CN103861102A - 抗ctla-4 抗体组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了包含螯合剂的抗CTLA-4抗体的新型组合物。还提供了用CTLA-4抗体的新型组合物治疗疾病和病状（包括各种瘤形成病状）的方法。

Description

抗CTLA-4 抗体组合物
本申请是申请日为2006年3月2日、申请号为200680015670.4、发明名称为“抗CTLA-4抗体组合物”的发明专利申请的分案申请。
对相关专利和专利申请的交叉参考
本申请要求2005年3月8日提交的美国临时专利申请系列号60/659,766、2005年10月19日提交的美国临时专利申请系列号60/728,165、2005年12月20日提交的美国临时专利申请系列号60/752,712和2006年1月26日提交的美国临时专利申请系列号60/762,456的权益，其全部在此以其全文引用作为参考。
发明背景
细胞毒性T淋巴细胞抗原-4（“CTLA-4”）是蛋白质的免疫球蛋白(“Ig”)超家族的成员。CTLA-4起着下调T细胞激活和保持免疫内环境稳定的作用。已显示，在动物模型中阻断CTLA-4（例如，通过使用CTLA-4抗体）可提高癌症免疫疗法的功效。
文献中已报导了结合CTLA-4并抑制其活性的抗体。例如，属于Pfizer,Inc.和Abgenix,Inc.的美国专利6,682,736报导了几种抗CTLA-4的人单克隆抗体，包括具有抗体11.2.1（现称为ticilimumabTM）的重链和轻链氨基酸序列的CTLA-4抗体。产生抗体11.2.1的杂交瘤细胞系在ATCC登录号PTA-5169下保藏。属于Bristol-Myers Squibb Company的美国专利5,977,318报导了另一种单克隆抗体，其识别并且结合CTLA-4的细胞外结构域，从而阻止CTLA-4与B7抗原的结合。属于Medarex,Inc.的美国公开申请20050201994报导了抗CTLA-4的几种人序列抗体，包括现称为ipilimumabTM的一种抗体。
施用此类CTLA-4抗体的一种可能的方式是通过肠胃外途径施用。例如，美国专利申请6,682,736报导了抗CTLA-4抗体的静脉内制剂，该制剂为包含抗CTLA-4抗体、20mM乙酸钠、0.2mg/ml聚山梨酯80和140mM氯化钠的无菌液体溶液（pH5.5）。
和其他蛋白质制剂一样，对于CTLA-4抗体制剂也存在相同的考虑，即在组合物中的抗体随着时间的化学和物理降解。一般地，CTLA-4抗体制剂应当在预期的贮存和使用条件范围内展示出可接受的化学和物理稳定性，即CTLA-4抗体制剂应当具有足够的保存期并仍保持具有生物学活性。在给定了生产CTL-4抗体产物所必需的时间和资源情况下，减少产品损失的制剂是所希望的。因此，本发明申请公开了展示出相比以前文献中公开的CTLA-4抗体制剂而言提高的化学和/或物理稳定性的新型CTLA-4抗体制剂。
发明概述
在一个方面，本发明提供了包含至少一种抗体和螯合剂的液体药物组合物，所述抗体包含与SEQ ID NO:2中所示的重链氨基酸序列至少95%同一的氨基酸序列，且还包含与SEQ ID NO:4中所示的轻链氨基酸序列至少95%同一性氨基酸序列，其中所述抗体结合人CTLA-4。
本发明还提供了包含至少一种抗体和螯合剂的组合物，所述抗体包含与SEQ ID NO:2中所示的重链氨基酸序列至少90%同一的氨基酸序列，且还包含与SEQ ID NO:4中所示的轻链氨基酸序列至少90%同一的氨基酸序列，其中所述抗体结合人CTLA-4，并且其中所述抗体是IgG2抗体。
本发明还提供了包含至少一种抗体和螯合剂的组合物，所述抗体包含与SEQ ID NO:2中所示的重链氨基酸序列至少90%同一的氨基酸序列，且还包含与SEQ ID NO:4中所示的轻链氨基酸序列至少90%同一的氨基酸序列，其中所述抗体结合人CTLA-4，并且其中所述抗体是人抗体。
本发明还提供了包含至少一种抗体和螯合剂的组合物，所述抗体包含与SEQ ID NO:2中所示的重链氨基酸序列至少90%同一的氨基酸序列，且还包含与SEQ ID NO:4中所示的轻链氨基酸序列至少90%同一的氨基酸序列，其中所述抗体结合人CTLA-4，并且其中所述抗体包含利用人VH3-33种系基因的VH氨基酸序列。
本发明还提供了包含至少一种抗体和螯合剂的组合物，所述抗体包含与SEQ ID NO:2中所示的重链氨基酸序列至少90%同一的氨基酸序列，且还包含与SEQ ID NO:4中所示的轻链氨基酸序列至少90%同一的氨基酸序列，其中所述抗体结合人CTLA-4，并且其中所述抗体具有包含按阅读框与CDR1、CDR2和CDR3序列有效连接的人FR1、FR2和FR3序列的VH氨基酸序列，所述人FR1、FR2和FR3序列利用人VH3-33基因家族。
本发明还提供了包含至少一种抗体和螯合剂的组合物，所述抗体包含与SEQ ID NO:2中所示的重链氨基酸序列至少90%同一的氨基酸序列，且还包含与SEQ ID NO:4中所示的轻链氨基酸序列至少90%同一的氨基酸序列，其中所述抗体结合人CTLA-4，并且其中所述抗体是分离的抗体。
本发明还提供了包含至少一种抗体和螯合剂的组合物，所述抗体包含与SEQ ID NO:2中所示的重链氨基酸序列至少90%同一的氨基酸序列，且还包含与SEQ ID NO:4中所示的轻链氨基酸序列至少90%同一的氨基酸序列，其中所述抗体结合人CTLA-4，并且其中所述抗体是重组抗体。
本发明还提供了包含至少一种抗体和螯合剂的组合物，所述抗体包含与SEQ ID NO:2中所示的重链氨基酸序列至少90%同一的氨基酸序列，且还包含与SEQ ID NO:4中所示的轻链氨基酸序列至少90%同一的氨基酸序列，其中所述抗体结合人CTLA-4，并且其中所述抗体特异性地结合人CTLA-4多肽上的构象表位。
本发明还提供了包含至少一种抗体和螯合剂的组合物，所述抗体包含与SEQ ID NO:2中所示的重链氨基酸序列至少90%同一的氨基酸序列，且还包含与SEQ ID NO:4中所示的轻链氨基酸序列至少90%同一的氨基酸序列，其中所述抗体结合人CTLA-4，并且其中所述抗体包含与SEQ ID NO:2具有至少95%序列同一性的重链氨基酸序列和与SEQID NO:4具有至少95%序列同一性的轻链氨基酸序列。
本发明还提供了包含至少一种抗体和螯合剂的组合物，所述抗体包含与SEQ ID NO:2中所示的重链氨基酸序列至少90%同一的氨基酸序列，且还包含与SEQ ID NO:4中所示的轻链氨基酸序列至少90%同一的氨基酸序列，其中所述抗体结合人CTLA-4，并且其中所述抗体包含与SEQ ID NO:2具有至少99%序列同一性的重链氨基酸序列和与SEQID NO:4具有至少99%序列同一性的轻链氨基酸序列。
本发明还提供了包含至少一种抗体和螯合剂的组合物，所述抗体包含与SEQ ID NO:2中所示的重链氨基酸序列至少90%同一的氨基酸序列，且还包含与SEQ ID NO:4中所示的轻链氨基酸序列至少90%同一的氨基酸序列，其中所述抗体结合人CTLA-4，并且其中所述抗体包含重链氨基酸序列和轻链氨基酸序列，所述重链氨基酸序列含有SEQID NO:2的可变区，和所述轻链氨基酸序列含有SEQ ID NO:4的可变区。
本发明还提供了包含至少一种抗体和螯合剂的组合物，所述抗体包含与SEQ ID NO:2中所示的重链氨基酸序列至少90%同一的氨基酸序列，且还包含与SEQ ID NO:4中所示的轻链氨基酸序列至少90%同一的氨基酸序列，其中所述抗体结合人CTLA-4，并且其中所述抗体包含重链可变区氨基酸序列和轻链可变区氨基酸序列，所述重链可变区氨基酸序列包含SEQ ID NO:5，和所述轻链可变区氨基酸序列包含SEQID NO:6。
本发明还提供了包含至少一种抗体和螯合剂的组合物，所述抗体包含与SEQ ID NO:2中所示的重链氨基酸序列至少90%同一的氨基酸序列，且还包含与SEQ ID NO:4中所示的轻链氨基酸序列至少90%同一的氨基酸序列，其中所述抗体结合人CTLA-4，并且其中所述抗体包含重链氨基酸序列和轻链氨基酸序列，所述重链氨基酸序列包含SEQID NO:2，和所述轻链氨基酸序列包含SEQ ID NO:4。
本发明还提供了包含至少一种抗体和螯合剂的组合物，所述抗体包含与SEQ ID NO:2中所示的重链氨基酸序列至少90%同一的氨基酸序列，且还包含与SEQ ID NO:4中所示的轻链氨基酸序列至少90%同一的氨基酸序列，其中所述抗体结合人CTLA-4，并且其中所述抗体的重链的C-末端赖氨酸不存在。
本发明还提供了包含至少一种抗体和螯合剂的组合物，所述抗体包含与SEQ ID NO:2中所示的重链氨基酸序列至少90%同一的氨基酸序列，且还包含与SEQ ID NO:4中所示的轻链氨基酸序列至少90%同一的氨基酸序列，其中所述抗体结合人CTLA-4，并且其中所述抗体包括具有抗体11.2.1的重链和轻链氨基酸序列的单克隆IgG2抗CTLA-4抗体。
本发明还提供了包含至少一种抗体和螯合剂的组合物，所述抗体包含与SEQ ID NO:2中所示的重链氨基酸序列至少90%同一的氨基酸序列，且还包含与SEQ ID NO:4中所示的轻链氨基酸序列至少90%同一的氨基酸序列，其中所述抗体结合人CTLA-4，并且其中所述抗体具有与由杂交瘤细胞系11.2.1.4（在ATCC登录号PTA-5169下保藏的）产生的抗体相同的重链和轻链氨基酸序列。
本发明还提供了包含至少一种抗体和螯合剂的组合物，所述抗体包含与SEQ ID NO:2中所示的重链氨基酸序列至少90%同一的氨基酸序列，且还包含与SEQ ID NO:4中所示的轻链氨基酸序列至少90%同一的氨基酸序列，其中所述抗体结合人CTLA-4，并且其中所述抗体是ticilimumab。
本发明还提供了包含至少一种抗体和螯合剂的组合物，所述抗体包含与SEQ ID NO:2中所示的重链氨基酸序列至少90%同一的氨基酸序列，且还包含与SEQ ID NO:4中所示的轻链氨基酸序列至少90%同一的氨基酸序列，其中所述抗体结合人CTLA-4，并且其中所述螯合剂选自氨基多元羧酸、羟基氨基羧酸、EDTA盐和衍生物、N-取代的甘氨酸、去铁胺衍生物及其混合物。
本发明还提供了包含至少一种抗体和螯合剂的组合物，所述抗体包含与SEQ ID NO:2中所示的重链氨基酸序列至少90%同一的氨基酸序列，且还包含与SEQ ID NO:4中所示的轻链氨基酸序列至少90%同一的氨基酸序列，其中所述抗体结合人CTLA-4，并且其中所述螯合剂选自乙二胺四乙酸、二亚乙基三胺五乙酸5、次氮基三乙酸、N-2-乙酰氨基-2-亚氨基二乙酸、二(氨乙基)乙二醇醚、N,N,N',N'-四乙酸、反式-二氨基环己烷四乙酸（DCTA）、谷氨酸、天冬氨酸、N-羟乙基亚氨基二乙酸、N,N-二-羟乙基甘氨酸、N-(三羟甲基甲基)10甘氨酸、甘氨酰甘氨酸、2-(2-氨基-2-氧代乙基)氨基乙烷磺酸、去铁胺、甲磺酸去铁胺、依地酸二钾、依地酸二钠、依地酸钙二钠、依地酸钠、依地酸三钠、依地酸钾、柠檬酸、柠檬酸钠、无水柠檬酸、柠檬酸三钠二水合物、烟酰胺、脱氧胆酸钠及其混合物。
本发明还提供了包含至少一种抗体和螯合剂的组合物，所述抗体包含与SEQ ID NO:2中所示的重链氨基酸序列至少90%同一的氨基酸序列，且还包含与SEQ ID NO:4中所示的轻链氨基酸序列至少90%同一的氨基酸序列，其中所述抗体结合人CTLA-4，并且其中所述螯合剂是EDTA。
本发明还提供了包含至少一种抗体和螯合剂并进一步包含缓冲剂的组合物，所述抗体包含与SEQ ID NO:2中所示的重链氨基酸序列至少90%同一的氨基酸序列，且还包含与SEQ ID NO:4中所示的轻链氨基酸序列至少90%同一的氨基酸序列，其中所述抗体结合人CTLA-4。
本发明还提供了包含至少一种抗体和螯合剂并进一步包含缓冲剂的组合物，所述抗体包含与SEQ ID NO:2中所示的重链氨基酸序列至少90%同一的氨基酸序列，且还包含与SEQ ID NO:4中所示的轻链氨基酸序列至少90%同一的氨基酸序列，其中所述抗体结合人CTLA-4，并且其中所述缓冲剂选自乙酸盐、琥珀酸盐、葡萄糖酸盐、柠檬酸盐、组氨酸、乙酸、磷酸盐、磷酸、抗坏血酸盐、酒石酸、马来酸、甘氨酸、乳酸盐、乳酸、抗坏血酸、咪唑、碳酸氢盐和碳酸、琥珀酸、苯甲酸钠、苯甲酸、葡萄糖酸盐、依地酸盐、乙酸盐、苹果酸盐、咪唑、tris、磷酸盐及其混合物。
本发明还提供了包含至少一种抗体和螯合剂并进一步包含缓冲剂的组合物，所述抗体包含与SEQ ID NO:2中所示的重链氨基酸序列至少90%同一的氨基酸序列，且还包含与SEQ ID NO:4中所示的轻链氨基酸序列至少90%同一的氨基酸序列，其中所述抗体结合人CTLA-4，并且其中所述缓冲剂包括组氨酸。
本发明还提供了包含至少一种抗体和螯合剂并进一步包含组氨酸的组合物，所述抗体包含与SEQ ID NO:2中所示的重链氨基酸序列至少90%同一的氨基酸序列，且还包含与SEQ ID NO:4中所示的轻链氨基酸序列至少90%同一的氨基酸序列，其中所述抗体结合人CTLA-4，并且其中所述组氨酸包括L-组氨酸或D-组氨酸。
本发明还提供了包含至少一种抗体和螯合剂并进一步包含组氨酸的组合物，所述抗体包含与SEQ ID NO:2中所示的重链氨基酸序列至少90%同一的氨基酸序列，且还包含与SEQ ID NO:4中所示的轻链氨基酸序列至少90%同一的氨基酸序列，其中所述抗体结合人CTLA-4，并且其中所述组氨酸包括L-组氨酸。
本发明还提供了包含至少一种抗体和螯合剂的组合物，所述抗体包含与SEQ ID NO:2中所示的重链氨基酸序列至少90%同一的氨基酸序列，且还包含与SEQ ID NO:4中所示的轻链氨基酸序列至少90%同一的氨基酸序列，其中所述抗体结合人CTLA-4，其中所述组合物包含浓度在大约0.1至大约200mg/ml范围内的抗体。
本发明还提供了包含至少一种抗体和螯合剂的组合物，所述抗体包含与SEQ ID NO:2中所示的重链氨基酸序列至少90%同一的氨基酸序列，且还包含与SEQ ID NO:4中所示的轻链氨基酸序列至少90%同一的氨基酸序列，其中所述抗体结合人CTLA-4，其中所述组合物包含浓度为大约20mg/ml的抗体。
本发明还提供了包含至少一种抗体和螯合剂的组合物，所述抗体包含与SEQ ID NO:2中所示的重链氨基酸序列至少90%同一的氨基酸序列，且还包含与SEQ ID NO:4中所示的轻链氨基酸序列至少90%同一的氨基酸序列，其中所述抗体结合人CTLA-4，其中所述组合物进一步包含至少一种选自张度剂、表面活性剂和缓冲剂的赋形剂。
本发明还提供了包含至少一种抗体和螯合剂的组合物，所述抗体包含与SEQ ID NO:2中所示的重链氨基酸序列至少90%同一的氨基酸序列，且还包含与SEQ ID NO:4中所示的轻链氨基酸序列至少90%同一的氨基酸序列，其中所述抗体结合人CTLA-4，其中所述组合物进一步包含至少两种选自张度剂、表面活性剂和缓冲剂的赋形剂。
本发明还提供了包含至少一种抗体和螯合剂的组合物，所述抗体包含与SEQ ID NO:2中所示的重链氨基酸序列至少90%同一的氨基酸序列，且还包含与SEQ ID NO:4中所示的轻链氨基酸序列至少90%同一的氨基酸序列，其中所述抗体结合人CTLA-4，其中所述组合物进一步包含张度剂、表面活性剂和缓冲剂。
本发明还提供了包含至少一种抗体和螯合剂的组合物，所述抗体包含与SEQ ID NO:2中所示的重链氨基酸序列至少90%同一的氨基酸序列，且还包含与SEQ ID NO:4中所示的轻链氨基酸序列至少90%同一的氨基酸序列，其中所述抗体结合人CTLA-4，其中所述组合物进一步包含张度剂、抗氧化剂、表面活性剂和缓冲剂。
本发明还提供了包含至少一种抗体和螯合剂的组合物，所述抗体包含与SEQ ID NO:2中所示的重链氨基酸序列至少90%同一的氨基酸序列，且还包含与SEQ ID NO:4中所示的轻链氨基酸序列至少90%同一的氨基酸序列，其中所述抗体结合人CTLA-4，其中所述组合物进一步包含至少一种选自张度剂、表面活性剂和缓冲剂的赋形剂，其中所述张度剂包括糖类。
本发明还提供了包含至少一种抗体和螯合剂的组合物，所述抗体包含与SEQ ID NO:2中所示的重链氨基酸序列至少90%同一的氨基酸序列，且还包含与SEQ ID NO:4中所示的轻链氨基酸序列至少90%同一的氨基酸序列，其中所述抗体结合人CTLA-4，其中所述组合物进一步包含至少一种选自张度剂、表面活性剂和缓冲剂的赋形剂，其中所述张度剂包括至少一种选自果糖、葡萄糖、甘露糖、山梨糖、木糖、乳糖、麦芽糖、蔗糖、葡聚糖、出芽短梗霉聚糖、糊精、环糊精、可溶性淀粉、羟乙基淀粉、水溶性葡聚糖及其混合物的赋形剂。
本发明还提供了包含至少一种抗体和螯合剂的组合物，所述抗体包含与SEQ ID NO:2中所示的重链氨基酸序列至少90%同一的氨基酸序列，且还包含与SEQ ID NO:4中所示的轻链氨基酸序列至少90%同一的氨基酸序列，其中所述抗体结合人CTLA-4，其中所述组合物进一步包含至少一种选自张度剂、表面活性剂和缓冲剂的赋形剂，其中所述张度剂包括多元醇。
本发明还提供了包含至少一种抗体和螯合剂的组合物，所述抗体包含与SEQ ID NO:2中所示的重链氨基酸序列至少90%同一的氨基酸序列，且还包含与SEQ ID NO:4中所示的轻链氨基酸序列至少90%同一的氨基酸序列，其中所述抗体结合人CTLA-4，其中所述组合物进一步包含至少一种选自张度剂、表面活性剂和缓冲剂的赋形剂，其中所述多元醇选自甘露醇、海藻糖、山梨糖醇、赤藓糖醇、isomalt、乳糖醇、麦芽糖醇、木糖醇、甘油、拉克替醇、丙二醇、聚乙二醇、肌醇及其混合物。
本发明还提供了包含至少一种抗体和螯合剂的组合物，所述抗体包含与SEQ ID NO:2中所示的重链氨基酸序列至少90%同一的氨基酸序列，且还包含与SEQ ID NO:4中所示的轻链氨基酸序列至少90%同一的氨基酸序列，其中所述抗体结合人CTLA-4，其中所述组合物进一步包含至少一种选自张度剂、表面活性剂和缓冲剂的赋形剂，其中所述张度剂包括非还原性糖。
本发明还提供了包含至少一种抗体和螯合剂的组合物，所述抗体包含与SEQ ID NO:2中所示的重链氨基酸序列至少90%同一的氨基酸序列，且还包含与SEQ ID NO:4中所示的轻链氨基酸序列至少90%同一的氨基酸序列，其中所述抗体结合人CTLA-4，其中所述组合物进一步包含至少一种选自张度剂、表面活性剂和缓冲剂的赋形剂，其中所述张度剂包括非还原性糖，其中所述非还原性糖包括至少一种选自蔗糖、海藻糖及其混合物的赋形剂。
本发明还提供了包含至少一种抗体和螯合剂的组合物，所述抗体包含与SEQ ID NO:2中所示的重链氨基酸序列至少90%同一的氨基酸序列，且还包含与SEQ ID NO:4中所示的轻链氨基酸序列至少90%同一的氨基酸序列，其中所述抗体结合人CTLA-4，其中所述组合物进一步包含至少一种选自张度剂、表面活性剂和缓冲剂的赋形剂，其中所述张度剂包括非还原性糖，其中所述非还原性糖是海藻糖。
本发明还提供了包含至少一种抗体和螯合剂的组合物，所述抗体包含与SEQ ID NO:2中所示的重链氨基酸序列至少90%同一的氨基酸序列，且还包含与SEQ ID NO:4中所示的轻链氨基酸序列至少90%同一的氨基酸序列，其中所述抗体结合人CTLA-4，其中所述组合物进一步包含至少一种选自张度剂、表面活性剂和缓冲剂的赋形剂，其中所述表面活性剂选自聚山梨酯、泊洛沙姆、tritons、十二烷基硫酸钠、月桂基硫酸钠、辛基糖苷钠（sodium octyl glycoside）、月桂基-磺基甜菜碱、肉豆蔻基-磺基甜菜碱、亚油基（linoleyl）-磺基甜菜碱、硬脂基-磺基甜菜碱、月桂基-肌氨酸、肉豆蔻基-肌氨酸、亚油基-肌氨酸、硬脂基-肌氨酸、亚油基-甜菜碱、肉豆蔻基-甜菜碱、鲸蜡基-甜菜碱、月桂酰胺丙基-甜菜碱、椰油酰胺丙基-甜菜碱、亚油酰胺丙基-甜菜碱、肉豆蔻酰胺丙基-甜菜碱、palmidopropyl-甜菜碱、异硬脂酰胺丙基-甜菜碱、肉豆蔻酰胺丙基-二甲胺、palmidopropyl-二甲胺、异硬脂酰胺丙基-二甲胺、甲基椰油基牛磺酸钠、甲基油基牛磺酸二钠、氯化二羟丙基peg5linoleammonium、聚乙二醇、聚丙二醇及其混合物。
本发明还提供了包含至少一种抗体和螯合剂的组合物，所述抗体包含与SEQ ID NO:2中所示的重链氨基酸序列至少90%同一的氨基酸序列，且还包含与SEQ ID NO:4中所示的轻链氨基酸序列至少90%同一的氨基酸序列，其中所述抗体结合人CTLA-4，其中所述组合物进一步包含至少一种选自张度剂、表面活性剂和缓冲剂的赋形剂，其中所述表面活性剂选自聚山梨酯20、聚山梨酯21、聚山梨酯40、聚山梨酯60、聚山梨酯61、聚山梨酯65、聚山梨酯80、聚山梨酯81、聚山梨酯85及其混合物。
本发明还提供了包含至少一种抗体和螯合剂的组合物，所述抗体包含与SEQ ID NO:2中所示的重链氨基酸序列至少90%同一的氨基酸序列，且还包含与SEQ ID NO:4中所示的轻链氨基酸序列至少90%同一的氨基酸序列，其中所述抗体结合人CTLA-4，其中所述组合物进一步包含至少一种选自张度剂、表面活性剂和缓冲剂的赋形剂，其中所述表面活性剂是聚山梨酯80。
本发明还提供了包含至少一种抗体和螯合剂的组合物，所述抗体包含与SEQ ID NO:2中所示的重链氨基酸序列至少90%同一的氨基酸序列，且还包含与SEQ ID NO:4中所示的轻链氨基酸序列至少90%同一的氨基酸序列，其中所述抗体结合人CTLA-4，其中所述组合物进一步包含至少一种选自张度剂、表面活性剂和缓冲剂的赋形剂，其中所述缓冲剂包括组氨酸。
本发明还提供了包含至少一种抗体和螯合剂的组合物，所述抗体包含与SEQ ID NO:2中所示的重链氨基酸序列至少90%同一的氨基酸序列，且还包含与SEQ ID NO:4中所示的轻链氨基酸序列至少90%同一的氨基酸序列，其中所述抗体结合人CTLA-4，其中所述组合物进一步包含聚山梨酯80。
本发明还提供了包含至少一种抗体和螯合剂的组合物，所述抗体包含与SEQ ID NO:2中所示的重链氨基酸序列至少90%同一的氨基酸序列，且还包含与SEQ ID NO:4中所示的轻链氨基酸序列至少90%同一的氨基酸序列，其中所述抗体结合人CTLA-4，其中所述组合物进一步包含海藻糖。
本发明还提供了包含至少一种抗体的组合物，所述抗体包含与SEQ ID NO:2中所示的重链氨基酸序列至少90%同一的氨基酸序列，且还包含与SEQ ID NO:4中所示的轻链氨基酸序列至少90%同一的氨基酸序列，其中所述抗体结合人CTLA-4，其中所述组合物还包含组氨酸、海藻糖、聚山梨酯80和EDTA。
本发明还提供了包含至少一种抗体的组合物，所述抗体包含与SEQ ID NO:2中所示的重链氨基酸序列至少90%同一的氨基酸序列，且还包含与SEQ ID NO:4中所示的轻链氨基酸序列至少90%同一的氨基酸序列，其中所述抗体结合人CTLA-4，其中所述组合物还包含组氨酸、海藻糖、聚山梨酯80和EDTA，并且其中所述组合物具有大约5.0至大约6.5的pH。
本发明还提供了包含至少一种抗体的组合物，所述抗体包含与SEQ ID NO:2中所示的重链氨基酸序列至少90%同一的氨基酸序列，且还包含与SEQ ID NO:4中所示的轻链氨基酸序列至少90%同一的氨基酸序列，其中所述抗体结合人CTLA-4，其中所述组合物还包含组氨酸、海藻糖、聚山梨酯80和EDTA，其中组氨酸的浓度为大约1mM至大约50mM。
本发明还提供了包含至少一种抗体的组合物，所述抗体包含与SEQ ID NO:2中所示的重链氨基酸序列至少90%同一的氨基酸序列，且还包含与SEQ ID NO:4中所示的轻链氨基酸序列至少90%同一的氨基酸序列，其中所述抗体结合人CTLA-4，其中所述组合物还包含组氨酸、海藻糖、聚山梨酯80和EDTA，其中组氨酸的浓度为大约20mM。
本发明还提供了包含至少一种抗体的组合物，所述抗体包含与SEQ ID NO:2中所示的重链氨基酸序列至少90%同一的氨基酸序列，且还包含与SEQ ID NO:4中所示的轻链氨基酸序列至少90%同一的氨基酸序列，其中所述抗体结合人CTLA-4，其中所述组合物还包含组氨酸、海藻糖、聚山梨酯80和EDTA，其中聚山梨酯80的浓度为大约0.01mg/ml至大约10mg/ml。
本发明还提供了包含至少一种抗体的组合物，所述抗体包含与SEQ ID NO:2中所示的重链氨基酸序列至少90%同一的氨基酸序列，且还包含与SEQ ID NO:4中所示的轻链氨基酸序列至少90%同一的氨基酸序列，其中所述抗体结合人CTLA-4，其中所述组合物还包含组氨酸、海藻糖、聚山梨酯80和EDTA，其中聚山梨酯80的浓度为大约0.2mg/ml。
本发明还提供了包含至少一种抗体的组合物，所述抗体包含与SEQ ID NO:2中所示的重链氨基酸序列至少90%同一的氨基酸序列，且还包含与SEQ ID NO:4中所示的轻链氨基酸序列至少90%同一的氨基酸序列，其中所述抗体结合人CTLA-4，其中所述组合物还包含组氨酸、海藻糖、聚山梨酯80和EDTA，其中EDTA的浓度为大约0.001mg/ml至大约10mg/ml。
本发明还提供了包含至少一种抗体的组合物，所述抗体包含与SEQ ID NO:2中所示的重链氨基酸序列至少90%同一的氨基酸序列，且还包含与SEQ ID NO:4中所示的轻链氨基酸序列至少90%同一的氨基酸序列，其中所述抗体结合人CTLA-4，其中所述组合物还包含组氨酸、海藻糖、聚山梨酯80和EDTA，其中EDTA的浓度为大约0.1mg/ml。
本发明还提供了包含至少一种抗体的组合物，所述抗体包含与SEQ ID NO:2中所示的重链氨基酸序列至少90%同一的氨基酸序列，且还包含与SEQ ID NO:4中所示的轻链氨基酸序列至少90%同一的氨基酸序列，其中所述抗体结合人CTLA-4，其中所述组合物还包含组氨酸、海藻糖、聚山梨酯80和EDTA，其中海藻糖的浓度为大约10mg/ml至大约100mg/ml。
本发明还提供了包含至少一种抗体的组合物，所述抗体包含与SEQ ID NO:2中所示的重链氨基酸序列至少90%同一的氨基酸序列，且还包含与SEQ ID NO:4中所示的轻链氨基酸序列至少90%同一的氨基酸序列，其中所述抗体结合人CTLA-4，其中所述组合物还包含组氨酸、海藻糖、聚山梨酯80和EDTA，其中海藻糖的浓度为大约84mg/ml。
本发明还提供了包含至少一种抗体的组合物，所述抗体包含与SEQ ID NO:2中所示的重链氨基酸序列至少90%同一的氨基酸序列，且还包含与SEQ ID NO:4中所示的轻链氨基酸序列至少90%同一的氨基酸序列，其中所述抗体结合人CTLA-4，其中所述组合物还包含组氨酸、海藻糖、聚山梨酯80和EDTA，其中所述组合物包含大约0.1mg/ml至大约100mg/ml的抗体；大约0.001mg/ml至大约1.0mg/ml的EDTA；大约1mM至大约50mM的组氨酸；大约0.01mg/ml至大约10mg/ml的聚山梨酯80；和大约10mg/ml至大约100mg/ml的海藻糖。
本发明还提供了包含至少一种抗体的组合物，所述抗体包含与SEQ ID NO:2中所示的重链氨基酸序列至少90%同一的氨基酸序列，且还包含与SEQ ID NO:4中所示的轻链氨基酸序列至少90%同一的氨基酸序列，其中所述抗体结合人CTLA-4，其中所述组合物还包含组氨酸、海藻糖、聚山梨酯80和EDTA，其中所述组合物包含：大约20mg/ml的抗体；大约0.1mg/ml的EDTA；大约20mM的组氨酸；大约0.2mg/ml的聚山梨酯80；和大约84mg/ml的海藻糖。
本发明还提供了包含至少一种抗体和螯合剂的组合物，所述抗体包含含有SEQ ID NO:2的重链氨基酸序列和含有SEQ ID NO:4的轻链氨基酸序列，其中所述抗体结合人CTLA-4，并且所述抗体在大约5℃的温度下在至少大约26周内是稳定的。
本发明还提供了包含至少一种抗体和螯合剂的组合物，所述抗体包含含有SEQ ID NO:2的重链氨基酸序列和含有SEQ ID NO:4的轻链氨基酸序列，其中所述抗体结合人CTLA-4，并且所述抗体在大约25℃的温度下在至少大约26周内是稳定的。
本发明还提供了包含至少一种抗体和螯合剂的组合物，所述抗体包含含有SEQ ID NO:2的重链氨基酸序列和含有SEQ ID NO:4的轻链氨基酸序列，其中所述抗体结合人CTLA-4，并且所述抗体在大约40℃的温度下在至少大约26周内是稳定的。
本发明还提供了包含至少一种抗体和螯合剂的组合物，所述抗体包含与SEQ ID NO:2中所示的重链氨基酸序列至少90%同一的氨基酸序列，且还包含与SEQ ID NO:4中所示的轻链氨基酸序列至少90%同一的氨基酸序列，其中所述抗体结合人CTLA-4，并且其中所述抗体在所述组合物的至少一个冷冻和解冻循环期间是稳定的。
本发明还提供了包含至少一种抗体和螯合剂的组合物，所述抗体包含与SEQ ID NO:2中所示的重链氨基酸序列至少90%同一的氨基酸序列，且还包含与SEQ ID NO:4中所示的轻链氨基酸序列至少90%同一的氨基酸序列，其中所述抗体结合人CTLA-4，并且其中所述抗体在所述组合物的至少六个冷冻和解冻循环期间是稳定的。
本发明还提供了包含至少一种抗体和螯合剂的组合物，所述抗体包含与SEQ ID NO:2中所示的重链氨基酸序列至少90%同一的氨基酸序列，且还包含与SEQ ID NO:4中所示的轻链氨基酸序列至少90%同一的氨基酸序列，其中所述抗体结合人CTLA-4，其中当将所述组合物在大约40℃的温度下贮存大约24周时，所述组合物的聚集体色谱图峰面积（aggragate chromatogram peak area）与在大约40℃的温度下贮存大约24周的不含螯合剂的相同组合物的聚集体色谱图峰面积之间的减少为至少大约2%。
本发明还提供了包含至少一种抗体和螯合剂的组合物，所述抗体包含与SEQ ID NO:2中所示的重链氨基酸序列至少90%同一的氨基酸序列，且还包含与SEQ ID NO:4中所示的轻链氨基酸序列至少90%同一的氨基酸序列，其中所述抗体结合人CTLA-4，其中当将所述组合物在大约40℃的温度下贮存大约24周时，所述组合物的聚集体色谱图峰面积与在大约40℃的温度下贮存大约24周的不含螯合剂的相同组合物的聚集体色谱图峰面积之间的减少为至少大约2%，其中所述色谱分离包括SE-HPLC。
本发明还提供了包含至少一种抗体和螯合剂的组合物，所述抗体包含与SEQ ID NO:2中所示的重链氨基酸序列至少90%同一的氨基酸序列，且还包含与SEQ ID NO:4中所示的轻链氨基酸序列至少90%同一的氨基酸序列，其中所述抗体结合人CTLA-4，其中当将所述组合物在大约40℃的温度下贮存大约24周时，所述组合物的聚集体色谱图峰面积与在大约40℃的温度下贮存大约24周的不含螯合剂的相同组合物的聚集体色谱图峰面积之间的减少为至少大约2%，其中使用紫外检测来测量已经聚集的抗体的量。
本发明还提供了包含至少一种抗体和螯合剂的组合物，所述抗体包含与SEQ ID NO:2中所示的重链氨基酸序列至少90%同一的氨基酸序列，且还包含与SEQ ID NO:4中所示的轻链氨基酸序列至少90%同一的氨基酸序列，其中所述抗体结合人CTLA-4，其中当将所述组合物在大约40℃的温度下贮存大约24周时，所述组合物的聚集体色谱图峰面积与在大约40℃的温度下贮存大约24周的不含螯合剂的相同组合物的聚集体色谱图峰面积之间的减少为至少大约2%，其中在214纳米处进行所述紫外检测。
本发明还提供了包含至少一种抗体和螯合剂的组合物，所述抗体包含与SEQ ID NO:2中所示的重链氨基酸序列至少90%同一的氨基酸序列，且还包含与SEQ ID NO:4中所示的轻链氨基酸序列至少90%同一的氨基酸序列，其中所述抗体结合人CTLA-4，其中当将所述组合物在大约40℃的温度下贮存大约24周时，所述组合物的聚集体色谱图峰面积与在大约40℃的温度下贮存大约24周的不含螯合剂的相同组合物的聚集体色谱图峰面积之间的减少为至少大约2%，其中在将所述组合物在大约40℃的温度下贮存大约24周后，所述组合物基本上仍保持清澈和无色。
本发明还提供了包含至少一种抗体和螯合剂的组合物，所述抗体包含与SEQ ID NO:2中所示的重链氨基酸序列至少90%同一的氨基酸序列，且还包含与SEQ ID NO:4中所示的轻链氨基酸序列至少90%同一的氨基酸序列，其中所述抗体结合人CTLA-4，其中当将所述组合物在大约40℃的温度下贮存大约24周时，所述组合物的聚集体色谱图峰面积与在大约40℃的温度下贮存大约24周的不含螯合剂的相同组合物的聚集体色谱图峰面积之间的减少为至少大约2%，并且其中如在用赖氨酰内肽酶酶促消化后接着通过反相HPLC进行分离所测定的，与在不含螯合剂的组合物中的抗体相比，当将所述组合物在大约40℃的温度下贮存大约24周时，氨基酸位置432处的甲硫氨酸残基的总氧化百分比减少等于或大于2.2%的量。
本发明还提供了包含至少一种抗体和螯合剂的组合物，所述抗体包含与SEQ ID NO:2中所示的重链氨基酸序列至少90%同一的氨基酸序列，且还包含与SEQ ID NO:4中所示的轻链氨基酸序列至少90%同一的氨基酸序列，其中所述抗体结合人CTLA-4，其中当将所述组合物在大约40℃的温度下贮存大约24周时，所述组合物的聚集体色谱图峰面积与在大约40℃的温度下贮存大约24周的不含螯合剂的相同组合物的聚集体色谱图峰面积之间的减少为至少大约2%，并且其中如在用赖氨酰内肽酶酶促消化后接着通过反相HPLC进行分离所测定的，与在不含螯合剂的组合物中的抗体相比，当将所述组合物在大约40℃的温度下贮存大约24周时，氨基酸位置256处的甲硫氨酸残基的总氧化百分比减少等于或大于4.2%的量。
本发明还提供了包含至少一种抗体和螯合剂的组合物，所述抗体基本上由与SEQ ID NO:2中所示的重链氨基酸序列至少90%同一的氨基酸序列组成和进一步基本上由与SEQ ID NO:4中所示的轻链氨基酸序列至少90%同一的氨基酸序列组成，其中所述抗体结合人CTLA-4。
本发明还提供了包含至少一种抗体和螯合剂的组合物，所述抗体由与SEQ ID NO:2中所示的重链氨基酸序列至少90%同一的氨基酸序列组成和进一步由与SEQ ID NO:4中所示的轻链氨基酸序列至少90%同一的氨基酸序列组成，其中所述抗体结合人CTLA-4。
本发明还提供了用于制备稳定的液体药物组合物的方法，其包括将单克隆抗CTLA-4抗体与减少所述抗体不稳定性的量的药学上可接受的螯合剂混合，其中当将所述组合物在大约40℃的温度下贮存大约24周时，所述包含单克隆抗CTLA-4抗体和螯合剂的稳定的液体药物组合物的聚集体色谱图峰面积与在大约40℃的温度下贮存大约24周的不含螯合剂的相同组合物的聚集体色谱图峰面积之间的减少为至少大约2%。
本发明还提供了用于稳定液体药物组合物中的单克隆抗CTLA-4抗体的方法，其包括形成包含所述抗体和药学上可接受的螯合剂的液体组合物，其中当将所述组合物在大约40℃的温度下贮存大约24周时，所述包含单克隆抗CTLA-4抗体和螯合剂的稳定的液体药物组合物的聚集体色谱图峰面积与在大约40℃的温度下贮存大约24周的不含螯合剂的相同组合物的聚集体色谱图峰面积之间的减少为至少大约2%。
本发明还提供了用于治疗受试者中的瘤形成病状的方法，其包括给所述受试者施用液体药物组合物，所述组合物包含：治疗有效量的单克隆抗CTLA-4抗体ticilimumab和药学上可接受的螯合剂。
本发明还提供了用于治疗受试者中的瘤形成病状的方法，其包括给所述受试者施用液体药物组合物，所述组合物包含：治疗有效量的单克隆抗CTLA-4抗体ticilimumab和药学上可接受的螯合剂，其中经静脉内途径给所述受试者施用所述组合物。
本发明还提供了用于治疗受试者中的瘤形成病状的方法，其包括给所述受试者施用液体药物组合物，所述组合物包含：治疗有效量的单克隆抗CTLA-4抗体ticilimumab和药学上可接受的螯合剂，其中所述受试者需要治疗瘤形成病状。
本发明还提供了用于治疗受试者中的瘤形成病状的方法，其包括给所述受试者施用液体药物组合物，所述组合物包含：治疗有效量的单克隆抗CTLA-4抗体ticilimumab和药学上可接受的螯合剂，其中所述瘤形成病状是选自脑癌、鳞状上皮细胞癌、膀胱癌、胃癌、胰腺癌、乳腺癌、头癌、颈癌、食道癌、前列腺癌、结肠直肠癌、肺癌、肾癌、肾脏癌、卵巢癌、妇科癌和甲状腺癌的癌症。
本发明还提供了用于制备经稳定的抗体的液体组合物的试剂盒，其包括：装有单克隆抗CTLA-4抗体ticilimumab溶液的第一容器和装有药学上可接受的螯合剂的第二容器。
本发明还提供了制品，其包括装有至少一种具有ticilimumab的重链和轻链氨基酸序列的抗CTLA-4抗体和螯合剂的混合物的容器。
本发明还提供了包含单克隆抗CTLA-4抗体和药学上可接受的螯合剂的液体药物组合物，其中所述抗体的摩尔浓度在大约0.0006mM至大约1.35mM的范围内，和螯合剂的摩尔浓度在大约0.003mM至大约50mM的范围内，并且其中抗体与螯合剂的摩尔比在大约0.00001至大约450的范围内。
本发明还提供了包含单克隆抗CTLA-4抗体和药学上可接受的螯合剂的液体药物组合物，其中所述抗体的摩尔浓度在大约0.0006mM至大约1.35mM的范围内，和螯合剂的摩尔浓度在大约0.003mM至大约50mM的范围内，并且其中抗体与螯合剂的摩尔比在大约0.00001至大约450的范围内，其中所述抗体包括具有抗体ticilimumab的重链和轻链氨基酸序列的单克隆抗CTLA-4抗体。
本发明还提供了包含单克隆抗CTLA-4抗体和药学上可接受的螯合剂的液体药物组合物，其中所述抗体的摩尔浓度在大约0.0006mM至大约1.35mM的范围内，和螯合剂的摩尔浓度在大约0.003mM至大约50mM的范围内，并且其中抗体与螯合剂的摩尔比在大约0.0001至大约100的范围内。
本发明还提供了包含单克隆抗CTLA-4抗体和药学上可接受的螯合剂的液体药物组合物，其中所述抗体的摩尔浓度在大约0.0006mM至大约1.35mM的范围内，和螯合剂的摩尔浓度在大约0.003mM至大约50mM的范围内，并且其中抗体与螯合剂的摩尔比在大约0.001至大约10的范围内。
本发明还提供了包含单克隆抗CTLA-4抗体和药学上可接受的螯合剂的液体药物组合物，其中所述抗体的摩尔浓度在大约0.0006mM至大约1.35mM的范围内，和螯合剂的摩尔浓度在大约0.003mM至大约50mM的范围内，并且其中抗体与螯合剂的摩尔比在大约0.1至大约1的范围内。
本发明还提供了包含单克隆抗CTLA-4抗体和药学上可接受的螯合剂的液体药物组合物，其中所述抗体的摩尔浓度在大约0.0006mM至大约1.35mM的范围内，和螯合剂的摩尔浓度在大约0.003mM至大约50mM的范围内，并且其中抗体与螯合剂的摩尔比在大约0.00001至大约450的范围内，其中抗体对螯合剂的摩尔比为大约0.5。
本发明还提供了包含至少一种人单克隆抗CTLA抗体和螯合剂的液体药物组合物，其中所述抗体结合人CTLA-4。
本发明还提供了包含至少一种抗体和药学上可接受的赋形剂的药物组合物，所述抗体包含与SEQ ID NO:2中所示的重链氨基酸序列至少95%同一的氨基酸序列，且还包含与SEQ ID NO:4中所示的轻链氨基酸序列至少95%同一的氨基酸序列，其中所述抗体结合人CTLA-4，其中所述组合物包含浓度为至少大约10mg/ml的抗体。
本发明还提供了包含至少一种抗体和药学上可接受的赋形剂的药物组合物，所述抗体包含与SEQ ID NO:2中所示的重链氨基酸序列至少95%同一的氨基酸序列，且还包含与SEQ ID NO:4中所示的轻链氨基酸序列至少95%同一的氨基酸序列，其中所述抗体结合人CTLA-4，其中所述组合物包含浓度在大约10mg/ml至大约25mg/ml范围内的抗体。
本发明还提供了包含至少一种抗体和药学上可接受的赋形剂的药物组合物，所述抗体包含与SEQ ID NO:2中所示的重链氨基酸序列至少95%同一的氨基酸序列，且还包含与SEQ ID NO:4中所示的轻链氨基酸序列至少95%同一的氨基酸序列，其中所述抗体结合人CTLA-4，其中所述组合物包含浓度在大约10mg/ml至大约200mg/ml范围内的抗体。
本发明还提供了包含至少一种抗体和药学上可接受的赋形剂的药物组合物，所述抗体包含与SEQ ID NO:2中所示的重链氨基酸序列至少95%同一的氨基酸序列，且还包含与SEQ ID NO:4中所示的轻链氨基酸序列至少95%同一的氨基酸序列，其中所述抗体结合人CTLA-4，其中所述组合物包含浓度为大约20mg/ml的抗体。
本发明还提供了包含至少一种螯合剂和至少一种抗体的组合物，所述抗体包含与SEQ ID NO:2中所示的重链氨基酸序列至少90%同一的氨基酸序列和与SEQ ID NO:4中所示的轻链氨基酸序列至少90%同一的氨基酸序列，其中所述抗体结合人CTLA-4。
本发明还提供了包含至少一种螯合剂和至少一种抗体的组合物，所述抗体包含与SEQ ID NO:2中所示的重链氨基酸序列至少90%同一的氨基酸序列和与SEQ ID NO:4中所示的轻链氨基酸序列至少90%同一的氨基酸序列，其中所述抗体结合人CTLA-4，并且其中所述抗体包括具有ticilimumab的重链和轻链氨基酸序列的单克隆IgG2抗CTLA-4抗体。
本发明还提供了用于制备液体药物组合物的方法，其包括将至少一种具有ticilimumab的重链和轻链氨基酸序列的抗CTLA-4抗体与至少一种螯合剂在溶液中混合。
本发明还提供了用于治疗受试者中的瘤形成病状的方法，其包括给所述受试者施用液体药物组合物，所述组合物包含：治疗有效量的至少一种具有ticilimumab的重链和轻链氨基酸序列的抗CTLA-4抗体；和药学上可接受的螯合剂。
本发明还提供了用于制备经稳定的抗体的液体组合物的试剂盒，其包括：装有至少一种具有ticilimumab的重链和轻链氨基酸序列的抗CTLA-4抗体溶液的第一容器，和装有药学上可接受的螯合剂的第二容器。
本发明还提供了包含至少一种抗体和药学上可接受的赋形剂的液体药物组合物，所述抗体包含与SEQ ID NO:2中所示的重链氨基酸序列至少95%同一的氨基酸序列，且还包含与SEQ ID NO:4中所示的轻链氨基酸序列至少95%同一的氨基酸序列，其中所述抗体结合人CTLA-4，其中所述组合物包含浓度为至少大约10mg/ml的抗体。
附图简述
图1是条形图，其显示了在40℃下贮存长达7周后通过大小排阻层析（SEC）测得的在各种受试制剂中的聚集百分比；
图2是条形图，其显示了在40℃下贮存长达7周后通过还原型SDSPAGE（rSDSPAGE）测得的在各种受试制剂中的总的（水解的）杂质形成百分比；
图3是线图，其显示了当在40℃下在加速的条件下贮存长达24周时通过SEC测得的在各种受试制剂中的聚集百分比；
图4是线图，其显示了当在40℃下在加速的条件下贮存长达24周时通过rSDSPAGE测得的在各种受试制剂中的总的（水解的）杂质形成百分比；
图5是线图，其显示了当在40℃下在加速的条件下贮存长达24周时通过SEC测得的在各种受试制剂中的聚集百分比；
图6是线图，其显示了当在40℃下在加速的条件下贮存长达24周时通过rSDSPAGE测得的在各种受试制剂中的总的（水解的）杂质形成百分比；
图7是条形图，其显示了当在40℃下在加速的条件下贮存长达24周时，作为EDTA水平的函数的通过SEC测得的在各种受试制剂中的聚集百分比；
图8是条形图，其显示了当在40℃下在加速的条件下贮存长达24周时，作为EDTA水平的函数的通过rSDSPAGE测得的在各种受试制剂中的总的（水解的）杂质形成百分比；
图9是线图，其显示了当在40℃下在加速的条件下贮存长达13周时通过SEC测得的在各种受试制剂中的聚集百分比；
图10是线图，其显示了当在40℃下在加速的条件下贮存长达13周时通过rSDSPAGE测得的在各种受试制剂中的总的（水解的）杂质形成百分比；和
图11，包括图11A-11D，其显示了抗CTLA4抗体11.2.1（现称为ticilimumab）的核苷酸和氨基酸序列。图11A显示了11.2.1重链的全长核苷酸序列（SEQ ID NO:1）。图11B显示了11.2.1重链的全长氨基酸序列（SEQ ID NO:2），和被标示于括号“[]”之间的11.2.1重链可变区的氨基酸序列（SEQ ID NO:5）。每个11.2.1重链CDR的氨基酸序列用下划线标示。所述CDR序列如下：CDR1：GFTFSSYGMH（SEQ ID NO:7）；CDR2：VIWYDGSNKYYADSV（SEQ ID NO:8）；和CDR3：DPRGATLYYYYYGMDV（SEQ ID NO:9）。图11C显示了11.2.1轻链的核苷酸序列（SEQ ID NO:3）。图11D显示了全长11.2.1轻链的氨基酸序列（SEQ ID NO:4），和被标示于括号“[]”之间的轻链可变区（SEQ ID NO:6）。每个CDR的氨基酸序列如下：CDR1：RASQSINSYLD（SEQ ID NO:10）；CDR2：AASSLQS（SEQ ID NO:11）；和CDR3：QQYYSTPFT（SEQ ID NO:12）。
发明详述
除非另外指明，通常按照本领域内熟知的和在整个本说明书中引用和讨论的各种普通及更专业的参考文献中所描述的常规方法来进行本发明的方法和技术。参见，例如，Sambrook等人,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第2版,Cold Spring Harbor LaboratoryPress,Cold Spring Harbor,N.Y.(1989)；和Ausubel等人,CurrentProtocols in Molecular Biology,Greene Publishing Associates(1992)；和Harlow和Lane,Antibodies:A Laboratory Manual,ColdSpring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.(1990)。如本领域所通常施行的或如此处所描述的，按照厂商说明书进行酶促反应和纯化技术。此处描述的涉及分析化学、合成有机化学以及医学和药物化学的术语以及实验室程序和技术是本领域内熟知且常用的。将标准的技术用于化学合成，化学分析，药物的制备、配制和递送，以及受试者的治疗。
定义:
为了帮助读者理解下列详细的描述，提供下列定义：
如此处所用的，术语“制剂”或“组合物”，当其涉及抗CTLA-4抗体时，是希望描述与包括螯合剂在内的药学上可接受的赋形剂相组合的所述抗体。例如，本发明的制剂与本领域公认的制剂相比具有提高的保存期和/或稳定性。
如此处所用的，术语“抗体”是指完整的抗体或与完整的抗体竞争进行特异性结合的抗原结合部分。一般参见，Fundamental Immunology,Ch.7（Paul,W.,ed.,第2版.Raven Press,N.Y.(1989)）。可通过重组DNA技术或通过完整抗体的酶促或化学切割来产生抗原结合部分。在一些实施方案中，抗原结合部分包括Fab、Fab'、F(ab')2、Fd、Fv、dAb和互补性决定区（CDR）片段、单链抗体（scFv）、嵌合抗体、双抗体和多肽，所述多肽包含足以将特异性抗原结合赋予该多肽的至少部分抗体。从N-末端至C-末端，成熟的轻链和重链可变结构域均包含区域FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。按照Kabat,Sequences of Proteins of Immunological Interest(National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1987和1991)),Chothia&Lesk,J.Mol.Biol.196:901-917(1987)，或者Chothia等人,Nature342:878-883(1989)的定义，将氨基酸分配给每个结构域。
如此处所用的，术语“多肽”包括天然的或人工的蛋白质、蛋白质片段和蛋白质序列的多肽类似物。多肽可以是单体或多聚体。
如此处所用的，Fd片段是指由VH和CH1结构域组成的抗体片段；Fv片段由抗体的单臂的VL和VH结构域组成；dAb片段（Ward等人,Nature341:544-546(1989)）由VH结构域组成。
术语“或其抗原结合部分”，当与术语“抗体”一起使用时，是指具有氨基末端和/或羧基末端缺失但其中剩余的氨基酸序列与天然发生的序列中的相应位置相同的多肽。在一些实施方案中，片段长度至少为5、6、8或10个氨基酸。在其他实施方案中，所述片段的长度为至少14、至少20、至少50、或至少70、80、90、100、150或200个氨基酸。
如此处所用的，术语“单克隆抗体”是指获自基本上均质的抗体即单一抗体的群体的抗体，所述群体包括除了可少量存在的可能天然发生的突变或缺少C-末端赖氨酸之外完全相同的群体。单克隆抗体是高度特异性的，其针对单个抗原位点。此外，与常规（多克隆）抗体制剂（其通常包含针对不同决定簇（表位）的不同抗体）相反，每个单克隆抗体针对抗原上的单个决定簇。修饰语“单克隆”指明了获自基本上均质的抗体群体的抗体的特征，但其不被解释为需要通过任何特定的方法来产生该抗体。例如，根据本发明使用的单克隆抗体可通过最早由Kohler,等人,Nature256:495(1975)所描述的杂交瘤方法来制备，或者可通过重组DNA方法(参见，例如美国专利4,816,567)来制备。例如还可使用在Clackson,等人,Nature352:624-628(1991)和Marks,等人,J.Mol.Biol.222:581-597(1991)中描述的技术从噬菌体抗体文库分离“单克隆抗体”。
如此处所用的，术语“分离的抗体”或“纯化的抗体”是指根据其起源或来历具有下列的1至4个方面的抗体：(1)不与在其天然状态下与其相伴的天然结合组分结合，(2)不含来自相同物种的其他蛋白，(3)由来自不同物种的细胞表达，或(4)不是天然发生的。因此，化学合成的或在与其所天然来源的细胞不同的细胞系统中合成的抗体是与其天然结合组分相分离和纯化的。也可使用本领域熟知的蛋白纯化技术，通过分离和纯化使抗体基本上不含天然结合组分。分离的/纯化的抗体的实例包括使用CTLA-4经亲和纯化的抗CTLA-4抗体、在体外通过杂交瘤或其他细胞系合成的抗CTLA-4抗体和来源于转基因小鼠的人抗CTLA-4抗体。
分离的/纯化的抗体的实例包括使用CTLA-4经亲和纯化的抗CTLA-4抗体、在体外通过杂交瘤或其他细胞系合成的抗CTLA-4抗体和来源于转基因小鼠的人抗CTLA-4抗体。因此，在优选的实施方案中，所述抗CTLA-4抗体具有至少大约95%（w/w－抗CTLA-4抗体的重量/除了药学上可接受的赋形剂以外的其他组分的重量）的纯度，并且在进一步的实施方案中，所述抗CTLA-4抗体具有大约95%w/w至大约99.5%w/w的纯度。
当至少大约60至75%的样品展示出单一种类的抗体时，抗体是“基本上纯的”、“基本上均质的”或“基本上纯化的”。所述抗体可以是单体或多聚体。基本上纯的抗体可以通常包含大约50%、60%、70%、80%或90%w/w的抗体样品，更通常地大约95%，和优选地超过99%的纯度。可通过许多本领域内熟知的方法来指明抗体的纯度或均质性，例如通过抗体样品的聚丙烯酰胺凝胶电泳，然后在用本领域内熟知的染料对凝胶染色后显现单个多肽条带。对于某些目的，可通过使用HPLC或本领域内熟知的用于纯化的其他方法来获得更高的分辨率。
如此处所用的，术语“人抗体”希望包括具有来源于人种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区的抗体。本发明的人抗体可在例如CDR（特别是CDR3）中包含不由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基（例如，通过体外随机或定点诱变或通过体内体细胞突变而引入的突变）。然而，术语“人抗体”，如此处所用的，不希望包括这样的抗体，即其中已将来源于另一种哺乳动物物种例如小鼠的种系的CDR序列接枝到人构架序列上。
如此处所用的，术语“重组人抗体”希望包括通过重组方法制备、表达、产生或分离的所有人抗体，例如使用转染入宿主细胞的重组表达载体所表达的抗体，从重组的组合人抗体文库分离的抗体，从对于人免疫球蛋白基因来说为转基因的动物（例如小鼠）中分离的抗体（参见，例如，Taylor,L.D.,等人(1992)Nucl.Acids Res.20:6287-6295)，或通过牵涉将人免疫球蛋白基因序列剪接成其他DNA序列的任何其他方法制备、表达、产生或分离的抗体。这样的重组人抗体具有来源于人种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区。然而，在某些实施方案中，使这样的重组人抗体经历体外诱变（或，当使用对于人Ig序列来说为转基因的动物时，进行体内体细胞诱变），从而重组抗体的VH和VL区的氨基酸序列是这样的序列，即该序列尽管来源于人种系VH和VL序列并与之相关，但在体内可能不是天然地存在于人抗体种系储库内。
如此处所用的，此处可互换使用的术语“多核苷酸”或“核酸”是指长度为至少10个碱基的核苷酸的多聚体形式，所述核苷酸可以是核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸或任一种核苷酸的经修饰的形式。该术语包括单链和双链形式。除非另外指出，“多核苷酸”或“核酸”序列包括其互补序列。因此，当提及具有特定序列的核酸时，应当理解为包括具有其互补序列的其互补链。
如此处所用的，术语“分离的多核苷酸”是指基因组、cDNA或合成来源的多核苷酸或者其一些组合，根据其起源或来历，分离的多核苷酸具有下列的1至3个方面：(1)不与天然地与所述“分离的多核苷酸”一起存在的多核苷酸的全部或部分相结合，(2)有效连接至不与其天然连接的多核苷酸，或(3)不作为更大序列的部分天然发生。
如此处所用的，术语“天然发生的核苷酸”包括脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸。术语“修饰的核苷酸”，如此处所用的，包括具有修饰的或取代的糖基团等的核苷酸。术语“寡核苷酸键”在此处包括诸如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、硒代磷酸酯（phosphoroselenoate）、二硒代磷酸酯（phosphorodiselenoate）、phosphoroanilothioate、phoshoraniladate、氨基磷酸酯（phosphoroamidate）等的寡核苷酸键。参见例如，LaPlanche等人,Nucl.Acids Res.14:9081(1986);Stec等人,J.Am.Chem.Soc.106:6077(1984);Stein等人,Nucl.Acids Res.16:3209(1988);Zon等人,Anti-Cancer Drug Design6:539(1991);Zon等人,Oligonucleotides and Analogues:APractical Approach,pp.87-108(F.Eckstein,Ed.,OxfordUniversity Press,Oxford England(1991));美国专利5,151,510;Uhlmann和Peyman,Chemical Reviews90:543(1990),它们的公开内容在此引用作为参考。如果需要，寡核苷酸可包含用于检测的标记。
“有效连接的”序列包括与目的基因相邻的表达控制序列和以反式或在远距离作用以控制目的基因的表达控制序列。术语“表达控制序列”，如此处所用的，是指实现与其连接的编码序列的表达和加工所必需的多核苷酸序列。表达控制序列包括合适的转录起始、终止、启动子和增强子序列；有效的RNA加工信号例如剪接和多腺苷酸化信号；稳定胞质mRNA的序列；增强翻译效率的序列（即，Kozak共有序列)；增强蛋白稳定性的序列；和当想要时，增加蛋白分泌的序列。此类序列的性质依赖于宿主生物而不同；在原核生物中，此类控制序列通常包括启动子、核糖体结合位点和转录终止序列；在真核生物中，此类控制序列通常包括启动子和转录终止序列。术语“控制序列”希望包括（最低限度）其的存在对于表达和加工来说是必需的所有组件，还可包括其的存在是有利的额外组件，例如，前导序列和融合伙伴序列。
如此处所用的，术语“载体”是指能够转运已与其相连接的另一种核酸的核酸分子。在一些实施方案中，载体是质粒，即可将额外的DNA区段连接入其中的环状双链DNA环。在一些实施方案，载体是病毒载体，其中可将额外的DNA区段连接入病毒基因组中。在一些实施方案中，载体能够在其中导入了它们的宿主细胞中自主复制（例如，具有细菌复制起始点的细菌载体和附加型哺乳动物载体)。在其他实施方案中，在导入宿主细胞后，载体（例如，非附加型哺乳动物载体）可被整合入所述宿主细胞的基因组中，从而所述载体可随宿主基因组一起复制。此外，某些载体能够指导与其有效连接的基因的表达。这样的载体在此处称为“重组表达载体”（或简称为“表达载体”）。
如此处所用的，术语“重组宿主细胞”（或简称“宿主细胞”）是指已将重组表达载体导入其中的细胞。应当题解，“重组宿主细胞”和“宿主细胞”不仅指特定的受试者细胞，而且还指此类细胞的后代。因为由于突变或环境影响的原因，某些修饰可在连续世代中发生，因此这样的后代实际上可能不与亲本细胞完全相同，但仍然包括在此处所用的术语“宿主细胞”的范围之内。
如此处所用的，术语“能够特异性地结合”是指当抗体以≤1μM，优选地≤1nM，和最优选地≤10pM的解离常数与抗原结合时。
如此处所用的，术语“选择性地杂交”是指可检测地和特异性地结合。本发明的多核苷酸、寡核苷酸及其片段在杂交和洗涤条件下选择性地与核酸链杂交，所述条件使对非特异性核酸的可检测结合的可测得的量减少至最低。“高严紧度”或“高度严紧的”条件可用于获得本领域内已知的和此处讨论的选择性杂交条件。“高严紧度”或“高度严紧的”条件的一个实例是在42℃的杂交温度下在6X SSPE或SSC、50%甲酰胺、5X Denhardt’s试剂、0.5%SDS、100μg/ml变性的片段化的鲑精DNA的杂交缓冲液中将多核苷酸和另一种多核苷酸一起温育12至16小时（其中可将一个多核苷酸固定至固体表面例如膜上），然后使用1X SSC,0.5%SDS的洗涤缓冲液在55℃下洗涤2次。还可参见Sambrook等人,同上,pp.9.50-9.55。
术语“序列同一性百分比”在核酸序列情况下是指当就最大对应将第一个连续序列与第二个连续序列进行比较和比对时,对应残基的百分比。序列同一性比较的长度可以是至少大约9个核苷酸，通常至少大约18个核苷酸，更常见地至少大约24个核苷酸，典型地至少大约28个核苷酸，更典型地至少大约32个核苷酸，和优选地至少大约36、48或更多个核苷酸的整个一段序列。存在许多可用于测量核苷酸序列同一性的本领域内已知的不同算法。例如，可使用FASTA、Gap或BESTFIT（其为Wisconsin Package Version10.0,GeneticsComputer Group(GCG),Madison,Wisconsin中的程序）来比较多核苷酸序列。包括例如程序FASTA2和FASTA3的FASTA提供了查询序列和搜索序列之间的最佳重叠区域的比对和序列同一性百分比（Pearson,Methods Enzymol.183:63-98(1990);Pearson,Methods Mol.Biol.132:185-219(2000);Pearson,Methods Enzymol.266:227-258(1996);Pearson,J.Mol.Biol.276:71-84(1998)）。除非另外指明，使用特定程序或算法的缺省参数。例如，可使用FASTA以其缺省参数（字长为6，和用于评分矩阵的NOPAM因子），或使用Gap以其缺省参数（如在GCG Version6.1中所提供的），来测定核酸序列之间的序列同一性百分比。
除非另外明确指出，否则当提及“多核苷酸”或“核酸”序列时，包括其互补序列。因此，当提及具有特定序列的核酸时，应当理解为包括具有其互补序列的其互补链。
术语“基本上的相似性”或“基本上的序列相似性”，当涉及核酸或其片段时，是指当使用合适的核苷酸插入或缺失与另一个核酸（或其互补链）进行最佳比对时，在至少大约85%，优选地至少大约90%，和更优选地至少大约95%、96%、97%、98%或99%的核苷酸碱基中存在核苷酸序列同一性，这是通过任何熟知的序列同一性算法例如上述的FASTA、BLAST或Gap所测量的。
当应用于多肽时，术语“基本上的同一性”、“同一性百分比”或“%同一的”是指，两个肽序列，当最佳比对时，例如通过程序GAP或BESTFIT并使用缺省缺口权重（随程序一起提供的）进行比对时，共有至少70%、75%或80%的序列同一性，优选地至少90%或95%的序列同一性，和更优选地至少97%、98%或99%的序列同一性。在某些实施方案中，不同一的残基位置的差异在于保守性氨基酸置换。“保守性氨基酸置换”是其中一个氨基酸残基被另一个具有有着相似化学性质（例如，电荷或疏水性）的侧链R基团的氨基酸残基替代的置换。一般地，保守性氨基酸置换基本上不改变蛋白质的功能特性。在其中两个或更多个氨基酸序列相互之间的差异在于保守性置换的情况下，可向上调整序列同一性百分比以对于置换的保守性质进行校正。用于进行该调整的方法对于本领域技术人员来说是熟知的。参见，例如，Pearson,Methods Mol.Biol.243:307-31(1994)。具有有着相似化学性质的侧链的氨基酸组的实例包括1)脂肪族侧链：甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸；2)脂肪族-羟基侧链：丝氨酸和苏氨酸；3)包含酰胺的侧链：天冬酰胺和谷氨酰胺；4)芳香族侧链：苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；5)碱性侧链：赖氨酸、精氨酸和组氨酸；6)酸性侧链：天冬氨酸和谷氨酸；和7)含硫侧链：半胱氨酸和甲硫氨酸。保守性氨基酸置换组是：缬氨酸-亮氨酸-异亮氨酸、苯丙氨酸-酪氨酸、赖氨酸-精氨酸、丙氨酸-缬氨酸、谷氨酸-天冬氨酸和天冬酰胺-谷氨酰胺。
通常使用序列分析软件来测量多肽的序列同一性。蛋白质分析软件使用分配给各种置换、缺失和其他修饰（包括保守性氨基酸置换）的相似性的量度来匹配序列。例如，GCG包含诸如“Gap”和“BESTFIT”的程序，可以以缺省参数（如所述程序所指定的缺省参数）使用所述程序来确定紧密相关的多肽例如来自不同生物物种的同源多肽之间或者野生型蛋白质和其突变体之间的序列同源性或序列同一性。参见例如GCG Version6.1。也可使用FASTA并采用缺省或推荐的参数来比较多肽序列，参见GCG Version6.1。（University of Wisconsin WI）FASTA（例如，FASTA2和FASTA3）提供了查询序列和搜索序列之间的最佳重叠区域的比对和序列同一性百分比。（Pearson,MethodsEnzymol.183:63-98(1990);Pearson,Methods Mol.Biol.132:185-219(2000)）。当将本发明的序列与包含大量来自不同生物的序列的数据库进行比较时，另一种优选的算法是计算机程序BLAST，尤其是blastp或tblastn，其使用缺省参数，如随所述程序一起提供的缺省参数。参见，例如，Altschul等人,J.Mol.Biol.215:403-410(1990);Altschul等人,Nucleic Acids Res.25:3389-402(1997)。就同源性进行比较的多肽序列的长度通常为至少大约16个氨基酸残基，通常至少大约20个残基，更通常地至少大约24个残基，典型地至少大约28个残基，和优选地超过大约35个残基。当搜索包含来自许多不同生物的序列的数据库时，优选地比较氨基酸序列。
“治疗有效量”是指在按剂量给药和经过必需的时间段时对于获得想要的治疗结果（其包括瘤形成病状的治疗或预防）来说有效的量。要注意，剂量值可随要被减轻的病状的严重度而变化。还要理解，对于任何特定的受试者，应当根据个体需要和施用组合物或监督组合物施用的人的专业判断，随着时间而调整特定的按剂量给药方案，以及要理解，此处所示的剂量范围仅仅是示例性的而不希望限定所要求保护的组合物的范围或实施。同样地，抗体或抗体部分的治疗有效量可根据因素例如个体的疾病状态、年龄、性别和重量，抗体或抗体部分在个体中引起想要的反应的能力，以及想要的所述抗体制剂的施用途径而变化。治疗有效量还是这样的量，其中所述抗体或抗体部分的任何毒性或有害效应被治疗有益效应超过。
如此处所用的，对于治疗目的，术语“受试者”包括任何受试者，优选地是需要治疗瘤形成病状的受试者。对于预防目的，所述受试者是任何受试者，优选地是处于发展出瘤形成病状的风险中或易于发展出瘤形成病状的受试者。术语“受试者”希望包括活的生物体，例如原核生物和真核生物。受试者的实例包括哺乳动物，例如人、狗、牛、马、猪、绵羊、山羊、猫、小鼠、兔、大鼠和转基因非人动物。在本发明的特定实施方案中，所述受试者是人。
如此处所用的，此处可互换使用的术语“瘤形成”和“瘤形成病状”是指由于对于正常生长控制的响应丧失而造成的新的细胞生长，例如是指“赘生性”细胞生长。在此处，瘤形成还可与术语“癌症”互换使用，并用于本发明的目的；癌症是瘤形成的一种亚型。如此处所用的，术语“瘤形成病状”还包括其他细胞异常，例如过度增生、组织转化（metaplasia）和发育异常。术语瘤形成、组织转化、发育异常和过度增生此处可互换使用，并且通常是指经历异常细胞生长的细胞。
如此处所用的，术语“治疗”是指治疗性处理和预防性或防护性措施，其中目的是预防或减缓（减少）被靶向的病理状况或病状。需要治疗的受试者包括已具有所述病状的受试者以及倾向于具有所述病状的受试者或要在其中预防所述病状的受试者。
当介绍本发明的元素或其优选的实施方案时，冠词“a”、“an”、“the”和“所述的”是希望指存在一个或多个所述元素。术语“包含”、“包括”、“含有”、“包含有”和“具有”是希望指被包括在内，并且表示除了所列出的元素外还存在其他元素。
抗CTLA-4抗体:
根据本发明，已发现某些此处描述的单克隆抗CTLA-4抗体的稳定性可通过将所述抗CTLA-4抗体与药学上可接受的螯合剂例如乙二胺四乙酸(“EDTA”)相混合来得到提高。
尽管不希望受理论束缚，但据信在本发明的组合物中螯合剂的存在通过减少下面的一种或多种情况的发生而有助于提高所述抗体多肽的稳定性：抗CTLA-4抗体的聚集、片段化、氧化、冷冻/解冻不稳定性、变色和/或脱酰胺作用。本发明包括具有与以前公开的抗体组合物相比而言提高的化学和/或物理稳定性的抗CTLA-4抗体制剂。
因此，在某些方面，本发明提供了包含药学上可接受的螯合剂例如EDTA和单克隆抗CTLA-4抗体或其抗原结合部分的组合物。在其他方面，前述包含螯合剂的液体抗CTLA-4抗体组合物可包含其他药学上可接受的赋形剂，包括但不限于一种或多种选自缓冲剂、抗氧化剂、张度剂、表面活性剂及其混合物的赋形剂。
本发明提供了抗CTLA-4抗体的新型制剂。如此处所用的，短语“抗CTLA-4抗体”是指能够结合细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4（“CTLA-4”）多肽的任何部分的任何抗体或其任何部分，所述CTLA-4多肽可存在于任何动物内或从中分离。在某些实施方案中，所述CTLA-4多肽是人CTLA-4多肽。
用于本发明的合适的抗CTLA-4抗体可选自多克隆抗体或单克隆抗体。在某些方面，单克隆抗CTLA-4抗体可以是鼠类抗体、嵌合抗体、人源化抗体或人抗体。在其他实施方案中，单克隆抗CTLA-4抗体是人单克隆抗CTLA-4抗体。
在某些实施方案中，适合用于本发明的抗CTLA-4抗体包括在1999年12月23日提交的属于Hanson等人的美国专利号6,682,736中描述的那些抗CTLA-4抗体以及用于制备它们的方法。在其他实施方案中，适合用于本发明的抗CTLA-4抗体包括具有在美国专利号6,682,736中命名为11.2.1的抗体的重链和轻链氨基酸序列的那些抗CTLA-4单克隆抗体。在其他实施方案，适合用于本发明的抗CTLA-4抗体包括具有抗体ticilimumab和ipilimumab的重链和轻链氨基酸序列的那些抗CTLA-4单克隆抗体。在其他实施方案中，适合用于本发明的抗CTLA-4抗体包括具有抗体ticilimumab的重链和轻链氨基酸序列的那些抗CTLA-4单克隆抗体。
如此处所用的，由代码表示的抗体具有与从有着相同代码的杂交瘤获得的单克隆抗体相同的重链和轻链氨基酸序列。例如，单克隆抗体11.2.1具有与从杂交瘤11.2.1获得的单克隆抗体相同的重链和轻链氨基酸序列。因此，当提及抗体11.2.1时，包括ticilimumabTM,其具有SEQ ID NO.2和4中所示的重链和轻链氨基酸序列和SEQ ID NO.5中所示的重链可变结构域和SEQ ID NO.6中所示的轻链可变结构域。其还包括在重链上缺少末端赖氨酸的抗体，因为该赖氨酸通常在制备过程中在一定比例的抗体中丢失。
此外，可基于它们的重链恒定区中的氨基酸序列的差异来选择此类抗CTLA-4抗体。例如，抗CTLA-4抗体可选自具有“γ”类型重链的IgG类别。可通过本领域内已知的任何方法来确定抗CTLA-4抗体的类和亚类。一般地，可使用对于特定类或亚类的抗体来说特异的抗体来确定抗体的类和亚类。此类抗体是商购可获得的。可通过ELISA或Western印迹法以及其他技术来确定类和亚类。备选地，可通过下列方式来确定类和亚类：对抗体的重链和/或轻链的恒定结构域的全部或部分进行测序，将其氨基酸序列与各种类和亚类的免疫球蛋白的已知氨基酸序列进行比较，从而确定所述抗体的类和亚类。
抗CTLA-4抗体可以是IgG、IgM、IgE、IgA或IgD分子。在其他实施方案中，所述抗CTLA-4抗体是IgG，和是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4亚类。然而，正如将会意识到的，通常不希望杀死表达CTLA-4的细胞。相反地，人们通常只是想要抑制CTLA-4与其配体结合从而减缓T细胞下调。抗体杀死细胞的一个主要机制是通过补体结合和参与CDC。抗体的恒定区在抗体结合补体和参与CDC的能力方面起着重要作用。因此，人们通常选择抗体的同种型以提供补体结合的能力或不提供该能力。在本发明的情况下，一般地，如上所述，使用杀死细胞的抗体通常不是优选的。存在许多能够进行补体结合和CDC的抗体的同种型，包括但不限于下列：鼠类IgM、鼠类IgG2a、鼠类IgG2b、鼠类IgG3、人IgM、人IgG1和人IgG3。相反地，优选的不能进行补体结合和CDC的同种型包括，但不限于，人IgG2和人IgG4。除了重链序列相异外，IgG抗体在其亚类中的差异在于二硫键的数目和铰链区的长度。例如，IgG2亚类具有几个与其他亚类截然不同的差异。已知IgG2和IgG4亚类在其铰链区内具有4个二硫键，而IgG1具有2个二硫键，和IgG3具有11个二硫键。IgG2抗体的其他差异包括其减少的穿过胎盘的能力，和IgG2抗体不能结合淋巴细胞Fc受体。因此，在某些实施方案中，抗CTLA-4抗体是亚类IgG2或IgG4。在另一个优选的实施方案中，抗CTLA-4抗体是亚类IgG2。
在其他实施方案中，可基于它们的重链氨基酸序列的差异来选择合适的抗CTLA-4抗体。例如，本发明的抗CTLA-4抗体可具有使用下列人VH种系基因中任一基因的人γ型重链：VH1、VH2、VH3、VH4或VH5。在某些实施方案中，抗CTLA-4抗体使用人VH3种系基因。在进一步的实施方案中，抗CTLA-4抗体使用人VH3种系基因和人DP-50或DP-46重链可变区，且在其他实施方案中，所述抗CTLA-4抗体使用人DP-50重链可变区。DP-50基因也称作VH3-33家族基因。DP-46基因也称作VH3-30.3家族基因。在更进一步的实施方案中，所述抗CTLA-4抗体使用选自DH基因D1-26、DIR4和DIR3的人DH基因，且在其他实施方案中，所述抗CTLA-4抗体使用D1-26人DH基因。在更进一步的实施方案中，所述抗CTLA-4抗体使用选自JH4和JH6的人JH基因，且在其他实施方案中，所述抗CTLA-4抗体使用JH6人JH基因。
在进一步的实施方案中，可基于它们的轻链氨基酸序列的差异来选择抗CTLA-4抗体。例如，合适的抗CTLA-4抗体可具有λ轻链或κ轻链。然而，在某些实施方案中，本发明的抗CTLA-4抗体具有κ轻链。在其中所述抗CTLA-4抗体包含κ轻链的一些实施方案中，编码轻链的可变结构域的多核苷酸包括人VκL5、O12、L2、B3、L15或A27基因以及人Jκ1、Jκ2、Jκ3、Jκ4或Jκ5基因。在其中所述抗体包含κ轻链的一些实施方案中，轻链可变结构域（VL）部分地由人VκO12或VκA27基因以及人Jκ3或Jκ4基因编码。在本发明的特定实施方案中，轻链可变结构域由人VκO12/Jκ3基因编码。
此外，所述抗体可包含这样的重链氨基酸序列，所述重链氨基酸序列包含来源于人VH3-30或3-33基因的人CDR氨基酸序列或其中的保守性置换或体细胞突变。要理解，所述VH3-33基因编码抗体分子的重链可变区的FR1至FR3。因此，本发明包括这样的抗体，所述抗体与抗体ticilimumab的FR1至FR3的序列共享至少85%，更优选地至少90%，更优选地至少91%，更优选地至少94%，更优选地至少95%，更优选地至少97%，更优选地至少98%，更优选地至少99%，和最优选地100%的同一性。
所述抗体还可进一步在其轻链中包含来源于A27或O12基因的CDR区，或其可包含抗体ticilimumab的CDR区。
在本发明的其他实施方案中，所述抗体抑制CTLA4与B7-1、与B7-2或与两者之间的结合。优选地，所述抗体可抑制与B7-1的结合，IC50为大约100nM或更低，更优选地，大约10nM或更低，例如大约5nM或更低，更优选地，大约2nM或更低，或更优选地，大约1nM或更低。同样地，所述抗体可抑制与B7-2的结合，IC50为大约100nM或更低，更优选地，10nM或更低，例如，更优选地，大约5nM或更低，更优选地，大约2nM或更低，或更优选地，1nM或更低。
此外，在另一个实施方案中，抗CTLA4抗体对于CTLA4的结合亲和力为大约10-8或更大的亲和力，更优选地，大约10-9或更大的亲和力，更优选地，大约10-10或更大的亲和力，和更优选地，大约10-11或更大的亲和力。
所述抗CTLA4抗体包括与具有抗体ticilimumab的重链和轻链氨基酸序列的抗体竞争结合的抗体。此外，所述抗CTLA4抗体可与抗体ipilimumab竞争结合。
在另一个实施方案中，所述抗体优选地与具有抗体ticilimumab的重链和轻链序列、可变重链和可变轻链序列、和/或重链和轻链CDR序列的抗体交叉竞争。例如，所述抗体可结合具有抗体ticilimumab的重链和轻链氨基酸序列、可变序列和/或CDR序列的抗体所结合的表位。在另一个实施方案中，所述抗体与具有MDX-D010的重链和轻链序列或抗原结合序列的抗体交叉竞争。
在另一个实施方案中，使用包含抗体ticilimumab的重链（包含CDR-1、CDR-2和CDR-3的氨基酸序列）和轻链（包含CDR-1、CDR-2和CDR-3的氨基酸序列）或包含具有CDR序列改变的序列的抗CTLA-4抗体来实施本发明，所述CDR序列改变选自保守改变，其中所述保守性改变选自非极性残基被其他非极性残基替代，极性带电荷残基被其他极性不带电荷残基替代，极性带电荷残基被其他极性带电荷残基替代，和结合构似的残基的置换；非保守性置换，其中所述非保守性置换选自极性带电荷残基被置换为极性不带电荷残基和非极性残基被置换为极性残基，添加和缺失。
在本发明的进一步实施方案中，所述抗体在构架区和CDR区中包含种系序列的少于10、7、5或3个氨基酸改变。在另一个实施方案中，所述抗体在构架区中包含少于5个氨基酸改变和在CDR区中包含少于10个改变。在一个优选实施方案中，所述抗体在构架区中包含少于3个氨基酸改变和在CDR区中包含少于7个改变。在优选实施方案中，在构架区中的改变是保守的，和在CDR区中的改变是体细胞突变。
更优选地，所述抗体在重链和轻链上，或者分别与抗体ticilimumab的重链或轻链，共享100%的序列同一性或序列相似性。
在另一个实施方案中，所述抗体在重链和轻链全长序列上，或者分别在重链或轻链上，与种系VκA27、种系VκO12和种系DP50（其为VH3-33基因座的等位基因）的序列共享至少80%，更优选地至少85%，更优选地至少90%，更优选地至少94%，更优选地至少95%，更优选地至少99%的序列同一性或序列相似性。更加优选地，所述抗体与种系DP50的重链序列和/或与种系A27或种系O12的轻链序列共享100%的序列同一性或序列相似性。
在一个实施方案中，所述抗体在重链和轻链可变区序列上或者分别在重链或轻链可变区序列上，与抗体3.1.1、4.1.1、4.8.1、4.10.2、4.13.1、4.14.3、6.1.1、ticilimumab、11.6.1、11.7.1、12.3.1.1、12.9.1.1、ipilimumab的序列共享至少80%，更优选地至少85%，更优选地至少90%，更优选地至少94%，更优选地至少95%，更优选地至少99%的序列（例如，氨基酸、核酸或两者）同一性或序列相似性。更加优选地，所述抗体在重链和轻链可变区序列上或者分别与选自下列的抗体的重链或轻链序列共享100%的序列同一性或序列相似性：3.1.1、4.1.1、4.8.1、4.10.2、4.13.1、4.14.3、6.1.1、ticilimumab、11.6.1、11.7.1、12.3.1.1、12.9.1.1、ipilimumab。
在另一个实施方案中，所述抗体在重链可变区序列上与重链种系DP50（其为VH3-33基因座的等位基因）的重链可变区序列或者与种系VκA27或种系VκO12的轻链可变区序列共享至少80%，更优选地至少85%，更优选地至少90%，更优选地至少94%，更优选地至少95%，更优选地至少99%的序列同一性或序列相似性。更优选地，所述抗体重链区序列与种系DP50的序列或与种系A27或种系O12的轻链序列共有100%的序列同一性或序列相似性。
在本发明的一个实施方案中，所述抗体在来自FR1至FR4的重链、轻链或两者序列方面与抗体ticilimumab的FR1至FR4区序列共享至少80%，更优选地至少85%，更优选地至少90%，更优选地至少95%，更优选地至少99%的序列同一性或序列相似性。更加优选地，所述抗体在来自FR1至FR4的重链、轻链或两者序列上与抗体ticilimumab共享100%的序列同一性或序列相似性。
在本发明的另一个实施方案中，所述抗体在来自FR1至FR3的重链序列方面与种系DP50的FR1至FR3区序列共享至少80%，更优选地至少85%，更优选地至少90%，更优选地至少95%，更优选地至少99%和最优选地大约100%的序列同一性或序列相似性。
在本发明的另一个实施方案中，所述抗体在来自FR1至FR4的轻链序列方面与种系VκA27或种系VκO12的FR1至FR4区序列共享至少80%，更优选地至少85%，更优选地至少90%，更优选地至少95%，更优选地至少99%和最优选地大约100%的序列同一性或序列相似性。
在本发明的一个实施方案中，所述抗体与抗体ticilimumab的重链、轻链或两者、CDR-1、CDR-2和CDR-3序列共享至少80%，更优选地至少85%，更优选地至少90%，更优选地至少95%，更优选地至少99%的序列同一性或序列相似性。更加优选地，所述抗体在重链、轻链或两者、CDR-1、CDR-2和CDR-3序列上与抗体ticilimumab共享100%的序列同一性或序列相似性。
在本发明的另一个实施方案中，所述抗体在重链CDR-1和CDR-2序列方面与种系DP50的CDR-1和CDR-2序列共享至少80%，更优选地至少85%，更优选地至少90%，更优选地至少95%，更优选地至少99%和最优选地大约100%的序列同一性或序列相似性。
在本发明的另一个实施方案中，所述抗体在轻链CDR-1、CDR-2和CDR-3序列方面与种系VκA27或种系VκO12的CDR-1、CDR-2和CDR-3序列共享至少80%，更优选地至少85%，更优选地至少90%，更优选地至少95%，更优选地至少99%和最优选地大约100%的序列同一性或序列相似性。
在一个实施方案中，所述抗CTLA-4抗体是称为ticilimumab的抗体。
表1列出了抗CTLA-4单克隆抗体11.2.1（即，ticilimumab）的重链和轻链人种系基因衍生。
表1：
Figure BDA0000480925720000391
通过偏重于利用DP-50重链可变区来产生一些本发明的抗CTLA-4抗体。DP-50基因也称为VH3-33家族基因。在XenoMouseTM小鼠中，存在超过30个用于产生抗体的不同的功能性重链可变基因。因此，在与抗原的结合和功能活性的组合性质方面，偏向性表明了抗体-抗原相互作用的优选的结合基元。
在一些实施方案中，抗体是单链抗体（scFv），其中VL和VH结构域通过合成连接体而配对形成单价分子，所述合成连接体使得它们能够以单个蛋白质链的形式产生。Bird等人,Science242:423-426(1988)；和Huston等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA85:5879-5883(1988)。在一些实施方案中，抗体是双抗体，即，是二价抗体，其中VH和VL结构域表达在单个多肽链上，但使用太短而不能允许在同一条链上进行两个结构域之间的配对，从而迫使所述结构域与另一条链的互补结构域配对并产生两个抗原结合位点的连接体。参见例如,Holliger P.等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:6444-6448(1993),和Poljak R.J.等人,Structure2:1121-1123(1994)。在一些实施方案中，可将来自本发明的抗体的一个或多个CDR共价或非共价地整合入分子中以使其成为特异性地结合CTLA-4的免疫粘附素。在此类实施方案中，可将所述CDR整合为更大多肽链的部分，可将其共价地连接至另一条多肽链，或可非共价地整合其。
在另一个实施方案中，抗CTLA-4抗体具有对于CTLA-4的选择性（或特异性），所述选择性比其对于任何其他多肽的选择性至少大100倍。在一些实施方案中，抗CTLA-4抗体不展示任何可测得的对除了CTLA-4以外的任何其他蛋白质的特异性结合。根据本说明书的教导，可使用本领域内熟知的方法来测定抗CTLA-4抗体对于CTLA-4的选择性。例如，可使用Western印迹法、FACS、ELISA或RIA来测定选择性。因此，在一些实施方案中，单克隆抗CTLA-4抗体能够特异性地结合CTLA-4。
在一些实施方案中，本发明的抗CTLA-4抗体的重链的C-末端赖氨酸不存在。在一些实施方案中，本发明的抗CTLA-4抗体的重链的C-末端赖氨酸不存在。在本发明的某些方面，抗CTLA-4抗体通常不包含信号多肽，因为信号多肽在翻译后修饰过程中被除去。在本发明的各种实施方案中，抗CTLA-4抗体的重链和轻链中的一个或两者包含信号序列（或信号序列的部分）。在本发明的其他实施方案中，抗CTLA-4抗体的重链和轻链都不包含信号序列。
表2列出了编码重链和轻链的可变区的核酸的序列标志符（SEQ IDNO）和相应的预测的抗CTLA-4单克隆抗体11.2.1的氨基酸序列。
表2：
Figure BDA0000480925720000401
在一些实施方案中，所述核酸分子包含编码单克隆抗体11.2.1的VL氨基酸序列（SEQ ID NO:4）或其部分的核苷酸序列。在一些实施方案中，所述部分包含至少CDR2区。在一些实施方案中，所述核酸编码所述抗体的轻链CDR的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述部分是包含CDR1-CDR3的连续部分。在某些方面，轻链CDR1氨基酸序列由SEQ ID NO:10指明，轻链CDR2氨基酸序列由SEQ ID NO:11指明，和轻链CDR3氨基酸序列由SEQ ID NO:12指明。
在其他实施方案中，所述核酸分子编码与SEQ ID NO:4的VL氨基酸序列至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%或99%同一的VL氨基酸序列。在其他实施方案中，所述核酸分子包含编码SEQ IDNO:4的轻链氨基酸序列或其部分的核苷酸序列。本发明的核酸分子包括在高度严紧的条件（例如上面描述的那些）下与编码SEQ ID NO:4的轻链氨基酸序列的核酸序列杂交的核酸。
在进一步的实施方案中，所述核酸分子包含核苷酸序列，所述核苷酸序列编码11.2.1的VH氨基酸序列（SEQ ID NO:2）或具有保守性氨基酸突变和/或总共3个或更少的非保守性氨基酸置换的所述序列的至少部分。在各种实施方案中，所述序列编码一个或多个CDR区，优选地CDR3区，所有3个CDR区，包含CDR1-CDR3的连续部分，或完整的VH区。在某些方面，重链CDR1氨基酸序列由SEQ ID NO:7指明，重链CDR2氨基酸序列由SEQ ID NO:8指明，和重链CDR3氨基酸序列由SEQ ID NO:9指明。
在一些实施方案中，所述核酸分子编码与SEQ ID NO:2的VH氨基酸序列至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、97%、98%或99%同一的VH氨基酸序列。在更进一步的实施方案中，所述核酸分子包含编码SEQ ID NO:2的重链氨基酸序列或其部分的核苷酸序列。本发明的核酸分子包括在高度严紧的条件（例如上面描述的那些）下与编码SEQ IDNO:2的重链氨基酸序列的核苷酸序列杂交的核酸。
在某些方面，本发明提供了包含至少一种结合CTLA-4的分离的人抗体和药学上可接受的赋形剂（包括螯合剂）的液体药物组合物，其中所述抗体包含采用人VH3-33种系基因的VH氨基酸序列。
在其他方面，本发明提供了包含至少一种结合CTLA-4的分离的人抗体的液体药物组合物，其中所述抗体包含与SEQ ID NO:2具有至少90%序列同一性的重链氨基酸序列和与SEQ ID NO:4具有至少90%序列同一性的轻链氨基酸序列。
在其他方面，本发明提供了包含至少一种结合CTLA-4的分离的人抗体的液体药物组合物，其中所述抗体包含与SEQ ID NO:2具有至少95%序列同一性的重链氨基酸序列和与SEQ ID NO:4具有至少95%序列同一性的轻链氨基酸序列。
在其他方面，本发明提供了包含至少一种结合CTLA-4的分离的人抗体的液体药物组合物，其中所述抗体包含与SEQ ID NO:2具有至少99%序列同一性的重链氨基酸序列和与SEQ ID NO:4具有至少99%序列同一性的轻链氨基酸序列。
在其他方面，所述抗体包含重链氨基酸序列和轻链氨基酸序列，所述重链氨基酸序列包含SEQ ID NO:2的可变区，和所述轻链氨基酸序列包含SEQ ID NO:4的可变区。在进一步方面，所述抗体包含含有SEQ ID NO:5的重链氨基酸序列和含有SEQ ID NO:6的轻链氨基酸序列。在进一步方面，所述抗体包含含有SEQ ID NO:2的重链氨基酸序列和含有SEQ ID NO:4的轻链氨基酸序列。在其他方面，所述抗体包含含有按阅读框与CDR1、CDR2和CDR3序列有效连接的人FR1、FR2和FR3序列的VH氨基酸序列，所述人FR1、FR2和FR3序列利用人VH3-33基因家族。
在一个实施方案中，所述抗CTLA-4抗体是ticilimumab（也称为CP-675,206），其具有抗体ticilimumab的重链和轻链氨基酸序列。
在本发明的一个实施方案中，所述抗CTLA-4抗体特异性地结合人CTLA-4上的构象表位。在其他实施方案中，所述抗CTLA-4抗体在施用给受试者后抑制人肿瘤生长。
单克隆抗CTLA-4抗体制剂的制备：
通常将抗CTLA-4抗体配制为用于给受试者肠胃外施用的药物组合物。在一个实施方案中，所述药物组合物是液体组合物。在另一个实施方案中，所述药物组合物是液体组合物。
本发明的组合物包含一种或多种本发明的抗CTLA-4单克隆抗体以及药学上可接受的赋形剂，所述赋形剂包括组氨酸和/或螯合剂。本发明的液体制剂包含一种或多种本发明的抗CTLA-4单克隆抗体以及药学上可接受的赋形剂，所述赋形剂包括组氨酸和/或螯合剂。
术语“药物组合物”是指以例如允许活性成分的生物学活性发挥功效的形式存在的制剂。“药学上可接受的赋形剂”（媒介物、添加剂）是可适度地（即，安全地）给受试者施用以提供所使用的活性成分的有效剂量的那些赋形剂。术语“赋形剂”或“载体”在此处用于指惰性物质，其通常用作药物的稀释剂、媒介物、防腐剂、粘合剂或稳定剂。如此处所用的，术语“稀释剂”是指药学上可接受的（对于给人施用是安全和无毒性的）溶剂，且可用于制备此处的液体制剂。示例性的稀释剂包括，但不限于，无菌水和抑菌性注射用水（BWFI）。
在另一个实施方案中，本发明涉及包含抗CTLA-4抗体和药学上可接受的螯合剂的组合物。在另一个实施方案中，本发明涉及包含抗CTLA-4抗体和EDTA的液体药物组合物。在另一个实施方案中，本发明涉及包含抗CTLA-4抗体和DTPA的组合物。
在另一个实施方案中，本发明涉及包含抗CTLA-4抗体、药学上可接受的螯合剂和药学上可接受的缓冲剂的组合物。在另一个实施方案中，本发明涉及包含抗CTLA-4抗体、药学上可接受的螯合剂和组氨酸的组合物。在另一个实施方案中，本发明涉及包含抗CTLA-4抗体、EDTA和组氨酸的组合物。在另一个实施方案中，本发明涉及包含抗CTLA-4抗体、DTPA和组氨酸的组合物。
在另一个实施方案中，本发明涉及包含抗CTLA-4抗体、药学上可接受的螯合剂和药学上可接受的张度剂的组合物。在另一个实施方案中，本发明涉及包含抗CTLA-4抗体、药学上可接受的螯合剂和海藻糖的组合物。在另一个实施方案中，本发明涉及包含抗CTLA-4抗体、EDTA和海藻糖的组合物。在另一个实施方案中，本发明涉及包含抗CTLA-4抗体、DTPA和海藻糖的组合物。
在另一个实施方案中，本发明涉及包含抗CTLA-4抗体、药学上可接受的螯合剂和药学上可接受的表面活性剂的组合物。在另一个实施方案中，本发明涉及包含抗CTLA-4抗体、EDTA和药学上可接受的表面活性剂的组合物。在另一个实施方案中，本发明涉及包含抗CTLA-4抗体、DTPA和药学上可接受的表面活性剂的组合物。在另一个实施方案中，本发明涉及包含抗CTLA-4抗体、选自EDTA和DTPA的药学上可接受的螯合剂和聚山梨酯80的组合物。
在另一个实施方案中，本发明涉及包含抗CTLA-4抗体、药学上可接受的缓冲剂和药学上可接受的表面活性剂的组合物。在另一个实施方案中，本发明涉及包含抗CTLA-4抗体、组氨酸和药学上可接受的表面活性剂的组合物。在另一个实施方案中，本发明涉及包含抗CTLA-4抗体、组氨酸和聚山梨酯80的组合物。
在另一个实施方案中，本发明涉及包含抗CTLA-4抗体、药学上可接受的螯合剂、药学上可接受的缓冲剂和药学上可接受的表面活性剂的组合物。
在另一个实施方案中，本发明涉及包含抗CTLA-4抗体、药学上可接受的螯合剂、药学上可接受的缓冲剂和药学上可接受的张度剂的组合物。
在另一个实施方案中，本发明涉及包含抗CTLA-4抗体、药学上可接受的螯合剂、药学上可接受的缓冲剂、药学上可接受的表面活性剂和药学上可接受的张度剂的组合物。
在另一个实施方案中，本发明涉及包含抗CTLA-4抗体和组氨酸的组合物。
存在于组合物中的抗CTLA-4抗体可以是本申请中前面描述的抗体。在一个实施方案中，所述组合物包含抗CTLA-4抗体，所述抗体包含与SEQ ID NO:4中所示的VL氨基酸序列90%、95%或99%同一的VL氨基酸序列，还包含与SEQ ID NO:2中所示的VH氨基酸序列90%、95%或99%同一的VH氨基酸序列。在另一个实施方案中，所述组合物包含为单克隆抗CTLA-4抗体11.2.1的抗CTLA-4抗体。
存在于液体药物组合物中的抗CTLA-4抗体可以是在本申请书中前面描述的抗体。在一个实施方案中，所述液体药物组合物包含抗CTLA-4抗体，所述抗体包含与SEQ ID NO:4中所示的VL氨基酸序列90%、95%或99%同一的VL氨基酸序列，还包含与SEQ ID NO:2中所示的VH氨基酸序列90%、95%或99%同一的VH氨基酸序列。在另一个实施方案中，所述液体药物组合物包含为单克隆抗CTLA-4抗体11.2.1的抗CTLA-4抗体。
本发明的液体药物组合物中抗CTLA-4抗体的浓度通常是至少大约0.1毫克/毫升（mg/ml）或更高、至少大约1.0mg/ml或更高、至少大约10mg/ml或更高、至少大约50mg/ml或更高、至少大约100mg/ml或更高或者至少大约200mg/ml或更高。在某些实施方案中，抗CTLA-4抗体的浓度通常在大约0.1mg/ml至大约200mg/ml、大约0.5mg/ml至大约100mg/ml、大约1mg/ml至大约70mg/ml、大约2.0mg/ml至大约65mg/ml、大约5.0mg/ml至大约50mg/ml、大约10mg/ml至大约35mg/ml、大约15mg/ml至大约25mg/ml的范围内，或者为大约20mg/ml。在一个实施方案中，液体药物组合物中抗CTLA-4抗体的浓度在大约50mg/ml至大约100mg/ml的范围内。在一些实施方案中，当想将组合物进行皮下递送时可使用更高的抗体浓度。
如此处所用的，术语“螯合剂”通常是指可与金属离子形成至少一个键（例如，共价键、离子键或其他类型的键）的赋形剂。螯合剂通常是多齿配位体，其可在所选择的液体组合物中用作与可能促进不稳定性的物质种类相复合的稳定剂。通常，可用作螯合剂的化合物具有富含电子的官能团。合适的富含电子的官能团包括羧酸基团、羟基和氨基。这些基团在氨基多元羧酸、羟基多元羧酸、羟基氨基羧酸等中的排列导致形成具有结合金属的能力的部分。
然而，本发明希望不限于主要通过螯合剂与金属离子形成键的能力来起作用的螯合剂。因此，本发明希望不受任何特定机制（通过所述机制，螯合剂在本发明的制剂中起作用）的限定，并且此处称为螯合剂的赋形剂可通过与所述螯合剂和金属离子形成键的能力完全无关的机制来实现其特性。
适合用于本发明的螯合剂包括，但不限于，氨基多元羧酸、羟基氨基羧酸、N-取代的甘氨酸、2-(2-氨基-2-氧代乙基)氨基乙烷磺酸（BES）、去铁胺（DEF）、柠檬酸、烟酰胺和脱氧胆酸盐。合适的氨基多元羧酸的实例包括乙二胺四乙酸（EDTA）、二亚乙基三胺五乙酸5（DTPA）、次氮基三乙酸（NTA）、N-2-乙酰氨基-2-亚氨基二乙酸（ADA）、二(氨乙基)乙二醇醚、N,N,N',N'-四乙酸（EGTA）、反式-二氨基环己烷四乙酸（DCTA）、谷氨酸和天冬氨酸。合适的羟基氨基羧酸的实例包括N-羟乙基亚氨基二乙酸（HIMDA）、N,N-二-羟乙基甘氨酸（bicine）和N-(三羟甲基甲基)10甘氨酸（tricine）。合适的N-取代的甘氨酸的实例是甘氨酰甘氨酸。合适的脱氧胆酸盐的实例是脱氧胆酸钠。本发明还包括两种或更多种螯合剂的混合物。
用于本发明的螯合剂可以作为该化合物的游离酸或游离碱形式（例如，此处可互换使用的“EDTA”或“依地酸”）或作为对应的盐形式（例如，对应的酸加成盐或碱加成盐，例如依地酸二钠）存在。合适的酸加成盐例如包括碱金属盐（例如，钠或钾盐）、碱土金属盐（例如，钙盐），且可使用其他弱结合金属离子来制备盐。如在本领域内已知的，盐的性质和待被中和的电荷数目依赖于存在的羧基数目和提供稳定性螯合剂时所处的pH。如在本领域内还已知的，螯合剂具有可变的与特定靶离子的结合强度。作为进一步的举例说明，EDTA的合适的盐包括依地酸二钾、依地酸二钠、依地酸钙二钠、依地酸钠、依地酸三钠和依地酸钾；以及合适的去铁胺（DEF）的盐是甲磺酸去铁胺（DFM）。
用于本发明的螯合剂可以以该化合物或相应盐的无水的、溶剂化的或水合的形式存在。当螯合剂以溶剂化的或水合的形式存在时，其可以溶剂化或水合的多种状态（包括，例如，无水、水合、二水合和三水合的形式）存在。作为进一步的举例说明，EDTA的合适水合物是EDTA二钠二水合物；以及柠檬酸的合适形式包括无水柠檬酸、柠檬酸一水合物和柠檬酸三钠二水合物。
用于本发明的抗体组合物的合适的螯合剂还包括，例如，在溶液中结合金属离子以使其不能与可获得的O2反应从而最小化或防止羟基自由基产生的那些螯合剂，所述羟基自由基是游离的从而与所述抗体反应并降解所述抗体。螯合剂可在本发明的组合物中降低还原型氧种类的形成，减少酸种类（例如，脱酰胺作用）的形成，减少抗体聚集，和/或减少抗体片段化。此类螯合剂可减少或防止在无螯合剂保护的情况下配制的抗体的降解。
当提到螯合剂的浓度时，希望所述浓度代表所述螯合剂的游离酸或游离碱形式的摩尔浓度。例如，某些液体药物组合物中的螯合剂的浓度通常在大约0.01μM至大约50mM、大约1μM至大约10.0mM、大约15μM至大约5.0mM、大约0.01mM至大约1.0mM或大约0.03mM至大约0.5mM的范围内。在某些实施方案中，液体药物组合物中螯合剂的浓度可以是大约0.01mM、0.02mM、0.027mM、0.03mM、大约0.04mM、大约0.05mM、大约0.06mM、大约0.07mM、大约0.10mM、大约0.20mM、大约0.26mM、大约0.27mM、大约0.30mM、大约0.31mM、大约0.34mM、大约0.40mM、大约0.50mM、大约1.0mM。在某些实施方案中，螯合剂的浓度是大约0.027mM、大约0.05mM、大约0.13mM或大约0.27mM。在一个实施方案中，螯合剂的浓度是大约0.05mM。在另一个实施方案中，螯合剂的浓度是大约0.13mM。
除非另外指出，此处所列的浓度是在环境条件（即，25℃和大气压）下的浓度。介于上述螯合剂浓度之间的范围也希望作为本发明的一部分。例如，希望包括使用上述任何值的组合作为上限和/或下限的值的范围。
在一个实施方案中，所述螯合剂选自EDTA、DTPA、DFM及其混合物。在另一个实施方案中，所述螯合剂是DFM。在另一个实施方案中，所述螯合剂是EDTA。在另一个实施方案中，所述螯合剂是DTPA。在另一个实施方案中，所述液体药物组合物包含EDTA，其量一般在大约0.01μM至大约50mM、大约1μM至大约20.0mM、大约15μM至大约10.0mM、大约0.01mM至大约5.0mM或大约0.03mM至大约1mM的范围内。在某些实施方案中，液体药物组合物中的EDTA浓度可以是大约0.01mM、0.02mM、0.027mM、0.03mM、大约0.04mM、大约0.05mM、大约0.06mM、大约0.07mM、大约0.10mM、大约0.20mM、大约0.26mM、大约0.27mM、大约0.30mM、大约0.31mM、大约0.34mM、大约0.40mM、大约0.50mM或大约1.0mM。在某些实施方案中，EDTA的浓度是大约0.027mM、大约0.05mM、大约0.13mM或大约0.27mM。在一个实施方案中，EDTA的浓度为大约0.05mM。在另一个实施方案中，EDTA的浓度为大约0.13mM。在另一个实施方案中，液体药物组合物以大约0.27mM的量包含EDTA。
如上面所指出的，除了螯合剂以外，本发明的组合物任选地还可包含药学上可接受的缓冲剂。如此处所用的，术语“缓冲剂”是指允许液体抗体制剂能够抵抗pH的变化的所加入的组合物。在某些实施方案中，所加入的缓冲剂通过其酸-碱共轭组分的作用而允许液体抗体制剂能够抵抗pH的变化。
例如，可通过加入对于达到所需pH来说合适的量的L-组氨酸-HCl（L-组氨酸-氯化氢）和L-组氨酸来制备经缓冲的制剂。然而，在其他实施方案中，所加入的缓冲剂通过其酸-碱共轭组分的作用而允许液体抗体制剂能够抵抗pH的变化。作为第二例子，可通过加入对于达到所需pH来说合适的量的酸例如盐酸和L-组氨酸来制备经缓冲的制剂。
合适的缓冲剂的实例包括，但不限于，乙酸盐（例如乙酸钠）、琥珀酸盐（例如琥珀酸钠）、葡萄糖酸盐、柠檬酸盐和其他有机酸缓冲剂，包括但不限于诸如氨基酸(例如，组氨酸)、乙酸、磷酸和磷酸盐、抗坏血酸盐、酒石酸、马来酸、甘氨酸、乳酸盐、乳酸、抗坏血酸、咪唑类、碳酸和碳酸氢盐、琥珀酸、苯甲酸钠和苯甲酸盐、葡萄糖酸盐、依地酸盐（EDTA）、乙酸盐、苹果酸盐、咪唑、tris、磷酸盐及其混合物的缓冲剂。在一个实施方案中，所述缓冲剂是乙酸盐。
在另一个实施方案中，所述缓冲剂是组氨酸。用于制备本发明的组合物的组氨酸起始材料可以以不同的形式存在。例如，所述组氨酸可以是组氨酸的对映体（例如，L-或D-对映体）或外消旋形式、组氨酸的游离酸或游离碱形式、组氨酸的盐形式(例如，单盐酸盐、二盐酸盐、氢溴酸盐、硫酸盐或乙酸盐)、组氨酸的溶剂化形式、组氨酸的水合形式（例如，一水合物）或组氨酸的无水形式。用于制备所述组合物的组氨酸碱和/或盐的纯度一般可以是至少大约98%、至少大约99%或至少大约99.5%。如此处所用的，在组氨酸的情况下，术语“纯度”是指组氨酸的化学纯度，这是本领域中所理解的，例如The MerckIndex,第13版,O'Neil等人ed.(Merck&Co.,2001)中所描述的。
当提到缓冲剂的浓度时，希望所述浓度代表所述缓冲剂的游离酸或游离碱形式的摩尔浓度。例如，当存在于某些液体药物组合物中时，缓冲剂的浓度可在大约0.1mM至大约100mM的范围内。在一个实施方案中，缓冲剂的浓度是大约1mM至大约50mM。在另一个实施方案中，缓冲剂的浓度是大约5mM至大约30mM。在多种实施方案中，缓冲剂的浓度是大约1mM、大约5mM、大约10mM、大约15mM、大约20mM、大约25mM、大约30mM、大约35mM、大约40mM、大约45mM、大约50mM、大约55mM、大约60mM、大约65mM、大约70mM、大约75mM、大约80mM、大约85mM、大约90mM、大约95mM或大约100mM。在一个实施方案中，药物组合物中组氨酸的浓度是大约10mM。在另一个实施方案中，药物组合物包含大约10mM的L-组氨酸（以碱形式存在）。在另一个实施方案中，药物组合物中组氨酸的浓度是大约20mM。在另一个实施方案中，药物组合物包含大约20mM的L-组氨酸（以碱基形式存在）。介于上述螯合剂浓度之间的范围也希望为本发明的部分。例如，希望包括使用上述任何值的组合作为上限和/或下限的值的范围。
一般地，使用缓冲剂以在液体药物组合物中保持可接受的pH水平(所述pH水平可影响抗体的稳定性)。液体药物组合物通常被缓冲至使pH保持在大约4至大约8、大约4.5至大约7、大约5.0至6.5或大约5.3至大约6.3的范围内。介于上述pH之间的范围也希望作为本发明的一部分。例如，希望包括使用上述任何值的组合作为上限和/或下限的值的范围。在一个实施方案中，液体药物组合物被缓冲至使pH保持在大约5.5。在另一个实施方案中，液体药物组合物被缓冲至使pH保持在大约6.0。
如上面所指出的，除了螯合剂以外，本发明的组合物可选地还可包含药学上可接受的张度剂。如此处所用的，术语“张度剂”是指可调节液体抗体制剂的渗透压的赋形剂。在某些实施方案中，张度剂可将液体抗体制剂的渗透压调节至等渗状态，这样所述抗体制剂与受试者的身体组织的细胞在生理上相容。在其他实施方案中，“张度剂”可有助于此处描述的任何抗CTLA-4抗体的稳定性的提高。“等渗”制剂是具有与人血液基本上相同的渗透压的制剂。等渗制剂通常具有大约250至350mOsm的渗透压。术语“低渗”描述了所具有的渗透压低于人血的渗透压的制剂。相应地，术语“高渗”用于描述所具有的渗透压高于人血的渗透压的制剂。可使用例如蒸汽压或冰冻型渗透压计（ice-freezing type osmometer）来测量等渗性。
用于制备本发明的组合物的张度剂可以以不同形式存在。当提及张度剂时，希望张度剂这一名称包括所有这些不同的形式。例如，张度剂可以以下列形式存在：对映体形式（例如，L-或D-对映体）或外消旋形式；异构体例如α或β，包括α，α或β，β，或α，β或β，α；游离酸或游离碱形式；水合物形式（例如，一水合物）；或无水形式。
在一个实施方案中，张度剂是糖类。如此处所用的，术语“糖类”是指为多羟基醇的一类分子。糖类通常称为碳水化合物，并可包含不同量的糖（糖类）单元，例如，单糖、二糖和多糖。适合在本发明中用作张度剂的糖类包括，但不限于，选自果糖、葡萄糖、甘露糖、山梨糖、木糖、乳糖、麦芽糖、蔗糖、葡聚糖、出芽短梗霉聚糖、糊精、环糊精、可溶性淀粉、羟乙基淀粉、水溶性葡聚糖和其混合物的糖。
在另一个实施方案中，张度剂是多元醇。如此处所用的，术语“多元醇”是指具有多个羟基的赋形剂，并且包括糖（还原性和非还原性糖）、糖醇和糖酸。在一个实施方案中，所述多元醇具有低于大约600kD（例如，在大约120至大约400kD的范围内）的分子量。“还原性糖”是包含可还原金属离子或与蛋白中的赖氨酸或其他氨基酸共价反应的半缩醛基团的糖，而“非还原性糖”是不具有还原性糖的这些性质的糖。适合在本发明中用作张度剂的多元醇包括，但不限于，选自甘露醇、海藻糖、山梨糖醇、赤藓糖醇、isomalt、乳糖醇、麦芽糖醇、木糖醇、甘油、拉克替醇、丙二醇、聚乙二醇、肌醇及其混合物的多元醇。在一个实施方案中，张度剂是选自海藻糖、蔗糖及其混合物的非还原性糖。
在一个实施方案中，张度剂是甘露醇。在另一个实施方案中，张度剂是D-甘露醇。在另一个实施方案中，张度剂是海藻糖。在另一个实施方案中，张度剂是αα-海藻糖二水合物。在另一个实施方案中，张度剂是蔗糖。
在一个实施方案中，液体药物组合物中张度剂的浓度在大约1mM至大约600mM、大约1mM至大约400mM、1mM至大约300mM或200mM至大约275mM的范围内。在另一个实施方案中，张度剂是甘露醇，并且以大约247mM的浓度存在于液体药物组合物中。在另一个实施方案中，张度剂是海藻糖，并且以大约222mM的浓度存在于液体药物组合物中。在另一个实施方案中，张度剂是海藻糖，并且以大约238mM的浓度存在于液体药物组合物中。在另一个实施方案中，张度剂是蔗糖，并且以大约263mM的浓度存在于液体药物组合物中。
在一个实施方案中，液体药物组合物中张度剂的浓度在大约1mg/ml至大约300mg/ml、大约1mg/ml至大约200mg/ml或大约50mg/ml至大约150mg/ml的范围内。在另一个实施方案中，张度剂是甘露醇，并且以大约45mg/ml mM的浓度存在于液体药物组合物中。在另一个实施方案中，张度剂是海藻糖，并且以大约84mg/ml的浓度存在于液体药物组合物中。在另一个实施方案中，张度剂是海藻糖，并且以大约90mg/ml的浓度存在于液体药物组合物中。在另一个实施方案中，张度剂是蔗糖，并且以大约90mg/ml的浓度存在于液体药物组合物中。
在一个实施方案中，张度剂是盐，例如氯化钠。在一个实施方案中，当张度剂是盐时，液体药物组合物中盐的浓度在大约1mg/ml至大约20mg/ml的范围内。在另一个实施方案中，张度剂是氯化钠，并且液体药物组合物中氯化钠的浓度为大约8.18mg/ml。
介于上述张度剂浓度之间的范围也希望作为本发明的一部分。例如，希望包括使用上述任何值的组合作为上限和/或下限的值的范围。
介于上述张度剂浓度之间的范围也希望作为本发明的一部分。例如，希望包括使用上述任何值的组合作为上限和/或下限的值的范围。
如上面所指出的，除了螯合剂以外，本发明的组合物可选地还可包含药学上可接受的表面活性剂。如此处所用的，术语“表面活性剂”是指可改变液体抗体制剂的表面张力的赋形剂。在某些实施方案中，所述表面活性剂减少液体抗体制剂的表面张力。在其他实施方案中，“表面活性剂”可有助于此处描述的任何抗CTLA-4抗体的稳定性的提高。例如，表面活性剂可减少配制的抗体的聚集和/或最小化制剂中的颗粒的形成和/或减少吸附。表面活性剂还可在冷冻/解冻循环期间和之后提高抗体的稳定性。
合适的表面活性剂包括聚山梨酯表面活性剂、泊洛沙姆（例如泊洛沙姆18和407）、triton表面活性剂例如聚山梨酯表面活性剂例如
Figure BDA0000480925720000522
和十二烷基硫酸钠、月桂基硫酸钠、辛基糖苷钠（sodium octyl glycoside）、月桂基-磺基甜菜碱、肉豆蔻基-磺基甜菜碱、亚油基（linoleyl）-磺基甜菜碱、硬脂基-磺基甜菜碱、月桂基-肌氨酸、肉豆蔻基-肌氨酸、亚油基-肌氨酸、硬脂基-肌氨酸、亚油基-甜菜碱、肉豆蔻基-甜菜碱、鲸蜡基-甜菜碱、月桂酰胺丙基-甜菜碱、椰油酰胺丙基-甜菜碱、亚油酰胺丙基-甜菜碱、肉豆蔻酰胺丙基-甜菜碱、palmidopropyl-甜菜碱、异硬脂酰胺丙基-甜菜碱、肉豆蔻酰胺丙基-二甲胺、palmidopropyl-二甲胺、异硬脂酰胺丙基-二甲胺、甲基椰油基牛磺酸钠、甲基油基牛磺酸二钠、氯化二羟丙基peg5linoleammonium、聚乙二醇、聚丙二醇和其混合物。
在一个实施方案中，表面活性剂是聚山梨酯表面活性剂，所述聚山梨酯表面活性剂包括至少一种选自聚山梨酯20、聚山梨酯21、聚山梨酯40、聚山梨酯60、聚山梨酯61、聚山梨酯65、聚山梨酯80、聚山梨酯81、聚山梨酯85和其混合物的赋形剂。在另一个实施方案中，所述液体药物组合物包含聚山梨酯80。
当存在于组合物中时，表面活性剂的浓度通常在大约0.01mg/ml至大约10mg/ml、大约0.05mg/ml至大约5.0mg/ml、大约0.1mg/ml至大约1.0mg/ml或大约0.2mg/ml至大约0.7mg/ml的范围内。在另一个实施方案中，表面活性剂以大约0.2mg/ml的量存在。在另一个实施方案中，表面活性剂以大约0.5mg/ml的量存在。在一个实施方案中，液体药物组合物包含大约0.2mg/ml的聚山梨酯80。在另一个实施方案中，液体药物组合物包含大约0.4mg/ml的聚山梨酯80。在另一个实施方案中，液体药物组合物包含大约0.5mg/ml的聚山梨酯80。
介于上述表面活性剂浓度之间的范围也希望作为本发明的一部分。例如，希望包括使用上述任何值的组合作为上限和/或下限的值的范围。
除了螯合剂以外，本发明的组合物可选地还可包含药学上可接受的抗氧化剂。合适的抗氧化剂包括，但不限于，甲硫氨酸、硫代硫酸钠、过氧化氢酶和铂。例如，液体药物组合物可以包含浓度在1mM至大约100mM的范围内的甲硫氨酸，并且特别地甲硫氨酸的浓度为大约27mM。
在一个实施方案中，本发明包括包含至少一种抗体和螯合剂的组合物，所述抗体包含与SEQ ID NO:2中所示的重链氨基酸序列至少95%同一的氨基酸序列，且还包含与SEQ ID NO:4中所示的轻链氨基酸序列至少95%同一的氨基酸序列，其中所述抗体结合人CTLA-4。
在一个实施方案中，本发明包括包含至少一种抗体和螯合剂的组合物，所述抗体包含与SEQ ID NO:2中所示的重链氨基酸序列至少95%同一的氨基酸序列，且还包含与SEQ ID NO:4中所示的轻链氨基酸序列至少95%同一的氨基酸序列，其中所述抗体结合人CTLA-4。
在一个实施方案中，本发明包括包含至少一种人单克隆抗CTLA抗体和螯合剂的组合物，其中所述抗体结合人CTLA-4。
在一个实施方案中，本发明包括包含至少一种人单克隆抗CTLA抗体和螯合剂的液体药物组合物，其中所述抗体结合人CTLA-4。
在一个实施方案中，本发明包括包含至少一种抗体和药学上可接受的赋形剂的组合物，所述抗体包含与SEQ ID NO:2中所示的重链氨基酸序列至少95%同一的氨基酸序列，且还包含与SEQ ID NO:4中所示的轻链氨基酸序列至少95%同一的氨基酸序列，其中所述抗体结合人CTLA-4，其中所述组合物包含浓度为至少大约10mg/ml、至少大约15mg/ml、至少大约20mg/ml或至少大约25mg/ml的抗体。
在一个实施方案中，本发明包括包含至少一种抗体和药学上可接受的赋形剂的液体药物组合物，所述抗体包含与SEQ ID NO:2中所示的重链氨基酸序列至少95%同一的氨基酸序列，且还包含与SEQ ID NO:4中所示的轻链氨基酸序列至少95%同一的氨基酸序列，其中所述抗体结合人CTLA-4，其中所述组合物包含浓度在大约10mg/ml至大约200mg/ml范围内的抗体。
在一个实施方案中，本发明包括包含至少一种抗体和药学上可接受的赋形剂的组合物，所述抗体包含与SEQ ID NO:2中所示的重链氨基酸序列至少95%同一的氨基酸序列，且还包含与SEQ ID NO:4中所示的轻链氨基酸序列至少95%同一的氨基酸序列，其中所述抗体结合人CTLA-4，其中所述组合物包含浓度在大约15mg/ml至大约200mg/ml范围内的抗体。
在一个实施方案中，本发明包括包含至少一种抗体和药学上可接受的赋形剂的组合物，所述抗体包含与SEQ ID NO:2中所示的重链氨基酸序列至少95%同一的氨基酸序列，且还包含与SEQ ID NO:4中所示的轻链氨基酸序列至少95%同一的氨基酸序列，其中所述抗体结合人CTLA-4，其中所述组合物包含浓度在大约20mg/ml至大约200mg/ml范围内的抗体。
在一个实施方案中，本发明包括包含至少一种抗体和药学上可接受的赋形剂的组合物，所述抗体包含与SEQ ID NO:2中所示的重链氨基酸序列至少95%同一的氨基酸序列，且还包含与SEQ ID NO:4中所示的轻链氨基酸序列至少95%同一的氨基酸序列，其中所述抗体结合人CTLA-4，其中所述组合物包含浓度在大约50mg/ml至大约200mg/ml范围内的抗体。
在一个实施方案中，本发明包括包含至少一种抗体和药学上可接受的赋形剂的液体药物组合物，所述抗体包含与SEQ ID NO:2中所示的重链氨基酸序列至少95%同一的氨基酸序列，且还包含与SEQ ID NO:4中所示的轻链氨基酸序列至少95%同一的氨基酸序列，其中所述抗体结合人CTLA-4，其中所述组合物包含浓度在大约100mg/ml至大约200mg/ml范围内的抗体。
在一个实施方案中，本发明包括包含至少一种抗体和药学上可接受的赋形剂的组合物，所述抗体包含与SEQ ID NO:2中所示的重链氨基酸序列至少95%同一的氨基酸序列，且还包含与SEQ ID NO:4中所示的轻链氨基酸序列至少95%同一的氨基酸序列，其中所述抗体结合人CTLA-4，其中所述组合物包含浓度在大约10mg/ml至大约25mg/ml范围内的抗体。
在一个实施方案中，本发明包括包含至少一种抗体和药学上可接受的赋形剂的组合物，所述抗体包含与SEQ ID NO:2中所示的重链氨基酸序列至少95%同一的氨基酸序列，且还包含与SEQ ID NO:4中所示的轻链氨基酸序列至少95%同一的氨基酸序列，其中所述抗体结合人CTLA-4，其中所述组合物包含浓度为大约20mg/ml的抗体。
在一个实施方案中，所述液体药物组合物包含大约0.01mg/ml至大约200mg/ml的单克隆抗CTLA-4抗体ticilimumab，和大约0.3μM至大约50mM的螯合剂。
在另一个实施方案中，所述液体药物组合物包含大约0.1mg/ml至大约100mg/ml的单克隆抗CTLA-4抗体ticilimumab，和大约3μM至大约5.0mM的螯合剂。
在另一个实施方案中，所述液体药物组合物包含大约0.1mg/ml至大约100mg/ml的单克隆抗CTLA-4抗体ticilimumab，和大约0.27mM的螯合剂。
在另一个实施方案中，所述液体药物组合物包含大约0.1mg/ml至大约100mg/ml的单克隆抗CTLA-4抗体ticilimumab，和大约0.3μM至大约50mM的EDTA。
在另一个实施方案中，所述液体药物组合物包含大约0.1mg/ml至大约100mg/ml的单克隆抗CTLA-4抗体ticilimumab，和大约3μM至大约10.0mM的EDTA。
在另一个实施方案中，所述液体药物组合物包含大约0.1mg/ml至大约100mg/ml的单克隆抗CTLA-4抗体ticilimumab，和大约0.1mM至大约1.0mM的EDTA。
在另一个实施方案中，所述液体药物组合物包含大约0.1mg/ml至大约100mg/ml的单克隆抗CTLA-4抗体ticilimumab，和大约0.27mM的EDTA。
在另一个实施方案中，所述液体药物组合物包含大约0.1mg/ml至大约100mg/ml的单克隆抗CTLA-4抗体ticilimumab，和大约3μM至大约5.0mM的DTPA。
在另一个实施方案中，所述液体药物组合物包含大约0.1mg/ml至大约100mg/ml的单克隆抗CTLA-4抗体ticilimumab，和大约3μM至大约5.0mM的去铁胺。
在一个实施方案中，所述液体药物组合物包含大约0.01mg/ml至大约200mg/ml的单克隆抗CTLA-4抗体ticilimumab，和大约1mM至大约100mM的组氨酸。
在另一个实施方案中，所述液体药物组合物包含大约0.1mg/ml至大约200mg/ml的单克隆抗CTLA-4抗体ticilimumab，大约3μM至大约5.0mM的螯合剂，和大约1mM至大约100mM的组氨酸。
在另一个实施方案中，所述液体药物组合物包含大约0.1mg/ml至大约200mg/ml的单克隆抗CTLA-4抗体ticilimumab，大约3μM至大约5.0mM的螯合剂，和大约10mM至大约400mM的海藻糖。
在另一个实施方案中，所述液体药物组合物包含大约0.1mg/ml至大约200mg/ml的单克隆抗CTLA-4抗体ticilimumab，大约3μM至大约5.0mM的螯合剂，大约10mM至大约400mM的海藻糖，和大约1mM至大约100mM的组氨酸。
在另一个实施方案中，所述液体药物组合物包含大约0.1mg/ml至大约200mg/ml的单克隆抗CTLA-4抗体ticilimumab，大约3μM至大约5.0mM的螯合剂，大约10mM至大约400mM的海藻糖,大约1mM至大约100mM的组氨酸，和大约0.005mM至大约10mM的聚山梨酯80。
在另一个实施方案中，所述液体药物组合物包含大约0.1mg/ml至大约200mg/ml的单克隆抗CTLA-4抗体ticilimumab，大约3μM至大约5.0mM的EDTA，大约10mM至大约400mM的张度剂,大约1mM至大约100mM的缓冲剂，和大约0.005mM至大约10mM的表面活性剂。
在另一个实施方案中，所述液体药物组合物包含大约0.1mg/ml至大约200mg/ml的单克隆抗CTLA-4抗体ticilimumab，大约3μM至大约5.0mM的EDTA，大约10mM至大约400mM的张度剂,大约1mM至大约100mM的组氨酸，和大约0.005mM至大约10mM的表面活性剂。
在另一个实施方案中，所述液体药物组合物包含大约0.1mg/ml至大约200mg/ml的单克隆抗CTLA-4抗体ticilimumab，大约3μM至大约5.0mM的EDTA，大约10mM至大约400mM的海藻糖,大约1mM至大约100mM的组氨酸，和大约0.005mM至大约10mM的表面活性剂。
在本发明的某些方面，所述液体抗CTLA-4抗体组合物包含大约0.1mg/ml至大约200mg/ml的单克隆抗CTLA-4抗体ticilimumab，大约1mM至大约100mM的组氨酸，大约0.005mM至大约10mM的聚山梨酯80，大约3μM至大约5.0mM的EDTA，和大约10mM至大约400mM的海藻糖。
在本发明的其他方面，所述液体抗CTLA-4抗体组合物包含大约1.0mg/ml至大约100mg/ml的单克隆抗CTLA-4抗体ticilimumab，大约10mM至大约50mM的组氨酸，大约0.01mM至大约1.0mM的聚山梨酯80,大约3μM至大约5.0mM的EDTA，和大约100mM至大约300mM的海藻糖。
在本发明的其他方面，所述液体抗CTLA-4抗体组合物包含大约10mg/ml至大约50mg/ml的单克隆抗CTLA-4抗体ticilimumab，大约10mM至大约30mM的组氨酸，大约0.05mM至大约0.5mM的聚山梨酯80,大约0.1mM至大约1mM的EDTA，和大约200mM至大约250mM的海藻糖。
在本发明的其他方面，所述液体抗CTLA-4抗体组合物包含大约20mg/ml的单克隆抗CTLA-4抗体ticilimumab，大约20mM的组氨酸，大约0.15mM的聚山梨酯80，大约0.27mM的EDTA，和大约222mM的海藻糖。
在另一个实施方案中，本发明涉及包含抗CTLA-4抗体和药学上可接受的螯合剂的稳定的液体药物组合物，其中所述抗体的摩尔浓度在大约0.0006mM至大约1.35mM的范围内，和所述螯合剂的摩尔浓度在大约0.003mM至大约50mM的范围内，并且其中抗体与螯合剂的摩尔比在大约0.00001至大约450、大约0.0001至大约100、大约0.005至大约50、大约0.001至大约10、大约0.01至大约5、大约0.1至大约1的范围之内，或为大约0.5。
在另一个实施方案中，本发明涉及包含ticilimumab和药学上可接受的螯合剂的稳定的液体药物组合物，其中所述抗体的摩尔浓度在大约0.0006mM至大约1.35mM的范围内，和所述螯合剂的摩尔浓度在大约0.003mM至大约50mM的范围内，并且其中抗体与螯合剂的摩尔比在大约0.00001至大约450、大约0.0001至大约100、大约0.005至大约50、大约0.001至大约10、大约0.01至大约5、大约0.1至大约1的范围之内，或为大约0.5。
在另一个实施方案中，本发明涉及包含ticilimumab、药学上可接受的螯合剂和组氨酸的稳定的液体药物组合物，其中所述抗体的摩尔浓度在大约0.0006mM至大约1.35mM的范围内，所述螯合剂的摩尔浓度在大约0.003mM至大约50mM的范围内，和组氨酸的摩尔浓度在大约1mM至大约100mM的范围内，并且其中抗体与螯合剂的摩尔比在大约0.00001至大约450、大约0.0001至大约100、大约0.005至大约50、大约0.001至大约10、大约0.01至大约5、大约0.1至大约1的范围之内，或为大约0.5。
在另一个实施方案中，本发明涉及包含ticilimumab、药学上可接受的螯合剂和组氨酸的稳定的液体药物组合物，其中所述抗体的摩尔浓度在大约0.0006mM至大约1.35mM的范围内，所述螯合剂的摩尔浓度在大约0.003mM至大约50mM的范围内,和组氨酸的摩尔浓度在大约10mM至大约50mM的范围内，并且其中抗体与螯合剂的摩尔比在大约0.0001至大约100、大约0.005至大约50、大约0.001至大约10、大约0.01至大约5、大约0.1至大约1的范围之内，或为大约0.5。
在另一个实施方案中，本发明涉及包含ticilimumab、药学上可接受的螯合剂和组氨酸的稳定的液体药物组合物，其中所述抗体的摩尔浓度在大约0.0006mM至大约1.35mM的范围内，所述螯合剂的摩尔浓度在大约0.003mM至大约50mM的范围内，和组氨酸的摩尔浓度在大约10mM至大约30mM的范围内，并且其中抗体与螯合剂的摩尔比在大约0.005至大约50、大约0.001至大约10、大约0.01至大约5、大约0.1至大约1的范围之内，或为大约0.5。
在另一个实施方案中，本发明涉及包含ticilimumab、药学上可接受的螯合剂和组氨酸的稳定的液体药物组合物，其中所述抗体的摩尔浓度在大约0.0006mM至大约1.35mM的范围内，所述螯合剂的摩尔浓度在大约0.003mM至大约50mM的范围内，和组氨酸的摩尔浓度在大约10mM至大约30mM的范围内，并且其中抗体与螯合剂的摩尔比在大约0.001至大约10、大约0.01至大约5、大约0.1至大约1的范围之内，或为大约0.5。
在另一个实施方案中，本发明涉及包含ticilimumab、药学上可接受的螯合剂和组氨酸的稳定的液体药物组合物，其中所述抗体的摩尔浓度在大约0.0006mM至大约1.35mM的范围内，所述螯合剂的摩尔浓度在大约0.003mM至大约50mM的范围内，和组氨酸的摩尔浓度为大约20mM，并且其中抗体与螯合剂的摩尔比在大约0.001至大约10、大约0.01至大约5、大约0.1至大约1的范围之内，或为大约0.5。
产生抗CTLA-4抗体的方法和抗体生成细胞系：
可通过使用转基因小鼠来制备本发明的抗体，所述转基因小鼠具有插入的产生人抗体的基因组的基本部分，但所述小鼠被使得在产生内源性鼠类抗体方面是缺陷的。因此，这样的小鼠能够产生人免疫球蛋白分子和抗体，且在产生鼠类免疫球蛋白分子和抗体方面是缺陷的。下面描述用于获得这样的小鼠的技术。
可能产生转基因动物（例如，小鼠），其能够在免疫接种后在不产生内源性免疫球蛋白的情况下产生人抗体的完全储库（repertoire）。然而，特别地，在属于Hanson等人的美国专利号6,682,736中公开了转基因产生小鼠和来源于其的抗体的一个实施方案。通过使用该技术，可制备结合MAdCAM的抗体和产生此类抗体的杂交瘤。
人抗体避免了某些与具有鼠类或大鼠可变区和/或恒定区的抗体相关的潜在问题。此类鼠类或大鼠来源的蛋白质的存在可导致抗体的快速清除或可导致接受了此类抗体的施用的受试者产生针对所述抗体的免疫应答。
例如，已描述了，嵌合和种系突变型小鼠中的抗体重链连接区（JH）基因的纯合缺失导致内源性抗体产生的完全抑制。将人种系免疫球蛋白基因阵列（array）转移入这样的种系突变型小鼠中将导致在抗原（例如，CTLA-4）攻击后产生人抗体。参见，例如，Jakobovits等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:2551(1993);Jakobovits等人,Nature,362:255-258(1993);Bruggermann等人,Year in Immuno.,7:33(1993);和Duchosal等人,Nature355:258(1992)。人抗体还可来源于噬菌体展示文库（Hoogenboom等人,J.Mol.Biol.,227:381(1991);Marks等人,J.MoL Biol.,222:581-597(1991);Vaughan等人,Nature Biotech14:309(1996)）。
在一些实施方案中，可通过免疫接种非人转基因动物例如XENOMOUSETM小鼠来产生人抗CTLA-4抗体，所述小鼠的基因组包含人免疫球蛋白基因，这样所述重组小鼠能够产生人抗体。XENOMOUSETM小鼠是经工程改造的小鼠品系，其包含人免疫球蛋白重链和轻链基因座的大片段，并且在小鼠抗体产生方面是缺陷的。XENOMOUSETM小鼠产生完全人的抗体的成人样（adult-like）人储库，和产生抗原特异性人抗体。在一些实施方案中，所述的XENOMOUSETM小鼠通过导入人重链基因座和κ轻链基因座的百万碱基大小的种系构型（germlineconfiguration）酵母人工染色体（YAC）片段而包含大约80%的人抗体V基因储库。在其他实施方案中，XENOMOUSETM小鼠还包含大约所有的λ轻链基因座。参见，例如，Green等人,Nature Genetics7:13-21(1994)和美国专利5,916,771、5,939,598、5,985,615、5,998,209、6,075,181、6,091,001、6,114,598、6,130,364、6,162,963和6,150,584。还可参见WO91/10741、WO94/02602、WO96/34096、WO96/33735、WO98/16654、WO98/24893、WO98/50433、WO99/45031、WO99/53049、WO00/09560和WO00/037504。
在一些实施方案中，包含人免疫球蛋白基因的非人动物是具有人免疫球蛋白“微小基因座（minilocus）”的动物。在微小基因座方法中，通过包含来自Ig基因座的单独基因来模拟外源Ig基因座。因此，将一个或多个VH基因、一个或多个DH基因、一个或多个JH基因、μ恒定结构域和第二恒定结构域（优选地，γ恒定结构域）形成入用于插入动物的构建体中。除了其他以外，在美国专利5,545,807、5,545,806、5,569,825、5,625,126、5,633,425、5,661,016、5,770,429、5,789,650、5,814,318、5,591,669、5,612,205、5,721,367、5,789,215和5,643,763中描述了该方法。
因此，在一些实施方案中，可通过用CTLA-4抗原免疫接种非人动物来产生人抗体，所述非人动物在其基因组中包含一些或所有人免疫球蛋白重链和轻链基因座。
在一些实施方案中，所述CTLA-4抗原是分离的和/或纯化的CTLA-4。在优选实施方案中，所述CTLA-4抗原是人CTLA-4。在一些实施方案中，所述CTLA-4抗原是CTLA-4的片段。在一些实施方案中，所述CTLA-4片段包含CTLA-4的至少一个表位。在其他实施方案中，所述CTLA-4抗原是在其表面上表达或过表达CTLA-4或其免疫原性片段的细胞。在其他实施方案中，所述CTLA-4抗原是CTLA-4融合蛋白。可使用已知的技术从天然来源中纯化出CTLA-4。
在优选实施方案中，所述非人动物是XENOMOUSETM动物（AbgenixInc.,Fremont,CA）。可使用的另一种非人动物是由Medarex（Medarex,Inc.,Princeton,NJ）生产的转基因小鼠。
可通过本领域已知的任何方法来免疫接种动物。参见，例如，Harlow和Lane,Antibodies:A Laboratory Manual,New York:ColdSpring Harbor Press,1990。用于免疫接种非人动物例如小鼠、大鼠、绵羊、山羊、猪、牛和马的方法在本领域内是熟知的。参见，例如，Harlow和Lane（同上），和美国专利5,994,619。在优选实施方案中，将CTLA-4抗原与佐剂一起施用以刺激免疫应答。示例性的佐剂包括完全或不完全弗氏佐剂、RIBI（胞壁酰二肽）或ISCOM（免疫刺激复合物）。此类佐剂可通过将多肽隔离在局部沉积物中来保护其免于快速分散，或者它们可包含刺激宿主分泌因子的物质，所述因子是巨噬细胞和免疫系统的其他组分的趋化剂。优选地，如果正在施用多肽，那么免疫接种方案可在数周的时期内包括两次或更多次所述多肽的施用。
在用CTLA-4抗原免疫接种动物后，可从所述动物获得抗体和/或抗体产生细胞。在一些实施方案中，通过放血或处死动物而从动物获得包含抗CTLA-4抗体的血清。因为其获自所述动物，所以可使用该血清，可从该血清获得免疫球蛋白级分，或可从该血清纯化出抗CTLA-4抗体。
在一些实施方案中，从分离自经免疫接种的动物的细胞制备抗体产生性永生化细胞系。在免疫接种后，处死动物，然后使淋巴节和/或脾B细胞永生化。使细胞永生化的方法包括，但不限于，用癌基因转染细胞，用致癌病毒感染细胞，在选择永生化细胞的条件下培养细胞，使细胞接受致癌或致突变化合物，将细胞与永生化细胞例如骨骼瘤细胞融合，和使肿瘤抑制基因失活。参见，例如，Harlow和Lane（同上）。在优选实施方案中，经免疫接种的动物是表达人免疫球蛋白基因的非人动物，并将脾B细胞融合至来自与该非人动物相同的物种的骨髓瘤细胞系。在更优选的实施方案中，所述经免疫接种的动物是XENOMOUSETM动物，和所述骨髓瘤细胞系是非分泌型小鼠骨髓瘤。在更加优选的实施方案中，所述骨髓瘤细胞系P3-X63-AG8-653。如果采用与骨髓瘤细胞融合，那么所述骨髓瘤细胞优选地不分泌免疫球蛋白多肽（非分泌型细胞系）。使用CTLA-4、其部分或表达CTLA-4的细胞来筛选永生化细胞。在优选实施方案，使用酶联免疫测定法（ELISA）或放射免疫测定法进行初步筛选。在WO00/37504中提供了ELISA筛选的实例。
选择、克隆抗CTLA-4抗体产生细胞例如杂交瘤，并就想要的特征（包括强势生长、高抗体产量和想要的抗体特征，如下面进一步讨论的）来进一步进行筛选。可在同系动物中，在缺少免疫系统的动物例如裸鼠中于体内扩增杂交瘤，或者在细胞培养中于体外扩增杂交瘤。选择、克隆和扩增杂交瘤的方法对于本领域普通技术人员来说是熟知的。
如将会意识到的，可在除了杂交瘤细胞系以外的细胞系中重组表达本发明的抗体。可将编码特定抗体的cDNA或基因组克隆的核酸序列用于转化合适的哺乳动物或非哺乳动物宿主细胞。
本发明还包括编码抗CTLA-4抗体的核酸分子。在一些实施方案中，不同的核酸分子编码抗CTLA-4免疫球蛋白的重链和轻链。在其他实施方案中，同一个核酸分子编码抗CTLA-4免疫球蛋白的重链和轻链。在一个实施方案中，所述核酸编码本发明的抗CTLA-4抗体。
可从产生抗CTLA-4抗体的任何来源分离编码该抗体的重链或完整轻链或者其部分的核酸分子。在各种不同的实施方案中，从分离自用抗CTLA-4免疫接种的动物的B细胞中或从来源于此类表达抗CTLA-4抗体的B细胞的永生化细胞中分离出所述核酸分子。分离编码抗体的mRNA的方法在本领域中是熟知的。参见，例如，Sambrook,等人,Molecular Cloning，第3版，第3卷(1989)。所述mRNA可用于产生在抗体基因的聚合酶链式反应（PCR）或cDNA克隆中使用的cDNA。在优选实施方案中，从杂交瘤中分离所述核酸分子，所述杂交瘤具有来自非人转基因动物的人免疫球蛋白产生细胞作为其融合伙伴之一。在更加优选的实施方案中，所述人免疫球蛋白产生细胞分离自XENOMOUSETM动物。在另一个实施方案中，所述人免疫球蛋白产生细胞来自上述的非人、非小鼠转基因动物。在另一个实施方案中，所述核酸分离自非人、非转基因动物。可将分离自非人动物的所述核酸分子用于例如人源化抗体。
在一些实施方案中，编码本发明的抗CTLA-4抗体的重链的核酸可包含编码本发明的VH结构域的核苷酸序列，该核苷酸序列按阅读框架连接至编码来自任何来源的重链恒定结构域的核苷酸序列。类似地，编码本发明的抗CTLA-4抗体的轻链的核酸分子可包含编码本发明的VL结构域的核苷酸序列，该核苷酸序列按阅读框架连接至编码来自任何来源的轻链恒定结构域的核苷酸序列。
在本发明的进一步方面，将编码重链可变结构域（VH）和轻链可变结构域（VL）的核酸分子“转变”成全长抗体基因。在一个实施方案中，通过下述方式来将编码VH或VL结构域的核酸分子转变成全长抗体基因：将编码VH或VL结构域的核酸分子插入已分别编码重链恒定结构域（CH）或轻链恒定结构域（CL）的表达载体中，从而VH区段有效连接至载体内的CH区段，和VL区段有效连接至载体内的CL区段。在另一个实施方案中，通过下述方式来将编码VH和/或VL结构域的核酸分子转变成全长抗体基因：使用标准的分子生物学技术将编码VH和/或VL结构域的核酸分子连接例如连结至编码CH和/或CL结构域的核酸分子。人重链和轻链免疫球蛋白恒定结构域基因的核酸序列在本领域内是已知的。参见，例如，Kabat等人,Sequences of Proteins ofImmunological Interest,第5版,NIH Publ.No.91-3242,1991。然后，可从已导入了编码全长重链和/或轻链的核酸分子的细胞中表达所述编码全长重链和/或轻链的核酸，并分离抗CTLA-4抗体。
本发明还提供了包含编码本发明抗CTLA-4抗体的重链或其抗原结合部分的核酸分子的载体。本发明还提供了包含编码此类抗体的轻链或其抗原结合部分的核酸分子的载体。本发明进一步提供了包含编码融合蛋白、经修饰的抗体、抗体片段和其探针的核酸分子的载体。
在一些实施方案中，通过下列方式来表达本发明的抗CTLA-4抗体或抗原结合部分：将如上获得的编码部分或全长轻链和重链的DNA插入表达载体中以使所述基因有效连接至必需的表达控制序列，例如转录和翻译控制序列。表达载体包括质粒，逆转录病毒，腺病毒，腺伴随病毒（AAV），植物病毒例如花椰菜花叶病毒，烟草花叶病毒，粘粒，YAC，EBV来源的附加体等。将所述抗体基因连接入载体，以使载体内的转录和翻译控制序列发挥所想要的其调节所述抗体基因的转录和翻译的功能。选择表达载体和表达控制序列以与所使用的表达宿主细胞相容。可将抗体轻链基因和抗体重链基因插入至分开的载体中。在优选实施方案中，将两个基因都插入同一个的表达载体中。通过标准的方法（例如，连接抗体基因片段和载体上的互补的限制性位点，或如果没有限制性位点存在则进行平端连接）将抗体基因插入表达载体中。
方便的载体是编码在功能上完整的人CH或CL免疫球蛋白序列的载体，其具有经改造的合适的限制性位点，从而使任何VH或VL序列可容易地插入和表达，正如上面所述的。在此类载体中，通常在插入的J区域中的剪接供体位点和位于人C结构域之前的剪接接纳体位点之间发生剪接，并且剪接还可在位于人CH外显示子内的剪接区域处发生。多腺苷酸化和转录终止在所述编码区下游的天然染色体位置处发生。所述重组表达载体还可编码有助于抗体链从宿主细胞中分泌的信号肽。可将抗体链基因克隆入载体中，以使信号肽按阅读框架连接至免疫球蛋白的氨基末端。所述信号肽可以是免疫球蛋白信号肽或异源信号肽（即，来自非免疫球蛋白的信号肽）。
除了所述抗体链基因外，本发明的重组表达载体携带在宿主细胞中控制所述抗体链基因表达的调控序列。本领域技术人员将意识到，表达载体的设计（包括调控序列的选择）可依赖于例如下列因素：待转化的宿主细胞的选择、想要的蛋白质的表达水平等。优选的用于哺乳动物宿主细胞表达的调控序列包括，指导蛋白质在哺乳动物细胞中高水平表达的病毒元件，例如来源于逆转录病毒（例如逆转录病毒LTR）、巨细胞病毒（CMV）（例如CMV启动子/增强子）、猿猴病毒40（SV40）（例如SV40启动子/增强子）、腺病毒（例如，腺病毒主要晚期启动子（AdMLP））的启动子和/或增强子，多瘤和强的哺乳动物启动子例如天然免疫球蛋白和肌动蛋白的启动子。关于病毒调控元件和其序列的进一步描述，参见例如，美国专利5,168,062、美国专利4,510,245和美国专利4,968,615。用于在植物中表达抗体的方法，包括启动子和载体以及植物转化的描述，在本领域内是已知的。参见，例如，美国专利6,517,529，此处引用作为参考。在细菌细胞或真菌细胞例如酵母细胞中表达多肽的方法在本领域内也是熟知的。
除了所述抗体链基因和调控序列外，本发明的重组表达载体可携带额外的序列，例如在宿主细胞中调控载体的复制的序列（例如，复制起点）和选择标记基因。所述选择标记基因有助于选择出其中已导入了所述载体的宿主细胞（参见例如，美国专利4,399,216、4,634,665和5,179,017）。例如，通常，选择标记基因为其中已导入了所述载体的宿主细胞提供对药物例如G418、潮霉素或氨甲蝶呤的抗性。优选的选择标记基因包括二氢叶酸还原酶（DHFR）基因（用于使用氨甲蝶呤的DHFR-宿主细胞选择/扩增）、新霉素抗性基因（用于G418选择）和谷氨酰胺合成酶基因。
可使用编码抗CTLA-4抗体的核酸分子和包含这些核酸分子的载体来转化合适的哺乳动物、植物、细菌或酵母宿主细胞。可通过下列方式采用转基因方法来产生本发明的抗体：产生对于目的免疫球蛋白重链和轻链序列来说为转基因的哺乳动物或植物，并从中以可回收的形式产生抗体。
可通过用于将多核苷酸导入宿主细胞的任何已知方法（包括，例如将多核苷酸包装入病毒（或包装入病毒载体），并用病毒（或载体）转导宿主细胞）或通过本领域内已知的转染方法（如美国专利4,399,216、4,912,040、4,740,461和4,959,455中例举的方法）来进行转化。使用的转化方法依赖于待转化的宿主。用于将异源多核苷酸导入哺乳动物细胞的方法在本领域内是熟知的，并且包括，但不限于，葡聚糖介导的转染、磷酸钙沉淀法、polybrene介导的转染、原生质体融合、电穿孔、粒子轰击、将多核苷酸包囊到脂质体中、肽辍合物、树枝状聚合物和直接将DNA显微注射入细胞核中。
可获得作为用于表达的宿主的哺乳动物细胞系在本领域内是熟知的，其包括可从美国典型培养物保藏中心（ATCC）获得的许多永生化细胞系，包括但不限于中国仓鼠卵巢（CHO）细胞、NS0细胞、HeLa细胞、幼仑鼠肾（BHK）细胞、猴肾细胞（COS）、人肝细胞癌细胞（例如，Hep G2），和许多其他细胞系。非哺乳动物细胞包括但不限于细菌、酵母、昆虫和植物，它们也可用于表达重组抗体。为了防止由于非人糖基化而导致的免疫原性、药物代谢动力学和/或效应器功能的改变，对抗体的CH2结构域进行位点定向诱变以除去糖基化可能是优选的。通过确定哪种系统产生最高表达水平和产生具有组成型CTLA-4结合特性的抗体来选择表达方法。
此外，可使用许多已知的技术来增强从生产细胞系中表达本发明的抗体（或来源于其的其他部分）。例如，谷氨酰胺合成酶和DHFR基因表达系统是用于在某些条件下增强表达的常用方法。可使用常规技术例如限度稀释克隆法和微滴技术来鉴定高表达性细胞克隆。在欧洲专利0216846、0256055和0323997以及欧洲专利申请89303964.4中完整或部分地讨论了谷氨酰胺合成酶系统。
关于在哺乳动物中的转基因产生，还可以在山羊、牛或其他哺乳动物中产生抗体，并从它们的奶中回收抗体。参见，例如，美国专利5,827,690、5,756,687、5,750,172和5,741,957。
可从相关的细胞材料中纯化和/或分离在上述细胞中表达的抗CTLA-4抗体。抗体可存在于完整的细胞中、细胞裂解物中，或以部分纯化或基本上纯的形式存在。为了除去其他细胞组分或其他污染物例如其他细胞的核酸或蛋白质，通过标准技术进行纯化，所述标准技术包括碱/SDS处理、柱层析和本领域内熟知的其他方法。参见Ausubel,F.,等人,ed.Current Protocols in Molecular Biology,GreenePublishing and Wiley Interscience,New York(1987)。
在本发明中，由不同细胞系或在转基因动物中表达的本发明的抗CTLA-4抗体可能相互之间将会具有不同的糖基化模式。然而，所有由此处提供的核酸和氨基酸所编码的抗CTLA-4抗体被认为是本发明的一部分，无论其糖基化模式或者其修饰或缺失如何。因此，为了本发明的目的，所述抗CLTA-4抗体可以是糖基化的或非糖基化的。当所述抗CLTA-4抗体是糖基化的时，它们可具有任何可能的糖基化模式。此外，一个抗体内的每条重链可具有相同的糖基化模式，或两条重链可具有不同的糖基化模式。为了防止由于非人糖基化而导致的免疫原性、药物代谢动力学和/或效应子功能的改变，本发明还包括抗体CH2结构域的位点定向诱变以消除糖基化。
如此处所用的，术语“糖基化”是指共价附着至抗体的糖单元的模式。当说道此处的抗CTLA-4抗体具有特定的糖基化模式时，这是表示大部分所提及的抗CTLA-4抗体具有该特定的糖基化模式。在其他方面，当说道此处的抗CTLA-4抗体具有特定的糖基化模式时，这是表示大于或等于50%、75%、90%、95%、99%或100%的所提及的抗CTLA-4抗体具有该特定的糖基化模式。
本发明的抗CTLA-4抗体还包括其糖基化变体（例如，通过缺失、插入或置换合适的氨基酸残基来插入糖基化位点或删除任何糖基化位点而产生的）。
多肽的糖基化通常是N-联或O-联的。抗体多肽的糖基化通常是N-联的，并且形成二天线型结构。N-联是指将糖部分附着至天冬酰胺残基的侧链。三肽序列天冬酰胺-X-丝氨酸和天冬酰胺-X-苏氨酸，其中X是除了脯氨酸外的任何氨基酸，是用于将糖部分酶促附着至天冬酰胺侧链的识别序列。因此，抗体中这些三肽序列的存在产生了潜在的糖基化位点。
二天线型聚糖的三种不同结构称为“G0”、“G1”和“G2”，其分别在聚糖的非还原性末端具有0、1或2个末端半乳糖残基。参见Jefferis等人,Biochem.J.,268,529-537(1990)。在一些情况下，聚糖结构也可具有连接至N-乙酰葡糖胺的岩藻糖残基，所述N-乙酰葡糖胺共价结合至在抗体中发现的天冬酰胺氨基酸（例如，位点297）。当岩藻糖（F）存在时，依赖于末端半乳糖残基的数目，二天线型聚糖命名法改变为“G0F”、“G1F”或“G2F”。参见，Teillaud,ExpertOpin.Biol.Ther.,5(Suppl.1):S15-S27(2005)。此外，当抗体包含两条重链时，对于两条重链中的每一条重复聚糖命名法。“G0F,G0F”糖形是其中两条重链都附着有G0聚糖并且各G0聚糖都具有连接至N-乙酰葡糖胺的岩藻糖（F）残基的种类。“G0F,G1F”糖形是其中一条重链附着有G0聚糖而另一条重链附着有G1聚糖的种类，其中各G0聚糖和G1聚糖具有连接至N-乙酰葡糖胺的岩藻糖（F）残基。
在某些实施方案中，所述抗CTLA-4抗体具有选自“G0F,G0F”、“G0F,G1F”、“G1F,G1F”、“G1F,G2F”和其混合物的糖基化模式。在其他实施方案中，对于超过50%的所产生的抗体，抗CTLA-4抗体具有为“G0F,G1F”的糖基化模式。在其他实施方案中，对于少于50%的所产生的抗体，抗CTLA-4抗体具有为“G0F,G0F”的糖基化模式。例如，在一个实施方案中，此处描述的抗CTLA-4抗体11.2.1具有“G0F,G0F”或“G0F,G1F”的糖基化模式。在一些实施方案中，产生具有不同糖基化模式的混合状态的抗CTLA-4抗体（11.2.1）。例如，在抗体（11.2.1）的样品中，可存在抗体（11.2.1）的混合物，所述抗体中的一些具有“G0F,G1F”的糖基化模式和其他具有“G0F,G0F”的糖基化模式，其比例为3:2。
施用途径和按剂量给药:
本发明的组合物可以以液体溶液形式（例如，可注射的和可输注的溶液）存在。优选形式依赖于所希望的施用方式和治疗性应用。通常的优选的组合物以可注射的或可输注的溶液形式存在，例如与用于人的被动免疫接种的组合物相似的组合物。优选的施用方式是以无菌注射液或油质（olagenous）悬浮液的形式经肠胃外（例如，静脉内、皮下、腹膜内、肌内和胸骨内）施用或通过输注技术施用。正如本领域技术人员将会认识到的，施用的途径和/或方式将依赖于想要的结果而变化。在优选实施方案中，通过静脉内输注或注射施用抗体。在另一个优选实施方案中，通过肌内或皮下注射施用所述抗体。
治疗性组合物在生产和贮存的条件下通常是无菌的和稳定的。
可将组合物配制为溶液、微乳液、分散体或脂质体。可通过将抗CTLA-4抗体以需要的量与上面例举的成分中的一种或其组合一起（如果需要）掺入合适的稀释剂中，然后进行灭菌（例如，过滤灭菌），来制备可注射溶液。一般地，通过将活性化合物掺入无菌媒介物中来制备分散体，所述媒介物包含基础分散介质和所需要的来自上面例举的那些的其他成分。可按照已知的技术使用那些合适的分散剂、湿润剂和悬浮剂或其他可接受的试剂来配制此类悬浮液。无菌可注射制剂也可以是在无毒的肠胃外可接受的稀释剂或溶剂（例如1,3-丁二醇）中的无菌可注射溶液或悬浮液。其中，可使用的可接受的媒介物和溶剂是水、林格氏溶液和等渗氯化钠溶液。此外，无菌的不挥发性油常规地用作溶剂或悬浮介质。对于该目的，可使用任何温和的不挥发性油，包括合成的甘油单酯或甘油二酯。此外，n-3多不饱和脂肪酸可用于制备可注射液。
在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末的情况下，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥，所述干燥方法从其先前无菌过滤的溶液中产生活性成分加上任何额外的想要的成分的粉末。可通过例如使用包衣例如卵磷脂，通过在分散体的情况下保持所需颗粒大小，和通过使用表面活性剂，来保持液体的适当的流动性。
可通过在组合物中包含延迟吸收的试剂例如单硬脂酸盐和明胶，或者通过将所述组合物配制成延长吸收形式例如贮库制剂（depots）、脂质体、聚合物微球、聚合物凝胶和植入物，来产生可注射组合物的延长吸收。
用于施用此处描述的抗体的其他方法包括直接将药物释放入受试者皮肤的皮肤贴剂。此类贴剂可包含在可选地经缓冲的液体溶液中的、溶解和/或分散在粘合剂中的、或分散在聚合物中的本发明的抗体。
施用此处描述的抗体的其他方法包括用于眼睛的滴眼液。
可施用所述抗体一次，但更优选地施用多次。例如，可从每天一次至每6个月或更长时间一次施用所述抗体。可按方案例如每天3次、每天2次、每天1次、每2天1次、每3天1次、每周1次、每2周1次、每1个月1次、每2个月1次、每3个月1次和每6个月1次来进行施用。
还可通过微型泵连续施用所述抗体。可将抗体施用在肿瘤或发炎的身体部分的位点处，施用入肿瘤或发炎的身体部分中或施用在远离肿瘤或发炎的身体部分位点的位点处。可以施用所述抗体1次，至少2次，或施用至少一段时间直至病状被治疗、减轻或治愈。通常只要肿瘤存在就可施用所述抗体，条件是所述抗体可使肿瘤或癌症停止生长或减少重量或体积，或者施用所述抗体直至发炎的身体部分愈合，通常将所述抗体作为上面描述的药物组合物的一部分进行施用。
本发明的组合物可包含治疗有效量或预防有效量的本发明的抗体或抗原结合部分。在制备所述制剂中，可通过例如考虑想要的剂量体积和施用方式，待治疗的病状的性质和严重度，以及受试者的年龄和身材大小，来确定存在于制剂中的抗CTLA-4抗体的治疗有效量。
给受试者施用的本发明的药物组合物的示例性、非限定性剂量范围为大约0.01mg/kg至大约200mg/kg（以每千克（kg）受试者体重所施用的抗CTLA-4抗体的毫克（mg）数表示）、大约0.1mg/kg至大约100mg/kg、大约1.0mg/kg至大约50mg/kg、大约5.0mg/kg至大约20mg/kg、或大约15mg/kg。为了本发明的目的，平均人受试者体重为大约70kg。
还希望将介于此处所述的任何剂量之间的范围，例如，大约0.01mg/kg－199mg/kg，作为本发明的一部分。例如，希望包括使用所述任何值的组合作为上限和/或下限的值的范围。
还可通过在一段时间内给受试者施用几个分剂量来调整按剂量给药方案从而提供最佳的想要的应答（例如，治疗性或预防性应答），或者可根据治疗状况的紧迫性按比例地减少或增加剂量。为了方便施用和剂量统一，以剂量单位形式配制肠胃外组合物是尤其有利的。
此处所用的剂量单位形式是指适合用作待治疗的哺乳动物受试者的单一剂量的物理上分开的单位；每个单位包含经计算而产生想要的治疗效果的预定量的活性化合物和所需的药物载体。本发明的剂量单位形式的规范由下列因素规定并直接依赖于下列因素：(a)抗CTLA-4抗体或部分的独特特征和要获得的特定治疗或预防效果，和(b)在配制这样的用于治疗个体敏感性的抗体的领域中固有的限制。
可将本发明的液体制剂配制为单位剂型。例如，每瓶单位剂量可包含1至1000毫升（ml）的不同浓度的抗CTLA-4抗体。在其他实施方案中，每瓶单位剂量可包含大约1ml、2ml、3ml、4ml、5ml、6ml、7ml、8ml、9ml、10ml、15ml、20ml、30ml、40ml、50ml或100ml的不同浓度的抗CTLA-4抗体。如果需要，可通过向每个瓶中加入无菌稀释剂来将这些制剂调整至想要的浓度。还可将本发明的液体制剂制备为在无菌袋或容器中的单位剂型，所述无菌袋或容器适合连接至静脉内施用线或导管。
稳定性评估：
本发明包括包含此处描述的抗CTLA-4抗体和药学上可接受的螯合剂的稳定的液体药物组合物。期望稳定的组合物保持例如产品的外观和完整性或抵抗它们的变化（包括可能导致生物学活性减少的物理或化学降解）。在文献中报导了用于测量蛋白稳定性的各种分析技术和指示剂，在Peptide and Protein Drug Delivery,247-301,VincentLee Ed.,Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.,Pubs.(1991)和Jones,A.Adv.Drug Delivery Rev.10:29-90(1993)中概述了许多这些技术和指示剂。一般地，本发明的液体药物组合物，当在一段时间内经历低的贮存温度和/或当经历一个或多个冷冻/解冻循环时展现出提高的稳定性。
在一个实施方案中，所述组合物，当在大约2℃至大约8℃的温度下贮存至少大约12个月，优选地至少大约18个月，和更优选地至少大约24个月时，比在相同条件下贮存相同时间的缺少螯合剂的相同组合物更稳定。
在另一个实施方案中，所述组合物，当在大约25℃至大约30℃的温度下贮存至少大约3个月，优选地至少6个月，和更优选地至少大约12个月时，比在相同条件下贮存相同时间的缺少螯合剂的相同组合物更稳定。
在另一个实施方案中，所述组合物，当在大约40℃的温度下贮存至少大约1个月，优选地至少大约2个月，和更优选地至少大约3个月时，比在相同条件下贮存相同时间的缺少螯合剂的相同组合物更稳定。
如此处所用的，术语“冷冻/解冻循环”是指在冷冻贮存后使用液体抗体样品的技术，其中将样品的温度降低至0℃或更低的温度以冷冻该液体样品，然后让样品经历使其恢复液体状态的温度，并进行足够的时间以允许使用样品，然后将其返回冷冻贮存，优选地在0℃或更低的温度下贮存。如此处所用的，术语“冷冻贮存”是指在0℃或更低的温度下，优选地在-20℃或更低的温度下，冷冻和保持先前液态的抗体样品。
在一个实施方案中，所述组合物，当进行至少1个冷冻/解冻循环，优选地至少2个冷冻/解冻循环，更优选地至少3个冷冻/解冻循环，更加优选地至少4个冷冻/解冻循环，更加优选地至少5个冷冻/解冻循环，和更加优选地至少6个冷冻/解冻循环时，比经历相同的冷冻/解冻条件的缺少螯合剂的相同组合物更稳定。
在另一个实施方案中，所述组合物满足下列条件中的两个或更多个：
(a)所述组合物，当在大约2℃至大约8℃的温度下贮存至少大约12个月，优选地至少大约18个月，和更优选地至少大约24个月时，比在相同条件下贮存相同时间的缺少螯合剂的相同组合物更稳定；
(b)所述组合物，当在大约25℃至大约30℃的温度下贮存至少大约3个月，优选地至少6个月，和更优选地至少大约12个月时，比在相同条件下贮存相同时间的缺少螯合剂的相同组合物更稳定；
(c)所述组合物，当在大约40℃的温度下贮存至少大约1个月，优选地至少大约2个月，和更优选地至少大约3个月时，比在相同条件下贮存相同时间的缺少螯合剂的相同组合物更稳定；或
(d)所述组合物，当进行至少1个冷冻/解冻循环，优选地至少2个冷冻/解冻循环，更优选地至少3个冷冻/解冻循环，更加优选地至少4个冷冻/解冻循环，更加优选地至少5个冷冻/解冻循环，和更加优选地至少6个冷冻/解冻循环时，比经历相同的冷冻/解冻条件的缺少螯合剂的相同组合物更稳定。
在另一个实施方案中，所述组合物满足上面刚刚讨论的条件中的三个或更多个。
为了本发明的目的，抗体聚集、抗体片段化和/或组合物变色例如可用作组合物的稳定性指标。一般地，本发明的液体药物组合物，当经历一种或多种上述贮存或冷冻/解冻条件时，相对于经历相同条件的缺少螯合剂的相同组合物而言，展示出更低水平的抗体聚集、抗体片段化和组合物变色中的至少一种。
可通过本领域内已知的各种方法来测量液体组合物中的蛋白质聚集。这些方法包括基于其分子量来分离蛋白质的凝胶过滤层析。“凝胶”是水和聚合物例如琼脂糖或聚丙烯酰胺的混合物。本发明还包括使用凝胶过滤HPLC（高效液相色谱）。其他公认的测量聚集的方法包括阳离子交换层析，该方法是使用阴离子柱的离子交换层析的一般液相层析技术。在本发明中交换的阳离子来自蛋白质分子。因为多价蛋白质聚集体可具有多个单链抗原结合蛋白的净电荷，从而聚集体可获得更强的保留，并可与单链分子相分离。优选的阳离子交换剂是聚天冬氨酸柱。因此，可容易地区分单体蛋白和聚集体。然而，本领域技术人员将认识到，本发明的聚集测定法不限于任何特定的层析柱类型，只要其能够分离两种形式的蛋白质分子。
可通过本领域内已知的各种方法来测量液体药物组合物中的蛋白质片段化。这些方法包括，例如，大小排阻层析、紫外线检测（例如，在214纳米处）、SDS-PAGE和/或基质辅助激光解吸电离/飞行时间质谱法（MALDI/TOF MS）。可通过例如离子交换层析或等电聚焦（IEF）来评估导致电荷改变（例如，由于脱酰胺作用而发生）的蛋白质片段化。
一般地，可通过组合物本身的目测观察来测量组合物的变色。一般地，包含螯合剂的本液体药物组合物，相对于不包含所述螯合剂的相同的组合物而言，减少了组合物的变色（例如，粉红色或黄色）和/或保持了组合物的清澈度（例如浊度、浑浊度和/或颗粒形成）。为了本发明的目的，术语“变色”是指颜色的改变（例如，从清澈和无色至粉红色或黄色）以及清澈度的改变（例如从清澈和无色至混浊、浑浊和/或具有颗粒）。一般地，可使用其他技术例如通过在214纳米处进行紫外线检测和/或通过对具有和不具有所述螯合剂的组合物的标准色标进行目测比较，来测量组合物的变色。参见PhEur5.0,2005Monograph2.2.2。
在一个实施方案中，在所述组合物经历下列条件中的至少一个后测定抗体聚集：
(a)将所述组合物在大约2℃至大约8℃的温度下贮存至少大约12个月，优选地至少大约18个月，和更优选地至少大约24个月；
(b)将所述组合物在大约25℃至大约30℃的温度下贮存至少大约3个月，优选地至少6个月，和更优选地至少大约12个月；
(c)将所述组合物在大约40℃的温度下贮存至少大约1个月，优选地至少大约2个月，和更优选地至少大约3个月；或
(d)使所述组合物经历至少1个冷冻/解冻循环，优选地至少2个冷冻/解冻循环，更优选地至少3个冷冻/解冻循环，更加优选地至少4个冷冻/解冻循环，更加优选地至少5个冷冻/解冻循环，和更加优选地至少6个冷冻/解冻循环。然后通过层析法（例如使用HPLC）将抗体聚集体与单体分离，并根据所得的色谱图来确定聚集的程度。本发明的稳定的液体药物组合物所具有的在色谱图上的聚集体峰面积通常低于大约6%、低于大约5%、低于大约4%、低于大约3%、低于大约2%或低于大约1.5%的在所述色谱图上的总峰面积。在用于测量聚集的该技术的一个具体的实例中，将所述组合物在40℃下贮存24周，然后使用SE-HPLC进行层析分离并在214纳米处进行紫外线检测。该技术在实施例11中用于测量抗体聚集，在所述实施例中，例如，第37号制剂（包含螯合剂）在色谱图上展示出大约1.1%的聚集体峰面积，而制剂26（缺少螯合剂）在色谱图上展示出大约6.4%的聚集体峰面积。
一般地，本发明的稳定的液体药物组合物的聚集体色谱图峰面积和经历相同条件的缺少所述螯合剂的相同组合物的聚集体色谱图峰面积之间的差异为至少大约2%、至少大约3%、至少大约4%或至少大约4.5%。例如如上所述在实施例11中测试的制剂37（在色谱图上大约1.1%的聚集体峰面积）和制剂26（在色谱图上大约6.4%的聚集体峰面积）之间的差异为大约5.3%。
在另一个实施方案中，在所述组合物经历下列条件中的至少一个后测定抗体片段化：
(a)将所述组合物在大约2℃至大约8℃的温度下贮存至少大约12个月，优选地至少大约18个月，和更优选地至少大约24个月；
(b)将所述组合物在大约25℃至大约30℃的温度下贮存至少大约3个月，优选地至少6个月，和更优选地至少大约12个月；
(c)将所述组合物在大约40℃的温度下贮存至少大约1个月，优选地至少大约2个月，和更优选地至少大约3个月；或
(d)使所述组合物经历至少1个冷冻/解冻循环，优选地至少2个冷冻/解冻循环，更优选地至少3个冷冻/解冻循环，更加优选地至少4个冷冻/解冻循环，更加优选地至少5个冷冻/解冻循环，和更加优选地至少6个冷冻/解冻循环。然后通过色谱法（例如，使用凝胶过滤）将抗体片段与所述组合物分离，并根据所得的色谱图来确定片段化的程度。本发明的稳定的液体药物组合物所具有的在色谱图上的片段条带体积通常为低于大约9%、低于大约8%、低于大约7%、低于大约6%、低于大约5%或低于大约4.5%的在所述色谱图上的总条带体积。在用于测量片段化的该技术的一个具体实例中，将所述组合物在40℃下贮存24周，然后使用还原型SDS-PAGE（rSDS-PAGE）进行色谱分析，其中通过使用Molecular Dynamics Personal Densitometer PDQC-90或Bio-Rad GS800Imaging Densitometer进行扫描来测定条带体积。该技术在实施例11中用于测量抗体片段化，在所述实施例中，例如，第37号制剂（包含螯合剂）在色谱图上展示出大约4.5%的片段条带体积而制剂26（缺少螯合剂）在色谱图上展示出大约10.1%的片段条带体积。
一般地，本发明的稳定的液体药物组合物的片段条带体积和经历相同条件的缺少所述螯合剂的相同组合物的片段条带体积之间的差异为至少大约2%、至少大约3%、至少大约4%或至少大约5%。例如，如上所述在实施例11中测试的制剂37（在色谱图上大约4.5%的片段条带体积）和制剂26（在色谱图上大约10.1%的片段条带体积）之间的差异为大约5.6%。
治疗方法:
可在治疗上使用此处描述的任何类型的抗体。在优选实施方案中，所述抗CTLA-4抗体是人抗体。在另一个优选实施方案中，所述CTLA-4是人的，且所述受试者是人受试者。在另一个优选实施方案中，所述抗CTLA-4抗体是人IgG2抗体。备选地，所述受试者可以是表达与所述抗CTLA-4抗体交叉反应的CTLA-4蛋白的哺乳动物。可以将所述抗体施用给表达与所述抗体交叉反应的CTLA-4的非人哺乳动物（即，灵长类动物），以用于兽医学目的或作为人疾病的动物模型。此类动物模型可用于评估本发明的抗体的治疗功效。
本发明提供了用于治疗受试者中的瘤形成病状的方法，其包括给所述受试者施用包含抗CTLA-4抗体和螯合剂（单独的或与选自缓冲剂、张度剂或表面活性剂及其混合物的其他赋形剂相组合的）的液体药物组合物。在其他实施方案中，上述受试者是需要预防或治疗瘤形成病状的受试者。
在另一个实施方案中，本发明提供了用于治疗受试者中的瘤形成病状的方法，其包括给受试者施用包含抗CTLA-4抗体和药学上可接受的赋形剂的液体药物组合物，所述药学上可接受的赋形剂包括螯合剂（单独的或与选自缓冲剂、张度剂或表面活性剂及其混合物的其他赋形剂相组合的）。
术语“瘤形成”和“瘤形成病状”都是指可以是良性的、恶化前的、转移的或恶性的“赘生物”或肿瘤。本发明还包括良性的、恶化前的、转移的或恶性的瘤形成。本发明还包括良性的、恶化前的、转移的或恶性的肿瘤。因此，所有良性的、恶化前的、转移的或恶性的瘤形成或肿瘤包括在本发明内，并且可互换地称为瘤形成、赘生物或瘤形成相关病状。肿瘤在本领域内通常被称为瘤形成块（mass ofneoplasia）或或“赘生性”细胞。尽管如此，要理解，为了本发明的目的，即使一个赘生性细胞也被认为是赘生物或备选地瘤形成。
可由本发明的抗CTLA-4抗体治疗的瘤形成病状可涉及任何组织或器官，并且包括但不限于骨癌、脑癌、肺癌、鳞状上皮细胞癌、膀胱癌、胃癌、胰腺癌、乳腺癌、头癌、颈癌、肝癌、肾癌、卵巢癌、前列腺癌、结肠直肠癌、食管癌、妇科癌（例如子宫颈癌和卵巢癌）、鼻咽癌或甲状腺癌。特别地，本发明的抗CTLA-4抗体制剂用于治疗乳腺癌、前列腺癌、结肠癌和肺癌。
在其他实施方案中，本发明的方法和组合物包括预防和治疗瘤形成病状，所述瘤形成病状选自：肢端色斑样黑色素瘤、光化性角化病、腺癌、囊腺癌、腺瘤、家族性腺瘤性息肉病、家族性息肉、结肠息肉、息肉、腺肉瘤、腺鳞癌、肾上腺皮质癌、AIDS相关性淋巴瘤、肛门癌、星形细胞瘤、前庭大腺癌、基底细胞癌、胆管癌、膀胱癌、脑干神经胶质瘤、脑肿瘤、乳腺癌、支气管腺体癌、毛细管癌、类癌、癌、输卵管癌瘤、子宫内膜癌、癌肉瘤、海绵状淋巴瘤、中枢神经系统淋巴瘤、大脑星形细胞瘤、胆管癌、软骨肉瘤、脉络丛乳头状瘤/癌、透明细胞癌、皮肤癌、脑癌、结肠癌、结肠直肠癌、皮肤T淋巴细胞瘤、囊腺瘤、内胚窦瘤、子宫内膜增生、子宫内膜间质肉瘤、子宫内膜样腺癌、室管膜癌、上皮样癌、食管癌、尤因肉瘤、性腺外生殖细胞瘤、纤维板层型癌、局灶性结节性增生、胆囊癌、胃泌素瘤、生殖细胞瘤、妊娠性滋养层细胞瘤、成胶质细胞瘤、神经胶质瘤、胰高血糖素瘤、成血管细胞瘤、血管内皮瘤、血管瘤、肝腺瘤、肝腺瘤病、肝细胞癌、何杰金淋巴瘤、下咽癌、下丘脑和视通路神经胶质瘤、胰岛素瘤、上皮内瘤形成、上皮内鳞状细胞瘤形成、眼内黑色素瘤、浸润性鳞状细胞癌、大细胞癌、胰岛细胞癌、卡波西肉瘤、肾癌、喉癌、平滑肌肉瘤、恶性着色斑型黑色素瘤、白血病相关病状、唇和口腔癌、肝癌、肺癌、淋巴瘤、恶性间皮瘤、恶性胸腺瘤、成神经管细胞瘤、髓上皮瘤、黑色素瘤、脑膜癌、梅克尔细胞癌、间皮癌、转移癌、粘液表皮样癌、多发性骨髓瘤/浆细胞赘生物、蕈样肉芽肿病、骨髓增生异常综合征、骨髓增殖性病状、鼻腔和鼻旁窦癌、鼻咽癌、成神经细胞瘤、神经上皮腺癌、结节性黑色素癌、中枢神经系统的赘生物（例如，原发性中枢神经系统淋巴瘤、脊柱轴肿瘤（spinal axis tumor）、脑干神经胶质瘤或垂体腺瘤）、非何杰金淋巴瘤、燕麦细胞癌、少突神经胶质细胞癌、口腔癌、口咽癌、骨肉瘤、胰多肽、卵巢癌、卵巢生殖细胞瘤、胰腺癌、乳头状浆液性腺癌、松果体细胞、垂体瘤、浆细胞瘤、假肉瘤、肺母细胞瘤、甲状旁腺癌、阴茎癌、嗜铬细胞瘤、松果体和天幕上原发性神经外胚层瘤、垂体肿瘤、浆细胞赘生物、胸膜肺母细胞瘤、前列腺癌、直肠癌、肾细胞癌、视网膜母细胞瘤、横纹肌肉瘤、肉瘤、浆液性癌（serous carcinoma）、小细胞癌、小肠癌、软组织癌、生长抑素分泌型肿瘤（somatostatin-secreting tumor）、鳞癌、鳞状细胞癌、间皮下、浅表扩散性黑色素瘤、天幕上原发性神经外胚层瘤、甲状腺癌、未分化癌、尿道癌、子宫癌、眼色素层黑素瘤、疣状癌、阴道癌、血管活性肠多肽瘤、外阴癌、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症、高分化性癌和维尔姆斯瘤。
在更优选的实施方案中，给患有乳腺癌、前列腺癌、肺癌或结肠癌的受试者施用所述抗CTLA-4抗体。在更加优选的实施方案中，所述方法使癌症停止异常增殖，或者不增加重量或体积或减少重量或体积。
制品：
在本发明的另一个实施方案中，提供了包括容器的制品，所述容器装载有液体药物制剂和任选地提供了其使用说明书，所述液体药物制剂在包含单独的或与其他药学上可接受赋形剂相组合的螯合剂的制剂中包含至少一种本发明的单克隆抗CTLA-4抗体。合适的容器包括，例如，瓶子、管形瓶、袋子和注射器。可从多种材料例如玻璃或塑料制造所述容器。示例性的容器是3-20cc的单次使用的玻璃管形瓶。备选地，对于多剂量制剂，所述容器可以是3-100cc的玻璃管形瓶。所述容器装载所述制剂，并且所述容器上或与其结合的标签可标明使用说明。制品还可包括从商业和用户角度来说想要的其他材料，包括其他缓冲剂、稀释剂、过滤器、针头、注射器，和具有使用说明、禁忌症和/或潜在副作用列表的包装插页。
本发明还提供了用于制备经稳定的抗体的液体组合物的试剂盒，所述试剂盒包含装有单克隆抗CTLA-4抗体11.2.1溶液的第一个容器，和装有在溶液中的足以稳定所述抗体的量的螯合剂（单独的或与其他赋形剂相组合的）的第二个容器。
下列实施例描述了本发明的实施方案。根据此处公开的本发明的说明或实践，此处权利要求书范围内的其他实施方案对于本领域技术人员来说是显然的。希望说明书和实施例只是被认为是示例性的，本发明的范围和精神由实施例后面的权利要求书来指明。在所述实施例中，除非另外指出，所有百分比均基于重量给出。本领域技术人员将认识到，使用本领域公认的所述成分的分子量可将实施例中所述的重量和/或重量-体积比转换成摩尔数和/或体积摩尔浓度。此处例举的重量（例如，克）是对于所述体积（例如，缓冲液、抗体制剂等的体积）来说的。本领域技术人员将认识到，当想要不同的制剂体积时可按比例调整重量。
实施例1
本实施例显示了产生在属于Hanson等人的美国专利6,682,736中所述的抗CTLA-4抗体的淋巴瘤细胞系的产生。
如下制备、选择和测定本发明的抗体：
抗原制备：制备三种不同的免疫原以用于免疫接种XenoMouseTM小鼠：(i)CTLA-4-IgG融合蛋白，(ii)CTLA-4肽，和(iii)用组成型地在细胞表面上表达的CTLA-4突变体（Y201V）转染的300.19鼠类淋巴瘤细胞。
CTLA-4-IgG1融合蛋白：
表达载体的构建
使用根据公布的序列（Eur.J Immunol18:1901-1905(1988)）设计的引物从人胸腺cDNA文库（Clontech）中PCR扩增出编码CTLA-4的成熟细胞外结构域的cDNA。将所述片段在人制瘤素M信号肽和人IgGγ1(IgG1)CH1/CH2/CH3结构域之间定向亚克隆入pSR5（辛德比斯病毒表达质粒）（InVitrogen）中。所述融合蛋白不包含铰链区但在CTLA-4的细胞外结构域中包含半胱氨酸120以形成共价二聚体。所得的载体称为CTLA-4-IgG1/pSR5。对载体中的完全CTLA-4-IgG1cDNA的两条链都进行序列确认。下面显示了CTLA4-Ig蛋白的氨基酸序列。从人淋巴细胞文库（Clontech）中PCR扩增出CD44的成熟细胞外结构域，然后将其亚克隆入pSinRep5中，从而产生具有相同的IgG1尾的对照蛋白。
OM-CTLA4-IgG1融合蛋白:
MGVLLTQRTLLSLVLALLFPSMASMAMHVAQPAVVLASSRGIASFVCEYASPGKATEVRVTVLRQADSQVTEVCAATYMMGNELTFLDDSICTGTSSGNQVNLTIQGLRAMDTGLYICKVELMYPPPYYLGIGNGTQIYVIDPEPCPDSDLEGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPTPEEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
加下划线的=信号肽。
从人淋巴细胞文库（Clontech）中PCR扩增出CD28的成熟细胞外结构域的cDNA，并将其亚克隆入pCDM8（J.Immunol.151:5261-71(1993)）中，从而产生包含凝血酶切割区和铰链区的人IgG1融合蛋白。使用标准的简并PCR技术从分离自用PHA刺激的PBMC的mRNA中克隆狨猴、食蟹猴和猕猴的CTLA4。序列测定表明猕猴和食蟹猴的氨基酸序列相同，其与成熟人CTLA4细胞外结构域具有3个差异（S13N、I17T和L105M）。狨猴显示与成熟人CTLA4细胞外结构域具有10个氨基酸差异（V21A、V33I、A41T、A51G、541、S71F、Q75K、T88M、L105M和G106S）。使用位点定向诱变使狨猴CTLA4中所有不同的氨基酸产生单个点突变以对对于所述抗体与人CTLA4-IgG的相互作用重要的氨基酸作图。通过matchmaker位点定向诱变（Promega）产生用于表位作图的人和狨猴CTLA-IgG的突变。通过Cos7细胞的瞬时转染产生IgG融合蛋白，并使用标准的A蛋白技术进行纯化。通过免疫印迹法和使用BIAcore分析就与抗体的结合来评估突变的CTLA4-IgG蛋白。
重组蛋白的表达/纯化
如InVitrogen所描述的，通过用经SP6体外转录的CTLA-4-IgG1/pSR5mRNA和DH-26S辅助mRNA对幼仓鼠肾细胞进行电穿孔（Gibco）来产生重组辛德比斯病毒。48小时后收获重组病毒，并就在中国仓鼠卵巢细胞（CHO-K1）中的最佳蛋白质表达进行滴定。将CHO-K1细胞悬浮培养在DMEM/F12（Gibco）中，所述DMEM/F12包含10%热失活的胎牛血清（Gibco）、非必需氨基酸（Gibco）、4mM谷氨酰胺（Gibco）、青霉素/链霉素（Gibco）、10mM Hepes pH7.5（Gibco）。为产生CTLA-4-IgG，以1×107个细胞/ml将CHO-K1细胞重悬浮在DMEM/F12中，并将其与辛德比斯病毒在室温下温育1小时。然后将细胞在DMEM/F12中稀释至1×106/ml，所述DMEM/F12包含1%胎牛血清（通过使用A蛋白Sepharose（Pharmacia）除去了牛IgG）、非必需氨基酸（Gibco）、4mM谷氨酰胺、12.5mM Hepes pH7.5和青霉素/链霉素（Gibco）。感染后48小时沉淀细胞，收获条件化培养基，并用完全蛋白酶抑制剂片剂进行补充，将pH调节至7.5，然后通过0.2μ（Nalgene）过滤。通过使用5ml A蛋白HiTrap柱（Pharmacia）以10ml/分钟的流速将FPLC（Pharmacia）用于亲和纯化融合蛋白。用30倍床体积的PBS洗涤柱子，并用0.1M甘氨酸/HCl pH2.8以1ml/分钟进行洗脱。立即用Tris pH9将级分（1ml）中和至pH7.5。通过SDS-PAGE鉴定包含CTLA-4-IgG1的级分，然后使用centriplus50（Amicon）进行浓缩，然后使用PBS作为溶剂以1ml/分钟施加至sepharose200柱（Pharmacia）。汇集包含CTLA-4-IgG1的级分，然后通过0.2μ.（Millipore）过滤灭菌，将其等分，并冷冻在-80℃下。使用相同的方法表达和纯化CD44-IgG1。从来自瞬时转染的Cos7细胞的条件培养基中纯化出CD28-IgG。
表征CTLA-4-IgG1
在使用胶体考马斯染色（Novex）的SDS-PAGE上，纯化的CTLA-4-IgG1作为单一条带迁移。在非还原性条件下，CTLA-4-IgG1是二聚体（100kDa），当用50mM DTT处理时，该二聚体还原成50kDa的单聚体。溶液中纯化的CTLA-4-IgG1的氨基酸序列测定确认了CTLA-4的N末端（MHVAQPAVVLAS），并证实制瘤素-M信号肽被从成熟的融合蛋白上切割掉。CTLA-4-IgG1以浓度依赖性的方式结合至固定的B7.1-IgG，并且该结合被仓鼠抗人抗CTLA-4抗体（BNI3:PharMingen）阻断。无菌的CTLA-4-IgG不含内毒素，并且可使用1.4作为消光系数通过OD280进行定量。纯化的CTLA-4-IgG的产率在0.5至3mg/升CHO-K1细胞的范围内。
CTLA-4多肽:
如下所述制备下列CTLA-4肽：
NH2:MHVAQPAVVLASSRGIASFVCEYASPGKATEVRVTVLRQADSQVTEVCAATYMMGNELTFLDDSICTGTSSGNQVNLTIQGLRAMDTGLYICKVELMYPPPYYLGIGNGTQIYVIDPEPC-CONH2。
缩写/材料:
NMP，N-甲基吡咯烷酮；TFE，2,2,2-三氟乙醇;DCM，二氯甲烷；FMOC，芴基甲氧羰基。除了下列例外，所有试剂均由Perkin Elmer提供：TFE，Aldrich Chemical，FMOC-PAL-PEG树脂，PerseptiveBiosystems。Fmoc-Arg(PMC)-OH;FMOC-Asn(Trt)-OH、FMOC-Asp(tBu)-OH、FMOC-Cys(Trt)-OH、FMOC-Glu(tBu)-OH、FMOC-Gln(Trt)-OH、FMOC-His(Boc)-OH、FMOC-Lys(BOC)-OH、FMOC-Ser(tBu)-OH、FMOC-Thr(tBu)-OH和FMOC-Tyr(tBu)-OH用于需要侧链保护基团的那些氨基酸。
肽的合成
在Perkin-Elmer431A（其采用通过在301nm处的紫外吸光度进行的反馈监控来进行改进（Perkin-Elmer759A型检测仪））上进行肽合成。使用条件双偶联循环（conditional double coupling cycle）在FMOC-PAL-PEG树脂上装配肽序列。在循环10、11、18、19、20和28至33中进行强制双偶联（Forced double couplings）。在各酰化循环完成时用DCM和TFE的50%混合物洗涤树脂，然后在NMP中使用乙酸酐对未反应的氨基进行加帽。在完成循环49后从反应器中除去树脂，然后继续完成剩余的反应。在415mg树脂上经过6小时，使用试剂K将肽从所述树脂上切割下来（King等人International Journalof Protein and Peptide Research36:255-266(1990)），从而提供186mg粗制CTLA-4肽。
肽的表征
将粗制CTLA-4肽的25mg等分试样溶解在5ml6M盐酸胍/100mMK2PO3（pH6.4）中，然后在Pharmacia Hi Load Superdex75 16/60柱上（16mm×600mm,120ml床体积）用2M盐酸胍/100mM K2PO3（pH6.4）以2ml/分钟的流速洗脱180分钟，收集到5ml级分。级分通过如下方式来进行分析：将1.7μl级分装载至NuPAGE Laemeli凝胶上，使用MES走样缓冲液进行走样，并使用Daichii银染方案进行显现。将展示12KDa分子量（参照分子量标准判断的）的那些级分汇集在一起并在4℃下贮存。通过UV和凝胶电泳来分析合并的级分。通过将100微升样品吸收在ProSorb药筒中（吸收在PVDF膜上）并进行洗涤以除去缓冲剂盐来测定氨基酸序列。在Applied Biosystems420测序仪上进行测序。观察到预期的N-末端序列（MHVAQPAVVLA）。免疫印迹法证实，所述肽被BNI3抗人CTLA-4抗体（PharMingen）所识别。为了脱盐，将包含648μg材料的等分试样置于3500Da MWCO透析袋中，并且在4℃下在搅拌的情况下逆0.1%TFA/H20透析9天。将透析袋中的所有内容物冻干成粉末。
用CTLA-4（Y201V）肽抗原转染的“300.19”细胞:
从人胸腺cDNA文库（Stratagene）中PCR扩增出全长CTLA-4cDNA，并将其亚克隆入pIRESneo（Clontech）中。使用MatchMaker诱变系统（Promega）引入导致组成型细胞表面表达的CTLA-4突变。酪氨酸的突变（Y201变成缬氨酸）抑制了负责CTLA-4的快速内在化的衔接蛋白AP50的结合（Chuang,等人J.Immunol.159:144-151(1997)）。将无支原体的300.19鼠类淋巴瘤细胞培养在包含10%胎牛血清、非必需氨基酸、青霉素/链霉素、2mM谷氨酰胺、12.5mM Hepes pH7.5和25μMβ-巯基乙醇的RPMI-1640中。使用200V/1180uF（GibcoCellPorator），在1ml小室中使用20ug CTLA-4-Y201V/pIRESneo对细胞进行电穿孔（3×106/0.4ml无血清RPMI）。将细胞静置10分钟，然后置于8ml预温热的完全RPMI培养基中。在48小时时，将细胞在包含1mg/ml G418（Gibco）的完全RPMI培养基中稀释至0.5×106/ml。抗性细胞得到扩增，并且通过使用缀合有藻红蛋白（PharMingen）的BNI3抗体显示所述细胞在细胞表面上表达CTLA-4。通过无菌分选来分离高水平表达的细胞。
免疫接种和杂交瘤的产生：
(i)在尾基部用1×107个悬浮在具有完全弗氏佐剂的磷酸缓冲液（PBS）中的如上所述经转染而表达CTLA-4的300.19细胞经皮下途径免疫接种XenoMouseTM小鼠（8至10周龄），或(ii)在尾基部用使用完全弗氏佐剂乳化的(a)10μg CTLA-4融合蛋白或(b)10μg CTLA-4肽经皮下途径免疫接种所述小鼠。在各情况下，在不完全弗氏佐剂中重复所述剂3或4次。在融合前4天，所述小鼠接受所述免疫原或在PBS中的细胞的最后注射。将来自经免疫接种的小鼠的脾和/或淋巴结淋巴细胞与[鼠类非分泌型骨髓瘤P3细胞系]融合并经历HAT选择，如先前所述的（Galfre,G.和Milstein,C.,"Preparation ofmonoclonal antibodies:strategies and procedures."MethodsEnzymol.73:3-46(1981)）。回收全都分泌CTLA-4特异性人IgG2Κ抗体的大批杂交瘤。
如下命名的下列产生抗CTLA-4抗体的杂交瘤于2003年4月29日保藏在美国典型培养物保藏中心，10801University Blvd.Manassas,Va.20110-2209:
Figure BDA0000480925720000861
实施例2
该实施例显示了产生抗CTLA-4抗体的重组哺乳动物细胞系的产生。
从各杂交瘤细胞系11.2.1中克隆编码单克隆抗体11.2.1的重链和轻链的DNA，然后使用本领域技术人员已知的方法确定所述DNA序列。根据抗体11.2.1的核酸序列和预测的氨基酸序列，确定对于各抗体链的基因使用的一致性。
然后将11.2.1DNA序列插入片段亚克隆入表达载体中。随后将所述表达载体转染入小鼠骨髓瘤（NS0）宿主细胞中，从而形成产生抗CTLA抗体的各种初级转染子细胞系。基于生长和生产率分析选择先导细胞系（lead cell line）。然后亚克隆所述先导系以产生克隆细胞系。
通过使用所述细胞系在包含细胞培养基的生物反应器中进行细胞培养来产生抗CTLA4抗体。在生产期间给培养基补充营养物。在达到收获标准后，通过单独的过滤或通过在离心之后进行过滤来收获生物反应器。然后用包括A蛋白亲和柱和两个离子交换柱的三个层析步骤来纯化经澄清的上清液。在该过程中还进行低pH灭活和病毒过滤以清除任何潜在的病毒。浓缩所述产物，然后渗滤至制剂缓冲液中以生产药物物质。
实施例3
进行用于评估4种不同的缓冲剂对抗体聚集和片段化的影响的研究。
具体地，制备包含抗CTLA4抗体11.2.1并用乙酸盐、琥珀酸盐、组氨酸和EDTA缓冲的4种液体制剂。然后将所述制剂在40℃下贮存，并在第0、2、5和7周时进行抗体聚集和片段化的测量。
缓冲溶液的制备:
如表3中所描述制备4种缓冲溶液。通过首先将一定量的缓冲剂种类（列于表3中）溶解在水中来制备每种溶液（大约80%的靶）。然后通过加入足够量的表3中指定的酸或碱溶液将各缓冲溶液的pH调节至5.5。在调节pH后，加入额外量的水以提供20mM的终缓冲剂浓度。选择20mM的缓冲剂浓度以确保在所选择的pH5.5处的适当的pH稳定性。然后将缓冲溶液通过除菌滤器（0.22微米的孔大小）过滤至灭菌的容器中以待以后使用。
表3：缓冲溶液
Figure BDA0000480925720000881
通过用水适当地稀释（1ml至100ml）冰乙酸（99.9%）来制备1%v/v冰醋酸溶液。通过将40g固体氢氧化钠溶解在1L水中来制备1体积摩尔浓度（M）的氢氧化钠溶液。通过用水适当地稀释浓盐酸（37.8%）来制备5体积摩尔浓度（M）的盐酸溶液。
抗体制剂的制备:
被评估的抗体制剂列于下面的表4中。为制备各制剂，首先将一定量的张度剂（在表4中以mg/ml表示）加入至所示的缓冲溶液中，然后搅拌溶液直至张度剂溶解。在20mM乙酸钠缓冲液pH5.5+140mM氯化钠中以13.2mg/mL获得来自实施例2中描述的纯化方法的抗体本体溶液。在以6500RPM于5℃下运行的Beckman Coulter Allegra21R离心机上使用Amicon Ultra15MWCO10K(UFC901024)离心浓缩器将该本体溶液进行缓冲液交换而进入上面鉴定的制剂溶液中。进行大约8倍体积的交换，并将抗体溶液浓缩至27至30mg/ml。制备大约3至4ml的制剂1－18。在280nm处使用1.43(mg/ml)-1cm-1的消光系数通过紫外-可见光谱法（UV-Vis）来确定抗体的浓度。
通过用如上制备的合适的制剂缓冲液稀释和溶解聚山梨酯80来制备20mg/ml聚山梨酯80（PS80）溶液。然后以20mg/ml的浓缩物将聚山梨酯80以及合适量的缓冲剂、抗体、张度剂和水加入抗体和缓剂溶液中，从而获得在相应于下面表4中所示组成的制剂中的20mg/ml的抗CTLA-4单克隆抗体终溶液。
对于表4中的制剂No.2，在该点上作为200mg/ml的浓缩物加入PEG3350。
然后将所述制剂通过0.2μ的除菌级过滤器过滤并过滤至小瓶中。在2ml的1型玻璃小瓶中使用0.5至1ml的填充体积。所述小瓶用经Daikyo777-1
Figure BDA0000480925720000892
包被的塞子密闭，压褶（crimp）密封，并置于稳定性测试箱中，在40℃下直立贮存2、5和7周。洗涤小瓶并进行高压灭菌，对于13mm Daikyo777-1血清塞（serumstopper）也进行洗涤和高压灭菌。立即就聚集和片段化的水平来分析一式两份的小瓶。
表4：受试抗体制剂
Figure BDA0000480925720000891
聚集分析:
将表4的抗体制剂在40℃的温度下贮存。在第0、2、5和7周，使用大小排阻层析（SEC）就聚集来分析每种制剂。使用TSK凝胶G3000SWXL-G2000SWXL柱，流动相0.2M磷酸钠缓冲液（pH7.0），采用1ml/分钟的流速和214nm处的UV检测来进行大小排阻层析。图1显示了对于每种制剂在相关时间测得的洗脱的高分子量种类（即，抗CTLA-4单克隆抗体11.2.1的聚集体）的百分比。如此来计算聚集水平，即将每种制剂的色谱图峰下的面积进行积分，并将高分子量种类的峰下的经积分的面积报告为总峰面积的百分比（参见图1）。如可在图1中看到的，经EDTA缓冲的制剂显示出最低水平的聚集，按该顺序随后为经组氨酸、乙酸盐和琥珀酸盐缓冲的制剂。
片段化分析:
如上面所指出的，在40℃的温度下贮存表4的抗体制剂。在第0、2、5和7周，还使用rSDS-PAGE就片段化来分析每种制剂。使用NuPAGE4-12%bis-Tris凝胶和胶体蓝（考马斯）染料来进行rSDS-PAGE分析。对于还原型凝胶（rSDS-PAGE），通过
Figure BDA0000480925720000902
还原剂获得还原。通过使用Molecular Dynamics Personal Densitometer PDQC-90或Bio-Rad GS800Imaging Densitometer进行扫描来估量总的水解杂质（即，抗CTLA-4单克隆抗体11.2.1的片段）。图2显示了对于每种制剂在相关时间测得的片段化百分比。所述片段化水平计算为总条带体积的百分比（参见图2）。正如可从图2中看到的，经EDTA缓冲的制剂显示最低的片段化水平，按该顺序随后为经组氨酸、乙酸盐和琥珀酸盐缓冲的制剂。
下面的表5(a)（0周）、表5(b)（2周）、表5(c)（5周）和表5(d)（7周）报导了在图1和2中图解说明的聚集和片段化数据。
表5(a)：在0时间点上的聚集和片段化结果
制剂No. 聚集百分比 片段化百分比
1 0.4% 0.62%
2 0.4% 0.66%
3 0.3% 0.53%
4 0.4% 0.49%
5 0.4% 0.67%
6 0.3% 0.56%
7 0.3% 0.46%
8 0.4% 0.62%
9 0.4% 0.49%
10 0.3% 0.51%
11 0.3% 0.64%
12 0.3% 0.62%
13 0.3% 0.47%
14 0.3% 0.37%
15 0.3% 0.42%
16 0.3% 0.50%
17 0.3% 0.49%
18 0.3% 0.47%
表5(b)：在第2周时间点上的聚集和片段化结果
制剂No. 聚集百分比 片段化百分比
1 0.7% 1.52%
2 0.7% 1.35%
3 0.5% 1.16%
4 0.5% 1.13%
5 0.5% 1.10%
6 0.4% 1.34%
7 0.6% 1.34%
8 0.6% 1.44%
9 0.6% 1.22%
10 0.5% 1.16%
11 0.4% 1.29%
12 0.4% 1.19%
13 0.4% 1.00%
14 0.4% 0.99%
15 0.5% 1.24%
16 0.5% 1.00%
17 0.5% 1.07%
18 0.5% 0.96%
表5(c)：在第5周时间点上的聚集和片段化结果
制剂No. 聚集百分比 片段化百分比
1 0.8% 1.40%
2 0.9% 1.59%
3 1.2% 2.61%
4 1.1% 1.49%
5 1.0% 2.12%
6 0.6% 1.56%
7 1.7% 2.50%
8 1.4% 1.86%
9 1.4% 2.03%
10 0.9% 1.46%
11 0.6% 1.42%
12 0.7% 1.36%
13 0.6% 1.03%
14 0.5% 1.05%
15 0.5% 1.21%
16 0.5% 0.78%
17 0.6% 1.27%
18 0.5% 1.25%
表5(d)：在第7周时间点上的聚集和片段化结果
制剂No. 聚集百分比 片段化百分比
1 1.4% 2.39%
2 1.2% 1.90%
3 1.4% 1.89%
4 1.8% 2.96%
5 1.3% 1.92%
6 1.1% 1.77%
7 1.2% 1.97%
8 2.2% 2.91%
9 2.4% 3.25%
10 1.3% 1.82%
11 0.9% 1.34%
12 0.9% 1.33%
13 0.7% 1.12%
14 0.6% 0.92%
15 0.6% 1.04%
16 0.6% 1.18%
17 0.6% 1.01%
18 0.6% 1.18%
实施例4
进行用于评估包含单克隆抗CTLA-4抗体11.2.1的不同液体制剂耐受多个冷冻和解冻循环的能力的研究。
通常评估液体制剂耐受多个冷冻/解冻循环的能力以确定所述制剂是否可冷冻贮存（和，如果想要，进行运输），然后解冻以备后用。
被评估的制剂列于下面的表6中。用于制备制剂的方法与实施例3中描述的方法相同。将2.5mL每种溶液置于5-mL1型玻璃小瓶中，塞上塞子，然后密封。下面鉴定为第1至4、7至8、11至12和15至16号的制剂与实施例3中具有相同数字标记符的制剂相同。
表6：受试抗体制剂
Figure BDA0000480925720000941
将每种制剂经历程6个连续的冷冻/解冻循环。在速度受控的制冷器中进行前3个循环。后3个循环是使用许多置于制冷器或冰箱中的相应于高热负荷（high thermal load）的注水小瓶进行的更慢的循环。对于循环1、2和3，将装有制剂的小瓶置于速度受控的制冷器（PlanerKryo560-16）中并经历程下列循环：以0.2℃/分钟的速率冷却制剂直至达到-70℃的温度，保持在-70℃下1.5至3小时，然后以0.3℃/分钟的速率解冻制剂直至达到5℃的温度。对于循环4、5和6，将小瓶与其他注水小瓶（对于每种制剂一个样品瓶；17个制剂小瓶和总共大约30个注水小瓶）一起置于盒子中。然后首先将该盒子置于保持在-70℃的温度下的制冷器中冷冻大约17小时，然后置于保持在2－8℃的温度下的冰箱中大约50小时。置于盒中的记录式热传感器测得冷冻过程的平均冷却速率为0.09℃/分钟，和解冻过程的平均加热速率为0.03℃/分钟。
在各冷冻/解冻周期后就颗粒形成、颜色变化和浊度变化来目测评估每种制剂。当制剂在每次解冻后仍保持冰冷时，在黑色和白色背景下在透明的盒子中进行每种制剂的该目测观察。表7（下面）报告了结果。
表7：抗CTLA-4抗体11.2.1的冷冻/解冻稳定性的目测评估
Figure BDA0000480925720000951
在冷冻/解冻循环后，只包含氯化钠（即，氯离子）的制剂在可溶性颗粒水平上展示出比包含海藻糖、蔗糖或山梨糖醇的制剂更大的增加。然而，相对于不包含PEG的相应制剂，将PEG加入包含氯化钠的制剂中，看起来减少了在冷冻/解冻循环后测得的可溶性颗粒水平。
聚集分析:
此外，在6个连续冷冻/解冻循环后，对于每种制剂，使用大小排阻层析测量可溶性颗粒的增加百分比。
在第6个冷冻/解冻循环后，使用大小排阻层析就聚集来分析每种制剂。使用TSK凝胶G3000SWXL-G2000SWXL柱，流动相0.2M磷酸钠缓冲液（pH7.0），采用1ml/分钟的流速和214nm处的UV检测来进行大小排阻层析。表7显示了对于每种制剂在相关时间测得的洗脱的高分子量种类（即，抗CTLA-4单克隆抗体11.2.1的聚集体）的百分比。如此来计算聚集水平，即将每种制剂的色谱图峰下的面积进行积分，并将高分子量种类的峰下的经积分的面积报告为总峰面积的百分比（参见表7）。如可在表7中看到的，经EDTA缓冲的制剂显示出最低水平的聚集，按该顺序随后为经组氨酸、乙酸盐和琥珀酸盐缓冲的制剂。
实施例5
进行用于评估EDTA、甲硫氨酸和无氧条件对于在包含单克隆抗CTLA-4抗体11.2.1的液体制剂中的变色和聚集的影响的研究。从审美方面、产品的完整性方面或两个方面来看，这些液体制剂中的变色和聚集通常是不想要的。
下面的表8列出了被评估的制剂处理。用于制备制剂的一般方法与实施例3中描述的方法相同。对于本实施例，制备包含单克隆抗CTLA-4抗体11.2.1（5mg/ml）、乙酸钠缓冲液（20mM）、氯化钠（8.2mg/ml）和聚山梨醇80（0.2mg/ml）并具有pH5.5的起始制剂，并将其加至几个包含密封顶部的10-mL玻璃小瓶中以允许进行无菌取样。
根据下面的表8对起始制剂进行各种处理。如表8中所指出的，将甲硫氨酸加至一些小瓶中。将两种不同浓度的EDTA加入其他小瓶中。将氮气加入经选择的装有EDTA或甲硫氨酸小瓶的顶部空间。此外，在将氮气注射入其顶部空间中之前排除一些剩下的未处理的小瓶中的空气。另外，留下一些剩下的小瓶不接受处理以用作实验对照。
将来自表8中每种处理的两个小瓶在40℃下贮存0、2、4、6、8、10、14、16和18周。在各时间点上将两个贮存的小瓶中的一个用于目视颜色评估，而对另一个小瓶进行无菌取样以测量贮存后11.2.1抗体聚集的水平。表9和10报导了结果。
表8：受试抗体制剂的处理
制剂外观分析:
在0（初始）、2、4、6、8、10、14、16和18周后就颗粒形成、颜色变化和浊度变化目测评估每种制剂。在表9中报告了目测观察结果。
表9：在表8中的制剂处理后的目测评估
Figure BDA0000480925720000972
Figure BDA0000480925720000981
表9中的结果表明，无EDTA和/或甲硫氨酸的制剂在40℃下贮存至少4周后在小瓶中形成粉红色着色。然而不希望束缚于任何特定的理论，据信在本发明的一个实施方案中，该颜色改变可能（至少部分地）是由于氧化过程造成的。然而，在其他实施方案中，所述颜色改变可能是由于许多与氧化无关的其他过程造成的。
将氮气加至小瓶的顶部空间中，与加入甲硫氨酸和/或EDTA相比，看起来在减少变色方面具有较少的影响。
聚集分析：
在40℃的温度下贮存根据表8进行处理的抗体制剂。在第0、2、6、8、10、14、16和18周，使用大小排阻层析就聚集来分析每种制剂。使用TSK凝胶G3000SWXL-G2000SWXL柱，流动相0.2M磷酸钠缓冲液（pH7.0），采用1ml/分钟的流速和214nm处的UV检测来进行大小排阻层析。表10显示了对于每种制剂处理在相关时间测得的洗脱的高分子量种类（即，抗CTLA-4单克隆抗体11.2.1的聚集体）的百分比。如此来计算聚集水平，即将每种制剂的色谱图峰下的面积进行积分，并将高分子量种类的峰下的经积分的面积报告为总峰面积的百分比（参见表10）。
表10：关于表8中的制剂处理的聚集百分比
Figure BDA0000480925720000991
表9中的结果表明，无EDTA和/或甲硫氨酸的制剂在40℃下贮存至少4周后开始在小瓶中形成粉红色着色。如可在表10中看到的，经EDTA和/或甲硫氨酸处理的制剂显示最低的聚集水平，接着是经氮气处理的和未处理的对照制剂。
实施例6
进行研究以评估在作为液体制剂进行贮存后甲硫氨酸和EDTA对于抗CTLA-4抗体11.2.1中的某些甲硫氨酸残基的氧化作用的影响。
甲硫氨酸氧化分析：
在40℃下贮存8周后，通过赖氨酸-C作图法测量抗CTLA-4抗体11.2.1中的氨基酸位点256和432处的甲硫氨酸残基的氧化水平。
在第8周时间点上对装有制剂No.26、29和33的玻璃小瓶（表8）以及按照实施例5的它们的处理所得物进行无菌取样。然后，在标准条件下在tris缓冲液（pH8.0）中用Lyc-C酶消化所述样品，并通过反相高效液相色谱法进行分析。使用Grace Vydac Protein C4分析柱，用在水中的0.1%TFA和在乙腈中的0.085%TFA梯度洗脱液来进行分离。
表11：在表8中的处理后，抗Anti-CTLA-4抗体11.2.1中的甲硫氨酸的氧化百分比
Figure BDA0000480925720001001
表11中的结果表明，向11.2.1抗体制剂中加入甲硫氨酸或EDTA，与无EDTA或甲硫氨酸的制剂相比，减少了在所述两个指定的甲硫氨酸残基处的氧化百分比。
实施例7
进行用于评估在抗CTLA-4抗体11.2.1中的某些色氨酸和酪氨酸残基的氧化的研究。
随时间而发生粉红色变色的抗CTLA-4抗体11.2.1制剂被发现在进行紫外/可见光谱法（UV-Vis）后在500nm处具有特征性的最大吸收。
用于制备制剂的方法与实施例3中描述的方法相同。对于本实施例，将包含5mg/ml的在20mM乙酸钠缓冲液、8.2mg/ml氯化钠和0.2mg/ml聚山梨醇80（pH5.5）中的单克隆抗CTLA-4抗体11.2.1溶液的制剂在两个玻璃小瓶中于40℃下贮存4周，在所述时间，所述制剂已发生粉红色变色。
然后将变色的小瓶制剂之一中的溶液经历分子量（截止）过滤，这允许制剂赋形剂通过过滤装置，但将抗体留下。过滤洗脱液（例如，水和赋形剂）是清澈且无色的，但收集的级分（例如，抗体11.2.1）保持粉红色。因此，过滤实验表明，所述粉红色变色与抗体11.2.1本身相关，而不是从制剂的赋形剂产生。
接下来，在标准条件下用胰蛋白酶消化具有粉红色变色的第二个小瓶，并通过与质谱偶联的反相高效液相色谱（LC-MS）进行分析。使用Grace Vydac Protein C4分析柱，用在水中的0.1%TFA和在乙腈中的0.085%TFA梯度洗脱液来进行分离。在500nm下监测经消化的肽的UV-Vis吸光度，然后基于其分子量鉴定相应的肽。
与500nm吸收峰相关的胰蛋白酶消化肽段具有氨基酸序列：GLEWVAVIWYDGSNK。然后，在标准条件下进一步用Asp-N蛋白酶消化肽序列GLEWVAVIWYDGSNK，500nm吸收（UV-Vis）峰随同Asp-N蛋白酶降消化的肽一起进行迁移，所述消化的肽具有氨基酸序列：GLEWVAVIWY。
因此，不希望被任何特定的理论束缚，据信在所述经蛋白酶消化的肽（GLEWVAVIWY）中的两个色氨酸残基（W）之中的任一个或两个或酪氨酸残基（Y）是可能的氧化位点，所述氧化可造成本实施例中的抗体11.2.1制剂的粉红色变色。在特定的实施方案中，据信所述经蛋白酶消化的肽（GLEWVAVIWY）中的两个色氨酸残基（W）之中的任一个或两个是可能的氧化位点，所述氧化可造成粉红色变色。
尽管如此，也可能的是，除了氧化以外的其他机制可造成在此处评估的各种制剂中所看到的特定变色（例如粉红色和黄色）中的任一种或多种。
实施例8
进行用于评估EDTA和DTPA对于抗CTLA-4抗体11.2.1变色、聚集和片段化的影响的研究。
具体地，制备三种具有和不具有EDTA和DTPA的包含抗体11.2.1的液体制剂。将所述制剂在40℃下贮存，在第0、2、4、6、8和10周进行抗体的变色、聚集和片段化评估。
对于本实施例，如实施例3中所述，制备在具有8.2mg/ml氯化钠和0.2mg/ml聚山梨酯80的20mM乙酸钠缓冲液（pH5.5）中的20mg/ml抗CTLA-4抗体溶液并将其分装入几个玻璃小瓶中，然后通过加入EDTA或DTPA进行处理。以固体形式向制剂小瓶中加入EDTA和DTPA。立即就变色、聚集和片段化的水平对几个小瓶进行分析，还将几个其他一式两份的小瓶在40℃下直立贮存2、4、6、8和10周。
然后对经处理的和未处理的小瓶进行无菌取样以在第2、4、6、8和10周时间点上测量制剂中的抗体11.2.1聚集和片段化的水平，并观察变色。表12和13报告了结果。
制剂外观分析:
在0（初始）、2、4、6、8和10周后就颗粒形成、颜色变化和浊度变化目测评估每种制剂。在表12中报告了目视观察结果。
表12：EDTA和DTPA制剂处理的目测评估
Figure BDA0000480925720001021
表12中的结果表明,在40℃下贮存至少6周后，无EDTA或DTPA的制剂在小瓶中发生粉红色变色。
聚集分析：
在40℃的温度下贮存根据表12处理的抗体制剂。在第0、2、6、8和10周，使用大小排阻层析就聚集来分析每种制剂。使用TSK凝胶G3000SWXL-G2000SWXL柱，流动相0.2M磷酸钠缓冲液（pH7.0），采用1ml/分钟的流速和214nm处的UV检测来进行大小排阻层析。表13显示了对于每种制剂处理在相关时间测得的洗脱的高分子量种类（即，抗CTLA-4单克隆抗体11.2.1的聚集体）的百分比。如此来计算聚集水平，即将每种制剂的色谱图峰下的面积进行积分，并将高分子量种类的峰下的经积分的面积报告为总峰面积的百分比（参见表13）。
表13：关于EDTA和DTPA制剂处理的聚集百分比
Figure BDA0000480925720001031
如可在表7中看到的，包含EDTA和DTPA的制剂都显示出比无EDTA或DTPA的制剂更低的聚集水平。
实施例9
进行用于评估EDTA和氮气对于抗CTLA-4抗体11.2.1稳定性的影响的研究。
具体地，在经组氨酸缓冲的制剂（其包含海藻糖和聚山梨酯80）中在变色、聚集、氧化、片段化和带电荷种类的形成方面分析EDTA和氮气对于抗体11.2.1稳定性的影响。
被评估的制剂列于下面的表13中。用于制备制剂的方法与后面实施例10中描述的方法相同。在40℃下贮存所述制剂，并在第0、4、8、12和24周进行稳定性评估。
对于本实施例，如实施例10中一样制备在具有84mg/ml海藻糖和0.2mg/ml聚山梨醇80的20mM组氨酸缓冲液（pH5.5）中的20mg/ml抗CTLA-4抗体溶液。通过用海藻糖和聚山梨酯80的储液将抗体的浓缩储液稀释成含20mg/mL抗CTLA-4抗体的最终组合物来制备制剂的一部分。除了加入10mg/mL Na2EDTA.2H2O浓缩物以获得0.1mg/mL的终浓度的额外步骤外，类似地制备制剂的第二部分。然后以每2ml玻璃小瓶1ml的量分配制剂。然后将半瓶每种制剂置于冷冻干燥器内，在抽真空后将顶部空间改变为氮气。在用氮气充注小瓶后，其氧气水平的测量值报告为大约1.5%至1.6%的氧气，而顶部空间具有空气的小瓶报告为大约19.7%至20%的氧气。
立即就变色、聚集、片段化、氧化和带电荷种类的形成的水平来分析几个小瓶，还将几个其他一式两份的小瓶在40℃下直立贮存2、4、8、12和24周。在各时间点上，对于每种条件，每种处理取出两个贮存小瓶以测量制剂中抗体11.2.1聚集、片段化、氧化和带电荷种类的形成的水平，并观察变色。表14至18报告了结果。
表13：受试抗体制剂
Figure BDA0000480925720001041
制剂外观分析：
在0（初始）、4、8、12和24周后就颗粒形成、颜色变化和浊度变化目测评估每种制剂。在表14中报告了目测观察结果。
表14：在表13中的制剂处理后的目测评估
Figure BDA0000480925720001042
Figure BDA0000480925720001051
表14中的结果表明，无EDTA或氮气的制剂在40℃下贮存4周后发生粉红色变色。表14还表明，用氮气替代小瓶顶部空间中的空气的制剂使粉红色变色延迟至第12周发生。包含EDTA的两种制剂在至少24周内不具有可见的变色。
聚集分析：
在40℃的温度下贮存根据表13处理的抗体制剂。在第0、4、8、12和24周，使用大小排阻层析就聚集来分析每种制剂。在各时间点对制剂小瓶进行无菌取样。使用TSK凝胶G3000SWXL-G2000SWXL柱，流动相0.2M磷酸钠缓冲液（pH7.0），采用1ml/分钟的流速和214nm处的UV检测来对所述样品进行大小排阻层析。表15显示了对于每种制剂处理在相关时间测得的洗脱的高分子量种类（即，抗CTLA-4单克隆抗体11.2.1的聚集体）的百分比。如此来计算聚集水平，即将每种制剂的色谱图峰下的面积进行积分，并将高分子量种类的峰下的经积分的面积报告为总峰面积的百分比（参见表15）。
表15：表13中的制剂的聚集百分比
如在表15中看到的，与无EDTA和在顶部空间中具有空气的制剂相比，包含EDTA的制剂、氮气制剂和EDTA+氮气提剂显示出更低的随时间的聚集水平。
片段化分析：
在40℃的温度下贮存根据表13制备的抗体制剂。在第0、4、8、12和24周，使用还原型SDS-PAGE（rSDS-PAGE）就总水解杂质（即，片段化）来分析每种制剂。在各时间点对制剂小瓶进行无菌取样，然后装载至NuPAGE4-12%bis-Tris凝胶上，使用胶体蓝（考马斯）染料。通过使用
Figure BDA0000480925720001062
还原剂获得凝胶的还原。通过在MolecularDynamics Personal Densitometer PDQC-90或Bio-Rad GS800ImagingDensitometer上进行扫描来估量还原型凝胶中每个样品条带的杂质（即，片段化）百分比。片段化水平计算为总条带体积的百分比（参见图16）。
表16：表13中的制剂的总（杂质）片段化百分比
Figure BDA0000480925720001063
如在表16中看到的，与无EDTA和在顶部空间中具有空气的制剂相比，包含EDTA的制剂、氮气制剂和EDTA+氮气提剂显示出更低的随时间的片段化水平。
酸和碱种类的配制：
在40℃的温度下贮存根据表13制备的抗体制剂。在第0、4、12和24周，使用成像毛细管电泳（Imaging Capillary Electrophoresis，iCE）就酸和碱种类的形成来分析每种制剂。使用ConvergentBiosciences iCE280分析仪来进行成像毛细管电泳以评估电荷不均一性。所述Convergent iCE280是允许用户对在毛细管内包含的分开的样品进行图像拍摄的成像毛细管等电聚焦（IEF）装置。
在各时间点上对制剂小瓶进行无菌取样。然后在电泳两性电解质、甲基纤维素、校准标记物（calibration marker）和水的混合物中制备样品。将样品导入iCE280中，并施加高电位/电压。使用手工制备的pH3－10.5聚丙烯酰胺凝胶并使用考马斯蓝染料进行IEF测定。基于它们的相对等电点（pI）和它们的位置来分开样品蛋白质组分。通过成像CCD照相机来观察每种分开的组分的相对量。然后使用常规色谱图积分软件来加工数据，并将所述数据表示为主峰的损失（即，酸和碱种类的形成）（参见表17）。
表17：表13中的制剂的主峰损失
Figure BDA0000480925720001071
Figure BDA0000480925720001081
如可在表17中看到的，与无EDTA和在顶部空间中具有空气的制剂相比，包含EDTA的制剂、氮气制剂和EDTA+氮气提剂显示出更高的随时间的完整主峰水平。因此，在不含EDTA和/或于顶部空间中不具有氮气的制剂中，随着时间过去酸和碱种类形成的量更大。
氨基酸氧化分析：
在40℃下贮存12周后，通过赖氨酸-C作图法测量抗CTLA-4抗体11.2.1中的氨基酸位点256和432处的甲硫氨酸残基的氧化水平。
在第12周时间点上对装有表13的制剂的小瓶进行无菌取样。然后，在标准条件下在tris缓冲液（pH 8.0）中用赖氨酰内肽酶（Lys-C）消化所述样品，并通过反相高效液相色谱法进行分析。使用GraceVydac Protein C4分析柱，用在水中的0.1%TFA和在乙腈中的0.085%TFA梯度洗脱液来进行分离。
表18：表13的制剂中的抗CTLA-4抗体中的甲硫氨酸的百分比氧化
Figure BDA0000480925720001082
表18中的结果表明，向11.2.1抗体制剂加入EDTA和/或向小瓶的顶部空间加入氮气，与无EDTA和在顶部空间中具有空气的制剂相比，减少了在两个指定的甲硫氨酸残基处的氧化百分比。
实施例10
进行研究以比较对于下列制剂的稳定性的影响：包含乙酸钠缓冲剂和氯化钠（即，氯离子）的抗CTLA-4抗体11.2.1制剂对包含组氨酸缓冲剂和海藻糖的制剂。
具体地，在变色、聚集和片段化方面分析对于抗体11.2.1稳定性的影响。
被评估的制剂列于下面的表19中。用于制备所述制剂的方法与实施例3中描述的方法相同。
通过下列方式来制备表19中的制剂：取在20mM乙酸钠缓冲液（pH5.5）、140mM氯化钠中的11.9mg/ml的抗体11.2.1储液，然后将其在具有Pellicon XL PBTK30K50cm2膜的Millipore Lab Scale TFF系统中经历超滤/渗滤（UF/DF）步骤。接下来，在35至40mg/ml的范围内在20mM乙酸钠或20mM组氨酸缓冲液中制备抗体11.2.1的浓缩液。
以3倍靶终浓度在乙酸钠或组氨酸缓冲液中制备张度剂的浓缩物。在每种缓冲液中以20mg/ml制备聚山梨酯80的浓缩液，和以10mg/ml制备Na2EDTA.2H2O的浓缩液。通过适当地稀释浓缩液来制备单个制剂。然后将制剂通过0.2μ除菌级过滤器过滤，并注入几个一式两份的小瓶中。在2-ml1型玻璃小瓶中使用1ml的填充体积。所述小瓶用经Daikyo777-1
Figure BDA0000480925720001091
包被的塞子密闭，压褶（crimp）密封，并将其在25℃和40℃下在稳定性测试箱中直立贮存。还将另一组小瓶在-20℃下放置4周，和将另一组如实施例4中所描述的经历4x冷冻/解冻循环（注水小瓶盒）。所有制剂具有5.5的pH和20mg/ml的抗CTLA-4抗体11.2.1浓度。
立即就变色、聚集和片段化的水平来分析几个小瓶，还将几个其他一式两份的小瓶在25℃和40℃下直立贮存4、8、12、18、24和36周。在各时间点上，对于每种条件，每种制剂取出两个贮存小瓶以测量抗体11.2.1聚集、片段化的水平，以及观察变色。表20至24以及图3和4报告了结果。
表19：受试抗体制剂
Figure BDA0000480925720001101
制剂外观分析：
1)在初始混合制剂后，2)在-20℃下冷冻制剂4周后，和在3)4个冷冻/解冻循环（如实施例4中描述的，在盒中与注水小瓶一起，于-70℃至5℃）后目测评估每种制剂。在第0（初始）、8、12和24周后就颗粒形成、颜色变化和浊度变化目测评估每种制剂。就颗粒形成、颜色变化和浊度变化对制剂进行评估，并报告于表20（冷冻/解冻）、表21（在25℃下贮存）和表22（在40℃下贮存）中。
表20：在冷冻/解冻后对表19中的制剂的目测评估
Figure BDA0000480925720001102
Figure BDA0000480925720001111
表21：在25℃下贮存后对表19中的制剂的目测评估
Figure BDA0000480925720001112
表22：在40℃下贮存后对表19的制剂的目测评估
Figure BDA0000480925720001113
Figure BDA0000480925720001121
表20至表22中的结果表明，包含EDTA的抗体11.2.1制剂具有相比无EDTA的那些制剂而言减少的变色、减少的浊度和减少的颗粒形成。总体上，包含氯化钠的制剂具有相比含有EDTA但不含有氯化钠的制剂而言增加的变色、浊度和颗粒形成。
聚集分析：
在25℃和40℃的温度下贮存根据表19制备的抗体制剂。在第0（初始）、4、8、12、24和36周，使用大小排阻层析就聚集来分析25℃制剂。在第4、8、12和24周，使用大小排阻层析就聚集来分析40℃制剂。在各时间点对制剂小瓶进行无菌取样。使用大小排阻层析就聚集来分析每种制剂。使用TSK凝胶G3000SWXL-G2000SWXL柱，流动相0.2M磷酸钠缓冲液（pH7.0），采用1ml/分钟的流速和214nm处的UV检测来对所述样品进行大小排阻层析。表23(a)和23(b)显示了对于每种制剂处理在相关时间测得的抗体11.2.1聚集百分比。如此来计算聚集水平，即将每种制剂的色谱图峰下的面积进行积分，并将高分子量种类的峰下的经积分的面积报告为总峰面积的百分比（参见表23(a)和23(b)）。
表23(a)：在25℃下贮存后表19中的的剂的百分比聚集
下面的表23(b)报告了聚集数据，其在图3中进行图解说明。
表23(b)：在40℃下贮存后表19中的制剂的聚集百分比
Figure BDA0000480925720001132
如可在表23(a)、23(b)和图3中看到的，在25℃和40℃下贮存后，与缺少EDTA但具有乙酸盐缓冲剂和氯化钠的制剂相比，包含EDTA的制剂显示出减少的聚集水平。此外，与缺少EDTA但包含乙酸盐缓冲剂和氯化钠的制剂相比，包含组氨酸缓冲剂（无EDTA）的制剂具有减少的聚集量。
片段化分析：
在25℃和40℃的温度下贮存根据表19制备的抗体制剂。在第0（初始）、4、8、12、18和36周，使用还原型SDS-PAGE（rSDS-PAGE）就总水解杂质（即，片段化）来分析每种制剂。在各时间点对制剂小瓶进行无菌取样，然后装载至NuPAGE4-12%bis-Tris凝胶上，使用胶体蓝（考马斯）染料。通过使用
Figure BDA0000480925720001143
还原剂获得凝胶的还原。通过在Molecular Dynamics Personal Densitometer PDQC-90或Bio-Rad GS800Imaging Densitometer上进行扫描来估量还原型凝胶中每个样品条带的杂质（即，片段化）百分比。片段化水平计算为总条带体积的百分比（参见表24(a)和24(b)）。
表24(a)：在25℃下贮存后表19中的制剂的片段化百分比
Figure BDA0000480925720001141
下面的表24(b)报告了片段化数据，其在图4中进行图解说明。
表24(b)：在40℃下贮存后表19中的制剂的百分比片段化
Figure BDA0000480925720001142
如可在表24(a)、24(b)和图4中看到的，在25℃和40℃下贮存后，与缺少EDTA但具有乙酸盐缓冲剂和氯化钠的制剂相比，包含EDTA的制剂显示出减少的片段化水平。
实施例11
进行用于比较不同浓度的EDTA对于抗CTLA-4抗体11.2.1制剂稳定性的影响的研究。通过用甘露醇代替部分海藻糖，还测试了对组氨酸缓冲剂-海藻糖制剂的另一选择。
具体地，在变色、聚集、片段化和氧化方面分析对于抗体11.2.1稳定性的影响。
被评估的制剂列于下面的表25中。用于制备所述制剂的方法与实施例10中描述的方法相同。
通过下列方式来制备表25中的制剂：取在20mM乙酸钠缓冲液（pH5.5）、140mM氯化钠中的11.9mg/ml的抗体11.2.1储液，然后将其在具有Pellicon XL PBTK30K50cm2膜的Millipore Lab Scale TFF系统中经历超滤/渗滤（UF/DF）步骤。接下来，在35至40mg/ml的范围内在20mM乙酸钠或20mM组氨酸缓冲液中制备抗体11.2.1的浓缩液。
以3倍靶终浓度在乙酸钠或组氨酸缓冲液中制备张度剂的浓缩物。在每种缓冲液中以20mg/ml制备聚山梨酯80的浓缩液，和以10mg/ml制备Na2EDTA.2H2O的浓缩液。通过适当地稀释浓缩液来制备单个制剂。经检查，EDTA的浓度（作为Na2EDTA.2H2O）在0－0.1mg/ml的范围内。然后将制剂通过0.2μ除菌级过滤器过滤，并注入几个一式两份的小瓶中。在2-ml1型玻璃小瓶中使用1ml的填充体积。
所述小瓶用经Daikyo777-1
Figure BDA0000480925720001151
包被的塞子密闭，压褶（crimp）密封，并将其在25℃和40℃下在稳定性测试箱中直立贮存。将另一组小瓶如实施例10中所描述的经历4x冷冻/解冻循环。所有制剂具有5.5的pH和20mg/ml的抗CTLA-4抗体11.2.1浓度。
立即就变色、聚集、片段化和氧化的水平来分析几个小瓶，还将几个其他一式两份的小瓶在25℃和40℃下直立贮存4、8、13、18和24周。在各时间点上，对于每种条件，每种制剂取出两个贮存小瓶以测量抗体11.2.1聚集、片段化的水平，以及观察变色。表26至31以及图5和10报告了结果。
表25：受试抗体制剂
Figure BDA0000480925720001161
制剂外观分析：
1)在初始混合制剂后，2)在4个冷冻/解冻循环后，和3）在25℃和40℃下贮存4、8、13、18和24周后目测评估每种制剂。就颗粒形成、颜色变化和浊度变化评估所述制剂，并报告于表26至28中。
表26：在冷冻/解冻后表25的制剂的目测评估
Figure BDA0000480925720001171
表27：在25℃下贮存后表25的制剂的目测评估
Figure BDA0000480925720001172
*Y6和Y4是EP黄色标度上的色标符号。Y6比Y4的黄色浅。（参考：PhEur5.0,2005Monograph2.2.2）。
表28：在40℃下贮存后表25的制剂的目测评估
Figure BDA0000480925720001182
*Y6和Y4是EP黄色标度上的色标符号。Y6比Y4的黄色浅。（参考：PhEur5.0,2005Monograph2.2.2）。
表26至28中的结果表明，包含所有受试EDTA浓度的抗体11.2.1制剂相比无EDTA的那些制剂而言具有减少的变色、减少的浊度和减少的颗粒形成。
总之，与具有EDTA但不具有氯化钠的制剂相比，包含氯化钠的制剂具有由增加的变色、浊度和颗粒形成所证明的减少的冷冻/解冻保护作用。
聚集分析：
在25℃和40℃的温度下贮存根据表25制备的抗体制剂。在第0（初始）、4、8、13、18和24周，使用大小排阻层析就聚集来分析25℃和40℃制剂。在各时间点对制剂小瓶进行无菌取样。使用TSK凝胶G3000SWXL-G2000SWXL柱，流动相0.2M磷酸钠缓冲液（pH7.0），采用1ml/分钟的流速和214nm处的UV检测来对所述样品进行大小排阻层析。表29(a)显示了在25℃下贮存后对于每种制剂在相关时间测得的抗体11.2.1聚集百分比。表29(b)显示了在40℃下贮存后测得的抗体11.2.1聚集百分比。如此来计算聚集水平，即将每种制剂的色谱图峰下的面积进行积分，并将高分子量种类的峰下的经积分的面积报告为总峰面积的百分比（参见表29(a)和29(b)）。
表29(a)：在25℃下贮存后表25中的制剂的聚集百分比
Figure BDA0000480925720001191
Figure BDA0000480925720001201
下面的表29(b)报告了聚集数据，其在图5中图解说明。
表29(b)：在40℃下贮存后表25中的制剂的聚集百分比
Figure BDA0000480925720001202
如可在表29(a)、29(b)和图5中看到的，在25℃和40℃下贮存后，与缺少EDTA但具有乙酸盐缓冲剂和氯化钠的制剂相比，包含EDTA的制剂在所有受试EDTA浓度上显示出减少的聚集水平。图7图解概括作为EDTA浓度的函数的表25中的制剂的聚集百分比的减少。
片段化分析：
在25℃和40℃的温度下贮存根据表25制备的抗体制剂。在第0（初始）、4、8、13、18和24周，使用还原型SDS-PAGE（rSDS-PAGE）就总水解杂质（即，片段化）来分析25℃和40℃制剂。在各时间点对制剂小瓶进行无菌取样，然后装载至NuPAGE4-12%bis-Tris凝胶上，使用胶体蓝（考马斯）染料。通过使用
Figure BDA0000480925720001213
还原剂获得凝胶的还原。通过在Molecular Dynamics Personal Densitometer PDQC-90或Bio-Rad GS800Imaging Densitometer上进行扫描来估量还原型凝胶中每个样品条带的杂质（即，片段化）百分比。片段化水平计算为总条带体积的百分比（参见图30(a)和30(b)）。
表30(a)：在25℃下贮存后表25中的制剂的片段化百分比
Figure BDA0000480925720001211
下面的表30(b)报告了片段化数据，其在图6中图解说明。
表30(b)：在40℃下贮存后表25中的制剂的片段化百分比
Figure BDA0000480925720001212
Figure BDA0000480925720001221
如可在表30(a)、30(b)和图6中看到的，在25℃和40℃下贮存后，与缺少EDTA但具有乙酸盐缓冲剂和氯化钠的制剂相比，包含EDTA的制剂显示出减少的片段化水平。此外，包含组氨酸和海藻糖但无EDTA的制剂显示出相比包含氯化钠但无EDTA的制剂而言减少的片段化。
图8图解概括了作为EDTA浓度的函数的表25中的制剂的片段化百分比的减少。
氨基酸氧化分析：
通过赖氨酸-C作图法测量抗CTLA-4抗体中的氨基酸位点256和432处的某些甲硫氨酸残基的氧化水平。在40℃下贮存后，在第12周和第24周时间点上对装有表25的制剂的小瓶进行无菌取样。然后，在标准条件下在tris缓冲液（pH8.0）中用赖氨酰内肽酶（Lys-C）消化所述样品，并通过反相高效液相色谱法进行分析。使用GraceVydac Protein C4分析柱，用在水中的0.1%TFA和在乙腈中的0.085%TFA梯度洗脱液来进行分离。表31报告了结果。
表31：在表25的制剂中抗CTLA-4抗体11.2.1的甲硫氨酸的氧化百分比
No. 氨基酸残基 初始 18周 24周
26 Met432 1.6% 5.5% 6.9%
Met256 5% 12.8% 13.6%
40 Met432 1.6% 5.6% 8.8%
Met256 5% 14.0% 16.1%
45 Met432 1.6% 4.8% 6.2%
Met256 5% 11.6% 12.8%
46 Met432 1.6% 3.5% 6.1%
Met256 5% 8.8% 12.5%
47 Met432 1.6% 3.4% 4.2%
Met256 5% 8.4% 8.3%
48 Met432 1.6% 2.8% 5.7%
Met256 5% 7.6% 12.6%
37 Met432 1.6% 4.5% 4.7%
Met256 5% 11.0% 9.4%
如可在表31中看到的，抗体11.2.1制剂中的EDTA百分比减少了随时间而发生的甲硫氨酸氧化的水平。
实施例12
进行用于比较甘露醇和山梨糖醇对于抗CTLA-4抗体11.2.1制剂稳定性的影响的研究。在本实施例中，通过用不同浓度的甘露醇和/或山梨糖醇代替部分海藻糖（表32），检测了对组氨酸-海藻糖制剂的另一选择。经检查，EDTA的浓度（作为Na2EDTA.2H2O）在0－0.1mg/ml的范围内。
具体地，在变色、聚集、片段化和氧化方面分析对抗体11.2.1稳定性的影响。
被评估的制剂列于下面的表32中。用于制备所述制剂的方法与实施例10中描述的方法相同。
通过下列方式来制备表32中的制剂：取在20mM乙酸钠缓冲液（pH5.5）、140mM氯化钠中的11.9mg/ml的抗体11.2.1储液，然后将其在具有Pellicon XL PBTK30K50cm2膜的Millipore Lab Scale TFF系统中经历超滤/渗滤（UF/DF）步骤。接下来，在35至40mg/ml的范围内在20mM乙酸钠或20mM组氨酸缓冲液中制备抗体11.2.1的浓缩液。
以3倍靶终浓度在乙酸钠或组氨酸缓冲液中制备张度剂的浓缩物。在每种缓冲液中以20mg/ml制备聚山梨酯80的浓缩液，和以10mg/ml制备Na2EDTA.2H2O的浓缩液。通过适当地稀释浓缩液来制备单个制剂。然后将制剂通过0.2μ除菌级过滤器过滤，并注入几个一式两份的小瓶中。在2-ml1型玻璃小瓶中使用1ml的填充体积。
所述小瓶用经Daikyo777-1
Figure BDA0000480925720001242
包被的塞子密闭，压褶（crimp）密封，并将其在25℃和40℃下在稳定性测试箱中直立贮存。将另一组小瓶如实施例10中所描述的经历4x冷冻/解冻循环。所有制剂具有5.5的pH和20mg/ml的抗CTLA-4抗体11.2.1浓度。
立即就变色、聚集、片段化和氧化的水平来分析几个小瓶，还将几个其他一式两份的小瓶在25℃和40℃下直立贮存4、8、13、18和24周。在各时间点上，对于每种条件，每种制剂取出两个贮存小瓶以测量抗体11.2.1聚集、片段化的水平，以及观察变色。表33至37以及图10和11报告了结果。
表32：受试抗体制剂
制剂外观分析：
1)在初始混合制剂后，2)在4个冷冻/解冻循环（按照实施例4，在盒中与注水小瓶一起，于-70℃至5℃）后，和3）在25℃和40℃下贮存8、13和24周后目测评估每种制剂。就颗粒形成、颜色变化和浊度变化评估所述制剂，并报告于表33至35中。
表33：在冷冻/解冻后表32的制剂的目测评估
Figure BDA0000480925720001251
表34：在25℃下贮存后表32的制剂的目测评估
Figure BDA0000480925720001252
Figure BDA0000480925720001261
表35：在40℃下贮存后表25的制剂的目测评估
Figure BDA0000480925720001262
表33至35中的结果表明，与具有EDTA但无氯化钠的制剂相比，包含氯化钠但无EDTA的抗体11.2.1制剂具有由增加的变色、浊度和颗粒形成所证明的减少的冷冻/解冻保护作用。所述结果还表明，与无EDTA的制剂相比，包含所有受试EDTA浓度的抗体11.2.1制剂具有减少的变色、减少的浊度和减少的颗粒形成。
聚集分析：
在25℃和40℃的温度下贮存根据表32制备的抗体制剂。在第0（初始）、4、8、13、18和24周，使用大小排阻层析就聚集来分析25℃和40℃制剂。在各时间点对制剂小瓶进行无菌取样。使用TSK凝胶G3000SWXL-G2000SWXL柱，流动相0.2M磷酸钠缓冲液（pH7.0），采用1ml/分钟的流速和214nm处的UV检测来对所述样品进行大小排阻层析。表36(a)显示了在25℃下贮存后对于每种制剂在相关时间测得的抗体11.2.1聚集百分比。表36(b)显示了在40℃下贮存后测得的抗体11.2.1聚集百分比。如此来计算聚集水平，即将每种制剂的色谱图峰下的面积进行积分，并将高分子量种类的峰下的经积分的面积报告为总峰面积的百分比（参见表36(a)和36(b)）。
表36(a)：在25℃下贮存后表32中的制剂的聚集百分比
Figure BDA0000480925720001271
下面的表36(b)报告了聚集数据，其在图9图解说明。
表36(b)：在40℃下贮存后表32中的制剂的聚集百分比
Figure BDA0000480925720001281
如可在表36(a)、36(b)和图9中看到的，在25℃和40℃下贮存后，与缺少EDTA但具有乙酸盐缓冲剂和氯化钠（即氯离子）的制剂相比，包含EDTA的制剂在所有受试EDTA浓度上显示出减少的聚集水平。图9图解概括表32中制剂的聚集百分比的减少。
片段化分析：
在25℃和40℃的温度下贮存根据表32制备的抗体制剂。在第0（初始）、4、8、13、18和24周，使用还原型SDS-PAGE（rSDS-PAGE）就总水解杂质（即，片段化）来分析25℃和40℃制剂。在各时间点对制剂小瓶进行无菌取样，然后装载至NuPAGE4-12%bis-Tris凝胶上，使用胶体蓝（考马斯）染料。通过使用
Figure BDA0000480925720001282
还原剂获得凝胶的还原。通过在Molecular Dynamics Personal Densitometer PDQC-90或Bio-Rad GS800Imaging Densitometer上进行扫描来估量还原型凝胶中每个样品条带的杂质（即，片段化）百分比。片段化水平计算为总条带体积的百分比（参见表37(a)和37(b)）。
表37(a)：在25℃下贮存后表32中的制剂的片段化百分比
Figure BDA0000480925720001291
下面的表37(b)报告了片段化数据，其在图10中图解说明。
表37(b)：在40℃下贮存后表32中的制剂的片段化百分比
Figure BDA0000480925720001292
如可在表37(a)、37(b)和图10中看到的，在25℃和40℃下贮存后，与缺少EDTA但具有乙酸盐缓冲剂和氯化钠（即，氯离子）的制剂相比，包含EDTA的制剂显示出减少的片段化水平。
实施例13
本实施例举例说明包含抗CTLA-4抗体ticilimumab、L-组氨酸单盐酸盐一水合物、乙二胺四乙酸二钠二水合物、αα-海藻糖二水合物和聚山梨酯80的液体药物组合物的生产。
通过获得下列组分来形成本发明的液体药物组合物：抗CTLA-4抗体ticilimumab（可根据实施例1从在ATCC登录号PTA-5169下保藏的杂交瘤细胞系11.2.1.4获得，或根据实施例2从哺乳动物细胞系重组制备）、L-组氨酸单盐酸盐一水合物（可从Ajinomoto,Raleigh,NC获得）、L-组氨酸（可从Ajinomoto,Raleigh,NC获得）、乙二胺四乙酸二钠二水合物（可从Merck KgaA,Darmstadt,Germany作为Titriplex III获得）、αα-海藻糖二水合物（可从FerroPfanstiehl,Waukegan IL以产品号T-104-1-MC获得）和聚山梨酯80（可从Croda Inc.,Mill Hall PA作为Crillet4HP获得）。
通过首先制备抗CTLA-4抗体ticilimumab、L-组氨酸单盐酸盐一水合物、乙二胺四乙酸二钠二水合物、αα-海藻糖二水合物和聚山梨酯80的几种储液来制备所述液体药物组合物。通过将3.27mg/mL（15.6mM）L-组氨酸HCl一水合物和0.68mg/mL（4.4mM）L-组氨酸溶解在水中来制备20mM的组氨酸缓冲液pH5.5。通过将3.27mg/mL（15.6mM）L-组氨酸HCl一水合物和0.68mg/mL（4.4mM）L-组氨酸、84mg/mL（222mM）αα-海藻糖二水合物、0.2mg/mL聚山梨酯80和0.1mg/mL（0.268mM）乙二胺四乙酸二钠二水合物溶解在水中来制备1×制剂缓冲液。通过将3.27mg/mL（15.6mM）L-组氨酸HCl一水合物和0.68mg/mL（4.4mM）L-组氨酸、168mg/mL（444mM）αα-海藻糖二水合物、0.4mg/mL聚山梨酯80和0.2mg/mL（0.536mM）乙二胺四乙酸二钠二水合物溶解在水中来制备2×制剂缓冲液。根据实施例2来制备抗CTLA-4抗体ticilimumab的储液，然后采用使用50kD型膜（Biomax PES）的超滤过程将其在组氨酸缓冲液中浓缩至42至55mg/ml（靶45mg/mL）。
为制备药物组合物，向适合用于充分混合液体组合物的容器中加入等体积的抗CTLA-4抗体ticilimumab的浓缩储液和2×制剂缓冲液。在混合后，取出少量体积的溶液，并使用1.43(mg/mL)-1cm-1的消光系统通过紫外-可见光谱法（UV-Vis）来确定抗体的浓度（预期在21至27.5mg/mL的范围内，靶22.5mg/mL）。最后，加入经合适计算的体积的1×制剂缓冲液，并进行混合以使抗体达到20mg/mL（范围在18－22mg/mL之间）的靶浓度。
然后将所述药物组合物通过0.2μ除菌级过滤器过滤并注入小瓶中。在20毫升1型玻璃小瓶中使用20毫升的标称填充体积。所述小瓶用经Daikyo777-1
Figure BDA0000480925720001311
包被的塞子密闭，并压褶密封。将玻璃小瓶灭菌，对于20mm Daikyo777-1血清塞也进行灭菌。
每个单个小瓶单位包含大约400mg抗CTLA-4抗体ticilimumab、65.4mg L-组氨酸单盐酸盐一水合物、13.6mg L-组氨酸、2mg乙二胺四乙酸二钠二水合物、1680mgαα-海藻糖二水合物和4mg聚山梨糖醇80。
实施例14
本实施例举例说明了包含抗CTLA-4抗体ticilimumab、L-组氨酸单盐酸盐一水合物、乙二胺四乙酸二钠钙、αα-海藻糖二水合物和聚山梨酯80的液体药物组合物的有前景的生产。
可通过获得下列组分来形成本发明的液体药物组合物：抗CTLA-4抗体ticilimumab（可根据实施例1从在ATCC登录号PTA-5169下保藏的杂交瘤细胞系11.2.1.4获得，或根据实施例2从哺乳动物细胞系重组制备）、L-组氨酸单盐酸盐一水合物（可从Ajinomoto,Raleigh,NC获得）、L-组氨酸（可从Ajinomoto,Raleigh,NC获得）、乙二胺四乙酸二钠钙（可从Sigma-Aldrich,St.Louis,MO获得）、αα-海藻糖二水合物（可从Ferro Pfanstiehl,Waukegan IL以产品号T-104-1-MC获得）和聚山梨酯80（可从Croda Inc.,Mill Hall PA作为Crillet4HP获得）。
可通过首先制备抗CTLA-4抗体ticilimumab、L-组氨酸单盐酸盐一水合物、乙二胺四乙酸二钠二水合物、αα-海藻糖二水合物和聚山梨酯80的几种储液来制备所述液体药物组合物。可通过将3.27mg/mL（15.6mM）L-组氨酸HCl一水合物和0.68mg/mL（4.4mM）L-组氨酸溶解在水中来制备20mM的组氨酸缓冲液pH5.5。可通过将3.27mg/mL（15.6mM）L-组氨酸HCl一水合物和0.68mg/mL（4.4mM）L-组氨酸、84mg/mL（222mM）αα-海藻糖二水合物、0.2mg/mL聚山梨酯80和0.1003mg/mL（0.268mM）乙二胺四乙酸二钠钙溶解在水中来制备1×制剂缓冲液。可通过将3.27mg/mL（15.6mM）L-组氨酸HCl一水合物和0.68mg/mL（4.4mM）L-组氨酸、168mg/mL（444mM）αα-海藻糖二水合物、0.4mg/mL聚山梨酯80和0.2006mg/mL（0.536mM）乙二胺四乙酸二钠钙溶解在水中来制备2×制剂缓冲液。可根据实施例2来制备抗CTLA-4抗体ticilimumab的储液，然后采用使用50kD型膜（Biomax PES）的超滤过程将其在组氨酸缓冲液中浓缩至42至55mg/ml（靶45mg/mL）。
为制备药物组合物，可向适合用于充分混合液体组合物的容器中加入等体积的抗CTLA-4抗体ticilimumab的浓缩储液和2×制剂缓冲液。在混合后，可取出少量体积的溶液，并使用1.43(mg/mL)-1cm-1的消光系统通过紫外-可见光谱法（UV-Vis）来确定抗体的浓度（预期在21至27.5mg/mL的范围内，靶22.5mg/mL）。最后，可加入经合适计算的体积的1×制剂缓冲液，并进行混合以使抗体达到20mg/mL（范围在18－22mg/mL之间）的靶浓度。
然后可将所述药物组合物通过0.2μ除菌级过滤器过滤并注入小瓶中。在20毫升1型玻璃小瓶中可使用20毫升的标称填充体积。所述小瓶可用经Daikyo777-1
Figure BDA0000480925720001321
包被的塞子密闭，并压褶密封。可将玻璃小瓶灭菌，对于20mm Daikyo777-1血清塞同样也进行灭菌。
每个单个小瓶单位将包含大约400mg抗CTLA-4抗体ticilimumab、65.4mg L-组氨酸单盐酸盐一水合物、13.6mg L-组氨酸、2.006mg乙二胺四乙酸二钠钙、1680mgαα-海藻糖二水合物和4mg聚山梨糖醇80。
实施例15
本实施例举例说明了包含抗CTLA-4抗体ticilimumab、L-组氨酸单盐酸盐一水合物、乙二胺四乙酸三钠、αα-海藻糖二水合物和聚山梨酯80的液体药物组合物的有前景的生产。
通过获得下列组分来形成本发明的液体药物组合物：抗CTLA-4抗体ticilimumab（可根据实施例1从在ATCC登录号PTA-5169下保藏的杂交瘤细胞系11.2.1.4获得，或根据实施例2从哺乳动物细胞系重组制备）、L-组氨酸单盐酸盐一水合物（可从Ajinomoto,Raleigh,NC获得）、L-组氨酸（可从Ajinomoto,Raleigh,NC获得）、乙二胺四乙酸三钠（可从Sigma-Aldrich,St.Louis,MO获得）、αα-海藻糖二水合物（可从Ferro Pfanstiehl,Waukegan IL以产品号T-104-1-MC获得）和聚山梨酯80（可从Croda Inc.,Mill Hall PA作为Crillet4HP获得）。
通过首先制备抗CTLA-4抗体ticilimumab、L-组氨酸单盐酸盐一水合物、乙二胺四乙酸三钠、αα-海藻糖二水合物和聚山梨酯80的几种储液来制备所述液体药物组合物。通过将3.27mg/mL（15.6mM）L-组氨酸HCl一水合物和0.68mg/mL（4.4mM）L-组氨酸溶解在水中来制备20mM的组氨酸缓冲液pH5.5。通过将3.27mg/mL（15.6mM）L-组氨酸HCl一水合物和0.68mg/mL（4.4mM）L-组氨酸、84mg/mL（222mM）αα-海藻糖二水合物、0.2mg/mL聚山梨酯80和0.096mg/mL（0.268mM）乙二胺四乙酸三钠溶解在水中来制备1×制剂缓冲液。通过将3.27mg/mL（15.6mM）L-组氨酸HCl一水合物和0.68mg/mL（4.4mM）L-组氨酸、168mg/mL（444mM）αα-海藻糖二水合物、0.4mg/mL聚山梨酯80和0.192mg/mL（0.536mM）乙二胺四乙酸三钠溶解在水中来制备2×制剂缓冲液。根据实施例2来制备抗CTLA-4抗体ticilimumab的储液，然后采用使用50kD型膜（Biomax PES）的超滤过程将其在组氨酸缓冲液中浓缩至42至55mg/ml（靶45mg/mL）。
为制备药物组合物，向适合用于充分混合液体组合物的容器中加入等体积的抗CTLA-4抗体ticilimumab的浓缩储液和2×制剂缓冲液。在混合后，取出少量体积的溶液，并使用1.43(mg/mL)-1cm-1的消光系统通过紫外-可见光谱法（UV-Vis）来确定抗体的浓度（预期在21至27.5mg/mL的范围内，靶22.5mg/mL）。最后，加入经合适计算的体积的1×制剂缓冲液，并进行混合以使抗体达到20mg/mL（范围在18－22mg/mL之间）的靶浓度。
然后将所述药物组合物通过0.2μ除菌级过滤器过滤并注入小瓶中。在20毫升1型玻璃小瓶中使用20毫升的标称填充体积。所述小瓶用经Daikyo777-1
Figure BDA0000480925720001341
包被的塞子密闭，并压褶密封。将玻璃小瓶灭菌，对于20mm Daikyo777-1血清塞也进行灭菌。
每个单个小瓶单位包含大约400mg抗CTLA-4抗体ticilimumab、65.4mg L-组氨酸单盐酸盐一水合物、13.6mg L-组氨酸、1.92mg乙二胺四乙酸三钠、1680mgαα-海藻糖二水合物和4mg聚山梨糖醇80。
序列
Ticilimumab（11.2.1）重链DNA（SEQ ID NO:1）
Figure BDA0000480925720001351
Ticilimumab（11.2.1）重链蛋白质（SEQ ID NO:2）
Figure BDA0000480925720001352
可变区（SEQ ID NO:5）显示于[括号之间]，和CDRs用下划线标示。CDR1由SEQ ID NO:7指明，CDR2由SEQ ID NO:8指明，和CDR3由SEQ ID NO:9指明。
Ticilimumab（11.2.1）轻链DNA（SEQ ID NO:3）
Ticilimumab（11.2.1）轻链蛋白质（SEQ ID NO:4）
可变区（SEQ ID NO:6）显示于[括号之间]，和CDRs用下划线标示。CDR1由SEQ ID NO:10指明，CDR2由SEQ ID NO:11指明，和CDR3由SEQ ID NO:12指明。
Figure IDA0000480925810000011
Figure IDA0000480925810000021
Figure IDA0000480925810000041
Figure IDA0000480925810000051
Figure IDA0000480925810000061

Claims (25)

1.组合物，其包含：
至少一种螯合剂；和
至少一种抗体，其包含：
与SEQ ID NO:2中所示的重链氨基酸序列至少90%同一的氨基酸序列；和
与SEQ ID NO:4中所示的轻链氨基酸序列至少90%同一的氨基酸序列；
其中所述抗体结合人CTLA-4。
2.权利要求1的组合物，其中所述组合物是液体组合物，和所述抗体是人IgG2抗体。
3.权利要求1的组合物，其中所述抗体包含与SEQ ID NO:2具有至少99%序列同一性的重链氨基酸序列和与SEQ ID NO:4具有至少99%序列同一性的轻链氨基酸序列。
4.权利要求1的组合物，其中所述抗体包含重链氨基酸序列和轻链氨基酸序列，所述重链氨基酸序列含有SEQ ID NO:2的可变区，和所述轻链氨基酸序列含有SEQ ID NO:4的可变区。
5.权利要求1的组合物，其中所述抗体包括具有ticilimumab的重链和轻链氨基酸序列的单克隆IgG2抗CTLA-4抗体。
6.权利要求1的组合物，其中所述组合物包含EDTA。
7.权利要求1的组合物，其中所述组合物包含：螯合剂和缓冲剂。
8.权利要求1的组合物，其中所述组合物包含：EDTA和组氨酸。
9.权利要求1的组合物，其中所述组合物包含：螯合剂、缓冲剂和表面活性剂。
10.权利要求1的组合物，其中所述组合物包含：螯合剂、缓冲剂、表面活性剂和张度剂。
11.权利要求1的组合物，其中所述组合物包含：EDTA、缓冲剂、表面活性剂和张度剂。
12.权利要求1的组合物，其中所述组合物包含：EDTA、组氨酸、表面活性剂和张度剂。
13.权利要求1的组合物，其中所述组合物包含：EDTA、组氨酸、聚山梨酯80和张度剂。
14.权利要求1的组合物，其中所述组合物包含：EDTA、组氨酸、聚山梨酯80和海藻糖。
15.权利要求1的组合物，其中所述组合物包含：
大约1mg/ml至大约200mg/ml的抗体；
大约0.01mM至大约5.0mM的螯合剂；和
大约1mM至大约100mM的组氨酸。
16.权利要求1的组合物，其中所述组合物包含：
大约1mg/ml至大约200mg/ml的抗体；
大约0.01mM至大约5.0mM的EDTA；和
大约1mM至大约100mM的组氨酸。
17.权利要求1的组合物，其中所述组合物包含：
大约1mg/ml至大约100mg/ml的抗体；
大约0.01mM至大约1.0mM的EDTA；
大约1mM至大约100mM的组氨酸；
大约0.01mg/ml至大约10mg/ml的聚山梨酯80；和
大约100mM至大约300mM的张度剂。
18.权利要求1的组合物，其中所述组合物包含：
大约0.1mg/ml至大约100mg/ml的抗体；
大约0.001mg/ml至大约1.0mg/ml的EDTA；
大约1mM至大约50mM的组氨酸；
大约0.01mg/ml至大约5mg/ml的聚山梨酯80；和
大约10mg/ml至大约200mg/ml的海藻糖。
19.权利要求1的组合物，其中所述组合物包含：
大约20mg/ml的抗体；
大约0.27mg/ml的EDTA；
大约20mM的组氨酸；
大约0.2mg/ml的聚山梨酯80；和
大约222mg/ml的海藻糖。
20.权利要求1的组合物，其中所述组合物包含：
大约20mg/ml的抗体；
大约0.1mg/ml的EDTA；
大约20mM的组氨酸；
大约0.2mg/ml的聚山梨酯80；和
大约84mg/ml的海藻糖。
21.包含至少一种单克隆抗CTLA-4抗体和螯合剂的稳定组合物，其中在将所述组合物在大约40℃的温度下贮存大约24周后，所述包含单克隆抗CTLA-4抗体和螯合剂的稳定的液体药物组合物的聚集体色谱图峰面积与在大约40℃的温度下贮存大约24周的不含螯合剂的相同组合物的聚集体色谱图峰面积之间的减少为至少大约2%。
22.用于制备液体药物组合物的方法，其包括将至少一种具有ticilimumab的重链和轻链氨基酸序列的抗CTLA-4抗体在溶液中与至少一种螯合剂混合。
23.用于治疗受试者中的瘤形成病状的方法，其包括给所述受试者施用液体药物组合物，所述组合物包含：
a)治疗有效量的至少一种具有ticilimumab的重链和轻链氨基酸序列的抗CTLA-4抗体；和
b)药学上可接受的螯合剂。
24.液体药物组合物，其包含单克隆抗CTLA-4抗体和药学上可接受的螯合剂，其中所述抗体的摩尔浓度在大约0.0006mM至大约1.35mM的范围内，和所述螯合剂的浓度在大约0.003mM至大约50mM的范围内，并且其中抗体与螯合剂的摩尔比在大约0.00001至大约450的范围内。
25.液体药物组合物，其包含：
至少一种抗体，所述抗体包含与SEQ ID NO:2中所示的重链氨基酸序列至少95%同一的氨基酸序列，且还包含与SEQ ID NO:4中所示的轻链氨基酸序列至少95%同一的氨基酸序列，其中所述抗体结合人CTLA-4；
和药学上可接受的赋形剂，
其中所述组合物包含浓度为至少大约10mg/ml的抗体。
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