BRPI0608815A2

BRPI0608815A2 - composições de anticorpo anti-ctla-4

Info

Publication number: BRPI0608815A2
Application number: BRPI0608815-5A
Authority: BR
Inventors: Justin Donald Abate; Tapan Kanti Das; Carrie Marie Elliot; Kevin Wamiti Muthurnia; Sandeep Nema; Satish Kumar Singh
Original assignee: Pharmacia & Upjohn Co Llc
Priority date: 2005-03-08
Filing date: 2006-03-02
Publication date: 2010-01-26
Also published as: PT2620450T; NZ560844A; SI2620450T1; EP1865986A2; HUE028410T2; WO2006096488A2; JP2006249083A; PL2620450T3; WO2006096461A3; CA2600434A1; CA2600434C; DK1865986T3; EP1865986B1; WO2006096488A3; AU2006220829B2; IL185380A0; WO2006096491A3; AR053553A1; AR062247A1; BRPI0608815A8

Abstract

COMPOSIçõES DE ANTICORPO ANTI-CTLA-4. A presente invenção proporciona novas composições de anticorpos anti-CTLA-4 compreendendo um agente quelante. Também é proporcionado o uso das novas composições de anticorpos cTLA-4 para a preparação de medicamentos para o tratamento de doenças e condições, incluindo várias condições neoplásicas.

Description

"COMPOSIÇÕES DE ANTICORPO ANTI-CTLA-4"

Referência Cruzada a Patentes e Pedidos de PatenteRelacionados.

Este pedido reivindica o beneficio do Pedido dePatente Provisório U.S. n° de Série 60/659.766, depositadoem 8 de março de 2005; Pedido de patente Provisório U.S. n°60/728.165, depositado em 19 de outubro e de 2005; Pedido dePatente Provisório N° de serie 60/752.712, depositado em 20de dezembro de 2005, e Pedido de Patente Provisório U.S. n°de Série 60/762.456, depositado em 26 de janeiro de 2006,todos os quais ora incorporados por referência em suatotalidade.

Antecedentes da Invenção

Antigeno-4 de linfócito T citotóxico ("CTLA-4") éum membro da superfamilia de proteínas de imunoglobulina("Ig"). CTLA-4 age na infra-regulagem de ativação de célulaT mantendo a homeostase imunológica. O bloqueio de CTLA-4(por exemplo, mediante uso de anticorpos de CTLA-4) foidemonstrado em modelos animais para melhoxar a eficácia daimunoterapia do câncer.

Anticorpos que ligam-se e inibem a atividade deCTLA-4 foram relatados na literatura, por exemplo, a PatenteU.S. n° 6.682.736 cedida a Pfizer, Inc e Abgenix, Inc.,descreve vários anticorpos monoclonais humanos para CTLA-4,inclusive um anticorpo de CTLA-4 com as seqüências deaminoácido pesada e leve do anticorpo 11.2.1, agoraconhecido como ticillimumab™. Uma linhagem de célula dehibridoma produzindo o anticorpo 11.2.1 foi depositada emATCC N° de Acesso PTA-5169. A Patente U.S. n° 5.977,318,cedida a Bristol-Myers Squibb Company, descreve um outroanticorpo monoclonal que reconhece e se liga ao dominioextracelular de CTLA-4, prevenindo assim, a ligação de CTLA-4 ao antigeno B7. 0 pedido publicado U.S. n° 20050201994cedido a Medarex, Inc, relata vários anticorpos de seqüênciahumana para CTLA-4 incluindo um que é agora referido comoipillumumab™.

Um modo possivel de administração de taisanticorpos de CTLA-4 é por via parenteral. Por exemplo, aPatente U.S. n° 6.682.736 descreve uma formulaçãointravenosa de anticorpo anti-CTLA-4 que é uma soluçãoliquida estéril contendo anticorpos anti-CTLA-4, acetato desódio 20 mM, polisorbato 80 0,2 mg/mL e cloreto de sódio 140mM a pH 5,5.

Como outras formulações de proteina, formulaçõesde anticorpo CTLA-4 são submetidas aos mesmos problemasreferentes a degradação quimica e fisica do anticorpo naformulação, com o tempo. Em geral, formulações de anticorpode CTLA-4 devieram apresentar estabilidade quimica e fisicaaceitável sob a faixa de armazenagem esperada e condições deuso, ou seja, a formulação de anticorpo CTLA-4 deveria teruma vida útil suficiente, e ainda permanecer biologicamenteativa. Dados o tempo e os recursos necessários para fabricarum produto de anticorpo para CTLA-4, as formulações quereduzem a perda do produto são desejáveis. Portanto, opresente pedido revela novas formulações de anticorpo CTLA-4que apresentam estabilidade quimica e/ou fisica melhoradasem relação ' a formulações de anticorpo CTLA-4 descritaspreviamente na literatura.

Sumário da Invenção

Em um aspecto, a presente invenção proporciona umacomposição farmacêutica liquida compreendendo pelo menos umanticorpo compreendendo uma seqüência de aminoácido que épelo menos 95% idêntica a uma seqüência de aminoácido decadeia pesada mostrada em SEQ ID NO: 2, e compreendendoainda uma seqüência de aminoácido que é pelo menos 95%idêntica a uma seqüência de aminoácido de cadeia levemostrada em SEQ ID NO: 4, onde o anticorpo liga-se a CTLA-4humano, e um agente quelante.

A presente invenção também proporciona umacomposição compreendendo pelo menos um anticorpocompreendendo uma seqüência de aminoácido que é pelo menos90% idêntica a uma seqüência de aminoácido de cadeia pesadamostrada em SEQ ID NO: 2, compreendendo ainda uma seqüênciade aminoácido que é pelo menos 90% idêntica a uma seqüênciade aminoácido de cadeia leve mostrada em SEQ ID NO: 4, ondeo anticorpo liga-se a um CTLA-4 humano; e um agentequelante; onde o anticorpo é um anticorpo de IgG2.

A presente invenção também proporciona umacomposição compreendendo pelo menos um anticorpocompreendendo uma seqüência de aminoácido que é pelo menos90% idêntica a uma seqüência de aminoácido de cadeia pesadamostrada em SEQ ID NO: 2, compreendendo ainda uma seqüênciade aminoácido que é pelo menos 90% idêntica a uma seqüênciade aminoácido de cadeia leve mostrada em SEQ ID NO: 4, ondeo anticorpo liga-se a um CTLA-4 humano; e um agentequelante; onde o anticorpo é um anticorpo humano.

A presente invenção também proporciona umacomposição compreendendo pelo menos um anticorpocompreendendo uma seqüência de aminoácido que é pelo menos90% idêntica a uma seqüência de aminoácido de cadeia pesadamostrada em SEQ ID NO: 2, compreendendo ainda uma seqüênciade aminoácido que é pelo menos 90% idêntica a uma seqüênciade aminoácido de cadeia leve mostrada em SEQ ID NO: 4, ondeo anticorpo liga-se a um CTLA-4 humano; e um agentequelante; onde o anticorpo compreende uma seqüência deaminoácido que utiliza um gene de linhagem germinativa VH 3-33 humano.

A presente invenção também proporciona umacomposição compreendendo pelo menos um anticorpocompreendendo uma seqüência de aminoácido que é pelo menos90% idêntica a uma seqüência de aminoácido de cadeia pesadamostrada em SEQ ID NO: 2, compreendendo ainda uma seqüênciade aminoácido que é pelo menos 90% idêntica a uma seqüênciade aminoácido de cadeia leve mostrada em SEQ ID NO: 4, ondeo anticorpo liga-se a um CTLA-4 humano; e um agentequelante; onde o anticorpo tem uma seqüência de aminoácidoVH compreendendo seqüências FR1, FR2 e FR3 humanasutilizando uma familia do gene VH 3-33 humano operativamenteligado em quadro com uma seqüência CDR1, uma seqüência CDR2e uma seqüência CDR3.

A presente invenção também proporciona umacomposição compreendendo pelo menos um anticorpocompreendendo uma seqüência de aminoácido que é pelo menos90% idêntica a uma seqüência de aminoácido de cadeia pesadamostrada em SEQ ID NO: 2, compreendendo ainda uma seqüênciade aminoácido que é pelo menos 90% idêntica a uma seqüênciade aminoácido de cadeia leve mostrada em SEQ ID NO: 4, ondeo anticorpo liga-se a um CTLA-4 humano; e um agenteque1ante; onde o anticorpo é um anticorpo isolado.

A presente invenção também proporciona umacomposição compreendendo pelo menos um anticorpocompreendendo uma seqüência de aminoácido que é pelo menos90% idêntica a uma seqüência de aminoácido de cadeia pesadamostrada em SEQ ID NO: 2, compreendendo ainda uma seqüênciade aminoácido que é pelo menos 90% idêntica a uma seqüênciade aminoácido de cadeia leve mostrada em SEQ ID NO: 4, ondeo anticorpo liga-se a um CTLA-4 humano; e um agentequelante; onde o anticorpo é um anticorpo recombinante.

A presente invenção também proporciona umacomposição compreendendo pelo menos um anticorpocompreendendo uma: seqüência de aminoácido que é pelo menos90% idêntica a uma seqüência de aminoácido de cadeia pesadamostrada em SEQ ID NO: 2, compreendendo ainda uma seqüênciade aminoácido que é pelo menos 90% idêntica a uma seqüênciade aminoácido de cadeia leve mostrada em SEQ ID NO: 4., ondeo anticorpo liga-se a um CTLA-4 humano; e um agentequelante; onde o anticorpo liga-se especificamente a umepitopo conformacional no polipeptidio de CTLA-4 humano.

A presente invenção também proporciona umacomposição compreendendo pelo menos um anticorpocompreendendo uma seqüência de aminoácido que é pelo menos90% idêntica a uma seqüência de aminoácido de cadeia pesadamostrada em SEQ ID NO: 2, compreendendo ainda uma seqüênciade aminoácido que é pelo menos 90% idêntica a uma seqüênciade aminoácido de cadeia leve mostrada em SEQ ID NO: 4, ondeo anticorpo liga-se a um CTLA-4 humano; e um agentequelante; onde o anticorpo compreende uma seqüência deaminoácido de cadeia pesada com pelo menos 95% de identidadede seqüência a SEQ ID NO: 2 e uma seqüência de aminoácido decadeia leve com pelo menos 95% de identidade de seqüênciapara SEQ ID NO: 4.

A presente invenção também proporciona umacomposição compreendendo pelo menos um anticorpocompreendendo uma seqüência de aminoácido que é pelo: menos90% idêntica a uma seqüência de aminoácido de cadeia pesadamostrada em SEQ ID NO: 2, compreendendo ainda uma seqüênciade aminoácido que é pelo menos 90% idêntica a uma seqüênciade aminoácido de cadeia leve mostrada em SEQ ID NO: 4, ondeo anticorpo liga-se a um CTLA-4 humano; e um agentequelante; -onde o anticorpo compreende uma seqüência deaminoácido de cadeia pesada com pelo menos 99% de identidadede seqüência a SEQ ID NO: 2 e uma seqüência de aminoácido decadeia leve com pelo menos 99% de identidade de seqüênciapara SEQ ID NO: 4.

A presente invenção também proporciona umacomposição compreendendo pelo menos um anticorpocompreendendo uma seqüência de aminoácido que é pelo menos90% idêntica a uma seqüência de aminoácido de cadeia pesadamostrada em SEQ ID NO: 2, compreendendo ainda uma seqüênciade aminoácido que é pelo menos 90% idêntica a uma seqüênciade aminoácido de cadeia leve mostrada em SEQ ID NO: 4, ondeo anticorpo liga-se a um CTLA-4 humano; e um agentequelante; onde o anticçrpo compreende uma seqüência deaminoácido de cadeia pesada, compreendendo a região variávelde SEQ ID NO: 2 e uma seqüência de aminoácido de cadeia levecompreendendo a região variável de SEQ ID NO: 4.

A presente invenção também proporciona umacomposição compreendendo pelo menos um anticorpocompreendendo uma seqüência de aminoácido que é pelo menos90% idêntica a uma seqüência de aminoácido de cadeia pesadamostrada em SEQ ID NO: 2, compreendendo ainda uma seqüênciade aminoácido que é pelo menos 90% idêntica a uma seqüênciade aminoácido de cadeia leve mostrada em SEQ ID NO: 4, ondeo anticorpo liga-se a um CTLA-4 humano; e um agentequelante; onde o anticorpo compreende uma seqüência deaminoácido da região variável de cadeia pesada compreendendoSEQ ID NO: 5 e uma seqüência de aminoácido da regiãovariável de cadeia leve compreendendo SEQ ID NO: 6.

A presente invenção também proporciona umacomposição compreendendo pelo menos um anticorpocompreendendo uma seqüência de aminoácido que é pelo menos90% idêntica a uma seqüência de aminoácido de cadeia pesadamostrada em SEQ ID NO: 2, compreendendo ainda uma seqüênciade aminoácido que é pelo menos 90% idêntica a uma seqüênciade aminoácido de cadeia leve mostrada em SEQ ID NO: 4, ondeo anticorpo liga-se a um CTLA-4 humano; e um agentequelante; onde o anticorpo compreende uma seqüência deaminoácido de cadeia pesada, compreendendo SEQ ID NO: 2 euma seqüência de aminoácido de cadeia leve compreendendo SEQID NO: 4.

A presente invenção também proporciona umacomposição compreendendo pelo menos um anticorpocompreendendo uma seqüência de aminoácido que é pelo menos90% idêntica a uma seqüência de aminoácido de cadeia pesadamostrada em SEQ ID NO: 2, compreendendo ainda uma seqüênciade aminoácido que é pelo menos 90% idêntica a uma seqüênciade aminoácido de cadeia leve mostrada em SEQ ID NO: 4, ondeo anticorpo liga-se a um CTLA-4 humano; e um agentequelante; onde o lisina C-terminal da cadeia pesada doanticorpo não está presente.

A presente invenção também proporciona umacomposição compreendendo pelo menos um anticorpocompreendendo uma seqüência de aminoácido que é pelo menos90% idêntica a uma seqüência de aminoácido de cadeia pesadamostrada em SEQ ID NO: 2, compreendendo ainda uma seqüênciade aminoácido que é pelo menos 90% idêntica a uma seqüênciade aminoácido de cadeia leve mostrada em SEQ ID NO: 4, ondeo anticorpo liga-se a um CTLA-4 humano; e um agentequelante; onde o anticorpo compreende um anticorpo anti-CTLA-4 de IgG2 monoclonal com as seqüências de aminoácido decadeia pesada e cadeia leve do anticorpo 11.2.1.

A presente invenção também proporciona umacomposição compreendendo pelo menos um anticorpocompreendendo uma seqüência de aminoácido que é pelo menos90% idêntica a uma seqüência de aminoácido de cadeia pesadamostrada em SEQ ID NO: 2, compreendendo ainda uma seqüênciade aminoácido que é pelo menos 90% idêntica a uma seqüênciade aminoácido de cadeia leve mostrada em SEQ ID NO: 4, ondeo anticorpo liga-se a um CTLA-4 humano; e um agentequelante; onde o anticorpo possui as mesmas seqüências deaminoácido de cadeias pesada e leve do anticorpo produzidopela linhagem celular de hibridoma 11.1.1.4 depositada juntoà ATCC N° de Acesso PTA-5169.

A presente invenção também proporciona umacomposição compreendendo pelo menos um anticorpocompreendendo uma seqüência de aminoácido que é pelo menos90% idêntica a uma seqüência de aminoácido de cadeia pesadamostrada em SEQ ID NO: 2, compreendendo ainda uma seqüênciade aminoácido que é pelo menos 90% idêntica a uma seqüênciade aminoácido de cadeia leve mostrada em SEQ ID NO: 4, ondeo anticorpo liga-se a um CTLA-4 humano; e um agentequelante; onde o anticorpo é ticilimumab.

A presente invenção também proporciona umacomposição compreendendo pelo menos um anticorpocompreendendo uma seqüência de aminoácido que é pelo menos90% idêntica a uma seqüência de aminoácido de cadeia pesadamostrada em SEQ ID NO: 2, compreendendo ainda uma seqüênciade aminoácido que é pelo menos 90% idêntica a uma seqüênciade aminoácido de cadeia leve mostrada em SEQ ID NO: 4, ondeo anticorpo liga-se a um CTLA-4 humano; e um agentequelante; onde o agente quelante é selecionado do grupoconsistindo de ácidos aminopolicarboxilicos, ácidoshidroxiaminocarboxilicos, sais de EDTA e derivados, glicinasN-substituidas, derivados deferoxamina e misturas dosmesmos.

A presente invenção também proporciona umacomposição compreendendo pelo menos um anticorpocompreendendo uma seqüência de. aminoácido que é pelo menos90% idêntica a uma seqüência de aminoácido de cadeia pesadamostrada em SEQ ID NO: 2, compreendendo ainda uma seqüênciade aminoácido que é pelo menos 90% idêntica a uma seqüênciade aminoácido de cadeia leve mostrada em SEQ ID NO: 4, ondeo anticorpo liga-se a um CTLA-4 humano; e um agenteque1ante; onde o agente que1ante é selecionado do grupoconsistindo de ácido etilenodiaminotetracético, ácidodietilenotriaminopentacético 5, ácido nitrilotriacético,ácido N-2-acetamido-2-iminodiacético, éter bis(aminoetil)glieólico, ácido N,N,Nf,N1-tetracético, ácido trans-diaminoclicloexano tetracético, ácido glutâmico, ácidoaspártico, N-hidroxietiliminodiacético, N,N-bis-hidroxietilglicina, N-(tris-hidroximetilmetil)10-glicina,glicilglicina, ácido 2-(2-amino-2-oxoetil)aminoetanosulfônico, deferoxamina, mesilato de deferoxamina, edetatodipotássico, edetato dissódico, cálcio edetato dissódico,edetato de sódio, ededato trissódico, edetato potássico,ácido citrico, citrato de sódio, ácido citrico anidro,citrato trissódico diidratado, niacinamida, desoxicolato desódio, e misturas destes.

A presente invenção também proporciona umacomposição compreendendo pelo menos um anticorpocompreendendo uma seqüência de aminoácido que é pelo menos90% idêntica a uma seqüência de aminoácido de cadeia pesadamostrada em SEQ ID NO: 2, compreendendo ainda uma seqüênciade aminoácido que é pelo menos 90% idêntica a uma seqüênciade aminoácido de cadeia leve mostrada em SEQ ID NO: 4, ondeo anticorpo liga-se a um CTLA-4 humano; e um agentequelante; onde o agente quelante é EDTA.

A presente invenção também proporciona umacomposição compreendendo pelo menos um anticorpocompreendendo uma seqüência de aminoácido que é pelo menos90% idêntica a uma seqüência de aminoácido de cadeia pesadamostrada em SEQ ID NO: 2, compreendendo ainda uma seqüênciade aminoácido que é pelo menos' 90% idêntica a uma seqüênciade aminoácido de cadeia leve mostrada em SEQ ID NO: 4, ondeo anticorpo liga-se a um CTLA-4 humano; e um agentequelante; compreendendo ainda um tampão.

A presente invenção também proporciona umacomposição compreendendo pelo menos um anticorpocompreendendo uma seqüência de aminoácido que é pelo menos90% idêntica a uma seqüência de aminoácido de cadeia pesadamostrada em SEQ ID NO: 2, compreendendo ainda uma seqüênciade aminoácido que é pelo menos 90% idêntica a uma seqüênciade aminoácido de cadeia leve mostrada em SEQ ID NO: 4, ondeo anticorpo liga-se a um CTLA-4 humano; e um agentequelante; compreendendo ainda um tampão, onde o tampão éselecionado do grupo consistindo de acetato, succinato,gluconato, citrato, histidina, ácido acético, fosfato, ácidofosfórico, ascorbato, ácido tartárico, ácido maleico,glicina, lactato, ácido láctico, ácido ascórbico, imidazol,bicarbonato e ácido carbônico, ácido succinico, benzoato desódio, ácido benzóico, gluconato, edetato, acetato, malato,imidazol, tris, fosfato e misturas destes.

A presente invenção também proporciona umacomposição compreendendo pelo menos um anticorpocompreendendo uma seqüência de aminoácido que é pelo menos90% idêntica a uma seqüência de aminoácido de cadeia pesadamostrada em SEQ ID NO: 2, compreendendo ainda uma seqüênciade aminoácido que é pelo menos 90% idêntica a uma seqüênciade aminoácido de cadeia leve mostrada em SEQ ID NO: 4, ondeo anticorpo liga-se a um CTLA-4 humano; e um agentequelante; compreendendo ainda um tampão, onde o tampãocompreende histidina.

A presente invenção também proporciona umacomposição compreendendo pelo menos um anticorpocompreendendo uma seqüência de aminoácido que é pelo menos90% idêntica a uma seqüência de aminoácido de cadeia pesadamostrada em SEQ ID NO: 2, compreendendo ainda uma seqüênciade aminoácido que é pelo menos 90% idêntica a uma seqüênciade aminoácido de cadeia leve mostrada em SEQ ID NO: 4, ondeo anticorpo liga-se a um CTLA-4 humano; e um agentequelante; compreendendo ainda histidina, onde histidina écomposto por L-histidina ou D-histidina.

A presente invenção também proporciona umacomposição compreendendo pelo menos um anticorpocompreendendo uma seqüência de aminoácido que é pelo menos90% idêntica a uma seqüência de aminoácido de cadeia pesadamostrada em SEQ ID NO: 2, compreendendo ainda uma seqüênciade aminoácido que é pelo menos 90% idêntica a uma seqüênciade aminoácido de cadeia leve mostrada em SEQ ID NO: 4, ondeo anticorpo liga-se a um CTLA-4 humano; e um agenteque1ante; compreendendo ainda histidina onde histidina écomposto por L-histidina.

A presente invenção também proporciona umacomposição compreendendo pelo menos um anticorpocompreendendo uma seqüência de aminoácido que é pelo menos90% idêntica a uma seqüência de aminoácido de cadeia pesadamostrada em SEQ ID NO: 2, compreendendo ainda uma seqüênciade aminoácido que é pelo menos 90% idêntica a uma seqüênciade aminoácido de cadeia leve mostrada em SEQ ID NO: 4, ondeo anticorpo liga-se a um CTLA-4 humano; e um agenteque1ante; onde a composição contém uma concentração deanticorpos variando desde cerca de 0,1 a cerca de 200 mg/mL.

A presente invenção também proporciona umacomposição compreendendo pelo menos um anticorpocompreendendo uma seqüência de aminoácido que é pelo menos90% idêntica a uma seqüência de aminoácido de cadeia pesadamostrada em SEQ ID NO: 2, compreendendo ainda uma seqüênciade aminoácido que é pelo menos 90% idêntica a uma seqüênciade aminoácido de cadeia leve mostrada em SEQ ID NO: 4, ondeo anticorpo liga-se a um CTLA-4 humano; e um agentequelante; onde a composição contém uma concentração deanticorpos de cerca de 20 mg/mL.

A presente invenção também proporciona umacomposição compreendendo pelo menos um anticorpocompreendendo uma seqüência de aminoácido que é pelo menos90% idêntica a uma seqüência de aminoácido de cadeia pesadamostrada em SEQ ID NO: 2, compreendendo ainda uma seqüênciade aminoácido que é pelo menos 90% idêntica a uma seqüênciade aminoácido de cadeia leve mostrada em SEQ ID NO: 4, ondeo anticorpo liga-se a um CTLA-4 humano; e um agentequelante; onde a composição compreende ainda pelo menos umexcipiente selecionado do grupo consistindo de agentes detonicidade, tensoativos e tampões.

A presente invenção também proporciona umacomposição compreendendo pelo menos um anticorpocompreendendo uma seqüência de aminoácido que é pelo menos90% idêntica a uma seqüência de aminoácido de cadeia pesadamostrada em SEQ ID NO: 2, compreendendo ainda uma seqüênciade aminoácido que é pelo menos 90% idêntica a uma seqüênciade aminoácido de cadeia leve mostrada em SEQ ID NO: 4, ondeo anticorpo liga-se a um CTLA-4 humano; e um agentequelante; onde a composição compreende ainda pelo menos doisexcipientes selecionados do grupo consistindo de agentes detonicidade, tensoativos e tampões.

A presente invenção também proporciona umacomposição compreendendo pelo menos um anticorpocompreendendo uma seqüência de aminoácido que é pelo menos90% idêntica a uma seqüência de aminoácido de cadeia pesadamostrada em SEQ ID NO: 2, compreendendo ainda uma seqüênciade aminoácido que é pelo menos 90% idêntica a uma seqüênciade aminoácido de cadeia leve mostrada em SEQ ID NO: 4, ondeo anticorpo liga-se a um CTLA-4 humano; e um agenteque1ante; onde a composição compreende ainda um agente detonicidade, um tensoativo e um tampão.

A presente invenção também proporciona umacomposição compreendendo pelo menos um anticorpocompreendendo uma seqüência de aminoácido que é pelo menos90% idêntica a uma seqüência de aminoácido de cadeia pesadamostrada em SEQ ID NO: 2, compreendendo ainda uma seqüênciade aminoácido que é pelo menos 90% idêntica a uma seqüênciade aminoácido de cadeia leve mostrada em SEQ ID NO: 4, ondeo anticorpo liga-se a um CTLA-4 humano; e um agenteque1ante; onde a composição compreende ainda um agente detonicidade, um antioxidante, um tensoativo e um tampão.

A presente invenção também proporciona umacomposição compreendendo pelo menos um anticorpocompreendendo uma seqüência de aminoácido que é pelo menos90% idêntica a uma seqüência de aminoácido de cadeia pesadamostrada em SEQ ID NO: 2, compreendendo ainda uma seqüênciade aminoácido que é pelo menos 90% idêntica a uma seqüênciade aminoácido de cadeia leve mostrada em SEQ ID NO: 4, ondeo anticorpo liga-se a um CTLA-4 humano; e um agenteque1ante; onde a composição compreende ainda pelo menos umexcipiente selecionado do grupo consistindo de agentes detonicidade, tensoativos e tampões, onde o agente detonicidade compreende um sacarideo.

A presente invenção também proporciona umacomposição compreendendo pelo menos um anticorpocompreendendo uma seqüência de aminoácido que é pelo menos90% idêntica a uma seqüência de aminoácido de cadeia pesadamostrada em SEQ ID NO: 2, compreendendo ainda uma seqüênciade aminoácido que é pelo menos 90% idêntica a uma seqüênciade aminoácido de cadeia leve mostrada em SEQ ID NO: 4, ondeo anticorpo liga-se a um CTLA-4 humano; e um agentequelante; onde a composição compreende ainda pelo menos umexcipiente selecionado do grupo consistindo de agentes detonicidade, tensoativos e tampões, onde o agente detonicidade compreende pelo menos um excipiente que éselecionado do grupo consistindo de frutose, glicose,manose, sorbose, xilose, lactose, maltose, sacarose,dextrana, pullulan, dextrina, ciclodextrinas, amido solúvel,amido hidroxietila, glicanos hidrossolúveis, e misturasdestes.

A presente invenção também proporciona umacomposição compreendendo pelo menos um anticorpocompreendendo uma seqüência de aminoácido que é pelo menos90% idêntica a uma seqüência de aminoácido de cadeia pesadamostrada em SEQ ID NO: 2, compreendendo ainda uma seqüênciade aminoácido que é pelo menos 90% idêntica a uma seqüênciade aminoácido de cadeia leve mostrada em SEQ ID NO:- 4,.ondeo anticorpo liga-se a um CTLA-4 humano; e um agentequelante; onde a composição compreende ainda pelo menos umexcipiente selecionado do grupo consistindo de agentes detonicidade, tensoativos e tampões, onde o agente detonicidade compreende um poliol.

A presente invenção também proporciona uma'composição compreendendo pelo menos um anticorpocompreendendo uma seqüência de aminoácido que é pelo menos90% idêntica a uma seqüência de aminoácido de cadeia pesadamostrada em SEQ ID NO: 2, compreendendo ainda uma seqüênciade aminoácido que é pelo menos 90% idêntica a uma seqüênciade aminoácido de cadeia leve mostrada em SEQ ID NO: 4, ondeo anticorpo liga-se a um CTLA-4 humano; e um agentequelante; onde a composição compreende ainda pelo menos umexcipiente selecionado do grupo consistindo de agentes detonicidade, tensoativos e tampões, onde o poliol éselecionado do grupo consistindo de manitol, trehalose,sorbitol, eritritol, isomalte, lactitol, maltitol, xilitol,glicerol, lactitol, polietilenoglicol, inositol e suasmisturas.

A presente invenção também proporciona umacomposição compreendendo pelo menos um anticorpocompreendendo uma seqüência de aminoácido que é pelo menos90% idêntica a uma seqüência de aminoácido de cadeia pesadamostrada em SEQ ID NO: 2, compreendendo ainda uma seqüênciade aminoácido que é pelo menos 90% idêntica a uma seqüênciade aminoácido de cadeia leve mostrada em SEQ;ID NO: 4, ondeo anticorpo liga-se a um CTLA-4 humano; e um agentequelante; onde a composição compreende ainda pelo menos umexcipiente selecionado do grupo consistindo de agentes detonicidade tensoativos e tampões, onde o agente detonicidade compreende um açúcar não redutor.

A presente invenção também proporciona umacomposição compreendendo pelo menos um anticorpocompreendendo uma seqüência de aminoácido que é pelo menos90% idêntica a uma seqüência de aminoácido de cadeia pesadamostrada em SEQ ID NO: 2, compreendendo ainda uma seqüênciade aminoácido que é pelo menos 90% idêntica a uma seqüênciade aminoácido de cadeia leve mostrada em SEQ ID NO: 4, ondeo anticorpo liga-se a um CTLA-4 humano; e um agentequelante, onde a composição compreende ainda pelo menos umexcipiente selecionado do grupo consistindo de agentes detonicidade, tensoativos e tampões, onde o agente detonicidade compreende um açúcar não redutor, onde o açúcarnão redutor compreende pelo menos um excipiente que éselecionado do grupo consistindo de sacarose, trehalose emisturas destes.

A presente invenção também proporciona umacomposição compreendendo pelo menos um anticorpocompreendendo uma seqüência de aminoácido que é pelo menos90% idêntica a uma seqüência de aminoácido de cadeia pesadamostrada em SEQ ID NO: 2, compreendendo ainda uma seqüênciade aminoácido que é pelo menos 90% idêntica a uma seqüênciade aminoácido de cadeia leve mostrada em SEQ ID NO: 4, ondeo anticorpo liga-se a um CTLA-4 humano; e um agentequelante, onde a composição compreende ainda pelo menos umexcipiente selecionado do grupo consistindo de agentes detonicidade, tensoativos, e tampões, onde o agente detonicidade compreende um açúcar não redutor, onde o açúcarnão redutor é trehalose.

A presente invenção também proporciona umacomposição compreendendo pelo menos um anticorpocompreendendo uma seqüência de aminoácido que é pelo menos90% idêntica a uma seqüência de aminoácido de cadeia pesadamostrada em SEQ ID NO: 2, compreendendo ainda uma seqüênciade aminoácido que é pelo menos 90% idêntica a uma seqüênciade aminoácido de cadeia leve mostrada em SEQ ID NO: 4, ondeo anticorpo liga-se a um CTLA-4 humano; e um agentequelante, onde a composição compreende ainda pelo menos umexcipiente selecionado do grupo consistindo de agentes detonicidade, tensoativos e tampões, onde o tensoativo éselecionado do grupo consistindo de polisorbatos,poloxâmeros, tritons, dodecil sulfato de sódio, laurelsulfato de sódio, octil glicosideo de sódio, lauril-sulfobetaina, miristil-sulfobeaina, linoleil-sulfobetaina,estearil-sulfobetaina, lauril-sarcosina, miristil-sarcosina,linoleil-sarcosina, estearil-sarcosina, linoleil-betaina,miristil-betaina, cetil-betaina, lauroamidopropil-betaina,cocamidopropil-betaina, linoleamidopropil-betaina,miristamidopropil-betaina, palmidopropil-betaina,isoestearamidopropil-betaina, miristamidopropil-dimetilamina, palmidopropil-dimetilamina,isoestearamidopropil-dimetilamina, metil cocoil-taurato desódio, metil oleiol-taurato • dissódico, cloreto dediidroxipropil PEG 5 linolil-amônio, polietileno glicol,polipropileno glicol e misturas destes.

A presente invenção também proporciona umacomposição compreendendo pelo menos um anticorpocompreendendo uma seqüência de aminoácido que é pelo menos90% idêntica a uma seqüência de aminoácido de cadeia pesadamostrada em SEQ ID NO: 2, compreendendo ainda uma seqüênciade aminoácido que é pelo menos 90% idêntica a uma seqüênciade aminoácido de cadeia leve mostrada em SEQ ID NO: 4, ondeo anticorpo liga-se a um CTLA-4 humano; e um agentequelante, onde a composição compreende ainda pelo menos umexcipiente selecionado do grupo consistindo de agentes detonicidade, tensoativos e tampões, onde o tensoativo éselecionado do grupo consistindo de polisorbato 20,polisorbato 21, polisorbato 4 0, polisorbato 60, polisorbato61, polisorbato 65, polisorbato 80, polisorbato 81,polisorbato 85 e suas misturas.

A presente invenção também proporciona umacomposição compreendendo pelo menos um anticorpocompreendendo uma seqüência de aminoácido que é pelo menos90% idêntica a uma seqüência de aminoácido de cadeia pesadamostrada em SEQ ID NO: 2, compreendendo ainda uma seqüênciade aminoácido que é pelo menos 90% idêntica a uma seqüênciade aminoácido de cadeia leve mostrada em SEQ ID NO: 4, ondeo anticorpo liga-se a um CTLA-4 humano; e um agentequelante, onde a composição compreende ainda pelo menos umexcipiente selecionado do; grupo consistindo de agentes detonicidade, tensoativos e tampões, onde o tensoativo épolisorbato 80.

A presente invenção também proporciona umacomposição compreendendo pelo menos um anticorpocompreendendo uma seqüência de aminoácido que é pelo menos90% idêntica a uma seqüência de aminoácido de cadeia pesadamostrada em SEQ ID NO: 2,' compreendendo ainda uma seqüênciade aminoácido que é pelo menos 90% idêntica a uma seqüênciade aminoácido de cadeia leve mostrada em SEQ ID NO: 4, ondeo anticorpo liga-se a um CTLA-4 humano; e um agenteque1ante, onde a composição compreende ainda pelo menos umexcipiente selecionado do grupo consistindo de agentes detonicidade, tensoativos e tampões, onde o tampão compreendehistidina.

A presente invenção também proporciona umacomposição compreendendo pelo menos um anticorpocompreendendo uma seqüência de aminoácido que é pelo menos90% idêntica a uma seqüência de aminoácido de cadeia pesadamostrada em SEQ ID NO: 2, compreendendo ainda uma seqüênciade aminoácido que é pelo menos 90% idêntica a uma seqüênciade aminoácido de cadeia leve mostrada em SEQ ID NO: 4, ondeo anticorpo liga-se a um CTLA-4 humano; e um agenteque1ante, onde a composição compreende ainda polisorbato 80.

A presente invenção também proporciona umacomposição compreendendo pelo menos um anticorpocompreendendo uma seqüência de aminoácido que é pelo menos90% idêntica a uma seqüência de aminoácido de cadeia pesadamostrada em SEQ ID NO: 2, compreendendo ainda uma seqüênciade aminoácido que épelo menos 90% idêntica a uma seqüênciade aminoácido de cadeia leve mostrada em SEQ ID NO: 4, ondeo anticorpo liga-se a um CTLA-4 humano; e um agentequelante, onde a composição compreende ainda trehalose.

A presente invenção também proporciona umacomposição compreendendo pelo menos um anticorpocompreendendo uma seqüência de aminoácido que é pelo menos90% idêntica a uma seqüência de aminoácido de cadeia pesadamostrada em SEQ ID NO: 2, compreendendo ainda uma seqüênciade aminoácido que é pelo menos 90% idêntica a uma seqüênciade aminoácido de cadeia leve mostrada em SEQ ID NO: 4, ondeo anticorpo liga-se a um CTLA-4 humano; onde a composiçãocompreende histidina, trehalose, polisorbato 80 e EDTA.

A presente invenção também proporciona umacomposição compreendendo pelo menos um anticorpocompreendendo uma seqüência de aminoácido que é pelo menos90% idêntica a uma seqüência de aminoácido de cadeia pesadamostrada em SEQ ID NO: 2, compreendendo ainda uma seqüênciade aminoácido que é pelo menos 90% idêntica a uma seqüênciade aminoácido de cadeia leve mostrada em SEQ ID NO: 4, ondeo anticorpo liga-se a um CTLA-4 humano; onde a composiçãocompreende histidina, trehalose, polisorbato 80 e EDTA, ondea composição possui um pH desde cerca de 5,0 a cerca de 6,5.

A presente invenção também proporciona umacomposição compreendendo pelo menos um anticorpocompreendendo uma seqüência de aminoácido que é pelo menos90% idêntica a uma seqüência de aminoácido de cadeia pesadamostrada em SEQ ID NO: 2, compreendendo ainda uma seqüênciade aminoácido- que é pelo menos 90% idêntica a uma seqüênciade aminoácido de cadeia leve mostrada em SEQ ID NO: 4, ondeo anticorpo liga-se a um CTLA-4 humano; onde a composiçãocompreende histidina, trehalose, polisorbato 80 e EDTA, ondea concentração de histidina fica entre cerca de 1 kiM a cercade 50 mM.

A presente invenção também proporciona umacomposição compreendendo pelo menos um anticorpocompreendendo uma seqüência de aminoácido que é pelo menos90% idêntica a uma seqüência de aminoacido de cadeia pesada mostrada em SEQ ID NO: 2, compreendendo ainda uma seqüência de aminoacido que é pelo menos 90% idêntica a uma seqüência de aminoacido de cadeia leve mostrada em SEQ ID NO: 4, onde o anticorpo liga-se a um CTLA-4 humano; onde a composição compreende histidina, trehalose, polisorbato 80 e EDTA, onde a concentração de histidina é cerca de 20 mM.

A presente invenção também proporciona uma composição compreendendo pelo menos um anticorpo compreendendo uma seqüência de aminoacido que é pelo menos 90% idêntica a uma seqüência de aminoacido de cadeia pesada mostrada em SEQ ID NO: 2, compreendendo ainda uma seqüência de aminoacido que é pelo menos 90% idêntica a uma seqüência de aminoacido de cadeia leve mostrada em SEQ ID NO: 4, onde o anticorpo liga-se a um CTLA-4 humano; onde a composição compreende histidina, trehalose, polisorbato 80 e EDTA, onde a concentração de polisorbato 80 fica entre cerca de 0,01 mg/mL a cerca de 10 mg/mL.

A presente invenção também proporciona uma composição compreendendo pelo menos um anticorpo compreendendo uma seqüência de aminoacido que é pelo menos 90% idêntica a uma seqüência de aminoacido de cadeia pesada mostrada em SEQ ID NO: 2, compreendendo ainda uma seqüência de aminoacido que é pelo menos 90% idêntica a uma seqüência de aminoacido de cadeia leve mostrada em SEQ ID NO: 4, onde o anticorpo liga-se a um CTLA-4 humano; onde a composição compreende histidina, trehalose, polisorbato 80 e EDTA, onde a concentração de polisorbato 80 é de cerca de 0,2 mg/mL.A presente invenção também proporciona uma composição compreendendo pelo menos um anticorpo compreendendo uma seqüência de aminoácido que é pelo menos 90% idêntica a uma seqüência de aminoácido de cadeia pesada mostrada em SEQ ID NO: 2, compreendendo ainda uma seqüência de aminoácido que é pelo menos 90% idêntica a. uma seqüência de aminoácido de cadeia leve mostrada em SEQ ID NO: 4, onde o anticorpo liga-se a um CTLA-4 humano; onde a composição compreende histidina, trehalose, polisorbato 80 e EDTA, onde a concentração de EDTA fica entre cerca de 0,001 mg/mL a cerca de 10 mg/mL.

A presente invenção também proporciona uma composição compreendendo pelo menos um anticorpo compreendendo uma seqüência de aminoácido que é pelo menos 90% idêntica a uma seqüência de aminoácido de cadeia pesada mostrada em SEQ ID NO: 2, compreendendo ainda uma seqüência de aminoácido que é pelo menos 90% idêntica a uma seqüência de aminoácido de cadeia leve mostrada em SEQ ID NO: 4, onde ç anticorpo liga-se a um CTLA-4 humano; onde a composição compreende histidina, trehalose, polisorbato 80 e EDTA, onde a concentração de EDTA é de cerca de 0,1 mg/mL.

A presente invenção também proporciona uma composição compreendendo pelo menos um anticorpo compreendendo uma seqüência de aminoácido que é pelo menos 90% idêntica a uma seqüência de aminoácido de cadeia pesada mostrada em SEQ ID NO: 2, compreendendo ainda uma seqüência de aminoácido que é pelo menos 90% idêntica a uma seqüência de aminoácido de cadeia leve mostrada em SEQ ID NO: 4, ondeo anticorpo liga-se a um CTLA-4 humano; onde a composição compreende histidina, trehalose, polisorbato 80 e EDTA, onde a concentração de trehalose fica entre cerca de 10 mg/mL a cerca de 100 mg/mL.

A presente invenção também proporciona uma composição compreendendo pelo menos um anticorpo compreendendo uma seqüência de aminoácido que é pelo menos 90% idêntica a uma seqüência de aminoácido de cadeia pesada mostrada em SEQ ID NO: 2, compreendendo ainda uma seqüência de aminoácido que é pelo menos 90% idêntica a uma seqüência de aminoácido de cadeia leve mostrada em SEQ ID NO: 4, onde o anticorpo liga-se a um CTLA-4 humano; onde a composição compreende histidina, trehalose, polisorbato 80 e EDTA, onde a concentração de trehalose é cerca de 84 mg/mL.

A presente invenção também proporciona uma composição compreendendo pelo menos um anticorpo compreendendo uma seqüência de aminoácido que é pelo menos 90% idêntica a uma seqüência de aminoácido de cadeia pesada ; mostrada em SEQ ID NO: 2, compreendendo ainda uma seqüência de aminoácido que é pelo menos 90% idêntica a uma seqüência de aminoácido de cadeia leve mostrada em SEQ ID NO: 4, onde o anticorpo liga-se a um CTLA-4 humano; onde a composição compreende histidina, trehalose, polisorbato 80 e EDTA, onde a composição compreende de cerca de 0,1 mg/mL a cerca de 100 mg/mL do anticorpo; de cerca de 0,001 mg/mL a cerca de 1,0 mg/mL de EDTA; de cerca de 1 mM a cerca de 50 mM de histidina, de cerca de 0,01 mg/mL a cerca de 10 mg/mL de polisorbato 80, e de cerca de 10 mg/mL a cerca de 100 mg/mLde trehalose.

A presente invenção também proporciona uma composição compreendendo pelo menos um anticorpo compreendendo uma seqüência de aminoácido que é pelo menos 90% idêntica a uma seqüência de aminoácido de cadeia pesada mostrada em SEQ ID NO: 2, compreendendo ainda uma seqüência de aminoácido que é pelo menos 90% idêntica a uma seqüência de aminoácido de cadeia leve mostrada em SEQ ID NO: 4, onde o anticorpo liga-se a um CTLA-4 humano; onde a composição compreende histidina, trehalose, polisorbato 80 e EDTA, onde a composição compreende: cerca de 20 mg/mL do anticorpo, cerca de 0,1 mg/mL de EDTA, cerca de 20 mM de histidina, cerca de 0,2 mg/mL de polisorbato80, e cerca de 84 mg/mL de trehalose.

A presente invenção também proporciona uma composição compreendendo pelo menos um anticorpo, onde o anticorpo compreende uma seqüência de aminoácido de cadeia pesada compreendendo SEQ ID NO: 2 e uma seqüência de aminoácido de cadeia leve compreendendo SEQ ID NO: 4, onde o anticorpo liga-se a CTLA-4 humano; e um agente quelante, sendo que o anticorpo é estável a uma temperatura de cerca de 5°C por pelo menos cerca de 26 semanas.

A presente invenção também proporciona uma composição compreendendo pelo menos um anticorpo, onde o anticorpo compreende uma seqüência de aminoácido de cadeia pesada compreendendo SEQ ID NO: 2 e uma seqüência de aminoácido de cadeia leve compreendendo SEQ ID NO: 4, onde o anticorpo liga-se a CTLA-4 humano; e um agente quelante,sendo que o anticorpo é estável a uma temperatura de cerca de 25°C por pelo menos cerca de 26 semanas.

A presente invenção também proporciona uma composição compreendendo pelo menos um anticorpo, onde o anticorpo compreende uma seqüência de aminoácido de cadeia pesada compreendendo SEQ I.D NO: 2 e uma seqüência de aminoácido de cadeia leve compreendendo SEQ ID NO: 4, onde o anticorpo liga-se a CTLA-4 humano; e um agente quelante, sendo que o anticorpo é estável a uma temperatura de cerca de 40°C por pelo menos cerca de 26 semanas.

A presente invenção também proporciona uma composição compreendendo pelo menos um anticorpo compreendendo uma seqüência de aminoácido que é pelo menos 90% idêntica a uma seqüência de aminoácido de cadeia pesada mostrada em SEQ ID NO: 2, compreendendo ainda uma seqüência de aminoácido que é pelo menos 90% idêntica a uma seqüência de aminoácido de cadeia leve mostrada em SEQ ID NO: 4, onde o anticorpo liga-se a um CTLA-4 humano; e um agente quelante onde o anticorpo é estável durante pelo menos um ciclo de congelamento e descongelamento da composição.

A presente invenção também proporciona uma composição compreendendo pelo menos um anticorpo compreendendo uma seqüência de aminoácido que é pelo menos 90% idêntica a uma seqüência de aminoácido de cadeia pesada mostrada em SEQ ID NO: 2, compreendendo ainda uma seqüência de aminoácido que é pelo menos 90% idêntica a uma seqüência de aminoácido de cadeia leve mostrada em SEQ ID NO: 4, onde o anticorpo liga-se a um CTLA-4 humano; e um agente quelanteonde o anticorpo é estável durante pelo menos seis ciclos de congelamento e descongelamento da composição.

A presente invenção também proporciona uma composição compreendendo pelo menos um anticorpo compreendendo uma seqüência de aminoácido que é pelo menos 90% idêntica a uma seqüência de aminoácido de cadeia pesada mostrada em SEQ ID NO: 2, compreendendo ainda uma seqüência de aminoácido que é pelo menos 90% idêntica a uma seqüência de aminoácido de cadeia leve mostrada em SEQ ID NO: 4, onde o anticorpo liga-se a um CTLA-4 humano; e um agente quelante, onde, quando a composição é armazenada durante um periodo de cerca de 24 semanas a uma temperatura de cerca de 40 °C, a redução entre uma área de pico do cromatograma agregada para a composição e uma área de pico do cromatograma agregada para uma composição de outro modo idêntica, carecendo do agente quelante que é armazenada por um periodo de cerca de 24 semanas a uma temperatura de cerca de 40°C, é de pelo menos cerca de 2%.

A presente invenção também proporciona uma composição compreendendo pelo menos um anticorpo compreendendo uma seqüência de aminoácido que é pelo menos 90% idêntica a uma seqüência de aminoácido de cadeia pesada mostrada em SEQ ID NO: 2, compreendendo ainda uma seqüência de aminoácido que é pelo menos 90% idêntica a uma seqüência de aminoácido de cadeia leve mostrada em SEQ ID NO: 4, onde o anticorpo liga-se a um CTLA-4 humano; e um agente quelante, onde, quando a composição é armazenada durante um periodo de cerca de 24 semanas a uma temperatura de cercade 4O°C, a redução entre uma área de pico do cromatograma agregada para a composição e uma área de pico do cromatograma agregada para uma composição de outro modo idêntica, carecendo do agente quelante que é armazenada por um periodo de cerca de 24 semanas a uma temperatura de cerca de 40°C, é de pelo menos cerca de 2%, onde a separação cromatográfica compreende SE-HPLC.

A presente invenção também proporciona uma composição compreendendo pelo menos um anticorpo compreendendo uma seqüência de aminoácido que é pelo menos 90% idêntica a uma seqüência de aminoácido de cadeia pesada mostrada em SEQ ID NO: 2, compreendendo ainda uma seqüência de aminoácido que é pelo menos 90% idêntica a uma seqüência de aminoácido de cadeia leve mostrada em SEQ ID NO: 4, onde o anticorpo liga-se a um CTLA-4 humano; e um agente quelante, onde, quando a composição é armazenada durante um periodo de cerca de 2 4 semanas a uma temperatura de cerca de 40°C, a redução entre uma área de pico do cromatograma agregada para a composição e uma área de pico do cromatograma agregada para uma composição de outro modo idêntica, carecendo do agente quelante que é armazenada por um periodo de cerca de 24 semanas a uma temperatura de cerca de 40°C, é de pelo menos cerca de 2% , onde é empregada a detecção por ultravioleta para se medir a quantidade de anticorpos que ficaram agregados.

A presente invenção também proporciona uma composição compreendendo pelo menos um anticorpo compreendendo uma seqüência de aminoácido que é pelo menos90% idêntica a uma seqüência de aminoácido de cadeia pesada mostrada em SEQ ID NO: 2, compreendendo ainda uma seqüência de aminoácido que é pelo menos 90% idêntica a uma seqüência de aminoácido de cadeia leve mostrada em SEQ ID NO: 4, onde o anticorpo liga-se a um CTLA-4 humano; e um agente quelante, onde, quando a composição é armazenada durante um periodo de cerca de 24 semanas a uma temperatura de cerca de 40 °C, a redução entre uma área de pico do cromatograma agregada para a composição e uma área de pico do cromatograma agregada para uma composição de outro modo idêntica, carecendo do agente quelante, que é armazenada por um periodo de cerca de 24 semanas a uma temperatura de cerca de 40°C, é de pelo menos cerca de 2%, onde a detecção por ultravioleta é realizada a 214 nanômetros.

A pres'ente invenção também proporciona uma composição compreendendo pelo menos um anticorpo compreendendo uma seqüência de aminoácido que é pelo menos 90% idêntica a uma seqüência de aminoácido de cadeia pesada mostrada em SEQ ID NO: 2, compreendendo ainda uma seqüência de aminoácido que é pelo menos 90% idêntica a uma seqüência de aminoácido de cadeia leve mostrada em SEQ ID NO: 4, onde o anticorpo liga-se a um CTLA-4 humano; e um agente quelante, onde, quando a composição é armazenada durante um periodo de cerca de 24 semanas a uma temperatura de cerca de 40°C, a redução entre uma área de pico do cromatograma agregada para a composição e uma área de pico do cromatograma agregada para uma composição de outro modo idêntica, carecendo do agente quelante, que é armazenada porum período de cerca de 24 semanas a uma temperatura de cerca de 40°C, é de pelo menos cerca de 2%, onde após a composição ser armazenada por um período de cerca de 24 semanas a uma temperatura de cerca de 40°C, a composição permanece substancialmente límpida e incolor.

A presente invenção também proporciona uma composição compreendendo pelo menos um anticorpo compreendendo uma seqüência de aminoácido que é pelo menos 90% idêntica a uma seqüência de aminoácido de cadeia pesada mostrada em SEQ ID NO: 2, compreendendo ainda uma seqüência de aminoácido que é pelo menos 90% idêntica a uma seqüência de aminoácido de cadeia leve mostrada em SEQ ID NO: 4, onde o anticorpo liga-se a um CTLA-4 humano; e um agente quelante, onde, quando a composição é armazenada durante um período de cerca de 24 semanas a uma temperatura de cerca de 40 °C, a redução entre uma área de pico do cromatograma agregada para a composição e uma área de pico do cromatograma agregada para uma composição de outro modo idêntica, carecendo do agente quelante, que é armazenada pori um período de cerca de 24 semanas a uma temperatura de cerca* de 40 °C, é de pelo menos cerca de 2%, onde quando a composição é armazenada por um período de cerca de 24. semanas a uma temperatura de cerca de 40 °C, a oxidação percentual total de resíduos metionina na posição 432 do aminoácido é reduzida em uma proporção igual ou maior que. -2,2%, conforme determinado após digestão enzimática . com Endopeptidase Lisil, seguido por separação com HPLC de fase reversa, quando comparado com os anticorpos numa composiçãoque é isenta de um agente quelante.

A presente invenção também proporciona uma composição compreendendo pelo menos um anticorpo compreendendo uma seqüência de aminoácido que é pelo menos 90% idêntica a uma seqüência de aminoácido de cadeia pesada mostrada em SEQ ID NO: 2, compreendendo ainda uma seqüência de aminoácido que é pelo menos 90% idêntica a uma seqüência de aminoácido de cadeia leve mostrada em SEQ ID NO: 4, onde o anticorpo liga-se a um CTLA-4 humano; e um agentequelante, onde, quando a composição é armazenada durante um periodo de cerca de 24 semanas a uma temperatura de cerca de 40°C, a redução entre uma área de pico do cromatograma agregada para a composição e uma área de pico do cromatograma agregada para uma composição de outro modo idêntica, carecendo do agente quelante, que é armazenada por um periodo de cerca de 24 semanas a uma temperatura de cerca de 40 °C, é de pelo menos cerca de 2%, onde quando a composição é armazenada por um periodo de cerca de 24 semanas a uma temperatura de cerca de 40°C, a oxidaçãopercentual total de residuos metionina na posição 256 do aminoácido é reduzida em uma proporção igual ou maior que 4,2%, conforme determinado após digestão enzimática com Endopeptidase Lisil, seguido por separação com HPLC de fase reversa, quando comparado com os anticorpos numa composição que é isenta de um agente quelante.

A presente invenção também proporciona uma composição compreendendo pelo menos um anticorpo consistindo, essencialmente, de uma seqüência de aminoácidoque é pelo menos 90% idêntica a uma seqüência de aminoácido de cadeia pesada mostrada em SEQ ID NO: 2, consistindo ainda, essencialmente, de uma seqüência de aminoácido que é pelo menos 90% idêntica a uma seqüência de aminoácido de cadeia leve mostrada em SEQ ID NO: 4, onde o anticorpo liga-se a um CTLA-4 humano; e um agente quelante.

A presente invenção também proporciona uma composição compreendendo pelo menos um anticorpo consistindo de uma seqüência de aminoácido que é pelo menos 90% idêntica a uma seqüência de aminoácido de cadeia pesada mostrada em SEQ ID NO: 2, consistindo ainda, de uma seqüência de aminoácido que é pelo menos 90% idêntica a uma seqüência de aminoácido de cadeia leve mostrada em SEQ ID NO: 4, onde o anticorpo liga-se a um CTLA-4 humano; e um agente quelante.

A presente invenção também proporciona um método para preparar uma composição farmacêutica liquida estável, compreendendo a mistura de anticorpos monoclonais anti-CTLA-4 com um agente quelante farmaceuticamente aceitável numa quantidade que reduz a instabilidade do anticorpo, onde, quando a composição é armazenada durante um período de cerca de 24 semanas a uma temperatura de cerca de 40 °C, a redução entre uma área de pico do cromatograma agregada para a composição farmacêutica liquida estável compreendendo anticorpos monoclonais anti-CTL4 e o agente quelante, e uma área de pico do cromatograma agregada para uma composição de outro modo idêntica, carecendo do agente quelante, que é armazenada por um período de cerca de 24 semanas a uma temperatura de cerca de 40°C, é de pelo menos cerca de 2%.A presente invenção também proporciona um método para estabilizar anticorpos monoclonais anti-CTLA-4 numa composição farmacêutica liquida, compreendendo formar uma composição liquida compreendendo os anticorpos e um agente quelante farmaceuticamente aceitável, onde, quando a composição é armazenada durante um periodo de cerca de 24 semanas a uma temperatura de cerca de 40°C, a redução entre uma área de pico do cromatograma agregada para a composição farmacêutica liquida estável compreendendo anticorpos monoclonais anti-CTL4 e o agente quelante; e uma área de pico do cromatograma agregada para uma composição de outro modo idêntica, carecendo do agente quelante, que é armazenada por um periodo de cerca de 24 semanas a uma temperatura de cerca de 40°C, é de pelo menos cerca de 2%.

A presente invenção também proporciona um método de tratamento de uma condição neoplásica num indivíduo, compreendendo a administração ao indivíduo de uma composição farmacêutica liquida composta de: uma quantidade terapeuticamente eficaz do anticorpo monbclonal anti-CTLA-4 ticilimumab; e um agente quelante farmaceuticamente aceitável.

A presente invenção também proporciona um método de tratamento de uma condição neoplásica num indivíduo, compreendendo a administração ao indivíduo de uma composição farmacêutica liquida composta de: uma quantidade terapeuticamente eficaz do anticorpo monoclonal anti-CTLA-4 ticilimumab; e um agente quelante farmaceuticamente aceitável, onde a composição é administrada ao indivíduo,intravenosamente.

A presente invenção também proporciona um método de tratamento de uma condição neoplásica num individuo, compreendendo a administração ao individuo de uma composição farmacêutica liquida composta de: uma quantidade terapeuticamente eficaz do anticorpo monoclonal anti-CTLA-4 ticilimumab; e um agente quelante farmaceuticamente aceitável, onde o individuo está em necessidade de tratamento de uma condição neoplásica .

A presente invenção também proporciona um método de tratamento de uma condição neoplásica num individuo, compreendendo a administração ao individuo de uma composição farmacêutica liquida composta de: uma quantidade terapeuticamente eficaz do anticorpo monoclonal anti-CTLA-4 ticilimumab; e um agente quelante farmaceuticamente aceitável.

Onde a condição neoplásica é um câncer, selecionado do grupo consistindo de câncer cerebral, de célula escamosa, da bexiga, gástrico, pancreático, de mama, de cabeça, de pescoço, esofágico, da próstata, colo-retal, do pulmão, renal, do rim, ovariano, ginecológico e da tireóide.

A presente invenção também proporciona um kit para preparar uma composição liquida de um anticorpo estabilizado, compreendendo: um primeiro recipiente compreendendo o anticorpo monoclonal anti-CTLA-4 ticilimumab em solução, e um segundo recipiente compreendendo um agente quelante farmaceuticamente aceitável.A presente invenção também proporciona um artigo de manufatura compreendendo um recipiente que encerra uma mistura de pelo menos um anticorpo anti-CTLA-4 com as seqüências de aminoácido de cadeias pesada e leve de ticilimumab, e um agente quelante.

A presente invenção também proporciona uma composição farmacêutica liquida compreendendo anticorpos monoclonais anti-CTLA-4 e um agente quelante farmaceuticamente aceitável, onde a concentração molar dos anticorpos varia de cerca de 0,000 6 milimolar a cerca de 1,35 milimolar e a concentração molar do agente quelante varia de cerca de 0,003 milimolar a cerca de 50 milimolar, e onde a relação molar dos anticorpos para agente quelante varia de cerca de 0,00001 a cerca de 450.

A presente invenção também proporciona uma composição farmacêutica liquida compreendendo anticorpos monoclonais anti-CTLA-4 e um agente quelante farmaceuticamente aceitável, onde a concentração molar dos anticorpos varia de cerca djs 0,0006 milimolar a cerca de 1,35 milimolar e a concentração molar do agente quelante varia de cerca de 0,003 milimolar a cerca de 50 milimolar, e onde a relação molar dos anticorpos para agente quelante varia de cerca de 0,00001 a cerca de 450, onde os anticorpos compreendem anticorpos monoclonais anti-CTLA-4 com as seqüências de aminoácido de cadeia pesada e cadeia leve do anticorpo ticilimumab.

A presente invenção também proporciona uma composição farmacêutica liquida compreendendo anticorposmonoclonais anti-CTLA-4 e um agente quelante farmaceuticamente aceitável, onde a concentração molar dos anticorpos varia de cerca de 0,0006 milimolar a cerca de 1,35 milimolar e a concentração molar do agente, quelante varia de cerca de 0,003 milimolar a cerca de 50 milimolar, e onde a relação molar dos anticorpos para agente quelante varia de cerca de 0,00001 a cerca de 100.

A presente invenção também proporciona uma composição farmacêutica liquida compreendendo anticorpos monoclonais anti-CTLA-4 e um agente quelante farmaceuticamente aceitável, onde a concentração molar dos anticorpos varia de cerca de 0,000 6 milimolar a cerca de 1,35 milimolar e a concentração molar do agente quelante varia de cerca de 0,003 milimolar a cerca de 50 milimolar, e onde a relação molar dos anticorpos para agente quelante varia de cerca de 0,001 a cerca de 10.

A presente invenção também proporciona uma composição farmacêutica liquida compreendendo anticorpos monoclonais anti-CTü.A-4 e um agente quelante farmaceuticamente aceitável, onde a concentração molar dos anticorpos varia de cerca de 0,0006 milimolar a cerca de 1,35 milimolar e a concentração molar do agente quelante varia de cerca de 0,003 milimolar a cerca de 50 milimolar, e onde a relação molar dos anticorpos para agente quelante varia de cerca de 0,1 a. cerca de 1.

A presente invenção também proporciona uma composição farmacêutica liquida compreendendo anticorpos monoclonais anti-CTLA-4 e um agente quelantefarmaceuticamente aceitável, onde a concentração molar dos anticorpos varia de cerca de 0,0006 milimolar a cerca de 1,35 milimolar e a concentração molar do agente quelante varia de cerca de 0,003 milimolar a cerca de 50 milimolar, e onde a relação molar dos anticorpos para agente quelante varia de cerca de 0, 00001 a cerca de 450, onde a relação molar dos anticorpos para agente quelante é cerca de 0,5.

A presente invenção também proporciona uma composição farmacêutica liquida compreendendo pelo menos um anticorpo monoclonal anti-ctla, onde o anticorpo liga-se a CTLA-4 humano e um agente quelante.

A presente invenção também proporciona uma composição farmacêutica compreendendo pelo menos um anticorpo compreendendo uma seqüência de aminoácido que é pelo menos 95% idêntica a uma seqüência de aminoácido de cadeia pesada mostrada em SEQ ID NO: 2, compreendendo ainda uma seqüência de aminoácido que é pelo menos 95% idêntica a uma seqüência de aminoácido de cadeia leve mostrada em SEQ ID NO: 4, onde; o anticorpo liga-se a CTLA-4 humano; e um excipiente farmaceuticamente aceitável onde a composição contém uma concentração do anticorpo que é pelo menos cerca de 10 mg/mL.

A presente invenção também proporciona uma composição farmacêutica compreendendo pelo menos um anticorpo compreendendo uma seqüência de aminoácido que é pelo menos 95% idêntica a uma seqüência de aminoácido de cadeia pesada mostrada em SEQ ID NO: 2, compreendendo ainda uma seqüência de aminoácido que é pelo menos 95% idêntica auma seqüência de aminoácido de cadeia leve mostrada em SEQ ID NO: 4, onde o anticorpo liga-se a CTLA-4 humano; e um excipiente farmaceuticamente aceitável onde a composição contém uma concentração do anticorpo que varia de cerca de 10 mg/mL a cerca de 25 mg/mL.

A presente invenção também proporciona . uma composição farmacêutica compreendendo pelo menos um anticorpo compreendendo uma seqüência de aminoácido que é pelo menos 95% idêntica a uma seqüência de aminoácido de cadeia pesada mostrada em SEQ ID NO: 2, compreendendo ainda uma seqüência de aminoácido que é pelo menos 95% idêntica a uma seqüência de aminoácido de cadeia leve mostrada em SEQ ID NO: 4, onde o anticorpo liga-se a CTLA-4 humano; e um excipiente farmaceuticamente aceitável onde a composição contém uma concentração do anticorpo que varia de cerca de 10 mg/mL a cerca de 2 00 mg/mL.

A presente invenção também proporciona uma composição farmacêutica compreendendo pelo menos um anticorpo i compreendendo uma seqüência de aminoácido que é pelo menos 95% idêntica a uma seqüência de aminoácido de cadeia pesada mostrada em SEQ ID NO: 2, compreendendo ainda uma seqüência de aminoácido que é pelo menos 95% idêntica a uma seqüência de aminoácido de cadeia leve mostrada em SEQ ID NO: 4, onde o anticorpo liga-se a CTLA-4 humano; e umexcipiente farmaceuticamente aceitável onde a composição contém umá concentração do anticorpo que é de cerca de 20 mg/mL.

A presente invenção também proporciona umacomposição compreendendo: pelo menos um agente que1ante, e pelo menos um anticorpo compreendendo: uma seqüência de aminoacido que é pelo menos 90% idêntica a uma seqüência de aminoacido de cadeia pesada mostrada em SEQ ID NO: 2; uma seqüência de aminoacido que é pelo menos 90% idêntica a uma seqüência de aminoacido de cadeia leve mostrada, em SEQ ID NO: 4, onde o anticorpo liga-se a CTLA-4.

A presente invenção também proporciona uma composição compreendendo: pelo menos um agente quelante, e pelo menos um anticorpo compreendendo: uma seqüência de aminoacido que é pelo menos 90% idêntica a uma seqüência de aminoacido de cadeia pesada mostrada em SEQ ID NO: 2; uma seqüência de aminoacido que é pelo menos. 90% idêntica a uma seqüência de aminoacido de cadeia leve mostrada em SEQ ID NO: 4, onde o anticorpo liga-se a CTLA-4, onde o anticorpo compreende um anticorpo anti-CTLA-4 de IgG2 monoclonal com as seqüências de aminoacido de cadeia leve e pesada de ticilimumab.

A presente invenção também proporciona um método para preparar uma composição farmacêutica liquida compreendendo a mistura de pelo menos um anticorpo anti-cTLA-4 com as seqüências de aminoacido de cadeias pesada e leve de ticilimumab em solução, com pelo menos um agente quelante.

A presente invenção também proporciona um método para tratamento de uma condição neoplásica num indivíduo, compreendendo a administração ao indivíduo, de uma composição farmacêutica liquida compreendendo: umaquantidade terapeuticamente eficaz de pelo menos um anticorpo anti-cTLA-4 com as seqüências de aminoácido de cadeia pesada e leva de ticilimumab, e um agente quelante farmaceuticamente aceitável.

A presente invenção também proporciona um kit para preparar uma composição liquida de um anticorpo estabilizado compreendendo: um primeiro recipiente composto por pelo menos um anticorpo anti-CTLA-4 com as seqüências de aminoácido de cadeias pesada e leve de ticilimumab em solução, e um segundo recipiente composto de um agente quelante farmaceuticamente aceitável.

A presente invenção também proporciona uma composição farmacêutica liquida compreendendo: pelo um anticorpo compreendendo: uma seqüência de aminoácido que é pelo menos 95% idêntica a uma seqüência de aminoácido de cadeia pesada mostrada em SEQ ID NO: 2; e compreendendo ainda, uma seqüência de aminoácido que é pelo menos 95% idêntica a uma seqüência de aminoácido de cadeia leve i mostrada em SEQ ID NO: 4, onde o anticorpo liga-se a CTLA-4 humano; e um excipiente farmaceuticamente aceitável onde a composição contém uma concentração de anticorpo que é de pelo menos cerca de 10 mg/mL.

DESCRIÇÃO SUCINTA DOS DESENHOS

A Figura 1 é um gráfico de barras mostrando a 25 agregação percentual em várias formulações de teste após armazenagem a 40 °C por até 7 semanas por cromatograf ia de exclusão por tamanho (SEC);

A Figura 2 é um gráfico de barras mostrando apercentagem total (hidrolítica) de formação de impurezas em varais formulações de teste após armazenagem a 40°C por até 7 semanas por SDSPAGE reduzida (rSDSPAGE);

A Figura 3 é um gráfico linear mostrando a agregação percentual em varias formulações de teste na armazenagem sob condições aceleradas a 40°C por até 24 semanas por SEC;

A Figura 4 é um gráfico linear mostrando a percentagem total (hidrolitica) de formação de impurezas em várias formulações de teste na armazenagem sob condições aceleradas a 40°C por até 24 semanas por rSDSPAGE;

A Figura 5 é um gráfico linear mostrando a agregação percentual em varias formulações de teste na armazenagem sob condições aceleradas a 40 °C por até 24 semanas por SEC;

A Figura 6 é um gráfico linear mostrando a percentagem total (hidrolitica) de formação de impurezas em várias formulações de teste na armazenagem sob condições aceleradas a 40°C por até 24 semanas por rSDSPAGE;

A Figura 7 é um gráfico de barras mostrando a agregação percentual em várias formulações de teste como uma função do nivel de EDTA na armazenagem sob condições aceleradas a 40°C por até 24 semanas, por SEC;

A Figura 8 é um gráfico de barras mostrando a percentagem total (hidrolitica) de formação de impurezas em várias formulações de teste como uma função do nivel de EDTA na armazenagem sob condições aceleradas a 40°C por até 24 semanas por rSDSPAGE;A Figura 9 é um gráfico linear mostrando a agregação percentual em varias formulações de teste na armazenagem sob condições aceleradas a 40 ° C por até 13 semanas por SEC;

A Figura 10 é um gráfico de barras mostrando a percentagem total (hidrolitica) de formação de impurezas em várias formulações de teste desde a armazenagem sob condições aceleradas a 40 °C por até 13 semanas por rSDSPAGE; e

A Figura 11 compreendendo as Figuras 1IA-11D, mostra as seqüências de aminoácido e de nucleotideo para anticorpo anti-CTLA-4 11.2.1 agora referido como ticilimumab. A Figura 11A mostra a seqüência de nucleotideo de comprimento total para cadeia pesada 11.2.1 (SEQ ID NO: 1). Figura 11B mostra a seqüência de aminoácido de comprimento total para a cadeia pesada 11.2.1 (SEQ ID NO: 2) e a seqüência de aminoácido para a região variável de cadeia pesada 11.2.1 como indicado entre colchetes " [ ] " (SEQ ID NO: 5). A seqüência de aminoácido de cada CDR de cadeia pesada 11.2.1 está sublinhada. As seqüências CDR são como segue: CDR1: GFTFSSYBJH (SEQ ID NO: 7), CDR2: VIWYDGSNKYYADSV (SEQ ID NO: 8) e CDR3: DPRGATLYYYYYGMDV (SEQ ID NO: 9) . A Figura 11 C mostra a seqüência de nucleotideo para a cadeia leve 11.2.1 (SEQ ID NO: 3). Figura 11D mostra a seqüência de aminoácido da cadeia leve 11.2.1 de comprimento total (SEQ ID NO: 4) e a região variável de cadeia leve como indicado entre colchetes (SEQ ID NO: 6). A seqüência de aminoácido de cada CDR está indicada comosegue: CDR1: RASQSINSYLD (SEQ ID NO: 10); CDR2: AASSLQS (SEQ ID NO: 11); e CDR3: QQYYSTPFT (SEQ ID NO: 12).

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

Os métodos e técnicas da presente invenção são realizados em geral, de acordo com os métodos convencionais conhecidos da técnica conforme descrito em varias referencias genéricas e mais especificas que são mencionadas e discutidas por todo o presente relatório, a menos que indicado diferentemente. Ver por exemplo, Sambrook et la., Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2a. ed, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y (1989) e Ausubel et al, Current Protocxols in Molecular Biology , Greene Publishing Associates (1992) e Harlow and Lane Antibodies: A Laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y (1990) . Reações enzimáticas e técnicas de purificação são realizadas de acordo com as recomendações do fabricante, como normalmente feito na técnica ou como aqui descrito. As nomenclaturas empregadas em conexão com, e os procedimentos e técnicas laboratoriais de quimica analítica, química orgânica sintética, e quimica medicinal e farmacêutica aqui descritos, são os do conhecimento prático na técnica. Técnicas padrão só as usadas para sinteses quimicas, análises quimicas, preparação farmacêutica, formulações e, distribuição e tratamento de indivíduos.

Definições:

De modo a auxiliar no entendimento da seguinte descrição detalhada, são fornecidas as seguintes definições:Como aqui empregado, os termos "formulações" ou "composição" como se referindo a um anticorpo anti-CTLA-4 pretendem descrever o anticorpo em combinação com um excipiente farmaceuticamente aceitável compreendendo um agente quelante. Por exemplo, as formulações da invenção têm uma vida em prateleira melhorada e/ou estabilidade, quando comparadas com as formulações reconhecidas na técnica.

Como aqui empregado, o termo "anticorpo" refere-se a um anticorpo intato ou uma parte de ligação ao antigeno que compete com o anticorpo intato para ligação especifica. Ver genericamente, Fundamental Immunology, Cap. 7 (Paul. W. 2a. ed. Ed. Raven Press, N.Y (1989). Partes de ligação ao antigeno podem ser produzidas por técnicas de DNA recombinantes ou por clivagem enzimática ou quimica de anticorpos intatos. Em algumas modalidades, partes de ligação ao antigeno incluem FAb, FAb', F(ab')2/ Fd, Fc, dAb e fragmentos da região determinante de complementaridade (CDR), anticorpos de cadeia simples, (scFv), anticorpos quiméricos, diacorpos e polipeptideos que contém pelo menos uma parte de um anticorpo que é suficiente para conferir ligação antigeno-especifica ao polipeptideo. Do N-terminal ao C-terminal, ambos os domínios variáveis de cadeia leve e pesada maduros compreendem as regiões FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 e FR4. A cessão dos aminoácidos a cada domínio está de acordo com as definições de Kabat, Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of health, Bethesda, Md. (1987 e 1991)), Chothia & Lesk, J.Mol. Biol. 196.901-917 (1987) of Chothia et al., Nature 342:878-883 (1989).

Como aqui empregado, o termo "polipeptídeo"abrange proteínas nativas ou artificiais, fragmentos de proteina e análogos de polipeptideo de uma seqüência de proteina. Um polipeptideo pode ser monomérico ou polimérico.

Como aqui empregado um fragmento Fd significa um fragmento de anticorpo consistindo dos dominios VH e CH1, um fragmento Fv consiste dos dominios VL e VH de um único braço de um anticorpo; e um fragmento dAb (Ward et al., Nature 341:544-546 (1989)0 consiste de um dominio VH.

O termo "ou uma parte de ligação ao antigeno do mesmo" quando empregado com o termo "anticorpo" refere-se a um polipeptideo que tem uma deleção amino-terminal e/ou carboxi-termina1, mas onde a seqüência de aminoácido restante é idêntica às posições correspondentes na seqüência de ocorrência natural. Em algumas modalidades, os fragmentos são pelo menos 5, 6, 8 ou 10 aminoacidos em comprimento. Em outras modalidades, os fragmentos dão pelo menos 14, pelo menos 20, pelo menos 50, ou pelo menos 70, 80, 90, 100, 150, ou 200 aminoacidos em comprimento.

Como aqui empregado, o termo "anticorpo monoclonal" refere-se a um anticorpo obtido de uma população de anticorpos substancialmente homogêneos, ou seja, os anticorpos individuais compreendendo a população são idênticos, como exceção para possíveis mutações que ocorrem naturalmente, que podem estar presentes em menor quantidade ou carecendo de um lisina C-terminal. Anticorposmonoclonais são altamente específicos, estando direcionados contra um único sítio antigênico. Além disso, em contraste com as preparações de anticorpo convencionais (policlonais), que incluem tipicamente, diferentes anticorpos, direcionados contra diferentes determinantes, (epitopos), cada anticorpo monoclonal é direcionado contra um único determinante no antígeno. 0 "monoclonal" modificador indica o caráter o anticorpo como sendo obtido de uma população de anticorpos substancialmente homogênea e não deve ser construído como necessitando da produção do anticorpo por qualquer método particular. Por exemplo, os anticorpos monoclonais para uso de acordo com a presente invenção podem ser produzidos pelo método do hibridoma primeiramente descrito por Kohler, et al., Nature 256:495 (1975), ou podem ser produzidos por métodos de DNA recombinante (ver por exemplo,Patente U.S. 4.816.567). Os "anticorpos monoclonais" podem também ser isolados de bibliotecas de anticorpo de f ago usando as técnicas descritas em Clackson et al., Nature 352:624-628 (1991) e Marks, et al., J. Mol. Biol 222:581-597 (1991), por exemplo.

Como aqui empregado, os termos "anticorpo isolado" ou anticorpo purificado" refere-se a um anticorpo que, em virtude de sua origem ou fonte de derivação, possui de um a quatro dos seguintes: (1) não está associado com componentes naturalmente associados que o acompanham em seu estado nativo, (2) é isento de outras proteínas da mesma espécie,(3) é expressado por uma célula de espécies diferentes, ou (4) não ocorre na natureza. Portanto, um anticorpo que équimicamente sintetizado ou sintetizado num sistema celular diferentes da célula da qual ele se origina naturalmente, é isolado e purificado de seus componentes naturalmente associados. Um anticorpo pode também ser tornado

substancialmente isento de componentes naturalmente associados por isolamento e purificação, usando técnicas de purificação do conhecimento da técnica.

Exemplos de anticorpo isolados/purificados incluem um anticorpo anti-CTLA-4 que foi purificado por afinidade usando CTLA-4, um anticorpo anti-CTLA-4 que foi sintetizado por um hibridoma ou outra linhagem de célula in vitro, e um anticorpo anti-CTLA-4 humano derivado de um camundongo transgênico.

Exemplos de anticorpos isolados/purificados incluem um anticorpo anti-CTLA-4 que foi purificado por afinidade usando CTLA-4, um anticorpo anti-CTLA-4 que foi sintetizado por um hibridoma ou outra linhagem de célula in vitro, e um anticorpo anti-CTLA-4 humano derivado de um camundongo transgênico. Assim, em modalidades preferidas, os anticorpos anti-CTLA-4 têm uma pureza de pelo mienos cerca de 95% peso/peso - peso de anticorpos anti-CTLA-4/peso dos componentes diferentes dos excipientes farmaceuticamente aceitáveis) e, em outras modalidades, os anticorpos anti-CTLA-4 têm uma pureza de cerca de 95% peso/peso a cerca de 99,5% peso/peso.

Um anticorpo é "substancialmente puro", substancialmente homogêneo" ou "substancialmente purificado" quando pelo menos cerca de 60 a 75% de uma amostra apresenta uma única espécie de anticorpo. O anticorpo pode sermonomérico ou multimérico. Um anticorpo substancialmente puro, pode, tipicamente compreender cerca de 50%, 60%, 70%, 80%, ou 90% peso.peso de uma amostra de anticorpo, mais normalmente, cerca de 95%, e preferivelmente, será acima de 99% puro. A pureza ou homogeneidade do anticorpo pode ser indicada por uma serie de meios, do conhecimento da técnica, tais como eletroforese de gel em poliacrilamida de uma amostra de anticorpo, seguido por visualização de uma única faixa de polipeptideo com manchamento do gel com técnica de manchamento do conhecimento da técnica. Para algumas finalidades, a maior resolução pode ser conseguida mediante uso de HP1C ou outro meio do conhecimento da técnica para purificação.

Como aqui empregado, o termo "anticorpo humano" destina-se a incluir anticorpos com regiões variáveis e constantes derivadas de seqüências de imunoglobulina de linhagem germinativa humana. Os anticorpos humanos da invenção podem incluir residuos de aminoácido não codificados pelas seqüências de imunoglobulina dê linhagem germinativa humana (por exemplo, mutações introduzidas por mutagênese especifica ao sitio ou aleatória in vitro ou por mutação somática in vivo), por exemplo, nas CDRs e em particular, CDR3. Contudo, o termo "anticorpo humano" conforme aqui empregado, não se destina a incluir anticorpos em que as seqüências da CDR derivadas da linhagem germinativa ou de outras espécies de mamífero, tais como um camundongo, foram enxertadas sobre seqüências de quadro genético humano.Como aqui empregado, o termo "anticorpo humano recombinante" destina-se a incluir todos os anticorpos humanos que são preparados, expressados, criados ou isolados por meios recombinantes, tais como anticorpos expressados usando um vetor de expressão recombinante transfectado numa célula hospedeira, anticorpos isolados de uma biblioteca de anticorpo humano recombinante, combinatória, anticorpos isolados de um animal (por exemplo, um camundongos) que é transgênico para genes de imunoglobulina humana (ver por exemplo, Taylor, L.D., et al. , (1992), Nucl Acids Res 20:6287-6295) ou anticorpos preparados, expressados, criados ou isolados por quaisquer outros meios, que envolvem a divisão de seqüências genéticas de imunoglobulina humana para outras seqüências de DNA. Tais anticorpos humanos recombinantes têm regiões variáveis e constantes, derivadas de seqüências de imunoglobulina de linhagem germinativa humana. Em algumas modalidades, contudo, tais anticorpos humanos recombinantes, são submetidos a mutagênese in vitro (ou, quando um animal transgênico para seqüências de Ig humana é usado, mutagênese somática in vivo) e assim, as seqüências de aminoácido das regiões VH e VL dos anticorpos recombinantes são seqüências que, embora, derivadas de seqüências VH e VL de linhagem germinativa humana e a elas relacionadas, podem não existir naturalmente dentro do repertório de linhagem germinativa do anticorpo humano in vivo.

Como aqui empregado, o termo "polinucleotideo" ou "ácido nucléico" significa um polinucleotideo de origemgenômica, cDNA, ou sintética ou alguma combinação destes, que, em virtude de sua origem ou fonte de derivação, o polinucleotideo isolado possui um a três dos seguintes: (1) não está associado com toda ou uma parte de um polinucleotideo com a qual o "polinucleotideo isolado" é encontrado na natureza, (2) é operativamente ligado a um polinucleotideo ao qual ele não está ligado in natura, ou (3) não ocorre na natureza como parte de uma seqüência maior.

Como aqui empregado, o termo "nucleotideos de ocorrência natural" inclui desoxirribonucleotideos e ribonucleotideos. O termo "nucleotideos modificados" como aqui empregado, inclui nucleotideos com grupos açúcar modificado ou substituído e similar. O termo "ligações de oligonucleotideo" referidas aqui inclui ligações de oligonucleotideos tais como fosforotioato, fosforoditioato, fosforoselenoato, fósforo-di-selenoato, fosforoanilotioato, fosforaniladato, fosforoamidato, e similar. Ver, por exemplo, Laplanche et al., Nucl. Acids Res 14:9081 (1986); Stec, et al., J. Am. Chem. Soe. 106':6077 (1984); Stein et al., Nucl Acids Res. 16:3209 (1988); Zon et al., Anti-Cancer drug Design 6:539 (1991); Zon t al., Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach pág. 87-108 (F. Eckstein, Ed. Oxford University Press, Oxford England (9191)), Patente U.S. n°. 5.151.510; Uhlmann e Peyman, Chemical Reviews 90:543 (1990), cujas revelações estão ora incorporadas por referência. Um oligonucleotideo pode incluir um rótulo para detecção, caso desejado.Seqüências "operativamente ligadas" incluem tanto seqüências de controle de expressão, que são adjacentes ao gene de interesse e seqüências de controle de expressão que atuma em trans ou a uma distancia para controle do gene de interesse. 0 termo "seqüência de controle de expressão" como aqui empregado, significa seqüências de polinucleotideo que são necessárias para realizar a expressão e processamento das seqüências de codificação as quais elas são ligadas. Seqüências de controle de expressão incluem seqüências de iniciação de transcrição apropriada, de terminação, promotora e incentivadora; sinais de processamento de RNA eficientes, tais como sinais de emenda de genes e poliadenilação; seqüências que estabilizam mRNA citoplasmático; seqüências que incentivam a eficiência de tradução (por exemplo, seqüência de consenso Kozak); seqüências que incentivam estabilidade de proteina; e quando desejado, seqüências que intensificam a seqüência de proteina. A natureza de tais seqüências de controle é diferente, dependendo do organismo hospedeiro; em procariontes, tais seqüências de controle incluem, geralmente, seqüência promotora, seqüência do sitio de ligação ribossomai, e seqüência de terminação da transcrição; em eucariontes, geralmente tais seqüências de controle incluem seqüência promotora e de terminação da transcrição. 0 termo "seqüências de controle" destina-se a incluir, no minimo, todos os componentes cuja presença é essencial para a expressão e processamento, e também podem incluir componentes adicionais cuja presença é vantajosa,por exemplo, seqüências lider e seqüências parceiras de fusão.

Como aqui empregado, o termo "vetor" significa uma molécula de ácido nucléico capaz de transportar um outro ácido nucléico ao qual ele foi ligado. Em algumas modalidades, o vetor é um plasmideo, ou seja, um laço de DNA de fita dupla circular, ao qual segmentos adicionais de DNA podem ser ligados. Em algumas modalidades, o vetor é um vetor viral, onde segmentos de DnA adicionais podem ser ligados ao genoma viral. Em algumas modalidades, os vetores são capazes de replicação autônoma, numa célula hospedeira para a qual eles são introduzidos (por exemplo, vetores bacterianos com uma origem bacteriana de replicação e vetores mamíferos epissornais). Em algumas modalidades, osvetores (por exemplo, vetores de mamíferos não epissomais) podem ser integrados ao genoma de uma célula hospedeira com introdução à célula hospedeira, e dai serem replicados juntamente com o genoma hospedeiro. Além disso, alguns vetores são capazes de direcionar a expressão de genes aos quais eles soa operativamente ligados. Tais vetores são referidos aqui como "vetores de expressão recombinante" (ou simplesmente, vetores de expressão ).

Como aqui empregado, os termos "célula hospedeira recombinantes" (ou simplesmente "célula hospedeira")significa uma célula na. qual foi introduzido um vetor de expressão recombinante. Deve ficar entendido que, "célula hospedeira recombinante" e "célula hospedeira" significa não apenas a célula individual particular, mas também adescendência dessa célula. Devido a algumas modificações poderem ocorrer em gerações sucessivas devido a, ou influências mutacionais ou ambientais, tal descendência pode não ser, de fato, idêntica à célula de origem, mas ainda assim, estão incluídas no escopo do termo "célula hospedeira"conforme aqui empregado.

Como aqui empregado, os termos "capaz de ligação especifica" refere-se ao fato de um anticorpo ligar-se a um antigeno com uma constante de dissociação que é < 1 jaM, preferivelmente, < 1 nM e mais preferivelmente, < 10 pM.

Como aqui empregado, os termos "hibridiza seletivamente" significa a ligação detectável e especifica. Polinucleotideos, oligonucleotideos, e seus fragmentos de acordo com a invenção hibiridizam seletivamente, para fitasde ácido nucléico sob condições de hibridização e lavagem, que minimizam quantidades apreciáveis de ligação detectável a ácidos nucléicos não específicos. Condições "altamente rigorosas" ou "de grande rigorosidade" podem ser usadas para se conseguir hibridização seletiva como é do conhecimento da técnica e aqui descrito. Um exemplo de condição de "alta rigorosidade"ou "altamente rigorosa" é a incubação de um polinucleotideo com um outro polinucleotideo onde um polinucleotideo pode ser fixo a uma superfície sólida como uma membrana, num tampão de hibridização de 6X SSPE ou SSC,50% formamida, reagente de Denhardt 5X, SDS 0,5%, 100 jig/mL de DNA de esperma de salmão desnaturado, fragmentado a uma temperatura de hibridização de 42 °C durante 12-16 horas, seguido por duas lavagens a 55 °C, usando um tampão delavagem de IX SSC , SDS a 0,5%. Ver também Sambrook et. al. supra, págs.9.50-9.55.

O termo "identidade da seqüência percentual" no contexto das seqüências de ácido nucléico significa o percentual de residuos, quando uma primeira seqüência adjacente é comparada e alinhada para correspondência máxima a uma segunda seqüência adj acente. A extensão da comparação de identidade da seqüência pode ser em um estiramento de pelo menos cerca de nove nucleotideos, normalmente de pelo menos cerca de 18 nucleotideos, mais comumente, pelo menos cerca de 24 nucleotideos, tipicamente pelo menos cerca de 28 nucleotideos, mais tipicamente pelo menos cerca de 32 nucleotideo, em, preferivelmente, pelo menos cerca de 36, 48 ou mais nucleotideos. Existe, uma série de diferentes algoritmos conhecidos na técnica que podem ser usados para se medir a identidade da seqüência de nucleotideo. Por exemplo, seqüências de polinucleotideo podem ser comparadas usando FASTA, Gap ou BESTFIT, que são programas em Wisconsin Package VERSÃO 10.0, Genetics Computer Group (GCG) Madison, Wisconsin, 'FASTA, que inclui, por exemplo, os programas FASTA 2 e FASTA 3, prove alinhamentos e identidade de seqüência percentual das regiões do melhor prolongamento entre as seqüências duvidosa e de investigação (Pearson, Methods Enzymol. 183:63-98 (1990); Pearson, Methods Mol. Biol. 132:185-219 (2000); Pearson Methods Enzymol 266:227-258 (1996); Pearson J. Mol. Biol. 276-71-84 (1998)). Amenos que de outro modo indicado, parâmetros de default para um dado programa de algoritmo são usados. Por exemplo, aidentidade da seqüência percentual entre seqüências de ácido nucléico pode ser determinada usando FASTA com seus parâmetros de default (um tamanho de palavra de 6 e o fator NOPAM para a matriz de marcação) , ou uso de Gap com seus parâmetros de default, conforme proporcionado na versão 6.1 de GCG.

Uma referência a uma seqüência de polinucleotideo ou ácido nucléico abrange seu complemento, a menos que de outro modo especificado. Assim, uma referência a um ácido nucléico com uma dada seqüência deve ser entendida como abrangendo sua fita complementar, com sua seqüência complementar.

0 termo "similaridade substancial" ou "similaridade de seqüência substancial", quando se referindo a um ácido nucléico ou um seu fragmento, significa que, quando otimamente alinhada com inserções ou deleções de nucleotideos apropriados, com um outro ácido nucléico ( ou sua fita complementar), há uma identidade de seqüência de nucledtideo em pelo menos cerca de 85%, preferivelmente, pelo menos cerca de 90%, e mais pref erivelmente, pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% das bases nucleotidicas, conforme medido por qualquer algoritmo bem conhecido da identidade da seqüência, tal como FASTA, BLAST ou Gap, conforme descrito supra. Como aplicado a polipeptideos, o termo "identidade substancial" "identidade percentual" ou "% idêntico" significa que, duas seqüências peptidicas, quanto otimamente alinhadas tal como pelos programas GAP ou BESTFIT usando pesos de intervalo de omissão fornecido com osprogramas, compartilhar pelo menos 70%, 75% ou 0% de identidade de seqüência, preferivelmente, pelo menos 90%, ou 95% de identidade de seqüência e mais preferivelmente, pelo menos 97%, 98%, ou 99% de identidade de seqüência. Em algumas modalidades, posições de residuo que não são idênticas diferem em substituições de aminoácido conservadoras. Uma "substituição de aminoácido conservadora" é uma em que um residuo de aminoácido é substituído por um outro residuo de aminoácido com um grupo R na cadeia lateral com propriedades quimicas similares, (por exemplo, carga ou hidrofobicidade). Em geral, uma substituição de aminoácido conservadora não mudará substancialmente as propriedades funcionais de uma proteina. Em casos em que duas ou mais seqüências de aminoácido sejam diferentes entre si, por substituições conservadoras, a identidade de seqüência percentual pode ser ajustada para cima para corrigir a natureza conservadora da substituição. Meios para fazer este ajuste são do conhecimento dos ;versados na técnica. ver, por exemplo, Pearson, Methods -Mol. Biol. 243L307-31 (1994). Exemplos de grupos de aminoácidos que têm cadeias laterais com propriedades .quimicas similares incluem (1) cadeias alifáticas laterais: glicina, alanina, valina, leucina e isoleucina; 2) cadeias laterais alifática-hidroxila: serina e treonina; 3) cadeias laterais contendo amida: asparagina e glutamina; 4) cadeias "laterais aromáticas: fenilalanina, tirosina e triptofano; 5) cadeias laterais básicas: lisina, arginina, e histidina; 6) cadeias laterais ácidas: ácido aspartico e ácido glutâmico e7) cadeias laterais contendo enxofre: cisteina e metionina.

Grupos de substituição de aminoácidos conservadores são valina-leucina-isoleucina, fenilalanina-tirosina, lisina-arginina, alanina-valina, glutamato-aspartato, e asparagina-glutamina.

A identidade da seqüência para polipeptideos, é tipicamente medida usando software de análise da seqüência. 0 software da análise de proteina combina seqüências usando medidas de similaridade atribuídas a varias substituições, deleções e outras modificações, incluindo substituições de aminoácido conservadoras. Por exemplo, GCG contém programas trais como "Gap" e "BESTFIT" que podem ser usados com parâmetros de omissão, como especificado com os programas, para determinar a homologia da seqüência ou identidade da seqüência entre polipeptideos estreitamente relacionados, tais como polipeptideos homólogos de diferentes espécies de organismos ou entre uma proteina do tipo selvagem e um mutante desta. Ver por exemplo, GCG Versão 6.1. Seqüências de polipeptideo também podem ser comparadas usando FASTA, usando parâmetros de omissão ou recomendados, ver GCG VERSÃO 6.1 (University of Wisconsin WI) FASTA (por exemplo, FASTA2 e FASTA3) proporciona alinhamentos e identidade de seqüência percentual das regiões de melhor sobreposição entre as seqüências duvidosa e indagadora (Pearson, Methods Enzymol. 183:63-98 (1990); Pearson Methods Mol. Biol. 132:185-219 (2000). Um outro algoritmo preferido quando comparando uma seqüência da invenção a uma base de dados contendo um grande número de seqüências de diferentes organismos é o programade computador BLAST, especialmente, blastp ou tblastn, usando parâmetros de default, conforme fornecido como os programas. Ver, por exemplo, Altschul et al., J- Mol. Biol. 215:403-410 (1990: Altschul et al., Nucleic Acids Res 25:3389-402 (1997). O comprimento das seqüências de polipeptideo comparada para homologia serão geralmente de pelo menos 16 resíduos de aminoácido, normalmente pelo menos cerca de 20 residuos, mais normalmente pelo menos cerca de 24 residuos, tipicamente pelo menos cerca de 28 residuos, e, preferivelmente, mais que cerca de 35 residuos. Quando da pesquisa de uma base de dados contendo seqüências de um grande número de diferentes organismo, prefere-se comparar seqüências de aminoácido.

Uma "quantidade terapeuticamente eficaz" refere-se a uma quantidade eficaz, a dosagens e durante periodos de tempo necessários para se conseguir o resultado terapêutico desejado, que inclui o tratamento ou prevenção profilática de condições neoplásicas. Deve-se observar, que os valores de dosagem podem variar com a gravidade da condição a seraliviada. Deve ficar entendido ainda, que para qualquer indivíduo particular, regimes de dosagem específicos devem ser ajustados com o tempo de acordo com a necessidade individual e julgamento profissional da pessoa que administra ou supervisiona a administração das composições, e que as faixas de dosagem aqui descrita, são exemplares apenas, não se destinando a limitar o escopo ou prática da composição reivindicada. similarmente, uma quantidade terapeuticamente eficaz do anticorpo ou parte do anticorpopodem variar de acordo com fatores tais como estado da doença, idade, sexo, e peso do indivíduo, a capacidade do anticorpo ou parte do anticorpo em extrair uma resposta desejada no indivíduo, e a via desejada de administração da formulação de anticorpo. Uma quantidade terapeuticamente eficaz também é uma tal que, quaisquer efeitos prejudiciais ou tóxicos do anticorpo ou parte do anticorpo são superados pelos efeitos terapeuticamente benéficos.

Como aqui empregado, o termo "indivíduo" para fins de tratamento inclui quaisquer indivíduos, e preferivelmente, é um indivíduo que está em necessidade do tratamento de uma condição neoplásica. Para fins de prevenção, o indivíduo é qualquer indivíduos, e pref erivelmente, é um indivíduo que está em risco para ou está predisposto desenvolver uma condição neoplásica. O termo indivíduo destina-se a incluir organismos vivos, por exemplo, procariontes e eucariontes. Exemplos de indivíduos incluem mamíferos, por exemplo, humanos, cães, vacas, cavalos, porcos, ovelha, cabras, gatos, camundongos, coelhos, ratos e animais não humanos transgênicos. Em modalidades especificas da invenção, o indivíduo é um ser humano.

Como aqui empregado, os termos "neoplasia" e "condições neoplásicas" usados permutavelmente aqui, refere-se a recente crescimento celular que resulta de uma perda de sensibilidade a controles de crescimento normal, por exemplo, a crescimento celular "neoplásico". Neoplasia também é empregado permutavelmente aqui com o termo "câncer"e para fins da presente invenção; câncer é um subtipo de neoplasia. Como aqui empregado, o termo "condiçãoneoplásica"também abrange outros anormalidades celulares, tais como hiperplasia, metaplasia e displasia. Os termos neoplasia, metaplasia, displasia e hiperplasia podem ser usados permutavelmente aqui e referem-se em geral, a células que experimental crescimento celular anormal.

Como aqui empregado, o termo "tratamento", refere-se a, tanto tratamento terapêutico, e profilático, ou medidas preventivas, onde o objeto é prevenir ou retardar (diminuir) a condição patológica visada. Aqueles que estão em necessidade de tratamento incluem os que já tem a condição, bem como aqueles propensos a ter a condição ou aqueles em que a condição deve ser evitada.

Quando da introdução de elementos da presente invenção ou das modalidades preferidas da mesma, os artigos, "um, uma", "o, a, os, as, e "referido"(a) , destinam-se a significar que existe um ou mais elementos. Os termos "compreendendo", "compreende", "incluindo" e "dotado de", com" destinam-se a ser inclusivos, significando que, pode existir elementos adicionais diferentes daqueles elementos relacionados.

Anticorpos Anti-CTLA-4:

De acordo com a presente invenção, descobriu-se que, a estabilidade de alguns anticorpos monoclonais anti-CTLA-4 que estão aqui descritos pode ser melhorada, misturando-se os anticorpos anti-CTLA-4 com um agente quelante farmaceuticamente aceitável,m tal como ácidoetilenodiaminotetracético ("EDTA").

Embora não desejando estar ligado a qualquer teoria, acredita-se que, a presença de um agente quelante na composição da presente invenção ajuda a melhorar a estabilidade do polipeptidio do anticorpo reduzindo a incidência de um ou mais dos seguintes: agregação do anticorpo anti-CTLA-4, fragmentação, oxidação, instabilidade de congelamento descongelamento, descoloração e/ou desamidação.

A presente invenção compreende formulações de anticorpo anti-CTLA-4 com estabilidade quimica e/ou fisica melhorada se comparado às composições de anticorpo previamente reveladas.

Conseqüentemente, em alguns aspectos, a presente invenção proporciona uma composição compreendendo um agente quelante farmaceuticamente aceitável, tal como EDTA e um anticorpo monoclonal anti-CTLA-4 ou uma parte de ligação ao antigeno do mesmo. Em ainda outros aspectos, as composições de anticorpo anti-CTLA-4 líquidas supracitadas compreendendo um agente quelante podem incluir excipientes farmaceuticamente aceitáveis, incluindo, sem limitação, um ou mais excipientes que são escolhidos dentre tampões, antioxidantes, agentes de tonicidade, tensoativos e misturas destes.

A presente invenção proporciona novas formulações para anticorpos anti-CTLA-4. Como aqui empregado, a frase "anticorpo anti-CTLA-4" refere-se a qualquer anticorpo ou qualquer parte dele, que é capaz de ligar-se a qualquerparte de um polipeptideo de proteína 4 associado a linfócito T citotóxico ("CTLA-4"), que pode estar presente dentro de qualquer animal ou isolado deste. Em algumas modalidades, o polipeptideo CTLA-4 é um polipeptideo CTLA-4 humano.

Anticorpos anti-CTLA-4 adequados para emprego com a presente invenção podem ser escolhidos de anticorpos policlonais ou monoclonais. Em alguns aspectos, o anticorpo anti-CTLA-4 monoclonal pode ser um anticorpo de murideo, quimérico, humanizado ou humano. Em outras modalidades, o anticorpo monoclonal anti-CTLA-4 é um anticorpo monoclonal anti-CTLA-4 humano.

Em algumas modalidades, os anticorpos anti-CTLA-4 que são adequados par emprego com a presente invenção incluem os anticorpos anti-CTLA-4 e métodos de prepará-los, descritos na patente U.S. número 6.682.736 a Hanson, et al., depositado em 23 de dezembro de 1999. Em outras modalidades, os anticorpos anti-CTLA-4 adequados para emprego com a presente invenção incluem os anticorpos monoclonal anti-CTLA-4 com as seqüências de aminoácido de cadeia pesada e leve do anticorpo indicado como 11.2.1 na patente U.S. número 6.682.736. Em outras modalidades, os anticorpos anti-CTLA-4 adequados para emprego com a presente invenção incluem os anticorpos monoclonal anti-CTLA-4 com as seqüências de aminoácido de cadeias pesada e leve dos anticorpos ticilimumab e ipilimumab. Em outras modalidades, os anticorpos anti-CTLA-4 adequados para emprego com a presente invenção incluem os anticorpos monoclonal anti-CTLA-4 com as seqüências de aminoácido de cadeia pesada eleve do anticorpo ticilimumab.

Como aqui empregado, um anticorpo que é referido pelo número, possui as mesmas seqüências de aminoácido de cadeias pesada e leve de um anticorpo monoclonal que é obtido do hibridoma do mesmo número. Por exemplo, o anticorpo monoclonal 11.2.1 tem as mesmas seqüências de aminoácido de cadeia pesada e leve daquela obtida do hibridoma 11.2.1. Assim, referência ao anticorpo 11.2.1 inclui o anticorpo, ticilimumab™, que possui as seqüências de aminoácido de cadeias pesada e leve mostrado em SEQ ID NO: 2 e 4 e o dominio variável para a cadeia pesada mostrado em SEQ ID NO: 5 e o dominio variável para a cadeia leve mostrado em SEQ ID NO: 6. Ele também inclui um anticorpo carecendo de um terminal lisina na cadeia pesada, sendo esta perda, de praxe numa proporção de anticorpos durante a manufatura.

Além disso, tais anticorpos anti-CTLA-4 podem ser escolhidos com base nas diferenças nas seqüências de aminoácido na região constante de suas cadeias pesadas. Pcjr exemplo, os anticorpos anti-CTLA-4 podem ser escolhidos da classe de IgG, que possui cadeias pesadas do tipo "gama". A classe e subclasse dos anticorpos anti-CTLA-4 podem ser determinada por qualquer método conhecido na técnica. Geralmente, a classe e subclasse de um anticorpo pode ser determinada usando anticorpos que, são específicos para uma dada classe e subclasse do anticorpo. Tais anticorpos são comercialmente disponíveis. A classe e subclasse pode ser determinada por ELISA, ou Western Blot, bem como por outrastécnicas. Alternativamente, a classe e subclasse pode ser determinada por sequenciamento de todos ou uma parte dos domínios constantes dessas cadeias pesada e/ou leve dos anticorpos comparando-se suas seqüências de aminoácido com as seqüências de aminoácido conhecidas de varias classes e subclasses de imunoglobulinas, e determinando a calasse e subclasse dos anticorpos/

0 anticorpo anti-CTLA-4 pode ser uma molécula de IgG, uma IgM, uma IgE, uma IgA, ou uma IgD. Em outras modalidades, o anticorpo anti-CTLA-4 é uma IgG e é uma subclasse IgGl, IgG2, IgG3 ou IgG4. Contudo, como será apreciado, ele não é geralmente desejável para aniquilar células expressando CTLA-4. Em vez disso e simplesmente, é geralmente conveniente inibir a ligação a CTLA-4 com seus ligantes para mitigar a infra-regulagem de célula T. Um dos mecanismos principais, através dos quais os anticorpos aniquilam as células, é através da fixação de complemento e participação em CDC. A região constante de um anticorpo desempenha um papel importante em conexão com a capacidade do anticorpo em fixar complemento e participar na CDC. Assim, em geral, seleciona-se o isotipo de um anticorpo, para ou proporcionar a capacidade de fixação complementar ou não. No caso da presente invenção, em geral, como supracitado, não é preferível utilizar um anticorpo que aniquila as células. Há uma série de isotipos de anticorpos que são capazes de fixação complementar e CDC, incluindo, sem limitação, aos seguintes, IgM de murideo, IgG2a de murideo, IgG2b de murideo, IgG3 de murideo, IgM humano, IgGlhumano, e IgG3 humano. Em contraste, isotipos preferidos que não são capazes de fixação complementar e CDC , incluem, sem limitação, IgG2 humano e IgG4 humano. Além das diferenças na seqüência de cadeia pesada, os anticorpos de IgG diferem dentro de suas subclasses, com base no número de pontes dissulfeto e comprimento da região de articulação. Por exemplo, a subclasse IgG2 possui várias diferenças distintas das outras subclasses. As subclasses IgG2 e IgG4 são conhecidas por terem 4 pontes dissulfeto dentro de sua região de articulação, enquanto IgGl possui 2 e IgG3 possui .11 pontes dissulfeto. Outras diferenças para anticorpos IgG2, incluem sua reduzida capacidade em atravessar a placenta e incapacidade dos anticorpos IgG2 em ligarem-se aos receptores de linfócito Fc. Assim, em algumasmodalidades,o anticorpo anti-CTLA-4 é subclasse de IgG2 ou IgG4. Em outras modalidades preferidas o anticorpo anti-CTLA-4 é subclasse IgG2.

Em algumas modalidades, anticorpos anti-CTLA-4 adequados podem ser escolhidos, com base nas diferenças nasseqüências de aminoácido em suas cadeias 'pesadas. Por exemplo, os anticorpos anti-CTLA-4 da presente invenção podem ter cadeias pesadas tipo gama humano que utilizam quaisquer dos seguintes genes de linhagem germinativa VH humana: VH1, VH2, VH3, VH4 ou VH5. Em algumas modalidades, os anticorpos anti-CTLA-4 utilizam o gene da linha germinativa VH3. Em outras modalidades, os anticorpos anti-CTLA-4 utilizam o gene da linhagem germinativa VH3 humano e a região variável de cadeia pesada DP-50 ou DP-46 e emoutras modalidades, os anticorpos anti-CTLA-4 utilizam a região de cadeia pesada variável humana DP-50. 0 gene DP-50 também é referido como um gene da família VH 3-33. O gene DP-46 também é referido como um gene da família VH3-30.3. Em ainda outras modalidades, os anticorpos anti-CTLA-4 utilizam um gene DH humano que é selecionado de Dl-26, DIR4 e DIR3, e em outras modalidades, os anticorpos anti-CTLA-4 utilizam um gene DH Dl-26 humano. Em algumas modalidades adicionais, os anticorpos anti-CTLA-4 utilizam um gene JH humano que é selecionado de JH4 e Jh6, e em outras modalidades, os anticorpos anti-CTLA-4 utilizam o gene JH humano JH6.

Em outras modalidades ainda, os anticorpos anti-CTLA-4 podem ser escolhidos com base nas diferenças nas seqüências de aminoácido de suas cadeias leves, Por exemplo, anticorpos anti-CTLA-4 adequados podem ter cadeias leve lambda ou cadeias leve kappa. Contudo, em determinadas modalidades, os anticorpos anti-CTLA-4 da presente invenção têm cadeias leve kappa. Em algumas modalidades, onde o anticorpo anti-CTLA-4 compreende uma cadeia leve kappa, o polinucleotídeo codificando o domínio 'variável da cadeia leve compreende um gene VKL5, 012, L2, B3, L15 ou A27 humano e um gene JkI, Jk2, Jk3, Jk4, ou Jk5 humano. Em outras modalidades, onde o anticorpo compreende uma cadeia leve kappa, o domínio variável de cadeia leve (VL) é codificado em parte, por um gene Vk012 ou Vk027 e um gene Jk3 ou Jk4 humano. Em modalidades particulares da invenção, o domínio variável de cadeia leve é codificado pelos genes Vk012/Jk3 humanos.Adicionalmente, o anticorpo pode compreender uma seqüência de aminoácido de cadeia pesada compreendendo seqüências de aminoácido da CDR humana derivadas do gene VH 3-30 ou 3-33, ou substituições conservadoras ou mutações somáticas ai. Deve ficar entendido que, o gene VH 3-33 codifica de FR1 até FR3 da região variável de cadeia pesada de uma molécula do anticorpo. Assim, a invenção abrange um anticorpo que divide pelo menos 85%, mais preferivelmente, pelo menos 90%, ainda mais preferivelmente, pelo menos 91%, até mesmo mais preferivelmente, pelo menos 94%, ainda mais preferivelmente, pelo menos 95%, mais preferivelmente, pelo menos 97%, ainda mais preferivelmente, pelo menos 98%, ainda mais preferivelmente, pelo menos 99% e mais preferivelmente, ainda 100% de identidade com a seqüência de FR1 até FR3 do anticorpo ticilimumab.

O anticorpo pode ainda compreender regiões CDR em sua cadeia leve derivadas do gene A27 ou 012 ou ele pode compreender as regiões CDR do anticorpo ticilimumab.

Em outras modalidades ; da invenção o anticorpo inibe a ligação entre CTLA4 e B7-1, B7-2, ou ambos. Preferivelmente, o anticorpo pode inibir a ligação com B7-1 com uma IC5o de cerca de 100 nM ou mais baixa, mais preferivelmente, cerca de 10 nM ou menor, por exemplo, cerca de 5 nM ou menor, ainda mais preferivelmente, cerca de 2 nM ou menor, ou mesmo mais preferivelmente, por exemplo, cerca de 1 nM ou menor. Similarmente, o anticorpo pode inibir a ligação com B7-2 com uma IC50 de cerca de 100 nM ou menor, mais pref erivelmente 10 nM ou menor, por exemplo, mesmomais preferivelmente, cerca de 5 nM ou menor, ainda mais preferivelmente, cerca de 2 nM ou menor, ou mesmo mais preferivelmente, cerca de 1 nM ou menor.

Além disso, em outra modalidade, o anticorpo anti-CTLA-4 possui uma afinidade de ligação para CTLA4 de cerca de 10~8, ou afinidade maior, mais preferivelmente, cerca de IO"9 ou maior afinidade, mais pref erivelmente, cerca de 10~10 ou afinidade maior, e mesmo mais preferivelmente, cerca de 10"nou afinidade maior.

0 anticorpo anti-CTLA-4 inclui um anticorpo que compete para ligação com um anticorpo com seqüências de aminoácido de cadeias leve e pesada do anticorpo ticilimumab. Além disso, o anticorpo anti-CTLA-4 pode competir para ligação com o anticorpo ipilimumab.

Em outra modalidade, o anticorpo, de preferência, compete cruzado com um anticorpo com uma seqüência de cadeias pesada e leve, um seqüência de cadeias pesada e leve variáveis, e/ou as seqüências da CDR pesada e leve do anticorpo ticilimumab. Por exemplo, o anticorpo pode ligar-se ao epitopo, ao qual se liga um anticorpo que tem as seqüências de aminoácido de cadeias leve e pesada, seqüências variáveis e/ou seqüências da CDR, do anticorpo ticilimumab. Em outra modalidade, o anticorpo compete cruzado com um anticorpo com as seqüências de cadeias leve e pesada, ou seqüência de ligação ao antigeno, de MDX-D010.

Numa outra modalidade, a invenção é praticada com o uso de um anticorpo anti-CTLA-4 que compreende uma cadeia pesada compreendendo as seqüências de aminoácido de CDR-1,CDR-2 e CDR-3, e uma cadeia leve compreendendo as seqüências de aminoácido de CDR-1, CDR-2, e CDR-3 de um anticorpo ticilimumab, ou seqüências com alterações da seqüência da CDR selecionadas do grupo consistindo de alterações conservadoras, onde as alterações conservadoras são selecionadas do grupo consistindo de substituição de resíduos não polares por outros residuos não polares, substituição de residuos com carga polar, outros residuos polares não carregados, substituição de residuos com carga polar por outros residuos com carga polar, e substituição de residuos estruturalmente similares, substituições não conservadoras, onde as substituições não conservadoras são selecionadas do grupo consistindo de substituição do resíduo com carga polar pelos residuos sem carga polar e substituição de residuos não polares por residuos polares, adições e deleções.

Numa outra modalidade da invenção, o anticorpo contém menos que 10, 7, 5 ou 3 alterações de aminoácido da seqüência da linhagqm germinativa no quadro genético das regiões cDR. Numa outra modalidade, o anticorpo contém menos que 5 alterações de aminoácido nas regiões do quadro genético e pouco menos que 1 alterações nas regiões cDR. Numa modalidade preferida, o anticorpo contem pouco menos que 3 alterações de aminoácido nas regiões do quadro genético e pouco menos que 7 alterações nas regiões cDR. Numa modalidade preferida, as alterações nas regiões do quadro genético são conservadoras e aquelas nas regiões CDR são mutações somáticas.Ainda mais preferivelmente, o anticorpo divide 100% de identidade de seqüência ou similaridade de seqüência sobre as cadeias pesada e leve, ou com a cadeia pesada ou cadeia leve, separadamente de um anticorpo ticilimumab.

Numa outra modalidade, o anticorpo divide pelo menos 80%, mais preferivelmente, pelo menos 85%, mesmo mais preferivelmente, pelo menos 90%, ainda mais preferivelmente, pelo menos 94%, mais preferivelmente, pelo menos 95%, mesmo mais preferivelmente, pelo menos 99% de identidade de seqüência ou similaridade de seqüência com as seqüências de aminoácido de cadeias leve e pesada de comprimento total, ou sobre a cadeia pesada ou cadeia leve, separadamente, com as seqüências da linhagem germinativa VkA27, linhagem germinativa Vk012, e linhagem germinativa DP50 (que é um alelo do lócus genético VH 3-33. Ainda mais preferivelmente, o anticorpo divide 100 % de identidade da seqüência ou similaridade de seqüência sobre a seqüência de cadeia pesada da linhagem germinativa DP50 e/ou com a seqüência de cadeia leve da linhagem germinativa A27, ou linhagem germinativa 012.

Numa outra modalidade, o anticorpo divide pelo menos 80%, mais preferivelmente, pelo menos 85%, ainda mais preferivelmente, pelo menos 90%, ainda mais preferivelmente, pelo menos 94%, mais preferivelmente, pelo menos 95%, mesmo mais preferivelmente, pelo menos 99% da identidade de seqüência (por exemplo, aminoácido, ácido nucléico ou ambos) ou similaridade de seqüência com as seqüências da região variável de cadeias pesada e leve, ou sobre a seqüência daregião variável de cadeia pesada ou leve, separadamente com as seqüências do anticorpo 3.1.1, 4.1.1, 4.8.1, 4.10.2, 4.13.1, 4.14.3, 6.1.1 tilimumab, 11.6.1, 11.7.1, 12.3.1.1, 12.9.1.1, ipilimumab. Ainda mais preferivelmente, o anticorpo divide 100% de identidade de seqüência ou similaridade de seqüência sobre as seqüências da região variável de cadeias leve e pesada, ou com a seqüência de cadeia pesada ou cadeia leve, separadamente, de um anticorpo selecionado de anticorpo 3.1.1, 4.1.1, 4.8.1, 4.10.2, 4.13.1, 4.14.3, 6.1.1, ticilimumab, 11,6.1, 11.7.1, 12.3.1.1, 12.9.1.1, ipilimumab.

Numa outra modalidade, o anticorpo divide pelo menos 80%, mais preferivelmente, pelo menos 85%, mesmo mais preferivelmente, pelo menos 90%, ainda mais preferivelmente, pelo menos 94%, mais preferivelmente, pelo menos 95%, mesmo mais preferivelmente, pelo menos 99% de identidade de seqüência ou similaridade de seqüência com a seqüência da região variável de cadeia pesada com a seqüência variável de cadeia pesada da linhagem germinativa DP50 (que é um alelo do'lócus do gene VH 3-33) ou com a seqüência variável de cadeia leve da linhagem germinativa VkA27 ou linhagem germinativa Vk012. Ainda mais preferivelmente, a seqüência da região de cadeia pesada do anticorpo divide 100 % de identidade da seqüência ou similaridade de seqüência com a seqüência da linhagem germinativa DP50 ou com a seqüência de cadeia ieve da linhagem germinativa A27, ou linhagem germinativa 012.

Numa outra modalidade da presente invenção, oanticorpo divide pelo menos 80%, mais preferivelmente, pelo menos 85%, mesmo mais preferivelmente, pelo menos 90%, pelo menos 95%, mesmo mais pref erivelmente, pelo menos 99% de identidade de seqüência ou similaridade de seqüência com a cadeia pesada, a cadeia leve, ou ambas as seqüências de FRl até FR4 com as seqüências da região FRl até fR4 do anticorpo ticilimumab. Ainda mais preferivelmente, o anticorpo divide 100% de identidade de seqüência ou similaridade de seqüência sobre as seqüência pesada, leve ou ambas, de FRl até FR4 como anticorpo ticilimumab.

Numa outra modalidade da presente invenção, o anticorpo divide pelo menos 80%, mais preferivelmente, pelo menos 85%, mesmo mais preferivelmente, pelo menos 90%, ainda mais preferivelmente, pelo menos 95%, mais preferivelmente,pelo menos 99%, e mais pref erivelmente, cerca de 100% de identidade de seqüência ou similaridade de seqüência com a seqüências de cadeia pesada de FRl até FR3 com as seqüência da região FRl até FR3 da linhagem germinativa DP50.

Numa outra modalidade ainda da presente invenção, o anticorpo divide pelo menos 80%, mais preferivelmente, pelo menos 85%, mesmo mais preferivelmente, pelo menos 90%, ainda mais preferivelmente, pelo menos 95%, mais preferivelmente, pelo menos 99%, e mais preferivelmente, cerca de 100% de identidade de seqüência ou similaridade de seqüência com as seqüências de cadeia leve de FRl até FR4 com as seqüências da região FRl até FR3 da linhagem germinativa VKA27, ou linhagem germinativa VK012.

Numa modalidade da presente invenção, o anticorpodivide pelo menos 80%, mais preferivelmente, pelo menos 85%, mesmo mais preferivelmente, pelo menos 90%, ainda mais preferivelmente, pelo menos 95%, mais preferivelmente, pelo menos 99%, de identidade de seqüência ou similaridade de seqüência com a cadeia pesada, a cadeia leve ou ambas, seqüências CDR-1, CDR-2 e CDR-3 do anticorpo ticilimumab. Ainda mais preferivelmente, o anticorpo divide 100% de identidade de seqüência ou similaridade de seqüência sobre as seqüência de cadeia pesada ou leve,, ou ambas da CDR-1, CDR-2 e CDR-3 com o anticorpo ticilimumab.

Numa outra modalidade ainda da presente invenção, o anticorpo divide pelo menos 80%, mais preferivelmente, pelo menos 85%, mesmo mais preferivelmente, pelo menos 90%, ainda mais preferivelmente, pelo menos 95%, mais preferivelmente, pelo menos 99%, e mais preferivelmente, cerca de 100% de identidade de seqüência ou similaridade de seqüência com as seqüências de cadeia pesada CDR-1 e CDR-2 com as seqüência cDR-1 e CDR-2 da linhagem germinativa DP50.

Numa outra modalidade ainda da presente invenção, o anticorpo divide pelo menos 80%, mais preferivelmente, pelo menos 85%, mesmo mais preferivelmente, pelo menos 90%, ainda mais preferivelmente, pelo menos 95%, mais preferivelmente, pelo menos 99%, e mais preferivelmente, cerca de 100% de identidade de seqüência ou similaridade de seqüência com as seqüências de cadeia leve CDR-1, CDR-2 e CDR-3 com as seqüências CDR-1, CDR-2 e CDR-3 da linhagem germinativa VkA27, ou linhagem germinativa Vk012.

Numa modalidade, o anticorpo anti-CTLA-4 é oanticorpo conhecido como ticilimumab.

A Tabela 1 relaciona a germinativa humana de cadeia pesada anticorpo monoclonal anti-CTLA-4 ticilimumab).

Tabela 1:.

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Alguns anticorpos anti-CTLA-4 de acordo com a presente invenção foram gerados com uma tendência no sentido da utilização da região variável de cadeia pesada DP-50. O gene DP-50 é também referido como um gene da família VH 3-33. Em camundongos XenoMouse™, existem mais de 30 genes variáveis de cadeia pesada funcionais distintos com os quais se pode gerar anticorpos. A tendência, em conseqüência, é indicativa de um motivo de ligação preferido da interação anticorpo-antigeno com relação asa propriedades combinadas de ligação ao antigeno e atividade funcional.

Em algumas modalidades, o anticorpo é um anticorpo de cadeia simples (scFv) em que os dominios VL e VH são emparelhados para formar uma molécula monovalente via um derivação de linhagem e cadeia leve para o 11.2.1 (ou seja,76

ligante sintético que permite a eles serem produzidos como uma cadeia protéica simples. Bird et al., Science 242:423-426 (1988) e Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sei USA 85:5879-5883 (1988). Em algumas modalidades os anticorpos são diacorpos, ou seja, são anticorpos bivalentes, em que os domínios VH e VL são expressos numa única cadeia polipeptidica, mas usando um ligante que é curto demais para permitir o pareamento entre os dois domínios na mesma cadeia, forçando desse modo, os domínios a parear com domínios complementares de uma outra cadeia, criando assim, dois sitios de ligação ao antigeno. Ver, por exemplo, Holliger P. et al., Proc. Natl. Acad. sei USA 90:6444-6448 (1993) e Poljak R. J et a. , Structure 2:1121-1123 (1994) . Em algumas modalidades, uma ou mais CDRs de um anticorpo da invenção podem ser incorporadas numa molécula, seca covalentemente, ou não covalentemente, para torná-la imunoadesiva, ligando-se especificamente a CTLA-4. Em tais modalidades, as CDR(s) podem ser incorporadas, como parte de uma cadeia polipeptidica maior, podem ser covalentemente ligadas a uma outra cadeia polipeptidica, ou podem ser incorporadas não covalentemente.

Numa outra modalidade, o anticorpo anti-CTLA-4 possui seletividade (ou especificidade) para CTLA-4 que é pelo menos 1010. vezes maior do que sua seletividade para qualquer outro polipeptideo., Em algumas modalidades, o anticorpo anti-CTLA-4 não apresenta qualquer ligação especifica apreciável a qualquer outra proteína diferente de CTLA-4. Pode-se determinar a seletividade do anticorpoanti-CTLA-4 para CTLA-4 usando métodos do conhecimento da técnica seguindo os ensinamentos do relatório descritivo. Por exemplo, pode-se determinar a seletividade usando Western blot, FACS, ELISA, ou RIA. Assim, em algumas modalidades, o anticorpo monoclonal anti-CTLA-4 é capaz de ligação especifica a CTLA-4. Em algumas modalidades, o lisina C-terminal da cadeia pesada do anticorpo anti-CTLA-4 da invenção não está presente. Em algumas modalidades, o lisina C-terminal da cadeia pesada do anticorpo anti-CTLA-4 da invenção não está presente. Em alguns aspectos da presente invenção, o anticorpo anti-CTLA-4, tipicamente, não compreende um polipeptideo de sinal porque o polipeptideo de sinal é em geral, eliminado durante as modificações pós-traducionais. Em varias modalidades da invenção, uma ou ambas as cadeias pesada e leve dos anticorpos anti-CTLA-4 incluem uma seqüência de sinal (ou uma parte da seqüência de sinal). Em outras modalidades da invenção, nem a cadeia pesada nem a leve dos anticorpos anti-CTLA-4 inclui uma seqüência de sinal.

A tabela 2 relaciona os identificadores de seqüência (SEQ ID NOS) dos ácidos nucléicos que codificam a região variável das cadeias pesada e leve e das correspondentes seqüências de aminoácido previstas para o anticorpo monoclonal anti-CTLA-4 11.2.1.Tabela 2:

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Em algumas modalidades, a molécula de ácido nucléico compreende uma seqüência de nucleotideo que codifica a seqüência de aminoácido VL do anticorpo monoclonal 11.2.1 (SEQ ID NO: 4), ou uma patê do mesmo. Em algumas modalidades, essa parte compreende pelo menos a região CDR2. Em algumas modalidades, o ácido nucléico codifica a seqüência de aminoácido das CDRs de cadeia leve do referido anticorpo. Em algumas modalidades, a referida parte é uma parte adjacente compreendendo CDR1-CDR3. Em alguns aspectos, a seqüência de aminoácido da CDR1 de cadeia leve é indicada por SEQ ID NO: 10, a seqüência de aminoácido da CDR2 de cadeia leve por SEQ ID NO: 11, e a seqüência de aminoácido da CDR3 de cadeia leve por SEQ ID NO: 12.

Em outras modalidades, a molécula de ácido nucléico codifica uma seqüência de aminoácido VL que é pelo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, ou 99% idêntica a uma seqüência de aminoácido VL da SEQ ID NO: 4. Em outras modalidades, a molécula de ácido nucléicocompreende uma seqüência de nucleotideo que codifica a seqüência de aminoácido de cadeia leve da SEQ ID NO: 4, ou uma parte desta. Moléculas de ácido nucléico da invenção incluem ácidos nucléicos que hibridizam sob condições altamente rigorosas, tais como as aqui descritas para uma seqüência de ácido nucléico codificando a seqüência de aminoácido de cadeia leve de SEQ ID NO: 4.

Em outras modalidades, a molécula de ácido nucléico compreende uma seqüência de nucleotideo que codifica pelo menos uma parte da seqüência de aminoácido VH de 11.2.1 (SEQ ID NO: 2) ou a referida seqüência com mutações de aminoácido conservadoras e/ou um total de três ou pouco menos substituições de aminoácido não conservadoras. Em varias modalidades a seqüência codifica uma ou mais regiões CDR, pref erivelmente uma região CDR3, todas as três regiões cDR, uma parte adjacente incluindo CDR1-CDR3 ou toda a região VH. Em alguns aspectos, a seqüência de aminoácido da CDR1 de cadeia pesada é indicada por SEQ ID NO: 7, a seqüência de aminoácido da CDR2 de cadeia pesada por SEQ ID NO: 8 e a seqüência de aminoácido da CDR3 de cadeia pesada por SEQ ID NO: 9.

Em algumas modalidades, a molécula de ácido nucléico codifica uma seqüência de aminoácido VH que é pelo menos 7 0%, 7 5%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, ou 99% idêntica a uma seqüência de aminoácido VH da SEQ ID NO: 2. Em outras modalidades ainda, a molécula de ácido nucléico compreende uma seqüência de nucleotideo que codifica a seqüência de aminoácido de cadeia pesada da SEQ ID NO: 2,ou uma parte desta. Moléculas de ácido nucléico da invenção incluem ácidos nucléicos que hibridizam sob condições altamente rigorosas, tais como as aqui descritas para uma seqüência de nucleotideo codificando a seqüência de aminoácido de cadeia pesada de SEQ ID NO: 2.

Em alguns aspectos, a presente invenção proporciona uma composição farmacêutica liquida compreendendo pelo menos um anticorpo isolado humano que se liga a cTLA-4 onde o anticorpo compreende uma seqüência de aminoácido VH que utiliza um gene da linha germinativa VH 3-33; e um excipiente farmaceuticamente aceitável compreendendo um agente quelante.

Em outros aspectos, a presente invenção proporciona uma composição farmacêutica liquida compreendendo pelo menos um anticorpo humano isolado que se liga a CTLA-, onde o anticorpo compreende uma seqüência de aminoácido de cadeia pesada com pelo menos 90% de identidade de seqüência para SEQ ID NO: 2 e uma seqüência de aminoácido de cadeia leve com pelo menos 90% de identidade de seqüência para SEQ ID NO: 4.

Em outros aspectos, a presente invenção proporciona uma composição farmacêutica liquida compreendendo pelo menos um anticorpo humano isolado que se liga a CTLA-4, onde o anticorpo compreende uma seqüência de aminoácido de cadeia pesada com pelo menos 95% de identidade de seqüência para SEQ ID NO: 2 e uma seqüência de aminoácido de cadeia leve com pelo menos 95% de identidade de seqüência para SEQ ID NO: 4.Em outros aspectos, a presente invenção proporciona uma composição farmacêutica liquida compreendendo pelo menos um anticorpo humano isolado que se liga a CTLA-4, onde o anticorpo compreende uma seqüência de aminoácido de cadeia pesada com pelo menos 99% de identidade de seqüência para SEQ ID NO: 2 e uma seqüência de aminoácido de cadeia leve com pelo menos 99% de identidade de seqüência para SEQ ID NO: 4.

Em ainda outros aspectos o anticorpo compreende uma seqüência de aminoácido de cadeia pesada que compreende a região variável de SEQ ID NO: 2 e uma seqüência de aminoácido de cadeia leve que compreende a região variável SEQ ID NO: 4. Em aspectos adicionais o anticorpo compreende uma seqüência de aminoácido de cadeia pesada compreendendo SEQ ID NO: 5 e uma seqüência de aminoácido de cadeia leve compreendendo SEQ ID NO: 6. Em aspectos adicionais, o anticorpo compreende uma seqüência de aminoácido de cadeia pesada compreendendo SEQ ID NO: 2 e uma seqüência de aminoácido de cadeia leve compreendendp SEQ ID NO: 4. Em ainda outros aspectos, o anticorpo compreende uma seqüência de aminoácido VH compreendendo seqüências FR1, FR2 e FR3 que uti 1 izam uma familia de gene VH 3-33 humano operativamente ligada em quadro com uma seqüência CDR1, uma CDR2 e CDR3.

Numa modalidade, o anticorpo anti-CTLA-4 é ticilimumab, (também conhecido como CP-675.206) que tém as seqüências de aminoácido de cadeias leve e pesada do anticorpo ticilimumab.Numa modalidade da presente invenção os anticorpos anti-CTLA-4 ligam-se especificamente a um epitopo conformacional em CTLA-4 humano. Em outras modalidades, os anticorpos anti-CTLA-4 inibem o crescimento de tumor humano após administração a um indivíduo.

Preparação das Formulações de Anticorpo Monoclonal Anti-CTLA-4

0 anticorpo anti-CTLA-4 é formulado, tipicamente como uma composição farmacêutica para administração parenteral a um indivíduo. Numa modalidade, a composição farmacêutica é uma composição liquida, Em outra modalidade, a composição farmacêutica é uma composição liquida.

As composições da presente invenção envolvem um ou mais anticorpos monoclonals anti-CTLA-4 da invenção em combinação com excipientes farmaceuticamente aceitáveis, que compreendem histidina e/ou um agente quelante. As formulações líquidas da presente invenção envolvem um ou mais anticorpos monoclonais anti-CTLA-4 da invenção em combinação com excipientes farmaceuticamente aceitáveis que compreendem histidina e/ou um agente quelante.

0 termo "composição farmacêutica" refere-se a preparações que estão em forma tal que permitem que a atividade biológica dos ingrediente ativos seja eficaz. "Excipientes farmaceuticamente aceitáveis" (veículos, aditivos) soa os que podem razoavelmente (ou seja, em segurança) ser administrados a um sujeito fornecendo uma dose eficaz do ingrediente ativo empregado. 0 termo "excipiente" ou "veiculo" como aqui empregado, refere-se auma substancia inerte, que é normalmente empregada como um diluente, veiculo, conservante, aglutinante ou agente estabilizante para as drogas. Como aqui empregado, o termo "diluente"refere-se a um solvente farmaceuticamente aceitável (seguro e não tóxico para administração a um humano) de utilidade para a preparação das formulações liquidas presentes. Diluentes exemplares, incluindo, sem limitação, água estéril e água bacteriostática para injeção (BWFI).

Numa outra modalidade, a invenção dirige-se a uma composição compreendendo um anticorpo anti-CTLA-4 e um agente que1ante farmaceuticamente aceitável. Em outras modalidades, a invenção dirige-se a uma composição farmacêutica liquida compreendendo um anticorpo anti-CTLA-4 e EDTA. Numa outra modalidade, a invenção dirige-se a uma composição compreendendo um anticorpo anti-CTLA-4 e DTPA.

Numa outra modalidade, a invenção dirige-se a uma composição compreendendo um anticorpo anti-CTLA-4, um agente quelante farmaceuticamente aceitável ; e um tampão farmaceuticamente aceitável. Em outra modalidade, a invenção dirige-se a uma composição compreendendo um anticorpo anti-CTLA-4, um agente quelante farmaceuticamente aceitável e histidina. Numa outra modalidade, a invenção dirige-se a uma composição compreendendo um anticorpo anti-CTLA-4 EDTA e histidina. Numa outra modalidade, a invenção dirige-se a uma composição compreendendo um anticorpo anti-CTLA-4, DTPA e histidina.

Numa outra modalidade, a invenção dirige-se a umacomposição compreendendo um anticorpo anti-CTLA-4, um agente quelante farmaceuticamente aceitável e um agente de tonicidade farmaceuticamente aceitável. Em outra modalidade, a invenção dirige-se a uma composição compreendendo um anticorpo anti-CTLA-4, um agente quelante farmaceuticamente aceitável e trehalose. Numa outra modalidade, a invenção dirige-se a uma composição compreendendo um anticorpo anti-CTLA-4 EDTA e trehalose. Numa outra modalidade, a invenção dirige-se a uma composição compreendendo um anticorpo anti-CTLA-4, DTPA e trehalose.

Numa outra modalidade, a invenção dirige-se a uma composição compreendendo um anticorpo anti-CTLA-4, um agente quelante farmaceuticamente aceitável e um tensoativo farmaceuticamente aceitável. Em outra modalidade, a invenção dirige-se a uma composição compreendendo um anticorpo anti-CTLA-4 , EDTA, e um tensoativo farmaceuticamente aceitável. Numa outra modalidade, a invenção dirige-se a uma

composição compreendendo um anticorpo anti-CTLA-4 DTPA e um tensoativo farmaceuticamente aceitável. Numa outra modalidade, a invenção dirige-se a uma composição compreendendo um anticorpo anti-CTLA-4, um agente quelante farmaceuticamente aceitável selecionado do grupo consistindo de EDTA e DTPA, e polisorbato 80.

Numa outra modalidade, a invenção dirige-se a uma composição compreendendo um anticorpo anti-CTLA-4, um tampão farmaceuticamente aceitável è um tensoativo

farmaceuticamente aceitável. Em outra modalidade, a invenção dirige-se a uma composição compreendendo um anticorpo anti-CTLA-4, histidina e um tensoativo farmaceuticamente aceitável. Numa outra modalidade, a invenção dirige-se a uma composição compreendendo um anticorpo anti-CTLA-4, histidina e polisorbato 80.

Numa outra modalidade, a invenção dirige-se a uma composição compreendendo um anticorpo anti-CTLA-4, um agente quelante farmaceuticamente aceitável, um tampão farmaceuticamente aceitável e um tensoativo farmaceuticamente aceitável.

Numa outra modalidade, a invenção dirige-se a uma composição compreendendo um anticorpo anti-CTLA-4, um agente quelante farmaceuticamente aceitável, um tampão farmaceuticamente aceitável e um agente de tonicidade farmaceuticamente aceitável.

Numa outra modalidade, a invenção dirige-se a uma composição compreendendo um anticorpo anti-CTLA-4, um agente quelante farmaceuticamente aceitável, um tampão farmaceuticamente aceitável, um tensoativo farmaceuticamente aceitável e um agente de itonicidade farmaceuticamente aceitável.

Numa outra modalidade, a invenção dirige-se a uma composição compreendendo um. anticorpo anti-CTLA-4 e histidina.

0 anticorpo anti-CTLA-4 presente na composição pode ser como previamente descrito neste pedido de patente. Numa modalidade, a composição compreende um anticorpo anti-CTLA-4 compreendendo uma seqüência de aminoácido VL que é 90%, 95%, ou 99% idêntica a uma seqüência de aminoácido VLand a pharmaceutically acceptable surfactant pharmaceutically acceptable.

In another embodiment, the invention is directed to a composition comprising an anti-CTLA-4, a pharmaceutically acceptable chelating agent, a buffer and a pharmaceutically acceptable tonicity agent pharmaceutically acceptable.

In another embodiment, the invention is directed to a composition comprising an anti-CTLA-4, a pharmaceutically acceptable chelating agent, a buffer a pharmaceutically acceptable, a surfactant and a pharmaceutically acceptable agent itone pharmaceutically acceptable.

In another embodiment, the invention is directed to a composition comprising a. anti-CTLA-4 and histidine.

0 anti-CTLA-4 present in the composition may be as previously described in this patent application. In an embodiment, the composition comprises an anti-CTLA-4 comprising a VL amino acid sequence that is 90%, 95% or 99% identical to an amino acid sequence of VLmostrada em SEQ ID NO: 4 e compreender ainda uma seqüência de aminoácido VH que é 90%, 95%, ou 99% idêntica a uma seqüência de aminoácido VH mostrada em SEQ ID NO: 2. Numa outra modalidade, a composição compreende um anticorpo anti-CTLA-4 que é o anticorpo monoclonal anti-CTLA-4 11.2.1.

O anticorpo anti-CTLA-4 presente na composição pode ser como previamente descrito neste pedido de patente. Numa modalidade, as composições farmacêuticas líquidas compreendem, um anticorpo anti-CTLA-4 compreendendo uma seqüência de aminoácido VL que é 90%, 95%, ou 99% idêntica a uma seqüência de aminoácido VL mostrada em SEQ ID NO 4: e compreender ainda uma seqüência de aminoácido VH que é 90%, 95%, ou 99% idêntica a uma seqüência de aminoácido VH mostrada em SEQ ID NO: 2. Numa outra modalidade, a composição farmacêutica liquida compreende um anticorpo anti-CTLA-4 que é o anticorpo monoclonal anti-CTLA-4 11.2.1.

A concentração do anticorpo anti-CTLA-4 nas composições farmacêuticas líquidas da presente invenção é, geralmente pelo menos cjerca de 0,1 miligrama por mililitro (mg/mL) ou maior, pelo -menos cerca de 1,0 mg/mL ou maior, pelo menos cerca de 10 mg/mL ou maior, pelo menos cerca de 50 mg/mL ou maior, pelo. menos cerca de 100 mg/mL ou maior, ou pelo menos cerca de 200 mg/mL ou maior. Em algumas modalidades,a concentração do anticorpo anti-CTLA-4 varia, em geral de cerca de 0,1 mg/mL a cerca de 200 mg/mL, de cerca de 0,5 mg/mL a cerca de 100 mg/mL, de cerca de 1 mg/mL a cerca de 70 mg/mL, de cerca de 2,0 mg/mL a cerca de 65 mg/mL, de cerca de 5,0 mg/mL a cerca de 50 mg/mL, de cercade 10 mg/mL a cerca de 35 mg/mL, de cerca de 15 mg/mL a cerca de 25 mg/mL ou é de cerca de 20 mg/mL. Numa modalidade, a concentração do anticorpo anti-CTLA-4 na composição farmacêutica liquida varia de cerca de 50 mg/mL a cerca de 100 mg/mL. Em algumas modalidades, maiores concentrações do anticorpo podem ser utilizadas onde a composição destina-se à distribuição subcutânea.

Como aqui empregado, os termos "agente quelante" refere-se em geral a um excipiente que pode formar pelo menos uma ligação (por exemplo, covalente, iônica, ou diferentemente) a um ion metálico. Um agente quelante é tipicamente um ligante multidentado que pode ser usado em composições líquidas selecionadas como um estabilizante para complexar com espécies, que poderiam promover instabilidade. Freqüentemente, os compostos que podem agir como um agente quelante terão grupos funcionais ricos em elétrons. Grupos funcionais ricos em elétron adequados incluem grupos ácido carboxilico, grupos hidróxi e grupos amino. A disposição desses grupos nos ácidos aminopolicarboxilicos, ácidos hidroxipolicarboxilicos, ácidos hidroxiaminocarboxilicos, e similar, resulta em frações que têm a capacidade de ligar-se a metal.

Contudo, a presente invenção não se destina a estar limitada aos agentes quelantes, em primeiro lugar, pela capacidade dos agentes quelantes em formar pontes com um ion metálico. Conseqüentemente, a presente invenção não se destina a estar limitada por qualquer mecanismo especifico pelo qual os agente quelantes agem nasformulações da presente invenção e os excipientes denominados agentes quelantes no presente, podem conseguir suas propriedades através de mecanismos que, todos juntos, não estão relacionados à capacidade do agente quelante em formar pontes com um ion metálico.

Agentes quelantes adequados para emprego na presente invenção, incluem, sem limitação, ácidos aminopolicarboxilicos, ácidos hidroxiaminocarboxilicos, glicinas N-substituidas, ácido 2-(2-amino-2-oxoetil)aminoetano sulfônico (BES), deferoxamina (DEF), ácido citrico, niacinamida e desoxicolatos. Exemplos de ácidos aminopolicarboxilicos adequados incluem ácido etileno diaminotetracético (EDTA), ácido dietilenotriamino pentaacético (DTPA), ácido nitrilotriacético (NTA), ácido N-2-acetamido-2-iminodiacético (ADA), éter bis(aminoetil) glicólico, ácido N,N,N',N'-tetraacético (EGTA), ácido trans-diaminocicloexano tetraacético (DCTA), ácido glutâmico e ácido aspártico. Exemplos de ácidos hidroxiaminocarboxilicos adequados incluem ácido N-hidroxietiliminodiacético (HMDA), N,N-bis-hidroxietilglicina (bicina) e N-(tris-hidroximetilmetil) 10 glicina (tricina). Um exemplo de um glicina N-substituido é glicilglicina. Um exemplo de um desoxicolato adequado é desoxicolato de sódio. Misturas de dois ou mais agentes quelantes também estão abrangidos pela presente invenção.

Agentes quelantes usados na invenção podem se apresentar, onde possível, como o ácido livre ou forma de base livre do composto (por exemplo, referidopermutavelmente aqui como "EDTA" ou "ededato") ou como uma forma de sal correspondente (por exemplo, o sal de adição de ácido ou sal de adição de base, tal como ededato dissódico). Sais de adição de ácido, por exemplo, incluem sais de metal alcalino (por exemplo, sais de sódio ou de potássio), sais de metal alcalino terroso (por exemplo, sais de cálcio), e sais preparados usando outros ions metálicos fracamente ligados. Como é do conhecimento da técnica, a natureza do sal e o número de cargas para neutralização dependerá do número de grupos carboxila presentes e do pH ao qual o agente que1ante de estabilização é fornecido. Como é também do conhecimento da técnica, agentes quelantes, têm resistência variada com a qual os ions alvo particulares são ligados. À guisa de ilustração adicional, sais adequados de EDTA incluem ededato dipotássico, ededato dissódico, cálcio edetado dissódico, ededato de sódio, ededato trissódico, e ededato de potássio, e um sal adequado de deferoxamina (DEF) é mesilato de deferoxamina (DFM).

Agentes quelantes usados na invenção podem estar presentes como uma forma anidra, solvatada ou hidratada do composto ou sal correspondente. Onde o agente quelante está numa forma solvatada ou hidratada, ele pode estar presente em estados variados de solvatação ou hidratação (incluindo por exemplo, formas anidras, hidratadas, diidratadas, e triidratadas). À guisa de ilustração adicional, um hidrato de EDTA é EDTA dissódico diidratado; e as formas adequadas do ácido citrico incluem ácido citrico anidro, ácido citrico monoidratado, e citrato trissódico diidratado.Agentes quelantes adequados usados nas composições de anticorpo da presente invenção também incluem, por exemplo, os que se ligam a ions metálicos em solução para torná-los incapazes de reagir com 02 disponível, minimizando ou prevenindo assim, a geração de radicais hidroxila que estão livres para reagir com o anticorpo e degradá-lo. Agentes quelantes podem baixar a formação de espécies oxigênio reduzidas, reduzir a formação de espécies ácidas (por exemplo, desamidação), reduzir agregação do anticorpo, e/ou reduzir a fragmentação do anticorpo nas composições da presente invenção.

Esses agentes quelantes podem reduzir ou prevenir a degradação de um anticorpo que é formulado sem a proteção de um agente quelante.

Quando se refere a uma concentração de um agente quelante pretende-se que a concentração em questão represente a concentração molar da forma de ácido ou base livre do agente quelante. Por exemplo, a concentração do agente quelante em algumas composições farmacêuticas liquidas varia, em geral de cerca de 0,01 micromolar a cerca de 50 milimolar, de cerca de 1 micromolar a cerca de 10,0 milimolar, de cerca de 15 micromolar a cerca de 5,0 milimolar, de cerca de 0,01 milimolar a cerca de 1,0 milimolar, ou de cerca de 0,03 milimolar a cerca de 0,5 milimolar. Em algumas modalidades, a concentração do agente quelante na composição farmacêutica liquida pode ser cerca de 0,01 milimolar, 0,02 milimolar, 0, 027 milimolar, 0,03 milimolar, cerca de 0,04 milimolar, cerca de 0,05 milimolar,cerca de 0,06 milimolar, cerca de 0,07 milimolar, cerca de 0,10 milimolar, cerca de 0,20 milimolar, cerca de 0,26 milimolar, cerca de 0,27 milimolar, cerca de 0,30 milimolar, cerca de 0,31 milimolar, cerca de 0,34 milimolar, cerca de 0,40 milimolar, cerca de 0,50 milimolar, ou cerca de 1,0 milimolar. Em algumas modalidades a concentração do agente quelante é cerca de 0,027 milimolar, cerca de 0,05 milimolar, cerca de 0,13 milimolar, ou cerca de 0,27 milimolar. Numa modalidade a concentração do agente quelante é cerca de 0,05 milimolar. Numa outra modalidade, a concentração do agente quelante é cerca de 0,13 milimolar.

A menos que de outro modo observado, a concentração relacionada aqui soa as concentrações em condições ambientais (ou seja, a 25 °C e pressão atmosférica) Faixas intermediárias para as concentrações do agente quelante descrito também destinam-se a ser parte desta invenção. Por exemplo, faixas de valores usando uma combinação de quaisquer valores supracitados como limites superiores e/ou inferiores destinam-se a estar incluídos.

Numa modalidade, o agente quelante é selecionado do grupo consistindo de EDTA, DTPA, D FM e misturas destes. Numa outra modalidade, o agente quelante é DFM. Numa outra modalidade, o agente quelante é EDTA. Numa outramodalidade, o agente quelante é DTPA. Numa outra modalidade, a composição farmacêutica liquida compreende EDTA numa quantidade que, varia, geralmente de cerca de 0,01 milimolar, a cerca de 50 milimolar 50 milimolar, de cerca de 1 micromolar a cerca de 2 0,0 milimolar, de cerca de 15micromolar a cerca de 10,0 milimolar, de cerca de 0,01 milimolar a cerca de 5,0 milimolar, ou de cerca de 0,03 milimolar a cerca de 1 milimolar. Em algumas modalidades, a concentração de EDTA na composição farmacêutica liquida pode ser de cerca de 0,01 milimolar, 0,02 milimolar, 0,027 milimolar, 0,03 milimolar, cerca de 0,04 milimolar, cerca de 0,05 milimolar, cerca de 0,06 milimolar, cerca de 0,07 milimolar, cerca de 0,10 milimolar, cerca de 0,20 milimolar, cerca de 0,26 milimolar, cerca de 0,27 milimolar, cerca de 0,30 milimolar, cerca de 0,31 milimolar, cerca de 0,34 milimolar, cerca de 0,40 milimolar, cerca de 0,50 milimolar, ou cerca de 1,0 milimolar. Em algumas modalidades a concentração do EDTA é cerca de 0,027 milimolar, cerca de 0,05 milimolar, cerca de 0,13 milimolar, ou cerca de 0,27 milimolar. Numa modalidade a concentração do EDTA é cerca de 0,05 milimolar. Numa outra modalidade, a concentração de EDTA é cerca de 0,13 milimolar. Numa outra modalidade, a composição farmacêutica liquida compreende EDTA numa quantidade de cerca de 0,27 milimolar.

Como observado supra, as composições da presente invenção podem ainda compreender um tampão farmaceuticamente aceitável além de um agente quelante.

Como aqui empregado, o termo "tampão" refere-se a uma composição adicionada que permite que uma formulação de anticorpo liquida resista a alterações no pH. Em algumas modalidades, o tampão adicionado permite que uma formulação de anticorpo liquida resista alterações no pH pela ação de seus componentes conjugados ácido-base.Por exemplo, uma formulação tamponada pode ser preparada por adição de L-histidina-HC (cloridrato de L-histidina) e L-histidina em quantidades apropriadas para se chegar a um pH desejado.

Exemplos de tampões adequados incluem, sem limitação, acetato (por exemplo, acetato de sódio), succinato (por exemplo, succinato de sódio) , gliconato, citrato (por exemplo, e outros tampões de ácido orgânico, incluindo, sem limitação, a tampões tais como aminoácidos (por exemplo, histidina), ácido acético, ácido fosfórico e fosfatos, ascorbato, ácido tartárico, ácido maleico, glicina, lactato, ácido láctico, ácido ascórbico, imidazóis, ácido carbônico e bicarbonatos, ácido succinico, ácido benzóico de sódio e benzoatos, gluconato, ededato (EDTA), acetato, malato, imidazol, tris, fosfato, e misturas destes. Numa modalidade, o tampão é acetato.

Numa modalidade, o tampão é histidina. O material de partida histidina usado para preparar as composições da presente invenção podem existir em formas diferentes. Por exemplo, o histidina pode ser um enantiomérico, (por exemplo, enantiômero L- ou D) ou forma racêmica de histidina, uma forma de ácido livre ou base livre, uma forma de sal (por exemplo, um sal monocloridrato, dicloridrato, bromidrato, sulfato ou acetato) de histidina, uma formasolvatada de histidina, uma forma hidratadas (por exemplo, monoidratada) de histidina, ou uma forma anidra de histidina. A pureza da base histidina e/ou sal usado para preparar as composições, geralmente, pode ser de pelo menoscerca de 98% pelo menos cerca de 99% ou pelo menos cerca de 99,5%. Como aqui empregado, o termo "pureza" no contexto de histidina, refere-se à pureza química de histidina como é entendido na técnica, por exemplo, como descrito no índice Merck, 13a. ed. 0'Neil et al., ed. (Merck & Co. 2001).

Quando uma concentração de um tampão é referido, pretende-se que a concentração descrita represente a concentração molar da forma de ácido livre ou base do tampão. Por exemplo, a concentração do tampão, quando presente em determinadas composições farmacêuticas líquidas pode variar de cerca de 0,1 milimolar (mM) a cerca de 100 mM. Numa modalidade, a concentração do tampão é de cerca de 1 mM a cerca de 50 mM. Numa outra modalidade, a concentração do tampão é de cerca de 1 mM a cerca de 50 mM. Numa outra modalidade, a concentração do tampão é de cerca de 5 a cerca de 30 mM. Em varais modalidades, a concentração do tampão é cerca de 1 mM, cerca de 5 mM, cerca de 10 mM, cerca de 15 mM, cerca de 20 mM, cerca de 25 mM, cerca de 30 mM, cerca de 35 mM, cerca de 40 mM, cerca de 45 mM, cerca de 50 mM, cerca de 55 mM, cerca de 60 mM, cerca de 65 mM, cerca de 70 mM, cerca de 75 mM, cerca de 80 mM, cerca de 80 mM, cerca de 85 mM, cerca de 90 mM, cerca de 95 mM, ou cerca de 100 mM. Numa modalidade, a concentração de histidina na composição farmacêutica é de cerca de 10 mM. Numa outra modalidade, a composição farmacêutica contém, cerca de 10 mM de L-histidina ( na forma de base). Numa outra modalidade, a concentração de histidina na composição farmacêutica é cerca de 20 mM> Numa outra modalidade, a composiçãofarmacêutica contem cerca de 20 mM de L-histidina (na forma de base). Faixas intermediárias às concentrações dehistidina supracitadas também pretendem fazer parte da invenção. Por exemplo, faixas de valores usando uma combinação de quaisquer dos valores supracitados como limites superiores e/ou inferiores destinam-se a estar incluídos.

Em geral, o tampão é usado para manter um nivel de pH aceitável (que pode afetar a estabilidade do anticorpo)na composição farmacêutica liquida. A composição farmacêutica liquida, tipicamente é tamponada para manter um pH na faixa de cerca de 4 a cerca de 8, de cerca de 4,5 a cerca de 7, de cerca de 5,0 a 6,5, ou de cerca de 5,3 a cerca de 6,3. Faixas intermediárias aos pH's supracitados também se destinam a fazer parte desta invenção. Por exemplo, faixas de valores usando uma combinação de quaisquer dos valores supracitados como imites superiores e/ou inferiores destinam-se a estar incluídos. Numa modalidade, a composição farmacêutica liquida é tamponadapara manter um pH de cerca de 5,5. Numa outra modalidade, a composição farmacêutica liquida é tamponada para manter um pH de cerca de 6,0.

Como supracitado, as composições da presente invenção, podem compreender opcionalmente, ainda um agente de tonicidade farmaceuticamente aceitável além de um agente quelante. Como aqui empregado, os termos "agente de tonicidade" ou "tonificante" refere-se a um excipiente que pode ajustar a pressão osmótica de uma formulação deanticorpo liquida. Em algumas modalidades, o agente de tonicidade pode ajustar a pressão osmótica de uma formulação de anticorpo liquida para isôtonica, de forma que, a formulação de anticorpo fique fisiologicamente compatível com as células do tecido corpóreo do indivíduo. Em ainda outras modalidades, o "agente de tonicidade" pode contribuir para uma melhoria na estabilidade de quaisquer anticorpos anti-CTLA-4 aqui descritos. Uma formulação "isotônica" é uma que tem , essencialmente, a mesma pressão osmótica do sangue humano. Formulações isotônicas, têm geralmente uma pressão osmótica de cerca de 250 a 350 mOsm. O termo "hipotônico" descreve uma formulação com uma pressão osmótica abaixo daquela do sangue humano.

Correspondentemente, o termo "hipertônico" é empregado para descrevem uma formulação com uma pressão osmótica acima daquela do sangue humano. A isotonicidade pode ser medida usando-se uma pressão de vapor ou osmômetro do tipo congelamento em gelo, por exemplo.

0 agente de tonicidade usado para preparar as composições da presente invenção podem existir em diferentes formas. Quando o agente de tonicidade está em questão, pretende-se que todas essas diferentes formas sejam abrangidas pelo nome de "agente de tonicidade". Por exemplo, o agente de tonicidade pode estar numa forma enantiomérica (por exemplo, enantiômero L- ou D-) ; ou forma racêmica; isômeros tais como alfa ou beta, incluindo alfa, alfa; ou beta, beta; ou alfa, beta; ou beta, alfa; uma forma de ácido livre ou base livre; uma forma hidratada (por exemplo,monoidratada) ou uma forma anidra.

Numa modalidade, o agente de tonicidade é um sacarideo. Como aqui empregado, o termo "sacarídeo" refere-se a uma classe de moléculas que são derivadas de álcoois poliidricos. Sacarideos são normalmente referidos como carboidratos e podem conter diferentes quantidades de açúcar (sacarideo) por exemplo, monossacarideos, dissacarideos, e polissacarideos. Sacarideos que são adequados para uso como um agente de tonicidade na presente invenção, incluem, sem limitação, aos sacarideos selecionados do grupo consistindo de futose, glicose, manose, sorbose, xilose, lactose, maltose, sacarose, dextrana, pululan, dextrina, ciclodextrinas, amido solúvel, amido hidroxietila, glucanos hidrossolúveis e misturas destes.

Numa outra modalidade, o agente de tonicidade é um poliol. Como aqui empregado, o termo "poliol" refere-se a um excipiente com múltiplos grupos hidroxila, e inclui açúcares (açúcares redutores e não redutores) álcoois de açúcar e ácidos de açúcar. Numa modalidade, o poliol tem; um peso molecular menor que cerca de 600 kD(por exemplo, na faixa de cerca de 120 a cerca de 400 kD). Um "açúcar redutor" é aquele que contém um grupo hemiacetal que ode reduzir ions metálicos ou reagir covalentemente com lisina e outros grupos amino em proteínas e um "açúcar não redutor" é aquele que não tem essas propriedades de um açúcar redutor. Polióis adequados para emprego como um agente de tonicidade na presente invenção, incluem, sem limitação, polióis selecionados do grupo consistindo de manitol, trehalose,sorbitol, eritritol, isomaite, lactitol, maltitol, xilitol, glicerol, lactitol, propileno glicol, polietileno glicol, inositol e misturas dos acima. Numa modalidade, o agente de tonicidade é um açúcar não redutor selecionado do grupo consistindo de trehalose, sacarose e misturas dos acima.a

Numa modalidade, o agente de tonicidade é manitol. Numa outra modalidade, o agente de tonicidade é D-manitol. Numa outra modalidade, o agente de tonicidade é trehalose. Numa outra modalidade, o agente de tonicidade é a-trehalose diidratado. Numa outra modalidade, o agente de tonicidade é sacarose.

Numa modalidade, o agente de tonicidade é manitol. Numa outra modalidade, o agente de tonicidade é D-manitol. Numa outra modalidade, o agente de tonicidade é trehalose, Numa outra modalidade, o agente de tonicidade é a-trehalose diidratada. Numa outra modalidade, o agente de tonicidade é sacarose.

Numa modalidade, a concentração do agente de tonicidade na composição farmacêutica liquida varia ide cerca de 1 milimolar a cerca de 600 milimolar, de cerca de 1 milimolar a cerca de 400 milimolar, de 1 milimolar a cerca de 300 milimolar, ou de 200 milimolar a cerca, de 275 milimolar. Numa outra modalidade, o agente de tonicidade é manitol e está presente na composição farmacêutica liquida a uma concentração de cerca de 247 milimolar. Numa outra modalidade, o agente de tonicidade é trehalose e está presente na composição farmacêutica liquida a uma concentração de cerca de 222 milimolar. Numa outramodalidade, o agente de tonicidade é trehalose e está presente na composição farmacêutica liquida a uma concentração de cerca de 238 milimolar. Numa outra modalidade, o agente de tonicidade, é sacarose estando presente na composição farmacêutica liquida a uma concentração de cerca de 263 milimolar.

Numa modalidade, a concentração do agente de tonicidade na composição farmacêutica liquida varia de cerca de 1 milimolar a cerca de 300 mg/mL, de cerca de 1 mg/mL a cerca de 200 mg/mL, ou de cerca de 50 mg/mL a cerca de 150 mg/mL. Numa outra modalidade, o agente de tonicidade é manitol e está presente na composição farmacêutica liquida a uma concentração de cerca de 45 mg/mL milimolar. Numa outra modalidade o agente de tonicidade é trehalose e está presente na composição farmacêutica liquida a uma concentração de cerca de 84 mg/mL. Numa outra modalidade, o agente de tonicidade é trehalose e está presente na composição farmacêutica liquida a uma concentração de cerca de 90 mg/mL. Numa outra modalidade, o agente de tonicidade é sacarose e está presente na composição farmacêutica liquida a uma cód de cerca de 90 mg/mL.

Numa modalidade, o agente de tonicidade é um sal tal como cloreto de sódio. Numa modalidade, quanto o agente de tonicidade é um sal a concentração do sal na composição farmacêutica liquida varia de cerca de 1 mg/mL a cerca de 20 mg/mL. Numa outra modalidade, o agente de tonicidade é cloreto de sódio e a concentração do cloreto de sódio na composição farmacêutica liquida é de cerca de 8,18 mg/ml.Faixas intermediárias das concentrações do agente de tonicidade supracitadas são também destinadas a fazer parte desta invenção. Por exemplo, faixas de valores usando uma combinação de quaisquer valores supracitados, como limites superiores e/ou inferiores pretendem estar incluídos.

Faixas intermediárias às concentrações do agente de tonicidade supracitado de quaisquer valores supracitados, como limites superiores e/ou inferiores pretendem estar incluídos.

Como aqui empregado, as composições da presente invenção, podem opcionalmente, compreender ainda um tensoativo farmaceuticamente aceitável além de um agente quelante. Como aqui empregado, o termo "tensoativo1 refere-se a um excipiente que, pode alterar a tensão superficial de uma formulação de anticorpo liquida. Em algumas modalidades, o tensoativo reduz a tensão superficial de uma formulação de anticorpo liquida. Em outras modalidades ainda, o "tensoativo" pode contribuir para; uma melhora na estabilidade de quaisquer anticorpos anti-CTLA-4 presentes. Por exemplo, o tensoativo pode reduzir a agregação do anticorpo formulado e/ou minimizar, a formação de particulados na formulação e/ou reduzir a adsorção. O tensoativo pode ainda melhorar a estabilidade do anticorpo durante e após um ciclo de congelamento/descongelamento.

Tensoativos adequados incluem tensoativos de polisorbato, poloxâmeros (por exemplo, poloxâmerro 18 e 4 07) , tensoativos triton, tais como Triton X-100ÍR),tensoativos de polisrobato, tais como Tween 20(R) e Tween 80 <R>, dodecil sulfato de sódio, lauril sulfato de sódio, octil glicosideo de sódio, lauril-sulfobetaina, miristil-sulfobetaina, linoleil-sulfobetaina, estearil-sulfobetaina, lauril-sarcosina, miristil-sarcosina, linoleil-sarcosina, estearil-sarcosina, linoleil-betaina, miristil-betaina, cetil-betaina, lauroamidopropil-betaina, cocamidopropil-betaina, linoleamidopropil-betaina, miristamidopropil-betaina, palmidopropil-betaina, isoestearamidopropil-betaina, miristamidopropil-dimetilamina, palmidopropil-dimetilamina, isoestearamidopropil-dimetilamina, metil cocoil-taurato de sódio, metil oleil-taurato dissódico, cloreto de di-hidroxipropil Peg 5 linoeamônio, polietileno glicol, polipropileno glicol, e misturas dos acima.

Numa modalidade, o tensoativo é tensoativo de polisorbato compreendendo pelo menos um excipiente selecionado do grupo consistindo de polisorbato 20, polisorbato 21, polisorbato 40, polisorbato 60, polisorbato 61, polisorbato 65, polisorbato 80, polisorbato 81, polisorbato 85 e misturas destes'. Numa outra modalidade, a composição farmacêutica liquida compreende polisorbato 80.

A concentração do tensoativo, quando presente na concentração, varia em geral, de cerca de 0,01 mg/mL a cerca de 10 mg/mL, de cerca de 0,05 mg/mL a cerca de 5,0 mg/mL, de cerca de 0,1 mg/mL a cerca de 1,0 mg/mL, ou de cerca de 0,2 mg/mL a cerca de 0,7 mg/mL.' Numa outra modalidade, o tensoativo está presente numa quantidade que é cerca de 0,2 mg/mL. Numa outra modalidade, o tensoativo está presentenuma proporção que é cerca de 0,5 mg/mL. numa modalidade, a composição farmacêutica liquida contém cerca de 0,2 mg/mL de polisorbato 79, Numa outra modalidade, a composição farmacêutica liquida contém cerca de 0,4 mg/mL de polisorbato 80. Numa outra modalidade, a composição farmacêutica liquida contém cerca de 0,5 mg/mL de polisorbato 80.

Faixas intermediárias das concentrações de tensoativo supracitadas também se destinam a fazer parte desta invenção. Por exemplo, faixas de valores usando uma combinação de quaisquer valores supracitados como limites superiores e/ou inferiores pretendem estar incluídas.

As composições da presente invenção podem, ainda compreender um antioxidante farmaceuticamente aceitável, além de um agente quelante. Antioxidantes adequados incluem, sem limitação, metionina, tiosulfato de sódio, catalase e platina. Por exemplo, a composição farmacêutica liquida pode conter metionina numa concentração variando desde 1 mM a cerca de 100 rriM, e, particularmente, é cerca de 27 mM.

Numa modalidade, a presente invenção compreende uma composição que tem pelo menos um anticorpo compreendendo uma seqüência de aminoácido que é pelo menos 95% idêntica a uma seqüência de aminoácido de cadeia pesada mostrada em SEQ ID NO: 2, compreendendo ainda uma seqüência de aminoácido que é pelo menos 95% idêntica a uma seqüência de aminoácido de cadeia leve mostrada em" SEQ ID NO: 4, onde o anticorpo liga-se a CTLA-4 humano; e um agente quelante.Numa modalidade, a presente invenção compreende uma composição que tem pelo menos um anticorpo compreendendo uma seqüência de aminoácido que é pelo menos 95% idêntica a uma seqüência de aminoácido de cadeia pesada mostrada em SEQ ID NO: 2, compreendendo ainda uma seqüência de aminoácido que é pelo menos 95% idêntica a uma seqüência de aminoácido de cadeia leve mostrada em SEQ ID NO: 4, onde o anticorpo liga-se a CTLA-4 humano; e um agente quelante.

Numa modalidade, a presente invenção abrange uma composição farmacêutica compreendendo pelo menos umanticorpo monoclonal anti-CTLA-4, onde o anticorpo liga-se a CTLA-4 humano e um agente quelante.

Numa modalidade, a presente invenção abrange uma composição compreendendo pelo menos um anticorpo monoclonal anti-CTLA-4, onde o anticorpo liga-se a CTLA-4 humano e um agente quelante.

Numa modalidade, a presente invenção compreende uma composição que tem pelo menos um anticorpo compreendendo uma seqüência de aminoácido que é pelo menos 95% idêntica a uma seqüência de amiíioácido de cadeia pesada mostrada em SEQ ID NO: 2, compreendendo ainda uma seqüência de aminoácido que é pelo menos 95% idêntica a uma seqüência de aminoácido de cadeia leve mostrada em SEQ ID NO: 4, onde o anticorpo liga-se a CTLA-4 humano; e um excipiente farmaceuticamente aceitável, onde a composição contem uma concentração do anticorpo que é pelo menos cerca de 10 mg/mL, pelo menos 15 mg/ML, pelo menos 20 mg/mL ou pelo menos cerca de 25 mg/mL.

Numa modalidade, a presente invenção compreendeuma composição farmacêutica liquida que tem pelo menos um anticorpo compreendendo uma seqüência de aminoácido que é pelo menos 95% idêntica a uma seqüência de aminoácido de cadeia pesada mostrada em SEQ ID NO: 2, compreendendo ainda uma seqüência de aminoácido que é pelo menos 95% idêntica a uma seqüência de aminoácido de cadeia leve mostrada em SEQ ID NO: 4, onde o anticorpo liga-se a CTLA-4 humano; e um excipiente farmaceuticamente aceitável, onde a composição contem uma concentração do anticorpo que varia de cerca de 10 mg/mL a cerca de 200 mg/mL.

Numa modalidade, a presente invenção compreende uma composição que tem pelo menos um anticorpo compreendendo uma seqüência de aminoácido que é pelo menos 95% idêntica a uma seqüência de aminoácido de cadeia pesada mostrada em SEQ ID NO: 2, compreendendo ainda uma seqüência de aminoácido que é pelo menos 95% idêntica a uma seqüência de aminoácido de cadeia leve mostrada em SEQ ID NO: 4, onde o anticorpo liga-se a CTLA-4 humano; e um excipiente farmaceuticamente aceitável, onde a composição contem uma concentração do anticorpo que" varia de cerca de 15 mg/mL a cerca de 200 mg/mL.

Numa modalidade, a presente invenção compreende uma composição que tem pelo menos um anticorpo compreendendo uma seqüência de aminoácido que é pelo menos 95% idêntica a uma seqüência de aminoácido de cadeia pesada mostrada em SEQ ID NO: 2, compreendendo ainda uma seqüência de aminoácido que é pelo menos 95% idêntica a uma seqüência de aminoácido de cadeia leve mostrada em SEQ ID NO: 4, onde o anticorpoliga-se a CTLA-4 humano; e um excipiente farmaceuticamente aceitável, onde a composição contem uma concentração do anticorpo que varia de cerca de 20 mg/mL a cerca de 200 mg/mL.

Numa modalidade, a presente invenção compreende uma composição que tem pelo menos um anticorpo compreendendo uma seqüência de aminoacido que é pelo menos 95% idêntica a uma seqüência de aminoacido de cadeia pesada mostrada em SEQ ID NO: 2, compreendendo ainda uma seqüência de aminoacido que é pelo menos 95% idêntica a uma seqüência de aminoacido de cadeia leve mostrada em SEQ ID NO: 4, onde o anticorpo liga-se a CTLA-4 humano; e um excipiente farmaceuticamente aceitável, onde a composição contem uma concentração do anticorpo que varia de cerca de 50 mg/mL a cerca de 200 mg/mL.

Numa modalidade, a presente invenção compreende uma composição farmacêutica liquida que tem pelo menos um anticorpo compreendendo uma seqüência de aminoacido que é pelo menos 95% idêntica a uma seqüência de aminoacido de cadeia pesada mostrada em SEQ ID NO: 2, compreendendo ainda uma seqüência de aminoacido que é pelo menos 95% idêntica a uma seqüência de aminoacido de cadeia leve mostrada em SEQ ID NO: 4, onde o anticorpo liga-se a CTLA-4 humano; e um excipiente farmaceuticamente aceitável, onde a composição contem uma concentração do anticorpo que varia de cerca de 100 mg/mL a cerca de 200 mg/mL.

Numa modalidade, a presente invenção compreende uma composição que tem pelo menos um anticorpo compreendendouma seqüência de aminoacido que é pelo menos 95% idêntica a uma seqüência de aminoacido de cadeia pesada mostrada em SEQ ID NO: 2, compreendendo ainda uma seqüência de aminoacido que é pelo menos 95% idêntica a uma seqüência de aminoacido de cadeia leve mostrada em SEQ ID NO: 4, onde o anticorpo liga-se a CTLA-4 humano; e um excipiente farmaceuticamente aceitável, onde a composição contem uma concentração do anticorpo que varia de cerca de 10 mg/mL a cerca de 25 mg/mL.

Numa modalidade, a presente invenção compreende uma composição que tem pelo menos um anticorpo compreendendo uma seqüência de aminoacido que é pelo menos 95% idêntica a uma seqüência de aminoacido de cadeia pesada mostrada em SEQ ID NO: 2, compreendendo ainda uma seqüência de aminoacido que é pelo menos 95% idêntica a uma seqüência de aminoacido de cadeia leve mostrada em SEQ ID NO: 4, onde o anticorpo liga-se a CTLA-4 humano; e um excipiente farmaceuticamente aceitável, onde a composição contem uma concentração do anticorpo que é cerca de 20 mg/mL.

Numa modalidade, a composição farmacêutica liquida compreende de cerca de 0,01 mg/mL a cerca de 200 mg/mL do anticorpo monoclonal anti-CTLA-4 tilimumab, e de cerca de 0,3 micromolar a cerca de 50 milimolar do agente quelante.

Numa outra modalidade, a composição farmacêuticaliquida compreende de cerca de 0,1 mg/mL a cerca de 100 mg/mL do anticorpo monoclonal anti-CTLA-4 tilimumab, e de cerca de 3 micromolar a cerca de 5,0 milimolar do agente quelante.

Numa outra modalidade, a composição farmacêutica liquida compreende de cerca de 0,1 mg/mL a cerca de 100 mg/mL do anticorpo monoclonal anti-CTLA-4 tilimumab, e de cerca de 0,27 milimolar do agente quelante.

Numa outra modalidade, a composição farmacêutica liquida compreende de cerca de 0,1 mg/mL a cerca de 100 mg/mL do anticorpo monoclonal anti-CTLA-4 tilimumab, e de cerca de 0,3 micromolar a cerca de 50 milimolar de EDTA.

Numa outra modalidade, a composição farmacêutica liquida compreende de cerca de 0,1 mg/mL a cerca de 100 mg/mL do anticorpo monoclonal anti-CTLA-4 tilimumab, e de cerca de 3 micromolar a cerca de 10,0 milimolar de EDTA.

Numa outra modalidade, a composição farmacêutica liquida compreende de cerca de 0,1 mg/mL a cerca de 100 mg/mL do anticorpo monoclonal anti-CTLA-4 tilimumab, e de cerca de 0,1 micromolar a cerca de 1,0 milimolar de EDTA.

Numa outra modalidade, a composição farmacêutica liquida compreende de cerca de 0,1 mg/mL a cerca de 100 mg/mL do anticorpo monoclonal anti-CTLA-4 tilimumab, e de cerca de 0,27 micromolar de EDTA.

Numa outra modalidade, a composição farmacêutica liquida compreende de cerca de 0,1 mg/mL a cerca de 100 mg/mL do anticorpo monoclonal anti-CTLA-4 tilimumab, e de cerca de 3 micromolar a cerca de 5,0 milimolar de DTPA.Numa outra modalidade, a composição farmacêutica liquida compreende de cerca de 0,1 mg/mL a cerca de 100 mg/mL do anticorpo monoclonal anti-CTLA-4 tilimumab, e de cerca de 3 micromolar a cerca de 5,0 milimolar de deferoxamina.

Numa outra modalidade, a composição farmacêutica liquida compreende de cerca de 0,01 mg/mL a cerca de 200 mg/mL do anticorpo monoclonal anti-CTLA-4 tilimumab, e de cerca de 1 mM a cerca de lOOmM de histidina.

Numa outra modalidade, a composição farmacêutica liquida compreende de cerca de 0,1 mg/mL a cerca de 200 mg/mL do anticorpo monoclonal anti-CTLA-4 tilimumab, e de cerca de 3 micromolar a cerca de 5,0 milimolar do agente quelante; e de cerca de 1 mM a cerca de 100 mM de histidina.

Numa outra modalidade, a composição farmacêutica liquida compreende de cerca de 0,1 mg/mL a cerca de 200 mg/mL do anticorpo monoclonal anti-CTLA-4 tilimumab, e de cerca de 3 micromolar a cerca de 5,0 milimolar do agente quelante; e de cerca de 10 milimolar a cerca de 400 milimolar de trehalose.

Numa outra modalidade, a composição farmacêutica liquida compreende de cerca de 0,1 mg/mL a cerca de 200 mg/mL do anticorpo monoclonal anti-CTLA-4 tilimumab, de cerca de 3 micromolar a cerca de 5,0 milimolar do agente quelante, de cerca de 10 milimolar a cerca de 4 00 milimolar de trehalose, e de cerca de 1 mM a cerca de 100 mM de histidina.

Numa outra modalidade, a composição farmacêuticalíquida compreende de cerca de 0,1 mg/mL a cerca de 200 mg/mL do anticorpo monoclonal anti-CTLA-4 tilimumab, de cerca de 3 micromolar a cerca de 5,0 milimolar do agente quelante, de cerca de 10 milimolar a cerca de 400 milimolar de trehalose, de cerca de 1 mM a cerca de 100 mM de histidina; e de cerca de 0,005 milimolar a cerca de 10 milimolar de polisorbato 80.

Numa outra modalidade, a composição farmacêutica líquida compreende de cerca de 0,1 mg/mL a cerca de 200 mg/mL do anticorpo monoclonal anti-CTLA-4 tilimumab, de cerca de 3 micromolar a cerca de 5,0 milimolar de EDTA, de cerca de 10 milimolar a cerca de 400 milimolar de um agente de tonicidade, de cerca de 1 mM a cerca de 100 mM de um tampão; e de cerca de 0,005 milimolar a cerca de 10 milimolar de um tensoativo.

Numa outra modalidade, a composição farmacêutica líquida compreende de cerca de 0,1 mg/mL a cerca de 200 mg/mL do anticorpo monoclonal anti-CTLA-4 ticilimumab, de cerca de 3 micromolar a cerca de 5,0 milimolar de EDTA, de cerca de 10 milimolar a cerca de 400 milimolar de um agente de tonicidade; de cerca de 1 mM a cerca de 100 mM de histidina; e de cerca de 0,005 milimolar a cerca de 10 milimolar de um tensoativo.

Numa outra modalidade, a composição farmacêutica líquida compreende de cerca de 0,1 mg/mL a cerca de 200 mg/mL do anticorpo monoclonal anti-CTLA-4 ticilimumab, de cerca de 3 micromolar a cerca de 5,0 milimolar de EDTA, de cerca de 10 milimolar a cerca de 400 milimolar de trehalose;de cerca de 1 mM a cerca de 100 mM de histidina; e de cerca de 0,005 milimolar a cerca de 10 milimolar de um tensoativo.

Em alguns aspectos da presente invenção, as composições do anticorpo anti-CTLA-4 liquidas compreendem de cerca de 0,1 mg/mL a cerca de 200 mg/mL do anticorpo monoclonal anti-CTLA-4 ticilimumab; de cerca de 1 mM a cerca de lOOmM de histidina; de cerca de 0, 005 milimolar a cerca de 10 milimolar de polisorbato 80; de cerca de 3 micromolar a cerca de 5,0 milimolar de EDTA e de cerca de 10 milimolar a cerca de 400 milimolar de trehalose

Em outros aspectos da presente invenção, as composições do anticorpo anti-CTLA-4 liquidas compreendem de cerca de 1,0 mg/mL a cerca de 100 mg/mL do anticorpo monoclonal anti-CTLA-4 ticilimumab; de cerca de 10 mM a cerca de 50 mM de histidina; de cerca de 0,01 milimolar a cerca de 1,0 milimolar de polisorbato 80; de cerca de 3 micromolar a cerca de 5,0 milimolar de EDTA e de cerca de 100 milimolar a cerca de 300 milimolar de trehalose.

Em outros aspectos da presente invenção, as composições do anticorpo anti-CTLA-4 liquidas compreendem de cerca de 10 mg/mL a cerca de 50 mg/mL do anticorpo monoclonal anti-CTLA-4 ticilimumab; de cerca de 10 mM a cerca de 30 mM de histidina; de cerca de 0,05 milimolar a cerca de 0,5 milimolar de polisorbato 80; de cerca de 0,1 micromolar a cerca de 1 milimolar de EDTA e de cerca de 200 milimolar a cerca de 250 milimolar de trehalose.

Em outros aspectos da presente invenção, as composições do anticorpo anti-CTLA-4 liquidas compreendemcerca de 20 mg/mL do anticorpo monoclonal anti-CTLA-4 ticilimumab; cerca de 20 mM de histidina; cerca de 0,15 milimolar de polisorbato 80; cerca de 0,27 milimolar de EDTA; e cerca de 222 milimolar de trehalose.

Numa outra modalidade, a invenção é direcionada a uma composição farmacêutica liquida estável compreendendo um anticorpo anti-CTLA-4 e um agente quelante farmaceuticamente aceitável, onde a concentração molar do anticorpo varia de cerca de 0, 0006 milimolar a cerca de 1,35 milimolar e a concentração molar do agente quelante varia de cerca de 0, 003 milimolar a cerca de 50 milimolar, e onde a relação molar do anticorpo para agente quelante varia de cerca de 0,0001 a cerca de 450; de cerca de 0,0001 a cerca de 100, de cerca de 0, 005 a cerca de 50; de cerca de 0,001 a cerca de 10; de cerca de 0,01 a cerca de 5; de cerca de 0,1 a cerca de 1, ou é cerca de 0,5.

Numa outra modalidade, a invenção é direcionada a uma composição farmacêutica liquida estável compreendendo ticilimumab e um agente quelante farmaceuticamente aceitável, onde a concentração molar do anticorpo varia de cerca de 0, 0006 milimolar a cerca de 1,35 milimolar e a concentração molar do agente quelante varia de cerca de 0, 003 milimolar a cerca de 50 milimolar, e onde a relação molar do anticorpo para agente quelante varia de cerca de 0, 0001 a cerca de 450; de cerca de 0, 0001 a cerca de 100, de cerca de 0,005 a cerca de 50; de cerca de 0,001 a cerca de 10; de cerca de 0,01 a cerca de 5; de cerca de 0,1 a cerca de 1, ou é cerca de 0,5.Numa outra modalidade, a invenção é direcionada a uma composição farmacêutica liquida estável compreendendo ticilimumab, um agente quelante farmaceuticamente aceitável e histidina, onde a concentração molar do anticorpo varia de cerca de 0, 0006 milimolar a cerca de 1,35 milimolar, a concentração molar do agente quelante varia de cerca de 0,003 milimolar a cerca de 50 milimolar, e a concentração molar de histidina varia de cerca de 1 milimolar a cerca de 100 milimolar, onde a relação molar do anticorpo para agente quelante varia de cerca de 0, 00001 a cerca de 450; de cerca de 0, 0001 a cerca de 100, de cerca de 0, 005 a cerca de 50; de cerca de 0,001 a cerca de 10; de cerca de 0,01 a cerca de 5; de cerca de 0,1 a cerca de 1, ou é cerca de 0,5.

Numa outra modalidade, a invenção é direcionada a uma composição farmacêutica liquida estável compreendendo ticilimumab, um agente quelante farmaceuticamente aceitável e histidina, onde a concentração molar do anticorpo varia de cerca de 0,0006 milimolar a cerca de 1,35 milimolar, a concentração molar do agente quelante varia de cerca de 0,003 milimolar a cerca de 50 milimolar, e a concentração molar de histidina varia de cerca de 10 milimolar a cerca de 50 milimolar, onde a relação molar do anticorpo para agente quelante varia de cerca de 0,0001 a cerca de. 100; de cerca de 0, 005 a cerca de 50; de cerca de 0,001 a cerca de 10; de cerca de 0,01 a cerca de 5; de cerca de 0,1 a cerca de 1, ou é cerca de 0,5,

Numa outra modalidade, a invenção é direcionada a uma composição farmacêutica liquida estável compreendendoticilimumab, um agente quelante farmaceuticamente aceitável e histidina, onde a concentração molar do anticorpo varia de cerca de 0,0006 milimolar a cerca de 1,35 milimolar, a concentração molar do agente quelante varia de cerca de 0,003 milimolar a cerca de 50 milimolar, e a concentração molar de histidina varia de cerca de 10 milimolar a cerca de 30 milimolar, onde a relação molar do anticorpo para agente quelante varia de cerca de 0,005 a cerca de 50; de cerca de 0,001 a cerca de 10, de cerca de 0,01 a cerca de 5; de cerca de 0,1 a cerca de 1, ou é cerca de 0,5.

Numa outra modalidade, a invenção é direcionada a uma composição farmacêutica liquida estável compreendendo ticilimumab, um agente quelante farmaceuticamente aceitável e histidina, onde a concentração molar do anticorpo varia de cerca de 0,0006 milimolar a cerca de 1,35 milimolar, a concentração molar do agente quelante varia de cerca de 0,003 milimolar a cerca de 50 milimolar, e a concentração molar de histidina é cerca de 20 milimolar, onde a relação molar do anticorpo para agente quelante varia de cerca dei 0,001 a cerca de 10; de cerca de 0,01 a cerca de 5; de cerca' de 0,1 a cerca de 1, ou é cerca de 0,5.

Métodos de Produzir Anticorpos anti-CTLA-4 e. Linhagens celulares Produtoras de Anticorpo:

Os anticorpos de acordo com a invenção podem ser preparados através da utilização de um camundongo. transgênico que possui uma parte substancial do genoma produtor de anticorpo humano inserido, mas que é tornado deficiente na produção de anticorpos endógenos, murinos.Tais camundongos, portanto, são capazes de produzir moléculas de imunoglobulina humana e anticorpos e são deficientes na produção de moléculas de imunoglobulina de murideos e anticorpos. As tecnologias utilizadas para se conseguir isto são as mesmas descritas abaixo.

É possivel produzir animais transgênico, (por exemplo, camundongos) capazes, com a imunização, de produzir um repertório completo de anticorpos humanos na ausência de produção de imunoglobulina endógena. Em particular,contudo, numa modalidade da produção transgênica de camundongos e ânticos dos mesmos está apresentada, na patente U.S. n° 6.682.736 para Hanson, et al. Através do uso dessa tecnologia, podem ser preparados os anticorpo que se ligam a CTLA-4 e os hibridomas produtores de tais anticorpos.

Anticorpos humanos evitam problemas potenciais associados com anticorpo que possuem regiões de murino ou de rato variáveis e/ou constantes. A presença de proteínas derivadas de tais murinos ou ratos pode levar à irápida depuração dos anticorpos, ou pode levar à geração de uma resposta imune contra o anticorpo por um indivíduo que recebe a administração de tais anticorpos.

Por exemplo, foi descrito que, a deleção do gene (JH) da região de união de cadeia pesada do anticorpo em camundongos mutantes quiméricos e da linhagem germinativa, resulta em completa inibição da produção de anticorpo endógeno. A transferência do arranjo genético de imunoglobulina da linhagem germinativa humana nessescamundongos mutantes de linhagem germinativa resultará na produção de anticorpos humanos com desafio ao antigeno (por exemplo, CTLA-4). Ver por exemplo, Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sei USA, 90:2551 (1993); Jakobovits et al., Nature, 362:255-259 (1993): Bruggermann et al, Year in Immuno, 7:33 (1993); e Duchosal et al., Nature 355:258 (1992). Anticorpos humanos também podem ser derivados de bibliotecas de visualização de fago (Hoogenboom et al., J Mol. Biol. 227:381 (1991); Marks et al., J Mol Biol, 222:581-597 (1991): Vaughan et al Nature Biotech 14:309 (1996)).

Em algumas modalidades, os anticorpos anti-CTLA-4 humanos podem ser produzidos através da imunização de um animal transgênico não humano por exemplo, camundongo XENOMOUSE™, cujo genoma compreende genes de imunoglobulina humana, de modo que, o camundongo recombinante produza anticorpos humanos.

Camundongos XENOMOUSE™ são linhagens de camundongos engenheiradas compreendendo grandes fragmentosde loci de cadeia pesada e cadeia leve de imunoglobulina humana e são deficientes na produção de anticorpo de camundongo. Camundongos XENOMOUSE ™ produzem um repertório humano semelhante ao adulto de anticorpos humanos completos e geram anticorpos humanos específicos ao antigeno. Em algumas modalidades, os camundongos XENOMOUSE™ contém aproximadamente 80% do repertório de gene V de anticorpo humano através da introdução de fragmentos de cromossomo artificial de levedura na conFiguração de linhagemgerminativa, com dimensão megabase (YAC) do loci de cadeia pesada humana e loci de cadeia leve kappa. Em outras modalidades, camundongos XENOMOUSE™ contém ainda aproximadamente todo o loci da cadeia leve lambda. Ver por exemplo, Green et al., Nature Genetics 7:13-21 (1994) e Patentes U.S. 5.916.771, 5.939.598, 5.985.615, 5.998.209, 6.075,171, 6.091,001, 6.114.598, 6.130.364, 6.162.963, e 6.150.584. Ver também WO 91/10741, WO 94/02602, WO96/34096, WO 96/33735, WO 98/16654, WO 98/24893, WO 98/50433, WO 99/45031, WO 99/53049, WO 00/09560 e WO 00/037504 .

Em algumas modalidades, o animal não humano compreende genes de imunoglobulina humana são animais que têm um "miniloci" de imunoglobulina humana. Na abordagem de miniloci, um loci Ig exógeno é imitado através da inclusão de genes individuais do loci Ig. Assim, um ou mais genes VH, um ou mais genes DH, um ou mais genes JH um dominio constante mu, e um segundo dominio constante (preferivelmente, um dominio constante gama) são formados num construtor para inserção ao animal. Esta tentativa está descrita inter alia, na Patente U.S. n°s 5.545.807, 5.545.806, 5.569.525, 5.625.126. 5.633.425, 5.661.016, , 5.770.429. 5.789.650, 5.814.318, 5.591.669, 5.612.205, 5.721.367, 5.789.215 e 5.643.763.

Portanto, em algumas modalidades, os anticorpos humanos podem ser produzidos por imunização de um animal não humano, compreendendo em seu genoma, algum ou todos os loci de cadeia pesada e cadeia leve de imunoglobulina humana comum antígeno CTLA-4.

Em algumas modalidades, o antígeno CTLA-4 é CTLA-4 isolado e/ou purificado. Numa modalidade preferida, o antígeno cTLA-4 é CTLA-4 humano. Em algumas modalidades, o antígeno cTLA-4 é um fragmento de CTLA-4. Em algumas modalidades, o fragmento CTLA-4 compreende pelo menos um epitopo de CTLA-4. Em outras modalidades, o antígeno CTLA-4 é uma célula que expressa ou superexpressa CTLA-4 ou um seu fragmento imunogênico, em sua superfície. Em ainda outras modalidades, o antígeno CTLA-4 é um proteína de fusão CTLA-4. CTLA-4 pode ser purificado de origens naturais usando técnicas conhecidas.

Numa modalidade preferida, o animal não humano é um animal XENOMOUSE ™ (Abgenix Ind. Fremont, CA). Um outro animal não humano que pose ser empregado é um camundongo transgênico produzido por Medarex (Medarex, Inc., Princeton, NJ) .

A imunização dos animais pode ser por qualquer método conhecido na técnica. Ver, por exemplo, Harlow e Lane Antibodies: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Press, 1990. Métodos para imunização de animais não humanos tais como camundongos, ratos, ovelha, cabras, porcos gado e cavalos são do conhecimento da técnica. Ver, por exemplo, Harlow and Lane supra e Patente U.S. 5.994.619. Numa modalidade preferida, o antígeno CTLA-4 é administrado com um adjuvante para estimular a resposta imunológica. Adjuvantes exemplares incluem adjuvante completo ou incompleto de Freund, RIBI (dipeptídeos muramil) ou ISCOM(complexos imunoestimulantes). Tais adjuvantes podem proteger o polipeptideo de rápida dispersão por seqüestro do mesmo num deposito local, ou eles podem conter substâncias que estimulam o hospedeiro a secretar fatores que são quimiotáticos para os macrófagos e outros componentes do sistema imunológico. Preferivelmente, caso seja administrado um polipeptideo, o programa de imunização pode envolver duas ou mais administrações do polipeptideo, no decurso de varias semanas.

Após imunização de um animal com um antigeno cTLA-4, os anticorpos e/ou células produtoras de anticorpo podem ser obtidos do animal. Em algumas modalidades, o soro contendo anticorpo anti-CTLA-4 é obtido do animal por sangramento ou sacrifício do animal. 0 soro pode ser usado como tal, oriundo do animal, uma fração de imunoglobulina pode ser obtida do soro, ou os anticorpos anti-CTLA-4 podem ser purificados do soro.

Em algumas modalidades, linhagens de célula imortalizadas produtoras do; anticorpo são preparadas de células isoladas do anima imunizado. Após imunização, os animais são sacrificados e o nódulo linfático e/ou células B esplênicas são imortalizadas. Métodos de imortalização de células incluem, sem limitação, a transfecção das mesmas com oncogenes, infecção das mesmas com um virus oncogênico, cultivo das mesmas sob condições que selecionam as células imortalizadas, submetendo-as aos compostos carcinogênicos ou mutantes, fusão das mesmas com uma célula imortalizada, por exemplo, uma célula de mieloma, e inativação de um genesupressor de tumor. Ver, por exemplo, Harlow e Lane, supra. Numa modalidade preferida, o animal imunizado é um animal não humano que expressão genes de imunoglobulina humana e as células B esplênicas são fundidas a uma linhagem de célula de mieloma das mesmas espécies do animal não humano. Numa modalidade mais preferidas, o animal imunizado é um animal XENOMOUSE™ e a linhagem de célula de mieloma é um mieloma de camundongo não secretor. Numa modalidade ainda mais preferida, a linhagem de célula de mieloma é P3-X63-AG8-653. Caso a fusão com células de mieloma seja usada, as células de mieloma preferivelmente, não secretam polipeptideos de imunoglobulina (uma linhagem de célula não secretora). As células imortalizadas são escolhidas usando CTLA-4, uma parte deste, ou um CTLA-4 expressando a célula. Numa modalidade preferida, a seleção criteriosa inicial é realizada usando um ELISA (imunoensaio ligado à enzima) ou um radioimunoensaio. Um exemplo de seleção por ELISA é dado em WO 00/37504.

Células produtoras de anticorpo anti-CTLA-4 (por exemplo, hibridomas, são selecionadas, clonadas e ainda selecionadas para características desejáveis, incluindo crescimento robusto, alta produção de anticorpo e desejáveis características do anticorpo, conforme descrito ainda a seguir. Os hibridomas podem ser expandidos in vitro em animais singenéicos, em animais que carecem de um sistema imune, por exemplo, camundongos escalvados, ou em cultura celular in vitro. Métodos de seleção, clonagem e expansão de hibridomas são do conhecimento da prática técnica.Como será apreciado, os anticorpos de acordo com a presente invenção podem ser expressados recombinantemente, em linhagens celulares diferente das linhagens celulares de hibridoma. Seqüências de ácido nucléico codificando os cDNAs ou clones genômicos para anticorpos particulares podem ser usadas para transformação de uma célula de mamífero adequado, ou células hospedeiras, que não de mamífero.

A presente invenção também abrange moléculas de ácido nucléico codificando anticorpos anti-CTLA-4. Em algumas modalidades, diferentes moléculas de ácido nucléico codificam uma cadeia pesada e uma cadeia leve de uma imunoglobulina anti-CTLA-4. Em outras modalidades, a mesma molécula de ácido nucléico codifica uma cadeia pesada e uma cadeia leve de uma imunoglobulina anti-CTLA-4. Numa modalidade, o ácido nucléico codifica um anticorpo anti-CTLA-4 da invenção.

Uma molécula de ácido nucléico codificando a cadeia pesada ou toda leve de um anticorpo anti-CTLA-4 ou partes deles podem ser isoladas de qualquer fonte que produza esse anticorpo. Em várias modalidades, as moléculas de ácido nucléico são isoladas de uma célula B isolada de um animal imunizado com um anti-CTL4 ou de uma célula imortalizada derivada dessa célula B que, expressa um anticorpo anti-CTLA-4. Métodos de isolamento de mRNA codificando um anticorpo são bem conhecidos na técnica. Ver, por exemplo, Sambrook, et al., Molecular Cloning 3a. Ed. Vol 3 (1989). O mRNA pode ser usado para produzir cDNA para uso na reação em cadeia da polimerase (PCR) ou clonagemde cDnA de genes do anticorpo. Numa modalidade preferida, amolécula de ácido nucléico é isolada de um hibridoma que temcomo um de seus pares de fusão, uma célula produtora deimunoglobulina humana de um animal transgênico não humano.Numa modalidade ainda mais preferida, a célula produtora deimunoglobulina humana, é isolada de um animal XENOMOUSE ™.Numa outra modalidade, a célula produtora de imunoglobulinahumana é de um animal transgênico, que não camundongo, nãohumano, conforme descrito supra. Numa outra modalidade, oácido nucléico é isolado de um animal não transgênico nãohumano. As moléculas de ácido nucléico isoladas de umanimal não humano podem ser usadas, por exemplo, paraanticorpos humanizados.

Em algumas modalidades, um ácido nucléicocodificando uma cadeia pesada de um anticorpo anti-CTLA-4 dainvenção pode compreender uma seqüência de nucleotideocodificando um dominio VH da invenção unido em quadro a umaseqüência de nucleotideo codificando um dominio constante decadeia pesada de qualquer fonte. Similarmente, uma moléculade ácido nucléico codificando uma cadeia leve de umanticorpo anti-CTLA-4 da invenção pode compreender umaseqüência - de nucleotideo codificando um dominio VL dainvenção unido em quadro a uma seqüência de nucleotideocodificando um dominio VL da invenção unido em quadro a umaseqüência de nucleotideo codificando um dominio constante decadeia leve de qualquer fonte.

Num aspecto adicional da invenção, moléculas deácido nucléico codificando o dominio variável das cadeiaspesada (VH) e leve (VL) são "convertidas" em genes de

anticorpo de comprimento total por inserção num vetor deexpressão já codificando os dominios constantes de cadeiapesada (CH) ou dominios constantes de cadeia leve (CL)(,respectivamente, tal que o segmento VH seja operativamenteligado aos segmentos CH dentro do vetor, e o segmento VL éoperativamente ligado ao segmento CL dentro do vetor. Numaoutra modalidade, moléculas de ácido nucléico codificando osdominios VH e/ou VL soa convertidos nos genes do anticorpode comprimento total por ligação, por exemplo, ligando umamolécula de ácido nucléico codificando um dominio VH e/ou VLa uma molécula de ácido nucléico codificando um dominio CHe/ou CL usando técnicas de biologia molecular padrão.Seqüências de ácido nucléico dos genes do dominio constantede imunoglobulina de cadeia pesada e leve humana sãoconhecidos na técnica. Ver, por exemplo, Kabat et al.,sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a. Ed. NIHPubi. N° 91-32 42, 1991. Moléculas de ácido nucléicocodificando as cadeias pesada e/ou leve de comprimento totalpodem então ser expressadas de uma célula para a qual elasforam introduzidas e o anticorpo anti-CTLA-4 isolado.

A presente invenção também proporciona vetorescompreendendo moléculas de ácido nucléico que codificam acadeia pesada de um anticorpo anti-CTLA-4 da invenção ouuma.parte de ligação ao antigeno deste. A invenção tambémproporciona vetores compreendendo moléculas de ácidonucléico que codificam a cadeia leve desses anticorpos ouparte de ligação ao antigeno deste. A invenção prove aindavetores compreendendo moléculas de ácido nucléicocodificando proteína de fusão, anticorpos modificados,fragmentos de anticorpo e sondas genéticas dos mesmos.

Em algumas modalidades, os anticorpos anti-CTLA-4,ou partes de ligação ao antigeno da invenção são expressadospor inserção de DNAs codificando cadeias leve e pesadas decomprimento total ou parcial, obtidas como descrito supra,aos vetores de expresso tal que os genes são operativãmenteligados a seqüências de controle de 4expressão necessáriastais como seqüências de controle traducional etranscripcional. Vetores de expressão incluem plasmideos,adenovirus, virus adeno-associados (AAV), virus de plantatais como virus do mosaico da couve-flor, virus do mosaicodo tabaco, cosmideos, YACs, epissomas derivados de EBV esimilar. 0 gene de anticorpo é ligado ao vetor, tal que asseqüências de controle transcripcional e traducional dentrodo vetor, se prestam a sua função pretendida de regular atranscrição e tradução do gene de anticorpo. 0 vetor deexpressão e as seqüências de controle de expressão sãoescolhidos para compatibilidade com a célula hospedeira deexpressão usadas. 0 gene da cadeia leve do anticorpo e ogene da cadeia pesada do anticorpo podem ser inseridos emvetores separados, numa modalidade preferida, ambos os genessão inseridos ao mesmo vetor de expressão. Os genes doanticorpo são inseridos ao vetor de expressão por métodospadrão (por exemplo, ligação dos sitios de restriçãocomplementares no fragmento do gene do anticorpo e vetor, ouligação de extremidade cega, caso não estejam presentesnenhum sitio de restrição).

Um vetor conveniente é um que codifica umaseqüência de imunoqlobulina CH ou CL humana funcionalmentecompleta com sitios de restrição apropriados engenheiradosde modo que, qualquer seqüência VH ou VL possa ser facilmenteinserida e expressada, como descrito supra. Nesses vetores,a emenda ocorre, normalmente entre o sitio doador.da emendana região J inserida e o sitio receptor da emenda precedenteao dominio C humano, e ainda nas regiões de emenda queocorrem dentro de éxons CH humanos. A poliadenilação eterminação da transcrição ocorre em sitios cromossornaisnativos, a jusante das regiões de codificação. 0 vetor deexpressão recombinante . também pode codificar um peptideosinal que facilita a secreção da cadeia de anticorpo de umacélula hospedeira. 0 gene da cadeia do anticorpo pode serclonado ao vetor, tal que o peptideo de sinal é ligado noquadro ao terminal amino da cadeia de imunoglobulina. 0peptideo de sinal pode ser um peptideo sinal deimunoglobulina ou um peptideo de sinal heterólogo (ouseja, um peptideo de sinal de uma proteina, diferente deimunoglobulina).

Além dos genes da cadeia de anticorpo, os vetoresde expressão recombinantes da invenção portam seqüênciasreguladoras, que controlam a expressão dos genes da cadeiado anticorpo numa célula hospedeira. Será considerado pelosversados na técnica que, o desenho do vetor de expressão,incluindo a seleção das seqüências reguladoras, podedepender de fatores tais como a escolha da célula hospedeirapara transformação, do nivel de expressão da proteínadesejada etc. seqüências reguladoras preferidas paraexpressão de célula hospedeira de mamífero incluem elementosvirais que, direcionam altos níveis de expressão de proteínaem célula de mamífero, tais como promotores e/ouintensificadores derivados de retrovírus (tais como LTRsretrovirais), citomegalovírus (CMV) tais como opromotor/intensificador CMV),0 vírus de símio 40 (SV40) talcomo o promotor/intensificador SV40), adenovirus (porexemplo, o promotor tardio principal de adenovirus (AdMLP)),promotores de polioma e de mamífero robustos, tais como ospromotores de imunoglobulina nativa e actina. Para maisdescrição de elementos reguladores virais e seqüência dosmesmos, ver por exemplo, Patente U.S. n° 5.168.062, PatenteU.S. n° 4.510.245 e Patente U.S. n° 4.968.615. Métodos paraexpressão de anticorpos em plantas, incluindo uma descriçãodos promotores e vetores, bem como transformação de plantasé do conhecimento da técnica. Ver, por exemplo, Patentesdos Estados Unidos 6.51.529 ora incorporadas por referência.

Métodos de expressão de polipeptídeos em célulasbacterianas ou células fúngicas por exemplo, células delevedura, também são do conhecimento da técnica.

Além dos genes de cadeia do anticorpo e seqüênciasreguladoras, os vetores de expressão recombinante dainvenção podem portar seqüências adicionais, tais comoseqüências que regulam a replicação do vetor em célulashospedeiras (por exemplo, origens de replicação) e genemarcador selecionável. O gene marcador selecionávelfacilita a seleção de células hospedeiras para as quais ovetor foi introduzido (ver por exemplo, Patente U.S. n°.4.399.316, 4.634, 665, e 5.179.017 ) Por exemplo o genemarcador selecionável, confere, tipicamente resistência adrogas, tais como G418, hidromicina ou metotrexato, numacélula hospedeira para a qual o vetor foi introduzido.Genes marcadores selecionáveis preferidos incluem o genediidrofolato redutase (DHFR) (para uso em célulashospedeiras de DHFR com seleção/amplificação demetotrexato), o gene de resistência à neomicina (paraseleção de G418) e o gene glutamina sintetase.

Moléculas de ácido nucléico codificando anticorposanti-CTLA-4 e vetores compreendendo essas moléculas de ácidonucléico podem ser usadas para transformação de uma célulahospedeira de mamifero, planta, bacteriana ou de leveduraadequada. Anticorpos da invenção podem ser produzidostransgenicamente, através da geração de um mamifero ouplanta que é transgênica para as seqüências de cadeiapesada e leve de imunoglobulina de interesse, e produção doanticorpo numa forma recuperável das mesmas.

A transformação pode ser feita por qualquermétodos de introdução de polinucleotideos para a célulahospedeira, incluindo por exemplo, envolvendo opolinucleotideo num virus (ou num vetor viral) e transduçãode uma célula hospedeira com o virus (ou vetor) ou porprocedimentos de transfecção conhecidos na técnica, conformeexemplificado pelas Patentes U.S.4.399.216, 4.912.040,4.740.461, e 4.959.455. O procedimento de transformaçãousado depende do hospedeiro a ser transformado. Métodospara introdução de polinucleotideos heterólogos às célulasde mamífero são do conhecimento da técnica e incluem, semlimitação, a transfecção mediada por dextrana, ouprecipitação com fosfato de cálcio, transfecção mediada porpolibreno, fusão de protoplasto, e1etroporação,bombardeamento de partícula, encapsulação do (s)polinucleotideo(s) em lipossornas, conj ugados peptidicos,dendrimeros, e microinjeção direta do DNA aos núcleos.

Linhagem de célula de mamífero disponíveis comohospedeiros para expressão são conhecidas na técnica eincluem muitas linhagens de célula imortalizadas disponíveisde American Type Culture Collection (ATCC), e incluem, semlimitação, a células de ovário de hamster chinês (CHO),células NSO, células HeLa, células de rim de hamster jovem(BHK), células de rim de macaco (COS), células de carcinomahepatocelular humano (por exemplo Hep G2) e uma série deoutras linhagens celulares. Células que não de mamífero,incluem, sem limitação, bactéria, levedura, inseto e plantaque podem ser usados para expressar os anticorposrecombinantes. Mutagênese direcionada ao sitio do domínioCH2 do anticorpo para eliminar glicosilação pode serpreferida de modo a evitar mudanças em, se j aimunogenicidade, farmacocinética e/ou funções efetorasresultantes da glicosilação não humana. Os métodos deexpressão são selecionados determinando-se quais sistemasgeram os maiores niveis de expressão, produzindo anticorposcom propriedades de ligação a CTLA-4 constitutiva.Além disso, a expressão dos anticorpos da invenção(ou de outras frações destes) da produção de linhagens decélula pode ser melhorada usando uma série de técnicasconhecidas. Por exemplo, os sistemas de expressão genéticade glutamina sintetase e DHFR são abordagens comuns paraintensificar a expresso sob determinadas condições. Clonesde célula de alta expressão podem ser identificados usandotécnicas convencionais tais como clonagem com diluiçãolimitada e tecnologia de Microdrop. 0 sistema GlutaminaSintetase é discutido no todo ou em parte, em conexão com aPatente Européia n°s. 0 216 846, 0 256 055 e 0 323 997 ePedido de Patente Europeu n° 89303964.4.

Em conexão com a produção transgênica emmamíferos, os anticorpos podem também ser produzidos erecuperados do leite de cabras, vacas ou de outrosmamíferos. Ver, por exemplo, Patente US. ns. 5.827.690,5.756.687. 5.750.172 e 5.741.957.

Os anticorpos anti-CTLA-4 expressados em linhagenscelulares como descrito supra podem ser purificados e/ouisolados do material celular associado. Os anticorpos podeestar presentes em células totais, num lisado de célula, ounuma forma substancialmente pura, parcialmente purificada.A purificação é realizada de modo a eliminar outroscomponentes celulares ou outros contaminantes, por exemplo,outros ácidos nucleicos ou proteínas celulares, por técnicaspadrão, incluindo tratamento alcalino/SDS, cromatografia decoluna e outros do conhecimento da técnica. Ver Ausubel, F.et al., ed. Current Protocols in Molecular Biology, GreenePublishing and Wiley Interscience, New York (1987).

Na presente invenção, é possivel que, osanticorpos anti-CTLA-4 da presente invenção expressados pordiferentes linhagens celulares ou em animais transgênicostenham diferentes padrões de glicosilação entre si.Contudo, todos os anticorpos anti-CTLA-4 codificados pelosácidos nucléicos e aminoácidos aqui proporcionados sãoconsiderados parte da presente invenção, independentementede seu padrão de glicosilação ou modificação ou deleção dosmesmos. Assim, para efeito da presente invenção osanticorpos anti-CTLA-4 podem ser glicosilados ou nãoglicosilados. Quando, os anticorpos anti-CTLA-4 sãoglicosilados eles podem ter qualquer padrão possivel deglicosilação. Além disso, cada cadeia pesada com umanticorpo pode ter o mesmo padrão de glicosilação ou asduas cadeias pesadas podem ter diferentes padrões deglicosilação. A mutagênese direcionada ao sitio do dominioCH2 do anticorpo para eliminar a glicosilação também éabrangida pela presente invenção, de modo a preveniralterações, em funções de imunogenicidade, farmacocinéticae/ou efetora, resultantes da glicosilação não humana.

Como aqui empregado, o termo "glicosilação"refere-se ao padrão de unidades de carboidrato que sãoligadas covalentemente a um anticorpo. Quando se diz que osanticorpos anti-M-CTLA-4 presente, têm um dado padrão deglicosilação, significa que, a maior parte dos anticorposanti-CTLA-4 referenciados têm aquele padrão de glicosilaçãoparticular. Em outros aspectos, quando se diz que osanticorpos anti-M-CTLA-4 presentes têm um dado padrão deglicosilação, significa que maior que, ou igual a 50%, 75%,90%, 95%, 99%, ou 100% dos anticorpos anti-CTLA-4referenciados têm aquele padrão de glicosilação particular.

Os anticorpos anti-CTLA-4 da presente invençãotambém abrangem suas variantes de glicosilação (por exemplo,por inserção de um sitio- de glicosilação ou deleção dequalquer sitio de glicosilação por deleção, inserção ousubstituição de residuos de aminoácido adequados).

A glicosilação de polipeptideos é tipicamente ou-N-ligada ou O-ligada. A glicosilação dos polipeptideos deanticorpo é tipicamente N-ligada e forma uma estrutura bi-antenária. N-ligado refere-se à ligação da fraçãocarboidrato à cadeia lateral de um residuo de asparagina.

As seqüências tripeptidicas asparagina-X-serina easparagina-X-treonina, onde X é qualquer aminoácido, excetoprolina, são as seqüências de reconhecimento para ligaçãoenzimática da fração carboidrato à cadeia lateral deasparagina.Assim, a presença de quaisquer dessas seqüênciastripeptidicas num anticorpo cria um sitio de glicosilaçãopotencial.

As três estruturas distintas de glicanos bi-antenários são denominadas "GO", Gl" e G2" com zero, um oudois residuos galactose terminais, respectivamente, naextremidade não redutora do glicano. Ver Jefferis et al. ,Bíochem. J., 268, 529-537 (1990). Em alguns casos, aestrutura do glicano pode também ter um residuo fucoseligado a uma N-acetilglicosamina, que é covalentementeligada ao aminoácido asparagina (por exemplo, posição 2 97)encontrada no anticorpo. Quando a fucose (F) está presente,a nomenclatura glicano biantenaria é mudada para GOF", GIF"ou "G2F" dependendo do número de resíduos galactoseterminais. Ver Teillaud, Expert Opin. Biol. Ther 5(suppl.l)S15-S27 (2005). Além do mais, quando o anticorpo contém asduas cadeias pesadas, a nomenclatura do glicano é repetidapara cada uma das duas cadeias pesadas. A glicoforma "GOF,GOF" é uma espécie em que ambas as cadeias pesadas têm oglicano GO ligado e cada glicano GO tem um residuo fucose(F) ligado a uma N-acetilglicosamina. A glicoforma "GOF,GIF" é uma espécie em uma das cadeias pesadas que tem o GOglicano ligado e a outra cadeia pesada tem o glicano Glligado a cada glicano GO e glicano Gl com um residuo fucose(F) ligado a uma N-acetilglicosamina.

Em algumas modalidades, os anticorpos anti-CTLA-4têm um padrão de glicosilação que é selecionado do grupoconsistindo de 'GOF,GOF"; "GOF,GIF", GIF,GIF", "GIF,G2F"e asmisturas destes. Numa outra modalidade, os anticorpos anti-CTLA-4 têm um padrão de glicosilação que é "GOF, GlF"paramais que 50% dos anticorpos produzidos. Em outrasmodalidades, os anticorpos anti-CTLA-4 têm um padrão deglicosilação que é 1 GOF, GOF" para menos que 50% dosanticorpos produzidos. Por exemplo, numa modalidade, oanticorpos anti-CTLA-4 11.2.1 aqui descrito tem um padrão deglicosilação de "GOF,GOF" ou "GOF,GIF". Em algumasmodalidades, os anticorpos anti-CTLA-4 (11.2.1) sãoproduzidos com uma mistura de diferentes padrões deglicosilação. Por exemplo, numa amostra dos anticorpos(11,2.1) pode haver uma mistura de anticorpos (11.2.1) comalguns tendo um padrão de glicosilação de "G0F,G1F" e outroscom um padrão de glicosilação de "G0F,G0F" numa relação deaproximadamente 3:2, respectivamente.

Vias de Administração e Dosagens:

As composições desta invenção podem ser soluçõeslíquidas (por exemplo, soluções injetáveis e para infusão).forma preferida depende do modo pretendido deadministração e aplicação terapêutica. Composiçõespreferidas típicas estão na forma de soluções injetáveis oupara infusão, tal como as composições similares àquelasusadas para imunização passiva de humanos. O modo preferidode administração pe por via parenteral (por exemplo,intravenosa, subcutânea, intraperitonial, intramuscular, eintra-esternal), ou por técnicas de infusão, na forma desuspensões líquidas inj etáveis estéreis ou oleaginosas.Como será considerado pelos versados na técnica, a via e/oumodo de administração dependerá dos resultados desejados.

Numa modalidade preferida, o anticorpo é administrado porinfusão ou injeção intravenosa. Numa outra modalidadepreferida, o anticorpo é administrado por injeçãointramuscular ou subcutânea.

As composições terapêuticas são, tipicamente,estéreis e estáveis sob condições de. manufatura earmazenagem.

A composição pode ser formulada como uma solução,microemulsão, dispersão ou lipossoma. Soluções inj etáveisestéreis podem ser preparadas por incorporação do anticorpoanti-CTLA-4 na quantidade necessária num diluente apropriadocom um ingrediente ou uma combinação de ingredientescitados supra, conforme necessário, seguido poresterilização (por exemplo, esterilização por filtragem).Geralmente, as dispersões são preparadas por incorporação doingrediente ativo ao veiculo estéril que contenha um meio dedispersão básica e os outros ingredientes necessáriosoriundos dos supracitados. Tais suspensões podem serformuladas de acordo com o conhecimento da técnica usando osagentes de dispersão adequados, agentes de umectação eagentes de suspensão ou outros agentes aceitáveis. Apreparação injetável estéril também pode ser uma soluçãoinjetável estéril ou suspensão num diluente ou solventeparenteralmente aceitável não tóxico, por exemplo, como umasolução de 1,3-butanodiol. Dentre os veiculos e solventesaceitáveis que podem ser empregados estão: água, solução deRinger, e solução de cloreto de sódio isotônica. Alemdisso, óleos fixos, estéreis, são convencionalmenteempregados como um solvente ou meio de suspensão. Para estefim, qualquer marca fixa de óleo pode ser empregada,incluindo mono- ou diglicerideos sintéticos. Além disso,ácidos graxos n-3 polinsaturados encontram uso na preparaçãode injetáveis.

No caso de pós estéreis. para preparação desoluções injetáveis estéreis, os métodos de preparaçãopreferidos são secagem a vácuo e liofilização, que produz umpó do ingrediente ativo mais qualquer ingrediente adicionaldesejado de uma solução previamente filtrada estéril domesmo. A fluidez adequada de uma solução pode ser mantida,por exemplo, mediante uso de um revestimento tal comolecitina, pela manutenção do tamanho de partícula necessáriono caso de dispersão e pelo uso de tensoativos.

A absorção prolongada de composições inj etáveispode ser ocasionada por inclusão na composição de um agenteque retarda a absorção, por exemplo, sais de monoestearato,e gelatina ou por formulação da composição em formas deabsorção prolongada tal como dispositivos de reserva,1ipossomas, microesferas polimericas, geles poliméricos eimplantes.

Outros métodos para administração dos anticorposaqui descritos incluem adesivos dérmicos que liberam amedicação diretamente para a pele do indivíduo. Taisadesivos podem conter os anticorpos da presente invençãonuma solução liquida, opcionalmente tamponada, dissolvidae/ou dispersa num adesivo, ou dispersa num polímero.

Ainda outros métodos para administração dosanticorpos aqui descritos incluem gotas oftalmológicaslíquidas oculares.

0 anticorpo pode ser . administrado uma vez, porémpreferivelmente é administrado múltiplas vezes. Por exemplo,o anticorpo pode ser administrado uma vez ao dia, há uma vezcada seis meses ou mais. A administração pode ser numprograma tal como três vezes ao dia, duas vezes ao dia, umavez ao dia, uma vez cada dois dias, uma vez cada três dias,semanalmente, uma vez cada duas semanas, uma vez por mês,uma vez cada dois meses, uma vez cada três meses e uma vezcada seis meses.

0 anticorpo pode ainda ser administradocontinuamente via uma minibomba. 0 anticorpo pode seradministrado no local do tumor ou parte inflamada do corpo,ao tumor ou parte inflamada do corpo ou num local distantedo local do tumor ou parte inflamada do corpo. 0 anticorpopode ser administrado uma vez, pelo menos duas vezes ou pelomenos o período de tempo até a condição ser tratada,atenuada ou curada. 0 anticorpo em geral, pode seradministrado por todo o tempo que o tumor persista, contantoque, o anticorpo faça com o que o tumor ou câncer pare decrescer ou diminua no peso ou volume ou até que o corpoinflamado tenha-se curado. 0 anticorpo, tipicamente, seriaadministrado como parte de uma composição farmacêuticaconforme descrito supra.

As composições da invenção podem incluir umaquantidade terapeuticamente eficaz ou uma quantidadeprofilaticamente eficaz de um anticorpo ou parte de ligaçãoao antigeno da invenção. No preparo da formulação, aquantidade terapeuticamente eficaz do anticorpo anti-CTLA-4presente na formulação pode ser determinada, por exemplo,levando-se em consideração os volumes de dose desejados emodo(s) de administração, da natureza e gravidade dacondição a ser tratada, e.da idade e tamanho do indivíduo.

Faixas de dose não limitantes exemplares, paraadministração das composições farmacêuticas da presenteinvenção a um indivíduo, são desde cerca de 0,01 mg/kg acerca de 200 mg/kg (expressos em termos de miligramas(mg) doanticorpo anti-CTLA-4 administrado por quilograma (kg) dopeso do indivíduo), de cerca de 0,1 mg/kg a cerca de 100mg/kg, de cerca de 1,0 mg/kg a cerca de 50 mg/kg, de cercade 5,0 mg/kg a cerca de 20 mg/kg, ou cerca de 15 mg/kg.Para fins da presente invenção um indivíduo humano médiopesa cerca de 70 kg.

Faixas intermediárias a quaisquer dosagens aquicitadas, por exemplo, cerca de 0,01 mg/kg = 199 mg/kg,também pretendem fazer parte desta invenção- Por exemplo,faixas de valores usando uma combinação de quaisquer valorescitados como limites superior e/ou inferior destinam-se aestar incluídos.

Regimes de dosagem também podem ser ajustados paraproporcionar a resposta ótima desej ada (por exemplo, umaresposta terapêutica ou profilatica) por administração devárias doses divididas a um indivíduo durante o tempo ou adose pode ser proporcionalmente reduzida ou aumentadaconforme o caso, pelas exigências da situação terapêutica.

É em especial vantajoso formular composições parenterais naforam de dosagem unitária por facilidade de administração euniformidade da dosagem.

Formas de dosagem unitárias como aqui empregado,refere-se a unidades fisicamente separadas adequadas comodosagens unitárias para indivíduos mamíferos em tratamento,contendo cada unidade uma predeterminada quantidade docomposto ativo calculada para produzir o desejado efeitoterapêutico em associação com o veiculo farmacêuticorequerido. A especificação para formas de dosagem unitáriada invenção são ditadas por (a) características singularesdo anticorpo anti-CTLA-4 e diretamente dependentes dele, ouparte e do efeito terapêutico particular ou profilático aser conseguido/ e (b) das limitações intrínsecas na técnicaem compor um tal anticorpo para tratamento de sensibilidadeem indivíduos.

As formulações líquidas da presente invenção,podem ser preparadas como formas de dosagem unitárias. Porexemplo, uma dosagem unitária por frasco pode conter de 1 a1000 mililitros (ml) de diferentes concentrações de umanticorpo anti-CTLA-4. Em outras modalidades, uma dosagemunitária por frasco pode.conter cerca de 1 mL, 2 mL, 3 mL, 4mL, 5 mL, 6 mL, 7 mL, 8 mL, 9 mL, 10 mL, 15 mL, 2 0 mL, 30mL, 40 mL, 50 mL ou 100 mL de diferentes concentrações de umanticorpo anti-CTLA-4. Caso necessário, essas preparaçõespodem ser ajustadas até uma concentração desejadaadicionando-se um diluente estéril para cada frasco. Asformulações iliquidas da presente invenção também podem serpreparadas como formas de dosagem unitária em bolsas ourecipientes estéreis, que são adequados para conexão com umalinha de administração intravenosa ou cateter.

Avaliação da Estabilidade

A presente invenção compreende composiçõesfarmacêuticas líquidas estáveis compreendendo um anticorpoanti-CTLA-4 conforme aqui descrito e um agente quelantefarmaceuticamente aceitável. Uma composição estável édesejável para manter ou resistir mudanças, na, por exemplo,aparência e integridade do produto (incluindo degradaçãofísica ou química levando, potencialmente a uma redução naatividade biológica). Varias técnicas analíticas eindicadores para medição da estabilidade protéica sãorelatados na literatura e uma série dessas técnicas eindicadores podem ser vistos em Peptide and Protein DrugDelivery, 247-301, Vincent Lee Ed, Mareei Dekker, Inc., NewYork, N.Y., Pubs. (1991) e Jones A. Adv. Drug Delivery Rev.1:29-90 (1993). Em geral, as composições farmacêuticaslíquidas da presente invenção apresentam melhor estabilidadequando submetidas a baixas temperaturas de armazenagemdurante um período de tempo, e/ou quando submetidas a um oumais ciclos de congelamento descongelamento.

Numa modalidade, a composição quando armazenada auma temperatura de cerca de 2°C a cerca de 8°C, por pelomenos cerca de 12 meses, preferivelmente, pelo menos cercade 18 meses e mais pref erivelmente, pelo menos cerca de 24meses, é mais estável do que uma temperatura de outro modo,idêntica, carecendo do agente quelante que é armazenadadurante as mesmas condições, pelo mesmo tempo.

Numa outra modalidade, a composição quandoarmazenada a uma temperatura de cerca de 25 °C a cerca de30°C por pelo menos 3 meses, preferivelmente, pelo menos 6meses, e mais preferivelmente, pelo menos cerca de 12 meses,é mais estável do que uma composição de outro modo, idênticacarecendo do agente quelante que é armazenada sob as mesmascondições, pelo mesmo tempo.

Numa outra modalidade, a composição quandoarmazenada a uma temperatura de cerca de 40 °C por pelomenos 2 meses, preferivelmente, pelo menos 3 meses, é maisestável do que uma composição de outro modo, idêntica,carecendo do agente quelante que é armazenada sob as mesmascondições, pelo mesmo tempo.

Como aqui empregado, o termo "ciclo decongelamento/descongelamento" refere-se a técnicas paraemprego de uma amostra de anticorpo liquida apósarmazenagem por congelamento, onde a temperatura da amostraé baixada até uma temperatura de 0°C ou menor, de modo acongelar a amostra liquida, e a seguir submeter a amostra aum anticorpo que irá restaurar seu estado liquido durante umperiodo de tempo suficiente para permitir o uso da amostra,seguido por retorno à armazenagem congelada,pref erivelmente, a uma temperatura de 0°C ou menor. Comoaqui empregado, o termo "armazenagem por congelamento"refere-se ao congelamento e manutenção de uma amostra doanticorpo previamente liquida a uma temperatura de 00 C ouiabaixo desta, e preferivelmente, -20°C ou abaixo desta.

Numa modalidade, a composição quando submetida apelo menos 1 ciclo de conge1amento/descongelamento,preferivelmente, pelo menos 2 ciclos decongelamento/descongelamento, mais preferivelmente, pelomenos 3 ciclos de congelamento/descongelamento, ainda maispref erivelmente, pelo menos 4 ciclos decongelamento/descongelamento, ainda mais preferivelmente,pelo menos 5 ciclos de congelamento/descongelamento, eainda mais preferivelmente, pelo menos 6 ciclos decongelamento/descongelamento, é mais estável do que umacomposição diferentemente, idêntica, carecendo do agentequelante, sendo submetida às mesmas condições decongelamento/descongelamento.

Numa outra modalidade, a composição satisfaz duasou mais das seguintes condições:

(a) a composição, quando armazenada a umatemperatura de cerca de 2°C a cerca de 8°C por pelo menoscerca de 12 meses, preferivelmente, pelo menos cerca de 18meses, e mais preferivelmente, pelo menos cerca de 24 meses,é mais estável do que uma composição diferentementeidêntica, carecendo do agente quelante, sendo armazenada sobcondições iguais, durante o mesmo tempo;

(b) a composição, quando armazenada a umatemperatura de cerca de 2 5 ° C a cerca de 30 ° C por pelo menoscerca de 3 meses, preferivelmente, pelo menos cerca de 6meses, e mais preferivelmente, pelo menos cerca de 12 meses,é mais estável do que uma composição diferentementeidêntica, carecendo do agente quelante, sendo armazenada sobcondições iguais, durante o mesmo tempo;

(c) a composição, quando armazenada a umatemperatura de cerca de 40 °C por pelo menos cerca de 1 mês,preferivelmente, pelo menos cerca de 2 meses, e maispreferivelmente, pelo menos cerca de 3 meses, é mais estáveldo que uma composição diferentemente idêntica, carecendo doagente quelante, sendo armazenada sob condições iguais,durante o mesmo tempo; ou

(d) a composição, quando submetida a pelo menos 1ciclo de conge1amento/descongelamento, preferivelmente, pelomenos 2 ciclos de congelamento/descongelamento, maispreferivelmente, pelo menos 3 ciclos decongelamento/descongelamento, ainda mais preferivelmente,pelo menos 4 ciclos de congelamento/descongelamento, maispreferivelmente, ainda pelo menos 5 ciclos decongelamento/descongelamento, e ainda mais preferivelmente,pelo menos 6 ciclos de congelamento/descongelamento, é maisestável do que uma composição de outro modo, idêntica,carecendo do agente quelante, que é submetida às mesmascondições de congelamento/descongelamento.

Numa outra modalidade, a composição satisfaz trêsou mais das condições imediatamente expostas acima.

Para fins do presente pedido de patente, aagregação do anticorpo, fragmentação do anticorpo, e/oudescoloração da composição, por exemplo, podem ser usadoscomo indicadores da estabilidade da composição. Em geral,as composições farmacêuticas líquidas da presente invençãoapresentam um menor nivel de pelo menos uma agregação deanticorpo, fragmentação do anticorpo e descoloração dacomposição quando submetidas a uma ou mais das condiçõessupracitadas de armazenagem oucongelamento/descongelamento, relativo a composições deoutro modo, idênticas, carecendo do agente quelante que sãosubmetidas às mesmas condições.

A agregação de proteína numa composiçãofarmacêutica liquida pode ser medida por vários métodosconhecidos na técnica. Tais métodos incluem umacromatografia por filtração com gel, para separar asproteínas com gás em seu peso molecular. Um "gel" é umamatriz de água e um polímero, tal como acrilamida de agaroseou polimerizada. A presente invenção também abrange o usode HPLC de filtração com gel (cromatografia liquida de altodesempenho). Outros métodos reconhecidos de medir-se aagregação, incluem cromatografia de troca catiônica, que é atécnica cromatografica liquida geral de cromatografia detroca iônica utilizando colunas aniônicas. Os cátionstrocados na presente invenção são oriundos de moléculas deproteína. Visto agregados de proteína multivalentes poderemter alguns múltiplos da carga liquida da proteína de ligaçãoao antigeno de cadeia simples, os agregados podem ficarretidos mais fortemente, e pode ser separados das moléculasde cadeia simples. Um trocador catiônico preferido é umcoluna e ácido poliaspártico. Assim, uma proteína monoméricapode ser prontamente distinguida de um agregado. Contudo,os de prática comum na técnica irão realizar que, a análisede agregação da invenção não. está limitada a qualquer tipoparticular de coluna cromatografica, desde que ela sejacapaz de separar as duas formas de moléculas de proteína.

Fragmentação de proteína numa composiçãofarmacêutica liquida pode ser medida por vários métodosconhecidos a técnica Tais métodos incluem, por exemplo,cromatografia de exclusão por tamanho, detecçãoultravioleta, (por exemplo, a 214 nanômetros), SDS-PAGE e/ouespectrometria de massa de ionização de dessorção alaser/tempo de precipitação auxiliada por matriz (MALDI/TOFEM) . A fragmentação da proteína resultante numa alteração.da carga (por exemplo, ocorrendo como resultado dedesamidação) pode ser avaliada, por exemplo, porcromatografia de troca iônica ou focaii zação isoelétrica(IEF) .

A descoloração da composição em geral, pode sermedida por observação visual da própria composição. Aspresentes composições farmacêuticas líquidas compreendendoum agente quelante, em geral, reduzem a descoloração dacomposição (por exemplo, rosa ou amarelo) e/ou mantém atransparência da composição (por exemplo, turbidez,enevoamento e/ou formação de particulado) em relação àscomposições de outro modo idênticas, que não contém o agentequelante. Para fins da presente invenção, o termo"descoloração" refere-se a, tanto alterações na cor (e, g delímpido e incolor para rosa ou amarelo e alterações natransparência (por exemplo, de límpido e incolor paratúrbido, turvo e/ou com particulados) A descoloração dacomposição, em geral, pode ser media usando-se técnicasadicionais tais como detecção ultravioleta a 214 nanômetrose/ou por comparação visual, contra uma escala de cor padrãodas composições com e sem o agente quelante. Ver PhEur 5.0,2005 Monograh 2.2.2.

Numa modalidade, a agregação do anticorpo édeterminada após a composição ser submetida a pelo menos umadas seguintes condições:

(a) a composição é armazenada a uma temperatura decerca de 2°C a cerca de 8°C por pelo menos 12 meses,preferivelmente, pelo menos cerca de 18 meses e maispreferivelmente, pelo menos cerca de 24 meses;

(b) a composição é armazenada a uma temperatura decerca de 25 °C a cerca de 30 °C, por pelo menos cerca de 3meses, preferivelmente, pelo menos 6 meses, e maispreferivelmente, pelo menos cerca de 12 meses;

(c) a composição é armazenada a uma temperatura decerca de 40 °C por pelo menos cerca de 1 mês,preferivelmente, pelo menos cerca de 2 meses, e maispreferivelmente, pelo menos cerca de 3 meses ; ou

(d) a composição é submetida a pelo menos umciclo de conge1amento/descongelamento, preferivelmente, pelomenos, 2 ciclos de conge1amento/descongelamento, maispreferivelmente, pelo menos 3 ciclos decongelamento/descongelamento, ainda mais preferivelmente,pelo menos 4 ciclos de congelamento/descongelamento, aindamais preferivelmente, pelo menos 5 ciclos decongelamento/descongelamento, e ainda mais preferivelmente,pelo menos 6 ciclos de congelamento/descongelamento.

Agregados do anticorpo são então cromatograficamenteseparados da composição (por exemplo, usando HPLC) e aextensão da agregação determinada do cromatogramaresultante. As composições farmacêuticas liquidas estáveisda presente invenção, tem tipicamente, uma área de pico doagregado no cromatograma, que é pelo menos cerca de 6%,menos que cerca de 5%, menos que cerca de 4%, menos quecerca de 3%, menos que cerca de 2%, ou menos que cerca de1,5%, da área de pico total do cromatograma. Num exemploespecifico desta técnica para medição da agregação, acomposição é armazenada por 24 semanas a 40 °C e a separaçãopor cromatografia é então realizada usando SE-HPLC comdetecção de ultravioleta a 214 nanômetros. Esta técnica foiusada para medir-se agregação do anticorpo no Exemplo 1,onde, por exemplo, a Formulação n° 37 (contendo um agentequelante) apresentou uma área de pico do agregado nocròmatograma de cerca de 1,1%, enquanto a Formulação 26(carecendo de um agente quelante) apresentou uma área depico do agregado no cròmatograma de cerca de 6,4%.

Geralmente, a diferença entre a área de pico docròmatograma do agregado para uma composição farmacêuticaliquida estável da presente invenção e a área de pico docròmatograma do agregado para uma composição de outro modoidêntica, carecendo do agente quelante que é submetida àsmesmas condições é de pelo menos 2% pelo menos cerca de 3%,pelo menos cerca de 4% ou pelo menos cerca de 4,5%. Porexemplo, esta diferença entre a Formulação 37 (área de picodo agregado no cròmatograma de cerca de 1,1%) e Formulação26 (área de pico do agregado no cròmatograma de cerca de6,4) testado no Exemplo 1, conforme descrito acima é decerca de 5,3%.

Numa modalidade, a fragmentação do anticorpo édeterminada após a composição ser submetida a pelo menos umadas seguintes condições:

(a) a composição é armazenada a cerca de 2°C acerca de 8°C por pelo menos cerca de 12 meses,preferivelmente pelo menos cerca de 18 meses e maispreferivelmente, pelo menos cerca de 24 meses;

(b) a composição é armazenada a cerca de 25 °C acerca de 30 °C por pelo menos cerca de 3 meses,preferivelmente pelo menos cerca de 6 meses e maispreferivelmente, pelo menos cerca de 12 meses;

(c) a composição é armazenada a cerca de 40°C porpelo menos cerca de 1 mês, preferivelmente pelo menos cercade 2 meses e mais preferivelmente, pelo menos cerca de 3meses; ou

(d) a composição é submetida a pelo menos umciclo de conge1amento/descongelamento, preferivelmente, pelomenos, 2 ciclos de conge1amento/descongelamento, maispreferivelmente, pelo menos 3 ciclos decongelamento/descongelamento, ainda mais preferivelmente,pelo menos 4 ciclos de congelamento/descongelamento, aindamais preferivelmente, pelo menos 5 ciclos decongelamento/descongelamento, e ainda mais preferivelmente,pelo menos 6 ciclos de congelamento/descongelamento.Fragmentos do anticorpo são então cromatograf icamentleseparados da composição (por exemplo, usando filtração comgel) e a extensão da fragmentação determinada docromatograma resultante. As composições farmacêuticasliquidas estáveis da presente invenção, tem tipicamente, umvolume de faixa do fragmento no cromatograma, que é menorque cerca de 9%, menos que cerca de 8%, menos que cerca de7%, menos que cerca de 6%, menos que cerca de 5%, ou menosque cerca de 4,5%, do volume da faixa total no cromatograma.Num exemplo especifico desta técnica para medição dafragmentação, a composição é armazenada por 24 semanas a40 °C e a seguir cromatografada usando SDS-PAGE (rSDS-PAGE)com volumes de faixa determinados por escaneamento com, ouum Densitômetro de Molecular Dynamics Personal (PDQC-90 ouum Densitômetro de imageamento Bio-Rad GS800. Esta técnicafoi usada para medir-se fragmentação no Exemplo 1, onde, porexemplo, a Formulação n° 37 (contendo um agente quelante)apresentou um volume de faixa do fragmento no cromatogramade cerca de 4,5%, enquanto a Formulação 26 (carecendo de umagente quelante) apresentou um volume de faixa de fragmentono cromatograma de cerca de 10,1%.

Geralmente, a diferença entre o volume de faixa dofragmento para uma composição farmacêutica liquida estávelda presente invenção e o volume de faixa do fragmento docromatograma para uma composição, de outro modo idêntica,carecendo do agente quelante que é submetida às mesmascondições é de pelo menos 2% pelo menos cerca de 3%, pelomenos cerca de 4% ou pelo menos cerca de 4,5%. Por exemplo,esta diferença entre a Formulação 37 (volume de faixa dofragmento no cromatograma de cerca de 4,5%) e a Formulação26 (volume de faixa do fragmento no cromatograma de cerca de10,1) testado no Exemplo 11, conforme descrito acima é decerca de 5,6%.

Métodos de Tratamento:

quaisquer tipos de anticorpos aqui descritos podemser usados terapeuticamente. Numa modalidade preferida, oanticorpo anti-CTLA-4 é um anticorpo humano. Numamodalidade preferida, o CTLA-4 é humano e o indivíduo é umser humano. Numa outra modalidade preferida ainda,oanticorpo anti-CTLA-4 é um anticorpo IgG2.

Alternativamente, o indivíduo pode ser um mamifero queexpressa uma proteína CTLA-4 que o anticorpo anti-CTLA-4reaja cruzado com ela.

0 anticorpo pode ser administrado a um mamiferonão humano expressando CTLA-4 com o qual o anticorpo reajacruzado (ou seja um primata) para fins veterinários ou comoum modelo animal de doença humana. Tais modelos animaispodem ser úteis para avaliação da eficácia terapêutica dosanticorpos desta invenção.

A presente invenção proporciona pum método para otratamento de uma condição neoplásica num indivíduo,compreendendo a administração ao indivíduo de uma composiçãofarmacêutica liquida compreendendo um anticorpo anti-CTLA-4,e um agente quelante ou em combinação com outros excipientesescolhidos dentre um tampão, um agente de tonicidade, ou umtensoativo, e misturas dos mesmos. Em outras modalidades, oindivíduo supracitado é um que está em necessidade deprevenção ou tratamento de uma condição neoplásica.

Numa outra modalidade, a presente invençãoproporciona um método para o tratamento de uma condiçãoneoplásica num indivíduo, compreendendo a administração aoindivíduo de uma composição farmacêutica liquida cor umanticorpo anti-CTLA-4 ticilimumab; e um excipientefarmaceuticamente aceitável compreendendo um agente quelantesozinho ou em combinação com outros excipientes escolhidosdentre um tampão, um agente de tonicidade, ou um tensoativoe misturas dos mesmos.

Ambos os termos "neoplasia" e "condiçãoneoplásica" referem-se a um "neoplasma" ou tumor, que podeser benigno, pré-maligno, metastático ou maligno. Tambémabrangidas pela presente invenção são neoplasias benignas,pré-malignas, metastáticas, ou malignas. Também abrangidospela presente invenção são tumores benignos, pré-malignos,metastáticos ou malignos. Assim, todas as neoplasias outumores benignos, pré-malignos, metastáticos, ou malignosestão abrangidos pela presente invenção, e podem serreferidos permutavelmente, como neoplasia, neoplasmas oucondições relacionadas a neoplasia. Os tumores sãogeralmente conhecidos na técnica como uma massa neoplásicaou células "neoplásticas". Entretanto, deve ficar entendidoque até mesmo uma célula neoplástica é considerada, parafins da presente invenção, como um neoplasma, oualternativamente, neoplasia.

Condições neoplásicas que podem ser tratadas porum anticorpo anti-CTLA-4 da invenção podem envolver qualquertecido ou órgão, e incluem, sem limitação a osso, cérebro,pulmão célula escamosa, bexiga, gástrica, pancreático, mama,cabeça, pescoço, figado, renal, ovário, próstata, colo-retal, esofágico, ginecológico (por exemplo, cervical eovariano), naso-faringeo ou câncer da tireóide. Tambémabrangidos pelo termo condições neoplásicas, estãometástases ósseas, melanomas, linfornas, leucemias emielomas múltiplas. Em particular as formulações doanticorpo anti-CTLA-4 da presente invenção ao úteis notratamento de cânceres da mama, próstata, cólon e pulmão.

Em outras modalidades, os métodos e composições dapresente invenção abrange, a prevenção e tratamento decondições neoplásicas selecionadas do grupo consistindo demelanoma lentigo acral, ceratose actinica, adenocarcinoma,carcinoma eistico adenóide, adenomas, polipose adenomatosofamiliar, pólipos familiares, pólipos de cólon, pólipos,adenosarcoma, carcinoma adeno-escamoso, carcinomaadrenocortical, linfoma relacionado a AIDS, câncer anal,tumores astrociticos, carcinoma de glândula de Bartolin,carcinoma de célula basal, câncer de duto biliar, câncer debexiga, glioma de haste cerebral, tumores cerebrais, câncerde mama, carcinomas de glândula bronquial, carcinomacapilar, carcinóides, carcinoma, carcinoma de trompas defalópio, carcinoma do endométrio, carcinosarcoma, cavernoso,linfoma do sistema nervoso central, astrocitoma cerebral,colangiocarcinoma, condosarcoma, papiloma/carcinoma do plexocoróide, carcinoma de célula clara, câncer de pele, câncercerebral, câncer de cólon, cânceír colo-retal, linfoma decélula T cutânea, cistadenoma, tumor do sino endodérmico,hiperplasia endometrial, sarcoma de estrorna endometrial,adenocarcinoma endometrióide, ependimal, epitelióide, cânceresofágico, sarcoma de Ewing, tumor de célula germinativaextragonadal, fibrolamelar, hiperpasia nodular focai, câncerde vesicula, gastrinoma, tumores de célula germinativa,tumor trofoblástico gestacional, glioblastoma, glioma,glicagonoma, hemangiblastornas, hemamgioendotelioma,hemangiomas, adenoma hepático, adenomatose hepática,carcinoma hepatocelular, linforna de Hodgkin, câncerhipofaringeano, glioma do passo hipotalâmico e visual,insulinoma, neoplasia intraepitelial , neoplasia de célulaescamosa inter-epitelial, melanoma intraocular, carcinoma decélula escamosa invasiva, carcinoma de célula grande,carcinoma de célula de ilhota, sarcoma de Kaposi, câncerrenal, câncer laringeano, leiomiosarcoma, melanomas malignoslentiginoso, condições relacionadas a leucemia, câncer decavidade labial e oral, câncer de figado, câncer de pulmão,linforna, tumores mesoteliais malignos, timoma maligno,meduloblastoma, meduloepitelioma, melanoma, meningeano,carcinoma de célula de Merkel, mesotelial, carcinomametastático, carcinoma mucoepidermóide, neoplasma de célulade mieiorna/plasma múltipla, fungóides micosis, sindromemielodisplásica, condições mieloproliferativas, câncer dosinus da cavidade nasal e paranasal, neuroblastoma, melanomanodular de adenocarcinoma neuroepitelial, neoplasmas dosistema nervoso central (por exemplo, linfoma do SNCprimário, tumores de eixo espinhal, gliornas de hastecerebral, ou adenomas pituitários) , linforna que não deHodgkin, carcinoma anaplásico, oligodendrogliano, cânceroral, câncer orofaringeo, osteosarcoma, polipeptideopancreático, câncer ovariano, tumor de célula germinativaovariana, câncer pancreático, adenocarcinoma seroso papilar,célula pineal, tumores. pituitários, plasmacitoma,pseudosarcoma, blastoma pulmonar, câncer da paratireóide,câncer do pênis, feocromocitoma, tumores neuroectodérmicosprimitivos pineais e supratentoriais, tumor pituitário,neoplasma de célula plasmática, blastoma pleuropulmonar,câncer da próstata, câncer retal, carcinoma de célula renal,retinoblastoma, radomiosarcoma, sarcoma, carcinoma seroso,carcinoma de célula pequena, câncer do intestino delgado,carcinomas de tecido mole, tumor secretor de somatostatina,carcinoma escamoso, carcinoma de célula escamosa,submesotelial, melanoma de disseminação superficial, tumoresneuroectodérmicos primitivos supratentoriais, câncer datireóide, carcinoma indiferenciado, câncer uretra1, cânceruterino, melanoma da úvea, carcinoma verrugoso, câncervaginal, vipoma, câncer vulvar, macroglobulinemia deWaldenstrom, carcinoma bem diferenciado, e tumor de Wilm.

Numa modalidade mais preferida, o anticorpo anti-CTLA-4 é administrado a um indivíduo com câncer de mama,câncer de próstata, câncer de pulmão ou câncer de cólon.Numa modalidade ainda mais preferida, o método faz com que ocâncer pare de proliferar-se anormalmente, ou não aumente empeso ou volume ou diminua em peso ou volume.

Artigos de Manufatura:

Numa outra modalidade da invenção, é proporcionadoum artigo de manufatura composto por um recipiente, quemantém a formulação farmacêutica liquida compreendendo pelomenos um dos anticorpos anti-CTLA-4 monoclonais da presenteinvenção numa formulação compreendendo um agente quelantesozinho ou em combinação com outros excipientesfarmaceuticamente aceitáveis, e, op, proporciona instruçõespara seu uso. Recipientes adequados, incluem, sem limitação,garrafas, frascos, bolsas e seringas. 0 recipiente pode serformado de uma série de materiais tais como vidro ouplástico. Um recipiente exemplar, é um frasco de vidro paraúnico uso de 3-20 cm3. Alternativamente, para a formulaçãode múltiplas doses, o recipiente pode ser um frasco devidro de 3-100 cm3. O recipiente retém a formulação e orótulo sobre o mesmo, ou associado com ele, o recipientepode indicar instruções de uso. O artigo de manufatura podeincluir anda outros materiais desejáveis do ponto de vistacomercial e do usuário, incluindo outros tampões, diluentes,filtros, agulhas, seringas, e inserções na embalagem cominstruções para uso, contra-indicações e/ou relações dosefeitos colaterais potenciais.

A presente invenção ainda proporciona um kit parapreparar uma composição liquida de um anticorpo estabilizadocompreendendo um primeiro recipiente, compreendendo oanticorpo anti-CTLA-4 monoclonal 11.2.1 em solução, e umsegundo recipiente compreendendo uma quantidade suficientede um agente que1ante sozinho ou em combinação com outrosexpipientes em solução para estabilizar o anticorpo.

Os exemplos a seguir descrevem modalidades dainvenção. Outras modalidades que se enquadram no escopo dasreivindicações presentes tornar-se-ão evidentes aos versadosna técnica a partir da consideração do relatório descritivoou pratica da invenção como aqui revelada. Pretende-se que,o relatório descritivo, juntamente com os exemplos sejaconsiderado como exemplo, apenas, com o escopo e espirito dainvenção aqui indicada pelas reivindicações, que se seguemaos exemplo. Nos exemplos, todas as percentagens estão empeso, a menos que, de outro modo indicado. 0 versado natécnica irá considerar, que, quantidades em peso e/ourelações peso-a-volume descritas no exemplos podem serconvertidas a moles e/ou molaridades, com emprego dos pesosmoleculares reconhecidos na técnica de ingredientesdescritos. Quantidades em peso exemplificadas aqui (porexemplo, grama) são para volumes descritos (por exemplo, desoluções tampão, formulação de anticorpo etc.,). 0 versadona técnica irá considerar, que as quantidades em peso podemser proporcionalmente ajustadas quando se deseja empregardiferentes volumes de formulação.

EXEMPLO 1

Este Exemplo mostra a geração de linhagens decélula de hibridoma que produzem anticorpos anti-CTLA-4conforme descrito na Patente u.S. n° 6.682.736 para Hansonet al.

0 anticorpos da invenção fora preparados,selecionados e analisados como a seguir:

Preparação do Antigeno: Três diferentesimunógenos foram preparados para imunização de camundongosXenoMouse ™ (i) uma proteína de fusão a CTLA-4-IgG (ii) umpeptideo de CTLA-4, e (iii) células de linfoma de murideo300.19 transfectadas com um mutante de CTLA-4 (Y201V) que éessencialmente expressado na superfície celular.

Proteina de Fusão a CTLA-4-IgGl:

Construção do Vetor de Expressão

0 cDNA codificando o dominio extracelular madurode cTLA-4 foi amplificado por PCR da biblioteca de cDNA dotimo de humanos (Clontech) usando iniciadores destinados àseqüência publicada (Eur. J Immunol 18:1905 (1988)). Ofragmento foi subclonado direcionalmente ao pSR5, umplasmideo de expressão viral Sindbis (InVitrogen) , entre opeptideo de sinal M de oncostatina humana e domíniosCH1/CH2/CH3 de IgG gama humana 1 (IgGl). A proteína defusão não contém um domínio de articulação , mas contémcisteina 120 no dominio extracelular de CtLA-4 para formarum dimero covalente. O vetor resultante foi denominadoCTLA-4-IgGl/pSR5. O cDNA de CTLA-4-IgGl completo no vetorfoi confirmado por seqüência em ambas as fitas. A seqüênciade aminoácido da proteína de CTLA-4-Ig é mostrada abaixo. Odominio extracelular maduro para CD44 foi amplificado pelaPCR da biblioteca de linfócito humano (Clontech) esubclonado em pSinRep5 para gerar uma proteína de controlecom a extremidade IgGl idêntica.

Proteína de Fusão a OM-CTLA-4-IgGl:

MGVLLTQRTLLSLVLALLFPSMASMAMHVAQPAVVLASSRGIASFVCEYASPGKATEVRVTVLRQADSQVTEVCAATYMMGNELTFLDDSICTGTSSGNQVNLTIQGLRAMDTGLYICHEVLMYPPPYYLGIGNGTQIYVIDPEPCPDSDLEGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPTPEEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

Sublinhado = peptideo sinal

Os cDNAs para dominio extracelular maduro de CD28foram amplificados pela PCR da biblioteca de linfócitohumano (Clontech) e a seguir subclonados ao pCDM8 (J.Immunol. 152:5261-71 (1993)) para produzir uma proteína defusão de IgGl humana contendo, tanto clivagem de trombina eregiões de articulação.

CTLA-4 de Sagüi, Cynomologous e Rhesus foramclonados de mRNA isolado de PBMCs PHA-estimulados usandotécnicas padrão de PCR degenerada. 0 seqüenciamentodemonstrou que, a seqüência de aminoácido de rhesus ecynomologous eram idênticas com três diferenças do domínioextracelular de CTLA-4 humano maduro (S13N, I17T e L105M)Sagüi demonstrou dez diferenças de aminoácido do domínioextracelular de CTLA-4 humano maduro (V21A, V33I, A41T,A51G, 541, S71F, Q75K, T88M, L105M e G106S) . A mutagênesedirecionada ao sítio foi usada para produzir mutações deponto simples de todos os aminoácidos diferentes em CTLA-4de sagüi para mapear os aminoácidos importantes parainteração dos anticorpos com CTLA-4-IgG. As mutações deCTLA-IgG humano e de sagüi para mapeamento do epitopo foramgeradas por mutagênese direcionada ao sítio do acasalador(Promega). As proteína de fusão de IgG foram produzidas portransfecção passageira de células Cos7 e purificadas usandotécnicas padrão de Proteína A. Proteínas CTLA-4-IgGmutantes foram avaliada par ligação aos anticorpos porimunomanchamento e uso de análises BIAcore.

Expressão/Purificação de Proteína Recombinante

Vírus sindbis recombinante foi gerado poreletroporação (Gibco) de células de rim de Hamster jovem commRNA de CTLA-4-IGGl/pSR5 por transcrição in vitro de SP6 emRNA auxiliar de DH-2 6S, conforme descrito por InVitrogen.Quarenta e oito horas mais tarde, o virus recombinante foicoleado e titulado para expressão de proteina ótima emcélulas de ovário de hamster chinês (CH0-K1). As célulasCH0-K1 foram cultivadas em suspensão de DMEM/F12 ( Gibco)contendo 10% de soro bovino fetal inativado pelo calor a 10%(Gibco), aminoácidos não essenciais (Gibco), glutamina 4 mM(Gibco), penicilina/estreptomicina (Gibco), Hepes 10 mM pH7,5 (Gibco). Para produzir CTLA-4-IgG, as células CHO-K1foram ressuspensas em DMEM/F12 a lx IO7 células/ml eincubadas com virus sindbis por uma hora a temperaturaambiente. As células foram a seguir diluidas a lx 106ml emDMEM/F12 contendo soro bovino fetal a 1% destituídas de IgGbovino usando Protein A Sepharose (Pharmacia), aminoácidosnão essenciais, glutamina 4 mM, Hepes 12,5 mM pH 7,5, epenicilina/estreptomicina. 48 horas pós-infecção as célulasforam peletizadas e o meio condicionado foi coletado esuplementado com comprimidos inibidores de proteasecompletos (Boehringer Mannheim), tendo o pH ajustado para7,5 e filtradas 0,2 [i (Nalgene) . Foi usado FPLC (Pharmacia)para pureza de afinidade da proteina de fusão usando umacoluna HITrap de proteina A (5 ml) a uma vazão de fluxo de10 ml/minutos. A coluna foi lavada com 30 volumes de leitode PBS e eluida com 0,1 M de glicina/HCl a pH 2,8 a 1ml/minutos. Frações (1 mL) foram imediatamente neutralizadaa pH 7,5 com Tares pH 9. As frações contendo CTLA-4-IgGlforam identificadas por SDS-PAGE e a seguir concentradasusando centriplus 50 (Amicon) antes da aplicação a umacoluna sepharose 200 (Pharmacia) a 1 ml/minutos usando PBScomo o solvente. Frações contendo CTLA-4-IgGl foramagrupadas, filtradas estericamente 0,2|i. (Millipore) feitasem aliquotas e congeladas a -80°C. DC44-IgGl foi expressadoe purificado usando métodos iguais. CD28-IgG foi purificadodo meio condicionado de células Cos7 transfectadaspassageiramente.

Caracterização de CTLA-4-IgGl:

O cTLA-4-IgG! purificado migrou como uma únicafaixa em SDS-PAGE usando manchamento com coomassie coloidal(Novex) . Sob condições não redutoras CTLA-4-IgGl era umdimero (100 kDa) que reduziu a um monômero de 50 kDa quandotratado com DTT a 50 mM. O seqüenciamento de aminoácido doCTLA-4-IgGl purificado em solução confirmou o N-terminal deCTLA-4 (MHVAQPAVVLAS) e que o peptideo de sinal oncostatina-M foi clivado de proteina de fusão madura. O CTLA-4-IgGlligou-se a B7.1-IgG imobilizado numa concentração modo-dependente e a ligação foi bloqueada por um anticorpo anti-CTLA-4 anti-humano de hamster (BNI3: PharMingen). O CTLA-4IgG estéril era endotoxina isenta e quantificada por OD280usando 1.4 como o coeficiente de extinção. O rendimento doCTLA-4IgG purificado variou entre 0,5-3 mg/litro de célulasCH0-K1.

Peptideo CTLA-4:

O seguinte peptideo de CTLA-4 foi preparado comodescrito seguir:

NH2: MHVAQPAVVLASSRGIASFVCEYASPGKATEVRVTVLRQADSQVTEVCAATYMMGNELTFLDDSICTGTSSGNQ VNLTIQGLRAMDTGLYICKVELMYPPPYYLGIGNGTQIYVIDPEPC-CONH2Materiais/Abreviações:

NMP, N-metilpirrolidinona; TFE, 2,2,2-

triflúoretanoll, DCM, diclorornetano, FMOC, fluorenilmetoxicarbonila. Todos os reagente foram fornecidos porPerkin Elmer, com as seguintes exceções: TFE, AldrichChemical, resina FMOC-PAL-PEG, Perserptive Biosystems,Fmoc-Arg(PMC)-0H; FMOC-Asn (Trt)-0H, FMOC-Asp(tBu)-0H, FMOC-Cys(Trt)-0H, FMOC-Glu(tBu)-0H, FMOC-Gln(Trt)-OH, FMOC-His(Boc)-OH, FMOC-Lys(BOC)-OH, FMOC-Ser(tBu)-OH, FMOC-Thr(tBu)-OH, e FMOC-Tyr(tBu)-OH, foram usados para aquelesaminoácidos necessitando de grupos protetores de cadeialateral.

Síntese Peptidica:

A síntese peptidica foi realizada num Perkin-Elmer431A, retro-equipada com monitoração de feedback viaabsorbância UV a 301 nm (detetor Perkin-Elmer Modelo 759A).A seqüência peptidica foi montada numa resina FMOC-PAL-PEGusando ciclos de acoplamento duplos condicionais.Acoplamentos duplos forçados foram realizados em ciclos, 10,11, 18, 19, 20 e 28 até 33. A resina foi lavada com umamistura 50% de DCM e TFE no término de cada ciclo deacilaçao, seguido pr capeamento dos grupos amino nãoreagidos com anidrido acético em NMP. A resina foi removidado reator após o término do ciclo 49 e o restante continuouaté o final. A clivagem peptidica da resina foi realizadausando Reagente K (King, et al., Internatcional Journal ofProtein and Peptide Research 36:255-266 (1990)) por 6 horasem 415 m de resina rendendo 186 mg de peptideo CTLA-4 bruto.Caracterização do Peptldeo:

Alíquotas de 25 mg, do peptldeo CTLA-4 brutoforam dissolvidos em 5 mL de Guanidina 6M HC1/100 mM deK1PO3 a pH 6,4 e eluidas numa coluna 16/60 Superdex 75Pharmacia HiLoad (16 mmX600 mm, 120 mL de volume do leito),com Guanidina 2M HcL/100 mM de K2P03 a pH 6,4 a 2 mL/minutospor 180 minutos coletando-se frações de 5 mL. As fraçõesforam analisadas introduzindo-se 1,7 |il das frações num gelNuPAGE Laemeli operando com MES e tampão, visulializando-seVia protocolo de manchamento com prata Daichii. As fraçõesapresentando um peso molecular de 12 kDA, como j ulgadoversus pesos moleculares padrão, foram agrupadas j untas earmazenadas a 40C. As frações combinadas foram analisadaspor eletroforese de gel e UV. O seqüenciamento de aminoácidofoi realizado por absorbância de uma amostra de 100microlitros num cartucho ProSorb (absorvido numa membrana dePVDF) e lavando-se para remover os sais do tampão. 0seqüenciamento foi realizado num seqüenciador da AppliedBiosystems 420. A seqüência N-terminal esperada(MHVAQPAVVLA) foi observada. 0 imunomanchamento demonstrouque, o peptldeo foi reconhecido pelo anticorpo anti-CTLA-4humano BNI3 (PharMingen) . Para dessalgar, uma alíquotacontendo 64 8 |ug do material foi colocada em tubulação dediálise MWCO de 3500 Da e dialisado contra 0,1% de TFA/H20 a4°C por 9 dias com agitação. Todo o conteúdo da bolsa dediálise foi liofilizado num pó.

Células "300/19" transfectadas com antigeno depeptldeo CTLA-4 (Y201VC)O cDNA de cTLA-4 de comprimento total foiamplificado por PCR de biblioteca de cDNA de timo humano(Stratagene) e subclonado em pIRESneo (Clontech). Umamutação de CTLA-4 que resulta numa expressão de superfíciecelular constitutiva foi introduzida usando MatchMakerMutagenesis System (Promega). A mutação de tirosina, Y201para Alina inibe a ligação da proteína adaptina AP50, que éresponsável pela rápida internalização de CTLA-4 (Chuang, etal. J. Immunol. 159:144-151 (1997)). Células de linfoma demurideo 300.19 isentas de micoplasma, foram cultivadas emRPMI-1640 contendo 10% de soro bovino fetal, aminoácidos nãoessenciais, penicilina/estreptomicina, glutamina 2 mM, Hepes12,5 mM a pH 7,5 e beta-mercaptoetanol 25 (iM. as célulasforam eletroporadas (RPMI isentas de soro 3 x 106/0,4 mL)numa câmara de 1 mL com 20 ug de CTLA-4-Y201V/pIRESneousando 200V/1180 uF (Gibco CellPorator). AS células forammantidas em repouso por 10 minutos e a seguir 8 ml de meioRPMI completo pré-aquecido. Há 48 horas as células foramdiluídas a 0,5 x IO6 mL em meio completo RPMI contendo 1mg/mL de G418 (Gibco). As células resistentes foramexpandidas demonstrando expressar CTLA-4 na superfíciecelular usando o anticorpo BNI3 conjugado com ficoeritrina(PharMingen). As células expressando alto nivel foramisoladas por classificação estéril.

Imunização e Geração do Hibridoma:

Camundongos XenoMouse™ (8 a 10 semanas de idade)foram imunizados (i) subcutaneamente na base das caudas com1X107 células 300.19 que foram transfectadas para expressãoCTLA-4 conforme descrito acima, ressuspensas em soluçãosalina tamponada com fosfato (PBS) com adjuvante completo deFreund, ou (ii) subcutaneamente na base da cauda com (a) 10jig da proteina de fusão CTLA-4 ou (b) 10 (ig de peptideoCTLA-4 emulsifiçadas com adjuvante completo de Freund. Emcada caso, a dose foi repetida três ou quatro vezes emadjuvante incompleto de Freund. Quatro dias antes da fusão,os camundongos receberam uma injeção final do imunógeno oucélulas em PBs. Linf ócitos de baço e/ou linf onodo doscamundongos imunizados foram fundidos com a [linha de célulaP3 de mieiorna não secretora de murideo] e forma submetidas aseleção HAT como antes descrito (Galre, G. e Milstein, C,"reparation of monoclonal antibodies: strategies andprocedures."Methods Enzymol 73:3-46 (1981)). : Um grandepainel de hibridomas, todos secretando anticorpos IgG2Khumano CTLA-4 específicos foram recuperados.

Os seguintes anticorpos anti-CTLA-4 produtores dehibridoma indicados como a seguir forma depositados em ATCC,10801 University Blvd. Manassa, Va. 20110-2209, em 29 deabril de 2003:

Clone Subclone Deposito ATCC n°

11.2.1 11.2.1.4 PTA-5169 .

4.1.1 4.1.1.1 PTA-5166

EXEMPLO 2

Este Exemplo mostra a geração de linhagens decélula de mamífero recombinantes que produzem anticorposanti-CTLA-4.

DNA codificando as cadeias pesada e leve doanticorpo monoclonal 11.2.1 foi clonado da respectivalinhagem de célula de hibridoma 11.2.1 e as seqüências deDNA foram determinadas por métodos conhecidos dos versadosna técnica. Da seqüência de ácido nucléico e seqüência deaminoácido previsível do anticorpo 11.2.1 foi determinadaa identidade do gene útil para cada cadeia de anticorpo.

Os insertos da seqüência de DNA 11.2.1 foramentão, sublclonados aos vetores de expressão. Os vetores deexpressão foram a seguir, transfectados numa célulahospedeira de mieloma de camundongos 9NS0) para gerar váriaslinhagem de célula transfectante primárias, que produzemanticorpos anti-CTLA-4. Uma linhagem de célula lider foiescolhida com base na análise de crescimento e produtividade.A linhagem lider foi depois subclonada para gerar umalinhagem de célula clonal.

0 anticorpo anti-CTLA-4 foi produzido por cultivode célula usando a linhagem de célula num biorreatorcontendo o meio de cultura da célula. 0 meio é suplementadocom nutrientes durante a produção. Após critériois de coletaserem feitos, o biorreator foi coletado, ou por filtraçãoapenas ou por centrifugação seguido por filtração. 0sobrenadante clarificado por a seguir purificado com trêsetapas de cromatografia compreendendo uma coluna deafinidade Proteina A e duas colunas de troca iônica. Umabaixa inativação do pH e uma filtração viral foram tambémfeitas para purificar qualquer virus potencial no processo.0 produto é concentrado e diafiltrado ao tampão deformulação produzindo a substância de droga.EXEMPLO 3

Foi realizado um teste para se avaliar o efeito dequatro tampões diferentes na agregação e fragmentação doanticorpo.

De modo especifico, quatro formulações líquidascompreendendo anticorpo anti-CTLA-4 11.2.1 e tamponadas comacetato, succinato, histidina ou EDTA foram preparadas . Asformulações foram a seguir armazenadas a 40 0C e a agregaçãoe fragmentação do anticorpo foram medidas em 0, 2, 5, e 7semanas.

Preparação de Soluções Tampão:

Quatro soluções tampão foram preparadas conformedescrito na Tabela 3. Cada solução foi preparada, primeiro,dissolvendo-se uma quantidade das espécies tampão(relacionada na Tabela 3) em água (aproximadamente 80% doalvo). O pH de cada solução tampão foi então, ajustado para5,5 por adição de uma quantidade suficiente da solução deácido ou base citada na Tabela 3. Após ajuste do pH, umaquantidade adicional de água foi adicionado para dar umaconcentração tampão final de 20 mM. A concentração tampãode 20 mM foi selecionada para garantir estabilidade razoáveldo pH ao pH selecionado de 5,5. A solução tampão foi entãofiltrada por um filtro de esterilização (tamanho de poro de0,22 (i) num recipiente esterilização para uso ulterior.Tabela 3: Soluções tampão

<table>table see original document page 166</column></row><table>

A solução de ácido acético glacial a 1% foipreparada por diluição adequada (1 mL a 100 mL) de ácidoglacial acético (99,9%) com água. A solução de hidróxido desódio 1 molar (M) foi preparada por dissolução de 40 g dohidróxido de sódio sólido em 1 L de água. A solução deácido clorídrico 5 molar (M) foi ;preparada por diluiçãoapropriada de ácido clorídrico concentrado (37,8%) com água.

Preparação das Formulações de Anticorpo

As formulações de anticorpo que foram avaliadasestão relacionadas na Tabela 4 abaixo. Para preparar cadaformulação, uma proporção do tonificante (relacionado emmg/mL na Tabela 4) foi primeiramente adicionada à soluçãotampão indicada e a solução agitada até a dissolução dotonificante. Uma solução grosseira de anticorpo do processode purificação descrito no Exemplo 2 foi obtida a 13,2 mg/mLem 20 mM de tampão de acetato de sódio pH 5,5 + 140 mM decloreto de sódio. Trocas de tampão desta solução grosseiranas soluções das formulações supracitadas foram realizadascom concentradores centrífugos Amicon Ultra 15 MWCO10K(UFC901024) numa Centrifuga Beckman Coulter Allegra 21 Roperando a 6500 rpm a 5°C. Aproximadamente 8 trocas devolume foram feitas e a soluções de anticorpo concentradaentre 27 e 30 mg/mL. Aproximadamente 3 a 4 mis dasformulações 1 a 18 foram preparadas. As concentrações doanticorpo foram determinada por método de espectrornetriavisivel a ultravioleta (*V-Vis) usando um coeficiente deextinção de 1,43 (mg/mL)"1 cm"1 a 280 nm.

Uma solução de polisorbato 80 20 mg/mL (PS80) foipreparada por diluição e dissolução do polisorbato 80 pelotampão apropriado da formulação preparado como descritosupra. O polisorbato 80 foi então adicionado para assoluções de anticorpo e tampão como um concentrado de 20mg/mL juntamente com quantidade adequada o tampão, anticorpo,agente de tonicidade e água ;obtendo-se uma solução de 20mg/mL final do anticorpo monoclonal anti-CTLA-4 naformulação correspondente às composições na Tabela 4 abaixo

Para a Formulação n\ 2 na Tabela 4, o PEG3350 foiadicionado como um concentrado de 200 mg/mL neste ponto.

As formulações foram então filtradas através defiltros de grau de esterilização de 0,2 (i e enchidas emfrascos. Um volume de enchimento der 0,5 a 1 mL foiempregado em frascos de vidro de 2 mL Tipo 1. Os frascosforam fechados com rolha, revestidos de FluorotecÍR) Daikyo777-1, vedados com virola, e colocados em câmaras deestabilidade armazenados eretor a 40°C por 2, 5 e 7 semanas.Os frascos foram lavados e submetidos a autoclave, como oforam os tampões de soro de 13 mm da Daikyo 777-1. Frascosem duplicata foram imediatamente analisados quanto a niveisde agregação e fragmentação.

Tabela 4: Formulações do Anticorpo Testadas:

<table>table see original document page 168</column></row><table><table>table see original document page 169</column></row><table>

Análise de Agregação:

As formulações de anticorpo da Tabela 4 foramarmazenadas a uma temperatura de 40 °C. Nas semanas 0, 2, 5e 7, cada formulação foi analisada quanto à agregação usandocromatografia de exclusão de tamanho (SEC) A cromatografiade exclusão de tamanho foi realizada usando uma coluna degel TSK G3000SWXL-G2000SWXL, tampão de fosfato de sódio 0,2M de fase móvel a pH 7,0 uma velocidade de escoamento de 1mL/minutos e detecção de UV a 214 nM. A Figura 1 mostra apercentagem das espécies de alto peso molecular eluidas (ouseja, agregados do anticorpo monoclonal anti-CTLA-4 11.2.1)medida no tempos relevantes para cada uma das formulaçõesNiveis de agregação foram calculados por integração dasáreas sob os picps de cromatograf ia para cada formulaçãorelatando as áreas integradas, sob os picos das espécies dealto peso molecular como uma percentagem da área de picototal (ver a Figura 1) . Como se pode ver na Figura 1, asformulações tamponadas com EDTA demonstraram os mais baixosniveis de agregação, seguido pelas formulações tamponadascom histidina, acetato, e succinato nesta ordem.

Análise de Fragmentação:

Como observado supra, as formulações do anticorpoda Tabela 4 foram armazenada a uma temperatura de 40 °C. Nassemanas 0, 2, 5 e 7, cada formulação também foi analisadaquanto a fragmentação usando rSDS-PAGE. A análise de rSDS-PaGE foi realizada usando NuPAGE 4 a 12% de gel bis-Tris emanchamento com azul coloidal (Coomassie). Para os gelesreduzidos (rSDS-PAGE), a redução foi conseguida por meio doagente redutor NuPAGEÍR) . As impurezas hidroliticas totais(ou seja, fragmentos do anticorpo monoclonal anti-CTLA-411.2.1) foram estimadas por varredura usando ou umDensitômetro de Molecular Dynamics personal PDQC-90 ou umDensitômetro de Imageamento da Bio-Rad GS800. A Figura 2mostra a percentagem de fragmentação medida nos temposrelevantes para cada uma das formulação. Os niveis defragmentação foram calculados como uma percentagem do volumede faixa total (ver a Figura 2). Como se pode ver da Figura2, as formulações tamponadas com EDTA mostraram os menoresniveis de fragmentação, seguido pelas formulações tamponadascom histidina, acetato e succinato, nesta ordem.

A tabela 5 (a) (0 semanas), Tabela 5 (b) (2 semanas,Tabela 5 (c) (5 semanas) e Tabela 5 (d) (7 semanas) abaixorelatam o si dados de agregação e fragmentação graficamenteapresentados nas Figuras 1 e 2.

Tabela 5(a): Resultados de Agregação e Fragmentação em

<table>table see original document page 170</column></row><table><table>table see original document page 171</column></row><table>

Tabela 5(b: Resultados de Agregação e Fragmentação no

<table>table see original document page 171</column></row><table><table>table see original document page 172</column></row><table>

Tabela 5(c): Resultados de Agregação e Fragmentação oTempo de 5 Semanas:

<table>table see original document page 172</column></row><table><table>table see original document page 173</column></row><table>

Tabela 5 (d) : Resultados de Agregação e Fragmentação noTempo de 7 Semanas

<table>table see original document page 173</column></row><table><table>table see original document page 174</column></row><table>

EXEMPLO 4

Realizou-se um teste para avaliar a capacidade dediferentes formulações líquidas compreendendo anticorpomonoclonal anti-CTLA-4 11.2.1 em tolerar múltiplos ciclosde congelamento e descongelamento.

A capacidade da formulação liquida A suportarmúltiplos ciclos de congelamento/descongelamento é, o maisdas vezes, avaliada para se determinar, se a formulação podeser armazenada (e, caso desejado, transportada) congelada ea seguir descongelada para uso posterior.

As formulações que foram avaliadas estãorelacionada na Tabela 6 abaixo. O procedimento usado parapreparar as formulações é igual ao do descrito no Exemplo 3.2,5 mL de cada solução foram colocados em frascos de vidrotipo 1 de 5 mL, tampados e vedados. AS formulaçõesidentificadas abaixo como números 1 a 4, 7 a 8, 11 a 12 e 15a 16 eram idênticas às formulações com os mesmosidentificadores numerais no Exemplo 3.

Tabela 6: Formulações de Anticorpo Testadas:

<table>table see original document page 174</column></row><table><table>table see original document page 175</column></row><table>

Cada formulação foi submetida a seis ciclosconsecutivos de congelamento/descongelamento. Os primeirostrês ciclos foram realizados num congelador a velocidadecontrolada. Os últimos três ciclos foram ciclos mais lentosrealizados com uma série de frascos enchidos com águacorrespondendo a uma alta carga térmica colocada numcongelador ou refrigerados. Para ciclos 1, 2 e 3, osfrascos contendo as formulações foram colocados numcongelador a velocidade controlada (Planer Kryo 560-16) esubmetidos ao seguinte ciclo: resfriar a formulação a umavelocidade de 0,2°C/minutos até uma temperatura de -70°C seratingida, manter a -70°C por 1,5 a 3 horas, e descongelar aformulações a uma velocidade de 0,3 °C/minutos até umatemperatura de 50C ser atingida. Para os ciclos 4, 5 e 6,os frascos foram colocados numa caixa juntamente com outrosfrascos enchidos com água (um frasco da amostra para cadaformulação; 17 frascos da formulações com um total deaproximadamente 30 frascos enchidos com água). Esta caixafoi então colocada primeiro, num congelador mantido a umatemperatura de -7 0 °C por aproximadamente 17 horas, e aseguir colocada num refrigerador mantido a uma temperaturade 2-8°C por aproximadamente 50 hora. Uma sonda térmicapara registro colocada na caixa mediu uma velocidade derefrigeração média de 0,09°C/minutos para o processo decongelamento e uma velocidade de aquecimento média de0,03 °C/minutos para o processo de descongelamento.

Cada formulação foi visualmente inspecionada apóscada ciclo de congelamento/descongelamento para formação departiculado, alteração na cor e mudança de turvação. Taisobservações visuais de cada formulação foram realizadas numacaixa clara contra fundos negro e branco, enquanto aformulação ainda estava fria após cada descongelamento. Aseguir a tabela 7 descreve os resultados.<table>table see original document page 177</column></row><table><table>table see original document page 178</column></row><table><table>table see original document page 179</column></row><table>As formulações contendo apenas cloreto de sódio(ou seja ions cloreto) apresentaram um maior aumento nosniveis de particulado solúvel após o ciclo de congelamentodescongelamento do que as formulações contendo trehalose,sacarose ou sorbitol. A adição de PEG às formulaçõescontendo cloreto de sódio, contudo, parece reduzir os niveisde particulado solúvel medidos após ciclagem decongelamento/descongelamento em relação às correspondentesformulações que não continham PEG.

Análise da Agregação:

Além disso, o aumento percentual nos particuladossolúveis foi medido para cada formulação após 6 ciclosconsecutivos de congelamento/descongelamento usandocromatografia de exclusão de tamanho.

Após o sexto ciclo de conge1amento/descongelamento,cada formulação foi analisada para agregação, usandocromatografia de exclusão de tamanho. A cromatografia deexclusão de tamanho foi realizada usando uma colunaG3000SWXL-G2000SWXL de gel TSK, tampão de fosfato ide sódio0,2 M de fase móvel a um pH 7,0, uma velocidade de fluxo de1 ml/mit, e detecção UV a 214 nm. A tabela 7 mostra apercentagem das espécies de alto peso molecular eluidas (ouseja, agregados do anticorpo monoclonal anti-CTLA-4 11.2.1)medido em tempos relevantes para cada uma das formulações.Os niveis de agregação foram calculados por integração dasáreas sob os picos de cromat.ograma para cada formulações,relatando as áreas integradas sob os picos de espécies dealto peso molecular como uma percentagem da área de picototal (ver Tabela 7). Como se pode ver da Tabela 7, asformulações tamponadas com EDTA, mostraram os menores níveisde agregação, seguido pelas formulações tamponadas comhistidina, acetato, e succinato, nesta ordem.

EXEMPLO 5

Realizou-se um teste para avaliar o efeito deEDTA, metionina e condições anaeróbicas na descoloração eagregação em formulações líquidas compreendendo anticorpomonoclonal anti-CTLA-4 11.2.1. A descoloração e agregaçãoem tais formulações líquidas, são geralmente indesejáveis deuma perspectiva estética do produto, uma perspectiva daintegridade do produto, ou ambos.

A tabela 8 abaixo relaciona os tratamentos daformulações que foram avaliados. 0 procedimento geral usadopara preparar as formulações foi igual do descrito noExemplo 3. Para este Exemplo, uma formulação de partidacompreendendo o anticorpo monoclonal anti-CTLA-4 11.2.1 (5mg/mL, um tampão de acetato de sódio (20 mM, cloreto desódio (8,2 mg/mL) e polisorbato 80 (0,2 mg/ml) tendo pH 5,5foi preparada e adicionada a vários frascos 'de vidro de 10mL contendo excelente vedação permitindo amostragemasséptica.

Vários tratamentos foram realizados na formulaçãode partida de acordo com a Tabela 8 abaixo. Comoevidenciado na Tabela 8, adicionou-se metionina a alguns dosfrascos. Duas diferentes concentrações de EDTA foramadicionadas a outros frascos. Adicionou-se gás nitrogêniopara o espaço culminante dos frascos selecionados contendoEDTA ou metionina. Além disso, alguns frascos restantes nãotratados, foram desaerados antes da injeção de gásnitrogênio a seus espaços mais elevados. Além disso, algunsdos frascos restantes foram deixados sem tratamento paraagir como controles experimentais.

Dois frascos de cada um dos tratamentos na Tabela8 foram armazenados a 4 0"C por 0, 2, 4, 6, 8, 10 14, 16, e18 semanas. Um dos dois frascos armazenados em cada ocasião,foi usado para a avaliações visuais da cor, enquanto ooutro frasco foi amostrado assepticamente, para medir onivel da agregação do anticorpo 11.2.1 após armazenagem. Astabelas 9 e 10 descrevem os resultados.

Tabela 8: Tratamentos da Formulação de Anticorpo Testados:

<table>table see original document page 182</column></row><table><table>table see original document page 183</column></row><table>

Análise da Aparência da Formulação

Cada formulação foi visualmente avaliada após 0(inicial) , 2, 4, 6, 8, 10, 14, 16, e 18 semanas paraformação de particulado, alteração na cor e alteração paraturvo. Observações visuais foram relatadas na Tabela 9.<table>table see original document page 184</column></row><table><table>table see original document page 185</column></row><table>Os resultados na Tabela 9 indicam que, asformulações sem EDTA e/ou metionina, desenvolveram umacoloração rosa no frasco, após armazenagem por pelo menos 4semanas a 40°C. Embora não desejando estar ligado aqualquer teoria particular, acredita-se, que, numamodalidade da invenção, esta alteração na cor pode serdevida, pelo menos em parte, a um processo oxidativo.Contudo, em outras modalidades, a alteração na cor pode serdevido a quaisquer outros processos, que não estãorelacionados com a oxidação.

A adição de gás nitrogênio para o espaço superiordos frascos pareceu ter menos influencia na redução dadescoloração do que a adição de metionina e/ou EDTA.

Análise de Agregação:

As formulações de anticorpo tratadas de acordo coma Tabela 8 foram armazenadas a uma temperatura de 40°C. Nassemanas 0, 2, 6, 8, 10, 14, 16 e 18, da formulação foianalisada quanto à agregação usando cromatografia deexclusão de tamanho. A cromatografia de exclusão de tamanhofoi realizada" usando uma coluna G3000SWXL-G2000SWXL de gelTSK, tampão de fosfato de sódio 0,2M de fase móvel a pH 7,0a uma velocidade de fluxo de 1 mL/minutos, e detecção de UVa 214 nm. A tabela 10 mostra a percentagem das espécies dealto peso molecular eluidas (ou seja, agregados do anticorpoanti-CTLA-4 11.2.1) medidas em tempo relevantes, para cadaum dos tratamento de formulação. Niveis de agregação foramcalculados por integração das áreas sob os picos docromatograma para cada formulação e relatando-se as áreasintegradas sob os picos das espécies de alto peso molecularcomo uma percentagem da área de pico total (Ver a tabela 10) .<table>table see original document page 188</column></row><table>Os resultados na Tabela 9 indicam que, asformulações sem EDTA e/ou metionina começam a desenvolveruma coloração rosa no frasco após armazenagem por pelo menos4 semanas a 40°C. Como se pode ver na Tabela 10, asformulações tratadas com EDTA e/ou metionina demonstraram osmenores niveis de agregação, seguido pelas formulaçõestratadas com gás nitrogênio e formulações de controle nãotratadas.

EXEMPLO 6

Foi realizado um teste para se avaliar o efeito demetionina de metionina e EDTA na oxidação de alguns residuosde aminoácido metionina no anticorpo anti-CTLA-4 11.2.1 apósarmazenagem como uma formulação liquida.

Análise de oxidação de Metionina:

Os niveis de oxidação de residuos de metionina nasposições 256 e 432 do aminoácido- no anticorpo anti-CTLA-411.2.1 foram medidos por um método de mapeamento de Lisina-Capós armazenagem por 8 semanas a 40°C,

Foi feita amostragem asséptica dos frascos devidro contendo as formulações n°s 26, 29 e 33 (Tabela 8) eseus tratamentos do Exemplo 5, por ocasião da 8a semana. Asamostras foram então digeridas com enzima Lyc-C em tampãotris a pH 8,0 sob condições padrão e analisadas porcromatografia liquida de alto desempenho de fase reversa. Aseparação foi realizada usando uma coluna analítica GraceVydac Protein C4 com TFA a 0,1% em água e TFA 0,085% emgradiente de eluição de acetonitrila.Tabela 11: Oxidação percentual de Aminoácidos Metionina noAnticorpo anti-CTLA-4 11.2.1 Após Tratamentos na Tabela 8:

<table>table see original document page 190</column></row><table>

Os resultados na Tabela 11 indicam que a adiçãode metionina ou EDTA para a formulação de anticorpo 11.2.1reduz a oxidação percentual nos dois residuos de metioninaindicados,se comparado com a formulação armazenada sem EDTAou metionina.

EXEMPLO 7

Foi feita uma analise para se avaliar a oxidaçãode alguns residuos dos aminoácido triptofano e tirosina noanticorpo anti-CTLA-4 11.2.1.

As formulações do anticorpo anti-CTLA-4 quedesenvolvem uma descoloração rosa com o tempo, foram vistasterem uma característica de absorção máxima a 500nm apósrealizar espectroscopia ultravioleta/visivel (UV-Vis).

O procedimento usado para preparar a formulação éigual ao descrito no Exemplo 3. Para este Exemplo, umaformulação compreendendo uma solução de 5 mg/mL do anticorpomonoclonal anti-CTLA-4 11.2.1 num tampão de acetato de sódio20 mM, cloreto de sódio 8,2 mg/mL e polisorbato 80, 0,2mg/mL (a pH 5,5) foi armazenada em dois frascos de vidropor 4 semanas a 40 °C, em cujo tempo, a formulaçãodesenvolveu uma descoloração rosa.

A solução em um dos frascos descolorida foi então,submetida a filtração do peso molecular (faixa) que permitiuaos excipientes da formulação passarem através dodispositivo de filtração, deixando retidos os anticorpos.O eluente de filtração (por exemplo, água e excipientes)estava límpido e incolor, embora a fração coletada (porexemplo, anticorpo 11.2.1) permanecesse cor-de-rosa. Assim,o experimento de filtração indicou que, a descoloração rosaestava relacionada com o próprio anticorpo 11.2.1,contrastando com o fato de ser proveniente dos excipientesda formulação.

A seguir, o segundo frasco com a descoloração rosafoi digerido com tripsina sob condições padrão e analisadopor cromatografia liquida de alto desempenho de fase reversa,acoplado com espectrometria de massa (LC-EM). A separaçãofoi realizada usando uma coluna analítica C4 Grace VydacProtein com 0,1% de TFA em água e 0,05% de TFA em gradientede eluição Acetonitrila. A absorbância UV-Vis dos peptideosdigeridos a 500 nm foi monitorada e os peptideoscorrespondentes foram identificados com base em seu pesomolecular.

O peptideo tríptico, que correlacionou-se com opico de absorbância a 500 nm, tinha a seqüência deaminoácido GLEWVAVIWYDGSNK. A seqüência de peptideoGLEWVAVIWYDGSNK foi a seguir, digerida ainda com Asp-N-protease sob condições padrão, e o pico de absorbância a500 nm (UV-Vis migrou juntamente com o peptideo digerido comAsp-N protease que tinha a seqüência de aminoácido:GLEWVAVIWY.

Portanto, sem querer estar ligado a qualquerteoria em particular, acredita-se que, quaisquer ou ambos osdois residuos de aminoácido triptofano (W) ou o residuotirosina (Y) dentro do peptideo digerido com protease(GLEWVAVIWY) são sitios possíveis para oxidação, que podeter sido responsável pela descoloração rosa da formulação deanticorpo 11.2.1 neste exemplo. Em modalidades particulares,acredita-se que qualquer um, ou ambos os residuos deaminoácido triptofano (W) dentro do peptideo digerido comprotease (GLEWVAVIWY) são sitios possíveis para oxidação,que pode ter sido responsável pela descoloração rosa.

Embora, também seja possível que, mecanismosoutros que a oxidação possam ter sido responsáveis porqualquer uma ou mais das descolorações particulares, (porexemplo, rosa e amarelo) vistas nas diversas formulaçõesaqui avaliadas.

EXEMPLO 8

Foi realizado um teste para se avaliar o efeito deEDTA e DTPA na descoloração, agregação e fragmentação doanticorpo anti-CTLA-4 11.2.1,

Especificamente, foram preparadas três formulaçõeslíquidas compreendendo o anticorpo 11.2.1 com e sem EDTA eDTPA.As formulações foram armazenadas a 40 *C e asavaliações de descoloração, agregação e fragmentação doanticorpo foram realizadas a 0, 2, 4, 6, 8 e 10 semanas.

Para este Exemplo, uma solução de 20 mg/mL doanticorpo anti-CTLA-4 em tampão de acetato de sódio 20 mM apH 5,5 com 8,2 mg/mL de cloreto de sódio e 0,2 mg/mL depolisorbato 80 foi preparadas e dividida entre váriosfrascos de vidro, conforme descrito no Exemplo 3, sendo aseguir tratadas por adição de EDTA ou DTPA. O EDTA e DTPAfoi adicionado para os frascos da formulação como sólidos.Vários frascos foram imediatamente analisados quanto aosniveis de descoloração agregação e fragmentação e váriosoutros frascos em duplicata também forma armazenados eretosa 40°C por 2, 4, 6, 8 e 10 semanas.

Foi realizada a amostragem dos frascos tratados enão tratados, assepticamente, para medir-se o nivel deagregação e fragmentação do anticorpo 11.2.1 nas formulações,no tempo de 2, 4, 6, 8 e 10 semanas, observando-se adescoloração. As Tabelas 12 e 13 descrevem os resultados.

Análise da aparência da Formulação:

Cada formulação foi visualmente avaliada após 0(inicial), 2, 4, 6, 8 e 10 semanas para formação departiculado, alteração na cor e mudança para turvo. Asobservações visual foram relatadas na Tabela 12.Tabela 12: Avaliações visuais dos Tratamentos daFormulação de EDTA e PTPA:

<table>table see original document page 194</column></row><table>

formulações sem EDTA ou DTPA desenvolveram uma coloraçãorosa no frasco após armazenagem por pelo menos 6 semanas a40°C.

Análise da Agregação:

As formulações de anticorpo tratadas de acordo coma Tabela 12 foram armazenada a uma temperatura de 40 °C. Nassemanas 0, 2, 6, 8 e 10, cada formulação foi analisada paraagregação usando cromatografia de exclusão por tamanho. Acromatografia de exclusão por tamanho foi realizada usandouma coluna G3000SWXL-G2000SWXL de gel TSK, tampão de fosfatode sódio 0,2M de fase móvel a pH 7,0 a uma velocidade defluxo de 1 mL/minuto, e detecção UV a 214 nm. A tabela 13mostra a percentagem das espécies de alto peso moleculareluidas (ou seja, agregados do anticorpo anti-CTLA-4 11.2.1)medidas em tempos relevantes, para cada um dos tratamento deformulação. Niveis de agregação foram calculados porintegração das áreas sob os picos do cromatograma para cadaformulação e relatando-se as áreas integradas sob os picosdas espécies de alto peso molecular como uma percentagem daárea de pico total (Ver a tabela 13).

Tabela 13: Agregação Percentual para Tratamentos10 da Formulação de EDTA e DTPA:

<table>table see original document page 195</column></row><table>

Como se pode ver na Tabela 7, tanto as formulaçõescontendo EDTA como DTPA demonstraram niveis mais baixos deagregação, comparado com a formulação sem EDTA ou DTPA.

EXEMPLO 9

Foi realizado um teste para se avaliar o efeito deEDTA e gás nitrogênio na estabilidade do anticorpo anti-CTLA-4 11.2.1.

Especificamente, analisou-se o impacto de EDTA egás nitrogênio na estabilidade do anticorpo 11.2.1, comreferência à descoloração, agregação, oxidação, fragmentaçãoe formação de espécies carregadas, em formulações tamponadascom histidina contendo trehalose e polisorbato 80.

AS formulações que foram avaliadas estãorelacionadas na Tabela 13 abaixo, O procedimento usado parapreparar as formulações é igual ao descrito depois noExemplo 10. AS formulações foram armazenadas a 40 °C e asavaliações de estabilidade foram realizadas a 0, 4, 8, 12 e24 semanas.

Para este Exemplo, uma solução de 20 mg/mL doanticorpo anti-CTLA-4 em 20 mM de tampão de histidina a pH5,5 com 84 mg/mL de trehalose e 0,2 mg/mL de polisorbato 80foi preparada como no Exemplo 10. Uma parte da formulaçãofoi preparada diluindo-se uma solução de estoque concentradado anticorpo com soluções de estoque de trehalose e depolisorbato 80 até a composição final a 20 mg/mL doanticorpo anti-CTLA-4. Uma segunda parte da formulação foipreparada similarmente, com exceção da etapa adicional deadição cie um concentrado de 10 mg/mL de Na2EDTA. 2H2Ó parachegar a uma concentração final de 0,1 mg/mL. As formulaçõesforam então colocadas em frascos de vidro a 1 mL por 2 mL.metade dos frascos de cada formulação foram colocados numliofilizador, e o espaço superior alterado para nitrogênioapós evacuação. Após os frascos serem carregados comnitrogênio, ume medição de seus niveis de oxigênio relatoucerca de 1,5% a 1,6% de oxigênio, enquanto os frascos com arno espaço superior relatou cerca de 19,7% a 20% de oxigênio.

Vários frascos foram imediatamente analisadosquanto aos níveis de descoloração, agregação, fragmentação,oxidação, e formação de espécies carregadas e vários outrosfrascos em duplicata também foram armazenados em pé a 40 °C,por 2, 4, 8, 12 e 24 semanas. Em cada ocasião, dois frascosarmazenados por tratamento foram removidos de cada condiçãopar se medir o nível de agregação, fragmentação, oxidação eformação de espécies carregadas do anticorpo 11.2.1 nasformulações e observados para descoloração. As tabelas 14até 18 descrevem os resultados.

Tabela 13: Formulações de Anticorpo Testadas:

<table>table see original document page 197</column></row><table>

Análise da aparência da Formulação:

Cada formulação foi visualmente avaliada após 0(inicial) , 4, 8, 12 e 24 semanas para formação departiculado, alteração na cor e alteração para turvo. Asobservações visuais são dadas na Tabela 14.<table>table see original document page 198</column></row><table>Os resultados na Tabela 14 indicam que aformulação sem EDTA ou nitrogênio desenvolveu uma coloraçãorosa após armazenagem por 4 semanas a 40 0C. A tabela 14também indica que, a formulação com o ar no espaço superiordo frasco substituído com gás nitrogênio retardou o inicioda descoloração rosa até a semana 12. Ambas as formulaçõescontendo EDTA não tiveram descoloração visivel por pelomenos 24 semanas.

Análise da Agregação:

AS formulações de anticorpo preparadas de acordocom a Tabela 13 foram armazenada a uma temperatura de 40 0C.Nas semanas 0, 4, 8, 12 e 24, cada formulação foi analisadapara agregação usando cromatografia de exclusão por tamanho.Foi realizada a amostragem dos frascos da formulação,assepticamente, em cada ocasião. A cromatografia deexclusão por tamanho foi realizada nas amostras usando umacoluna G3000SWXL-G2000SWXL, tampão de fosfato de sódio 0,2 Mde fase móvel a pH 7,0 a uma velocidade de fluxo de 1mL/minutos, e detecção UV a 214 nnv. A tabela 15 mostra apercentagem das espécies de alto peso molecular eluidas (ouseja, agregados do anticorpo anti-CTLA-4 11.2.1) medida emtempos relevantes para cada um dos tratamentos da formulação.Niveis de agregação foram calculados por integração dasáreas sob os picos do cromatograma para cada formulação erelatando-se as áreas integradas sob os picos das espéciesde alto peso molecular como uma percentagem da área de picototal (ver Tabela 15) .Tabela 15: Agregação Percentual para asFormulações na Tabela 13:

<table>table see original document page 200</column></row><table>

Como se pode ver na Tabela 15, a formulaçãocontendo EDTA, a formulação de gás nitrogênio e aformulações de gás nitrogênio mais EDTA demonstraram menoresniveis de agregação com o tempo, se comparado com aformulação sem EDTA, com ar no espaço superior.

Análise da Fragmentação:

AS formulações de anticorpo preparadas de acordocom a Tabela 13 foram armazenadas a uma temperatura de 40'C.Nas semanas, 0, 4, 8, 12 e 24, cada formulação foi analisadapar impurezas hidroliticas totais (ou seja, fragmentação)usando SDS-PAGE reduzida (r-SDS-PAGE). Foi realizada aamostragem dos frascos da formulação, assepticamente, emcada ocasião e carregados em geles bis-TRis NuPAGE 4-12% commanchamento azul coloidal (Coomassie). A redução do gel foirealizada mediante uso do agente redutor NuPAGE(R). Aimpureza percentual (ou seja, fragmentação) de cada faixa daamostra nos geles reduzidos foi avaliada por escaneamentoem, ou um Densitometro Molecular Dynamics Personal PDQC-90ou Densitometro de Imageamento da Bio-Rad GS800. O nivel defragmentação foi calculado como uma percentagem do volume dafaixa total (ver Tabela 16).

Tabela 16: Fragmentação percentual Total (impurezas)para as Formulações na Tabela 13:

<table>table see original document page 201</column></row><table>

Como se pode ver da Tabela 16, a formulaçãocontendo EDTA, a formulação de gás nitrogênio, e aformulação de EDTA mais gás nitrogênio, demonstraram menoresniveis de fragmentação com o tempo, se comparado com aformulação sem EDTA tendo ar no espaço superior.Formação de Espécies Ácidas e Básicas:

As formulações de anticorpo preparadas de acordocom a Tabela 13 foram armazenadas a uma temperatura de 40 0C.Nas semanas 0, 4, 12 e 24, cada formulação foi analisadapara formação de espécies ácidas e básicas usandoEletroforese Capilar por Imageamento (iCE). A EletroforeseCapilar por Imageamento foi realizada usando um analisadorConvergente da Biosciences ÍCE280 para avaliação daheterogeneidade da carga. O ÍCE280 convergente é uminstrumento de foco isoelétricô capilar de imageamento (IEF),que permite ao usuário fazer uma imagem de uma amostraseparada encerrada dentro de um capilar.

Foi realizada a amostragem dos frascos daformulação, assepticamente, em cada ocasião. As amostrasforam então -preparadas numa mistura de anfólitoseletroforéticos, metil celulose, marcadores de calibração, eágua. As amostras foram introduzidas ao iCE28o sendo aplicadauma voltagem de alto potencial. Os ensaios IEF foramrealizados usando geles de poliacrilamida manualmentepreparados pH 3 - 10,5, empregando-se manchamento com azulde Coomassie. Os componentes de proteína da amostra foramseparados com base em seus relativos pontos isoelétricos(pl) e sua localização. A quantidade relativa de cadacomponente separado foi observada por uma câmera CCD deimageamento. Os dados foram então processados e relatadoscomo perda do pico principal (ou seja, formação de espéciesácidas e básicas) usando software de integraçãocromatográfica convencional (Ver a Tabela 17).Tabela 17: Perda do Pico Principal para asFormulações na Tabela 13:

<table>table see original document page 203</column></row><table>

Como se pode ver da Tabela 17, a formulaçãocontendo EDTA, a formulação de gás nitrogênio, e aformulação de EDTA mais gás nitrogênio, demonstraram osniveis mais altos de fragmentação do pico intato principal,com o tempo, se comparado com a formulação sem EDTA tendoar no espaço superior. Portanto, a quantidade de espéciesácidas e básicas é maior, com o tempo, nas formulaçõescarecendo de EDTa e/ou gás nitrogênio no espaço superior.

Análise da Oxidação de Aminoácido:

Niveis de oxidação de residuos metionina nasposições de aminoácido 256 e 432 no anticorpo anti-CTLA-411.2.1 foram medidos por um método de mapeamento Lisina-Capós armazenagem por 12 semanas a 40°C.Foi realizada a amostragem dos frascos contendo asformulações da Tabela 13, assepticamente, no tempo de 12semanas. As amostras foram então digeridas com uma enzimaLisil Endopeptidase (Lys-C) tampão tris a pH 8,0, sobcondições padrão e analisadas por cromatografia.liquida dealto desempenho de fase reversa. A separação foi realizadausando uma coluna analítica Grace Vydac Protein C4 com 0,1%de TFA em água e 0, 085% de TFA em eluição de gradiente deacetonitrila.

Tabela 18: Oxidação Percentual de Aminoácidos Metionina emAnticorpo anti-CTLA-4 11.2.1 em Formulações da Tabela 13:

<table>table see original document page 204</column></row><table>

Os resultados da Tabela 18, indicam que, a adiçãode EDTA para a formulação de anticorpo 11.2.1 e/ou.adiçãode gás nitrogênio para o espaço superior do frasco, reduziua oxidação percentual nos dois resíduos de metioninaindicados, se comparado com a formulação sem EDTA, tendo arno espaço superior.

EXEMPLO 10

Realizou-se uma análise para comparar o efeito naestabilidade das formulações de anticorpo anti-CTLA-4 11.2.1compreendendo um tampão de acetato de sódio e cloreto desódio (ou seja, ions cloreto) versus formulaçõescompreendendo um tampão de histidina e trehalose.

De modo especifico, o impacto na estabilidade doanticorpo 11.2.1 analisado com respeito à descoloração,agregação e fragmentação.

As formulações que foram avaliadas estãorelacionadas na Tabela 19 a seguir. O procedimento usadopara preparar as formulações é igual a descrita no Exemplo 3.

As formulações na Tabela 19, foram preparadastomando-se uma solução de estoque de 11,9 mg/mL do anticorpo11.2.1 em 20 mM de tampão de acetato de sódio, pH 5,5, 140mM de cloreto de sódio e submetendo-a a uma etapa deultrafiltração/diafiltração (UF/DF) num Millipore Lab ScaleTFF System com uma membrana Pellicon XL PBTK 30 K de 50 cm2.A seguir soluções concentradas do anticorpo 11.2.1 forampreparadas na faixa de 35 a 40 mg/mL em acetato de sódio 20mM ou tampões de histidina 20 mM.

Concentrados do agente tonificante forampreparados em, ou tampão de acetato de sódio ou histidina emtrês vezes as concentrações finais do alvo. Uma soluçãoconcentrada de polisorbato 80 foi preparada a 20 mg/mL eNa2EDTA.2H20 a 10 mg/mL em cada um dos tampões. Formulaçõesindividuais foram preparadas diluido-se as soluçõesconcentradas apropriadamente. As formulações foram entãofiltradas por meio de filtros de grau esterilizante de 0,2 ^e enchidas em vários frascos em duplicata. Um volume deenchimento de 1 mL foi empregado em frasco de vidro Tipo 1de 2 mL. Os frascos foram fechados com rolha, vedados comvirola, e armazenados eretos em câmaras de estabilidade a25°C e 40°C. Um outro conjunto de frascos também foicolocado a -20 °C por 4 semanas, e um outro conjunto foisubmetido a ciclos de congelamento/descongelamento 4x(caixa de frascos enchida com água) conforme descrito noExemplo 4. Todas as formulações tinham um pH de 5,5 e umaconcentração do anticorpo anti-CTLA-4 11.2.1 de 20 mg/mL.

Vários frascos foram imediatamente analisadosquanto ao nivel de descoloração, agregação, e fragmentação evários outros frascos em duplicada também foram armazenadoseretos a 25°C e 40°C por 4, 8, 12, 18, 24 e 36 semanas. Emcada ocasião, dois frascos armazenados por formulação, foramremovidos de cada condição para medir-se o nivel daagregação e fragmentação do anticorpo anti-CTLA-4 11.2.1,bem como da descoloração. As Tabelas 20 a 24 e as Figuras 3e 4 descrevem os resultados.<table>table see original document page 207</column></row><table>Análise da Aparência da Formulação:

Cada formulação foi avaliada, visualmente, após 1)mistura inicial da formulação, 2) congelamento da formulaçãoa -20 ° C por 4 semanas, e 3) após 4 ciclos decongelamento/descongelamento (-70 °C a 5°C) na caixa juntocom os frascos enchidos com água conforme descrito noExemplo 4). Cada formulação foi avaliada, visualmente, após0 (inicial) 8, 12 e 24 semanas para formação de particulado,alteração na cor, e alteração para turvo. As formulaçõesforam avaliadas para formação de particulado, alterações nacor e alterações para turvo, sendo os dados relatados naTabela 20 (congelamento/descongelamento) , Tabela 21(armazenagem a 25°C) e Tabela 22 ( armazenagem a 40°C).

Tabela 20: Avaliações Visuais de Formulações daTabela 19 após Congelamento/descongelamento:

<table>table see original document page 208</column></row><table><table>table see original document page 209</column></row><table><table>table see original document page 210</column></row><table>Os resultados nas Tabelas 20 a 22 indicam que asformulações do anticorpo 11.2.1 contendo EDTA tiveramdescoloração reduzida, turvação reduzida e formação departiculado reduzida, quando comparado com as formulaçõessem EDTA. Em geral, as formulações contendo cloreto desódio. tiveram descoloração, turvação e formação departiculado aumentados, quando comparado com as formulaçõescom EDTA, porém sem cloreto de sódio.

Análise da Agregação:

AS formulações de anticorpo preparadas de acordocom a Tabela 19 foram armazenadas a uma.temperatura de 25°Ce 40°C. Nas semanas 0 (inicial), 4, 8, 12, 24, e 36 semanas,as formulações a 25 °C foram analisadas para agregação usandocromatografia de exclusão de tamanho. Nas semanas 4, 8, 12e 24, as formulações a 40 °C foram analisadas para agregaçãousando cromatografia de exclusão de tamanho. Foi realizadaamostragem asséptica dos frascos da formulação em cadaocasião. A cromatografia de exclusão por tamanho foirealizada nas amostras usando uma coluna G3000SWXL-G2000SWXLem gel TSK, tampão de fosfato de sódio 0,2 M de fase móvel apH 7,0, a uma velocidade de fluxo de 1 ml/minutos, edetecção UV a 214 nm. As tabelas 23 (a) e 23 (b) mostram apercentagem da agregação do anticorpo 11.2 1 medida emtempos relevantes para cada um dos tratamentos daformulação. Os niveis de agregação foram calculados porintegração das áreas sob os picos do cromatograma para cadaformulação, relatando-se as áreas integradas sob asespécies de alto peso molecular como uma percentagem da áreade pico total (ver Tabelas 23(a) e 23 (b) ) .

Tabela 23 (a): Agregação Percentual para as Formulações naTabela 19 após Armazenagem a 25°C

<table>table see original document page 212</column></row><table>

Tabela 23(b) abaixa relaciona os dados deagregação graficamente apresentados na Figura 3

Tabela 23 (b): Agregação Percentual para as Formulações naTabela 19 após Armazenagem a 40°C ;

<table>table see original document page 212</column></row><table><table>table see original document page 213</column></row><table>

Figura 3, as formulações contendo EDTA demonstraram niveisreduzidos de agregação se comparado com a formulaçãocarecendo de EDTA, mas com um tampão de acetato e cloretode sódio, após armazenagem a 25°C e 40°C. Além disso, umaformulação contendo um tampão de histidina (sem EDTA) teveuma quantidade reduzida de agregação comparado com aformulação carecendo de eDTA, porém contendo um tampão deacetato e cloreto de sódio.

Análise de Fragmentação:

As formulações de anticorpo preparadas de acordocom a Tabela 19 foram armazenadas a temperatura de 25 °C e40 °C. Nas semanas 0 (inicial) 4, 8, 12, 18 e 36 semanas,cada formulação foi analisada para impurezas hidroliticastotais (ou seja, fragmentação) usando SDS-PAGE reduzido(rSDS-PAGE). Foi feita amostragem dos frascos da formulação,assepticamente, em cada ocasião, e carregados em geles bis-Tris a 4-12% NuPAGE com manchamento azul coloidal(Coomassie). A redução do gel foi realizada mediante uso doagente redutor NuPAGE(R) . A impureza percentual (ou seja,fragmentação) de cada faixa da amostra nos geles reduzidosfoi avaliada por escaneamento em, ou um DensitômetroMolecular Dynamics Personal PDQC-90 ou Densitômetro deImageamento Bio-Rad GS800. O nivel de fragmentação foicalculado como uma percentagem do volume da faixa total (verTabelas 24 (a) e 24(b)) .

Tabela 24 (a) : Fragmentação Percentual para Formulações naTabela 19 Após Armazenagem a 25°C

<table>table see original document page 214</column></row><table>

A Tabela 24(b) abaixo relata os dados defragmentação graficamente apresentados na Figura 4.

Tabela 24 (b) : Fragmentação Percentual para as Formulações naTabela 19 após Armazenagem a 4Q°C.

<table>table see original document page 214</column></row><table><table>table see original document page 215</column></row><table>

Figura 3, as formulações contendo EDTA demonstraram niveisreduzidos de agregação se comparado com a formulaçãocarecendo de EDTA, mas com um tampão de acetato e cloretode sódio, após armazenagem a 25°C e 40°C.

EXEMPLO 11

Foi realizado um teste para se comparar o efeitode concentrações variadas de EDTA na estabilidade deformulações de anticorpo anti-CTLA-4 11.2.1. Também foramtestadas alternativas para uma formulação de tampão dehistidina-trehalose, substituindo-se parte de trehalose pormanitol.

De modo especial, o impacto sobre a estabilidadedo anticorpo 11.2.1 foi analisado com relação à descoloração,agregação, fragmentação e oxidação.

As formulações que foram avaliadas estãorelacionadas na/Tabela 25 abaixo. O procedimento usado parapreparar as formulações é igual ao descrito no Exemplo 10.

As formulações na Tabela 25 foram preparadastomando-se uma solução de estoque de 11,9 mg/mL do anticorpo11.2.1 em 20 mM de tampão de acetato de sódio a pH 5,5,cloreto de sódio 140 mM e submetendo-as a uma etapa deultrafiltração/diafiltração (UF/DF) num Sistema MilliporeLab Scale TFF com uma membrana Pellicon XL PBTK 30K de 50cm2. A seguir, soluções concentradas do anticorpo 11.2.1foram preparadas na faixa de 35 a 4 0 mg/mL em tampões deacetato de sódio 20 mM ou histidina 20 mM.

Concentrados do agente de tonicidade forampreparadas em, ou tampão de acetato de sódio ou histidina emtrês vezes as concentrações finais alvo. Uma soluçãoconcentrada de polisorbato 80 foi preparada a 20 mg/mL eNa2EDTA.2H2Ü a 10 mg/mL em cada um dos tampões. Formulaçõesindividuais foram preparadas por diluição das soluçõesconcentradas apropriadamente. Concentrações de EDTA (comoNa2EDTA. 2H2O) foram examinadas na faixa de 0 - 0,2 mg/mL. Asformulações foram então filtradas por meio de filtros degrau esterilizante de 0,2 \x e enchidas em vários frascos emduplicada. Um volume de enchimento de 1 mL foi usado nosfrascos de vidro Tipo 1 de 2 mL.

Os frascos foram fechados com rolhas revestidas deFluorotecÍR) Daikyo 777-1, vedados com virola, e armazenadoseretos em câmaras de estabilidade a 25 °C e 40 °C. Um outrolote de frascos foi submetido a ciclos decongelamento/descongelamento 4x iconforme descrito no Exemplo10. Todas as formulações tiveram um pH de 5,5 e umacomposição do anticorpo anti-CTLA-4 11.2.1 de 20 mg/mL.

Vários frascos foram imediatamente analisadosquanto a niveis de descoloração, agregação, fragmentação eoxidação e vários outros frascos em duplicada também foramarmazenados eretos a 25°C e 4Q°C, por 4, 8, 13, 18 e 24semanas. Em cada ocasião, dois frascos armazenados porformulação de cada condição, foram removidos para se medir onivel da agregação, fragmentação do anticorpo 11.2.1, etambém observar a descoloração. As tabelas 26 a 31 e asFiguras 5 a 10 descrevem os resultados.

Tabela 25: Formulações de Anticorpo Testadas:

<table>table see original document page 217</column></row><table>

Análise da Aparência da Formulação:

Cada formulação•foi visualmente inspecionada após1) mistura inicial da formulação, 2) após 4 ciclos decongelamento/descongelamento e 3) após armazenagem a 25'C e40°C por 4, 8, 13, 18 e 24 semanas. As formulações foramavaliadas para formação de particulado, alterações na cor ealterações de turvação tendo os dados revelados nas Tabelas26 a 28

Tabela 26: Avaliações Visuais das Formulações daTabela 25 após Congelamento/descongelamento

<table>table see original document page 218</column></row><table><table>table see original document page 219</column></row><table>

Tabela 27: Avaliações Visuais das Formulações daTabela 25 após Armazenagem a 25°C

<table>table see original document page 219</column></row><table><table>table see original document page 220</column></row><table><table>table see original document page 221</column></row><table><table>table see original document page 222</column></row><table>Os resultados nas Tabelas 2 6 a 2 8 indicam que as formulações do anticorpo 11.2.1 contendo todas as concentrações de eDTA em teste tiveram descoloração reduzida, turvação reduzida e formação de particulado reduzida, se comparado com as formulações sem eDTA.

Em geral, as formulações contendo cloreto de sódio, tiveram proteção de congelamento/descongelamento reduzida, conforme se evidenciou por descoloração, turvação e formação de particulados aumentados,s se comparado com as formulações com EDTA, porém sem cloreto de sódio.

Análise de Agregação:

As formulações de anticorpo preparadas de acordo com a Tabela 25 foram armazenadas a uma temperatura de 25 °C e 40 °C. Nas semanas 0 (inicial), 4, 8, 13, 18 e 24 cada formulação foi analisada quanto -à agregação usando cromatografia de exclusão de tamanho (SEC) A cromatografia de exclusão de tamanho foi realizada nas amostras, usando uma coluna de gel TSK G3000SWXL-G2000SWXL, tampão de fosfato de sódio 0,2 M de fase móvel a pH 7,0 uma velocidade de escoamento de 1 mL/minuto e detecção UV a 214 nM. A Tabela 29 (a) mostra a percentagem da agregação do anticorpo 11.2.1 medida após armazenagem a 40°C. Niveis de agregação foram calculados por integração das áreas sob os picos de cromatografia para cada formulação descrevendo-se as áreas integradas, sob os picos das espécies de alto peso molecular como uma percentagem da área de pico total (ver Tabelas 29 (a) e 29 (b)) .Tabela 29(a): Agregação Percentual para Formulações na Tabela 25 após Armazenagem a 25 °C

<table>table see original document page 224</column></row><table>

Tabela 49 (b) abaixo descreve os dados de agregação graficamente apresentados na Figura 5 5 Tabela 29(b): Agregação Percentual para Formulações na Tabela 25 após Armazenagem a 40 °C

<table>table see original document page 224</column></row><table><table>table see original document page 225</column></row><table>

Como se pode ver nas Tabelas 29 (a) e Figura 5, as formulações contendo EDTA, demonstrou níveis reduzidos de agregação em todas as concentrações de EDTA testadas, quando comparado com a formulação sem EDTA, porém com um tampão de acetato e cloreto de sódio, após armazenagem a 25°C e 40°C. A Figura 7 resume graficamente a redução na agregação percentual para as formulações da Tabela 25 como uma função da concentração de EDTA.

Análise da Fragmentação:

As formulações de anticorpo preparadas de acordo com a Tabela 25 foram armazenadas a uma temperatura de 25 e 40°C. Nas semanas, 0 (inicial), 4, 8, 13, 18 e 24, as formulações de 25 "C e 40°C foram analisadas para impurezas hidroliticas totais (ou seja, fragmentação) usando SDS-PAGE reduzida (r-SDS-PAGE). Foi realizada a amostragem dos frascos da formulação, assepticamente, em cada ocasião ecarregados em geles bis-Tris NuPAGE 4-12% com manchamento azul coloidal (Coomassie). A redução do gel foi realizada mediante uso do agente redutor NuPAGE(R>. A impureza percentual (ou seja, fragmentação) de cada faixa da amostra nos geles reduzidos foi avaliada por escaneamento em, ou um Densitometro Molecular Dynamics Personal PDQC-90 ou Densitometro de Imageamento da Bio-Rad GS800. 0 nivel de fragmentação foi calculado como uma percentagem do volume da faixa total (ver Tabelas 30(a) e 30(b)).

Tabela 30(a): Fragmentação Percentual para Formulações naTabela 25 após Armazenagem a 25°C

<table>table see original document page 226</column></row><table>A tabela 30(b) abaixo relata os dados de fragmentação graficamente representados na Figura 6

Tabela 30(b): Fragmentação Percentual para as Formulações na Tabela 25 após Armazenagem a 40°C:

<table>table see original document page 227</column></row><table>

Como se pode ver nas Tabelas 30 (a), 30(b) e Figura 6, as formulações contendo EDTA, demonstraram níveis reduzidos de fragmentação quando comparado com a formulação sem EDTA, porém com um tampão de acetato e cloreto de sódio, após armazenagem a 25 'C e 40 °C. Além disso, as formulações contendo histidina e trehalose sem EDTA demonstraram fragmentação reduzida sobre a formulação contendo cloretode sódio, sem EDTA.

A Figura 8 resume graficamente a redução na fragmentação percentual para as formulações da Tabela 25 como uma função da concentração de EDTA.

Análise da Oxidação de Aminoácido:

Os niveis de oxidação de determinados residuos de metionina nas posições 256 e 432 de aminoácido no anticorpo anti-CTLA-4 11.2.1 foram medidos por um método de mapeamento de Lisina-C.

Foi feita amostragem asséptica dos frascos contendo as formulações da Tabela 25 por ocasião da semana 18 e semana 24 a 40°C. As amostras foram então digeridas com enzima Lisil Endopeptidase (Lys-C) em tampão tris a pH 8,0 sob condições padrão e analisadas por crornatografia liquida de alto desempenho de fase reversa. A separação foi realizada usando uma coluna analítica Grace Vydac Protein C4 com TFA a 0,1% em água e TFA 0,085% em gradiente de eluição de acetonitrila. A Tabela 31 descreve os resultados.

Tabela 31: Oxidação percentual de Aminoácidos Metionina em anticorpo anti-CTLA-4 11.2.1 nas Formulações da Tabela 25:

<table>table see original document page 228</column></row><table><table>table see original document page 229</column></row><table>

Como se pode ver da Tabela 31, a presença, de EDTA na formulação do anticorpo 11.2.1 reduz o nivel de oxidação de metionina que ocorre com o tempo.

EXEMPLO 12

Foi realizado um teste para se comparar o efeito de manitol e sorbitol na estabilidade das formulações de anticorpo anti-CTLA-4 11.2.1. Neste Exemplo, alternativas para uma formulação de histidina-trehalose foram analisadas, substituindo-se parte de trehalose com concentrações variadas de manitol e/ou sorbitol (Tabela 32) As concentração de EDTA (como Na2EDTA.2H20) foram examinadas na faixa de 0 a 0,1 mg/mL.

De modo especifico, o impacto na estabilidade do anticorpo 11.2.1 foi analisado com respeito à descoloração,agregação, fragmentação e oxidação.

As formulações na que foram avaliadas estão relacionadas na Tabela 32 abaixo. O procedimento usado para preparar as formulações é igual ao descrito no Exemplo 10.As formulações na Tabela 32 foram preparadas tomando-se uma solução de estoque de 11,9 mg/mL do anticorpo 11.2.1 em 20 mM de tampão de acetato de sódio a pH 5,5, cloreto de sódio 140 mM e submetendo-as a uma etapa de ultrafiltração/diafiltração (UF/DF) num Sistema Millipore Lab Scale TFF com uma membrana Pellicon XL PBTK 30K de 50 cm2. A seguir, soluções concentradas do anticorpo 11.2.1 foram preparadas na faixa de 35 a 40 mg/mL em tampões de acetato de sódio 20 mM ou histidina 20 mM.

Concentrados do agente de tonicidade foram preparadas em, ou tampão de acetato de sódio ou histidina em três vezes as concentrações finais alvo. Uma solução concentrada de polisorbato 80 foi preparada a 20 mg/mL e Na2EDTA.2H20 a 10 mg/mL em cada um dos tampões. Formulações individuais foram preparadas por diluição das soluções concentradas apropriadamente. As formulações foram então filtradas por meio de filtros de grau esterilizante de 0,2 ja e enchidas em vários frascos em duplicata. Um volume de enchimento de 1 mL foi usado nos frascos de vidro Tipo 1 de 2 mL.

Os frascos foram fechados com rolhas revestidas de Fluor otec(R> Daikyo 7 77-1, vedados com virola, e armazenados eretos em câmaras de estabilidade a 25°C e 40°C. Um outro lote de frascos foi submetido a ciclos de conge1amento/descongelamento 4x conforme descrito no Exemplo 10. Todas as formulações tiveram um pH de 5,5 e uma composição do anticorpo anti-CTLA-4 11.2.1 de 20 mg/mL.

Vários frascos foram imediatamente analisadosquanto a níveis de descoloração, agregação, fragmentação e oxidação e vários outros frascos em duplicada também foram armazenados eretos a 25°C e 40°C, por 4, 8, 13, 18 e 24 semanas. Em cada ocasião, dois frascos armazenados por formulação de cada condição, foram removidos para se medir o nivel da agregação, fragmentação do anticorpo 11.2.1, e também observar a de s coloração. As tabelas 33 a 37 e as Figuras 10 a 11 descrevem os resultados.

Tabela 32: Formulações de Anticorpo Testadas:

<table>table see original document page 231</column></row><table>

Análise da aparência da Formulação:

Cada formulação foi visualmente inspecionada após 1) mistura inicial da formulação, 2) após 4 ciclos de congelamento/descongelamento (-7 0 °C a 5°C junto com osfrascos enchidos com água do Exemplo 4) e 3) após armazenagem a 25 °C e 40 °C por 8, 13, e 24 semanas. As formulações foram avaliadas para formação de particulado, alterações na cor e alterações de turvação, sendo os dados referidos nas Tabelas 33 a 35.

Tabela 33: Avaliações Visuais das Formulações da Tabela 32

<table>table see original document page 232</column></row><table><table>table see original document page 233</column></row><table>

Tabela 34: Avaliações Visuais das Formulações da Tabela 32 após Armazenagem a 25°C

<table>table see original document page 233</column></row><table>Tabela 35: Avaliações Visuais das Formulações da Tabela 25 após Armazenagem a 40 °C

<table>table see original document page 234</column></row><table><table>table see original document page 235</column></row><table>

Os resultados nas Tabelas 33 a 35 indicam que as formulações de anticorpo 11.2.1 contendo cloreto de sódio, porem sem EDTA, tiveram proteção reduzida de conge1amento/descongelamento como se evidenciou por descoloração aumentada, turvação e formação de particulado aumentadas, se comparado com as formulações com EDTA, porém sem cloreto de sódio.Os resultados também indicam que, as formulações de anticorpo 11.2.1 todas contendo concentrações de. EDTA testadas, tiveram descoloração reduzida, turvação reduzida e formação de particulados reduzida, se comprado com as formulações sem EDTA.

Análise de Agregação:

As formulações de anticorpo preparadas de acordo com a Tabela 32 foram armazenadas a uma temperatura de 25 °C e 40 °C. Nas semanas 0 (inicial) , 4, 8, 13, 18 e 24, as formulações a 25°C e 40°C foram analisadas quanto à agregação usando cromatografia de exclusão de tamanho. Foi feita a amostragem asséptica dos frascos de formulação emcada ocasião. A cromatografia de exclusão de tamanho foi realizada nas amostras, usando uma coluna de gel TSK G3000SWXL-G2000SWXL, tampão de fosfato de sódio 0,2 M de fase. móvel a pH 7,0 uma velocidade de escoamento de 1 mL/minuto e detecção UV a 214 nM. A Tabela 36 (a) mostra a percentagem da agregação do anticorpo 11.2.1 medida após armazenagem a 25 °C, em tempos relevantes para cada uma das formulações. A tabela 36 (b) mostra a percentagem de agregação do anticorpo 11.2.1 medida após armazenagem a 40 °C.

Niveis de agregação foram calculados por integração das áreas sob os picos de cromatograf ia para cada formulação descrevendo-se as áreas integradas, sob os picos das espécies de alto peso molecular como uma percentagem da área de pico total (ver Tabelas 36 (a) e 36(b)) .

Tabela 36 (a): Agregação Percentual para Formulações na Tabela 32 após Armazenagem a 25°C

<table>table see original document page 236</column></row><table><table>table see original document page 237</column></row><table>

Tabela 36(b) abaixo descreve os dados de agregação graficamente apresentados na Figura 9

Tabela 36 (b): Agregação Percentual para Formulações na Tabela 32 após Armazenagem a 40°C

<table>table see original document page 237</column></row><table>

Como se pode ver nas Tabelas 36(a) e Figura 9, as formulações contendo EDTA, demonstraram níveis reduzidos de agregação em todas as concentrações de EDTA testadas, quando comparado com a formulação sem EDTA, porém com um tampão de acetato e cloreto de sódio (ou seja íons cloreto), após armazenagem a 25°C e 40°C. A Figura 9 resume graficamente a redução na agregação percentual para as formulações da Tabela 32.Análise da Fragmentação:

As formulações de anticorpo preparadas de acordo com a Tabela 32 foram armazenadas a uma temperatura de 25 e 40°C. Nas semanas, 0 (inicial) , 4, 8, 13, 18 e 24, as formulações de 25 °C e 40 °C foram analisadas para impurezas hidroliticas totais (ou seja, fragmentação) usando SDS-PAGE reduzida (r-SDS-PAGE). Foi realizada a amostragem dos frascos da formulação, assepticamente, em cada ocasião e carregados em geles bis-Tris NuPAGE 4-12% com manchamento azul coloidal (Coomassie). A redução do gel foi realizada mediante emprego do agente redutor NuPAGEÍR). A impureza percentual (ou seja, fragmentação) de cada faixa da amostra nos geles reduzidos foi avaliada por escaneamento em, ou um Densitometro Molecular Dynamics Personal' PDQC-90 ou Densitometro de Imageamento da Bio-Rad GS800. O nivel de fragmentação foi calculado como uma percentagem do volume da faixa total (ver Tabelas 37 (a) e 37(b)).

Tabela 37(a): Fragmentação Percentual para Formulações na Tabela 32 após Armazenagem a 25°C

<table>table see original document page 238</column></row><table><table>table see original document page 239</column></row><table>

A tabela 37(b) abaixo descreve os dados de fragmentação graficamente representados na Figura 10 Tabela 37 (b) : Fragmentação Percentual para as Formulações na Tabela 32 após Armazenagem a 40°C:

<table>table see original document page 239</column></row><table>

Como se pode ver nas Tabelas 37 (a), 37 (b) e Figura 10, as formulações contendo EDTA, demonstraram niveis reduzidos de fragmentação guando comparado com a formulação sem EDTA, porém com um tampão de acetato e cloreto de sódio (ou seja, ions cloreto), após armazenagem a25°C e 40°C.

EXEMPLO 13

Este exemplo ilustra a produção de uma composição farmacêutica liquida contendo anticorpo anti-CTLA-4 ticilimumabf monocloridrato de L-histidina monoidratado, ácido etilenodiaminotetracético dissódico diidratado, a, a-trehalose diidratada e polisorbato 80.

Uma composição farmacêutica liquida da presente invenção foi formada por obtenção dos seguintes componentes:anticorpo anti-CTLA-4 ticilimumab (disponível de linhagem de célula de hibridoma 11.2.1.4 depositada sob o Número de Acesso ATCC PTA-5169, de acordo com o Exemplo 1 ou preparada recombinantemente de uma linhagem de célula de mamifero de acordo com o Exemplo 2), monocloridrato de L-histidina monoidratado (disponível de Ajinomoto, Raleigh, NC) L-histidina (disponível de Ajinomoto, Raleigh, NC) , ácido etilenodiaminotetracético dissódico diidratado (disponível como Titriplex III da Merck KgaA, DArmstadt, Alemanha) , aa-trehalose diidratada (disponível como Número de Produto T-104-1-MC de Ferro Pfanstiehl, Waukegan IL) e polisorbato 80 (disponível como Crillet 4 HP, da Croda Inc. Mill Hall PA) .

A composição farmacêutica liquida foi preparada, primeiramente, preparando-se várias soluções de estoque do anticorpo anti-CTLA-4 ticilimumab, monocloridrato de L-histidina monoidratado, ácido etilenodiaminotetracético dissódico diidratado, a,a-trehalose diidratada e polisorbato 80. Um tampão de histidina 20 mM pH 5,5 é preparado dissolvendo-se 3,27 mg/mL (15,6 mM) de L-Histidina HC1monoidratado e 0,68 mg/mL (4,4 mM) de L-histidina em água. Um tampão de Formulação IX é preparado, dissolvendo-se 3,27 mg/mL (15,6 mM) L-Histidina HC1 monoidratado e 0,68 mg/mL (4,4 mM) L-Histidina, 84 mg/mL (222 mM) a a-trehalose diidratada, 0,2 mg/mL de Polisorbato 80 e 0,1 mg/mL (0,268 mM) de ácido etilenodiaminotetracético dissódico diidratado em água. Um tampão de Formulação 2X é preparado dissolvendo-se 3,27 mg/mL (15,6 mM) de monocloridrato de L-histidina monoidratado e 0,68 mg/mL (4,4 mM) de L-Histidina, 168 mg/mL (4 44 mM) de a, a-trehalose diidratada, 0,4 mg/mL de polisorbato 80 e 0,2 mg/mL (0, 536 mM) de ácido etilenodiaminotetracético dissódico diidratado em água. Uma solução de estoque do anticorpo anti-CTLA-4 ticilimumab é preparada de acordo com o Exemplo 2 e concentrada entre 42 e 55 mg/mL ( o alvo é 4 5 mg/mL) no tampão de Histidina usando um processo de ultrafiltração realizado com uma membrana Tipo 50 kD (Biomax PES).

Para preparar a composição farmacêutica, volumes iguais da solução de estoque concentrada do anticorpo anti-CTLA-4 ticilimumab e do tampão de Formulação 2X são adicionados para um recipiente adequado para mistura intima das composições liquidas. Após misturar, um pequeno volume da solução é removido e a concentração do anticorpo determinada por espectrornetria de Ultravioleta-Visivel (UV-Vis), usando um coeficiente de extinção de 1,43 (mg/mL)-1 cm-1 (faixa esperada 21 a 27,5 mg/mL, alvo 22,5 mg/mL). Finalmente, um volume calculado adequadamente do tampão da Formulação IX é adicionado e misturado para conduzir oanticorpo para a concentração alvo de 20 mg/mL (faixa 18 -22 mg/mL).

As composições farmacêuticas sano então filtradas através de filtros de grau esterilizante de 0,2 |i e enchidas em frascos. Um volume de enchimento nominal de 20 ml foi usado em frascos de vidro Tipo 1 de 20 mililitros. Os frascos foram tampados com rolhas revestidas de Fluorotec(R) Daikyo 7 7 7-1 e vedados com virola. Os frascos de vidro foram esterilizados, assim como as rolhas de soro Daikyo 7 7 7-1 de 20 mm.

Cada unidade de frasco contém cerca de 400 mg/ do anticorpo anti-CTLA-4 ticilimumab, 65,4 mg de monocloridrato de L-histidina monoidratado 13,6 mg de L-Histidina, 2 mg de ácido etilenodiaminotetracético dissódico diidratado, 1680 mg de a,a-trehalose diidratada e 4 mg de polisorbato 80.

EXEMPLO 14

Este exemplo ilustra a produção esperada de uma composição farmacêutica liquida contendo anticorpo anti-CTLA-4 ticilimumab, monocloridrato de L-histidina monoidratado, ácido etilenodiaminotetracético dissódico diidratado, a,a-trehalose diidratada e polisorbato 80.

Uma composição farmacêutica liquida da presente invenção pode ser formada por obtenção dos seguintes componentes: anticorpo anti-CTLA-4 ticilimumab (disponível de linhagem de célula de hibridoma 11.2.1.4 depositada sob o Número de Acesso ATCC PTA-5169, de acordo com o Exemplo 1 ou preparada recombinantemente de uma linhagem de célula de mamifero de acordo com o Exemplo 2), monocloridrato de L-histidina monoidratado (disponível de Ajinomoto, Raleigh, NC) L-histidina (disponível de Ajinomoto, Raleigh, NC) , ácido etilenodiaminotetracético dissódico diidratado (disponível de Sigma-Aldrich, st. Louis, MO), aa-trehalose diidratada (disponível como Número de Produto T-104-1-MC de Ferro Pfanstiehl, Waukegan IL) e polisorbato 80 (disponível como Crillet 4 HP, da Croda Inc. Mill Hall PA).

A composição farmacêutica liquida pode ser preparada, primeiramente, preparando-se várias soluções de estoque do anticorpo anti-CTLA-4 ticilimumab, monocloridrato de L-histidina monoidratado, ácido etilenodiaminotetracético dissódico diidratado, a,a-trehalose diidratada e polisorbato 80. Um tampão de histidina 20 mM pH 5,5 pode ser preparado dissolvendo-se 3,27 mg/mL (15,6 mM) de L-Histidina HC1 monoidratado e 0,68 mg/mL (4,4 mM) de L-histidina em água. Um tampão de Formulação IX é preparado, dissolvendo-se 3,27 mg/mL (15,6 mM) de L-Histidina HC1 monoidratado e 0,68 mg/mL (4,4 mM) L-Histidina, 84 mg/mL (222 mM) de a a-trehalose diidratada, 0,2 mg/mL de Polisorbato 80 e 0,1003 mg/mL (0,268 mM) de ácido etilenodiaminotetracético dissódico de cálcio em água. Um tampão de Formulação 2X pode ser preparado dissolvendo-se 3,27 mg/mL (15,6 mM) de monocloridrato de L-histidina monoidratado e 0,68 mg/mL (4,4 mM) de L-Histidina, 168 mg/mL (444 mM) de a, a-trehalose diidratada, 0,4 mg/mL de polisorbato 80 e 0,2006 mg/mL (0,536 mM) de ácido etilenodiaminotetracético dissódico de cálcio em água. Uma solução de estoque do anticorpo anti-CTLA-4 ticilimumab pode preparada de acordo com o Exemplo 2e concentrada entre 42 e 55 mg/mL ( o alvo é 45 mg/mL) em tampão de Histidina usando um processo de ultrafiltração realizado com uma membrana Tipo 50 kD (Biomax PES).

Para preparar a composição farmacêutica, volumes iguais da solução de estoque concentrada do anticorpo anti-CTLA-4 ticilimumab e do tampão de Formulação 2X podem ser adicionados para um recipiente adequado realizando-se a mistura intima das composições liquidas. Após misturar, um pequeno volume da solução pode ser removido e a concentração do anticorpo determinada por espectrornetria de Ultraivoleta-Visivel (UV-Vis), usando um coeficiente de extinção de 1,4 3 (mg/mL)_1 cm-1 (faixa esperada 21 a 27,5 mg/mL, alvo 22,5 mg/mL). Finalmente, um volume calculado adequadamente do tampão da Formulação IX pode ser adicionado e misturado para conduzir o anticorpo para a concentração alvo de 20 mg/mL (faixa 18 - 22 mg/mL).

As composições farmacêuticas podem então, ser filtradas através de filtros de grau esterilizante de 0,2 ja e enchidas em frascos. Um volume de enchimento nominal de 20 ml pode ser usado em frascos de vidro Tipo 1 de 20 mililitros. Os frascos foram tampados com rolhas revestidas de Fluor otecÍR> Daikyo 777-1 e vedados com vi rol a. Os frascos de vidro foram esterilizados, assim como as rolhas de soro Daikyo 777-1 de 20 mm.

Cada unidade de frasco conteria cerca de 400 mg/ do anti corpo anti-CTLA-4 ticilimumab, 65,4 mg de monocloridrato de L-histidina monoidratado 13,6 mg de L-Histidina, 2,006 mg de ácido etilenodiaminotetracéticodissódico de cálcio, 1680 mg de a,a-trehalose diidratada e 4 mg de polisorbato 80.

EXEMPLO 15

Este exemplo ilustra a produção esperada de uma composição farmacêutica liquida contendo anticorpo anti-CTLA-4 ticilimumab, monocloridrato de L-histidina monoidratado, ácido etilenodiaminotetracético trissódico, a,a-trehalose diidratada e polisorbato 80.

Uma composição farmacêutica liquida da presente invenção foi formada por obtenção dos seguintes componentes: anticorpo anti-CTLA-4 ticilimumab (disponível de linhagem de célula de hibridoma 11.2.1.4 depositada sob o Número de Acesso ATCC PTA-5169, de acordo com o Exemplo 1 ou preparada recombinantemente de uma linhagem de célula de mamífero de acordo com o Exemplo 2), monocloridrato de L-histidina monoidratado (disponível de Aj inomoto, Raleigh, NC) L-histidina (disponível de Ajinomoto, Raleigh, NC), ácido etilenodiaminotetracético trissódico (disponível de Sigma-Aldrich, st. Louis, MO), aa-trehalose diidratada (disponível como Número de Produto T-104-1-MC de Ferro Pfanstiehl, Waukegan IL) e polisorbato 80 (disponível como Crillet 4 HP, da Croda Inc. Mill Hall PA).

A composição farmacêutica liquida foi preparada, primeiramente, preparando-se várias soluções de estoque do anticorpo anti-CTLA-4 ticilimumab, monocloridrato de L-histidina monoidratado, ácido etilenodiaminotetracético trissódico, a,a-trehalose diidratada e polisorbato 80. Um tampão de histidina 20 mM pH 5,5 é preparado dissolvendo-se3,27 mg/mL (15,6 mM) de L-Histidina HC1 monoidratado e 0,68 mg/mL (4,4 mM) de L-histidina em água. Um tampão de Formulação IX é preparado, dissolvendo-se 3,27 mg/mL (15,6 mM) L-Histidina-HCl monoidratado e 0,68 mg/mL (4,4 mM) L-5 Histidina, 84 mg/mL (222 mM) a a-trehalose diidratada, 0,2 mg/mL de Polisorbato 80 e 0, 096 mg/mL (0, 268 mM) de ácido etilenodiaminotetracético trissódico em água. Um tampão de Formulação 2X é preparado dissolvendo-se 3,27 mg/mL (15,6 mM) de monocloridrato de L-histidina monoidratado e 0,68 mg/mL (4,4 mM) de L-Histidina, 168 mg/mL (4 44 mM) de a, a-trehalose diidratada, 0,4 mg/mL de polisorbato 80 e 0,192 mg/mL (0,536 mM) de ácido etilenodiaminotetracético trissódico em água. Uma solução de estoque do anticorpo anti-CTLA-4 ticilimumab é preparada de acordo com o Exemplo2 e concentrada entre 4 2 e 55 mg/mL ( o alvo é 45 mg/mL) no tampão de Histidina usando um processo de ultrafiltração realizado com uma membrana Tipo 50 kD (Biomax PES).

Para preparar a composição farmacêutica, volumes iguais da solução de estoque concentrada do anticorpo anti-CTLA-4 ticilimumab e do tampão de Formulação 2X são adicionados para um recipiente adequado para mistura intima das composições líquidas. Após misturar, um pequeno volume da solução pode ser removido e a concentração do anticorpo determinada por método de espectrometria de Ultravioleta-Visível (UV-Vis), usando um coeficiente de extinção de 1,43 (mg/mL)"1 cm"1 (faixa esperada 21 a 27,5 mg/mL, alvo 22,5 mg/mL). Finalmente, um volume calculado adequadamente do tampão da Formulação IX pode ser adicionado e misturadopara conduzir o anticorpo para a concentração alvo de 20 mg/mL (faixa 18 - 22 mg/mL).

As composições farmacêuticas são então, filtradas através de filtros de grau esterilizante de 0,2 p, e enchidas em frascos. Um volume de enchimento nominal de 20 mL foi usado em frascos de vidro Tipo 1 de 20 mililitros. Os frascos foram tampados com rolhas revestidas de Fluorotec(R> Daikyo 777-1 e vedados com virola. Os frascos de vidro foram esterilizados, assim como as rolhas de soro Daikyo 777-1 de 20 mm.

Cada unidade de frasco contém cerca de 400 mg/ do anticorpo anti-CTLA-4 ticilimumab, 65,4 mg de monocloridrato de L-histidina monoidratado 13,6 mg de L-Histidina, 1,92 mg de ácido etilenodiaminotetracético trissódico, 1680 mg de a,a-trehalose diidratada e 4 mg de polisorbato 80.LISTAGEM DE SEQÜÊNCIAS

<110> Pharmacia and Upjohn Company, LLC Das, Tapan Elliott, Carrie Muthurania, Kevin Abate, Justin Nema, Sandeep Singh, Satish

<120> "COMPOSIÇÕES DE ANTICORPO ANTI-CTLA-4"

<130> PC 33042

<150> 60/659.766 <151> 08-03-2005

<150> 60/728.165 <151> 19-10-2005

<150> 60/752.712 <151> 20-10-2005

<150> 60/762.456 <151> 26-01-2005

<160> 12

<170> Patentln versão 3.3

<210> 1

<211> 1413

<212> DNA

<213> Homo sapiens<400> 1

atggagtttg ggctgagctg ggttttcctc gtgcagctgg tggagtctgg gggaggcgtg tgtgcagcgt ctggattcac cttcagtagc ggcaaggggc tggagtgggt ggcagttata gactccgtga agggccgatt caccatctcc caaatgaaca gcctgagagc cgaggacacg ggagctaccc tttactacta ctactacggt accgtctcct cagcctccac caagggccca agcacctccg agagcacagc ggccctgggc gtgacggtgt cgtggaactc aggcgctctg ctacagtcct caggactcta ctccctcagc ggcacccaga cctacacctg caacgtagat acagttgagc gcaaatgttg tgtcgagtgc ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc gaggtcacgt gcgtggtggt ggacgtgagc tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc agcacgttcc gtgtggtcag cgtcctcacc gagtacaagt gcaaggtctc caacaaaggc aaaaccaaag ggcagccccg agaacCacag atgaccaaga accaggtcag cctgacctgc gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg ctggactccg acggctcctt cttcctctac cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg cagaagagcc tctccctgtc tccgggtaaa

gttgctcttt taagaggtgt ccagtgtcag 60 gtccagcctg ggaggtccct gagactctcc 120 tatggcatgc actgggtccg ccaggctcca 180 tggtatgatg gaagtaataa atactatgca 240 agagacaatt ccaagaacac gctgtatctg 300 gctgtgtatt actgtgcgag agatccgagg 360 atggacgtct ggggccaagg gaccacggtc 420 tcggtcttcc ccctggcgcc ctgctccagg 480 tgcctggtca aggactactt ccccgaaccg 540 accagcggcg tgcacacctt cccagctgtc 600 agcgtggtqa ccgtgccctc cagcaacttc 660 cacaagccca gcaacaccaa ggtggacaag 720 ccaccgtgcc cagcaccacc tgtggcagga 780 aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct 840 cacgaagacc ccgaggtcca gttcaactgg 900 aagacaaagc cacgggagga gcagttcaac 960 gttgtgcacc aggactggct gaacggcaag 1020 ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc 1080 gtgtacaccc tgcccccatc ccgggaggag 1140 ctggtcaaag gcttctaccc cagcgacatc 1200 gagaacaact acaagaccac acctcccatg 1260 agc^agctca ccgtggacaa gagcaggtgg 1320 atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg 1380 tga 1413

<210> 2 <211> 451 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 2

Gln Vai Gln Leu Vai Glu Ser Gly Gly Gly Vai Vai Gln Pro Gly Arg 15 10 15Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Gly Met His Trp Vai Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Vai

35 40 45

Ala Vai lie Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Vai

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asp Pro Arg Gly Ala Thr Leu Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met

100 105 110

Asp Vai Trp Gly Gln Gly Thr Thr Vai Thr Vai Ser Ser Ala Ser Thr

115 120 125

Lys Gly Pro ser Vai Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser

130 135 140

Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Vai Lys Asp Tyr Phe Pro Glu 145 150 155 160

Pro Vai Thr Vai Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Vai His

165 170 175

Thr Phe Pro Ala Vai Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser

180 185 190

Vai Vai Thr Vai Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr Tyr Thr Cys

195 200 205

Asn Vai Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Vai Asp Lys Thr Vai Glu

210 215 220

Arg Lys Cys Cys Vai Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Vai Ala 225 230 • 235 240

Gly Pro Ser Vai Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met

245 250 255

lie Ser Arg Thr Pro Glu Vai Thr Cys Vai Vai Vai Asp Vai Ser His

260 265 270

Glu Asp Pro Glu Vai Gln Phe Asn Trp Tyr Vai Asp Gly Vai Glu Vai 275 280 285His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe

290 295 300

Arg Vai Vai Ser Vai Leu Thr Vai Vai His Gln Asp Trp Leu Asn Gly 305 310 315 320

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Vai Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro lie

325 330 335

Glu Lys Thr lie Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Vai

340 345 350

Tyr Thr Leu Pro Pro ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Vai Ser

355 360 365

Leu Thr Cys Leu Vai Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp lie Ala Vai Glu

370 375 380

Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro 385 390 395 400

Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Vai

405 410 415

Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Vai Phe Ser Cys Ser Vai Met

420 425 430

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys ser Leu Ser Leu Ser

435 440 445

Pro Gly Lys 450

<210> 3

<211> 714

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 3

atggacatga gggtccccgc tcagctcctg gggctcctgc tactctggct ccgaggtgcc 60 agatgtgaca tccagatgac ccagtctcca tcctccctgt ctgcatctgt aggagacaga 120 gtcaccatca cttgccgggc aagtcagagc attaacagct atttagattg gtatcagcag 180 aaaccaggga aagcccctaa actcctgatc tatgctgcat ccagtttgca aagtggggtc 240 ccatcaaggt tcagtggcag tggatctggg acagatttca ctctcaccat cagcagtctg 300caacctgaag attttgcaac ttactactgt caacagtatt acagtactcc attcactttc 360

ggccctggga ccaaagtgga aatcaaacga actgtggctg caccatctgt cttcatcttc 420

ccgccatctg atgagcagtt gaaatctgga actgcctctg ttgtgtgcct gctgaataac 480

ttctatccca gagaggccaa agtacagtgg aaggtggata acgccctcca atcgggtaac 540

tcccaggaga gtgtcacaga gcaggacagc aaggacagca cctacagcct cagcagcacc 600

ctgacgctga gcaaagcaga ctacgagaaa cacaaagtct acgcctgcga agtcacccat 660

cagggcctga gctcgcccgt cacaaagagc ttcaacaggg gagagtgtta gtga 714

<210> 4 <211> 214 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 4

Asp lie Gln Met 1

Asp Arg Vai Thr 20

Leu Asp Trp Tyr 35

Tyr Ala Ala Ser 50

Ser Gly Ser Glíy 65

Glu Asp Phe Ala

Thr Phe Gly Pro 10'0

Pro Ser Vai Phe 115

Thr Ala Ser Vai 130

Lys Vai Gln Trp 145

Thr Gln Ser Pro 5

lie Thr Cys Arg

Gln Gln Lys Pro 40

Ser Leu Gln Ser 55

Thr Asp Phe Thr 70

Thr Tyr Tyr cys 85

Gly Thr Lys Vai

lie Phe Pro Pro 120

Vai Cys Leu Leu 135

Lys Vai Asp ASn 150

Ser Ser Leu Ser 10

Ala Ser Gln Ser 25

Gly Lys Ala Pro

Gly Vai Pro Ser 60

Leu Thr lie Ser 75

Gln Gln Tyr Tyr 90

Glu lie Lys Arg 105

Ser Asp Glu Gln

Asn Asn Phe Tyr 140

Ala Leu Gln Ser 155

Ala Ser Vai Gly 15

lie Asn Ser Tyr 30

Lys Leu Leu lie 45

Arg Phe ser Gly

Ser Leu Gln Pro 80

Ser Thr Pro Phe 95

Thr Vai Ala Ala 110

Leu Lys Ser Gly 125

Pro Arg Glu Ala

Gly Asn Ser Gln 160Glu Ser Vai Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp ser Thr Tyr Ser Leu Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Vai Tyr

180 185 190

Ala Cys Glu Vai Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Vai Thr Lys Ser

195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210

<210> 5 <211> 125 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 5

Gln Vai Gln Leu Vai Glu Ser Gly Gly Gly Vai Vai Gln Pro Gly Arg

15 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Gly Met His Trp Vai Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Vai

35 40 45

Ala Vai lie Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Vai

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Vai Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Asp Pro Arg Gly Ala Thr Leu Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met

100 105 110

Asp Vai Trp Gly Gln Gly Thr Thr Vai Thr Vai Ser Ser 115 120 125

<210> 6 <211> 107<212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 6

Asp lie Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Vai Gly

15 10 15

Asp Arg Vai Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser lie Asn Ser Tyr

20 25 30

Leu Asp Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu lie

35 40 45

Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Vai Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Ser Thr Pro Phe

85 90 95

Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Vai Glu lie Lys 100 105

<210> 7 <211> 10 <212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 7

Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Gly Met His 15 10

<210> 8 <211> 15 <212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 8Vai lie Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Vai 15 10 15

<210> 9 <211> 16 <212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 9

Asp Pro Arg Gly Ala Thr Leu Tyr Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Vai 15 10 15

<210> 10 <211> 11 <212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 10

Arg Ala Ser Gln Ser lie Asn Ser Tyr Leu Asp 15 10

<210> 11 <211> 7 <212> PRT

<213> Homo sapiens <400> 11

Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser 1 5

<210> 12 <211> 9 <212> PRT

<213> Homo sapiens<400> 12

Gln Gln Tyr Tyr Ser Thr Pro Phe Thr 1 5

Claims

1. Composição, CARACTERIZADA por compreender: pelo menos um agente quelante, epelo menos um anticorpo compreendendo: uma seqüência de aminoácido que é pelo menos 90% idêntica a uma seqüência de aminoácido de cadeia pesada mostrada em SEQ ID NO: 2, euma seqüência de aminoácido que é pelo menos 90% idêntica a uma seqüência de aminoácido de cadeia leve mos-trada em SEQ ID NO: 4,onde o anticorpo'liga-se a CTLA-4 humano.

2. Composição, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADA pela composição ser uma composição liquida, e ío anticorpo ser um anticorpo de IgG2 humana.

3. Composição, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADA pelo anticorpo compreender uma seqüência de aminoácido de cadeia pesada com pelo menos 99% de identidade de seqüência para SEQ ID NO: 2 e uma seqüência de aminoácido de cadeia leve com pelo menos 99% de identidade de seqüência para SEQ ID NO: 4.

4. Composição, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADA pelo anticorpo compreender uma seqüência de aminoácido de cadeia pesada que compreende a região variável de SEQ ID NO: 2 e uma seqüência de aminoácido de cadeia leve que compreende a região variável SEQ ID NO: 4.

5. Composição, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADA pelo anticorpo compreender um anticorpo mono-clonal anti-CTLA-4 de IgG2 tendo as seqüências de aminoácidopesada e leve de ticilimumab.

6. Composição, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADA pela composição compreender EDTA.

7. Composição, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADA pela composição compreender:um agente quelante e um tampão.

8. Composição, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADA pela composição compreender:EDTA e histidina.

9. Composição, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADA pela composição compreender:um agente quelante., um tampão e um tensoativo.

10. Composição, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADA pela composição compreender:um agente quelante, um tampão, um tensoativo, e um agente de tonicidade.

11. Composição, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADA pela composição compreender:EDTA, um tampão, um tensoativo, e um agente de tonicidade.

12. Composição, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADA pela composição compreender:EDTA, histidina, um tensoativo, e um agente de tonicidade .

13. Composição, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADA pela composição compreender:EDTA, histidina, polisorbato 80, e um agente de tonicidade.

14. Composição, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADA pela composição compreender:EDTA, histidina polisorbato 80 e trehalose.

15. Composição/ de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADA pela composição compreender:de cerca de 1 mg/mL a cerca de 200 mg/mL do anticorpo,de cerca de 0,01 milimolar a cerca de 5,0 milimolar de um agente que1ante; e de cerca de 1 mM a cerca de 100 mM de histidina.

16. Composição, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADA pela composição compreender:de cerca de 1 mg/mL a cerca de 200 mg/mL do anti-corpo;de cerca de 0,01 milimolar a cerca de 5,0 milimolar de EDTA; ede cerca de 1 mM a cerca de 10 0 mM de histidina.

17. Composição, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADA pela composição compreender:de cerca de 1 mg/mL a cerca de 100 mg/mL do anti-corpo;de cerca de 0,01 milimolar a cerca de 5,0 milimolar de EDTA;de cerca de 1 mM a cerca de 100 mM de histidina; de cerca de 0,01 mg/mL a cerca de 10 mg/mL de polisorbato 80; ede cerca de 100 milimolar a cerca de 300 milimolar de um agente de tonicidade.

18. Composição, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADA pela composição compreender:de cerca de 0,1 mg/mL a cerca de 100 mg/mL do anticorpo ;de cerca de 0,001 mg/mL a cerca de 1,0 mg/mL de EDTA ;de cerca de 1 mM a cerca de 50 mM de histidina; de cerca de 0,01 mg/mL a cerca de 5 mg/mL de poli-sorbato 80; ede cerca de 10 mg/mL a cerca, de 200 mg/mL de tre-halose.

19. Composição, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADA pela composição compreender:cerca de 20 mg/mL do anticorpo; cerca de 0,27 mM de EDTA;cerca de 20 mM de histidina;cerca de 0,2 mg/mL de polisorbato 80; ecerca de 222 mM de trehalose.

20. Composição, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADA pela composição compreender:cerca de 20 mg/mL do anticorpo; cerca de 0,1 mg/mL de EDTA; cerca de 20 mM de histidina; cerca de 0,2mg/mL de polisorbato 80; e cerca de 84 mg/mL de trehalose.

21. Composição estável, CARACTERIZADA por compreender pelo menos um anticorpo monoclonal anti-CTLA-4 e um agente quelante onde após a composição ser armazenada duran-te um período de cerca de 24 semanas a uma temperatura de cerca de 40 °C, a redução entre uma área de pico de cromato-grama e agregado para a composição farmacêutica liquida estável compreendendo anticorpos monoclonais anti-CTLA-4 e o agente que1ante, e uma área de pico de cromatograma do agregado para uma composição de outro modo idêntica, carecendo do agente que 1 ante que é armazenada por um per iodo de cerca de 24 semanas a uma temperatura de cerca de 40 °C é de pelo menos cerca de 2%.

22. Processo para preparar uma composição farmacêutica liquida, CARACTERIZADO por compreender a mistura de pelo menos um anticorpo anti-CTLA-4 com as seqüências de aminoácido de cadeia leve e pesada de ticilimumab em solução, com pelo menos um agente quelante.

23. Método para o tratamento de uma condição neo-plásica num indivíduo, CARACTERIZADO por compreender a administração ao indivíduo de uma composição farmacêutica liquida compreendendo:a) uma quantidade terapeuticamente eficaz de pelo menos um anticorpo anti-CTLA-4 com as seqüências de aminoá-cido de cadeia pesada e leve de ticillimumab; eb) um agente quelante farmaceuticamente aceitável.

24. Composição farmacêutica liquida, CARACTERIZADA por compreender anticorpos anti-CTLA-4 e um agente quelante farmaceuticamente aceitável, onde a concentração molar dos anticorpos varia de cerca de 0,0006 milimolar a cerca de 1,35 milimolar e a concentração molar do agente quelante va-ria de cerca de O,003 milimolar a cerca de 50 milimolar, onde a relação molar dos anticorpos para agente quelante varia de cerca de 0,00001 a cerca de 450.

25. Composição farmacêutica liquida, CARACTERIZADA por compreender:pelo menos um anticorpo compreendendo uma seqüência de aminoácido que é pelo menos 95% idêntica a uma seqüência de aminoácido de cadeia pesada mostrada em SEQ ID NO: 2, e compreendendo ainda uma seqüência de aminoácido que é pelo menos 95% idêntica a uma seqüência de aminoácido de cadeia leve mostrada em SEQ ID NO: 4, onde o anticorpo se liga a um CTLA-4 humano;e um excipiente farmaceuticamente aceitável, onde a composição contém uma concentração do anticorpo que é de pelo menos cerca de 10 mg/mL.