을 투여하는 방법(여기서, IGF-1R 리간드는 인슐린양 성장 인자 1(IGF-1) 또는 이의 변이체 또는 인슐린임)을 제공하고; 상기 방법은 물질을 물 중에 본질적으로 100㎖ 내지 1리터의 5% 내지 10% 덱스트로스(w/v)의 용적으로 이루어진 희석제로 희석하여서 희석제 중의 물질의 용액을 제조하는 단계; 및 용액을 환자에 점적주사하는 단계를 포함한다. 바람직하게는, 점적주사는 30분 내지 2시간의 시간에 걸쳐 발생한다.
또 다른 실시형태는, 희소아구성 급성 골수성 백혈병(O-AML) 또는 골수이형성 증후군(MDS) 또는 만성 골수단핵구성 백혈병(CMML)을 치료하는 방법에서 사용하기 위한, 항암 화학요법 약물에 접합된 인슐린양 성장 인자 1형 수용체(IGF-1R) 리간드를 포함하는 물질을 포함하는 조성물을 제공한다.
또 다른 실시형태는 (b) 5% 또는 10%(w/v) 덱스트로스의 용액에 의해 충전되고, 용액 중에 (c) 메토트렉세이트에 공유 접합된 IGF-1R 리간드인 공유 접합체(여기서, IGF-1R 리간드는 인슐린양 성장 인자 1(IGF-1) 또는 이의 변이체 또는 인슐린임)로 이루어진 물질이 용해된(용액은 100㎖ 내지 1리터(더 바람직하게는 100㎖ 내지 500㎖, 150㎖ 내지 500㎖, 또는 약 250㎖)의 용적을 가짐), (a) 100㎖ 내지 2리터의 최대 용적을 보유할 수 있는 점적주사 백을 포함하는 장치를 제공한다.
도 1. I-125 표지된 IGF1에 대한 MCF7 세포에서 IGF1R에 대한 765IGF 및 긴-R3-IGF의 경쟁 결합 검정.
도 2. I-125 표지된 IGF1에 대한 MCF7 세포에서 IGF1R에 대한 765IGF의 경쟁 결합 검정.
도 3은 성장 저해에 대한 765IGF-MTX의 IC50을 경정하기 위해 사용된 765IGF-MTX에 의한 MCF7 세포 성장 저해의 선도이다.
도 4는 765IGF-MTX에 의한 다이하이드로폴레이트 환원효소(DHFR)의 저해에 대한 검정의 결과를 보여준다.
도 5. I-125 표지된 IGF1에 대한 MCF7 세포에서 IGF1R에 대한 765IGF-MTX의 경쟁 결합 검정.
도 6. 765IGF-MTX에 의한 MDS-L 세포 성장 저해의 선도이다.
도 7. MCF7(왼쪽 2개의 염색 레인) 및 MDS-L(오른쪽 염색 레인)의 웨스턴 블롯.
도 8. 765IGF-MTX에 의한 MCF7 세포의 증식의 저해.
도 9. nu/nu 마우스에서의 MCF7 종양의 IGF-MTX 및 유리 MTX에 의한 생체내 종양 성장 저해.
도 10. nu/nu 마우스에서의 MCF7-L 종양의 IGF-MTX 및 유리 MTX에 의한 생체내 종양 성장 저해.
도 11. nu/nu 마우스에서의 LNCaP 종양의 IGF-MTX 및 유리 MTX에 의한 생체내 종양 성장 저해.
도 12. 건강한 지원자로부터의 용혈된 혈액의 유세포분석법(CD34 및 IGF1R(CD221)을 검출함).
도 13. MDS-L 세포 1㎖당 10㎕의 100만 개와 혼합된 건강한 지원자로부터의 용혈된 혈액(100㎕)의 유세포분석법(CD34 및 IGF1R(CD221)을 검출함).
도 14. MDS-L 세포(100만 개/㎖)의 유세포분석법(CD34 및 IGF1R(CD221)을 검출함).
정의:
용어 "항암 화학요법 약물 또는 물질"은 효소가 아니고, 비암성 세포에 덜한 효과를 가지면서 암 세포를 사멸하거나 암 세포의 성장을 저해하는 합성, 생물학적 또는 반합성 화합물을 의미한다. 이것은 포유류에 의해 천연 제조된 항체 또는 분자, 예컨대, 성장 인자 및 사이토카인을 포함하지 않는다.
용어 "암을 치료하는"은, 예를 들어, 전이의 방지, 암의 성장의 저해, 암의 성장의 중단 또는 암의 세포의 사멸을 포함한다.
특정한 수용체에 대한 리간드의 용어 "결합 친화도"는 결합 상수 KA(해리 상수 KD의 역수) 또는 이의 실험적으로 결정된 근사치를 의미한다.
용어 "항대사물질"은 천연 발생 물질과 구조적 유사성을 보유하고, 저해제 또는 기질로서 효소와 상호작용하고, 세포 과정을 방해하는 항암 화학요법 물질을 의미한다. 예는 메토트렉세이트, 플루오로우라실, 플록수리딘, 플루다라빈, 머캅토퓨린, 티오구아닌, 사이타라빈, 아자시티딘, 클라드리빈 및 펜토스타틴을 포함한다.
"IGF-1 수용체"는 1형 IGF 수용체로서 문헌에 또한 공지되어 있고, 본 명세서에서 IGF-1R이라 축약된다.
본 명세서에 사용된 바대로 "함유하는"은 개방 말단이고; 즉, 이것은 다른 명명되지 않은 부재의 포함을 허용하고, "포함하는"과 동일한 의미를 갖는다.
본 명세서에 사용된 바대로 용어 "리더 서열"은 단백질의 N 말단에서의 아미노산 서열을 의미한다. 이것은 단백질의 합성 후 절단되지 않고, 성숙 단백질의 일부이다.
설명:
본 발명의 일 실시형태는, 항암 화학요법 약물에 접합된 인슐린양 성장 인자 1형 수용체(IGF-1R) 리간드를 포함하는 물질을 O-AML, MDS 또는 CMML에 대한 치료의 인식된 필요의 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 희소아구성 급성 골수성 백혈병(O-AML) 또는 골수이형성 증후군(MDS) 또는 만성 골수단핵구성 백혈병(CMML)에 대해 환자를 치료하는 방법을 제공한다. O-AML 및 CMML은 MDS와 매우 유사한 질환으로서 인식된다.
또 다른 실시형태는, (a) 저메틸화제(예를 들어, 아자시티딘 또는 데시타빈) 및 (b) 메토트렉세이트에 접합된 인슐린양 성장 인자 1형 수용체(IGF-1R) 리간드를 포함하는 물질(여기서, IGF-1R 리간드는 인슐린양 성장 인자 1(IGF-1) 또는 이의 변이체 또는 인슐린임)을 AML, CML, O-AML, CMML 또는 MDS에 대한 치료의 인식된 필요의 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 급성 골수성 백혈병(AML) 또는 만성 골수성 백혈병(CML) 또는 O-AML 또는 CMML 또는 MDS에 대해 환자를 치료하는 방법을 제공한다. 통상적으로, 저메틸화제 및 메토트렉세이트에 접합된 IGF-1R 리간드를 포함하는 물질은 동일자에 투여된다.
765IGF-MTX, 인슐린-MTX 및 긴-R3IGF-MTX가 각각 포스페이트 완충 식염수, 또는 염, 예를 들어, 약 50mM 초과의 NaCl을 함유하는 임의의 천연 pH 용액 중에 낮은 용해도를 갖는 경향이 있다고 발견되었다. 따라서, 765IGF-MTX는 10mM HCl 중에 4 mEq/ℓ 용액으로서 현재 저장된다. 환자에 대한 점적주사을 위해, 이것은 물 중의 250㎖의 5% 덱스트로스 또는 10% 덱스트로스로 희석된다. IGF-MTX는 저혈당증을 야기하여서, 5% 덱스트로스 중의 점적주사가 예상된 경증 저혈당증에 대응하도록 덱스트로스를 투여하는 것의 이익을 가지면서 이것을 전달한다. 그리고 765IGF-MTX는 임의의 농도의 덱스트로스에 의해 물 중에 완전히 가용성인 한편, 이것은 중성 pH에서 약 150mM NaCl에서 침전하는 경향이 있다.
따라서, 본 발명의 또 다른 실시형태는 (b) 물 중의 100㎖ 내지 1리터의 5% 내지 10%(w/v) 덱스트로스의 중에 용해된 (a) 메토트렉세이트에 공유 접합된 IGF-1R 리간드인 공유 접합체(여기서, IGF-1R 리간드는 인슐린양 성장 인자 1(IGF-1) 또는 이의 변이체 또는 인슐린임)로 이루어진 물질을 포함하는 점적주사용 용액인 약제학적 조성물을 제공하고, 여기서 조성물은 5mM 초과의 NaCl 또는 2mM 초과의 포스페이트를 포함하지 않고; 용액은 점적주사 백에 있고, 100㎖ 내지 1리터의 용적을 갖는다.
또 다른 실시형태는 메토트렉세이트에 공유 접합된 IGF-1R 리간드인 공유 접합체로 이루어진 물질을 투여하는 방법(여기서, IGF-1R 리간드는 인슐린양 성장 인자 1(IGF-1) 또는 이의 변이체 또는 인슐린임)을 제공하고; 상기 방법은 물질을 물 중에 본질적으로 100㎖ 내지 1리터의 5% 내지 10% 덱스트로스(w/v)의 용적으로 이루어진 희석제로 희석하여서 희석제 중의 물질의 용액을 제조하는 단계; 및 용액을 환자에 점적주사하는 단계를 포함한다. 바람직하게는, 점적주사는 30분 내지 2시간의 시간에 걸쳐 발생한다.
IGF-1R 리간드는 IGF-1R에 특이적으로 결합하는 항체일 수 있다. 다른 실시형태에서, 이것은 인슐린 또는 IGF-1(서열 번호 3) 또는 IGF-1의 변이체이다. 바람직한 구체적인 변이체는 765IGF(서열 번호 2)이다.
구체적인 실시형태에서, 항암 화학요법 약물은 메토트렉세이트, 클로르암부실 또는 벤다무스틴이다. 구체적인 실시형태에서, 이것은 메토트렉세이트이다.
구체적인 실시형태에서, 화학요법 약물은 단백질 또는 펩타이드가 아니고 유리 카복실기를 함유하는 소분자(2000달톤보다 적은 분자량)이다. 이것은 카복실을 단백질의 아미노기에 접합시키도록 EDC와의 반응에 의해 단백질 IGF-1R 리간드에 접합될 수 있다.
본 명세서에 기재된 환자를 치료하는 방법의 구체적인 실시형태는 환자 체중 1㎏당 0.1 내지 2.5 마이크로Eq의 용량으로 메토트렉세이트에 접합된 IGF-1R 리간드, 바람직하게는 765IGF-MTX의 투여를 수반한다. 다른 실시형태에서, 용량은 0.2 내지 2.5, 0.4 내지 2.5, 또는 0.4 내지 1.6, 약 0.2, 약 0.4, 약 0.8, 또는 약 1.6, 또는 약 2.5 마이크로Eq/㎏이다. 투약은 바람직하게는 1주 1회이지만, 1주 2회 또는 2주마다 1회 또는 3주마다 1회일 수 있다. 일 실시형태에서, 투약은 28일 사이클에서 3주 동안 1주 1회, 이어서 1주 휴약이다. 투약은 바람직하게는 정맥내 점적주사에 의한다. 일 실시형태에서, 접합체(항암 화학요법 약물에 접합된 IGF-1R 리간드)는 100㎖ 내지 1리터(더 바람직하게는 약 200㎖ 내지 약 500㎖, 및 다른 실시형태에서 100 내지 500㎖, 150 내지 500㎖, 200 내지 500㎖, 또는 약 250㎖, 또는 약 500㎖)의 용적으로 5% 내지 10% 덱스트로스 중에 정맥내 점적주사에 의해 투여된다.
IGF-1R 리간드는 몇몇 실시형태에서 화학요법 약물에 공유 부착된다. 다른 실시형태에서, 이것은, ABRAXANE이 알부민과 연관된 파클리탁셀의 나노입자인 방식과 유사하게, 예를 들어, 나노입자에서 화학요법 약물 및 IGF-1R 리간드를 함께 임베딩함으로써 비공유 부착에 의해 접합될 수 있다.
구체적인 실시형태에서, IGF-1R 리간드는 인슐린양 성장 인자-1(IGF-1), 또는 이의 변이체, 또는 인슐린이다. IGF-1의 변이체는 바람직하게는 네이티브 IGF-1과 비교하여 가용성 IGF 결합 단백질에 대한 감소된 결합 친화도를 갖는다. 가용성 IGF 결합 단백질은, IGF-1이 이의 생물학적 작용을 발휘하는 막 단백질인 IGF-1R 막 수용체와 반대로, IGF-1에 결합하는 혈액 중의 가용성 단백질이다. 생체내 99%만큼 많은 IGF-1은 가용성 IGF 결합 단백질에 결합되고, 이것이 가용성 IGF 결합 단백질에 결합될 때 이것은 IGF-1R에 대한 결합에 이용 가능하지 않다. 하기에 가용성 IGF 결합 단백질에 대한 감소된 결합 친화도를 갖는 IGF-1의 구체적인 변이체, 및 가용성 IGF 결합 단백질에 대한 결합 친화도를 결정하기 위한 검정은 기재되어 있다.
본 발명자들은 이. 콜라이에서, T7 촉진자에 의해 제어되고 IPTG에 의해 유도된 발현을 갖는 재조합 벡터로부터, 서열 번호 2의 서열을 갖는 융합 단백질을 발현하였다. 이 단백질은 정제를 위해 폴리his 태그를 제공하는 서열 번호 1의 이의 N 말단에서의 서열 및 몇몇 추가적인 라이신 잔기를 갖는다. 단백질의 C 말단은 19번 내지 88번 잔기이고, 야생형 IGF-1(서열 번호 3)의 3번 위치에서의 네이티브 글루탐산을 대체하는 서열 번호 2의 21번 위치에서의 아르기닌을 갖는 인간 야생형 IGF-1 서열인 R3-IGF에 상응한다.
R3-IGF(서열 번호 6)는 하기 기재된 바와 같은 변이체 IGF-1이다.
N 말단 서열로서 서열 번호 1을 포함하는 765IGF(서열 번호 2), 이어서 상이한 리더 서열을 포함하는 다른 IGF 융합 단백질 작제물보다 높은 수율로 발현되고 더 높은 수율로 정제되는 R3-IGF. 이것은 IGF132, 또 IGF-1의 다른 변이체보다 저장에 더 안정하였다. 이것은 또한 활성 형태의 거의 100% 수율로 재폴딩하고, 이것은 IGF-1의 또 다른 변이체인 긴-R3-IGF보다 MCF7 세포에 대한 이의 수용체로부터 더 많은 야생형 IGF-1을 대체하였다.
서열 번호 1 리더는 또한 5개의 라이신 잔기를 제공한다. 765IGF-메토트렉세이트 접합체는 765IGF에서 메토트렉세이트를 아마이드 결합에 의해 이의 카복실기 중 1개를 통해 아미노기에 공유 부착함으로써 제조되었다. 765IGF는 8개의 라이신 측쇄를 포함하는 9개의 아미노기(서열 번호 1 리더에서 이들의 5개) 및 아미노 말단 알파-아미노기를 갖는다. 765IGF-MTX는 IGF 단량체마다 약 8개의 메토트렉세이트기의 평균을 가졌다. 긴-R3-IGF 및 IGF132에 대한 접합체는 IGF 단량체마다 더 적은 메토트렉세이트기를 가졌다. 그래서 이것은 서열 번호 1 리더의 또 다른 이점이었다.
R3-IGF는 서열 번호 2에서 서열 번호 1과의 융합 단백질에서의 변이체 IGF-1이다. 이것은 (야생형 IGF-1과 비교하여) 가용성 IGF 결합 단백질에 대해 감소된 결합 친화도를 갖는 IGF 수용체(IGF-1R)를 활성화하는 변이체이다(Francis, G.L., et al.1992, J. Mol. Endocrinol. 8:213-223; Tomas, F.M. et al., 1993, J. Endocrinol. 137:413-421). 가용성 IGF 결합 단백질은 IGF-1에 결합하여서, 이것을 순환에 유지시키고 이의 생물학적 반감기를 연장하는 천연 혈청 단백질이다. 그러나 IGF-1이 IGF 결합 단백질에 결합될 때 이것은 막 IGF 수용체(IGF-1R)에 결합할 수 없다. (Clemons, D.R., 1998, Mol. Cell. Endocrinol. 140:19-24.) 이 이유로, 가용성 IGF 결합 단백질에 대한 감소된 결합을 갖는 IGF-1의 변이체는 생체내 야생형 IGF-1보다 더 활성이고, IGF 수용체를 더 신속히 표적화한다.
IGF 결합 단백질에 대한 결합 친화도는 래트 L6-근원세포 순화 배지에 의해 시험된다. 래트 L6 근원세포의 성장으로부터의 배지(0.2㎖)는 0.1nM 내지 1μM 최종 농도로 50mM 인산나트륨, pH 6.5, 0.25% 소 알부민 및 시험 경쟁물질(야생형 IGF-1 또는 IGF 변이체)의 0.3㎖ 최종 용적에서 8,000 cpm 125I-IGF-1(대략 0.05 uCi)과 혼합된다. 실온에서 90분 항온처리 후, 결합된 및 유리 트레이서를 분리시키기 위해 0.2㎎/㎖의 프로타민 설페이트를 함유하는 검정 완충제 중의 5mg/㎖에서의 챠콜의 아주 차가운 신속히 교반된 현탁액을 샘플에 첨가하고, 얼음에서 8분 후, 혼합물을 5,000 x g에서 20분 원심분리한다. 상청액 중의 방사능은 감마 카운터에서 계수된다. 변이체의 결합 친화도는 변이체가 가용성 IGF 결합 단백질에 대한 감소된 결합 친화도를 갖는지를 결정하기 위해 야생형 IGF의 것과 비교될 수 있다.
가용성 IGF 결합 단백질에 대한 감소된 결합 친화도를 갖는 IGF-1의 몇몇 구체적인 변이체는 (미국 특허 제4,876,242호에 개시된) IGF132(서열 번호 4), 긴-R3-IGF(서열 번호 5), R3-IGF(서열 번호 6) 및 야생형 IGF-1의 처음의 3개의 잔기가 결여된 des(1-3)IGF1(서열 번호 7)를 포함한다. (긴-R3-IGF, R3-IGF 및 des(1-3)IGF1은 문헌[Francis, G.L., et al.1992, J. Mol . Endocrinol. 8:213-223; Tomas, F.M. et al., 1993, J. Endocrinol . 137:413-421]에 기재되어 있다). 따라서, 특정한 실시형태에서, 가용성 IGF-1 결합 단백질에 감소된 결합을 갖는 변이체 IGF-1인 폴리펩타이드는 서열 번호 4 내지 7 중 임의의 하나를 포함한다.
IGF 수용체는 (b) 본 명세서에 기재된 IGF 수용체 리간드, 예컨대, IGF-1 또는 IGF 변이체에 공유 커플링된 (a) 항암 화학요법 물질을 포함하는 접합체에 의해 암에서 표적화될 수 있다. 인슐린이 IGF-1R에 대한 친화도를 가지므로, IGF-1R 리간드는 또한 인슐린일 수 있다.
바람직하게는, 가용성 IGF-1 결합 단백질에 대한 감소된 친화도를 갖는 IGF-1 수용체 리간드는 야생형 IGF-1보다 가용성 IGF-1 결합 단백질에 대해 적어도 5배, 더 바람직하게는 적어도 10배, 더 바람직하게는 더욱 적어도 100배 더 낮은 결합 친화도를 갖는다. 가용성 IGF-1 결합 단백질에 대한 결합 친화도는 문헌[Francis, G.L., et al. (1992, J. Mol. Endocrinol. 8:213-223); Szabo, L. et al. (1988, Biochem . Biophys . Res. Commun. 151:207-214); 및 Martin, J.L. et al. (1986, J. Biol . Chem. 261:8754-8760)]에 기재된 바대로 정제된 IGF-1 결합 단백질 또는 래트 L6 근원세포 순화 배지의 혼합물(IGF-1 결합 단백질의 천연 생성된 혼합물)을 사용하여 표지된 IGF-1(예를 들어, 125I IGF-1)에 대해 경쟁 결합 검정에 의해 측정될 수 있다. 바람직하게는, 변이체 IGF-1은 10nM 초과, 더 바람직하게는 100nM 초과의 L6 근원세포 순화 배지에서 가용성 IGF-1 결합 단백질에 대한 결합에 대해 표지된 야생형 IGF-1에 대해 경쟁 결합 검정에서 IC50을 갖는다.
바람직하게는, IGF-1R 리간드, 예컨대, 가용성 IGF-1 결합 단백질에 대한 감소된 친화도를 갖는 변이체 IGF-1 변이체는 야생형 IGF-1에 가까운 IGF-1 수용체에 대한 친화도(예를 들어, 야생형 IGF-1보다 30배 적게 큰, 더 바람직하게는 야생형 IGF-1보다 10배 적게 큰)를 갖는다. 구체적인 실시형태에서, 변이체 IGF-1은 (예를 들어, MCF-7 세포에서) 50nM 미만, 더 바람직하게는 10nM 미만, 더 바람직하게는 더욱 5nM 미만, 더 바람직하게는 더욱 3nM 미만의 IGF-1 수용체에 대한 결합에 대해 표지된 야생형 IGF-1에 대해 경쟁 결합 검정에서 KD를 갖는다. 이 검정은 문헌[Ross, M. et al. (1989, Biochem . J. 258:267-272) and Francis, G.L., et al. (1992, J. Mol. Endocrinol. 8:213-223)], 및 본 명세서에서 실시예 4에 기재되어 있다.
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본 발명의 구체적인 실시형태에서, IGF-1 변이체는 IGF-1(서열 번호 3)을 포함하거나, 서열 번호 3 및 4 중 어느 하나와 적어도 90% 동일한 분절을 포함한다.
구체적인 실시형태에서, 항암 화학요법 약물은 유리 카복실기를 갖는 것, 예컨대, 메토트렉세이트, 클로르암부실 또는 벤다무스틴일 수 있다.
특정한 실시형태에서, IGF-1R 리간드에 접합된 화학요법 물질은 메클로르에타민, 사이클로포스파미드, 이포스파미드, 멜팔란, 클로르암부실, 티오테파, 헥사메틸멜라민, 부술판, 카르무스틴, 로무스틴, 세무스틴, 스트렙토조신, 데카르바진, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 에토포사이드, 테니포사이드, 파클리탁셀, 도세탁셀, 다우노루비신, 이다루비신, 독소루비신, 에피루비신, 닥티노마이신, 플리카마이신, 미토마이신 C, 블레오마이신, 미톡산트론, 메토트렉세이트, 플루오로우라실, 플록수리딘, 플루다라빈, 머캅토퓨린, 티오구아닌, 사이타라빈, 아자시티딘, 클라드리빈, 펜토스타틴, 시스플라틴, 카보플라틴, 미토탄, 프로카바진 또는 암사크린이다.
상기 방법의 구체적인 실시형태에서, IGF-1R 리간드는 IGF-1(서열 번호 3)이 아니고, 765IGF(서열 번호 2), IGF132(서열 번호 4), 긴-R3-IGF(서열 번호 5), R3-IGF(서열 번호 6) 또는 des(1-3)IGF1(서열 번호 7), 또는 IGF-1과 적어도 90% 동일한 변이체이거나 이를 포함한다.
다른 실시형태에서, IGF-1R 리간드는 IGF-1R에 대한 항체이다.
IGF-1R 리간드가 메토트렉세이트에 접합된 구체적인 실시형태에서, 상기 방법은 0.1 내지 2.5 마이크로Eq/㎏, 0.1 내지 2.5, 0.4 내지 2.5, 0.4 내지 1.6, 약 0.2, 약 0.4, 약 0.8, 약 1.6 또는 약 2.5 마이크로Eq/㎏의 용량으로 환자에게 물질을 투약하는 것을 포함한다. 마이크로Eq는 (리간드에 접합된) 메토트렉세이트기의 마이크로몰이다.
저메틸화제를 투여하는 단계를 포함하는 방법에서, 저메틸화제는 바람직하게는 아자시티딘 또는 데시타빈, 더 바람직하게는 아자시티딘이다.
일 실시형태는 (b) 물 중의 100㎖ 내지 1 리터의 5% 내지 10%(w/v) 덱스트로스 중에 용해된 (a) 메토트렉세이트에 공유 접합된 IGF-1R 리간드인 공유 접합체로 이루어진 물질(여기서, IGF-1R 리간드는 인슐린양 성장 인자 1(IGF-1) 또는 이의 변이체 또는 인슐린임)을 포함하는 점적주사용 용액인 약제학적 조성물을 제공하고, 여기서 용액은 5mM 초과의 NaCl 또는 2mM 초과의 포스페이트를 포함하지 않고; 용액은 점적주사 백에 있고, 100㎖ 내지 1리터의 용적을 갖는다.
더 구체적인 실시형태에서, 용액은 100㎖ 내지 500㎖, 150㎖ 내지 500㎖, 200㎖ 내지 500㎖, 또는 약 250㎖, 또는 약 500㎖의 용적을 갖는다.
구체적인 실시형태에서, 물질은 765IGF-MTX이다.
더 구체적인 실시형태에서, 조성물은 1mM 미만의 NaCl 및 1mM 미만의 포스페이트를 포함한다.
또 다른 실시형태는 메토트렉세이트에 공유 접합된 IGF-1R 리간드인 공유 접합체로 이루어진 물질을 투여하는 방법을 제공하고, 여기서 IGF-1R 리간드는 인슐린양 성장 인자 1(IGF-1) 또는 이의 변이체 또는 인슐린이고; 상기 방법은 물질을 물 중에 본질적으로 100㎖ 내지 1리터의 5% 내지 10% 덱스트로스(w/v)의 용적으로 이루어진 희석제로 희석하여서 희석제 중의 물질의 용액을 제조하는 단계; 및 용액을 환자에 점적주사하는 단계를 포함한다.
구체적인 실시형태에서, 용액을 환자에 점적주사하는 단계는 20분 내지 2.5시간의 시간에 걸쳐, 또는 30분 내지 2시간에 걸쳐, 또는 45분 내지 1.5시간에 걸쳐, 또는 1 내지 2시간에 걸쳐 발생한다.
또 다른 실시형태는, 희소아구성 급성 골수성 백혈병(O-AML) 또는 골수이형성 증후군(MDS) 또는 만성 골수단핵구성 백혈병(CMML) 또는 급성 골수성 백혈병(AML) 또는 만성 골수성 백혈병(CML)을 치료하는 방법에서 사용하기 위한, 항암 화학요법 약물에 접합된 인슐린양 성장 인자 1형 수용체(IGF-1R) 리간드를 포함하는 물질을 포함하는 조성물을 제공한다.
또 다른 실시형태는 (b) 5% 또는 10%(w/v) 덱스트로스의 용액에 의해 충전되고, 용액 중에 (c) 메토트렉세이트에 공유 접합된 IGF-1R 리간드인 공유 접합체(여기서, IGF-1R 리간드는 인슐린양 성장 인자 1(IGF-1) 또는 이의 변이체 또는 인슐린임)로 이루어진 물질이 용해된(용액은 100㎖ 내지 1리터(더 바람직하게는 100㎖ 내지 500㎖, 150㎖ 내지 500㎖, 또는 약 250㎖)의 용적을 가짐), (a) 100㎖ 내지 2리터의 최대 용적을 보유할 수 있는 점적주사 백을 포함하는 장치를 제공한다.
장치는 (d) 점적주사 백에 연결된 배관, 및 (e) 배관에 연결된 피하 주사를 더 포함할 수 있다.
일 실시형태에서, 물질은 765IGF-MTX이다.
장치의 일 실시형태에서, 용액은 적어도 10 마이크로Eq의 물질 및 250 마이크로Eq 이하의 물질을 포함한다.
장치의 구체적인 실시형태에서, 용액은 5mM 이하의 NaCl(바람직하게는 1mM 이하의 NaCl) 및 2mM 이하의 포스페이트(바람직하게는 1mM 이하의 포스페이트)를 포함한다.
장치의 구체적인 실시형태에서, 용액은 5mM 이하의 NaCl(바람직하게는 1mM 이하의 NaCl, 더 바람직하게는 0의 NaCl)을 포함한다.
항암 화학요법 물질을 수용체 리간드에 커플링하기 위한 가이드라인
인슐린 및 IGF-1 수용체에 대한 천연 리간드는 단백질, 즉 인슐린, IGF-1 및 IGF-2이다. 화학요법 물질은 통상적으로 단백질에 존재하는 반응성 기를 통해 단백질에 커플링된다. 이것은 N 말단 알파-아미노기, C 말단 알파-카복실기, 라이신의 측쇄 아미노기, 아스파르트산 및 글루탐산의 측쇄 카복실기, 시스테인의 측쇄 티올 및 아르기닌의 측쇄를 포함한다. 단백질에서 발견되는 다른 반응성 측쇄는 세린 및 트레오닌의 측쇄 하이드록실, 타이로신의 하이드록시아릴, 히스티딘의 이미다졸 및 메티오닌 측쇄이다.
많은 동일한 반응성 기는 화학요법 물질 및 인슐린 및 IGF-1 수용체의 비단백질성 리간드에서 발견된다. 따라서, 본 명세서에 기재된 단백질의 변형 및 가교결합의 많은 원칙은 또한 화학요법 물질 및 비단백질성 리간드의 변형 및 가교결합에 적용된다.
단백질 접합 및 가교결합의 화학 및 원칙은 문헌[Wong, Shan S., Chemistry of Protein Conjugation and Cross-Linking, 1991, CRC Press, Boca Raton, Florida]에 기재되어 있다. 이 화학물질에 대한 정보에 대한 다른 소스는 Pierce Biochemistry 카탈로그; 및 문헌[Greene, T.W., and Wutz, P.G.M., Protecting Groups in Organic Synthesis, second edition 1991, John Wiley & Sons, Inc., New York] 및 이것 내에 인용된 참고문헌을 포함한다.
아미노산 측쇄의 가장 강한 친핵체는 환원된 시스테인 측쇄의 티올이다. 티올은 대부분의 단백질 변형 시약과 반응한다. 알파-할로아세트아마이드 및 말레이미드는 특히 pH 7.0 이하에서 시스테인 잔기와 특이적으로 반응하는 것으로 생각된다. 티올은 또한 다이설파이드 교환에 의해 다이설파이드 시약과 반응한다.
Figure pct00001
Figure pct00002
아미노기는 단백질에서 발견되는 다음의 가장 강한 친핵체이다. 알데하이드는 Schiff 염기를 형성하도록 아미노기와 반응한다. Schiff 염기는 가수분해 가능하고, 이것은 본 발명에서 이점일 수 있다. 리간드-화학요법 물질 접합체의 암 세포로의 유입에 의해, 몇몇 경우에 화학요법 물질이 이것이 활성인 접합체로부터 절단되는 것이 필요하다. 이것은 화학요법 물질이 절단 가능한 연결, 예컨대, 가수분해 가능한 연결에 의해 리간드에 연결되는 경우 더 양호하게 달성된다. 절단 가능한 연결은 자발적으로 또는 세포에서 효소에 의해 절단될 수 있다. 예를 들어, 아마이드 결합은 프로테아제를 포함하는 소정의 효소에 의해 절단된다. Schiff 염기 연결은 상당한 속도로 자발적으로 가수분해된다. 다이설파이드 연결은 암 세포의 세포내 환원 환경에서 환원으로 절단되는 것으로 예상된다.
Figure pct00003
아미노기와 알데하이드의 반응에 의해 형성된 Schiff 염기는, 예를 들어, 나트륨 보로하이드라이드 또는 피리딘 보란에 의한 환원에 의해 안정화될 수 있다. 피리딘 보란은 인슐린, IGF-1 및 IGF-2에서 발견되고 이 단백질의 구조에 필수적인 다이설파이드를 환원시키지 않는 것의 이점을 갖는다.
몇몇 화학요법 물질에서 발견되는 인접한 탄소에서 하이드록실기를 갖는 당 또는 다른 모이어티는 당을, 예를 들어, 페리오데이트에 의해 산화시킴으로써 아미노기와 반응하도록 변형될 수 있다. 이것은 탄소 사이에 절단하고, 다이알데하이드를 생성한다. 알데하이드기는 아미노기와 반응할 것이다.
다이알데하이드, 예컨대, 글루타르알데하이드는 아미노기를 갖는 2개의 분자를 가교결할시킬 것이다.
다른 아미노 시약은 활성화된 카보닐, 예컨대, N-하이드록시숙신이미드 에스터, p-나이트로페닐 에스터, 또는 산 언하이드라이드(예를 들어, 숙신산 무수물)를 포함한다.
Figure pct00004
Figure pct00005
아미노기는 또한 설포닐 할라이드 및 아릴 할라이드(예를 들어, 2,4-다이나이트로플루오로벤젠)와 반응한다.
Figure pct00006
Figure pct00007
아미노기는 또한 유레아 또는 티오유레아 유도체를 형성하도록 아이소사이아네이트 및 아이소티오사이아네이트와 반응한다.
Figure pct00008
이미도에스터는 아미노기에 대한 가장 구체적인 아실화 물질이다. 이미도에스터는 구체적으로 약 7 내지 10의 pH에서 이미도아마이드를 형성하도록 아민과 반응한다. 이 반응은 더 이전의 아미노기에서 이미도아마이드인 양으로 충전된 기를 생성함으로써 전하 안정성을 유지시키는 것의 이점을 갖는다. 이미도아마이드는 중성 초과의 pH에서 또한 천천히 가수분해하고, 이는 가수분해가 암 세포에서 유리 화학요법 물질을 방출시킬 수 있다는 점에서 또한 유리할 수 있다.
Figure pct00009
카복실기는 구체적으로 온화한 산 조건, 예를 들어, pH 5 하에 다이아조아세테이트 및 다이아조아세트아마이드와 반응한다.
Figure pct00010
카복실의 가장 중요한 화학 변형은 카보다이이미드, 예컨대, 1-사이클로헥실-3-(2-모르폴리닐-4-에틸)카보다이이미드(CMC) 및 3-(3-다이메틸아미노프로필)카보다이이미드(EDC)를 사용한다. 아민의 존재 하에, 카보다이이미드는 2개의 단계에서 카복실에 아마이드 결합을 형성한다. 제1 단계에서, 카복실기는 카보다이이미드에 첨가되어 O-아실아이소유레아 중간체를 형성한다. 아민과의 후속하는 반응은 상응하는 아마이드를 생성시킨다.
Figure pct00011
특히 중요한 카보다이이미드 반응은 N-하이드록시숙신이미드 에스터를 형성하도록 N-하이드록시숙신이미드에 의해 카복실을 활성화하는 데 이의 사용이다.
Figure pct00012
아르기닌은 인근 다이알데하이드 또는 다이케톤, 예컨대, 글리옥살, 2,3-부탄다이온 및 1,2-사이클로헥산다이온과 반응한다. 보레이트는 안정화가 원해질 때 부가물을 안정화시킬 수 있다.
Figure pct00013
반응성 기는 또한 상기 반응 중 몇몇에 의해 다른 반응성 기와 교환될 수 있다. 예를 들어, 산 무수물, 예컨대, 숙신산 무수물에 의한 아미노기의 변형은 양으로 충전된 아미노기를 유리 카복실기에 의해 대체한다. 마찬가지로, 카복실기와 카보다이이미드 및 다이아민, 예컨대, 에틸렌 다이아민의 반응은 카복실기를 유리 아미노기에 의해 대체한다.
가교결합: 상기 기재된 반응성 기, 예를 들어, 2개의 아미노-반응성 기 또는 아미노-반응성 및 티올-반응성 기 중 2개를 함유하는 시약은 적절한 기 중 하나를 함유하는 화학요법 물질을 다른 적절한 기를 함유하는 인슐린 또는 IGF-1 수용체 리간드에 가교결합시키도록 사용될 수 있다. 또한, 카보다이이미드 또는 카보다이이미드 및 N-하이드록시숙신이미드에 의해 활성화된(예를 들어, 화학요법 물질의) 카복실은 아마이드 결합 가교결합을 형성하도록 (예를 들어, 단백질 리간드의) 아미노기와 반응할 수 있다.
Figure pct00014
활성화된 카복실은 단리하기에 충분히 안정하지만, 이후 아마이드 결합을 형성하도록 아미노기와 용이하게 반응할 것이다.
숙신이미드, 예컨대, N-숙신이미딜-3-[2-피리딜다이티오]프로피오네이트(SPDP)는 아미노기를 통해 2개의 화합물을 커플링시키도록 사용될 수 있다(문헌[Pierce Biotechnology catalog, and Thorpe, P.E. et al. 1982, Immunol . Rev. 62:119-158] 참조).
실시예
실시예 1
플라스미드를 T7 촉진자의 제어 하에 이. 콜라이에서 발현에 최적화된 뉴클레오타이드 서열을 갖는 이 단백질을 코딩하는 DNA 2.0(Menlo Park(캘리포니아주))에 의해 합성하였다:
코딩된 단백질 설명 서열
403IGF His6-IGF 서열 번호 8
764IGF His6-K5-IGF132 서열 번호 11
765IGF His6-K5-R3IGF 서열 번호 2
784IGF mutTrx-R3IGF 서열 번호 9
785IGF mutTrx-IGF132 서열 번호 10
이. 콜라이 BL21(DE3)를 각각의 플라스미드에 의해 형질전환시키고, 형질전환체를 단리하였다. 각각의 10㎖의 형질전환된 BL21(DE3) 배양물을 사용하여 2ℓ의 배플 플라스크에서 50㎍/㎖의 카나마이신(LB-kan)을 갖는 500㎖의 LB 배지를 시딩하였다. 이것을 0.6의 O.D. 600㎚에서 0.4mM 최종 IPTG에 의해 유도하고, 25℃에서 밤새 성장시켰다.
세포를 50mM Tris-HCl(pH 8.0) 중에 재현탁시키고 동결시켰다. 이것을 해동시키고, 실온에서 30분 동안 세포 페이스트 1g당 50mM Tris-HCl(pH 8.0), 0.2% 트리톤-X100, 0.5㎎의 라이소자임 중에 5% 습식 중량/용적 세포 중량에서 항온처리하였다. 이것을 이후 음파처리하여 세포를 파괴하였다. MgCl2를 3mM 최종 농도에 첨가하고, 250㎕의 BENZONASE를 배양물 1리터당 첨가하였다. 이것을 실온에서 추가 1시간 동안 항온처리하였다.
봉입체(inclusion body)를 원심분리에 의해 단리시켰다. 가용성 분획은 보유되었다.
봉입체를 7M 유레아, 0.5 M NaCl, 20mM 포스페이트(pH 7.8) 중에 가용화시켰다.
가용화된 봉입체를 칼럼에서 1㎖의 Ni-나이트로리토-트라이아세트산(Ni-nitrolito-triacetic acidㅣ Ni-NTA) 수지에 로딩하였다. 칼럼을 Ni-A 완충제에 의해 세척하고, Ni-B 완충제에 의해 용리시켰다.
Ni-A 6M 유레아, 0.5M NaCl, 20mM 인산나트륨, 20mM 이미다졸, pH 7.3.
Ni-B 6M 유레아, 0.5M NaCl, 20mM 인산나트륨, 0.4M 이미다졸, pH 7.3.
단백질 수율은 하기와 같다:
403IGF 용리제 3.6㎎
764IGF 용리제 16㎎
765IGF 용리제 24㎎
784IGF 용리제 6.7㎎
785IGF 용리제 1.9㎎
SDS-PAGE는 용리제 및 미정제 불용성 및 가용성 분획의 실행이었다. 784IGF 및 785IGF가 가용성 분획에서 IGF의 거의 반 및 불용성 분획에서 반을 갖는 것으로 보였다. 403IGF, 764IGF 및 765IGF는 불용성 분획에서 거의 모든 IGF를 갖는 것으로 보였다.
이 데이터로부터, 최고의 수율은 765IGF에 의했다. 서열 번호 1 리더 서열을 갖는 것(764IGF 및 765IGF)은 단순한 Met-His6 리더(403IGF) 또는 티오레독신 리더 서열(784IGF 및 785IGF)을 갖는 것보다 더 양호한 수율을 생성시켰다. 그리고 IGF 부분(765IGF 및 784IGF)에 대한 R3IGF 돌연변이체를 갖는 작제물은 융합 단백질을 갖는 IGF 부분(764IGF 및 785IGF)에 대해 IGF132 돌연변이체를 갖는 상응하는 작제물보다 더 양호한 수율을 생성시켰다.
실시예 2
리폴딩 및 결합 검정
실시예 1로부터의 원래의 Ni 용리제의 각각의 2㎖를 거의 동일한 용적의 100mM 글리신, 6M 유레아(pH 9.5)와 혼합하고, CENTRICON 3 kDa 필터 유닛에서 한외여과에 의해 농축시키고, 이어서 그 완충제 중에 다시 넣고, 약 420㎕로 농축시켰다. 이어서, 이것을 403IGF, 764IGF 및 765IGF에 대해 2㎎/㎖로, 그리고 784IGF에 대해 4㎎/㎖, 그리고 785IGF에 대해 2.4㎎/㎖로 희석시켰다.
이들의 각각의 200㎕를 1.8㎖의 리폴드 완충제와 신속히 혼합하였다. 리폴드 완충제는 1.4M 유레아, 100mM 글리신, 0.5M NaCl, 19% 에탄올, 0.5mM GSSG, 4mM GSH(pH 9.5)이었다. 이것은 실온에서 3시간 동안 리폴딩되고, 이어서 I-132 방사능 야생형 IGF(Perkin Elmer, Inc.)에 대해 IGF 수용체에 대한 경쟁 결합에 대해 결합 검정에서 시험되었다. 비교를 위해, 상업용 긴-R3-IGF(LR3IGF)를 또한 시험하였다.
이 실험에서의 근사 결합 상수(KD)는 이들이다:
LR3IGF 1nM
403IGF 2nM
764IGF 100nM
765IGF 10nM
784IGF 3nM
785IGF 40nM
R3IGF 돌연변이체(LR3IGF, 765IGF 및 784IGF)를 함유하는 융합 단백질은 IGF132 돌연변이체(403IGF, 764IGF 및 785IGF)를 함유하는 것보다 더 낮은 KD를 가졌다.
실시예 3
765IGF의 정제 및 수율
T7 촉진자의 제어 하에 765IGF 유전자를 갖는, 이. 콜라이에 대한 최적화된 코돈 용법을 갖는 765IGF를 코딩하는 플라스미드를 DNA 2.0(Menlo Park(미국 캘리포니아주))에 의해 합성하였다. 이. 콜라이 Bl21(DE3)을 플라스미드에 의해 형질전환하고, 발효기 배양에서 성장시키고, IPTG에 의해 유도하였다.
765IGF를 이온 교환 크로마토그래피 및 니켈 친화도 크로마토그래피에 의해 변성 조건 하에 정제하였다. 정제된 765IGF의 수율은 배양물의 1리터당 약 60㎎이었다.
765IGF를 실시예 2의 것과 유사한 절차에 의해 리폴딩하고, 이어서 리폴딩된 단백질을 DEAE 수지에서 이온 교환 크로마토그래피 및 니켈 수지에서 친화도 크로마토그래피에 의해 정제하였다.
실시예 4
IGF -1 수용체에 대한 765IGF 결합 검정
방법:
검정의 이론: 방사능 125I 표지된 인슐린양 성장 인자-1(IGF-1)은 시험관내 MCF7 세포(인간 유방암 세포주)에서 풍부한 1형 IGF 수용체에 대한 결합에 대해 시험 리간드와 경쟁한다. 시험된 리간드는, 인슐린양 성장 인자-1(IGF-1)의 본 발명자들의 765IGF 변이체 및 765IGF에 커플링된 항엽산 약물 메토트렉세이트를 함유하는, 본 발명자들의 신규한 공유 접합체, 및 비교 및 양성 대조군으로서의 상업적으로 구입 가능한 긴-R3-IGF-1(Sigma Aldrich(미국 미주리주 세인트 루이스))을 포함한다.
MCF7 세포 배지: 500㎖의 MEM, 0.01mg/㎖의 소 인슐린; 5㎖의 나트륨 피류베이트, 5㎖의 비필수 아미노산, 10㎖의 중탄산나트륨, 10㎖의 소 태아 혈청, 5㎖의 페니실린/스트렙토마이신.
MCF7 세포(ATCC HTB-22)를 48웰 조직 배양 플레이트(낮은 증발 뚜껑을 갖는 평평 바닥)에서 0.5㎖/웰의 용적으로 웰당 20,000개의 세포로 플레이팅하고, 5% CO2를 갖는 37℃에서 설정된 세포 배양 항온처리기에 배치하였다. 배양에서 2일 내지 3일 후, 플레이트를 차가운 결합 검정 완충제(100mM Hepes-NaOH, pH 7.2; 120mM NaCl; 5mM KCl; 1.2mM MgSO4; 0.1% BSA)의 웰당 0.5㎖에 의해 2x 세척하였다. 최종 세척 후, 0.5㎖의 결합 검정 완충제를 각각의 웰에 첨가하고, 플레이트를 2 내지 6시간 동안 4℃에 두었다.
시험 리간드를 200㎕의 용적에서 5mM HCl에서 10마이크로몰(긴-R3-IGF) 또는 20마이크로몰(765IGF 및 IGF-MTX)의 농도로 제조하였다. 농도를 결정하기 위해, 765IGF의 분자량(9742달톤) 및 긴-R3-IGF의 분자량(9111달톤)을 사용하였다. 긴-R3에 대해, 동결건조된 상업용 재료를 10mM HCl 중에 1.0mg/㎖로 용해시키고, 이것을 10μM 용액에 대해 91㎍/㎖의 농도로 희석하였다.
765IGF 및 긴-R3-IGF를 2000nM 내지 1nM의 농도로 웰에서 결합 완충제로 희석하였다.
다음에, I-125 IGF(Perkin Elmer Radiochemicals(미국 메사추세츠주 왈탐)의 25 uCi 로트를 1㎖의 물 중에 용해시켰다. 결합 완충제로 적절한 희석을 만들고, 이어서 50㎕의 희석된 방사능 IGF를 각각의 웰에 첨가하여, 웰마다 0.03 uCi 이상을 첨가하였다. 새로운 I-125 IGF에 대해, 사용된 플레이트마다 물 중의 1㎖ 용액의 I-125 IGF의 100㎕를 사용된 플레이트마다 2.6㎖의 결합 완충제에 첨가되고, 50㎕는 웰에 첨가될 수 있다.
플레이트를 이어서 4℃에서 밤새 항온처리하였다. 이어서 액체를 마이크로피펫터에 의해 각각의 웰로부터 배출시키고, 웰을 결합 완충제에서 2회 세척하였다. 세포를 0.5㎖의 300mM NaOH, 1% SDS에 의해 용해시키고, 용해물을 감마 카운터에서 계수하였다.
결과:
765IGF 및 상업적으로 구입 가능한 긴-R3-IGF에 대한 IGF-1 수용체 결합 검정의 결과는 도 1에 도시되어 있다. 높은 농도에서, 765IGF는 긴-R3-IGF보다 더 방사능을 계속해서 대체하여서, 이것이 긴-R3-IGF가 결합하지 않는 막에서 IGF-1 결합 부위에 결합할 수 있다는 것을 제안한다. 이 검정에서의 765IGF의 KD는 1nM 미만이지만, 긴-R3-IGF의 KD는 약 3nM이었다. 765IGF의 상이한 로트를 갖는 제2 결합 검정은 도 2에 도시되어 있고, 3.5nM의 KD를 생성시켰다.
실시예 5
765IGF에 대한 메토트렉세이트의 접합
단백질을 pH 7.3 접합 완충제로 완충제 교환하고, 2.5㎎/㎖의 농도로 조정하였다.
pH 7.3 접합 완충제: 25mM 인산나트륨, 10mM NaCl, 6 M 유레아, pH 7.3.
pH 6.3 접합 완충제는 pH 6.3에서 동일한 완충제이다.
메토트렉세이트를 pH 6.3 접합 완충제 중에 20㎎/㎖에서 용해시키고, NaOH에 의해 pH 6.3으로 pH 조정하였다.
1-에틸-3-[3-다이메틸아미노프로필]카보다이이미드 하이드로클로라이드(EDC)를 75㎎/㎖에서 pH 6.3 접합 완충제 중에 새로 용해시켰다.
EDC 용액의 1 용적을 MTX 용액의 1 용적에 첨가하고, 실온에서 30초 동안 항온처리하고, 이어서 이 혼합물을 pH 7.3 접합 완충제 중에 2.5㎎/㎖ 단백질 용액의 8 용적에 첨가하였다.
혼합물을 혼합하고, 이어서 실온에서 밤새 반응시켰다. 이어서, 6M HCl을 60mM 최종 농도로 반응 혼합물에 첨가하였다. 이어서, 반응 혼합물을 10mM HCl로 완충제 교환하였다.
결과:
단백질의 1몰당 접합된 메토트렉세이트의 양은 1mM당 21.6의 메토트렉세이트기에 대한 몰 흡광 계수를 이용하여 100mM HCl 중에 305㎚에서 접합체의 흡광도를 측정함으로써 결정되었다(Chamberlin et al. Analytical Profiles of Drug Substances, 1976, 5:283-306). 단백질 농도는 정량적 아미노산 분석에 의해 결정되었다. 이에 의해, 765IGF-MTX 접합체 중의 MTX 그룹 대 IGF의 몰비는 대략 8이었다.
실시예 6
765IGF -MTX 시험관내 세포독성 검정
세포독성 검정 . 이 효력 검정은 765IGF-MTX와의 항온처리에 의해 시험관내 MCF-7 종양 세포의 증식의 저해에 대한 검정이다.
방법
0일. 5000개의 MCF7 세포를 0일에 100㎕의 풍부한 배지 중에 96웰 시험 플레이트에서 웰마다 플레이팅하였다.
1일. 새도우 플레이트는 각각의 시험 플레이트에 제조되고, 새도우 플레이트의 각각의 웰은 배지 또는 각각의 웰에서 배지 중에 시험 물질의 의도된 최종 농도의 3X를 함유한다. 음성 대조군으로서, 배지를 사용한다. 양성 대조군으로서, 3μM에서의 유리 메토트렉세이트를 사용한다.
새도우 플레이트를 제조한 후, 50㎕를 새도우 플레이트의 각각의 웰로부터 시험 플레이트의 상응하는 웰로 이동시켜서 시험 플레이트의 웰에서 시험 물질의 최종 농도를 생성시킨다.
5일. 세포 증식은 CCK-8 시약을 첨가하고 항온처리하고 제조사의 지시에 따라 염료의 흡광도를 측정함으로써 결정된다.
결과:
765IGF-MTX에 의한 대표적인 세포독성 검정의 결과는 도 3에 도시되어 있다. 765IGF-MTX의 IC50(세포 증식의 50% 저해에 필요한 농도)은 1ℓ마다 249 nEq이었다. (나노당량(nanoEquivalent)은 765IGF에 접합된 메토트렉세이트기의 나노몰이다.) 비교를 위해, 동일한 검정에서, 유리 메토트렉세이트의 IC50은 88nM으로서 측정되었다.
실시예 7
메토트렉세이트 및 IGF - 메토트렉세이트 접합체에 의한 다이하이드로폴레이트 환원효소의 저해
방법:
제조사의 지시에 따라 Sigma-Aldrich(미국 미주리주 세인트 루이스)로부터의 다이하이드로폴레이트 환원효소 검정 키트에 의해 실험하였다. 검정에서 다이하이드로폴레이트 환원효소는 pH 7.5 완충제와 혼합되었다. 다음에, 저해제(메토트렉세이트 또는 IGF-메토트렉세이트 접합체)를 첨가하고, 용액을 혼합하였다. 이것을 30초 동안 항온처리하여서 저해제 결합을 허용하였다. 이어서, NADPH를 50μM 최종 농도로 첨가하고, 이어서 다이하이드로엽산을 60μM 최종 농도로 첨가하였다. 340㎚에서의 흡광도를 측정함으로써 반응을 모니터링하였다.
결과:
시험된 접합체는 하기와 같다:
765IGF-MTX를 실시예 3에 기재된 바대로 제조하였다. 765IGF는 메토트렉세이트를 접합시키도록 이용 가능한 9개의 아미노기(8개의 라이신 및 N 말단 아미노기)를 갖는다. 이 배치는 7.5의 MTX:단백질 몰 비를 갖는다.
765IGF-MTX 1/3. 이 접합체를 접합 반응에서 MTX 및 EDC의 일반 농도의 1/3에 의해 제조하였다. 이것은 1.2의 MTX:단백질 몰 비로 접합체를 제조하였다.
LR3IGF-MTX. 이 경우에, IGF의 버전은 긴-R3-IGF이다. 이것은 접합에 4개의 이용 가능한 아미노기(3개의 라이신 측쇄 및 N 말단 아미노기)를 갖는다. 이 접합체는 2.8의 MTX:단백질 비를 갖는다.
또한, 유리 메토트렉세이트를 시험하였다.
접합체를 완전히 한외여과시켜서 저해 검정에서의 이의 사용 전에 임의의 유리 메토트렉세이트를 제거하였다.
765IGF-MTX에 대한 저해 데이터의 선도는 도 4에 도시되어 있다.
메토트렉세이트 및 접합체의 IC50은 하기있다:
Figure pct00015
nEq/ℓ에서의 IC50은, IGF 단백질 단량체당 접합된 상이한 수의 MTX기를 가짐에도 불구하고, IGF-MTX 접합체의 모든 3개에 대략 동일하였다. 이는 각각의 접합된 메토트렉세이트기가 효소의 독립적인 저해제로서 작용한다는 것을 보여준다. 하나의 기가 일단 DHFR 효소에 결합되면 접합체 단량체에서의 추가적인 메토트렉세이트기가 DHFR 효소에 입체적으로 결합하고 저해할 수 없는 경우, 접합체에 대한 IC50이, 관찰된 바대로 nEq/ℓ(MTX기) 농도의 면에서 동일한 것 대신에, 각각의 접합체에 대해 nM 단백질 농도의 면에서 동일하다고 기대될 것이다. 저해가 MTX기에 비례하므로, 765IGF-MTX는, 이의 더 높은 MTX 로딩에 의해 13nM의 단백질 농도의 면에서 저해 상수를 갖는 한편(IGF마다 7.5 MTX에 의해 나눈 95 nEq/ℓ은 13nM IGF를 생성함), LR3IGF-MTX는 35nM의 단백질 농도의 면에서 저해 상수를 갖는다. 따라서, MTX의 더 높은 로딩에 의해, DHFR의 동일한 저해, 및 추론하여 종양 세포의 살해의 동일한 수준을 달성하기 위해 더 적은 765IGF 단백질이 필요하다.
데이터는 단백질 접합된 MTX기가 DHFR을 저해하지만, 유리 MTX와 비교하여 저해에 더 높은 농도가 필요하다는 것을 보여준다.
실시예 8
MCF7 세포에서 IGF -1R에 대한 765IGF -MTX의 결합.
방사선 표지된 IGF-1에 대한 MCF7와의 765IGF-MTX 접합체의 몇몇 경쟁 결합 검정은 실시예 4에 기재된 바대로 수행되었다. 결과는 약 20nM 765IGF-MTX의 KD이었다. (설명하기 위해, 이것은 MTX기의 nEq/ℓ이 아니라 단백질 접합체의 nM이다. 765IGF마다 약 8 MTX가 있으므로, 20nM 765IGF-MTX는 약 160nEq/ℓ의 765IGF-MTX이다). 특히 결합 검정은 도 5에 도시되어 있고, KD는 13.4nM이었다.
실시예 9
생체내 독성학 연구
MTD는 비설치류 및 설치류 연구 둘 다에 기초한다. 정식 GLP 독성 생체내 연구는 래트 및 비글 개에서 완료되고, 여기서 765IGF-MTX 접합체는 개에 대해 표 1에 기재된 바대로 연구 1일 및 8일에 단일 30분 점적주사에 의해 정맥내 투여되었다.
Figure pct00016
임상 관찰, 연속 혈당 결정 및 임상 병리학을 포함하는 모든 생성된 데이터의 분석은 0.2 및 0.5μeq/㎏에서 5% 덱스트로스 중의 765IGF-MTX 접합체에 의해 정맥내 점적주사에 의해 치료된 개에서 약물/치료 관련된 유의미한 독성이 없음을 밝혀냈다. 0.2μeq/㎏ 그룹에서, 오직 일시적인 호흡곤란 및 부동태화가 주목되는 한편, 0.5μeq/㎏에서 치료된 동물에서 구토 및 설사의 단일 에피소드가 주목되고, 암컷 개의 머리에서 경증의 피부의 붉어짐 및 종창이 또한 있었다. 이들 2개의 그룹에서의 개의 치료는 매우 관용적이고, 치료에 대한 임의의 반응은 일시적이고 자체 해결되었다.
2μeq/㎏에서 투약된 동물에서, 치료에 대한 반응은 경증 내지 중등도의 아나필락시스모양 및 두드러기 유형 반응, 일시적인 거식증 및 체중 감소, 및 저혈당증을 포함하였다. 6μeq/㎏에서 투약된 개에서의 치료에 대한 반응은 2μmol/㎏에서의 반응과 유사하지만, 이들은 더 중증이고 더 오래 지속하였다. 따라서, 이 연구에서의 비글 개에서의 765IGF-MTX 접합체의 MTD는 30분에 걸친 단일 점적주사에 의해 6μeq/㎏인 것으로 생각될 수 있다.
2μEq/㎏에서 투약된 암컷 개 및 6μEq/㎏에서 투약된 동물 둘 다에서의 아나필락시스모양 반응 및 저혈당증으로부터의 회복은 다이펜하이드라민 및 덱스트로스에 의한 치료에 의해 보조되었다.
더 높은 용량 그룹에서의 저혈당증은 IGF의 약리학적 효과를 과장시키고, 이는 765IGF-MTX 접합체의 전달에 대한 비히클로서의 5% 덱스트로스의 사용에 의해 완화되었다. 아나필락시스모양 반응의 발병은 명확하지 않지만, 메토트렉세이트, IGF 또는 이들의 조합에 의해 야기될 수 있다. 구토, 설사, 거식증 및 체중 감소는 메토트렉세이트에 대한 공지된 반응이다.
비글에서의 가장 높은 심각하지 않게 독성인 용량은 0.5μeq/㎏이었다. μEq/㎏ 단위의 개에서의 용량으로부터 μEq/㎏ 단위의 동등한 인간 용량으로의 전환을 이용하여, 개에서의 0.5μEq/㎏와 동등한 인간 용량은 인간에서의 0.27μEq/㎏이다.
IGF -MTX는 유의미한 혈구감소증을 야기하지 않는다
혈구감소증은 이들 질환의 주요 후유증이므로 MDS, CMML 및 O-AML에 대해 특별히 우려된다. 래트 및 개 반복 용량 GLP 독성학 둘 다에서 시험 IGF-MTX는 시험된 가장 높은 용량에서도 거의 혈구감소증을 야기하지 않았다. 래트 및 개 독성학 연구 둘 다에서 IGF-MTX는 적혈구 덩어리의 약간의 용량 의존적 감소를 야기하였지만, 시험된 가장 높은 용량에서도 적혈구 덩어리는 정상 범위 내에 있었다. 개가 아니라 래트에서 호중구는 IGF-MTX에 의해 또한 약간 감소하였지만, 가장 높은 용량에서도 정상 범위 내에 있었다. 다른 혈액학적 매개변수는 IGF-MTX에 의해 영향을 받지 않았다.
인간 고형 종양 환자에서의 완료된 I상 용량 상승 연구에서, 0.8μEq/㎏의 용량은 임의의 심각한 부작용 없이 관용되는 것으로 발견되었다. MDS 환자가 MDS 환자의 안전성에 대해 고형 종양 환자보다 더 높은 혈구감소증을 가지므로, 본 발명자들은 1일, 8일 및 15일에 투여된 0.2μEq/㎏의 용량 수준에서 시작하여 이 연구에서의 새로운 용량 상승을 수행한다. 용량 상승 계획에 대해 6 페이지에서의 계획을 참조한다.
실시예 10
스프라그 - 다울리 래트에서의 IGF - 메토트렉세이트 접합체에 의한 6-용량, 1주 1회, 정맥내 독성 연구, 이어서 14일 회복 기간
이 반복된 용량 연구는 메토트렉세이트(MTX)에 의한 765IGF라 지칭되는 인슐린양 성장 인자의 변이체의 접합체인 765IGF-MTX의 독성에 대한 표적 장기 및 전신 독성 가능성을 조사하였다. IGF-MTX 접합체를 정맥내 느린 볼루스 주사에 의해 6주 동안 1주 1회 투여하였다. 스프라그-다울리 래트의 3개의 그룹에 2개의 용량에 대해 0.5, 2 및 5μEq/㎏의 용량 수준에서 정맥내 투약하였다(μEq는 메토트렉세이트기의 μmol임). 고용량 그룹에서 독성이 관찰되지 않으므로, 제3 용량으로부터 시작하여, 중간-용량 그룹에서의 용량 수준은 2로부터 5μEq/㎏로 증가하고, 이는 치료의 종료까지 남아 있었다(즉, 동물은 5μEq/㎏에서 전체 4 용량을 받았다). 고용량 그룹에서, 용량은 처음에 5로부터 10μEq/㎏(제3 용량)로 증가하고, 이어서 심각한 독성으로 인해, 용량 수준은 남은 3개의 용량에 대해 8μEq/㎏로 조정되었다. 래트의 대조군 그룹은 IGF-MTX 제제에 대해 희석제로서 사용된 5% 덱스트로스 주사 USP(D5W)가 투약되었다.
래트의 4개의 그룹을 이 연구(1개의 대조군 및 3개의 시험)에서 사용하였다. 각각의 주요 연구 시험 및 대조군 그룹은 10마리의 수컷 래트[균주: Crl:CD(등록상표)(SD) BR-스프라그-다울리(Charles River Canada Inc.(캐나다))]로 이루어졌다. 대조군, 중용량 및 고용량 그룹에서 회복 그룹에 포함된 성별당 또한 5마리의 래트가 있다; CBC/글루코스 하위그룹에서 그룹(시험 그룹)에서 성별마다 3마리의 래트(대조군) 및 성별마다 6마리의 래트. 성별마다 추가적인 3마리의 래트를 대조군 그룹으로 할당하고, 독성동태학적 혈액 수집을 위해 각각의 시험 그룹에 성별마다 9마리의 래트.
용량 용적은 대조군 그룹을 포함하는 모든 그룹에 대해 4㎖/㎏이었다. 이 보고서의 목적을 위해 용량 수준에 약간의 조정이 이루어질 수 있지만, 보고서에 사용된 용량은 0.5, 5 및 8μEq/㎏로 기재될 것이다.
모든 동물의 검사는 매일의 임상 관찰, 및 매일의 음식 및 물 모니터링을 포함하였다. 동물은 또한 주마다의 기준으로 상세한 신체 검사를 받았다. 체중을 초기에 그리고 이어서 7일, 14일, 21일, 28일, 35일 및 41일에, 및 42일에서의 부검 전에(주요 연구 동물), 및 추가적으로 37일, 42일 및 49일에 및 50일에서의 부검 전에(회복 동물) 기록하였다. 음식 소비를 주마다 기록하였다. 전혈구수(complete blood count: CBC)를 제2 용량 전 24시간에, 및 각각의 후속하는 용량 전 24시간에 수행하였다. 완전 임상 병리학을 주요 연구 및 회복 기간의 종료시 수행하였다.
초기에(치료의 개시 전에) 그리고 주요 연구의 종료 시 검안을 수행하였다.
독성동태학에 대한 프로토콜 스케줄에 따라 혈액 샘플을 또한 수집하지만, 샘플을 분석하지 않았다. 제6 용량의 종료 후 6일에, 각각의 그룹으로부터의 10마리의 수컷 및 10마리의 암컷 주요 연구 동물을 안락사시키고 총체적 부검 및 조직병리학 검사를 위해 제출하였다. 대조군 그룹, 및 5 및 8μEq/㎏에서 투약된 그룹에서의 남은 5마리의 수컷 및 5마리의 암컷 회복 래트를 마지막 용량 후 14일에 안락사시키고, 부검 및 조직병리학적 검사를 위해 제출하였다.
3마리의 래트는 고용량 그룹에서 죽고/죽거나 안락사되었다. 15일(용량 3)에 용량이 5로부터 10μEq/㎏로 증가할 때 1마리의 수컷(TK 그룹) 및 1마리의 암컷(주요 연구 그룹)은 투약을 완료한 직후에 죽었다.
용량 수준이 10μEq/㎏로 상승한 후 및/또는 시험 물품이 정맥내로 침전한 후 시험 물품의 낮은 pH(pH 약 2.3)가 대사 산증을 야기할 수 있다고 의심되었다. 조직병리학적 평가는 다수의 다양하게 크기화된 둥근 녹색-회색 비정질 입자를 발견하였고, 몇몇은 급성으로 죽은 동물 둘 다의 폐에서 중심 밀도를 갖는다. 이들 래트 중 1마리는 심장에서 이들 입자를 또한 가졌다. 동물 둘 다에서 폐에서의 급성 혈전증 및 심장에서의 급성 정맥내 응고가 또한 있었다. 작은 혈관의 미세 색전증 및 폐색에 의해 주사된 물질이 침전하고 혈관내 혈소판 응집을 개시하는 것으로 보인다.
24일에 안락사된 제3 래트에서, 허혈성 괴사 및 실질성 위축증을 갖는 상승적 신우신염이 관찰되었다. 이 변화는 중증이고 임상 악화를 설명하였다. 이 증상은 부수적이고 시험 물품에 의한 치료와 관련되지 않는 것으로 생각되었다.
죽은 래트를 제외하고, 모든 그룹으로부터의 모든 다른 래트는 기재된 치료를 받고, 예정된 안락사 및 부검 일자에 생존하였다.
0.5μEq/㎏에서 IGX-MTX 접합체에 의해 치료된 임의의 래트에서, 또는 (처음의 2 용량에 대해) 2μEq/㎏에서 투약된 래트에서, 및 이어서 남은 4마리의 개에 대해 5μEq/㎏에서 치료 관련된 전신 독성 효과가 없었다.
고용량 그룹에서 가끔씩의 혈뇨는 용량이 투약 후 1시간 내에 10μEq/㎏로 증가할 때 몇몇 래트에서 관찰되었다. 이는 시험 제제의 낮은 pH(pH = 약 2.3)로 인했다.
안과학 결과는 임의의 비정상 발견을 확인하지 못하고, 음식 소비 및 체중 증가는 시험 그룹과 대조군 그룹 사이의 임의의 유의미한 차이를 확인하지 못했다.
5 및 8μEq/㎏에서 투약된 그룹에서 필시 치료 관련되지만 MTX 투여에 대해 예상되고 흔한 불리한 반응인 병리학 발견은 하기와 같다:
Figure pct00017
연구 동안 모니터링되는 CBC 매개변수에서의 일반적인 경향은 망상적혈구의 보충적인 증가로 적혈구 덩어리(RBC, Hb, Hct)의 약간의 용량 의존적 감소였다. 용량 6 전에, 5μEq/㎏에서 치료된 그룹에서의 적혈구 덩어리는 대략 8% 내지 15%(성별 조합됨) 감소하고, 8μEq/㎏에서 투약된 그룹에서 대략 15% 내지 19% 감소가 있었다. 동시에, 망상적혈구 수는 각각 5 및 8μEq/㎏에서 IGF-MTX 접합체를 받는 그룹에서 47% 내지 102% 증가하고 2.2배 내지 2.4배(성별 조합됨)이었다. 호중구 수는 이들 그룹 둘 다에서 또한 감소하였다.
Figure pct00018
적혈구 덩어리의 감소는 5 및 8μEq/㎏에서 IGF-MTX 접합체에 의해 치료된 그룹에서 성별 둘 다의 동물에서 주요 연구의 종료 시 또한 관찰되었다(각각 5 및 8μEq/㎏에서 투약된 그룹에 대해 6% 내지 7%, 및 10% 내지 14%의 평균 감소). 보충적인 망상적혈구증은 이들 그룹의 둘 다에서 주목되었다.
Figure pct00019
WBC는 또한 이들 2개의 그룹에서 감소하였다(호중구, 림프구 및 단핵구는 모두 영향을 받음). 모든 세포 유형은 거의 동일하게 영향을 받는 것으로 나타났다. 호중구의 감소는 5μEq/㎏에서 치료된 그룹에서 약 5% 내지 35%(성별 조합됨)이고, 8μEq/㎏에서 투약된 그룹에서, 대조군과 비교할 때 50% 내지 57%의 범위의 감소였다. 혈소판은 8μEq/㎏에서 투약된 암컷에서 또한 유의미하게 감소하였다(대조군 암컷에 비해 대략 38% 감소). 회복 동물에서, 모든 이들 매개변수는 정상으로 다시 돌아가거나, 회복을 나타내는 정상화의 경향을 보여주었다.
Figure pct00020
비장의 평균 중량은 5 및 8μEq/㎏에서 투약된 수컷 및 암컷 둘 다에서 증가하였다. 대조군 래트에서의 비장의 평균 중량에 비해 평균 17% 내지 38% 증가한다.
치료 그룹에서 관찰되고, 치료 관련된다고 생각되지만, IGF의 과장된 약리학적 효과라 예상되는 변화는 하기와 같다:
Figure pct00021
0.5μEq/㎏에서 투약된 그룹(성별 조합됨)에서 평균 글루코스 수준은 투약 후 증가하였다. 증가는 6 용량에 걸쳐 0.3±0.5 내지 4.0±5.0m㏖/ℓ의 범위였다. 때때로, 몇몇 개별 동물에서 이 그룹에서 혈당 수준의 감소가 있었다.
Figure pct00022
5μEq/㎏에서 투약된 그룹에서, 6 용량에 걸친 혈당 수준의 평균 증가 또는 감소는 -1.8±7 내지 7.5±3.4m㏖/ℓ의 범위이고, 8μEq/㎏에서 투약된 그룹에서, 증가/감소는 -2.1±1.3 내지 2.6±3.1m㏖/ℓ의 범위였다. 하나의 경우(제3 용량 - 10μEq/㎏)에 몇몇 동물에서의 글루코스 수준은 2.8mmol/ℓ 아래로 감소하고, 이에 따라 이 그룹에서의 모든 동물은 2㎖/래트로 10% 덱스트로스, I.P.가 투약되었다. 혈당 수준의 감소가 용량 의존적으로 보인다는 것에 주목해야 한다.
조직병리학적 평가는 가능한 독성학적 유의성일 수 있는 8μEq/㎏에서 투약된 동물의 폐에서의 약간의 변화를 확인하였고, 이는 하기와 같다:
Figure pct00023
폐에서, 연구에서 많은 동물에서 혈관주위 간질조직에서의 과립구 및 림프구의 침윤물을 갖는 작은 혈관의 두드러짐이 증가한다. 이 혈관주위 염증성 세포 침윤물은 주요 연구에서 5/20 대조군에서 및 8μEq/㎏ 동물에서 투약된 그룹에서 19/19 관찰되었다. 이 반응의 심각성은 8μEq/㎏에서 투약된 그룹에서 더 높았다. 반응은 회복 그룹에서 4/10 대조군 및 0/10 고용량 동물에서 보였다.
Figure pct00024
고용량 회복 그룹에서의 1마리의 동물에서, 실질성 소실의 쐐기 형상의 구역이 있고, 대체 섬유증은 허혈성 경색과 일치한다. 이들은 조기의 병소 허혈성 사건의 잔재이다. 이러한 변화가 프로토콜과 관련되지 않은 산발적 조건에서 발생하므로, 경색이 치료와 관련되는지는 공지되어 있지 않다.
마지막으로, 임상 관찰 안과학, 총체적 부검 및 조직병리학을 포함하는 모든 생성된 데이터의 분석은 6주 동안 주마다 0.5 및 5μEg/㎏에서 IGF-MTX 접합체에 의해 정맥내 치료된 래트에서 약물/치료 관련된 유의미한 독성이 없음을 밝혀냈다. 이들 2개의 용량 수준에서, 치료는 동물에 의해 매우 관용적이었다.
0.5μEg/㎏의 용량 수준에서, 몇몇 래트에서 때때로 주목되는 유일한 발견은 혈당 수준의 미미한 감소였다. 이 발견은 IGF의 약리학적 효과로 예상되고, 이에 따라 이 실험의 조건 하에, 이 연구에서의 관찰된 효과 수준은 6주 동안 주마다 투약된 0.5μEq/㎏와 동일하다고 생각되지 않았다(NOEL).
5μEq/㎏의 용량 수준에서, 0.5μEg/㎏에서 투약된 동물에서보다 더 현저한 혈당 수준의 감소 이외에, 적혈구 덩어리의 미미한 감소가 또한 있었다(용량 6 전에 약 8 내지 15% 및 주요 연구의 종료 시 약 6 내지 7%). WBC는 주요 연구의 종료 시 이 그룹에서 또한 미미하게 감소하였다(약 5 내지 35%). 회복의 종료 시 RBC 및 WBC 둘 다는 이 그룹에서 정상 범위 내이고, 이는 이들 변화의 가역성을 나타낸다. 이 그룹에서의 비장의 중량의 미미한 증가가 또한 있고, 이는 회복 동물에서의 정상화의 경향을 보여주었다. 이 발견은 조혈작용에 대한 MTX의 공지된 효과였다. 따라서, 이 실험의 조건 하에, 이 연구에서의 관찰된 부작용 수준(NOAEL)은 5μEg/㎏와 동등하다고 생각되지 않았다.
실시예 11
비글 개에서의 IGF - 메토트렉세이트 접합체에 의한 5-용량, 1주 1회, 정맥내 점적주사 독성 연구, 이어서 21일 회복 기간
이 반복된 용량 연구는 메토트렉세이트(MTX)에 의한 765IGF라 지칭되는 인슐린양 성장 인자의 변이체의 접합체인 765IGF-MTX의 독성에 대한 표적 장기 및 전신 독성 가능성을 조사하였다. IGF-MTX 접합체를 정맥내(IV) 점적주사에 의해 5주 동안 1주 1회 투여하였다. 비글 개의 3개의 그룹에 5% 덱스트로스(D5W) 중의 0.5, 2 및 4μEq-㎏의 용량 수준에서 정맥내 투약하고(μEq는 메토트렉세이트기의 μmol임), 개의 제4 대조군 그룹에 IGF-MTX 접합체 제제에 대한 희석제로서 사용된 D5W를 투약하였다.
4개의 개의 그룹(1개의 대조군 및 3개의 시험 그룹)을 연구에서 사용하였다. 대조군 그룹, 중간-용량 및 고용량 그룹은 10마리(5마리의 수컷 및 5마리의 암컷)로 이루어지고, 저용량 그룹은 6마리의 개(3마리의 수컷 및 3마리의 암컷, 품종: 비글, Ridglan Farms)으로 이루어졌다. 시험 및 대조군 물품은 1시간에 걸쳐 5㎖/㎏/시간의 용량 용적에서 IV 점적주사에 의해 투여되었다.
모든 동물의 검사는 매일의 임상 관찰, 및 매일의 음식 및 물 모니터링을 포함하였다. 동물은 또한 주마다의 기준으로 상세한 신체 검사를 받았다. 체중을 초기에 그리고 이어서 8일, 15일, 22일, 29일 및 34일에, 및 35일에서의 부검 전에(주요 연구 동물), 및 추가적으로 30일, 37일, 44일, 49일에 및 50일에서의 부검 전에(회복 동물) 기록하였다. 음식 소비를 주마다 기록하였다. 전혈구수(CBC)를 제1 용량 후 24시간에, 및 각각의 후속하는 용량 전에 수행하였다. 완전 임상 병리학을 연구 개시 전, 주요 연구 및 회복 기간의 종료시 수행하였다.
모든 동물은 0.5 내지 4μEq/㎏의 용량으로 기재된 치료를 받고, 사망률은 치료와 연관되지 않았다.
안과학 및 ECG(QT 포함) 발견은 모든 시험 그룹에서 정상 생리학적 한계 내에 있다고 발견되었다.
0.5μEq/㎏에서 투약된 그룹에서, 치료에 대한 임상 반응은 경증이고, 1마리의 수컷 개에서의 경증 내지 중등도의 부동태화 및 주사된 공막, 2마리의 암컷 개에서의 구토 및 또 다른 암컷 개에서의 경증 호흡곤란으로 이루어졌다. 눈 주위의 경증 부종은 또한 1마리의 암컷 동물에서 관찰되었다. 상기 관찰의 모두는 5 용량 기간 동안 오직 한번 발생하는 단일 임상 사건이고, 일시적이고, 자체 해결되었다. 이들 동물에서의 투약 후 혈당 수준의 어떠한 감소는 무시할만하였다. 연구의 종료 시, 이 그룹에서 적혈구 덩어리의 최소 감소(대조군과 비교하여 약 10% 감소)가 주목된다. 그러나, 이 그룹에서의 적혈구(RBC), 헤마토크리트(Hct) 및 헤모글로빈(Hb)은 아주 정상 범위 내에 있었다. 이 발견은 이들이 낮은 규모이고 일시적이고 자체 해결되고 메토트렉세이트 치료의 예상된 부작용이면서 임상적으로 관련된다고 생각되지 않았다.
임상적으로 관련되지만 MTX 투여에 예상되고 흔한 불리한 반응인 2 및 4μEq/㎏에서 투약된 그룹에서 치료 관련된 임상 발견, 임상 병리학 및 총체적 부검은 하기와 같다:
□ 투약 후 거식증은 후속하는 체중의 감소, 및/또는 체중 손실에 의해 모든 개에서 관찰되었다. 2μEq/㎏에서 투약된 개에서, 거식증은 각각의 투약 후 제2 일에 보통 관찰되었고, 이는 며칠 동안 지속하고, 이어서 동물은 다음의 용량에 의해 완전히 또는 부분적으로 회복될 것이다. 주요 연구의 종료에 의해, 이들 개에서의 체중 증가는 무시할만하다. 수컷 동물은 34일 기간에 걸쳐 대조군 수컷 개에 대해 8.4%와 비교하여 오직 약 1.2% 증가하고, 암컷은 대조군 암컷에 대해 11.1%와 비교하여 2.8% 증가하였다. 이 그룹에서의 음식 소비는 대조군 개의 음식 소비보다 대략 22% 더 낮았다(성별 조합됨).
□ 4μEq/㎏에서 투약된 동물에서, 거식증은 2μEq/㎏에서 투약된 개에서보다 더 심각하였다. 이는 대조군과 비교할 때 치료 기간에 걸쳐 음식 소비의 대략 36% 내지 38% 감소를 발생시키고, 개에서의 전체 평균 체중 감소는 수컷에 대해 1.3㎏ 및 암컷에 대해 0.9㎏이었다. 3주 회복 기간 동안에, 이 그룹으로부터의 개는 체중이 다시 증가하여서, 가역성을 나타낸다.
□ 때때로 구역(구역질), 설사 및 구토는 2μEq/㎏에서 투약된 몇몇 동물에서 및 4μEq/㎏에서 투약된 모든 개에서 관찰되었다. 이것은 보통 투약이 수행될 때의 일자에 관찰되었다.
□ 적혈구 덩어리(RBC, Hb, Hct)의 감소 및 적혈구부동증/대적혈구증은 주요 연구의 종료에 경증이었다. 감소는 대조군 개와 비교할 때 각각 2 및 4μEq/㎏에서 투약된 개에 대해 대략 13% 및 15%이었다. 회복 기간의 종료에 의해, 적혈구 덩어리는 여전히 이들 2개의 그룹에서 연구전 수준 아래에 있었다. 그러나, RBC, Hb 및 Hct 수준의 감소는 정상 범위의 하한을 결코 초과하지 않았다.
□ 평균 전체 단백질 및 알부민 수준은 4μEq/㎏에서 투약된 동물에서 정상 범위의 하한보다 약간 낮게 감소하였다. 회복 기간 후, 이 수준은 정상 범위 내에 있었다. 감소된 알부민 수준은 필시 이들 개에서 보고된 바대로 거식증 및 몸무게 감소의 결과였다.
□ 2μEq/㎏에서 투약된 10마리 중 2마리의 개에서, ALT 활성은 정상 범위의 상한 위로 약간 증가하였다(평균적으로 11% 증가). 4μEq/㎏에서 투약된 개에서, 4마리의 개는 영향을 받고, 증가는 평균적으로 수컷에 대해 대략 1배 및 암컷에 대해 약 52%이었다. 간세포 손상을 나타내는 조직병리학적 발견의 부재에서, ALT의 증가는 필시 간세포 투과성의 변경 및 ALT의 증가에 의한 준치사 손상을 나타냈다.
□ 2μEq/㎏에서 투약된 그룹에서 글루코스 수준 감소(초기 혈당 수준 - 점적주사의 종료 직후의 혈당 수준)는 -2.5±1.3 내지 -0.7±1.3m㏖/ℓ(5 용량에 걸쳐 평균 감소, 성별 조합됨)의 범위였다. 4μEq/㎏에서 투약된 그룹에서, 증가는 -3.9±1.7 내지 -1.6±0.6m㏖/ℓ의 범위였다. 혈당 수준의 감소는 IGF의 예상된 약리학적 효과였다.
투약 및 치료 관련되고, 임상적으로 관련되고, 2 및 4μEq/㎏에서 투약된 그룹에서 독성학적으로 유의미하다고 생각되는 임상 및 병리학 발견은 하기 기재되어 있다. 하기 불리한 반응이 덜 흔하지만, 다양한 조건에 대해 MTX를 받는 인간에서 공지된 및 보고된 반응이라는 것에 주목해야 한다. 그러나, 하기 반응이 IGF의 존재에 의해 증대되지 않는다고 완전히 배제될 수 없었다. 이들 반응을 하기와 같다:
□ 아나필락시스모양(혈관부종), (눈, 입술, 귀 주위의) 얼굴의 피부, 목구멍, 목 및 앞다리의 종창(부종) 및 붉어짐(홍반)으로서 제시된 반응의 유형은 대부분 점적주사 동안 주목되었다. 투약 동안 이들 반응을 갖는 개의 전체 수(모든 그룹 조합됨)는 5마리의 개(제1 용량); 3마리의 개(제2 용량); 4마리의 개(제3 용량); 14마리의 개(제4 용량) 및 6마리의 개(제5 용량)였다. 투약의 제4 일에 이들 반응을 갖는 개의 수 및 반응의 중증도에서의 스파이크가 있었지만, 하기 용량(용량 5) 동안, 반응은 투약 1일, 2일 및 3일에 보인 반응에 필적한다는 것이 주목되어야 한다.
□ IGF-MTX 접합체의 2 또는 4μEq/㎏에서 투약된 그룹 사이에 아나필락시스모양 반응에서 차이(정성적 또는 정량적)가 있다고 보이지 않았다.
□ 2μEq/㎏에서 투약된 그룹으로부터의 2마리의 개는 제2 용량 동안 1마리의 수컷 개에서의 발작 및 1마리의 암컷 개에서의 제3 용량 동안 일시적인 의식 소실 및 자세 긴장으로 이루어진 신경학적 반응을 가졌다. 동물 둘 다는 추가의 신경학적 사건 없이 후속하는 치료를 받았다.
1마리의 개에서의 발작에 대한 하나의 그럴듯한 설명은 혈액-뇌-장벽(BBB)이 염증성 매개자의 방출에 의해 파괴되고/되거나(이 동물은 치료에 보통의 아나필락시스모양 반응을 갖고, 발작이 시작하기 전에 항히스타민제에 의해 치료되어야 함), BBB는 이 개에서 조직학적으로 발견되면서 맥락막에서 골수외 혈액생성에 의해 파괴되었다는 것일 것이다. 후자는 개에서 발작에서 대해 보고된 소인적 증상이다. 적은 신경학적 사건을 갖는 제2 개는 맥락총에서 골수외 혈액생성에 의해 또한 발견되었다. 둘째로, 발작을 갖는 개는 점적주사 동안 혈액에서 MTX의 예상치 못하게 높은 스파이크를 가졌다. 1일에 이 개에서의 MTX 수준은 2μEq/㎏에서 투약된 임의의 다른 개에서보다 적어도 2배 내지 7배 더 높고, 이것은 4μEq/㎏에서 시험 물품을 받는 개에서보다 적어도 2배 더 높았다. 따라서, 이 동물에서의 발작에 대한 가장 가능한 설명은 BBB의 그럴듯한 파괴 및 혈액에서의 MTX의 높은 스파이크였다.
조직병리학적으로 잠재적인 독성학적 유의성의 몇몇 발견이 있고, 이들은 하기와 같다:
□ 피질 및 수질 림프구의 고갈로 인한 흉선 위축증은 치료 용량에 의한 빈도 증가 및 증중도에 의해 몇몇 개에서 발생했다. 흉선 위축증은 확연하고, 0.5 내지 4.0μEq/㎏/주 용량 범위에 걸쳐 용량 관련되고, 회복 기간에 걸쳐 지속적이었다. 이것은 증식성 흉선 림프구에서 시험 물품의 직접적인 효과로 발생하지만, 흉선 위축증은 간접적인 스트레스 반응으로서 최고로 설명된다. 흉선 위축증은 MTX 화학요법에 대한 반응으로서 인간에서 보고되었다.
□ 발작을 갖는 2μEq/㎏에서 투약된 그룹에서의 동물은 연구에서 다른 동물에서 보이지 않은 몇몇 발견을 갖는다. 이것은 맹장 및 직장의 표재 점막의 림프구성 침윤물의 증가, 편측 국소 퇴행 및 하나의 부신의 피질속질 영역의 무기화작용, 및 기관 및 주기관지의 호흡 상피에서의 혼합된 백혈구 침윤물에 의한 주요 과증식을 포함하였다.
유리 MTX에 대한 독성동태(TK) 매개변수는 낮은(0.5μEq/㎏), 중간(2.0μEq/㎏) 및 높은(4.0μEq/㎏) MTX 당량 용량 수준에서 인슐린양 성장 인자(IGF) MTX 접합체에 의한 5-용량 1주 1회 정맥내 점적주사 연구로부터 생기는 혈장 농도-시간 데이터로부터 추산된다. MTX의 혈장 수준의 일관된 차이는 상이한 성별의 동물 사이에 관찰되지 않고, 이에 따라 수컷 및 암컷으로부터의 데이터는 조합되었다. MTX의 혈장 수준은 IGF-MTX 접합체의 1시간 정맥내 점적주사 동안 및 이후 둘 다에 시간에 따라 증가하였다. 1일에 그리고 6 내지 10의 평균 혈장 농도에 기초하여, Tmax는 모든 용량 수준에 대해 점적주사의 시작으로부터 2시간이었다. Cmax 값은 71.6 내지 511.9ng/㎖의 범위였다. AUC∞ 및 Cmax 값 둘 다는 용량 비례하였다. MTX의 혈장 말단 반감기 및 평균 잔류 시간은 각각 4.6 내지 5.5시간 및 6.1 내지 7.6시간의 범위였고, (접합체로부터의 유리 MTX의 방출에 기초한) 낮은 겉보기 청소율 및 높은 겉보기 분포 용적은 각각 0.34 내지 0.46ℓ/hr/㎏ 및 2.24 내지 2.81ℓ/㎏의 범위였다. 투약의 29일 이후의 MTX의 약물동태학은 투약의 1일 이후의 것과 유사하였다.
이 발견은 유리 MTX가 접합체의 대사로 인해 시간 의존적 방식으로 방출된다는 것을 제안한다. 따라서, MTX에 대한 생성된 TK는 시간에 걸쳐 접합체로부터의 MTX의 방출 및 제거 둘 다에 의존적이다.
비글 개에 대한 0.5 내지 4.0μEq/㎏의 용량 범위에서의 IGF-MTX 접합체의 정맥내 투여 이후에, IGF-MTX 접합체의 혈청 수준은 빨리 감소하였다. 성별 바이어스가 없고, 혈청 노출의 증가가 1일과 비교하여 29일에 관찰되었다. 작거나 0.02 내지 0.05ℓ/㎏/hr의 범위인 IGF-MTX 접합체의 겉보기 청소율은 1일과 비교하여 29일에 25% 내지 50% 감소하지만, 또한 작고 0.07 내지 0.20ℓ/㎏의 범위인 겉보기 분포 용적은 임의의 경향을 나타내지 않았다. 2.5 내지 4.6시간의 범위인 IGF-MTX 접합체의 말단 반감기는 1일과 비교하여 29일에 미미하게 더 길지만, 1.4 내지 5.3시간의 범위인 평균 잔류 시간은 임의의 경향을 나타내지 않았다. 종합하여 이들 발견은, IGF-MTX 접합체의 정맥내 투여 이후에, 이의 큰 분자 크기와 일치하는 작은 분포 용적으로부터 낮은 청소율에 의해 제거된다고 제안된다. IGF-MTX 접합체의 제거는 연속적인 용량에 의해 미미하게 더 느려서, 혈장 노출을 증가시켰다. IGF-MTX 접합체의 제거는 최대 MTX 농도의 발생을 진행시켰다.
마지막으로, 임상 관찰, 안과학, 심전도 검사, 총체적 부검 및 조직병리학을 포함하는 모든 생성된 데이터의 분석은 5주 동안 주마다 0.5μEq/㎏에서 IGF-MTX 접합체에 의해 정맥내 치료된 개에서 약물/치료 관련된 유의미한 독성을 밝혀내지 못했다.
0.5μEq/㎏의 이 용량 수준에서, 필시 치료 관련되는 유일한 발견은 1마리의 동물에서 경증 내지 중증도의 부동태화 및 주사된 공막, 2마리의 개에서 구토 및 또 다른 개에서 경증 호흡곤란이었다. 눈 주위의 경증 부종은 또한 1마리의 개에서 관찰되었다. 연구의 종료 시, 또한 적혈구의 약한 감소(대조군 그룹에 비해 약 10% 감소)가 있었다. 이 발견은 이들이 낮은 규모이고, 일시적이고, 자체 해결되고, 메토트렉세이트 치료의 예상된 부작용이므로 임상적으로 관련된다고 생각되지 않았다.
따라서, 이 실험의 조건 하에, 이 연구에서의 관찰된 부작용 수준(NOAEL)은 5주 동안 주마다 투약되는 0.5μEq/㎏에 동등하다고 생각되지 않았다.
2 및 4μEq/㎏에서 투약된 그룹에서, 또한 MTX 투여와 연관된 부작용은 거식증과 감소된 체중 증가 또는 체중 감소, 때때로의 설사 및 구토를 포함하였다. 적혈구 덩어리의 약간의 감소(약 13 내지 15%) 및 감소된 알부민 수준 및 ALT 활성의 약간의 증가가 또한 있었다. 이들 관찰은 용량 의존적인 것으로 보이고, RBC 감소의 배제에 의해, 회복 기간의 종료에 모든 동물의 완전한 회복이 있었다. 이들 2개의 그룹에서, 흉선 위축증 및 십이지장에서의 괴사성 세포의 증가된 수는 또한 조직병리학에서 주목되었다.
이 연구에서 또한 2개의 유형의 불리한 반응이 주목되고, 이는 바람직하지는 않지만 이들이 MTX 투여에 대한 불리한 반응을 보고하면서 완전히 예상치 못했다. 2μEq/㎏에서 투약된 그룹에서, 2마리의 개에서 신경학적 사건이 있었다. 제1 개는 제2 용량 동안 발작을 가졌다. 이 동물에서, 발작은 염증성 매개자 및/또는 골수외 혈액생성에 의해 유도된 혈액-뇌-장벽에서의 파괴 및 유리 MTX의 높은 스파이크의 결과일 수 있다. 제2 개에서, 의식 상실 및 자세 긴장의 하나의 에피소드가 있었다. 2 및 4μEq/㎏에서 투약된 그룹에서 아나필락시스모양 반응의 발생이 있었다.
신경학적 및 아나필락시스모양 반응에 대해, MTX에 의해 필시 유도되지만, IGF가 이들 사건에서 어떠한 역할을 하지 않는다는 것이 완전히 배제될 수 없었다. 이들 불리한 반응의 둘 다가 적절한 치료제(항히스타민제 및 디아제팜)에 의해 쉽게 제어될 수 있다는 것에 주목해야 한다.
실시예 12
IGF -1R을 발현하는 진행된 종양의 치료에서의 IGF - 메토트렉세이트 접합체의 I상 연구
이 연구의 1차 목적은 IGF-1R을 발현하는 진행된, 이전에 치료된 악성종양의 치료 동안 독성의 평가에 의해 765IGF-MTX의 최대 관용 용량(MTD)을 결정하는 것이다. 하나의 포함 기준은 대상체의 종양(조직, 골수, 또는 혈액)이 면역조직화학(IHC)에 의해 IGF-1R을 발현하는 종양 세포의 10% 이상으로서 정의된 IGF-1R을 발현해야 한다는 것이다. 고형 종양 또는 림프종을 갖는 환자가 등록하였다.
19명의 대상체는 이 용량 상승 연구에 등록하였다. 765IGF-MTX는 250㎖의 5% 덱스트로스 또는 의사의 결정으로 10% 덱스트로스 중에 28일 사이클의 1일, 8일 및 15일에 1시간에 걸쳐 IV 점적주사로서 투여되었다. 치료는 질환 진행, 허용 불가능한 독성 또는 환자 거절까지 지속하였다. 반응의 평가는 사이클 2±7일의 종료 시, 및 이후 2회 사이클마다 수행된 영상화 연구에 의해 확인되었다. 하기 표는 시험된 각각의 용량 수준에 대해 시험된 대상체, 이들이 갖는 악성종양의 유형, 이들이 완료한 사이클의 수, 이들이 용량 제한 독성(DLT)을 경험하는지 및 이용 가능한 경우, 연구 중단에 대한 이들의 이유를 보여준다. 용량 수준 3에서 호지킨 림프종을 갖는 1명의 환자를 CT 스캔에 의해 명확히 안정한 질환에 의해 22개의 용량에 의해 치료하지만, 림프절 생검이 암의 증거를 보여줄 때 치료를 중단하였다.
Figure pct00025
부작용
가능하게 또는 아마도 연구 약물과 관련된 것으로 등급화된 고형 종양 환자에서 이전의 고형 종양 I상 동안 경험한 부작용은 하기 표에 기재되어 있다.
Figure pct00026
부작용 중 어느 것도 모든 대상체 또는 단일 대상체에서의 모든 약물 투여에서 보이지 않았다. 가장 흔한 부작용은 연구 약물, 오한 및 열의 결과가 예상된 저혈당증이었다. 이것이 발생할 때, 이들은 보통 점적주사의 종료 후 2시간 내에 해결되었다. 1명의 대상체는 점적주사에 의해 시작하여 밤새 지속하는 등급 2 열을 가졌다. 1명의 대상체는 점적주사 동안 시작하여 밤새 지속하는 등급 3 저혈압을 가졌다. 구역 및 구토는 흔하지만, 화학요법에 의해 통상적인 것처럼 몇 시간 지연이 아니라 점적주사 동안 발생했다. 모든 경우에, 이들은 점적주사의 종료 후 1시간 내에 해결되었다. 복통 또는 경련통은 흔하지만, 결장 암종을 갖는 환자에 제한되는 것으로 보여서, 이는 이들의 종양 조직에 결합하고 이를 표적화하는 연구 약물과 연관될 수 있다. 보이는 1개의 발작은 용량 수준 0.4μEq/㎏에서 1일(환자의 제16 약물 용량)에 사이클 5 동안 대상체에서 점적주사 동안 발생하고, 2분에 해결되었다. 이 환자는 또한 동시에 등급 3 저혈압 사건을 경험하고, 이에 대해 밤새 입원하였다.
혈구감소증의 부재. 놀랄 만하게, 치료된 임의의 대상체에서 임의의 혈구감소증의 증거가 없었다.
실시예 13
MDS 및 AML 세포주에 대한 시험관내 세포독성 및 아자시티딘과의 시너지.
IGF -MTX는 MDS 세포주에 대해 시험관내 세포독성이다.
765IGF-MTX를 삼중수소 도입 검정에서 시험관내 시험하였다. MDS-L 세포주는 Kawasaki Medical School(일본)의 Kaoru Tohyama 박사로부터 허가되었다. 세포를 1일에 96웰 플레이트에서 150㎕의 배지 중에 웰당 15,000개의 세포로 플레이팅하였다. 2일에, IGF-MTX를 78nEq/ℓ 내지 15 마이크로Eq/ℓ의 범위의 농도에서 첨가하였다. 6일에, 1 마이크로Ci의 삼중수소화 타이미딘을 웰마다 첨가하고, 6시간 후 웰을 수확하고 계수하였다. 결과는 도 6에 도시되어 있다. IC50은 359nEq/ℓ였다. 1 nEq는 1n㏖의 MTX기로 정의된다. 765IGF마다 대략 8개의 MTX기가 있었다.
IGF -MTX는 골수성 암 세포주에 대해 시험관내 세포독성이고, 아자시티딘과 상승적이다.
3개의 AML 세포주를 IGF-MTX에 대한 민감도에 대해 본 발명자들의 실험실에서 시험하였다. 3개의 세포주는 HL-60, HL-60/S4 및 Kasumi-1이었다. 모든 3개는 458 내지 668nEq/ℓ의 IC50(IGF-MTX 접합체에서의 메토트렉세이트기의 nM)에 의해 IGF-MTX에 민감하였다. 이는 MCF7 유방암 세포주 및 LNCaP 전립선암 세포주에 대해 IC50과 거의 동일하고, 이들 둘 다는 마우스 이종이식에서 IGF-MTX에 민감하다.
IGF-MTX의 효과는 또한 적어도 Kasumi-1 및 HL-60 세포주에 대해 아자시티딘에 의해 상가적 또는 상승적이었다(HL-60/S4에 대한 조합은 시험되지 않았다). 이의 IC50의 약 1/3인 아자시티딘의 농도의 존재 하에, IGF-MTX의 IC50은 Kasumi-1 세포주에서 668로부터 398 nEq/ℓ로 감소하고, HL-60에서 466으로부터 409 nEq/ℓ로 감소하였다.
실시예 14
MDS 세포주는 IGF -1R의 높은 수준을 갖는다
MDS-L 세포를 RMPM1640/10% 송아지 태아 혈청/50ng/㎖의 IL-3, 50 micoM 베타-머캅토에탄올 중에 성장시켰다. 이들을 0.5㎎/㎖(단백질)에서의 25mM Tris, 150mM NaCl, pH 7.5(TBS) 중에 1㎖당 2000만 개의 세포로 재현탁된 1㎖당 약 5 x 10^5 세포의 밀도에 있을 때 수확하였다.
MCF7을 이글 최소 필수 배지, 10% FBS, 0.1㎎/㎖ 인간 인슐린 중에 성장시켰다. MCF7을 1.0㎎/㎖(단백질)에서 TBS에 대수기에서 수확하였다.
비환원 SDS-PAGE를 4 내지 20% Tris 글리신 쐐기 겔에서 실행하였다.
샘플을 4x LDS(65㎕의 샘플, 20㎕의 LDS 완충제)에 의해 희석하였다.
레인
1. 마커 8㎕의 NEB P7710s 예비염색됨
2,3, 블랭크.
4. 15㎕의 MCF7 샘플(12㎍).
5. 3.75㎕의 MCF7 샘플(3㎍)
6. 블랭크.
7. 20㎕의 MDS 샘플(8㎍)
겔을 25mM Tris, 192mM 글리신, 0.1% SDS, 20% 메탄올(v/v) 이동 완충제 중에 0.2 마이크론 PVDF 필터(Invitrogen LC2002)로 전기이동시켰다.
막을 23℃에서 1시간 동안 TBST(TBS와 0.1% Tween-20)와 5% 분유 중에 차단하고, 이어서 4℃에서 IGF-1R(RnD systems)에 대해 0.2㎍/㎖의 BAF391 바이오티닐화 마우스 단일클론 항체에서 밤새 프로빙하였다. 다음날, 이것을 각각 TBST 중에 12분 동안 3회 세척하고, 이어서 30㎖의 TBST + 5% 밀크 중에 희석된 1/2,000 희석된 Pierce 고민감도 스트렙타비딘-HRP 접합체(thermo sci 카탈로그 21130호) 중에 희석하였다. Tt는 실온에서 60분 동안 그것에서 흔들렸다. 이어서 I를 TBST 중에 2회 잠시 세정하고, 이어서 12분 동안 TBST 중에 3회 흔들렸다.
이어서, 이것을 흔들림 없이 5분 동안 ECL Prime 웨스턴 블롯 시약에 넣고, 카메라 시스템에 넣고, 10분 동안 판독하였다.
결과:
웨스턴 블롯 결과는 도 7에 도시되어 있다. 가시적인 밴드인 왼쪽의 2개의 레인은 MCF7이고, 로딩된 전체 단백질의 각각 12㎍ 및 3㎍를 가졌다(레인 4 및 5). 오른쪽 염색된 레인은 MDS-L(레인 7)이고, 단백질 검정에 의해 8㎍의 로딩된 단백질을 가진다. 그러나 평행하게 겔 흐름의 쿠마시 염색에 의해 레인 4에서의 MCF7이 실제로 레인 7에서의 MDS-L만큼의 단백질의 거의 반을 갖는 것으로 보였다. MDS-L 레인 7에서의 염색된 IGF-1R 밴드는 200kDa 초과에서 흐른다. MCF7 레인에서의 2개의 염색된 밴드는 약 80과 150kDa 사이에 흐른다. IGF-1R은 205kD의 예측된 분자량의 이합체이고, 여기서 각각의 단량체는 81kDa 및 20kDa 폴리펩타이드를 함유한다. 그래서 MDS-L 밴드는 205kDa 이합체와 일치하고, MCF7 밴드는 81kDa 폴리펩타이드 및 102kDa 단량체와 일치하였다.
MCF7은 IGF-1R의 높은 발현을 위한 표준 세포주이고, MDS-L은 IGF-1R의 대략 동일한 양을 갖는다. 그래서 MDS-L은 IGF-1R의 높은 발현을 갖는다.
실시예 15
IGF -MTX는 고형 종양 전립선 및 유방암 세포주 LNCaP 및 MCF7의 증식을 저해한다
시험관내 증식 검정
LNCaP 세포를 100㎕ 중에 RPMI + 글루타민 + 10% FCS 배지에서 웰마다 5,000개의 세포로 96웰 플레이트에서 플레이팅하였다. 24시간 후, 표시된 농도에서 약물(대조군), IGF-MTX 또는 MTX를 함유하지 않는 100㎕의 새로운 배지를 첨가하였다. 추가의 항온처리의 48시간 후, 세포 증식을 제조사의 지시에 따라 세포 Counting Kit-8(Dojindo Molecular Technologies(일본 구마모토))에 의해 평가하였다.
MCF7을 0.01㎎/㎖ 인간 재조합 인슐린, 10% 소 태아 혈청 및 pen/strep를 갖는 이글 최소 필수 배지에서 배양하였다. 시험관내 증식 검정을 위해 이것을 96웰 플레이트에서 웰마다 8,000개의 세포에서 플레이팅하였다. 1일 후, 765IGF-MTX 또는 MTX를 표시된 농도로 첨가하였다. 5일 초과 후, 1 uCi 삼중수소화 타이미딘을 50㎕의 새로운 배지에서 웰마다 첨가하였다. 6시간 후 세포를 수확하고 방사능을 계수하였다.
시험관내 종양 저해
세포 증식에 대한 효과를 평가하기 위해, IGF-MTX 접합체 및 유리 MTX를 시험관내 LNCaP 종양 세포와 항온처리하였다. 물질 둘 다는 비치료된 대조군 세포와 비교하여 LNCaP 세포의 증식을 저해하였다. 2000nM의 가장 높은 시험된 농도에서, 유리 MTX는 IGF-MTX보다 유의미하게 더 높은 저해를 발생시켰다(P=0.003). 500nM에서의 유리 MTX에 의한 증식의 저해는 2000nM에서 IGF-MTX의 것과 유의미하게 다르지 않았다. 긴-R3-IGF-MTX에 대한 IC50은 약 1000nEq/ℓ이었다(nM 메토트렉세이트기)(McTavish, H. et al., Translational Research 2009;153:275-282). 이 경우에, 접합체의 IGF 부분은 긴-R3-IGF이었다.
MCF7 세포에 의한 765IGF-MTX의 증식 검정의 결과는 도 8에 도시되어 있다. 이 경우에, 765IGF-MTX의 IC50은 715nEq/㎖이었다(도 8). 평행한 검정에서 MCF7에 대한 유리 메토트렉세이트에 대한 IC50은 17nM이었다(데이터 비기재).
실시예 16
IGF -MTX는 IGF -MTX의 6배 더 낮은 용량에서도 유리 MTX보다 더 효과적으로 마우스에서의 전립선암 세포주의 생체내 종양 성장을 저해한다
IGF-MTX 접합체 합성, 분석 및 정량화
긴-R3-IGF-1을 Novozymes GroPep(Novozymes BioPharma AU(호주 티바튼))로부터 구입하였다. MTX를 Sigma(미국 미주리주 세인트 루이스)로부터 구입하였다. 긴-R3-IGF-1(20㎎)을 3.0㎖, 10mM HCl 중에 용해시켰다. 인산나트륨(2.5㎖, 200mM, pH 7.4) 및 고체 유레아(1.625g)를 용액에 첨가하였다. 용액을 4℃에서 밤새 20mM 인산나트륨, pH 7.4, 5mM NaCl, 6.5M 유레아(유레아 투석 완충제)에 대해 투석(3500 m.w. 컷오프)하였다. 0.4㎖의 유레아 투석 완충제 중에 용해된 1.4 ㏖ 당량의 NaOH에 의해 중화된 MTX 수화물(14.8㎎)을 투석 백에서 긴-R3 IGF 용액에 첨가하였다. 긴-R3-IGF-1 및 MTX를 1-에틸-3-[3-다이메틸아미노프로필]카보다이이미드 하이드로클로라이드(EDC)에 의한 항온처리에 의해 커플링하였다. EDC는 MTX에서 단백질 아민기와 카복실기 사이의 직접적인 아마이드 결합을 생성시키는 0-길이 가교결합제이다. EDC(60㎎)를 유레아 투석 완충제(0.6㎖) 중에 새로 용해시키고, 이어서 투석 백에 첨가하고, 이것을 밀봉하고 실온에서 2시간 동안 접시에서 저장하였다. 반응은 도 1에 도식적으로 도시되어 있다.
2시간 후, 백을 유레아 투석 완충제 중에 배치하고, 4℃에서 3.5시간 투석하였다. 투석 완충제를 2mM HCl로 바꾸고, 투석을 밤새 계속하였다. 긴-R3-IGF-1은 3개의 라이신 잔기 및 접합에 이용 가능한 전체 4개의 아미노기에 대한 아미노 말단을 갖는다. 포화의 정도를 결정하기 위해, 접합된 긴-R3-IGF-1 단백질에서의 MTX 농도는 ε372㎚ = 6.47mM-1을 이용하여 pH 11에서 광학 흡수에 의해 결정되었다. 접합된 단백질은 이후 (긴-R3-IGF-1-메토트렉세이트에 대해) IGF-MTX라 불린다.
생체내 종양 성장 검정
MCF7 세포(인간 유방 선암종 세포주)를 0.1㎎/㎖의 인슐린 및 10% FCS가 보충된 이글 최소 필수 배지에서 성장시켰다. 에스트로겐 의존적 MCF7-L 세포주를 미네소타 대학교(University of Minnesota)의 Deepali Sachdev로부터 받았다. MCF7-L 세포를 0.1㎎/㎖의 인슐린이 보충된 변형된 IMEM 배지(Invitrogen(미국 캘리포니아주 칼스바드))에서 성장시켰다. LNCaP 세포(전이성 인간 전립선 선암종)를 글루타민 및 10% FCS(Invitrogen(미국 캘리포니아주 칼스바드))가 보충된 RPMI에서 성장시켰다. 세포를 5% CO2 습윤 분위기에서 37℃에서 성장시켰다. 각각의 경우에, 세포를 대략 ⅔ 포화도로 성장시키고, 트립신화에 의해 수확하고, 풍부한 배지에 의해 세척하고, 이어서 PBS에 의해 2회 세척하고, BD 마트리겔 매트릭스(Becton Dickinson(미국 뉴저지주 프랭클린 레이크스))에서 포스페이트 완충 식염수 중에 재현탁시켰다. 세포를 마우스에서 등에 피내로 주사하였다. 에스트로겐 펠릿(0.5㎎ 에스트라디올, 60일 방출, Innovative Research of America(미국 플로리다주 사라소타))을 MCF7 및 MCF7-L 세포를 이식하기 전 2일에 견갑골 사이에 피하로 이식하였다. MCF7 및 MCF7-L 세포를 8주령 암컷 nu/nu 마우스에서 이식하였다. LNCaP 세포를 8주령 수컷 nu/nu 마우스에서 이식하였다. IGF-MTX 접합체를 2mM HCl, 1% 글라이세롤 중에 투여하였다. MTX를 PBS 중에 용해시켰다. 비처리된 비히클 대조군은 2mM HCl, 1% 글라이세롤을 받았다. 약물을 마우스 중량 1그램당 12.5:1의 용적으로 꼬리 정맥 주사에 의해 정맥내 투여하였다. 모든 연구는 미네소타 대학교 동물 관리 및 사용 위원회(Animal Care and Use Committee)에 의해 허가받고, 관련 윤리 가이드라인을 준수하였다.
결과: 마우스에서의 이종이식 종양 성장 저해
3개의 생체내 연구를 긴-R3-IGF-1에 의한 MTX의 표적화를 평가하도록 수행하였다. 초기 예비 연구에서, 유방암 MCF7 세포를 누드 마우스의 등에서 피내로 이식하였다. 15마리의 마우스에서의 종양이 감지 가능(대략 5 x 5㎜)할 때, 마우스를 3개의 그룹(그룹마다 n=5)으로 무작위로 분포시켰다. 무작위화 후, 마우스를 비히클, 40n㏖/g에서의 유리 MTX 또는 10n㏖의 MTX/g에서의 IGF-MTX의 정맥내 꼬리 정맥 주사에 의해 0일, 4일 및 8일에 치료하였다. 제1 치료 후 훨씬 1일마다, IGF-MTX 접합체 치료된 그룹에서의 종양은 다른 그룹에서의 것보다 작았다(도 9). 관찰의 12일에 대해, 종양은 유리 MTX 및 비치료된 대조군 그룹에서 계속해서 성장하는 한편, IGF-MTX에 의해 치료된 종양은 평균적으로 종양 성장의 징후를 나타내지 않았다. 12일에 IGF-MTX 접합체 치료된 그룹과 MTX 치료된 그룹 사이의 평균적으로 종양 용적의 대략 8배 차이가 있고, 이는 통계학적으로 유의미하다고 발견되었다(P=0.048, 독립 t 시험). 접합체가 유리 MTX의 용량보다 MTX의 4배 더 낮은 용량에서 사용되더라도, IGF-MTX 접합체에 의해 치료된 마우스에서의 종양 용적은 더 낮았다. 이 데이터는 용량의 1/4에서 사용될 때에도 IGF-MTX 접합체가 생체내 MCF7 종양의 성장을 저해하는 데 있어서 유리 MTX보다 더 효과적이라는 것을 나타낸다.
제2 생체내 연구를 MCF7-L인 에스트로겐 의존적 MCF7 균주를 사용하여 수행하였다. 종양 세포를 이식하고, 마우스를 종양 성장에 대해 모니터하였다. 종양 이식 후 9일에, 가시적인 종양을 갖는 15마리의 마우스를 동등한 평균 종양 크기를 갖는 3개의 그룹으로 분류하였다. 마우스를 이어서 비히클, 유리 MTX(40n㏖/g) 또는 IGF-MTX 접합체(10n㏖의 MTX/g)에 의해 0일 및 5일에 꼬리 정맥에 의해 주사하였다. 종양 성장을 22일에 IGF-MTX 또는 유리 MTX에 의해 치료된 동물에서 거의 동등하게 저해하였다(도 10). 그러나, IGF-MTX 접합체의 용량은 유리 MTX의 용량보다 4배 더 낮았다. IGF-MTX 그룹과 비치료된 대조군 사이의 22일에 종양 용적의 차이는 유의미하였다(P=0.008). 이 데이터는 다시 IGF-MTX의 더 낮은 용량이 생체내 종양 성장을 저해하는 데 유리 MTX의 더 높은 용량과 동등하게 효과적이라는 것을 제안한다.
최종 생체내 연구에서, 전립선암 LNCaP 세포를 마우스에서 0일에 피내 이식하고, 이는 이어서 상이한 치료 그룹으로 무작위화되었다. 마우스는 다양한 농도에서 MTX 또는 IGF-MTX 접합체에 의해 5일에(종양이 가시적이기 전) 단일 꼬리 정맥 주사를 받았다(도 11). 종양 크기는 유리 MTX의 더 높은 용량(50, 20 또는 8n㏖/g)에 의해 치료된 마우스와 비교하여 8n㏖/g 또는 3.2n㏖/g의 IGF-MTX 접합체(투약량은 각각의 MTX 분자의 몰로 표시됨)에 의해 치료된 그룹에서 훨씬 더 작았다. 1.28n㏖/g인 시험된 IGF-MTX 접합체의 가장 낮은 용량은 종양 성장을 저해하지 않았다. 연구의 종료(98일) 시 50n㏖/g의 유리 MTX와 비교하여 8n㏖/g의 IGF-MTX를 받는 동물에서의 종양 성장의 차이는 유의미하였다(P=0.04, 2측 t 시험). 2개의 가장 높은 IGF-MTX 농도(8n㏖/g 및 3.2n㏖/g) 및 가장 높은 유리 MTX 농도(50n㏖/g)(P=0.011)에 대한 풀링된 결과 사이에 또한 유의미한 차이가 있었다. 또한, 2개의 가장 높은 IGF-MTX 농도(8n㏖/g 및 3.2n㏖/g) 및 유리 MTX 농도(20n㏖/g 및 50n㏖/g)에 대한 풀링된 결과 사이의 차이는 유의미하였다(P=0.029). 이들 데이터에 기초하여, IGF-MTX 접합체가 6.25배 더 낮은 용량(8n㏖/g IGF-MTX 대 50n㏖/g MTX)에서도 생체내 종양 성장에 대해 유리 MTX보다 더 효과적이라고 결론짓는 것이 합당하다.
토의:
IGF-MTX(LR3IGF-MTX)는, IGF-MTX에서의 메토트렉세이트기의 6배 더 낮은 몰 용량(8 nEq/㎏)이 유리 MTX의 6배 더 높은 몰 용량(50n㏖/㎏)보다 더 효과적이라는 의미에서 LNCaP 모델에서 종양 성장을 저해하는 데 유리 MTX보다 적어도 6배 더 효과적이었다. 마찬가지로, MCF7 모델에서 IGF-MTX는 유리 MTX보다 IGF-MTX의 4배 더 낮은 몰 용량에서도 유리 MTX만큼 적어도 효과적이었다. 이는 시험관내 결과와 대조적이고, 여기서 MCF-7 세포에 의해 MTX의 IC50은 IGF-MTX보다 약 50배 더 낮다(IGF-MTX에 대한 17nM MTX 대 715 nEq/ℓ). 이는 생체내 종양 세포에 대한 IGF-MTX의 대단한 표적화가 있다는 것을 나타낸다.
실시예 17
혈액 세포 및 MDS-L의 유세포분석법은 건강 혈액 세포가 CD34 또는 IGF -1R을 거의 갖지 않고, MDS-L 세포가 CD34 및 IGF -1R의 높은 수준을 갖는다는 것을 보여준다
유세포분석법 검정은 CD34, 혈액 줄기 세포의 마커 및 IGF-1R에 대한 시험에 개발되었다. IGF-1R(CD221이라 불림)은 BD Biosciences로부터의 CD221 클론 1H7에 의해 검출되었다.
유세포분석법은 건강한 공여자로부터의 용혈된 전혈에서 수행되고, 생존 가능하게 동결된 100백만 개/㎖(MDS-L 세포)의 다양한 용적과 혼합되었다.
전혈 단독으로부터의 결과는 도 12에 도시되어 있고, 10㎕의 MDS-L 세포와 혼합된 100㎕의 전혈로부터의 결과는 도 13에 도시되어 있고, 75㎕의 MDS-L 세포 단독에 의한 결과는 도 14에 도시되어 있다. Q1(CD221+/CD34-), Q2(CD221+/CD34+), 및 Q4(CD221-/CD34+)에서의 세포의 백분율은 표 2에 요약되어 있다.
Figure pct00027
건강한 공여자의 혈액에서, 백혈구는 CD34 또는 IGF1R(CD221)에 대해 거의 양성이 아니었다. MDS-L 세포에서, 거의 모든 세포는 CD34 또는 IGF1R에 양성이고, 9.9%는 둘 다에 양성이었다. 이는 MDS 세포가 IGF1R 또는 CD34 또는 둘 다에 양성인 혈액에서 거의 유일한 세포라는 것을 제안한다.
실시예 18
AML -03: 골수이형성 증후군, CMML 및 희소아구성 AML의 치료에서의 IGF-메토트렉세이트 접합체의 파일럿 연구.
개요
1차 목적 :
이 연구의 1차 목적은 최대 관용 용량(MTD)을 결정하는 것을 포함하여 진행된, 이전에 치료된 골수이형성 증후군(MDS), 만성 골수단핵구성 백혈병(CMML) 및 희소아구성 급성 골수성 백혈병(희소아구성 AML 또는 O-AML)의 치료를 위해 765IGF-MTX인 인슐린양 성장 인자-1-메토트렉세이트 접합체를 사용하는 것의 안전성 및 관용성을 결정하는 것이다.
2차 목적 :
이 연구의 2차 목적은 진행된, 이전에 치료된 MDS, CMML 또는 O-AML을 갖는 환자에서 반응률, 무진행 생존율 및 전체 생존율에 의해 측정된 바와 같은 765IGF-MTX의 임상 이익을 결정하는 것이다.
환자 집단 :
Figure pct00028
표준 치료에 불응성이거나 불관용성이고, 이러한 치료에 더 이상 반응하지 않을 것 같은 MDS, CMML 또는 O-AML의 진단.
Figure pct00029
환자는 연구 등록 전에 이전의 항암 치료의 급성 독성 효과(등급 1 이하의 CTCAE v.4.0)로부터 회복되어야 한다.
Figure pct00030
18세 이상
Figure pct00031
ECOG 성능 상태 0, 1, 또는 2(부록 III)
연구 설계 :
이 파일럿 연구는 진행된, 이전에 치료된 MDS, CMML 및 O-AML을 갖는 환자에서 IGF-메토트렉세이트 접합체(765IGF-MTX)의 사용을 평가할 것이다. 1㎏당 0.20 내지 2.5μ당량의 용량에서의 765IGF-MTX는 28일 사이클의 1일, 8일 및 15일에 1.5시간에 걸쳐 IV 점적주사로서 투여된다. 치료는 2 사이클 후 평가된 바와 같은 질환 진행, 허용 불가능한 독성 또는 환자 거절까지 지속한다. 반응의 평가는 사이클 2, 4 및 6의 종료 시 수행된 골수 연구에 의해 확인될 것이다(각각±3일).
최종 최대 관용 용량 수준(MTD)이 결정되면, 765IGF-MTX의 약물동태학(PK)은 3명의 환자에서 MTD의 사이클 1의 1일 및 2일 및 15일 및 16일에 평가될 것이다.
연구 계획
환자를 스크리닝하고, 이어서 실험에 진입한 경우 28일 사이클의 1일, 8일 및 15일에 치료하였다. 환자를 질환 진행, 허용 불가능한 독성 또는 환자가 취소를 선택할 때까지 치료한다. 골수 샘플을 제1 용량 전 28일 내, 및 사이클 2, 4 및 6 후 취한다. 약력학적 샘플을 사이클 1의 1일, 사이클 2의 1일 및 15일 및 후속하는 사이클의 15일에 취한다. 최대 관용 용량에서, 약물동태학 샘플을 사이클 1의 1일 내지 2일 및 15일 내지 16일에 2일에 걸쳐 취한다.
I상 용량 수준
Figure pct00032
1. 목적
1.1. 1차 목적
1차 목적은 IGF-MTX의 MTD를 결정하는 것을 포함하여 진행된, 이전에 치료된 MDS, CMML 또는 O-AML의 치료에 사용될 때 765IGF-MTX의 안전성 및 관용성을 결정하는 것이다.
1.2. 2차 목적
2.2.1 진행된, 이전에 치료된 O-AML, CMML 또는 MDS를 갖는 환자에서 전체 반응률(ORR; = CR 및 PR), 무진행 생존율(PFS), 누적 진행 발생(CIP) 및 전체 생존율(OS)을 평가함으로써 765IGF-MTX의 임상 이익을 평가한다.
1.3. 상관관계 목적
1.3.1. 765IGF-MTX, 765IGF, 메토트렉세이트 및 7-OH 메토트렉세이트의 약물동태학(PK)을 규명한다
1.3.2. QT 연장에 대한 가능성을 평가한다
1.3.3. 가용성 IGF-1 및 IGF-1R 수준에서 765IGF-MTX의 약력학적(PD) 효과를 평가한다
1.3.4. 765IGF-MTX에 대한 항체의 형성을 평가한다
1.3.5. 중화 항체의 형성을 평가한다
1.3.6. 이환된 세포 IGF-1R 발현의 수준을 평가한다
2. 종점
2.1. 1차 종점
1차 종점은 765IGF-MTX의 안전성 및 관용성이다. 이것은 CTCAE v.4.0에 의해 정의된 바대로 부작용(AE)의 평가에 의해 평가될 것이다.
2.2. 2차 종점
2.2.1. ORR, PFS, CIP, OS의 평가에 의해 765IGF-MTX의 임상 이익을 평가한다.
2.2.2. 혈액학적 악성종양에 대한 하기 반응 기준에 의해 정의된 바와 같은 완전 관해(CR), CRi, PR(부록 I 표 5 및 표 6 및 부록 II 참조):
2.2.2.1. 급성 백혈병: 2015 SWOG Manual Chapter 11A44(부록 I); European LeukemiaNet 기준45 및 2003 IWG 기준46
2.2.2.2. MDS: 2006 IWG 기준 47(부록 II)
2.3. 상관관계 종점
3.3.1 765IGF-MTX, 765IGF, 메토트렉세이트 및 7-OH 메토트렉세이트에 대한 유리 MTX 및 IGF-MTX 둘 다의 점적주사의 시작으로부터 마지막 정량화 가능한 혈장 농도의 시간까지의 AUC, 점적주사의 시작으로부터 무한까지의 AUC, 최대 관찰된 혈장 농도, 최대 혈장 농도의 시간, 말단 제거 상수에 의해 정의된 바와 같은 약동력학적(PK) 매개변수.
3.3.2 QT 연장에 대한 765IGF-MTX의 가능성의 평가
3.3.3 혈장 IGF-1 및 혈장 IGF-1R 농도에 의해 여기서 정의된 바와 같은 약력학적 매개변수(PD), 및 관리 전신 PD 변수의 표준(세포수, 차이)
3.3.4 혈장 765IGF 수준 및 765IGF-MTX 독성/반응
3.3.5 혈청 및 혈액 IGF-1R 수준 및 765IGF-MTX 독성/반응
3.3.6 765IGF-MTX에 대한 항체의 형성의 평가
3.3.7 중화 항체의 형성의 평가
3.3.8 IHC, 및 유세포분석법에 의해 측정된 바와 같은 골수, 및 유세포분석법에 의해 측정된 바와 같은 혈액 세포에서의 이환된 조직에서의 IGF-1R 발현 수준.
3. 전체 설계 및 연구 계획
이 파일럿 연구는 진행된, 이전에 치료된 MDS, CMML 또는 O-AML을 갖는 환자에서 765IGF-MTX의 안전성 및 임상 이익을 평가할 것이다. 765IGF-MTX를 28일 사이클의 1일, 8일 및 15일에 1.5시간에 걸쳐 IV 점적주사로서 투여한다. 치료는 질환 진행, 허용 불가능한 독성 또는 환자 거절까지 지속하였다. 반응의 평가는 사이클 2의 종료 시, 및 사이클 6의 종료까지 이후 8주±7일(2 사이클)마다, 및 이후 의사의 결정으로 수행된 골수 연구에 의해 확인될 것이다.
Figure pct00033
용량 발견 성분: 5 이하의 용량 수준은 시험될 것이다(페이지 6에서의 계획 참조). 최대 관용 용량(MTD)은 변형된 독성 확률 간격 설계를 이용하여 결정될 것이고, 용량 제한 독성(DLT)은 0.33에서 예상된다.
본 발명자들의 변형은 초기 용량에 대해 크기 1의 코호트를 사용하는 것(이는 초기 용량 수준에 걸쳐 신속한 상승을 허용함) 및 (탈모, 구역 또는 설사의 배제로) 연구 약물과 관련된다고 생각되는 임의의 등급 2 또는 더 높은 독성이 관찰되면 크기 3의 코호트로 확장하는 것을 수반한다. 추가적인 환자 코호트는 사이클 1 동안 현재의 용량 수준에서 1명 중 1명(등급 2 독성 없음), 3명 중 3명, 6명 중 5명 또는 9명 중 7명의 환자가 모든 계획된 치료를 완료할 때까지 등록하지 않을 것이다(DLT가 없는 765IGF-MTX의 3 용량으로 정의되고, 2주 지연 이하로 사이클 2를 시작할 수 있다). 주요 조사자의 결정으로, 사이클 사이의 환자내 용량 상승은 또한 그러나 하나의 용량 수준에서 2 사이클 후에 오직 허용되고, 환자내 용량 상승된 환자는 더 높은 용량 수준에서 치료된 유일한 환자일 수 없다.
용량 상승은 발견된 변형된 독성 확률 간격 설계에 기초하여 그리고 연구 통계학자와의 상의 후 수행될 것이다. 용량 수준의 어느 것도 연구 완료 시 허용 가능하지 않는 경우, 최적 용량 수준은 확인되지 않을 것이고. 약물은 추가의 조사를 보장하지 않는다.
Figure pct00034
약물동태학 (PK) 및 약력학(PD)에 의한 최대 관용 용량( MTD ) 코호트: MTD는 치료된 환자의 33% 이하에서 DLT와 연관된 가장 높은 용량으로 정의될 것이다. MTD가 결정되면, 전체 9명의 환자가 MTD에서 누적될 때까지 등록은 계속될 것이다. 이 그룹에 대해, 약물동태학은 사이클 1의 1일 및 15일에서 약물 투여 전에 및 이후 48시간 이하 동안에 적어도 3명의 환자에서 수행될 것이다. 약력학적 샘플은 756IGF-MTX의 점적주사 전 사이클 1의 1일 및 사이클 2의 1일 및 15일에 평가될 것이고, 하나의 샘플은 각각의 치료 사이클의 제4 주 내에 또한 취해질 것이다.
용량 수준 중 어느 것도 연구 완료 시 허용 가능하지 않는 경우, 최적 용량 수준은 확인되지 않을 것이고. 약물은 추가의 조사를 보장하지 않는다.
환자에 대한 용량 제한 독성(DLT)은 사이클 1 동안 발생하는 하기 사건 중 하나로서 정의된다:
Figure pct00035
치료의 제1 사이클(28일) 동안 7일 초과 동안 등급 4 이상 치료 관련된 혈액학적 독성
Figure pct00036
치료의 제1 사이클(28일) 동안 등급 3 이상 치료 관련된 임상 비혈액학적 독성(배제 = 최대 의학 중재 및/또는 예방책이 없는 등급 3 구역, 구토 또는 설사)
Figure pct00037
치료의 제1 사이클(28일) 동안 발열성 호중구감소증
Figure pct00038
치료의 제1 사이클(28일) 동안 임상적으로 유의미한 출혈을 갖는 10 x 109/ℓ 미만의 혈소판
추가적인 환자 코호트는 사이클 1 동안 현재의 용량 수준에서 1명 중 1명(등급 2 독성 없음), 3명 중 3명, 6명 중 5명 또는 9명 중 7명의 환자가 모든 계획된 치료를 완료할 때까지 등록하지 않을 것이다(DLT가 없는 765IGF-MTX의 3 용량으로 정의되고, 2주 지연 이하로 사이클 2를 시작할 수 있다).
MTD는 치료된 환자의 33% 미만이 DLT를 경험하는 용량 수준으로 정의될 것이다.
최소 9명의 환자는 안전성을 평가하도록 MTD에서 치료되어야 하고, 765IGF-MTX 기반 약물동태학은 전체에서 적어도 3명의 환자에서 수행될 것이다.
약물동태학은 사이클 1의 1일(24시간 동안) 및 15일(24시간 동안)에 약물 투여 전에 및 이후 24시간 이하 동안 수행될 것이다. 약력학적 샘플은 사이클 1의 1일에 투약전, 사이클 2의 1일 및 15일에 투약전 및 모든 후속하는 사이클의 15일에 투약전 평가될 것이다.
4. 환자의 선택
연구 진입은 성별 또는 민족 배경과 무관하게 18세 이상의 성인에 개방이다. 여성 및 소수자를 찾고 포함하려는 모든 노력이 있지만, 환자 집단은 Mayo Clinic에서 수행되는 다른 연구의 것과 상이하지 않다고 예상된다.
4.1. 포함 기준
5.1.1 표준 치료에 불응성 또는 불관용성이고 이러한 치료(적어도 하나의 치료 라인)에 더 이상 반응하지 않을 것 같은 O-AML의 진단; 또는
표준 치료에 불응성 또는 불관용성이고 이러한 치료(적어도 하나의 치료 라인)에 더 이상 반응하지 않을 것 같은 MDS/CMML의 진단.
5.1.2 사이클 1을 시작하기 전 실험 진입의 14일 내의 골수 생검 및 흡입액에 대한 확인된 조직학적 진단.
5.1.3 혈소판 > 10 x 109/ℓ
5.1.4 연령 18세 이상
5.1.5 0, 1 또는 2의 ECOG 성능 상태(부록 III).
5.1.6 전신 화학요법, 면역요법 또는 생물학적 치료 이전에, 방사선 치료 및/또는 수술이 허용된다; 연구 진입 전 1개월 초과의 전신 메토트렉세이트의 사전의 사용은 허가된다. 척추강내 메토트렉세이트는 조사자 결정에 따라 치료 전에 및 동안에 허가된다.
사전의 치료 및 연구 약물의 제1 용량 이후의 시간:
Figure pct00039
전신 FDA 허가된 치료 전에 사전의 방사선, 비세포독성 소분자 약물, 사전의 대수술(환자의 생명에 위험을 수반하는 수술로 정의됨; 구체적으로: 두개골, 흉부, 복부 또는 골반강 내의 기관에 수술) 이후로 적어도 2주.
5.1.7 환자는 연구 등록 전 이전의 항암 치료의 급성 독성 효과(등급 1 이하의 CTCAE v.4.0)로부터 회복되어야 한다; 오직 등급 2 신경병증이 허가된다는 예외로.
5.1.8 하기한 바대로 정의된, 연구 등록의 14일 내의 적절한 기관 기능.
Figure pct00040
5.1.9 암컷에서의 음성의 뇨 또는 혈청 임신 시험. 생식 가능성을 갖는 수컷 및 암컷 환자는 765IGF-MTX의 마지막 용량 동안에 및 이후 3개월 동안 적절한 경우 허가된 피임 방법을 사용해야 한다(예를 들어, 금욕, 경구 피임제, 이식형 호르몬 피임제 또는 이중 장벽 방법).
5.1.10 동의가 미래의 의학 관리에 대한 편견 없이 임의의 시간에 환자에 의해 철회될 수 있다는 이해로, 정상 의학 관리의 일부가 아닌 임의의 연구 관련된 절차의 수행 전의 자발적인 서면 사전 동의.
6 연구 매개변수
6.1 관리 절차의 표준
Figure pct00041
a 사이클 1을 넘어 후속하는 사이클은 7.3 부문에서 발견된 기준을 만족해야 하고, 스케줄링 안건을 수용하도록 조기에 1일에 또는 나중에 2일까지 시작할 수 있다.
1 반응에 의한 치료에 남은 환자에 대해, 진행 또는 새로운 치료의 시작까지 6주 내지 12주마다 적절한 질환 평가를 반복한다.
2 오직 사이클 1에 대해, 시험 및 절차는 1일의 3일 내에 수행되는 경우 반복될 필요가 없다.
3 골수 생검은 사이클 2의 종료의 종료 시, 및 사이클 6에 이후에 2 사이클마다이어야 한다. 반응(CR)을 달성한 환자는 MD 결정에 따라 반복 골수 생검을 가질 수 있다.
4 CBC 및 완전 대사 패널(complete metabolic panel: CMP)은, 임상적으로 필요한 바대로, 주마다, 또는 더 흔히 수행될 것이다.
5 연구 등록의 1주 내. 소변검사가 비정상이면, 연구에서의 참여를 허용하도록 단백질에 대한 24시간 뇨는 24시간에 1g 이하의 단백질을 입증하여야 한다.
6 오직 사이클 1에서 및 최종 용량 후 연구 방문 30일의 종료 시 수행된 ECG.
6.2 조사 관련된 절차
Figure pct00042
1 오직 MTD에서 PK 환자에서 수행됨. 765IGF-MTX 점적주사 전에(am lab이 765IGF-MTX 점적주사의 1시간 내인 경우 am lab의 시간에), 점적주사 완료 전 5분에(±5분), 및 점적주사의 완료 후 하기 시점에: 30분(±5분), 60분(±15분), 2시간(±15분), 4시간(±15분), 6시간(±15분), 10시간(±15분 및 24시간(±2시간)). 10시간 시점은 15일에서가 아니라 1일에 수집될 것이다.
2 오직 MTD에서 PK 환자에서 수행됨. 765IGF-MTX 점적주사 전에(±5분), 및 점적주사의 시작 후 30분(±5분)에, 점적주사의 완료 후 하기 시점에: 60분(±15분) 및 3시간(±15분). 모든 환자에서, ECG는 기준치에서, 1일에, 사이클 1(점적주사 전), 및 최종 용량 후 30일(±1주)에 수행된다(8.1 부문 참조).
3 점적주사 전의 채혈
4 골수 생검 및 흡입액은 기준치에서 및 24주까지 8주(±1주)마다, 즉, 사이클 2, 4 및 6 후에, 다음의 사이클의 제1 용량 전에 수집될 것이다. 유세포분석법에 대해 생존 가능하게 동결되거나 새로 수집되는 골수 흡입액이 사이클 1 전에 28일 기준치 기간에, 1일에 환자로부터 이용 가능하지 않는 경우, 환자는 여전히 등록할 수 있고, 새로운 골수 흡입액은 기준치 샘플에 필요하지 않을 것이다.
5 EDTA 관에서의 전혈 수집.
7 상관관계 연구
상관관계 연구에 대한 혈액 샘플의 수집에 대한 정보(사용된 수집 관, 채혈의 용적, 수집 처리, 분취액 절차 및 저장, 및 이용되는 특정한 검정)는 부록 VII에서 발견될 수 있다.
7.1 약물동태학
7.1.1 약동력학적 샘플 수집
765IGF-MTX의 약물동태학은 사이클 1의 1일 및 15일에서 투여되는 용량 이후에 조사될 것이다. 이들 일자에 765IGF-메토트렉세이트는 7.1.1 부문에 기재된 바대로 아침에 점적주사될 것이다. 조사 팀은 점적주사의 시작 및 중단 시간 및 점적주사된 765IGF-MTX 용액의 용적을 기록할 것이다. 전혈(6㎖)은 환자가 점적주사 바로 전에, 점적주사 종료 전 5분에, 및 점적주사의 완료 후 30분, 60분, 2시간, 4시간, 6시간, 10시간 및 24시간(상기와 같은 윈도우[조사 관련된 절차 표, 각주 1)의 시점에 중앙 정맥 카테터 765IGF-MTX를 갖는지를 반대 팔에서의 삽입된 버터플라이 바늘 또는 말초 부위로부터 수집될 것이다. 10시간 시점은 15일이 아니라 1일에 수집될 것이다. IGF-MTX 및 IGF에 비결합된 MTX 독성동태 분석은 수행될 것이다. 이들 시점은 개에서의 약물동태학에 기초한다. PK 샘플 수집 절차에 대해 부록 VII를 참조한다.
7.1.2 약동력학적 샘플 처리
혈액 샘플(6㎖)은 6㎖의 EDTA(적색 상부) 관에 수집될 것이다. 관은 항응고제와의 완전한 혼합 동안 수회 약하게 도립되어야 한다. 샘플 수집의 정확한 시간은 관 라벨 및 제공된 약물동태학 데이터 폼에 기록되어야 한다. 관은 원심분리까지 웨트 아이스에서 유지되어야 한다. 혈액 수집의 120분 내에, 4℃에서 5분 내지 10분 동안 대략 3,000 X g에서 각각의 혈액 샘플을 원심분리한다. 각각 대략 0.5㎖의 분취액은 4개의 별개의 플라스틱 원심분리 관으로 피펫팅되고 분석까지 -80℃에서 동결될 것이다. PK 샘플 수집 절차에 대해 부록 VII를 참조한다.
765IGF-MTX, 765IGF, 메토트렉세이트 및 7-OH-메토트렉세이트 혈장 농도는 시카고에서의 일리노이주 대학교(University of Illinois) 독성학 조사 실험실에서 GLP 조건 하에 검증된 검정을 이용하여 결정될 것이다.
7.1.3 약동력학적 매개변수 결정
765IGF-메토트렉세이트, 765IGF, 메토트렉세이트 및 7-OH 메토트렉세이트의 약물동태학은 구획적 및 비구획적 접근법에 의해 분석될 것이다. 관심 대상의 각각의 화합물에 대한 혈장 농도-시간 데이터의 비구획적 분석은 WinNonlin 6.3(Pharsight(미주리주 세인트 루이스))을 이용하여 수행될 것이다. 예상되는 약동력학적 매개변수는 1). 점적주사의 시작으로부터 마지막 정량화 가능한 혈장 농도의 시간까지의 약물 혈장 농도-시간 곡선 하 면적(AUC0 -t), 2) 점적주사의 시작으로부터 무한까지의 AUC(AUC0 -∞), 3). 최대 관찰된 혈장 농도(Cmax), 4). 최대 혈장 농도의 시간(Tmax) 및 5). 말단 제거 상수(λz)를 포함한다.
관심 대상의 화합물에 대한 혈장 농도 대 시간 데이터는 NONMEM(버전 7.3)에서 실행된 바대로 비선형 혼합 효과 모델링을 이용하여 적절한 모델로 개별적으로 및 동시에 피팅될 것이다. 데이터는 개별 및 집단 접근법에 의해 모델링될 것이다. 모 및 대사물질 배치를 도입하는 1, 2 및 3-구획 모델은 평가될 것이다. 1차 조건적 추정, Monte Carlo 기대 최대화 및 Monte Carlo 베이지안(Bayesian) 방법은 최대 우도를 추정하기 위해 조사될 것이다.
항-765IGF 항체가 몇몇 또는 모든 환자에서 검출되는 경우, 약동력학적 매개변수에서의 이들 항체의 존재의 효과는 조사될 것이다. 예를 들어, 항-약물 항체가 존재하지 않을 때 제1 용량에서의 약동력학적 매개변수를 항-765IGF 항체가 발생하는 것으로 나타난 후 더 나중의 용량에서의 매개변수를 비교함으로써, 그리고 항-765IGF 항체를 갖는 환자에서의 매개변수를 이를 갖지 않는 것과 비교함으로써 이는 수행될 것이다.
7.1.4 약물동태학에 대한 통계 분석
765IGF-MTX, 765IGF, 메토트렉세이트 및 7-OH 메토트렉세이트에 대한 매개변수는 서술적 통계(기하 평균, 중앙치, 표준 편차 및 변동 계수)에 의해 표시될 것이다. 각각의 화합물에 대해 조사되는 1차 약동력학적 매개변수는 AUC0 -t, AUC0 -∞, Cmax 및 λz일 것이다. 서술적 통계는 인구학적 데이터에 대해 계산될 것이다. 그래프 및 상관관계는 값의 분포 및 이변량 관계를 조사하도록 이용될 것이다.
7.2 약력학적 평가
약력학적 샘플은 사이클 1의 D1, 사이클 2의 D1 및 D15, 및 각각의 후속하는 사이클의 D15에 평가될 것이다.
전신 반응은, 모든 대상체에 대해 측정되고 765IGF-MTX가 이들 생물학적 마커의 생성에 영향을 미치는지를 평가하기 위해 사용되는, IGF-1의 혈장 농도 및 IGF-1R의 혈액 및 혈청 농도로서 정의된다. 독성의 측정치(예를 들어, 변화 WBC 수, 세포 집단 차이, 혈소판 등)는 또한 전신 PD 변수로 생각된다.
약력학적 데이터는 최대 우도 추정을 이용하여 적절한 모델로 피팅될 것이다. 약물의 전신 활성과 바이오마커 사이에 어떠한 관계가 존재하는지를 결정하기 위해, 개별 기준치 보정된 최대 바이오마커 농도는 개별 765IGF-MTX 약동력학적 값에 대해 작도될 것이고, Pearson 상관관계 계수는 계산될 것이다.
7.3 QT 연장에 대한 765IGF -MTX의 가능성의 평가
QT 평가는 765IGF-MTX 점적주사의 바로 전, 점적주사를 시작한 후 30분, 및 점적주사의 완료 후 하기 시점에서 ECG에 의해 오직 PK 수집 시간 동안 PK 대상체에서 수행될 것이다: 60분 및 3시간. 모든 대상체에서, QT 평가는 기준치(등록의 14일 내)에, 사이클 1 1일(점적주사 전)에 및 765IGF-MTX의 최종 용량 후 30일(±1주)에 ECG에 의해 수행될 것이다.
7.4 혈장 IGF 수준 및 765IGF -MTX 독성/반응
사이클 1의 D1에서의 점적주사 전, 및 사이클 2의 D1 및 D15에서의 점적주사 전으로부터의 혈청 샘플은 치료전 및 치료 동안 혈장 가용성 IGF-1 수준이 765IGF-MTX 독성 및/또는 반응과 연관되는지를 결정하기 위해 각각의 환자로부터 수집될 것이다. 혈장에서의 IGF-1의 정량화는 LC/MS에 의해 Quest Diagnostics, 시험 코드 16293에 의해 수행될 것이다. 서술적 분석은 임상 반응과 마커 수준 사이에 수행될 것이다. 바이오마커 수집 절차에 대해 부록 VII를 참조한다.
7.5 혈청 및 혈액 IGF -1R 수준 및 765IGF -MTX 독성/반응
사이클 1의 D1에서의 점적주사 전, 및 사이클 2의 D1 및 D15에서의 점적주사 전으로부터의 혈청 샘플은 치료전 및 치료내 혈청 및 혈액 IGF-1R 수준이 765IGF-MTX 독성 및/또는 반응과 연관되는지를 결정하기 위해 각각의 환자로부터 수집될 것이다. 혈장에서의 IGF-1R의 정량화는 웨스턴 블로팅을 이용하여 IGF Oncology에 의해 수행될 것이다. 서술적 분석은 임상 반응과 마커 수준 사이에 수행될 것이다. 바이오마커 수집 절차에 대해 부록 VII를 참조한다.
7.6 항- 765IG -MTX 항체의 형성.
사이클 1의 D1에서의 점적주사 전, 및 사이클 2의 D1 및 D15에서의 점적주사 전으로부터의 혈청 샘플은 각각의 환자로부터 수집되고, 전임상 시험 개 및 래트에서 항-765IG-MTX 항체를 검출하기 위해 스폰서가 이용하는 검정에 의해 항-약물 항체에 대해 분석될 것이다. 검정은 혈청을 96웰 플레이트에서 플레이팅하는 것, 약물을 플레이트의 웰에 첨가하여서 혈청에 존재할 수 있는 임의의 항-약물 항체에 결합시키는 것 및 이어서 R&D Systems, Quantikine human IGF-1 ELISA 키트로부터 항-IGF-HRP 접합체 항체에 의해 결합된 765IGF-MTX 약물을 검출하는 것을 수반하는 샌드위치 ELISA이다.
그 샌드위치 검정은 765IGF-MTX에 대한 항체를 검출한다. 동일한 검정은 765IGF-MTX 대신에 765IGF 단백질이 플레이트에 첨가되는 경우 수행될 것이다. 이는 765IGF 단백질에 대한 항체를 검출할 것이다.
혈청 샘플은 중화 항체의 존재에 대해 또한 분석될 것이다. 이 검정에서, 혈청은, 환자 혈청의 첨가가 MCF7 세포의 성장을 저해하는 데 있어서 765IGF-MTX의 최소 저해 농도에 영향을 미치는지를 결정하기 위해, 인간 MCF7 유방암 세포의 사멸에 대해 시험관내 검정에서 765IGF-MTX와 혼합될 것이다. 이 검정은 사이클 2에서, 사이클 4 및 6의 1일 및 15일에 치료 전에 수집된 동일한 혈청 샘플에서 수행될 것이다. 바이오마커 수집 절차에 대해 부록 VII를 참조한다.
위험 평가 . 항-765IGF 항체에 대한 평가로부터의 환자에 대한 위험은 최소이고 사이클 1의 D1, 및 사이클 2의 D1 및 D15에서 점적주사 전에 추가적인 채혈로부터 오직 발생한다. 혈액의 소량(7.5㎖/채혈)이 취해질 것이고, 이는 환자 건강에 효과를 가지지 않을 것이다. 항-765IGF 항체를 가능하게 발생시키는 것의 환자에 대한 위험은 또한 적고, 이들이 이들 항체를 발생시키는지에 대한 본 발명자들의 지식에 의해 습득될 것이다. 처음에, 개도 그리고 래트도 전임상 시험에서 항-약물 항체를 발생시키지 않았고, 그래서 이것은 환자가 항-765IGF 항체를 발생시키는 것 같지 않아 보인다. 항체를 발생시키는 것의 환자에 대한 위험은, 생기는 경우, 항체가 약물의 효과를 가능하게 감소시키는 것으로 예상되고, 약물의 투여에 대한 아나필릭시스 반응의 위험을 제기할 것이라는 것이다. 아나필릭시스 반응은 몇몇 생물학적 약제, 예컨대, 리툭시맙(Rituximab)에 의해 발생하고, 보통 항히스타민제, 예컨대, 다이펜하이드라민에 의해 관리될 수 있다. 765IGF에 대한 항체의 형성은 또한 IGFR1 수용체에 대한 항체의 유사한 부작용, 예컨대, 고혈당증의 발생의 가능성을 잠재적으로 야기할 것이다. 혈당 수준의 모니터링은 이 연구에서 일상적으로 수행될 것이다.
7.7 중화 항체 및 765IGF -MTX 독성/반응
사이클 1의 D1에 점적주사 전에 그리고 사이클 2의 D1 및 D15에, 및 사이클 4 및 6의 D15일에 점적주사 전에로부터의 혈청 샘플은 중화 항체의 존재에 대해 분석될 것이다. 이 검정에서, 혈청은, 환자 혈청의 첨가가 MCF7 세포의 성장을 저해하는 데 있어서 765IGF-MTX의 최소 저해 농도에 영향을 미치는지를 결정하기 위해, 인간 MCF7 유방암 세포의 사멸에 대해 시험관내 검정에서 765IGF-MTX와 혼합될 것이다. 바이오마커 수집 절차에 대한 부록 VII를 참조한다.
서술적 분석은 수행되어서 중화 항체 존재 또는 수준을 765IGF-MTX에 대한 임상 반응, 및 이의 독성과 상관시킬 것이다.
7.8 IHC 및 유세포분석법을 통한 골수 흡입액의 이환된 세포에서의 IGF -1R 발현 수준
골수 흡입액이 환자로부터 수집될 때, 약간의 부분은 응고되고, 고정되고, 파리핀 포매될 것이고; 제2 부분은 실온에서 유지되고, 동일자에 밤새 선적될 것이다. 병리학 보고서는 고정된 샘플에 대해 제조될 것이다. 모든 샘플은 Mayo Clinic에서 유지되고, 이들의 시험 코드 19429X에 의해 IHC에 의한 IGF-1R 발현 수준 시험을 위해 Quest Diagnostics로 이들의 병리학 보고서에 의해 연구의 종료 시 함께 선적될 것이다.
새로운 생존 가능 골수 흡입액은 유세포분석법에 의한 IGF-1R 및 CD34 발현의 시험을 위해 Charles River, Inc.로 동일자에 밤새 선적될 것이다. 이 검정은 He 등의 것과 유사할 것이다.28
7.9 유세포분석법을 통한 전혈의 이환된 세포에서의 IGF-1R 발현 수준
전혈은 EDTA 관(6㎖)에서 수집되고, 유세포분석법에 의한 IGF-1R 및 CD34 발현의 시험을 위해 Charles River, Inc.로 실온에서 절연처리된 용기에서 동일자에 밤새 선적될 것이다. 이 검정은 He 등의 것과 유사할 것이다.28 이 수집 및 시험은 기준치에서 및 치료를 시작하기 전 8주마다일 것이다.
결과 :
현재까지, 2명의 대상체는 등록하였고, 둘 다 O-AML에 의해 진단되었다. 대상체(101)는 이전에 O-AML로 형질전환된 MDS를 가졌다.
치료 전에 및 치료의 2개의 사이클(6 용량) 후 8주에 기준치에서의 대상체 둘 다에 대한 차이를 갖는 흡입액 골수아구 수 및 완전 혈액 수는 표 3에 기재되어 있다. 둘 다는 용량 수준 1(0.2 마이크로Eq/㎏)에서 투약되었다. 둘 다는 80세 이상의 남성(80세 및 83세)이었다.
Figure pct00043
골수아구 세포 백분율은 MDS 및 관련된 질환 O-AML 및 CMML을 평가하기 위해 사용된 중요한 매개변수이다. 이것은 대상체(101)에서 실질적으로 개선되고 대상체(102)에서 안정하다. 다음의 중요한 측정은 백혈구이고, 이것은 대상체 둘 다에 대해 실질적으로 개선된다. 다음의 중요한 매개변수는 호중구 및 혈소판이다. 호중구는 대상체 둘 다에 대해 실질적으로 개선되고, 혈소판은 대상체(101)에 대해 개선되고, 대상체(102)에 대해 더 나쁘다. 측정된 매 번의 혈액 매개변수는 대상체(102)에서의 혈소판을 제외하고 대상체 둘 다에서 개선되거나 안정하였다.
8주 후 대상체 둘 다의 임상 평가는 안정한 질환이었다. 임상 실험의 의사 주요 조사자에 따라 오직 3개월의 치료를 시작할 때 이들 대상체의 둘 다가 기대 수명이 예상되므로, 거의 모든 매개변수가 개선하면서, 8주 동안 안정한 질환은 효율의 증거이다.
서열
Figure pct00044
Figure pct00045
Figure pct00046
Figure pct00047
Figure pct00048
Figure pct00049
Figure pct00050
Figure pct00051
Figure pct00052
Figure pct00053
Figure pct00054
모든 특허, 특허 문헌 및 다른 참고문헌은 본 명세서에 포함된다.
SEQUENCE LISTING <110> IGF Oncology, LLC <120> AN INSULIN-LIKE GROWTH FACTOR-CHEMOTHERAPEPUTIC CONJUGATE FOR TREATING MYELODYSPLASTIC SYNDROME <130> WO2018/217669 <140> PCT/US2018/033747 <141> 2018-05-21 <150> US 62/509,150 <151> 2017-05-21 <160> 11 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthesized <400> 1 Met Val Lys Gly Lys His His His His His His Asn Gly Lys Gly Lys 1 5 10 15 Ser Lys <210> 2 <211> 88 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthesized <400> 2 Met Val Lys Gly Lys His His His His His His Asn Gly Lys Gly Lys 1 5 10 15 Ser Lys Gly Pro Arg Thr Leu Cys Gly Ala Glu Leu Val Asp Ala Leu 20 25 30 Gln Phe Val Cys Gly Asp Arg Gly Phe Tyr Phe Asn Lys Pro Thr Gly 35 40 45 Tyr Gly Ser Ser Ser Arg Arg Ala Pro Gln Thr Gly Ile Val Asp Glu 50 55 60 Cys Cys Phe Arg Ser Cys Asp Leu Arg Arg Leu Glu Met Tyr Cys Ala 65 70 75 80 Pro Leu Lys Pro Ala Lys Ser Ala 85 <210> 3 <211> 70 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Gly Pro Glu Thr Leu Cys Gly Ala 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His Ser Ala Lys Gly Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly 115 120 125 Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Asp Arg Gly Phe 130 135 140 Tyr Phe Asn Lys Pro Thr Gly Tyr Gly Ser Ser Ser Arg Arg Ala Pro 145 150 155 160 Gln Thr Gly Ile Val Asp Glu Cys Cys Phe Arg Ser Cys Asp Leu Arg 165 170 175 Arg Leu Glu Met Tyr Cys Ala Pro Leu Lys Pro Ala Lys Ser Ala 180 185 190 <210> 11 <211> 89 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Synthesized <400> 11 Met Val Lys Gly Lys His His His His His His Asn Gly Lys Gly Lys 1 5 10 15 Ser Lys Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala 20 25 30 Leu Tyr Leu Val Cys Gly Asp Arg Gly Phe Tyr Phe Asn Lys Pro Thr 35 40 45 Gly Tyr Gly Ser Ser Ser Arg Arg Ala Pro Gln Thr Gly Ile Val Asp 50 55 60 Glu Cys Cys Phe Arg Ser Cys Asp Leu Arg Arg Leu Glu Met Tyr Cys 65 70 75 80 Ala Pro Leu Lys Pro Ala Lys Ser Ala 85

Claims (35)

  1. 골수이형성 증후군(myelodysplastic syndrome: MDS), 희소아구성 급성 골수성 백혈병(oligoblastic acute myelogenous leukemia: O-AML) 또는 만성 골수단핵구성 백혈병(chronic myelomonocytic leukemia: CMML)에 대해 환자를 치료하는 방법으로서,
    MSDS, O-AML 또는 CMML에 대한 치료의 인식된 필요의 환자에게 항암 화학요법 약물에 접합된 인슐린양 성장 인자 1형 수용체(insulin-like growth factor type 1 receptor: IGF-1R) 리간드를 포함하는 물질을 투여하는 단계를 포함하는, 환자를 치료하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 환자는 MDS에 대한 치료의 인식된 필요에 있는, 환자를 치료하는 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 IGF-1R 리간드는 상기 항암 화학요법 약물에 공유 부착된, 환자를 치료하는 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 IGF-1R 리간드는 인슐린양 성장 인자 1(IGF-1) 또는 이의 변이체 또는 인슐린인, 환자를 치료하는 방법.
  5. 제4항에 있어서, 상기 IGF-1R 리간드는 IGF-1과 비교하여 IGF-1 결합 단백질에 대한 감소된 결합 친화도를 갖는 IGF-1의 변이체인, 환자를 치료하는 방법.
  6. 제5항에 있어서, 상기 IGF-1R 리간드는 IGF-1(서열 번호 3)이 아니고, 765IGF(서열 번호 2), IGF132(서열 번호 4), 긴-R3-IGF(서열 번호 5), R3-IGF(서열 번호 6) 또는 des(1-3)-IGF(서열 번호 7), 또는 IGF-1(서열 번호 3)과 적어도 90% 동일한 변이체이거나 이를 포함하는, 환자를 치료하는 방법.
  7. 제1항에 있어서, 상기 IGF-1R 리간드는 IGF-1R에 대한 항체인, 환자를 치료하는 방법.
  8. 제4항, 제1항 및 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항암 화학요법 약물은 메토트렉세이트, 벤다무스틴 및 클로르암부실로 이루어진 군으로부터 선택되는, 환자를 치료하는 방법.
  9. 제8항에 있어서, 상기 항암 화학요법 약물은 메토트렉세이트인, 환자를 치료하는 방법.
  10. 제4항 또는 제6항에 있어서, 상기 항암 화학요법 약물은 메토트렉세이트이고, 상기 물질은 환자 체중 1㎏당 0.1 내지 2.5(또는 0.2 내지 2.5, 또는 0.4 내지 2.5, 또는 0.4 내지 1.6) 마이크로Eq의 용량으로 100㎖ 내지 1리터의 5% 내지 10% 덱스트로스의 용적 중에 용해되어 투여되는, 환자를 치료하는 방법.
  11. 제1항 또는 제10항에 있어서, 상기 물질은 765IGF-MTX인, 환자를 치료하는 방법.
  12. 제10항 또는 제11항에 있어서, 상기 용적은 100㎖ 내지 500㎖, 150㎖ 내지 500㎖, 200㎖ 내지 500㎖, 또는 약 250㎖인, 환자를 치료하는 방법.
  13. 제12항에 있어서, 상기 방법은 상기 환자에게 0.2 내지 2.5 마이크로Eq/㎏의 용량으로 상기 물질을 투약하는 단계를 포함하는, 환자를 치료하는 방법.
  14. 제13항에 있어서, 상기 방법은 1주 1회 또는 2회 상기 환자에게 0.2 내지 2.5 마이크로Eq/㎏(예를 들어, 3주 동안 1주 1회, 이어서 1주 휴약)의 용량으로 상기 물질을 투약하는 단계를 포함하는, 환자를 치료하는 방법.
  15. 급성 골수성 백혈병(AML), 만성 골수성 백혈병(CML), O-AML, CMML 또는 MDS에 대한 환자를 치료하는 방법으로서,
    (a) 저메틸화제(예를 들어, 아자시티딘 또는 데시타빈) 및 (b) 메토트렉세이트에 접합된 인슐린양 성장 인자 1형 수용체(IGF-1R) 리간드를 포함하는 물질을 AML, CML, O-AML, CMML 또는 MDS에 대한 치료의 인식된 필요의 환자에게 투여하는 단계를 포함하되;
    상기 IGF-1R 리간드는 인슐린양 성장 인자 1(IGF-1) 또는 이의 변이체 또는 인슐린인, 환자를 치료하는 방법.
  16. 제15항에 있어서, 상기 IGF-1R 리간드는 IGF-1과 비교하여 IGF-1 결합 단백질에 대한 감소된 결합 친화도를 갖는 IGF-1의 변이체인, 환자를 치료하는 방법.
  17. 제15항에 있어서, 상기 IGF-1R 리간드는 IGF-1(서열 번호 3)이 아니고, 765IGF(서열 번호 2), IGF132(서열 번호 4), 긴-R3-IGF(서열 번호 5), R3-IGF(서열 번호 6) 또는 des(1-3)-IGF(서열 번호 7), 또는 IGF-1(서열 번호 3)과 적어도 90% 동일한 변이체이거나 이를 포함하는, 환자를 치료하는 방법.
  18. 제15항에 있어서, 상기 방법은 MDS, O-AML 또는 CMML에 대해 환자를 치료하는 방법이고, 상기 환자는 MDS, O-AML 또는 CMML의 치료에 대한 인식된 필요에 있는, 환자를 치료하는 방법.
  19. 제15항 또는 제18항에 있어서, 상기 저메틸화제는 아자시티딘인, 환자를 치료하는 방법.
  20. 제15항, 제18항 및 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 물질은 765IGF-MTX인, 환자를 치료하는 방법.
  21. 제18항에 있어서, 상기 방법은 상기 환자를 아자시티딘에 의해 치료하는 단계를 포함하고, 상기 물질은 765IGF-MTX인, 환자를 치료하는 방법.
  22. 제20항에 있어서, 상기 765IGF-MTX는 환자 체중 1㎏당 0.1 내지 2.5 마이크로Eq의 용량으로 100㎖ 내지 1리터의 5% 내지 10% 덱스트로스의 용적 중에 용해되어 투여되는, 환자를 치료하는 방법.
  23. 제22항에 있어서, 상기 용적은 100㎖ 내지 500㎖, 150㎖ 내지 500㎖, 200㎖ 내지 500㎖, 또는 약 250㎖인, 환자를 치료하는 방법.
  24. (b) 물 중의 100㎖ 내지 1리터의 5% 내지 10%(w/v) 덱스트로스 중에 용해된 (a) 메토트렉세이트에 공유 접합된 IGF-1R 리간드인 공유 접합체로 이루어진 물질을 포함하는 점적주사용 용액인 약제학적 조성물로서,
    상기 IGF-1R 리간드는 인슐린양 성장 인자 1(IGF-1) 또는 이의 변이체 또는 인슐린이고; 상기 용액은 5mM 초과의 NaCl 또는 2mM 초과의 포스페이트를 포함하지 않고; 상기 용액은 점적주사 백에 있고, 100㎖ 내지 1리터의 용적을 갖는, 약제학적 조성물.
  25. 제24항에 있어서, 상기 용액은 100㎖ 내지 500㎖, 150㎖ 내지 500㎖, 200㎖ 내지 500㎖, 또는 약 250㎖의 용적을 갖는, 약제학적 조성물.
  26. 제24항에 있어서, 상기 물질은 765IGF-MTX인, 약제학적 조성물.
  27. 메토트렉세이트에 공유 접합된 IGF-1R 리간드인 공유 접합체로 이루어진 물질을 투여하는 방법으로서,
    상기 IGF-1R 리간드는 인슐린양 성장 인자 1(IGF-1) 또는 이의 변이체 또는 인슐린이되,
    상기 물질을 물 중에 본질적으로 100㎖ 내지 1리터의 5% 내지 10% 덱스트로스(w/v)의 용적으로 이루어진 희석제로 희석하여서 상기 희석제 중의 상기 물질의 용액을 제조하는 단계; 및 상기 용액을 환자에게 점적주사하는 단계를 포함하는, 물질을 투여하는 방법.
  28. 제27항에 있어서, 상기 용액을 환자에게 점적주사하는 단계는 20분 내지 2.5시간의 시간에 걸쳐, 또는 30분 내지 2시간에 걸쳐, 또는 45분 내지 1.5시간에 걸쳐, 또는 1 내지 2시간에 걸쳐 발생하는, 물질을 투여하는 방법.
  29. 희소아구성 급성 골수성 백혈병(O-AML) 또는 골수이형성 증후군(MDS) 또는 만성 골수단핵구성 백혈병(CMML)을 치료하는 방법에서 사용하기 위한 조성물로서,
    항암 화학요법 약물에 접합된 인슐린양 성장 인자 1형 수용체(IGF-1R) 리간드를 포함하는 물질을 포함하는, 조성물.
  30. 장치로서,
    (b) 5% 또는 10%(w/v) 덱스트로스의 용액에 의해 충전되고, 상기 용액 중에 (c) 메토트렉세이트에 공유 접합된 IGF-1R 리간드인 공유 접합체로 이루어진 물질이 용해된,
    (a) 100㎖ 내지 2리터의 최대 용적을 보유할 수 있는 점적주사 백을 포함하되,
    상기 IGF-1R 리간드는 인슐린양 성장 인자 1(IGF-1) 또는 이의 변이체 또는 인슐린이고, 상기 용액은 100㎖ 내지 1리터(더 바람직하게는 100㎖ 내지 500㎖, 150㎖ 내지 500㎖, 또는 약 250㎖)의 용적을 가지는, 장치.
  31. 제30항에 있어서,
    (d) 상기 점적주사 백에 연결된 배관, 및
    (e) 상기 배관에 연결된 피하 주사를 더 포함하는, 장치.
  32. 제30항에 있어서, 상기 물질은 765IGF-MTX인, 장치.
  33. 제30항 또는 제32항에 있어서, 상기 용액은 적어도 10 마이크로Eq의 상기 물질 및 250 마이크로Eq 이하의 상기 물질을 포함하는, 장치.
  34. 제30항 또는 제32항에 있어서, 상기 용액은 5mM 이하의 NaCl(바람직하게는 1mM 이하의 NaCl) 및 2mM 이하의 포스페이트(바람직하게는 1mM 이하의 포스페이트)를 포함하는, 장치.
  35. 제30항 또는 제32항에 있어서, 상기 용액은 5mM 이하의 NaCl(바람직하게는 1mM 이하의 NaCl, 더 바람직하게는 0의 NaCl)을 포함하는, 장치.
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