WO2022242527A1 - 一种单克隆抗体-细胞因子融合蛋白制剂 - Google Patents

一种单克隆抗体-细胞因子融合蛋白制剂 Download PDF

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cytokine fusion
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Definitions

  • the monoclonal antibody-cytokine fusion protein Due to the complex spatial structure of the monoclonal antibody-cytokine fusion protein, it is susceptible to various factors during production and storage (such as temperature, shear force, shaking, freezing and thawing, ultraviolet exposure, pH changes, organic solvents, microbial contamination, etc.) ), leading to changes in the chemical and physical properties of protein drugs.
  • Chemical changes include oxidation, deamidation, isomerization, degradation, and covalent polymerization of protein molecules;
  • physical changes include protein spatial conformation changes such as unfolding, non-covalent aggregation of monomer molecules, and these changes are susceptible to protein amino acid sequences and Effect of environmental conditions (salt, pH and temperature) in which the protein is contained.
  • the polysorbate is selected from the group consisting of polysorbate 20 (PS-20, Tween-20), polysorbate 40 (PS-40, Tween-40), polysorbate Ester 60 (PS-60, Tween-60), polysorbate 80 (PS-80, Tween-80), or a combination thereof.
  • the medium of the buffer solution is water.
  • a freeze-dried preparation is provided, and the freeze-dried preparation is prepared by the following method:
  • the fourth aspect of the present invention provides a use of the composition as described in the first aspect of the present invention or the freeze-dried preparation as described in the third aspect of the present invention for the preparation of medicines for preventing and/or Treat tumors.
  • the subject includes a human or a non-human mammal.
  • the monoclonal antibody-cytokine fusion protein of the present invention is a fusion protein formed by linkage (peptide bond linkage) between monoclonal antibody and cytokine.
  • composition of the present invention is preferably a pharmaceutical composition.
  • the surfactants include (but not limited to): cationic surfactants, anionic surfactants, nonionic surfactants, or combinations thereof.
  • the surfactant includes (but not limited to): polyoxyethylene sorbitan fatty acid ester, polyoxyethylene hydrogenated castor oil, glycerin fatty acid ester, polysorbate, poloxamer, or combination.
  • the buffer includes citric acid-disodium hydrogen phosphate buffer.
  • the concentration of the citric acid-disodium hydrogen phosphate buffer is 3-80mM, preferably 5-60mM, more preferably 10-50mM, more preferably 20-40mM, more preferably 25-35mM, more preferably 28-32mM, most preferably 30mM.
  • the sugar alcohols include (but not limited to): sucrose, mannitol, trehalose, maltose, sorbitol, or combinations thereof.
  • the sugar alcohols include (but not limited to): sucrose, mannitol, trehalose, sorbitol, or combinations thereof.
  • the inorganic salts include (but not limited to): sodium chloride, potassium chloride, calcium chloride, magnesium chloride, or combinations thereof.
  • the present invention also provides a kind of lyophilized preparation, and described lyophilized preparation is prepared by the following method:
  • the indicated tumors include solid tumors with positive expression of HER2.
  • citrate buffer and histidine buffer in the following examples are as follows:
  • Citric acid buffer citric acid-disodium hydrogen phosphate buffer, the medium is water, and the solute is citric acid and disodium hydrogen phosphate.
  • the monoclonal antibody-cytokine fusion protein in the following examples is formed by connecting the C-terminal of the heavy chain amino acid sequence of the monoclonal antibody with the N-terminal of the cytokine amino acid sequence through peptide bonds, wherein the heavy chain amino acid sequence of the monoclonal antibody As shown in SEQ ID NO.: 1, the light chain amino acid sequence of the monoclonal antibody is shown in SEQ ID NO.: 2, and the amino acid sequence of the cytokine is shown in SEQ ID NO.: 3;
  • the buffer solution The concentration has a significant impact on the stability of the sample.
  • the sample protein purity is when the histidine concentration is 30mM lower than 5mM, and the sample protein purity is when the citric acid concentration is 30mM higher than 5mM. According to the overall stability of the pH6.0-6.5 buffer solution, the citric acid buffer solution is preferred for investigation.
  • the insoluble particles in the sample were measured by the photoresist method, and the results are shown in Table 6.
  • the results showed that the number of insoluble particles was significantly reduced after adding Tween 20 to the sample solution. According to the results, adding 0.03% Tween 20 to the sample can control the amount of insoluble particles in the sample solution.
  • Table 7 contains sugar, salt and amino acid adjuvant preparation purity test result
  • the osmotic pressure of the preparation is adjusted to the osmotic pressure under the condition of the stock solution preparation.
  • auxiliary materials in Example 4 considering the source of the auxiliary material, choose to add 5 to the stock liquid preparation. %sucrose.
  • the preliminarily proposed monoclonal antibody-cytokine fusion protein stock solution formulation is monoclonal antibody-cytokine fusion protein concentration 5mg/ml, 30mM citrate buffer, 0.03wt% polysorbate 20, 5wt% sucrose, pH 6.5.

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Abstract

一种单克隆抗体-细胞因子融合蛋白制剂。具体是一种单克隆抗体-细胞因子融合蛋白组合物，所述的组合物包括单克隆抗体-细胞因子融合蛋白、表面活性剂、缓冲液和稳定剂。所述的组合物能够提高单克隆抗体-细胞因子融合蛋白的稳定性。

Description

一种单克隆抗体-细胞因子融合蛋白制剂 技术领域
本发明涉及药物制剂领域，具体地涉及一种单克隆抗体-细胞因子融合蛋白制剂。
背景技术
由于单克隆抗体-细胞因子融合蛋白具有复杂的空间结构，在生产、储存过程中容易受到各种因素(如温度、剪切力、振荡、冻融、紫外暴露、pH变化、有机溶剂、微生物污染)的影响，导致蛋白质药物的化学和物理性质的变化。化学变化包括蛋白分子的氧化、脱酰胺、异构化、降解、共价聚合；物理变化包括蛋白质空间构象变化如解折叠，单体分子的非共价聚集，这些变化易受到蛋白质的氨基酸序列以及含有该蛋白质的所处环境条件(盐、pH和温度)的影响。
蛋白质作为生物药物，从生产、流通及病人使用系列环节，需要较长时间的储存有效期。在储存期间，需保持蛋白的稳定性，避免理化性质的变化，从而影响蛋白的安全性及有效性。
因此，本领域需要开发一种具有稳定性高的单克隆抗体-细胞因子融合蛋白制剂，提高单克隆抗体-细胞因子融合蛋白的稳定性。
发明内容
本发明的目的是提供一种具有稳定性高的单克隆抗体-细胞因子融合蛋白组合物。
本发明第一方面，提供一种单克隆抗体-细胞因子融合蛋白组合物，所述的组合物包括抗单克隆抗体-细胞因子融合蛋白、表面活性剂、缓冲液和稳定剂。
在另一优选例中，所述的组合物为药物组合物。
在另一优选例中，所述的单克隆抗体-细胞因子融合蛋白包括人源单克隆抗体-细胞因子融合蛋白。
在另一优选例中，所述的单克隆抗体-细胞因子融合蛋白中的单克隆抗体的重链氨基酸序列的C端与细胞因子的氨基酸序列的N端连接。
在另一优选例中，所述的连接为肽键连接。
在另一优选例中，在所述的单克隆抗体-细胞因子融合蛋白中，单克隆抗体的具有如SEQ ID NO.：1的重链氨基酸序列和SEQ ID NO.：2轻链氨基酸序列。
在另一优选例中，在所述的单克隆抗体-细胞因子融合蛋白中，细胞因子具有如SEQ ID NO.：3的氨基酸序列。
在另一优选例中，所述单克隆抗体-细胞因子融合蛋白的含量为0.5-50mg/mL，较佳地0.5-40mg/mL，更佳地0.5-30mg/mL，更佳地0.5-20mg/mL，更佳地1-15mg/mL，更佳地2-10mg/mL，更佳地3-8mg/mL，最佳地5mg/mL。
在另一优选例中，所述的表面活性剂选自下组：正离子型表面活性剂、负离子型表面活性剂、非离子型表面活性剂，或其组合。
在另一优选例中，所述的表面活性剂选自下组：聚氧乙烯山梨醇酐脂肪酸酯、聚氧乙烯氢化蓖麻油、甘油脂肪酸酯、聚山梨酯、泊洛沙姆，或其组合。
在另一优选例中，所述的聚山梨酯选自下组：聚山梨酯20(PS–20，吐温-20)、聚山梨酯40(PS-40，吐温-40)、聚山梨酯60(PS–60，吐温-60)、聚山梨酯80(PS-80，吐温-80)，或其组合。
在另一优选例中，所述的表面活性剂包括聚山梨酯20(PS-20，吐温-20)。
在另一优选例中，所述表面活性剂的含量为0.001-8wt％，较佳地0.001-3wt％，更佳地0.001-1wt％，更佳地0.005-0.5wt％，更佳地0.005-0.1wt％，更佳地0.008-0.1wt％，更佳地0.01-0.08wt％，更佳地0.01-0.05wt％，更佳地0.02-0.04wt％，最佳地0.03wt％，以组合物的总重量计。
在另一优选例中，所述的缓冲液选自下组：柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液、柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液、磷酸盐-磷酸缓冲液、组氨酸缓冲液，或其组合。
在另一优选例中，所述的缓冲液的介质为水。
在另一优选例中，所述缓冲液的浓度为3-80mM，较佳地5-60mM，更佳地10-50mM，更佳地20-40mM，更佳地25-35mM，更佳地28-32mM，最佳地30mM。
在另一优选例中，所述的缓冲液包括柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液。
在另一优选例中，所述柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液的浓度为3-80mM，较佳地5-60mM，更佳地10-50mM，更佳地20-40mM，更佳地25-35mM，更佳地28-32mM，最佳地30mM。
在另一优选例中，所述稳定剂为渗透压调节剂。
在另一优选例中，所述的稳定剂选自下组：氨基酸、糖醇、无机盐，或其组 合。
在另一优选例中，所述的氨基酸选自下组：脯氨酸、精氨酸(Arginine)、甘氨酸(Glycine)、组氨酸(Histidine)、甲硫氨酸(Methionine)，或其组合。
在另一优选例中，所述的糖醇选自下组：蔗糖(Sucrose)、甘露醇(Mannitol)、海藻糖(Trehalose)、麦芽糖(Maltose)、山梨醇(Sorbitol)，或其组合。
在另一优选例中，所述的糖醇选自下组：蔗糖、甘露醇、海藻糖、山梨醇，或其组合。
在另一优选例中，所述的无机盐选自下组：氯化钠、氯化钾、氯化钙、氯化镁，或其组合。
在另一优选例中，所述的稳定剂包括蔗糖。
在另一优选例中，所述的稳定剂的含量为0.5-50wt％，较佳地0.5-40wt％，更佳地0.8-30wt％，更佳地1-20wt％，更佳地1-15wt％，更佳地1-10wt％，更佳地1-8wt％，更佳地2-7wt％，最佳地5wt％，以组合物的总重量计。
在另一优选例中，所述的组合物的pH为5-8，较佳地5.0-7.5，更佳地5.0-7.0，更佳地6.0-7.0，更佳地6.0-6.8，更佳地6.2-6.8，更佳地6.3-6.7，最佳地6.5。
在另一优选例中，所述的组合物还包括螯合剂。
在另一优选例中，所述的螯合剂包括EDTA(乙二胺四乙酸)。
在另一优选例中，所述的组合物为液体制剂。
在另一优选例中，所述的组合物为注射液体制剂。
在另一优选例中，所述的组合物为药物组合物。
在另一优选例中，所述的药物组合物的剂型为注射制剂。
在另一优选例中，所述的组合物包括：
Figure PCTCN2022092262-appb-000001
在另一优选例中，所述的组合物包括：
Figure PCTCN2022092262-appb-000002
Figure PCTCN2022092262-appb-000003
在另一优选例中，所述的组合物包括：
Figure PCTCN2022092262-appb-000004
本发明第二方面，提供一种制备如本发明第一方面所述的单克隆抗体-细胞因子融合蛋白组合物的方法，所述的方法包括步骤：
将如本发明第一方面，所述的组合物的各组分混合后，得到单克隆抗体-细胞因子融合蛋白组合物。
本发明第三方面，提供一种冻干制剂，所述的冻干制剂通过以下方法制备：
将如本发明第一方面所述的组合物进行冷冻干燥，得到冻干制剂。
在另一优选例中，所述的冻干制剂为冻干粉剂。
在另一优选例中，所述的冻干制剂还包括冻干保护剂。
在另一优选例中，所述的冻干保护剂选自下组：葡萄糖、甘露醇、果糖、半乳糖，或其组合。
本发明第四方面，提供一种如本发明第一方面所述的组合物或如本发明第三方面所述的冻干制剂的用途，用于制备药物，所述药物用于预防和/或治疗肿瘤。
在另一优选例中，所示的肿瘤包括实体瘤。
在另一优选例中，所示的肿瘤包括HER2阳性表达的实体瘤。
本发明第五方面，提供一种预防和/或治疗肿瘤的方法，所述的方法包括：给予所需对象施用如本发明第一方面所述的组合物或如本发明第三方面所述的冻干制剂，从而治疗肿瘤。
在另一优选例中，所述的对象包括人或非人哺乳动物。
在另一优选例中，所示的肿瘤包括实体瘤。
在另一优选例中，所示的肿瘤包括HER2阳性表达的实体瘤。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
具体实施方式
本发明人通过广泛而深入的研究，研发出一种组合物，所述的组合物能够有效保持抗单克隆抗体-细胞因子融合蛋白的稳定性，组合物中的单克隆抗体-细胞因子融合蛋白能够在高温、振荡等条件下均能保持其稳定性，因此，本发明所述的组合物能够稳定单克隆抗体-细胞因子融合蛋白的质量，延长产品的货架期，提高临床实用的安全性。在此基础上，完成了本发明。
术语
除非另有定义,否则本文中所用的所有技术和科学术语的含义与本发明所属领域普通技术人员普遍理解的含义相同。
如本文所用，术语“包含”、“包括”、“含有”可互换使用，不仅包括封闭式定义，还包括半封闭、和开放式的定义。换言之，所述术语包括了“由……构成”、“基本上由……构成”。
如本文所用，“mM”为mmol/L单位，例如，1mM＝1mmol/L。
在本发明中在所述的组合物中，各个组分的重量含量(wt.％)均以组合物的重量计。
如本文所用，术语“EDTA”为乙二胺四乙酸。
单克隆抗体-细胞因子融合蛋白
在本发明中，本发明所述单克隆抗体-细胞因子融合蛋白为单克隆抗体与细胞因子连接(肽键连接)形成的融合蛋白。
如本文所用，术语“单克隆抗体”由两个相同的轻链(L)和两个相同的重链(H)组成。每条重链的一端有可变区(VH)，其后是多个恒定区。每条轻链的一端有 可变区(VL)，另一端有恒定区；轻链的恒定区与重链的第一个恒定区相对，轻链的可变区与重链的可变区相对。
在本发明的一个优选例中，所述的单克隆抗体-细胞因子融合蛋白中的单克隆抗体的重链氨基酸序列的C端与细胞因子的氨基酸序列的N端连接。
在另一优选例中，在所述的单克隆抗体-细胞因子融合蛋白中，单克隆抗体的具有如SEQ ID NO.：1的重链氨基酸序列和SEQ ID NO.：2轻链氨基酸序列。
在另一优选例中，在所述的单克隆抗体-细胞因子融合蛋白中，细胞因子具有如SEQ ID NO.：3的氨基酸序列。
组合物及其制备方法
本发明提供一种单克隆抗体-细胞因子融合蛋白组合物，所述的组合物包括抗单克隆抗体-细胞因子融合蛋白、表面活性剂、缓冲液和任选地稳定剂。
本发明所述的组合物优选为药物组合物。
本发明所述的组合物可以为固体制剂、半固体制剂和液体制剂，优选为液体制剂，例如口服液体制剂或注射液体制剂。
在本发明的一个优选例中，所述的单克隆抗体-细胞因子融合蛋白包括人源单克隆抗体-细胞因子融合蛋白。
在本发明的一个优选例中，所述单克隆抗体-细胞因子融合蛋白的含量为0.5-50mg/mL，较佳地0.5-40mg/mL，更佳地0.5-30mg/mL，更佳地0.5-20mg/mL，更佳地1-15mg/mL，更佳地2-10mg/mL，更佳地3-8mg/mL，最佳地5mg/mL。
在本发明的一个优选例中，所述的表面活性剂包括(但不限于)：正离子型表面活性剂、负离子型表面活性剂、非离子型表面活性剂，或其组合。
代表性地，所述的表面活性剂包括(但不限于)：聚氧乙烯山梨醇酐脂肪酸酯、聚氧乙烯氢化蓖麻油、甘油脂肪酸酯、聚山梨酯、泊洛沙姆，或其组合。
典型地，所述的聚山梨酯包括(但不限于)：聚山梨酯20(PS–20，吐温-20)、聚山梨酯40(PS-40，吐温-40)、聚山梨酯60(PS–60，吐温-60)、聚山梨酯80(PS-80，吐温-80)，或其组合。
典型地，所述的表面活性剂包括聚山梨酯20(PS-20，吐温-20)。
在本发明的一个优选例中，所述表面活性剂的含量为0.001-8wt％，较佳地0.001-3wt％，更佳地0.001-1wt％，更佳地0.005-0.5wt％，更佳地0.005-0.1wt％，更佳地0.008-0.1wt％，更佳地0.01-0.08wt％，更佳地0.01-0.05wt％，更佳地 0.02-0.04wt％，最佳地0.03wt％，以组合物的总重量计。
在本发明的一个优选例中，所述的缓冲液包括(但不限于)：柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液、柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液、磷酸盐-磷酸缓冲液、组氨酸缓冲液，或其组合。
在另一优选例中，所述的缓冲液的介质为水。
在本发明的一个优选例中，所述缓冲液的浓度为3-80mM，较佳地5-60mM，更佳地10-50mM，更佳地20-40mM，更佳地25-35mM，更佳地28-32mM，最佳地30mM。
代表性地，所述的缓冲液包括柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液。
在本发明的一个优选例中，所述柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液的浓度为3-80mM，较佳地5-60mM，更佳地10-50mM，更佳地20-40mM，更佳地25-35mM，更佳地28-32mM，最佳地30mM。
在本发明的一个优选例中，所述的稳定剂包括(但不限于)：氨基酸、糖醇、无机盐，或其组合。
代表性地，所述的氨基酸包括(但不限于)：脯氨酸、精氨酸(Arginine)、甘氨酸(Glycine)、组氨酸(Histidine)、甲硫氨酸(Methionine)，或其组合。
代表性地，所述的糖醇包括(但不限于)：蔗糖(Sucrose)、甘露醇(Mannitol)、海藻糖(Trehalose)、麦芽糖(Maltose)、山梨醇(Sorbitol)，或其组合。
代表性地，所述的糖醇包括(但不限于)：蔗糖、甘露醇、海藻糖、山梨醇，或其组合。
在本发明的一个优选例中，所述的无机盐包括(但不限于)：氯化钠、氯化钾、氯化钙、氯化镁，或其组合。
代表性地，所述的稳定剂包括蔗糖。
在本发明的一个优选例中，所述的稳定剂的含量为0.5-50wt％，较佳地0.5-40wt％，更佳地0.8-30wt％，更佳地1-20wt％，更佳地1-15wt％，更佳地1-10wt％，更佳地1-8wt％，更佳地2-7wt％，最佳地5wt％，以组合物的总重量计。
在本发明的一个优选例中，所述的组合物的pH为5-8，较佳地5.0-7.5，更佳地5.0-7.0，更佳地6.0-7.0，更佳地6.0-6.8，更佳地6.2-6.8，更佳地6.3-6.7，最佳地6.5。
在本发明的一个优选例中，所述的组合物还包括螯合剂。
代表性地，所述的螯合剂包括EDTA(乙二胺四乙酸)。
在本发明的一个优选例中，所述的组合物包括：
Figure PCTCN2022092262-appb-000005
在本发明的一个优选例中，所述的组合物包括：
Figure PCTCN2022092262-appb-000006
在本发明的一个优选例中，所述的组合物包括：
Figure PCTCN2022092262-appb-000007
本发明还提供一种本发明所述组合物的制备方法，所述的方法包括步骤：
将如本发明所述的组合物的各组分混合后，得到单克隆抗体-细胞因子融合蛋白组合物。
冻干制剂
本发明还提供一种冻干制剂，所述的冻干制剂通过以下方法制备：
将如本发明所述的组合物进行冷冻干燥，得到冻干制剂。
在另一优选例中，所述的冻干制剂为冻干粉的形式。当需要使用时，可溶解于相应的溶剂，优选缓冲液中进行使用。
在另一优选例中，所述的冻干制剂还包括冻干保护剂。
在另一优选例中，所述的冻干保护剂包括(但不限于)：葡萄糖、甘露醇、果糖、半乳糖，或其组合。
用途和施用方法
本发明还提供一种如本发明所述组合物或所述冻干制剂的用途，用于制备药物，所述药物用于预防和/或治疗肿瘤。
本发明还提供一种预防和/或治疗肿瘤的方法，所述的方法包括：给予所需对象施用如如本发明所述组合物或所述冻干制剂，从而治疗肿瘤。
在另一优选例中，所示的肿瘤包括实体瘤。
在另一优选例中，所示的肿瘤包括HER2阳性表达的实体瘤。
本发明的组合物的施用方式没有特别限制，代表性的施用方式包括(但并不限于)：口服、瘤内、肠胃外(静脉内、肌肉内或皮下)、和局部给药。
本发明的组合物可以单独给药，或者与其他药学上可接受的治疗剂联合给药。
本发明治疗方法可以单独施用，或者与其它治疗手段或者治疗药物联用。
使用本发明的组合物时，是将安全有效量的本发明组合物施用于需要治疗的哺乳动物(如人)，其中施用时剂量为药学上认为的有效给药剂量，对于60kg体重的人而言，日给药剂量通常为1～2000mg，优选50～1000mg。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。
本发明的主要优点包括：
本发明提供一种含有单克隆抗体-细胞因子融合蛋白的组合物，所述的组合物能够提高单克隆抗体-细胞因子融合蛋白的稳定性。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。
实施例
以下实施例中的柠檬酸缓冲液和组氨酸缓冲液如下：
柠檬酸缓冲液：柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液，介质为水，溶质为柠檬酸和磷酸氢二钠。
组氨酸缓冲液：介质为水，溶质为组氨酸和组氨酸盐酸。
以下实施例中的单克隆抗体-细胞因子融合蛋白为单克隆抗体的重链氨基酸序列的C端与细胞因子的氨基酸序列的N端通过肽键连接形成，其中，单克隆抗体的重链氨基酸序列如SEQ ID NO.：1所示，单克隆抗体的轻链氨基酸序列如SEQ ID NO.：2所示，细胞因子的氨基酸序列如SEQ ID NO.：3所示；
SEQ ID NO.：1(N端到C端)：
Figure PCTCN2022092262-appb-000008
SEQ ID NO.：2(N端到C端)：
Figure PCTCN2022092262-appb-000009
SEQ ID NO.：3(N端到C端)：
Figure PCTCN2022092262-appb-000010
Figure PCTCN2022092262-appb-000011
单克隆抗体-细胞因子融合蛋白用于治疗HER2阳性表达的实体瘤，偶联的细胞因子杀伤单抗靶向的肿瘤细胞，极大的增强了单抗的治疗效果。
通用测定方法
SEC-HPLC为体积排阻色谱法，用于分析单克隆抗体-细胞因子融合蛋白的纯度，具体地，检测单克隆抗体-细胞因子融合蛋白的因聚集产生的多聚体含量及降解产生的小分子片段含量。
实施例1
研究样品具有相同的制剂组成，但含有不同pH的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲体系中单克隆抗体-细胞因子融合蛋白的稳定性。
上述不同pH是指pH4.5，pH5.0，pH5.5，pH6.0，pH6.5，pH7.0，pH7.5及pH8.0的10mM柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液。
单克隆抗体-细胞因子融合蛋白制剂到上述缓冲溶液中，蛋白浓度为5mg/ml，分别在2～8℃及40℃下孵育3天(T3)、7天(T7)，制剂中单克隆抗体-细胞因子融合蛋白纯度通过SEC-HPLC进行分析，2～8℃条件下孵育不同时间制剂纯度检测结果见表1，40℃条件下孵育不同时间制剂纯度检测结果见表2。
表1 2～8℃条件下孵育的制剂纯度测定结果
Figure PCTCN2022092262-appb-000012
Figure PCTCN2022092262-appb-000013
表2 40℃条件下孵育的制剂纯度测定结果
Figure PCTCN2022092262-appb-000014
表1和表2的结果所示：2～8℃条件下各制剂相对较为稳定，在加速试验条件下(40℃)，样品稳定性变化趋势明显，制剂pH为4.5时样品聚集明显，T3时聚集体达到80.3％，pH5.0～8.0范围内样品聚集的稳定性无显著性差异；降解片段在pH5.5～6.5条件下相对稳定，没有明显增加趋势，结果表明制剂pH影响单克隆抗体-细胞因子融合蛋白的稳定性，低pH条件下趋向聚集，高pH条件下降解趋势增加明显，根据加速稳定性试验初步结果，优选的制剂pH范围为5.5到6.5。
实施例2
根据实例1确定的pH范围，考察单克隆抗体-细胞因子融合蛋白在组氨酸缓冲液及柠檬酸缓冲液体系中的稳定性，筛选合适的缓冲溶液。根据缓冲溶液特性，组氨酸缓冲液pH范围为5.5～7.0，柠檬酸缓冲液pH范围为5.5～6.5，蛋白浓度均为5mg/ml,采用DOE设计，按照pH、缓冲溶液浓度2个因素进行设计制剂处方。制剂样品在加速稳定性试验条件(50℃)孵育3天后，测定蛋白纯度，组氨酸缓冲体系制剂处方试验结果见表3、柠檬酸缓冲体系制剂处方试验结果见表4。
结果显示：组氨酸缓冲溶液、柠檬酸缓冲溶液两种缓冲溶液在相对低pH(5.5)条件下均易产生聚集，在pH6.0～6.5条件下相对稳定，在该pH范围内， 缓冲溶液浓度对样品稳定性有明显的影响，组氨酸浓度为30mM低于5mM时样品蛋白纯度，柠檬酸浓度为30mM高于5mM时样品蛋白纯度。根据pH6.0～6.5缓冲溶液整体稳定性情况，优选柠檬酸缓冲溶液进行考察。
表3组氨酸缓冲液体系的制剂蛋白纯度检测结果
Figure PCTCN2022092262-appb-000015
表4柠檬酸缓冲液体系的制剂蛋白纯度检测结果
Figure PCTCN2022092262-appb-000016
Figure PCTCN2022092262-appb-000017
实施例3
选择柠檬酸缓冲溶液，对缓冲溶液浓度及pH进一步考察，以2个因素，3个水平进行DOE处方设计，pH选择6.0、6.5、7.0，缓冲溶液浓度为10mM、30mM、50mM。制剂样品在加速试验条件下进行考察，在50℃孵育3天后，测定蛋白纯度，测定结果见表5，结果显示：制剂缓冲溶液pH在6.0～7.0范围内，样品相对较为稳定，其中pH6.5的缓冲溶液有相对较好的稳定性，当缓冲溶液浓度升高时，聚集体有减少的趋势，样品纯度有增加的趋势。根据该试验结果，优先选择柠檬酸缓冲溶液浓度为30mM，pH6.5作为蛋白制剂处方最适宜的缓冲体系。
表5蛋白纯度检测结果
Figure PCTCN2022092262-appb-000018
实施例4
表面活性剂影响：选择生产过程中中间产品单克隆抗体-细胞因子融合蛋白亲和层析洗脱液，添加0.03％、0.1％吐温20，观察样品不溶性微粒变化，考察吐温20对样品稳定性影响。
采用光阻法测定样品不溶性微粒，结果见表6，结果显示：在样品溶液中添加吐温20后，显著减少不溶性微粒的数量。根据结果，样品中添加0.03％吐温20能控制样品溶液中的不溶性微粒数量。
表6不溶性微粒测定结果
Figure PCTCN2022092262-appb-000019
备注：wt％是基于制剂重量的重量百分比；
糖、盐及氨基酸影响：选择单克隆抗体-细胞因子融合蛋白制剂缓冲体系为柠檬酸缓冲溶液，浓度为30mM、pH6.5、0.03％吐温20，进一步考察辅料糖、盐和氨基酸对单克隆抗体-细胞因子融合蛋白稳定性的影响。
辅料包括蔗糖、氯化钠、精氨酸，蛋白浓度为5mg/ml，蔗糖浓度设定为0％、5％、10％，氯化钠设定为0mM、30mM、60mM，精氨酸设定为0mM、25mM、50mM，按照3个因素3个水平进行设计。制剂样品在加速试验条件下进行考察，在50℃孵育3天后，测定蛋白纯度，测定结果见表7，结果显示：制剂加速试验条件下孵育3天，聚集体明显增加，且添加蔗糖、氯化钠、精氨酸辅料的制剂与未添加辅料的制剂相比，样品加速试验条件下稳定性并没有得到明显改善。
表7含有糖、盐和氨基酸辅料的制剂纯度检测结果
Figure PCTCN2022092262-appb-000020
Figure PCTCN2022092262-appb-000021
备注：wt％是基于制剂重量的重量百分比；“-”代表无。
抗氧化剂及氨基酸影响：选择单克隆抗体-细胞因子融合蛋白制剂缓冲体系为柠檬酸缓冲溶液，浓度为30mM、pH6.5、0.03％吐温20，进一步考察EDTA(乙二胺四乙酸)、组氨酸、甘氨酸对单克隆抗体-细胞因子融合蛋白稳定性的影响。
制剂样品在加速试验条件下进行考察，在50℃孵育3天后，测定蛋白纯度，测定结果见表8，结果显示：添加EDTA、组氨酸、甘氨酸均不能有效抑制单克隆抗体-细胞因子融合蛋白的降解。
表8蛋白纯度检测结果
Figure PCTCN2022092262-appb-000022
备注：wt％是基于制剂重量的重量百分比；“-”代表无。
实施例5
蛋白质聚集与降解一般与储存温度有高度的相关性，实施例1～4均采用50℃孵育3天的加速稳定性试验，试验条件相对较为剧烈，根据上述案例试验研究，初步拟定单克隆抗体-细胞因子融合蛋白原液制剂处方为单克隆抗体-细胞因子融合蛋白浓度为5mg/ml，含30mM柠檬酸缓冲液，0.03wt％聚山梨酯20、pH为6.5。对该处方降低加速试验条件，确认pH适用范围及该制剂是否能作为长期储存的有效制剂处方。
选择pH范围为5.0～7.0，加速试验条件为50℃孵育2天。检验结果见表9，结果显示：pH≤6.0条件下，样品有明显的聚集现象，pH在6.0-7.0范围内，蛋白相对较为稳定，在50℃孵育2天后蛋白纯度能维持在95.0％左右。根据该试验结果，推测制剂在2～8℃储存能维持较好的稳定性，后续需要长期稳定性试验进行确认，因此，制剂pH范围为6.0-7.0，最优pH为6.5。
表9蛋白纯度检测结果
Figure PCTCN2022092262-appb-000023
实施例6
根据单克隆抗体-细胞因子融合蛋白制剂拟定剂量及注射方式，在原液制剂条件下调整制剂渗透压至生理条件时渗透压，结合实施例4辅料研究，考虑辅料来源，选择在原液制剂中添加5％蔗糖。初步拟定单克隆抗体-细胞因子融合蛋白原液制剂处方为单克隆抗体-细胞因子融合蛋白浓度为5mg/ml，30mM柠檬酸缓冲液，0.03wt％聚山梨酯20、5wt％蔗糖，pH为6.5。
对拟定的制剂处方进行确认，在50℃条件下孵育3天，孵育结束后，通过 SEC-HPLC测定蛋白纯度，评估制剂稳定性，结果见表10，结果显示：该制剂50℃高温条件下孵育3天，仅降解明显增加，纯度维持在94.0％。根据试验结果及结合降解与温度的关联性，认为制剂保存在2～8℃储存仍能维持较好的稳定性，该制剂能满足蛋白药物储存有效期的要求。
表10蛋白纯度检测结果
Figure PCTCN2022092262-appb-000024
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (10)

  1. 一种单克隆抗体-细胞因子融合蛋白组合物，其特征在于，所述的组合物包括抗单克隆抗体-细胞因子融合蛋白、表面活性剂、缓冲液和稳定剂。
  2. 如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述的单克隆抗体-细胞因子融合蛋白中的单克隆抗体的重链氨基酸序列的C端与细胞因子的氨基酸序列的N端连接；
    在所述的单克隆抗体-细胞因子融合蛋白中，单克隆抗体的具有如SEQ ID NO.：1的重链氨基酸序列和SEQ ID NO.：2轻链氨基酸序列；
    在所述的单克隆抗体-细胞因子融合蛋白中，细胞因子具有如SEQ ID NO.：3的氨基酸序列。
  3. 如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述的表面活性剂选自下组：聚氧乙烯山梨醇酐脂肪酸酯、聚氧乙烯氢化蓖麻油、甘油脂肪酸酯、聚山梨酯、泊洛沙姆，或其组合；
    所述的缓冲液选自下组：柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液、柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液、磷酸盐-磷酸缓冲液、组氨酸缓冲液，或其组合；和/或
    所述的稳定剂选自下组：氨基酸、糖醇、无机盐，或其组合。
  4. 如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述单克隆抗体-细胞因子融合蛋白的含量为0.5-50mg/mL，较佳地0.5-40mg/mL，更佳地0.5-30mg/mL，更佳地0.5-20mg/mL，更佳地1-15mg/mL，更佳地2-10mg/mL，更佳地3-8mg/mL，最佳地5mg/mL；
    所述表面活性剂的含量为0.001-8wt％，较佳地0.001-3wt％，更佳地0.001-1wt％，更佳地0.005-0.5wt％，更佳地0.005-0.1wt％，更佳地0.008-0.1wt％，更佳地0.01-0.08wt％，更佳地0.01-0.05wt％，更佳地0.02-0.04wt％，最佳地0.03wt％，以组合物的总重量计；
    所述缓冲液的浓度为3-80mM，较佳地5-60mM，更佳地10-50mM，更佳地20-40mM，更佳地25-35mM，更佳地28-32mM，最佳地30mM；和/或
    所述的稳定剂的含量为0.5-50wt％，较佳地0.5-40wt％，更佳地0.8-30wt％，更佳地1-20wt％，更佳地1-15wt％，更佳地1-10wt％，更佳地1-8wt％，更佳地2-7wt％，最佳地5wt％，以组合物的总重量计。
  5. 如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述的组合物的pH为5-8，较佳地5.0-7.5，更佳地5.0-7.0，更佳地6.0-7.0，更佳地6.0-6.8，更佳地6.2-6.8，更佳地6.3-6.7，最佳地6.5。
  6. 如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述的组合物包括：
    Figure PCTCN2022092262-appb-100001
  7. 如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述的组合物包括：
    Figure PCTCN2022092262-appb-100002
  8. 一种冻干制剂，所述的冻干制剂通过以下方法制备：
    将如权利要求1所述的组合物进行冷冻干燥，得到冻干制剂。
  9. 如权利要求1所示的组合物或如权利要求8所述的冻干制剂的用途，其特征在于，用于制备药物，所述药物用于预防和/或治疗肿瘤。
  10. 一种预防和/或治疗肿瘤的方法，所述的方法包括：给予所需对象施用如权利要求1所示的组合物或如权利要求8所述的冻干制剂，从而治疗肿瘤。
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