CN117442747A - 胰岛素样生长因子——用于治疗骨髓增生异常综合症的化学治疗缀合物 - Google Patents
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Abstract
本发明的名称是胰岛素样生长因子——用于治疗骨髓增生异常综合症的化学治疗缀合物。提供了使用765IGF‑MTX和其它IGF受体靶向药剂来治疗骨髓增生异常综合症(MDS)、寡原始细胞急性粒细胞性白血病(O‑AML)或慢性髓单核细胞白血病(CMML)的方法,以及用于向患者递送765IGF‑MTX和其它IGF受体靶向药剂的调配物。还提供了用于治疗MDS、O‑AML和CMML的药物组合物。
Description
本申请为分案申请,原申请的申请日是2018年5月21日、申请号是201880030546.8、发明名称为“胰岛素样生长因子——用于治疗骨髓增生异常综合症的化学治疗缀合物”。
背景技术
骨髓增生异常综合症(MDS)是一种由异常的多能祖细胞衍生的造血疾病,其特征在于无效的造血功能、骨髓衰竭、外周血细胞减少和生存期缩短。骨髓增生异常综合症包含慢性髓单核细胞白血病(CMML)作为MDS的亚型。而且其经常发展为寡原始细胞急性髓细胞性白血病(O-AML)。MDS、CMML和O-AML可能被认为是骨髓增生性疾病的类型。CMML和O-AML也可能被视为与MDS密切相关的MDS疾病的亚型。[Schanz J、Tüchler H、SoléF等人,《用于从国际数据库合并而来的原发性骨髓增生异常综合症(MDS)和MDS后的寡原始细胞急性髓性白血病的新型综合细胞遗传学评分系统(New comprehensive cytogenetic scoringsystem for primary myelodysplastic syndromes(MDS)and oligoblastic acutemyeloid leukemia after MDS derived from an international database merge)》《临床肿瘤学杂志(J Clin Oncol)》2012;30:820-829。http://www.clevelandclinicmeded.com/medicalpubs/diseasemanagement/hematology-oncology/myelodysplastic-syndromes/]。
在美国,仅三种药物被批准用于治疗MDS。前两个是去甲基化剂阿扎胞苷(azacitidine)(5-AZA,VIDAZA)和地西他滨(decitabine)(DACOGEN)。据称,这些低甲基化剂通过重新激活肿瘤抑制基因并通过直接的细胞毒性机制起作用,并且可能诱导造血祖细胞分化。在最近的一项针对高危患者的III期试验中,与接受传统疗法(包含最佳支持疗法或化疗)治疗的患者相比,接受阿扎胞苷治疗的患者中约50%的患者发生了应答,并且在接受随访的2年中,存活率增加了一倍。在一项多中心III期研究中已经对地西他滨进行了研究,其中30%的患者获得了应答,完全和部分缓解率达到17%,但与最佳支持治疗相比,尚无整体存活率优势。与沙利度胺(thalidomide)相关的来那度胺(lenalidomide)(REVLIMID)也被批准用于MDS,并且已在某些(但不是全部)MDS中显示出疗效。
在MDS中通常不使用以某种方式干扰DNA复制的标准化疗药物,因为它们会减少血细胞计数(引起血细胞减少症),并且MDS患者由于自身疾病而已经患有血细胞减少症且无法忍受血细胞计数的进一步减少。来那度胺还具有引起血细胞减少的副作用,这限制了其在MDS中的效用。
用于MDS、O-AML和CMML的现有药物均效果不佳。使用MDS诊断时的预期寿命仍为4-85个月,中位数约为24个月[Bennett JM、Catovsky D、Daniel MT等人,《关于骨髓增生异常综合症分类的建议(Proposals for the classification of the myelodysplasticsyndromes)》英国血液病杂志(Br J Haematol)》1982;51:189-199。http://www.clevelandclinicmeded.com/medicalpubs/diseasemanagement/hematology-oncology/myelodysplastic-syndromes/]。需要用于MDS、O-AML和CMML的新型药物和疗法。
发明内容
在此描述了与甲氨蝶呤(methotrexate,MTX)共价连接的胰岛素样生长因子-1(IGF-1或IGF)或IGF的变体(如765IGF)的缀合物(IGF-MTX)。如甲氨蝶呤等缀合物在体外对癌细胞具有细胞毒性。如MTX等IGF-MTX缀合物抑制二氢叶酸还原酶。与游离MTX相比,IGF-MTX缀合物具有更高的IC50(50%抑制剂浓度),以便在体外抑制癌细胞生长。但是在小鼠模型中,其在体内抑制肿瘤生长的效力比MTX高6倍以上。也就是说,就每千克给药的MTX基团的摩尔数而言,IGF-MTX甚至比MTX更有效,即使其剂量低6倍。
我们现在显示,在一项人类临床试验中,765IGF-MTX以令人惊讶的低剂量0.2微当量/kg有效地延缓某些实体瘤患者的肿瘤生长。在每周用0.2微当量/kg 765IGF-MTX治疗后,还发现一名霍奇金淋巴瘤(Hodgkin’s lymphoma)复发患者未患癌症。在这项临床试验中,在人体中未发现高达0.8微当量/kg的剂量极限毒性。在这项临床试验中,在任何剂量下均未见任何血细胞减少症,包含最高测试剂量0.8微当量/kg。相反,用甲氨蝶呤治疗会导致血细胞减少,并且血细胞减少可能是甲氨蝶呤导致的最严重的常见不良事件。
在对狗进行的为期5周的重复剂量研究中(每周剂量分别为0.5、2.0和4.0微当量/kg 765IGF-MTX),尽管未达到正常范围的水平,但红血球质量略有减少,但未见淋巴细胞或中性粒细胞减少。在一项对大鼠进行的持续6周的每周剂量为0.5、5或8微当量/kg的重复剂量研究中,在0.5微当量/kg的情况下未观察到血细胞减少,并且在5微当量/kg的情况下,红细胞和白细胞的数量仅略有减少,二者的数量在3周恢复期后恢复正常。
在人类和动物毒理学研究中,缺乏IGF-MTX引起的血细胞减少症使得IGF-MTX在治疗白血病,具体地说髓细胞性白血病(包含急性髓细胞性白血病(AML))方面具有吸引力,因为血细胞减少症是这些疾病的结果。在人类和动物毒理学研究中,缺乏IGF-MTX引起的血细胞减少症使其特别适合治疗骨髓增生异常综合症(MDS)(包含密切相关的疾病——寡原始细胞急性髓细胞性白血病(O-AML)和慢性髓单核细胞白血病(CMML)),其特征在于骨髓中的髓系克隆的生长,排挤了其它血细胞的产生,从而导致严重的细胞减少症。患者变得依赖于输血。
我们在此显示,MDS细胞系和三个AML细胞系在体外均对765IGF-MTX敏感,其浓度与在体内也对IGF-MTX敏感的MCF7的浓度大致相同。我们还显示,MDS细胞系以类似于MCF7的高水平表达1型IGF膜受体(IGF-1R)。这表明在人类中,MDS将对IGF-MTX敏感,并且可以用有效但不引起血细胞减少的剂量的IGF-MTX治疗MDS患者。
因此,本发明的一个实施例提供了一种治疗患有寡原始细胞急性粒细胞性白血病(O-AML)或骨髓增生异常综合症(MDS)或慢性髓单核细胞白血病(CMML)的患者的方法,所述方法包括:向被认为需要治疗O-AML、MDS或CMML的患者施用药剂,所述药剂包括:与抗癌化疗药物缀合的胰岛素样生长因子1型受体(IGF-1R)配体。O-AML和MDS被认为是与MDS非常相似的疾病。
另一个实施例提供了一种治疗患者的急性髓细胞性白血病(AML)、慢性髓细胞性白血病(CML)、O-AML、CMML或MDS的方法,所述方法包括:向被认为需要治疗AML、CML、O-AML、CMML或MDS的患者施用(a)低甲基化剂(例如,阿扎胞苷或地西他滨)和(b)药剂,所述药剂包括:与甲氨蝶呤缀合的胰岛素样生长因子1型受体(IGF-1R)配体;其中所述IGF-1R配体为胰岛素样生长因子1(IGF-1)或其变体或胰岛素。
已经发现,765IGF-MTX、胰岛素-MTX和longR3IGF-MTX往往各自在磷酸盐缓冲盐水或任何含盐的中性pH溶液(例如超过约50mM NaCl)中具有低溶解度。因此,765IGF-MTX当前以4mEq/L溶液的形式储存在10mM HCl中。对于向患者输液,将其稀释到250ml的5%葡萄糖或10%葡萄糖水溶液中。IGF-MTX会引起低血糖症,因此以5%葡萄糖的输液形式递送IGF-MTX具有施用葡萄糖以抵消预期的轻度低血糖症的好处。765IGF-MTX完全溶于具有任何浓度的葡萄糖的水中,而在中性pH值下,其往往在约150mM NaCl中沉淀。
因此,本发明的另一个实施例提供了一种作为输注溶液的药物组合物,所述药物组合物包括:(a)由IGF-1R配体与甲氨蝶呤共价缀合形成的共价缀合物组成的药剂,其中所述IGF-1R配体为胰岛素样生长因子1(IGF-1)或其变体或胰岛素;所述药剂溶解于(b)100ml到1升的5%到10%(w/v)葡萄糖水溶液中,其中所述组合物包括不超过5mM的NaCl或不超过2mM的磷酸盐;其中所述溶液位于输液袋中并且体积为100ml到1升。
另一个实施例提供了一种施用由IGF-1R配体与甲氨蝶呤共价缀合形成的共价缀合物组成的药剂的方法,其中所述IGF-1R配体为胰岛素样生长因子1(IGF-1)或其变体或胰岛素;所述方法包括:将所述药剂稀释到基本上由体积为100ml到1升的5%到10%(w/v)葡萄糖水溶液组成的稀释剂中,以便制备所述药剂在所述稀释剂中的溶液;以及将所述溶液输注到患者体内。优选地,所述输注经30分钟到2小时的时间发生。
另一个实施例提供了一种组合物,其包括:药剂,所述药剂包括:与抗癌化疗药物缀合的胰岛素样生长因子1型受体(IGF-1R)配体,所述药剂用于治疗寡原始细胞急性粒细胞性白血病(O-AML)或骨髓增生异常综合症(MDS)或慢性髓单核细胞白血病(CMML)的方法中。
另一个实施例提供了一种装置,所述装置包括:(a)能够容纳的最大体积为100ml到2升的输液袋,所述输液袋填充有(b)5%或10%(w/v)葡萄糖的溶液以及溶解于所述溶液中的(c)由IGF-1R配体与甲氨蝶呤共价缀合形成的共价缀合物组成的药剂,其中所述IGF-1R配体为胰岛素样生长因子1(IGF-1)或其变体或胰岛素,所述溶液的体积为100ml到1升(更优选地100ml到500ml、150ml到500ml或约250ml)。
附图说明
图1:765IGF和longR3-IGF到MCF7细胞上的IGF1R相对于I-125标记的IGF1的竞争结合测定。
图2:765IGF到MCF7细胞上的IGF1R相对于I-125标记的IGF1的竞争结合测定。
图3:示出了通过765IGF-MTX实现的MCF7细胞生长抑制的绘图,其用于测定用于生长抑制的765IGF-MTX的IC50。
图4:示出了通过765IGF-MTX实现的对二氢叶酸还原酶(DHFR)的抑制的测定结果。
图5:765IGF-MTX到MCF7细胞上的IGF1R相对于I-125标记的IGF1的竞争结合测定。
图6:是通过765IGF-MTX实现的MDS-L细胞生长抑制的绘图。
图7:MCF7(左侧第2染色通道)和MDS-L(右侧染色通道)的蛋白质印迹。
图8:765IGF-MTX对MCF7细胞增殖的抑制。
图9:IGF-MTX和MCF7肿瘤的游离MTX在nu/nu小鼠中实现的体内肿瘤生长抑制。
图10:IGF-MTX和MCF7-L肿瘤的游离MTX在nu/nu小鼠中实现的体内肿瘤生长抑制。
图11:IGF-MTX和LNCaP肿瘤的游离MTX在nu/nu小鼠中实现的体内肿瘤生长抑制。
图12:来自健康志愿者的溶血血液检测CD34和IGF1R(CD221)的流式细胞术。
图13:来自健康志愿者的溶血血液(100ul)与10ul 100万/ml MDS-L细胞的混合体检测CD34和IGF1R(CD221)的流式细胞术。
图14:MDS-L细胞(100万/ml)检测CD34和IGF1R(CD221)的流式细胞术。
具体实施方式
定义:
术语“抗癌化疗药物或药剂”是指不是酶的并且杀死癌细胞或抑制癌细胞生长同时对非癌细胞具有较小作用的合成的、生物的或半合成的化合物。其不包含哺乳动物天然产生的抗体或分子,如生长因子和细胞因子。
术语“治疗癌症”包含,例如,预防转移、抑制癌症的生长、停止癌症的生长或杀死癌症细胞。
配体对特定受体的术语“结合亲和力”是指缔合常数KA(解离常数KD的倒数)或实验确定的其近似值。
术语“抗代谢物”是指与天然物质具有结构相似性、与作为抑制剂或底物的酶相互作用并干扰细胞过程的抗癌化学治疗剂。实例包含甲氨蝶呤、氟尿嘧啶(fluorouracil)、氟尿苷(floxuridine)、氟达拉滨(fludarabine)、巯基嘌呤(mercaptopurine)、硫鸟嘌呤(thioguanine)、阿糖胞苷(cytarabine)、氮杂胞苷(azacytidine)、克拉屈滨(cladribine)和喷司他丁(pentostatin)。
“IGF-1受体”在文献中也被称为1型IGF受体,并且在本文中简称为IGF-1R。
如本文所用,“含有”是开放式的;即,其允许包含其它未命名的元素,并且具有与“包括”相同的含义。
如本文所用,术语“前导序列”是指氨基酸序列,即蛋白质的N端。蛋白质合成后不会被切割掉,而是作为成熟蛋白质的一部分。
描述:
本发明的一个实施例提供了一种治疗患有寡原始细胞急性粒细胞性白血病(O-AML)或骨髓增生异常综合症(MDS)或慢性髓单核细胞白血病(CMML)的患者的方法,所述方法包括:向被认为需要治疗O-AML、MDS或CMML的患者施用药剂,所述药剂包括:与抗癌化疗药物缀合的胰岛素样生长因子1型受体(IGF-1R)配体。O-AML和CMML被认为是与MDS非常相似的疾病。
另一个实施例提供了一种治疗患有急性髓细胞性白血病(AML)、或慢性髓细胞性白血病(CML)、或O-AML、或CMML或MDS的患者的方法,所述方法包括:向被认为需要治疗AML、CML、O-AML、CMML或MDS的患者施用(a)低甲基化剂(例如,阿扎胞苷或地西他滨)和(b)药剂,所述药剂包括:与甲氨蝶呤缀合的胰岛素样生长因子1型受体(IGF-1R)配体;其中所述IGF-1R配体为胰岛素样生长因子1(IGF-1)或其变体或胰岛素。通常,在同一天施用低甲基化剂和包括与甲氨蝶呤缀合的IGF-1R配体的药剂。
已经发现,765IGF-MTX、胰岛素-MTX和longR3IGF-MTX往往各自在磷酸盐缓冲盐水或任何含盐的中性pH溶液(例如超过约50mM NaCl)中具有低溶解度。因此,765IGF-MTX当前以4mEq/L溶液的形式储存在10mM HCl中。对于向患者输液,将其稀释到250ml的5%葡萄糖或10%葡萄糖水溶液中。IGF-MTX会引起低血糖症,因此以5%葡萄糖的输液形式递送IGF-MTX具有施用葡萄糖以抵消预期的轻度低血糖症的好处。765IGF-MTX完全溶于具有任何浓度的葡萄糖的水中,而在中性pH值下,其往往在约150mM NaCl中沉淀。
因此,本发明的另一个实施例提供了一种作为输注溶液的药物组合物,所述药物组合物包括:(a)由IGF-1R配体与甲氨蝶呤共价缀合形成的共价缀合物组成的药剂,其中所述IGF-1R配体为胰岛素样生长因子1(IGF-1)或其变体或胰岛素;所述药剂溶解于(b)100ml到1升的5%到10%(w/v)葡萄糖水溶液中,其中所述组合物包括不超过5mM的NaCl或不超过2mM的磷酸盐;其中所述溶液位于输液袋中并且体积为100ml到1升。
另一个实施例提供了一种施用由IGF-1R配体与甲氨蝶呤共价缀合形成的共价缀合物组成的药剂的方法,其中所述IGF-1R配体为胰岛素样生长因子1(IGF-1)或其变体或胰岛素;所述方法包括:将所述药剂稀释到基本上由体积为100ml到1升的5%到10%(w/v)葡萄糖水溶液组成的稀释剂中,以便制备所述药剂在所述稀释剂中的溶液;以及将所述溶液输注到患者体内。优选地,所述输注经30分钟到2小时的时间发生。
IGF-1R配体可以是与IGF-1R特异性结合的抗体。在其它实施例中,其为胰岛素或IGF-1(SEQ ID NO:3)或IGF-1的变体。优选的特定变体是765IGF(SEQ ID NO:2)。
在具体的实施例中,抗癌化疗药物为甲氨蝶呤、苯丁酸氮芥或苯达莫司汀。在具体的实施例中,其是甲氨蝶呤。
在具体的实施例中,化疗药物是小分子(分子量小于2000道尔顿),其不是蛋白质或肽并且含由游离的羧基。这些可以通过与EDC反应以将羧基与蛋白质的氨基缀合,从而与蛋白质IGF-1R配体缀合。
本文所描述的治疗患者的方法的具体实施例涉及以0.1到2.5微当量/kg患者体重的剂量施用与甲氨蝶呤缀合的IGF-1R配体,优选为765IGF-MTX。在其它实施例中,剂量为约0.2到2.5、0.4到2.5、或0.4到1.6、约0.2、约0.4、约0.8或约1.6或约2.5微当量/kg。优选地,每周一次给药,但是也可以每周两次或每2周一次或每3周一次。在一个实施例中,在28天的周期中,每周给药一次,持续3周,然后停一周。优选地,通过静脉内输注给药。在一个实施例中,通过静脉内输注体积为100ml到1升(更优选为约200ml到约500ml,并且在其它实施例中为100到500ml、150到500ml、200到500ml或约250ml或约500ml)的5%到10%的右旋糖来施用缀合物(与抗癌化疗药物缀合的IGF-1R配体)。
在一些实施例中,IGF-1R配体与化疗药物共价连接。在其它实施例中,其可以通过非共价连接来缀合,例如通过将化疗药物和IGF-1R配体一起嵌入纳米颗粒中,类似于ABRAXANE是与白蛋白缔合的紫杉醇纳米颗粒的方式。
在具体的实施例中,IGF-1R配体为胰岛素样生长因子-1(IGF-1)或其变体或胰岛素。优选地,与天然IGF-1相比,IGF-1的变体对可溶性IGF结合蛋白的结合亲和力降低。可溶性IGF结合蛋白是血液中与IGF-1结合的可溶性蛋白,与作为发挥IGF-1生物学作用的膜蛋白的IGF-1R膜受体相反。体内多达99%的IGF-1与可溶性IGF结合蛋白结合,并且当其与可溶性IGF结合蛋白结合时,就无法与IGF-1R结合。下文描述了对可溶性IGF结合蛋白的结合亲和力降低的IGF-1的特定变体,以及用于测定对可溶性IGF结合蛋白的结合亲和力的测定法。
我们已经在大肠杆菌中表达了重组载体,所述重组载体的表达受T7启动子控制并被IPTG诱导,IPTG是一种具有SEQ ID NO:2序列的融合蛋白。所述蛋白质在其N端具有SEQID NO:1的序列,所述序列提供了用于纯化的多聚组氨酸标签和几个另外的赖氨酸残基。蛋白质的C端是19-88位残基,并且对应于作为人野生型IGF-1序列的R3-IGF,所述序列在SEQID NO:2的位置21处带有精氨酸,取代了野生型IGF-1(SEQ ID NO:3)的位置3处的天然谷氨酸。
R3-IGF(SEQ ID NO:6)是变体IGF-1,如下所述。
包括SEQ ID NO:1作为N端序列的765IGF(SEQ ID NO:2)之后是R3-IGF,与包括不同前导序列的其它IGF融合蛋白构建体相比,所述R3-IGF以更高的产率进行表达并以更高的产率进行纯化。其比IGF-1的另一个变体IGF132更稳定地储存。其还以几乎100%产率的活性形式进行重新折叠,并且与IGF-1的另一个变体long-R3-IGF相比,其取代更多MCF7细胞上的野生型IGF-1受体。
SEQ ID NO:1前导序列还提供五个赖氨酸残基。通过使用酰胺键将甲氨蝶呤通过其羧基之一共价连接到765IGF的氨基上来制备765IGF-甲氨蝶呤缀合物。765IGF具有九个氨基,包含八个赖氨酸侧链(在SEQ ID NO:1前导中有五个赖氨酸侧链)和氨基端α-氨基。765IGF-MTX每个IGF单体平均连接约8个甲氨蝶呤基团。longR3-IGF和IGF132的缀合物每个IGF单体具有更少的甲氨蝶呤基团。因此,这是SEQ ID NO:1前导的另一个优点。
R3-IGF是融合蛋白中的变体IGF-1,其具有SEQ ID NO:2中的SEQ ID NO:1。其是激活IGF受体(IGF-1R)但对可溶性IGF结合蛋白的结合亲和力降低的变体(与野生型IGF-1相比)(Francis,G.L.等人1992,《分子内分泌学杂志(J.Mol.Endocrinol.)》8:213-223;Tomas,F.M.等人,1993,《内分泌学杂志(J.Endocrinol.)》137:413-421)。可溶性IGF结合蛋白是与IGF-1结合的天然血清蛋白,可将其保持在循环状态中并延长其生物学半衰期。但是,当IGF-1与IGF结合蛋白结合时,它就不能与膜IGF受体(IGF-1R)结合。(Clemons,D.R.1998,《分子和细胞内分泌学杂志(Mol.Cell.Endocrinol.)》140:19-24)。由于这个原因,与可溶性IGF结合蛋白的结合减少的IGF-1变体在体内比野生型IGF-1更活跃并且更快地靶向IGF受体。
可以用大鼠L6-成肌细胞条件培养基测试对IGF结合蛋白的结合亲和力。将来自大鼠L6成肌细胞生长的培养基(0.2ml)与8,000cpm125I-IGF-1(约0.05uCi)混合于最终体积为0.3ml的50mM磷酸钠(pH 6.5、0.25%牛白蛋白)中,并测试最终浓度为0.1nM到1uM的竞争者(野生型IGF-1型或IGF变体)。在室温下孵育90分钟后,为了分离结合的示踪剂和游离的示踪剂,将含有0.2mg/ml硫酸鱼精蛋白的测定缓冲液中的5mg/ml冰冷的经过快速搅拌的木炭悬浮液加入样品中,并在冰上放置8分钟后,将混合物以5,000×g离心20分钟。在γ计数器中计数上清液中的放射性。可以将变体的结合亲和力与野生型IGF的结合亲和力进行比较,以确定变体对可溶性IGF结合蛋白的结合亲和力是否降低。
对可溶性IGF结合蛋白的结合亲和力降低的IGF-1的一些特定变体包含IGF132(SEQ ID NO:4)(在美国专利第4,876,242号中公开)、LONG-R3-IGF(SEQ ID NO:5)、R3-IGF(SEQ ID NO:6)和des(1-3)IGF1(SEQ ID NO:7),它们缺少野生型IGF-1的前三个残基。(LongR3-IGF、R3-IGF和des(1-3)IGF1在以下文献中描述:Francis,G.L.等人1992,《分子内分泌学杂志》8:213-223;Tomas,F.M.等人,1993,《内分泌学杂志》137:413-421)。因此,在特定的实施例中,作为与可溶性IGF-1结合蛋白的结合减少的变体IGF-1的多肽包括SEQ IDNO:4-7中的任何一个。
可以用包括与(b)IGF受体配体(如本文所述的IGF-1或IGF变体)共价偶联的(a)抗癌化学治疗剂的缀合物在癌症中靶向IGF受体。因为胰岛素对IGF-1R具有亲和力,所以IGF-1R配体也可以是胰岛素。
优选地,对可溶性IGF-1结合蛋白的亲和力降低的IGF-1受体配体对可溶性IGF-1结合蛋白的结合亲和力比野生型IGF-1低至少5倍、更优选至少10倍、还更优选至少100倍。可以通过针对标记的IGF-1(例如,125I IGF-1)的竞争结合测定测量对可溶性IGF-1结合蛋白的结合亲和力,所述竞争结合测定使用经过纯化的IGF-1结合蛋白或大鼠L6成肌细胞条件培养基的混合物(自然产生的IGF-1结合蛋白混合物),如Francis,G.L.等人(1992,《分子内分泌学杂志》8:213-223);Szabo,L.等人(1988,《生物化学与生物物理研究通讯(Biochem.Biophys.Res.Commun.)》151:207-214);以及Martin,J.L.等人(1986,《生物化学杂志(J.Biol.Chem.)》261:8754-8760)所述。优选地,在针对标记的与L6成肌细胞条件培养基中的可溶性IGF-1结合蛋白结合的野生型IGF-1的竞争结合测定中,变体IGF-1的IC50大于10nM,更优选大于100nM。
优选地,IGF-1R配体(如对可溶性IGF-1结合蛋白的亲和力降低的变体IGF-1变体)对IGF-1受体的亲和力接近野生型IGF-1(例如,比野生型IGF-1高出小于30倍,更优选比野生型IGF-1高出小于10倍)。在具体的实施例中,在针对标记的与IGF-1受体(例如,MCF-7上的)结合的野生型IGF-1的竞争结合测定中,变体IGF-1的KD小于50nM、更优选小于10nM、还更优选小于5nM、还更优选小于3nM。所述测定法描述于以下文献中:Ross,M.等人(1989,《生物化学杂志(Biochem.J.)》258:267-272)和Francis,G.L.等人(1992,《分子内分泌学杂志》8:213-223),以及本文实例4中。
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在本发明的具体实施例中,IGF-1变体包括IGF-1(SEQ ID NO:3)或包括与SEQ IDNOS:3和4中的任何一个至少90%相同的区段。
在具体的实施例中,抗癌化学治疗药物可以是具有游离羧基的药物,如甲氨蝶呤、苯丁酸氮芥或苯达莫司汀。
在特定的实施例中,与IGF-1R配体缀合的化学治疗剂为氮芥(mechlorethamine)、环磷酰胺(cyclophosphamide)、异环磷酰胺(ifosfamide)、美法仑(melphalan)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、噻替哌(thiotepa)、六甲蜜胺(hexamethylmelamine)、白消安(busulfan)、卡莫司汀(carmustine)、洛美斯汀(lomustine)、司莫司汀(semustine)、链脲霉素(streptozocin)、达卡巴嗪(decarbazine)、长春新碱(vincristine)、长春碱(vinblastine)、依托泊苷(etoposide)、替尼泊苷(teniposide)、紫杉醇(paclitaxel)、多西他赛(docetaxel)、道诺霉素(daunorubicin)、伊达比星(idarubicin)、阿霉素(doxorubicin)、表柔比星(epirubicin)、更生霉素(dactinomycin)、普卡霉素(plicamycin)、丝裂霉素C(mitomycin C)、博来霉素(bleomycin)、米托蒽醌(mitoxantrone)、甲氨蝶呤、氟尿嘧啶、氟尿苷、氟达拉滨、巯基嘌呤、硫鸟嘌呤、阿糖胞苷、氮杂胞苷、克拉屈滨、喷司他丁、顺铂(cisplatin)、卡铂(carboplatin)、米托坦(mitotane)、丙卡巴肼(procarbazine)或安吖啶(amsacrine)。
在所述方法的具体实施例中,所述IGF-1R配体不是IGF-1(SEQ ID NO:3),而是或包括765IGF(SEQ ID NO:2)、IGF132(SEQ ID NO:4)、long-R3-IGF(SEQ ID NO:5)、R3-IGF(SEQ ID NO:6)或des(1-3)IGF1(SEQ ID NO:7)或与IGF-1至少90%相同的变体。
在其它实施例中,所述IGF-1R配体是抗IGF-1R抗体。
在IGF-1R配体与甲氨蝶呤缀合的具体实施例中,所述方法包括以0.1到2.5微当量/kg、0.1到2.5、0.4到2.5、0.4到1.6、约0.2、约0.4、约0.8、约1.6或约2.5微当量/kg的剂量向患者施用所述药剂。一微当量是指一微摩尔(与配体缀合的)甲氨蝶呤基团。
在包括施用低甲基化剂的方法中,低甲基化剂优选为阿扎胞苷或地西他滨,更优选为阿扎胞苷。
一个实施例提供了一种作为输注溶液的药物组合物,所述药物组合物包括:(a)由IGF-1R配体与甲氨蝶呤共价缀合形成的共价缀合物组成的药剂,其中所述IGF-1R配体为胰岛素样生长因子1(IGF-1)或其变体或胰岛素;所述药剂溶解于(b)100ml到1升的5%到10%(w/v)葡萄糖水溶液中,其中所述溶液包括不超过5mM的NaCl或不超过2mM的磷酸盐;其中所述溶液位于输液袋中并且体积为100ml到1升。
在更具体的实施例中,所述溶液的体积为100ml到500ml、150ml到500ml、200ml到500ml、或约250ml或约500ml。
在具体的实施例中,所述药剂765IGF-MTX。
在更具体的实施例中,所述组合物包括少于1mM的NaCl和少于1mM的磷酸盐。
另一个实施例提供了一种施用由IGF-1R配体与甲氨蝶呤共价缀合形成的共价缀合物组成的药剂的方法,其中所述IGF-1R配体为胰岛素样生长因子1(IGF-1)或其变体或胰岛素;所述方法包括:将所述药剂稀释到基本上由体积为100ml到1升的5%到10%(w/v)葡萄糖水溶液组成的稀释剂中,以便制备所述药剂在所述稀释剂中的溶液;以及将所述溶液输注到患者体内。
在具体的实施例中,将所述溶液输注到患者体内的所述步骤经20分钟到2.5小时的时间、或经30分钟到2小时、或经45分钟到1.5小时、或经1小时到2小时发生。
另一个实施例提供了一种组合物,其包括:药剂,所述药剂包括:与抗癌化疗药物缀合的胰岛素样生长因子1型受体(IGF-1R)配体,所述药剂用于治疗寡原始细胞急性粒细胞性白血病(O-AML)或骨髓增生异常综合症(MDS)或慢性髓单核细胞白血病(CMML)或急性髓细胞性白血病(AML)或慢性髓细胞性白血病(CML)的方法中。
另一个实施例提供了一种装置,其包括:(a)能够容纳的最大体积为100ml到2升的输液袋,所述输液袋填充有(b)5%或10%(w/v)葡萄糖的溶液以及溶解于所述溶液中的(c)由IGF-1R配体与甲氨蝶呤共价缀合形成的共价缀合物组成的药剂,其中所述IGF-1R配体为胰岛素样生长因子1(IGF-1)或其变体或胰岛素,所述溶液的体积为100ml到1升(更优选地100ml到500ml、150ml到500ml或约250ml)。
所述装置可以进一步包括(d)连接到所述输液袋的管,以及(e)连接到所述管的皮下注射针。
在一个实施例中,所述药剂765IGF-MTX。
在所述装置的一个实施例中,所述溶液包括至少10微当量的所述药剂并且不超过250微当量的所述药剂。
在所述装置的具体实施例中,所述溶液包括不超过5mM的NaCl(优选地不超过1mM的NaCl)和不超过2mM的磷酸盐(优选地不超过1mM的磷酸盐)。
在所述装置的具体实施例中,所述溶液包括不超过5mM的NaCl(优选地不超过1mM的NaCl,更优选地不包括NaCl)。
用于将抗癌化学治疗剂与受体配体偶联的指南
胰岛素和IGF-1受体的天然配体是蛋白质,即胰岛素、IGF-1和IGF-2。化学治疗剂通常通过蛋白质上存在的反应性基团与蛋白质偶联。这些包含N端的α-氨基、C端的α-羧基、赖氨酸的侧链氨基、天冬氨酸和谷氨酸的侧链羧基、半胱氨酸的侧链硫醇和精氨酸的侧链。在蛋白质上发现的其它反应性侧链是丝氨酸和苏氨酸的侧链羟基、酪氨酸的羟芳基、组氨酸的咪唑和蛋氨酸侧链。
在化学治疗剂以及胰岛素和IGF-1受体的非蛋白质配体上发现了许多相同的反应性基团。因此,本文讨论的蛋白质修饰和交联的许多原理也适用于化学治疗剂和非蛋白质配体的修饰和交联。
蛋白质缀合和交联的化学过程和原理描述于以下文献中:Wong、Shan S.,《蛋白质缀合和交联的化学过程(Chemistry of Protein Conjugation and Cross-Linking)》,1991,CRC出版社(CRC Press),布卡拉顿,佛罗里达州。有关这一化学过程的其它信息来源包含:《皮尔斯生物化学目录(Pierce Biochemistry catalog)》;以及Greene,T.W.和Wutz,P.G.M.,《有机合成中的保护基(Protecting Groups in Organic Synthesis)》,1991年第二版,约翰威利父子出版公司(John Wiley&Sons,Inc.),纽约,以及本文引用的参考文献。
氨基酸侧链的最强亲核试剂是还原的半胱氨酸侧链的巯基。硫醇与大多数蛋白质修饰试剂反应。α-卤代乙酰胺和马来酰亚胺被认为与半胱氨酸残基特异性反应,特别是在pH 7.0及以下。硫醇还通过二硫交换与二硫试剂发生反应。
你好
氨基是蛋白质上发现的次强的亲核试剂。醛与氨基反应形成希夫碱(Schiffbase)。希夫碱是可水解的,这在本发明中是一个优点。在某些情况下,随着配体-化学治疗剂缀合物被摄取到癌细胞中,有必要将化学治疗剂从缀合物上切割下来以使其具有活性。如果化学治疗剂通过可断键(如可水解的键)与配体相连,则可以更好地实现这一点。可断键可以自发地断裂或被细胞中的酶切割。例如,酰胺键被某些酶(包含蛋白酶)切割。希夫碱键以可察觉的速率自发地水解。预期二硫键在癌细胞的细胞内还原环境中被还原性切割。
由氨基与醛反应形成的希夫碱可以通过例如用硼氢化钠或吡啶硼烷还原来稳定。吡啶硼烷具有不还原二硫键的优势,二硫键存在于胰岛素、IGF-1和IGF-2中,并且对这些蛋白质的结构至关重要。
在某些化学治疗剂中发现的相邻碳原子上的糖或具有羟基的其它部分可以通过用例如高碘酸盐使糖氧化来进行修饰,从而与氨基反应。这在碳之间进行切割并产生二醛。醛基将与氨基反应。
二醛(如戊二醛)将使具有氨基的两个分子交联。
其它氨基试剂包含活化的羰基化合物,如N-羟基琥珀酰亚胺酯、对硝基苯基酯或酸酐(例如,琥珀酸酐)。
氨基也与磺酰卤和芳基卤(例如,2,4-二硝基氟苯)反应。
氨基也与异氰酸酯和异硫氰酸酯反应生成尿素或硫脲衍生物。
亚氨基酯是最具体的氨基酰化剂。亚氨酸酯在约7到10的pH值下与胺发生特异性反应生成亚酰胺。这一反应具有通过在前一个氨基上产生带正电荷的基团亚氨基酰胺来保持电荷稳定性的优点。亚氨基酰胺还可以在高于中性的pH值下缓慢水解,这也是一个优点,因为水解可以在癌细胞中释放出游离的化学治疗剂。
羧基在弱酸性条件下(例如,pH 5)与重氮乙酸酯和重氮乙酰胺发生特异性反应。
羧基的最重要的化学修饰使用碳二亚胺,如1-环己基-3-(2-吗啉基-4-乙基)碳二亚胺(CMC)和3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)。在存在胺的情况下,碳二亚胺分两个步骤与羧基形成酰胺键。在第一步中,羧基加到碳二亚胺上形成O-酰基异脲中间体。随后与胺反应,得到相应的酰胺。
一个特别重要的碳二亚胺反应是其在用N-羟基琥珀酰亚胺活化羧基以形成N-羟基琥珀酰亚胺酯中的用途。
精氨酸与邻近的二醛或二酮(如乙二醛、2,3-丁二酮和1,2-环己二酮)反应。
如果期望稳定的话,硼酸盐可以稳定加合物。
反应性基团也可以通过上述一些反应与其它反应性基团互换。例如,用酸酐(如琥珀酸酐)对氨基进行的修饰使用游离的羧基取代带正电荷的氨基。同样,羧基与碳二亚胺和二胺(如乙二胺)的反应使用游离的氨基取代羧基。
交联:可以使用含有上述反应性基团中的两个(例如两个氨基反应性基团或氨基和硫醇反应性基团)的试剂将含有合适基团之一的化学治疗剂与含有其它合适基团的胰岛素或IGF-1受体配体交联。另外,用碳二亚胺或碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺活化的羧基(例如,化学治疗剂的羧基)可以与氨基(例如,蛋白质配体的氨基)反应形成酰胺键交联。
活化的羧基足够稳定以至于可以被分离,但是随后会容易地与氨基反应形成酰胺键。
可以使用琥珀酰亚胺(如N-琥珀酰亚胺基-3-[2-吡啶基二硫代]丙酸酯(SPDP))通过氨基使两种化合物偶联。(参见《皮尔斯生物化学目录》以及Thorpe,P.E.等人1982,《免疫学评论(Immunol.Rev.)》62:119-158.)
实例
实例1
通过DNA 2.0(门洛帕克,加利福尼亚州)合成了对这些蛋白质进行编码的质粒,所述质粒具有用于在大肠杆菌中进行表达的最佳核苷酸序列,并处于T7启动子的控制下:
用所述质粒中的每一个转化大肠杆菌BL21(DE3),并分离转化体。使用10ml的每个转化的BL21(DE3)培养物将500ml LB培养基与50ug/ml卡那霉素(LB-kan)一起接种在2L带挡板的烧瓶中。用0.4mM最终IPTG在0.6的O.D.600nm下对其进行诱导,并在25℃下生长过夜。
将细胞重新悬浮于50mM Tris-HCl(pH 8.0)中并冷冻。将细胞解冻,并以5%湿重/体积细胞重量在50mM Tris-HCl(pH 8.0)、0.2% Triton-X100、0.5mg溶菌酶/克细胞糊中室温孵育30分钟。然后将对其进行超声处理以破坏细胞。加入MgCl2至3mM最终浓度,并且每升培养物加入250ul BENZONASE。将其在室温下再孵育1小时。
通过离心使包涵体分离。保留可溶性部分。
将包涵体溶于7M尿素、0.5M NaCl、20mM磷酸盐(pH 7.8)中。
将溶解后的包涵体在柱中上样到1ml Ni-硝基三乙酸(Ni-NTA)树脂上。用Ni-A缓冲液洗涤柱,并用Ni-B缓冲液洗脱柱。
Ni-A 6M尿素、0.5M NaCl、20mM磷酸钠、20mM咪唑,pH 7.3。
Ni-B 6M尿素、0.5M NaCl、20mM磷酸钠、0.4M咪唑,pH 7.3。
蛋白质产量为:
对洗脱液以及不可溶和可溶性粗品馏分进行SDS-PAGE。784IGF和785IGF似乎在可溶性部分中具有约一半IGF,并且在不可溶部分中具有一半。403IGF、764IGF和765IGF似乎在不可溶部分中具有几乎全部IGF。
根据这一数据,最好的产率是765IGF的产率。具有SEQ ID NO:1前导序列的那些(764IGF和765IGF)比具有简单的Met-His6前导序列(403IGF)或具有硫氧还蛋白前导序列的那些(784IGF和785IGF)提供了更好的产率。并且具有IGF部分的R3IGF突变体的构建体(765IGF和784IGF)比具有融合蛋白的IGF部分的IGF132突变体的对应构建体(764IGF和785IGF)提供了更好的产率。
实例2
重新折叠和结合测定
将实例1中的2ml每个原始Ni洗脱液与约等体积的100mM甘氨酸、6M尿素(pH 9.5)混合,在CENTRICON 3kDa过滤器中通过超滤进行浓缩,然后再次置于所述缓冲液中并浓缩至约420ul。然后将其分别稀释至2mg/ml(对于403IGF、764IGF和765IGF)和4mg/ml(对于784IGF)和2.4mg/ml(对于785IGF)。
将200ul每个洗脱液与1.8ml复性缓冲液快速混合。复性缓冲液为1.4M尿素、100mM甘氨酸、0.5M NaCl、19%乙醇、0.5mM GSSG、4mM GSH,pH 9.5。将其在室温下重新折叠3小时,然后在结合测定中测试其与IGF受体针对I-132放射性野生型IGF(珀金·埃尔默公司(Perkin Elmer,Inc.))的竞争结合。作为比较,还测试了商用Long-R3-IGF(LR3IGF)。
这个实验中的近似结合常数(KD)为:
含有R3IGF突变体的融合蛋白(LR3IGF、765IGF和784IGF)的KD低于含有IGF132突变体的融合蛋白(403IGF、764IGF和785IGF)。
实例3
765IGF的纯化和产率
通过DNA 2.0(门洛帕克,加利福尼亚州,美国)合成了对765IGF进行编码的质粒,所述质粒具有针对大肠杆菌的最佳密码子选择,并且765IGF基因处于T7启动子的控制之下。用所述质粒转化大肠杆菌Bl21(DE3),使其在发酵罐培养物中生长并用IPTG诱导。
在变性条件下,通过离子交换色谱法和镍亲和色谱法对765IGF进行纯化。经过纯化的765IGF的产率为每升培养物约60mg。
通过类似于实例2的方法将765IGF重新折叠,然后通过DEAE树脂的离子交换色谱法和在镍树脂的亲和色谱法对重新折叠的蛋白进行纯化。
实例4
765IGF与IGF-1受体的结合测定
方法:
测定理论:放射性125I标记的胰岛素样生长因子1(IGF-1)与测试配体竞争结合在体外MCF7细胞(人乳腺癌细胞系)上大量存在的1型IGF受体。测试的配体包含我们的胰岛素样生长因子-1(IGF-1)的765IGF变体和含有与765IGF偶联的抗叶酸药物甲氨蝶呤的我们的新型共价缀合物,以及作为比较和阳性对照的市售long-R3-IGF-1(西格玛奥德里奇(SigmaAldrich),圣路易斯,密苏里州,美国)。
MCF7细胞培养基:500mL MEM、0.01mg/mL牛胰岛素;5mL丙酮酸钠、5mL非必需氨基酸、10mL碳酸氢钠、10mL胎牛血清、5mL青霉素/链霉素。
将MCF7细胞(ATCC HTB-22)以每孔20,000个细胞平板接种在体积为0.5mL/孔的48孔组织培养板(含有低蒸发盖的平底)中,并置于37℃且含有5%CO2的细胞培养箱中。培养2-3天后,将板用每孔0.5mL冷结合测定缓冲液(100mM Hepes-NaOH,pH 7.2;120mM NaCl;5mM KCl;1.2mM MgSO4;0.1% BSA)洗涤2次。最后一次洗涤后,将0.5mL结合测定缓冲液添加到每个孔中,并将板置于4℃下,持续2到6小时。
在体积为200ul的5mM HCl中,制备浓度为10微摩尔的测试配体(long-R3-IGF)或20微摩尔的测试配体(765IGF and IGF-MTX)。为了测定浓度,使用了765IGF的分子重量(9742道尔顿)和long-R3-IGF的分子重量(9111道尔顿)。对于long-R3,将冻干的市售材料以1.0mg/ml的浓度溶于10mM HCl中,然后将其稀释成浓度为91ug/ml的10uM溶液。
将765IGF和long-R3-IGF以2000nM到1nM的浓度稀释到孔中的结合缓冲液中。
接下来,将25uCi批次的I-125IGF(珀金·埃尔默公司放射化学公司(PerkinElmer Radiochemicals),沃尔瑟姆,马萨诸塞州,美国)溶解在1ml水中。在结合缓冲液中进行适当的稀释,然后将50ul经过稀释的放射性IGF添加到每个孔中,以每孔添加0.03uCi或更多。对于新鲜的I-125IGF,可以将每板使用的100ul I-125IGF的1ml水溶液添加到每板使用的2.6ml结合缓冲液中,并且每孔添加50ul。
然后将板在4℃下孵育过夜。然后用微量移液器从每个孔中抽出液体,并在结合缓冲液中将孔洗涤两次。用0.5mL 300mM NaOH(1% SDS)裂解细胞,并在γ计数器上对裂解物进行计数。
结果:
765IGF和市售long-R3-IGF的IGF-1受体结合测定的结果示于图1中。在高浓度下,765IGF始终比long-R3-IGF取代更多的放射性,这表明其可能与long-R3-IGF不结合的膜上的IGF-1结合位点结合。在这个试验中,765IGF的KD低于1nM,而long-R3-IGF的KD约为3nM。用不同批次的765IGF进行的第二种结合测定示于图2中,并且提供的KD为3.5nM。
实例5
甲氨蝶呤与765IGF的缀合
将蛋白质缓冲液交换到pH 7.3缀合缓冲液中,并调节至浓度为2.5mg/ml。
pH 7.3缀合缓冲液:25mM磷酸钠、10mM NaCl、6M尿素,pH 7.3。
pH 6.3缀合缓冲液:与pH 6.3缓冲液相同。
将甲氨蝶呤以20mg/ml的浓度溶解在pH 6.3缀合缓冲液中,然后用NaOH将pH调节至pH 6.3。
将1-乙基-3-[3-二甲基氨基丙基]碳二亚胺盐酸盐(EDC)以75mg/ml新鲜溶解在pH6.3缀合缓冲液中。
将一体积的EDC溶液添加到1体积的MTX溶液中,并在室温下孵育30秒,然后将该混合物添加到8体积的pH 7.3缀合缓冲液中的2.5mg/ml蛋白质溶液中。
混合所述混合物,然后在室温下反应过夜。然后将6M HCl添加到反应混合物中,直至最终浓度为60mM。然后将反应混合物缓冲液交换成10mM HCl。
结果:
通过使用21.6/mM甲氨蝶呤基团的摩尔消光系数在100mM HCl中测量缀合物在305nm下的吸光度来确定每摩尔蛋白质的甲氨蝶呤缀合物的量(Chamberlin等人《药物物质分析概况(Analytical Profiles of Drug Substances)》,1976,5:283-306)。通过定量的氨基酸分析来确定蛋白质浓度。这样,765IGF-MTX缀合物中MTX基团与IGF的摩尔比约为8。
实例6
765IGF-MTX体外细胞毒性测定
细胞毒性测定这个效能测定法是用于通过与765IGF-MTX一起孵育在体外抑制MCF-7肿瘤细胞增殖的测定法。
方法
第0天在第0天,将五千个MCF7细胞逐孔地平板接种于100ul富培养基中的96孔测试板中。
第1天为每个测试板制作一个阴影板,所述阴影板的每个孔中含有培养基,或者每个孔中的培养基中的测试剂的预期最终浓度为3X。作为阴性对照,使用了培养基。作为阳性对照,使用了3uM游离甲氨蝶呤。
制成阴影板之后,将50ul从阴影板的每个孔转移到测试板的相应孔,以在测试板的孔中产生最终浓度的测试剂。
第5天通过加入Dojindo CCK-8试剂并根据制造商的说明进行孵育并测量染料的吸光度来确定细胞增殖。
结果:
用765IGF-MTX进行的代表性细胞毒性测定的结果示于图3中。765IGF-MTX的IC50(抑制50%细胞增殖所需的浓度)为每升249毫微当量。(一毫微当量是指一毫微摩尔与765IGF缀合的甲氨蝶呤基团)。作为比较,在同一测定中,测得游离甲氨蝶呤的IC50为88nM。
实例7
甲氨蝶呤和IGF-甲氨蝶呤缀合物对二氢叶酸还原酶的抑制作用
方法:
根据制造商的说明,使用购自西格玛-奥德里奇(Sigma-Aldrich)(圣路易斯,密苏里州,美国)的二氢叶酸还原酶测定试剂盒进行实验。在测定中,将二氢叶酸还原酶与pH7.5缓冲液混合。接下来,加入抑制剂——甲氨蝶呤或IGF-甲氨蝶呤缀合物,并混合溶液。将其孵育30秒以允许抑制剂结合。然后添加NADPH至最终浓度为50uM,并且然后添加二氢叶酸至最终浓度为60uM。通过测量340nm的吸光度来监测反应。
结果:
测试的缀合物为:
如实例3中所述制备的765IGF-MTX。765IGF具有9个可用于缀合甲氨蝶呤的氨基(8个赖氨酸和N端氨基)。这一批次的MTX:蛋白质摩尔比为7.5。
765IGF-MTX 1/3。在缀合反应中,用MTX和EDC通常浓度的1/3制备这个缀合物。这产生了MTX:蛋白质摩尔比为1.2的缀合物。
LR3IGF-MTX。在这种情况下,IGF的版本为long-R3-IGF。其具有4个可用于进行缀合的氨基(3个赖氨酸侧链和N端氨基)。这个缀合物的MTX:蛋白质比率为2.8。
另外,测试了游离甲氨蝶呤。
在将所述缀合物用于抑制测定之前,将其彻底超滤以除去任何游离的甲氨蝶呤。
765IGF-MTX的抑制数据图示于图4中。
甲氨蝶呤和缀合物的IC50为:
尽管每IGF蛋白单体缀合的MTX基团数量不同,但所有三种IGF-MTX缀合物的IC50(以nEq/L计)大致相同。这表明每个缀合的甲氨蝶呤基团均充当酶的独立抑制剂。一旦一个基团与DHFR酶结合,如果缀合单体上的另外的甲氨蝶呤基团在空间上无法结合并抑制DHFR酶,则人们期望对于每种结合物,结合物的IC50在蛋白浓度(nM)方面将是相同的,而在MTX基团浓度(nEq/L)方面不是相同的,如所观察到的那样。因为抑制与MTX基团成正比,所以具有较高MTX负载的765IGF-MTX具有13nM的蛋白质浓度抑制常数(95nEq/L除以每IGF 7.5MTX得到13nM IGF),而LR3IGF-MTX具有35nM的蛋白质浓度抑制常数。因此,随着MTX负载量的升高,需要更少的765IGF蛋白来实现对DHFR的相同抑制,并且通过推断相同水平的肿瘤细胞杀死。
数据显示,蛋白质缀合的MTX基团抑制DHFR,但是与游离的MTX相比,抑制作用需要更高的浓度。
实例8
765IGF-MTX与MCF7细胞上的IGF-1R的结合。
已经进行了带有MCF7的765IGF-MTX缀合物与放射性标记的IGF-1的几个竞争结合测定,如实例4所述。结果是KD约为20nM的765IGF-MTX。(为说明起见,这是蛋白质缀合物(nM),不是MTX基团(nEq/L)。由于每个765IGF大约有8个MTX,因此20nM 765IGF-MTX大约是160nEq/L 765IGF-MTX)。在图5所示的特定结合测定中,KD为13.4nM。
实例9
体内毒理学研究
MTD基于非啮齿动物和啮齿动物研究。已经完成了对大鼠和比格犬的正式的GLP毒性体内研究,其中在研究第1天和第8天通过单次30分钟输注向这些狗静脉注射了765IGF-MTX缀合物,如表1所示:
表1
对所有产生的数据(包含临床观察、连续血糖测定和临床病理学)进行的分析表明,在通过静脉内输注0.2和0.5μeq/kg 5%葡萄糖中的765IGF-MTX缀合物进行治疗的狗中,并未发现与药物/治疗相关的明显毒性。在0.2μeq/kg组中,仅观察到短暂的呼吸困难和被动性,而在用0.5μeq/kg进行治疗的动物中,记录到单发的呕吐和腹泻,并且母犬的头部的皮肤有轻微的红肿现象。两组狗的治疗耐受性良好,对治疗的任何反应都是短暂的,并且可以自行解决。
以2μeq/kg给药的动物对治疗的反应包含轻至中度的类过敏反应和荨麻疹型反应、短暂性厌食和体重减轻以及低血糖症。以6μeq/kg给药的狗对治疗的反应类似于以2μeq/kg给药时的反应,但反应更严重且持续时间更长。因此,在本研究中,通过经30分钟的单次输注,在比格犬中765IGF-MTX缀合物的MTD可能被认为是6μeq/kg。
用苯海拉明和右旋糖治疗可以帮助以2μEq/kg给药的母犬和以6μEq/kg给药的两个动物从类过敏反应和低血糖中恢复。
高剂量组中的低血糖症是IGF的夸大药理作用,可以通过使用5%葡萄糖作为递送765IGF-MTX缀合物的媒剂来减轻。类过敏反应的发病机理尚不清楚,但可能是由甲氨蝶呤、IGF或其组合引起的。呕吐、腹泻、厌食和体重减轻是甲氨蝶呤的已知反应。
比格犬中最高的非严重毒性剂量为0.5μeq/kg。通过将以uEq/kg计的狗的剂量转换为相当的以μEq/kg计的人类剂量,与狗的0.5μEq/kg的相当的人类剂量为人的0.27μEq/kg。
IGF-MTX不会引起明显的血细胞减少
细胞减少症是MDS、CMML和O-AML的特别关注,因为其是这些疾病的主要后遗症。在大鼠和狗的重复剂量的GLP毒理学测试中,即使在最高测试剂量下,IGF-MTX几乎也不会引起血细胞减少。在大鼠和狗的毒理学研究中,IGF-MTX引起轻微的红细胞质量的剂量依赖性降低,但即使在最高剂量下,红细胞质量也处于正常范围内。在大鼠而非狗中,IGF-MTX也会使中性粒细胞略微减少,但即使在最高剂量下,中性粒细胞也保持在正常范围内。IGF-MTX不会影响其它血液学参数。
在已完成的针对人实体瘤患者的I期剂量递增研究中,发现在不发生任何严重的不良事件的情况下,可以耐受0.8μEq/kg的剂量。由于MDS患者比实体瘤患者具有更多血细胞减少症,并且出于MDS患者的安全,我们正在这项研究中进行新的剂量递增,从第1天、第8天和第15天施用的0.2μEq/kg剂量水平开始。关于剂量递增方案,参见第6页的方案。
实例10
使用IGF-甲氨蝶呤缀合物对SPRAGUE-DOWLEY大鼠进行每周一次6剂静脉毒性研究,然后是14天恢复期
这项重复剂量研究检查了765IGF-MTX(一种名为765IGF的胰岛素样生长因子的变体与甲氨蝶呤(MTX)的缀合物)的全身毒性潜力和对靶器官的毒性。每周一次通过静脉内缓慢推注施用IGF-MTX缀合物,持续6周。分别以0.5、2和5μEq/kg(μEq是μmol甲氨蝶呤)剂量水平对三组Sprague-Dawley大鼠进行两次静脉内给药。由于在大剂量组中未观察到毒性,从第三次给药开始,将中剂量组的剂量水平从2μEq/kg增加到5μEq/kg,并且一直保持到治疗结束(即动物总共接受4次给药,总剂量为5μEq/kg)。在高剂量组中,首先将剂量从5μEq/kg增加到10μEq/kg(第三次给药),然后由于严重的毒性,将其余3次给药的剂量水平调整为8μEq/kg。向对照组大鼠给药用作IGF-MTX制剂的稀释剂的5%葡萄糖注射液USP(D5W)。
在本研究中使用了四组大鼠(1个对照组和3个测试组)。每个主要研究测试组和对照组均由10只雄性大鼠组成[品系:Crl:(SD)BR-Sprague-Dawley(查尔斯河加拿大公司(Charles River Canada Inc.),加拿大)。对照组、中剂量组和高剂量组中的恢复组还包含每种性别的5只大鼠;CBC/葡萄糖亚组包含每种性别的3只大鼠(对照组)和每种性别的6只大鼠(测试组)。将每种性别的另外3只大鼠分配给对照组并将每种性别的9只大鼠分配给每个测试组,以进行毒代动力学血液采集。
所有组(包含对照组)的剂量体积为4mL/kg。尽管出于本报告的目的对剂量水平进行了一些调整,但报告中使用的剂量将被称为0.5、5和8μEq/kg。
对所有动物的检查均包含每日临床观察以及每日食物和水监测。还每周对动物进行详细的体格检查。记录最初体重,然后记录第7天、第14天、第21天、第28天、第35天和第41天以及在第42天进行尸检之前的体重(主要研究动物),另外,记录第37天、第42天和第49天以及在第50天进行尸检之前的体重(恢复动物)。每周记录食物消耗量。在第二次给药之前24小时以及在每次后续给药之前24小时进行全血细胞计数(CBC)。在主要研究期和恢复期结束时进行完整的临床病理检查。
在最初(治疗开始前)以及主要研究结束时进行眼底镜检查。
还按照毒物动力学规程收集了血样,但是没有对血样进行分析。第六次给药结束六天后,将每组的10只雄性和10只雌性主要研究动物安乐死,并进行尸检和组织病理学检查。最后一次给药14天后,将对照组中其余的5只雄性和5只雌性恢复期大鼠以及分别以5和8μEq/kg剂量给药的组安乐死,并进行尸检和组织病理学检查。
使高剂量组中的三只大鼠死亡和/或安乐死。在第15天(第3次给药),当剂量从5μEq/kg增加到10μEq/kg时,雄性(TK组)和雌性(主要研究组)在给药结束后立即死亡。
怀疑在剂量水平增加至10μEq/kg后,被测物的低pH值(pH~2.3)可能引起了代谢性酸中毒和/或测试物通过静脉发生了沉淀。组织病理学评估发现了许多大小不等的圆形绿色-灰色无定形颗粒,其中一些在两只动物的肺中均具有中央密度,这些颗粒会迅速死亡。这些大鼠中的一只在心脏中也具有这些颗粒。两个动物的肺部均存在急性血栓栓塞,并且心脏中存在急性静脉凝血。注射的物质似乎发生了沉淀并引发了血管内血小板凝集,并伴有微栓塞和小血管阻塞。
在第24天安乐死的第三只大鼠中,发现上升性肾盂肾炎伴缺血性坏死和实质萎缩。这些变化是严重的,并且解释了临床恶化。这种情况被认为是偶然的,并且与被测物的治疗无关。
除死亡的大鼠外,所有组的所有其它大鼠均接受了指定的治疗,并存活到预定的安乐死和尸检日期。
在用0.5μEq/kg的IGX-MTX缀合物治疗的任何大鼠中,或在用2μEq/kg剂量(对于前2剂)并然后用5μEq/kg(对于剩下的4剂)剂量给药的大鼠中,均没有与治疗相关的全身毒性作用。
在高剂量组中,将剂量增加至10μEq/kg后,在给药后一小时内在某些大鼠中偶尔观察到血尿。这归因于测试制剂的低pH(pH=~2.3)。
眼科检查结果未发现任何异常发现,并且食物消耗和体重增量未发现测试组与对照组之间有任何显著差异。
在以5和8μEq/kg给药的组中,最有可能与治疗相关但已知的病理发现以及施用MTX的常见不良反应如下:
●在研究期间监测的CBC参数的总体趋势是红细胞质量(RBC、Hb、Hct)略有剂量依赖性降低,而网织红细胞代偿性增加。在第6次给药之前,以5μEq/kg治疗的组中的红细胞质量减少了约8-15%(性别合并),而在以8μEq/kg进行治疗的组中,红细胞质量减少了约15-19%。同时,在分别接受5和8μEq/kg IGF-MTX缀合物的组中,网织红细胞计数增加了47-102%和2.2-2.4倍(性别合并)。这两个组中的中性粒细胞计数也均降低。
●在主要研究结束时,在以5和8μEq/kg的IGF-MTX缀合物治疗的组中,在两种性别的动物中也观察到了红细胞质量的减少(对于,分别以5和8μEq/kg给药的组,平均减少了6-7%和10-14%)。在这两个组中均发现代偿性网织红细胞增多。
●这2组中的WBC也降低了(中性粒细胞、淋巴细胞和单核细胞均受到影响)。所有细胞类型似乎都受到同样的影响。当与对照相比时,在以5μEq/kg治疗的组中,性粒细胞减少约5-35%(性别合并),而在以8μEq/kg治疗的组中,中性粒细胞减少范围为50-57%之间。以8μEq/kg给药的雌性的血小板也显著减少(相对于对照组雌性,血小板减少约38%)。在恢复期动物中,所有这些参数要么恢复正常,要么显示出表明恢复的归一化趋势。
●以5和8μEq/kg给药的雄性和雌性的平均脾脏重量均增加。相对于对照组大鼠的平均脾脏重量,增加量平均在17%到38%之间。
在治疗组中观察到的且被认为与治疗有关但已知的变化夸大了IGF的药理作用,所述变化如下所示:
●在以0.5μEq/kg给药的组中(性别合并),平均葡萄糖水平在给药后升高。在6次给药中,平均葡萄糖水平的升高范围为0.3±0.5到4.0±5.0mmol/L之间。有时,在某些个体动物中,该组的血糖水平降低。
●在以5μEq/kg给药的组中,血糖水平在6次给药中的平均升高或降低范围为-1.8±7到7.5±3.4mmol/L,而在以8μEq/kg给药的组中,平均升高/降低范围为-2.1±1.3到2.6±3.1mmol/L。在某些情况下(第3次剂量为10μEq/kg),某些动物的葡萄糖水平降至2.8mmol/L以下,因此,该组中的所有动物均以2mL/大鼠腹腔注射了10%右旋糖。应当注意的是,葡萄糖血液水平的降低表现出剂量依赖性。
组织病理学评估发现了以8μEq/kg给药的动物的肺部变化可能具有潜在的毒理学意义,这些变化如下:
●在研究中,在肺中,许多动物的血管周围间隙中的粒细胞和淋巴细胞浸润增加了小血管的突出性。在主要研究中,在5/20对照和19/19以8μEq/kg给药的动物组中观察到了这些血管周围炎性细胞浸润。在以8μEq/kg给药的组中,这种反应的严重性更高。在恢复组中,在4/10对照和0/10高剂量动物中观察到了反应。
●高剂量恢复组的一个动物中,存在楔形的实质损失区域,伴有与缺血性梗死一致的替代性纤维化。这些是早期局灶性缺血事件的残留物。尚不清楚梗死是否与治疗有关,因为这种改变可能是与方案无关的偶发性疾病。
总之,对所有产生的数据(包含临床观察、眼科、尸检和组织病理学)进行的分析表明,在持续6周每周接受0.5和5μEg/kg IGF-MTX缀合物静脉内治疗的大鼠中,并未发现与药物/治疗相关的明显毒性。在这两个剂量水平下,动物对治疗的耐受性良好。
在0.5μEg/kg的剂量水平下,在某些大鼠中偶尔发现的唯一发现是血糖水平略有下降。这个发现是IGF的预期药理作用,因此在这个实验的条件下,本研究中未观察到的效应水平(NOEL)被认为等于持续6周每周给药的0.5μEq/kg。
在5μEq/kg的剂量水平下,除了血糖水平的降低比在以0.5μEg/kg给药的动物中更为明显外,红细胞质量也有少量降低(第6次给药之前约为8-15%并且在主要研究结束时约为6%-7%)。在主要研究结束时,该组的WBC也有所减少(约5-35%)。恢复期结束时,RBC和WBC都在该组的正常范围内,这表明这些变化具有可逆性。该组中脾脏重量也略有增加,这表明恢复期动物中有归一化的趋势。这些发现是MTX对造血作用的已知效应。因此,在这个实验的条件下,本研究中未观察到的不良反应水平(NOAEL)被认为等于5μEg/kg。
实例11
使用IGF-甲氨蝶呤缀合物对比格犬进行每周一次5剂静脉注射毒性研究,然后是21天恢复期
这项重复剂量研究检查了765IGF-MTX(一种名为765IGF的胰岛素样生长因子的变体与甲氨蝶呤(MTX)的缀合物)的全身毒性潜力和对靶器官的毒性。每周一次通过静脉内(IV)输注施用IGF-MTX缀合物,持续5周。用5%葡萄糖(D5W)分别以0.5、2和4μEq-kg(一μEq是指一微摩尔甲氨蝶呤组)的剂量水平对三组比格犬进行静脉内给药,并且向第四组对照组给药用作IGF-MTX缀合物制剂的稀释剂的D5W。
在本研究中使用了四组狗(1个对照组和3个测试组)。对照组、中剂量组和高剂量组均由10只狗组成(雄性5只,雌性5只),并且低剂量组由6只狗组成(雄性3只,雌性3只),品种为:比格(Beagle),里奇兰农场公司(Ridglan Farms)。通过IV输注以每小时5mL/kg的剂量体积经1小时施用测试物和对照物物。
对所有动物的检查均包含每日临床观察以及每日食物和水监测。还每周对动物进行详细的体格检查。记录最初体重,然后记录第8天、第15天、第22天、第29天和第34天以及在第35天进行尸检之前的体重(主要研究动物),另外,记录第30天、第37天、第44天、第49天以及在第50天进行尸检之前的体重(恢复动物)。每周记录食物食物消耗量。在第一次给药之后24小时以及在每次后续给药之前进行全血细胞计数(CBC)。在研究开始前、在主要研究期和恢复期结束时进行完整的临床病理检查。
所有动物均接受0.5到4μEq/kg剂量的指定治疗,并且死亡率与治疗有关。
在所以测试组中,发现眼科和ECG(包含QT)检查结果处于正常生理极限范围内。
在以0.5μEq/kg给药的组中,对治疗的临床反应较轻并且包括以下:一只公犬的轻度到中度被动性和巩膜注射、两只母犬呕吐、并且另一只母犬轻度呼吸困难。在一个雌性动物中还观察到眼睛周围的轻度水肿。以上所有观察结果均为单一临床事件,在5个剂量周期内仅发生一次,是暂时性的并自行解决。对这些动物给药后血糖水平的任何下降可以忽略不计。在研究结束时,在该组中注意到红细胞质量轻微较少(与对照组相比减少了约10%)。但是,该组中的红血细胞(RBC)、血细胞比容(Hct)和血红蛋白(Hb)良好处于正常范围内。这些发现被认为不具有临床意义,因为它们的程度低、短暂、可以自行解决,并且是甲氨蝶呤疗法的预期副作用。
在以2和4μEq/kg给药的组中,治疗相关的具有临床相关性但已知的临床发现、临床病理和尸检以及施用MTX的常见不良反应如下:
□在所有的狗中都观察到服药后厌食,随后伴有体重下降和/或体重减轻。在以2μEq/kg给药的狗中,通常在每次服药后的第二天观察到厌食症,这会持续几天,然后在下一次给药时动物会完全或部分恢复。到主要研究结束时,这些狗的体重增加可以忽略不计,经34天时段,雄性动物体重仅增加了约1.2%而对照公犬增加了8.4%,雌性体重增加了2.8%而对照雌性增加了11.1%。该组中的食物消耗比对照犬的食物消耗低约22%(性别合并)。
□在以4μEq/kg给药的动物中,厌食症比以2μEq/kg给药的狗严重。这导致与对照组相比在治疗期间食物消耗减少了约36-38%,并且公犬的总平均体重下降1.3公斤,母犬下降0.9公斤。在为期3周的恢复期中,该组中的狗恢复了体重,这表明了可逆性。
□在某些以2μEq/kg给药的动物和以4μEq/kg给药的所有狗中,偶尔会出现恶心(干呕)、腹泻和呕吐。通常在给药的几天观察到这些。
□到主要研究结束时,红细胞质量(RBC、Hb、Hct)和异吞/巨噬细胞的减少程度较轻。与对照犬相比,分别以2和4μEq/kg给药的狗的减少量约为13%和15%。到恢复期结束时,这两个组中的红细胞质量仍低于研究前的水平。但是,RBC、Hb和Hct水平的降低从未超过正常范围的下限。
□在以4μEq/kg给药的动物中,平均总蛋白和白蛋白水平下降至略低于正常范围的限值。恢复期之后,这些水平处于正常范围内。如所报道的,这些狗的白蛋白水平降低很可能是厌食和体重减轻的结果。
□在以2μEq/kg给药的10只狗中,有2只的ALT活性略微上升至高于正常范围的上限(平均增加11%)。在以4μEq/kg给药的狗中,有4只狗受到了影响,雄性平均增加约1倍而雌性平均增加约52%。在缺乏表明肝细胞损伤的组织病理学结果的情况下,ALT的升高很可能代表了亚致死性损伤,伴有肝细胞通透性的改变和ALT的升高。
□在以2μEq/kg给药的组中,葡萄糖水平下降范围(初始血糖水平减去输液结束后立即的血糖水平)为-2.5±1.3到-0.7±1.3mmol/L之间(5剂均值下降,性别组合)。在以4μEq/kg给药的组中,下降范围为-3.9±1.7到-1.6±0.6mmol/L之间。血糖水平的降低是IGF的预期药理作用。
在以2和4μEq/kg给药的组中,被认为与给药和治疗有关的且具有临床相关性和毒理学意义的临床和病理发现如下所述:应当注意的是,以下不良反应不太常见,但在接受MTX的患有各种疾病的人中是已知的和已报道的不良反应。但是,不能完全排除以下反应并未因IGF的存在而增强。这些反应如下:
□类过敏反应(血管性水肿)主要在输注期间出现,其表现为头部(眼睛、嘴唇、耳朵周围)、喉咙、颈部和前肢皮肤肿胀(浮肿)和发红(红斑)的反应类型。在给药期间发生这些反应的狗的总数(所有组合计)为:5只狗(第一次给药);3只狗(第二次给药);4只狗(第三次给药);14只狗(第四次给药)和6只狗(第五次给药)。应当注意的是,在给药的第四天,发生这些反应的狗的数量和反应的严重性都有所上升,但是,在随后的给药(第五次给药)中,这些反应与第1天、第2天和第3天给药时的反应相当。
□在以2或4μEq/kg IGF-MTX缀合物给药的组之间,类过敏反应似乎没有差异(定性或定量)。
□以2μEq/kg给药的组中的两只狗具有神经系统反应,包括第二次给药时一只公犬的癫痫发作和第三次给药时一只母犬的暂时性意识丧失和姿势紧张。两只动物都接受了后续治疗,没有发生进一步的神经系统事件。
一只狗癫痫发作的一个合理解释是,炎性介质的释放破坏了血脑屏障(BBB)(所述动物对治疗有中度类过敏反应,在癫痫发作开始之前必须用抗组胺药进行治疗),和/或脉络丛中的髓外造血破坏了B组织,如在这只狗的组织学上发现的那样。据报道后者是狗癫痫发作的诱因。还发现了第二只具有轻微神经系统事件的狗,其脉络丛中存在髓外造血。其次,癫痫发作的狗在输液过程中血液中的MTX异常高。在第1天,这只狗的MTX水平比以2μEq/kg给药的任何其它狗高至少2-7倍,并且比以4μEq/kg接受测试物的狗高至少2倍。因此,最有可能解释这种动物癫痫发作的原因可能是BBB破裂和血液中MTX上升。
组织病理学上存在一些具有潜在毒理学意义的发现,如下所示:
□在多只狗中,发生由于皮层和髓样淋巴细胞的消耗而导致的胸腺萎缩,随着治疗剂量的增加,其频率和严重性增加。胸腺萎缩明显可见,在每周0.5-4.0μEq/kg的剂量范围内呈剂量相关性,并在恢复期持续存在。尽管这可能是由于测试物对增殖性胸腺淋巴细胞的直接作用引起的,但最好将胸腺萎缩解释为间接应激反应。据报道,胸腺萎缩是人类对MTX化疗的反应。
□以2μEq/kg给药的组中癫痫发作的动物具有一些在研究中其它动物中未见的发现。这些发现包含:盲肠和直肠浅层粘膜的淋巴细胞浸润增加;一个肾上腺皮质肾小球区域的单侧局灶性变性和矿化;以及气管和主要支气管的呼吸道上皮中伴随混合白细胞浸润的显著增生。
游离MTX的毒代动力学(TK)参数由血浆浓度-时间数据估算得出,所述血浆浓度-时间数据来自于使用低(0.5μEq/kg)、中(2.0μEq/kg)和高(4.0μEq/kg)MTX等效剂量水平的胰岛素样生长因子(IGF)MTX缀合物进行的每周一次的5剂量静脉输注研究。在不同性别的动物之间未观察到MTX血浆水平的一致差异,因此将雄性和雌性的数据进行了合并。在1小时的静脉输注IGF-MTX缀合物期间和输注之后,MTX的血浆水平随时间增加。在第1天,基于6-10只狗的平均血浆浓度,对于所有剂量水平,Tmax为从输注开始2小时。Cmax值介于71.6-511.9ng/mL之间。AUC∞和Cmax值均与剂量成正比。MTX的血浆终末半衰期和平均停留时间分别为4.6-5.5小时和6.1-7.6小时,低表观清除率(基于缀合物中游离MTX的释放)和大表观分布体积分别为0.34-0.46L/hr/kg和2.24-2.81L/kg。给药第29天后MTX的药代动力学与给药第1天后的药代动力学相似。
这些发现表明,由于以下缀合物的代谢,游离MTX以时间依赖性方式释放。因此,所得的MTX的TK既依赖于MTX从缀合物中释放,也依赖于游离MTX随时间推移消除。
向比格犬静脉注射剂量范围为0.5-4.0μEq/kg的IGF-MTX缀合物后,IGF-MTX缀合物的血清水平迅速下降。与第1天相比,在第29天未观察到性别偏差和血清暴露的增加。与第1天相比,在第29天,IGF-MTX缀合物的表观清除率(很小并且范围为0.02-0.05L/kg/hr)下降了25-50%,而表观分布体积(也很小并且范围为0.07-0.20L/kg)未显示出任何趋势。与第1天相比,在第29天,IGF-MTX缀合物的终末半衰期(范围为2.5-4.6小时)略长,而平均停留时间(范围为1.4-5.3小时)未显示出任何趋势。这些发现共同表明,在静脉内施用IGF-MTX缀合物后,其以低清除率从小体积的分布中被消除,这与它的大分子尺寸相一致。连续给药后,IGF-MTX缀合物的消除速度减慢,这导致血浆暴露增加。IGF-MTX缀合物的消除先于最大MTX浓度的产生。
总之,对所有产生的数据(包含临床观察、眼科、心电图、尸检和组织病理学)进行的分析表明,在持续5周每周接受0.5μEq/kg IGF-MTX缀合物静脉内治疗的狗中,并未发现与药物/治疗相关的明显毒性。
在0.5μEq/kg的这个剂量水平下,与治疗最相关的唯一发现是:一个动物的轻度到中度被动性和巩膜注射,两只狗呕吐,另一只狗轻度呼吸困难。在一只狗中还观察到眼睛周围的轻度水肿。在研究结束时,红细胞也有轻度减少(相对于对照组减少约10%)。这些发现被认为不具有临床意义,因为它们的程度低、短暂、可以自行解决,并且是甲氨蝶呤疗法的预期副作用。
因此,在这个实验的条件下,本研究中未观察到的不良反应水平(NOAEL)被认为等于每周给药的0.5μEq/kg(持续5周)。
在以2和4μEq/kg给药的组中,还与MTX施用相关的副作用包含厌食症(伴随体重下降或体重减轻)、偶有腹泻和呕吐。红细胞质量也轻度减少(约13-15%)、白蛋白水平降低并且ALT活性略有增加。这些观察结果似乎是剂量依赖性的,除了RBC减少外,到恢复期结束时所有动物都完全恢复。在这两个组中,在组织病理学上还注意到胸腺萎缩和十二指肠坏死细胞数量增加。
在这项研究中还注意到了两种类型的不良反应,尽管这是不期望的,但由于它们被报道成施用MTX的不良反应,因此并不是完全意外的。在以2μEq/kg给药的组中,两只狗发生了神经系统事件。在第二次给药期间,第一只狗癫痫发作。这只动物的癫痫发作可能是由炎症介质和/或髓外造血所致的血脑屏障破坏和游离MTX上升的结果在第二只狗中,一度产生意识丧失和姿势紧张。在以2和4μEq/kg给药的组中,发生类过敏反应事件。
尽管神经系统和类过敏反应很可能是由MTX引起的,但不能完全排除IGF在这些事件中没有任何作用。必须注意的是,通过适当的疗法(抗组胺药和地西泮)可以轻松控制这两种不良反应。
实例12
对IGF-甲氨蝶呤缀合物治疗表达IGF-1R的晚期肿瘤的I期研究
这项研究的主要目的是通过评估表达IGF-1R的晚期恶性肿瘤的治疗过程中的毒性来确定765IGF-MTX的最大耐受剂量(MTD)。一项纳入标准是受试者的肿瘤(组织、骨髓或血液)必须表达IGF-1R,免疫组织化学(IHC)定义为≥10%的表达IGF-1R的肿瘤细胞。患者患有实体瘤或淋巴瘤。
十九名受试者参加了这一剂量递增研究。在28天周期的第1天、第8天和第15天经1小时静脉输注250ml 5%葡萄糖或医师酌情决定的10%葡萄糖来施用765IGF-MTX。继续治疗直至疾病进展、产生不可接受的毒性或患者拒绝治疗。在第2+/-7天的周期结束时进行影像学研究,然后每2个周期进行一次影像学研究,确认对反应的评估。下表示出了针对所测试的每种剂量水平,所测试的受试者、恶性肿瘤的类型、完成的周期数、受试者是否经历了剂量极限毒性(DLT)以及研究中止的原因(如果适用)。一名3级霍奇金淋巴瘤患者通过CT扫描接受了22剂明显稳定型疾病治疗,但是当淋巴结活检未显示出癌症迹象时,所述治疗被中止。
*在本报告发表时,淋巴结活检无肿瘤。
不良事件
下表示出了在先前的实体瘤I期中被分级为可能与研究药物相关的实体瘤患者经历的不良事件。
在所有受试者中或在单个受试者的所有药物施用中均未见任何不良事件。最常见的不良事件是低血糖症(这是研究药物的预期结果)、感冒和发烧。当这些不良事件发生时,其通常在输注结束后2小时内消失。一名受试者从输注开始并持续一整夜发生2级发烧。一名受试者在输注期间开始并持续一整夜患有3级低血压。恶心和呕吐很常见,但发生在输液过程中,并不像化疗那样延迟数小时。在所有情况下,这些不良事件在输注结束后1小时内消失。腹部疼痛或绞痛很常见,但似乎仅限于结肠癌患者,因此其可能与结合并靶向肿瘤组织的研究药物有关。在第5周期的第1天(对患者的第16次给药)的输注过程中(剂量水平为0.4uEq/kg)观察到受试者发生一次癫痫发作,并在2分钟内消失。这名患者也同时经历了3级低血压事件,并因此住院过夜。
缺乏血细胞减少症。值得注意的是,在任何接受治疗的受试者中都未发现任何血细胞减少的迹象。
实例13
对MDS和AML细胞系的体外细胞毒性以及与阿扎胞苷的协同作用。
IGF-MTX在体外对MDS细胞系具有细胞毒性。
在氚掺入测定法中进行了765IGF-MTX的体外测试。MDS-L细胞系由日本川崎医学院(Kawasaki Medical School)的Kaoru Tohyama博士许可。在第1天,将细胞以每孔15,000个细胞平板接种在96孔板的150ul培养基中。在第2天,以范围为78nEq/L到15微当量/L的浓度添加IGF-MTX。在第6天,每孔加入一微居里的氚化胸腺嘧啶,并在6小时后收获孔并进行计数。结果示于图6中。IC50为359nEq/L。一nEq被定义为1纳摩尔MTX基团。每个765IGF大约有8个MTX基团。
IGF-MTX在体外对髓样癌细胞系具有细胞毒性,并且与氮杂胞苷具有协同作用
在我们的实验室中测试了三种AML细胞系对IGF-MTX的敏感性。这三种细胞系是HL-60、HL-60/S4和Kasumi-1。这三个均对IGF-MTX敏感,IC50为458-668nEq/L(IGF-MTX缀合物中的甲氨蝶呤基团(nM))。这与针对MCF7乳腺癌细胞系和LNCaP前列腺癌细胞系的IC50大致相同,二者均对小鼠异种移植物中的IGF-MTX敏感。
IGF-MTX与阿扎胞苷的作用还至少对Kasumi-1和HL-60细胞系具有加和或协同作用(未在HL-60/S4上测试组合)。在浓度约为IC50的1/3的阿扎胞苷存在的情况下,在Kasumi-1细胞系中,IGF-MTX的IC50从668nEq/L降至398nEq/L,而在HL-60中,从466nEq/L降至409nEq/L。
实例14
具有高水平IGF-1R的MDS细胞系
在RMPM1640/10%胎牛血清/50ng/ml IL-3、50micoMβ-巯基乙醇中生长MDS-L细胞。当MDS-L细胞的密度为每毫升约5×10^5个细胞并以每毫升2000万个细胞重新悬浮在25mM Tris、150mM NaCl、pH 7.5(TBS)中时(蛋白质浓度为0.5mg/ml),收获细胞。
Eagle最低基础培养基(10%FBS、0.1mg/ml人胰岛素)中生长MCF7。在指数期将MCF7收获到蛋白质浓度为1.0mg/ml的TBS中。
在4-20% Tris甘氨酸楔形凝胶上进行非还原性SDS-PAGE。
用4x LDS(65ul样品,20ul LDS缓冲液)稀释样品。
通道
1.标志物8ul预染色的NEB P7710
2,3.空白。
4.15ul MCF7样品(12ug)。
5.3.75ul MCF7样品(3ug)
6.空白。
7.20ul MDS样品(8ug)
将凝胶电转移到25mM Tris、192mM甘氨酸、0.1% SDS、20%甲醇(v/v)转移缓冲液中的0.2微米PVDF过滤器(英杰(Invitrogen)LC2002)上。
将膜在TBST(含0.1% Tween-20的TBS)加5%干奶中在23℃下封闭一小时,然后在0.2microg/ml的BAF391生物酰化小鼠单克隆抗体——抗IGF-1R抗体(RnD systems)中在4℃下探测过夜。第二天,将膜在TBST中洗涤3次,每次12分钟,然后在1/2,000稀释的皮尔斯高灵敏度链霉亲和素-HRP缀合物(热科学目录号:21130)中孵育,用30ml TBST+5%牛奶进行稀释。在室温下将其摇晃60分钟。然后在TBST中短暂漂洗两次,然后在TBST中摇晃12分钟3次。
然后在不摇晃的情况下将其置于ECL Prime蛋白质印迹试剂中5分钟,并置于相机系统中读取10分钟
结果:
蛋白质印迹的结果示于图7中。具有可见条带的左侧两个通道是MCF7,并且分别上样有12ug和3ug总蛋白(通道4和5)。右侧染色通道是MDS-L(通道7),通过蛋白质测定法上样有8ug蛋白质。但是,通过对平行电泳进行考马斯染色(commassie staining),通道4中的MCF7似乎实际上只有通道7中MDS-L的约一半的蛋白质。MDS-L通道7中的IGF-1R染色带运行超过200kDa。MCF7通道中的两个染色带的运行频率约为80到150kDa之间。IGF-1R是预测分子量为205kD的二聚体,其中每个单体含有81kDa和20kDa多肽。因此,MDS-L条带与205kDa二聚体一致,而MCF7条带与81kDa多肽和102kDa单体一致。
MCF7是用于高度表达IGF-1R的标准细胞系,并且MDS-L具有大致相同的IGF-1R含量。因此,MDS-L具有高表达的IGF-1R。
实例15
IGF-MTX抑制实体瘤前列腺和乳腺癌细胞系LNCaP和MCF7的增殖
体外增殖测定
在100μl的RPMI+谷氨酰胺+10%FCS培养基中将LNCaP细胞以每孔5,000个细胞平板接种于96孔板中。24小时后,加入100μl新鲜培养基,其不含指定浓度的药物(对照)、IGF-MTX或MTX。进一步孵育48小时后,根据制造商的说明,使用细胞计数试剂盒Kit-8(东仁分子技术公司(Dojindo Molecular Technologies),熊本,日本)对细胞增殖进行分析。
在含有0.01mg/ml人类重组胰岛素、10%胎牛血清和pen/strep的Eagle最低基础培养基中培养MCF7。为了进行体外增殖测定,将其以每孔8,000个细胞平板接种在96孔板中。1天后,将765IGF-MTX或MTX添加至指定浓度。再过5天后,在50ul新鲜培养基中每孔加入1uCi氚化胸腺嘧啶。六小时后,收获细胞并对放射性进行计数。
体外肿瘤抑制
为了评估对细胞增殖的影响,将IGF-MTX缀合物和游离MTX与LNCaP肿瘤细胞一起进行体外孵育。与未处理的对照细胞相比,两种药剂均抑制LNCaP细胞的增殖。在2000nM的最高测试浓度下,游离的MTX引起的抑制作用明显大于IGF-MTX(P=0.003)。500nM游离MTX对增殖的抑制作用与2000nM IGF-MTX的抑制作用无显著差异。longR3-IGF-MTX的IC50约为1000nEq/L(nM甲氨蝶呤基团)(McTavish,H.等人,《转移研究(Translational Research)》2009;153:275–282)在这种情况下,缀合物的IGF部分为long-R3-IGF。
带有MCF7细胞的765IGF-MTX的增殖测定结果示于图8中。在这种情况下,765IGF-MTX的IC50为715nEq/ml(图8)。在平行测定中,抗MCF7的游离甲氨蝶呤的IC50为17nM(数据未示出)。
实例16
IGF-MTX比游离MTX更有效地抑制小鼠前列腺癌细胞系的体内肿瘤生长,即使将IGF-MTX的剂量降低了6倍
IGF-MTX缀合物的合成、分析和定量
Long-R3-IGF-1购自Novozymes GroPep(诺维信生物医药澳大利亚公司(Novozymes BioPharma AU),塞巴顿,澳大利亚)。MTX购自西格玛公司(圣路易斯,密苏里州,美国)。将Long-R3-IGF-1(20mg)溶于3.0ml,10mM HCl中。将磷酸钠(2.5ml,200mM,pH7.4)和固体尿素(1.625g)添加到溶液中。将溶液用20mM磷酸钠,pH 7.4,5mM NaCl,6.5M尿素(尿素透析缓冲液)在4℃下透析过夜(截止值为3500m.w.)。将使用溶于0.4ml尿素透析缓冲液中的1.4摩尔当量NaOH中和的MTX水合物(14.8mg)添加到透析袋中的long-R3 IGF溶液中。Long-R3-IGF-1和MTX通过与1-乙基-3-[3-二甲基氨基丙基]碳二亚胺盐酸盐(EDC)一起孵育而进行偶联。EDC是一种零长度的交联剂,其可以在MTX的蛋白胺基和羧基之间产生直接的酰胺键。将EDC(60mg)新鲜溶解在尿素透析缓冲液(0.6ml)中,然后添加到透析袋中,将透析袋密封并在室温下在培养皿中保存2小时。反应示意图如图1所示。
2小时后,将袋子置于尿素透析缓冲液中,并在4℃下透析3.5小时。将透析缓冲液更改为2mM HCl,并继续透析过夜。Long-R3-IGF-1具有3个赖氨酸残基和一个氨基端,共有4个可用于缀合的氨基。为了确定饱和程度,通过使用∈372nm=6.47mM-1在pH 11下的光学吸收,测定了缀合的long-R3-IGF-1蛋白中的MTX浓度。缀合的蛋白质在下文中被称为IGF-MTX(对于long-R3-IGF-1-甲氨蝶呤)。
体内肿瘤生长测定
在补充有0.1mg/ml胰岛素和10% FCS的Eagle最低基础培养基中生长MCF7细胞(人乳腺腺癌细胞)。雌激素依赖性MCF7-L细胞系是来自明尼苏达大学Deepali Sachdev的礼物。在补充有0.1mg/ml胰岛素的改良IMEM培养基(英杰,卡尔斯巴德,加利福尼亚,美国)中生长MCF7-L细胞。在补充有谷氨酰胺和10% FCS的RPMI(英杰,卡尔斯巴德,加利福尼亚,美国)中生长LNCaP细胞(转移性人类前列腺癌)。将细胞在37℃下在5% CO2湿润大气中生长。在每种情况下,将细胞生长至大约三分之二的融合度,通过胰蛋白酶消化收获细胞,用富集的培养基洗涤,然后用PBS洗涤两次,并重新悬浮于BD Matrigel基质(美国BD公司(Becton Dickinson),富兰克林湖,新泽西州,美国)中的磷酸盐缓冲液中。将细胞皮内注射到小鼠的背部。在植入MCF7和MCF7-L细胞之前两天,将雌激素沉淀物(0.5mg雌二醇,释放60天,美国创新研究公司(Innovative Research of America),萨拉索塔,佛罗里达州,美国)皮下植入到肩胛骨之间。将MCF7和MCF7-L细胞植入8周大的雌性nu/nu小鼠中。将LNCaP细胞植入8周大的雄性nu/nu小鼠中。在2mM HCl,1%甘油中施用IGF-MTX缀合物。将MTX溶解在PBS中。未处理的媒剂对照接受2mM HCl,1%甘油。通过尾静脉注射以每克小鼠体重12.5:l的体积静脉内施用药物。所有研究均由明尼苏达大学动物护理和使用委员会批准,并符合相关的道德准则。
结果:小鼠中的异种移植肿瘤生长抑制
进行了三项体内研究,以评估long-R3-IGF-1对MTX的靶向作用。在最初的初步研究中,将乳腺癌MCF7细胞皮内植入裸鼠的背部。当15只小鼠的肿瘤变得可触知时(大约5x5mm),将小鼠随机分为三组(每组n=5)。随机分组后,在第0天、第4天和第8天通过静脉内尾静脉注射媒剂(即,40nmol/g的游离MTX或MTX/g的10nmol的IGF-MTX)对小鼠进行治疗。即使在第一次治疗后仅一天,IGF-MTX缀合物治疗组的肿瘤也比其它组的肿瘤小(图9)。在观察的12天中,游离MTX和未处理的对照组中肿瘤继续生长,而用IGF-MTX治疗的肿瘤平均无肿瘤生长迹象。在第12天,IGF-MTX缀合物治疗组和MTX治疗组之间的平均肿瘤体积平均相差约8倍,这一发现具有统计学意义(P=0.048,未配对t检验)。即使缀合物剂量低4倍,使用IGF-MTX缀合物治疗的小鼠的肿瘤体积仍比游离MTX的肿瘤体积低。这些数据表明,即使在使用四分之一剂量的情况下,IGF-MTX缀合物仍比游离MTX更有效地在体内控制MCF7肿瘤的生长。
使用雌激素依赖性MCF7菌株MCF7-L进行了第二项体内研究。植入肿瘤细胞,并监测小鼠的肿瘤生长。肿瘤植入后九天,将15只带有可见肿瘤的小鼠分为平均肿瘤大小相等的三组。然后在第0天和第5天通过尾静脉给小鼠注射媒剂,即游离MTX(40nmol/g)或IGF-MTX缀合物(MTX/g的10nmol)。在第22天,在用IGF-MTX或游离MTX治疗的动物中,肿瘤的生长受到了大约相等的抑制(图10)。然而,IGF-MTX缀合物的剂量比游离MTX的剂量低4倍。IGF-MTX组与未处理的对照组在第22天的肿瘤体积差异显著(P=0.008)。这些数据再次表明,较低剂量的IGF-MTX与较高剂量的游离MTX抑制体内肿瘤生长的效果相当。
在一项最终的体内研究中,在第0天将前列腺癌LNCaP细胞皮内植入小鼠体内,然后将小鼠随机分为不同的治疗组。在第5天(在肿瘤可见之前)用不同浓度的MTX或IGF-MTX缀合物对小鼠进行单尾静脉注射(图11)。与用较高剂量的游离MTX(50、20或8nmol/g)治疗的小鼠相比,用8nmol/g或3.2nmol/g的IGF-MTX缀合物(剂量表示为每个MTX分子的摩尔数)治疗的组的肿瘤大小要小得多。所测试的IGF-MTX缀合物的最低剂量1.28nmol/g不会抑制肿瘤的生长。研究结束时(第98天),接受8nmol/g IGF-MTX的动物与接受50nmol/g游离MTX的动物的肿瘤生长差异显著(P=0.04,两尾t检验)。两种最高IGF-MTX浓度(8nmol/g和3.2nmol/g)和最高游离MTX浓度(50nmol/g)的合并结果之间也存在显著差异(P=0.011)。另外,两种最高IGF-MTX浓度(8nmol/g和3.2nmol/g)和游离MTX浓度(20nmol/g和50nmol/g)的合并结果之间的差异是显著的(P=0.029)。根据这些数据,可以合理地得出结论,即使在剂量低6.25倍的情况下(8nmol/g IGF-MTX与50nmol/g MTX),IGF-MTX缀合物对抗体内肿瘤生长的效果仍比游离MTX更好。
讨论:
在LNCaP模型中,IGF-MTX(LR3IGF-MTX)在抑制肿瘤生长方面比游离MTX至少有效6倍,因为IGF-MTX中摩尔剂量低6倍的甲氨蝶呤基团(8nEq/kg)比摩尔剂量高6倍的游离MTX(50纳摩尔/kg)更有效。同样,在MCF7模型中,即使IGF-MTX的摩尔剂量比游离MTX低4倍,IGF-MTX仍至少与游离MTX一样有效。这与体外结果相反,在带有MCF-7细胞的体外结果中,MTX的IC50约比IGF-MTX低50倍(17nM MTX与715nEq/L IGF-MTX)。这表明IGF-MTX在体内对肿瘤细胞具有巨大的靶向性。
实例17
血细胞和MDS-L的流式细胞术显示健康血细胞几乎没有CD34或IGF-1R而MDS-L细胞具有高水平的CD34和IGF-1R
开发了流式细胞术测定法以测试CD34(一种血液干细胞的标志物)和IGF-1R。使用来自BD生物科技公司(BD Biosciences)的CD221克隆1H7检测IGF-1R(被称为CD221)。
对来自健康供体的溶血全血液进行流式细胞术,并将血液与不同体积的100万/mlMDS-L细胞混合,并进行冷冻。
图12示出了仅全血液的结果,图13示出了100ul全血液与10ul MDS-L细胞混合的结果,并且图14示出了仅75ul MDS-L细胞的结果。表2总结了Q1(CD221+/CD34-)、Q2(CD221+/CD34+)和Q4(CD221-/CD34+)中的细胞百分比。
表2.
在健康献血者的血液中,几乎没有白细胞对CD34或IGF1R(CD221)呈阳性。在MDS-L细胞中,几乎所有细胞对CD34或IGF1R呈阳性,而9.9%的细胞对二者均呈阳性。这表明MDS细胞几乎是血液中唯一对IGF1R或CD34或两者呈阳性的细胞。
实例18
AML-03:对IGF-甲氨蝶呤缀合物治疗骨髓增生异常综合症、CMML和寡原始细胞AML的初步研究。
概要
主要目的:
这项研究的主要目的是确定利用胰岛素样生长因子-1-甲氨蝶呤缀合物765IGF-MTX来治疗晚期的先前治疗过的骨髓增生异常综合症(MDS)、慢性髓单核细胞白血病(CMML)和寡原始细胞急性粒细胞性白血病(寡原始细胞AML或O-AML)的安全性和耐受性,包含确定最大耐受剂量(MTD)。
次要目的:
这项研究的第二个目的是确定通过患有晚期MDS、CMML或O-AML的患者的反应率、无进展生存期和总生存期衡量的765IGF-MTX的临床益处。
患者群体:
●诊断对标准疗法无效或不耐受并且不再可能对这种疗法产生反应的MDS、CMML或O-AML
●患者必须在参加研究之前从先前的抗癌治疗的急性毒性作用(≤1CTCAE v.4.0级)中恢复过来
●年龄为18岁或以上
●ECOG绩效状态为0、1或2(附录III)
研究设计:
这项初步研究将评估IGF-甲氨蝶呤缀合物(765IGF-MTX)在患有晚期的先前治疗过的MDS、CMML和O-AML的患者中的用途。在28天周期的第1天、第8天和第15天,经1.5个小时以静脉输注的方式施用剂量为0.20到2.5微当量/千克的765IGF-MTX。继续治疗直至疾病进展(如2个周期后评估的)、产生不可接受的毒性或患者拒绝治疗。对反应的评估将通过在第2个、第4个和第6个周期(每个周期+/-3天)结束时进行的骨髓研究来证实。
一旦确定了最终的最大耐受剂量水平(MTD),则将在三名患者的MTD下,在第1周期的第1天、第2天和第15天和第16天评估765IGF-MTX的药代动力学(PK)。
研究方案
对患者进行筛查,然后如果患者进入试验,则在28天周期的第1天、第8天和第15天进行治疗。对患者进行治疗直至疾病进展、产生不可接受的毒性或患者选择退出治疗。在第一次给药前的28天内以及在第2个、第4个和第6周期后采集骨髓样品。在第1周期的第1天、第2周期的第1和15天以及下个周期的第15天采集药效学样品。在最大耐受剂量下,在第1周期的第1-2天和第15-16天经2天采集药代动力学样品。
I期剂量水平
*1-9名患者之间的剂量递增队列;在MTD队列中总共有9名患者。根据主要研究者的判断,允许患者在两个周期之间增加剂量。
1.目的
1.1.主要目的
主要目的是确定765IGF-MTX在用于治疗晚期的先前治疗的MDS、CMML或O-AML时的安全性和耐受性,包含确定IGF-MTX的MTD。
1.2.次要目的
2.2.1通过评估患有晚期的先前治疗的O-AML、CMML或MDS的患者的总反应率(ORR;=CR和PR)、无进展生存期(PFS)、进展的累积发生率(CIP)和总生存期(OS)来评估765IGF-MTX的临床获益。
1.3.相关目的
1.3.1.对765IGF-MTX、765IGF、甲氨蝶呤和7-OH甲氨蝶呤的药代动力学(PK)进行表征
1.3.2.评估延长QT的可能性
1.3.3.评估765IGF-MTX对可溶性IGF-1的药效(PD)作用以及IGF-1R水平
1.3.4.评估抗765IGF-MTX抗体的形成
1.3.5.评估中和性抗体的形成
1.3.6.评估患病细胞IGF-1R表达的水平
2.端点
2.1.主要端点
主要端点是765IGF-MTX的安全性和耐受性。这将通过评估如CTCAE v.4.0.定义的不良影响(AE)进行评估。
2.2.次要端点
2.2.1.通过评估ORR、PFS、CIP、OS来评估765IGF-MTX的临床获益。
2.2.2.完全缓解(CR)、CRi、PR,其定义为血液恶性肿瘤的以下应答标准(请参阅附录I表5和6,以及附录II):
2.2.2.1.急性白血病:2015年SWOG指南第11A44章(附录I);欧洲白血病净标准45和2003年IWG标准46
2.2.2.2.MDS:2006年IWG标准47(附录II)
2.3.相关端点
3.3.1 765IGF-MTX、765IGF、甲氨蝶呤和7-OH甲氨蝶呤的药代动力学(PK)参数,其定义为从输注的开始到产生最后可量化血浆浓度的时间之间的AUC、从输注开始到无穷大的AUC、观察到的最大血浆浓度、产生最大血浆浓度的时间、两个游离MTX和IGF-MTX的终末消除常数。
3.3.2评估765IGF-MTX延长QT的可能性
3.3.3药效学参数(PD),此处定义为血浆IGF-1和血浆IGF-1R的浓度以及护理系统性PD变量的标准(细胞计数,差异)
3.3.4血浆765IGF水平和765IGF-MTX毒性/反应
3.3.5血清和血液IGF-1R水平以及765IGF-MTX毒性/反应
3.3.6评估抗765IGF-MTX抗体的形成
3.3.7评估中和性抗体的形成
3.3.8通过IHC和流式细胞术测定的IGF-1R在骨髓病变组织中的表达水平,以及通过流式细胞术测定的其在血细胞中的表达。
3.总体设计和研究计划
这项初步研究将评估765IGF-MTX在患有晚期的先前治疗过的MDS、CMML或O-AML的患者中的安全性和临床获益。在28天周期的第1天、第8天和第15天,经1.5个小时以静脉输注的方式施用765IGF-MTX。继续治疗直至疾病进展、产生不可接受的毒性或患者拒绝治疗。对反应的评估将通过在第2周期结束时进行的骨髓研究来证实,所述骨髓研究随后每8周+/-7天(2个周期)进行一次直至第6周期结束,然后由医生酌情决定。
●剂量查询组件:最多将测试5个剂量水平(请参阅第6页的架构)。将使用经过改良的毒性概率区间设计来确定最大耐受剂量(MTD),剂量极限毒性(DLT)估计为0.33。
我们的修改涉及在初始剂量中使用大小为1的队列,从而允许初始剂量水平快速升级,并在观察到与研究药物相关的任何2级或更高毒性(除了脱发、恶心或腹泻)后,扩展至大小为3的队列。直到1/1(无2级毒性)、3/3、5/6或7/9当前剂量水平的患者在无DLT的情况下完成了第1周期的所有计划治疗(定义为3剂765IGF-MTX)并且能够延迟不超过2周启动第2周期时,另外的患者队列才入组。根据主要研究者的判断,还允许在两个剂量周期之间递增患者体内的剂量,但必须在以一个剂量水平施用2个周期后,并且患者体内剂量升高的患者不能是唯一接受高剂量治疗的患者。
根据发现的经过改良的毒性概率区间设计并在咨询研究统计学家后,将递增剂量。如果研究完成时没有一个可接受的剂量水平,则将无法确定最佳剂量水平,因此该药物不值得进一步研究。
●具有药代动力学(PK)和药效学(PD)的最大耐受剂量(MTD)队列:MTD将被定义为与少于或等于33%的患者的DLT相关的最高剂量。确定MTD后,将继续招募直至在MTD下总共招募了9名患者。对于这一组,在第1周期的第1天和第15天,将在给药前和给药后至多48小时内对3名患者进行药代动力学。在注入756IGF-MTX之前,将在第1周期的第1天、第2周期的第1天和第15天评估药效学样品,并且还将在每个治疗周期的第四周内抽取一份样品。
如果研究完成时没有一个可接受的剂量水平,则将无法确定最佳剂量水平,因此该药物不值得进一步研究。
患者的剂量极限毒性(DLT)被定义为在周期1期间发生的以下事件之一:
●在治疗的第一个周期(28天)中,超过7天出现4级或以上与治疗相关的血液学毒性
●在治疗的第一个周期(28天)中,出现3级或以上与治疗相关的临床非血液学毒性(不包括3级以上的恶心、呕吐或腹泻,在没有最大的医疗干预和/或预防的情况下)
●在治疗的第一个周期(28天)中,出现发热性中性粒细胞减少
●在治疗的第一个周期(28天)中,血小板少于10×109/L,且具有明显的临床出血
直到1/1(无2级毒性)、3/3、5/6或7/9当前剂量水平的患者在无DLT的情况下完成了第1周期的所有计划治疗(定义为3剂765IGF-MTX)并且能够延迟不超过2周启动第2周期时,另外的患者队列才入组。
MTD将被定义为接受治疗的患者中少于33%的患者经历DLT的剂量水平。
为了确保安全性,至少9名患者将在MTD下接受治疗,并且总共将对至少3名患者进行基于765IGF-MTX的药代动力学。
在第1个周期的第1天(24小时)和第15天(24小时),将在给药前和给药后至多24小时内进行药代动力学。将通过在第1个周期的第1天预给药、在第2个周期的第1天和第15天预给药以及在所有后续周期的第15天预给药来评估药效学样品。
4.患者选择
不论性别或种族背景,年龄为18岁或以上的成年人均可参加研究。尽管将尽一切努力寻找并包含妇女和少数民族,但预计患者人数与在梅奥诊所(Mayo Clinic)进行的其它研究没有什么不同。
4.1.入选标准
5.1.1诊断对标准疗法无效或不耐受并且不再可能对这种疗法(至少一种疗法)产生反应的O-AML;或
诊断对标准疗法无效或不耐受并且不再可能对这种疗法(至少一种疗法)产生反应的MDS/CMML
5.1.2在开始第1周期之前,在试验进入的14天内对骨髓活检和抽吸术进行了组织学确诊。
5.1.3血小板>10×109/L
5.1.4年龄≥18岁
5.1.5ECOG绩效状态为0、1或2(附录III)。
5.1.6允许预先进行全身化疗、免疫疗法或生物疗法、放射疗法和/或手术;允许在进入研究前大于1个月的时间内预先使用系统性甲氨蝶呤。根据研究者的判断,在治疗之前和治疗期间允许鞘内注射甲氨蝶呤。
自先前治疗和首次服用研究药物以来的时间:
●自先前放疗、无细胞毒性小分子药物、先前大手术(被定义为可能危及患者生命的手术;具体地说:对颅骨,胸部,腹部或骨盆腔内的器官进行的手术)、先前经FDA批准的系统性疗法以来已有2周
5.1.7患者必须在参加研究之前从先前的抗癌治疗的急性毒性作用(≤1CTCAEv.4.0级)中恢复过来;唯一的例外是允许2级神经病
5.1.8在注册研究后的14天内有足够的器官功能,如下定义:
5.1.9女性阴性尿液或血清妊娠试验。有生育能力的男性和女性患者必须在最后一次服用765IGF-MTX期间以及之后3个月内使用适当的批准的避孕方法(例如,禁欲、口服避孕药、可植入激素避孕药或双重屏障方法)。
5.1.10在进行任何与研究无关的程序之前获得自愿的书面知情同意书是正常医疗服务的一部分,但应了解患者可以随时撤回同意书,而不会影响将来的医疗服务。
6研究参数
6.1护理程序标准
a超过周期1的后续周期必须满足7.3节中的标准,并且可以提前1天或至多延迟2天开始,以适应调度问题。
1对于因反应而退出治疗的患者,每6-12周重复进行适当的疾病评估,直至进展或开始新的治疗。
2仅对于周期1,如果在第1周期的3天内完成测试和步骤,则无需重复进行。
3骨髓活检应在第2周期结束时进行,此后每2周期至进行一次,直到第6周期结束。根据MD的判断,获得应答(CR)的患者可重复进行骨髓活检。
4根据临床需要,将每周或更频繁地进行CBC和完整代谢检查(CMP)。
5在研究注册的1周内。如果尿液分析异常,则24小时尿液中的蛋白质必须在24小时内显示≤1gm的蛋白质,才能参与研究
6仅在第1周期和最终给药后30天的研究结束时进行ECG。
6.2研究相关程序
1仅在MTD中的PK患者中完成。765IGF-MTX输注之前(如果am实验室在765IGF-MTX输注的一小时内,则在am实验室时)、输注结束前5分钟(+/-5分钟),以及完成输注后的以下时间点:30分钟(+/-5分钟)、60分钟(+/-15分钟)、2小时(+/-15分钟)、4小时(+/-15分钟)、6小时(+/-15)分钟)、10小时(+/-15分钟和24小时(+/-2小时))。将在第1天而不是第15天收集10小时时间点。
2仅在MTD中的PK患者中完成。765IGF-MTX输注之前(+/-5分钟)以及开始输注后30分钟(+/-5分钟)、完成输注后的以下时间点:60分钟(+/-15分钟)和3小时(+/-15分钟)。在所有患者中,在第1周期的第1天(输注前)和最终给药后30天(±1周)在基线处完成ECG(参见8.1节)。
3在输液前抽血
4将每8周(±1周)在基线处收集骨髓活检和抽吸物,直至第24周(即,在周期2、4和6之后,在下一个周期的第一次给药之前)。如果在第1周期第1天之前的第28天基线期中没有从患者那里获得冷冻或新鲜收集的骨髓抽吸物以进行流式细胞术,则该患者仍可参加,并且基线样品不需要新的骨髓抽吸物。
5在EDTA管中收集全血。
7相关研究
可以在附录VII中找到有关用于相关研究的血样采集信息(要使用的采集管、抽取的血液量、采集处理、等分程序和存储以及要使用的特定测定法)。
7.1药代动力学
7.1.1药代动力学样品采集
在第1个周期的第1天和第15天施用剂量后,将检查765IGF-MTX的药代动力学。在这几天,如7.1.1节所述,将在早晨输注765IGF-甲氨蝶呤。研究小组将记录注入的开始和停止时间以及注入的765IGF-MTX溶液的量。如果患者在765IGF-MTX输注之前、输注结束前5分钟以及完成输注后的以下时间点有中心静脉导管,则将从对侧手臂上插入的蝶形针或周围部位采集全血(6mL):30分钟、60分钟、2小时、4小时、6小时、10小时和24小时(上述窗口[研究相关程序表,脚注1)。将在第1天而不是第15天收集10小时时间点。将执行不受IGF毒代动力学分析限制的IGF-MTX和MTX。这些时间点基于狗的药代动力学。有关PK样品采集程序,请参阅附录VII。
7.1.2药代动力学样品处理
血液样品(6mL)将被收集到6-mL EDTA(紫色顶部)试管中。应将试管轻轻倒转几次,以与抗凝剂完全混合。应将样品采集的准确时间记录在试管标签和提供的药代动力学数据表上。应将试管保持在湿冰上,直至进行离心。在采血的120分钟内,将每个血液样品以3,000×g下在4℃下离心5-10分钟。将约0.5mL的等分试样吸取到4个单独的塑料离心管中并在-80℃下冷冻,直至进行分析。有关PK样品采集程序,请参阅附录VII。
将在伊利诺伊州芝加哥大学毒理学研究实验室中在GLP条件下使用经过验证的测定方法测定765IGF-MTX、765IGF、甲氨蝶呤和7-OH-甲氨蝶呤的血浆浓度。
7.1.3药代动力学参数确定
将通过隔室和非隔室方法分析765IGF-甲氨蝶呤、765IGF、甲氨蝶呤和7-OH甲氨蝶呤的药代动力学。使用WinNonlin 6.3(Pharsight公司,圣路易斯,密苏里州)对每种目标化合物的血浆浓度-时间数据进行非隔室分析。待估计的药代动力学参数包含:1)从输注开始到最后可量化血浆浓度的时间(AUC0-t)内药物血浆浓度-时间曲线下的面积;2)从输注开始到无穷大的AUC(AUC0-∞);3)观察到的最大血浆浓度(Cmax);4)最大血浆浓度出现的时间(Tmax)和5)终末消除常数(λz)。
使用NONMEM(版本7.3)中实现的非线性混合效应模型,可以将目标化合物的血浆浓度与时间的数据分别并同时拟合到适当的模型中。将采用个别和总体方法进行数据建模。将评估含有母体和代谢物处置方式的一室、两室和三室模型。将采用一阶条件估计、蒙特卡洛期望最大化(Monte Carlo expectation maximization)和蒙特卡洛贝叶斯(MonteCarlo Bayesian)方法估计最大似然。
如果在某些或所有患者中检测到抗765IGF抗体,则将研究这些抗体的存在对药代动力学参数的影响。例如,当不存在抗药物抗体时,通过比较第一次剂量中的药代动力学参数(已经证明已产生抗765IGF抗体后的后续剂量参数)并通过比较具有抗765IGF抗体的患者和没有抗765IGF抗体的患者的参数来完成此操作。
7.1.4药代动力学统计分析
将通过描述性统计数据(几何平均值、中位数、标准偏差和变异系数)表示765IGF-MTX、765IGF、甲氨蝶呤和7-OH甲氨蝶呤的参数。每种化合物的研究的主要药代动力学参数将为AUC0-t、AUC0-∞、Cmax和λz。将对人口数据进行描述性统计。图和相关性将用于检查值的分布和二元关系。
7.2药效学评估
将在第1个周期的第1天、第2个周期的第1天和第15天以及每个后续周期的第15天评估药效学样品。
全身反应被定义为IGF-1的血浆浓度以及IGF-1R的血液和血清浓度,将对所有受试者进行测量,并将其用于评估765IGF-MTX是否已经影响了这些生物标志物的产生。毒性的量度(例如,WBC计数变化、细胞数量差异,血小板等)也被认为是全身PD变量。
通过使用最大似然估计,将药效学数据拟合到合适的模型中。为了确定药物的全身活性与生物标志物之间是否存在任何关系,将针对各个基线校正的最大生物标志物浓度与各个765IGF-MTX药代动力学值对比作图,并计算皮尔逊相关系数(Pearson’scorrelation coefficients)。
7.3评估765IGF-MTX延长QT的可能性
在765IGF-MTX输注之前、开始输注后30分钟以及完成输注后的以下时间点仅在ECG收集PK时间内对PK受试者进行QT评估:60分钟和3小时。在所有受试者中,将在第1周期的第1天(输注前)和765IGF-MTX最终给药后30天(±1周)在基线处(入组14天之内)通过ECG进行QT评估。
7.4血浆IGF水平和765IGF-MTX毒性/反应
将采集每个患者在第1个周期的第1天输注之前以及在第2个周期的第1天和第15天输注之前的血液样品,以确定在治疗前和治疗期间血浆可溶性IGF-1水平是否与765IGF-MTX毒性和/或反应相关。将用Quest Diagnostics(LC/MS,测试代码为16293)执行血浆中IGF-1的定量。将在临床反应和标志物水平之间进行描述性分析。有关生物标志物采集程序,请参阅附录VII。
7.5血清和血液IGF-1R水平以及765IGF-MTX毒性/反应
将采集每个患者在第1个周期的第1天输注之前以及在第2个周期的第1天和第15天输注之前的血清和血液样品,以确定在治疗前和治疗中血清和血液IGF-1R水平是否与765IGF-MTX毒性和/或反应相关。将通过IGF肿瘤学使用蛋白质印迹进行血浆中IGF-1R的定量。将在临床反应和标志物水平之间进行描述性分析。有关生物标志物采集程序,请参阅附录VII。
7.6抗765IG-MTX抗体的形成。
将采集每个患者在第1周期的第1天输注之前以及在第2周期的第1天和第15天输注之前的血清样品,并通过赞助商用于检测临床前测试犬和测试大鼠中的抗765IG-MTX抗体的测定方法对血清样品进行抗药物抗体分析。所述测定法是一种夹心ELISA,其涉及将血清平板接种在96孔板中,将药物添加到板孔中以结合血清中可能存在的任何抗药物抗体,然后用抗IGF-HRP缀合抗体(来自R&D Systems,Quantikine人IGF-1ELISA试剂盒)检测结合的765IGF-MTX药物。
所述夹心测定法检测抗765IGF-MTX抗体。将执行将765IGF蛋白(而不是765IGF-MTX)添加到平板中的相同测定。这将检测抗765IGF蛋白抗体。
还将分析血清样品中是否存在中和抗体。在这项测定中,将在体外测定中将血清与765IGF-MTX混合以杀死人MCF7乳腺癌细胞,以确定患者血清的添加是否会影响765IGF-MTX抑制MCF7细胞生长的最小抑制浓度。将在第2周期的第1天和第15天以及第4和6周期的第15天对治疗前收集的同一血清样品进行这项测定。有关生物标志物采集程序,请参阅附录VII。
风险评估。检测抗765IGF抗体对患者的风险极小,并且仅在第1周期的第1天和第2周期的第1天和第15天输液之前由额外抽血引起。将抽取少量血液(7.5mL/抽),这对患者健康没有影响。患者可能会产生抗765IGF抗体的风险也很小,并且由于我们了解患者是否正在产生这些抗体,这种风险将降低。首先,在临床前测试中,狗和大鼠均未产生抗药物抗体,因此患者似乎不太可能产生抗765IGF抗体。如果产生抗体,则患者产生抗体的风险将是预期抗体可能会降低药物的效力,并会增加施用药物后的过敏反应的风险。某些生物药物(如利妥昔单抗)中发生会过敏反应,通常可以通过抗组胺药(如苯海拉明)来进行控制。抗765IGF抗体的形成也可能潜在地引起抗IGFR1受体抗体的类似副作用,如发生高血糖症的可能性。在这项研究中将常规监测血糖水平。
7.7中和抗体和765IGF-MTX毒性/反应
将分析第1周期的第1天输注之前、第2周期的第1天和第15天输注之前以及第4和第6周期的第15天输注之前的血清样品是否存在中和抗体。在这项测定中,将在体外测定中将血清与765IGF-MTX混合以杀死人MCF7乳腺癌细胞,以确定患者血清的添加是否会影响765IGF-MTX抑制MCF7细胞生长的最小抑制浓度。有关生物标志物采集程序,请参阅附录VII。
将进行描述性分析,将中和抗体的存在或水平与对765IGF-MTX的临床反应和毒性进行关联。
7.8通过IHC和流式细胞术检测骨髓抽吸物患病细胞中的IGF-1R表达水平
当从患者那里收集骨髓抽吸物时,一部分将被凝结、固定和用石蜡包埋;将第二部分在室温下保存,并在同一天过夜运送。将准备固定样品的病理报告。所有样品将保存在梅奥诊所并在研究结束时一起运送,向Quest Diagnostics进行病理报告,以通过IHC测试IGF-1R表达水平,测试代码为19429X。
新鲜的活的骨髓抽吸物将在同一天过夜运送到查尔斯河加拿大公司,以通过流式细胞术测试IGF-1R和CD34的表达。这一测定方法将与He等人28的方法类似。
7.9通过流式细胞术检测全血患病细胞中的IGF-1R表达水平
全血将被收集到EDTA管(6ml)中,并于隔天在室温下于隔热容器中过夜运送到查尔斯河加拿大公司,以通过流式细胞术测试IGF-1R和CD34的表达。这一测定方法将与He等人28的方法类似。将在基线处以及治疗开始后每8周进行一次所述收集和检测。
结果:
迄今为止,已有2名受试者被诊断为患有O-AML。受试者101之前患有的MDS已转换为O-AML。
表3示出了两个治疗周期(6剂)后两个受试者在治疗前基线处和第8周时的骨髓抽吸原始细胞计数和全血计数的差异。两人均以剂量水平1(0.2微当量/kg)进行给药。两人均为80岁以上的男性(80岁和83岁)。
表3.招募的前两个受试者的骨髓和血液学结果。
骨髓原始细胞百分比是用于评估MDS以及相关疾病O-AML和CMML的关键参数。其在受试者101中得到了实质性改善,并在受试者102中稳定。下一个关键指标是白细胞,其在两个受试者中而言都得到了实质性改善。下一个重要参数是中性粒细胞和血小板。两名受试者的中性粒细胞均得到显著改善,受试者101的血小板得到改善,而受试者102的血小板恶化。除了受试者102的血小板外,这两个受试者中测得的每个血液参数均得到改善或稳定。
两名受试者在8周后的临床评估均为稳定疾病。临床试验的首席研究员表示,持续8周稳定的疾病(几乎所有参数均得到改善)是疗效的证据,因为这两个受试者在开始治疗时仅有3个月的预期寿命。
序列
SEQ ID NO:1MVKGKHHHHHHNGKGKSK
SEQ ID NO:2(765IGF)
MVKGKHHHHH HNGKGKSKGP RTLCGAELVD ALQFVCGDRG FYFNKPTGYG SSSRRAPQTGIVDECCFRSC DLRRLEMYCA PLKPAKSA
SEQ ID NO:3(人IGF-1)
GPETLCGAEL VDALQFVCGD RGFYFNKPTG YGSSSRRAPQ TGIVDECCFR SCDLRRLEMYCAPLKPAKSA
SEQ ID NO:4(IGF132)
FVNQHLCGSHLVEALYL VCGDRG FYFNKPTGYG SSSRRAPQTG IVDECCFRSCDLRRLEMYCAPLKPAKSA
SEQ ID NO:5(long-R3-IGF)
MFPAMPLSSLFVN GPRTL CGALVDALQ FVCGDRGFYF NKPTGYGSSS RRAPQTGIVDECCFRSCDLR RLEMYCAPLK PAKSEA
SEQ ID NO:6(R3-IGF)
GPRTLCGAELVD ALQFVCGDRG FYFNKPTGYG SSSRRAPQTG IVDECCFRSC DLRRLEMYCAPLKPAKSA
SEQ ID NO:7des(1-3)IGF1
TLCGAELVD ALQFVCGDRG FYFNKPTGYG SSSRRAPQTG IVDECCFRSC DLRRLEMYCAPLKPAKSA
SEQ ID NO:8,403IGF
MTSGHHHHHHSAGVNG FVNQHLCGSHL VEALYLVCGD RGFYFNKPTG YGSSSRRAPQTGIVDECCFR SCDLRRLEMY CAPLKPAKSA
SEQ ID NO:9,784IGF
MVKQIESKTAFQEALDAAGDKLVVVDFSATWCGHCKMIKPFFHSLSEKYSNVIFLE
VDVDDSQDVASESEVKSMPTFQFFKKGQKVGEFSGANKEKLEATINELVGSKSGHHHHHH
SAKGGPRTLCGAELVDALQFVCGDRGFYFNKPTGYGSSSRRAPQTGIVDECCFRSCDLRR
LEMYCAPLKPAKSA
SEQ ID NO:10,785IGF
MVKQIESKTAFQEALDAAGDKLVVVDFSATWCGHCKMIKPFFHSLSEKYSNVIFLE
VDVDDSQDVASESEVKSMPTFQFFKKGQKVGEFSGANKEKLEATINELVGSKSGHHHHHH
SAKGFVNQHLCGSHLVEALYLVCGDRGFYFNKPTGYGSSSRRAPQTGIVDECCFRSCDLR
RLEMYCAPLKPAKSA
SEQ ID NO:11,764IGF
MVKGKHHHHHHNGKGKSKFVNQHLCGSHLVEALYLVCGDRGFYFNKPTGYGSSSRR
APQTGIVDECCFRSCDLRRLEMYCAPLKPAKSA
所引用的所有专利、专利文件和其它文献参考均通过引用并入。
Claims (10)
1.一种治疗患有骨髓增生异常综合症(MDS)、寡原始细胞急性髓性白血病(O-AML)或慢性髓单核细胞白血病(CMML)的患者的方法,所述方法包括:
向被认为需要治疗MSDS、O-AML或CMML的患者施用药剂,所述药剂包括:
与抗癌化疗药物缀合的胰岛素样生长因子1型受体(IGF-1R)配体。
2.根据权利要求1所述的方法,其中所述患者被认为需要治疗MDS。
3.根据权利要求1所述的方法,其中所述IGF-1R配体与所述抗癌化疗药物共价连接。
4.根据权利要求1到3中任一项所述的方法,其中所述IGF-1R配体为胰岛素样生长因子1(IGF-1)或其变体或胰岛素。
5.根据权利要求4所述的方法,其中所述IGF-1R配体是IGF-1的变体,与IGF-1相比,所述变体对IGF-1结合蛋白的结合亲和力降低。
6.根据权利要求5所述的方法,其中所述IGF-1R配体不是IGF-1(SEQ ID NO:3),而是或包括765IGF(SEQ ID NO:2)、IGF132(SEQ ID NO:4)、long-R3-IGF(SEQ ID NO:5)、R3-IGF(SEQ ID NO:6)或des(1-3)-IGF(SEQ ID NO:7)或与IGF-1(SEQ ID NO:3)至少90%相同的变体。
7.根据权利要求1所述的方法,其中所述IGF-1R配体是抗IGF-1R抗体。
8.根据权利要求4或1或6所述的方法,其中所述抗癌化疗药物选自由以下组成的组:甲氨蝶呤(methotrexate)、苯达莫司汀(bendamustine)和苯丁酸氮芥(chlorambucil)。
9.根据权利要求8所述的方法,其中所述抗癌化疗药物是甲氨蝶呤。
10.根据权利要求4或6所述的方法,其中所述抗癌化疗药物是甲氨蝶呤,其中所述药剂以0.1到2.5(或0.2到2.5、或0.4到2.5、或0.4到1.6)微当量/kg患者体重的剂量溶解于体积为100ml到1升的5%到10%葡萄糖中进行施用。
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