MX2007010971A

MX2007010971A - Composiciones de anticuerpo anti-citla-4.

Info

Publication number: MX2007010971A
Application number: MX2007010971A
Authority: MX
Inventors: Tapan Kanti Das; Sandeep Nema; Satish Kumar Singh; Justin Donald Abate; Carrie Marie Elliott; Kevin Wamiti Muthurania
Original assignee: Pharmacia & Upjohn Co Llc
Priority date: 2005-03-08
Filing date: 2006-03-02
Publication date: 2007-09-19
Also published as: US9487581B2; CY1121254T1; HUS2300026I1; WO2006096491A2; BRPI0608815A2; AR053026A1; TW200700081A; BRPI0608815A8; HUE028410T2; JP2006249083A; DK1865986T3; WO2006096491A9; CA2600434A1; KR20070100922A; JP6212509B2; WO2006096461A2; EP1868646A2; WO2006096490A3; ES2569409T3; LT2620450T

Abstract

La presente invencion provee composiciones novedosas de anticuerpos anti-CTLA-4 que comprenden un agente quelante; tambien se provee un metodo de tratamiento de enfermedades y condiciones con las composiciones novedosas de anticuerpos de CTLA-4, que incluyen varias condiciones de neoplasia.

Description

COMPOSICIONES DE ANTICUERPO ANTI-CTLA-4 INTERREFERENCIA CON PATENTES Y SOLICITUDES DE PATENTE RELACIONADAS Esta solicitud reclama el beneficio de la solicitud provisional de patente de EE UU No de sene 60/659,766, presentada el 8 de marzo de 2005, la solicitud provisional de patente de EE UU No de sene 60/728,165, presentada el 19 de octubre de 2005, la solicitud provisional de patente de EE uu No de sene 60/752,712, presentada el 20 de diciembre de 2005, y la solicitud provisional de patente de EE UU No de serie 60/762,456, presentada el 26 de enero de 2006, que se incorporan aquí como referencia en su totalidad ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN El antígeno 4 de linfocito T citotoxico ("CTLA-4") es un miembro de la superfamilia de proteínas de inmunoglobuhna ("Ig") El CTLA-4 actúa para regular negativamente la activación de las células T y mantener la homeostasis inmunológica Se ha mostrado en modelos de animal que el bloqueo de CTLA-4 (por ejemplo usando anticuerpos de CTLA-4) mejora la eficacia de la mmunoterapia del cáncer Se han descrito en la literatura anticuerpos que se unen a CTLA- 4 e inhiben su actividad. Por ejemplo, la patente de EE. UU. No. 6,682,736, de Pfizer, Inc. y Abgenix, Inc., describe varios anticuerpos monoclonales humanos para CTLA-4, que incluyen un anticuerpo de CTLA-4 que tiene las secuencias de aminoácidos de la cadena pesada o ligera del anticuerpo 1 1.2.1 , conocido ahora como ticilimumab ™. Una línea de células de hibridoma que produce el anticuerpo 11.2.1 fue depositada con el No. de Registro de ATCC PTA-5169. La patente de EE. UU. No. 5,977,318, de Bristol-Myers Squibb Company, describe otro anticuerpo monoclonal, que reconoce y se une al dominio extracelular de CTLA-4, impidiendo así la unión de CTLA-4 ai antíyeno B7. La solicitud publicada de EE. uU. No. 20050201994, de Medarex, Inc., describe varios anticuerpos de secuencia humana para CTLA-4 que incluyen uno referido ahora como ipílimumab™. Un modo de administración posible de dichos anticuerpos de CTLA-4 es la administración parenteral. Por ejemplo, la patente de EE. UU. No. 6,682,736, describe una formulación intravenosa de anticuerpo anti-CTLA-4 que es una solución líquida estéril que contiene anticuerpos anti-CTLA-4, acetato de sodio 20 mM, polisorbato 80 0.2 mg/ml, y cloruro de sodio 140 mM, a pH 5.5. Igual que otras formulaciones de proteína, las formulaciones de anticuerpo de CTLA-4 presentan los mismos problemas respecto a la degradación química y física del anticuerpo en la formulación con el paso del tiempo. En general, las formulaciones de anticuerpo de CTLA-4 deben exhibir una estabilidad química y física aceptable bajo la escala de condiciones esperadas de uso y almacenamiento; es decir, la formulación de anticuerpo de CTLA-4 debe tener una vida de anaquel adecuada permaneciendo biológicamente activa. Dados el tiempo y los recursos necesarios para producir un producto de anticuerpo CTLA-4, son deseables las formulaciones que reducen la pérdida de producto. Por consiguiente, la presente solicitud describe formulaciones de anticuerpo CTLA-4 novedosas que exhiben una estabilidad química y física mejorada con respecto a las formulaciones de anticuerpo CTLA-4 descritas anteriormente en la literatura.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN En un aspecto, la presente invención provee una composición farmacéutica líquida que comprende por lo menos un anticuerpo que comprende una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 95% idéntica a una secuencia de aminoácidos de cadena pesada que se muestra en la SEQ ID NO: 2, y que además comprende una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 95% idéntica a una secuencia de aminoácidos de cadena ligera que se muestra en la SEQ ID NO: 4, en donde el anticuerpo se une al CTLA-4 humano; y un agente quelante. La presente invención también provee una composición que comprende por lo menos un anticuerpo, que comprende una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 90% idéntica a una secuencia de aminoácidos de cadena pesada que se muestra en la SEQ ID NO: 2, y que además comprende una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 90% idéntica a una secuencia de aminoácidos de cadena ligera que se muestra en la SEQ ID NO: 4, en donde el anticuerpo se une al CTLA-4 humano; y un agente quelante; en donde el anticuerpo es un anticuerpo lgG2. La presente invención también provee una composición que comprende por lo menos un anticuerpo, que comprende una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 90% idéntica a una secuencia de aminoácidos de cadena pesada que se muestra en la SEQ ID NO: 2, y que además comprende una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 90% idéntica a una secuencia de aminoácidos de cadena ligera que se muestra en la SEQ ID NO: 4, en donde el anticuerpo se une al CTLA-4 humano; y un agente quelante; en donde el anticuerpo es un anticuerpo humano. La presente invención también provee una composición que comprende por lo menos un anticuerpo, que comprende una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 90% idéntica a una secuencia de aminoácidos de cadena pesada que se muestra en la SEQ ID NO: 2, y que además comprende una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 90% idéntica a una secuencia de aminoácidos de cadena ligera que se muestra en la SEQ ID NO: 4, en donde el anticuerpo se une al CTLA-4 humano; y un agente quelante; en donde el anticuerpo comprende una secuencia de aminoácidos de VH que utiliza un gen de línea germinal VH 3-33 humano. La presente invención también provee una composición que comprende por lo menos un anticuerpo, que comprende una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 90% idéntica a una secuencia de aminoácidos de cadena pesada que se muestra en la SEQ ID NO 2, y que además comprende una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 90% idéntica a una secuencia de aminoácidos de cadena ligera que se muestra en 5 la SEQ ID NO 4, en donde el anticuerpo se une al CTLA-4 humano, y un agente quelante, en donde el anticuerpo tiene una secuencia de aminoácidos de V que comprende secuencias de FR1 , FR2 y FR3 humanos que utilizan una familia de genes VH 3-33 humanos enlazados operativamente en marco con una secuencia de CDR1 , CDR2 y CDR3 1 I ^ ^ ^^ ^ ? «»-« . „ . ,„ „ „. A ^ t^ „^ . A „ , . — „ ,-.„ „, _. „ „ . „, A .~ „ , . « ? ? -a µi sospis n i vci ?<_.?u? i ?a? nuisi i µi uvcc ui la ui i ?µuo??_<?u? i ue comprende por lo menos un anticuerpo, que comprende una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 90% idéntica a una secuencia de aminoácidos de cadena pesada que se muestra en la SEQ ID NO 2, y que además comprende una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 90% 15 idéntica a una secuencia de aminoácidos de cadena ligera que se muestra en la SEQ ID NO 4, en donde el anticuerpo se une al CTLA-4 humano, y un agente quelante, en donde el anticuerpo es un anticuerpo aislado La presente invención también provee una composición que comprende por lo menos un anticuerpo, que comprende una secuencia de 0 aminoácidos que es por lo menos 90% idéntica a una secuencia de aminoácidos de cadena pesada que se muestra en la SEQ ID NO' 2, y que además comprende una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 90% idéntica a una secuencia de aminoácidos de cadena ligera que se muestra en la SEQ ID NO 4, en donde el anticuerpo se une al CTLA-4 humano, y un agente quelante, en donde el anticuerpo es un anticuerpo recombinante La presente invención también provee una composición que comprende por lo menos un anticuerpo, que comprende una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 90% idéntica a una secuencia de aminoácidos de cadena pesada que se muestra en la SEQ ID NO 2, y que ademas comprende una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 90% idéntica a una secuencia de aminoácidos de cadena ligera que se muestra en la SEQ ID NO 4, en donde el anticuerpo se une al CTLA-4 humano, y un agente quelante, en donde el anticuerpo se une específicamente a un epítope conformacional en el pohpeptido CTLA-4 humano La presente invención también provee una composición que comprende por lo menos un anticuerpo, que comprende una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 90% idéntica a una secuencia de aminoácidos de cadena pesada que se muestra en la SEQ ID NO 2, y que además comprende una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 90% idéntica a una secuencia de aminoácidos de cadena ligera que se muestra en la SEQ ID NO 4, en donde el anticuerpo se une al CTLA-4 humano, y un agente quelante, en donde el anticuerpo comprende una secuencia de aminoácidos de cadena pesada que tiene por lo menos 95% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO 2, y una secuencia de aminoácidos de cadena ligera que tiene por lo menos 95% de identidad de secuencia con la SEQ ID La presente invención también provee una composición que comprende por lo menos un anticuerpo, que comprende una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 90% idéntica a una secuencia de aminoácidos de cadena pesada que se muestra en la SEQ ID NO: 2, y que además comprende una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 90% idéntica a una secuencia de aminoácidos de cadena ligera que se muestra en la SEQ ID NO: 4, en donde el anticuerpo se une al CTLA-4 humano; y un agente quelante; en donde el anticuerpo comprende una secuencia de aminoácidos de cadena pesada que tiene por lo menos 99% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 2, y una secuencia de aminoácidos de cadena ligera que tiene por lo menos 99% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 4. La presente invención también provee una composición que comprende por lo menos un anticuerpo, que comprende una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 90% idéntica a una secuencia de aminoácidos de cadena pesada que se muestra en la SEQ ID NO: 2, y que además comprende una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 90% idéntica a una secuencia de aminoácidos de cadena ligera que se muestra en la SEQ ID NO: 4, en donde el anticuerpo se une al CTLA-4 humano; y un agente quelante; en donde el anticuerpo comprende una secuencia de aminoácidos de cadena pesada que comprende la región variable de la SEQ ID NO: 2, y una secuencia de aminoácidos de cadena ligera que comprende la región variable de la SEQ ID NO: 4.

La presente invención también provee una composición que comprende por lo menos un anticuerpo, que comprende una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 90% idéntica a una secuencia de aminoácidos de cadena pesada que se muestra en la SEQ ID NO 2, y que además comprende una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 90% idéntica a una secuencia de aminoácidos de cadena ligera que se muestra en la SEQ ID NO 4, en donde el anticuerpo se une al CTLA-4 humano, y un agente quelante, en donde el anticuerpo comprende una secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena pesada que comprende la LM n-< uc id i cyiui l Vdl IdUlc Ut; Id cadena ligera que comprende la SEQ ID NO 6 La presente invención también provee una composición que comprende por lo menos un anticuerpo, que comprende una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 90% idéntica a una secuencia de aminoácidos de cadena pesada que se muestra en la SEQ ID NO 2, y que ademas comprende una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 90% idéntica a una secuencia de aminoácidos de cadena ligera que se muestra en la SEQ ID NO 4, en donde el anticuerpo se une al CTLA-4 humano, y un agente quelante, en donde el anticuerpo comprende una secuencia de aminoácidos de cadena pesada que comprende la SEQ ID NO 2 y una secuencia de aminoácidos de cadena ligera que comprende la SEQ ID NO 4 La presente invención también provee una composición que comprende por lo menos un anticuerpo, que comprende una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 90% idéntica a una secuencia de aminoácidos de cadena pesada que se muestra en la SEQ ID NO: 2, y que además comprende una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 90% idéntica a una secuencia de aminoácidos de cadena ligera que se muestra en 5 la SEQ ID NO: 4, en donde el anticuerpo se une al CTLA-4 humano; y un agente quelante, en donde no está presente la lisina C-terminal de la cadena pesada del anticuerpo. La presente invención también provee una composición que comprende por lo menos un anticuerpo, que comprende una secuencia de i ? aminoácidos que es por lo menos 90% idéntica a una secuencia de aminoácidos de cadena pesada que se muestra en la SEQ ID NO: 2, y que además comprende una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 90% idéntica a una secuencia de aminoácidos de cadena ligera que se muestra en la SEQ ID NO: 4, en donde el anticuerpo se une al CTLA-4 humano; y un 15 agente quelante; en donde el anticuerpo comprende un anticuerpo monoclonal de lgG2 anti-CTLA-4 que tiene las secuencias de aminoácidos de la cadena pesada y ligera del anticuerpo 1 1 .2.1 . La presente invención también provee una composición que comprende por lo menos un anticuerpo, que comprende una secuencia de 20 aminoácidos que es por lo menos 90% idéntica a una secuencia de aminoácidos de cadena pesada que se muestra en la SEQ ID NO: 2, y que además comprende una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 90% idéntica a una secuencia de aminoácidos de cadena ligera que se muestra en la SEQ ID NO: 4, en donde el anticuerpo se une al CTLA-4 humano; y un agente quelante; en donde el anticuerpo tiene las mismas secuencias de aminoácidos de cadena pesada y ligera que el anticuerpo producido por la línea de células de hibridoma 11.2.1.4 depositada en la ATCC con el No. de 5 Registro PTA-5169. La presente invención también provee una composición que comprende por lo menos un anticuerpo, que comprende una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 90% idéntica a una secuencia de aminoácidos de cadena pesada que se muestra en la SEQ ID NO: 2, y que i ? además comprende una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 90% idéntica a una secuencia de aminoácidos de cadena ligera que se muestra en la SEQ ID NO: 4, en donde el anticuerpo se une al CTLA-4 humano; y un agente quelante; en donde el anticuerpo es ticilimumab. La presente invención también provee una composición que 15 comprende por lo menos un anticuerpo, que comprende una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 90% idéntica a una secuencia de aminoácidos de cadena pesada que se muestra en la SEQ ID NO: 2, y que además comprende una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 90% idéntica a una secuencia de aminoácidos de cadena ligera que se muestra en 0 la SEQ ID NO: 4, en donde el anticuerpo se une al CTLA-4 humano; y un agente quelante, en donde el agente quelante se selecciona del grupo que consiste en ácidos aminopolicarboxílicos, ácidos hidroxiaminocarboxílicos, sales y derivados de EDTA, glicinas N-sustituidas, derivados de deferoxamina, y mezclas de los mismos. La presente invención también provee una composición que comprende por lo menos un anticuerpo, que comprende una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 90% idéntica a una secuencia de aminoácidos de cadena pesada que se muestra en la SEQ ID NO: 2, y que además comprende una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 90% idéntica a una secuencia de aminoácidos de cadena ligera que se muestra en la SEQ ID NO: 4, en donde el anticuerpo se une al CTLA-4 humano; y un agente quelante, en donde el agente quelante se selecciona del grupo que consiste en acido etilendiamipotetraacetico, acido d¡eíiiepípam¡po?entadCéíico 5, ácido nitrilotriacético, ácido N-2-acetamido-2-iminodiacético, éter bis(aminoetil)glicólico, ácido N,N,N',N'-tetraacético, ácido trans-diaminociclohexanotetraacético, ácido glutámico, ácido aspártico, ácido N-hidroxietiliminodiacético, N,N-bis-hidroxiet¡lglicina, N-(tríshidroximetilmetil)-10-glicina, glicilglicina, ácido 2-(2-amino-2-oxoctil)aminoetanosulfónico, deferoxamina, mesilato de deferoxamina, edetato de dipotasio, edetato de disodío, edetato de disodio de calcio, edetato de sodio, edetato de trisodio, edetato de potasio, ácido cítrico, citrato de sodio, ácido cítrico anhidro, citrato de trisodio dihidratado, niacinamida, desoxicolato de sodio, y mezclas de los mismos. La presente invención también provee una composición que comprende por lo menos un anticuerpo, que comprende una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 90% idéntica a una secuencia de aminoácidos de cadena pesada que se muestra en la SEQ ID NO: 2, y que además comprende una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 90% idéntica a una secuencia de aminoácidos de cadena ligera que se muestra en la SEQ ID NO: 4, en donde el anticuerpo se une al CTLA-4 humano, y un agente quelante, en donde el agente quelante es EDTA. La presente invención también provee una composición que comprende por lo menos un anticuerpo, que comprende una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 90% idéntica a una secuencia de aminoácidos de cadena pesada que se muestra en la SEQ ID NO: 2, y que además comprende una secuencia de aminoácidos que es por io menos 90% idéntica a una secuencia de aminoácidos de cadena ligera que se muestra en la SEQ ID NO: 4, en donde el anticuerpo se une al CTLA-4 humano; y un agente quelante; comprendiendo, además, un amortiguador. La presente invención también provee una composición que comprende por lo menos un anticuerpo, que comprende una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 90% idéntica a una secuencia de aminoácidos de cadena pesada que se muestra en la SEQ ID NO: 2, y que además comprende una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 90% idéntica a una secuencia de aminoácidos de cadena ligera que se muestra en la SEQ ID NO: 4, en donde el anticuerpo se une al CTLA-4 humano; y un agente quelante; comprendiendo, además, un amortiguador, en donde el amortiguador se selecciona del grupo que consiste en acetato, succinato, gluconato, citrato, histidina, ácido acético, fosfato, ácido fosfórico, ascorbato, ácido tartárico, ácido maleico, glicina, lactato, ácido láctico, ácido ascórbico, imidazol, bicarbonato y ácido carbónico, ácido succínico, benzoato de sodio, ácido benzoico, gluconato, edetato, acetato, malato, ¡midazol, tris, fosfato, y mezclas de los mismos. La presente invención también provee una composición que comprende por lo menos un anticuerpo, que comprende una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 90% idéntica a una secuencia de aminoácidos de cadena pesada que se muestra en la SEQ ID NO: 2, y que además comprende una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 90% idéntica a una secuencia de aminoácidos de cadena ligera que se muestra en la SEQ ID NO: 4, en donde el anticuerpo se une al CTLA-4 humano; y un agente quelante; comprendiendo, además, un amortiguador, e donde el amortiguador comprende histidina. La presente invención también provee una composición que comprende por lo menos un anticuerpo, que comprende una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 90% idéntica a una secuencia de aminoácidos de cadena pesada que se muestra en la SEQ ID NO: 2, y que además comprende una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 90% idéntica a una secuencia de aminoácidos de cadena ligera que se muestra en la SEQ ID NO: 4, en donde el anticuerpo se une al CTLA-4 humano; y un agente quelante; comprendiendo, además, histidina, en donde la histidina comprende L-histidina o D-histidina. La presente invención también provee una composición que comprende por lo menos un anticuerpo, que comprende una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 90% idéntica a una secuencia de aminoácidos de cadena pesada que se muestra en la SEQ ID NO: 2, y que además comprende una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 90% idéntica a una secuencia de aminoácidos de cadena ligera que se muestra en la SEQ ID NO: 4, en donde el anticuerpo se une al CTLA-4 humano; y un agente quelante; comprendiendo, además, histidina, en donde la histidina comprende L-histidina. La presente invención también provee una composición que comprende por lo menos un anticuerpo, que comprende una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 90% idéntica a una secuencia de aminoácidos de cadena pesada que se muestra en la SEQ ID NO: 2, y que además comprende una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 90% idéntica a una secuencia de aminoácidos de cadena ligera que se muestra en la SEQ ID NO: 4, en donde el anticuerpo se une al CTLA-4 humano; y un agente quelante, en donde la composición contiene una concentración de anticuerpos que varía de aproximadamente 0.1 mg/ml a aproximadamente 200 mg/ml. La presente invención también provee una composición que comprende por lo menos un anticuerpo, que comprende una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 90% idéntica a una secuencia de aminoácidos de cadena pesada que se muestra en la SEQ ID NO: 2, y que además comprende una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 90% idéntica a una secuencia de aminoácidos de cadena ligera que se muestra en la SEQ ID NO: 4, en donde el anticuerpo se une al CTLA-4 humano; y un agente quelante, en donde la composición contiene una concentración de anticuerpos de aproximadamente 20 mg/ml. La presente invención también provee una composición que comprende por lo menos un anticuerpo, que comprende una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 90% idéntica a una secuencia de aminoácidos de cadena pesada que se muestra en la SEQ ID NO: 2, y que además comprende una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 90% idéntica a una secuencia de aminoácidos de cadena ligera que se muestra en la SEQ ID NO: 4, en donde el anticuerpo se une al CTLA-4 humano; y un agente quelante; en donde la composición también comprende por lo menos un excipiente seleccionado del grupo que consiste en agentes de tonicidad, agentes tensioactivos, y amortiguadores. La presente invención también provee una composición que comprende por lo menos un anticuerpo, que comprende una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 90% idéntica a una secuencia de aminoácidos de cadena pesada que se muestra en la SEQ ID NO: 2, y que además comprende una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 90% idéntica a una secuencia de aminoácidos de cadena ligera que se muestra en la SEQ ID NO: 4, en donde el anticuerpo se une al CTLA-4 humano; y un agente quelante, en donde la composición también comprende por lo menos dos excipientes seleccionados del grupo que consiste en agentes de tonicidad, agentes tensioactivos, y amortiguadores. La presente invención también provee una composición que comprende por lo menos un anticuerpo, que comprende una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 90% idéntica a una secuencia de aminoácidos de cadena pesada que se muestra en la SEQ ID NO: 2, y que además comprende una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 90% idéntica a una secuencia de aminoácidos de cadena ligera que se muestra en la SEQ ID NO: 4, en donde el anticuerpo se une al CTLA-4 humano; y un agente quelante, en donde la composición también comprende un agente de tonicidad, un agente íensioactivo y un amortiguador. La presente invención también provee una composición que comprende por lo menos un anticuerpo, que comprende una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 90% idéntica a una secuencia de aminoácidos de cadena pesada que se muestra en la SEQ ID NO: 2, y que además comprende una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 90% idéntica a una secuencia de aminoácidos de cadena ligera que se muestra en la SEQ ID NO: 4, en donde el anticuerpo se une al CTLA-4 humano; y un agente quelante, en donde la composición también comprende un agente de tonicidad, un antioxidante, un agente tensioactivo y un amortiguador. La presente invención también provee una composición que comprende por lo menos un anticuerpo, que comprende una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 90% idéntica a una secuencia de aminoácidos de cadena pesada que se muestra en la SEQ ID NO: 2, y que ademas comprende una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 90% idéntica a una secuencia de aminoácidos de cadena ligera que se muestra en la SEQ ID NO 4, en donde el anticuerpo se une al CTLA-4 humano, y un agente quelante, en donde la composición también comprende por lo menos un excipiente seleccionado del grupo que consiste en agentes de tonicidad, agentes tensioactivos y amortiguadores, en donde el agente de tonicidad comprende un sacárido La presente invención también provee una composición que comprende por lo menos un anticuerpo, que comprende una secuencia de aminoácidos que es por io menos 90% idéntica a una secuencia de aminoácidos de cadena pesada que se muestra en la SEQ ID NO 2, y que además comprende una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 90% idéntica a una secuencia de aminoácidos de cadena ligera que se muestra en la SEQ ID NO 4, en donde el anticuerpo se une al CTLA-4 humano, y un agente quelante, en donde la composición también comprende por lo menos un excipiente seleccionado del grupo que consiste en agentes de tonicidad, agentes tensioactivos y amortiguadores, en donde el agente de tonicidad comprende por lo menos un excipiente que se selecciona del grupo que consiste en fructosa, glucosa, mañosa, sorbosa, xilosa, lactosa, maltosa, sacarosa, dextrano, pululan, dextrina, ciclodextnnas, almidón soluble, hidroxietil almidón, glucanos solubles en agua, y mezclas de los mismos La presente invención también provee una composición que comprende por lo menos un anticuerpo, que comprende una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 90% idéntica a una secuencia de aminoácidos de cadena pesada que se muestra en la SEQ ID NO: 2, y que además comprende una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 90% idéntica a una secuencia de aminoácidos de cadena ligera que se muestra en la SEQ ID NO: 4, en donde el anticuerpo se une al CTLA-4 humano; y un agente quelante, en donde la composición también comprende por lo menos un excipiente seleccionado del grupo que consiste en agentes de tonicidad, agentes tensioactivos y amortiguadores, en donde el agente de tonicidad comprende un poliol. La presente invención también provee una composición que comprende por lo menos un anticuerpo, que comprende una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 90% idéntica a una secuencia de aminoácidos de cadena pesada que se muestra en la SEQ ID NO: 2, y que además comprende una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 90% idéntica a una secuencia de aminoácidos de cadena ligera que se muestra en la SEQ ID NO: 4, en donde el anticuerpo se une al CTLA-4 humano; y un agente quelante, en donde la composición también comprende por lo menos un excipiente seleccionado del grupo que consiste en agentes de tonicidad, agentes tensioactivos y amortiguadores, en donde el poliol se selecciona del grupo que consiste en manitol, trehalosa, sorbitol, eritritol, isomalta, lactitol, maltitol, xilitol, glicerol, lactitol, propilenglicol, polietilenglicol, inositol, y mezclas de los mismos. La presente invención también provee una composición que comprende por lo menos un anticuerpo, que comprende una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 90% idéntica a una secuencia de aminoácidos de cadena pesada que se muestra en la SEQ ID NO: 2, y que además comprende una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 90% idéntica a una secuencia de aminoácidos de cadena ligera que se muestra en la SEQ ID NO: 4, en donde el anticuerpo se une al CTLA-4 humano; y un agente quelante, en donde la composición también comprende por lo menos un excipiente seleccionado del grupo que consiste en agentes de tonicidad, agentes tensioactivos y amortiguadores, en donde el agente de tonicidad comprende un azúcar no reductor. La presente invención también provee una composición que comprende por lo menos un anticuerpo, que comprende una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 90% idéntica a una secuencia de aminoácidos de cadena pesada que se muestra en la SEQ ID NO: 2, y que además comprende una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 90% idéntica a una secuencia de aminoácidos de cadena ligera que se muestra en la SEQ ID NO: 4, en donde el anticuerpo se une al CTLA-4 humano; y un agente quelante, en donde la composición también comprende por lo menos un excipiente seleccionado del grupo que consiste en agentes de tonicidad, agentes tensioactivos y amortiguadores, en donde el agente de tonicidad comprende un azúcar no reductor, en donde el azúcar no reductor comprende por lo menos un excipiente que se selecciona del grupo que consiste en sacarosa, trehalosa y mezclas de las mismas.

La presente invención también provee una composición que comprende por lo menos un anticuerpo, que comprende una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 90% idéntica a una secuencia de aminoácidos de cadena pesada que se muestra en la SEQ ID NO 2, y que además comprende una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 90% idéntica a una secuencia de aminoácidos de cadena ligera que se muestra en la SEQ ID NO 4, en donde el anticuerpo se une al CTLA-4 humano, y un agente quelante, en donde la composición también comprende por lo menos un excipiente seleccionado del grupo que consiste en agentes de tonicidad, agentes tensioactivos y amortiguadores, en donde el agente de tonicidad comprende un azúcar no reductor, en donde el azúcar no reductor es la trehalosa La presente invención también provee una composición que comprende por lo menos un anticuerpo, que comprende una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 90% idéntica a una secuencia de aminoácidos de cadena pesada que se muestra en la SEQ ID NO 2, y que ademas comprende una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 90% idéntica a una secuencia de aminoácidos de cadena ligera que se muestra en la SEQ ID NO 4, en donde el anticuerpo se une al CTLA-4 humano, y un agente quelante, en donde la composición también comprende por lo menos un excipiente seleccionado del grupo que consiste en agentes de tonicidad, agentes tensioactivos y amortiguadores, en donde el agente tensioactivo se selecciona del grupo que consiste en po sorbatos, poloxámeros, tritones, dodecilsulfato de sodio, lauplsulfato de sodio, octilghcósido de sodio, lauril-sulfobetaina, minstil-sulfobetaina, hnoleil-sulfobetama, esteanl-sulfobetaina, launl-sarcosina, minstil-sarcosina, hnoleil-sarcosina, esteanl-sarcosina, noleil-betaina, mipstil-betaína, cetil-betaína, lauroamidopropil-betaína, cocamidopropil-betama, linoleamidopropil-betaína, minstamidopropil-betaína, palmidopropil-betaina, isostearamidopropil-betaína, minstamidopropil-dimetilamina, palmidopropil-dimetilamina, isostearamidopropil-dimetilamina, metilcocoil-taurato de sodio, metil-oleil-taurato de disodio, cloruro de dihidroxipropil PEG 5 linolamonio, polietilenglicol, polipropileng col, y mezclas de ios mismos La presente invención también provee una composición que comprende por lo menos un anticuerpo, que comprende una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 90% idéntica a una secuencia de aminoácidos de cadena pesada que se muestra en la SEQ ID NO 2, y que además comprende una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 90% idéntica a una secuencia de aminoácidos de cadena ligera que se muestra en la SEQ ID NO 4, en donde el anticuerpo se une al CTLA-4 humano, y un agente quelante, en donde la composición también comprende por lo menos un excipiente seleccionado del grupo que consiste en agentes de tonicidad, agentes tensioactivos y amortiguadores, en donde el agente tensioactivo se selecciona del grupo que consiste en polisorbato 20, polisorbato 21 , polisorbato 40, polisorbato 60, polisorbato 61 , polisorbato 65, polisorbato 80, polisorbato 81 , po sorbato 85, y mezclas de los mismos La presente invención también provee una composición que comprende por lo menos un anticuerpo, que comprende una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 90% idéntica a una secuencia de aminoácidos de cadena pesada que se muestra en la SEQ ID NO: 2, y que 5 además comprende una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 90% idéntica a una secuencia de aminoácidos de cadena ligera que se muestra en la SEQ ID NO: 4, en donde el anticuerpo se une al CTLA-4 humano; y un agente quelante, en donde la composición también comprende por lo menos un excipiente seleccionado del grupo que consiste en agentes de tonicidad, i ? agentes tensioactivos y amortiguadores, en donde ei agente tensioactivo es el polisorbato 80. La presente invención también provee una composición que comprende por lo menos un anticuerpo, que comprende una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 90% idéntica a una secuencia de 1 5 aminoácidos de cadena pesada que se muestra en la SEQ ID NO: 2, y que además comprende una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 90% idéntica a una secuencia de aminoácidos de cadena ligera que se muestra en la SEQ ID NO: 4, en donde el anticuerpo se une al CTLA-4 humano; y un agente quelante, en donde la composición también comprende por lo menos 0 un excipiente seleccionado del grupo que consiste en agentes de tonicidad, agentes tensioactivos y amortiguadores, en donde el amortiguador comprende histidina. La presente invención también provee una composición que comprende por lo menos un anticuerpo, que comprende una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 90% idéntica a una secuencia de aminoácidos de cadena pesada que se muestra en la SEQ ID NO 2, y que además comprende una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 90% idéntica a una secuencia de aminoácidos de cadena ligera que se muestra en la SEQ ID NO 4, en donde el anticuerpo se une al CTLA-4 humano, y un agente quelante, en donde la composición también comprende po sorbato 80 La presente invención también provee una composición que comprende por lo menos un anticuerpo, que comprende una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 90% idéntica a una secuencia de aminoácidos de cadena pesada que se muestra en la SEQ ID NO 2, y que además comprende una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 90% idéntica a una secuencia de aminoácidos de cadena ligera que se muestra en la SEQ ID NO 4, en donde el anticuerpo se une al CTLA-4 humano, y un agente quelante, en donde la composición también comprende trehalosa La presente invención también provee una composición que comprende por lo menos un anticuerpo, que comprende una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 90% idéntica a una secuencia de aminoácidos de cadena pesada que se muestra en la SEQ ID NO 2, y que además comprende una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 90% idéntica a una secuencia de aminoácidos de cadena ligera que se muestra en la SEQ ID NO 4, en donde el anticuerpo se une al CTLA-4 humano, en donde la composición comprende histidina, trehalosa, pohsorbato 80 y EDTA La presente invención también provee una composición que comprende por lo menos un anticuerpo, que comprende una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 90% idéntica a una secuencia de aminoácidos de cadena pesada que se muestra en la SEQ ID NO: 2, y que además comprende una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 90% idéntica a una secuencia de aminoácidos de cadena ligera que se muestra en la SEQ ID NO: 4, en donde el anticuerpo se une al CTLA-4 humano; en donde la composición comprende histidina, trehalosa, polisorbato 80 y EDTA, en donde la composición tiene un pH de aproximadamente 5.0 a aproximadamente 6.5. La presente invención también provee una composición que comprende por lo menos un anticuerpo, que comprende una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 90% idéntica a una secuencia de aminoácidos de cadena pesada que se muestra en la SEQ ID NO: 2, y que además comprende una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 90% idéntica a una secuencia de aminoácidos de cadena ligera que se muestra en la SEQ ID NO: 4, en donde el anticuerpo se une al CTLA-4 humano; en donde la composición comprende histidina, trehalosa, polisorbato 80 y EDTA, en donde la concentración de histidina es de entre aproximadamente 1 mM y aproximadamente 50 mM. La presente invención también provee una composición que comprende por lo menos un anticuerpo, que comprende una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 90% idéntica a una secuencia de aminoácidos de cadena pesada que se muestra en la SEQ ID NO: 2, y que además comprende una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 90% idéntica a una secuencia de aminoácidos de cadena ligera que se muestra en la SEQ ID NO: 4, en donde el anticuerpo se une al CTLA-4 humano; en donde 5 la composición comprende histidina, trehalosa, polisorbato 80 y EDTA, en donde la concentración de histidina es de aproximadamente 20 mM. La presente invención también provee una composición que comprende por lo menos un anticuerpo, que comprende una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 90% idéntica a una secuencia de i ? aminoácidos de cadena pesada que se muestra en ¡a SEQ ID NO. 2, y que además comprende una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 90% idéntica a una secuencia de aminoácidos de cadena ligera que se muestra en la SEQ ID NO: 4, en donde el anticuerpo se une al CTLA-4 humano; en donde la composición comprende histidina, trehalosa, polisorbato 80 y EDTA, en 15 donde la concentración del polisorbato 80 es de entre aproximadamente 0.01 mg/ml y aproximadamente 10 mg/ml. La presente invención también provee una composición que comprende por lo menos un anticuerpo, que comprende una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 90% idéntica a una secuencia de 0 aminoácidos de cadena pesada que se muestra en la SEQ ID NO: 2, y que además comprende una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 90% idéntica a una secuencia de aminoácidos de cadena ligera que se muestra en la SEQ ID NO: 4, en donde el anticuerpo se une al CTLA-4 humano; en donde la composición comprende histidina, trehalosa, polisorbato 80 y EDTA, en donde la concentración del polisorbato 80 es de aproximadamente 0.2 mg/ml. La presente invención también provee una composición que comprende por lo menos un anticuerpo, que comprende una secuencia de 5 aminoácidos que es por lo menos 90% idéntica a una secuencia de aminoácidos de cadena pesada que se muestra en la SEQ ID NO: 2, y que además comprende una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 90% idéntica a una secuencia de aminoácidos de cadena ligera que se muestra en la SEQ ID NO: 4, en donde el anticuerpo se une al CTLA-4 humano; en donde i ? ¡a composición comprende histidina, trehalosa, polisorbato 80 y EDTA, en donde la concentración de EDTA es de entre aproximadamente 0.001 mg/ml y aproximadamente 10 mg/ml. La presente invención también provee una composición que comprende por lo menos un anticuerpo, que comprende una secuencia de 15 aminoácidos que es por lo menos 90% idéntica a una secuencia de aminoácidos de cadena pesada que se muestra en la SEQ ID NO: 2, y que además comprende una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 90% idéntica a una secuencia de aminoácidos de cadena ligera que se muestra en la SEQ ID NO: 4, en donde el anticuerpo se une al CTLA-4 humano; en donde 0 la composición comprende histidina, trehalosa, polisorbato 80 y EDTA, en donde la concentración de EDTA es de aproximadamente 0.1 mg/ml. La presente invención también provee una composición que comprende por lo menos un anticuerpo, que comprende una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 90% idéntica a una secuencia de aminoácidos de cadena pesada que se muestra en la SEQ ID NO: 2, y que además comprende una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 90% idéntica a una secuencia de aminoácidos de cadena ligera que se muestra en la SEQ ID NO: 4, en donde el anticuerpo se une al CTLA-4 humano; en donde la composición comprende histidina, trehalosa, polisorbato 80 y EDTA, en donde la concentración de trehalosa es de entre aproximadamente 10 mg/ml y aproximadamente 100 mg/ml. La presente invención también provee una composición que comprende por lo menos un anticuerpo, que comprende una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 90% idéntica a una secuencia de aminoácidos de cadena pesada que se muestra en la SEQ ID NO: 2, y que además comprende una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 90% idéntica a una secuencia de aminoácidos de cadena ligera que se muestra en la SEQ ID NO: 4, en donde el anticuerpo se une al CTLA-4 humano; en donde la composición comprende histidina, trehalosa, polisorbato 80 y EDTA, en donde la concentración de trehalosa es de aproximadamente 84 mg/ml. La presente invención también provee una composición que comprende por lo menos un anticuerpo, que comprende una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 90% idéntica a una secuencia de aminoácidos de cadena pesada que se muestra en la SEQ ID NO: 2, y que además comprende una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 90% idéntica a una secuencia de aminoácidos de cadena ligera que se muestra en la SEQ ID NO 4, en donde el anticuerpo se une al CTLA-4 humano, en donde la composición comprende histidina, trehalosa, pohsorbato 80 y EDTA, en donde la composición comprende de aproximadamente 0 1 mg/ml a aproximadamente 100 mg/ml de anticuerpo, de aproximadamente 0 001 mg/ml a aproximadamente 1 0 mg/ml de EDTA; de aproximadamente 1 mM a aproximadamente 50 mM de histidina, de aproximadamente 0 01 mg/ml a aproximadamente 10 mg/ml de polisorbato 80, y de aproximadamente 10 mg/ml a aproximadamente 100 mg/ml de trehalosa La presente invención también provee una composición que comprende por lo menos un anticuerpo, que comprende una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 90% idéntica a una secuencia de aminoácidos de cadena pesada que se muestra en la SEQ ID NO 2, y que además comprende una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 90% idéntica a una secuencia de aminoácidos de cadena ligera que se muestra en la SEQ ID NO 4, en donde el anticuerpo se une al CTLA-4 humano, en donde la composición comprende histidina, trehalosa, pohsorbato 80 y EDTA, en donde la composición comprende aproximadamente 20 mg/ml de anticuerpo, aproximadamente 0 1 mg/ml de EDTA, aproximadamente 20 mM de histidina; aproximadamente 0 2 mg/ml de polisorbato 80, y aproximadamente 84 mg/ml de trehalosa La presente invención también provee una composición que comprende por lo menos un anticuerpo, en donde el anticuerpo comprende una secuencia de aminoácidos de cadena pesada que comprende la SEQ ID NO: 2, y una secuencia de aminoácidos de cadena ligera que comprende la SEQ ID NO: 4, en donde el anticuerpo se une al CTLA-4 humano; y un agente quelante; y el anticuerpo es estable a una temperatura de aproximadamente 5°C durante por lo menos 26 semanas aproximadamente. La presente invención también provee una composición que comprende por lo menos un anticuerpo, en donde el anticuerpo comprende una secuencia de aminoácidos de cadena pesada que comprende la SEQ ID NO: 2, y una secuencia de aminoácidos de cadena ligera que comprende la SEQ ID NO: 4, en donde el anticuerpo se une al CTLA-4 humano; y un agente quelante, y el anticuerpo es estable a una temperatura de aproximadamente 25°C durante por lo menos 26 semanas aproximadamente. La presente invención también provee una composición que comprende por lo menos un anticuerpo, en donde el anticuerpo comprende una secuencia de aminoácidos de cadena pesada que comprende la SEQ ID NO: 2, y una secuencia de aminoácidos de cadena ligera que comprende la SEQ ID NO: 4, en donde el anticuerpo se une al CTLA-4 humano; y un agente quelante; y el anticuerpo es estable a una temperatura de aproximadamente 40°C durante por lo menos 26 semanas aproximadamente. La presente invención también provee una composición que comprende por lo menos un anticuerpo, que comprende una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 90% idéntica a una secuencia de aminoácidos de cadena pesada que se muestra en la SEQ ID NO: 2, y que además comprende una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 90% idéntica a una secuencia de aminoácidos de cadena ligera que se muestra en la SEQ ID NO: 4, en donde el anticuerpo se une al CTLA-4 humano; y un agente quelante; en donde el anticuerpo es estable durante por lo menos un ciclo de congelación y descongelación de la composición. La presente invención también provee una composición que comprende por lo menos un anticuerpo, que comprende una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 90% idéntica a una secuencia de aminoácidos de cadena pesada que se muestra en la SEQ ID NO: 2, y que además comprende una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 90% idéntica a una secuencia de aminoácidos de cadena ligera que se muestra en la SEQ ID NO: 4, en donde el anticuerpo se une al CTLA-4 humano; y un agente quelante; en donde el anticuerpo es estable durante por lo menos seis ciclos de congelación y descongelación de la composición. La presente invención también provee una composición que comprende por lo menos un anticuerpo, que comprende una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 90% idéntica a una secuencia de aminoácidos de cadena pesada que se muestra en la SEQ ID NO: 2, y que además comprende una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 90% idéntica a una secuencia de aminoácidos de cadena ligera que se muestra en la SEQ ID NO: 4, en donde el anticuerpo se une al CTLA-4 humano; y un agente quelante; en donde cuando la composición se almacena durante un periodo de aproximadamente 24 semanas a una temperatura de aproximadamente 40°C, la disminución del área pico de un cromatograma de agregado para la composición, con respecto al área pico de un cromatograma de agregado para una composición que carece del agente quelante, por lo demás idéntica, que se almacena durante un periodo de aproximadamente 24 semanas a una temperatura de aproximadamente 40°C, es de por lo menos aproximadamente 2%. La presente invención también provee una composición que comprende por lo menos un anticuerpo, que comprende una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 90% idéntica a una secuencia de aminoácidos de cadena pesada que se muestra en la SEQ ID NO: 2, y que además comprende una secuencia de aminoácidos que es por io menos 90% idéntica a una secuencia de aminoácidos de cadena ligera que se muestra en la SEQ ID NO: 4, en donde el anticuerpo se une al CTLA-4 humano; y un agente quelante; en donde cuando la composición se almacena durante un periodo de aproximadamente 24 semanas a una temperatura de aproximadamente 40°C, la disminución del área pico de un cromatograma de agregado para la composición, con respecto al área pico de un cromatograma de agregado para una composición que carece del agente quelante, por lo demás idéntica, que se almacena durante un periodo de aproximadamente 24 semanas a una temperatura de aproximadamente 40°C, es de por lo menos aproximadamente 2%, en donde la separación cromatográfica comprende SE-HPLC. La presente invención también provee una composición que comprende por lo menos un anticuerpo, que comprende una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 90% idéntica a una secuencia de aminoácidos de cadena pesada que se muestra en la SEQ ID NO: 2, y que además comprende una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 90% idéntica a una secuencia de aminoácidos de cadena ligera que se muestra en la SEQ ID NO: 4, en donde el anticuerpo se une al CTLA-4 humano; y un agente quelante; en donde cuando la composición se almacena durante un período de aproximadamente 24 semanas a una temperatura de aproximadamente 40°C, la disminución del área pico de un cromatograma de agregado para la composición, con respecto al área pico de un cromatograma de agregado para una composición que carece del agente quelante, por io demás idéntica, que se almacena durante un periodo de aproximadamente 24 semanas a una temperatura de aproximadamente 40°C, es de por lo menos aproximadamente 2%, en donde se utiliza detección en luz ultravioleta para medir la cantidad de anticuerpos que se han agregado. La presente invención también provee una composición que comprende por lo menos un anticuerpo, que comprende una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 90% idéntica a una secuencia de aminoácidos de cadena pesada que se muestra en la SEQ ID NO: 2, y que además comprende una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 90% idéntica a una secuencia de aminoácidos de cadena ligera que se muestra en la SEQ ID NO: 4, en donde el anticuerpo se une al CTLA-4 humano; y un agente quelante; en donde cuando la composición se almacena durante un periodo de aproximadamente 24 semanas a una temperatura de aproximadamente 40°C, la disminución del área pico de un cromatograma de agregado para la composición, con respecto al área pico de un cromatograma de agregado para una composición que carece del agente quelante, por lo demás idéntica, que se almacena durante un periodo de aproximadamente 24 5 semanas a una temperatura de aproximadamente 40°C, es de por lo menos aproximadamente 2%, en donde la detección en luz ultravioleta se realiza a 214 nanómetros. La presente invención también provee una composición que comprende por lo menos un anticuerpo, que comprende una secuencia de i O aminoácidos que es por lo menos 90% idéntica a una secuencia de aminoácidos de cadena pesada que se muestra en la SEQ ID NO: 2, y que además comprende una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 90% idéntica a una secuencia de aminoácidos de cadena ligera que se muestra en la SEQ ID NO: 4, en donde el anticuerpo se une al CTLA-4 humano; y un 15 agente quelante; en donde cuando la composición se almacena durante un periodo de aproximadamente 24 semanas a una temperatura de aproximadamente 40°C, la disminución del área pico de un cromatograma de agregado para la composición, con respecto al área pico de un cromatograma de agregado para una composición que carece del agente quelante, por lo 20 demás idéntica, que se almacena durante un periodo de aproximadamente 24 semanas a una temperatura de aproximadamente 40°C, es de por lo menos aproximadamente 2%, en donde la composición permanece sustancialmente transparente e incolora.

La presente invención también provee una composición que comprende por lo menos un anticuerpo, que comprende una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 90% idéntica a una secuencia de aminoácidos de cadena pesada que se muestra en la SEQ ID NO: 2, y que además comprende una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 90% idéntica a una secuencia de aminoácidos de cadena ligera que se muestra en la SEQ ID NO: 4, en donde el anticuerpo se une al CTLA-4 humano; y un agente quelante; en donde cuando la composición se almacena durante un periodo de aproximadamente 24 semanas a una temperatura de aproximadamente 40°C, ¡a disminución dei área pico de un cromaiograma de agregado para la composición, con respecto al área pico de un cromatograma de agregado para una composición que carece del agente quelante, por lo demás idéntica, que se almacena durante un periodo de aproximadamente 24 semanas a una temperatura de aproximadamente 40°C, es de por lo menos aproximadamente 2%, en donde cuando la composición se almacena durante un periodo de aproximadamente 24 semanas a una temperatura de aproximadamente 40°C, el porcentaje total de oxidación de los residuos de metionina en la posición del aminoácido 432 se reduce una cantidad que es igual o mayor de 2.2%, determinada después de digestión enzimática con Lisil endopeptidasa seguida por separación con HPLC de fase inversa, en comparación con los anticuerpos de una composición que está libre de un agente quelante. La presente invención también provee una composición que comprende por lo menos un anticuerpo, que comprende una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 90% idéntica a una secuencia de aminoácidos de cadena pesada que se muestra en la SEQ ID NO 2, y que además comprende una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 90% idéntica a una secuencia de aminoácidos de cadena ligera que se muestra en la SEQ ID NO 4, en donde el anticuerpo se une al CTLA-4 humano, y un agente quelante, en donde cuando la composición se almacena durante un periodo de aproximadamente 24 semanas a una temperatura de aproximadamente 40°C, la disminución del área pico de un cromatograma de agregado para la composición, con respecto al área pico de un crornatograma de agregado para una composición que carece del agente quelante, por lo demás idéntica, que se almacena durante un periodo de aproximadamente 24 semanas a una temperatura de aproximadamente 40°C, es de por lo menos aproximadamente 2%, en donde cuando la composición se almacena durante un periodo de aproximadamente 24 semanas a una temperatura de aproximadamente 40°C, el porcentaje total de oxidación de los residuos de metionina en la posición del aminoácido 256 se reduce una cantidad que es igual o mayor de 4 2%, determinada después de digestión enzimática con Lisil endopeptidasa seguida por separación con HPLC de fase inversa, en comparación con los anticuerpos de una composición que esta libre de un agente quelante La presente invención también provee una composición que comprende por lo menos un anticuerpo que consiste esencialmente en una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 90% idéntica a una secuencia de aminoácidos de cadena pesada que se muestra en la SEQ ID NO: 2, y que además consiste esencialmente en una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 90% idéntica a una secuencia de aminoácidos de cadena ligera que se muestra en la SEQ ID NO: 4, en donde el anticuerpo se une al CTLA-4 humano; y un agente quelante. La presente invención también provee una composición que comprende por lo menos un anticuerpo que consiste en una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 90% idéntica a una secuencia de aminoácidos de cadena pesada que se muestra en ia SEQ ID NO: 2, y que además consiste en una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 90% idéntica a una secuencia de aminoácidos de cadena ligera que se muestra en la SEQ ID NO: 4, en donde el anticuerpo se une al CTLA-4 humano; y un agente quelante. La presente invención también provee un método para preparar una composición farmacéutica líquida estable, que comprende mezclar anticuerpos monoclonales anti-CTLA-4 con un agente quelapte farmacéuticamente aceptable en una cantidad que reduce la inestabilidad del anticuerpo, en donde cuando la composición se almacena durante un periodo de aproximadamente 24 semanas a una temperatura de aproximadamente 40°C, la disminución del área pico de un cromatograma de agregado para la composición farmacéutica líquida estable que comprende anticuerpos monoclonales anti-CTLA-4 y el agente quelante, con respecto al área pico de un cromatograma de agregado para una composición que carece del agente quelante, por lo demás idéntica, que se almacena durante un periodo de aproximadamente 24 semanas a una temperatura de aproximadamente 40°C, es de por lo menos aproximadamente 2%. La presente invención también provee un método para estabilizar anticuerpos monoclonales anti-CTLA-4 en una composición farmacéutica líquida, que comprende formar una composición líquida que comprende los anticuerpos y un agente quelante farmacéuticamente aceptable, en donde cuando la composición se almacena durante un periodo de aproximadamente 24 semanas a una temperatura de aproximadamente 40°C, ¡a disminución del área pico de un cromatograma de agregado para la composición farmacéutica líquida estable que comprende anticuerpos monoclonales anti-CTLA-4 y el agente quelante, con respecto al área pico de un cromatograma de agregado para una composición que carece del agente quelante, por lo demás idéntica, que se almacena durante un periodo de aproximadamente 24 semanas a una temperatura de aproximadamente 40°C, es de por lo menos aproximadamente 2%. La presente invención también provee un método de tratamiento de una condición de neoplasia en un sujeto, que comprende administrar al sujeto una composición farmacéutica líquida que comprende: una cantidad terapéuticamente efectiva del anticuerpo monoclonal anti-CTLA-4 ticilimumab; y un agente quelante farmacéuticamente aceptable. La presente invención también provee un método de tratamiento de una condición de neoplasia en un sujeto, que comprende administrar al sujeto una composición farmacéutica líquida que comprende: una cantidad terapéuticamente efectiva del anticuerpo monoclonal anti-CTLA-4 ticilimumab; y un agente quelante farmacéuticamente aceptable, en donde la composición se administra al sujeto por vía intravenosa. La presente invención también provee un método de tratamiento de una condición de neoplasia en un sujeto, que comprende administrar al sujeto una composición farmacéutica líquida que comprende: una cantidad terapéuticamente efectiva del anticuerpo monoclonal anti-CTLA-4 ticilimumab; y un ag nte quelapte farmacéuticamente aceptable, en donde el sujeto requiere el tratamiento de una condición de neoplasia. La presente invención también provee un método de tratamiento de una condición de neoplasia en un sujeto, que comprende administrar al sujeto una composición farmacéutica líquida que comprende: una cantidad terapéuticamente efectiva del anticuerpo monoclonal anti-CTLA-4 ticilimumab; y un agente quelante farmacéuticamente aceptable, en donde la condición de neoplasia es un cáncer que se selecciona del grupo que consiste en cáncer del cerebro, de célula escamosa, de la vejiga, gástrico, pancreático, mamario, de la cabeza, cuello, esófago, próstata, colorrectal, de pulmón, renal, de riñon, ovario, ginecológico y de la tiroides. La presente invención también provee un equipo para preparar una composición líquida de un anticuerpo estabilizado, que comprende un primer contenedor que comprende el anticuerpo monoclonal anti-CTLA-4 ticilimumab en solución, y un segundo contenedor que comprende un agente quelante farmacéuticamente aceptable. La presente invención también provee un artículo de fabricación que comprende un contenedor que guarda una mezcla de por lo menos un 5 anticuerpo anti-CTLA-4 que tiene las secuencias de aminoácidos de la cadena pesada y ligera de tícilimumab, y un agente quelante. La presente invención también provee una composición farmacéutica líquida que comprende anticuerpos monoclonales anti-CTLA-4 y un agente quelante farmacéuticamente aceptable, en donde la concentración i O moiar de ios anticuerpos varía de aproximadamente 0.0006 milimolar a aproximadamente 1 .35 milimolar, y la concentración molar del agente quelante varía de aproximadamente 0.003 milimolar a aproximadamente 50 milimolar, y en donde la relación molar de anticuerpos a agente quelante varía de aproximadamente 0.00001 a aproximadamente 450. 15 La presente invención también provee una composición farmacéutica líquida que comprende anticuerpos monoclonales anti-CTLA-4 y un agente quelante farmacéuticamente aceptable, en donde la concentración molar de los anticuerpos varía de aproximadamente 0.0006 milimolar a aproximadamente 1 .35 milimolar, y la concentración molar del agente 20 quelante varía de aproximadamente 0.003 milimolar a aproximadamente 50 milimolar, y en donde la relación molar de anticuerpos a agente quelante varía de aproximadamente 0.00001 a aproximadamente 450, en donde los anticuerpos comprenden anticuerpos monoclonales anti-CTLA-4 que tienen las secuencias de aminoácidos de la cadena pesada y ligera del anticuerpo ticilimumab. La presente invención también provee una composición farmacéutica líquida que comprende anticuerpos monoclonales anti-CTLA-4 y 5 un agente quelante farmacéuticamente aceptable, en donde la concentración molar de los anticuerpos varía de aproximadamente 0.0006 milimolar a aproximadamente 1 .35 milimolar, y la concentración molar del agente quelante varía de aproximadamente 0.003 milimolar a aproximadamente 50 milimolar, y en donde la relación molar de anticuerpos a agente quelante varía i O de aproximadamente 0.0001 a aproximadamente 100. La presente invención también provee una composición farmacéutica líquida que comprende anticuerpos monoclonales anti-CTLA-4 y un agente quelante farmacéuticamente aceptable, en donde la concentración molar de los anticuerpos varía de aproximadamente 0.0006 milimolar a 15 aproximadamente 1 .35 milimolar, y la concentración molar del agente quelante varía de aproximadamente 0.003 milimolar a aproximadamente 50 milimolar, y en donde la relación molar de anticuerpos a agente quelante varía de aproximadamente 0.001 a aproximadamente 10. La presente invención también provee una composición 0 farmacéutica líquida que comprende anticuerpos monoclonales anti-CTLA-4 y un agente quelante farmacéuticamente aceptable, en donde la concentración molar de los anticuerpos varía de aproximadamente 0.0006 milímolar a aproximadamente 1 .35 milimolar, y la concentración molar del agente quelante varía de aproximadamente 0.003 milimolar a aproximadamente 50 milimolar, y en donde la relación molar de anticuerpos a agente quelante varía de aproximadamente 0.1 a aproximadamente 1 . La presente invención también provee una composición 5 farmacéutica líquida que comprende anticuerpos monoclonales anti-CTLA-4 y un agente quelante farmacéuticamente aceptable, en donde la concentración molar de los anticuerpos varía de aproximadamente 0.0006 milimolar a aproximadamente 1 .35 milimolar, y la concentración molar del agente quelante varía de aproximadamente 0.003 milimolar a aproximadamente 50 i O milimoiar, y en donde ¡a relación molar de anticuerpos a agente queiante varía de aproximadamente 0.00001 a aproximadamente 450, en donde la relación molar de anticuerpos a agente quelante es de aproximadamente 0.5. La presente invención también provee una composición farmacéutica líquida que comprende por lo menos un anticuerpo monoclonal 15 anti-CTLA humano, en donde el anticuerpo se une al CTLA-4 humano; y un agente quelante. La presente invención también provee una composición farmacéutica que comprende por lo menos un anticuerpo, que comprende una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 95% idéntica a una secuencia 0 de aminoácidos de cadena pesada que se muestra en la SEQ ID NO: 2, y que además comprende una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 95% idéntica a una secuencia de aminoácidos de cadena ligera que se muestra en la SEQ ID NO: 4, en donde el anticuerpo se une al CTLA-4 humano; y un excipiente farmacéuticamente aceptable, en donde la composición contiene una concentración de anticuerpo que es de por lo menos aproximadamente 10 mg/ml. La presente invención también provee una composición farmacéutica que comprende por lo menos un anticuerpo, que comprende una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 95% idéntica a una secuencia de aminoácidos de cadena pesada que se muestra en la SEQ ID NO: 2, y que además comprende una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 95% idéntica a una secuencia de aminoácidos de cadena ligera que se muestra en la SEQ ID NO. 4, en donde el anticuerpo se une ai CTLA-4 humano; y un excipiente farmacéuticamente aceptable, en donde la composición contiene una concentración de anticuerpo que varía de aproximadamente 10 mg/ml a aproximadamente 25 mg/ml. La presente invención también provee una composición farmacéutica que comprende por lo menos un anticuerpo, que comprende una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 95% idéntica a una secuencia de aminoácidos de cadena pesada que se muestra en la SEQ ID NO: 2, y que además comprende una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 95% idéntica a una secuencia de aminoácidos de cadena ligera que se muestra en la SEQ ID NO: 4, en donde el anticuerpo se une al CTLA-4 humano; y un excipiente farmacéuticamente aceptable, en donde la composición contiene una concentración de anticuerpo que varía de aproximadamente 10 mg/ml a aproximadamente 200 mg/ml.

La presente invención también provee una composición farmacéutica que comprende por lo menos un anticuerpo, que comprende una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 95% idéntica a una secuencia de aminoácidos de cadena pesada que se muestra en la SEQ ID NO: 2, y que además comprende una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 95% idéntica a una secuencia de aminoácidos de cadena ligera que se muestra en la SEQ ID NO: 4, en donde el anticuerpo se une al CTLA-4 humano; y un excipiente farmacéuticamente aceptable, en donde la composición contiene una concentración de anticuerpo de aproximadamente 20 mg/ml. La presente invención también provee una composición que comprende: un agente quelante; y por lo menos un anticuerpo que comprende: una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 90% idéntica a una secuencia de aminoácidos de cadena pesada que se muestra en la SEQ ID NO: 2, una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 90% idéntica a una secuencia de aminoácidos de cadena ligera que se muestra en la SEQ ID NO: 4, en donde el anticuerpo se une al CTLA-4 humano. La presente invención también provee una composición que comprende: un agente quelante; y por lo menos un anticuerpo que comprende: una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 90% idéntica a una secuencia de aminoácidos de cadena pesada que se muestra en la SEQ ID NO: 2, una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 90% idéntica a una secuencia de aminoácidos de cadena ligera que se muestra en la SEQ ID NO: 4, en donde el anticuerpo se une al CTLA-4 humano; en donde el anticuerpo comprende un anticuerpo monoclonal de lgG2 anti-CTLA-4 que tiene las secuencias de aminoácidos de la cadena pesada y ligera de ticilimumab. La presente invención también provee un método para preparar una composición farmacéutica liquida, que comprende mezclar por lo menos un anticuerpo anti-CTLA-4 que tiene las secuencias de aminoácidos de la cadena pesada y ligera de ticilimumab en solución, que tiene por lo menos un agente quelante. La presente invención también provee un método de tratamiento de una condición de neopiasia en un sujeto, que comprende administrar ai sujeto una composición farmacéutica líquida que comprende: una cantidad terapéuticamente efectiva de por lo menos un anticuerpo anti-CTLA-4 que tiene las secuencias de aminoácidos de la cadena pesada y ligera de ticilimumab; y un agente quelante farmacéuticamente aceptable. La presente invención también provee un equipo para preparar una composición líquida de un anticuerpo estabilizado que comprende: un primer contenedor que comprende por lo menos un anticuerpo anti-CTLA-4 que tiene las secuencias de aminoácidos de la cadena pesada y ligera de ticilimumab en solución, y un segundo contenedor que comprende un agente quelante farmacéuticamente aceptable. La presente invención también provee una composición farmacéutica líquida que comprende: por lo menos un anticuerpo que comprende una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 95% idéntica a una secuencia de aminoácidos de cadena pesada que se muestra en la SEQ ID NO 2, y que además comprende una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 95% idéntica a una secuencia de aminoácidos de cadena ligera que se muestra en la SEQ ID NO 4, en donde el anticuerpo se une al CTLA-4 humano, y un excipiente farmacéuticamente aceptable, en donde la composición contiene una concentración de anticuerpo de por lo menos aproximadamente 10 mg/ml BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS I U La figura 1 es una gráfica de barras que muestra el porcentaje de agregación de vanas formulaciones de prueba después de su almacenamiento a 40 °C durante hasta 7 semanas, por medio de cromatografía de exclusión de tamaño (SEC), 15 La figura 2 es una gráfica de barras que muestra el porcentaje total de formación de impurezas (hidrolítico) en varias formulaciones de prueba después de su almacenamiento a 40°C durante hasta 7 semanas, por medio de PAGE reducido -SDS (rSDSPAGE), La figura 3 es una gráfica de líneas que muestra el porcentaje de 0 agregación de varias formulaciones de prueba en almacenamiento bajo condiciones aceleradas a 40°C durante hasta 24 semanas, por medio de SEC, La figura 4 es una gráfica de líneas que muestra el porcentaje total de formación de impurezas (hidrolítico) en varias formulaciones de prueba después de almacenamiento bajo condiciones aceleradas a 40°C durante hasta 24 semanas, por medio de rSDSPAGE; La figura 5 es una gráfica de líneas que muestra el porcentaje de agregación de varias formulaciones de prueba después de almacenamiento bajo condiciones aceleradas a 40°C durante hasta 24 semanas, por medio de SEC; La figura 6 es una gráfica de líneas que muestra el porcentaje total de formación de impurezas (hidrolítico) en varias formulaciones de prueba después de almacenamiento bajo condiciones aceleradas a 40°C durante hasta 24 semanas, por medio de rSDSPAGE, La figura 7 es una gráfica de barras que muestra el porcentaje de agregación de varias formulaciones de prueba en función de la concentración de EDTA después de almacenamiento bajo condiciones aceleradas a 40°C durante hasta 24 semanas, por medio de SEC; La figura 8 es una gráfica de barras que muestra el porcentaje total de formación de impurezas (hidrolítico) en varias formulaciones de prueba en función de la concentración de EDTA después de almacenamiento bajo condiciones aceleradas a 40°C durante hasta 24 semanas, por medio de rSDSPAGE; La figura 9 es una gráfica de líneas que muestra el porcentaje de agregación de varias formulaciones de prueba después de almacenamiento bajo condiciones aceleradas a 40°C durante hasta 13 semanas, por medio de SEC; La figura 10 es una gráfica de líneas que muestra el porcentaje total de formación de impurezas (hidrolítico) en varias formulaciones de prueba después de almacenamiento bajo condiciones aceleradas a 40°C durante hasta 13 semanas, por medio de rSDSPAGE; y Las figuras 1 1 A-1 1 D muestran las secuencias de aminoácidos y nucleótidos para el anticuerpo anti-CTLA4, referido ahora como ticilimumab. La figura 1 1 A muestra la secuencia de nucleótídos de longitud completa para la cadena pesada de 1 1 .2.1 (SEQ ID NO: 1 ). La figura 1 1 B muestra la secuencia de aminoácidos para la cadena pesada de 11 .2.1 (SEQ ID NO: 2), y la secuencia de aminoácidos para la región variable de la cadena pesada de 1 1 .2.1 se indica entre corchetes "[ ]" (SEQ ID NO: 5). La secuencia de aminoácidos de cada CDR de la cadena pesada de 1 1 .2.1 está subrayada. Las secuencias de CDR son como sigue: CDR1 : GFTFSSYGMH (SEQ ID NO: 7); CDR2: VIWYDGSNKYYADSV (SEQ ID NO: 8); y CDR3: DPRGATLYYYYYGMDV (SEQ ID NO: 9). La figura 1 1 C muestra la secuencia de nucleótidos para la cadena ligera de 1 1 .2.1 (SEQ ID NO: 3). La figura 1 1 D muestra la secuencia de aminoácidos de la cadena ligera de longitud completa de 1 1 .2.1 (SEQ ID NO: 4), y la región variable de la cadena ligera se indica entre corchetes "[ ]" (SEQ ID NO: 6). La secuencia de aminoácidos de cada CDR es como sigue: CDR1 : RASQSINSILD (SEQ ID NO: 10); CDR2: AASSLQS (SEQ ID NO: 1 1 ); y CDR3: QQYYSTPFT (SEQ ID NO: 1 2).

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN En general, los métodos y técnicas de la presente invención se realizan de acuerdo con los métodos convencionales conocidos y como se 5 describe en referencias generales y más específicas que se citan y discuten en toda la presente especificación, a menos que se indique de otra manera. Véase, por ejemplo, Sambrook y otros, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 2o ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989); Ausubel y otros, "Current Protocols in Molecular Biology", Greene ? ? r UUIISI III ?y ?\ asumi íes ( ? v ¿.), y ridi n vv y ?_di ?c, ??I iiiuuuieo. r\ au?i diui y Manual", Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1990). Las reacciones enzimáticas y las técnicas de purificación se realizan de acuerdo con las especificaciones del fabricante, tal como se realiza comúnmente o como se describe en la presente. La nomenclatura usada y 15 los procedimientos y técnicas de laboratorio aquí descritos de química analítica, química orgánica sintética y química médica y farmacéutica, son muy conocidos y son usados comúnmente. Se utilizan las técnicas estándares para síntesis química, análisis químico, preparación, formulación y suministro farmacéutico, y tratamiento de sujetos. 0 Definiciones Para ayudarle al lector a que entienda la siguiente descripción detallada, se proveen las siguientes definiciones: Como se usa en la presente, el término "formulación" o "composición", como se refiere a un anticuerpo anti-CTLA-4, se usa para describir el anticuerpo en combinación con un excipiente farmacéuticamente aceptable que comprende un agente quelante. Por ejemplo, las composiciones de la invención tienen una vida de anaquel y/o estabilidad mejorada en comparación con las formulaciones reconocidas de la técnica. Como se usa en la presente, el término "anticuerpo" se refiere a un anticuerpo intacto o una porción de unión a antígeno que compite con el anticuerpo intacto por unión específica. Véase en general, "Fundamental Immunology", capítulo 7 (Paul, W., ed., 2a. ed. Raven Press, N.Y. (1989). Pueden producirse porciones de unión a antígeno mediante técnicas de ADN recombinante, o mediante digestión enzimática o química de anticuerpos intactos. En algunas modalidades, las porciones de unión a antígeno incluyen Fab, Fab', F(ab')2? Fd, Fv, dAb, y fragmentos de la región determinante de complementariedad (CDR), anticuerpos de cadena sencilla (scFv), anticuerpos quiméricos, cuerpos completos y polipéptidos que contengan por lo menos una porción de un anticuerpo que sea suficiente para conferir unión específica del antígeno al polipéptido. Del extremo N al extremo C, los dominios variables de cadena pesada y ligera maduros comprenden las regiones FR1 , CDR1 , FR2, CDR2, FR3, CDR3 y FR4. Esta asignación de aminoácidos a cada dominio está de acuerdo con las definiciones de Kabat, "Sequences of Proteins of Immunological Interest" (National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987 y 1991 )), Chothia & Lesk, J. Mol. Biol. 196: 901 - 917 (1987), o Chothia y otros, Nature 342: 878-883 (1989). Como se usa en la presente, el término "polipéptido" abarca proteínas nativas o artificiales, fragmentos de proteína y análogos de polipéptido de una secuencia de proteínas. Un polípéptido puede ser monomérico o polimérico. Como se usa en la presente, un fragmento Fd significa un fragmento de anticuerpo que consiste en los dominios VH y CH 1 ; un fragmento Fv consiste en los dominios VL y VH de un brazo individual de un anticuerpo; y un fragmento dAb (Ward y otros, Nature 341 : 544-546 (1989)) consiste en un dominio V?. El término "o una porción de unión a antígeno del mismo", cuando se usa con el término "anticuerpo", se refiere a un polipéptido que tiene una supresión amino-terminal y/o carboxi-terminal, pero en donde la secuencia de aminoácidos restante es idéntica a las posiciones correspondientes en la secuencia de ocurrencia natural. En algunas modalidades, los fragmentos tienen por lo menos 5, 6, 8 ó 10 aminoácidos de longitud. En otras modalidades, los fragmentos tienen por lo menos 14, por lo menos 20, por lo menos 50, o por lo menos 70, 80, 90, 100, 150 ó 200 aminoácidos de longitud. Como se usa en la presente, el término "anticuerpo monoclonal" se refiere a un anticuerpo obtenido de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, es decir, los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos, salvo por mutaciones posibles de ocurrencia natural que pueden estar presentes en cantidades menores o que carecen de una lisina C-terminal. Los anticuerpos monoclonales son altamente específicos, siendo dirigidos contra un sitio antigénico individual. Además, en contraste a las preparaciones de anticuerpo convencionales (policlonales), que incluyen típicamente diferentes anticuerpos, dirigidos contra diferentes determinantes (epítopes), cada anticuerpo monoclonal es dirigido contra un determinante individual en el antígeno. El modificador "monoclonal" indica el carácter del anticuerpo que se obtiene de una población sustancialmente homogénea de anticuerpos, y no deberá considerarse que requiere ¡a producción del anticuerpo mediante algún método particular. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales que se usarán de conformidad con la presente invención, pueden obtenerse mediante el método de hibridoma descrito primero por Kohler y otros, Nature 256: 495 (1975), o pueden obtenerse mediante métodos de ADN recombinante (véase, por ejemplo, la patente de EE. UU. No. 4,816,567). Los "anticuerpos monoclonales" pueden aislarse también de colecciones de anticuerpos de fagos usando, por ejemplo, las técnicas descritas en Clackson y otros, Nature 352: 624-628 (1991 ) y en Marks y otros, J. Mol. Biol. 222: 581 -597 (1991 ). Como se usa en la presente, los términos "anticuerpo aislado" o "anticuerpo purificado, se refieren a un anticuerpo que en virtud de su origen o fuente de derivación, tiene de 1 a 4 de las siguientes características: (1 ) no está asociado con componentes asociados naturalmente que lo acompañan en su estado nativo, (2) está libre de otras proteínas de la misma especie, (3) es expresado por una célula de una especie diferente, o (4) no ocurre en la naturaleza. De esta manera, un anticuerpo que es sintetizado químicamente o sintetizado en un sistema celular diferente de la célula de la cual se origina naturalmente, es aislado y purificado de sus componentes asociados naturalmente. Puede hacerse también que un anticuerpo esté sustancialmente libre de componentes asociados naturalmente mediante aislamiento y purificación, usando técnicas de purificación de proteínas bien conocidas en la materia. Ejemplos de anticuerpos aislados/purificados, incluyen un anticuerpo anti-CTLA-4 que haya sido purificado por afinidad usando CTLA-4, un anticuerpo anti-CTLA-4 que haya sido sintetizado por un hibridoma u otra línea de células in vitro, y un anticuerpo anti-CTLA-4 de humano derivado de un ratón transgénico. Ejemplos de anticuerpos aislados/purificados, incluyen un anticuerpo anti-CTLA-4 que ha sido purificado por afinidad usando CTLA-4, un anticuerpo anti-CTLA-4 que ha sido sintetizado por un hibridoma u otra línea de células in vitro, y un anticuerpo anti-CTLA-4 de humano derivado de un ratón transgénico. De esta manera, en modalidades preferidas, los anticuerpos anti-CTLA-4 tienen una pureza de por lo menos aproximadamente 95% (p/p - peso de anticuerpos anti-CTLA-4/peso de componentes diferentes de excipientes farmacéuticamente aceptables), y en otras modalidades, los anticuerpos antí-CTLA-4 tienen una pureza de aproximadamente 95% en p/p a aproximadamente 99.5% en p/p. Un anticuerpo es "sustancialmente puro", "sustancialmente homogéneo" o "sustancialmente purificado", cuando por lo menos aproximadamente 60 a 75% de una muestra exhibe una especie de anticuerpo individual. El anticuerpo puede ser monomérico o multimérico. Un anticuerpo sustancialmente puro puede comprender por lo regular aproximadamente 50%, 60%, 70%, 80% o 90% en p/p de una muestra de anticuerpo, más usualmente aproximadamente 95%, y de preferencia será más de 99% puro. La pureza u homogeneidad del anticuerpo puede indicarse mediante muchos medios bien conocidos en la técnica, tales como electroforesis en gel de poliacrilamida de una muestra de anticuerpo, seguida de visuaiización de una banda de poiipéptidos individual tras ¡a tinción del gel con un colorante bien conocido en la técnica. Para ciertos propósitos, puede lograrse mayor resolución usando HPLC u otros medios bien conocidos en la técnica para purificación. Como se usa en la presente, se considera que el término "anticuerpo humano" incluye anticuerpos que tienen regiones variables y constantes derivadas de secuencias de inmunoglobulina de la línea germinal humana. Los anticuerpos humanos de la invención pueden incluir residuos de aminoácido no codificados por secuencias de inmunoglobulina de la línea germinal humana (por ejemplo, mutaciones introducidas mediante mutagénesis aleatoria o específica de sitio in vitro o medíante mutación somática in vivo), por ejemplo, en las CDR's, y en particular la CDR3. Sin embargo, se considera que el término "anticuerpo humano", como se usa en la presente, no incluye anticuerpos en los cuales se han injertado secuencias de CDR derivadas de la línea germinal de otra especie de mamífero, tal como un ratón, e.n las secuencias de armazón de humano. Como se usa en la presente, se considera que el término "anticuerpo humano recombinante" incluya todos los anticuerpos humanos que se preparan, expresan, crean o aislan medíante medios recombinantes, tales como anticuerpos expresados usando un vector de expresión recombinante transfectado en una célula hospedera, anticuerpos aislados de una colección combinatoria recombinante de anticuerpos humanos, anticuerpos aislados de un animal (por ejemplo, un ratón) que sea transgénico para ¡os genes de ¡nmunoglobulina humana (véase, por ejemplo, Taylor, L. D., y otros (1992) Nucí. Acids Res. 20: 6287-6295), o anticuerpos preparados, expresados, creados o aislados mediante cualquier otro medio que implique empalme de secuencias de genes de inmunoglobulina humana con otras secuencias de ADN. Dichos anticuerpos humanos recombinantes tienen regiones variables y constantes derivadas de secuencias de inmunoglobulina de la línea germinal humana. Sin embargo, en ciertas modalidades, dichos anticuerpos humanos recombinantes se someten a mutagénesis in vitro (o cuando se usa un animal transgénico para secuencias de Ig humana, mutagénesis somática in vivo), y de esta manera las secuencias de aminoácidos de las regiones VH y VL de los anticuerpos recombinantes son secuencias que, mientras se derivan de, y se relacionan con, secuencias de VH y VL de la línea germinal humana, pueden no existir en forma natural dentro del repertorio de la línea germinal de anticuerpos humanos in vivo.

Como se usa en la presente, el término "pohnucleótido" o "ácido nucleico", como se usa reciprocamente en la presente, significa una forma polimérica de nucleótidos de por lo menos 10 bases de longitud, ya sea ribonucleótidos o desoxinucleótidos o una forma modificada de cualquier tipo de nucleótido El termino incluye formas de cadena sencilla y formas de doble cadena Un "polinucleótido" o una secuencia de "ácido nucleico" abarca su complemento, a menos que se especifique de otra manera De esta manera, debe entenderse que la referencia a un ácido nucleico que tiene una secuencia particular abarca su cadena complementaria, con su secuencia complementaria Como se usa en la presente, el término "polinucleótido aislado" o "ácido nucleico aislado" significa un polinucleótido de origen genómico, de ADNc o sintético, o alguna combinación de los mismos, que en virtud de su origen o fuente de derivación, el po nucleótido aislado tiene de 1 a 3 de las siguientes características (1 ) no esta asociado con un pohnucleótido completo o una porción del mismo con el cual el "polinucleótido aislado" se encuentra en la naturaleza, (2) esta enlazado operablemente a un polinucieótido con el cual no esta enlazado en la naturaleza, o (3) no ocurre en la naturaleza como parte de una secuencia más grande Como se usa en la presente, el término "nucleotidos de ocurrencia natural' incluye desoxirribonucleótidos y ribonucleótidos El término "nucleotidos modificados", como se usa en la presente, incluye nucleótidos con grupos azúcar modificados o sustituidos, o similares El término "enlaces de oligonucleótido' referido en la presente, incluye enlaces de oligonucleótidos tales como fosforotioato, fosforoditioato, fosforoselenoato, fosforodiselenoato, fosforoanilotioato, fosforaniladato, fosforoamidato, y similares Véase, por ejemplo, LaPlanche y otros, Nucí Acids Res 14 9081 (1986), Stec y otros, J Am Chem Soc 106 6077 (1984), Stein y otros, Nucí Acids Res 16 3209 (1988), Zon y otros, Anti-Cancer Drug Design 6 539 (1991 ), Zon y otros, Oligonucleotides and Analogues A Practical Approach, p 87-108 (F Eckstein, ed , Oxford University Press, Oxford Inglaterra (1991 )), patente de EE UU No 5,151 ,510, y Uhlmann y Peyman, Chemical Reviews 90 543 (1990), cuyas descripciones se incorporan en ¡a presente como referencia Un oligonucleótido puede incluir una marca para detección, si se desea Las secuencias "enlazadas operablemente", incluyen secuencias de control de la expresión que son contiguas con el gen de interés, y secuencias de control de la expresión que actúan en la posición trans, o a una distancia para controlar el gen de ínteres El término "secuencia de control de la expresión", como se usa en la presente, significa secuencias de pohnucleótidos que son necesarias para efectuar la expresión y el procesamiento de secuencias codificadoras a las cuales están ligadas Las secuencias de control de la expresión incluyen secuencias de inicio y terminación de la transcripción y secuencias de promotor e intensificador adecuadas, señales de procesamiento de ARN eficientes, tales como señales de poliadenilacion y empalme, secuencias que estabilizan ARN mensajero citoplasmico, secuencias que intensifican la eficiencia de la traducción (es decir, secuencia consenso de Kozak), secuencias que intensifican la estabilidad de las proteínas, y, cuando se desee, secuencias que intensifican la secreción de proteínas La naturaleza de dichas secuencias de control difiere, dependiendo del organismo hospedero, en proca ontes, dichas secuencias de control incluyen en general promotor, sitio de unión del ribosoma y secuencia de terminación de la transcripción, en eucapontes, en general, dichas secuencias de control incluyen promotores y secuencia de terminación de la transcripción Se considera que el término "secuencias de control" incluye como un mínimo todos los componentes cuya presencia sea esencial para la expresión y procesamiento, y pueden incluir también componentes adicionales cuya presencia sea ventajosa, por ejemplo, secuencias guia y secuencias de miembro de fusión Como se usa en la presente, el término "vector" significa una molécula de ácido nucleico capaz de transportar otro ácido nucleico con el cual ha estado enlazado En algunas modalidades, el vector es un plásmido, es decir, una asa de ADN de doble cadena circular en la cual segmentos de ADN adicionales pueden estar ligados En algunas modalidades, el vector es un vector viral, en donde segmentos de ADN adicionales pueden estar ligados en el genoma viral En algunas modalidades, los vectores son capaces de rephcación autónoma en una célula hospedera en la cual son introducidos (por ejemplo, vectores bacterianos que tienen un origen de replicación bacteriano y vectores episomicos de mamífero) En otras modalidades, los vectores (por ejemplo, vectores no episómicos de mamífero) pueden estar integrados en el genoma de una célula hospedera tras la introducción en la célula hospedera, y se replican de esta manera junto con el genoma del hospedero. Además, ciertos vectores son capaces de dirigir la expresión de genes con los cuales están enlazados operativamente. Dichos vectores son referidos en la presente como "vectores de expresión recombinantes" (o simplemente, "vectores de expresión"). Como se usa en la presente, el término "célula hospedera recombinante" (o simplemente "célula hospedera"), significa una célula en la cual un vector de expresión recombinapte ha sido introducido. Debe entenderse que los términos "célula hospedera recombinante" y "célula hospedera" significan no sólo la célula sujeto particular, sino también la progenie de dicha célula. Debido a que ciertas modificaciones pueden ocurrir en generaciones sucesivas debido a mutación o influencias ambientales, dicha progenie puede de hecho no ser idéntica a la célula progenitora, pero se incluye aún dentro del alcance del término "célula hospedera", como se usa en la presente. Como se usa en la presente, el término "es capaz de unirse específicamente", se refiere a cuando un anticuerpo se une a un antígeno con una constante de disociación que es < 1 µM, de preferencia < 1 nM, y más preferiblemente < 10 pM. Como se usa en la presente, el término "híbrida selectivamente" significa que se une detectable y específicamente. Polinucleótidos, oligonucleótidos y fragmentos de los mismos de conformidad con la invención, hibridan selectivamente con cadenas de ácido nucleico, bajo condiciones de hibridación y lavado que reducen al mínimo cantidades apreciables de unión detectable a ácidos nucleicos no específicos. Pueden usarse condiciones de "alta severidad" o condiciones "altamente severas" para lograr condiciones de hibridación selectiva, como es sabido en la técnica y como se discute en la presente. Un ejemplo de condiciones de "alta severidad" o condiciones "altamente severas", es la incubación de un polinucleótido con otro polinucleótido, en donde un polinucleótido puede estar adherido a una superficie sólida tal corno una membrana, en un amortiguador de hibridación SSPE o SSC 6X, formamida al 50%, reactivo de Denhardt 5X, SDS al 0.5%, 100 µg/ml de ADN de esperma de salmón fragmentado desnaturalizado a una temperatura de hibridación de 42°C por 12 a 16 horas, seguida de lavado dos veces a 55°C usando un amortiguador de lavado de SSC 1 X, SDS al 0.5%; Véase también Sambrook y otros, citado anteriormente, p. 9.50-9.55. El término "porcentaje de identidad de secuencia" en el contexto de secuencias de ácido nucleico, significa el porcentaje de residuos cuando una primera secuencia contigua se compara y se alinea para correspondencia máxima con una segunda secuencia contigua. La longitud de la comparación de la identidad de secuencia puede ser sobre un tramo de por lo menos aproximadamente 9 nucleótidos, usualmente por lo menos aproximadamente 18 nucleótidos, más usualmente por lo menos aproximadamente 24 nucleótidos, típicamente por lo menos aproximadamente 28 nucleótidos, más típicamente por lo menos aproximadamente 32 nucleótidos, y de preferencia por lo menos aproximadamente 36, 48 o más nucleótidos. Existen muchos algoritmos diferentes conocidos en la técnica que pueden usarse para medir la identidad de la secuencia de nucleótidos. Por ejemplo, pueden compararse 5 las secuencias de polinucleótidos usando FASTA, Gap o BESTFIT, que son programas en el paquete Wisconsin versión 10.0, Genetics Computer Group (GCG), Madison, Wísconsin. FASTA, que incluye, por ejemplo, los programas FASTA2 y FASTA3, provee alineaciones y el porcentaje de identidad de secuencia de las regiones del mejor traslape entre las secuencias de consulta ? ? y uc uuou,ueud (rcdi ouu, ivicipuu? i?? ?¿y???u?. 1 00. Oo-ao i sauj, redi un, Methods Mol. Biol. 132: 185-219 (2000); Pearson, Methods Enzymol. 266: 227-258 (1996); Pearson, J. Mol. Biol. 276: 71 -84 (1998)). A menos que se especifique de otra manera, se usan parámetros predeterminados para un programa o algoritmo particular. Por ejemplo, puede determinarse el 15 porcentaje de identidad de secuencia entre secuencias de ácido nucleico, usando FASTA con sus parámetros predeterminados (un tamaño de palabra de 6 y el factor NOPAM para la matriz de evaluación), o usando Gap con sus parámetros predeterminados provistos en GCG versión 6.1. La referencia a un "polinucleótido" o una secuencia de "ácido 0 nucleico" abarca su complemento, a menos que se especifique de otra manera. De esta manera, debe entenderse que la referencia a un ácido nucleico que tiene una secuencia particular abarca su cadena complementaria, con su secuencia complementaria.

El termino "similitud sustancial" o "similitud de secuencia sustancial", cuando se refiere a un ácido nucleico o fragmento del mismo, significa que cuando se alinea óptimamente con inserciones o supresiones de nucleotidos adecuadas con otro ácido nucleico (o su cadena complementaria), 5 existe identidad de secuencia de nucleótidos en por lo menos aproximadamente 85%, de preferencia por lo menos aproximadamente 90%, y de preferencia por lo menos aproximadamente 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de las bases de nucleótidos, según se mide mediante algún algoritmo o identidad de secuencia bien conocido, tales como FASTA, BLAST o Gap, i O como se discutió anteriormente Como se aplica a pohpéptidos, el término "identidad sustancial", "porcentaje de identidad" o "% de identidad", significa que dos secuencias de peptidos, cuando se alinean óptimamente, tal como mediante los programas GAP o BESTFIT que usan pesos de espacio predeterminados provistos con 15 los programas, comparten por lo menos 70%, 75% u 80% de identidad de secuencia, de preferencia por lo menos 90% o 95% de identidad de secuencia, y muy preferiblemente por lo menos 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia En ciertas modalidades, las posiciones de residuos que no son idénticas, difieren por sustituciones conservativas de aminoácidos Una 20 "sustitución conservativa de aminoácidos", es una en la cual un residuo de aminoácido es sustituido por otro residuo de aminoácido que tenga un grupo R de cadena lateral con propiedades químicas similares (por ejemplo, carga o carácter hidrofobico) En general, una sustitución conservativa de aminoácidos no cambiará sustancialmente las propiedades funcionales de una proteína. En casos en donde dos o más secuencias de aminoácidos difieren entre sí por sustituciones conservativas, el porcentaje de identidad de secuencia puede ajustarse hacia arriba para corregir la naturaleza conservativa de la sustitución. Medios para hacer este ajuste, son bien conocidos por los expertos en la técnica. Véase, por ejemplo, Pearson, Methods Mol. Biol. 243: 307-31 (1994). Ejemplos de grupos de aminoácidos que tienen cadenas laterales con propiedades químicas similares, incluyen 1 ) cadenas laterales alifáticas: glicina, alanina, valina, leucina e isoleucina; 2) cadenas laterales de hidroxilo alifáticas: serina y treonina; 3) cadenas laterales que contienen amida: asparagina y glutamina; 4) cadenas laterales aromáticas: fenilalanina, tirosina y triptófano; 5) cadenas laterales básicas: lisina, arginina e histidina; 6) cadenas laterales acidas: ácido aspártico y ácido glutámico; y 7) cadenas laterales que contienen azufre: císteína y metionina. Los grupos de sustitución conservativa de aminoácidos son: valina-leucina-isoleucina, fenilalanina-tirosina, lisina-arginina, alanína-valina, glutamato-aspartato y asparagina-glutamina. La identidad de secuencia para polipéptidos, se mide típicamente usando un software de análisis de secuencias. El software de análisis de proteínas, compara secuencias usando medidas de similitud asignadas a varias sustituciones, supresiones y otras modificaciones, incluyendo sustituciones conservativas de aminoácidos. Por ejemplo, GCG contiene programas tales como "Gap" y "BESTFIT" que pueden usarse con parámetros predeterminados, como se especifica con los programas, para determinar la homología de secuencia o identidad de secuencia entre polipeptidos estrechamente relacionados, tales como polipeptidos homólogos de diferentes especies de organismos, o entre una proteína de tipo silvestre y un mutante 5 de la misma Véase, por ejemplo, GCG versión 6 1 Pueden compararse también secuencias de polipéptidos usando FASTA, que usa parámetros predeterminados o recomendados, véase GCG versión 6 1 (Universidad de Wisconstn Wl) FASTA (por ejemplo, FASTA2 y FASTA3) provee alineaciones y porcentaje de identidad de secuencia de las regiones de mejor i ? u a iaµc ci ui c iso oc ucn iao uc ui ibuna y uc üua ,ucud ^r cai oui i , iw?n lOud Enzymol 183 63-98 (1990), Pearson, Methods Mol Biol 132 185-219 (2000)) Otro algoritmo preferido cuando se compara una secuencia de la invención con una base de datos que contiene un gran número de secuencias de diferentes organismos, es el programa de cómputo BLAST, especialmente 15 blastp o tblastn, usando parámetros predeterminados, provistos con los programas Véase, por ejemplo, Altschul y otros, J Mol Biol 215 403-410 (1990), y Altschul y otros, Nucleic Acids Res 25 3389-402 (1997) La longitud de las secuencias de pohpeptidos comparadas para homología, sera en general de por lo menos aproximadamente 16 residuos de aminoácido, 0 usualmente por lo menos aproximadamente 20 residuos, más usualmente por lo menos aproximadamente 24 residuos, típicamente por lo menos aproximadamente 28 residuos, y de preferencia mas de aproximadamente 35 residuos Cuando se busca una base de datos que contiene secuencias de un gran número de diferentes organismos, se prefiere comparar las secuencias de aminoácidos. Una "cantidad terapéuticamente efectiva" se refiere a una cantidad efectiva, a dosis y por períodos necesarios, para lograr el resultado terapéutico deseado, que incluye tratamiento o prevención profiláctica de condiciones de neoplasia. Se notará que los valores de dosificación pueden variar con la severidad de la condición que se va a aliviar. Se entenderá además que para algún sujeto particular, deben ajustarse los regímenes de dosificación específicos con el tiempo de acuerdo a la necesidad individual y el criterio profesional de la persona que administra o que supervisa la administración de las composiciones, y que las escalas de dosificación expuestas en la presente son sólo ejemplos, y no se considera que limiten el alcance o la práctica de la composición reclamada. Asimismo, una cantidad terapéuticamente efectiva del anticuerpo o porción de anticuerpo puede variar de acuerdo a factores tales como el estado de enfermedad, edad, sexo y peso de individuo, la capacidad del anticuerpo o porción de anticuerpo para inducir una respuesta deseada en el individuo, y la vía de administración deseada de la formulación de anticuerpo. Una cantidad terapéuticamente efectiva es también una en la cual cualquier efecto tóxico o perjudicial del anticuerpo o porción de anticuerpo, sea excedido por los efectos terapéuticamente benéficos. Como se usa en la presente, el término "sujeto" para propósitos de tratamiento incluye cualquier sujeto, y de preferencia es un sujeto que esté en necesidad de tratamiento de una condición de neoplasia Para propósitos de prevención, el sujeto es cualquier sujeto, y de preferencia es un sujeto que esté en riesgo de, o esté predispuesto a, desarrollar una condición de neoplasia Se considera que el término "sujeto" incluya organismos vivos, por ejemplo, procanontes y eucanontes Ejemplos de sujetos incluyen mamíferos, por ejemplo, humanos, perros, vacas, caballos, cerdos, ovejas, cabras, gatos, ratones, conejos, ratas, y animales no humanos transgénicos En modalidades específicas de la invención, el sujeto es un humano Como se usa en la presente, los términos "neoplasia" y "condiciones de eoplasia", usados recíprocamente en ia presente, se refieren a nuevo crecimiento de células que resulta de una pérdida de sensibilidad a controles de crecimiento normales, por ejemplo, a crecimiento de células "neoplásicas" El término neoplasia se usa también recíprocamente en la presente con el término "cáncer", y para los propósitos de la presente invención, el cáncer es un subtipo de neoplasia Como se usa en la presente, el término "condición de neoplasia" abarca también otras anormalidades celulares, tales como hiperplasia, metaplasia y displasia Los términos neoplasia, metaplasia, displasia e hiperplasia pueden usarse recíprocamente en la presente, y se refieren en general a células que experimentan crecimiento celular anormal Como se usa en la presente, el término "tratamiento" se refiere a tratamiento terapéutico y medidas profilácticas o preventivas, en donde el objetivo es prevenir o retardar (aminorar) la condición o enfermedad patológica elegida como objetivo. Aquellos en necesidad de tratamiento incluyen aquellos ya con la condición, así como aquellos propensos a tener la condición, o aquellos en quien la condición será prevenida. Cuando se introducen elementos de la presente invención o las 5 modalidades preferidas de la misma, se considera que los artículos "un", "una", "la" y "dicha" significan que existen uno o más de los elementos. Se considera que los términos "que comprende", "comprende", "comprenden", "que incluye" y "que tiene" son inclusivos, y que puede haber elementos adicionales además de los elementos enlistados. i r\ i ? Anticuerpos anti-CTLA-4 De conformidad con la presente invención, se ha descubierto que puede mejorarse la estabilidad de ciertos anticuerpos anti-CTLA-4 monoclonales que se describen en la presente, mezclando los anticuerpos 15 anti-CTLA-4 con un agente quelante farmacéuticamente aceptable, tal como ácido etilendiaminotetraacético ("EDTA"). Aunque no se desea limitarse por la teoría, se cree que la presencia de un agente quelante en las composiciones de la presente invención ayuda a mejorar la estabilidad del polipéptido del anticuerpo, 20 reduciendo la incidencia de uno o más de lo siguiente: agregación, fragmentación, oxidación, inestabilidad a la congelación/descongelación, decoloración y/o desamidación del anticuerpo anti-CTLA-4. La presente invención comprende formulaciones de anticuerpo anti-CTLA-4 que tienen estabilidad química y/o química mejorada, en comparación con composiciones de anticuerpo descritas previamente Por lo tanto, en ciertos aspectos, la presente invención provee una composición que comprende un agente quelante farmacéuticamente aceptable, tal como EDTA, y un anticuerpo monoclonal ant?-CTLA-4 o una porción de unión a antígeno del mismo En otros aspectos, las composiciones líquidas de anticuerpo ant?-CTLA-4 mencionadas anteriormente que comprenden un agente quelante, pueden incluir excipientes farmacéuticamente aceptables adicionales que incluyen, sin limitación, uno o mas excipientes que se seleccionan de amortiguadores, antiO?idaptes, agentes de tonicidad, agentes tensioactivos, y mezclas de los mismos La presente invención provee formulaciones novedosas para anticuerpos ant?-CTLA-4 Como se usa en la presente, la frase "anticuerpo ant?-CTLA-4" se refiere a cualquier anticuerpo, o cualquier porción del mismo, que sea capaz de unirse a cualquier porción de un polipéptido de la proteína 4 asociada con linfocitos T citotóxicos ("CTLA-4") que pueda estar presente dentro de, o pueda aislarse de, algún animal En algunas modalidades, el polipéptido CTLA-4 es un polipéptido CTLA-4 humano Anticuerpos ant?-CTLA-4 adecuados para su uso con la presente invención, pueden seleccionarse de anticuerpos monoclonales o pohclonales En ciertos aspectos, el anticuerpo monoclonal ant?-CTLA-4 puede ser un anticuerpo de murino, quimérico, humanizado o de humano En otras modalidades, el anticuerpo monoclonal ant?-CTLA-4 es un anticuerpo monoclonal anti-CTLA-4 humano. En ciertas modalidades, los anticuerpos anti-CTLA-4 que son adecuados para su uso con la presente invención incluyen aquellos anticuerpos anti-CTLA-4, y métodos para prepararlos, que se describen en la 5 patente de EE. UU. número 6,682,736, de Hanson y otros, presentada el 23 de diciembre de 1999. En otras modalidades, los anticuerpos anti-CTLA-4 que son adecuados para su uso con la presente invención incluyen los anticuerpos monoclonales anti-CTLA-4 que tienen las secuencias de aminoácidos de cadena ligera y pesada del anticuerpo designado como 11.2.1 1 i v ?j u ,Jc„ C ?_C?_. I u/ I Iu I . ~ i i.u' mc —i u C C O O "7 C C ~ u - *i•i —d ~b ~ ¡T-?luUdllucíu le~Sj- , ? lO~,b~ U,UU-, I JU . Cl i anticuerpos anti-CTLA-4 que son adecuados para su uso con la presente invención incluyen los anticuerpos monoclonales anti-CTLA-4 que tienen las secuencias de aminoácidos de cadena ligera y pesada de los anticuerpos ticilimumab e ipilimumab. En otras modalidades, los anticuerpos anti-CTLA-4 15 que son adecuados para su uso con la presente invención incluyen los anticuerpos monoclonales anti-CTLA-4 que tienen las secuencias de aminoácidos de cadena ligera y pesada del anticuerpo ticilimumab. Como se usa en la presente, un anticuerpo que es referido por número tiene las mismas secuencias de aminoácidos de cadena ligera y 0 pesada que un anticuerpo monoclonal que se obtiene del hibridoma del mismo número. Por ejemplo, el anticuerpo monoclonal 11.2.1 tiene las mismas secuencias de aminoácidos de cadena ligera y pesada que se obtienen del hibridoma 1 1.2.1 . De esta manera, la referencia al anticuerpo 11.2.1 incluye el anticuerpo ticilimumab™ que tiene las secuencias de aminoácidos de cadena ligera y pesada mostradas en SEQ ID NOS 2 y 4, y el dominio variable para la cadena pesada que se muestra en SEQ ID NO 5 y el dominio variable para la cadena ligera que se muestra en SEQ ID NO 6 Incluye también un anticuerpo que carece de una sina terminal en la cadena pesada, ya que esta se pierde normalmente en una proporción de anticuerpos durante la fabricación Además, tales anticuerpos ant?-CTLA-4 se pueden elegir basándose en las diferencias de secuencias de aminoácidos en la región constante de sus cadenas pesadas Por ejemplo, los anticuerpos ani?-CTLA-4 se pueden elegir de la clase de IgG que tienen las cadenas pesadas de tipo "gamma" La clase y subclase de los anticuerpos ant?-CTLA-4 se pueden determinar mediante cualquier método conocido En general, la clase y subclase de un anticuerpo se pueden determinar usando anticuerpos que son específicos para una clase y subclase particular del anticuerpo Tales anticuerpos están disponibles comercialmente La clase y la subclase se pueden determinar por medio de ELISA o Western Blot, y otras técnicas Alternativamente, la clase y la subclase se pueden determinar por secuenciación de una parte o todos los dominios constantes de las cadenas pesada y/o ligera de los anticuerpos, comparando sus secuencias de aminoácidos de vanas clases y subclases e inmunoglobulinas, y determinando la clase y subclase de los anticuerpos El anticuerpo ant?-CTLA-4 puede ser una molécula de IgG, IgM, IgE, IgA, o IgD. En modalidades adicionales, el anticuerpo anti-CTLA-4 es una IgG y es una subclase lgG1 , lgG2, lgG3 o lgG4. Sin embargo, como se apreciará, generalmente no es conveniente destruir las células que expresan CTLA-4. Más bien, en general se busca simplemente inhibir la unión de CTLA-4 con sus ligandos para mitigar la regulación negativa de células T. Uno de los principales mecanismos a través de los cuales los anticuerpos destruyen a las células es por fijación del complemento y participación en CDC. La región constante de un anticuerpo tiene una función importante con respecto a la capacidad de un anticuerpo para fijar el complemento y participar en CDC. De esta manera, generalmente se selecciona el isotipo de anticuerpo para proveer o no la capacidad de fijación de complemento. En el caso de la presente invención, como se mencionó arriba, generalmente es preferible no utilizar un anticuerpo que destruya las células. Existen varios isotipos de anticuerpo que son capaces de fijación de complemento y CDC, que incluyen sin limitación los siguientes: IgM murina, lgG2a murina, lgG2b murina, lgG3 murina, IgM humana, lgG1 humana, e lgG3 humana. En contraste, los isotipos preferidos que no son capaces de fijación de complemento ni CDC incluyen, sin limitación, lgG2 humana e lgG4 humana. Además de las diferencias de secuencia de la cadena pesada, los anticuerpos IgG difieren dentro de su subclase en función del número de enlaces disulfuro y la longitud de la región de gozne. Por ejemplo, la subclase lgG2 tiene varias diferencias con respecto a otras subclases. Se sabe que las subclases lgG2 e lgG4 tienen 4 enlaces disulfuro dentro de su región de gozne, mientras que lgG1 tiene 2 e lgG3 tiene 1 1 enlaces disulfuro Otras diferencias de los anticuerpos lgG2 incluyen su capacidad reducida de atravesar la placenta y la incapacidad de los anticuerpos lgG2 para unirse a receptores de los linfocitos Fe De esta manera, en algunas modalidades, el anticuerpo ant?-CTLA-4 es la subclase lgG2 o lgG4 En otra modalidad preferida, el anticuerpo ant?-CTLA-4 es la subclase lgG2 En otras modalidades, los anticuerpos ant?-CTLA-4 se pueden elegir basándose en las diferencias de las secuencias de aminoácidos de sus cadenas pesadas Por ejemplo, los anticuerpos ant?-CTLA-4 de la presente invención pueden tener cadenas pesadas humanas de tipo gamma que utilizan cualquiera de los genes humanos de la línea germinal de VH VH1 , VH2, VH3, VH4, o VH5 En algunas modalidades, los anticuerpos ant?-CTLA-4 utilizan el gen humano de la línea germinal de VH3 En modalidades adicionales, los anticuerpos ant?-CTLA-4 utilizan el gen humano de la línea germinal de VH3 y la región variable de la cadena pesada de DP-50 o DP-46 humana, y en otras modalidades, los anticuerpos ant?-CTLA-4 utilizan la región variable de la cadena pesada de DP-50 humana El gen de DP-50 es referido también como un gen de la familia VH 3-33 El gen de DP-46 también es referido como un gen de la familia VH 3-30 3 En modalidades adicionales, los anticuerpos ant?-CTLA-4 utilizan un gen DH humano que se selecciona de D1 -26, DIR4 y DIR3, y en otras modalidades, los anticuerpos ant?-CTLA-4 utilizan un gen DH humano D1 -26 En otras modalidades, los anticuerpos anti-CTLA-4 utilizan un gen J humano que se selecciona de JH4 y JH6, y en otras modalidades, los anticuerpos ant?-CTLA-4 utilizan el gen JH humano JH6 En modalidades adicionales, los anticuerpos ant?-CTLA-4 se pueden elegir basándose en las diferencias de las secuencias de aminoácidos de sus cadenas ligeras Por ejemplo, los anticuerpos ant?-CTLA-4 adecuados pueden tener cadenas ligeras lambda o cadenas ligeras kappa. Sin embargo, en algunas modalidades, los anticuerpos ant?-CTLA-4 de la presente invención tienen cadenas ligeras kappa En algunas modalidades en donde el anticuerpo ant?-CTLA-4 comprende una cadena ligera kappa, el polinucleótido que codifica el dominio variable de la cadena ligera comprende un gen V? numai iu D, K \ , ?_¿, D O, I O , ? I?/ I , y un yci i J K I , J K.Z , JKo, JKt O JK.0 humano En algunas modalidades en donde el anticuerpo comprende una cadena ligera kappa, el dominio variable de la cadena ligera (VL) es codificado en parte por un gen V?012 o VKA27 humano, y un gen J?3 o J?4 humano En modalidades particulares de la invención, el dominio variable de la cadena ligera es codificado por genes V? 012/J?3 humanos. Además, el anticuerpo puede comprender una secuencia de aminoácidos que comprende secuencias de aminoácidos CDR humanas derivadas del gen VH 3-30 o 3-33, o sustituciones conservativas o mutaciones somáticas del mismo Se entiende que el gen VH 3-33 codifica de FR1 a FR3 de la región variable de la cadena pesada de una molécula de anticuerpo Así, la invención abarca un anticuerpo que comparte por lo menos 85%, de preferencia por lo menos 90%, de preferencia por lo menos 91 %, muy de preferencia por lo menos 94%, de preferencia por lo menos 95%, de preferencia por lo menos 97%, muy de preferencia por lo menos 98%, de preferencia por lo menos 99%, y muy preferiblemente 100% de identidad, con la secuencia de FR1 a FR3 del anticuerpo ticilimumab. Además, el anticuerpo puede comprender regiones CDR en su cadena ligera derivadas del gen A27 u 012, o puede comprender las regiones CDR del anticuerpo ticilimumab. En otras modalidades de la invención, el anticuerpo inhibe la unión entre CTLA4 y B7-1 , B7-2, o ambos. Preferiblemente, el anticuerpo puede inhibir la unión con B7-1 con una Cl50 de aproximadamente 100 nM o menor, de preferencia aproximadamente 10 nM o menor, por ejemplo aproximadamente 5 nM o menor, de preferencia aproximadamente 2 nM o menor, o muy de preferencia, por ejemplo, aproximadamente 1 nM o menor. Similarmente, el anticuerpo puede inhibir la unión con B7-2 con una Cl50 de aproximadamente 100 nM o menor, de preferencia 10 nM o menor, por ejemplo, muy de preferencia, aproximadamente 5 nM o menor, de preferencia aproximadamente 2 nM o menor, o muy de preferencia aproximadamente 1 nM o menor. Además, en otra modalidad, el anticuerpo anti-CTLA-4 tiene una afinidad de unión por CTLA-4 de aproximadamente 10"8 o mayor, de preferencia aproximadamente 10~9 o mayor, de preferencia aproximadamente 10"10 o mayor, y muy de preferencia aproximadamente 10"11 o mayor. El anticuerpo anti-CTLA-4 incluye un anticuerpo que compite por la unión con un anticuerpo que tiene las secuencias de aminoácidos de la cadena pesada y ligera del anticuerpo ticilimumab. Además, el anticuerpo anti-CTLA-4 puede competir por la unión con el anticuerpo ipilimumab. En otra modalidad, preferiblemente el anticuerpo compite cruzadamente con un anticuerpo que tiene una secuencia de cadena pesada y ligera, una secuencia variable de cadena pesada y una secuencia variable de cadena ligera, y/o las secuencias de CDR pesadas y ligeras, del anticuerpo ticilimumab. Por ejemplo, el anticuerpo se puede unir al epítope al que se une un anticuerpo que tiene secuencias de aminoácidos de cadena pesada y ligera, secuencias variables y/o secuencias de CDR, del anticuerpo ticilimumab. En otra modalidad, el anticuerpo compite cruzadamente con un anticuerpo que tiene secuencias de cadena pesada y ligera, o secuencias de unión de antígeno, de MDX-D010. En otra modalidad, la invención se practica usando un anticuerpo anti-CTLA-4 que comprende una cadena pesada que comprende las secuencias de aminoácidos de CDR-1 , CDR-2, y CDR-3, y una cadena ligera que comprende las secuencias de aminoácidos de CDR-1 , CDR-2, y CDR-3, de un anticuerpo ticilimumab, o secuencias que tienen cambios de las secuencias de CDR seleccionados del grupo que consiste en cambios conservativos, en donde los cambios conservativos se seleccionan del grupo que consiste en reemplazo de residuos no polares con otros residuos no polares, reemplazo de residuos polares cargados con otros residuos polares no cargados, reemplazo de residuos polares cargados con otros residuos polares cargados, y sustitución de residuos estructuralmente similares; sustituciones no conservativas, en donde las sustituciones no conservativas se seleccionan del grupo que consiste en la sustitución de residuos polares cargados con residuos polares no cargados y la sustitución de residuos no polares con residuos polares, adiciones y supresiones. En una modalidad adicional de la invención, el anticuerpo contiene menos de 10, 7, 5, o 3 cambios de aminoácido de la secuencia de la línea germinal en las regiones de armazón o CDR. En otra modalidad, el anticuerpo contiene menos de 5 cambios de aminoácidos en las regiones de armazón y menos de 10 cambios en las regiones CDR. En una modalidad preferida, el anticuerpo contiene menos de 3 cambios de aminoácido en ¡as regiones de armazón y menos de 7 cambios en las regiones CDR. En una modalidad preferida, los cambios en las regiones de armazón son conservativos y los de las regiones CDR son mutaciones somáticas. Muy preferiblemente, el anticuerpo comparte 100% de identidad de secuencia o similitud de secuencia sobre la cadena pesada y la cadena ligera, o con la cadena pesada o la cadena ligera, separadamente, de un anticuerpo ticilimumab. En otra modalidad, el anticuerpo comparte por lo menos 80%, de preferencia por lo menos 85%, muy de preferencia por lo menos 90%, de preferencia por lo menos 94%, de preferencia por lo menos 95%, muy de preferencia por lo menos 99% de identidad de secuencia o similitud de secuencia sobre las secuencias de longitud completa de la cadena pesada y ligera, o sobre la cadena pesada o ligera, separadamente, con las secuencias de la línea germinal de V? A27, la línea germinal de V? 012, y la línea germinal de DP50 (que es un alelo del locus del gen VH 3-33). De preferencia, el anticuerpo comparte 100% de identidad de secuencia o similitud de secuencia sobre la secuencia de cadena pesada de la línea germinal de DP50 y/o con la secuencia de cadena ligera de la línea germinal de A27, o la línea germinal de 012 En una modalidad, el anticuerpo comparte por lo menos 80%, de preferencia por lo menos 85%, muy de preferencia por lo menos 90%, de preferencia por lo menos 94%, de preferencia por lo menos 95%, de preferencia por lo menos 99% de identidad o similitud de secuencia (por ejemplo, de aminoácidos, ácidos nucleicos, o ambos) sobre las secuencias de la región variable de la cadena pesada y ligera, o sobre la secuencia de la región variable de la cadena pesada o ligera, separadamente, con las secuencias del anticuerpo 311, 411, 481, 4.10.2, 4.131, 4.14.3, 611, ticilimumab, 11.61, 1171, 12311. 12.9.1.1, ipilimumab. Muy de preferencia, el anticuerpo comparte 100% de identidad de secuencia o similitud de secuencia sobre las secuencias de la región variable de la cadena pesada y la cadena ligera, o con la secuencia de la cadena pesada o la cadena ligera, separadamente, de un anticuerpo seleccionado del anticuerpo 31.1, 4.1.1, 48.1, 410.2, 4131, 4.14.3, 6.1.1, ticilimumab, 11.61, 11.7.1, 12.3.1.1, 12911, ipilimumab En otra modalidad, el anticuerpo comparte por lo menos 80%, de preferencia por lo menos 85%, muy de preferencia por lo menos 90%, de preferencia por lo menos 94%, de preferencia por lo menos 95%, muy de preferencia por lo menos 99% de identidad de secuencia o similitud de secuencia sobre la secuencia de la región variable de la cadena pesada, con la secuencia variable de la cadena pesada de la línea germinal pesada de 5 DP50 (que es un alelo del locus del gen VH 3-33), o con la secuencia variable de la cadena ligera de la línea germinal de V? A27, o la línea germinal de V? 012. Muy de preferencia, la secuencia de la cadena pesada del anticuerpo comparte 100% de identidad de secuencia o similitud de secuencia con la secuencia de la línea germinal DP50, o con la secuencia de la cadena ligera ? ? ue ta iined yei i i nuai ue t ¿. ? u la m ica yei u iipai ue ? __. En una modalidad de la presente invención, el anticuerpo comparte por lo menos 80%, de preferencia por lo menos 85%, muy de preferencia por lo menos 90%, de preferencia por lo menos 95%, de preferencia por lo menos 99% de identidad de secuencia o similitud de 15 secuencia con las secuencias de la cadena pesada, la cadena ligera, o ambas, de FR1 a FR4, con las secuencias de las regiones FR1 a FR4 del anticuerpo ticilímumab. Muy de preferencia, el anticuerpo comparte 100% de identidad de secuencia o similitud de secuencia sobre las secuencias pesada, ligera, o ambas, de FR1 a FR4 con el anticuerpo ticilimumab. 0 En otra modalidad de la presente invención, el anticuerpo comparte por lo menos 80%, de preferencia por lo menos 85%, muy de preferencia por lo menos 90%, de preferencia por lo menos 95%, de preferencia por lo menos 99%, y muy de preferencia aproximadamente 100%, de identidad de secuencia o similitud de secuencia con las secuencias de la cadena pesada de FR1 a FR3, con las secuencias de las regiones FR1 a FR3 de la linea germinal de DP50 En otra modalidad de la presente invención, el anticuerpo 5 comparte por lo menos 80%, de preferencia por lo menos 85%, muy de preferencia por lo menos 90%, de preferencia por lo menos 95%, de preferencia por lo menos 99%, y muy de preferencia aproximadamente 100% de identidad de secuencia o similitud de secuencia con las secuencias de cadena ligera de FR1 a FR4, con las secuencias de las regiones FR1 a FR4 ? ? ue la ni ica gei mipai uc V ? I?¿. I , ? la m ica ger minal ae v? U i ? En una modalidad de la presente invención, el anticuerpo comparte por lo menos 80%, de preferencia por lo menos 85%, muy de preferencia por lo menos 90%, de preferencia por lo menos 95%, de preferencia por lo menos 99% de identidad de secuencia o similitud de 15 secuencia con las secuencias de CDR-1 , CDR-2 y CDR-3 de la cadena pesada, la cadena ligera, o ambas, del anticuerpo ticilimumab Muy de preferencia, el anticuerpo comparte 100% de identidad de secuencia o similitud de secuencia sobre las secuencias de CDR-1 , CDR-2 y CDR-3 de cadena pesada, ligera, o ambas, con el anticuerpo ticilimumab 0 En otra modalidad de la presente invención, el anticuerpo comparte por lo menos 80%, de preferencia por lo menos 85%, muy de preferencia por lo menos 90%, de preferencia por lo menos 95%, de preferencia por lo menos 99%, y muy de preferencia aproximadamente 100% de identidad de secuencia o similitud de secuencia con las secuencias de CDR-1 y CDR-2 de cadena pesada, con las secuencias de CDR-1 y CDR-2 de la línea germinal de DP50. En otra modalidad de la presente invención, el anticuerpo 5 comparte por lo menos 80%, de preferencia por lo menos 85%, muy de preferencia por lo menos 90%, de preferencia por lo menos 95%, de preferencia por lo menos 99%, y muy de preferencia aproximadamente 100% de identidad de secuencia o similitud de secuencia con las secuencias de CDR-1 , CDR-2 y CDR-3 de cadena ligera, con las secuencias de CDR-1 , I U ?uK-¿ y i , u ?a linea germinal Uc v? U l ¿. En una modalidad, el anticuerpo anti-CTLA-4 es el anticuerpo conocido como tícilimumab. El cuadro 1 muestra la derivación de genes humanos de la línea germinal de la cadena pesada y ligera para el anticuerpo monoclonal anti-15 CTLA-4 11.2.1 (es decir, ticilimumab).

CUADRO 1 Algunos de los anticuerpos anti-CTLA-4 de acuerdo con la presente invención se generaron con una desviación hacia la utilización de la región variable de la cadena pesada de DP-50. El gen DP-50 también es referido como un gen de ia familia VH 3-33. En ratones XenoMouse™ hay más de 30 genes variables funcionales distintos de cadena pesada con los cuales generar anticuerpos. Por lo tanto, la desviación es indicativa de un motivo de unión preferido de la interacción anticuerpo-antígeno con respecto a las propiedades combinadas de la unión al antígeno y la actividad funcional. En algunas modalidades, el anticuerpo es un anticuerpo de una sola cadena (scFv) en la que unos dominios VL y VH se aparean para formar moléculas monovalentes por medio de un enlazador sintético, que permite hacerlo como una sola cadena de proteína: Bird y otros, Science 242:423-426 ( 1988) y Huston y otros, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 85:5879-5883 (1988). En algunas modalidades, los anticuerpos son dianticuerpos, es decir, son anticuerpos divalentes en los que los dominios VH y VL son expresados en una sola cadena de polipéptido, pero usando un enlazador que es demasiado corto para permitir un apareamiento entre los dos dominios en la misma cadena, forzando asi a los dominios a aparearse con dominios complementarios de otra cadena y crear dos sitios de unión de antígeno Véase, por ejemplo, Holhger P y otros, Proc Nati Acad Sci USA 90 6444-6448 (1993), y Poljak R J y otros, Structure 2 1 121 -1 123 (1994) En algunas modalidades, una o más CDRs de un anticuerpo de la invención se pueden incorporar en una molécula, covalentemente o no covalentemente, para hacerlo una inmunoadhesina que se une específicamente a CTLA-4 En dichas modalidades, las CDR(s) se pueden incorporar como parte de una cadena de polipéptido mas grande, se pueden unir covalentemente a otra cadena de polipéptido, o se pueden incorporar de modo no covalente En otra modalidad, el anticuerpo ant?-CTLA-4 tiene una selectividad (o especificidad) por el CTLA-4 que es por lo menos 100 veces mayor que su selectividad por cualquier otro polipéptido En algunas modalidades, el anticuerpo ant?-CTLA-4 no exhibe unión específica apreciable a ninguna otra proteína que no sea CTLA-4 La selectividad del anticuerpo ant?-CTLA-4 para CTLA-4 se puede determinar usando métodos muy conocidos, siguiendo las enseñanzas de la especificación Por ejemplo, la selectividad se puede determinar usando Western blot, FACS, ELISA o RÍA. De esta manera, en algunas modalidades, el anticuerpo monoclonal anti-CTLA-4 es capaz de unirse específicamente a CTLA-4 En algunas modalidades no está presente la lisina C-terminal de la cadena pesada del anticuerpo ant?-CTLA-4 de la invención En algunas modalidades no esta presente la lisina C-terminal de la cadena pesada del anticuerpo anti-CTLA-4 de la invención. En algunos aspectos de la presente invención, el anticuerpo anti-CTLA-4 normalmente no comprende un polipéptido de señal porque el polipéptido de señal generalmente es eliminado durante las modificaciones posteriores a la traducción. En varias modalidades de la invención, la cadena pesada, o la cadena ligera, o ambas, de los anticuerpos anti-CTLA-4, incluyen una secuencia de señal (o una porción de la secuencia de señal). En otras modalidades de la invención, ni la cadena pesada ni la cadena ligera de los anticuerpos anti-CTLA-4 incluyen una secuencia de señal. I U El cuadro 2 indica los identificadores de secuencia (SEQ ID Nos) de los ácidos nucleicos que codifican la región variable de las cadenas pesada y ligera, y las secuencias de aminoácidos predichas correspondientes para el anticuerpo monoclonal anti-CTLA-4 1 1.2.1. 15 CUADRO 2 0 En algunas modalidades, la molécula de ácido nucleico comprende una secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos de VL del anticuerpo monoclonal 1 1 .2.1 (SEQ ID NO: 4), o una porción de la misma. En algunas modalidades, dicha porción comprende por lo menos la región CDR2. En algunas modalidades, el ácido nucleico codifica la secuencia de aminoácidos de las CDRs de cadena ligera de dicho anticuerpo. En algunas modalidades, dicha porción es una porción contigua que comprende CDR1 -CDR3. En algunos aspectos, la secuencia de aminoácidos de la CDR1 de cadena ligera es indicada por la SEQ ID NO: 10, la secuencia de aminoácidos de la CDR2 de cadena ligera es indicada por la SEQ ID NO: 1 1 , y la secuencia de aminoácidos de la CDR3 de cadena ligera es indicada por ¡a SEQ ID NO: 12. En otras modalidades, la molécula de ácido nucleico codifica una secuencia de aminoácidos de V que es por lo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, o 99% idéntica a una secuencia de aminoácidos de VL de la SEQ ID NO: 4. En otras modalidades, la molécula de ácido nucleico comprende una secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos de cadena ligera de la SEQ ID NO: 4, o una porción de la misma. Las moléculas de ácido nucleico de la invención incluyen ácidos nucleicos que hibridan bajo condiciones muy severas, como las que aquí se describen, con una secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de aminoácidos de cadena ligera de la SEQ ID NO: 4. En modalidades adicionales, la molécula de ácido nucleico comprende una secuencia de nucleótídos que codifica por lo menos una porción de la secuencia de aminoácidos de VH de 1 1 .2.1 (SEQ ID NO: 2), o dicha secuencia tiene mutaciones de aminoácidos conservativas y/o un total de tres o menos sustituciones de aminoácido no conservativas En varias modalidades la secuencia codifica una o más regiones CDR, preferiblemente una región CDR3, las tres regiones CDR, una porción contigua que incluye 5 CDR1 -CDR3, o toda la región VH En algunos aspectos, la secuencia de aminoácidos de la CDR1 de cadena pesada es indicada por la SEQ ID NO 7, la secuencia de aminoácidos de la CDR2 de cadena pesada es indicada por la SEQ ID NO 8, y la secuencia de aminoácidos de la CDR3 de cadena pesada es indicada por la SEQ ID NO 9 i O En algunas modalidades, ¡a moiécuia de ácido nucleico codifica una secuencia de aminoácidos de VH que es por lo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, o 99% idéntica a la secuencia de aminoácidos de VH de la SEQ ID NO 2 En modalidades adicionales, la molécula de ácido nucleico comprende una secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia 15 de aminoácidos de cadena pesada de la SEQ ID NO 2, o una porción de la misma Las moléculas de ácido nucleico de la invención incluyen ácidos nucleicos que hibridan bajo condiciones muy severas, como las que se describen arriba, con una secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos de cadena pesada de la SEQ ID NO 2 0 En algunos aspectos, la presente invención provee una composición farmacéutica líquida que comprende por lo menos un anticuerpo humano aislado que se une al CTLA-4, en donde el anticuerpo comprende una secuencia de aminoácidos de VH que utiliza un gen de línea germinal de VH 3-33 humano; y un excipiente farmacéuticamente aceptable que comprende un agente quelante. En otros aspectos, la presente invención provee una composición farmacéutica líquida que comprende por lo menos un anticuerpo humano aislado que se une al CTLA-4, en donde el anticuerpo comprende una secuencia de aminoácidos de cadena pesada que tiene por lo menos 90% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 2, y una secuencia de aminoácidos de cadena ligera que tiene por lo menos 90% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 4. En otros aspectos, la presente invención provee una composición farmacéutica líquida que comprende por lo menos un anticuerpo humano aislado que se une al CTLA-4, en donde el anticuerpo comprende una secuencia de aminoácidos de cadena pesada que tiene por lo menos 95% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 2, y una secuencia de aminoácidos de cadena ligera que tiene por lo menos 95% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 4. En otros aspectos, la presente invención provee una composición farmacéutica líquida que comprende por lo menos un anticuerpo humano aislado que se une al CTLA-4, en donde el anticuerpo comprende una secuencia de aminoácidos de cadena pesada que tiene por lo menos 99% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 2, y una secuencia de aminoácidos de cadena ligera que tiene por lo menos 99% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 4.

En otros aspectos, el anticuerpo comprende una secuencia de aminoácidos de cadena pesada que comprende la región variable de la SEQ ID NO 2, y una secuencia de aminoácidos de cadena ligera que comprende la región variable de la SEQ ID NO 4 En aspectos adicionales, el anticuerpo comprende una secuencia de aminoácidos de cadena pesada que comprende la SEQ ID NO 5, y una secuencia de aminoácidos de cadena ligera que comprende la SEQ ID NO 6 En aspectos adicionales, el anticuerpo comprende una secuencia de aminoácidos de cadena pesada que comprende la SEQ ID NO 2 y una secuencia de aminoácidos de cadena ligera que comprende la SEQ ID NO 4 En otros aspectos, el anticuerpo comprende una secuencia de aminoácidos de VH que comprende secuencias FR1 , FR2 y FR3 humanas que utilizan una familia de genes VH 3-33 humanos enlazados operativamente en marco con una secuencia de CDR1 , CDR2 y CDR3 En una modalidad, el anticuerpo ant?-CTLA-4 es ticihmumab (conocido también como CP-675,206), que tiene las secuencias de aminoácidos de la cadena pesada y ligera del anticuerpo ticilimumab En una modalidad de la presente invención, los anticuerpos anti-CTLA-4 se unen específicamente a un epítope conformacional en el CTLA-4 humano En otras modalidades, los anticuerpos ant?-CTLA-4 inhiben el crecimiento de tumor humano después de su administración a un sujeto Preparación de las formulaciones de anticuerpo monoclonal anti-CTLA-4: Normalmente el anticuerpo anti-CTLA-4 se formula como una composición farmacéutica para su administración parenteral a un sujeto. En una modalidad, la composición farmacéutica es una composición líquida. En otra modalidad, la composición farmacéutica es una composición líquida. Las composiciones de la presente invención incluyen uno o más anticuerpos monoclonales anti-CTLA-4 de la invención en combinación con excipientes farmacéuticamente aceptables que comprenden histidina y/o un agente quelante. Las formulaciones líquidas de ¡a presente invención ¡nciuyen uno o más anticuerpos monoclonales anti-CTLA-4 de la invención en combinación con excipientes farmacéuticamente aceptables que comprenden histidina y/o un agente quelante. El término "composición farmacéutica" se refiere a las preparaciones que están en una forma adecuada para permitir la actividad biológica eficaz de los ingredientes activos. Los "excipientes (vehículos, aditivos) farmacéuticamente aceptables" son aquellos que se pueden administrar racionalmente (es decir, de forma segura) a un sujeto para proveer una dosis efectiva del ingrediente activo empleado. El término "excipiente" o "vehículo" como se usa en la presente se refiere a una sustancia inerte que es usada comúnmente como díluente, vehículo, conservador, aglutinante o agente de estabilización para fármacos. Como se usa aquí, el término "diluente" se refiere a un disolvente farmacéuticamente aceptable (seguro e inocuo para su administración a un humano), y que es útil para la preparación de las formulaciones líquidas de la presente. Los diluentes ejemplares incluyen, sin limitación, agua estéril y agua bacteriostática para inyección (BWFI). En otra modalidad, la invención está dirigida a una composición que comprende un anticuerpo antí-CTLA-4 y un agente quelante farmacéuticamente aceptable. En otra modalidad, la invención está dirigida a una composición farmacéutica líquida que comprende un anticuerpo anti-CTLA-4 y EDTA. En otra modalidad, la invención está dirigida a una composición que comprende un anticuerpo apti-CTLA4 y DTPA. En otra modalidad, la invención está dirigida a una composición que comprende un anticuerpo anti-CTLA-4, un agente quelante farmacéuticamente aceptable, y un amortiguador farmacéuticamente aceptable. En otra modalidad, la invención está dirigida a una composición que comprende un anticuerpo anti-CTLA-4, un agente quelante farmacéuticamente aceptable, e hístídina. En otra modalidad, la invención está dirigida a una composición que comprende un anticuerpo anti-CTLA-4, EDTA, e histidina. En otra modalidad, la invención está dirigida a una composición que comprende un anticuerpo anti-CTLA4, DTPA, e histidina. En otra modalidad, la invención está dirigida a una composición que comprende un anticuerpo anti-CTLA-4, un agente quelante farmacéuticamente aceptable, y un agente de tonicidad farmacéuticamente aceptable. En otra modalidad, la invención está dirigida a una composición que comprende un anticuerpo ant?-CFLA-4, un agente quelante farmacéuticamente aceptable, y trehalosa En otra modalidad, la invención está dirigida a una composición que comprende un anticuerpo ant?-CTLA-4, EDTA, y trehalosa En otra modalidad, la invención está dirigida a una composición que comprende un anticuerpo ant?-CTLA-4, DTPA, y trehalosa En otra modalidad, la invención está dirigida a una composición que comprende un anticuerpo ant?-CTLA-4, un agente quelante farmacéuticamente aceptable, y un agente tensioactivo farmacéuticamente aceptable En otra modalidad, la invención está dirigida a una composición que comprende un anticuerpo ant?-CTLA-4, EDTA, y un agente tensioactivo farmacéuticamente aceptable En otra modalidad, la invención está dirigida a una composición que comprende un anticuerpo ant?-CTLA-4, DTPA, y un agente tensioactivo farmacéuticamente aceptable En otra modalidad, la invención esta dirigida a una composición que comprende un anticuerpo anti-CTLA-4, un agente quelante farmacéuticamente aceptable seleccionado del grupo que consiste en EDTA y DTPA, y pohsorbato 80 En otra modalidad, la invención está dirigida a una composición que comprende anticuerpo ant?-CTLA-4, un amortiguador farmacéuticamente aceptable, y un agente tensioactivo farmacéuticamente aceptable En otra modalidad, la invención esta diugida a una composición que comprende un anticuerpo ant?-CTLA-4, histidina, y un agente tensioactivo farmacéuticamente aceptable En otra modalidad, la invención está dirigida a una composición que comprende un anticuerpo ant?-CTLA-4, histidina, y polisorbato 80 En otra modalidad, la invención está dirigida a una composición que comprende un anticuerpo anti-CTLA-4, un agente quelante farmacéuticamente aceptable, un amortiguador farmacéuticamente aceptable, y un agente tensioactivo farmacéuticamente aceptable. En otra modalidad, la invención está dirigida a una composición que comprende un anticuerpo anti-CTLA-4, un agente quelante farmacéuticamente aceptable, un amortiguador farmacéuticamente aceptable, y un agente de tonicidad farmacéuticamente aceptable. En otra modalidad, la invención está dirigida a una composición que comprende un anticuerpo anti-CTLA-4, un agente queíante farmacéuticamente aceptable, un amortiguador farmacéuticamente aceptable, un agente tensioactivo farmacéuticamente aceptable, y un agente de tonicidad farmacéuticamente aceptable. En otra modalidad, la invención está dirigida a una composición que comprende un anticuerpo anti-CTLA-4 e histidina. El anticuerpo anti-CTLA-4 presente en la composición puede ser como se describió anteriormente en esta solicitud. En una modalidad, la composición comprende un anticuerpo anti-CTLA-4 que comprende una secuencia de aminoácidos de VL que es 90%, 95%, o 99% idéntica a una secuencia de aminoácidos de VL que se muestra en la SEQ ID NO: 4, y además comprende una secuencia de aminoácidos de VH que es 90%, 95%, o 99% idéntica a una secuencia de aminoácidos de VH que se muestra en la SEQ ID NO: 2. En otra modalidad, la composición comprende un anticuerpo anti-CTLA-4 que es un anticuerpo monoclonal anti-CTLA-4 11.2.1. El anticuerpo ant?-CTLA-4 presente en las composiciones farmacéuticas líquidas puede ser como se describió anteriormente en esta solicitud. En una modalidad, las composiciones farmacéuticas líquidas comprenden un anticuerpo anti-CTLA-4 que comprende una secuencia de aminoácidos de V que es 90%, 95%, o 99% idéntica a una secuencia de aminoácidos de VL que se muestra en la SEQ ID NO: 4, y comprende además una secuencia de aminoácidos de VH que es 90%, 95%, o 99% idéntica a una secuencia de aminoácidos de VH que se muestra en la SEQ ID NO: 2. En otra modalidad, la composición farmacéutica líquida comprende un anticuerpo anti-CTLA-4 que es un anticuerpo monoclonal anti-CTLA-4 11.2.1. Generalmente, la concentración del anticuerpo anti-CTLA-4 en las composiciones farmacéuticas líquidas de la presente invención es de por lo menos aproximadamente 0.1 miligramos por mililitro (mg/ml) o mayor, por lo menos aproximadamente 1.0 mg/ml o mayor, por lo menos aproximadamente 10 mg/ml o mayor, por lo menos aproximadamente 50 mg/ml o mayor, por lo menos aproximadamente 100 mg/ml o mayor, o por lo menos aproximadamente 200 mg/ml o mayor. En algunas modalidades, la concentración del anticuerpo anti-CTLA-4 generalmente varía de aproximadamente 0.1 mg/ml a aproximadamente 200 mg/ml, de aproximadamente 0.5 mg/ml a aproximadamente 100 mg/ml, de aproximadamente 1 mg/ml a aproximadamente 70 mg/ml, de aproximadamente 2.0 mg/ml a aproximadamente 65 mg/ml, de aproximadamente 5.0 mg/ml a aproximadamente 50 mg/ml, de aproximadamente 10 mg/ml a aproximadamente 35 mg/ml, de aproximadamente 15 mg/ml a aproximadamente 25 mg/ml, o es de aproximadamente 20 mg/ml. En una modalidad, la concentración del anticuerpo anti-CTLA-4 en la composición farmacéutica líquida varía de aproximadamente 50 mg/ml a aproximadamente 100 mg/ml. En algunas modalidades, cuando la composición se destina a suministro subcutáneo, se pueden usar concentraciones de anticuerpo más altas. Como se usa aquí, el término "agente quelante" se refiere en general a un excipiente que puede formar por io menos un enlace (por ejemplo covalente, iónico u otro) con un ¡on de metal. Normalmente un agente quelante es un ligando multidentado que se puede usar en composiciones líquidas seleccionadas como un estabilizador, para formar un complejo con las especies que podrían promover la inestabilidad. Muchas veces los compuestos que actúan como agentes quelantes tienen grupos funcionales ricos en electrones. Los grupos funcionales ricos en electrones que son adecuados incluyen grupos de ácido carboxílico, grupos hídroxí y grupos amino. La disposición de estos grupos en ácidos aminopolicarboxílicos, ácidos hidroxipolicarboxílícos, ácidos hidroxiaminocarboxílicos, y similares, resulta en porciones que tienen la capacidad de unirse a metales. Sin embargo, la presente invención no se limita a los agentes quelantes principalmente por la capacidad de estos para formar enlaces con un ion de metal. Por lo tanto, la presente invención no se limita a algún mecanismo específico mediante el cual actúa el agente quelante en las formulaciones de la presente invención, y los excipientes llamados aquí agentes quelantes pueden obtener sus propiedades mediante mecanismos que no están relacionados en absoluto con la capacidad del agente quelante para formar enlaces con un ion de metal. Los agentes quelantes que son adecuados para usar en la presente invención incluyen, sin limitación, ácidos aminopolicarboxílicos, ácidos hidroxiaminocarboxílicos, glicinas N-sustituidas, ácido 2-(2-amino-2-oxoct¡i)arninoetanosuifón¡co (BES), deferoxamina (DEF), ácido cítrico, niacinamida, y desoxicolatos. Los ejemplos de ácidos aminopolicarboxílicos incluyen ácido etilendiaminotetraacético (EDTA), ácido dietilentriamino-pentaacético 5 (DTPA), ácido nitrilotriacético (NTA), ácido N-2-acetamido-2-iminodiacético (ADA), éter bis(aminoetil)glícólico, ácido N,N',N'-tetraacético (EGTA), ácido trans-diaminociclohexanotetraacético (DCTA), ácido glutámico, y ácido aspártico. Los ejemplos de ácidos hidroxíaminocarboxílicos adecuados incluyen ácido N-hidroxietiliminodiacético (HIMDA), N,N-bis-hidroxietilglicina (bicina) y N-(trishidroximetilmetil)-10-glicína (tricina). Un ejemplo de una glicina N-sustituida adecuada es la glicilglicina. Un ejemplo de un desoxicolato adecuado es el desoxicolato de sodio. La presente invención también abarca mezclas de dos o más agentes quelantes. Los agentes quelantes usados en la invención pueden estar presentes, siempre que sea posible, como el ácido libre o la base libre del compuesto (por ejemplo, el referido aquí intercambiablemente como "EDTA" o "edetato"), o en una forma de sal correspondiente (por ejemplo la sal de adición de ácido o la sal de adición de base correspondiente, tal como el edetato de disodio). Las sales de adición de ácido adecuadas incluyen por ejemplo las sales de metal alcalino (por ejemplo sales de sodio o potasio), sales de metal alcalinotérreo (por ejemplo las sales de calcio); las sales se pueden preparar usando otros iones de metal enlazados débilmente. Como se sabe, la naturaleza de la sal y el número de cargas por neutralizar dependen del número de grupos carboxilo presentes y el pH al que se suministra el agente queianie estabilizador. Como también se sabe, ios agentes quelantes se enlazan a los iones objetivo particulares con fuerzas variables. A manera de ilustración, las sales adecuadas de EDTA incluyen edetato de dipotasio, edetato de disodio, edetato de disodio y calcio, edetato de sodio, edetato de trisodio y edetato de potasio; y una sal adecuada de deferoxamina (DEF) es el mesilato de deferoxamina (DFM). Los agentes quelantes usados en la invención pueden estar presentes en una forma anhidra, solvatada o hidratada del compuesto o sal correspondiente. Cuando el agente quelante está en forma solvatada o hidratada, puede estar presente en diversos estados de solvatación o hidratación (que incluyen por ejemplo las formas anhidras, hidratadas, dihídratadas y trihidratadas). A manera de ilustración, un hidrato adecuado del EDTA es el EDTA de disodio dihidratado; y las formas adecuadas de ácido cítrico incluyen ácido cítrico anhidro, ácido cítrico monohidratado, y citrato de trisodio dihidratado. Los agentes quelantes adecuados usados en las composiciones de anticuerpo de la presente invención también incluyen, por ejemplo, los que se unen a los iones de metal en solución para hacerlos incapaces de reaccionar con el 02 disponible, minimizando o previniendo así la generación de los radicales hidroxilo que están libres para reaccionar con el anticuerpo y degradarlo. Los agentes quelantes pueden disminuir la formación de las especies de oxígeno reducido, disminuir la formación de las especies acidas (por ejemplo por desamidación), disminuir la agregación del anticuerpo y/o disminuir la fragmentación del anticuerpo en las composiciones de ia presente invención. Estos agentes quelantes pueden disminuir o prevenir la degradación de un anticuerpo que está formulado sin la protección de un agente quelante. Cuando se menciona la concentración del agente quelante, se considera que la concentración mencionada representa la concentración molar de la forma de ácido libre o base libre del agente quelante. Por ejemplo, en algunas composiciones farmacéuticas líquidas la concentración del agente quelante generalmente varía de aproximadamente 0.01 micromolar a aproximadamente 50 milimolar, de aproximadamente 1 micromolar a aproximadamente 10.0 milimolar, de aproximadamente 15 micromolar a aproximadamente 5.0 milimolar, de aproximadamente 0.01 milimolar a aproximadamente 1.0 milimolar, o de aproximadamente 0.03 milimolar a aproximadamente 0.5 milimolar. En algunas modalidades, la concentración del agente quelante en la composición farmacéutica líquida puede ser aproximadamente 0 01 milimolar, 0 02 mihmolar, 0 027 milimolar, 0 03 mihmolar, aproximadamente 0 04 mihmolar, aproximadamente 0 05 milimolar, aproximadamente 0 06 milimolar, aproximadamente 0 07 milimolar, 5 aproximadamente 0 10 milimolar, aproximadamente 0 20 milimolar, aproximadamente 0 26 mi molar, aproximadamente 0 27 mihmolar, aproximadamente 0 30 milimolar, aproximadamente 0 31 milimolar, aproximadamente 0 34 milimolar, aproximadamente 0 40 mihmolar, aproximadamente 0 50 milimolar, o aproximadamente 1 0 milimolar En i O algunas modalidades, ia concentración del agente queiante es aproximadamente 0 027 milimolar, aproximadamente 0 05 mi molar, aproximadamente 0 13 milimolar, o aproximadamente 0 27 mihmolar En una modalidad, la concentración del agente quelante es aproximadamente 0 05 mi molar En otra modalidad, la concentración del agente quelante es 15 aproximadamente 0 13 milimolar A menos que se indique de otra manera, las concentraciones indicadas en la presente son las concentraciones a condiciones ambientales (es decir, a 25°C y presión atmosférica) Las escalas intermedias de las concentraciones anteriormente mencionadas de agente quelante también se 0 consideran parte de esta invención Por ejemplo, se consideran incluidas las escalas de valores que usan una combinación de cualquiera de los valores anteriormente mencionados como limite superior y/o inferior En una modalidad, el agente quelante se selecciona del grupo que consiste en EDTA, DTPA, DFM y mezclas de los mismos En otra modalidad, el agente quelante es DFM En otra modalidad, el agente quelante es EDTA En otra modalidad, el agente quelante es DTPA En otra modalidad, la composición farmacéutica liquida comprende EDTA en una cantidad que varia por lo general de aproximadamente 0 01 micromolar a aproximadamente 50 milimolar, de aproximadamente 1 micromolar a aproximadamente 20 0 milimolar, de aproximadamente 15 micromolar a aproximadamente 10 0 milimolar, de aproximadamente 0 01 milimolar a aproximadamente 5 0 milimolar, o de aproximadamente 0 03 milimolar a aprü?irnadarnepte 1 milimolar En algunas modalidades, la concentración de EDTA en la composición farmacéutica liquida puede ser aproximadamente 0 01 mihmolar, 0 02 milimolar, 0 027 milimolar, 0 03 milimolar, aproximadamente 0 04 mihmolar, aproximadamente 0 05 milimolar, aproximadamente 0 06 mihmolar, aproximadamente 0 07 milimolar, aproximadamente 0 10 milimolar, aproximadamente 0 20 milimolar, aproximadamente 0 26 milimolar, aproximadamente 0 27 milimolar, aproximadamente 0 30 milimolar, aproximadamente 0 31 milimolar, aproximadamente 0 34 milimolar, aproximadamente 0 40 milimolar, aproximadamente 0 50 mihmolar, o aproximadamente 1 0 milimolar En algunas modalidades, la concentración de EDTA es aproximadamente 0 027 milimolar, aproximadamente 0 05 milimolar, aproximadamente 0 13 milimolar, o aproximadamente 0 27 milimolar En una modalidad, la concentración de EDTA es aproximadamente 0 05 milimolar En otra modalidad, la concentración de EDTA es aproximadamente 0.13 milimolar. En otra modalidad, la composición farmacéutica líquida comprende EDTA en una cantidad de aproximadamente 0.27 milimolar. Como se indicó arriba, además de un agente quelante las composiciones de la presente invención pueden comprender opcionalmente un amortiguador farmacéuticamente aceptable. Como se usa aquí, el término "amortiguador" se refiere a una composición añadida que permite que una formulación líquida de anticuerpo resista los cambios de pH. En algunas modalidades, el amortiguador añadido permite que una formulación liquida de anticuerpo resista ios cambios de pH mediante la acción de sus componentes ácido-base conjugados. Por ejemplo, una formulación se puede hacer amortiguadora agregando L-histidina HCl (clorhidrato de L-histidina) y L-histidina en las cantidades apropiadas para llegar a un pH deseado. Sin embargo, en otras modalidades el amortiguador añadido permite que una formulación líquida de anticuerpo resista los cambios de pH mediante la acción de sus componentes ácido-base conjugados. Como un segundo ejemplo, una formulación se puede hacer amortiguadora añadiendo un ácido como ácido clorhídrico y L-histidina en las cantidades apropiadas para llegar a un pH deseado. Los ejemplos de amortiguadores adecuados incluyen, sin limitación, acetato (por ejemplo, acetato de sodio), succinato (por ejemplo, succinato de sodio), gluconato, citrato (por ejemplo, y otros amortiguadores ácidos orgánicos que incluyen, sin limitación, amortiguadores tales como aminoácidos (por ejemplo, histidina), ácido acético, ácido fosfórico y fosfatos, ascorbato, ácido tartárico, ácido maleico, glicina, lactato, ácido láctico, ácido ascórbico, imidazoles, ácido carbónico y bicarbonatos, ácido succínico, ácido benzoico y benzoatos, gluconato, edetato (EDTA), acetato, malato, ¡midazol, tris, fosfato, y mezclas de los mismos. En una modalidad, el amortiguador es acetato. En otra modalidad, el amortiguador es histidina. La histidina inicial usada para preparar las composiciones de la presente invención puede existir en diferentes formas. Por ejemplo, la histidina puede ser una forma enantiomérica (por ejemplo, el enantiórnero L o D) o racémica de ia histidina, una forma de ácido libre o base libre de la histidina, una forma de sal de la histidina (por ejemplo, una sal de monoclorhidrato, diclorhidrato, bromhidrato, sulfato, o acetato), una forma solvatada de la histídina, una forma hidratada de la histidina (por ejemplo, monohidrato), o una forma anhidra de la histidina. La pureza de la base y/o sal de histidina usada para preparar las composiciones, generalmente puede ser de por lo menos aproximadamente 98%, por lo menos aproximadamente 99%, o por lo menos aproximadamente 99.5%. Como se usa aquí, el término "pureza" en el contexto de la histidina se refiere a la pureza química de la histidina como se entiende en la técnica, por ejemplo, como se describe en el "The Merck Index", 13° ed., O'Neil y otros, ed. (Merck & Co., 2001 ). Cuando se hace referencia a una concentración de amortiguador, se entiende que la concentración mencionada representa la concentración molar de la forma de acido libre o base libre del amortiguador Por ejemplo, la concentración del amortiguador cuando está presente en algunas composiciones farmacéuticas líquidas, puede variar de aproximadamente 0 1 milimolar (mM) a aproximadamente 100 mM En una modalidad, la concentración del amortiguador es de aproximadamente 1 mM a aproximadamente 50 mM En otra modalidad, la concentración del amortiguador es de aproximadamente 5 mM a aproximadamente 30 mM. En vanas modalidades, la concentración del amortiguador es aproximadamente 1 mM, aproximadamente 5 mM, aproximadamente 10 mM, aproximadamente 15 mM, aproximadamente 20 mM, aproAimadamepte 25 mM, aproximadamente 30 mM, aproximadamente 35 mM, aproximadamente 40 mM, aproximadamente 45 mM, aproximadamente 50 mM, aproximadamente 55 M, aproximadamente 60 mM, aproximadamente 65 mM, aproximadamente 70 mM, aproximadamente 75 mM, aproximadamente 80 mM, aproximadamente 85 mM, aproximadamente 90 mM, aproximadamente 95 mM, o aproximadamente 100 mM En una modalidad, la concentración de histidma en la composición farmacéutica es aproximadamente 10 mM En otra modalidad, la composición farmacéutica contiene aproximadamente 10 mM de L-histidina (en forma de base) En otra modalidad, la concentración de histidma en la composición farmacéutica es aproximadamente 20 mM. En otra modalidad, la composición farmacéutica contiene aproximadamente 20 mM de L-histidina (en forma de base) Las escalas intermedias de las concentraciones de histidma anteriormente mencionadas también se consideran parte de esta invención. Por ejemplo, se consideran incluidas las escalas de valores que usan una combinación de cualquiera de los valores anteriormente mencionados como límite superior y/o inferior. En general, el amortiguador se usa para mantener un valor de pH aceptable (que puede afectar la estabilidad del anticuerpo) en la composición farmacéutica líquida. La composición farmacéutica líquida normalmente se hace amortiguadora para mantener un pH en la escala de aproximadamente 4 a aproximadamente 8; de aproximadamente 4.5 a aproximadamente 7; de aproximadamente 5.0 a 6.5, o de aproximadamente 5.3 a aproximadamente 6.3. Las escalas intermedias de los valores de pH anteriormente mencionados también se consideran parte de esta invención. Por ejemplo, se consideran incluidas las escalas de valores que usan una combinación de cualquiera de los valores anteriormente mencionados como límite superior y/o inferior. En una modalidad, la composición farmacéutica líquida se hace amortiguadora para mantener un pH de aproximadamente 5.5. En otra modalidad, la composición farmacéutica líquida se hace amortiguadora para mantener un pH de aproximadamente 6.0. Como se indicó arriba, además de un agente quelante, las composiciones de la presente invención también pueden comprender opcionalmente un agente de tonicidad farmacéuticamente aceptable. Como se usan aquí, los términos "agente de tonicidad" o "tonificante" se refieren a un excipiente que puede ajustar la presión osmótica de una formulación líquida de anticuerpo. En algunas modalidades, el agente de tonicidad puede ajustar la presión osmótica de una formulación líquida de anticuerpo a la isotonicidad, de tal manera que la formulación de anticuerpo sea fisiológicamente compatible con las células del tejido corporal del sujeto. En otras modalidades, el "agente de tonicidad" puede contribuir a mejorar la estabilidad de cualquiera de los anticuerpos anti-CTLA-4 aquí descritos. Una formulación "isotónica" es aquella que tiene esencialmente la misma presión osmótica que la sangre humana. Generalmente las formulaciones isotónicas tienen una presión osmótica de aproximadamente 250 mOsm a 350 mOsm. El término "hipotónico" describe una formulación con una presión osmótica por debajo de la sangre humana. Correspondientemente, ei término "hipertónico" se usa para describir una formulación con una presión osmótica por arriba de la sangre humana. La isotonicidad se puede medir usando un osmómetro de presión de vapor o de tipo de congelación de hielo, por ejemplo. El agente de tonicidad usado para preparar las composiciones de la presente invención puede existir en diferentes formas. Cuando se hace referencia al agente de tonicidad, se entiende que todas las formas están incluidas con el nombre del agente de tonicidad. Por ejemplo, el agente de tonicidad puede estar en forma enantiomérica (por ejemplo, enantiómero L o D), o racémica; isómeros tales como alfa o beta, incluyendo alfa, alfa; o beta, beta; o alfa, beta; o beta, alfa; una forma de ácido libre o base libre; una forma hidratada (por ejemplo, monohidrato), o una forma anhidra. En una modalidad, el agente de tonicidad es un sacando. Como se usa aquí, el término "sacárido" se refiere a una clase de moléculas que son derivados de alcoholes polihídricos Los sacáridos son referidos comúnmente como carbohidratos y pueden contener cantidades diferentes de unidades de azúcar (sacárido), por ejemplo monosacáridos, disacándos y pohsacáridos Los sacáridos que son adecuados para usarse como agente de tonicidad en la presente invención incluyen, sin limitación, los sacáridos seleccionados del grupo que consiste en fructosa, glucosa, mañosa, sorbosa, xilosa, lactosa, maltosa, sacarosa, dextrano, pululan, dextnna, ciclodextnnas, almidón soluble, hidroxietil almidón, glucanos solubles en agua, y mezclas de los mismos En otra modalidad, el agente de tonicidad es un pohol Como se usa aquí, el termino "polio!" se refiere a un excipiente con múltiples grupos hidroxilo, e incluye azúcares (azúcares reductores y no reductores), alcoholes de azúcar y ácidos de azúcar En una modalidad, el pohol tiene un peso molecular que es menor de aproximadamente 600 kD (por ejemplo, en la escala de aproximadamente 120 kD a aproximadamente 400 kD) Un "azúcar reductor" es aquel que contiene un grupo hemiacetal que puede reducir iones de metal o reaccionar covalentemente con la lisina y otros grupos amino de las proteínas, y un "azúcar no reductor" es el que no tiene estas propiedades de un azúcar reductor Los podóles adecuados para usar como agente de tonicidad en la presente invención incluyen, sin limitación, políoles seleccionados del grupo que consiste en manitol, trehalosa, sorbitol, entritol, isomalta, lactitol, maltitol, xihtol, g cerol, lactitol, propilenglicol, po etileng col, inositol, y mezclas de los mismos En una modalidad, el agente de tonicidad es un azúcar no reductor seleccionado del grupo que consiste en trehalosa, sacarosa, y mezclas de los mismos En una modalidad, el agente de tonicidad es el manitol En otra modalidad, el agente de tonicidad es el D-manitol En otra modalidad, el agente de tonicidad es la trehalosa En otra modalidad, el agente de tonicidad es a,a-trehalosa dihidratada En otra modalidad, el agente de tonicidad es la sacarosa En una modalidad, la concentración del agente de tonicidad en la composición farmacéutica líquida varía de aproximadamente 1 mi molar a aproximadamente 600 mihmolar, de aproximadamente 1 mihmolar a aproximadamente 400 mihmoiar, ae i minmoiar a aproximadamente 300 milimolar, o de 200 milimolar a aproximadamente 275 milimolar. En otra modalidad, el agente de tonicidad es manitol y está presente en la composición farmacéutica líquida a una concentración de aproximadamente 247 milimolar En otra modalidad, el agente de tonicidad es trehalosa y está presente en la composición farmacéutica líquida a una concentración de aproximadamente 222 milimolar En otra modalidad, el agente de tonicidad es trehalosa y está presente en la composición farmacéutica líquida a una concentración de aproximadamente 238 milimolar En otra modalidad, el agente de tonicidad es sacarosa y está presente en la composición farmacéutica líquida a una concentración de aproximadamente 263 mihmolar En una modalidad, la concentración del agente de tonicidad en la composición farmacéutica líquida varía de aproximadamente 1 mg/ml a aproximadamente 300 mg/ml, de aproximadamente 1 mg/ml a aproximadamente 200 mg/ml, o de aproximadamente 50 mg/ml a aproximadamente 150 mg/ml En otra modalidad, el agente de tonicidad es manitol y esta presente en la composición farmacéutica líquida a una concentración de aproximadamente 45 mg/ml milimolar En otra modalidad, el agente de tonicidad es trehalosa y está presente en la composición farmacéutica liquida a una concentración de aproximadamente 84 mg/ml En otra modalidad, el agente de tonicidad es trehalosa y está presente en la composición farmacéutica liquida a una concentración de aproximadamente 90 mg/ml En otra modalidad, el agente de tonicidad es sacarosa y está presente en la composición farmacéutica líquida a una concentración de aproximadamente 90 mg/ml En una modalidad, el agente de tonicidad es una sal, tal como cloruro de sodio En una modalidad, cuando el agente de tonicidad es una sal, la concentración de la sal en la composición farmacéutica líquida varía de aproximadamente 1 mg/ml a aproximadamente 20 mg/ml En otra modalidad, el agente de tonicidad es cloruro de sodio y la concentración del cloruro de sodio en la composición farmacéutica líquida es de aproximadamente 8 18 mg/ml Las escalas intermedias de las concentraciones de agente de tonicidad anteriormente mencionadas también se consideran parte de esta invención Por ejemplo, se consideran incluidas las escalas de valores que usan una combinación de cualquiera de los valores anteriormente mencionados como limite superior y/o inferior Las escalas intermedias de las concentraciones de agente de tonicidad anteriormente mencionadas también se consideran parte de esta invención Por ejemplo, se consideran incluidas las escalas de valores que usan una combinación de cualquiera de los valores anteriormente mencionados como límite superior y/o inferior Como se indico arriba, además de un agente quelante, las composiciones de la presente invención también pueden comprender opcionalmente un agente tensioactivo farmacéuticamente aceptable Como se usa aquí, el término "agente tensioactivo" se refiere a un excipiente que puede alterar la tensión superficial de una formulación líquida de anticuerpo En algunas modalidades, el agente tensioactivo reduce la tensión superficial de una formulación líquida de anticuerpo En otras modalidades, el "agente tensioactivo" puede contribuir a mejorar la estabilidad de cualquiera de los anticuerpos ant?-CTLA-4 aquí descritos Por ejemplo, el agente tensioactivo puede reducir la agregación del anticuerpo formulado y/o minimizar la formación de partículas en la formulación, y/o reducir la adsorción El agente tensioactivo también puede mejorar la estabilidad del anticuerpo durante y después de un ciclo de congelación/descongelación Los agentes tensioactivos adecuados incluyen tensioactivos de pohsorbato, poloxameros (por ejemplo, poloxámero 18 y 407), tensioactivos de tritón, tales como Tritón X-100®, tensioactivos de polisorbato como Tween 20® y Tween 80®, dodecilsulfato de sodio, launlsulfato de sodio, octilglicósido de sodio, launl-sulfobetaína, mipstil-sulfobetaína, linoleil-sulfobetaína, esteanl- sulfobetaína, launl-sarcosina, minstil-sarcosina, linoleil-sarcosina, esteanl-sarcosina, linoleil-betaína, minstil-betaína, cetil-betaina, lauroamidopropil-betama, cocamidopropil-betaina, linoleamidopropil-betaína, minstamidopropil-betaína, palmidopropil-betaína, isoestearamidopropil-betaína, minstamidopropil-dimetilamina, palmidopropil-dimetilamina, isoestearamidopropil-dimetilamina, metil-cocoil-taurato de sodio, metil-oleil-taurato de disodio, cloruro de dihidroxipropil PEG 5 hnolamonio, po etilenghcol, pohpropilenghcol, y mezclas de los mismos En una modalidad, el agente tensioactivo es un tensioactivo de poiisorbaío que comprende por lo menos un excipiente que se selecciona del grupo que consiste en polisorbato 20, polisorbato 21 , po sorbato 40, polisorbato 60, pohsorbato 61 , polisorbato 65, polisorbato 80, polisorbato 81 , polisorbato 85, y mezclas de los mismos En otra modalidad, la composición farmacéutica líquida comprende polisorbato 80 La concentración del agente tensioactivo cuando está presente en la composición varía por lo general de aproximadamente 0 01 mg/ml a aproximadamente 10 mg/ml, de aproximadamente 0.05 mg/ml a aproximadamente 5 0 mg/ml, de aproximadamente 0 1 mg/ml a aproximadamente 1 0 mg/ml, o de aproximadamente 0 2 mg/ml a aproximadamente 0 7 mg/ml. En otra modalidad, el agente tensioactivo está presente en una cantidad que es de aproximadamente 0 2 mg/ml En otra modalidad, el agente tensioactivo está presente en una cantidad de aproximadamente 0 5 mg/ml En una modalidad, la composición farmacéutica líquida contiene aproximadamente 0 2 mg/ml de polisorbato 80 En otra modalidad, la composición farmacéutica líquida contiene aproximadamente 0 4 mg/ml de polisorbato 80 En otra modalidad, la composición farmacéutica líquida contiene aproximadamente 0 5 mg/ml de pohsorbato 80 Las escalas intermedias de las concentraciones de agente tensioactivo anteriormente mencionadas también se consideran parte de esta invención Por ejemplo, se consideran incluidas las escalas de valores que usan una combinación de cualquiera de los valores anteriormente mencionados como límite superior y/o inferior puci nao uc ui i aycm «.jucidi ilc, i o 1-.U1 1 i uc3lt-.?<_ ? ico uc id presente invención también pueden comprender opcionalmente un antioxidante farmacéuticamente aceptable Los antioxidantes adecuados incluyen, sin limitación, metiomna, tiosulfato de sodio, catalasa y platino Por ejemplo, la composición farmacéutica líquida puede contener metionina en una concentración que varía de 1 mM a aproximadamente 100 mM, y en particular, es aproximadamente 27 mM En una modalidad, la presente invención abarca una composición que comprende por lo menos un anticuerpo, que comprende una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 95% idéntica a una secuencia de aminoácidos de cadena pesada que se muestra en la SEQ ID NO: 2, y que además comprende una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 95% idéntica a una secuencia de aminoácidos de cadena ligera que se muestra en la SEQ ID NO 4, en donde el anticuerpo se une al CTLA-4 humano, y un agente quelante. En una modalidad, la presente invención abarca una composición que comprende por lo menos un anticuerpo, que comprende una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 95% idéntica a una secuencia de aminoácidos de cadena pesada que se muestra en la SEQ ID NO: 2, y que además comprende una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 95% idéntica a una secuencia de aminoácidos de cadena ligera que se muestra en la SEQ ID NO: 4, en donde el anticuerpo se une al CTLA-4 humano; y un agente quelante. En una modalidad, la presente invención abarca una composición que comprende por lo menos un anticuerpo monoclonal humano anti-CTLA, en donde el anticuerpo se une al CTLA-4 humano; y un agente quelante. En una modalidad, la presente invención abarca una composición farmacéutica líquida que comprende por lo menos un anticuerpo monoclonal humano anti-CTLA, en donde el anticuerpo se une al CTLA-4 humano; y un agente quelante. En una modalidad, la presente invención abarca una composición que comprende por lo menos un anticuerpo, que comprende una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 95% idéntica a una secuencia de aminoácidos de cadena pesada que se muestra en la SEQ ID NO: 2, y que además comprende una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 95% idéntica a una secuencia de aminoácidos de cadena ligera que se muestra en la SEQ ID NO 4, en donde el anticuerpo se une al CTLA-4 humano, y un excipiente farmacéuticamente aceptable, en donde la composición contiene una concentración de anticuerpo que es de por lo menos aproximadamente 10 mg/ml, por lo menos aproximadamente 15 mg/ml, por lo menos aproximadamente 20 mg/ml, o por lo menos aproximadamente 25 mg/ml En una modalidad, la presente invención abarca una composición farmacéutica liquida que comprende por lo menos un anticuerpo, que comprende una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 95% idéntica a una secuencia de aminoácidos de cadena pesada que se muestra en la SEQ ID NO 2, y que además comprende una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 95% idéntica a una secuencia de aminoácidos de cadena ligera que se muestra en la SEQ ID NO 4, en donde el anticuerpo se une al CTLA-4 humano, y un excipiente farmacéuticamente aceptable, en donde la composición contiene una concentración de anticuerpo que varía de aproximadamente 10 mg/ml a aproximadamente 200 mg/ml. En una modalidad, la presente invención abarca una composición que comprende por lo menos un anticuerpo, que comprende una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 95% idéntica a una secuencia de aminoácidos de cadena pesada que se muestra en la SEQ ID NO" 2, y que ademas comprende una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 95% idéntica a una secuencia de aminoácidos de cadena ligera que se muestra en la SEQ ID NO 4, en donde el anticuerpo se une al CTLA-4 humano, y un excipiente farmacéuticamente aceptable, en donde la composición contiene una concentración de anticuerpo que varía de aproximadamente 15 mg/ml a aproximadamente 200 mg/ml. En una modalidad, la presente invención abarca una composición que comprende por lo menos un anticuerpo, que comprende una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 95% idéntica a una secuencia de aminoácidos de cadena pesada que se muestra en la SEQ ID NO: 2, y que además comprende una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 95% idéntica a una secuencia de aminoácidos de cadena ligera que se muestra en la SEQ ID NO: 4, en donde el anticuerpo se une al CTLA-4 humano; y un excipiente farmacéuticamente aceptable, en donde la composición contiene una concentración de anticuerpo que varía de aproximadamente 20 mg/ml a aproximadamente 200 mg/ml. En una modalidad, la presente invención abarca una composición que comprende por lo menos un anticuerpo, que comprende una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 95% idéntica a una secuencia de aminoácidos de cadena pesada que se muestra en la SEQ ID NO: 2, y que además comprende una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 95% idéntica a una secuencia de aminoácidos de cadena ligera que se muestra en la SEQ ID NO: 4, en donde el anticuerpo se une al CTLA-4 humano; y un excipiente farmacéuticamente aceptable, en donde la composición contiene una concentración de anticuerpo que varía de aproximadamente 50 mg/ml a aproximadamente 200 mg/ml. En una modalidad, la presente invención abarca una composición farmacéutica líquida que comprende por lo menos un anticuerpo, que comprende una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 95% idéntica a una secuencia de aminoácidos de cadena pesada que se muestra en la SEQ ID NO 2, y que ademas comprende una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 95% idéntica a una secuencia de aminoácidos de cadena ligera que se muestra en la SEQ ID NO 4, en donde el anticuerpo se une al CTLA-4 humano, y un excipiente farmacéuticamente aceptable, en donde la composición contiene una concentración de anticuerpo que varía de aproximadamente 100 mg/ml a aproximadamente 200 mg/ml En una modalidad, la presente invención abarca una composición que comprende por lo menos un anticuerpo, que comprende una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 95% idéntica a una secuencia de aminoácidos de cadena pesada que se muestra en la SEQ ID NO 2, y que además comprende una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 95% idéntica a una secuencia de aminoácidos de cadena ligera que se muestra en la SEQ ID NO 4, en donde el anticuerpo se une al CTLA-4 humano, y un excipiente farmacéuticamente aceptable, en donde la composición contiene una concentración de anticuerpo que varía de aproximadamente 10 mg/ml a aproximadamente 25 mg/ml En una modalidad, la presente invención abarca una composición que comprende por lo menos un anticuerpo, que comprende una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 95% idéntica a una secuencia de aminoácidos de cadena pesada que se muestra en la SEQ ID NO. 2, y que además comprende una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 95% idéntica a una secuencia de aminoácidos de cadena ligera que se muestra en la SEQ ID NO: 4, en donde el anticuerpo se une al CTLA-4 humano; y un excipiente farmacéuticamente aceptable, en donde la composición contiene una concentración de anticuerpo de aproximadamente 20 mg/ml. En una modalidad, la composición farmacéutica líquida comprende de aproximadamente 0.01 mg/ml a aproximadamente 200 mg/ml del anticuerpo monocional anti-CTLA-4 ticilimumab; y de aproximadamente 0.3 micromolar a aproximadamente 50 milimolar de agente quelante. En otra modalidad, la composición farmacéutica líquida comprende de aproximadamente 0.1 mg/ml a aproximadamente 100 mg/ml del anticuerpo monoclonal anti-CTLA-4 ticilimumab; y de aproximadamente 3 micromolar a aproximadamente 5.0 milimolar de agente quelante. En otra modalidad, la composición farmacéutica líquida comprende de aproximadamente 0.1 mg/ml a aproximadamente 100 mg/ml del anticuerpo monoclonal anti-CTLA-4 ticilimumab; y aproximadamente 0.27 milimolar de agente quelante. En otra modalidad, la composición farmacéutica líquida comprende de aproximadamente 0.1 mg/ml a aproximadamente 100 mg/ml del anticuerpo monoclonal anti-CTLA-4 ticilimumab; y de aproximadamente 0.3 micromolar a aproximadamente 50 milimolar de EDTA. En otra modalidad, la composición farmacéutica líquida comprende de aproximadamente 0.1 mg/ml a aproximadamente 100 mg/ml del anticuerpo monoclonal anti-CTLA-4 ticilimumab; y de aproximadamente 3 micromolar a aproximadamente 10.0 milimolar de EDTA. En otra modalidad, la composición farmacéutica líquida comprende de aproximadamente 0.1 mg/ml a aproximadamente 100 mg/ml 5 del anticuerpo monoclonal anti-CTLA-4 ticilimumab; y de aproximadamente 0.1 milimolar a aproximadamente 1.0 milimolar de EDTA. En otra modalidad, la composición farmacéutica líquida comprende de aproximadamente 0.1 mg/ml a aproximadamente 100 mg/ml del anticuerpo monoclonal anti-CTLA-4 ticilimumab; y aproximadamente 0.27 I U ¡Tlilp i iuidi ue cü i ??. En otra modalidad, la composición farmacéutica líquida comprende de aproximadamente 0.1 mg/ml a aproximadamente 100 mg/ml del anticuerpo monoclonal anti-CTLA-4 tícilimumab; y de aproximadamente 3 micromolar a aproximadamente 5.0 milimolar de DTPA. 15 En otra modalidad, la composición farmacéutica líquida comprende de aproximadamente 0.1 mg/ml a aproximadamente 100 mg/ml del anticuerpo monoclonal anti-CTLA-4 ticilimumab; y de aproximadamente 3 micromolar a aproximadamente 5.0 milimolar de deferoxamina. En una modalidad, la composición farmacéutica líquida 0 comprende de aproximadamente 0.01 mg/ml a aproximadamente 200 mg/ml del anticuerpo monoclonal anti-CTLA-4 ticilimumab; y de aproximadamente 1 mM a aproximadamente 100 mM de histidina. En otra modalidad, la composición farmacéutica líquida comprende de aproximadamente 0.1 mg/ml a aproximadamente 200 mg/ml del anticuerpo monoclonal anti-CTLA-4 ticilimumab; de aproximadamente 3 micromolar a aproximadamente 5.0 milimolar de agente quelante; y de aproximadamente 1 mM a aproximadamente 100 mM de histidina. 5 En otra modalidad, la composición farmacéutica líquida comprende de aproximadamente 0.1 mg/ml a aproximadamente 200 mg/ml del anticuerpo monoclonal anti-CTLA-4 ticilimumab; de aproximadamente 3 micromolar a aproximadamente 5.0 milimolar de agente quelante; y de aproximadamente 10 milimolar a aproximadamente 400 milimolar de I n trahalnc En otra modalidad, la composición farmacéutica líquida comprende de aproximadamente 0.1 mg/ml a aproximadamente 200 mg/ml del anticuerpo monoclonal anti-CTLA-4 ticilimumab; de aproximadamente 3 micromolar a aproximadamente 5.0 milimolar de agente quelante; de 15 aproximadamente 10 milimolar a aproximadamente 400 milimolar de trehalosa; y de aproximadamente 1 mM a aproximadamente 100 mM de histidina. En otra modalidad, la composición farmacéutica líquida comprende de aproximadamente 0.1 mg/ml a aproximadamente 200 mg/ml 20 del anticuerpo monoclonal antí-CTLA-4 ticílimumab; de aproximadamente 3 micromolar a aproximadamente 5.0 milimolar de agente quelante; de aproximadamente 10 milimolar a aproximadamente 400 milimolar de trehalosa; de aproximadamente 1 mM a aproximadamente 100 mM de histidina; y de aproximadamente 0.005 mílimolar a aproximadamente 10 milimolar de polisorbato 80. En otra modalidad, la composición farmacéutica líquida comprende de aproximadamente 0.1 mg/ml a aproximadamente 200 mg/ml del anticuerpo monoclonal anti-CTLA-4 ticilimumab; de aproximadamente 3 micromolar a aproximadamente 5.0 milimolar de EDTA; de aproximadamente 10 mílimolar a aproximadamente 400 milimolar de un agente de tonicidad; de aproximadamente 1 mM a aproximadamente 100 mM de un amortiguador; y de aproximadamente 0.005 milimolar a aproximadamente 10 milimolar de un agente tensioactivo. En otra modalidad, la composición farmacéutica líquida comprende de aproximadamente 0.1 mg/ml a aproximadamente 200 mg/ml del anticuerpo monoclonal anti-CTLA-4 ticilimumab; de aproximadamente 3 micromolar a aproximadamente 5.0 milimolar de EDTA; de aproximadamente 10 milimolar a aproximadamente 400 milimolar de un agente de tonicidad; de aproximadamente 1 mM a aproximadamente 100 mM de histidina; y de aproximadamente 0.005 milímolar a aproximadamente 10 milimolar de un agente tensioactivo. En otra modalidad, la composición farmacéutica líquida comprende de aproximadamente 0.1 mg/ml a aproximadamente 200 mg/ml del anticuerpo monoclonal anti-CTLA-4 ticílimumab; de aproximadamente 3 micromolar a aproximadamente 5.0 milimolar de EDTA; de aproximadamente 10 milimolar a aproximadamente 400 milimolar de trehalosa; de aproximadamente 1 mM a aproximadamente 100 mM de histidina; y de aproximadamente 0.005 milimolar a aproximadamente 10 milimolar de un agente tensioactivo. En algunos aspectos de la presente invención, las composiciones líquidas de anticuerpo anti-CTLA-4 comprenden de aproximadamente 0.1 mg/ml a aproximadamente 200 mg/ml del anticuerpo monoclonal anti-CTLA-4 ticilimumab; de aproximadamente 1 mM a aproximadamente 100 mM de histidina; de aproximadamente 0.005 milimolar a aproximadamente 10 milimolar de polisorbato 80; de aproximadamente 3 micromolar a aproximadamente 5.0 milimolar de EDTA; y de aproximadamente 10 milimolar a aproximadamente 400 milimolar de trehalosa. En otros aspectos de la presente invención, las composiciones líquidas de anticuerpo anti-CTLA-4 comprenden de aproximadamente 1.0 mg/ml a aproximadamente 100 mg/ml del anticuerpo monoclonal anti-CTLA-4 ticilimumab; de aproximadamente 10 mM a aproximadamente 50 mM de histidina; de aproximadamente 0.01 milimolar a aproximadamente 1.0 mílimolar de polisorbato 80; de aproximadamente 3 micromolar a aproximadamente 5.0 mílimolar de EDTA; y de aproximadamente 100 milimolar a aproximadamente 300 milimolar de trehalosa. En otros aspectos de la presente invención, las composiciones líquidas de anticuerpo anti-CTLA-4 comprenden de aproximadamente 10 mg/ml a aproximadamente 50 mg/ml del anticuerpo monoclonal anti-CTLA-4 ticilimumab; de aproximadamente 10 mM a aproximadamente 30 mM de histidina; de aproximadamente 0.05 milimolar a aproximadamente 0.5 milimolar de polisorbato 80; de aproximadamente 0.1 milimolar a aproximadamente 1 milimolar de EDTA; y de aproximadamente 200 mílimolar a aproximadamente 250 milimolar de trehalosa. En otros aspectos de la presente invención, las composiciones líquidas de anticuerpo anti-CTLA-4 comprenden aproximadamente 20 mg/ml del anticuerpo monoclonal anti-CTLA-4 ticilimumab; aproximadamente 20 mM de histidina; aproximadamente 0.15 milimolar de polisorbato 80; aproximadamente 0.27 milimolar de EDTA; y aproximadamente 222 milimolar de trehalosa. En otra modalidad, la invención está dirigida a una composición farmacéutica líquida estable que comprende un anticuerpo anti-CTLA-4 y un agente quelante farmacéuticamente aceptable, en donde la concentración molar del anticuerpo varía de aproximadamente 0.0006 milimolar a aproximadamente 1.35 milimolar, y la concentración molar del agente quelante varía de aproximadamente 0.003 milimolar a aproximadamente 50 milimolar, y en donde la relación molar de anticuerpo a agente quelante varía de aproximadamente 0.00001 a aproximadamente 450; de aproximadamente 0.0001 a aproximadamente 100; de aproximadamente 0.005 a aproximadamente 50; de aproximadamente 0.001 a aproximadamente 10; de aproximadamente 0.01 a aproximadamente 5; de aproximadamente 0.1 a aproximadamente 1 ; o es aproximadamente 0.5.

En otra modalidad, la invención esta dirigida a una composición farmacéutica liquida estable que comprende ticilimumab y un agente quelante farmacéuticamente aceptable, en donde la concentración molar del anticuerpo vana de aproximadamente 0 0006 milimolar a aproximadamente 1 35 mihmolar, y la concentración molar del agente quelante vana de aproximadamente 0 003 milimolar a aproximadamente 50 milimolar, y en donde la relación molar de anticuerpo a agente quelante varia de aproximadamente 0 00001 a aproximadamente 450, de aproximadamente 0 0001 a aproximadamente 100, de aproximadamente 0 005 a aproximadamente 50, de apro?imadamepte 0 001 a aproximadamente 10, de aproximadamente 0 01 a aproximadamente 5, de aproximadamente 0 1 a aproximadamente 1 , o es aproximadamente 0 5 En otra modalidad, la invención esta dirigida a una composición farmacéutica líquida estable que comprende ticilimumab, un agente quelante farmacéuticamente aceptable, e histidina, en donde la concentración molar del anticuerpo varía de aproximadamente 0 0006 milimolar a aproximadamente 1 35 milimolar, la concentración molar del agente quelante varía de aproximadamente 0 003 mi molar a aproximadamente 50 milimolar, y la concentración molar de histidina varía de aproximadamente 1 milimolar a aproximadamente 100 mi molar, y en donde la relación molar de anticuerpo a agente quelante varia de aproximadamente 0 00001 a aproximadamente 450, de aproximadamente 0 0001 a aproximadamente 100, de aproximadamente O 005 a aproximadamente 50, de aproximadamente 0 001 a aproximadamente 10; de aproximadamente 0.01 a aproximadamente 5; de aproximadamente 0.1 a aproximadamente 1 ; o es aproximadamente 0.5. En otra modalidad, la invención está dirigida a una composición farmacéutica líquida estable que comprende ticilimumab, un agente quelante farmacéuticamente aceptable, e histidina; en donde la concentración molar del anticuerpo varía de aproximadamente 0.0006 milimolar a aproximadamente 1 .35 milimolar, la concentración molar del agente quelante varía de aproximadamente 0.003 milimolar a aproximadamente 50 mílimolar, y la concentración molar de histidina varía de aproximadamente 10 milímolar a aproximadamente 50 milimolar; y en donde la relación molar de anticuerpo a agente quelante varía de aproximadamente 0.0001 a aproximadamente 100; de aproximadamente 0.005 a aproximadamente 50; de aproximadamente 0.001 a aproximadamente 10; de aproximadamente 0.01 a aproximadamente 5; de aproximadamente 0.1 a aproximadamente 1 ; o es aproximadamente 0.5. En otra modalidad, la invención está dirigida a una composición farmacéutica líquida estable que comprende ticilímumab, un agente quelante farmacéuticamente aceptable, e histidina; en donde la concentración molar de el anticuerpo varía de aproximadamente 0.0006 milimolar a aproximadamente 1 .35 milimolar, la concentración molar del agente quelante varía de aproximadamente 0.003 milimolar a aproximadamente 50 milimolar, y la concentración molar de histidina varía de aproximadamente 10 milimolar a aproximadamente 30 milimolar; y en donde la relación molar de anticuerpo a agente quelante varía de aproximadamente 0.005 a aproximadamente 50; de aproximadamente 0.001 a aproximadamente 10; de aproximadamente 0.01 a aproximadamente 5; de aproximadamente 0.1 a aproximadamente 1 ; o es aproximadamente 0.5. En otra modalidad, la invención está dirigida a una composición 5 farmacéutica líquida estable que comprende ticilimumab, un agente quelante farmacéuticamente aceptable, e histidina; en donde la concentración molar del anticuerpo varía de aproximadamente 0.0006 milimolar a aproximadamente 1 .35 milimolar, la concentración molar del agente quelante varía de aproximadamente 0.003 milimolar a aproximadamente 50 milimolar, y la ¡ 0 concentración molar de histidina varía de aproximadamente 10 milimolar a aproximadamente 30 milimolar; y en donde la relación molar de anticuerpo a agente quelante varía de aproximadamente 0.001 a aproximadamente 10; de aproximadamente 0.01 a aproximadamente 5; de aproximadamente 0.1 a aproximadamente 1 ; o es aproximadamente 0.5. 15 En otra modalidad, la invención está dirigida a una composición farmacéutica líquida estable que comprende ticilimumab, un agente quelante farmacéuticamente aceptable, e histidina; en donde la concentración molar del anticuerpo varía de aproximadamente 0.0006 milimolar a aproximadamente 1 .35 milimolar, la concentración molar del agente quelante varía de 0 aproximadamente 0.003 milimolar a aproximadamente 50 milímolar, y la concentración molar de histidina es aproximadamente 20 milimolar; y en donde la relación molar de anticuerpo a agente quelante varía de aproximadamente 0.001 a aproximadamente 10; de aproximadamente 0.01 a aproximadamente 5; de aproximadamente 0.1 a aproximadamente 1 ; o es aproximadamente 0.5.

Métodos de producción de anticuerpos anti-CTLA-4 y lineas de células productoras de anticuerpo Los anticuerpos de acuerdo con la invención se pueden preparar utilizando un ratón transgénico que tiene insertada una porción sustancial del genoma productor de anticuerpo humano, pero que se hace deficiente en la producción de anticuerpos murinos endógenos. Tales ratones son capaces de producir entonces moléculas de inmunoglobulina y anticuerpos humanos y son deficientes en la producción de moléculas de inmunoglobulina y anticuerpos murínos. Más abajo se expone la tecnología usada para lograr esto. Es posible producir animales (por ejemplo ratones) que son capaces de producir, por medio de inmunización, un repertorio completo de anticuerpos humanos en ausencia de producción endógena de inmunoglobulina. Sin embargo, en particular, una modalidad de la producción transgénica de ratones y anticuerpos de los mismos se describe en la patente de EE. UU. No. 6,682,736, de Hanson y otros. Usando dicha tecnología se pueden preparar anticuerpos que se unen al CTLA-4 e hibridomas que producen dichos anticuerpos. Los anticuerpos humanos evitan los problemas potencíales asociados con los anticuerpos que poseen regiones variables y/o constantes murinas o de rata. La presencia de dichas proteínas derivadas de murino o rata puede producir una depuración rápida de los anticuerpos o puede generar una respuesta inmune contra el anticuerpo en un sujeto que recibe dichos anticuerpos. Por ejemplo, se ha descrito que la supresión homocigótica del gen de la región de unión de cadena pesada de anticuerpo (JH) en ratones quiméricos y mutantes de línea germinal, resulta en la inhibición completa de la producción de anticuerpo endógeno. La transferencia del arreglo génico de inmunoglobulina de línea germinal humana en dichos ratones mutantes de línea germinal, resultará en la producción de anticuerpos humanos por exposición al antígeno (por ejemplo CTLA-4). Véase, por ejemplo, Jakobovits y otros, Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 90:2551 (1993); Jakobovíts y otros, Nature, 362:255-258 (1993); Bruggermann y otros, Year in Immuno., 7:33 (1993); y Duchosal y otros, Nature 355:258 (1992). También se pueden derivar anticuerpos humanos de colecciones de despliegue de fago (Hoogenboom y otros, J. Mol. Biol., 227:381 (1991 ); Marks y otros, J. MoL Biol., 222:581 -597 (1991 ); Vaughan y otros, Nature Biotech 14:309 (1996)). En algunas modalidades se pueden producir anticuerpos anti-CTLA-4 humanos inmunizando un animal transgénico no humano, por ejemplo ratones XENOMOUSE™, cuyo genoma comprende genes humanos de inmunoglobulina, de modo que el ratón recombinante produce anticuerpos humanos. Los ratones XENOMOUSE™ son especies de ratón construidas por ingeniería que comprenden fragmentos grandes de locus de cadena pesada y cadena ligera de inmunoglobu na humana, y son deficientes en la producción de anticuerpo de ratón Los ratones XENOMOUSE™ producen un repertorio de anticuerpos completamente humanos de tipo de adulto y generan anticuerpos humanos específicos de antígeno En algunas modalidades, los ratones XENOMOUSE™ contienen aproximadamente 80% del repertorio del gen V de anticuerpo humano mediante la introducción de fragmentos de cromosoma artificial de levadura (YAC) de configuración de línea germinal, de tamaño megabase, de los locus de cadena pesada humana y los locus de cadena ligera kappa En otras modalidades, los ratones XENOMOUSE™ también contienen aproximadamente todo el locus de la cadena ligera lambda Véase, por ejemplo, Green y otros, Nature Genetics 7 13-21 (1994), y las patentes de EE UU Nos 5,916,771 , 5,939,598, 5,985,615, 5,998,209, 6,075,181 , 6,091 ,001 , 6,1 14,598, 6,130,364, 6,162,963 y 6, 150,584 Véase también WO 91 /10741 , WO 94/02602, WO 96/34096, WO 96/33735, WO 98/16654, WO 98/24893, WO 98/50433, WO 99/45031 , WO 99/53049, WO 00/09560 y WO 00/037504 En algunas modalidades, el animal no humano que comprende genes de inmunoglobulina humana son animales que tienen un "minilocus" de inmunoglobulina humana En el enfoque del microlocus se ¡mita un locus de Ig exógeno mediante la inclusión de genes individuales del locus de Ig Así, se forman uno o más genes VH, uno o más genes DH, uno o más genes JH , un dominio constante mu, y un segundo dominio constante (preferiblemente un dominio constante gamma) en una construcción para su inserción en un animal Este enfoque se describe, entre otras partes, en las patentes de EE UU Nos 5,545,807, 5,545,806, 5,569,825, 5,625,126, 5,633,425, 5,661 ,016, 5,770,429, 5,789,650, 5,814,318, 5,591 ,669, 5,612,205, 5,721 ,367, 5,789,215, y 5,643,763 Por lo tanto, en algunas modalidades se pueden producir anticuerpos humanos inmunizando un animal no humano que comprende en su genoma algunos o todos los locus de cadena pesada y cadena ligera de inmunoglobu na humana con un antígeno CTLA-4 En algunas modalidades, el antígeno CTLA-4 es CTLA-4 aislado y/o purificado En una modalidad preferida, el antígeno CTLA-4 es CTLA-4 humano En algunas modalidades, el antígeno CTLA-4 es un fragmento del CTLA-4 En algunas modalidades, el fragmento de CTLA-4 comprende por lo menos un epitope de CTLA-4 En otras modalidades, el antígeno CTLA-4 es una célula que expresa o sobreexpresa CTLA-4 o un fragmento inmunogénico del mismo sobre su superficie En otras modalidades, el antígeno CTLA-4 es una proteína de fusión de CTLA-4 El CTLA-4 se puede purificar de fuentes naturales usando las técnicas conocidas En una modalidad preferida, el animal no humano es un animal XENOMOUSE™ (Abgenix Ine , Fremont, CA) Otro animal no humano que se puede usar es un ratón transgénico producido por Medarex (Medarex, Ine , Princeton, NJ) La inmunización de animales puede ser por medio de cualquier método conocido Véase por ejemplo Harlow y Lañe, "Antibodies A Laboratory Manual' , New York Cold Spring Harbor Press, 1990 Los métodos para inmunizar animales no humanos tales como ratones, ratas, ovejas, cabras, cerdos, reses y caballos, son muy conocidos Véase, por ejemplo, Harlow y Lañe, supra, y la patente de EE UU No 5,994,619 En una modalidad preferida, el antigeno CTLA-4 se administra con un adyuvante para estimular la respuesta inmune Los adyuvantes ejemplares incluyen adyuvante completo o incompleto de Freund, RIBI (dipeptidos de muramilo) o ISCOM (complejos inmunoestimuladores) Tales adyuvantes pueden proteger al pohpeptido de una dispersión rápida secuestrándolo en un depósito local, o pueden contener sustancias que estimulan ai hobpedero para secretar factores que son quimiotacticos para los macrofagos y otros componentes del sistema inmune Preferiblemente, si se administra un polipéptido, el programa de inmunización puede incluir dos o mas administraciones del polipéptido, extendiéndose a vanas semanas Después de la inmunización de un animal con un antigeno CTLA-4 se pueden obtener del animal anticuerpos y/o células productoras de anticuerpo En algunas modalidades se obtiene suero del animal que contiene el anticuerpo ant?-CTLA-4, sangrando o sacrificando el animal El suero se puede usar como se obtiene del animal, o una fracción de inmunoglobulina se puede obtener del suero, o los anticuerpos ant?-CTLA-4 se pueden purificar del suero En algunas modalidades se preparan lineas celulares inmortalizadas productoras de anticuerpo de las células aisladas del animal inmunizado. Después de la inmunización se sacrifica al animal y se inmortalizan células B de ganglio linfático y/o esplénicas. Los métodos de inmortalízación de las células incluyen, sin limitación, transfección de las células con oncogenes, infección de las células con un virus oncogénico, cultivo de las células bajo condiciones que seleccionan las células inmortalizadas, exposición de las células a compuestos carcinogénicos o mutantes, fusión de las células con una célula inmortalizada, por ejemplo una célula de mieloma, e inactivación un gen supresor de tumor. Véase, por ejemplo, Harlow y Lañe, supra. En una modalidad preferida, el animal inmunizado es un animal no humano que expresa genes de inmunoglobulina humana, y las células B esplénicas se fusionan con una línea de células de mieloma de la misma especie que el animal no humano. En una modalidad muy preferida, el animal inmunizado es un animal XENOMOUSE™ y la línea de células de mieloma es un mieloma de ratón no secretor. En una modalidad muy preferida, la línea de células de mieloma es P3-X63-AG8-653. Sí se usa fusión con células de mieloma, preferiblemente las células de mieloma no secretan polipéptido de inmunoglobulina (una línea de células no secretoras). Las células inmortalizadas se examinan y seleccionan usando CTLA-4, una porción del mismo, o una célula que expresa CTLA-4. En una modalidad preferida, el examen y selección iniciales se realizan usando un inmunoensayo de enlace de enzima (ELISA) o un radioinmunoensayo. En WO 00/37504 se da un ejemplo del método de ELISA. Las células productoras de anticuerpo anti-CTLA-4, por ejemplo hibpdomas, se seleccionan y se clonan, y se vuelven a examinar y seleccionar para obtener productos con las características deseadas, que incluyen crecimiento robusto, alta producción de anticuerpo y características deseadas del anticuerpo, como se expone más abajo Los hibpdomas se pueden expandir in vivo en animales sinérgicos, en animales que carecen de sistema inmune, por ejemplo ratones sin pelo, o en cultivo de células in vitro Los métodos de selección, clonación y expansión de hibndomas son muy conocidos para los expertos en la materia Como se apreciará, los anticuerpos de acuerdo con la presente invención se pueden expresar de forma recombinante en líneas de células diferentes de las lineas de células de hibpdoma Se pueden usar secuencias de ácido nucleico que codifican ADNc's o clonas genómicas para los anticuerpos particulares, para la transformación de células hospederas adecuadas de mamífero o no mamífero La presente invención también abarca moléculas de ácido nucleico que codifican anticuerpos ant?-CTLA-4 En algunas modalidades, diferentes moléculas de ácido nucleico codifican una cadena pesada y una cadena ligera de una inmunoglobuhna ant?-CTLA-4 En otras modalidades, la misma molécula de ácido nucleico codifica una cadena pesada y una cadena ligera de una inmunoglobulina de ant?-CTLA-4 En una modalidad, el ácido nucleico codifica un anticuerpo ant?-CTLA-4 de la invención Una molécula de ácido nucleico que codifica la cadena pesada o toda la cadena ligera de un anticuerpo ant?-CTLA-4, o porciones del mismo, se puede aislar de una fuente que produce dicho anticuerpo. En varías modalidades, las moléculas de ácido nucleico son aisladas de una célula B aislada de un animal inmunizado con anti-CTLA-4, o de una célula inmortalizada derivada de dicha célula B que expresa un anticuerpo anti-CTLA-4. Los métodos de aislamiento de ARNm que codifica un anticuerpo son muy conocidos. Véase, por ejemplo, Sambrook y otros, "Molecular Cloning" 3a ed. Vol.3 (1989). El ARNm se puede usar para producir ADNc para usar en la reacción en cadena de polimerasa (PCR) o clonación de ADNc de genes de anticuerpo. En una modalidad preferida, la molécula de ácido nucleico es aislada de un hibridoma que tiene como uno de sus socios de fusión una célula productora de inmunoglobulina humana de un animal transgénico no humano. En una modalidad muy preferida, la célula productora de inmunoglobulina humana es aislada de un animal XENOMOUSE™ . En otra modalidad, la célula productora de inmunoglobulina humana es de un animal transgénico no humano no murino, como se describió arriba. En otra modalidad, el ácido nucleico es aislado de un animal no transgénico no humano. Las moléculas de ácido nucleico aisladas de un animal no humano se pueden usar por ejemplo para anticuerpos humanizados. En algunas modalidades, un ácido nucleico que codifica una cadena pesada de un anticuerpo anti-CTLA-4 de la invención, puede comprender una secuencia de nucleótidos que codifica un dominio de VH de la invención, unido en marco a una secuencia de nucleótidos que codifica un dominio constante de cadena pesada de cualquier fuente Similarmente, una molécula de acido nucleico que codifica una cadena ligera de un anticuerpo ant?-CTLA-4 de la invención, puede comprender una secuencia de nucleótidos que codifica un dominio de VL de la invención, unido en marco a una secuencia de nucleótidos que codifica un dominio constante de cadena ligera de cualquier fuente En un aspecto adicional de la invención, moléculas de ácido nucleico que codifican el dominio variable de las cadenas pesada (VH) y ligera (VL) son "convertidas" en genes de anticuerpo de longitud completa En una modalidad, moléculas de ácido nucleico que codifican los dominios VH o VL son convertidas en genes de anticuerpo de longitud completa por inserción en un vector de expresión que ya codifica el dominio constante de cadena pesada (CH) o el dominio constante de cadena ligera (C ), respectivamente, de tal manera que el segmento VH se enlaza operativamente a los segmentos CH dentro del vector, y el segmento VL se enlaza operativamente al segmento CL dentro del vector En otra modalidad, moléculas de ácido nucleico que codifican los dominios VH y/o VL son convertidas en genes de anticuerpo de longitud completa enlazando, por ejemplo ligando, una molécula de ácido nucleico que codifica los dominios VH y/o VL con una molécula de ácido nucleico que codifica un dominio CH y/o CL, usando las técnicas estándares de biología molecular Las secuencias de ácido nucleico de genes constantes de inmunoglobulina humana de cadena pesada y ligera son conocidas, véase por ejemplo Kabat y otros, "Sequences of Proteins of Immunological Interest", 5a ed , NIH Pub No 91 -3242, 1991 Las moléculas de ácido nucleico que codifican la cadena pesada y/o ligera de longitud completa pueden ser expresadas entonces de una célula en la que se han introducido, y se puede aislar el anticuerpo ant?-CTLA-4 La presente invención también provee vectores que comprenden moléculas de acido nucleico que codifican la cadena pesada de un anticuerpo ant?-CTLA-4 de la invención, o una porción de unión de antígeno del mismo La invención también provee vectores que comprenden moléculas de ácido nucleico que codifican la cadena ligera de tales anticuerpos, o una porción de unión de antígeno de la misma La invención también provee vectores que comprenden moléculas de acido nucleico que codifican proteínas de fusión, anticuerpos modificados, fragmentos de anticuerpo y sondas de los mismos En algunas modalidades, los anticuerpos ant?-CTLA-4 o las porciones de unión de antígeno de la invención, se expresan insertando ADN's que codifican las cadenas ligeras y pesadas parciales o de longitud completa obtenidas como se describe arriba, en vectores de expresión, de modo que los genes se enlazan operativamente a las secuencias necesarias de control de expresión, tales como secuencias de control de transcripción y traducción Los vectores de expresión incluyen plásmidos, retrovirus, adenovirus, virus adeno-asociados (AAV), virus de planta como el virus del mosaico de la coliflor, virus del mosaico del tabaco, cósmidos, YAC's, episomas derivados de EBV, y similares El gen de anticuerpo se liga en un vector de tal manera que las secuencias de control de transcripción y traducción dentro del vector sirvan para realizar la función deseada de regulación de transcripción y traducción del gen de anticuerpo. El vector de expresión y las secuencias de control de expresión se eligen de modo que sean compatibles con la célula hospedera de expresión usada. El gen de cadena ligera de anticuerpo y el gen de cadena pesada de anticuerpo se pueden insertar en vectores separados. En una modalidad preferida, ambos genes se insertan en el mismo vector de expresión. Los genes de anticuerpo se insertan en el vector de expresión por medio de los métodos estándares (por ejemplo ligación de sitios de restricción complementarios en el fragmento y vector del gen de anticuerpo, o ligación de extremos emparejados si no están presentes sitios de restricción). Un vector conveniente es el que codifica una secuencia de inmunoglobulina humana de CH o CL funcionalmente completa, con sitios de restricción apropiados construidos por ingeniería, de modo que cualquier secuencia VH o VL se pueda insertar y expresar fácilmente, como se describe arriba. En dichos vectores usualmente ocurre empalme entre el sitio donador de empalme en la región J insertada y el sitio receptor de empalme que precede el dominio C humano, y también en las regiones de empalme que existen dentro de los exones de CH humanos. Ocurre poliadenilación y terminación de la transcripción en sitios cromosómicos nativos posteriores a las regiones codificadoras. El vector de expresión recombínante también puede codificar un péptido señal que facilite la secreción de la cadena de anticuerpo de una célula hospedera. El gen de la cadena del anticuerpo se puede clonar en el vector de tal manera que el péptido señal se enlace en marco con el extremo amino de la cadena de inmunoglobulina. El péptido señal puede ser un péptido señal de inmunoglobulina o un péptido señal heterólogo (es decir, un péptido señal de una proteína no inmunoglobulina). Además de los genes de las cadenas de anticuerpo, los vectores de expresión recombinante de la invención llevan secuencias reguladoras que controlan la expresión de los genes de las cadenas de anticuerpo en una célula hospedera. Será apreciado por los expertos en la materia que el diseño del vector de expresión, que incluye la selección de secuencias reguladoras, puede depender de factores tales como la elección de la célula hospedera que se va a transformar, el grado de expresión de la proteína deseada, etc. Las secuencias reguladoras preferidas para la expresión en células hospederas de mamífero incluyen elementos virales que dirigen un alto grado de expresión de proteína en células de mamífero, tales como promotores y/o intensificadores derivados de retrovirus (tales como LTRs retroviral), citomegalovirus (CMV) (tales como el promotor/intensificador de CMV), virus de simio 40 (SV40) (tal como el promotor/intensificador de SV40), adenovirus (por ejemplo el promotor tardío mayor de adenovirus (AdMLP)), polioma, y promotores de mamífero fuertes, tales los como promotores nativos de inmunoglobulina y actina. Para una descripción adicional de los elementos reguladores virales y sus secuencias, véase por ejemplo la patente de EE. UU. No. 5,168,062, la patente de EE. UU. No. 4,510,245, y la patente de EE. UU. No. 4,968,615. Los métodos para expresar un anticuerpo en las plantas, que incluyen una descripción de promotores y vectores, así como la transformación de plantas, son muy conocidos; véase por ejemplo, la patente de Estados Unidos 6,517,529, que se incorpora aquí como referencia. También son conocidos los métodos de expresión de polipéptidos en células 5 bacterianas o de hongo, por ejemplo células de levadura. Además de los genes de las cadenas de anticuerpo y las secuencias reguladoras, los vectores recombinantes de expresión de la invención pueden llevar secuencias adicionales, tales como secuencias que regulan la duplicación del vector en células hospederas (por ejemplo orígenes I U uc uuµii a iun) y yci ico n idi uduOi cb Seieo iOi idDieb. ti gen iTIdi uaOOr seleccionable facilita la selección de las células hospederas en las que se ha introducido el vector (véase por ejemplo, las patentes de EE. UU. Nos. 4,399,216, 4,634,665 y 5,179,017). Por ejemplo, normalmente el gen marcador seleccionable confiere resistencia a fármacos tales como G418, 15 higromicina o metotrexate, en una célula hospedera en la que se ha introducido el vector. Los genes marcadores seleccionables preferidos incluyen el gen de dihidrofolato reductasa (DHFR; para usar en células que alojan DHFR con selección/amplificación de metotrexate), el gen de resistencia a la neomicina (para selección de G418) y el gen de glutamina 0 sintetasa. Para la transformación de una célula hospedera adecuada de mamífero, planta, bacteriana o de levadura, se pueden usar moléculas de ácido nucleico que codifican anticuerpos anti-CTLA-4 y vectores que comprenden estas moléculas de acido nucleico Los anticuerpos de la invención se pueden producir transgenicamente mediante la generación de un mamífero o planta que sea transgénico para las secuencias de cadena pesada y ligera de inmunoglobulma de interés, y la producción del anticuerpo en una forma recuperable de la misma La transformación se puede hacer mediante cualquier método conocido introduciendo los polinucleotidos en una célula hospedera, que incluyen por ejemplo, empaquetamiento del pohnucleótido en un virus (o en un vector viral) y transducción de una célula hospedera con el virus (o vector), o mediante procedimientos de transfección conocidos, como se ejemplifica en las patentes de EE UU Nos 4,399,216, 4,912,040, 4,740,461 , y 4,959,455 El procedimiento de transformación usado depende del hospedero por transformar Los métodos de introducción de po nucleótidos heterólogos en células de mamífero son muy conocidos e incluyen, sin limitación, transfección mediada por dextrano, precipitación con sulfato de calcio, transfección mediada por polibreno, fusión de protoplasto, electroporación, bombardeo de partículas, encapsulacion de los polmucleótidos en liposomas, conjugados de péptido, dendpmeros, y micromyeccion directa del ADN en el núcleo Las lineas de células de mamífero disponibles como hospederos para expresión son muy conocidas e incluyen muchas líneas de células inmortalizadas disponibles de la Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC), que incluyen sin limitación células de ovario de hámster chino (CHO), células NS0, células HeLa, células de riñon de hámster crío (BHK), células de riñon de mono (COS), células de carcinoma hepatocelular humano (por ejemplo HepG2), y otras líneas de células. Para expresar anticuerpos recombinantes también se pueden usar células que no son de mamífero que incluyen, sin limitación, bacterianas, de levadura, insecto y plantas. Se puede preferir la mutagénesis dirigida al sitio del dominio CH2 del anticuerpo para eliminar la glicosilación e impedir cambios de la inmunogenicidad, farmacocinética y/o funciones efectoras, que se originan por glicosilación no humana. Los métodos de expresión se seleccionan determinando qué sistema genera el mayor grado de expresión y produce anticuerpos con propiedades de unión de CTLA-4 constitutivas. Además, la expresión de los anticuerpos de la invención (u otras porciones de los mismos) de líneas de células de producción se puede incrementar usando varias técnicas conocidas. Por ejemplo, los sistemas de expresión del gen de glutamina sintetasa y DHFR son propuestas conocidas para incrementar la expresión bajo ciertas condiciones. Se pueden identificar clonas de células de alta expresión usando las técnicas convencionales, tales como clonación de dilución limitada y tecnología Microdrop. El sistema de glutamina sintetasa se expone parcial o totalmente en las patentes europeas 0 216 846, 0 256 055, y 0 323 997, y la solicitud de patente europea No. 89303964.4. Con respecto a la producción transgénica en mamíferos, los anticuerpos también se pueden producir y recuperar en la leche de cabra, vaca, u otros mamíferos; véase por ejemplo, las patentes de EE. UU. Nos. 5,827,690, 5,756,687, 5,750, 172, y 5,741 ,957. Los anticuerpos anti-CTLA-4 expresados como se describe arriba en líneas celulares se pueden purificar y/o aislar del material celular asociado. Los anticuerpos pueden estar presentes en células completas, en un lisado celular, o en una forma parcialmente purificada o sustancialmente purificada. La purificación se hace para eliminar otros componentes celulares y otros contaminantes, por ejemplo otros ácidos nucleicos o proteínas celulares, por medio de las técnicas estándares que incluyen tratamiento alcalino/SDS, cromatografía en columna y otras muy conocidas; véase Ausubei, F. , y otros, ed. "Current Protocols in Molecular Bioiogy", Greene Publishing y Wiley Interscience, New York (1987). En la presente invención es posible que los anticuerpos anti-CTLA-4 de la presente invención expresados por líneas celulares diferentes o en animales transgénicos tengan diferentes patrones de glicosilación entre sí. Sin embargo, todos los anticuerpos antí-CTLA-4 codificados por los ácidos nucleicos y aminoácidos aquí provistos se consideran parte de la presente invención, sin importar su patrón de glicosilación ni la modificación o supresión del mismo. De esta manera, para los fines de la presente invención, los anticuerpos anti-CTLA-4 pueden estar glicosilados o no glicosilados. Cuando los anticuerpos anti-CTLA-4 están glicosilados pueden tener cualquier patrón de glícosilación posible. Además, cada cadena pesada en un anticuerpo puede tener el mismo patrón de glicosilación, o las dos cadenas pesadas pueden tener diferentes patrones de glicosilación. La presente invención también abarca la mutagénesis dirigida al sitio del dominio CH2 del anticuerpo para eliminar la glicosilación, para impedir los cambios de inmunogenicidad, farmacocinética, y/o funciones efectoras, que se originan por la glicosilación no humana. Como se usa aquí, el término "glicosilación" significa el patrón de unidades de carbohidrato que están unidas covalentemente a un anticuerpo. Cuando se dice que los anticuerpos anti-CTLA-4 de la presente tienen un patrón de glicosilación particular, se entiende que la mayoría de los anticuerpos anti-CTLA-4 referidos tienen ese patrón de glicosilación particular. En otros aspectos, cuando se dice que ios anticuerpos anti-CTLA-4 de ia presente tienen un patrón de glicosilación particular, se entiende que 50%, 75%, 90%, 95%, 99%, o 100%, o más, de los anticuerpos anti-CTLA-4 referidos tienen ese patrón de glicosilación particular. Los anticuerpos anti-CTLA-4 de la presente invención también abarcan variantes de glicosilación (por ejemplo por inserción de un sitio de glicosilación o supresión de cualquier sitio de glicosilación por supresión, inserción o sustitución de residuos de aminoácido adecuados). La glicosilación de polipéptidos normalmente es N-enlazada u O-enlazada. Normalmente la glicosilación de los polipéptidos de anticuerpo es N-enlazada y forma una estructura de dos antenas. N-enlazado se refiere a la unión de la porción de carbohidrato a la cadena lateral de un residuo de asparagina. Las secuencias de tripéptído asparagina-X-serina y asparagina-X-treonina, en donde X es cualquier aminoácido excepto prolina, son secuencias de reconocimiento para la unión enzimatica de la porción de carbohidrato a la cadena lateral de asparagina Así, la presencia de cualquiera de estas secuencias de tppeptido en un anticuerpo crea un sitio de glicosilacion potencial Las tres estructuras distintas de los g canos de dos antenas son designadas como "GO", "G1" y "G2", que tienen cero, uno, o dos residuos de galactosa terminales, respectivamente, en el extremo no reductor del ghcano, véase Jefferis y otros, Biochem J , 268, 529-537 (1990) En algunos casos, la estructura del ghcano también puede tener un residuo de fucosa enlazado a una N-acetiiglucosarnina, que esta enlazado covalentemente con ei aminoácido asparagina (por ejemplo, la posición 297) encontrado en el anticuerpo Cuando esta presente la fucosa (F), la nomenclatura del glicano de dos antenas se cambia a "GOF", "G1 F", o "G2F", dependiendo del numero de residuos terminales de galactosa, véase Teillaud, Expert Opin Biol Ther , 5 (Supl 1 ) S15-S27 (2005) Ademas, cuando el anticuerpo contiene las dos cadenas pesadas, la nomenclatura del ghcano se repite para cada una de las dos cadenas pesadas La ghcoforma "GOF, GOF" es una especie en la cual las dos cadenas pesadas tienen el glicano GO unido y cada glicano GO tiene un residuo de fucosa (F) unido a una N-acetiIglucosamina La ghcoforma "G0F,G1 F" es una especie en una de las cadenas pesadas que tiene el glicano GO unido, y la otra cadena pesada tiene el glicano G1 unido con cada glicano GO y glicano G1 que tiene un residuo de fucosa (F) enlazado a una N-acetilglucosamina En algunas modalidades, los anticuerpos ant?-CTLA-4 tienen un patrón de ghcosilacion que se selecciona del grupo que consiste en "G0F.G0F", "G0F,G1 F", "G1 F,G1 F", "G1 F,G2F", y mezclas de los mismos En otras modalidades, los anticuerpos ant?-CTLA-4 tienen un patrón de ghcosilacion que es "G0F,G1 F" para más del 50% de los anticuerpos producidos En otras modalidades, los anticuerpos ant?-CTLA-4 tienen un patrón de ghcosilacion que es "GOF, GOF" para menos del 50% de los anticuerpos producidos Por ejemplo, en una modalidad, el anticuerpo anti-CTLA-4 11 2 1 aquí descrito tiene un patrón de glicosilación de "GOF, GOF" o "GOF, GI F" En algunas modalidades, los anticuerpos ant?-CTLA-4 (1 1 2 1 ) se producen con una mezcla de patrones de glicosilación diferentes Por ejemplo, en una muestra de los anticuerpos (11 2 1 ), puede haber una mezcla de anticuerpos (11 2 1 ), algunos teniendo un patrón de g cosilacion de "G0F,G1 F", y otros teniendo un patrón de glicosilación de "GOF, GOF", en una relación de aproximadamente 3 2, respectivamente Vías de administración y dosis Las composiciones de esta invención pueden estar en soluciones líquidas (por ejemplo soluciones inyectables e infundibles) La forma preferida depende del modo de administración deseado y la aplicación terapéutica Las composiciones típicas preferidas están en forma de soluciones inyectables o infundibles, tales como composiciones similares a las usadas para inmunización pasiva en los humanos El modo de administración preferido es el parenteral (por ejemplo, intravenoso, subcutáneo, intrapentoneal, intramuscular e intraestemal), o mediante técnicas de infusión, en forma de suspensiones líquidas u oleaginosas inyectables estériles Como será apreciado por el experto en la materia, la vía y/o modo de administración vana dependiendo de los resultados deseados En una modalidad preferida, el anticuerpo se administra por infusión o inyección intravenosa En otra modalidad preferida, el anticuerpo se administra por inyección intramuscular o subcutánea Las composiciones terapéuticas normalmente son estériles y estables bajo las condiciones de fabricación y almacenamiento La composición se puede formular como una solución, microemulsión, dispersión o liposoma Se pueden preparar soluciones inyectables estériles incorporando el anticuerpo ant?-CTLA-4 en la cantidad requerida en un diluente apropiado, con un ingrediente o una combinación de ingredientes como los anteriormente descritos, según se requiera, seguido por esterilización (por ejemplo esterilización por filtración) Generalmente las dispersiones se preparan incorporando el compuesto activo en un vehículo estéril que contiene un medio de dispersión básico y los otros ingredientes requeridos descritos anteriormente Tales suspensiones se pueden formular de acuerdo con la técnica conocida usando los agentes adecuados de dispersión o mojado y de suspensión, u otros agentes aceptables La preparación inyectable estéril también puede ser una solución o suspensión inyectable estéril en un diluente o disolvente inocuo parenteralmente aceptable, por ejemplo como una solución en 1 ,3-butanod?ol Entre los vehículos y disolventes aceptables que se pueden usar están el agua, solución de Ringer y solución isotónica de cloruro de sodio Además, convencionalmente se usan aceites fijos estériles como disolventes o medios de suspensión. Para este fin se puede usar cualquier aceite fijo blando que incluye mono- o dighcéridos sintéticos Además, en la preparación de inyectables se pueden usar ácidos grasos n-3 polnnsaturados En el caso de polvos estériles para la preparación de soluciones inyectables estériles, los métodos preferidos de preparación son secado al vacío y secado en congelación, que producen un polvo del ingrediente activo mas cualquier ingrediente adicional deseado de una solución del mismo previamente filtrada en estéril La fluidez apropiada de una solución se puede mantener, por ejemplo, usando un recubrimiento como lecitina, manteniendo el tamaño de partícula deseado en el caso de dispersiones, y usando agentes tensioactivos Las composiciones inyectables se pueden hacer de absorción prolongada incluyendo en la composición un agente que retarda la absorción, por ejemplo, sales de monoestearato y gelatina, o formulando la composición en formas de absorción prolongada tales como depósitos, liposomas, microesferas polimépcas, geles polimépcos e implantes. Otros métodos de administración de los anticuerpos aquí descritos incluyen los parches dérmicos que liberan el medicamento directamente en la piel de un sujeto Estos parches pueden contener los anticuerpos de la presente invención en una solución líquida opcionalmente amortiguadora, o disueltos y/o dispersos en un adhesivo, o dispersos en un polímero. Otros métodos de administración de los anticuerpos aquí descritos incluyen gotas oftálmicas líquidas para los ojos. El anticuerpo se puede administrar una vez, pero preferiblemente se administra múltiples veces. Por ejemplo, el anticuerpo se puede administrar de una vez al día a una vez cada seis meses o más. La administración puede ser en un horario de tres veces al día, dos veces al día, una vez al d¡a, una vez cada dos días, una vez cada tres d¡as, una vez a la semana, una vez cada dos semanas, una vez cada mes, una vez cada dos meses, una vez cada tres meses y una vez cada seis meses. El anticuerpo también se puede administrar continuamente por medio de una minibomba. El anticuerpo se puede administrar en el sitio del tumor o parte del cuerpo inflamada, o en un sitio distante del sitio del tumor o parte del cuerpo inflamada. El anticuerpo se puede administrar una vez, por lo menos dos veces, o por lo menos durante el periodo en el que se trata, atenúa o cura la condición. Generalmente el anticuerpo se puede administrar durante todo el periodo en el que está presente el tumor, siempre que el anticuerpo detenga el crecimiento del tumor o cáncer, o disminuya su peso o volumen, o hasta que haya sanado la parte del cuerpo inflamada. Normalmente el anticuerpo se administraría como parte de una composición farmacéutica como se describe arriba.

Las composiciones de la invención pueden incluir una cantidad terapéuticamente efectiva o una cantidad profilácticamente efectiva de un anticuerpo o porción de unión de antígeno de la invención Para preparar la formulación, la cantidad terapéuticamente efectiva del anticuerpo anti-CTLA-4 presente en la formulación se puede determinar, por ejemplo, tomando en cuenta los volúmenes de dosis y el modo de administración deseados, la naturaleza y severidad de la condición tratada, y la edad y talla del sujeto. Escalas de dosis ejemplares y no limitativas para la administración de las composiciones farmacéuticas de la presente invención a un sujeto, son de aproximadamente 0 01 mg/kg a aproximadamente 200 mg/kg (expresadas en miligramos (mg) de anticuerpo ant?-CTLA-4 administrados por kilogramo (kg) de peso del sujeto), de aproximadamente 0 1 mg/kg a aproximadamente 100 mg/kg, de aproximadamente 1.0 mg/kg a aproximadamente 50 mg/kg, de aproximadamente 5 0 mg/kg a aproximadamente 20 mg/kg, o aproximadamente 15 mg/kg. Para los fines de la presente invención, un sujeto humano promedio pesa aproximadamente 70 kg. Las escalas intermedias de cualquiera de las dosis aquí referidas, por ejemplo aproximadamente 0 01 mg/kg a 199 mg/kg, también se consideran parte de esta invención Por ejemplo, se consideran incluidas las escalas de valores que usan una combinación de cualquiera de los valores anteriormente mencionados como límite superior y/o inferior. Los regímenes de dosificación también se pueden ajustar para proveer la respuesta deseada óptima (por ejemplo una respuesta terapéutica o profiláctica), administrando a un sujeto varias dosis divididas en el tiempo, o la dosis se puede reducir o aumentar proporcionalmente según las exigencias de la situación terapéutica Es especialmente ventajoso formular las composiciones parenterales en forma de dosis unitarias para facilitar la administración y obtener uniformidad de dosificación Forma de dosis unitaria, como se usa aquí, se refiere a unidades físicamente separadas, adecuadas como dosis unitarias para los sujetos mamíferos por tratar, cada unidad contiene una cantidad predeterminada de compuesto activo calculada para producir el efecto terapéutico deseado en asociación con el vehículo farmacéutico requerido La especificación de las formas de dosis unitarias de la invención son dictadas por, y directamente dependientes de, (a) las características únicas del anticuerpo ant?-CTLA-4 o porción y el efecto terapéutico o profiláctico particular que se busca, y (b) las limitaciones inherentes de la técnica de formulación de dicho anticuerpo para el tratamiento de sensibilidad en los individuos Las formulaciones líquidas de la presente invención se pueden preparar como formas de dosis unitarias Por ejemplo, una dosis unitaria por frasco puede contener de 1 a 1000 mililitros (ml) de concentraciones diferentes de un anticuerpo ant?-CTLA-4 En otras modalidades, una dosis unitaria por frasco puede contener aproximadamente 1 ml, 2 ml, 3 ml, 4 ml, 5 ml, 6 ml, 7 ml, 8 ml, 9 ml, 10 ml, 15 ml, 20 ml, 30 ml, 40 ml, 50 ml, o 100 ml de de concentraciones diferentes de un anticuerpo ant?-CTLA-4. Si es necesario, estas preparaciones se pueden ajustar a una concentración deseada añadiendo un diluente estéril a cada frasco Las formulaciones líquidas de la presente invención también se pueden preparar como formas de dosis unitarias en bolsas o contenedores estériles, que son adecuadas para una línea de administración intravenosa o catéter Determinación de la estabilidad La presente invención comprende composiciones farmacéuticas líquidas estables que comprenden un anticuerpo ant?-CTLA-4 como se Ueb uuc en is µi cbct iis, y ui i ayci nc u,ucidi ??e idi i i idUcUllCaiTici ue Una composición estable es deseable para mantener o resistir los cambios, por ejemplo, de apariencia e integridad de producto (que incluyen degradación física o química que produce potencialmente una disminución de la actividad biológica) Se reportan en la literatura vanas técnicas analíticas e indicadores para medir la estabilidad de la proteína, y vanas de estas técnicas e indicadores se revisan en "Peptide and Protein Drug Delivery", 247-301 , Vincent Lee, ed , Marcel Dekker, Ine , Pubs (1991 ), Nueva York, N Y , y Jones, A Adv Drug Delivery Rev. 10 29-90 (1993). En general, las composiciones farmacéuticas líquidas de la presente invención exhiben una estabilidad mejorada cuando se someten a temperaturas de almacenamiento bajas durante un periodo, y/o cuando se someten a uno o más ciclos de congelación/descongelación En una modalidad, cuando la composición se almacena a una temperatura de aproximadamente 2°C a aproximadamente 8°C durante al menos 12 meses aproximadamente, de preferencia por lo menos aproximadamente 18 meses, y muy de preferencia por lo menos aproximadamente 24 meses, es más estable que una composición por lo demás idéntica que carece del agente quelante y se almacena bajo las mismas condiciones durante el mismo tiempo. En otra modalidad, cuando la composición se almacena a una temperatura de aproximadamente 25°C a aproximadamente 30°C durante al menos 3 meses aproximadamente, de preferencia por lo menos aproximadamente 6 meses, y muy de preferencia por ¡o menos aproximadamente 12 meses, es más estable que una composición por lo demás idéntica que carece del agente quelante y se almacena bajo las mismas condiciones durante el mismo tiempo. En otra modalidad, cuando la composición se almacena a una temperatura de aproximadamente 40°C durante al menos 1 mes aproximadamente, de preferencia por lo menos aproximadamente 2 meses, y muy de preferencia por lo menos aproximadamente 3 meses, es más estable que una composición por lo demás idéntica que carece del agente quelante y se almacena bajo las mismas condiciones durante el mismo tiempo. Como se usa aquí, el término "ciclo de congelación/descongelación" se refiere a las técnicas de uso de una muestra de anticuerpo líquida después de su almacenamiento en congelación, en donde la temperatura de la muestra se reduce a una temperatura de 0 °C o más baja para congelar la muestra líquida, y después la muestra se somete a una temperatura que restaura su estado líquido durante un periodo suficiente para permitir el uso de la muestra, seguido por un retorno a almacenamiento en congelación, preferiblemente a una temperatura de 0 °C o menor Como se usa aquí, el término "almacenamiento en congelación" se refiere a congelar y mantener una muestra de anticuerpo previamente líquida a una temperatura de 0 °C o menor, de preferencia de -20 °C o menor En una modalidad, cuando la composición se somete a por lo menos un ciclo de congelación/descongelación, preferiblemente por lo menos dos ciclos de congelación/descongelación, de preferencia por lo menos tres ciclos de congelación/descongelación, de preferencia por lo menos cuatro ciclos de congelación/descongelación, de preferencia por lo menos cinco ciclos de congelación/descongelación, muy de preferencia por lo menos seis ciclos de congelación/descongelación, es más estable que una composición por lo demás idéntica que carece del agente quelante que se somete a las mismas condiciones de congelación/descongelación. En otra modalidad, la composición satisface dos o más de las siguientes condiciones (a) cuando la composición se almacena a una temperatura de aproximadamente 2°C a aproximadamente 8°C durante por lo menos aproximadamente 12 meses, de preferencia por lo menos aproximadamente 1 8 meses, de preferencia por lo menos aproximadamente 24 meses, es más estable que una composición por lo demás idéntica que carece del agente quelante que se almacena bajo las mismas condiciones durante el mismo tiempo; (b) cuando la composición se almacena a una temperatura de aproximadamente 25°C a aproximadamente 30°C durante por lo menos aproximadamente 3 meses, de preferencia por lo menos 6 meses, de preferencia por lo menos aproximadamente 12 meses, es más estable que una composición por lo demás idéntica que carece del agente quelante que se almacena bajo las mismas condiciones durante el mismo tiempo; (c) cuando la composición se almacena a una temperatura de aproximadamente 40°C durante por lo menos aproximadamente 1 mes, de preferencia por lo menos aproximadamente 2 meses, de preferencia por lo menos aproximadamente 3 meses, es más estable que una composición por lo demás idéntica que carece del agente quelante que se almacena bajo las mismas condiciones durante el mismo tiempo; o (d) cuando la composición se somete a por lo menos 1 ciclo de congelación/descongelación, de preferencia por lo menos 2 ciclos de congelación/descongelación, de preferencia por lo menos 3 ciclos de congelación/descongelación, de preferencia por lo menos 4 ciclos de congelación/descongelación, de preferencia por lo menos 5 ciclos de congelación/descongelación, muy de preferencia por lo menos 6 ciclos de congelación/descongelación, es más estable que una composición por lo demás idéntica que carece del agente quelante que se somete a las mismas condiciones de congelación/descongelación.

En otra modalidad, la composición satisface tres o más de las condiciones anteriormente indicadas Para los fines de la presente solicitud, la agregación de anticuerpo, la fragmentación de anticuerpo, y/o la decoloración de la composición, por ejemplo, se pueden usar como indicadores de la estabilidad de la composición En general, las composiciones farmacéuticas líquidas de la presente invención exhiben un menor grado de por lo menos una de agregación de anticuerpo, fragmentación de anticuerpo y decoloración de la composición, cuando se someten a una o más de las condiciones de almacenamiento o congelación/descongelación anteriormente descritas, con respecto a composiciones por lo demás idénticas que carecen del agente quelante y se someten a las mismas condiciones La agregación de proteína en una composición farmacéutica líquida se puede medir por medio de vanos métodos conocidos Tales métodos incluyen cromatografía de filtración en gel para separar las proteínas en función de su peso molecular Un "gel" es una matriz de agua y un polímero, tal como agarosa o acplamida polimepzada La presente invención también abarca el uso de HPLC (cromatografía de líquidos de alto rendimiento) de filtración en gel Otros métodos reconocidos para medir la agregación incluyen cromatografía de intercambio de cationes, que es la técnica cromatografica líquida general de cromatografía de intercambio iónico que utiliza columnas de aniones Los cationes intercambiados en la presente invención son de las moléculas de proteina Puesto que los agregados de proteína multivalentes pueden tener algún múltiplo de la carga neta de la proteína de unión de antígeno de una sola cadena, los agregados pueden ser retenidos más fuertemente y se pueden separar de las moléculas de una sola cadena. Un intercambiador catiónico preferido es una columna de ácido poliaspártico. De esta manera, se puede distinguir fácilmente una proteína monomérica de un agregado. Sin embargo, los expertos en la materia se darán cuenta de que las pruebas de agregación de la invención no se limitan a ningún tipo particular de columna de cromatografía, siempre que sea capaz de separar las dos formas de moléculas de proteína. La fragmentación en una composición farmacéutica líquida se puede medir mediante varios métodos conocidos. Tales métodos incluyen, por ejemplo, cromatografía de exclusión de tamaño, detección con luz ultravioleta (por ejemplo a 214 nanómetros), SDS-PAGE y/o espectrometría de masa con desorción/ionización mediante láser asistida por matriz acoplada con un analizador de tiempo de vuelo (MALDI/TOF MS). La fragmentación de proteína que resulta en una alteración de la carga (por ejemplo la que ocurre como resultado de desamidación) se puede evaluar por ejemplo por medio de cromatografía de intercambio iónico o enfoque isoeléctrico (IEF). La decoloración de la composición generalmente se puede medir por evaluación visual de la composición misma. Las composiciones farmacéuticas líquidas presentes que comprenden un agente quelante generalmente presentan una disminución de decoloración (por ejemplo rosa y/o amarillo) y/o mantienen su claridad (por ejemplo, en cuanto a turbidez, nubosidad y/o formación de partículas) con respecto a composiciones por lo demás idénticas que no contienen el agente quelante. Para los fines de la presente invención, el término "decoloración" se refiere a cambios de color (por ejemplo de transparente e incoloro a rosa o amarillo) y a cambios de claridad (por ejemplo de transparente e incoloro a turbio, nubloso y/o que tiene partículas). La decoloración de la composición generalmente se puede medir usando técnicas adicionales como detección con luz ultravioleta a 214 nanómetros y/o comparación visual contra una escala de color estándar de las composiciones con y sin el agente quelante; véase la Farmacopea Europea 5.0, 2005, Monografía 2.2.2. En una modalidad, la agregación de anticuerpo se determina después de que la composición se somete a por lo menos una de las siguientes condiciones: (a) la composición se almacena a una temperatura de aproximadamente 2°C a aproximadamente 8°C durante por lo menos aproximadamente 12 meses, de preferencia por lo menos aproximadamente 18 meses, muy de preferencia por lo menos aproximadamente 24 meses; (b) la composición se almacena a una temperatura de aproximadamente 25°C a aproximadamente 30°C durante por lo menos aproximadamente 3 meses, de preferencia por lo menos 6 meses, muy de preferencia por lo menos aproximadamente 12 meses; (c) la composición se almacena a una temperatura de aproximadamente 40°C durante por lo menos aproximadamente 1 mes, de preferencia por lo menos aproximadamente 2 meses, muy de preferencia por lo menos aproximadamente 3 meses, o (d) la composición se somete a por lo menos 1 ciclo de congelación/descongelación, de preferencia por lo menos 2 ciclos de congelación/descongelación, de preferencia por lo menos 3 ciclos de congelación/descongelación, de preferencia por lo menos 4 ciclos de congelación/descongelación, de preferencia por lo menos 5 ciclos de congelación/descongelación, y muy de preferencia por lo menos 6 ciclos de congelación/descongelación Después, los agregados de anticuerpo se separan cromatográficamente de la composición (por ejemplo usando HPLC) y se determina el grado de agregación del cromatograma resultante Las composiciones farmacéuticas líquidas estables de la presente invención normalmente tienen un área pico de agregado en el cromatograma que es menor de aproximadamente 6%, menor de aproximadamente 5%, menor de aproximadamente 4%, menor de aproximadamente 3%, menor de aproximadamente 2%, o menor de aproximadamente 1.5% del área pico total en el cromatograma. En un ejemplo específico de esta técnica para medir la agregación, la composición se almacena durante 24 semanas a 40°C y después se hace una separación cromatográfica usando SE-HPLC con detección en ultravioleta a 214 nanómetros. Esta técnica se usó para medir la agregación del anticuerpo en el ejemplo 1 1 , en donde, por ejemplo, la formulación No. 37 (que contiene un agente quelante) exhibió un área pico de agregado en el cromatograma de aproximadamente 1.1 %, mientras que la formulación No. 26 (que carece de un agente quelante) exhibió un área pico de agregado en el cromatograma de aproximadamente 6.4%. En general, la diferencia entre el área pico de agregado del cromatograma para una composición farmacéutica líquida estable de la presente invención, y el área pico de agregado del cromatograma para una composición por lo demás idéntica que carece del agente quelante y se somete a las mismas condiciones, es de por lo menos aproximadamente 2%, por lo menos aproximadamente 3%, por lo menos aproximadamente 4%, o por lo menos aproximadamente 4.5%. Por ejemplo, esta diferencia entre la formulación 37 (área pico del agregado en el cromatograma de aproximadamente 1.1%) y la formulación 26 (área pico del agregado en el cromatograma de aproximadamente 6.4%), probadas en el ejemplo 11 como se menciona arriba, es de aproximadamente 5.3%. En otra modalidad, la fragmentación de anticuerpo se determina después de que la composición se somete a por lo menos una de las siguientes condiciones: (a) la composición se almacena a una temperatura de aproximadamente 2°C a aproximadamente 8°C durante por lo menos aproximadamente 12 meses, de preferencia por lo menos aproximadamente 18 meses, muy de preferencia por lo menos aproximadamente 24 meses; (b) la composición se almacena a una temperatura de aproximadamente 25°C a aproximadamente 30°C durante por lo menos aproximadamente 3 meses, de preferencia por lo menos 6 meses, muy de preferencia por lo menos aproximadamente 12 meses; (c) la composición se almacena a una temperatura de aproximadamente 40°C durante por lo menos aproximadamente 1 mes, de preferencia por lo menos aproximadamente 2 meses, muy de preferencia por lo menos aproximadamente 3 meses; o (d) la composición se somete a por lo menos 1 ciclo de congelación/descongelación, de preferencia por lo menos 2 ciclos de congelación/descongelación, de preferencia por lo menos 3 ciclos de congelación/descongelación, de preferencia por lo menos 4 ciclos de congelación/descongelación, de preferencia por lo menos 5 ciclos de congelación/descongelación, y muy de preferencia por lo menos 6 ciclos de congelación/descongelación. Después, los fragmentos de anticuerpo se separan cromatográficamente de la composición (por ejemplo usando filtración en gel) y se determina el grado de fragmentación del cromatograma resultante. Las composiciones farmacéuticas líquidas estables de la presente invención normalmente tienen un volumen de banda de fragmento en el cromatograma que es menor de aproximadamente 9%, menor de aproximadamente 8%, menor de aproximadamente 7%, menor de aproximadamente 6%, menor de aproximadamente 5%, o menor de aproximadamente 4.5% del volumen de banda total en el cromatograma. En un ejemplo específico de esta técnica para medir la fragmentación, la composición se almacena durante 24 semanas a 40°C y después se hace una separación cromatográfica usando PAGE reducido /SDS (rSDS-PAGE) con volúmenes de banda determinados por exploración con un densitómetro personal PDQC-90 Molecular Dynamics, o un densitómetro de imagen GS800 Bio-Rad. Esta técnica se usó para medir la fragmentación del anticuerpo en el ejemplo 11 , en donde, por ejemplo, la formulación No. 37 (que contiene un agente quelante) exhibió un volumen de banda de fragmento en el cromatograma de aproximadamente 4.5%, mientras que la formulación No. 26 (que carece de un agente quelante) exhibió un volumen de banda de fragmento en el cromatograma de aproximadamente 10.1 %. En general, la diferencia entre el volumen de banda de fragmento para una composición farmacéutica líquida estable de la presente invención, y el volumen de banda de fragmento para una composición por lo demás idéntica que carece del agente quelante y se somete a las mismas condiciones, es de por lo menos aproximadamente 2%, por lo menos aproximadamente 3%, por lo menos aproximadamente 4%, o por lo menos aproximadamente 5%. Por ejemplo, esta diferencia entre la formulación 37 (volumen de banda de fragmento en el cromatograma de aproximadamente 4.5%) y la formulación 26 (volumen de banda de fragmento en el cromatograma de aproximadamente 10.1 %), probadas en el ejemplo 11 como se menciona arriba, es de aproximadamente 5.6%.

Métodos de tratamiento Cualquiera de los tipos de anticuerpos aquí descritos se puede usar terapéuticamente. En una modalidad preferida, el anticuerpo anti-CTLA-4 es un anticuerpo humano. En otra modalidad preferida, el CTLA-4 es humano y el sujeto es un sujeto humano. En otra modalidad, el anticuerpo anti-CTLA-4 es un anticuerpo lgG2 humano. Alternativamente, el sujeto puede ser un mamífero que expresa una proteína CTLA-4 con la que el anticuerpo anti-CTLA-4 reacciona cruzadamente. Para aplicaciones veterinarias o como un modelo animal de enfermedad humana, el anticuerpo se puede administrar a un mamífero no humano que expresa un CTLA-4 con el que el anticuerpo reacciona cruzadamente (es decir, un primate). Tales modelos animales pueden ser útiles para evaluar la eficacia terapéutica de los anticuerpos de esta invención. La presente invención provee un método para el tratamiento de una condición de neoplasia en un sujeto, que comprende administrar al sujeto una composición farmacéutica líquida que comprende un anticuerpo anti-CTLA-4; y un agente quelante sólo o en combinación con otros excipientes, elegidos de un amortiguador, un agente de tonicidad, o un agente tensioactivo, y mezclas de los mismos. En modalidades adicionales, el sujeto anteriormente mencionado requiere la prevención o tratamiento de una condición de neoplasia. En otra modalidad, la presente invención provee un método para tratamiento de una condición de neoplasia en un sujeto, que comprende administrar al sujeto una composición farmacéutica líquida que comprende el anticuerpo anti-CTLA-4 ticilimumab; y un excipiente farmacéuticamente aceptable que comprende un agente quelante solo o en combinación con otros excipientes, elegidos de un amortiguador, un agente de tonicidad, o un agente tensioactivo, y mezclas de los mismos. Los dos términos, "neoplasia" y "condición de neoplasia" se refieren a un "neoplasma" o tumor, que puede ser benigno, premaligno, metastásico, o maligno. La presente invención también abarca neoplasias benignas, premalignas, metastásicas o malignas. La presente invención también abarca tumores benignos, malignos, metastásicos, o malignos. De esta manera, la presente invención abarca todas las neoplasias o tumores benignos, premalignos, metastásicos o malignos, y pueden ser referidos intercambiablemente como neoplasia, neoplasmas o condiciones relacionadas con neoplasia. Generalmente se sabe que los tumores son una masa de neoplasia o células "neoplásicas". Aunque se entiende que se considera incluso una célula neoplásica, para los fines de la presente invención es un neoplasma o alternativamente neoplasia. Las condiciones de neoplasia que pueden ser tratadas con un anticuerpo anti-CTLA-4 de la invención pueden incluir cualquier tejido u órgano e incluyen, sin limitación, cáncer del hueso, cerebro, pulmón, célula escamosa, vejiga, gástrico, pancreático, mamario, de la cabeza, cuello, hígado, renal, ovárico, prostático, colorrectal, esofágico, ginecológico (por ejemplo cervical y ovárico), nasofaríngeo, o de la tiroides. El término neoplasia también abarca condiciones que son metástasis de hueso, melanomas, linfomas, leucemias y mielomas múltiples. En particular, las formulaciones de anticuerpo anti-CTLA-4 de la presente invención son útiles para tratar el cáncer de la mama, próstata, colon y pulmón. En otras modalidades, los métodos y composiciones de la presente invención abarcan la prevención y tratamiento de las condiciones de neoplasia seleccionadas del grupo que consiste en melanoma lentiginoso acral, queratosis actínica, adenocarcinoma, carcinoma quístico adenoide, adenomas, poliposis adenomatosa familiar, pólipos familiares, pólipos del colon, pólipos, adenosarcoma, carcinoma adenoescamoso, carcinoma adrenocortical, linfoma relacionado con el SIDA, cáncer anal, tumores astrocíticos, carcinoma de la glándula de Bartholin, carcinoma de célula basal, cáncer del ducto biliar, cáncer de la vejiga, glíoma de tronco cerebral, tumores cerebrales, cáncer mamario, carcinomas de glándula bronquial, carcinoma capilar, carcinoídes, carcinoma, carcinoma de las trompas de Falopio, carcinoma del endometrio, carcinosarcoma, cavernoso, línfoma del sistema nervioso central, astrocitoma cerebral, colangiocarcinoma, condosarcoma, papiloma/carcinoma del plexo coroidal, carcinoma de célula clara, cáncer de la piel, cáncer del cerebro, cáncer del colon, cáncer colorrectal, linfoma cutáneo de células T, cistadenoma, tumor del seno endodérmíco, hiperplasia endometrial, sarcoma estromal endometrial, adenocarcinoma endometrioide, ependimal, epiteloide, cáncer esofágico, sarcoma de Ewing, tumor de célula germinal extragonadal, fibrolamínar, hiperplasia nodular focal, cáncer de la vesícula biliar, gastrinoma, tumores de célula germinal, tumor trofoblástico gestacíonal, glioblastoma, glioma, glucagonoma, hemangiblastomas, hemangioendotelioma, hemangíomas, adenoma hepático, adenomatosis hepática, carcinoma hepatocelular, linfoma de Hodgkin, cáncer hipofaríngeo, glioma de la ruta hipotalámica y visual, insulinoma, neoplasia intraepitelial, neoplasia de célula escamosa interepitelial, melanoma intraocular, carcinoma de célula escamosa invasivo, carcinoma de célula grande, carcinoma de célula de isleta, sarcoma de Kaposí, cáncer de riñon, cáncer laríngeo, leiomiosarcoma, melanomas de lentigo malignos, condiciones relacionadas con leucemia, cáncer de labio y la cavidad oral, cáncer del hígado, cáncer del pulmón, linfoma, tumores mesoteliales malignos, timoma maligno, meduloblastoma, meduloepitelioma, melanoma, meníngeno, carcinoma de células de Merkel, mesotelial, carcinoma metastásico, carcinoma mucoepidermoide, mieloma múltiple /neoplasma de célula del plasma, micosis fungoide, síndrome mielodisplásico, condiciones mieloproliferativas, cáncer de la cavidad nasal y del seno paranasal, cáncer nasofaríngeo, neuroblastoma, melanoma nodular, adenocarcinoma neuroepitelial, neoplasmas del sistema nervioso central (por ejemplo, linfoma primario del SNC, tumores del eje espinal, gliomas del tronco cerebral o adenomas de pituitaria), linfoma no Hodgkin, carcinoma de células en avena, oligodendroglial, cáncer oral, cáncer orofaríngeo, osteosarcoma, polípéptido pancreático, cáncer ovárico, tumor de célula germinal del ovario, cáncer pancreático, adenocarcinoma seroso papilar, célula pineal, tumores de pituitaria, plasmacitoma, pseudosarcoma, blastoma pulmonar, cáncer paratiroideo, cáncer del pene, feocromocitoma, tumores neuroectodérmicos primitivos pineal y supratentohal, tumor de la pituitaria, neoplasma de célula de plasma, blastoma pleuropulmonar, cáncer de próstata, cáncer rectal, carcinoma de célula renal, retinoblastoma, rabdomiosarcoma, sarcoma, carcinoma seroso, carcinoma de célula pequeña, cáncer del intestino delgado, carcinomas de tejido blando, tumor de secreción de somatostatina, carcinoma escamoso, carcinoma de célula escamosa, melanoma de diseminación superficial submesotelial, tumores neuroectodérmicos primitivos supratentoriales, cáncer de la tiroides, carcinoma no diferenciado, cáncer uretral, cáncer uterino, melanoma uveal, carcinoma verrucoso, cáncer vaginal, vipoma, cáncer vulvar, macroglobulinemía de Waldenstrom, carcinoma bien diferenciado y tumor de Wilm. En una modalidad muy preferida, el anticuerpo anti-CTLA-4 se administra a un sujeto con cáncer mamario, cáncer de próstata, cáncer de pulmón o cáncer de colon. En una modalidad muy preferida, el método detiene la proliferación anormal del cáncer, o evita el aumento de peso o volumen del cáncer, o disminuye su peso o volumen.

Artículos de fabricación En otra modalidad de la invención se provee un artículo de fabricación que comprende un contenedor que guarda la formulación farmacéutica líquida que comprende por lo menos uno de los anticuerpos anti- CTLA-4 monoclonales de la presente invención, en una formulación que comprende un agente quelante solo o en combinación con otros excipientes farmacéuticamente aceptables, y opcionalmente provee instrucciones para su uso. Los contenedores adecuados incluyen por ejemplo botellas, frascos, bolsas y jeringas. El contenedor se puede formar de una variedad de materiales tales como vidrio o plástico. Un contendor ejemplar es un frasco de vidrio de un solo uso de 3-20 ml. Alternativamente, para una formulación de multidosis, el contenedor puede ser un frasco de vidrio de 3-100 ml. El contenedor guarda la formulación, y la etiqueta asociada con el contendor puede indicar las instrucciones de uso. Además, el artículo de fabricación incluye otros materiales deseables desde un punto de vista comercial y del usuario, que incluyen otros amortiguadores, diluentes, filtros, agujas, jeringas, e inserciones en el envase con instrucciones de uso, contraindicaciones, y/o lista de efectos secundarios potenciales. La presente invención también provee un equipo para preparar una composición líquida de un anticuerpo estabilizado que comprende un primer contenedor, que comprende el anticuerpo monoclonal anti-CTLA-4 1 1.2.1 en solución, y un segundo contenedor que comprende una cantidad suficiente de un agente quelante solo o en combinación con otros excipientes en solución para estabilizar el anticuerpo. Los siguientes ejemplos describen las modalidades de la invención. Otras modalidades dentro del alcance de las reivindicaciones de la presente serán evidentes para el experto en materia de la consideración de la especificación o práctica de la invención como se expone en la presente. Se considera que la especificación, junto con los ejemplos, es únicamente ejemplar, ya que el alcance y espíritu de la invención es indicada por las reivindicaciones que se dan después de los ejemplos. En los ejemplos, todos los porcentajes se dan en peso a menos que se indique de otra manera. El experto en la materia apreciará que las cantidades en peso o las relaciones de peso a volumen citadas en los ejemplos pueden ser convertidas a moles y/o molaridades usando los pesos moleculares reconocidos de los ingredientes citados. Las cantidades en peso ejemplificadas en la presente (por ejemplo gramos) son para los volúmenes citados (por ejemplo de soluciones amortiguadoras, formulación de anticuerpo, etc.). El experto en la materia apreciará que las cantidades en peso se pueden ajustar proporcionalmente cuando se desean diferentes volúmenes de formulación.

EJEMPLO 1 Este ejemplo muestra la generación de líneas de células de hibridoma que producen anticuerpos anti-CTLA-4 como se describe en la patente de EE. UU. No. 6,682,736, de Hanson y otros. Los anticuerpos de la invención se preparan, seleccionan y prueban de la siguiente manera: Preparación de antígeno: Se prepararon tres inmunógenos distintos para la inmunización de los ratones XenoMouse™: (i) una proteína de fusión CTLA4-lgG, (ii) un péptido de CTLA-4, y (iii) células de linfoma murinas 300.19 transfectadas con un mutante de CTLA-4 (Y201V) que es expresado constitutivamente en la superficie celular. Proteína de Fusión CTLA4-lgG1 : Construcción del vector de expresión El ADNc que codifica del dominio extracelular maduro de CTLA-4 se amplificó mediante PCR partiendo de una colección de ADNc de timo humano (Clontech) usando los iniciadores designados para la secuencia publicada (Eur. J Imnunol 18:1901 -1905 (1988)). El fragmento se subclonó direccionamente en pSR5, un plásmido de expresión del virus Sindbis (InVitrogen), entre el péptido señal de oncostatina M humana y los dominios CH1/CH2/CH3 de IgG gamma 1 (lgG1 ) humana. La proteína de fusión no contiene un dominio de gozne pero contiene cisteína 120 en el dominio extracelular de CTLA-4 para formar un dímero covalente. El vector resultante se denominó CTLA-4-lgG1/pSR5. Se confirmó la secuencia del ADNc completo de CTLA-4-lgG1 en el vector en ambas cadenas. La secuencia de aminoácidos de la proteína CTLA4-lg se muestra más abajo. El dominio extracelular maduro para CD44 se amplificó mediante PCR partiendo de una colección de linfocito humano (Clontech), y se subclonó en pSinRepd, para generar una proteína de control con la cola idéntica de lgG1. Proteína de Fusión OM-CTLA4-lgG1 : MGVLLTQRTLLSLVLALLFPSMASMAMHVAQPAWLASSRGIA SFVCEYASPGKATEVRVTVLRQADSQVTEVCAATYMMGNELTFLDDSICTGT SSGNQVNLTIQGLRAMDTGLYICKVELMYPPPYYLGIGNGTQIYVIDPEPCPD SDLEGAPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNVVYVDGV EVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPTPEE KTISKAKGQPREPQVYLTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESN GQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHN HYTQKSLSLSPGK Subrayado = péptido señal Los ADNc para el dominio extracelular maduro de CD28 se amplificaron mediante PCR partiendo de una colección de linfocito humano (Clontech), y después se subclonaron en pCDMd (J. Immunol. 151 :5261 -71 (1993)), para producir una proteína de fusión lgG1 humana que contiene regiones de corte y gozne de trombina. Se clonó CTLA4 de tití, mono cynomologus y mono rhesus de ARNm aislado de PBMCs estimulada con PHA utilizando técnicas estándares de PCR degenerada. La secuenciación demostró que las secuencias de aminoácidos del mono rhesus y cynomologus fueron idénticas, con tres diferencias del dominio extracelular de CTLA4 humano maduro (S13N, 117T y L105M). El tití mostró diez diferencias de aminoácido del dominio extracelular de CTLA4 humano maduro (V21 A, V33I, A41T, A51G, 541 , S71 F, Q75K, T88M, L10M y G106S). Se utilizó mutagénesis dirigida al sitio para hacer mutaciones de un solo punto de todos los aminoácidos diferentes en CPLA4 de tití para mapear los aminoácidos importantes para la interacción de los anticuerpos con CTLA4-lgG humana.

Se generaron mutaciones de CTLA-lgG de humano y tití para mapeo de epítope por medio de mutagénesis dirigida al sitio para hacer emparejamiento (Promega). Las proteínas de fusión IgG se produjeron mediante transfección transitoria de células Cos7 y se purificaron usando técnicas estándares de proteína A. Las proteínas CTLA4-lgG mutantes se evaluaron para determinar su unión a anticuerpos por medio de inmunoblot, y usando análisis de BIAcore.

Expresión/purificación de proteína recombinante Se generaron virus sindbis recombinantes mediante electroporación de células de riñon de hámster crío (Gibco) con ARNm de CTLA-4-lgG1/pSR5 transcrito in vitro de SP6 y ARNm ayudador de DH-26S, como lo describe InVitrogen. Cuarenta y ocho horas después se cosecharon virus recombinantes y se titularon para obtener una expresión óptima de proteína en células de ovario de hámster chino (CHO-K1 ). Las células CHO-Kl se cultivaron en suspensión en DMEM/F12 (Gibco) que contenía 10% de suero bovino fetal inactivado por calor (Gibco), aminoácidos no esenciales (Gibco), glutamina 4 mM (Gibco), penicilina/estreptomicina (Gibco), 10 mM de Hepes pH 7.5 (Gibco). Para producir CTLA-4-lgG, las células CHO-K1 se resuspendieron en 1 X107 células/ml en DMEM/F12 y se incubaron con virus sindbis durante una hora a temperatura ambiente. Las células se diluyeron entonces a 1 X106/ml en DMEM/F12 que contenía 1 % de suero bovino fetal agotado de IgG bovina usando Protein A Sepharose (Pharmacia), aminoácidos no esenciales, 4 mM de glutamina, 12.5 mM de Hepes, pH 7.5, y penicilina/estreptomicina. Cuarenta y ocho horas después de la infección las células se hicieron pella y el medio acondicionado se cosechó y complementó con tabletas inhibidoras de proteasa completa (Boehringer Mannheim), el pH se ajustó a 7.5 y se filtró a 0.2µ, (Nalgene). Se usó FPLC (Pharmacia) para purificar por afinidad la proteína de fusión usando una columna de proteína A HiTrap de 5 ml (Pharmacia), a una velocidad de flujo de 10 ml/min. La columna se lavó con 30 volúmenes de lecho de PBS y se eluyó con 0.1 M de glicina/HCI pH 2.8 a 1 ml/min. Las fracciones (1 ml) se neutralizaron inmediatamente a pH 7.5 con Tris pH 9. Las fracciones que contenían CTLA-4-lgG1 se identificaron por medio de SDS-PAGE y después se concentraron usando centriplus 50 (Amicon) antes de aplicar a una columna sepharose 200 (Pharmacia) a 1 mL/min, usando PBS como disolvente. Las fracciones que contenían CTLA-4-lgG1 se reunieron, se filtraron en estéril, 0.2µ (Millipore), se dividieron en alícuotas y se congelaron a -80°C. La CD44-lgG1 se expresó y se purificó usando los mismos métodos. La CD28-lgG se purificó de medio acondicionado partiendo de células Cos7 transfectadas transitoriamente. Caracterización de CTLA-4-lgG1: La CTLA-4-lgG1 purificada emigró como una sola banda sobre SDS-PAGE usando tinción coloidal de coomassíe (Novex). Bajo condiciones reductoras CTLA-4-lgG1 era un dímero (100 kDa), que se redujo a un monómero de 50 kDa cuando se trató con DTT 50 mM. La secuenciación de aminoácidos de la CTLA-4-lgG1 purificada en solución, confirmó el extremo N de CTLA-4 (MHVAQPAVVLAS), y que el péptido señal de oncostatin-M fue cortado de la proteína de fusión madura. La CTLA-4-lgG1 se enlazó con B7.1-lgG inmovilizada, de una manera dependiente de la concentración, y la unión se bloqueó con un anticuerpo antí-CTLA-4 de hámster anti-humano (BNI3:PharMingen). La CTLA-4-lgG estéril estaba libre de endotoxina y se cuantíficó por medio de su DO28o usando 1.4 como coeficiente de extinción. El rendimiento de la CTLA-4-lgG purificada varió de 0.5-3 mg/litro de células CHO-K1.

Péptido CTLA-4 El siguiente péptido de CTLA-4 se preparó como se describe más abajo: NH2:MHVAQPAVVLASSRGIASFVCEYASPGKATEVRVTVLRQA DSQVTEVCAATYMMGNELTFLDDSICTGTSSGNQVNLTIQGLRAMDTGLYIC KVELMYPPYYLGIGNGTQIYVIDPEPC-CONH2 Abreviaciones/Materiales NMP, N-Metilpirrolidínona; TFE, 2,2,2-trifluoroetanol; DCM, diclorometano; FMOC, Fluorenilmetoxicarbonilo. Todos los reactivos fueron provistos por Perkin Elmer, con las siguientes excepciones: TFE, Aldrich Chemical; resina FMOC-PAL-PEG, Perspeptive Biosystems; Fmoc-Arg(PMC)-OH; FMOC-Asn(Trt)-OH, FMOC-Asp(tBu)-OH, FMOC-Cys(Trt)-OH, FMOC-Glu(tBu)-OH, FMOC-Gln(Trt)-OH, FMOC-His(Boc)-OH, FMOC-Lys(BOC)-OH, FMOC-Ser(tBu)-OH, FMOC-Thr(tBu)-OH y FMOC-Tyr(tBu)-OH, se usaron para los aminoácidos que requerían grupos protectores de cadena lateral.

Síntesis del péptido La síntesis del péptido se realizó en un Perkin-Elmer 431 A, retroajustado con monitoreo de retroalimentación por medio de absorbancia UV a 301 nm (detector Perkin-Elmer Modelo 759A). La secuencia del péptido se ensambló en una resina FMOC-PAL-PEG usando ciclos de acoplamiento dobles condicionales. Los acoplamientos dobles forzados se realizaron a ciclos 10, 11 , 18, 19, 20 y 28 a 33. La resina se lavó con una mezcla al 50% de DCM y TFE al fínal de cada ciclo de acilación, seguido por un bloqueo de grupos amino sin reaccionar con anhídrido acético en NMP; la resina se removió del reactor después de completar el ciclo 49 y el resto continuó hasta la terminación. La separación del péptido de la resina se realizó usando el reactivo K (King y otros. International Journal of Protein and Peptide Research 36:255-266 (1990)) durante 6 horas, sobre 415 mg de resina, produciendo 186 mg de péptido CTLA-4 crudo.

Caracterización del péptido Alícuotas de 25 mg del péptido CTLA-4 crudo se disolvieron en 5 ml de Guanidina HCl 6M /K2PO3 100 mM a pH 6.4, y se eluyeron sobre una columna Pharmacia Hi Load Superdex 75 16/60 (16 mmX600 mm, volumen de lecho 120 ml) con guanidina HCl 2M /K2PO3 100 MM a pH 6.4, a 2 ml/min durante 180 minutos, recogiendo fracciones de 5 ml. Las fracciones se analizaron cargando 1.7 µl de fracciones sobre un gel NuPAGE Laemeli que corre con un amortiguador de corrida MES, y visualizando mediante un protocolo de tinción de plata Daichií. Las fracciones que exhibieron un peso molecular de 12 kDa, evaluados contra estándares de peso molecular, se reunieron y almacenaron a 4°C. Las fracciones combinadas se analizaron mediante UV y electroforesis en gel. Se hizo una secuenciación de aminoácidos absorbiendo una muestra de 100 microlitos en un cartucho ProSorb (absorbido sobre una membrana de PVDF), y lavando para remover las sales de amortiguador. La secuenciación se realizó en un secuenciador Applied Biosystems 420. Se observó la secuencia N-terminal esperada (MHVAQPAVVLA). El ¡nmunoblot demostró que el péptido fue reconocido por el anticuerpo anti-CTLA-4 humano BNI3 (PharMingen). Para desalar, una alícuota que contenía 648 µg de material se colocó en tubería de diálisis 3500 Da MWCO y se dializó contra TFA 0.1 % /H2O a 4°C durante 9 días, con agitación. El contenido completo de la bolsa de diálisis se liofilizó hasta quedar un polvo.

Células "300.19" transfectadas con antíqeno de péptido CTLA-4 (Y201V) El ADNc de CTLA-4 de longitud completa se amplificó mediante PCR partiendo de una colección de ADNc de timo humano (Stratagene), y se subclonó en pIRESneo (Clontech). Se introdujo una mutación de CTLA-4 que da como resultado la expresión constitutiva en la superficie celular usando el MatchMaker Mutagenesis System (Promega). La mutación de tirosina, Y201 a valina inhibe la unión de la proteína adaptina AP50 que es responsable de la rápida internación del CTLA-4 (Chuang y otros, J. Immunol. 159:144-151 (1997)). Se cultivaron células de linfoma murino 300.19 libres de micoplasma en RPMI-1640 que contenía 10% de suero fetal de becerro, aminoácidos no esenciales, penicilina/estreptomicina, 2 mM de glutamina, 12.5 mM de Hepes, pH 7.5, y 25 µM de beta-mercaptoetanol. Las células se sometieron a electroporación (3X106/0.4 ml RPMI libre de suero) en una cámara de 1 ml con 20 ug de CTLA-4-Y201V/plRESneo, utilizando 200V/1180 uF (Gibco CellPorator). Las células se dejaron reposar 10 minutos y después se les añadieron 8 ml de medio RPMI completo previamente calentado. A las 48 horas las células se diluyeron a 0.5 X 106/ml en medio RPMI completo que contenía 1 mg/ml de G418 (Gibco). Las células resistentes se expandieron y mostraron la expresión de CTLA4 sobre la superficie celular, usando el anticuerpo BNI3 conjugado con picoeritrina (PharMingen). Se aislaron células con expresión de alto nivel mediante clasificación en estéril.

Inmunización y generación de hibridoma Ratones XenoMouse™ (de 8 a 10 semanas de edad) se inmunizaron (¡) subcutáneamente en la base de las colas con 1X107 células 300.19 que se había transfectado para expresar CTLA-4 como se describió arriba, resuspendidas en solución salina amortiguadora de fosfato (PBS) con adyuvante completo de Freund, o (ii) subcutáneamente en la base de la cola con (a) 10 µg de la proteína de fusión CTLA-4, o (b) 10 µg de péptido CTLA-4 emulsionado con ayudante completo de Freund. En cada caso la dosis se repitió tres o cuatro veces en adyuvante incompleto de Freund. Cuatro días antes de la fusión los ratones recibieron una inyección fínal del inmunógeno o células en PBS. Los linfocitos de bazo y/o ganglio linfático de ratones inmunizados se fusionaron con la [línea de células P3 de mieloma no secretoras murinas] y se sometieron a selección de HAT como se describió previamente (Galfre, G. y Mílstein, O, "Peparation of monoclonal antibodies: strategies and procedures". Methods Enzymol. 73:3-46 (1981 )). Se recuperó un panel grande de hibridomas que secretan anticuerpos lgG2K humanos específicos de CTLA-4.

Los siguientes hibridomas que producen anticuerpos anti-CTLA- 4 designados de la siguiente manera, se depositaron en la Colección Americana de Cultivos Tipo (American Type Culture Collection, 10801 University BIvd. Manassas, Va. 201 10-2209), el 29 de abril de 2003: Clona Subclona No. Registro ATCC 11.2.1 11.2.1.4 PTA-5169 4.1.1 4.1.1.1 PTA-5166 EJEMPLO 2 Este ejemplo muestra la generación de líneas de células recombinantes de mamífero que producen anticuerpos anti-CTLA-4. El ADN que codifica la cadena pesada y ligera del anticuerpo monoclonal 11.2.1 se clonó de la línea de células del híbridoma respectivo 1 1.2.1 , y las secuencias del ADN se determinaron mediante los métodos conocidos para el experto en la materia. A partir de la secuencia de ácidos nucleicos y la secuencia predicha de aminoácidos del anticuerpo 1 1.2.1 , se determinó la identidad del uso de gen para cada cadena de anticuerpo. Después, los insertos de secuencia de ADN de 11.2.1 se subclonaron en vectores de expresión. Subsiguientemente los vectores de expresión se transfectaron a una célula hospedera de mieloma de ratón (NSO) para generar varias líneas de células transfectadas primarias que producen anticuerpos anti-CTLA-4. Se eligió una línea de células guía basándose en el crecimiento y el análisis de productividad. La línea guía se subclonó posteriormente para generar una línea de células clónales. El anticuerpo anti-CTLA-4 se produjo mediante cultivo de células usando la línea celular en un biorreactor que contenía medio de cultivo celular. El medio se suplemento con nutrientes durante la producción. Después de cumplir con el criterio de cosecha se cosechó del biorreactor por filtración sola o por centrifugación seguida por filtración. Después, el sobrenadante clarificado se purificó con tres pasos cromatográficos que comprenden una columna de afinidad de proteína A y dos columnas de intercambio iónico. También se hizo una inactivación de pH bajo y una filtración viral para eliminar cualquier virus potencial en el proceso. El producto se concentró y se sometió a diafiltración en el amortiguador de formulación para hacer la sustancia medicamentosa.

EJEMPLO 3 Se realizó un estudio para evaluar el efecto de cuatro amortiguadores diferentes sobre la agregación y fragmentación del anticuerpo. Específicamente, se prepararon cuatro formulaciones líquidas que comprenden el anticuerpo anti-CTLA-4 11.2.1 y amortiguador de acetato, succinato, histidína o EDTA. Después, las formulaciones se guardaron a 40°C y se tomaron mediciones de la agregación y fragmentación de anticuerpo a las semanas 0, 2, 5 y 7.

Preparación de soluciones amortiguadoras Se prepararon cuatro soluciones amortiguadoras como se describe en el cuadro 3. Primero cada solución se preparó disolviendo una cantidad de la especie amortiguadora (enlistada en el cuadro 3) en agua (aproximadamente a 80% del objetivo). Después el pH de cada solución amortiguadora se ajustó a 5.5 agregando una cantidad suficiente de la solución acida o básica indicada en el cuadro 3. Después de ajustar el pH se le añadió una cantidad extra de agua para proveer una concentración final amortiguadora de 20 mM. La concentración de amortiguador de 20 mM se seleccionó para asegurar una estabilidad razonable del pH al pH seleccionado de 5.5. Después se filtró la solución amortiguadora a través de un filtro de esterilización (tamaño de poro de 0.22 mieras) hacia un receptáculo estéril para uso subsiguiente.

CUADRO 3 Soluciones amortiguadoras La solución de ácido acético glacial al 1 % v/v se preparó mediante la dilución apropiada (1 ml a 100 ml) de ácido acético glacial (99.9%) con agua. La solución de hidróxido de sodio 1 molar (M) se preparó disolviendo 40 g de hidróxido de sodio sólido en 1 L de agua. La solución de ácido clorhídrico 5 molar (M) se preparó medíante la dilución apropiada de ácido clorhídrico concentrado (37.8%) con agua.

Preparación de las Formulaciones de Anticuerpo Las formulaciones de anticuerpo que se evaluaron se indican en el cuadro 4 más abajo. Para preparar cada formulación, primero se agregó una cantidad del tonificante (indicado en mg/ml en el cuadro 4) a la solución amortiguadora indicada, y la solución se agitó hasta que se disolvió el tonificante. Se obtuvo una solución del anticuerpo a granel del proceso de purificación descrito en el ejemplo 2, a 13.2 mg/mL en solución amortiguadora de acetato de sodio 20 mM, pH 5.5, +140 mM de cloruro de sodio. Se hizo intercambio de amortiguador de esta solución de granel hacia las soluciones de formulación anteriormente identificadas, con concentradores de centrífuga Amicon Ultra 15 MWCO10K (UFC901024), en una centrífuga Beckman Coulter Allegra 21 R, corrida a 6500 RPM a 5°C. Se hicieron aproximadamente 8 intercambios de volumen y la solución de anticuerpo se concentró a entre 27 y 30 mg/ml. Se prepararon aproximadamente de 3 a 4 ml de las formulaciones 1 a 18. Las concentraciones de anticuerpo se determinaron mediante un método de espectrometría ultravioleta-visíble (UV-Vis) usando un coeficiente de extinción de 1.43 (mg/ml)"1 cm"1 a 280 nm. Se preparó una solución de polisorbato 80 (PS80), 20 mg/ml, por dilución y disolución del polisorbato 80 con el amortiguador de formulación apropiado preparado como se describe arriba. Después, el polisorbato 80 se añadió a las soluciones de anticuerpo y amortiguador como un concentrado de 20 mg/ml, junto con la cantidad apropiada de amortiguador, anticuerpo, tonificante y agua, para obtener una solución final de 20 mg/ml del anticuerpo monoclonal anti-CTLA-4 en la formulación correspondiente a las composiciones del cuadro 4 siguiente. Para la formulación No. 2 del cuadro 4, se agregó PEG3350 como un concentrado de 200 mg/ml en este punto. Después, las formulaciones se filtraron a través de filtros de esterilización de 0.2 µ y se vaciaron en frascos. Se usó un volumen de llenado de 0.5 ml a 1 ml en frascos de vidrio de 2 ml de tipo 1. Los frascos se cerraron con tapones Daikyo 777-1 recubiertos con Flurotec®, se sellaron y se colocaron en cámaras de estabilidad guardadas verticalmente a 40°C durante 2, 5 y 7 semanas. Los frascos estaban lavados y esterilizados en autoclave, igual que los tapones de suero Daikyo 777-1 de 13 mm. Inmediatamente se analizó por duplicado el grado de agregación y fragmentación en los frascos.

CUADRO 4 Formulaciones de anticuerpo analizadas Análisis de agregación Las formulaciones de anticuerpo del cuadro 4 se almacenaron a una temperatura de 40°C. A las semanas 0, 2, 5 y 7, se analizó cada 20 formulación para determinar la agregación utilizando cromatografía de exclusión de tamaño (SEC). La cromatografía de exclusión de tamaño se efectuó usando una columna G3000SWXL-G2000SWXL de gel TSK, fase móvil de amortiguador de fosfato de sodio 0.2 M a pH 7.0, una velocidad de flujo de 1 ml/min, y detección en UV a 214 nm. La figura 1 muestra el porcentaje de las especies eluidas de peso molecular alto (es decir, los agregados del anticuerpo monoclonal anti-CTLA-4 11.2.1 ), determinado a los tiempos relevantes para cada una de las formulaciones. El grado de agregación se calculó integrando las áreas bajo los picos del cromatograma de cada formulación, y reportando las áreas integradas bajo los picos de las especies de peso molecular alto como un porcentaje del área pico total (véase la figura 1 ). Como puede verse en la figura 1 , las formulaciones con amortiguador de EDTA mostraron el más bajo grado de agregación, seguido por las formulaciones con amortiguador de histidína, acetato y succínato, en ese orden.

Análisis de fragmentación Como se indicó arriba, las formulaciones de anticuerpo del cuadro 4 se almacenaron a una temperatura de 40°C. A las semanas 0, 2, 5 y 7, cada formulación también se analizó para determinar la fragmentación usando rSDS-PAGE. El análisis de rSDS-PAGE se hizo usando un gel de NuPAGE, bis-tris 4% a 12% ,y tinción de azul coloidal (Coomassie). Para los geles reducidos (rSDS-PAGE), la reducción se logró mediante el agente reductor NuPAGE®. Se estimó el total de impurezas hidrolíticas (es decir, los fragmentos de anticuerpo monoclonal anti-CTLA-4 11.2.1 ) por medio de exploración con un densitómetro Molecular Dynamics Personal Densitometer PDQC-90, o un densitómetro de imagen Bío-Rad GS800. La figura 2 muestra el porcentaje de fragmentación medida a los tiempos relevantes para cada una de las formulaciones. El grado de fragmentación se calculó como un porcentaje del volumen total de banda (véase la figura 2). Como puede verse en la figura 2, las formulaciones con amortiguador de EDTA mostraron el grado más bajo de fragmentación, seguidas por las formulaciones con amortiguador de histidina, acetato y succinato, en ese orden. Los cuadros 5(a)-5(d) indican la agregación y fragmentación que se presenta gráficamente en las figuras 1 y 2; 5(a): 0 semanas; 5(b): 2 semanas; 5(c): 5 semanas; y 5(d): 7 semanas.

CUADRO 5(a) Resultados de agregación y fragmentación en el punto de tiempo 0 CUADRO 5(b) Resultados de agregación y fragmentación a las 2 semanas CUADRO 5(c) Resultados de agregación y fragmentación a las 5 semanas CUADRO 5(d) Resultados de agregación y fragmentación a las 7 semanas EJEMPLO 4 Se realizó un estudio para evaluar la capacidad de diferentes formulaciones líquidas que comprenden anticuerpo monoclonal anti-CTLA-4 1 1.2.1 para tolerar múltiples ciclos de congelación y descongelación. La capacidad de una formulación líquida para resistir múltiples cíelos de congelación/descongelación frecuentemente se evalúa para determinar si la formulación se puede almacenar (y, si se desea, transportar) congelada y después descongelarse para uso posterior. Las formulaciones que se evaluaron se indican en el cuadro 6. El procedimiento usado para preparar las formulaciones es el mismo que se describe en el ejemplo 3. Se colocaron 2.5 mL de cada solución en frascos de vidrio de tipo 1 de 5 ml, se taparon y sellaron. Las formulaciones identificadas más abajo como los números 1 a 4, 7 a 8, 11 a 12, y 15 a 16, fueron idénticas a las formulaciones que tienen los mismos identificadores numéricos en el ejemplo 3.

CUADRO 6 Formulaciones de anticuerpo analizadas Cada formulación se sometió a seis ciclos consecutivos de congelación/descongelación. Los primeros tres ciclos se efectuaron en un congelador de velocidad controlada. Los últimos tres ciclos fueron ciclos más lentos efectuados con varios frascos llenos de agua para corresponder con una carga térmica alta colocada en un congelador o refrigerador. Para los ciclos 1 , 2 y 3, los frascos que contenían las formulaciones se colocaron en un congelador de velocidad controlada (Planer Kryo 560-16) y se sometieron al siguiente ciclo: enfriamiento de la formulación a una velocidad de 0.2°C/min hasta alcanzar una temperatura de -70°C; retención a -70°C durante 1.5 horas a 3 horas, y descongelación de la formulación a una velocidad de 0.3°C/min hasta alcanzar una temperatura de 5°C. Para los ciclos 4, 5 y 6, los frascos se colocaron en una caja junto con otros frascos llenos de agua (un frasco de muestra para cada formulación; 17 frascos de formulación con un total de aproximadamente 30 frascos llenos de agua). Después, esta caja se puso en un congelador mantenido a una temperatura de congelador de -70°C durante aproximadamente 17 horas, y después se colocó en un refrigerador mantenido a una temperatura de 2-8°C durante aproximadamente 50 horas. Una sonda térmica de registro colocada en la caja midió una velocidad de enfriamiento promedio de 0.09°C/min para el proceso de congelación, y una temperatura de calentamiento promedio de 0.03°C/mín para el proceso de descongelación. Cada formulación se evaluó visualmente después de cada ciclo de congelación/descongelación para ver la formación de partículas, cambio de color y cambio de turbídez. Dichas observaciones visuales de cada formulación se hicieron en una caja de luz contra fondos blanco y negro mientras la formulación estaba todavía fría después de cada descongelación. El cuadro 7 siguiente indica los resultados.

CUADRO 7 Evaluaciones visuales de la estabilidad del anticuerpo anti-CTLA-4 11.2.1 a la congelación/descongelación CUADRO 7 (Continuación) Las formulaciones que contenían únicamente cloruro de sodio (es decir, iones cloruro) exhibieron un mayor aumento en el grado de partículas solubles después de los cíelos de congelación/descongelación que las formulaciones que contenían trehalosa, sacarosa o sorbitol. La adición de PEG a las formulaciones que contenían cloruro de sodio, sin embargo, pareció reducir el grado de partículas solubles medido después de los ciclos de congelación/descongelación, con respecto a las formulaciones correspondientes que no contenían PEG.

Análisis de aqreqación Además, se midió el porcentaje de aumento de partículas solubles de cada formulación después de seis ciclos consecutivos de congelación/descongelación usando cromatografía de exclusión de tamaño. Después del sexto ciclo de congelación/descongelación, se analizó la agregación de cada formulación usando cromatografía de exclusión de tamaño. La cromatografía de exclusión de tamaño se efectuó usando una columna G3000SWXL-G2000SWXL de gel TSK, fase móvil de amortiguador de fosfato de sodio 0.2 M a pH 7.0, una velocidad de flujo de 1 ml/min, y detección en UV a 214 nm. El cuadro 7 muestra el porcentaje de especies eluidas de peso molecular alto (es decir, los agregados de anticuerpo monoclonal anti-CTLA-4 11.2.1 ), determinado a los tiempos relevantes para cada formulación. El grado de agregación se calculó integrando las áreas bajo los picos del cromatograma de cada formulación y reportando las áreas integradas bajo los picos de las especies de peso molecular alto como un porcentaje del área pico total (véase el cuadro 7). Como puede verse en el cuadro 7, las formulaciones con amortiguador de EDTA mostraron el nivel de agregación más bajo, seguidas por las formulaciones con amortiguador de histidina, acetato y succinato, en ese orden.

EJEMPLO 5 Se hizo un estudio para evaluar el efecto del EDTA, la metíonina y condiciones anaeróbicas sobre la decoloración y agregación en formulaciones líquidas que comprenden el anticuerpo monoclonal anti-CTLA-4 1 1.2.1. La decoloración y agregación en dichas formulaciones líquidas generalmente son indeseables desde una perspectiva estética de producto, una perspectiva de integridad de producto, o ambas cosas. El cuadro 8 siguiente indica los tratamientos de la formulación que se evaluaron. El procedimiento general usado para preparar las formulaciones fue el mismo que se describe en el ejemplo 3. Para este ejemplo, se preparó una formulación inicial que comprende el anticuerpo monoclonal anti-CTLA-4 11.2.1 (5 mg/ml), un amortiguador de acetato de sodio (20 mM), cloruro de sodio (8.2 mg/ml), y polisorbato 80 (0.2 mg/ml), y con pH de 5.5, y se añadió a varios frascos de vidrio de 10 mL que contenían tapas de sello para permitir un muestreo aséptico. Se realizaron varios tratamientos a la formulación inicial de acuerdo con el cuadro 8 siguiente. Como se indica en el cuadro 8, a algunos de los frascos se los agregó metionina. A otros frascos se les agregaron dos concentraciones diferentes de EDTA. Se agregó nitrógeno gaseoso a los espacios superiores de frascos seleccionados que contenían EDTA o metionina. Además, algunos de los frascos restantes no tratados se desairaron antes de la inyección de gas nitrógeno en sus espacios superiores. Además, algunos de los frascos restantes se dejaron sin tratar para actuar como controles experimentales. Dos frascos de cada uno de los tratamientos del cuadro 8 se almacenaron a 40°C durante 0, 2, 4, 6, 8, 10, 4, 16 y 18 semanas. Uno de los dos frascos guardados en cada punto de tiempo se usó para evaluaciones visuales de color, mientras que el otro frasco se muestreó asépticamente para medir el grado de agregación del anticuerpo 11.2.1 después del almacenamiento. Los cuadros 9 y 10 indican los resultados.

CUADRO 8 Tratamientos de formulación de anticuerpo analizados Análisis de apariencia de formulación Cada formulación se evaluó visualmente después de 0 semanas (inicial), y 2, 4, 6, 8, 10, 14, 16 y 18 semanas, para determinar la formación de partículas, cambio de color y cambio de turbidez. Las observaciones visuales se indican en el cuadro 9.

CUADRO 9 Evaluaciones visuales después de los tratamientos de las formulaciones del cuadro 8 Los resultados del cuadro 9 indican que las formulaciones sin EDTA y/o sin metíonina desarrollaron una coloración rosa en el frasco después de su almacenamiento durante al menos cuatro semanas a 40°C. Aunque no se desea limitarse a alguna teoría particular, en una modalidad de la invención se cree que este cambio de color se puede deber, por lo menos en parte, a un proceso oxidativo. Sin embargo, en otras modalidades, el cambio de color se puede deber a otros procesos que no están relacionados con la oxidación. La adición de nitrógeno gaseoso al espacio superior de los frascos pareció afectar menos la reducción de la decoloración que la adición de metionina y/o EDTA.

Análisis de Agregación Las formulaciones de anticuerpo tratadas de acuerdo con el cuadro 8 se almacenaron a una temperatura de 40°C. A las semanas 0, 2, 6, 8, 10, 4, 16 y 18, cada formulación se analizó para determinar la agregación usando cromatografía de exclusión de tamaño. La cromatografía de exclusión de tamaño se efectuó usando una columna G3000SWXL-G2000SWXL de gel TSK, fase móvil de amortiguador de fosfato de sodio 0.2 M a pH 7.0, una velocidad de flujo de 1 ml/min, y detección en UV a 214 nm. El cuadro 10 muestra el porcentaje de las especies eluidas de peso molecular alto (es decir, los agregados del anticuerpo monoclonal anti-CTLA-4 11.2.1 ), determinado a los tiempos relevantes para cada una de las formulaciones. El grado de agregación se calculó integrando las áreas bajo los picos del cromatograma de cada formulación, y reportando las áreas integradas bajo los picos de las especies de peso molecular alto como un porcentaje del área pico total (véase el cuadro 10).

CUADRO 10 Porcentaje de agregación de los tratamientos de las formulaciones del cuadro 8 Los resultados del cuadro 9 indican que las formulaciones sin EDT y/o sin metionina empiezan a desarrollar una coloración rosa en el frasco después de su almacenamiento durante al menos 4 semanas a 40°C Como puede verse en el cuadro 10, las formulaciones tratadas con EDTA y/o metionina mostraron el nivel de agregación más bajo, seguido por las formulaciones tratadas con nitrógeno gaseoso y las formulaciones de control no tratadas EJEMPLO 6 Se realizó un estudio para evaluar el efecto de la metionina y el EDTA sobre la oxidación de ciertos residuos de metionina en el anticuerpo anti-CTLA-4 11.2.1 después de su almacenamiento como una formulación líquida.

Análisis de Oxidación de Metionina El grado de oxidación de los residuos de metionina en las posiciones de aminoácido 256 y 432 en el anticuerpo anti-CTLA-4 11.2.1 , se midió por medio de un método de mapeo de lisina C después de su almacenamiento durante 8 semanas a 40°C. Frascos de vidrio que contenían las formulaciones Nos. 26, 29 y 33 (cuadro 8) y con sus tratamientos del ejemplo 5, se muestrearon asépticamente en el punto de tiempo de 8 semanas. Después, las muestras se digirieron con enzima Lyc-C en amortiguador Tris a pH 8.0, bajo condiciones estándares, y se analizaron por cromatografía de líquidos de alto rendimiento de fase inversa. La separación se realizó usando una columna analítica Grace Vydac Protein C4 con un gradiente de elución de TFA al 0.1 % en agua y TFA al 0.085% en acetonitrilo.

CUADRO 11 Porcentaje de oxidación de aminoácidos de metionina en el anticuerpo anti-CTLA-4 11.2.1 después de los tratamientos indicados en el cuadro 8 Los resultados del cuadro 11 indican que la adición de metionina o EDTA a la formulación de anticuerpo 11.2.1 reduce el porcentaje de oxidación en los dos residuos de metionina indicados, en comparación con las formulaciones almacenadas sin EDTA ni metionina.

EJEMPLO 7 Se realizó un estudio para evaluar la oxidación de algunos residuos de triptófano y tirosina en el anticuerpo anti-CTLA-4 11.2.1. Se encontró que las formulaciones de anticuerpo anti-CTLA-4 1 1.2.1 que desarrollan una decoloración rosa con el tiempo tienen un máximo de absorción característico a 500 nm después de realizar la espectroscopia ultravioleta/visible (UV-Vis). El procedimiento usado para preparar la formulación es el mismo que se describe en el ejemplo 3. Para este ejemplo, una formulación que comprende una solución de 5 mg/ml de anticuerpo monoclonal anti-CTLA-4 1 1.2.1 en un amortiguador de acetato de sodio 20 mM, cloruro de sodio 8.2 mg/ml y polisorbato 80 0.2 mg/ml (a pH 5.5), se almacenó en dos frascos de vidrio durante 4 semanas a 40°C, después de lo cual las formulaciones habían desarrollado una decoloración rosa. La solución de una de las formulaciones de los frascos decolorados se sometió entonces a filtración de corte de peso molecular, lo que permitió que los excipientes de formulación pasaran a través del dispositivo de filtración, dejando atrás los anticuerpos. El eluente de filtración (por ejemplo agua y excipiente) fue claro e incoloro, mientras que la fracción recogida (por ejemplo el anticuerpo 11.2.1 ) permaneció de color rosa. De esta manera, el experimento de filtración indicó que la decoloración rosa estaba relacionada con el anticuerpo 11.2.1 solo, y no se origina de los excipientes de la formulación. Después, el segundo frasco que tenía la decoloración rosa se digirió con tripsina bajo condiciones estándares y se analizó por medio de cromatografía de líquidos de alto rendimiento de fase inversa, junto con espectroscopia de masa (LC-MS). La separación se hizo usando una columna analítica Grace Vydac Protein C4 con un gradiente de elución de TFA al 0.1 % en agua y TFA al 0.085% en acetonitrilo. La absorbancia UV-Vis a 500 nM de los péptidos digeridos se monitoreó, y los péptidos correspondientes se identificaron basándose en su peso molecular. El péptido tríptico, que se correlaciona con el pico de absorbancia a 500 nm, tenía la secuencia de aminoácidos: GLEWVAIWYDGSNK. Después, la secuencia de péptido GLEWVAVIWYDGSNK se digirió adicionalmente con proteasa Asp-N bajo condiciones estándares, y el pico de absorbancia (UV-Vis) a 500 nm emigró junto con el péptido digerido con proteasa Asp-N, que tenía la secuencia de aminoácido: GLEWVAVIWY. Por lo tanto, sin desear limitarse a ninguna teoría en particular, se considera que uno o los dos residuos de triptófano (W), o el residuo de tirosina (Y), del péptido digerido con proteasa (GLEWVAVIWY), son sitios posibles de oxidación, o que pueden ser responsables de la decoloración rosa de la formulación del anticuerpo 11.2.1 en este ejemplo. En modalidades particulares se cree que uno o los dos residuos de triptófano (W) del péptido digerido con proteasa (GLEWVAVIWY) son sitios posibles de oxidación que pueden ser responsables de la decoloración rosa. Aunque también es posible que mecanismos diferentes de la oxidación hayan sido los responsables de cualesquiera una o más de las decoloraciones particulares observadas en las formulaciones aquí evaluadas (por ejemplo rosa y amarillo).

EJEMPLO 8 Se realizó un estudio para evaluar el efecto del EDTA y DTPA sobre la decoloración, agregación y fragmentación del anticuerpo anti-CTLA-4 1 1 .2.1 . Específicamente se prepararon tres formulaciones líquidas que comprendían el anticuerpo 11.2.1 , con y sin EDTA y DTPA. Las formulaciones se guardaron a 40°C y se evaluó la decoloración, agregación y fragmentación de anticuerpo a las semanas 0, 2, 4, 6, 8 y 10. Para este ejemplo se preparó una solución de 20 mg/ml de anticuerpo anti-CTLA-4 en amortiguador de acetato de sodio 20 mM, pH 5.5, con 8.2 mg/ml de cloruro de sodio y 0.2 mg/ml de polisorbato 80, y se dividió entre varios frascos de vidrio como se describe en el ejemplo 3; después se trató agregando EDTA o DTPA. El EDTA y el DTPA se agregaron a los frascos de formulación como sólidos. Varios frascos se analizaron inmediatamente para determinar el grado de decoloración, agregación y fragmentación, y otros frascos también se almacenaron verticalmente por duplicado a 40°C durante 2, 4, 6, 8 y 10 semanas. Después, a las 2, 4, 6, 8 y 10 semanas, los frascos tratados y no tratados se muestrearon asépticamente para medir el grado de agregación y fragmentación del anticuerpo 11.2.1 en las formulaciones, y se observó la decoloración. Los cuadros 12 y 13 indican los resultados.

Análisis de la apariencia de las formulaciones Se analizó visualmente la formación de partículas, cambio de color y cambio de turbidez de cada formulación después de 0 semanas (inicial), y 2, 4, 6, 8 y 10 semanas. Las observaciones visuales se indican en el cuadro 12.

CUADRO 12 Evaluaciones visuales de los tratamientos con EDTA y DTPA de las formulaciones Los resultados del cuadro 12 indican que las formulaciones sin EDTA o sin DTPA desarrollaron una coloración rosa en el frasco después de su almacenamiento durante al menos 6 semanas a 40°C.

Análisis de agregación Las formulaciones de anticuerpo tratadas de acuerdo con el cuadro 12 se almacenaron a una temperatura de 40°C. A las semanas 0, 2, 6, 8 y 10, cada formulación se analizó para determinar la agregación usando cromatografía de exclusión de tamaño. La cromatografía de exclusión de tamaño se efectuó usando una columna G3000SWXL-G2000SWXL de gel TSK, fase móvil de amortiguador de fosfato de sodio 0.2 M a pH 7.0, una velocidad de flujo de 1 ml/mín, y detección en UV a 214 nm. El cuadro 13 muestra el porcentaje de las especies eluidas de peso molecular alto (es decir, los agregados del anticuerpo anti-CTLA-4 11 2.1 ), determinado a los tiempos relevantes para cada una de las formulaciones tratadas. El grado de agregación se calculó integrando las áreas bajo los picos del cromatograma de cada formulación, y reportando las áreas integradas bajo los picos de las especies de peso molecular alto como un porcentaje del área pico total (véase el cuadro 13) CUADRO 13 Porcentaje de agregación de las formulaciones tratadas con EDTA y DTPA Como puede verse en el cuadro 7, las formulaciones que contenían EDTA y las formulaciones que contenían DTPA mostraron un grado de agregación más bajo en comparación con la formulación sin EDTA o sin DTPA.

EJEMPLO 9 Se realizó un estudio para evaluar el efecto del EDTA y nitrógeno gaseoso sobre la estabilidad del anticuerpo anti-CTLA-4 11.2.1. Específicamente, se analizó el impacto del EDTA y nitrógeno gaseoso sobre la estabilidad del anticuerpo 11.2.1 con respecto a la decoloración, agregación, oxidación, fragmentación y formación de especies cargadas, en formulaciones con amortiguador de histidina que contienen trehalosa y polísorbato 80. Las formulaciones que se evaluaron se indican en el cuadro 13 más abajo. El procedimiento usado para preparar las formulaciones es el mismo que se describe más adelante en el ejemplo 10. Las formulaciones se almacenaron a 40°C y se evaluó la estabilidad a las semanas 0, 4, 8, 12 y 24. Para este ejemplo se preparó una solución de 20 mg/ml de anticuerpo anti-CTLA-4 en amortiguador de histidina 20 mM a pH 5.5, con 84 mg/ml de trehalosa y 0.2 mg/ml de polisorbato 80, como en el ejemplo 10. Una parte de la formulación se preparó diluyendo solución de reserva concentrada del anticuerpo con soluciones de reserva de trehalosa y polisorbato 80, hasta la composición final a 20 mg/ml de anticuerpo anti-CTLA-4. Una segunda parte de la formulación se preparó de manera similar, excepto el paso adicional de agregar un concentrado de 10 mg/ml de Na2EDTA.2H2O para obtener una concentración final de 0.1 mg/mL. Después, se dispensó 1 mL de las formulaciones en frascos de vidrio de 2 ml.

La mitad de los frascos de cada formulación se puso entonces en un liofilizador y el espacio superior se cambió a nitrógeno después de evacuación. Después de cargar los frascos con nitrógeno, una medición de su concentración de oxígeno fue de aproximadamente 1.5% a 1.6% de oxígeno, mientras que los frascos con aire en el espacio superior dieron aproximadamente 19.7% a 20% de oxígeno. Varios frascos se analizaron inmediatamente para determinar el grado de decoloración, agregación, fragmentación, oxidación y formación de especies cargadas, y otros frascos también se guardaron verticalmente por duplicado a 40°C durante 2, 4, 8, 12 y 24 semanas. En cada punto de tiempo se retiraron de cada condición dos frascos almacenados por tratamiento para medir el grado de agregación, fragmentación, oxidación y formación de especies cargadas del anticuerpo 11.2.1 en las formulaciones, y se observó la decoloración. Los cuadros 14 a 18 indican los resultados.

CUADRO 13 Formulaciones de anticuerpo analizadas Cada formulación se evaluó visualmente después de 0 semanas (inicial), y 4, 8, 12 y 24 semanas, para determinar la formación de partículas, cambio de color y cambio de turbidez. Las observaciones visuales se indican en el cuadro 14.

CUADRO 14 Evaluaciones visuales después de los tratamientos de formulación indicados en el cuadro 13 Los resultados del cuadro 14 indican que la formulación sin EDTA o sin nitrógeno gaseoso desarrollaron una coloración rosa después de su almacenamiento durante 4 semanas a 40°C. El cuadro 14 también indica que en la formulación en donde el aire del espacio superior del frasco fue reemplazado con nitrógeno gaseoso se retrasó la aparición de la decoloración rosa hasta la semana 12. Las dos formulaciones que contenían EDTA no tuvieron decoloración visible durante al menos 24 semanas.

Análisis de agregación Las formulaciones de anticuerpo preparadas de acuerdo con el cuadro 13 se almacenaron a una temperatura de 40°C. A las semanas 0, 4, 8, 12 y 24, cada formulación se analizó para determinar la agregación usando cromatografía de exclusión de tamaño. Los frascos de cada formulación se muestrearon asépticamente en cada punto de tiempo. La cromatografía de exclusión de tamaño se efectuó en las muestras usando una columna G3000SWXL-G2000SWXL de gel TSK, fase móvil de amortiguador de fosfato de sodio 0.2 M a pH 7.0, una velocidad de flujo de 1 ml/min, y detección en UV a 214 nm. El cuadro 15 muestra el porcentaje de las especies eluidas de peso molecular alto (es decir, los agregados del anticuerpo anti-CTLA-4 1 1.2.1 ), determinado a los tiempos relevantes para cada una de las formulaciones tratadas. El grado de agregación se calculó integrando las áreas bajo los picos del cromatograma de cada formulación, y reportando las áreas integradas bajo los picos de las especies de peso molecular alto como un porcentaje del área pico total (véase el cuadro 15).

CUADRO 15 Porcentaje de agregación en las formulaciones indicadas en el cuadro 13 Como puede verse en el cuadro 15, la formulación que contenía EDTA, la formulación que contenía gas nitrógeno y la formulación que contenía EDTA más nitrógeno gaseoso, mostraron el grado de agregación más bajo con el tiempo en comparación con una formulación sin EDTA y con aire en el espacio superior.

Análisis de fragmentación Las formulaciones de anticuerpo preparadas de acuerdo con el cuadro 13 se almacenaron a una temperatura de 40°C. A las semanas 0, 4, 8, 12 y 24, cada formulación se analizó para determinar el total de impurezas (es decir, la fragmentación), usando PAGE reducido /SDS (rSDS-PAGE). Los frascos de cada formulación se muestrearon asépticamente en cada punto de tiempo y se cargaron sobre geles de NuPAGE, bis-tris 4% a 12%, con tinción de azul coloidal (Coomassie). La reducción del gel se logró usando el agente reductor NuPAGE®. El porcentaje de impurezas (es decir, la fragmentación) de cada banda de muestra en los geles reducidos se estimó por medio de exploración con un densitómetro Molecular Dynamics Personal Densitometer PDQC-90, o un densitómetro de imagen Bio-Rad GS800. El grado de fragmentación se calculó como un porcentaje del volumen total de banda (véase el cuadro 16).

CUADRO 16 Porcentaje de fragmentación total (impurezas) para las formulaciones del cuadro 13 Como puede verse en el cuadro 16, la formulación que contiene EDTA, la formulación que contiene nitrógeno gaseoso, y la formulación que contiene EDTA más nitrógeno gaseoso, mostraron el grado de fragmentación más bajo con el tiempo en comparación con una formulación sin EDTA y que tiene aire en el espacio superior.

Formación de especies acidas y básicas Las formulaciones de anticuerpo preparadas de acuerdo con el cuadro 13 se guardaron a una temperatura de 40°C. A las semanas 0, 4, 12 y 24 cada formulación se analizó para determinar la formación de especies acidas y básicas usando electroforesis capilar de imagen (iCE). La electroforesis capilar de imagen se realizó usando un analizador Convergent Bioscíences iCE28o para evaluar la heterogeneidad de carga. La ¡CE280 convergente es un instrumento de enfoque isoeléctrico capilar de imagen (IEF), que permite al usuario captar una imagen de una muestra separada contenida dentro de un capilar. Los frascos de formulación se muestrearon asépticamente en cada punto de tiempo. Entonces se prepararon las muestras en una mezcla de anfolitos electroforéticos, metilcelulosa, marcadores de calibración y agua. Las muestras se introdujeron en el iCE28o y se aplicó un potencial/voltaje alto. Las pruebas de IEF se realizaron usando geles de poliacrilamida a pH 3-10.5 preparados manualmente usando tinción de azul de Coomassie. Los componentes de proteína de la muestra se separaron en función de sus puntos isoeléctricos relativos (pl) y su localización. La cantidad relativa de cada componente separado se observó por medio de una cámara de imagen CCD. Después, los datos se procesaron y reportaron como pérdida del pico principal (es decir, formación de especies acidas y básicas), utilizando software de integración de cromatografía convencional (véase el cuadro 17).

CUADRO 17 Pérdida del pico principal de las formulaciones del cuadro 13 Como puede verse en el cuadro 17, la formulación que contiene EDTA, la formulación de nitrógeno gaseoso, y la formulación que contiene EDTA más nitrógeno gaseoso, mostraron el grado más alto de pico principal intacto con el tiempo en comparación con una formulación sin EDTA y que tiene aire en el espacio superior. De esta manera, la cantidad de formación de especies acidas y básicas es mayor con el tiempo en las formulaciones que carecen de EDTA y/o nitrógeno gaseoso en el espacio superior.

Análisis de oxidación de aminoácidos El grado de oxidación de los residuos de metionína en las posiciones de aminoácido 256 y 432 del anticuerpo anti-CTLA-4 11.2.1 se midió por medio de un método de mapeo de lisina C después de almacenamiento durante 12 semanas a 40°C. Los frascos que contenían las formulaciones indicadas en el cuadro 13 se muestrearon asépticamente a las 12 semanas. Las muestras se digirieron entonces con una enzima lisil endopeptidasa (Lys-C) en amortiguador tris a pH 8.0 bajo condiciones estándares, y se analizaron por cromatografía de líquidos de alto rendimiento de fase inversa. La separación se logró usando una columna analítica Grace Vydac Protein C4 con un gradiente de elución de TFA al 0.1 % en agua y 0.085% de TFA en acetonitrilo.

CUADRO 18 Porcentaje de oxidación de aminoácidos de metionina en el anticuerpo anti-CTLA-4 11.2.1 en las formulaciones del cuadro 13 Los resultados del cuadro 18 indican que la adición de EDTA a la formulación de anticuerpo 11.2.1 y/o la adición de nitrógeno gaseoso al espacio superior del frasco redujeron el porcentaje de oxidación en los dos residuos de metionina indicados, en comparación con una formulación sin EDTA y que tiene aire en el espacio superior.

EJEMPLO 10 Se realizó un estudio para comparar el efecto sobre la estabilidad de las formulaciones del anticuerpo anti-CTLA-4 11.2.1 que comprenden un amortiguador de acetato de sodio y cloruro de sodio (es decir, iones cloruro), en comparación con formulaciones que comprenden un amortiguador de histidina y trehalosa. Específicamente, se analizó el impacto sobre la estabilidad del anticuerpo 11.2.1 con respecto a decoloración, agregación y fragmentación. Las formulaciones que se evaluaron se indican en el cuadro 19 más abajo. El procedimiento usado para preparar las formulaciones es el mismo que se describe en el ejemplo 3. Las formulaciones del cuadro 19 se prepararon tomando una solución de reserva de 11.9 mg/ml de anticuerpo 11.2.1 en amortiguador de acetato de sodio 20 mM, pH 5.5, cloruro de sodio 140 mM, y sometiéndola a un paso de ultrafiltración/diafiltración (UF/DF) en un sistema Millipore Lab Scale TFF, con una membrana Pellicon XL PBTK 30K de 50 cm2. Después, se prepararon soluciones concentradas del anticuerpo 11.2.1 en la escala de 35 a 40 mg/ml en amortiguadores de acetato de sodio 20 mM o histidina 20 mM. Se prepararon concentrados del agente tonificante en amortiguador de acetato de sodio o de histidína a 3 veces las concentraciones finales objetivo. Se preparó una solución concentrada de polisorbato 80 a 20 mg/ml y Na2EDTA.2H2O a 10 mg/ml en cada uno de los amortiguadores. Se prepararon formulaciones individuales eluyendo apropiadamente las soluciones concentradas. Las formulaciones se filtraron entonces a través de filtros grado esterilizante de 0.2 µ y se vaciaron en varios frascos por duplicado. Se usó un volumen de llenado de 1 ml en frascos de vidrio de 2 ml de tipo 1 . Los frascos se cerraron con tapones Daikyo 777-1 recubiertos con Flurotec®, se sellaron, y se guardaron verticalmente en cámaras de estabilidad a 25°C y 40°C. Otro grupo de frascos también se colocó a -20°C durante 4 semanas, y otro grupo se sometió a 4 ciclos de congelación/descongelación (caja de frascos llena de agua), como se describe en el ejemplo 4. Todas las formulaciones tenían un pH de 5.5 y una concentración de anticuerpo anti-CTLA-4 1 1.2.1 de 20 mg/ml. Varios frascos se analizaron inmediatamente para determinar el grado de decoloración, agregación y fragmentación, y otros frascos también se almacenaron verticalmente por duplicado a 25°C y 40°C durante 4, 8, 12, 18, 24 y 36 semanas. En cada punto de tiempo se retiraron dos frascos almacenados por formulación de cada condición para medir el grado de agregación y fragmentación de anticuerpo 1 1 .2.1 , y también se observó la decoloración. Los cuadros 20 a 24 y las figuras 3 y 4 indican los resultados.

CUADRO 19 Formulaciones de anticuerpo analizadas Análisis de la apariencia de la formulación Cada formulación se evaluó vísualmente después de 1 ) mezclar inicíalmente la formulación, 2) congelar la formulación a -20°C durante 4 semanas, y 3) después de cuatro ciclos de congelación/descongelación (-70°C a 5°C en una caja junto con frascos llenos de agua como se describe en el ejemplo 4). Cada formulación se evaluó visualmente después de 0 semanas (inicial), y 8, 12 y 24 semanas, para determinar la formación de partículas, cambio de color y cambio de turbidez. Las formulaciones se evaluaron para determinar la formación de partículas, cambios de color y cambios de turbidez y se indican en el cuadro 20 (congelación/descongelación), cuadro 21 (almacenamiento a 25°C), y cuadro 22 (almacenamiento a 40°C).

CUADRO 20 Evaluaciones visuales de las formulaciones del cuadro 19 después de congelación/descongelación CUADRO 21 Evaluaciones visuales de las formulaciones del cuadro 19 después de almacenamiento a 25°C CUADRO 22 Evaluaciones visuales de las formulaciones del cuadro 19 después de almacenamiento a 40°C Los resultados de los cuadros 20 a 22 indican que las formulaciones de anticuerpo 11.2.1 que contienen EDTA tuvieron menor decoloración, menor turbidez y menor formación de partículas que las formulaciones sin EDTA En general, las formulaciones que contienen cloruro de sodio tuvieron una mayor decoloración, turbidez y formación de partículas en comparación con las formulaciones que contienen EDTA pero sin cloruro de sodio Análisis de agregación Las formulaciones de anticuerpo preparadas de acuerdo con el cuadro 19 se almacenaron a una temperatura de 25°C y 40°C. A las 0 semanas (inicial), y 4, 8, 12, 24 y 36 semanas, las formulaciones de 25°C se analizaron para determinar la agregación usando cromatografía de exclusión de tamaño. A las semanas 4, 8, 12 y 24, las formulaciones de 40°C se analizaron para determinar la agregación usando cromatografía de exclusión de tamaño. Los frascos de cada formulación se muestrearon asépticamente en cada punto de tiempo. La cromatografía de exclusión de tamaño se efectuó en las muestras usando una columna G3000SWXL-G2000SWXL de gel TSK, fase móvil de amortiguador de fosfato de sodio 0.2 M a pH 7.0, una velocidad de flujo de 1 ml/min, y detección en UV a 214 nm. Los cuadros 23(a) y 23(b) muestran el porcentaje de agregación del anticuerpo 11.2.1 determinado a los tiempos relevantes para cada una de las formulaciones tratadas. El grado de agregación se calculó integrando las áreas bajo los picos del cromatograma de cada formulación, y reportando las áreas integradas bajo los picos de las especies de peso molecular alto como un porcentaje del área pico total (véanse los cuadros 23(a) y 23(b)).

CUADRO 23(a) Porcentaje de agregación de las formulaciones del cuadro 19 después de almacenamiento a 25°C El cuadro 23(b) siguiente indica los datos de agregación que se presentan gráficamente en la figura 3.

CUADRO 23(b) Porcentaje de agregación de las formulaciones del cuadro 19 después de almacenamiento a 40°C Como puede verse en los cuadros 23(a), 23(b) y la figura 3, las formulaciones que contienen EDTA mostraron una menor agregación en comparación con una formulación que carece de EDTA pero que tiene un amortiguador de acetato y cloruro de sodio, después de su almacenamiento a 25°C y 40°C. Además, una formulación que contiene un amortiguador de histidina (sin EDTA) tenía menor agregación en comparación con una formulación que carece de EDTA pero que contiene un amortiguador de acetato y cloruro de sodio.

Análisis de fraqmentación Las formulaciones de anticuerpo preparadas de acuerdo con el cuadro 19 se almacenaron a una temperatura de 25°C y 40°C. A las semanas 0 (inicial), y 4, 8, 12, 18 y 36 semanas, cada formulación se analizó para determinar la impureza hidrolítica total (es decir, la fragmentación) usando PAGE reducido /SDS (rSDS-PAGE). Los frascos de la formulación se muestrearon asépticamente en cada punto de tiempo y se cargaron sobre geles NuPAGE, 4-12% bis-Tris, con tinción de azul coloidal (Coomassie). La reducción del gel se logró usando el agente reductor NuPAGE®. El porcentaje de impurezas (es decir, la fragmentación) de cada banda de muestra en los geles reducidos se estimó explorando en un densitómetro Molecular Dynamics Personal PDQC-90, o un densitómetro de imagen Bio-Rad GS800. El grado de fragmentación se calculó como un porcentaje del volumen total de la banda (véanse los cuadros 24(a) y 24(b).

CUADRO 24(a) Porcentaje de fragmentación de las formulaciones del cuadro 19 después de almacenamiento a 25°C El cuadro 24(b) siguiente indica los datos de fragmentación que se presentan gráficamente en la figura 4.

CUADRO 24(b) Porcentaje de fragmentación de las formulaciones del cuadro 19 después de almacenamiento a 40°C Como puede verse en los cuadros 24(a), 4(b), y en la figura 4, las formulaciones que contienen EDTA mostraron un menor grado de fragmentación en comparación con una formulación que carece de EDTA pero que tiene un amortiguador de acetato y cloruro de sodio, después de su almacenamiento a 25°C y 40°C.

EJEMPLO 11 Se realizó un estudio para comparar el efecto de concentraciones variables de EDTA sobre la estabilidad de las formulaciones de anticuerpo anti-CTLA-4 11.2.1. También se probaron alternativas de la formulación de amortiguador de histidina-trehalosa, reemplazando parte de la trehalosa con manitol.

Específicamente, se analizó el impacto sobre la estabilidad del anticuerpo 11.2.1 con respecto a decoloración, agregación, fragmentación y oxidación. Las formulaciones que se evaluaron se indican en el cuadro 25 más abajo. El procedimiento usado para preparar las formulaciones es el mismo que se describe en el ejemplo 10. Las formulaciones del cuadro 25 se prepararon tomando una solución de reserva de 11.9 mg/ml de anticuerpo 1 1.2.1 en amortiguador de acetato de sodio 20 mM, pH 5.5, cloruro de sodio 140 mM, y se sometieron a un paso de ultrafiltración/diafiltración (UF/DF) en un sistema Millipore Lab Scale TFF System, con una membrana Pellicon XL PBTK 30K de 50 cm2. Después, se prepararon soluciones concentradas del anticuerpo 11.2.1 en la escala de 35 a 40 mg/ml en amortiguadores de acetato de sodio 20 mM o histidína 20 mM. Se prepararon concentrados del agente tonificante en amortiguador de acetato de sodio o de histidina a tres veces las concentraciones finales objetivo. Se preparó una solución concentrada de polisorbato 80 a 20 mg/ml y Na2EDTA.2H2O a 10 mg/ml en cada uno de los amortiguadores. Se prepararon formulaciones individuales diluyendo apropiadamente las soluciones concentradas. Se examinaron concentraciones de EDTA (como Na2EDTA.2H2O) en la escala de 0-0.1 mg/ml. Las formulaciones se filtraron entonces a través de filtros grado esterilizante de 0.2 µ y se vaciaron en varios frascos por duplicado. Se usó un volumen de llenado de 1 ml en frascos de vidrio de 2 ml de tipo 1. Los frascos se cerraron con tapones Daikyo 777-1 recubiertos con Flurotec®, se sellaron, y se guardaron verticalmente en cámaras de estabilidad a 25°C y 40°C. Otro grupo de frascos se sometió a 4 ciclos de congelación/descongelación como se describe en el ejemplo 10. Todas las formulaciones tenían un pH de 5.5 y una concentración de anticuerpo anti-CTLA-4 11.2.1 de 20 mg/ml. Varios frascos se analizaron inmediatamente para determinar el grado de decoloración, agregación, fragmentación y oxidación, y otros frascos también se almacenaron verticalmente por duplicado a 25°C y 40°C durante 4, 8, 13, 18 y 24 semanas. En cada punto de tiempo se retiraron dos frascos almacenados por formulación de cada condición para medir el grado de agregación y fragmentación de anticuerpo 11.2.1 , y también se observó la decoloración. Los cuadros 26 a 31 y las figuras 5 a 10 indican los resultados.

CUADRO 25 Formulaciones de anticuerpo analizadas Análisis de la apariencia de las formulaciones Cada formulación se evaluó visualmente después de 1 ) mezclar inicialmente la formulación, 2) después de cuatro ciclos de congelación/descongelación, y 3) después de almacenamiento a 25°C y 40°C durante 4, 8, 13, 18 y 24 semanas. Las formulaciones se evaluaron para determinar la formación de partículas, cambio de color y cambio de turbidez, y se indican en los cuadros 26 a 28.

CUADRO 26 Evaluaciones visuales de las formulaciones del cuadro 25 después de congelación/descongelación CUADRO 27 Evaluaciones visuales de las formulaciones del cuadro 25 después de almacenamiento a 25 °C -Y6 y Y4 son notaciones de escala de color de la escala de Amarillo EP; Y es menos amarillo que Y4 (ref: Farmacopea Europea 5.0, 2005, Monografía 2.2.2) CUADRO 28 Evaluaciones visuales de las formulaciones del cuadro 25 después de almacenamiento a 40 °C -Y6 y Y4 son notaciones de escala de color de la escala de Amapllo EP, Y es menos amarillo que Y4 (ref Farmacopea Europea 5 0, 2005, Monografía 2 2 2) Los resultados de los cuadros 26 a 28 indican que las formulaciones de anticuerpo 11.2.1 que contienen todas las concentraciones de EDTA probadas tuvieron decoloración reducida, turbidez reducida y formación de partículas reducida en comparación con las formulaciones sin EDTA. En general, las formulaciones que contienen cloruro de sodio tuvieron una protección reducida frente a congelación/descongelación, como es evidente por la mayor decoloración, turbidez y formación de partículas en comparación con las formulaciones que tienen EDTA sin cloruro de sodio.

Análisis de aqreqación Las formulaciones de anticuerpo preparadas de acuerdo con el cuadro 25 se almacenaron a una temperatura de 25°C y 40°C. A las 0 semanas (inicial), y 4, 8, 13, 18 y 24 semanas, las formulaciones de 25°C y 40 °C se analizaron para determinar la agregación usando cromatografía de exclusión de tamaño. Los frascos de cada formulación se muestrearon asépticamente en cada punto de tiempo. La cromatografía de exclusión de tamaño se efectuó en las muestras usando una columna G3000SWXL-G2000SWXL de gel TSK, fase móvil de amortiguador de fosfato de sodio 0.2 M a pH 7.0, una velocidad de flujo de 1 ml/min, y detección en UV a 214 nm. El cuadros 29(a) muestra el porcentaje de agregación del anticuerpo 11.2.1 determinado a los tiempos relevantes para cada una de las formulaciones después de su almacenamiento a 25 °C. El cuadro 29(b) muestra el porcentaje de agregación del anticuerpo 11.2.1 determinado después de almacenamiento a 40 °C. El grado de agregación se calculó integrando las áreas bajo los picos del cromatograma de cada formulación, y reportando las áreas integradas bajo los picos de las especies de peso molecular alto como un porcentaje del área pico total (véanse los cuadros 29(a) y 29(b)).

CUADRO 29(a) Porcentaje de agregación para las formulaciones del cuadro 25 después de almacenamiento a 25 °C El cuadro 29(b) siguiente indica los datos de agregación que se presentan gráficamente en la figura 5.

CUADRO 29(b) Porcentaje de agregación para las formulaciones del cuadro 25 después de almacenamiento a 40 °C Como puede verse en los cuadros 29(a), 29(b) y la figura 5, las formulaciones que contienen EDTA mostraron una agregación reducida a todas las concentraciones de EDTA probadas, en comparación con una formulación que carece de EDTA y tiene un amortiguador de acetato y cloruro de sodio, después de almacenamiento a 25 °C y 40 °C La figura 7 resume gráficamente la reducción del porcentaje de agregación de las formulaciones del cuadro 25 en función de la concentración de EDTA Análisis de fraqmentación Las formulaciones de anticuerpo preparadas de acuerdo con el cuadro 25 se almacenaron a una temperatura de 25 °C y 40°C A las semanas O (inicial), 4, 8, 13, 18 y 24, las formulaciones de 25 °C y 40 °C se analizaron para determinar el total de impurezas (es decir, la fragmentación), usando PAGE reducido /SDS (rSDS-PAGE). Los frascos de cada formulación se muestrearon asépticamente en cada punto de tiempo y se cargaron sobre geles de NuPAGE, bis-tris 4%-12%, con tinción de azul coloidal (Coomassie). La reducción del gel se logró usando el agente reductor NuPAGE®. El porcentaje de impurezas (es decir, la fragmentación) de cada banda de muestra en los geles reducidos se estimó por medio de exploración con un densitómetro Molecular Dynamics Personal Densitometer PDQC-90, o un densitómetro de imagen Bio-Rad GS800. El grado de fragmentación se calculó como un porcentaje del volumen total de banda (véanse los cuadros 30(a) y 30 (b)).

CUADRO 30(a) Porcentaje de fragmentación para las formulaciones del cuadro 25 después de almacenamiento a 25 °C El cuadro 30(b) siguiente indica los datos de fragmentación que resentan gráficamente en la figura 6.

CUADRO 30(b) Porcentaje de fragmentación para las formulaciones del cuadro 25 después de almacenamiento a 40 °C Como puede verse en los cuadros 30(a), 30(b) y la figura 6, después de almacenamiento a 25 °C y 40 °C, las formulaciones que contienen EDTA mostraron un grado reducido de fragmentación en comparación con una formulación que carece de EDTA y que tiene un amortiguador de acetato y cloruro de sodio. Además, las formulaciones que contienen histidina y trehalosa sin EDTA mostraron un grado reducido de fragmentación con respecto a la formulación que contiene cloruro de sodio sin EDTA. La figura 8 resume gráficamente la reducción del porcentaje de fragmentación para las formulaciones del cuadro 25 en función de la concentración de EDTA.

Análisis de oxidación de aminoácidos El grado de oxidación de algunos residuos de metionina en las posiciones de aminoácido 256 y 432 del anticuerpo anti-CTLA-4 11.2.1 se midió por medio de un método de mapeo de lisina C. Los frascos que contenían las formulaciones indicadas en el cuadro 25 se muestrearon asépticamente a las 18 y 24 semanas después de almacenamiento a 40 °C. Las muestras se digirieron entonces con una enzima lisil endopeptidasa (Lys-C) en amortiguador tris a pH 8.0 bajo condiciones estándares, y se analizaron por cromatografía de líquidos de alto rendimiento de fase inversa. La separación se logró usando una columna analítica Grace Vydac Protein C4 con un gradiente de elución de TFA al 0.1 % en agua y 0.085% de TFA en acetonitrilo. El cuadro 31 indica los resultados.

CUADRO 31 Porcentaje de oxidación de aminoácidos de metionina en el anticuerpo anti-CTLA-4 11.2.1 en las formulaciones del cuadro 25 Como puede verse en el cuadro 31 , la presencia de EDTA en la formulación de anticuerpo 11.2.1 disminuye el grado de oxidación de metionina que ocurre con el tiempo.

EJEMPLO 12 Se realizó un estudio para comparar el efecto del manitol y sorbitol sobre la estabilidad de las formulaciones de anticuerpo anti-CTLA-4 1 1.2.1. En este ejemplo se probaron alternativas de una formulación de histidina-trehalosa, reemplazando una parte de la trehalosa con concentraciones variables de manitol y/o sorbitol (cuadro 32). Se examinaron concentraciones de EDTA (como Na2EDTA.2H2O) en la escala de 0 a 0.1 mg/ml. Específicamente, se analizó el impacto sobre la estabilidad del anticuerpo 11.2.1 con respecto a decoloración, agregación, fragmentación y oxidación. Las formulaciones que se evaluaron se indican en el cuadro 32 más abajo. El procedimiento usado para preparar las formulaciones es el mismo que se describe en el ejemplo 10. Las formulaciones del cuadro 32 se prepararon tomando una solución de reserva de 11.9 mg/ml de anticuerpo 11.2.1 en amortiguador de acetato de sodio 20 mM, pH 5.5, cloruro de sodio 140 mM, y se sometieron a un paso de ultrafiltración/diafiltración (UF/DF) en un sistema Millipore Lab Scale TFF System, con una membrana Pellicon XL PBTK 30K de 50 cm2. Después, se prepararon soluciones concentradas del anticuerpo 11.2.1 en la escala de 35 a 40 mg/ml en amortiguadores de acetato de sodio 20 mM o histidina 20 mM. Se prepararon concentrados del agente tonificante en amortiguador de acetato de sodio o de histidina a tres veces las concentraciones finales objetivo. Se preparó una solución concentrada de polisorbato 80 a 20 mg/ml y Na2EDTA.2H2O a 10 mg/ml en cada uno de los amortiguadores. Se prepararon formulaciones individuales diluyendo apropiadamente las soluciones concentradas. Las formulaciones se filtraron entonces a través de filtros grado esterilizante de 0.2 µ y se vaciaron en varios frascos por duplicado. Se usó un volumen de llenado de 1 ml en frascos de vidrio de 2 ml de tipo 1. Los frascos se cerraron con tapones Daikyo 777-1 recubiertos con Flurotec®, se sellaron, y se guardaron verticalmente en cámaras de estabilidad a 25°C y 40°C. Otro grupo de frascos se sometió a 4 ciclos de congelación/descongelación como se describe en el ejemplo 10. Todas las formulaciones tenían un pH de 5.5 y una concentración de anticuerpo anti-CTLA-4 11.2.1 de 20 mg/ml. Varios frascos se analizaron inmediatamente para determinar el grado de decoloración, agregación, fragmentación y oxidación, y otros frascos también se almacenaron verticalmente por duplicado a 25°C y 40°C durante 4, 8, 13, 18 y 24 semanas. En cada punto de tiempo se retiraron dos frascos almacenados por formulación de cada condición para medir el grado de agregación y fragmentación de anticuerpo 11.2.1 , y también se observó la decoloración. Los cuadros 33 a 37 y las figuras 10 a 11 indican los resultados.

CUADRO 32 Formulaciones de anticuerpo analizadas Análisis de la apariencia de las formulaciones Cada formulación se evaluó visualmente después de (1 ) mezclar inicialmente la formulación, (2) después de 4 ciclos de congelación/descongelación (-70 °C a 5 °C, junto con frascos llenos de agua en una caja del ejemplo 4), y (3) después de almacenamiento a 25°C y 40°C durante 8, 13 y 24 semanas. Las formulaciones se evaluaron para determinar la formación de partículas, cambio de color y cambio de turbidez, y se indican en los cuadros 33 a 35.

CUADRO 33 Evaluaciones visuales de las formulaciones del cuadro 32 después de congelación/descongelación CUADRO 34 Evaluaciones visuales de las formulaciones del cuadro 32 después de almacenamiento a 25 °C CUADRO 35 Evaluaciones visuales de las formulaciones del cuadro 25 después de almacenamiento a 40 °C Los resultados de los cuadros 33 a 35 indican que las formulaciones del anticuerpo 11.2.1 que contienen cloruro de sodio pero sin EDTA, tienen una protección reducida contra la congelación/descongelación como es evidente por el aumento de decoloración, turbidez y formación de partículas, en comparación con las formulaciones que tienen EDTA pero sin cloruro de sodio. Los resultados también indican que las formulaciones del anticuerpo 1 1.2.1 que contienen todas las concentraciones de EDTA probadas, tienen decoloración reducida, turbidez reducida y formación de partículas reducida en comparación con las formulaciones sin EDTA.

Análisis de aqreqación Las formulaciones de anticuerpo preparadas de acuerdo con el cuadro 32 se almacenaron a una temperatura de 25°C y 40°C. A las 0 semanas (inicial), y 4, 8, 13, 18 y 24 semanas, las formulaciones de 25°C y 40 °C se analizaron para determinar la agregación usando cromatografía de exclusión de tamaño. Los frascos de cada formulación se muestrearon asépticamente en cada punto de tiempo. La cromatografía de exclusión de tamaño se efectuó en las muestras usando una columna G3000SWXL-G2000SWXL de gel TSK, fase móvil de amortiguador de fosfato de sodio 0.2 M a pH 7.0, una velocidad de flujo de 1 ml/mín, y detección en UV a 214 nm. El cuadros 36(a) muestra el porcentaje de agregación del anticuerpo 11.2.1 determinado a los tiempos relevantes para cada una de las formulaciones después de su almacenamiento a 25 °C. El cuadro 36(b) muestra el porcentaje de agregación del anticuerpo 11.2.1 determinado después de almacenamiento a 40 °C. El grado de agregación se calculó integrando las áreas bajo los picos del cromatograma de cada formulación, y reportando las áreas integradas bajo los picos de las especies de peso molecular alto como un porcentaje del área pico total (véanse los cuadros 36(a) y 36(b)).

CUADRO 36(a) Porcentaje de agregación para las formulaciones del cuadro 32 después de almacenamiento a 25 °C El cuadro 36(b) siguiente indica los datos de agregación que se presentan gráficamente en la figura 9.

CUADRO 36(b) Porcentaje de agregación para las formulaciones del cuadro 32 después de almacenamiento a 40 °C Como puede verse en los cuadros 36(a), 36(b) y la figura 9, las formulaciones que contienen EDTA mostraron una agregación reducida a todas las concentraciones de EDTA probadas, en comparación con una formulación que carece de EDTA pero que tiene un amortiguador de acetato y cloruro de sodio (es decir, iones cloruro), después de almacenamiento a 25 °C y 40 °C. La figura 9 resume gráficamente la reducción del porcentaje de agregación de las formulaciones del cuadro 32.

Análisis de fragmentación Las formulaciones de anticuerpo preparadas de acuerdo con el cuadro 32 se almacenaron a una temperatura de 25 °C y 40°C. A las semanas 0 (inicial), 4, 8, 13, 18 y 24, las formulaciones de 25 °C y 40 °C se analizaron para determinar el total de impurezas (es decir, la fragmentación), usando PAGE reducido /SDS (rSDS-PAGE). Los frascos de cada formulación se muestrearon asépticamente en cada punto de tiempo y se cargaron sobre geles de NuPAGE, bis-tris 4%-12%, con tinción de azul coloidal (Coomassie). La reducción del gel se logró usando el agente reductor NuPAGE®. El porcentaje de impurezas (es decir, la fragmentación) de cada banda de muestra en los geles reducidos se estimó por medio de exploración con un densitómetro Molecular Dynamics Personal Densitometer PDQC-90, o un densitómetro de imagen Bio-Rad GS800. El grado de fragmentación se calculó como un porcentaje del volumen total de banda (véanse los cuadros 37(a) y 37 (b)).

CUADRO 37(a) Porcentaje de fragmentación para las formulaciones del cuadro 32 después de almacenamiento a 25 °C El cuadro 37(b) siguiente indica los datos de fragmentación que resentan gráficamente en la figura 10.

CUADRO 37(b) Porcentaje de fragmentación para las formulaciones del cuadro 32 después de almacenamiento a 40 °C Como puede verse en los cuadros 37(a), 37(b) y la figura 10, después de almacenamiento a 25 °C y 40 °C, las formulaciones que contienen EDTA mostraron un grado reducido de fragmentación en comparación con una formulación que carece de EDTA pero que tiene un amortiguador de acetato y cloruro de sodio (es decir, ¡ones cloruro).

EJEMPLO 13 Este ejemplo ilustra la producción de una composición farmacéutica líquida que contiene el anticuerpo anti-CTLA-4 ticilimumab, monoclorhidrato de L-histidina monohidratado, etilendiaminotetraacetato de disodio dihidratado, a,a-trehalosa dihidratada, y polisorbato 80.

Se formó una composición farmacéutica líquida de la presente invención obteniendo los siguientes componentes: anticuerpo anti-CTLA-4 ticilimumab (disponible de la línea de células de híbridoma 11.2.1.4, depositada con el No. de Registro ATCC PTA-5169, de acuerdo con el ejemplo 1 , o preparado recombinantemente de una línea de células de mamífero de acuerdo con el ejemplo 2), monoclorhidrato de L-histidina monohidratado (disponible de Ajinomoto, Raleigh, NC), L-histidina (disponible de Ajinomoto, Raleigh, NC), etílendiaminotetraacetato de disodio dihidratado (disponible como Titriplex lll de Merck KgaA, Darmstadt, Alemania), a,a-trehalosa dihidratada (disponible con el Número de producto T-104-1-MC de Ferro Planstiehl, Waukegan IL), y polisorbato 80 (disponible como Crillet 4 HP, de Croda Inc., Mili Hall PA). Primero, la composición farmacéutica se preparó preparando varias soluciones de reserva del anticuerpo anti-CTLA-4 ticilimumab, monoclorhidrato de L-histidina monohidratado, etilendiaminotetraacetato de disodío dihídratado, a,a-trehalosa dihidratada y polisorbato 80. Se preparó un amortiguador de histidina 20 mM, pH 5.5, disolviendo 3.27 mg/mL (15.6 mM) de L-histidina HCl monohidratado y 0.68 mg/mL (4.4 mM) de L-histidina en agua. Se preparó un amortiguador de formulación 1X disolviendo en agua 3.27 mg/mL (15.6 mM) de L-histidina HCl monohidratado y 0.68 mg/mL (4.4 mM) de L-histidína, 84 mg/mL (222 mM) de a,a-trehalosa dihidratada, 0.2 mg/mL de polisorbato 80 y 0.1 mg/mL (0.268 mM) de etilendiaminotetraacetato de disodio dihidratado. Se preparó un amortiguador de formulación 2X disolviendo 3.27 mg/mL (15.6 mM) de L-histidina HCl monohidratado y 0.68 mg/mL (4.4 mM) de L-histidina, 168 mg/mL (444 mM) de a,a-trehalosa dihidratada, 0.4 mg/mL de polisorbato 80, y 0.2 mg/mL (0.536 mM) de etilendiaminotetraacetato de disodio dihidratado. Se preparó una solución de reserva de anticuerpo anti-CTLA-4 ticílimumab de acuerdo con el ejemplo 2 y se concentró a entre 42 mg/ml y 55 mg/ml (objetivo 45 mg/mL) en el amortiguador de histidina, usando un proceso de ultrafiltración con una membrana tipo 50kD (Biomax PES). Para preparar la composición farmacéutica se agregaron volúmenes iguales de la solución de reserva concentrada del anticuerpo anti-CTLA-4 ticilimumab y el amortiguador de formulación 2X a un contendor adecuado para mezclado íntimo de las composiciones líquidas. Después de mezclar se retiró un volumen pequeño de la solución y se determinó la concentración de anticuerpo por medio del método de espectrometría ultravioleta-visible (UV-Vis), usando un coeficiente de extinción de 1.43 (mg/mL)"1 cm'1 (escala esperada 21 a 27.5 mg/ml, objetivo 22.5 mg/mL). Finalmente se agregó un volumen apropiadamente calculado de amortiguador de formulación 1 X y se mezcló para llevar el anticuerpo a la concentración objetivo de 20 mg/mL (escala 18-22 mg/mL). Las composiciones farmacéuticas se filtraron entonces a través de filtros de esterilización de 0.2 µ y se vaciaron en frascos. Se utilizó un volumen de llenado nominal de 20 ml en frascos de vidrio de 20 ml de tipo 1. Los frascos se cerraron con tapones Daikyo 777-1 recubiertos con Flurotec® y se sellaron. Los frascos de vidrio se esterilizaron igual que los tapones de suero Daikyo 777-1 de 20 mm. Cada frasco individual contiene aproximadamente 400 mg del anticuerpo anti-CTLA-4 tícilimumab, 65.4 mg de monoclorhidrato de L-hístidina monohidratada, 13.6 mg de L-histidina, 2 mg de etilendiaminotetraacetato de disodio dihidratado, 1680 mg de a,a-trehalosa dihidratada, y 4 mg de polisorbato 80.

EJEMPLO 14 Este ejemplo ilustra la producción prospectiva de una composición farmacéutica líquida que contiene el anticuerpo anti-CTLA-4 ticilimumab, monoclorhidrato de L-hístidina monohidratada, etilendíaminotetraacetato de disodio y calcio, a,a-trehalosa dihidratada, y polisorbato 80. Una composición farmacéutica líquida de la presente invención se puede formar obteniendo los siguientes componentes: anticuerpo anti-CTLA-4 ticilimumab (disponible de la línea de células de hibridoma 11.2.1.4, depositada bajo el No. de registro ATCC PTA-5169 de acuerdo con el ejemplo 1 , o se puede preparar recombinantemente de una línea de células de mamífero de acuerdo con el ejemplo 2), monoclorhidrato de L-histidina monohidratado (disponible de Ajinomoto, Raleigh, NC), L-histidina (disponible de Ajinomoto, Raleígh, NC), etilendiaminotetraacetato de disodio y calcio (disponible de Sigma-Aldrich, San Luis, Misuri), a,a-trehalosa dihidratada (disponible como el número de producto T-104-1-MC, de Ferro Pfanstiehl, Waukegan IL), y polisorbato 80 (disponible como Crillet 4 HP, de Croda Inc., Mili Hall PA ). La composición farmacéutica líquida se puede preparar preparando primero varias soluciones de reserva del anticuerpo anti-CTLA-4 ticilimumab, monoclorhidrato de L-histidina monohidratado, etilendiaminotetraacetato de disodio dihidratado, a,a-trehalosa dihidratada y polisorbato 80. Se puede preparar un amortiguador de histidina 20 mM, pH 5.5, disolviendo en agua 3.27 mg/mL (15.6 mM) de L-histidina HCl monohidratado y 0.68 mg/mL (4.4 mM) de L-histidina. Se puede preparar un amortiguador de formulación 1 X disolviendo en agua 3.27 mg/mL (15.6 mM) de L-histidina HCl monohidratado y 0.68 mg/mL (4.4 mM) de L-histidina, 84 mg/mL (222 mM) de a,a-trehalosa dihidratada, 0.2 mg/mL de polisorbato 80 y 0.1003 mg/mL (0.268 mM) de etilendiaminotetraacetato de disodio y calcio dihidratado. Se puede preparar un amortiguador de formulación 2X disolviendo en agua 3.27 mg/mL (15.6 mM) de L-histidina HCl monohidratado y 0.68 mg/mL (4.4 mM) de L-histidina, 168 mg/mL (444 mM) de a,a-trehalosa dihidratada, 0.4 mg/mL de polisorbato 80, y 0.2006 mg/mL (0.536 mM) de etilendiaminotetraacetato de disodio y calcio. Se puede preparar una solución de reserva de anticuerpo anti-CTLA-4 ticilimumab de acuerdo con el ejemplo 2 y se concentra a entre 42 mg/ml y 55 mg/ml (objetivo 45 mg/mL) en el amortiguador de histidina, usando un proceso de ultrafiltración con una membrana tipo 50kD (Bíomax PES). Para preparar la composición farmacéutica se pueden agregar volúmenes iguales de la solución de reserva concentrada del anticuerpo anti-CTLA-4 ticilimumab y el amortiguador de formulación 2X a un contenedor adecuado para mezclado íntimo de las composiciones líquidas. Después de mezclar se puede retirar un volumen pequeño de la solución y se determina la concentración de anticuerpo por medio del método de espectrometría ultravioleta-visible (UV-Vis), usando un coeficiente de extinción de 1.43 (mg/mL)"1 cm"1 (escala esperada 21 a 27.5 mg/ml, objetivo 22.5 mg/mL). Finalmente se puede agregar un volumen apropiadamente calculado de amortiguador de formulación 1 X y se mezcla para llevar el anticuerpo a la concentración objetivo de 20 mg/mL (escala 18-22 mg/mL). Las composiciones farmacéuticas se pueden filtrar entonces a través de filtros de esterilización de 0.2 µ y se vacían en frascos. Se puede usar un volumen de llenado nominal de 20 ml en frascos de vidrio de 20 ml de tipo 1. Los frascos de vidrio se pueden cerrar entonces con tapones Daikyo 777-1 recubiertos con Flurotec® y se sellan. Los frascos de vidrio se pueden esterilizar, igual que los tapones de suero Daikyo 777-1 de 20 mm. Cada frasco individual contendría aproximadamente 400 mg del anticuerpo anti-CTLA-4 ticilimumab, 65.4 mg de monoclorhidrato de L-histidina monohidratada, 13.6 mg de L-histidina, 2.006 mg de etilendiaminotetraacetato de disodio y calcio, 1680 mg de a,a-trehalosa dihidratada, y 4 mg de polisorbato 80.

EJEMPLO 15 Este ejemplo ilustra la producción prospectiva de una composición farmacéutica líquida que contiene el anticuerpo anti-CTLA-4 ticilimumab, monoclorhidrato de L-hístidina monohidratada, etilendiaminotetraacetato de trisodio, a,a-trehalosa dihidratada, y polisorbato 80. Se formó una composición farmacéutica líquida de la presente invención obteniendo los siguientes componentes: anticuerpo anti-CTLA-4 ticilimumab (disponible de la línea de células de hibridoma 11.2.1.4, depositada con el No. de Registro ATCC PTA-5169, de acuerdo con el ejemplo 1 , o preparado recombinantemente de una línea de células de mamífero de acuerdo con el ejemplo 2), monoclorhidrato de L-histidina monohidratado (disponible de Ajinomoto, Raleigh, NC), L-histidina (disponible de Ajinomoto, Raleigh, NC), etilendiaminotetraacetato de trisodio (disponible de Sigma-Aldrich, San Luis Misuri), a,a-trehalosa dihidratada (disponible con el Número de producto T-104-1 -MC de Ferro Pfanstiehl, Waukegan IL), y polisorbato 80 (disponible como Crillet 4 HP, de Croda Inc., Mili Hall PA). Primero, la composición farmacéutica líquida se preparó preparando varias soluciones de reserva del anticuerpo anti-CTLA-4 ticilimumab, monoclorhidrato de L-hístidina monohidratado, etilendíaminotetraacetato de trisodio, a,a-trehalosa dihidratada y polisorbato 80. Se prepara un amortiguador de histidina 20 mM, pH 5.5, disolviendo en agua 3.27 mg/mL (15.6 mM) de L-histidina HCl monohidratado y 0.68 mg/mL (4.4 mM) de L-histidina. Se prepara un amortiguador de formulación 1 X disolviendo en agua 3.27 mg/mL (15.6 mM) de L-histidina HCl monohidratado y 0.68 mg/mL (4.4 mM) de L-histidina, 84 mg/mL (222 mM) de a,a-trehalosa dihidratada, 0.2 mg/mL de polisorbato 80 y 0.096 mg/mL (0.268 mM) de etilendiaminotetraacetato de trisodio. Se prepara un amortiguador de formulación 2X disolviendo 3.27 mg/mL (15.6 mM) de L-histidina HCl monohidratado y 0.68 mg/mL (4.4 mM) de L-histidina, 168 mg/mL (444 mM) de a,a-trehalosa dihidratada, 0.4 mg/mL de polisorbato 80, y 0.192 mg/mL (0.536 mM) de etilendiaminotetraacetato de trisodio. Se prepara una solución de reserva del anticuerpo anti-CTLA-4 ticilimumab de acuerdo con el ejemplo 2 y se concentra a entre 42 mg/ml y 55 mg/ml (objetivo 45 mg/mL) en el amortiguador de histidina, usando un proceso de ultrafiltración con una membrana tipo 50kD (Bíomax PES). Para preparar la composición farmacéutica se agregan volúmenes iguales de la solución de reserva concentrada del anticuerpo anti-CTLA-4 ticilimumab y el amortiguador de formulación 2X a un contendor adecuado para mezclado íntimo de las composiciones líquidas. Después de mezclar se retira un volumen pequeño de la solución y se determina la concentración de anticuerpo por medio del método de espectrometría ultravíoleta-visible (UV-Vis), usando un coeficiente de extinción de 1.43 (mg/mL)"1 cm"1 (escala esperada 21 a 27.5 mg/ml, objetivo 22.5 mg/mL). Finalmente se agrega un volumen apropiadamente calculado de amortiguador de formulación 1 X y se mezcla para llevar el anticuerpo a la concentración objetivo de 20 mg/mL (escala 18-22 mg/mL). Las composiciones farmacéuticas se filtran entonces a través de filtros de esterilización de 0.2 µ y se vacían en frascos. Se utilizó un volumen de llenado nominal de 20 ml en frascos de vidrio de 20 ml de tipo 1. Los frascos se cerraron con tapones Daikyo 777-1 recubiertos con Flurotec® y se sellaron. Los frascos de vidrio se esterilizaron igual que los tapones de suero Daikyo 777-1 de 20 mm. Cada frasco individual contiene aproximadamente 400 mg del anticuerpo anti-CTLA-4 ticilimumab, 65.4 mg de monoclorhidrato de L-histidina monohidratada, 13.6 mg de L-histidina, 1.92 mg de etilendiaminotetraacetato de trisodio, 1680 mg de a,a-trehalosa dihidratada, y 4 mg de polisorbato 80.

Claims

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES

1.- Una composición que comprende: un agente quelante; y por lo menos un anticuerpo que comprende: una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 90% idéntica a una secuencia de aminoácidos de cadena pesada que se muestra en la SEQ ID NO: 2, y una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 90% idéntica a una secuencia de aminoácidos de cadena ligera que se muestra en la SEQ ID NO: 4; en donde el anticuerpo se une al CTLA-4 humano.

2.- La composición de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque es una composición líquida y el anticuerpo es un anticuerpo lgG2 humano.

3.- La composición de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque el anticuerpo comprende una secuencia de aminoácidos de cadena pesada que tiene por lo menos 99% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO: 2, y una secuencia de aminoácidos de cadena ligera que tiene por lo menos 99% de identidad de secuencia con la SEQ ID NO:

4. 4.- La composición de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque el anticuerpo comprende una secuencia de aminoácidos de cadena pesada que comprende la reglón variable de la SEQ ID NO: 2, y una secuencia de aminoácidos de cadena ligera que comprende la región variable de la SEQ ID NO: 4.

5.- La composición de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque el anticuerpo comprende un anticuerpo monoclonal lgG2 anti-CTLA-4 que tiene las secuencias de aminoácidos de cadena pesada y ligera de ticilimumab.

6.- La composición de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque comprende EDTA.

7.- La composición de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque comprende: un agente quelante y un amortiguador.

8.- La composición de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque comprende: EDTA e histidina.

9.- La composición de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque comprende: un agente quelante, un amortiguador y un agente tensíoactivo.

10.- La composición de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque comprende: un agente quelante, un amortiguador, un agente tensioactivo y un agente de tonicidad.

11.- La composición de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque comprende: EDTA, un amortiguador, un agente tensioactivo y un agente de tonicidad.

12.- La composición de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque comprende: EDTA, histidina, un agente tensioactivo y un agente de tonicidad.

13.- La composición de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque comprende: EDTA, histidina, polisorbato 80 y un agente de tonicidad.

14.- La composición de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque comprende: EDTA, histidina, polisorbato 80 y trehalosa.

15.- La composición de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque comprende: de aproximadamente 1 mg/ml a aproximadamente 200 mg/ml del anticuerpo; de aproximadamente 0.01 milimolar a aproximadamente 5.0 milimolar de un agente quelante; y de aproximadamente 1 mM a aproximadamente 100 mM de histidina.

16.- La composición de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque comprende: de aproximadamente 1 mg/ml a aproximadamente 200 mg/ml del anticuerpo; de aproximadamente 0.01 mílimolar a aproximadamente 5.0 milimolar de EDTA; y de aproximadamente 1 mM a aproximadamente 100 mM de histidina.

17.- La composición de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque comprende: de aproximadamente 1 mg/ml a aproximadamente 100 mg/ml del anticuerpo; de aproximadamente 0.01 milimolar a aproximadamente 1.0 milimolar de EDTA; de aproximadamente 1 mM a aproximadamente 100 mM de histidina; de aproximadamente 0.01 mg/ml a aproximadamente 10 mg/ml de polisorbato 80; y de aproximadamente 100 milimolar a aproximadamente 300 milimolar de un agente de tonicidad.

18.- La composición de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque comprende: de aproximadamente 0.1 mg/ml a aproximadamente 100 mg/ml del anticuerpo; de aproximadamente 0.001 mg/ml a aproximadamente 1.0 mg/ml de EDTA; de aproximadamente 1 mM a aproximadamente 50 mM de histidina; de aproximadamente 0.01 mg/ml a aproximadamente 5 mg/ml de polisorbato 80; y de aproximadamente 10 mg/ml a aproximadamente 200 mg/ml de trehalosa.

19.- La composición de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque comprende: aproximadamente 20 mg/ml del anticuerpo; aproximadamente 0.27 mM de EDTA; aproximadamente 20 mM de histidina; aproximadamente 0.2 mg/ml de polisorbato 80; y aproximadamente 222 mM de trehalosa.

20.- La composición de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque comprende: aproximadamente 20 mg/ml del anticuerpo; aproximadamente 0.1 mg/ml de EDTA; aproximadamente 20 mM de histidina; aproximadamente 0.2 mg/ml de polisorbato 80; y aproximadamente 84 mg/ml de trehalosa.

21.- Una composición estable que comprende por lo menos un anticuerpo monoclonal anti-CTLA-4 y un agente quelante, en donde después de que la composición se almacena durante un periodo de aproximadamente 24 semanas a una temperatura de aproximadamente 40°C, la disminución del área pico de un cromatograma de agregado para la composición farmacéutica líquida estable que comprende anticuerpos monoclonales anti-CTLA-4 y el agente quelante, con respecto al área pico de un cromatograma de agregado para una composición que carece del agente quelante, por lo demás idéntica, que se almacena durante un periodo de aproximadamente 24 semanas a una temperatura de aproximadamente 40°C, es de por lo menos aproximadamente 2%.

22.- Un procedimiento para preparar una composición farmacéutica líquida que comprende mezclar en solución por lo menos un anticuerpo anti-CTLA-4 que tiene las secuencias de aminoácidos de la cadena pesada y ligera de tícilimumab, con al menos un agente quelante.

23.- El uso de una composición farmacéutica líquida que comprende: (a) por lo menos un anticuerpo anti-CTLA-4 que tiene las secuencias de aminoácidos de la cadena pesada y ligera de ticilimumab; y (b) un agente quelante farmacéuticamente aceptable, en la fabricación de un medicamento útil para el tratamiento de una condición de neoplasia en un sujeto.

24.- Una composición farmacéutica líquida que comprende anticuerpos monoclonales anti-CTLA-4 y un agente quelante farmacéuticamente aceptable, en donde la concentración molar de los anticuerpos varía de aproximadamente 0.0006 milimolar a aproximadamente 1 .35 mílimolar, y la concentración molar del agente quelante varía de aproximadamente 0.003 milimolar a aproximadamente 50 milimolar, y en donde la relación molar de anticuerpos a agente quelante varía de aproximadamente 0.00001 a aproximadamente 450.

25.- Una composición farmacéutica líquida que comprende: por lo menos un anticuerpo que comprende una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 95% idéntica a una secuencia de aminoácidos de cadena pesada que se muestra en la SEQ ID NO: 2, y que además comprende una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 95% idéntica a una secuencia de aminoácidos de cadena ligera que se muestra en la SEQ ID NO: 4, en donde el anticuerpo se une al CTLA-4 humano; y un excipiente farmacéuticamente aceptable; en donde la composición contiene una concentración de anticuerpo de por lo menos aproximadamente 10 mg/ml.