CN117257936A - 一种阿达木单抗组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明属于药学领域，提供一种阿达木单抗组合物，所述组合物使用天冬氨酸作为缓冲体系。本发明的阿达木药物组合物的物理和化学稳定性高，能够长期地稳定存储。

Description

一种阿达木单抗组合物
技术领域
本发明属于药学领域，具体涉及阿达木单抗组合物。
背景技术
阿达木单抗(adalimumab,CAS#331731-18-1)是一种全人源单克隆抗体，它通过特异性结合人体内的TNF-α，阻止TNF-α与其细胞表面受体结合，从而阻断了TNF-α的生物学活性，达到减轻炎症反应并减少破骨细胞激活，最终达到控制并缓解症状的目的。它可用于治疗类风湿性关节炎、银屑病、强制性脊柱炎、溃疡性结肠炎和克罗恩氏病等。
然而，阿达木单抗与其它单克隆抗体药物一样，稳定性较差。它会发生多种化学和物理降解，尤其是高级结构非常脆弱，容易发生结构变化，如变性、聚集和沉淀等。这些降解或不稳定的产物会对生物制药的安全性产生很大的影响。特别是一些蛋白聚集物会激发人体的免疫反应，轻者会降低生物药物的疗效，重者甚至会造成病人的死亡。因此，多聚体被认为是生物制药安全性的关键质量属性(CQA)，直接影响到阿达木单抗的用药安全。抗体药物不仅仅需要在生产的时候能得到高纯度的产品，还要在运输、储存和使用过程中保持结构稳定，这对于长期用药的产品如阿达木单抗尤为重要。
艾伯维公司原研上市阿达木单抗制剂为水针制剂，含有阿达木单抗50mg/mL，氯化钠6.16mg/mL，枸橼酸钠0.35mg/mL，枸橼酸1.3mg/mL，二水磷酸二氢钠0.86mg/mL，二水磷酸氢二钠1.53mg/mL，甘露醇12mg/mL，聚山梨醇酯80 1mg/mL，溶液pH 5.2。其中，阿达木单抗为有效成分，氯化钠为渗透压调节剂，枸橼酸盐和磷酸盐为缓冲剂，甘露醇为结构稳定性，聚山梨醇酯80为表面活性剂。
CN201080030083.9公开了一种不含氯化钠而含有高浓度(>20mg/ml)多元醇如甘露醇的阿达木单抗药物制剂，该制剂相比已上市的制剂在高温条件下具有更高的稳定性。但上述配方中缓冲体系较复杂，由两种缓冲液组成，制备不方便；若含有枸橼酸盐，可引起病人注射部位的注射疼痛感，降低病人的用药舒适度。
CN201310611288.1公开了一种稳定的阿达木组合物，其采用的缓冲溶液为0.8-6.2mg/ml组氨酸。但公开的制剂配方中含有NaCl作为渗透压调节剂，可能出现如沉淀和凝胶化的问题(KCl也存在此问题)。
因此，开发一种新型的阿达木抗体制剂以提高阿达木抗体的稳定性，从而提高产品质量的均一性和一致性，以及提高使用稳定性仍很有必要。
发明内容
发明人经过反复的实验研究，对各类缓冲体系的组分和含量进行了大量的筛选后惊喜的发现，在含有阿达木单抗的药物组合物中，使用天冬氨酸缓冲体系可大大提高阿达木药物组合物的稳定性，具有非常广阔的市场应用前景。
因此，本发明提供一种阿达木单抗组合物，包括阿达木单抗和缓冲剂，其中，所述缓冲剂为天冬氨酸。
在优选实施方案中，所述组合物还包括稳定剂和表面活性剂。
在优选实施方案中，所述组合物为液体制剂。
在优选实施方案中，所述组合物中，阿达木单抗的浓度为5～100mg/mL，例如20mg/mL至100mg/mL、50mg/mL至100mg/mL、60mg/mL至100mg/mL、70mg/mL至100mg/mL、80mg/mL至100mg/mL、10mg/mL至90mg/mL、20mg/mL至80mg/mL、30mg/mL至50mg/mL；一些具体实施方案中，所述阿达木单抗的浓度为约10mg/mL、约20mg/mL、约30mg/mL、约50mg/mL、约60mg/mL、约65mg/mL、约70mg/mL、约75mg/mL、约80mg/mL、约85mg/mL、约90mg/mL、约95mg/mL、约100mg/mL或任意两数值间任意值。优选为5mg/mL、50mg/mL或100mg/mL。
在优选实施方案中，天冬氨酸的浓度为5～20mM，例如5mM至15mM、5mM至10mM、10mM至15mM、8mM至12mM；一些具体实施方案中，所述缓冲剂的浓度为约5mM、约6mM、约7mM、约8mM、约9mM、约10mM、约11mM、约12mM、约13mM、约14mM、约15mM、约18mM、约20mM或任意两数值间任意值；优选为5mM、10mM或20mM。
在优选实施方案中，所述稳定剂为蔗糖、二水海藻糖或甘露醇；优选地，所述稳定剂的浓度为43～91mg/ml；例如45mg/mL至91mg/mL、50mg/mL至91mg/mL、60mg/mL至83mg/mL、70mg/mL至90mg/mL、70mg/mL至80mg/mL、43mg/mL至60mg/mL；一些具体实施方案中，所述稳定剂的浓度为约83mg/mL、约97.3mg/mL、约43.7mg/mL、或任意两数值间任意值。优选为83mg/mL蔗糖、90.7mg/mL二水海藻糖或43.7mg/mL甘露醇。
在优选实施方案中，所述表面活性剂为聚山梨酯80；优选地，所述聚山梨酯80的浓度为0.8mg/mL～2mg/mL，例如0.8mg/mL至1.5mg/mL、0.8mg/mL至1.2mg/mL、0.8mg/mL至1mg/mL。优选为1mg/mL。
在优选实施方式中，所述组合物的pH值为4.8～5.6，例如4.8至5.5、4.8至5.4、4.8至5.2、5.2至5.6；一些具体实施方案中，所述缓冲剂的pH值为约4.8、约4.9、约5.0、约5.1、约5.2、约5.3、约5.4、约5.5、约5.6；优选为4.8、5.2或5.6。
在优选实施方案中，所述组合物包含：5mg/mL～100mg/mL阿达木单抗、80mg/mL～90mg/mL蔗糖、0.8mg/mL～2mg/mL聚山梨酯80和5mM～20mM天冬氨酸，pH值为4.8～5.6。
在优选实施方案中，所述组合物包含：5mg/mL～100mg/mL阿达木单抗、83mg/mL蔗糖、0.8mg/mL～2mg/mL聚山梨酯80和5mM～20mM天冬氨酸，pH值为4.8～5.6。
在优选实施方案中，所述组合物包含：5mg/mL～100mg/mL阿达木单抗、83mg/mL蔗糖、1mg/mL聚山梨酯80和5mM～20mM天冬氨酸，pH值为4.8～5.6。
在具体实施方式中，所述组合物为以下中的任一种：
(1)50mg/mL阿达木单抗、83mg/mL蔗糖、1mg/mL聚山梨酯80和20mM天冬氨酸，pH值为5.2；
(2)5mg/mL阿达木单抗、83mg/mL蔗糖、1mg/mL聚山梨酯80和20mM天冬氨酸，pH值为5.2；
(3)5mg/mL阿达木单抗、83mg/mL蔗糖、1mg/mL聚山梨酯80和20mM天冬氨酸，pH值为4.8；
(4)5mg/mL阿达木单抗、83mg/mL蔗糖、1mg/mL聚山梨酯80和20mM天冬氨酸，pH值为5.6；
(5)5mg/mL阿达木单抗、83mg/mL蔗糖、1mg/mL聚山梨酯80和5mM天冬氨酸，pH值为5.2；
(6)5mg/mL阿达木单抗、83mg/mL蔗糖、1mg/mL聚山梨酯80和10mM天冬氨酸，pH值为5.2；
(7)100mg/mL阿达木单抗、83mg/mL蔗糖、1mg/mL聚山梨酯80和20mM天冬氨酸，pH值为5.2；
(8)5mg/mL阿达木单抗、90.7mg/mL二水海藻糖、1mg/mL聚山梨酯80和20mM天冬氨酸，pH值为5.2；
(9)5mg/mL阿达木单抗、43.7mg/mL甘露醇、1mg/mL聚山梨酯80和20mM天冬氨酸，pH值为5.2。
在第二个方面，提供一种含阿达木单抗的冻干制剂，所述冻干制剂通过将本文上述的组合物经冷冻干燥获得。
在第三个方面，提供天冬氨酸作为缓冲剂在制备如本发明所述的阿达木单抗组合物或含阿达木单抗的冻干制剂中的应用。
在第四个方面，提供本发明的组合物的制备方法，包括按照组合物的配方，准确称量各种组分，以注射用水配制，并调节pH值。
在第五个方面，提供本发明的阿达木单抗组合物或含阿达木单抗的冻干制剂在制备用于治疗炎症疾病的药物中的用途。在一些实施方案中，所述炎症疾病选自类风湿关节炎、强直性脊柱炎、银屑病、银屑病关节炎、幼年特发性关节炎、克罗恩病、溃疡性结肠炎、化脓性汗腺炎和葡萄膜炎。
在第六个方面，还提供一种治疗和/或预防炎症疾病的方法，包括给予有需要的受试者治疗和/或预防有效量的前述的阿达木单抗组合物或冻干制剂或冻干制剂的复溶溶液。一些实施方案中，所述受试者为人类受试者。
在第七个方面，本发明的阿达木单抗组合物可用作药物。在一些实施方案中，用作治疗炎症疾病的药物。
在本发明中，所述阿达木单抗包括轻链和重链，轻链氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，重链氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。本发明中所述的冻干制剂的制备和复溶都是本领域常规技术。
本发明通过选用天冬氨酸缓冲体系，大大提高了阿达木药物组合物的物理和化学稳定性，尤其是在高温和光照条件下的稳定性，使制得的阿达木组合物能够稳定地长期存储。
附图说明
图1为3种制剂处方0时DSC实验Tonset对比图；
图2为3种制剂处方0时DSC实验Tm1对比图。
具体实施方式
以下将通过具体实施方式说明本发明的内容。如无其它说明，本发明中使用的仪器和试剂都是常规仪器和试剂，可以通过商购方式获得；所使用的方法为常规技术方法，本领域技术人员根据实施例记载的内容可以毫无疑问地知道如何实施本发明内容并获得相应的结果。
术语“包含”涵盖了“包括”以及“由……组成”的含义，例如“包含”X的组合物可仅由X组成，也可包括一些其他成分，例如X+Y。
“组合物”表示含有一种或多种本文所述化合物或其生理学上/可药用的盐或前体药物与其他化学组分的混合物，所述其他组分例如生理学/可药用的载体和赋形剂。药物组合物的目的是促进对生物体的给药，利于活性成分的吸收进而发挥生物活性。本文中，“药物组合物”、“组合物”、“制剂”和“处方”可以互换使用。本文中所述药物组合物的溶液形式，若无特殊说明，其中的溶剂均为水。
“缓冲剂”指通过其酸-碱共轭组分的作用而耐受pH变化的物质。用于本文公开组合物的合适缓冲试剂包括但不限于组氨酸缓冲液、柠檬酸盐缓冲液、磷酸盐[例如钠或钾]缓冲液、琥珀酸盐[例如钠]缓冲液、乙酸盐缓冲液、Tris缓冲液、甘氨酸、精氨酸、天冬氨酸及其组合。优选的缓冲剂是天冬氨酸。
适用于本文公开组合物的表面活性剂包括但不限于非离子型表面活性剂、离子型表面活性剂、两性离子表面活性剂及其组合。用于本发明的典型表面活性剂包括但不限于山梨聚糖脂肪酸酯(例如山梨聚糖单辛酸酯、山梨聚糖单月桂酸酯、山梨聚糖单棕榈酸酯)，山梨聚糖三油酸酯，甘油脂肪酸酯(例如甘油单辛酸酯、甘油单肉豆蔻酸酯、甘油单硬脂酸酯)，聚甘油脂肪酸酯(例如十甘油基单硬脂酸酯、十甘油基二硬脂酸酯、十甘油基单亚油酸酯)，聚氧乙烯山梨聚糖脂肪酸酯(例如聚氧乙烯山梨聚糖单月桂酸酯、聚氧乙烯山梨聚糖单油酸酯、聚氧乙烯山梨聚糖单硬脂酸酯、聚氧乙烯山梨聚糖单棕榈酸酯、聚氧乙烯山梨聚糖三油酸酯、聚氧乙烯山梨聚糖三硬脂酸酯)，聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯(例如聚氧乙烯山梨醇四硬脂酸酯、聚氧乙烯山梨醇四油酸酯)，聚氧乙烯甘油脂肪酸酯(例如聚氧乙烯甘油基单硬脂酸酯)，聚乙烯乙二醇脂肪酸酯(例如聚乙烯乙二醇二硬脂酸酯)，聚氧乙烯烷基醚(例如聚氧乙烯月桂基醚)，聚氧乙烯聚氧丙烯烷基醚(例如聚氧乙烯聚氧丙烯乙二醇、聚氧乙烯聚氧丙烯丙基醚、聚氧乙烯聚氧丙烯鲸蜡基醚)，聚氧乙烯烷基苯基醚(例如聚氧乙烯壬基苯基醚)，聚氧乙烯氢化蓖麻油(例如聚氧乙烯蓖麻油、聚氧乙烯氢化蓖麻油)，聚氧乙烯蜂蜡衍生物(例如聚氧乙烯山梨醇蜂蜡)，聚氧乙烯羊毛脂衍生物(例如聚氧乙烯羊毛脂)，和聚氧乙烯脂肪酸酰胺(例如聚氧乙烯硬脂酸酰胺)；C10-C18烷基硫酸盐(例如鲸蜡基硫酸钠、月桂基硫酸钠、油烯基硫酸钠)，具有平均添加2至4摩尔环氧乙烷单元的聚氧乙烯C10-C18烷基醚硫酸盐(例如聚氧乙烯月桂基硫酸钠)，和C1-C18烷基磺基琥珀酸酯盐(例如月桂基磺基琥珀酸酯钠盐)；和天然表面活性剂例如卵磷脂、甘油磷脂、鞘磷脂(例如神经鞘磷脂)，和C12-C18脂肪酸的蔗糖酯。组合物可包含一或多种这些表面活性剂。优选的表面活性剂是聚氧乙烯山梨聚糖脂肪酸酯，例如聚山梨醇酯20、40、60或80。聚山梨醇酯80(Tween80)(例如浓度为约1mg/mL)是特别合适的。
“冻干制剂”表示液体或溶液形式的药物组合物或溶液制剂经过真空冷冻干燥步骤之后获得的制剂或药物组合物。
本文所用术语“约”或“大约”是指数值在由本领域一般技术人员所测定的具体值的可接受误差范围内，所述数值部分取决于怎样测量或测定(即测量体系的限度)。例如，在本领域每一次实行中“约”可意味着在1内或超过1的标准差。或者，“约”或“基本上包含”可意味着至多±20％的范围，例如，约5.5的pH意指pH5.5±1.1。此外，特别对于生物学系统或过程而言，该术语可意味着至多一个数量级或数值的至多5倍。除非另外说明，否则当具体值在本申请和权利要求中出现时，“约”或“基本上包含”的含义应该假定为在该具体值的可接受误差范围内。
本文所述的药物组合物能够达到一种稳定的效果：其中的抗体在贮藏后基本上保留其物理稳定性和/或化学稳定性和/或生物学活性，例如药物组合物在贮藏后基本上保留其物理和化学稳定性以及其生物学活性。贮藏期一般基于药物组合物的预定保存期来选择。目前有多种测量蛋白质稳定性的分析技术，可测量在选定温度贮藏选定时间段后的稳定性。
稳定的药物抗体制剂是在下述情况下没有观察到显著变化的制剂：在冷藏温度(2-8℃)保存至少3个月、至少6个月、至少1年、最多达2年。另外，稳定的液体制剂包括这样的液体制剂：其在包括25℃保存包括1个月、3个月、6个月或在40℃保存1个月在内的时段后表现出期望的特征。稳定性的典型的可接受的标准如下：通过SEC-HPLC测得，通常不超过约10％、例如不超过约5％的抗体单体发生降解。通过视觉分析，药物抗体制剂是无色的，或澄清至稍微乳白色。所述制剂的浓度、pH和重量克分子渗透压浓度具有不超过±10％变化。通常观察到不超过约10％、例如不超过约5％的截短，通常形成不超过约10％、例如不超过约5％的聚集。
如果在目检颜色和/或澄清度后，或者通过UV光散射、尺寸排阻色谱法(SEC)和动态光散射(DLS)测得，抗体没有显示出显著的聚集增加、沉淀和/或变性，那么所述抗体在药物制剂中“保留它的物理稳定性”。蛋白构象的变化可以通过荧光光谱法(其确定蛋白三级结构)和通过FTIR光谱法(其确定蛋白二级结构)来评价。
如果抗体没有显示出显著的化学改变，那么所述抗体在药物制剂中“保留它的化学稳定性”。通过检测和定量化学上改变的形式的蛋白，可以评估化学稳定性。经常改变蛋白化学结构的降解过程包括水解或截短(通过诸如尺寸排阻色谱法和SDS-PAGE等方法来评价)、氧化(通过诸如与质谱法或MALDI/TOF/MS结合的肽谱法等方法来评价)、脱酰胺作用(通过诸如离子交换色谱法、毛细管等电聚焦、肽谱法、异天冬氨酸测量等方法来评价)和异构化(通过测量异天冬氨酸含量、肽谱法等来评价)。
如果抗体在给定时间的生物活性是在制备药物制剂时表现出的生物活性的预定范围内，那么所述抗体在药物制剂中“保留它的生物活性”。抗体的生物活性可以例如通过抗原结合测定来确定。
在本文中，除非另外指明或者明显不适合，包括百分比在内的比例均按重量计。
在本文中，“/”表示不含或者未检测到。
“给予”和“处理”当应用于动物、人、实验受试者、细胞、组织、器官或生物流体时，是指外源性药物、治疗剂、诊断剂或组合物与动物、人、受试者、细胞、组织、器官或生物流体的接触。“给予”和“处理”可以指例如治疗、药物代谢动力学、诊断、研究和实验方法。细胞的处理包括试剂与细胞的接触，以及试剂与流体的接触，其中所述流体与细胞接触。“给予”和“处理”还意指通过试剂、诊断、结合组合物或通过另一种细胞体外和离体处理例如细胞。“处理”当应用于人、兽医学或研究受试者时，是指治疗处理、预防或预防性措施，研究和诊断应用。
“治疗”意指给予受试者内用或外用治疗剂，例如包含本文公开的任一种结合化合物的组合物，所述受试者具有一种或多种疾病症状，而已知所述治疗剂对这些症状具有治疗作用。通常，在受治疗受试者或群体中以有效缓解一种或多种疾病症状的量给予治疗剂，以诱导这类症状退化或抑制这类症状发展到任何临床可测量的程度。有效缓解任何具体疾病症状的治疗剂的量(也称作“治疗有效量”)可根据多种因素变化，例如受试者的疾病状态、年龄和体重，以及药物在受试者产生需要疗效的能力。通过医生或其它专业卫生保健人士通常用于评价该症状的严重性或进展状况的任何临床检测方法，可评价疾病症状是否已被减轻。尽管本文公开的实施方案(例如治疗方法或制品)在缓解每个目标疾病症状方面可能无效，但是根据本领域已知的任何统计学检验方法如Student t检验、卡方检验、依据Mann和Whitney的U检验、Kruskal-Wallis检验(H检验)、Jonckheere-Terpstra检验和Wilcoxon检验确定，其在统计学显著数目的受试者中应当减轻目标疾病症状。
“有效量”包含足以改善或预防医学疾病的症状或病症的量。有效量还意指足以允许或促进诊断的量。用于特定受试者或兽医学受试者的有效量可依据以下因素而变化：例如，待治疗的病症、受试者的总体健康情况、给药的方法途径和剂量以及副作用严重性。有效量可以是避免显著副作用或毒性作用的最大剂量或给药方案。
“Tm值”是指蛋白质热变性温度，即一半蛋白去折叠时的温度，此时蛋白的空间结构被破坏，所以Tm值越高，蛋白热稳定性越高。通常，抗体具有三個过度区，Tm1相对于Fc部分的CH2结构域，Tm2相对于Fab部分，Tm3相对于Fc部分的CH3结构域。
“Tonset”即T起始，是蛋白开始解折叠的温度。
本文还涵盖用于治疗各种炎症疾病(例如银屑病)的试剂盒。这些试剂盒大体包括至少一种本文公开组合物以及使用说明。该说明公开了将稳定的组合物提供给患者作为给药方案一部分的合适技术。这些试剂盒还可包含用于治疗炎症疾病例如银屑病的其他试剂(如免疫抑制剂、DMARD、疼痛控制药、类固醇、非甾体抗炎药(NSAID)等)，用于与所含组合物联合(即同时或按顺序[之前或之后])递送。
稳定性考察实验：
用注射用水配制阿达木单抗药物组合物溶液，并对各个制剂分别进行稳定性考察实验。
本发明中，稳定性考察实验可从下述几方面展开：
振动试验：密封、避光、25℃、300rpm条件下振动3天。
冻融试验：冻融3次，冻融条件为-20℃放置2天，室温(约25℃)融化2天。
光照试验：将样品放置于光照箱(5℃±3℃，4500Lx±500Lx)中，于10天后取样。
高温试验：将样品放置于培养箱(40℃±3℃，避光)中，分别于7天、14天后取样。
加速1个月试验：将样品放置于恒温恒湿箱(25℃±3℃，避光)中，1个月后取样。
每一条件下的样品平行放置3份。
试剂和检测仪器
阿达木单抗，参照CN1300173C制备，其序列如下：
轻链:
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGIRNYLAWYQQKPGKAPKLLIYAASTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCQRYNRAPYTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ IDNO:1)
重链：
EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEWVSAITWNSGHIDYADSVEGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKVSYLSTASSLDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO:2)
试剂：
蔗糖，购自Merck KGaA；
二水海藻糖，购自日本株式会社林原；
聚山梨酯80，购自JT Baker(货号4117-04)、或南京威尔药业集团股份有限公司；仪器：
Agilent 1200液相色谱仪，购自美国Agilent公司；
SEC-HPLC色谱柱：日本TOSOH公司的TSK-GEL G3000 SWXL，7.8×300mm；流动相：0.08mol/L磷酸二氢钠、0.5mol/L氯化钠缓冲液，pH 7.0；流速：0.5ml/min；柱温：室温；运行时间：30min；波长：280nm。
IEC-HPLC色谱柱：美国Thermo公司的Propac WCX-10，4.0*250mm；流动相A：0.01mol/L磷酸氢二钠，pH＝7.5，流动相B：0.01mol/L磷酸氢二钠，0.5mol/L氯化钠，pH＝5.5；柱温：30℃；波长：280nm；运行时间：30min；运行梯度见下表1。
表1运行条件
微热差示扫描量热仪DSC购自马尔文。
CE-SDS：仪器为Agilent 7100毛细管电泳仪；毛细管有效长度220mm，总长度305mm；-10.0kv进样40s；运行电压-15.0kv；运行时间40min；检测波长214nm；柱温20℃。
方法
蛋白质含量检测方法：使用Unchained Labs的高通量蛋白检测设备Lunatic进行蛋白质含量的测定。通过测定样品在280nm处的吸光度，并使用消光系数1.369L*g-1*cm-1进行计算，以得到蛋白质含量。
蛋白质相对含量计算方法：以0时SEC-HPLC的所有峰的峰面积总和为基准，计算在各个实验条件下SEC-HPLC的所有峰的峰面积总和与该基准的相对比值。
实施例1
本实施例比较了天冬氨酸(制剂1)、组氨酸(制剂2)和磷酸/枸橼酸(原研产品中使用了该缓冲体系，制剂3)作为缓冲液对阿达木单抗药物组合物稳定性的影响。对阿达木单抗原液进行超滤置换，以低浓度磷酸/枸橼酸(1.75mM/0.925mM pH5.2)置换原液中原有缓冲液。测定超滤置换后浓缩液蛋白质含量，根据原液蛋白质含量计算制备如表2所列的制剂1-制剂3。
表2.制剂的组成
序号 阿达木单抗 蔗糖 聚山梨酯80 缓冲液pH5.2
制剂1 50mg/mL 83mg/mL 1mg/mL 天冬氨酸20mM
制剂2 50mg/mL 83mg/mL 1mg/mL 组氨酸20mM
制剂3 50mg/mL 83mg/mL 1mg/mL 磷酸14.1mM/枸橼酸7.2mM
对制剂1-3进行外观、可见异物检测，均为无色无可见异物。用SEC-HPLC检测聚体含量，IEC-HPLC检测电荷异构体纯度，结果见表3。
表3.SEC-HPLC和IEC-HPLC的蛋白纯度
*数据为平均值±标准偏差，重复3次，下同。
表3结果显示：制剂1-3中使用SEC-HPLC检测的单体含量为99.71％-99.75％，极为相近，说明制剂的制备过程较为精确，蛋白含量按100％计，可以以此次各制剂的0时数据作为对比，对加速实验进行检测和分析，对各个处方进行评价。
热稳定性实验
对3个处方制剂0时样品分别进行差示扫描量热法(DSC)实验测定变性温度(Tonset和Tm1)，用于评估其热稳定性，具体结果见图1-2。
图1显示了3个处方制剂开始发生变性的温度(Tonset)值的趋势，制剂1-3的Tonset值分别为66.7℃、60.2℃和62.9℃。从Tonset值来说，制剂1的Tonset值最高，效果最好，热稳定性最高；制剂2的Tonset值最低，说明其开始发生变性的温度最低，热稳定性最差。
图2显示了3个处方制剂发生50％变性的温度值(Tm1)值的趋势，制剂1-3的Tm1值分别为75.0、66.3和73.9(℃)。从Tm1来说，制剂1的Tm1值最高，效果最好，热稳定性最高，其次为制剂3，制剂2的Tm1值最低。
综上可知，制剂1的热稳定性优于制剂3和制剂2。
稳定性考察试验
振动试验
将经过振动3天的制剂1-3液体制剂样品进行SEC-HPLC和IEC-HPLC检测对比，结果见表4。
由表4可得制剂1-3的SEC-HPLC纯度、IEC-HPLC纯度、蛋白含量方面均无明显变化。说明制剂1-3在振动条件下均表现出良好的稳定性。
表4制剂1-3振动3天的SEC-HPLC和IEC-HPLC的检测结果
冻融试验
将经过冻融的制剂1-3液体制剂样品进行SEC-HPLC和IEC-HPLC检测对比，结果见表5。
由表5可得经过冻融3次实验后，制剂1-3的SEC-HPLC纯度、聚体含量和蛋白含量均无变化；制剂3的IEC-HPLC的主峰含量较其他处方低，表明制剂1(天冬氨酸)和制剂2(组氨酸)的均优于制剂3(磷酸/枸橼酸缓冲液)。
表5制剂冻融3次的SEC-HPLC和IEC-HPLC的蛋白纯度
注：△值，表示使用不同条件处理后检测到的参数与0时相应参数的差值，反应了在不同处理条件下，相应参数的变化。
高温试验
分别对经高温7天/14天后(40℃)的制剂1-3进行SEC-HPLC和IEC-HPLC检测，结果见表6。
由表6-1和6-2可得：①经过7天、14天高温破坏后，制剂1-3的SEC-HPLC蛋白纯度和聚体含量均出现了不同程度的下降和增长，其中制剂1和制剂2的聚体含量均低于制剂3，蛋白含量除制剂3高温14天略有下降外(98.9％)，基本都没有变化。由此可得制剂1和制剂2在高温条件下的物理稳定性优于制剂3。②制剂1和制剂2在高温条件破坏后的CE-SDS纯度和IEC-HPLC纯度比制剂3高，说明制剂1和2的化学稳定性也高于制剂3。
表6-1制剂高温7天和高温14天SEC-HPLC和IEC-HPLC纯度
表6-2制剂高温7天和高温14天SEC-HPLC和IEC-HPLC的变化
综上，使用天冬氨酸作为缓冲液制备的制剂优于原研上市产品使用的磷酸/枸橼酸缓冲液，尤其是在高温条件下；且含有天冬氨酸作为缓冲液的制剂1具有更高的热稳定性(更高的Tmonset和Tm1)。
实施例2
本实施例比较了缓冲液、pH值对阿达木单抗药物组合物稳定性的影响。对阿达木单抗原液进行超滤置换，置换原液中原有缓冲液后再进行浓缩。浓缩后得到超滤浓缩液，检测其蛋白质含量，根据蛋白质含量计算并制备表7中所列的制剂4-制剂9(制剂4为使用磷酸/枸橼酸缓冲体系)。
表7制剂处方组成
各制剂处方样品进行稳定性试验后(振动3天；冻融3次；高温7天/14天；光照10天；加速一个月)，检测其外观、可见异物、蛋白质含量(结果见表8)、SEC-HPLC纯度(结果见表9)。
其中，各制剂处方的外观、可见异物均未发现颗粒，表明均较为稳定。
由下表8蛋白质含量可得，各制剂处方均无明显变化。
由下表9可得，①制剂5～制剂9的聚体含量低于制剂4，单体纯度高于制剂4，尤其以光照10天较为显著。②从SEC-HPLC纯度上，不同含量天冬氨酸(5～20mM)及不同pH(4.8～5.6)对阿达木单抗均有较好的保护效果。
表8制剂4-9的蛋白质含量(mg/mL)
0时 振动3天 冻融3次 高温7天 高温14天 光照10天 加速一个月
制剂4 5.55 5.58 5.48 5.46 5.47 5.42 5.38
制剂5 5.61 5.55 5.45 5.58 5.49 5.52 5.53
制剂6 5.54 5.59 5.55 5.47 5.47 5.47 5.50
制剂7 5.50 5.49 5.44 5.51 5.39 5.46 5.43
制剂8 5.34 5.40 5.34 5.31 5.48 5.32 5.32
制剂9 5.39 5.53 5.53 5.47 5.58 5.49 5.47
表9制剂4-9的SEC-HPLC变化(与0时比较)
实施例3
本实施例比较了蛋白质含量、稳定剂种类对阿达木单抗药物组合物稳定性的影响。对阿达木单抗原液进行超滤置换，置换原液中原有缓冲液后再进行浓缩。浓缩后得到超滤浓缩液，检测其蛋白质含量，根据蛋白质含量计算并制备表12中所列的制剂4、制剂11、13、14和制剂15(制剂4为使用磷酸/枸橼酸缓冲体系)。
表12制剂处方组成
各制剂处方样品进行稳定性试验(振动3天；冻融3次；高温14天；光照10天；加速一个月)后，检测其外观、可见异物、蛋白质含量、SEC-HPLC纯度、IEC-HPLC纯度。其中，各制剂处方的外观、可见异物均未发现颗粒，表明均较为稳定。
由下表13蛋白质含量可得，各制剂处方均无明显变化。
由下表14SEC-HPLC纯度可得，①制剂11-15在各稳定性试验条件下均能保持稳定，相较于制剂4，制剂11～制剂15的光照10天保护效果较优。②从SEC-HPLC纯度上，不同蛋白质含量(5～100mg/mL)及不同稳定剂(蔗糖、二水海藻糖、甘露醇)对阿达木单抗均有较好的保护效果。
由下表15IEC-HPLC纯度可得，①制剂11-15在各稳定性试验条件下均能保持稳定，相较于制剂4，制剂11～制剂15的高温14天及光照10天保护效果较优。②从IEC-HPLC纯度上，不同蛋白质含量(5～100mg/mL)及不同稳定剂(蔗糖、二水海藻糖、盐酸精氨酸、甘露醇)对阿达木单抗均有较好的保护效果。
表13蛋白质含量结果(mg/mL)
0时 振动3天 冻融3轮 高温7天 高温14天 光照10天 加速一个月
制剂4 5.55 5.58 5.48 5.46 5.47 5.42 5.38
制剂11 106.59 105.82 103.50 106.04 105.39 105.67 107.77
制剂12 5.45 5.52 5.50 5.54 5.47 5.63 5.41
制剂13 5.39 5.42 5.28 5.36 5.32 5.46 5.36
制剂14 5.39 5.39 5.54 5.47 5.39 5.53 5.40
制剂15 5.24 5.30 5.28 5.42 5.23 5.26 5.27
表14SEC-HPLC变化
表15 IEC-HPLC纯度变化
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Claims (10)

1.一种阿达木单抗组合物，包括阿达木单抗和缓冲剂，其中，所述缓冲剂为天冬氨酸；优选地，所述组合物还包括稳定剂和表面活性剂。
2.根据权利要求1所述的组合物，其中，阿达木单抗的浓度为5mg/mL～100mg/mL，优选为5mg/mL、50mg/mL或100mg/mL。
3.根据权利要求1或2所述的组合物，其中，天冬氨酸的浓度为5mM～20mM，优选为5mM、10mM或20mM。
4.根据权利要求1～3任一项所述的组合物，其中，所述稳定剂为蔗糖、二水海藻糖或甘露醇；优选地，所述稳定剂的浓度为43mg/mL～91mg/mL。
5.根据权利要求1～4任一项所述的组合物，其中，所述表面活性剂为聚山梨酯80；其浓度为0.8mg/mL～2mg/mL；优选为1mg/mL。
6.根据权利要求1～5任一项所述的组合物，其中，所述组合物的pH值为4.8～5.6；优选为4.8、5.2或5.6。
7.根据权利要求1～6任一项所述的组合物，其中，所述组合物为以下中的任一种：
(1)50mg/mL阿达木单抗、83mg/mL蔗糖、1mg/mL聚山梨酯80和20mM天冬氨酸，pH值为5.2；
(2)5mg/mL阿达木单抗、83mg/mL蔗糖、1mg/mL聚山梨酯80和20mM天冬氨酸，pH值为5.2；
(3)5mg/mL阿达木单抗、83mg/mL蔗糖、1mg/mL聚山梨酯80和20mM天冬氨酸，pH值为4.8；
(4)5mg/mL阿达木单抗、83mg/mL蔗糖、1mg/mL聚山梨酯80和20mM天冬氨酸，pH值为5.6；
(5)5mg/mL阿达木单抗、83mg/mL蔗糖、1mg/mL聚山梨酯80和5mM天冬氨酸，pH值为5.2；
(6)5mg/mL阿达木单抗、83mg/mL蔗糖、1mg/mL聚山梨酯80和10mM天冬氨酸，pH值为5.2；
(7)100mg/mL阿达木单抗、83mg/mL蔗糖、1mg/mL聚山梨酯80和20mM天冬氨酸，pH值为5.2；
(8)5mg/mL阿达木单抗、90.7mg/mL二水海藻糖、1mg/mL聚山梨酯80和20mM天冬氨酸，pH值为5.2；和
(9)5mg/mL阿达木单抗、43.7mg/mL甘露醇、1mg/mL聚山梨酯80和20mM天冬氨酸，pH值为5.2。
8.一种含阿达木单抗的冻干制剂，所述冻干制剂通过将权利要求1～7任一项所述的组合物经冷冻干燥获得。
9.天冬氨酸作为缓冲剂在制备阿达木单抗组合物或含阿达木单抗的冻干制剂中的应用；优选地，所述阿达木单抗组合物为权利要求1～7中任一项所述的阿达木单抗组合物，所述含阿达木单抗的冻干制剂为权利要求8所述的含阿达木单抗的冻干制剂。
10.权利要求1～7任一项所述的阿达木单抗组合物或权利要求8所述的含阿达木单抗的冻干制剂在制备用于治疗炎症疾病的药物中的用途；优选地，所述炎症疾病选自类风湿关节炎、强直性脊柱炎、银屑病、银屑病关节炎、幼年特发性关节炎、克罗恩病、溃疡性结肠炎、化脓性汗腺炎和葡萄膜炎。
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