CN112569183A

CN112569183A - 一种抗ctla-4抗体及融合蛋白的制剂

Info

Publication number: CN112569183A
Application number: CN202011462549.4A
Authority: CN
Inventors: 方国波; 蔡则玲; 吴珩
Original assignee: Shanghai Celgen Biopharma Co ltd
Current assignee: Shanghai Celgen Biopharma Co ltd
Priority date: 2020-12-11
Filing date: 2020-12-11
Publication date: 2021-03-30
Anticipated expiration: 2040-12-11
Also published as: CN112569183B; WO2022122034A1

Abstract

本发明涉及一种抗CTLA‑4抗体及融合蛋白的制剂。具体地，本发明提供一种抗CTLA‑4抗体组合物，所述的组合物包括抗CTLA‑4单克隆抗体、表面活性剂、缓冲液和稳定剂。本发明所述的组合物能够提高抗CTLA‑4抗体的稳定性。

Description

一种抗CTLA-4抗体及融合蛋白的制剂

技术领域

本发明涉及药物制剂领域，具体地涉及一种抗CTLA-4抗体及融合蛋白的的制剂。

背景技术

重组抗CTLA-4全人源单克隆抗体是一种T细胞免疫功能调节剂，与APC细胞表面的B7-1分子竞争结合T细胞表面的CTLA-4分子，阻断B7-1分子调节的免疫抑制功能.

重组抗CTLA-4全人源单克隆抗体分子量约为145KD，由1324个氨基酸组成，在CHO细胞中表达和分泌。

由于其具有复杂的空间结构，在生产、储存过程中容易受到外部环境因素(如pH、温度、光照、冻融、有机溶剂或微生物污染等)的影响，发生形态上的变化，导致产生聚集或其他的化学修饰产物如降解、脱胺、氧化等，影响产品的有效性及安全性。蛋白稳定性易受到缓冲溶液的类型及浓度、pH、盐的种类及浓度、表面活性剂、氨基酸及糖类保护剂、蛋白浓度等的影响，结合产品的理化特性，开发适合重组抗CTLA-4全人源单克隆抗体稳定性优异的制剂处方对临床用药非常重要。

因此，本领域需要开发一种具有稳定性高的重组抗CTLA-4全人源单克隆抗体制剂，提高重组抗CTLA-4全人源单克隆抗体的稳定性。

发明内容

本发明的目的是提供一种抗CTLA-4抗体组合物，所述的组合物抑制抗CTLA-4抗体的聚集和降解，从而提高抗CTLA-4抗体的稳定性。

本发明第一方面，提供一种抗CTLA-4抗体组合物，其特征在于，所述的组合物包括抗CTLA-4单克隆抗体、表面活性剂、缓冲液和稳定剂。

优选地，所述的抗CTLA-4抗体具有如SEQ ID NO.：1的重链氨基酸序列和SEQ IDNO.：2轻链氨基酸序列。

优选地，所述的抗CTLA-4抗体具有如SEQ ID NO.：3的重链氨基酸序列和SEQ IDNO.：4轻链氨基酸序列。

优选地，所述的抗CTLA-4抗体具有如SEQ ID NO.：5的重链氨基酸序列和SEQ IDNO.：6轻链氨基酸序列。

在另一优选例中，所述的组合物为药物组合物。

在另一优选例中，所述的抗体包括人源抗体。

在另一优选例中，所述的抗体包括单克隆抗体。

在另一优选例中，所述的抗CTLA-4单克隆抗体包括人源抗CTLA-4单克隆抗体。

在另一优选例中，所述的抗CTLA-4单克隆抗体包括抗CTLA-4全人源单克隆抗体。

在另一优选例中，所述的抗CTLA-4全人源单克隆抗体包括重组抗CTLA-4全人源单克隆抗体。

在另一优选例中，所述抗CTLA-4单克隆抗体的含量为0.5-50mg/mL，较佳地0.5-40mg/mL，更佳地0.5-30mg/mL，更佳地0.5-20mg/mL，更佳地1-15mg/mL，更佳地2-10mg/mL，更佳地3-8mg/mL，最佳地5mg/mL。

在另一优选例中，所述的表面活性剂选自下组：正离子型表面活性剂、负离子型表面活性剂、非离子型表面活性剂，或其组合。

在另一优选例中，所述的表面活性剂选自下组：聚氧乙烯山梨醇酐脂肪酸酯、聚氧乙烯氢化蓖麻油、甘油脂肪酸酯、聚山梨醇酯、泊洛沙姆，或其组合。

在另一优选例中，所述的聚山梨醇酯选自下组：聚山梨醇酯20(PS–20，吐温-20)、聚山梨醇酯40(PS-40，吐温-40)、聚山梨醇酯60(PS–60，吐温-60)、聚山梨醇酯80(PS-80，吐温-80)。

在另一优选例中，所述的泊洛沙姆选自下组：泊洛沙姆188、泊洛沙姆108、泊洛沙姆124，或其组合。

在另一优选例中，所述的表面活性剂包括聚山梨醇酯。

在另一优选例中，所述的表面活性剂包括聚山梨醇酯80(PS-80)。

在另一优选例中，所述表面活性剂的含量为0.001-8wt％，较佳地0.001-3wt％，更佳地0.001-1wt％，更佳地0.002-0.5wt％，更佳地0.002-0.1wt％，更佳地0.002-0.06wt％，更佳地0.005-0.05wt％，更佳地0.005-0.03wt％，更佳地0.008-0.02wt％，更佳地0.008-0.012wt％，最佳地0.01wt％，以组合物的总重量计。

在另一优选例中，所述的缓冲液选自下组：柠檬酸盐-柠檬酸缓冲液、磷酸盐-磷酸缓冲液，或其组合。

在另一优选例中，所述的缓冲液的介质为水。

在另一优选例中，所述缓冲液的浓度为3-80mM，较佳地5-60mM，更佳地5-40mM，更佳地10-30mM，更佳地15-25mM，更佳地18-22mM。

在另一优选例中，所述的缓冲剂包括磷酸缓冲液。

在另一优选例中，所述的磷酸缓冲液的浓度为3-80mM，较佳地5-60mM，更佳地5-40mM，更佳地10-30mM，更佳地15-25mM，更佳地18-22mM，最佳地。

在另一优选例中，所述的稳定剂选自下组：氨基酸、糖醇，或其组合。

在另一优选例中，所述的氨基酸选自下组：脯氨酸、精氨酸(Arginine)、甘氨酸(Glycine)、组氨酸(Histidine)、甲硫氨酸(Methionine)，或其组合。

在另一优选例中，所述的糖醇选自下组：蔗糖(Sucrose)、甘露醇(Mannitol)、海藻糖(Trehalose)、麦芽糖(Maltose)、山梨醇(Sorbitol)，或其组合。

在另一优选例中，所述的糖醇选自下组：蔗糖、甘露醇、海藻糖、山梨醇，或其组合。

在另一优选例中，所述的稳定剂包括甘露醇。

在另一优选例中，所述的糖醇包括甘露醇。

在另一优选例中，所述的稳定剂的含量为0.5-50wt％，较佳地0.5-40wt％，更佳地0.8-30wt％，更佳地1-20wt％，更佳地1-15wt％，更佳地1-10wt％，更佳地1-8wt％，更佳地2-7wt％，最佳地4wt％或5wt％，以组合物的总重量计。

在另一优选例中，所述的组合物不包括渗透压调节剂。

在另一优选例中，所述的组合物还包括渗透压调节剂。

在另一优选例中，所述的渗透压调节剂包括无机盐。

在另一优选例中，所述的无机盐选自下组：钠盐、钾盐、钙盐、镁盐、氯盐、硫酸盐、硝酸盐，或其组合。

在另一优选例中，所述的无机盐选自下组：氯化钠、氯化钾、氯化钙、氯化镁、硫酸钠、硫酸钾、硫酸钙、硫酸镁、硝酸钠、硝酸钾、硝酸钙、硝酸镁，或其组合。

在另一优选例中，所述的无机盐选包括氯化钠。

在另一优选例中，所述的渗透压调节剂的含量为0-80mM，较佳地0-60mM，更佳地0-50mM，更佳地0-30mM。

在另一优选例中，所述稳定剂与所述表面活性剂的重量比为350-450：1，较佳地380-420：1，更佳地390-400：1。

在另一优选例中，所述稳定剂与所述表面活性剂的重量比为450-550：1，较佳地480-520：1，更佳地490-510：1。

在另一优选例中，所述甘露醇与所述吐温80的重量比为350-450：1，较佳地380-420：1，更佳地390-400：1。

在另一优选例中，所述甘露醇与所述吐温80的重量比为450-550：1，较佳地480-520：1，更佳地490-510：1。

在另一优选例中，所述的渗透压调节剂的含量为0Mm。

在另一优选例中，所述的渗透压调节剂的含量为10-50mM，较佳地20-40mM，更佳地25-30mM，最佳地0mM或30mM。

在另一优选例中，所述的组合物还包括抗氧化剂。

在另一优选例中，所述的抗氧化剂包括EDTA(乙二胺四乙酸)。

在另一优选例中，所述的组合物的pH为5.0-7.5，较佳地5.0-7.0，更佳地5.5-6.5，更佳地5.8-6.2，最佳地6.0。

在另一优选例中，所述的组合物为液体制剂。

在另一优选例中，所述的组合物为口服液体制剂或注射液体制剂。

在另一优选例中，所述的组合物为药物组合物。

在另一优选例中，所述的组合物的剂型为口服制剂或注射制剂。

在另一优选例中，所述的组合物包括：

抗CTLA-4抗体	1-15mg/mL
		磷酸缓冲液	10-30mM
吐温80	0.005-0.05wt％
		甘露醇	1-15wt％
NaCl	10-50mM。

在另一优选例中，所述的组合物包括：

在另一优选例中，所述的组合物包括：

抗CTLA-4抗体	1-15mg/mL
		磷酸缓冲液	10-30mM
吐温80	0.005-0.05wt％
		甘露醇	1-15wt％

在另一优选例中，所述的组合物包括：

抗CTLA-4抗体	2-10mg/mL
		磷酸缓冲液	15-25mM
吐温80	0.005-0.03wt％
		甘露醇	1-8wt％

本发明第二方面，提供一种冻干制剂，所述的冻干制剂通过以下方法制备：

将如本发明第一方面所述的组合物进行冷冻干燥，得到冻干制剂。

在另一优选例中，所述的冻干制剂还包括冻干保护剂。

在另一优选例中，所述的冻干保护剂选自下组：葡萄糖、甘露醇、果糖、半乳糖，或其组合。

本发明第三方面，提供一种如本发明第一方面所述的组合物或如本发明第二方面所述的冻干制剂的用途，用于制备药物，所述药物用于(i)预防和/或治疗无法切除或转移性黑色素瘤；(ii)预防和/或治疗晚期肾细胞癌；(iii)预防和/或治疗微卫星高度不稳定性或错配修复缺陷的转移性结直肠癌；和/或(iv)用于黑色素瘤辅助治疗。

本发明第四方面，提供一种(i)预防和/或治疗无法切除或转移性黑色素瘤；(ii)预防和/或治疗晚期肾细胞癌；(iii)预防和/或治疗微卫星高度不稳定性或错配修复缺陷的转移性结直肠癌；和/或(iv)用于黑色素瘤辅助治疗的方法，所述的方法包括：给予所需对象如本发明第一方面所述的组合物。

在另一优选例中，所述的对象为人或非人哺乳动物。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图

图1制剂样品60℃孵育24小时非还原电泳图谱。

图2制剂样品60℃孵育24小时非还原电泳图谱。

具体实施方式

本发明人通过广泛而深入的研究，研发出一种药物组合物，所述的药物组合物能够有效保持抗CTLA-4抗体的稳定性，组合物中的抗CTLA-4抗体能够在加压试验(高温、冻融)条件下均能保持其稳定性，因此，本发明所述的组合物能够稳定抗CTLA-4抗体的质量，延长产品的货架期，提高临床实用的安全性。在此基础上，完成了本发明。

术语

除非另有定义,否则本文中所用的所有技术和科学术语的含义与本发明所属领域普通技术人员普遍理解的含义相同。

如本文所用，术语“包含”、“包括”、“含有”可互换使用，不仅包括封闭式定义，还包括半封闭、和开放式的定义。换言之，所述术语包括了“由……构成”、“基本上由……构成”。

如本文所用，“mM”为mmol/L单位，例如，1mM＝1mmol/L。

在本发明中在所述的药物组合物中，各个组分的重量含量(wt.％)或浓度(如mM、mg/mL)均以药物组合物的重量或体积计。

如本文所用，三羟甲基氨基甲烷简称为Tris，即“三羟甲基氨基甲烷”与“Tris”可互换使用。

如本文所用，术语“EDTA”为乙二胺四乙酸。

如本文所用，术语“磷酸缓冲液”为磷酸-磷酸盐缓冲水溶液，其中，含量以磷酸根离子计，例如20mM磷酸缓冲液是指换算成PO₄ ^3-的浓度为20mM。

抗CTLA-4抗体

如本文所用，术语“抗CTLA-4抗体”由两个相同的轻链(L)和两个相同的重链(H)组成。每条重链的一端有可变区(VH)，其后是多个恒定区。每条轻链的一端有可变区(VL)，另一端有恒定区；轻链的恒定区与重链的第一个恒定区相对，轻链的可变区与重链的可变区相对。

本发明所述的抗CTLA-4抗体并没有特别的限定，优选为人抗CTLA-4抗体，例如抗CTLA-4全人源单克隆抗体。

优选地，本发明所述的抗CTLA-4抗体具有SEQ ID NO.：1的重链氨基酸序列和SEQID NO.：2轻链氨基酸序列；

SEQ ID NO.：1的氨基酸序列如下：

QVQLVQSGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYGMHWVRQAPGKGLEWVAVIWYDGSRQYYADSVKGRFTISRDDSKNTMYLQMNSLRAEDTAVYYCARGGFWGAFDIWGQGTMVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG

SEQ ID NO.：2的氨基酸序列如下：

DVVMTQSPGTLSLSPGEGATLSCRASQHVISSYLAWYQQKPGQAPRLLVYGASSRDTGVSDRFTGSGSGTDFTLTISRLEPEDSAVYFCQQYGTSPWTFGQGTKLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQID NO.：2)。

优选地，本发明所述的抗CTLA-4抗体具有SEQ ID NO.：3的重链氨基酸序列和SEQID NO.：4的轻链氨基酸序列；

SEQ ID NO.：3的氨基酸序列如下：

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGFSFPNYYMHWVRQAPGQGLEWMGIISPTGGSRTYAQKFQGRVTITRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAREMYNWNGGWDYGMDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG(SEQ ID NO.：3)。

SEQ ID NO.：4的氨基酸序列如下：

QSALTQSASVSGFPGQSITVSCVGTNSDVEAYDLVSWYRQHPDKSPNLLIYDNYKRPSGVSDRFSAFKSGNTASLTISGLQAEDEAYYYCCSYAGFSTWIFGAGTQLTVLGQPKANPTVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADGSPVKAGVETTKPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS(SEQID NO.：4)。

优选地，本发明所述的抗CTLA-4抗体具有SEQ ID NO.：5的重链氨基酸序列和SEQID NO.：6的轻链氨基酸序列；

SEQ ID NO.：5的氨基酸序列如下：

QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAISWVRQAPGQGLEWMGGIIPIFGTANYAQKFQGRVTITADESTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARDTAMALFYYYYGMDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG(SEQ ID NO.：5)

SEQ ID NO.：6的氨基酸序列如下：

QSALTQPASVSGSPGQSTTISCTGTSSDVGGYNYVSWYQQHPGKAPKLMIYEVSNRPSGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCSSYRSSGTPYVFGTGTKLTVLGQPKANPTVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAWKADGSPVKAGVETTKPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHRSYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS(SEQID NO.：6)

组合物

本发明提供一种抗CTLA-4抗体组合物，所述的组合物包括抗CTLA-4单克隆抗体、表面活性剂、缓冲液和稳定剂。

本发明所述的组合物优选为药物组合物。

本发明所述的组合物优选为液体制剂，例如口服液体制剂或注射液体制剂。

在本发明的一个优选例中，所述所述抗CTLA-4单克隆抗体的含量为0.5-50mg/mL，较佳地0.5-40mg/mL，更佳地0.5-30mg/mL，更佳地0.5-20mg/mL，更佳地1-15mg/mL，更佳地2-10mg/mL，更佳地3-8mg/mL，最佳地5mg/mL。

在本发明另一优选例中，所述的表面活性剂选自下组：正离子型表面活性剂、负离子型表面活性剂、非离子型表面活性剂，或其组合。

代表性地，所述的表面活性剂选自下组：聚氧乙烯山梨醇酐脂肪酸酯、聚氧乙烯氢化蓖麻油、甘油脂肪酸酯、聚山梨醇酯、泊洛沙姆，或其组合。

代表性地，所述的聚山梨醇酯选自下组：聚山梨醇酯20(PS–20，吐温-20)、聚山梨醇酯40(PS-40，吐温-40)、聚山梨醇酯60(PS–60，吐温-60)、聚山梨醇酯80(PS-80，吐温-80)。

代表性地，所述的泊洛沙姆选自下组：泊洛沙姆188、泊洛沙姆108、泊洛沙姆124，或其组合。

典型地，所述的表面活性剂包括聚山梨醇酯。

典型地，所述的表面活性剂包括聚山梨醇酯80(PS-80)。

在本发明所述的组合物中，所述表面活性剂的含量可以为0.001-8wt％，较佳地0.001-3wt％，更佳地0.001-1wt％，更佳地0.002-0.5wt％，更佳地0.002-0.1wt％，更佳地0.002-0.06wt％，更佳地0.005-0.05wt％，更佳地0.005-0.03wt％，更佳地0.008-0.02wt％，更佳地0.008-0.012wt％，最佳地0.01wt％，以组合物的总重量计。

在本发明的一个优选例中，所述的缓冲液选自下组：柠檬酸盐-柠檬酸缓冲液、磷酸盐-磷酸缓冲液，或其组合。

在另一优选例中，所述的缓冲液的介质为水。

在本发明所述的组合物中，所述缓冲液的浓度可以为3-80mM，较佳地5-60mM，更佳地5-40mM，更佳地10-30mM，更佳地15-25mM，更佳地18-22mM。

代表性地，所述的缓冲剂包括磷酸缓冲液。

代表性地，所述的磷酸缓冲液的浓度为3-80mM，较佳地5-60mM，更佳地5-40mM，更佳地10-30mM，更佳地15-25mM，更佳地18-22mM，最佳地。

在本发明的一个优选例中，所述的稳定剂选自下组：氨基酸、糖醇，或其组合。

代表性地，所述的氨基酸选自下组：脯氨酸、精氨酸(Arginine)、甘氨酸(Glycine)、组氨酸(Histidine)、甲硫氨酸(Methionine)，或其组合。

代表性地，所述的糖醇选自下组：蔗糖(Sucrose)、甘露醇(Mannitol)、海藻糖(Trehalose)、麦芽糖(Maltose)、山梨醇(Sorbitol)，或其组合。

代表性地，所述的糖醇选自下组：蔗糖、甘露醇、海藻糖、山梨醇，或其组合。

典型地，所述的稳定剂包括甘露醇。

典型地，所述的糖醇包括甘露醇。

在本发明所述的组合物中，所述的稳定剂的含量可以为0.5-50wt％，较佳地0.5-40wt％，更佳地0.8-30wt％，更佳地1-20wt％，更佳地1-15wt％，更佳地1-10wt％，更佳地1-8wt％，更佳地2-7wt％，最佳地4wt％或5wt％，以组合物的总重量计。

在本发明的一个优选例中，所述的组合物不包括渗透压调节剂。

在本发明的一个优选例中，所述的组合物还包括渗透压调节剂。

在另一优选例中，所述的渗透压调节剂包括无机盐。

代表性地，所述的无机盐选自下组：钠盐、钾盐、钙盐、镁盐、氯盐、硫酸盐、硝酸盐，或其组合。

代表性地，所述的无机盐选自下组：氯化钠、氯化钾、氯化钙、氯化镁、硫酸钠、硫酸钾、硫酸钙、硫酸镁、硝酸钠、硝酸钾、硝酸钙、硝酸镁，或其组合。

典型地，所述的无机盐选包括氯化钠。

在本发明的一个优选例中，所述的渗透压调节剂的含量为0-80mM，较佳地0-60mM，更佳地0-50mM，更佳地0-30mM。

在本发明的一个优选例中，所述稳定剂与所述表面活性剂的重量比为350-450：1，较佳地380-420：1，更佳地390-400：1。

在本发明的一个优选例中，所述稳定剂与所述表面活性剂的重量比为450-550：1，较佳地480-520：1，更佳地490-510：1。

在本发明的一个优选例中，所述甘露醇与所述吐温80的重量比为350-450：1，较佳地380-420：1，更佳地390-400：1。

在本发明的一个优选例中，所述甘露醇与所述吐温80的重量比为450-550：1，较佳地480-520：1，更佳地490-510：1。

在本发明的一个优选例中，所述的渗透压调节剂的含量为0Mm。

在本发明的一个优选例中，所述的渗透压调节剂的含量为10-50mM，较佳地20-40mM，更佳地25-30mM，最佳地0mM或30mM。

在本发明的一个优选例中，所述的组合物还包括抗氧化剂。

在另一优选例中，所述的抗氧化剂包括EDTA(乙二胺四乙酸)。

在本发明的一个优选例中，所述的组合物的pH为5.0-7.5，较佳地5.0-7.0，更佳地5.5-6.5，更佳地5.8-6.2，最佳地6.0。

在本发明的一个优选例中，所述的组合物包括：

抗CTLA-4抗体	2-10mg/mL
		磷酸缓冲液	15-25mM
吐温80	0.005-0.03wt％
		甘露醇	1-8wt％
NaCl	20-40mM。

在本发明的一个优选例中，所述的组合物包括：

冻干制剂

本发明还提供一种冻干制剂，所述的冻干制剂通过以下方法制备：

将如本发明所述的组合物进行冷冻干燥，得到冻干制剂。

在另一优选例中，所述的冻干制剂还包括冻干保护剂。

用途

本发明还提供一种如本发明所述组合物或所述冻干制剂的用途，用于制备药物，所述药物用于(i)预防和/或治疗无法切除或转移性黑色素瘤；(ii)预防和/或治疗晚期肾细胞癌；(iii)预防和/或治疗微卫星高度不稳定性或错配修复缺陷的转移性结直肠癌；和/或(iv)用于黑色素瘤辅助治疗。

本发明还提供一种(i)预防和/或治疗无法切除或转移性黑色素瘤；(ii)预防和/或治疗晚期肾细胞癌；(iii)预防和/或治疗微卫星高度不稳定性或错配修复缺陷的转移性结直肠癌；和/或(iv)用于黑色素瘤辅助治疗的方法，所述的方法包括：给予所需对象如本发明所述组合物或所述冻干制剂。

本发明的主要优点包括：

1、本发明提供一种含有抗CTLA-4抗体的组合物，所述的组合物能够提高抗CTLA-4抗体的稳定性。

2、本发明所述的抗CTLA-4抗体组合物够保持抗CTLA-4抗体在2～8℃至少18～24个月的稳定性。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。

实施例

以下实施例1-3中的重组抗CTLA-4全人源单克隆抗体的重链的氨基酸序列为如SEQ ID NO.：1，轻链的氨基酸序列为如SEQ ID NO.：2，

SEQ ID NO.：1的氨基酸序列如下：

SEQ ID NO.：2的氨基酸序列如下：

通用测定方法

SEC-HPLC为体积排阻色谱法，用于分析重组抗CTLA-4全人源单克隆抗体的纯度，具体地，检测重组抗CTLA-4全人源单克隆抗体的聚集及降解。

CEX-HPLC为阳离子交换色谱，用于分析重组抗CTLA-4全人源单克隆抗体的纯度，具体地，检测重组抗CTLA-4全人源单克隆抗体的电荷异质性。

非还原凝胶电泳(NR SDS-PAGE)根据变性后的样品分子大小进行分离，分离的蛋白条带采用考马斯蓝染色，染色的蛋白条带含量应用分析软件分析重组抗CTLA-4全人源单克隆抗体对应各组分蛋白相对纯度，主要评估样品的化学降解。

DSC为差示扫描量热法，具体地，通过重组抗CTLA-4全人源单克隆抗体在不同状态下的荧光的变化来测定Tm(熔解温度)、Tagg(聚集温度)、Tonset(变性温度阈值)

目测法观察来确定重组抗CTLA-4全人源单克隆抗体的沉淀状况。

实施例1单因素制剂组成的热稳定性

本文所用的术语“热稳定性”是通过DSC检测重组抗CTLA-4全人源单克隆抗体Tm值、Tagg值及Tonset值。

考察pH、盐离子、糖、氨基酸、表面活性剂及抗氧化剂等对重组抗CTLA-4全人源单克隆抗体热稳定性影响，制剂配方及热稳定性测定结果见表1。

表1 制剂处方及热稳定性测定结果

注：除A18重组抗CTLA-4全人源单克隆抗体浓度为28mg/ml外，其余制剂处方重组抗CTLA-4全人源单克隆抗体浓度均为5mg/ml；“％”为重量百分比(wt％)，以制剂的总重量计。

表1对样品的热力学参数进行研究，考察了pH、NaCl、糖类、精氨酸、吐温80、EDTA、缓冲液类型及缓冲液浓度对重组抗CTLA-4全人源单克隆抗体的热稳定性的影响。

1)pH的影响考察了重组抗CTLA-4全人源单克隆抗体在pH5.0～pH7.5时的热稳定性(A5～A9)，结果显示：当pH＜6.0时，制剂样品热稳定性值Tonset、Tm及Tagg值相对偏低，在pH6.0～7.5范围内的制剂样品热稳定性值Tonset、Tm相对稳定，且pH6.0的样品有最高Tagg值。

2)NaCl浓度的影响考察了NaCl浓度范围在0～120mM内的制剂样品(A1～A4)热稳定性，测定的热稳定性值没有明显差异，结果表明NaCl浓度对样品的热稳定性无明显的影响。

3)糖的影响考察了甘露醇含量在0～5％范围内制剂样品的热稳定性(A3，A10，A11)，海藻糖浓度范围为0～10％(A3，A12，A13)的制剂样品的热稳定性，蔗糖浓度范围为0～10％(A3，A14，A15)的制剂样品的热稳定性，结果显示随着糖的浓度增加，热稳定性值都有增加的趋势，但甘露醇、海藻糖、蔗糖种类对制剂样品的热稳定性没有明显的影响。

4)精氨酸浓度的影响：考察了精氨酸浓度在0～60mM范围内的制剂样品(A3，A16，A17)的热稳定性，含有精氨酸的制剂样品热稳定性没有差异，相对于不含有精氨酸的制剂样品测定的热稳定性值略有下降，结果表明精氨酸浓度对重组抗CTLA-4全人源单克隆抗体的热稳定性并无明显影响。

5)重组抗CTLA-4全人源单克隆抗体浓度的影响考察了制剂体系重组抗CTLA-4全人源单克隆抗体浓度(A3，A18)对制剂热稳定性的影响，当重组抗CTLA-4全人源单克隆抗体浓度从增加至28mg/ml时，Tagg明显下降。

6)吐温80浓度的影响考察了聚山梨酯80浓度在0～0.1％范围内的制剂样品(S3，S19，S20)的热稳定性，测定的热稳定性值没有明显差异，表明吐温80的浓度对重组抗CTLA-4全人源单克隆抗体的热稳定性并无明显影响。

7)EDTA浓度的影响考察了EDTA浓度在0～0.01％范围内的制剂样品(A3，A21，A22)的热稳定性，热稳定性值没有明显差异，结果表明EDTA浓度对重组抗CTLA-4全人源单克隆抗体的热稳定性无明显影响。

8)缓冲溶液的影响考察了三种缓冲溶液制剂体系下样品(A3，A23，A24)热稳定性，测定的热稳性值没有明显差异，结果表明磷酸缓冲液、柠檬酸缓冲液和柠檬酸钠-磷酸缓冲液均适用于重组抗CTLA-4全人源单克隆抗体制剂。

上述结果表明：制剂体系pH、重组抗CTLA-4全人源单克隆抗体浓度、糖的含量对重组抗CTLA-4全人源单克隆抗体热稳定性有明显的影响。根据表1的结果，结合拟定注射剂量，选择重组抗CTLA-4全人源单克隆抗体浓度为5mg/mL，溶液缓冲溶液为pH6.0，含有多种辅料组成的制剂，在室温条件下储存约12个月后考察重组抗CTLA-4全人源单克隆抗体的热稳定性，制剂配方及热稳定性测定结果见表2，结果显示：

9)缓冲溶液类型及浓度的影响考察了3种缓冲体系包括磷酸缓冲液、磷酸—柠檬酸缓冲溶液、柠檬酸缓冲溶液在不同浓度条件下的制剂样品稳定性，磷酸缓冲液浓度分别为20mM、40mM、60mM(B7，B8，B9)，磷酸-柠檬酸缓冲溶液浓度分别为13mM、26mM、40mM(B4，B5，B6)，柠檬酸缓冲溶液浓度分别为10mM、20mM、30mM(B1，B2，B3)，结果显示：随着缓冲溶液浓度的变化，测定热稳定性值Tm1没有发生明显的变化，而柠檬酸缓冲溶液、磷酸-柠檬酸缓冲溶液测定的Tagg值随溶液浓度的增加略有下降趋势；

10)糖的影响在磷酸缓冲液组合辅料条件下，考察单糖甘露醇(B12、B13、B14)与二糖海藻糖(B8、B10、B11)的热稳定性，糖的含量对制剂的热稳定性没有表现出明显的差异，且两者有相近的Tonset、Tm1值，但甘露醇有相对较高的Tagg值。

11)NaCl与甘露醇的影响在磷酸缓冲液体系下，含有甘露醇与NaCl辅料的制剂样品(B15、B16、B17)的热稳定性没有随NaCl含量的变化而表现出明显的差异；在含有NaCl的制剂中，随着甘露醇浓度的提高，样品Tagg值有增加的趋势(B16、B18、B19)。

上述结果表明：缓冲溶液浓度对重组抗CTLA-4全人源单克隆抗体的热稳定性没有明显影响，制剂体系组成中的甘露醇有助于维持重组抗CTLA-4全人源单克隆抗体的稳定性。

表2 制剂处方选择及热稳定性测定结果

注：各制剂中重组抗CTLA-4全人源单克隆抗体浓度为5mg/mL；“％”为重量百分比(wt％)，以制剂的总重量计。

实施例2组合制剂体系对纯度的影响

本文所用的术语“纯度”是指由SEC-HPLC及CEX-HPLC检测的重组抗CTLA-4全人源单克隆抗体纯度，重组抗CTLA-4全人源单克隆抗体单体分子由于外部环境影响，可能会形成多聚体、产生降解、发生化学修饰(包括脱胺、氧化、焦谷酰胺化、N-末端赖氨酸去除等)，通过SEC-HPLC分析单体、聚集体、小分子片段的相对含量；CEX-HPLC分析重组抗CTLA-4全人源单克隆抗体电荷异质性。

实施例1中主要通过考察辅料及制剂组成热力学参数的变化趋势确定各种因素对样品稳定性的影响，表3通过考察不同制剂组成在加速试验条件下的样品理化性质的变化进一步确认辅料组成对样品稳定性的影响。

将浓度为5mg/mL重组抗CTLA-4全人源单克隆抗体浓度处理成表3制剂处方，制剂置于37℃恒温箱中，孵育2周后，测定重组抗CTLA-4全人源单克隆抗体的纯度及电荷异质性，各制剂配方及纯度检测结果见表3。

制剂组成对重组抗CTLA-4全人源单克隆抗体纯度影响如下：

1)缓冲溶液影响考察了3种缓冲体系包括磷酸缓冲液、磷酸-柠檬酸缓冲溶液、柠檬酸缓冲溶液体系条件下制剂样品的稳定性，在含有海藻糖的制剂样品中，柠檬酸缓冲溶液体系有相对较高的纯度，在含有甘露糖的制剂样品中，缓冲溶液的类型对测定的重组抗CTLA-4全人源单克隆抗体纯度没有影响，但从整体而言，在含有辅料甘露醇制剂样品中测定的重组抗CTLA-4全人源单克隆抗体纯度要高于海藻糖，该结果同甘露醇能提高制剂的Tagg值判断一致；在含有海藻糖与甘露醇的制剂样品中，缓冲溶液的浓度对测定的IEC主峰纯度没有明显影响，但柠檬酸缓冲溶液体系中测定的IEC主峰纯度相对于另外两种缓冲体系偏低。

2)糖的影响改变制剂组成中海藻糖、甘露醇浓度，测定的SEC纯度没有明显的变化，但制剂组成中含有甘露醇，测定的SEC纯度相对于海藻糖较高，在含有NaCl制剂组成中，增加甘露醇含量，测定的SEC纯度没有明显的变化。

2)NaCl的影响：在含有甘露醇制剂组成中，改变NaCl浓度对SEC纯度没有明显的影响，但当NaCl浓度增加至90mM时，测定的SEC纯度有轻微下降趋势。

3)NaCl与甘露醇组合的影响：在含有甘露醇制剂组成中，改变NaCl浓度，测定的IEC主峰纯度没有明显影响；在含有NaCl制剂组成中，增加甘露醇含量，测定的IEC主峰纯度也没有明显影响；但在含有甘露醇与NaCl制剂中，测定的IEC主峰纯度高于不含有NaCl的甘露醇制剂。

结果表明：在制剂体系组成添加甘露醇有助于抑制重组抗CTLA-4全人源单克隆抗体聚集，含有甘露醇与NaCl组合的制剂有助于抑制重组抗CTLA-4全人源单克隆抗体降解。

表3 制剂配方及纯度检测结果

注：各制剂中重组抗CTLA-4全人源单克隆抗体浓度为5mg/mL；单体为SEC-HPLC测定的重组抗CTLA-4全人源单克隆抗体纯度，主峰为CEX-HPLC测定的重组抗CTLA-4全人源单克隆抗体纯度；“％”为重量百分比(wt％)，以制剂的总重量计。

实施例3制剂组成的确认

根据实施例1和2研究结果，初步确定了重组抗CTLA-4全人源单克隆抗体的制剂组成应包括磷酸缓冲液、甘露醇、NaCl、吐温80，重组抗CTLA-4全人源单克隆抗体浓度为5mg/mL，按照表4进行制备制剂样品，评估辅料浓度、pH对重组抗CTLA-4全人源单克隆抗体理化性质的影响，确认制剂处方。

试验条件分别为冻融加速试验、高温加速试验。

通过冻融实验，考察制剂组成的稳定性。试验条件为制剂在-20℃冷冻，室温融化，循环次数分别为3次及5次。通过冻融前后的外观、重组抗CTLA-4全人源单克隆抗体相对含量及SEC-HPLC测定重组抗CTLA-4全人源单克隆抗体纯度，评估制剂组成的稳定性。

冻融前后外观及重组抗CTLA-4全人源单克隆抗体含量测定结果见表4，重组抗CTLA-4全人源单克隆抗体纯度结果见表5。

冻融加速试验结果显示：冻融过程中，重组抗CTLA-4全人源单克隆抗体易于发生聚集，甚至产生沉淀；提高甘露醇含量，降低NaCl含量，有利于抑制重组抗CTLA-4全人源单克隆抗体冻融期间的聚集与沉淀，在pH相对较高的条件下现象尤为明显(F3、F6及F12)，推测原因是提高甘露醇含量有利于抑制NaCl在冻存期间以晶体形式析出；EDTA的浓度对重组抗CTLA-4全人源单克隆抗体的冻融稳定性并无明显影响。

表4 冻融制剂外观及重组抗CTLA-4全人源单克隆抗体浓度

注：“－”表示澄清液体，“+”轻微乳光，“++”表示浑浊，“+++”表示析出沉淀；各制剂中重组抗CTLA-4全人源单克隆抗体浓度为5mg/mL；“％”为重量百分比(wt％)，以制剂的总重量计。

表5 冻融制剂重组抗CTLA-4全人源单克隆抗体纯度变化

通过高温加速实验，制剂在60℃，24小时孵育，评估制剂稳定性，理化性质检测方法包括SEC-HPLC、CEX-HPLC、NR SDS-PAGE。检测结果见表6、表7、图1及图2。

结果显示：

1)pH影响

比较三组制剂处方样品，试验组A(F1、F2及F3)、试验组B(F4、F8及F6)、试验组C(F10、F11及F12)，结果显示：随着pH升高，聚集体有增加趋势(见表6)，电荷异质性中的主峰、碱性峰明显下降，酸性峰对应增加。

2)NaCl影响

试验组(F5、F8及F7)中逐渐提高NaCl浓度，观察到重组抗CTLA-4全人源单克隆抗体聚集体逐渐增加，重组抗CTLA-4全人源单克隆抗体纯度呈下降趋势，但电荷异构体主峰相对含量有增加的趋势。

3)甘露醇影响

试验C组中提高甘露醇含量至5％，不添加NaCl，能明显抑制聚集体生成，但电荷异构体主峰呈相对下降趋势。

4)EDTA影响

试验组(F8、F13及F14)中逐渐提高EDTA浓度，对多聚体形成抑制及IEC主峰含量改变没有明显影响。

5)吐温80影响

试验组(F8、F9)中提高吐温80含量时，多聚体增加及IEC主峰含量下降，可能与高温条件下吐温80发生降解相关，结合冻融试验结果，重组抗CTLA-4全人源单克隆抗体制剂处方含有0.01％吐温80能维持重组抗CTLA-4全人源单克隆抗体的稳定性。

表6 60℃高温孵育24小时测定重组抗CTLA-4全人源单克隆抗体纯度(SEC-HPLC)变化

注：重组抗CTLA-4全人源单克隆抗体浓度为5mg/mL；“％”为重量百分比(wt％)，以制剂的总重量计。

表7 60℃高温孵育24小时测定重组抗CTLA-4全人源单克隆抗体纯度(CEX-HPLC)变化

图1及图2所示，60℃孵育24小时，所有制剂降解均有增加，多聚体增加较为明显。制剂缓冲体系pH增加至6.5时，对应制剂为F3、F12、F6，观察到多聚体明显增加，见图1泳道6及泳道9、图2泳道4；制剂中甘露醇含量较低时，多聚体含量明显增加，对应制剂为F1、F2、F3，见图1泳道4及泳道5、6；制剂中添加EDTA没有达到抑制多聚体形成的作用；F4(图2泳道2)、F5(图2泳道3)、F10(图1泳道7)加样孔中样品组分条带颜色相对较浅，表明F4、F5、F10制剂聚集体相对含量较少，该结果和SEC-HPLC测定结果一致；

对制剂组成中的缓冲体系pH、甘露醇、NaCl、EDTA含量进行了确认分析，试验结果表明：制剂缓冲体系适宜pH为6.0，制剂组成中应包含甘露醇和任选地NaCl，其中甘露醇含量不低于40mg/ml，保持适宜的NaCl含量，根据试验结果，确认适宜的制剂处方为F4或F10，分别为5mg/mL重组抗CTLA-4全人源单克隆抗体/20mM磷酸缓冲液/0.01％吐温80/4％甘露醇/30mM NaCl(pH6.0)、5mg/mL重组抗CTLA-4全人源单克隆抗体/20mM磷酸缓冲液/0.01％吐温80/5％甘露醇/0mM NaCl(pH6.0)，制剂缓冲体系pH可控制在5.8～6.2范围内。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 上海赛金生物医药有限公司

<120> 一种抗CTLA-4抗体及融合蛋白的制剂

<130> P2020-1270

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 447

<212> PRT

<213> 人工序列(Artifical Sequence)

<400> 1

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Arg Gln Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

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65 70 75 80

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Met Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro

115 120 125

Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly

130 135 140

Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn

145 150 155 160

Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln

165 170 175

Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser

180 185 190

Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser

195 200 205

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210 215 220

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225 230 235 240

Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg

245 250 255

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Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala

275 280 285

Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val

290 295 300

Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr

305 310 315 320

Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr

325 330 335

Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu

340 345 350

Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys

355 360 365

Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser

370 375 380

Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp

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405 410 415

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Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

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<210> 2

<211> 215

<212> PRT

<213> 人工序列(Artifical Sequence)

<400> 2

Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Gly Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln His Val Ile Ser Ser

20 25 30

Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu

35 40 45

Val Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Asp Thr Gly Val Ser Asp Arg Phe Thr

50 55 60

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu

65 70 75 80

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100 105 110

Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser

115 120 125

Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu

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165 170 175

Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val

180 185 190

Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys

195 200 205

Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215

<210> 3

<211> 453

<212> PRT

<213> 人工序列(Artifical Sequence)

<400> 3

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Ser Phe Pro Asn Tyr

20 25 30

Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Ile Ile Ser Pro Thr Gly Gly Ser Arg Thr Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr

65 70 75 80

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180 185 190

Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn

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Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly

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Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp

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Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro

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Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys

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Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu

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Ser Leu Ser Pro Gly

450

<210> 4

<211> 216

<212> PRT

<213> 人工序列(Artifical Sequence)

<400> 4

Gln Ser Ala Leu Thr Gln Ser Ala Ser Val Ser Gly Phe Pro Gly Gln

1 5 10 15

Ser Ile Thr Val Ser Cys Val Gly Thr Asn Ser Asp Val Glu Ala Tyr

20 25 30

Asp Leu Val Ser Trp Tyr Arg Gln His Pro Asp Lys Ser Pro Asn Leu

35 40 45

Leu Ile Tyr Asp Asn Tyr Lys Arg Pro Ser Gly Val Ser Asp Arg Phe

50 55 60

Ser Ala Phe Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu

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Gln Ala Glu Asp Glu Ala Tyr Tyr Tyr Cys Cys Ser Tyr Ala Gly Phe

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Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr

130 135 140

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Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser

210 215

<210> 5

<211> 453

<212> PRT

<213> 人工序列(Artifical Sequence)

<400> 5

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

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Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly

130 135 140

Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro

145 150 155 160

Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr

165 170 175

Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val

180 185 190

Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn

195 200 205

Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro

210 215 220

Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu

225 230 235 240

Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp

245 250 255

Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp

260 265 270

Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly

275 280 285

Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn

290 295 300

Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp

305 310 315 320

Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro

325 330 335

Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu

340 345 350

Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn

355 360 365

Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile

370 375 380

Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr

385 390 395 400

Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys

405 410 415

Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys

420 425 430

Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu

435 440 445

Ser Leu Ser Pro Gly

450

<210> 6

<211> 217

<212> PRT

<213> 人工序列(Artifical Sequence)

<400> 6

Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Pro Gly Gln

1 5 10 15

Ser Thr Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val Gly Gly Tyr

20 25 30

Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu

35 40 45

Met Ile Tyr Glu Val Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Ser Asn Arg Phe

50 55 60

Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu

65 70 75 80

Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Tyr Arg Ser Ser

85 90 95

Gly Thr Pro Tyr Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly

100 105 110

Gln Pro Lys Ala Asn Pro Thr Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu

115 120 125

Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe

130 135 140

Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Gly Ser Pro Val

145 150 155 160

Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Lys Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys

165 170 175

Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser

180 185 190

His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu

195 200 205

Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser

210 215

Claims

1.一种抗CTLA-4抗体组合物，其特征在于，所述的组合物包括抗CTLA-4单克隆抗体、表面活性剂、缓冲液和稳定剂。

2.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述抗CTLA-4单克隆抗体的含量为0.5-50mg/mL，较佳地0.5-40mg/mL，更佳地0.5-30mg/mL，更佳地0.5-20mg/mL，更佳地1-15mg/mL，更佳地2-10mg/mL，更佳地3-8mg/mL，最佳地5mg/mL。

3.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述的表面活性剂选自下组：聚氧乙烯山梨醇酐脂肪酸酯、聚氧乙烯氢化蓖麻油、甘油脂肪酸酯、聚山梨醇酯、泊洛沙姆，或其组合；

所述的缓冲液选自下组：柠檬酸盐-柠檬酸缓冲液、磷酸盐-磷酸缓冲液，或其组合；和/或

所述的稳定剂选自下组：氨基酸、糖醇，或其组合。

4.如权利要求3所述的组合物，其特征在于，所述的聚山梨醇酯选自下组：聚山梨醇酯20(PS–20，吐温-20)、聚山梨醇酯40(PS-40，吐温-40)、聚山梨醇酯60(PS–60，吐温-60)、聚山梨醇酯80(PS-80，吐温-80)；

所述的氨基酸选自下组：脯氨酸、精氨酸(Arginine)、甘氨酸(Glycine)、组氨酸(Histidine)、甲硫氨酸(Methionine)，或其组合；和/或

所述的糖醇选自下组：蔗糖(Sucrose)、甘露醇(Mannitol)、海藻糖(Trehalose)、麦芽糖(Maltose)、山梨醇(Sorbitol)，或其组合。

5.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述表面活性剂的含量为0.001-8wt％，较佳地0.001-3wt％，更佳地0.001-1wt％，更佳地0.002-0.5wt％，更佳地0.002-0.1wt％，更佳地0.002-0.06wt％，更佳地0.005-0.05wt％，更佳地0.005-0.03wt％，更佳地0.008-0.02wt％，更佳地0.008-0.012wt％，最佳地0.01wt％，以组合物的总重量计；

所述缓冲液的浓度为3-80mM，较佳地5-60mM，更佳地5-40mM，更佳地10-30mM，更佳地15-25mM，更佳地18-22mM；和/或

所述的稳定剂的含量为0.5-50wt％，较佳地0.5-40wt％，更佳地0.8-30wt％，更佳地1-20wt％，更佳地1-15wt％，更佳地1-10wt％，更佳地1-8wt％，更佳地2-7wt％，最佳地4wt％或5wt％，以组合物的总重量计。

6.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述的组合物还包括渗透压调节剂，所述的渗透压调节剂包括无机盐；

优选地，所述的渗透压调节剂的含量为0-80mM，较佳地0-60mM，更佳地0-50mM，更佳地0-30mM。

7.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述的组合物的pH为5.0-7.5，较佳地5.0-7.0，更佳地5.5-6.5，更佳地5.8-6.2，最佳地6.0。

8.一种如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述的抗CTLA-4抗体具有如SEQ IDNO.：1的重链氨基酸序列和SEQ ID NO.：2轻链氨基酸序列；

所述的抗CTLA-4抗体具有如SEQ ID NO.：3的重链氨基酸序列和SEQ ID NO.：4轻链氨基酸序列；或

所述的抗CTLA-4抗体具有如SEQ ID NO.：5的重链氨基酸序列和SEQ ID NO.：6轻链氨基酸序列。

9.一种冻干制剂，所述的冻干制剂通过以下方法制备：

将如权利要求1所述的组合物进行冷冻干燥，得到冻干制剂。

10.如权利要求1所述的组合物或如权利要求9所述冻干制剂的用途，其特征在于，用于制备药物，所述药物用于(i)预防和/或治疗无法切除或转移性黑色素瘤；(ii)预防和/或治疗晚期肾细胞癌；(iii)预防和/或治疗微卫星高度不稳定性或错配修复缺陷的转移性结直肠癌；和/或(iv)用于黑色素瘤辅助治疗。