CN116785247A - 一种包含抗体融合蛋白的药物组合物及其用途 - Google Patents

一种包含抗体融合蛋白的药物组合物及其用途 Download PDF

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Abstract

本披露涉及一种包含抗体融合蛋白的药物组合物及其用途。具体而言，本披露涉及包含GCGR抗体与GLP‑1肽融合形成的双特异性蛋白的药物组合物及其用途。该组合物具有很高的稳定性。

Description

一种包含抗体融合蛋白的药物组合物及其用途
技术领域
本披露属于药物制剂领域，具体涉及一种包含GCGR抗体与GLP-1肽融合形成的双特异性蛋白的药物组合物，以及其作为药物的用途。
背景技术
这里的陈述仅提供与本披露有关的背景信息，而不必然地构成现有技术。
糖尿病(diabetes mellitus，DM)是一种表现为胰岛素分泌缺陷和/或胰岛素作用障碍，以高血糖为特征的代谢性疾病，其发病主要是胰岛素与胰高血糖素共同作用的结果。
GLP-1是影响胰岛素分泌最主要的激素之一，与胰高血糖素(Glucagon)一起均来源于前胰岛素原。前胰岛素原由约158个氨基酸组成，在不同的部位被切割成不同的肽链。人体内具有生物活性的GLP-1主要包括GLP-1(7-36)酰胺和GLP-1(7-37)两种形式。GLP-1通过小肠L细胞分泌，主要以葡萄糖浓度依赖性方式促进胰岛素分泌，保护胰岛β细胞，抑制胰高血糖素分泌来降低机体血糖水平。同时GLP-1还有抑制胃排空，降低食欲的作用。临床可用于II型糖尿病和肥胖症的治疗。机体内天然活性GLP-1的半衰期很短(不足2分钟)，很容易被机体内DPPIV酶降解，不具有临床使用价值。
延长半衰期一直是GLP-1类药物研发的主要方向，目前已有多款GLP-1激动剂上市，如度拉糖肽(Dulaglutide)和索马鲁肽(Semaglutide)等。虽然GLP-1激动剂在疗效上已经获得人们的充分肯定，但也存在诸多副作用，主要表现为胃肠道症状，低血糖，胰腺炎及肾损伤等。
胰高血糖素与胰岛素作用相反，主要起升高机体血糖的作用。胰高血糖素是由胰岛α细胞分泌的具有29个氨基酸的肽，与肝细胞膜上受体GCGR结合后主要通过激活下游cAMP/PKA途径，加速糖原分解、脂肪分解和糖异生，使血糖升高。
研究发现，GCGR基因敲除鼠呈现出GLP-1升高，肝糖输出减少，脂代谢增加，食欲减退等一系列表型。GCGR是糖尿病治疗最热门的靶点之一，但目前针对GCGR的拮抗类药物研发进展缓慢。REMD Biotherapeutics公司的REMD-477，目前是最前沿的GCGR单克隆抗体药物，处于临床二期。
现有技术已在专利CN 112996811 A中公开了一种包含GCGR抗体与GLP-1肽的融合蛋白，需提供优秀的制剂组成。
发明内容
本披露提供一种包含GCGR-GLP-1融合蛋白的药物组合物，该融合蛋白是由人GCGR抗体和GLP-1肽融合形成的双特异性蛋白。该组合物具有很高的稳定性，在振摇10天，或光照10天，或反复冻融(F/T，-35℃至4℃)，或40℃一个月条件下，外观保持澄明，纯度几乎没变化。此外，4℃放置4个月的条件下，外观保持澄明，说明该组合物同时有很高的长期储存稳定性。
在一些实施方案中，本披露所述的药物组合物，其包含GCGR-GLP-1融合蛋白和缓冲剂，其中：
所述GCGR-GLP-1融合蛋白包含SEQ ID NO：1的第一链和SEQ ID NO：2的第二链；
所述缓冲剂为三羟甲基氨基甲烷缓冲剂，且所述药物组合物的pH为约7.0至约8.0；包括但不限于约7.0、约7.1、约7.2、约7.3、约7.4、约7.5、约7.6、约7.7、约7.8、约7.9、约8.0，以及这些点值之间的任意范围。
在一些实施方案中，所述药物组合物的pH为约7.4至约7.8。
在一些实施方案中，所述药物组合物的pH为7.6至8.0。
在一些实施方案中，所述药物组合物的pH为约7.6。
在一些实施方案中，所述药物组合物的缓冲剂为三羟甲基氨基甲烷。
在一些实施方案中，所述药物组合物的缓冲剂选自三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲剂、三羟甲基氨基甲烷-醋酸缓冲剂、三羟甲基氨基甲烷-琥珀酸缓冲剂或三羟甲基氨基甲烷-枸橼酸缓冲剂。
在一些实施方案中，所述药物组合物的缓冲剂选自三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲剂、三羟甲基氨基甲烷-醋酸缓冲剂和三羟甲基氨基甲烷-枸橼酸缓冲剂。
在一些实施方案中，所述药物组合物的缓冲剂选自三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲剂和三羟甲基氨基甲烷-枸橼酸缓冲剂。
在一些实施方案中，所述药物组合物的缓冲剂为三羟甲基氨基甲烷-枸橼酸缓冲剂。
本披露中的药物组合物的最终pH与缓冲液pH几乎一致。但本领域技术人员公知，在制备药物制剂的过程中，可能会存在pH飘移，本披露中的药物制剂的最终pH的飘移在±0.2范围内。
在一些实施方案中，如上任一项所述的药物组合物，其中所述GCGR-GLP-1融合蛋白浓度为约1mg/mL至约48g/mL。在一些实施方案中，所述GCGR-GLP-1融合蛋白的浓度为约1.5mg/mL至约36mg/mL，优选为约6mg/mL至约24mg/mL，更优选为约6mg/mL至约18mg/mL，最优选为12mg/mL至18mg/mL。在一些实施方案中，所述GCGR-GLP-1融合蛋白的浓度为约1.5mg/mL至约18mg/mL。具体实施例包括但不限于约1.5mg/mL、约4mg/mL、约5mg/mL、约6mg/mL、约7mg/mL、约8mg/mL、约10mg/mL、约12mg/mL、约15mg/mL、约18mg/mL、约20mg/mL、约24mg/mL、约25mg/mL、约28mg/mL、约30mg/mL、约35mg/mL、约36mg/mL、约38mg/mL、约40mg/mL、约45mg/mL和约48mg/mL，以及这些点值之间的任意范围。在一些实施方案中，所述GCGR-GLP-1融合蛋白的浓度为约6mg/mL、约12mg/mL或约18mg/mL。
在一些实施方案中，如上任一项所述的药物组合物，其中所述药物组合物还包含表面活性剂。在一些实施方案中，所述表面活性剂是非离子表面活性剂。在一些实施方案中，所述表面活性剂选自聚山梨酯、聚山梨酯20、聚山梨酯80、聚羟亚烃、泊洛沙姆188、Triton、十二烷基磺酸钠、月桂基磺酸钠、辛基糖甙钠、月桂基-磺基甜菜碱、肉豆蔻基-磺基甜菜碱、亚油基-磺基甜菜碱、硬脂基-磺基甜菜碱、月桂基-肌氨酸、肉豆蔻基-肌氨酸、亚油基-肌氨酸、硬脂基-肌氨酸、亚油基-甜菜碱、肉豆蔻基-甜菜碱、鲸蜡基-甜菜碱、月桂酰胺基丙基-甜菜碱、柯卡酰胺基丙基-甜菜碱、亚油酰胺基丙基-甜菜碱、肉豆蔻酰胺基丙基-甜菜碱、棕榈酰胺基丙基-甜菜碱、异硬脂酰胺基丙基-甜菜碱、肉豆蔻酰胺基丙基-二甲基胺、棕榈酰胺基丙基-二甲基胺、异硬脂酰胺基丙基-二甲基胺、甲基可可酰基钠、甲基油基牛磺酸钠、聚乙二醇、聚丙二醇、乙烯与丙烯二醇的共聚物等。在一些实施方案中，所述表面活性剂为聚山梨酯或泊洛沙姆。在一些实施方案中，所述表面活性剂为聚山梨酯80或泊洛沙姆188。在一些实施方案中，所述表面活性剂为泊洛沙姆188。
在一些实施方案中，如上任一项所述的药物组合物，其中所述表面活性剂浓度为约0.05mg/mL至约1.2mg/mL；包括但不限于约0.05mg/mL、约0.1mg/mL、约0.2mg/mL、约0.3mg/mL、约0.4mg/mL、约0.5mg/mL、约0.6mg/mL、约0.7mg/mL、约0.8mg/mL、约0.9mg/mL、约1.0mg/mL、约1.1mg/mL、约1.2mg/mL，以及这些点值之间的任意范围。
在一些实施方案中，所述表面活性剂浓度为约0.2mg/mL至约0.8mg/mL。在一些实施方案中，所述表面活性剂浓度为约0.2mg/mL至约0.6mg/mL。在一些实施方案中，所述表面活性剂浓度为约0.3mg/mL至0.6mg/mL。在一些实施方案中，所述表面活性剂浓度为0.3mg/mL、0.4mg/mL、0.5mg/mL或0.6mg/mL。在一些实施方案中，所述表面活性剂浓度为约0.4mg/mL。
在一些实施方案中，所述表面活性剂为聚山梨酯80，其浓度为约0.2mg/mL至约0.8mg/mL。
在一些实施方案中，所述表面活性剂为聚山梨酯80，其浓度为约0.2mg/mL至约0.6mg/mL。
在一些实施方案中，所述表面活性剂为泊洛沙姆188，其浓度为约0.2mg/mL至约0.8mg/mL。
在一些实施方案中，所述表面活性剂为泊洛沙姆188，其浓度为约0.2mg/mL至约0.6mg/mL。在一些实施方案中，所述表面活性剂为泊洛沙姆188，其浓度为约0.4mg/mL。
在一些实施方案中，如上任一项所述的药物组合物，其中所述药物组合物还包含糖。在一些实施方案中，所述糖选自常规组合物(CH2O)n及其衍生物、包括单糖、二糖、三糖、多糖、糖醇、还原性糖、非还原性糖等等。所述的糖可选自葡萄糖、蔗糖、海藻糖、乳糖、果糖、麦芽糖、右旋糖苷、甘油、赤藻糖醇、丙三醇、阿拉伯糖醇、sylitol、山梨糖醇、甘露醇、密里二糖、松三糖、蜜三糖、甘露三糖、水苏糖、麦芽糖、乳果糖、麦芽酮糖、山梨醇、麦芽糖醇、乳糖醇、异-麦芽酮糖等。在一些实施方案中，所述糖选自蔗糖、甘露醇和海藻糖中的一种或多种。在一些实施方案中，所述糖为蔗糖。
在一些实施方案中，如上任一项所述的药物组合物，其中所述糖的浓度为约60mg/mL至约120mg/mL；包括但不限于约60mg/mL、约70mg/mL、约80mg/mL、约90mg/mL、约91mg/mL、约100mg/mL、约110mg/mL或约120mg/mL，以及这些点值之间的任意范围。
在一些实施方案中，所述糖的浓度为约80mg/mL至约100mg/mL。在一些实施方案中，所述糖的浓度为约80mg/mL、约85mg/mL、约90mg/mL、约91mg/mL、95mg/mL或约100mg/mL。在一些实施方案中，所述糖的浓度为约91mg/mL。
在一些实施方案中，如上任一项所述的药物组合物，其中所述缓冲剂的浓度为约0.5mM至约30mM；包括但不限于约0.5mM、1mM、约1.5mM、约3mM、约5mM、约10mM、约15mM、约20mM、约25mM或约30mM，以及这些点值之间的任意范围。
在一些实施方案中，所述缓冲剂的浓度为约1mM至约10mM。在一些实施方案中，所述缓冲剂的浓度为约1mM、约2mM、约3mM、约4mM、约5mM、约6mM、约7mM、约8mM、约9mM或约10mM。在一些实施方案中，所述缓冲剂的浓度为约3mM至约10mM。在一些实施方案中，所述缓冲剂的浓度为约3mM至约5mM。在一些实施方案中，所述缓冲剂的浓度为约5mM。
在一些实施方案中，如上任一项所述的药物组合物，其包含如下组分：
(a)约1mg/mL至约48mg/mL的GCGR-GLP-1融合蛋白，(b)约0.05mg/mL至约1.2mg/mL的泊洛沙姆188，(c)约80mg/mL至约100mg/mL的糖，和(d)约0.5mM至约30mM的三羟甲基氨基甲烷缓冲剂；所述药物组合物的pH为约7.0至约8.0。
在一些实施方案中，如上任一项所述的药物组合物，其包含如下组分：
(a)约1mg/mL至约36mg/mL的GCGR-GLP-1融合蛋白，(b)约0.2mg/mL至约0.8mg/mL的泊洛沙姆188，(c)约80mg/mL至约100mg/mL的蔗糖，和(d)约3mM至约10mM的三羟甲基氨基甲烷缓冲剂；所述药物组合物的pH为约7.0至约8.0；或
(a)约1.5mg/mL至约24mg/mL的GCGR-GLP-1融合蛋白，(b)约0.2mg/mL至约0.8mg/mL的泊洛沙姆188，(c)约80mg/mL至约100mg/mL的蔗糖，和(d)约3mM至约10mM的三羟甲基氨基甲烷缓冲剂；所述药物组合物的pH为约7.0至约8.0；或
(a)约6mg/mL至约24mg/mL的GCGR-GLP-1融合蛋白，(b)约0.2mg/mL至约0.8mg/mL的泊洛沙姆188，(c)约80mg/mL至约100mg/mL的蔗糖，和(d)约3mM至约10mM的三羟甲基氨基甲烷缓冲剂；所述药物组合物的pH为约7.0至约8.0；或
(a)约6mg/mL至约18mg/mL的GCGR-GLP-1融合蛋白，(b)约0.2mg/mL至约0.8mg/mL的泊洛沙姆188，(c)约80mg/mL至约100mg/mL的蔗糖，和(d)约3mM至约10mM的三羟甲基氨基甲烷缓冲剂；所述药物组合物的pH为约7.0至约8.0；或
(a)约6mg/mL至约18mg/mL的GCGR-GLP-1融合蛋白，(b)约0.2mg/mL至约0.8mg/mL的泊洛沙姆188，(c)约80mg/mL至约100mg/mL的蔗糖，和(d)约3mM至约10mM的三羟甲基氨基甲烷缓冲剂；所述药物组合物的pH为约7.6至约8.0；或
(a)约12mg/mL至约18mg/mL的GCGR-GLP-1融合蛋白，(b)约0.2mg/mL至约0.8mg/mL的泊洛沙姆188，(c)约80mg/mL至约100mg/mL的蔗糖，和(d)约3mM至约10mM的三羟甲基氨基甲烷缓冲剂；所述药物组合物的pH为约7.6至约8.0；或
(a)约6mg/mL的GCGR-GLP-1融合蛋白，(b)约0.4mg/mL的泊洛沙姆188，(c)约91mg/mL的蔗糖，和(d)约5mM的三羟甲基氨基甲烷-枸橼酸缓冲剂；所述药物组合物的pH为约7.6；或
(a)约18mg/mL的GCGR-GLP-1融合蛋白，(b)约0.4mg/mL的泊洛沙姆188，(c)约91mg/mL的蔗糖，和(d)约5mM的三羟甲基氨基甲烷-枸橼酸缓冲剂；所述药物组合物的pH为约7.6。
在一些实施方案中，如上任一项所述的药物组合物，所述药物组合物是液体制剂。在一些实施方案中，所述液体制剂的溶剂是水。
本披露提供一种冻干制剂，其为前述任一项所述的药物组合物的冻干形式。
本披露还提供一种的冻干制剂，其特征在于所述冻干制剂复溶后可形成如上任一项所述的药物组合物。
本披露还提供一种制备冻干制剂的方法，其中包括将如上任一项所述的药物组合物进行冷冻干燥的步骤。
本披露还提供一种冻干制剂，所述制剂通过将如上任一项所述的药物组合物冷冻干燥获得。在一些实施方案中，如上任一项所述冷冻干燥依次包括预冻、一次干燥和二次干燥的步骤。在一些实施方案中，该冻干制剂于40℃稳定至少7天，至少14天或至少28天。
本披露还提供一种复溶溶液，其特征在于所述复溶溶液是通过将如上任一项所述的冻干制剂经复溶制备获得。
在一些实施方案中，如上所述的复溶溶液包含如下组分：
(a)约1mg/mL至约36mg/mL的GCGR-GLP-1融合蛋白，(b)约0.2mg/mL至约0.8mg/mL的泊洛沙姆188，(c)约80mg/mL至约100mg/mL的蔗糖，和(d)约0.5mM至约30mM的三羟甲基氨基甲烷缓冲剂；所述药物组合物的pH为约7.0至约8.0；或
(a)约1.5mg/mL至约24mg/mL的GCGR-GLP-1融合蛋白，(b)约0.2mg/mL至约0.8mg/mL的泊洛沙姆188，(c)约80mg/mL至约100mg/mL的蔗糖，和(d)约3mM至约10mM的三羟甲基氨基甲烷缓冲剂；所述药物组合物的pH为约7.0至约8.0；或
(a)约6mg/mL至约24mg/mL的GCGR-GLP-1融合蛋白，(b)约0.2mg/mL至约0.8mg/mL的泊洛沙姆188，(c)约80mg/mL至约100mg/mL的蔗糖，和(d)约3mM至约10mM的三羟甲基氨基甲烷缓冲剂；所述药物组合物的pH为约7.0至约8.0；或
(a)约6mg/mL至约18mg/mL的GCGR-GLP-1融合蛋白，(b)约0.2mg/mL至约0.8mg/mL的泊洛沙姆188，(c)约80mg/mL至约100mg/mL的蔗糖，和(d)约3mM至约10mM的三羟甲基氨基甲烷缓冲剂；所述药物组合物的pH为约7.0至约8.0；或
(a)约6mg/mL至约18mg/mL的GCGR-GLP-1融合蛋白，(b)约0.2mg/mL至约0.8mg/mL的泊洛沙姆188，(c)约80mg/mL至约100mg/mL的蔗糖，和(d)约3mM至约10mM的三羟甲基氨基甲烷缓冲剂；所述药物组合物的pH为约7.6至约8.0；或
(a)约12mg/mL至约18mg/mL的GCGR-GLP-1融合蛋白，(b)约0.2mg/mL至约0.8mg/mL的泊洛沙姆188，(c)约80mg/mL至约100mg/mL的蔗糖，和(d)约3mM至约10mM的三羟甲基氨基甲烷缓冲剂；所述药物组合物的pH为约7.6至约8.0；或
(a)约6mg/mL的GCGR-GLP-1融合蛋白，(b)约0.4mg/mL的泊洛沙姆188，(c)约91mg/mL的蔗糖，和(d)约5mM的三羟甲基氨基甲烷-枸橼酸缓冲剂；所述药物组合物的pH为约7.6；或
(a)约18mg/mL的GCGR-GLP-1融合蛋白，(b)约0.4mg/mL的泊洛沙姆188，(c)约91mg/mL的蔗糖，和(d)约5mM的三羟甲基氨基甲烷-枸橼酸缓冲剂；所述药物组合物的pH为约7.6。
本披露所用术语“约”、“大约”是指数值在由本领域一般技术人员所测定的具体值的可接受误差范围内，其取决于怎样测量或测定(即测量体系的限度)，在本披露中，如无特别说明(比如pH的范围)，术语“约”可以表示在其后的具体数值的±10％的范围内，任选地，在其后具体数值的±10％、±9％、±8％、±7％、±6％或±5％的范围内。
前述pH值的“约”优选为±0.2，如约7.6为7.6±0.2。
前述涉及浓度的约最佳为10％，如蔗糖浓度为约91mg/mL，即为91mg/mL±9mg/mL；如约18mg/mL的GCGR-GLP-1融合蛋白，即为18mg/mL±1.8mg/mL；如约5mM的三羟甲基氨基甲烷-枸橼酸缓冲剂，即为5mM±0.5mM；如约0.4mg/mL的泊洛沙姆188，即为0.4mg/mL±0.04mg/mL。
本披露还提供一种制品，其包括容器，该容器中装有如上任一项所述的药物组合物、如上任一项所述的冻干制剂或如上任一项所述的复溶溶液。
在一些实施方案中，本披露还提供如上任一项所述的药物组合物、如上任一项的冻干制剂或如上任一项的复溶溶液在制备用于消除受试者免疫抑制相关疾病的药物中的用途。
本披露还提供一种消除受试者免疫抑制相关疾病的方法，包括给予患者有效量的如上任一项所述的药物组合物、如上任一项的冻干制剂或如上任一项的复溶溶液。
在一些实施方案中，本披露还提供如上任一项所述的药物组合物、如上任一项的冻干制剂或如上任一项的复溶溶液，用作药物。
在一些实施方案中，本披露还提供如上任一项所述的药物组合物、如上任一项的冻干制剂或如上任一项的复溶溶液，其用于治疗代谢障碍的相关疾病。
在一些实施方案中，所述代谢障碍的疾病选自：代谢综合征、肥胖症、葡萄糖耐量受损、糖尿病、糖尿病酮症酸中毒、高血糖症、高血糖高渗综合征、围术期高血糖症、高胰岛素血症、胰岛素抵抗综合症、空腹血糖受损、血脂异常、动脉粥样硬化和糖尿病前期状态。
在一些实施方案中，本披露还提供如上任一项所述的药物组合物、如上任一项的冻干制剂或如上任一项的复溶溶液，其用于治疗GCGR或GLP-1的相关疾病。
在一些实施方案中，所述GCGR或GLP-1相关疾病为代谢障碍，优选地，所述代谢障碍选自：代谢综合征、肥胖症、葡萄糖耐量受损、糖尿病、糖尿病酮症酸中毒、高血糖症、高血糖高渗综合征、围术期高血糖症、高胰岛素血症、胰岛素抵抗综合症、空腹血糖受损、血脂异常、动脉粥样硬化和糖尿病前期状态。
具体实施方式
术语
为了更容易理解本披露，以下具体定义了某些技术和科学术语。除非在本文中另有明确定义，本文使用的所有其它技术和科学术语都具有本披露所属领域的一般技术人员通常理解的含义。
本披露所用氨基酸三字母代码和单字母代码如J.biol.chem，243，p3558(1968)中所述。
术语“双特异性蛋白”指能够与两个目标蛋白或目标抗原结合的蛋白分子。本披露中的双特异性蛋白特指能够结合GCGR和GLP-1R(GLP-1受体)，由GLP-1肽和GCGR抗体(或其抗原结合片段)的多肽链融合后形成的蛋白。
“GLP-1肽”指能结合并激活GLP-1受体的肽。
GPCR(G Protein-Coupled Receptor)，即G蛋白偶联受体，是表达在细胞质膜上的一类跨膜蛋白。GPCR由超过800个成员组成，是目前已知的哺乳动物基因组中最大的膜蛋白家族。在人体内，GPCR蛋白广泛分布于中枢神经系统、免疫系统、心血管、视网膜等器官和组织，参与机体的发育和正常的功能行使。
本披露的术语“抗体”以最广义使用，其涵盖各种抗体结构，包括但不限于单克隆抗体，多克隆抗体，多特异性抗体(例如双特异性抗体)，全长抗体或其抗原结合片段(也称“抗原结合部分”)，鼠源抗体，嵌合抗体或人源化抗体，亲和力成熟的抗体，只要它们展现出期望的抗原结合活性。天然抗体指天然存在的免疫球蛋白分子。例如，天然IgG抗体是约150,000道尔顿的异四聚糖蛋白，由二硫键结合的两条相同轻链和两条相同重链构成。从N至C端，每条重链具有一个可变区(VH)，又称作可变重域或重链可变域，接着是三个恒定域(CH1、CH2和CH3)。类似地，从N至C端，每条轻链具有一个可变区(VL)，又称作可变轻域，或轻链可变域，接着是一个恒定轻(CL)域。“全长抗体”、“完整抗体”和“全抗体”在本文可互换使用，指具有与天然抗体结构基本类似的结构或具有含有如本文所限定的Fc区的重链的抗体。在一些实施方案中，本披露的全长抗体包括由表1、表2和表3中轻重链可变区组合中的轻链可变区与轻链恒定区连接和重链可变区与重链恒定区连接后所形成的全长抗体。本领域技术人员可以根据实际需要选择不同的抗体来源的轻链恒定区、重链恒定区，例如人抗体来源的轻链恒定区和重链恒定区。
“约”是指处于如本领域的普通技术人员所确定的特定值的可接受误差范围之内，其将部分取决于所述值是如何测量或测定的，即所述测量系统的限制。
“缓冲剂”指通过其酸-碱共轭组分的作用而耐受pH变化的缓冲剂。将pH控制在适当范围中的缓冲剂的例子包括三羟甲基氨基甲烷(Tris)、醋酸盐、琥珀酸盐、葡萄糖酸盐、组氨酸盐、草酸盐、乳酸盐、磷酸盐、枸橼酸盐、酒石酸盐、延胡索酸盐、甘氨酰和其它有机酸缓冲剂。
“三羟甲基氨基甲烷缓冲剂”是包含三羟甲基氨基甲烷(Tris)的缓冲剂。三羟甲基氨基甲烷缓冲剂的实例包括三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲剂((Tris-HCl)、三羟甲基氨基甲烷-醋酸缓冲剂(Tris-AA)、三羟甲基氨基甲烷-琥珀酸缓冲剂(Tris-SA)或三羟甲基氨基甲烷-枸橼酸缓冲剂(Tris-CA)等缓冲剂。
“组氨酸盐缓冲剂”是包含组氨酸根离子的缓冲剂。组氨酸盐缓冲剂的实例包括组氨酸-盐酸盐，组氨酸-醋酸盐，组氨酸-磷酸盐，组氨酸-硫酸盐等缓冲剂，优选组氨酸-盐酸盐缓冲剂或组氨酸-醋酸盐缓冲剂，组氨酸-醋酸盐缓冲剂是组氨酸与醋酸配制而成，组氨酸-盐酸盐缓冲剂是组氨酸与组氨酸盐酸盐配制而成，或组氨酸与盐酸配制而成。
“枸橼酸盐缓冲剂”是包括枸橼酸根离子的缓冲剂。枸橼酸盐缓冲剂的实例包括枸橼酸-枸橼酸钠(CA)、枸橼酸-枸橼酸钾、枸橼酸-枸橼酸钙、枸橼酸-枸橼酸镁等。优选的枸橼酸盐缓冲剂是枸橼酸-枸橼酸钠。
“琥珀酸盐缓冲剂”是包括琥珀酸根离子的缓冲剂。琥珀酸盐缓冲剂的实例包括琥珀酸-琥珀酸钠、琥珀酸-琥珀酸钾、琥珀酸-琥珀酸钙盐等。优选的琥珀酸盐缓冲剂是琥珀酸-琥珀酸钠。示例性的，所述的琥珀酸-琥珀酸钠可由琥铂酸与氢氧化钠配制而成，或由琥铂酸与琥珀酸钠配制而成。
“磷酸盐缓冲剂”是包括磷酸根离子的缓冲剂。磷酸盐缓冲剂的实例包括磷酸氢二钠-磷酸二氢钠、磷酸氢二钠-磷酸二氢钾、磷酸-枸橼酸(PB-CA)等。
“醋酸盐缓冲剂”是包括醋酸根离子的缓冲剂。醋酸盐缓冲剂的实例包括醋酸-醋酸钠、醋酸组氨酸盐、醋酸-三羟甲基氨基甲烷缓冲剂(AA-Tris)、醋酸-醋酸钾、醋酸醋酸钙、醋酸-醋酸镁等。优选的醋酸盐缓冲剂是醋酸-醋酸钠缓冲剂。
“稳定剂”是指有助于维持生物制药药物的结构完整性的组分，特别是在冷冻和/或冻干和/或储存期间(特别是当暴露于应激(stress)时)。这种稳定作用可以由于多种原因而产生，通常这种稳定剂可起到减轻蛋白质变性的渗透剂的作用。本文中额外的稳定剂是指除了缓冲体系、表面活性剂和糖醇以外的稳定剂，例如选自PEG、精氨酸和EDTA的稳定剂。
“药物组合物”表示含有一种或多种本文所述抗体与其他化学组分的混合物，所述其他组分例如生理学/可药用的载体和赋形剂。药物组合物的目的是保持活性成分的稳定性，促进对生物体的给药，利于活性成分的吸收进而发挥生物活性。
本披露中，“药物组合物”和“制剂”并不互相排斥。
本披露中所述药物组合物的溶液形式，若无特殊说明，其中的溶剂均为水。
“冻干制剂”表示液体或溶液形式的药物组合物或液体或溶液制剂经真空冷冻干燥步骤之后获得的制剂或药物组合物。
尽管本披露提供了含量范围或含量值，但本领域一般技术人员理解，所述含量范围或含量值涵盖了所测定具体值的可接受误差范围。
本披露所述的药物组合物能够达到一种稳定的效果：其中的抗体在贮藏后基本上保留其物理稳定性和/或化学稳定性和/或生物学活性的药物组合物，优选地，药物组合物在贮藏后基本上保留其物理和化学稳定性以及其生物学活性。贮藏期一般基于药物组合物的预定保存期来选择。目前有多种测量蛋白质稳定性的分析技术，可测量在选定温度贮藏选定时间段后的稳定性。
稳定的制剂是在下述情况下没有观察到显著变化的制剂：在冷藏温度(2-8℃)保存至少3个月、优选6个月、更优选1年，且甚至更优选地多达2年。另外，稳定的液体制剂包括这样的液体制剂：其在包括25℃的温度保存包括1个月、3个月、6个月在内的时段后表现出期望的特征。稳定性的典型的例子：通过SEC-HPLC测得，通常不超过约10％、优选不超过约5％的抗体单体发生聚集或降解。通过视觉分析，制剂是淡黄色近无色澄明液体或者无色澄明液体，或澄清至稍微乳白色。所述制剂的浓度、pH和重量克分子渗透压浓度具有不超过±10％变化。通常观察到不超过约10％、优选不超过约5％的减少。通常形成不超过约10％、优选不超过约5％的聚集。
本披露中无特别说明，振摇条件为25℃，300rpm。反复冻融条件为-35℃至4℃；F/T，5C表示从-35℃至4℃，反复冻融5次。
如果在目检颜色和/或澄清度后，或者通过UV光散射、尺寸排阻色谱法(SEC)和动态光散射(DLS)测得，抗体没有显示出显著的聚集增加、沉淀和/或变性，那么所述抗体在药物制剂中“保留它的物理稳定性”。蛋白构象的变化可以通过荧光光谱法(其确定蛋白三级结构)和通过FTIR光谱法(其确定蛋白二级结构)来评价。
如果抗体没有显示出显著的化学改变，那么所述抗体在药物制剂中“保留它的化学稳定性”。通过检测和定量化学上改变的形式的蛋白，可以评估化学稳定性。经常改变蛋白化学结构的降解过程包括水解或截短(通过诸如尺寸排阻色谱法和CE-SDS等方法来评价)、氧化(通过诸如与质谱法或MALDI/TOF/MS结合的肽谱法等方法来评价)、脱酰胺作用(通过诸如离子交换色谱法、毛细管等电聚焦、肽谱法、异天冬氨酸测量等方法来评价)和异构化(通过测量异天冬氨酸含量、肽谱法等来评价)。
如果抗体在给定时间的生物活性是在制备药物制剂时表现出的生物活性的预定范围内，那么所述抗体在药物制剂中“保留它的生物活性”。
“施用”、“给予”和“处理”，当其应用于动物、人、实验受试者、细胞、组织、器官或生物流体时，是指外源性药物、治疗剂、诊断剂或组合物与动物、人、受试者、细胞、组织、器官或生物流体的接触。“施用”、“给予”和“处理”可以指例如治疗、药物代谢动力学、诊断、研究和实验方法。细胞的处理包括试剂与细胞的接触，以及试剂与流体的接触，其中所述流体与细胞接触。“施用”、“给予”和“处理”还意指通过试剂、诊断、结合组合物或通过另一种细胞体外和离体处理例如细胞。“处理”当其应用于人、兽医学或研究受试者时，是指治疗处理、预防或预防性措施，研究和诊断应用。
“治疗”意指给予患者内用或外用治疗剂，例如包含本披露的任一种的药物组合物，所述患者具有一种或多种疾病症状，而已知所述治疗剂对这些症状具有治疗作用。通常，在受治疗患者或群体中以有效缓解一种或多种疾病症状的量给予治疗剂，以诱导这类症状退化或抑制这类症状发展到任何临床右测量的程度。有效缓解任何具体疾病症状的治疗剂的量(也称作“治疗有效量”)可根据多种因素变化，例如患者的疾病状态、年龄和体重，以及药物在患者产生需要疗效的能力。通过医生或其它专业卫生保健人士通常用于评价该症状的严重性或进展状况的任何临床检测方法，可评价疾病症状是否已被减轻。尽管本披露的实施方案(例如治疗方法或制品)在缓解每个目标疾病症状方面可能无效，但是根据本领域已知的任何统计学检验方法如Student t检验、卡方检验、依据Mann和Whitney的U检验、Kruskal-Wallis检验(H检验)、Jonckheere-Terpstra检验和Wilcoxon检验确定，其在统计学显著数目的患者中应当减轻目标疾病症状。
本披露中与GCGR抗体或与GLP-1肽相关疾病没有限制，只要它是与GCGR或GLP-1相关的疾病即可。
在以上说明书中提出了本披露一种或多种实施方式的细节。虽然可使用与本文所述类似或相同的任何方法和材料来实施或测试本披露，但是以下描述优选的方法和材料。通过说明书和权利要求书，本披露的其他特点、目的和优点将是显而易见的。在说明书和权利要求书中，除非上下文中有清楚的另外指明，单数形式包括复数指代物的情况。除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语都具有本披露所属领域普通技术人员所理解的一般含义。说明书中引用的所有专利和出版物都通过引用纳入。提出以下实施例是为了更全面地说明本披露的优选实施方式。这些实施例不应以任何方式理解为限制本披露的范围。
本披露中所述的双特异性GCGR-GLP-1融合蛋白由GCGR抗体与GLP-1肽融合形成，其制备及活性已在WO2020125744A1中公开；其中示例性的双特异性GCGR-GLP-1融合蛋白hu1803-9D为本披露中所用的融合蛋白，具有4肽结构，包含两条相同的第一链和两条相同第二链。本披露中使用的融合蛋白hu1803-9D序列如下：
hu1803-9D第一链：
HGEGTFTSDVSSYLEEEAAKEFVAWLVKGGGGGGGSGGGGSGGGGSEVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTDYWIEWVRQAPGQGLEWMGEILPGSTYTNYNEKFKGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARGLSTLMAVDYFDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
SEQ ID NO：1
hu1803-9D第二链：
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDISNYLNWYQQKPGKAVKLLIYYSSTLHSGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDFATYYCQQTNIFPWTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC
SED ID NO：2
制剂制备与检测过程中使用的设备及方法如下：
SEC分子排阻色谱法：
根据凝胶孔隙的孔径大小与高分子样品分子的线团尺寸间的相对关系而对溶质进行分离的分析的方法。
SEC％(SEC单体含量百分比)＝A单体/A总×100％(A单体为样品中主峰单体的峰面积，A总为所有峰面积之和)。ΔSEC％＝强制降解实验前制剂的SEC％-强制降解实验后制剂的SEC％。
SEC测定用仪器：安捷伦1260；柱子：waters，XBridgeSEC(300×7.8mm3.5μm)
NR-CE毛细管凝胶电泳：
将凝胶移到毛细管中作为支持介质进行的一种电泳，并在一定的电压下根据样品分子量的大小进行分离的方法。
NR-CE％＝A主峰/A总×100％(A主峰为样品中轻链主峰+重链主峰的峰面积，A总为所有峰面积之和。ΔNR-CE％＝强制降解实验前制剂的NR-CE％-强制降解实验后制剂的NR-CE％。
CE测定用仪器：Beckman型号plus800
截短体％测定：
包含抗体的待测物用去糖还原的方法将抗体去除N端的糖，再用DTT打开轻重链二硫键，还原成轻链和重链，重链包括在N端断裂1个或大于20个氨基酸的重链截短体和未发生氨基酸断裂的重链。本披露中截短体测定中的重链特指融合蛋白第一链。本披露中的HC-N1表示重链N端断裂1个氨基酸的重链截短体，HC->N20表示重链N端断裂大于20个氨基酸的重链截短体，HC-N加和表示在重链N端发生氨基酸断裂的重链截短体的总和。
发生N端氨基酸断裂的重链截短体百分比是通过液相色谱-质谱联用法测量的，基本原理是通过电离源将液相色谱洗脱出的待测物转化为带电离子，然后利用质量分析器的电场将质荷比不同的离子分离，再由离子检测器分别收集探测，并确定离子的质荷比和信号强度。通过待测物离子的质荷比可以确定待测物中各种截短或未截短的重链截短体的分子量，通过待测物离子的信号强度可以对待测物含量进行定量。
截短体％＝R截短体/R总×100％
R截短体为N端有氨基酸断裂的重链截短体的质谱峰响应，R总为所有重链(包括在N端断裂1个或大于20个氨基酸的重链截短体和未发生氨基酸断裂的重链)相关组份的质谱峰响应加和。
截短体％包括HC-N1％，HC->N20％和HC-N加和％。
HC-N1％为N端有1个氨基酸断裂的重链截短体的质谱峰响应与R总的比值。
HC->N20％为N端有大于20个氨基酸断裂的重链截短体的质谱峰响应与R总的比值。
HC-N加和％为N端有1个和有大于20个氨基酸断裂的重链截短体的质谱峰响应与R总的比值。
ΔHC-N％＝稳定性实验后制剂的HC-N加和％-稳定性实验前制剂的HC-N加和％。
液相色谱-质谱联用法仪器：Waters型号BioAccord。
渗透压测定：
冰点法测定渗透压，以冰点下降值与溶液的摩尔浓度成正比例关系为基础，采用高灵敏度感温元件，测定溶液结冰点，通过电量转化为渗透压。
仪器厂家罗泽Loser，型号OM815。
融合蛋白浓度测定：
以下实施例所采用的融合蛋白为hu1803-9D。融合蛋白的浓度采用蛋白浓度计。蛋白浓度测定仪器：紫外可见分光光度计，型号：Nano Drop oneC。
实施例1制剂pH值与缓冲体系的筛选
采用以下不同缓冲体系，制备含有6mg/mL融合蛋白hu1803-9D，0.1mg/mL聚山梨酯80的GCGR-GLP1融合蛋白制剂。
制备完成的制剂无菌过滤，灌装，加塞，轧盖。将样品进行高温稳定性(40℃)研究，以外观、SEC、非还原CE(NR-CE)、截短体为评价指标，考察制剂稳定性。缓冲体系信息，筛选条件及结果如下：
1)在40℃放置2天的结果见表1：
表1.pH值和缓冲体系筛选截短体数据
缓冲体系 HC-N加和％ HC->N20％ HC-N1％
10mM AA-Tris，pH 6.0 45.4 2.6 42.8
10mM Tris-HCl，pH 7.0 20.6 3.1 17.5
10mM Tris-HCl，pH 7.4 13.2 3.1 10.1
10mM Tris-HCl，pH 7.8 8.3 3.0 5.3
结果显示，pH越高截短体越少，pH<7.0时截短体过高，因此，融合蛋白制剂的缓冲液pH应大于7.0。
2)在40℃放置1个月的结果见表2：
表2.pH值和缓冲体系筛选外观、SEC与NR-CE数据
注：“+”表示颗粒多少程度，“+”越多表示颗粒越多。△SEC％表示放置后SEC下降幅度。△NR-CE％同理。
SEC/CE结果显示，PB/PB-CA体系较差。
实施例2pH值及缓冲体系优化
采用以下不同缓冲体系(pH 7.4-8.0)，制备含有6mg/mL融合蛋白hu1803-9D，0.4mg/mL聚山梨酯80(PS80)的制剂。
制备完的制剂无菌过滤，灌装，加塞，轧盖。将样品进行高温稳定性(40℃)研究，以SEC、NR-CE和截短体为评价指标。缓冲体系信息，筛选条件及结果如下：
1)在40℃，1个月的条件下，进行pH值和缓冲体系筛选，结果见表3：
表3.pH值及缓冲体系优化SEC与NR-CE数据
缓冲体系 △SEC％ △NR-CE％
10mM Tris-CA pH7.4 3.8 2.9
10mM Tris-CA pH7.8 5.9 3.1
10mM Tris-SA pH7.8 5.5 3.6
10mM PB-CA pH7.8 6.8 5
5mM Tris-CA pH7.8 5.5 3.5
SEC和NR-CE结果显示，融合蛋白在Tris-CA、Tris-SA缓冲体系中的稳定性优于在PB-CA缓冲液中的稳定性。
2)在40℃，5天的条件下，进行pH值和缓冲体系筛选，结果见表4：
表4.pH及缓冲体系优化截短体数据
缓冲体系 HC-N加和％ HC->N20％ HC-N1％
10mM Tris-CA pH7.4 17.7 2.4 15.3
10mM Tris-CA pH7.8 8.8 2.6 6.2
10mM Tris-CA pH8.0 6.5 2.5 4.0
10mM Tris-SA pH7.8 7.3 2.5 4.8
5mM Tris-CA pH7.8 4.4 2.5 1.9
结论：结果显示，pH越高截短体越少；在相同pH条件下，融合蛋白在5mM的Tris-CA缓冲液中，更不容易发生断裂。
实施例3pH及缓冲体系确定
选择以下不同缓冲液，制备含6mg/mL融合蛋白hu1803-9D的制剂，其中编号2-8号含有0.1mg/mL PS80，9-12号含有0.4mg/mL PS80。1号为原液。2-12样品均采用该原液制备。
制备完的制剂无菌过滤，灌装，加塞，轧盖。将样品进行长期稳定性(4℃)研究，以截短体为评价指标。缓冲体系及筛选结果见表5。
表5.pH及缓冲体系筛选截短体数据
注：M表示1个月(30天)，M5表示5个月，其余类推。△HC-N％表示放置后截短体增加幅度。
长期稳定性结果显示，融合蛋白在CA pH 7.0体系中的稳定性较差，容易发生断裂。但在pH 7.0-8.0的Tris-HCl缓冲体系中，融合蛋白发生断裂的比例明显减少。且融合蛋白的稳定性在不同Tris缓冲液中，即Tris-HCl/Tris-AA/Tris-CA间差异不大。因此，融合蛋白的缓冲液可选Tris-HCl、Tris-AA或Tris-CA，pH 7.0-8.0，优选pH 7.2-8.0。
实施例4辅料筛选
采用5mM Tris-CA(pH 7.8)的缓冲体系，制备含6mg/mL融合蛋白hu1803-9D，0.2mg/mL PS80和不同辅料的GCGR-GLP1融合蛋白制剂。
制备完的制剂无菌过滤，灌装，加塞，轧盖。将样品进行高温(40℃)、振摇(25℃，300rpm)或反复冻融5次(F/T，5C，即-35℃至4℃，5个循环)的稳定性研究，以SEC、NR-CE和截短体为评价指标。辅料筛选的处方信息及筛选结果见表6、表7。
表6.辅料筛选的SEC和NR-CE数据
结果显示，蔗糖、海藻糖、山梨醇对融合蛋白的SEC和CE影响较小，蔗糖振摇稳定性略优于海藻糖、山梨醇，而甘露醇、Arg-HCl和NaCl对融合蛋白的化学稳定性影响较大。
表7.辅料筛选截短体数据
/>
结果显示，蔗糖可以降低制剂中截短体的含量，可以减少融合蛋白的断裂。因此，优选处方中优选蔗糖来提高融合蛋白稳定性。
实施例5糖浓度确定
为开发皮下制剂，减少注射刺激性，对糖浓度进行筛选以保证制剂等渗。采用6mg/mL融合蛋白hu1803-9D，5mM Tris-CA pH 7.6处方，制备含不同蔗糖浓度的抗GCGR-GLP1抗体制剂，测定渗透压，蔗糖浓度和渗透压结果见表8。
表8.蔗糖浓度和测定的渗透压数据
编号 蔗糖浓度(mg/mL) 渗透压(mosm)
1 80 280
2 91 299
3 100 320
渗透压数据显示，蔗糖浓度为80到100mg/mL时，渗透压范围约为280到320mosm，符合临床对注射液渗透压的要求。
实施例6表面活性剂种类筛选
采用6mg/mL融合蛋白hu1803-9D，5mM Tris-CA pH 7.8，47mg/mL甘露醇处方，制备含有不同表面活性剂的CGR-GLP1融合蛋白制剂。
制备完的制剂无菌过滤，灌装，加塞，轧盖。将样品进行25℃、4℃及振摇稳定性研究，以外观，SEC为评价指标。表面活性剂信息及筛选结果见表9，10。
表9.表面活性剂筛选SEC数据
编号 表面活性剂 条件 △SEC％
1 0.2mg/mL PS80(聚山梨酯80) 振摇D16 3.7
2 0.2mg/mL PS20(聚山梨酯20) 振摇D16 0.5
3 0.2mg/mL PF68(泊洛沙姆188) 振摇D16 -0.2
表10.表面活性剂筛选外观数据
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振摇结果显示，PS80组SEC较差，PS20与PF68组较优，两组间无显著差异。在4℃及25℃放置过程中，PS20/80组均出现颗粒，仅PF68组外观澄明。因此，表面活性剂优选PF68。
实施例7表面活性剂种类优化
采用6mg/mL融合蛋白hu1803-9D，5mM Tris-CA(pH 7.6)，91mg/mL蔗糖处方，制备含有不同表面活性剂的GCGR-GLP1融合蛋白制剂。
制备完的制剂无菌过滤，灌装，加塞，轧盖。将样品进行高温(40℃)、振摇(25℃，300rpm)和4℃稳定性研究，以外观、SEC、NR-CE、截短体为评价指标。表面活性剂信息及筛选结果见表11，12。
表11.表面活性剂种类筛选外观，SEC，NR-CE数据
表12.表面活性剂种类筛选外观和截短体数据
结果显示，经过PS80组外观较差，PF68组外观较优。SEC、NR-CE、截短体检测项组间无显著差异。因此表面活性剂优选PF68。
实施例8表面活性剂浓度筛选
采用6mg/mL融合蛋白hu1803-9D，5mM Tris-CA pH 7.6，91mg/mL蔗糖处方，制备含有不同浓度PF68的GCGR-GLP1融合蛋白制剂。
制备完的制剂无菌过滤，灌装，加塞，轧盖。将样品进行高温(40℃)稳定性研究，以外观、SEC、NR-CE为评价指标。表面活性剂浓度信息及筛选结果见表13。
表13.表面活性剂浓度筛选外观，SEC和NR-CE数据
编号 表面活性剂 条件 △SEC％ △NR-CE％
1 PF68 0.4mg/mL 40℃-M1 0.8 2.2
2 PF68 0.8mg/mL 40℃-M1 0.8 2.6
3 PF68 1.2mg/mL 40℃-M1 0.8 4.7
结果显示，1.2mg/mL PF68组NR-CE纯度下降幅度较大，0.4-0.8mg/mL的PF68组蛋白更加稳定。因此，PF68浓度优选0.4-0.8mg/mL。
实施例9融合蛋白浓度筛选
采用5mM CA(pH 7.0)，80mg/mL蔗糖，0.4mg/mL PS80处方，制备不同融合蛋白hu1803-9D浓度的GCGR-GLP1融合蛋白制剂。
制备完的制剂无菌过滤，灌装，加塞，轧盖。将样品进行高温(40℃)稳定性研究，以SEC和NR-CE为评价指标。融合蛋白浓度信息及筛选结果见表14。
表14.融合蛋白浓度筛选SEC和NR-CE数据
编号 蛋白浓度 条件 △SEC％ △NR-CE％
1 6mg/mL 40℃-M1 2.0 3.8
2 1.5mg/mL 40℃-M1 2.4 4.1
结果显示1.5-6mg/mL蛋白浓度制剂组间无差异。
实施例10融合蛋白浓度优化
采用5mM Tris-CA(pH 7.6)，91mg/mL蔗糖，0.4mg/mL PF68处方，制备含有不同融合蛋白hu1803-9D浓度的GCGR-GLP1融合蛋白制剂。
制备完的制剂无菌过滤，灌装，加塞，轧盖。将样品进行高温(40℃)、振摇(25℃，300rpm)和4度稳定性研究，以外观，SEC、NR-CE、截短体为评价指标。6-12mg/mL蛋白浓度筛选结果见表15和表16。12-36mg/mL蛋白浓度筛选结果见表17和表18。
表15.蛋白浓度筛选外观，SEC，NR-CE数据
表16.蛋白浓度筛选截短体数据
结果显示，外观，SEC、NR-CE检测项组间无差异。N/A代表未检测。截短体数据显示，虽然40℃-D10时蛋白浓度6mg/mL数据较优，但从长期稳定性4℃-M3的数据来看，蛋白浓度6mg/mL和12mg/mL数据无差异，因此蛋白浓度6mg/mL到12mg/mL，均比较稳定。
表17.融合蛋白浓度筛选外观，SEC，NR-CE数据
表18.融合蛋白浓度筛选截短体数据
结果显示，外观、SEC、NR-CE检测项组间无差异。截短体数据显示12-18mg/mL略优，但12-24mg/mL降幅均在可接受范围，36mg/mL降幅略大，因此蛋白浓度12-24mg/mL均比较稳定，12-18mg/mL更优。
综合实施例9、10，蛋白浓度1.5-24mg/mL制剂稳定性均较好，1.5-18mg/mL更优。
实施例11缓冲体系种类的优化
采用91mg/mL蔗糖，0.4mg/mL PF68处方，制备含有不同浓度融合蛋白hu1803-9D及不同缓冲体系的GCGR-GLP1融合蛋白制剂。
制备完的制剂无菌过滤，灌装，加塞，轧盖。将样品进行长期(4℃)或40℃加速稳定性研究，以外观、SEC、NR-CE、截短体为评价指标。缓冲体系信息及筛选结果见表19，20。
表19.缓冲体系种类筛选SEC，NR-CE和截短体数据
结论：4℃M3 SEC、NR-CE、截短体组间无显著差异。缓冲体系Tris-HCl及Tris-CApH7.6稳定性均较好。
表20.缓冲体系种类筛选外观和截短体数据
结论：40℃-D10外观及截短体组间无显著差异。缓冲体系Tris-HCl及Tris-CApH7.6稳定性均较好。
综上所述，蛋白浓度在6-18mg/mL时，缓冲体系Tris-HCl及Tris-CA pH7.6稳定性均较好。
实施例12缓冲体系离子强度优化
采用6mg/mL融合蛋白hu1803-9D，0.4mg/mL PF68处方，制备不同离子强度的Tris-CA(pH 7.6)的GCGR-GLP1融合蛋白制剂。
制备完的制剂无菌过滤，灌装，加塞，轧盖。将样品进行长期(4℃)稳定性研究，以外观、SEC、NR-CE和截短体为评价指标。缓冲体系离子强度信息及筛选结果见表21。
表21.缓冲体系离子强度筛选SEC，NR-CE和截短体数据
结果显示，4℃M3 SEC、NR-CE、截短体组间无显著差异。因此Tris-CA离子强度3-5mM均比较稳定。
实施例13制剂稳定性确认
制备含有6mg/mL融合蛋白hu1803-9D，5mM Tris-CA(pH7.6)，91mg/mL蔗糖，0.4mg/mL PF68的GCGR-GLP1融合蛋白制剂终处方。
制备完的制剂无菌过滤，灌装，加塞，轧盖。将样品进行40℃、光照及振摇(25℃，300rpm)稳定性研究，以外观，SEC，NR-CE和截短体为评价指标。结果见表22。
表22.终处方稳定性外观，SEC，NR-CE和截短体数据
结果显示：振摇/光照/冻融条件下处方稳定性良好，40℃高温处理HC-N1截短体增多，但在可接受范围内，处方稳定性较好。
实施例14制剂外观稳定性确认
采用6mg/mL融合蛋白hu1803-9D，91mg/mL蔗糖，0.4mg/mL PF68的处方，制备含有不同缓冲体系的抗GCGR-GLP1抗体制剂。
制备完的制剂无菌过滤，灌装，加塞，轧盖。将样品进行长期稳定性(4℃-M4)研究，以外观为评价指标。结果见表23。
表23.缓冲体系外观数据
结果显示，所有处方外观均澄明，说明融合蛋白在Tris缓冲体系中的稳定性较好。

Claims (17)

1.一种药物组合物，包含GCGR-GLP-1融合蛋白和缓冲剂，其中：
所述GCGR-GLP-1融合蛋白包含SEQ ID NO：1的第一链和SEQ ID NO：2的第二链；
所述缓冲剂为三羟甲基氨基甲烷缓冲剂，且所述药物组合物的pH为约7.0至约8.0。
2.根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述的缓冲剂选自三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲剂、三羟甲基氨基甲烷-醋酸缓冲剂和三羟甲基氨基甲烷-枸橼酸缓冲剂；优选地，所述的缓冲剂为三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲剂和三羟甲基氨基甲烷-枸橼酸缓冲剂；更优选地，所述的缓冲剂为三羟甲基氨基甲烷-枸橼酸缓冲剂。
3.根据权利要求1或2所述的药物组合物，其中所述药物组合物的pH为约7.4至约7.8，优选pH为约7.6。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的药物组合物，其中所述GCGR-GLP-1融合蛋白的浓度为约1mg/mL至约48mg/mL，优选为约1.5mg/mL至约36mg/mL，更优选为约6mg/mL至约24mg/mL，最优选为约6mg/mL或约18mg/mL。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的药物组合物，其中所述药物组合物还包含表面活性剂，所述表面活性剂优选为聚山梨酯或泊洛沙姆，更优选为聚山梨酯80或泊洛沙姆188，最优选为泊洛沙姆188。
6.根据权利要求5所述的药物组合物，其中所述表面活性剂的浓度为约0.05mg/mL至约1.2mg/mL，优选为约0.2mg/mL至约0.8mg/mL，更优选为约0.4mg/mL。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的药物组合物，其中所述药物组合物还包含糖，所述糖选自蔗糖、山梨醇和海藻糖中的一种或多种，优选为蔗糖。
8.根据权利要求7所述的药物组合物，其中所述糖的浓度为约60mg/mL至约120mg/mL，优选为约80mg/mL至约100mg/mL，更优选为约91mg/mL。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的药物组合物，其中所述缓冲剂的浓度为约0.5mM至约30mM，优选为约3mM至约10mM，更优选为约5mM。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的药物组合物，其包含如下组分：
(a)约1.5mg/mL至约24mg/mL的GCGR-GLP-1融合蛋白，(b)约0.2mg/mL至约0.8mg/mL的泊洛沙姆188，(c)约80mg/mL至约100mg/mL的蔗糖，和(d)约3mM至约10mM的三羟甲基氨基甲烷缓冲剂；所述药物组合物的pH为约7.0至约8.0；或
(a)约6mg/mL至约24mg/mL的GCGR-GLP-1融合蛋白，(b)约0.2mg/mL至约0.8mg/mL的泊洛沙姆188，(c)约80mg/mL至约100mg/mL的蔗糖，和(d)约3mM至约10mM的三羟甲基氨基甲烷缓冲剂；所述药物组合物的pH为约7.0至约8.0；或
(a)约6mg/mL至约18mg/mL的GCGR-GLP-1融合蛋白，(b)约0.2mg/mL至约0.8mg/mL的泊洛沙姆188，(c)约80mg/mL至约100mg/mL的蔗糖，和(d)约3mM至约10mM的三羟甲基氨基甲烷缓冲剂；所述药物组合物的pH为约7.0至约8.0；或
(a)约6mg/mL的GCGR-GLP-1融合蛋白，(b)约0.4mg/mL的泊洛沙姆188，(c)约91mg/mL的蔗糖，和(d)约5mM的三羟甲基氨基甲烷-枸橼酸缓冲剂；所述药物组合物的pH为约7.6；或
(a)约18mg/mL的GCGR-GLP-1融合蛋白，(b)约0.4mg/mL的泊洛沙姆188，(c)约91mg/mL的蔗糖，和(d)约5mM的三羟甲基氨基甲烷-枸橼酸缓冲剂；所述药物组合物的pH为约7.6。
11.一种冻干制剂，所述冻干制剂复溶后可形成权利要求1至10中任一项所述的药物组合物。
12.一种冻干制剂，所述制剂通过将权利要求1至10中任一项所述的药物组合物冷冻干燥获得。
13.一种制备冻干制剂的方法，其包括将权利要求1至10中任一项所述的药物组合物进行冷冻干燥的步骤。
14.一种复溶溶液，所述复溶溶液是通过将权利要求11或12所述的冻干制剂复溶制备获得；
优选地，所述复溶溶液包含如下组分：
(a)约1.5mg/mL至约24mg/mL的GCGR-GLP-1融合蛋白，(b)约0.2mg/mL至约0.8mg/mL的泊洛沙姆188，(c)约80mg/mL至约100mg/mL的蔗糖，和(d)约3mM至约10mM的三羟甲基氨基甲烷缓冲剂；所述药物组合物的pH为约7.0至约8.0；或
(a)约6mg/mL至约24mg/mL的GCGR-GLP-1融合蛋白，(b)约0.2mg/mL至约0.8mg/mL的泊洛沙姆188，(c)约80mg/mL至约100mg/mL的蔗糖，和(d)约3mM至约10mM的三羟甲基氨基甲烷缓冲剂；所述药物组合物的pH为约7.0至约8.0；或
(a)约6mg/mL至约18mg/mL的GCGR-GLP-1融合蛋白，(b)约0.2mg/mL至约0.8mg/mL的泊洛沙姆188，(c)约80mg/mL至约100mg/mL的蔗糖，和(d)约3mM至约10mM的三羟甲基氨基甲烷缓冲剂；所述药物组合物的pH为约7.0至约8.0；或
(a)约6mg/mL的GCGR-GLP-1融合蛋白，(b)约0.4mg/mL的泊洛沙姆188，(c)约91mg/mL的蔗糖，和(d)约5mM的三羟甲基氨基甲烷-枸橼酸缓冲剂；所述药物组合物的pH为约7.6；或
(a)约18mg/mL的GCGR-GLP-1融合蛋白，(b)约0.4mg/mL的泊洛沙姆188，(c)约91mg/mL的蔗糖，和(d)约5mM的三羟甲基氨基甲烷-枸橼酸缓冲剂；所述药物组合物的pH为约7.6。
15.一种制品，其包括容器，该容器中装有如权利要求1至10中任一项所述的药物组合物，或权利要求11或12所述的冻干制剂，或权利要求14所述的复溶溶液。
16.一种治疗代谢障碍的疾病的方法，所述方法包括给予受试者有效量的权利要求1至10中任一项所述的药物组合物，或权利要求11或12所述的冻干制剂，或权利要求14所述的复溶溶液；优选地，所述代谢障碍的疾病选自：代谢综合征、肥胖症、葡萄糖耐量受损、糖尿病、糖尿病酮症酸中毒、高血糖症、高血糖高渗综合征、围术期高血糖症、高胰岛素血症、胰岛素抵抗综合症、空腹血糖受损、血脂异常、动脉粥样硬化和糖尿病前期状态。
17.一种治疗GCGR或GLP-1相关疾病的方法，所述方法包括给予受试者有效量的权利要求1至10中任一项所述的药物组合物，或权利要求11或12所述的冻干制剂，或权利要求14所述的复溶溶液；优选地，所述GCGR或GLP-1相关疾病为代谢障碍；更优选地，所述代谢障碍选自：代谢综合征、肥胖症、葡萄糖耐量受损、糖尿病、糖尿病酮症酸中毒、高血糖症、高血糖高渗综合征、围术期高血糖症、高胰岛素血症、胰岛素抵抗综合症、空腹血糖受损、血脂异常、动脉粥样硬化和糖尿病前期状态。
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