MX2007010970A - Composiciones de anticuerpo anti-molecula de adhesion celular adresina de mucosas. - Google Patents

Composiciones de anticuerpo anti-molecula de adhesion celular adresina de mucosas.

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Abstract

La presente invencion se refiere a composiciones de anticuerpo anti-MAdCAM que comprenden un agente quelante, y metodos para tratar enfermedad inflamatoria en un sujeto.

Description

COMPOSICIONES PE ANTICUERPO ANTI-MOLECULA DE ADHESflON CELULAR ADRESINA DE MUCOSAS REFERENCIA RECIPROCA A LAS PATENTES Y SOLICITUDES DE PATENTE RELACIONADAS Esta solicitud reclama el beneficio de la solicitud de patente provisional de E.U.A. No. de serie 60/752,712, presentada en marzo 8 de 2005; solicitud de patente provisional de E.U.A. No. de serie 60/762,456, presentada en enero 26 de 2006; solicitud de patente provisional de E.U.A. No. de serie 60/659,766, presentada en marzo 8 de 2005; y solicitud de patente provisional de E.U.A. No. 60/728,165, presentada en octubre 19 de 2005, las cuales se incorporan en su totalidad en la presente como referencia.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La ¡nvención se refiere a composiciones de anticuerpo y métodos para estabilizar anticuerpos, y a composiciones farmacéuticamente aceptables que comprenden anticuerpos anti-MAdCAM, y métodos para reducir la inestabilidad de anticuerpos anti-MAdCAM. La molécula de adhesión celular adresina de mucosas (MAdCAM), es un miembro de la superfamilia de inmunoglobulinas de receptores de adhesión celular. Mientras que la MadCAM desempeña una función fisiológica en la vigilancia inmune del intestino, parece ser que facilita la extravasación excesiva de linfocitos en enfermedad inflamatoria del intestino bajo condiciones de inflamación crónica del tracto gastrointestinal. Se ha mostrado que anticuerpos que inhiben la unión de linfocitos a4ß7+ a MadCAM reducen los eventos de reclutamiento de linfocitos, extravasación de tejidos, inflamación y severidad de la enfermedad en modelos animales. Se han reportado en la literatura anticuerpos que se unen a, e inhiben la actividad de, MadCAM. Por ejemplo, la solicitud de patente internacional No. PCT/US2005/000370 reporta varios anticuerpos monoclonales humanos para MadCAM, incluyendo un anticuerpo que tiene las secuencias de aminoácidos de la cadena ligera y pesada del anticuerpo 7J6.6. Una línea de células de hibridoma que produce el anticuerpo 7J6.6 fue depositada en la European Collection of Cell Cultures (ECACC), H.P.A. en CAMR, Portón Down, Salisbury, Wiltshire SP4 OJG el 9 de septiembre de 2003, con el número de depósito 03090909. Un modo de administración posible de dichos anticuerpos de MadCAM, es parenteral. Las composiciones anti-MadCAM, como con todas las composiciones de proteínas, están sujetas a problemas respecto a la degradación química y física del anticuerpo en la composición con el tiempo. En general, las composiciones de anticuerpo anti-MadCAM deben exhibir estabilidad física y química aceptable bajo la gama esperada de condiciones de almacenamiento y uso, es decir, las composiciones de anticuerpo anti- MadCAM deben tener una vida útil en depósito suficiente, y sin embargo deben continuar siendo biológicamente activas. La presente solicitud describe composiciones de anticuerpo anti-MadCAM novedosas que exhiben estabilidad química y/o física mejorada respecto a las composiciones anti-MadCAM descritas previamente en la literatura.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN En un aspecto, la presente ¡nvención provee una composición farmacéutica líquida que comprende por lo menos un anticuerpo que comprende una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 95% idéntica a una secuencia de aminoácidos de cadena pesada mostrada en SEQ ID NO: 2, y que comprende además una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 95% idéntica a una secuencia de aminoácidos de cadena ligera mostrada en SEQ ID NO: 4, en donde el anticuerpo se une a MadCAM de humano; y un agente quelante. La presente invención provee también un método para preparar una composición farmacéutica líquida estable, que comprende mezclar por lo menos un anticuerpo anti-MadCAM monoclonal con un agente quelante farmacéuticamente aceptable en una cantidad que reduzca la inestabilidad del anticuerpo, en donde cuando la composición se almacena por un período de aproximadamente 26 semanas a una temperatura de aproximadamente 40°C, la disminución entre un área pico del agregado en el cromatograma para la composición farmacéutica líquida estable que comprende anticuerpos anti- MadCAM monoclonales y el agente quelante, y un área pico del agregado en el cromatograma para una composición de otra manera idéntica que carece del agente quelante que se almacena por un período de aproximadamente 26 semanas a una temperatura de aproximadamente 40°C, es de por lo menos aproximadamente 2%. La presente invención provee también un método para estabilizar por lo menos un anticuerpo anti-MadCAM monoclonal en una composición farmacéutica líquida, que comprende formar una composición líquida que comprenda el anticuerpo (por lo menos uno), y un agente quelante farmacéuticamente aceptable, en donde cuando la composición se almacena por un período de aproximadamente 26 semanas a una temperatura de aproximadamente 40°C, la disminución entre un área pico del agregado en el cromatograma para la composición farmacéutica líquida estable que comprende por lo menos un anticuerpo anti-MadCAM monoclonal y el agente quelante, y un área pico del agregado en el cromatograma para una composición de otra manera idéntica que carece del agente quelante que se almacena por un período de aproximadamente 26 semanas a una temperatura de aproximadamente 40°C, es de por lo menos aproximadamente 2%. La presente invención provee también un método para el tratamiento de una enfermedad inflamatoria en un sujeto, que comprende administrar al sujeto una composición farmacéutica líquida que comprende: una cantidad terapéuticamente efectiva de anticuerpo anti-MadCAM monoclonal 7J 6.6; y un agente quelante farmacéuticamente aceptable. La presente invención provee también un equipo para preparar una composición líquida de un anticuerpo estabilizado, que comprende: un primer contenedor que comprende por lo menos un anticuerpo anti-MadCAM monoclonal 7J 6.6 en solución, y un segundo contenedor que comprende un agente quelante farmacéuticamente aceptable. La presente invención provee también un artículo de fabricación, que comprende un contenedor que contiene una mezcla de por lo menos un anticuerpo anti-MadCAM monoclonal 7.16.6 y un agente quelante farmacéuticamente aceptable. La presente invención provee también una composición farmacéutica líquida que comprende por lo menos un anticuerpo anti- MadCAM monoclonal y un agente quelante farmacéuticamente aceptable, en donde la concentración molar del anticuerpo varía de aproximadamente 0.0006 milimolar a aproximadamente 1.35 milimolar, y la concentración molar del agente quelante varía de aproximadamente 0.003 milimolar a aproximadamente 50 milimolar, y en donde la relación molar de anticuerpos a agente quelante varía de aproximadamente 0.00001 a aproximadamente 450. La presente invención provee también una composición farmacéutica líquida que comprende por lo menos un anticuerpo anti- MadCAM monoclonal de humano, en donde el anticuerpo se une a MadCAM de humano; y un agente quelante. La presente invención provee también una composición farmacéutica líquida que comprende por lo menos un anticuerpo que comprende una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 95% idéntica a una secuencia de aminoácidos de cadena pesada mostrada en SEQ ID NO: 2, y que comprende además una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 95% idéntica a una secuencia de aminoácidos de cadena ligera mostrada en SEQ ID NO: 4, en donde el anticuerpo se une a MadCAM de humano; y un excipiente farmacéuticamente aceptable, en donde la composición contiene una concentración de anticuerpo que es de por lo menos aproximadamente 10 mg/ml.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La figura 1 es una gráfica que ¡lustra el por ciento de agregación en varias composiciones de prueba que difieren en concentración de anticuerpo monoclonal (mAb) después de almacenamiento a 40°C por hasta 26 semanas mediante cromatografía de exclusión por tamaño (SEC); la figura 2 es una gráfica que ilustra el por ciento de agregación en varias composiciones de prueba que difieren en concentración de EDTA después de almacenamiento a 40°C por hasta 26 semanas, mediante SEC; la figura 3 es una gráfica que ilustra el por ciento de agregación en varias composiciones de prueba que difieren en concentración de PS80 después de almacenamiento a 40°C por hasta 26 semanas, mediante SEC; la figura 4 es una gráfica que ilustra el por ciento de agregación en varias composiciones de prueba que difieren en especies de regulador de pH después de almacenamiento a 40°C por hasta 26 semanas, mediante SEC; la figura 5 es una gráfica que ilustra el por ciento de agregación en varias composiciones de prueba que difieren en especies de estabilizador/tonificador después de almacenamiento a 40°C por hasta 26 semanas, mediante SEC; la figura 6 es una gráfica que ¡lustra el por ciento de agregación en varias composiciones de prueba que difieren en especies de agente tensioactivo después de almacenamiento a 40°C por hasta 26 semanas, mediante SEC.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Los métodos y técnicas de la presente invención se llevan a cabo generalmente de acuerdo a métodos convencionales bien conocidos en la técnica, y como se describe en varías referencias generales y más específicas que se citan y se discuten a lo largo de la presente especificación, a menos que se indique de otra manera. Véase, por ejemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a. ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989), Ausubel ef al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates (1992), y Harlow y Lañe, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1990). Reacciones enzimáticas y técnicas de purificación se llevan a cabo de acuerdo a las especificaciones del fabricante, como se logra comúnmente en la técnica o como se describe en la presente. La nomenclatura usada con relación a, y los procedimientos y técnicas de laboratorio de, química analítica, química de síntesis orgánica y química medicinal y farmacéutica descritas en la presente, es aquella bien conocida y usada comúnmente en la técnica. Técnicas estándar se usan para síntesis química, análisis químicos, preparación, formulación y suministro de agentes farmacéuticos, y tratamiento de sujetos.
Definiciones Para ayudarle al lector a que entienda la siguiente descripción detallada, se proveen las siguientes definiciones: Como se usa en la presente, el término "composición", como se refiere a un anticuerpo anti-MadCAM, se usa para describir el anticuerpo en combinación con un excipiente farmacéuticamente aceptable que comprende un agente quelante. Por ejemplo, las composiciones de la ¡nvención tienen una vida útil en depósito y/o estabilidad mejorada en comparación con composiciones reconocidas de la técnica anterior que comprenden un anticuerpo anti-MadCAM. Como se usa en la presente, el término "anticuerpo" se refiere a un anticuerpo intacto o una porción de unión a antígeno que compite con el anticuerpo intacto para unión específica. Véase en general, Fundamental Immunology, capítulo 7 (Paul, W., ed., 2a. ed. Raven Press, N.Y. (1989). Pueden producirse porciones de unión a antígeno mediante técnicas de ADN recombinante, o mediante digestión enzimática o química de anticuerpos intactos. En algunas modalidades, las porciones de unión a antígeno incluyen Fab, Fab', F(ab')2, Fd, Fv, dAb, y fragmentos de la región determinante de complementariedad (CDR), anticuerpos de cadena sencilla (scFv), anticuerpos quiméricos, cuerpos completos y polipéptidos que contengan por lo menos una porción de un anticuerpo que sea suficiente para conferir unión específica del antígeno al polipéptido. Del extremo N-terminal el extremo C-terminal, los dominios variables de cadena pesada y ligera maduros comprenden las regiones FR1 , CDR1 , FR2, CDR2, FR3, CDR3 y FR4. Esta asignación de aminoácidos a cada dominio está de acuerdo con las definiciones de Kabat, Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987 y 1991 )), Chothia & Lesk, J. Mol. Biol. 196: 901-917 (1987), o Chothia et al., Nature 342: 878-883 (1989). Como se usa en la presente, un anticuerpo que sea referido por número tiene las mismas secuencias de aminoácidos de cadena ligera y pesada que un anticuerpo monoclonal que se obtiene del hibridoma del mismo número. Por ejemplo, el anticuerpo monoclonal 7.16.6 tiene las mismas secuencias de aminoácidos de cadena ligera y pesada que se obtienen del hibridoma 7J6.6. De esta manera, la referencia al anticuerpo 7J6.6 incluye el anticuerpo que tiene las secuencias de aminoácidos de cadena ligera y pesada mostradas en SEQ ID NOS: 2 y 4. Incluye también un anticuerpo que carece de una lisina terminal en la cadena pesada, ya que esta se pierde normalmente en una proporción de anticuerpos durante la fabricación. Como se usa en la presente, el término "polipéptido" abarca proteínas nativas o artificiales, fragmentos de proteína y análogos de polipéptido de una secuencia de proteínas. Un polípéptido puede ser monomérico o polimérico. Como se usa en la presente, un fragmento Fd significa un fragmento de anticuerpo que consiste de los dominios VH y CH 1 ; un fragmento Fv consiste de los dominios V y VH de un brazo individual de un anticuerpo; y un fragmento dAb (Ward et al., Nature 341 : 544-546 (1989)) consiste de un dominio VH. El término "o una porción de unión a antígeno del mismo", cuando se usa con el término "anticuerpo", se refiere a un polipéptido que tiene una delecíón amino-terminal y/o carboxi-terminal, pero en donde la secuencia de aminoácidos restante es idéntica a las posiciones correspondientes en la secuencia de ocurrencia natural. En algunas modalidades, los fragmentos tienen por lo menos 5, 6, 8 ó 10 aminoácidos de longitud. En otras modalidades, los fragmentos tienen por lo menos 14, por lo menos 20, por lo menos 50, o por lo menos 70, 80, 90, 100, 150 ó 200 aminoácidos de longitud. Como se usa en la presente, el término "anticuerpo monoclonal" se refiere a un anticuerpo obtenido de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, es decir, los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos, salvo por mutaciones posibles de ocurrencia natural que pueden estar presentes en cantidades menores o que carecen de una lisina C-terminal. Los anticuerpos monoclonales son altamente específicos, siendo dirigidos contra un sitio antigénico individual. Además, en contraste a las preparaciones de anticuerpo convencionales (policlonales), que incluyen típicamente diferentes anticuerpos, dirigidos contra diferentes determinantes (epítopes), cada anticuerpo monoclonal es dirigido contra un determinante individual en el antígeno. El modificador "monoclonal" indica el carácter del anticuerpo que se obtiene de una población sustancialmente homogénea de anticuerpos, y no deberá considerarse que requiere la producción del anticuerpo mediante algún método particular. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales que se usarán de conformidad con la presente ¡nvención, pueden obtenerse medíante el método de híbridoma descrito primero por Kohier, et al., Nature 256: 495 (1975), o pueden obtenerse mediante métodos de ADN recombinante (véase, por ejemplo, la patente de E.U.A. No. 4,816,567). Los "anticuerpos monoclonales" pueden aislarse también de colecciones de anticuerpos de fagos usando, por ejemplo, las técnicas descritas en Clackson, et al., Nature 352: 624-628 (1991 ) y en Marks, ef al., J. Mol. Biol. 222: 581 -597 (1991 ). Como se usa en la presente, los términos "anticuerpo aislado" o "anticuerpo purificado, se refieren a un anticuerpo que en virtud de su origen o fuente de derivación, tiene de 1 a 4 de las siguientes características: (1 ) no está asociado con componentes asociados naturalmente que lo acompañan en su estado nativo, (2) está libre de otras proteínas de la misma especie, (3) es expresado por una célula de una especie diferente, o (4) no ocurre en la naturaleza. De esta manera, un anticuerpo que es sintetizado químicamente o sintetizado en un sistema celular diferente de la célula de la cual se origina naturalmente, es aislado y purificado de sus componentes asociados naturalmente. Puede hacerse también que un anticuerpo esté sustancialmente libre de componentes asociados naturalmente mediante aislamiento y purificación, usando técnicas de purificación de proteínas bien conocidas en la materia. Ejemplos de anticuerpos aislados/purificados, incluyen un anticuerpo anti-MadCAM que haya sido purificado por afinidad usando MadCAM, un anticuerpo anti-MadCAM que haya sido sintetizado por un hibridoma u otra línea de células in vitro, y un anticuerpo anti-MadCAM de humano derivado de un ratón transgénico. Un anticuerpo es "sustancialmente puro", "sustancialmente homogéneo" o "sustancialmente purificado", cuando por lo menos aproximadamente 60 a 75% de una muestra exhibe una especie de anticuerpo individual. El anticuerpo puede ser monomérico o multimérico. Un anticuerpo sustancialmente puro comprenderá típicamente aproximadamente 50%, 60%, 70%, 80% o 90% en p/p de una muestra de anticuerpo, más usualmente aproximadamente 95%, y de preferencia será más de 99% puro. La pureza u homogeneidad del anticuerpo puede indicarse mediante muchos medios bien conocidos en la técnica, tales como electroforesís en gel de poliacrilamida de una muestra de anticuerpo, seguida de vísualización de una banda de polipéptidos individual tras la tinción del gel con un colorante bien conocido en la técnica. Para ciertos propósitos, puede lograrse mayor resolución usando CLAR u otros medios bien conocidos en la técnica para purificación. Como se usa en la presente, se pretende que el término "anticuerpo humano" incluya anticuerpos que tienen regiones variables y constantes derivadas de secuencias de inmunoglobulína de la línea germinal humana. Los anticuerpos humanos de la invención pueden incluir residuos de aminoácido no codificados por secuencias de inmunoglobulina de la línea germinal humana (por ejemplo, mutaciones introducidas mediante mutagénesis aleatoria o específica de sitio in vitro o mediante mutación somática in vivo), por ejemplo, en las CDRs, y en particular la CDR3. Sin embargo, no se pretende que el término "anticuerpo humano", como se usa en la presente, incluya anticuerpos en los cuales secuencias de CDR derivadas de la línea germinal de otra especie de mamífero, tal como un ratón, hayan sido injertadas en secuencias del marco de lectura de humano. Como se usa en la presente, se pretende que el término "anticuerpo humano recombinante" incluya todos los anticuerpos humanos que se preparan, expresan, crean o aislan mediante medios recombinantes, tales como anticuefos expresados usando un vector de expresión recombinante transfectado en una célula hospedera, anticuerpos aislados de una colección combinatoria recombinante de anticuefos humanos, anticuerpos aislados de un animal (por ejemplo, un ratón) que sea transgénico para los genes de inmunoglobulina humana (véase por ejemplo, Taylor, L. D., et al. (1992) Nucí. Acids Res. 20: 6287-6295), o anticuerpos preparados, expresados, creados o aislados mediante cualquier otro medio que implique empalme de secuencias de genes de ¡nmunoglobulina humana con otras secuencias de ADN. Dichos anticuerpos humanos recombinantes tienen regiones variables y constantes derivadas de secuencias de ¡nmunoglobulina de la línea germinal humana. Sin embargo, en ciertas modalidades, dichos anticuerpos humanos recombinantes se someten a mutagénesis in vitro (o cuando se usa un animal transgénico para secuencias de Ig humana, mutagénesís somática in vivo), y de esta manera las secuencias de aminoácidos de las regiones VH y V de los anticuerpos recombinantes son secuencias que, mientras se derivan de, y se relacionan con, secuencias de VH y VL de la línea germinal humana, pueden no existir en forma natural dentro del repertorio de la línea germinal de anticuerpos humanos in vivo. Como se usa en la presente, el término "polinucleótido" significa una forma polimérica de nucleótidos de por lo menos 10 bases de longitud, ya sea ribonucleótidos o desoxinucleótidos o una forma modificada de cualquier tipo de nucleótido. El término ¡ncluye formas de cadena sencilla y formas de doble cadena. Como se usa en la presente, el término "polinucleótido aislado" significa un polinucleótído de origen genómico, de ADNc o sintético, o alguna combinación de los mismos, que en virtud de su origen o fuente de derivación, el "polinucleótido aislado" tiene de 1 a 3 de las siguientes características: (1 ) no está asociado con un polinucleótido completo o una porción del mismo con el cual el "polinucleótido aislado" se encuentra en la naturaleza, (2) está enlazado operablemente a un polínucleótido con el cual no está enlazado en la naturaleza, o (3) no ocurre en la naturaleza como parte de una secuencia más grande. Como se usa en la presente, el término "nucleótidos de ocurrencia natural" incluye desoxirribonucleótidos y ribonucleótidos. El término "nucleótidos modificados", como se usa en la presente, incluye nucleótidos con grupos azúcar modificados o sustituidos, o similares. El término "enlaces de oligonucleótido" referido en la presente, incluye enlaces de oligonucleótidos tales como fosforotioato, fosforoditioato, fosforoselenoato, fosforodiselenoato, fosforoanilotioato, fosforaniladato, fosforoamidato, y similares. Véase, por ejemplo, LaPlanche et al., Nucí. Acids Res. 14: 9081 (1986); Stec et al., J. Am. Chem. Soc. 106: 6077 (1984); Steín et al., Nucí. Acids Res. 16: 3209 (1988); Zon et al., Anti-Cancer Drug Design 6: 539 (1991 ); Zon et al., Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach, pp. 87-108 (F. Eckstein, ed., Oxford Uníversity Press, Oxford Inglaterra (1991 )); patente de E.U.A. 5,151 ,510; y Uhlmann y Peyman, Chemical Reviews 90: 543 (1990), cuyas descripciones se incorporan en la presente como referencia. Un oligonucleótido puede incluir una marca para detección, si se desea. Las secuencias "enlazadas operablemente", ¡ncluyen secuencias de control de la expresión que son contiguas con el gen de interés, y secuencias de control de la expresión que actúan en la posición trans, o a una distancia para controlar el gen de interés. El término "secuencia de control de la expresión", como se usa en la presente, significa secuencias de polinucleótídos que son necesarias para efectuar la expresión y el procesamiento de secuencias codificantes a las cuales están ligadas. Las secuencias de control de la expresión incluyen secuencias de inicio y terminación de la transcripción y secuencias de promotor e intensíficador adecuadas; señales de procesamiento de ARN eficientes, tales como señales de poliadenilación y empalme; secuencias que estabilizan ARN mensajero citoplásmico; secuencias que intensifican la eficiencia de la traducción (es decir, secuencia consenso de Kozak); secuencias que intensifican la estabilidad de las proteínas; y, cuando se desee, secuencias que intensifican la secreción de proteínas. La naturaleza de dichas secuencias de control difiere, dependiendo del organismo hospedero; en procariontes, dichas secuencias de control incluyen en general promotor, sitio de unión del ribosoma y secuencia de terminación de la transcripción; en eucariontes, en general, dichas secuencias de control incluyen promotores y secuencia de terminación de la transcripción. Se pretende que el término "secuencias de control" incluya, a un mínimo, todos los componentes cuya presencia sea esencial para expresión y procesamiento, y pueden incluir también componentes adicionales cuya presencia sea ventajosa, por ejemplo, secuencias guía y secuencias de miembro de fusión. Como se usa en la presente, el término "vector" significa una molécula de ácido nucleico capaz de transportar otro ácido nucleico con el cual ha estado enlazado. En algunas modalidades, el vector es un plásmido, es decir, una asa de ADN de doble cadena circular en la cual segmentos de ADN adicionales pueden estar ligados. En algunas modalidades, el vector es un vector viral, en donde segmentos de ADN adicionales pueden estar ligados en el genoma viral. En algunas modalidades, los vectores son capaces de replicacíón autónoma en una célula hospedera en la cual son introducidos (por ejemplo, vectores bacterianos que tienen un origen de replicación bacteriano y vectores episómícos de mamífero). En otras modalidades, los vectores (por ejemplo, vectores no episómicos de mamífero) pueden estar integrados en el genoma de una célula hospedera tras la introducción en la célula hospedera, y se replican de esta manera junto con el genoma del hospedero. Además, ciertos vectores son capaces de dirigir la expresión de genes con los cuales están enlazados operativamente. Dichos vectores son referidos en la presente como "vectores de expresión recombinantes" (o simplemente, "vectores de expresión"). Como se usa en la presente, el término "célula hospedera recombinante" (o simplemente "célula hospedera"), significa una célula en la cual un vector de expresión recombinante ha sido introducido. Debe entenderse que los términos "célula hospedera recombinante" y "célula hospedera" significan no sólo la célula sujeto particular, sino también la progenie de dicha célula. Debido a que ciertas modificaciones pueden ocurrir en generaciones sucesivas debido a mutación o influencias ambientales, dicha progenie puede de hecho no ser idéntica a la célula progenitora, pero se incluye aún dentro del alcance del término "célula hospedera", como se usa en la presente. Como se usa en la presente, el término "es capaz de unirse específicamente", se refiere a cuando un anticuerpo se une a un antígeno con una constante de disociación que es < 1 µM, de preferencia < 1 nM, y más preferiblemente < 10 pM. Como se usa en la presente, el término "hibrida selectivamente" significa que se une detectablemente y específicamente. Polinucleótidos, oligonucleótidos y fragmentos de los mismos de conformidad con la invención, hibridan selectivamente con cadenas de ácido nucleico, bajo condiciones de hibridación y lavado que reducen al mínimo cantidades aprecíables de unión detectable a ácidos nucleicos no específicos. Pueden usarse condiciones de "alta severidad" o condiciones "altamente severas" para lograr condiciones de hibridación selectiva, como es sabido en la técnica y como se discute en la presente. Un ejemplo de condiciones de "alta severidad" o condiciones "altamente severas", es la incubación de un polinucleótido con otro polinucleótído, en donde un polinucleótido puede estar adherido a una superficie sólida tal como una membrana, en un regulador de pH de hibridación de 6X SSPE o SSC, formamida a 50%, 5X reactivo de Denhardt, SDS a 0.5%, 100 µg/ml de ADN de esperma de salmón fragmentado desnaturalizado a una temperatura de hibridación de 42°C por 12 a 16 horas, seguida de lavado dos veces a 55°C usando un regulador de pH de lavado de 1X SSC, SDS a 0.5%. Véase también Sambrook et al., citado anteriormente, pp. 9.50-9.55. El término "por ciento de identidad de secuencia" en el contexto de secuencias de ácido nucleico, significa el por ciento de residuos cuando una primera secuencia contigua se compara y se alinea para correspondencia máxima con una segunda secuencia contigua. La longitud de la comparación de la identidad de secuencia puede ser sobre un tramo de por lo menos aproximadamente 9 nucleótidos, usualmente por lo menos aproximadamente 18 nucleótidos, más usualmente por lo menos aproximadamente 24 nucleótidos, típicamente por lo menos aproximadamente 28 nucleótídos, más típicamente por lo menos aproximadamente 32 nucleótidos, y de preferencia por lo menos aproximadamente 36, 48 o más nucleótidos. Existen muchos algoritmos diferentes conocidos en la técnica que pueden usarse para medir la identidad de la secuencia de nucleótidos. Por ejemplo, pueden compararse las secuencias de polinucleótidos usando FASTA, Gap o Bestfit, que son programas en el paquete Wisconsín versión 10.0, Genetics Computer Group (GCG), Madison, Wisconsin. FASTA, que incluye, por ejemplo, los programas FASTA2 y FASTA3, provee alineaciones y el por ciento de identidad de secuencia de las regiones del mejor traslape entre las secuencias de consulta y de búsqueda (Pearson, Methods Enzymol. 183: 63-98 (1990); Pearson, Methods Mol. Biol. 132: 185-219 (2000); Pearson, Methods Enzymol. 266: 227-258 (1996); Pearson, J. Mol. Bíol. 276: 71-84 (1998); citas incorporadas en la presente como referencia). A menos que se especifique de otra manera, se usan parámetros predeterminados para un programa o algoritmo particular.
Por ejemplo, puede determinarse el por ciento de identidad de secuencia entre secuencias de ácido nucleico, usando FASTA con sus parámetros predeterminados (un tamaño de palabra de 6 y el factor NOPAM para la matriz de evaluación), o usando Gap con sus parámetros predeterminados provistos en GCG versión 6J , programas incorporados en la presente como referencia. La referencia a un "polinucleótido" o una secuencia de "ácido nucleico" abarca su complemento, a menos que se especifique de otra manera. De esta manera, debe entenderse que la referencia a un ácido nucleico que tiene una secuencia particular abarca su cadena complementaria, con su secuencia complementaria. El término "similitud sustancial" o "similitud de secuencia sustancial", cuando se refiere a un ácido nucleico o fragmento del mismo, significa que cuando se alinea óptimamente con inserciones o deleciones de nucleótidos adecuadas con otro ácido nucleico (o su cadena complementaria), existe identidad de secuencia de nucleótidos en por lo menos aproximadamente 85%, de preferencia por lo menos aproximadamente 90%, y más preferiblemente por lo menos aproximadamente 95%, 96%, 97%, 98% o 99% de las bases de nucleótidos, según se mide mediante algún algoritmo o identidad de secuencia bien conocido, tales como FASTA, BLAST o Gap, como se discutió anteriormente. Como se aplica a polipéptidos, el término "identidad sustancial", "por ciento de identidad" o "% idéntica", significa que dos secuencias de péptidos, cuando se alinean óptimamente, tal como mediante los programas GAP o BESTFIT que usan pesos de espacio predeterminados provistos con los programas, comparten por lo menos 70%, 75% u 80% de identidad de secuencia, de preferencia por lo menos 90% o 95% de identidad de secuencia, y más preferiblemente por lo menos 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia. En ciertas modalidades, las posiciones de residuos que no son idénticas, difieren por sustituciones conservativas de aminoácidos. Una "sustitución conservativa de aminoácidos", es una en la cual un residuo de aminoácido es sustituido por otro residuo de aminoácido que tenga un grupo R de cadena lateral con propiedades químicas similares (por ejemplo, carga o carácter hidrofóbico). En general, una sustitución conservativa de aminoácidos no cambiará sustancíalmente las propiedades funcionales de una proteína. En casos en donde dos o más secuencias de aminoácidos difieren entre sí por sustituciones conservativas, el por ciento de identidad de secuencia puede ajustarse hacía arriba para corregir la naturaleza conservativa de la sustitución. Medios para hacer este ajuste, son bien conocidos por los expertos en la técnica. Véase, por ejemplo, Pearson, Methods Mol. Biol. 243: 307-31 (1994). Ejemplos de grupos de aminoácidos que tienen cadenas laterales con propiedades químicas similares, ¡ncluyen 1 ) cadenas laterales alifáticas: glicina, alanina, valina, leucina e isoleucina; 2) cadenas laterales de hidroxilo alifáticas: serina y treonina; 3) cadenas laterales que contienen amida: asparagina y glutamina; 4) cadenas laterales aromáticas: fenílalanina, tirosina y triptófano; 5) cadenas laterales básicas: lisina, arginina e histidina; 6) cadenas laterales acidas: ácido aspártico y ácido glutámico; y 7) cadenas laterales que contienen azufre: cisteína y metionina. Los grupos de sustitución conservativa de aminoácidos son: valina-leucina-isoleucina, fenilalanina-tirosina, lisina-arginina, alanina-valina, glutamato-aspartato y asparagina-glutamina. La identidad de secuencia para polipéptidos, se mide típicamente usando un software de análisis de secuencias. El software de análisis de proteínas, compara secuencias usando medidas de similitud asignadas a varias sustituciones, deleciones y otras modificaciones, incluyendo sustituciones conservativas de aminoácidos. Por ejemplo, GCG contiene programas tales como "Gap" y "Bestfit" que pueden usarse con parámetros predeterminados, como se especifica con los programas, para determinar la homología de secuencia o identidad de secuencia entre polipéptidos estrechamente relacionados, tales como polípéptidos homólogos de diferentes especies de organismos, o entre una proteína de tipo silvestre y un mutante de la misma. Véase, por ejemplo, GCG versión 6.1. Pueden compararse también secuencias de polipéptidos usando FASTA, que usa parámetros predeterminados o recomendados; véase GCG versión 6.1. (Universidad de Wisconsin Wl). FASTA (por ejemplo, FASTA2 y FASTA3) provee alineaciones y por ciento de identidad de secuencia de las regiones de mejor traslape entre las secuencias de consulta y de búsqueda (Pearson, Methods Enzymol. 183: 63-98 (1990); Pearson, Methods Mol. Bíol. 132: 185-219 (2000)). Otro algoritmo preferido cuando se compara una secuencia de la invención con una base de datos que contiene un gran número de secuencias de diferentes organismos, es el programa de cómputo BLAST, especialmente blastp o tblastn, usando parámetros predeterminados, provistos con los programas. Véase, por ejemplo, Altschul et al., J. Mol. Biol. 215: 403-410 (1990); y Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25: 3389-402 (1997). La longitud de las secuencias de polipéptidos comparadas para homología, será en general de por lo menos aproximadamente 16 residuos de aminoácido, usualmente por lo menos aproximadamente 20 residuos, más usualmente por lo menos aproximadamente 24 residuos, típicamente por lo menos aproximadamente 28 residuos, y de preferencia más de aproximadamente 35 residuos. Cuando se busca una base de datos que contiene secuencias de un gran número de diferentes organismos, se prefiere comparar las secuencias de aminoácidos. Una "cantidad terapéuticamente efectiva" se refiere a una cantidad efectiva, a dosificaciones y por períodos necesarios, para lograr el resultado terapéutico deseado, que incluye tratamiento o prevención profiláctica de enfermedades inflamatorias. Se notará que los valores de dosificación pueden variar con la severidad de la condición que se va a aliviar. Se entenderá además que para algún sujeto particular, deben ajustarse los regímenes de dosificación específicos con el tiempo de acuerdo a la necesidad individual y el juicio profesional de la persona que administra o que supervisa la administración de las composiciones, y que las escalas de dosificación expuestas en la presente son sólo ejemplos, y no se pretende que limiten el alcance o la práctica de la composición reclamada. Asimismo, una cantidad terapéuticamente efectiva del anticuerpo o porción de anticuerpo puede variar de acuerdo a factores tales como el estado de enfermedad, edad, sexo y peso de individuo, la capacidad del anticuerpo o porción de anticuerpo para inducir una respuesta deseada en el individuo, y la vía de administración deseada de la composición de anticuerpo. Una cantidad terapéuticamente efectiva es también una en la cual cualquier efecto tóxico o perjudicial del anticuerpo o porción de anticuerpo, sea excedido por los efectos terapéuticamente benéficos. Como se usa en la presente, el término "sacárido" se refiere a una clase de moléculas que son derivados de alcoholes polihídricos. Como se usa en la presente, el término "sujeto" para propósitos de tratamiento ¡ncluye cualquier sujeto, y de preferencia es un sujeto que esté en necesidad de tratamiento de una enfermedad inflamatoria. Para propósitos de prevención, el sujeto es cualquier sujeto, y de preferencia es un sujeto que esté en riesgo de, o esté predispuesto a, desarrollar una enfermedad inflamatoria. Se pretende que el término "sujeto" incluya organismos vivos, por ejemplo, procariontes y eucariontes. Ejemplos de sujetos incluyen mamíferos, por ejemplo, humanos, perros, vacas, caballos, cerdos, ovejas, cabras, gatos, ratones, conejos, ratas, y animales no humanos transgénicos. En modalidades específicas de la invención, el sujeto es un humano. Como se usa en la presente, el término "tratamiento" se refiere a tratamiento terapéutico y medidas profilácticas o preventivas, en donde el objetivo es prevenir o retardar (aminorar) la condición o enfermedad patológica elegida como objetivo. Aquellos en necesidad de tratamiento incluyen aquellos ya con la enfermedad, así como aquellos propensos a tener la enfermedad, o aquellos en quien la enfermedad será prevenida. Cuando se introducen elementos de la presente invención o las modalidades preferidas de la misma, se pretende que los artículos "un", "una", "la" y "dicha" signifiquen que existen uno o más de los elementos. Se pretende que los términos "que comprende", "comprende", "comprenden", "que incluye" y "que tiene" sean inclusivos, y que signifiquen que puede haber elementos adicionales además de los elementos enlistados.
Anticuerpos anti-MadCAM De conformidad con la presente invención, se ha descubierto que la estabilidad de ciertos anticuerpos anti-MAdCAM monoclonales que se describen en la presente puede mejorarse en solución, mezclando los anticuerpos anti-MAdCAM con un agente quelante farmacéuticamente aceptable, tal como ácido etilendiaminotetraacétíco ("EDTA"). Mientras que no se desea que sea limitado por la teoría, se cree que la presencia de un agente quelante en la composición de la presente invención ayuda a mejorar la estabilidad del polipéptido del anticuerpo, reduciendo la incidencia de uno o más de los siguientes: agregación, fragmentación, oxidación, inestabilidad a la congelación/descongelación, decoloración y/o desamidación del anticuerpo anti-MAdCAM. La presente ¡nvención comprende composiciones de anticuerpo anti-MAdCAM que tienen estabilidad química y/o química mejorada, en comparación con composiciones de anticuefo descritas previamente. Por lo tanto, en ciertos aspectos, la presente invención provee una composición farmacéutica líquida que comprende un agente quelante farmacéuticamente aceptable, tal como EDTA, y por lo menos un anticuerpo anti-MAdCAM monoclonal o una porción de unión a antígeno del mismo. En otros aspectos, las composiciones de anticuerpo anti-MAdCAM líquidas mencionadas anteriormente que comprenden un agente quelante, pueden incluir excipientes farmacéuticamente aceptables adicionales que incluyen, pero no están limitados a, uno o más excipientes que se seleccionan de reguladores de pH, agentes de tonicidad, agentes tensioactívos, y mezclas de los mismos. La presente invención provee composiciones novedosas que comprenden anticuefos antí-MAdCAM. Como se usa en la presente, la frase "anticuerpo anti-MAdCAM" se refiere a cualquier anticuerpo, o cualquier porción del mismo, que sea capaz de unirse a cualquier porción de un polipéptido MAdCAM que pueda estar presente dentro de, o pueda aislarse de, cualquier animal. En ciertas modalidades, el polipéptído MAdCAM es un polipéptido MAdCAM de humano. Anticuerpos anti-MAdCAM adecuados para su uso con la presente invención, pueden seleccionarse de anticuerpos monoclonales o policlonales. En ciertos aspectos, el anticuerpo anti-MAdCAM monoclonal puede ser un anticuerpo de murino, quimérico, humanizado o de humano. En otras modalidades, el anticuerpo anti-MAdCAM monoclonal es un anticuerpo anti-MAdCAM monoclonal de humano. En ciertas modalidades, los anticuerpos anti-MAdCAM que son adecuados para su uso con la presente invención incluyen aquellos anticuerpos anti-MAdCAM, y métodos para prepararlos, que se describen en la solicitud internacional número PCT/US2005/000370, presentada el 7 de enero de 2005 y publicada el 28 de julio de 2005. En otras modalidades, los anticuerpos anti-MAdCAM que son adecuados para su uso con la presente invención incluyen aquellos anticuefos monoclonales anti-MAdCAM que tienen las secuencias de aminoácidos de cadena ligera y pesada del anticuerpo designado como 7J6.6 en la solicitud internacional número PCT/US2005/000370. Además, dichos anticuerpos antí-MAdCAM pueden seleccionarse con base en diferencias en las secuencias de aminoácidos en la región constante de sus cadenas pesadas. Por ejemplo, los anticuerpos anti-MAdCAM pueden seleccionarse de la clase de IgG, que tienen cadenas pesadas tipo "gamma". La clase y subclase de anticuerpos anti-MAdCAM, pueden determinarse mediante cualquier método conocido en la técnica. En general, la clase y subclase de un anticuerpo puede determinarse usando anticuerpos que sean específicos para una clase y subclase de anticuerpo particular. Dichos anticuerpos están disponibles comercialmente. La clase y subclase puede determinarse mediante ELISA o Western Blot, así como otras técnicas. En forma alternativa, la clase y subclase puede determinarse mediante secuenciación de los dominios constantes completos, o una porción de los mismos, de las cadenas ligera y/o pesada de los anticuerpos, comparando sus secuencias de aminoácidos con las secuencias de aminoácidos conocidas de varias clases y subclases de inmunoglobulinas, y determinando la clase y subclase de los anticuerpos. El anticuerpo anti-MAdCAM puede ser una molécula de IgG, IgM, IgE, IgA o IgD. En otras modalidades, el anticuerpo antí-MAdCAM es una IgG, y es una subclase lgG1 , lgG2, lgG3 o lgG4. Sin embargo, como se apreciará, no es generalmente deseable destruir las células que expresan a MAdCAM. Más bien, se desea en general inhibir simplemente la unión de MAdCAM con sus ligandos, para mitigar la subregulación de células T. Uno de los mecanismos principales a través de los cuales los anticuerpos destruyen células, es a través de la fijación del complemento y participación en CDC. La región constante de un anticuerpo desempeña una función importante con relación a la capacidad de un anticuerpo para fijar el complemento y participar en CDC. De esta manera, en general se selecciona el isotipo de un anticuerpo para proveer o no la capacidad de fijación del complemento. En el caso de la presente invención, en general, como se mencionó anteriormente, no se prefiere en general usar un anticuerpo que destruya las células. Existen muchos isotipos de anticuerpos que son capaces de fijación del complemento y CDC e incluyen, sin limitación, los siguientes: IgM de murino, lgG2a de murino, lgG2b de murino, lgG3 de murino, IgM de humano, lgG1 de humano e lgG3 de humano. En contraste, isotipos preferidos que no son capaces de fijación del complemento y CDC ¡ncluyen, sin limitación, lgG2 de humano e lgG4 de humano. Además de diferencias de secuencia de la cadena pesada, los anticuerpos IgG difieren dentro de su subclase con base en el número de enlaces disulfuro y la longitud de la región de gozne. Por ejemplo, la subclase lgG2 tiene varias diferencias distintas de las otras subclases. Las subclases lgG2 e lgG4 son conocidas por tener 4 enlaces disulfuro dentro de su región de gozne, mientras que lgG1 tiene 2 e lgG3 tiene 11 enlaces disulfuro. Otras diferencias para los anticuerpos lgG2, incluyen su capacidad reducida para cruzar la placenta, y la incapacidad de los anticuerpos lgG2 para unirse a los receptores Fc de linfocitos. De esta manera, en ciertas modalidades, el anticuerpo anti-MAdCAM es de la subclase lgG2 o lgG4. En otra modalidad preferida, el anticuerpo anti-MAdCAM es de la subclase lgG2. En algunas modalidades, el anticuerpo es un anticuerpo de cadena sencilla (scFv) en el cual los dominios VL y VH están apareados para formar moléculas monovalentes mediante un enlazador sintético que permite que se obtengan como una proteína de cadena sencilla (véase Bird ef al., Science 242: 423-426 (1988) y Huston et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 85: 5879-5883 (1988)). En algunas modalidades, los anticuerpos son cuerpos completos, es decir, son anticuerpos bivalentes, en los cuales los dominios VH y VL se expresan en una cadena polipeptídica individual, pero usando un enlazador que es demasiado corto para permitir el apareamiento entre los dos dominios en la misma cadena, forzando de esta manera a los dominios para que se apareen con dominios complementarios de otra cadena, y creando dos sitios de unión a antígeno (véase, por ejemplo, Holliger P. et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993), y Poljak R. J. et al., Structure 2: 1121-1123 (1994)). En algunas modalidades, una o más CDRs de un anticuerpo de la invención pueden incorporarse en una molécula ya sea covalentemente o no covalentemente, para hacerla una inmunoadhesina que se une específicamente a MAdCAM. En dichas modalidades, las CDRs pueden incorporarse como parte de una cadena de polipéptidos más larga, pueden enlazarse covalentemente a otra cadena de polipéptidos, o pueden incorporarse no covalentemente. En otra modalidad, el anticuerpo anti-MAdCAM tiene selectividad (o carácter específico) por MAdCAM que es por lo menos 100 veces mayor que su selectividad por algún otro polipéptido. En algunas modalidades, el anticuerpo anti-MAdCAM no exhibe unión específica apreciable alguna a alguna otra proteína diferente de MAdCAM. Puede determinarse la selectividad del anticuerpo anti-MAdCAM por MAdCAM usando métodos bien conocidos en la técnica, siguiendo las enseñanzas de la especificación. Por ejemplo, puede determinarse la selectividad usando Western blot, FACS, ELISA o RÍA. De esta manera, en algunas modalidades, el anticuerpo anti-MAdCAM monoclonal es capaz de unirse específicamente a MAdCAM. En algunas modalidades, la lisina C-terminal de la cadena pesada del anticuerpo antí-MAdCAM de la ¡nvención, no está presente. En varias modalidades de la invención, la cadena ligera y pesada de los anticuerpos anti-MAdCAM puede incluir opcionalmente una secuencia de señal. El cuadro 1 enlista los identificadores de secuencia (SEQ ID NOS) de los ácidos nucleicos que codifican para las cadenas ligera y pesada y las secuencias de aminoácidos predichas correspondientes, para el anticuerpo monoclonal anti-MAdCAM 7J6.6. Mientras que las secuencias de ADN que codifican para un polipéptido de señal se muestran en los identificadores de secuencia (SEQ ID NOS), el anticuerpo no comprende típicamente un polipéptido de señal, debido a que el polipéptido de señal es generalmente eliminado durante las modificaciones pos-traducción. En varias modalidades de la invención, las cadenas ligera y pesada, o una de las mismas de los anticuerpos anti-MAdCAM, incluyen una secuencia de señal (o una porción de la secuencia de señal). En otras modalidades de la invención, ninguna de las cadenas ligera o pesada de los anticuerpos anti-MAdCAM incluye una secuencia de señal.
CUADRO 1 En algunas modalidades, la molécula de ácido nucleico comprende una secuencia de nucleótidos que codifica para la secuencia de aminoácidos de V del anticuerpo monoclonal 7.16.6 (SEQ ID NO: 4), o una porción de la misma. En algunas modalidades, dicha porción comprende por lo menos la región CDR3. En algunas modalidades, el ácido nucleico codifica para la secuencia de aminoácidos de las CDRs de cadena ligera de dicho anticuerpo. En algunas modalidades, dicha porción es una porción contigua que comprende CDR1 a CDR3. En otras modalidades, la molécula de ácido nucleico codifica para una secuencia de aminoácidos de V que es por lo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100% idéntica a una secuencia de aminoácidos de V del anticuerpo 7J6.6, o una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4. Las moléculas de ácido nucleico de la invención incluyen ácidos nucleicos que hibridan bajo condiciones altamente severas, tales como aquellas descritas anteriormente, con una secuencia de ácido nucleico que codifica para la secuencia de aminoácidos de cadena ligera de SEQ ID NO: 4. En otras modalidades, la molécula de ácido nucleico comprende una secuencia de nucleótidos que codifica para por lo menos una porción de la secuencia de aminoácidos de VH de 7J6.6 (SEQ ID NO: 2), o dicha secuencia que tiene mutaciones conservativas de aminoácidos y/o un total de tres o menos sustituciones no conservativas de aminoácidos. En varias modalidades, la secuencia codifica para una o más regiones CDR, de preferencia una región CDR3, las tres regiones CDR, una porción contigua que incluye CDR1 a CDR3, o la región VH entera. En algunas modalidades, la molécula de ácido nucleico codifica para una secuencia de aminoácidos de VH que es por lo menos 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ó 100% idéntica a la secuencia de aminoácidos de VH de SEQ ID NO: 2. Las moléculas de ácido nucleico de la ¡nvención incluyen ácidos nucleicos que hibridan bajo condiciones altamente severas, tales como aquellas descritas anteriormente, con una secuencia de nucleótidos que codifica para la secuencia de aminoácidos de cadena pesada de SEQ ID NO: 2. En otros aspectos, la presente invención provee una composición farmacéutica líquida que comprende por lo menos un anticuerpo humano purificado que se une a MAdCAM, en donde el anticuerpo comprende una secuencia de aminoácidos de cadena pesada con por lo menos 95% de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 2, y una secuencia de aminoácidos de cadena ligera con por lo menos 95% de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 4. En otros aspectos, el anticuefo comprende una secuencia de aminoácidos de cadena pesada con por lo menos 99% de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 2, y una secuencia de aminoácidos de cadena ligera con por lo menos 99% de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 4. En otros aspectos, el anticuerpo comprende una secuencia de aminoácidos de cadena pesada que comprende la región variable de SEQ ID NO: 2, y una secuencia de aminoácidos de cadena ligera que comprende la región variable de SEQ ID NO: 4. En otros aspectos, el anticuerpo comprende una secuencia de aminoácidos de cadena pesada que comprende SEQ ID NO: 2, y una secuencia de aminoácidos de cadena ligera que comprende SEQ ID NO: 4.
En una modalidad de la presente invención, el anticuerpo anti-MAdCAM se une específicamente a un epítope conformacional en MAdCAM de humano.
Preparación de las composiciones de anticuerpo anti-MAdCAM monoclonal El anticuerpo anti-MAdCAM se formula típicamente como una composición farmacéutica para administración parenteral a un sujeto. En una modalidad, la composición farmacéutica es una composición líquida. En otra modalidad, la composición farmacéutica es una composición líquida. En otra modalidad, la invención está dirigida a una composición farmacéutica líquida que comprende por lo menos un anticuerpo anti-MAdCAM y un agente quelante farmacéuticamente aceptable. En otra modalidad, la invención está dirigida a una composición farmacéutica líquida que comprende por lo menos un anticuerpo anti-MAdCAM y EDTA. En otra modalidad, la invención está dirigida a una composición farmacéutica líquida que comprende por lo menos un anticuerpo anti-MAdCAM, un agente quelante farmacéuticamente aceptable, y un regulador de pH farmacéuticamente aceptable. En otra modalidad, la invención está dirigida a una composición farmacéutica líquida que comprende por lo menos un anticuerpo anti-MAdCAM, un agente quelante farmacéuticamente aceptable, e histidina. En otra modalidad, la ¡nvención está dirigida a una composición farmacéutica líquida que comprende un anticuerpo anti-MAdCAM, EDTA e histidina. En otra modalidad, la invención está dirigida a una composición farmacéutica líquida que comprende un anticuerpo anti-MAdCAM, DTPA e histidina. En otra modalidad, la invención está dirigida a una composición farmacéutica líquida que comprende un anticuerpo anti-MAdCAM, un agente quelante farmacéuticamente aceptable, y un agente de tonicidad farmacéuticamente aceptable. En otra modalidad, la invención está dirigida a una composición farmacéutica líquida que comprende un anticuerpo antí-MAdCAM, un agente quelante farmacéuticamente aceptable, y trehalosa. En otra modalidad, la invención está dirigida a una composición farmacéutica líquida que comprende un anticuerpo anti-MAdCAM, EDTA y trehalosa. En otra modalidad, la invención está dirigida a una composición farmacéutica líquida que comprende un anticuerpo anti-MAdCAM, DTPA y trehalosa. En otra modalidad, la invención está dirigida a una composición farmacéutica líquida que comprende un anticuerpo anti-MAdCAM, un agente quelante farmacéuticamente aceptable, y un agente tensioactivo farmacéuticamente aceptable. En otra modalidad, la invención está dirigida a una composición farmacéutica líquida que comprende un anticuerpo anti-MAdCAM, EDTA, y un agente tensioactívo farmacéuticamente aceptable. En otra modalidad, la invención está dirigida a una composición farmacéutica líquida que comprende un anticuerpo anti-MAdCAM, DTPA, y un agente tensioactivo farmacéuticamente aceptable. En otra modalidad, la invención está dirigida a una composición farmacéutica líquida que comprende un anticuerpo anti-MAdCAM, y un agente quelante farmacéuticamente aceptable seleccionado del grupo que consiste de EDTA y DTPA, y polisorbato 80. En otra modalidad, la invención está dirigida a una composición farmacéutica líquida que comprende un anticuerpo anti-MAdCAM, un regulador de pH farmacéuticamente aceptable, y un agente tensioactivo farmacéuticamente aceptable. En otra modalidad, la invención está dirigida a una composición farmacéutica líquida que comprende un anticuerpo anti-MAdCAM, histidina, y un agente tensioactivo farmacéuticamente aceptable. En otra modalidad, la invención está dirigida a una composición farmacéutica líquida que comprende un anticuerpo anti-MAdCAM, histidina, y polisorbato 80. En otra modalidad, la invención está dirigida a una composición farmacéutica líquida que comprende un anticuerpo anti-MAdCAM, un agente quelante farmacéuticamente aceptable, un regulador de pH farmacéuticamente aceptable, y un agente tensioactivo farmacéuticamente aceptable. En otra modalidad, la ¡nvención está dirigida a una composición farmacéutica líquida que comprende un anticuerpo anti-MAdCAM, un agente quelante farmacéuticamente aceptable, un regulador de pH farmacéuticamente aceptable, y un agente de tonicidad farmacéuticamente aceptable. En otra modalidad, la invención está dirigida a una composición farmacéutica líquida que comprende un anticuerpo anti-MAdCAM, un agente quelante farmacéuticamente aceptable, un regulador de pH farmacéuticamente aceptable, un agente tensioactivo farmacéuticamente aceptable, y un agente de tonicidad farmacéuticamente aceptable. En otra modalidad, la invención está dirigida a una composición farmacéutica líquida que comprende un anticuerpo anti-MAdCAM e hístidina. El término "composición farmacéutica" se refiere a preparaciones, las cuales están en forma tal que permiten que la actividad biológica de los ingredientes activos sea efectiva. "Excipientes farmacéuticamente aceptables" (vehículos, aditivos), son aquellos que pueden administrarse razonablemente (es decir, con seguridad) a un sujeto para proveer una dosis efectiva del ingrediente activo usado. El término "excipiente" o "vehículo", como se usa en la presente, se refiere a una sustancia inerte, la cual se usa comúnmente como un diluyente, vehículo, conservador, aglutinante o agente de estabilización para fármacos. Como se usa en la presente, el término "diluyente" se refiere a un solvente farmacéuticamente aceptable (seguro y no tóxico para administración a un humano), y es útil para la preparación de las composiciones líquidas de la presente. Ejemplos de diluyentes incluyen, pero no están limitados a, agua estéril y agua bacteriostática para inyección (BWFI). El anticuerpo anti-MAdCAM presente en la composición farmacéutica líquida, puede ser como se describió previamente en esta solicitud. En una modalidad, la composición farmacéutica líquida comprende un anticuerpo anti-MAdCAM que comprende una secuencia de aminoácidos de VL que es 90%, 95% o 99% idéntica a una secuencia de aminoácidos de VL mostrada en SEQ ID NO: 4, y comprende además una secuencia de aminoácidos de VH que es 90%, 95% o 99% idéntica a una secuencia de aminoácidos de VH mostrada en SEQ ID NO: 2. En otra modalidad, la composición farmacéutica líquida comprende un anticuerpo anti-MAdCAM que es el anticuerpo anti-MAdCAM monoclonal 7J 6.6. La concentración del anticuerpo anti-MAdCAM en las composiciones farmacéuticas líquidas de la presente ¡nvención, es generalmente de por lo menos aproximadamente OJ miligramos por mililitro (mg/ml) o mayor, por lo menos aproximadamente 1.0 mg/ml o mayor, por lo menos aproximadamente 10 mg/ml o mayor, por lo menos aproximadamente 50 mg/ml o mayor, por lo menos aproximadamente 75 mg/ml o mayor, por lo menos aproximadamente 100 mg/ml o mayor, o por lo menos aproximadamente 200 mg/ml o mayor. En ciertas modalidades, la concentración del anticuerpo anti-MAdCAM varía generalmente de aproximadamente 1 mg/ml a aproximadamente 200 mg/ml, de aproximadamente 2 mg/ml a aproximadamente 100 mg/ml, de aproximadamente 5 mg/ml a aproximadamente 90 mg/ml, de aproximadamente 10 mg/ml a aproximadamente 80 mg/ml, de aproximadamente 50 mg/ml a aproximadamente 90 mg/ml, de aproximadamente 60 mg/ml a aproximadamente 80 mg/ml, de aproximadamente 65 mg/ml a aproximadamente 85 mg/ml, o es de aproximadamente 75 mg/ml. En una modalidad, la concentración del anticuerpo anti-MAdCAM en la composición farmacéutica líquida varía de aproximadamente 50 mg/ml a aproximadamente 100 mg/ml. Como se usa en la presente, el término "agente quelante" se refiere en general a un excipiente que puede formar por lo menos un enlace (por ejemplo, enlace covalente, iónico o de otro tipo) con un ion de metal. Un agente quelante es típicamente un ligando multidentado que puede usarse en composiciones líquidas seleccionadas como un estabilizador para combinarse con especies, lo cual podría promover la inestabilidad. Con frecuencia, los compuestos que pueden actuar como un agente quelante tendrán grupos funcionales ricos en electrones. Grupos funcionales adecuados ricos en electrones, incluyen grupos ácido carboxílico, grupos hidroxi y grupos amino. La disposición de estos grupos en ácidos aminopolicarboxílicos, ácidos hidroxipolicarboxílicos, ácidos hidroxiaminocarboxílícos, y similares, resulta en porciones que tienen la capacidad de unirse a metales. Sin embargo, no se pretende que la presente invención sea limitada a agentes quelantes que intensifican la estabilidad del anticuerpo principalmente por la capacidad del agente quelante para formar enlaces con un ion de metal. Por lo tanto, no se pretende que la presente invención sea limitada por el mecanismo específico por el cual el agente quelante estabiliza las composiciones de la presente ¡nvención, y los excipientes denominados agentes quelantes en la presente pueden lograr sus propiedades de intensificación de la estabilidad del anticuerpo principalmente a través de mecanismos que están en conjunto no relacionados con la capacidad del agente quelante para formar enlaces con un ion de metal. Agentes quelantes que son adecuados para su uso en la presente invención incluyen, pero no están limitados a, ácidos amínopolicarboxílicos, ácidos hidroxiaminocarboxílicos, glicinas N-sustituidas, ácido 2-(2-amino-2-oxoctil)aminoetansulfónico (BES), deferoxamina (DEF), ácido cítrico, niacinamida y desoxicolatos. Ejemplos de ácidos aminopolicarboxílicos adecuados incluyen ácido etilendiamínotetraacético (EDTA), ácido dietilentriaminopentaacético (DTPA), ácido nitrilotriacético (NTA), ácido N-2-acetamido-2-imínodiacétíco (ADA), éter de bis(aminoetil)glicol, ácido N,N,N',N'-tetraacético (EGTA), ácido trans-diaminociclohexantetraacético (DCTA), ácido glutámico y ácido aspártico. Ejemplos de ácidos hidroxiaminocarboxílicos adecuados incluyen ácido N-hidroxíetilíminodiacético (HIMDA), N,N-bis-h¡droxiet¡lglicina (bicina) y N-(trishidroxímetilmetil) 10 glicina (tricina). Un ejemplo de una glicina N-sustituída adecuada es glicilglicina. Un ejemplo de un desoxicolato adecuado es desoxicolato de sodio. Los agentes quelantes usados en la invención pueden estar presentes, en donde sea posible, como la forma de ácido libre o base libre del compuesto (por ejemplo, referido recíprocamente en la presente como "EDTA" o "edetato"), o como una forma de sal correspondiente (por ejemplo, la sal acida de adición o sal básica de adición correspondiente, tal como edetato disódico). Sales acidas de adición adecuadas incluyen, por ejemplo, sales de metal alcalino (por ejemplo, sales de sodio o de potasio), sales de metal alcalinotérreo (por ejemplo, calcio), y las sales pueden prepararse usando otros iones de metal unidos débilmente. Como es sabido en la técnica, la naturaleza de la sal y el número de cargas que serán neutralizadas, dependerán del número de grupos carboxilo presentes, y el pH al cual el agente quelante de estabilización es suministrado. Como es sabido también en la técnica, los agentes quelantes tienen concentraciones variables con las cuales los iones objetivo particulares se unen. A manera de otra ilustración, sales adecuadas de EDTA incluyen edetato dipotásico, edetato disódico, edetato disódico de calcio, edetato de sodio, edetato trisódico y edetato de potasio; y una sal de deferoxamina (DEF) adecuada, es mesilato de deferoxamina (DFM). Los agentes quelantes usados en la invención pueden estar presentes como una forma anhidra, solvatada o hidratada del compuesto o sal correspondiente. En donde el agente quelante esté en una forma solvatada o hidratada, puede estar presente en estados variables de solvatación o hidratacíón (incluyendo, por ejemplo, formas anhidras, hidratadas, dihidratadas y trihidratadas). A manera de otra ilustración, un hidrato de EDTA adecuado es dihidrato de EDTA disódíco; y formas adecuadas de ácido cítrico incluyen ácido cítrico anhidro, monohidrato de ácido cítrico y dihidrato de citrato trisódico. Los agentes quelantes adecuados usados en una composición de anticuerpo de la presente ¡nvención ¡ncluyen también, por ejemplo, aquellas que se unen a ¡ones de metal en solución para hacerlos incapaces de reaccionar con 02 disponible, de esta manera reduciendo al mínimo o previniendo la generación de radicales hidroxilo que están libres para reaccionar con, y degradar, el anticuerpo. Otros agentes quelantes tales como DMF pueden disminuir la formación de especies de oxígeno reducidas, reducir la formación de especies acidas (por ejemplo, desamídacíón) y/o reducir la fragmentación del anticuerpo. En otras modalidades, el agente quelante puede reducir o prevenir la agregación de los anticuerpos en las composiciones descritas en la presente. Dichos agentes quelantes pueden reducir o prevenir la degradación de un anticuerpo que se formula sin la protección de un agente quelante. Cuando se hace referencia a una concentración de un agente quelante, se pretende que la concentración citada represente la concentración molar de la forma de ácido libre o base libre del agente quelante. Por ejemplo, la concentración de agente quelante en ciertas composiciones farmacéuticas líquidas, varía en general de aproximadamente 0.3 micromolar a aproximadamente 50 milimolar, de aproximadamente 3.0 micromolar a aproximadamente 10.0 milimolar, de aproximadamente 30 micromolar a aproximadamente 5.0 milimolar, y de aproximadamente 0J milimolar a aproximadamente 1 milimolar. En modalidades específicas, la concentración de agente quelante en la composición farmacéutica líquida puede ser de aproximadamente 3 micromolar, aproximadamente 13 micromolar, aproximadamente 27 micromolar, aproximadamente 0.27 milimolar, aproximadamente 1 milimolar o aproximadamente 2.7 milímolar. En una modalidad, la concentración de agente quelante es de aproximadamente 0.27 milimolar. A menos que se indique de otra manera, las concentraciones enlistadas en la presente son aquellas concentraciones a condiciones ambientales (es decir, a 25°C y presión atmosférica). En una modalidad, el agente quelante se selecciona del grupo que consiste de EDTA, DTPA, DFM, y mezclas de los mismos. En otra modalidad, el agente quelante es DMF. En otra modalidad, el agente quelante es EDTA. En otra modalidad, el agente quelante es DTPA. En otra modalidad, la composición farmacéutica líquida comprende EDTA en una cantidad que varía de aproximadamente 0.3 micromolar a aproximadamente 50 milímolar, y en algunas modalidades, de aproximadamente OJ milimolar a aproximadamente 1.0 milimolar. En otra modalidad, la composición farmacéutica líquida comprende EDTA en una cantidad de aproximadamente 0.27 milimolar. Como se indicó anteriormente, las composiciones farmacéuticas líquidas de la presente invención pueden comprender además opcionalmente un regulador de pH farmacéuticamente aceptable además de un agente quelante. Como se usa en la presente, el término "regulador de pH" se refiere a una composición añadida que permite que una composición de anticuerpo líquida resista cambios en pH. En ciertas modalidades, el regulador de pH añadido permite que una composición de anticuerpo líquida resista cambios en pH, mediante la acción de sus componentes de conjugado de ácido-base. Ejemplos de reguladores de pH adecuados incluyen, pero no están limitados a, reguladores de pH de acetato (por ejemplo, acetato de sodio), succinato (por ejemplo, succinato de sodio), gluconato, citrato, y otros reguladores de pH de ácido orgánico que incluyen, pero no están limitados a, reguladores de pH tales como reguladores de pH de aminoácidos (por ejemplo, histidina), ácido acético, ácido fosfórico y fosfonatos, ascorbato, ácido tartárico, ácido maleico, glicina, lactato, ácido láctico, ácido ascórbico, imidazoles, ácido carbónico y bicarbonatos, ácido succínico, ácido benzoico de sodio y benzoatos, gluconato, edetato (EDTA), acetato, malato, imidazol, tris, fosfato, y mezclas de los mismos. En una modalidad, el regulador de pH es histidína. El material de partida de histidina usado para preparar las composiciones farmacéuticas líquidas de la presente invención, puede existir en diferentes formas. Por ejemplo, la histidina puede ser una forma enantiomérica (por ejemplo, enantiómero D o L) o racémica de histidina, una forma de ácido libre o base libre de histidina, una forma de sal (por ejemplo, una sal de monoclorhidrato, diclorhidrato, bromhidrato, sulfato o acetato) de histidina, una forma solvatada de histídina, una forma hidratada (por ejemplo, monohidrato) de histidina, o una forma anhidra de hístidina. La pureza de la base y/o sal de histidina usada para preparar las composiciones farmacéuticas líquidas, puede ser generalmente de por lo menos aproximadamente 98%, por lo menos aproximadamente 99%, o por lo menos aproximadamente 99.5%. Como se usa en la presente, el término "pureza" en el contexto de la histidina, se refiere a la pureza química de la histidina como se entiende en la técnica, por ejemplo, como se describe en el índice Merck, decimotercera edición, O'Neil et al. ed. (Merck & Co., 2001 ). Cuando se hace referencia a una concentración de un regulador de pH, se pretende que la concentración citada represente la concentración molar de la forma de ácido libre o base libre del regulador de pH. Por ejemplo, la concentración del regulador de pH cuando está presente en ciertas composiciones farmacéuticas líquidas, puede variar de aproximadamente OJ milimolar (mM) a aproximadamente 100 mM. En una modalidad, la concentración del regulador de pH es de aproximadamente 1 mM a aproximadamente 50 mM. En otra modalidad, la concentración del regulador de pH es de aproximadamente 5 mM a aproximadamente 20 mM. En varias modalidades, la concentración del regulador de pH es de aproximadamente 1 mM, aproximadamente 5 mM, aproximadamente 10 mM, aproximadamente 15 mM, aproximadamente 20 mM, aproximadamente 25 mM, aproximadamente 30 mM, aproximadamente 35 mM, aproximadamente 40 mM, aproximadamente 45 mM, aproximadamente 50 mM, aproximadamente 55 mM, aproximadamente 60 mM, aproximadamente 65 mM, aproximadamente 70 mM, aproximadamente 75 mM, aproximadamente 80 mM, aproximadamente 85 mM, aproximadamente 90 mM, aproximadamente 95 mM o aproximadamente 100 mM. En una modalidad, la concentración de histidina en la composición farmacéutica es de aproximadamente 10 mM. En una modalidad, la composición farmacéutica contiene aproximadamente 10 mM de L-histídina (en forma de base).
En general, el regulador de pH se usa para mantener un nivel de pH aceptable (el cual puede afectar la estabilidad del anticuerpo) en la composición farmacéutica líquida. La composición farmacéutica líquida es típicamente regulada en su pH para mantener un pH en la escala de aproximadamente 4 a aproximadamente 8; de aproximadamente 4.5 a aproximadamente 7; o de aproximadamente 5.2 a aproximadamente 5.8. Escalas intermedias a los valores de pH citados anteriormente, se consideran también como parte de esta ¡nvención. Por ejemplo, se pretende que se incluyan escalas de valores usando una combinación de cualquiera de los valores citados anteriormente como límites superior y/o inferior. En una modalidad, la composición farmacéutica líquida es regulada en su pH para mantener un pH de aproximadamente 5.5. Como se indicó anteriormente, las composiciones farmacéuticas líquidas de la presente invención pueden comprender además opcionalmente un agente de tonicidad farmacéuticamente aceptable además de un agente quelante. Como se usa en la presente, los términos "agente de tonicidad" o "tonificador", se refieren a un excipiente que puede ajustar la presión osmótica de una composición de anticuerpo líquida. En ciertas modalidades, el agente de tonicidad puede ajustar la presión osmótica de una composición de anticuerpo líquida para que sea isotónica, de modo que la composición de anticuerpo sea fisiológicamente compatible con las células del tejido del cuerpo del sujeto. En otras modalidades, el "agente de tonicidad" puede contribuir a una mejora en estabilidad de alguno de los anticuerpos anti- MAdCAM descritos en la presente. Una composición "isotónica", es una que tiene esencialmente la misma presión osmótica que la sangre humana. Las composiciones isotónicas tienen en general una presión osmótica de aproximadamente 250 a 350 mOsm. El término "hipotónica" describe una composición con una presión osmótica menor que la de la sangre humana. En forma correspondiente, el término "hipertónica" se usa para describir una composición con una presión osmótica mayor que la de la sangre humana. La isotonicidad puede medirse usando, por ejemplo, un osmómetro del tipo de congelación con hielo o de presión de vapor. El agente de tonicidad usado para preparar las composiciones farmacéuticas líquidas de la presente invención, puede existir en diferentes formas. Por ejemplo, el agente de tonicidad puede estar en una forma enantiomérica (por ejemplo, enantiómero L o D) o racémica; isómeros tales como alfa o beta, ¡ncluyendo alfa, alfa o beta, beta, o alfa, beta o beta, alfa; una forma de ácido libre o base libre; una forma hidratada (por ejemplo, monohidrato), o una forma anhidra. En una modalidad, el agente de tonicidad es un sacárido. Los sacáridos son referidos comúnmente como carbohidratos, y pueden contener diferentes cantidades de unidades de azúcar (sacárido), por ejemplo, monosacáridos, disacáridos y polisacáridos. Sacáridos que son adecuados para su uso como un agente de tonicidad en la presente invención incluyen, pero no están limitados a, sacáridos seleccionados del grupo que consiste de fructosa, glucosa, mañosa, sorbosa, xilosa, lactosa, maltosa, sacarosa, dextrán, pululana, dextrina, ciclodextrinas, almidón soluble, hidroxietil almidón, glucanos solubles en agua, y mezclas de los mismos. En una modalidad, el agente de tonicidad es sacarosa. En otra modalidad, el agente de tonicidad es un poliol. Como se usa en la presente, el término "poliol" se refiere a un excipiente con múltiples grupos hidroxilo, e incluye azúcares (azúcares reductores y no reductores), alcoholes de azúcar y ácidos de azúcar. En una modalidad, el poliol tiene un peso molecular que es menor de aproximadamente 600 kD (por ejemplo, en la escala de aproximadamente 120 a aproximadamente 400 kD). Un "azúcar reductor", es uno que contiene un grupo hemiacetal que puede reducir iones de metal, o puede reaccionar covalentemente con la lisina y otros grupos amino en las proteínas, y un "azúcar no reductor", es uno que no tiene estas propiedades de un azúcar reductor. Políoles que son adecuados para su uso como un agente de tonicidad en la presente invención incluyen, pero no están limitados a, polioles seleccionados del grupo que consiste de manitol, trehalosa, sorbitol, eritritol, ¡somalto, lactitol, maltitol, xilitol, glicerol, lactitol, propilenglicol, polietilenglicol, inositol, y mezclas de los mismos. En una modalidad, el agente de tonicidad es un azúcar no reductor seleccionado del grupo que consiste de sacarosa, trehalosa, sorbosa, melezitosa, rafinosa, y mezclas de los mismos. En otra modalidad, el agente de tonicidad es un azúcar no reductor seleccionado del grupo que consiste de trehalosa y sacarosa, y mezclas de las mismas. En otra modalidad, el agente de tonicidad es manitol. En otra modalidad, el agente de tonicidad es D-manitol. En otra modalidad, el agente de tonicidad es trehalosa. En otra modalidad, el agente de tonicidad es dihidrato de a-trehalosa. En otra modalidad, el agente de tonicidad es una sal, tal como cloruro de sodio. La concentración del agente de tonicidad, cuando está presente en la composición farmacéutica líquida, puede variar de aproximadamente 1.0 milimolar a aproximadamente 600 milimolar, de aproximadamente 10 milimolar a aproximadamente 400 milimolar, o de aproximadamente 100 milimolar a aproximadamente 300 milimolar. En una modalidad, la concentración del agente de tonicidad varía de aproximadamente 200 milimolar a aproximadamente 250 milimolar. En otra modalidad, la concentración del agente de tonicidad en la composición farmacéutica líquida es de aproximadamente 222 milímolar, aproximadamente 238 milimolar, o aproximadamente 247 milimolar. En otra modalidad, el agente de tonicidad es manitol, y está presente en la composición farmacéutica líquida a una concentración de 247 milimolar. En otra modalidad, el agente de tonicidad es trehalosa, y está presente en la composición farmacéutica líquida a una concentración de 222 milimolar. En otra modalidad, el agente de tonicidad es trehalosa, y está presente en la composición farmacéutica líquida a una concentración de 238 milimolar. Como se indicó anteriormente, las composiciones farmacéuticas líquidas de la presente invención pueden comprender además opcionalmente un agente tensioactivo farmacéuticamente aceptable además de un agente quelante. Como se usa en la presente, el término "agente tensioactivo" se refiere a un excipiente que puede alterar la tensión superficial de una composición de anticuerpo líquida. En ciertas modalidades, el agente tensioactivo reduce la tensión superficial de una composición de anticuerpo líquida. En otras modalidades, el "agente tensioactivo" puede contribuir a una mejora en estabilidad de alguno de los anticuerpos anti-MAdCAM descritos en la presente. Por ejemplo, el agente tensioacfivo puede reducir la agregación del anticuefo formulado, y/o puede reducir al mínimo la formación de materia en partículas en la composición, y/o puede reducir la adsorción. El agente tensioactivo puede mejorar también la estabilidad del anticuerpo durante y después de un ciclo de congelación/descongelación. Agentes tensíoactivos adecuados incluyen agentes tensioactivos de polisorbato, poloxámero 18, agentes tensioactivos de Tritón, tales como Tritón X-100®, agentes tensioactivos de polisorbato tales como Tween 20® y Tween 80®, dodecil sulfato de sodio, laureth sulfato de sodio, octil glucósido de sodio, lauril-sulfobetaína, miristil-sulfobetaína, linoleil-sulfobetaína, estearíl-sulfobetaína, lauril-sarcosina, mirístil-sarcosina, linoleil-sarcosína, estearil-sarcosina, linoleil-betaína, miristil-betaína, cetil-betaína, lauroamidopropil-betaína, cocoamídopropil-betaína, linolamidopropil-betaína, miristamidopropil-betaína, palmidopropil-betaína, isoestearamidopropil-betaína, míristamidopropil-dímetilamína, palmidopropil-dimetilamina, isoestearamidopropil-dimetilamína, metíl cocoil-taurato de sodio, metil oleil-taurato disódico, cloruro de dihidroxipropil PEG 5 linol amonio, políetilenglícol, polipropilenglicol, y mezclas de los mismos. En una modalidad, el agente tensioactivo es un agente tensioactivo de polisorbato que comprende por lo menos un excipiente que se selecciona del grupo que consiste de polisorbato 20, polisorbato 21 , polisorbato 40, polisorbato 60, polisorbato 61 , polisorbato 65, polisorbato 80, polisorbato 81 , polisorbato 85, y mezclas de los mismos. En otra modalidad, la composición farmacéutica líquida comprende polisorbato 80. La concentración del agente tensioactivo, cuando está presente en la composición farmacéutica líquida, puede variar de aproximadamente 0.005 milimolar a aproximadamente 10 milimolar, de aproximadamente 0.007 milimolar a aproximadamente 5.0 milimolar, o de aproximadamente 0.01 milimolar a aproximadamente 1.0 milimolar. En otra modalidad, la concentración del agente tensioactivo es de aproximadamente 0.05 milimolar a aproximadamente 1.0 mílímolar. En otra modalidad, la composición farmacéutica líquida contiene aproximadamente 0.30 milimolar de polisorbato 80. En una modalidad, la presente invención abarca una composición farmacéutica líquida que comprende por lo menos un anticuerpo que comprende una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 95% idéntica a una secuencia de aminoácidos de cadena pesada mostrada en SEQ ID NO: 2, y que comprende además una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 95% idéntica a una secuencia de aminoácidos de cadena ligera mostrada en SEQ ID NO: 4, en donde el anticuerpo se une a MAdCAM de humano; y un agente quelante. En una modalidad, la presente ¡nvención abarca una composición farmacéutica líquida que comprende por lo menos un anticuerpo que comprende una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 95% idéntica a una secuencia de aminoácidos de cadena pesada mostrada en SEQ ID NO: 2, y que comprende además una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 95% idéntica a una secuencia de aminoácidos de cadena ligera mostrada en SEQ ID NO: 4, en donde el anticuerpo se une a MAdCAM de humano; y un agente quelante; y en donde la composición está sustancialmente libre de iones cloruro o iones acetato, o ambos. En una modalidad, la presente invención abarca una composición farmacéutica líquida que comprende por lo menos un anticuerpo anti-MAdCAM monoclonal de humano, en donde el anticuerpo se une a MAdCAM de humano; y un agente quelante. En una modalidad, la presente invención abarca una composición farmacéutica líquida que comprende por lo menos un anticuerpo anti-MAdCAM monoclonal de humano, en donde el anticuerpo se une a MAdCAM de humano; y un agente quelante; en donde la composición está sustancíalmente libre de iones cloruro o iones acetato, o ambos. En una modalidad, la presente invención abarca una composición farmacéutica líquida que comprende por lo menos un anticuerpo que comprende una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 95% idéntica a una secuencia de aminoácidos de cadena pesada mostrada en SEQ ID NO: 2, y que comprende además una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 95% idéntica a una secuencia de aminoácidos de cadena ligera mostrada en SEQ ID NO: 4, en donde el anticuerpo se une a MAdCAM de humano; y un excipiente farmacéuticamente aceptable, en donde la composición contiene una concentración de anticuerpo que es de por lo menos aproximadamente 50 mg/ml, por lo menos aproximadamente 60 mg/ml, por lo menos aproximadamente 70 mg/ml, por lo menos aproximadamente 80 mg/ml, por lo menos aproximadamente 90 mg/ml, o por lo menos aproximadamente 100 mg/ml. En una modalidad, la presente invención abarca una composición farmacéutica líquida que comprende por lo menos un anticuerpo que comprende una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 95% idéntica a una secuencia de aminoácidos de cadena pesada mostrada en SEQ ID NO: 2, y que comprende además una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 95% idéntica a una secuencia de aminoácidos de cadena ligera mostrada en SEQ ID NO: 4, en donde el anticuerpo se une a MAdCAM de humano; y un excipiente farmacéuticamente aceptable, en donde la composición contiene una concentración de anticuerpo que varía de aproximadamente 10 mg/ml a aproximadamente 200 mg/ml. En una modalidad, la presente invención abarca una composición farmacéutica líquida que comprende por lo menos un anticuerpo que comprende una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 95% idéntica a una secuencia de aminoácidos de cadena pesada mostrada en SEQ ID NO: 2, y que comprende además una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 95% idéntica a una secuencia de aminoácidos de cadena ligera mostrada en SEQ ID NO: 4, en donde el anticuerpo se une a MAdCAM de humano; y un excipiente farmacéuticamente aceptable, en donde la composición contiene una concentración de anticuerpo que varía de aproximadamente 15 mg/ml a aproximadamente 200 mg/ml. En una modalidad, la presente ¡nvención abarca una composición farmacéutica líquida que comprende por lo menos un anticuerpo que comprende una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 95% idéntica a una secuencia de aminoácidos de cadena pesada mostrada en SEQ ID NO: 2, y que comprende además una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 95% idéntica a una secuencia de aminoácidos de cadena ligera mostrada en SEQ ID NO: 4, en donde el anticuerpo se une a MAdCAM de humano; y un excipiente farmacéuticamente aceptable, en donde la composición contiene una concentración de anticuerpo que varía de aproximadamente 20 mg/ml a aproximadamente 200 mg/ml. En una modalidad, la presente invención abarca una composición farmacéutica líquida que comprende por lo menos un anticuerpo que comprende una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 95% idéntica a una secuencia de aminoácidos de cadena pesada mostrada en SEQ ID NO: 2, y que comprende además una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 95% idéntica a una secuencia de aminoácidos de cadena ligera mostrada en SEQ ID NO: 4, en donde el anticuerpo se une a MAdCAM de humano; y un excipiente farmacéuticamente aceptable, en donde la composición contiene una concentración de anticuerpo que varía de aproximadamente 50 mg/ml a aproximadamente 200 mg/ml. En una modalidad, la presente invención abarca una composición farmacéutica líquida que comprende por lo menos un anticuerpo que comprende una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 95% idéntica a una secuencia de aminoácidos de cadena pesada mostrada en SEQ ID NO: 2, y que comprende además una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 95% idéntica a una secuencia de aminoácidos de cadena ligera mostrada en SEQ ID NO: 4, en donde el anticuerpo se une a MAdCAM de humano; y un excipiente farmacéuticamente aceptable, en donde la composición contiene una concentración de anticuerpo que varía de aproximadamente 100 mg/ml a aproximadamente 200 mg/ml. En una modalidad, la presente invención abarca una composición farmacéutica líquida que comprende por lo menos un anticuerpo que comprende una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 95% idéntica a una secuencia de aminoácidos de cadena pesada mostrada en SEQ ID NO: 2, y que comprende además una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 95% idéntica a una secuencia de aminoácidos de cadena ligera mostrada en SEQ ID NO: 4, en donde el anticuerpo se une a MAdCAM de humano; y un excipiente farmacéuticamente aceptable, en donde la composición contiene una concentración de anticuerpo que varía de aproximadamente 65 mg/ml a aproximadamente 85 mg/ml. En una modalidad, la presente invención abarca una composición farmacéutica líquida que comprende por lo menos un anticuerpo que comprende una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 95% idéntica a una secuencia de aminoácidos de cadena pesada mostrada en SEQ ID NO: 2, y que comprende además una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 95% idéntica a una secuencia de aminoácidos de cadena ligera mostrada en SEQ ID NO: 4, en donde el anticuerpo se une a MAdCAM de humano; y un excipiente farmacéuticamente aceptable, en donde la composición contiene una concentración de anticuerpo que es de aproximadamente 75 mg/ml. En una modalidad, la composición farmacéutica líquida comprende de aproximadamente 0.01 mg/ml a aproximadamente 200 mg/ml de anticuerpo anti-MAdCAM monoclonal 7.16.6; y de aproximadamente 0.3 micromolar a aproximadamente 50 milimolar de agente quelante. En otra modalidad, la composición farmacéutica líquida comprende de aproximadamente 0J mg/ml a aproximadamente 100 mg/ml de anticuerpo anti-MAdCAM monoclonal 7.16.6; y de aproximadamente 30 micromolar a aproximadamente 5.0 milímolar de agente quelante. En otra modalidad, la composición farmacéutica líquida comprende de aproximadamente 0J mg/ml a aproximadamente 100 mg/ml de anticuerpo anti-MAdCAM monoclonal 7J6.6; y aproximadamente 0.27 milimolar de agente quelante. En otra modalidad, la composición farmacéutica líquida comprende de aproximadamente OJ mg/ml a aproximadamente 100 mg/ml de anticuerpo anti-MAdCAM monoclonal 7J6.6; y de aproximadamente 0.3 micromolar a aproximadamente 50 milimolar de EDTA. En otra modalidad, la composición farmacéutica líquida comprende de aproximadamente 0J mg/ml a aproximadamente 100 mg/ml de anticuerpo anti-MAdCAM monoclonal 7.16.6; y de aproximadamente 30 micromolar a aproximadamente 10.0 milimolar de EDTA. En otra modalidad, la composición farmacéutica líquida comprende de aproximadamente 0J mg/ml a aproximadamente 100 mg/ml de anticuerpo anti-MAdCAM monoclonal 7J6.6; y de aproximadamente 0J milimolar a aproximadamente 1.0 milimolar de EDTA. En otra modalidad, la composición farmacéutica líquida comprende de aproximadamente 0J mg/ml a aproximadamente 100 mg/ml de anticuerpo anti-MAdCAM monoclonal 7.16.6; y aproximadamente 0.27 milimolar de EDTA. En otra modalidad, la composición farmacéutica líquida comprende de aproximadamente 0J mg/ml a aproximadamente 100 mg/ml de anticuerpo anti-MAdCAM monoclonal 7J6.6; y de aproximadamente 30 micromolar a aproximadamente 5.0 milimolar de DTPA.
En otra modalidad, la composición farmacéutica líquida comprende de aproximadamente OJ mg/ml a aproximadamente 100 mg/ml de anticuerpo anti-MAdCAM monoclonal 7J6.6; y de aproximadamente 30 micromolar a aproximadamente 5.0 milimolar de deferoxamina. En una modalidad, la composición farmacéutica líquida comprende de aproximadamente 0.01 mg/ml a aproximadamente 200 mg/ml de anticuerpo anti-MAdCAM monoclonal 7J6.6; y de aproximadamente 1 mM a aproximadamente 100 mM de histidina. En otra modalidad, la composición farmacéutica líquida comprende de aproximadamente 0J mg/ml a aproximadamente 200 mg/ml de anticuerpo anti-MAdCAM monoclonal 7J6.6; de aproximadamente 30 micromolar a aproximadamente 5.0 milimolar de agente quelante; y de aproximadamente 1 mM a aproximadamente 100 mM de histidina. En otra modalidad, la composición farmacéutica líquida comprende de aproximadamente 0J mg/ml a aproximadamente 200 mg/ml de anticuerpo anti-MAdCAM monoclonal 7.16.6; de aproximadamente 30 micromolar a aproximadamente 5.0 milimolar de agente quelante; y de aproximadamente 10 milimolar a aproximadamente 400 milimolar de trehalosa. En otra modalidad, la composición farmacéutica líquida comprende de aproximadamente 0J mg/ml a aproximadamente 200 mg/ml de anticuerpo antí-MAdCAM monoclonal 7.16.6; de aproximadamente 30 micromolar a aproximadamente 5.0 milimolar de agente quelante; de aproximadamente 10 milimolar a aproximadamente 400 milimolar de trehalosa; y de aproximadamente 1 mM a aproximadamente 100 mM de histidina. En otra modalidad, la composición farmacéutica líquida comprende de aproximadamente 0J mg/ml a aproximadamente 200 mg/ml de anticuerpo anti-MAdCAM monoclonal 7J6.6; de aproximadamente 30 micromolar a aproximadamente 5.0 milimolar de agente quelante; de aproximadamente 10 milimolar a aproximadamente 400 milimolar de trehalosa; de aproximadamente 1 mM a aproximadamente 100 mM de histidina; y de aproximadamente 0.005 milimolar a aproximadamente 10 milimolar de polisorbato 80. En otra modalidad, la composición farmacéutica líquida comprende de aproximadamente 0J mg/ml a aproximadamente 200 mg/ml de anticuerpo anti-MAdCAM monoclonal 7J6.6; de aproximadamente 30 micromolar a aproximadamente 5.0 milimolar de EDTA; de aproximadamente 10 milimolar a aproximadamente 400 mílimolar de un agente de tonicidad; de aproximadamente 1 mM a aproximadamente 100 mM de un regulador de pH; y de aproximadamente 0.005 milimolar a aproximadamente 10 milimolar de un agente tensioactivo. En otra modalidad, la composición farmacéutica líquida comprende de aproximadamente 0J mg/ml a aproximadamente 200 mg/ml de anticuerpo anti-MAdCAM monoclonal 7.16.6; de aproximadamente 30 micromolar a aproximadamente 5.0 milimolar de EDTA; de aproximadamente 10 milimolar a aproximadamente 400 milimolar de un agente de tonicidad; de aproximadamente 1 mM a aproximadamente 100 mM de histidina; y de aproximadamente 0.005 milimolar a aproximadamente 10 mílimolar de un agente tensioactivo. En otra modalidad, la composición farmacéutica líquida comprende de aproximadamente 0J mg/ml a aproximadamente 200 mg/ml de anticuerpo anti-MAdCAM monoclonal 7J6.6; de aproximadamente 30 micromolar a aproximadamente 5.0 milimolar de EDTA; de aproximadamente 10 milimolar a aproximadamente 400 milimolar de trehalosa; de aproximadamente 1 mM a aproximadamente 100 mM de histidina; y de aproximadamente 0.005 milimolar a aproximadamente 10 milímolar de un agente tensioactivo. En ciertos aspectos de la presente invención, las composiciones de anticuefo anti-MAdCAM líquidas comprenden de aproximadamente 10 mg/ml a aproximadamente 200 mg/ml de anticuerpo antí-MAdCAM monoclonal 7J6.6; de aproximadamente 1 mM a aproximadamente 100 mM de histidina; de aproximadamente 0.005 milimolar a aproximadamente 10 milimolar de polisorbato 80; de aproximadamente 30 micromolar a aproximadamente 5.0 mílimolar de EDTA; y de aproximadamente 10 milimolar a aproximadamente 400 milimolar de trehalosa. En otros aspectos de la presente invención, las composiciones de anticuefo anti-MAdCAM líquidas comprenden de aproximadamente 50 mg/ml a aproximadamente 100 mg/ml de anticuerpo anti-MAdCAM monoclonal 7J 6.6; de aproximadamente 5 mM a aproximadamente 30 mM de histidina; de aproximadamente 0.01 milimolar a aproximadamente 1.0 milimolar de polisorbato 80; de aproximadamente 30 micromolar a aproximadamente 5.0 milimolar de EDTA; y de aproximadamente 100 milimolar a aproximadamente 300 milimolar de trehalosa. En otros aspectos de la presente invención, las composiciones de anticuerpo antí-MAdCAM líquidas comprenden de aproximadamente 65 mg/ml a aproximadamente 85 mg/ml de anticuerpo anti-MAdCAM monoclonal 7J6.6; de aproximadamente 5 mM a aproximadamente 15 mM de histidina; de aproximadamente 0.05 milimolar a aproximadamente 0.5 milimolar de polisorbato 80; de aproximadamente 0J milimolar a aproximadamente 1 milimolar de EDTA; y de aproximadamente 200 mílimolar a aproximadamente 250 milimolar de trehalosa. En otros aspectos de la presente invención, las composiciones de anticuerpo anti-MAdCAM líquidas comprenden aproximadamente 75 mg/ml de anticuefo antí-MAdCAM monoclonal 7.16.6; aproximadamente 20 mM de histidina; aproximadamente 0.3 milimolar de polisorbato 80; aproximadamente 0.27 milimolar de EDTA; y aproximadamente 238 milimolar de trehalosa. En otra modalidad, la invención está dirigida a una composición farmacéutica líquida estable que comprende un anticuerpo anti-MAdCAM y un agente quelante farmacéuticamente aceptable, en donde la concentración molar del anticuerpo varía de aproximadamente 0.0006 milimolar a aproximadamente 1.35 milimolar, y la concentración molar del agente quelante varía de aproximadamente 0.003 milimolar a aproximadamente 50 milimolar, y en donde la relación molar de anticuerpo a agente quelante varía de aproximadamente 0.00001 a aproximadamente 450; de aproximadamente 0.0001 a aproximadamente 100; de aproximadamente 0.005 a aproximadamente 50; de aproximadamente 0.001 a aproximadamente 10; de aproximadamente 0.01 a aproximadamente 5; de aproximadamente 0J a aproximadamente 3; o es de aproximadamente 1.9. En otra modalidad, la invención está dirigida a una composición farmacéutica líquida estable que comprende un anticuerpo anti-MAdCAM 7J6.6 y un agente quelante farmacéuticamente aceptable, en donde la concentración molar del anticuerpo varía de aproximadamente 0.0006 milimolar a aproximadamente 1.35 mílimolar, y la concentración molar del agente quelante varía de aproximadamente 0.003 milímolar a aproximadamente 50 milimolar, y en donde la relación molar de anticuerpo a agente quelante varía de aproximadamente 0.00001 a aproximadamente 450; de aproximadamente 0.0001 a aproximadamente 100; de aproximadamente 0.005 a aproximadamente 50; de aproximadamente 0.001 a aproximadamente 10; de aproximadamente 0.01 a aproximadamente 5; de aproximadamente 0J a aproximadamente 3; o es de aproximadamente 1.9. En otra modalidad, la invención está dirigida a una composición farmacéutica líquida estable que comprende un anticuerpo anti-MAdCAM 7J6.6, un agente quelante farmacéuticamente aceptable, e histidina; en donde la concentración molar del anticuerpo varía de aproximadamente 0.0006 milimolar a aproximadamente 1.35 milímolar, la concentración molar del agente quelante varía de aproximadamente 0.003 milimolar a aproximadamente 50 milimolar, y la concentración molar de histidina varia de aproximadamente 1 milimolar a aproximadamente 100 milimolar; y en donde la relación molar de anticuerpo a agente quelante varía de aproximadamente 0.00001 a aproximadamente 450; de aproximadamente 0.0001 a aproximadamente 100; de aproximadamente 0.005 a aproximadamente 50; de aproximadamente 0.001 a aproximadamente 10; de aproximadamente 0.01 a aproximadamente 5; de aproximadamente 0J a aproximadamente 1 ; o es de aproximadamente 0.5. En otra modalidad, la invención está dirigida a una composición farmacéutica líquida estable que comprende un anticuerpo anti-MAdCAM 7.16.6, un agente quelante farmacéuticamente aceptable, e histídina; en donde la concentración molar del anticuerpo varía de aproximadamente 0.0006 milimolar a aproximadamente 1.35 milimolar, la concentración molar del agente quelante varía de aproximadamente 0.003 milímolar a aproximadamente 50 mílímolar, y la concentración molar de histidina varía de aproximadamente 5 milimolar a aproximadamente 30 milimolar; y en donde la relación molar de anticuerpo a agente quelante varía de aproximadamente 0.0001 a aproximadamente 100; de aproximadamente 0.005 a aproximadamente 50; de aproximadamente 0.001 a aproximadamente 10; de aproximadamente 0.01 a aproximadamente 5; de aproximadamente 0J a aproximadamente 3; o es de aproximadamente 1.9.
En otra modalidad, la invención está dirigida a una composición farmacéutica líquida estable que comprende un anticuerpo anti-MAdCAM 7J 6.6, un agente quelante farmacéuticamente aceptable, e histidina; en donde la concentración molar del anticuerpo varía de aproximadamente 0.0006 milimolar a aproximadamente 1.35 milimolar, la concentración molar del agente quelante varía de aproximadamente 0.003 milimolar a aproximadamente 50 milimolar, y la concentración molar de histidina varía de aproximadamente 5 milimolar a aproximadamente 20 milimolar; y en donde la relación molar de anticuerpo a agente quelante varía de aproximadamente 0.005 a aproximadamente 50; de aproximadamente 0.001 a aproximadamente 10; de aproximadamente 0.01 a aproximadamente 5; de aproximadamente 0J a aproximadamente 3; o es de aproximadamente 1.9. En otra modalidad, la invención está dirigida a una composición farmacéutica líquida estable que comprende un anticuerpo anti-MAdCAM 7J6.6, un agente quelante farmacéuticamente aceptable, e histidina; en donde la concentración molar del anticuerpo varía de aproximadamente 0.0006 milimolar a aproximadamente 1.35 milimolar, la concentración molar del agente quelante varía de aproximadamente 0.003 milimolar a aproximadamente 50 milímolar, y la concentración molar de histidina varía de aproximadamente 5 mílimolar a aproximadamente 20 mílimolar; y en donde la relación molar de anticuerpo a agente quelante varía de aproximadamente 0.001 a aproximadamente 10; de aproximadamente 0.01 a aproximadamente 5; de aproximadamente OJ a aproximadamente 3; o es de aproximadamente 1.9. En otra modalidad, la invención está dirigida a una composición farmacéutica líquida estable que comprende un anticuerpo anti-MAdCAM 7J 6.6, un agente quelante farmacéuticamente aceptable, e hístidina; en donde la concentración molar del anticuerpo varía de aproximadamente 0.0006 milimolar a aproximadamente 1.35 milimolar, la concentración molar del agente quelante varía de aproximadamente 0.003 mílimolar a aproximadamente 50 milimolar, y la concentración molar de histidína es de aproximadamente 20 milimolar; y en donde la relación molar de anticuerpo a agente quelante varía de aproximadamente 0.001 a aproximadamente 10; de aproximadamente 0.01 a aproximadamente 5; de aproximadamente 0J a aproximadamente 3; o es de aproximadamente 1.9.
Métodos para producir anticuerpos anti-MAdCAM. y líneas de células que producen anticuerpos Los anticuerpos de conformidad con la invención pueden prepararse a través del uso de un ratón transgénico que tenga una porción sustancial insertada del genoma humano que produce anticuerpos, pero que se hace que sea deficiente en la producción de anticuerpos endógenos de murino. Entonces, dichos ratones son capaces de producir anticuerpos y moléculas de inmunoglobulina humana, y son deficientes en la producción de anticuerpos y moléculas de inmunoglobulina de murino. Tecnologías usadas para lograr los mismos, se discuten a continuación. Es posible producir animales transgénicos (por ejemplo, ratones) que sean capaces, tras inmunización, de producir un repertorio completo de anticuerpos humanos en presencia de la producción de inmunoglobulina endógena. Sin embargo, en particular, una modalidad de la producción de ratones transgénicos y anticuerpos de los mismos, se describe en la solicitud internacional número PCT/US2005/000370. A través del uso de dicha tecnología, pueden prepararse anticuerpos que se unen a MAdCAM, e hibridomas que producen dichos anticuerpos. Los anticuerpos humanos evitan algunos de los problemas asociados con anticuerpos que poseen regiones constantes y/o variables de murino o rata. La presencia de dichas proteínas derivadas de murino o rata puede llevar a la depuración rápida de los anticuerpos, o puede llevar a la generación de una respuesta inmune contra el anticuerpo por un sujeto que recibe la administración de dichos anticuerpos. Por ejemplo, se ha descrito que la deleción homocígótica del gen de la región de unión de la cadena pesada del anticuerpo (J ) en ratones mutantes quiméricos y de la línea germinal, resulta en la inhibición completa de la producción endógena de anticuerpos. La transferencia de la disposición de genes de inmunoglobulina de la línea germinal humana en dichos ratones mutantes de la línea germinal, resultará en la producción de anticuerpos humanos tras desafío con el antígeno (por ejemplo, MAdCAM). Véase, por ejemplo, Jakobovits et al., Proc. Nati. Acad. Scí. USA, 90: 2551 (1993); Jakobovits et al., Nature, 362: 255-258 (1993); Bruggermann ef al., Year ¡n Immuno., 7: 33 (1993); y Duchosal et al., Nature 355: 258 (1992). Pueden derivarse también anticuerpos humanos de colecciones de exhibición de fagos (Hoogenboom ef al., J. Mol. Biol., 227: 381 (1991); Marks ef al., J. Mol. Biol., 222: 581-597 (1991 ); Vaughan et al., Nature Biotech 14: 309 (1996)). En algunas modalidades, pueden producirse anticuerpos anti-MAdCAM de humano, inmunizando a un animal transgénico no humano, por ejemplo, ratones XENOMOUSE™, cuyo genoma comprende genes de inmunoglobulina humana, de modo que el ratón recombinante produce anticuerpos humanos. Los ratones XENOMOUSE™ son cepas de ratón diseñadas, que comprenden grandes fragmentos de loci de cadena ligera y cadena pesada de inmunoglobulina humana, y son deficientes en la producción de anticuerpos de ratón. Los ratones XENOMOUSE™, producen un repertorio de anticuerpos completamente humanos de humano tipo adulto, y generan anticuerpos humanos específicos del antígeno. En algunas modalidades, los ratones XENOMOUSE™ contienen aproximadamente 80% del repertorio de genes de anticuerpos humanos a través de la introducción de fragmentos de cromosomas artificiales de levadura (YAC) con configuración de la línea germinal y un tamaño en megabases, de los locí de cadena pesada y loci de cadena ligera kappa de humano. En otras modalidades, los ratones XENOMOUSE™ contienen además casi todo el locus de la cadena ligera lambda. Véase, por ejemplo, Green et al., Nature Genetics 7: 13-21 (1994) y las patentes de E.U.A. 5,916,771 , 5,939,598, 5,985,615, 5,998,209, 6,075,181 , 6,091 ,001 , 6,114,598, 6,130,364, 6,162,963 y 6,150,584. Véase también los documentos WO 91/10741 , WO 94/02602, WO 96/34096, WO 96/33735, WO 98/16654, WO 98/24893, WO 98/50433, WO 99/45031 , WO 99/53049, WO 00/09560 y WO 00/037504. En algunas modalidades, los animales no humanos que comprenden genes de inmunoglobulina humana, son animales que tienen un "minilocus" de inmunoglobulina humana. En alternativa del minilocus, un locus de Ig exógeno es imitado a través de la inclusión de genes individuales del locus de Ig. De esta manera, uno o más genes de VH, uno o más genes de DH, uno o más genes de JH, un dominio constante mu y un segundo dominio constante (de preferencia un dominio constante gamma), se forman en una construcción para inserción en un animal. Este procedimiento se describe, entre otras citas, en las patentes de E.U.A. Nos. 5,545,807, 5,545,806, 5,569,825, 5,625,126, 5,633,425, 5,661 ,016, 5,770,429, 5,789,650, 5,814,318, 5,591 ,669, 5,612,205, 5,721 ,367, 5,789,215 y 5,643,763. Por lo tanto, en algunas modalidades, pueden producirse anticuerpos humanos inmunizando a un animal no humano que comprenda en su genoma todos los loci de cadena ligera y cadena pesada de inmunoglobulina humana, o algunos de los mismos, con un antígeno de MAdCAM. En algunas modalidades, el antígeno de MAdCAM es MAdCAM aislada y/o purificada. En una modalidad preferida, el antígeno de MAdCAM es MAdCAM de humano. En algunas modalidades, el antígeno de MAdCAM es un fragmento de MAdCAM. En algunas modalidades, el fragmento de MAdCAM comprende por lo menos un epítope de MAdCAM. En otras modalidades, el antígeno de MAdCAM es una célula que expresa o sobreexpresa MAdCAM, o un fragmento inmunógeno del mismo, sobre su superficie. En otras modalidades, el antígeno de MAdCAM es una proteína de fusión de MAdCAM. Puede purificarse MAdCAM de fuentes naturales, usando técnicas conocidas. Además, la proteína de MAdCAM recombínante está disponible comercialmente. En una modalidad preferida, el animal no humano es un animal XENOMOUSE™ (Abgenix Inc., Fremont, CA). Otro animal no humano que puede usarse, es un ratón transgénico producido por Medarex (Medarex, Inc., Princeton, NJ). La inmunización de los animales puede llevarse a cabo mediante cualquier método conocido en la técnica. Véase, por ejemplo, Harlow y Lañe, Antibodies: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Press, 1990. Métodos para inmunizar a animales no humanos, tales como ratones, ratas, ovejas, cabras, cerdos, ganado y caballos, son bien conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, Harlow y Lañe, citado anteriormente, y la patente de E.U.A. 5,994,619. En una modalidad preferida, el antígeno de MAdCAM se administra con un adyuvante para estimular la respuesta inmune. Ejemplos de adyuvantes incluyen adyuvante completo o incompleto de Freund, RIBI (dipéptidos de muramilo) o ISCOM (complejos de inmunoestimulaclón).
Dichos adyuvantes pueden proteger al polipéptido de la dispersión rápida secuestrándolo en un depósito local, o pueden contener sustancias que estimulen al hospedero para que secrete factores que sean quimiotácticos para macrófagos y otros componentes del sistema inmune. De preferencia, si se está administrando un polipéptido, el plan de inmunización puede incluir dos o más administraciones del polipéptido, y extensión durante varias semanas. Después de la inmunización de un animal con un antígeno de MAdCAM, pueden obtenerse anticuerpos y/o células que producen anticuerpos del animal. En algunas modalidades, se obtiene suero que contiene anticuerpos anti-MAdCAM del animal, sangrando o sacrificando al animal. El suero puede usarse como se obtiene del animal, puede obtenerse una fracción de inmunoglobulina del suero, o los anticuerpos anti-MAdCAM pueden purificarse del suero. En algunas modalidades, líneas de células inmortalizadas que producen anticuerpos, se preparan a partir de células aisladas del animal inmunizado. Después de la inmunización, el animal es sacrificado, y células B esplénicas y/o de nodulos linfáticos son inmortalizadas. Métodos para inmortalizar células incluyen, pero no están limitados a, transfectándolas con oncogenes, infectándolas con un virus oncogénico, cultivándolas bajo condiciones que se seleccionan para células inmortalizadas, sometiéndolas a compuestos carcinógenos o mutágenos, fusionándolas con una célula inmortalizada, por ejemplo, una célula de mieloma, e inactivando un gen supresor de tumores. Véase, por ejemplo, Harlow y Lañe, citado anteriormente. En una modalidad preferida, el animal inmunizado es un animal no humano que expresa genes de inmunoglobulina humana, y las células B esplénicas son fusionadas a una línea de células de mieloma de la misma especie que el animal no humano. En una modalidad más preferida, el animal inmunizado es un animal XENOMOUSE™, y la línea de células de mieloma es un mieloma de ratón no secretorio. Si se usa fusión con células de mieloma, las células de mieloma no secretan de preferencia polipéptidos de inmunoglobulina (una línea de células no secretoria). Se seleccionan células inmortalizadas usando MAdCAM, una porción de la misma, o una célula que exprese MAdCAM. En una modalidad preferida, la selección inicial se lleva a cabo usando un ¡nmunoensayo ligado a enzima (ELISA) o un radioinmunoensayo. Un ejemplo de selección por ELISA se provee en el documento WO 00/37504. Células que producen anticuerpos anti-MAdCAM, por ejemplo, híbridomas, son seleccionadas, clonadas y además seleccionadas para características deseables, que incluyen crecimiento vigoroso, alta producción de anticuerpos y características deseables de los anticuerpos, como se discute además más adelante. Pueden expandirse hibridomas in vivo en animales singénicos, en animales que carecen de un sistema inmune, por ejemplo, ratones desnudos, o en cultivo de células in vitro. Métodos para seleccionar, clonar y expandir hibridomas, son bien conocidos por los expertos en la técnica.
Como se apreciará, los anticuerpos de conformidad con la presente ¡nvención pueden expresarse en forma recombinante en líneas de células diferentes de líneas de células de hibridoma. Pueden usarse secuencias de ácido nucleico que codifiquen para las moléculas de ADNc o clones genómicos para los anticuerpos particulares, para la transformación de células hospederas de mamífero o no de mamífero adecuadas. La presente invención abarca también moléculas de ácido nucleico que codifican para anticuerpos anti-MAdCAM. En algunas modalidades, diferentes moléculas de ácido nucleico codifican para una cadena pesada y una cadena ligera de una inmunoglobulina anti-MAdCAM. En otras modalidades, la misma molécula de ácido nucleico codifica para una cadena pesada y una cadena ligera de una inmunoglobulína anti-MAdCAM. En una modalidad, el ácido nucleico codifica para un anticuerpo anti-MAdCAM de la invención. Una molécula de ácido nucleico que codifique para la cadena ligera entera o cadena pesada de un anticuerpo anti-MAdCAM, o porciones de la misma, puede aislarse de cualquier fuente que produzca dicho anticuerpo. En varias modalidades, las moléculas de ácido nucleico se aislan de una célula B aislada de un animal inmunizado con anti-MAdCAM, o de una célula inmortalizada derivada de dicha célula B que exprese un anticuerpo anti-MAdCAM. Métodos para aislar ARN mensajero que codifica para un anticuerpo, son bien conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, Sambrook, ef al., Molecular Cloníng 3a. ed. vol. 3 (1989). El ARN mensajero puede usarse para producir ADNc para su uso en la reacción en cadena de polimerasa (PCR) o clonación de ADNc de genes de anficuerpo. En una modalidad preferida, la molécula de ácido nucleico se aisla de un hibridoma que tenga como uno de sus miembros de fusión una célula que produce inmunoglobulina humana de un animal transgénico no humano. En una modalidad aún más preferida, la célula que produce inmunoglobulína humana se aisla de un animal XENOMOUSE™. En otra modalidad, la célula que produce inmunoglobulina humana es de un animal transgénico no humano o diferente de un ratón, como se describió anteriormente. En otra modalidad, el ácido nucleico se aisla de un animal no transgénico no humano. Las moléculas de ácido nucleico aisladas de un animal no humano pueden usarse, por ejemplo, para anticuerpos humanizados. En algunas modalidades, un ácido nucleico que codifica para una cadena pesada de un anticuerpo anti-MAdCAM de la ¡nvención, puede comprender una secuencia de nucleótidos que codifica para un dominio VH de la ¡nvención unida en el marco de lectura a una secuencia de nucleótidos que codifica para un dominio constante de cadena pesada de cualquier fuente. Asimismo, una molécula de ácido nucleico que codifica para una cadena ligera de un anticuerpo anti-MAdCAM de la invención, puede comprender una secuencia de nucleótidos que codifica para un dominio V de la invención unida en el marco de lectura a una secuencia de nucleótidos que codifica para un dominio constante de cadena ligera de cualquier fuente.
En otro aspecto de la invención, las moléculas de ácido nucleico que codifican para el dominio variable de las cadenas pesada (VH) y ligera (VL), son "convertidas" a genes de anticuerpo de longitud completa. En una modalidad, las moléculas de ácido nucleico que codifican para los dominios VH o V , son convertidas a genes de anticuerpo de longitud completa mediante inserción en un vector de expresión que codifica ya para los dominios constantes de cadena pesada (CH) o de cadena ligera (CL), respectivamente, de modo que el segmento VH sea enlazado operativamente a los segmentos CH dentro del vector, y el segmento V sea enlazado operativamente al segmento C dentro del vector. En otra modalidad, las moléculas de ácido nucleico que codifican para los dominios VH y/o V son convertidas en genes de anticuerpo de longitud completa enlazando, por ejemplo, ligando, una molécula de ácido nucleico que codifica para dominios VH y/o V a una molécula de ácido nucleico que codifica para un dominio CH y/o CL usando técnicas estándar de biología molecular. Se conocen en la técnica secuencias de ácido nucleico de genes del dominio constante de inmunoglobulina de cadena ligera y pesada humanas. Véase, por ejemplo, Kabat ef al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a ed., NIH Publ. No. 91-3242, 1991. Moléculas de ácido nucleico que codifican para las cadenas ligera y/o pesada de longitud completa, pueden ser expresadas entonces de una célula en la cual hayan sido introducidas, y el anticuerpo anti-MAdCAM haya sido aislado.
La presente invención provee también vectores que comprenden moléculas de ácido nucleico que codifican para la cadena pesada de un anticuerpo anti-MAdCAM de la invención, o una porción de unión a antígeno del mismo. La invención provee también vectores que comprenden moléculas de ácido nucleico que codifican para la cadena ligera de dichos anticuerpos o porción de unión a antígeno de los mismos. La invención provee además vectores que comprenden moléculas de ácido nucleico que codifican para proteínas de fusión, anticuerpos modificados, fragmentos de anticuerpo, y sondas de los mismos. En algunas modalidades, los anticuerpos antí-MAdCAM, o porciones de unión a antígeno de la invención, son expresados insertando moléculas de ADN que codifican para las cadenas ligera y pesada de longitud completa o parcial, obtenidas como se describió anteriormente, en vectores de expresión, de modo que los genes son enlazados operativamente a secuencias de control de la expresión necesarias, tales como secuencias de control de la transcripción y traducción. Vectores de expresión ¡ncluyen plásmidos, retrovirus, adenovirus, virus adenoasociados (AAV), virus de plantas tales como virus del mosaico de la coliflor, virus del mosaico del tabaco, cósmidos, YACs, episomas derivados de EBV, y similares. El gen del anticuerpo es ligado en un vector, de modo que las secuencias de control de la transcripción y traducción dentro del vector cumplen su función deseada de regular la transcripción y traducción del gen del anticuerpo. El vector de expresión y secuencias de control de la expresión son elegidos para que sean compatibles con la célula hospedera de expresión usada. El gen de la cadena ligera del anticuerpo y el gen de la cadena pesada del anticuerpo pueden ser insertados en vectores separados. En una modalidad preferida, ambos genes son insertados en el mismo vector de expresión. Los genes del anticuerpo son insertados en el vector de expresión mediante métodos estándar (por ejemplo, ligación de sitios de restricción complementarios en el fragmento del gen del anticuerpo y vector, o ligación de extremos rasurados si no están presentes sitios de restricción). Un vector conveniente es uno que codifique para una secuencia de inmunoglobulina CH o CL humana funcionalmente completa, con sitios de restricción adecuados diseñados de modo que cualquier secuencia de VH O VL pueda ser insertada y expresada fácilmente, como se describió anteriormente. En dichos vectores, ocurre usualmente empalme entre el sitio del donador de empalme y la región J insertada y el sitio del aceptor de empalme que precede al dominio C de humano, y también en las regiones de empalme que ocurren dentro de los exones de CH de humano. Poliadenílación y terminación de la transcripción ocurren en sitios cromosómicos nativos, hacia el extremo 3' de las regiones codificantes. El vector de expresión recombinante puede codificar también para un péptido de señal que facilite la secreción de la cadena del anticuerpo de una célula hospedera. El gen de la cadena del anticuerpo puede ser clonado en el vector, de modo que el péptido de señal sea enlazado en el marco de lectura al extremo amino de la cadena de inmunoglobulina. El péptido de señal puede ser un péptido de señal de ¡nmunoglobulina o un péptido de señal heterólogo (es decir, un péptído de señal de una proteína diferente de inmunoglobulina). Además de los genes de la cadena del anticuerpo, los vectores de expresión recombinantes de la invención poseen secuencias reguladoras que controlan la expresión de los genes de la cadena del anticuerpo en una célula hospedera. Los expertos en la técnica apreciarán que el diseño del vector de expresión, ¡ncluyendo la selección de secuencias reguladoras, puede depender de factores tales como la elección de la célula hospedera que será transformada, el nivel de expresión deseado de las proteínas, etc. Secuencias reguladoras preferidas para la expresión de células hospederas de mamífero, incluyen elementos virales que dirigen altos niveles de expresión de proteínas en células de mamífero, tales como promotores y/o intensificadores derivados de retrovírus (tales como LTRs retrovirales), citomegalovirus (CMV) (tales como el ¡ntensificador/promotor de CMV), virus 40 simiano (SV40) (tal como el ¡ntensificador/promotor de SV40), adenovirus (por ejemplo, el promotor tardío principal de adenovirus (AdMLP)), polioma y promotores fuertes de mamífero, tales como los promotores de actina e inmunoglobulina nativos. Para más descripción de elementos reguladores virales, y secuencias de los mismos véase, por ejemplo, la patente de E.U.A. No. 5,168,062, patente de E.U.A. No. 4,510,245 y patente de E.U.A. No. 4,968,615. Se conocen en la técnica métodos para la expresión de anticuerpos en plantas, incluyendo una descripción de promotores y vectores, así como la transformación de plantas. Véase, por ejemplo, la patente de los Estados Unidos 6,517,529, incorporada en la presente como referencia. Métodos para la expresión de polipéptidos en células bacterianas o células de hongos, por ejemplo, células de levadura, son también bien conocidos en la técnica. Además de los genes de la cadena del anticuerpo y secuencias reguladoras, los vectores de expresión recombinantes de la invención pueden poseer secuencias adicionales, tales como secuencias que regulan la replícación del vector en células hospederas (por ejemplo, orígenes de replicación) y genes marcadores seleccionables. El gen marcador seleccionable facilita la selección de células hospederas en las cuales el vector ha sido introducido (véase, por ejemplo, las patentes de E.U.A. Nos. 4,399,216, 4,634,665 y 5,179,017). Por ejemplo, típicamente, el gen marcador seleccionable confiere resistencia a fármacos, tales como G418, higromicina o metotrexato, en una célula hospedera en la cual el vector ha sido introducido. Genes marcadores seleccionables preferidos incluyen el gen de dihidrofolato reductasa (DHFR) (para su uso en células hospederas dhfr con amplificación/selección con metotrexato), el gen de resistencia a neomicina (para selección con G418), y el gen de glutamato sintetasa. Moléculas de ácido nucleico que codifiquen para anticuerpos antí-MAdCAM, y vectores que comprendan estas moléculas de ácido nucleico, pueden usarse para la transformación de una célula hospedera de mamífero, planta, bacteria o levadura adecuada. Los anticuerpos de la invención pueden producirse transgénicamente a través de la generación de un mamífero o planta que sea transgénico para las secuencias de la cadena ligera y pesada de inmunoglobulina de interés, y la producción del anticuerpo en una forma recuperable del mismo. La transformación puede ser mediante cualquier método conocido para la introducción de polinucleótidos en una célula hospedera incluyendo, por ejemplo, empacando el polinucleótido en un virus (o en un vector viral), y transduciendo una célula hospedera con el virus (o vector), o mediante procedimientos de transfección conocidos en la técnica, como se ejemplifica en las patentes de E.U.A. Nos. 4,399,216, 4,912,040, 4,740,461 y 4,959,455. El procedimiento de transformación usado, depende del hospedero que será transformado. Métodos para la introducción de polinucleótidos heterólogos en células de mamífero son bien conocidos en la técnica e ¡ncluyen, pero no están limitados a, transfección mediada por dextrán, precipitación con sulfato de calcio, transfección mediada por polybrene (bromuro de hexadimetrina), fusión de protoplastos, electroporación, bombardeo de partículas, encapsulacíón de los polinucleótidos en liposomas, conjugados de péptidos, dendrímeros y microinyección directa del ADN en núcleos. Líneas de células de mamífero disponibles como hospederos para expresión son bien conocidas en la técnica, e incluyen muchas líneas de células inmortalizadas disponibles de The American Type Culture Collection (ATCC) que incluyen, pero no están limitadas a, células de ovario de hámster chino (CHO), células NSO, células HeLa, células de riñon de cría de hámster (BHK), células de riñon de mono (COS), células de carcinoma hepatocelular humano (por ejemplo, Hep G2), y muchas otras líneas de células. Células no de mamífero que incluyen, pero no están limitadas a, células de bacterias, levaduras, insectos y plantas, pueden usarse también para expresar anticuerpos recombinantes. Puede preferirse la mutagénesís dirigida a sitio del dominio CH2 del anticuerpo para eliminar la glucosilacíón, para prevenir cambios en la inmunogenicidad y funciones farmacocinéticas y/o efectoras que resultan de la glucosilación no humana. Los métodos de expresión se seleccionan determinando qué sistema genera los más altos niveles de expresión y produce anticuerpos con propiedades constitutivas de unión a MAdCAM. Además, la expresión de anticuerpos de la invención (u otras porciones de los mismos) de líneas de células de producción, puede intensificarse usando muchas técnicas conocidas. Por ejemplo, los sistemas de expresión génica de DHFR y glutamina sintetasa, son procedimientos comunes para intensificar la expresión bajo ciertas condiciones. Pueden identificarse clones de células de alta expresión usando técnicas convencionales, tales como clonación por dilución limitada y tecnología Microdop. El sistema de glutamina sintetasa se discute totalmente o en parte con relación a las patentes europeas Nos. 0 216 846, 0 256 055 y 0 323 997 y la solicitud de patente europea No. 89303964.4. Con relación a la producción transgéníca en mamíferos, pueden producirse también anticuerpos en, y pueden recuperarse de, la leche de cabras, vacas u otros mamíferos. Véase, por ejemplo, las patentes de E.U.A. Nos. 5,827,690, 5,756,687, 5,750,172 y 5,741 ,957. Los anticuerpos anti-MAdCAM expresados en líneas de células como se describió anteriormente, pueden purificarse y/o aislarse del material celular asociado. Los anticuerpos pueden estar presentes en células enteras, en un lisado de células, o en una forma parcialmente purificada o sustancialmente pura. La purificación se lleva a cabo para eliminar otros componentes celulares u otros contaminantes, por ejemplo, otros ácidos nucleicos o proteínas celulares, mediante técnicas estándar que incluyen tratamiento con SDS/tratamiento alcalino, cromatografía en columna, y otras técnicas bien conocidas en la materia. Véase Ausubel, F., et al., ed. Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing y Wiley Interscience, New York (1987). En la presente invención, es posible que los anticuerpos anti-MAdCAM de la presente ¡nvención expresados por diferentes líneas de células o en animales transgénicos, tengan diferentes patrones de glucosilación entre sí. Sin embargo, todos los anticuerpos anti-MAdCAM codificados por los ácidos nucleicos y aminoácidos provistos en la presente se consideran como parte de la presente invención, sin importar su patrón de glucosilación o modificación o deleción de los mismos. Como se usa en la presente, el término "glucosilación" significa el patrón de unidades de carbohidratos que están unidas covalentemente a un anticuerpo. Cuando se dice que los anticuerpos anti-MAdCAM de la presente tienen un patrón de glucosilación particular, significa que la mayoría de los anticuerpos anti-MAdCAM referidos tienen ese patrón de glucosilación particular. En otros aspectos, cuando se dice que los anticuerpos anti-MAdCAM de la presente tienen un patrón de glucosilación particular, significa que más que o igual a 50%, 75%, 90%, 95%, 99% o 100% de los anticuerpos anti-MAdCAM referidos, tienen ese patrón de glucosilación particular. Los anticuerpos anti-MAdCAM de la presente invención abarcan también variantes de glucosilación de los mismos (por ejemplo, mediante inserción de un sitio de glucosilación o deleción de algún sitio de glucosilación mediante deleción, inserción o sustitución de residuos de aminoácido adecuados). Para los propósitos de la presente invención, los anticuerpos anti-MAdCAM pueden ser glucosilados o no glucosilados. Cuando los anticuerpos anti-MAdCAM son glucosilados, pueden tener cualquier patrón de glucosilación posible. Además, cada cadena pesada dentro del anticuerpo puede tener el mismo patrón de glucosilación, o las dos cadenas pesadas pueden tener diferentes patrones de glucosilación.
Vías de administración y dosificaciones Las composiciones de esta invención pueden estar en soluciones líquidas (por ejemplo, soluciones inyectables e infusibles). La forma preferida depende del modo de administración y la aplicación terapéutica que se deseen. Composiciones preferidas típicas, están en la forma de soluciones inyectables o infusibles, tales como composiciones similares a las usadas para la inmunización pasiva de humanos. El modo de administración preferido es parenteral (por ejemplo, intravenoso, subcutáneo, intradérmico, intraperitoneal, intramuscular e intraestemal), o mediante técnicas de infusión, en la forma de suspensiones oleaginosas o líquidas inyectables estériles. Como lo apreciarán los expertos en la técnica, la vía y/o el modo de administración variarán, dependiendo de los resultados deseados. En una modalidad preferida, el anticuerpo se administra mediante infusión o inyección intravenosa. En otra modalidad preferida, el anticuerpo se administra mediante inyección intramuscular, subcutánea o intradérmica. Las composiciones terapéuticas son típicamente estériles y estables bajo las condiciones de fabricación y almacenamiento. La composición puede formularse como una solución, microemulsión, dispersión o liposoma. Pueden prepararse soluciones inyectables estériles, incorporando el anticuerpo anti-MAdCAM en la cantidad requerida en un diluyente adecuado con un ingrediente o una combinación de los ingredientes enumerados anteriormente, según se requiera, seguido de esterilización (por ejemplo, esterilización con filtro). En general, se preparan dispersiones incorporando el compuesto activo en un vehículo estéril que contenga un medio de dispersión básico y los otros ingredientes requeridos de los enumerados anteriormente. Dichas suspensiones pueden formularse de acuerdo a la técnica conocida, usando aquellos agentes mojantes o de dispersión y agentes de suspensión u otros agentes aceptables adecuados. La preparación inyectable estéril puede ser también una suspensión o solución inyectable estéril en un diluyente o solvente no tóxico parenteralmente aceptable, por ejemplo, como una solución en 1 ,3-butanodiol. Entre los vehículos y solventes aceptables que pueden usarse, están agua, solución de Ringer y solución isotónica de cloruro de sodio. Además, aceites fijados estériles se usan convencionalmente como un solvente o medio de suspensión. Para este propósito, puede usarse cualquier aceite fijado blando, incluyendo monoglicéridos o diglicéridos sintéticos. Además, ácidos grasos n-3 poliinsaturados, pueden encontrar uso en la preparación de preparaciones inyectables. En el caso de polvos estériles para la preparación de soluciones inyectables estériles, los métodos de preparación preferidos son secado al vacío y deshidratación por congelación (liofilización), que dan un polvo del ingrediente activo más algún ingrediente deseado adicional de una solución filtrada previamente estéril del mismo. La fluidez adecuada de una solución puede mantenerse, por ejemplo, mediante el uso de un recubrimiento tal como lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de dispersión, y mediante el uso de agentes tensioactivos. Puede producirse la absorción prolongada de composiciones inyectables, ¡ncluyendo en la composición un agente que retarde la absorción, por ejemplo, sales de monoestearato y gelatina, o formulando la composición en formas de absorción prolongada tales como depósitos, liposomas, microesferas poliméricas, geles poliméricos e implantes.
Otros métodos para la administración de los anticuerpos descritos en la presente, incluyen parches dérmicos que liberan las medicaciones directamente en la piel de un sujeto. Dichos parches pueden contener los anticuerpos de la presente invención en una solución líquida opcionalmente regulada en su pH, disueltos y/o dispersos en un adhesivo, o dispersos en un polímero. Otros métodos para la administración de los anticuerpos descritos en la presente, incluyen gotas oftalmológicas líquidas para los ojos. El anticuerpo puede administrarse una vez, pero más preferiblemente se administra veces múltiples. Por ejemplo, el anticuerpo puede administrarse de una vez al día a una vez cada seis meses o más tiempo. La administración puede ser con base en un plan como tres veces al día, dos veces al día, una vez al día, una vez cada dos días, una vez cada tres días, una vez por semana, una vez cada dos semanas, una vez al mes, una vez cada dos meses, una vez cada tres meses, y una vez cada seis meses. El anticuerpo puede administrarse también continuamente mediante una minibomba. El anticuerpo puede administrarse una vez, por lo menos dos veces, o por lo menos el período hasta que la enfermedad sea tratada, aliviada o curada. El anticuerpo se administraría típicamente como parte de una composición farmacéutica como se describió anteriormente. Las composiciones de la invención pueden incluir una cantidad terapéuticamente efectiva o una cantidad profilácticamente efectiva, de un anticuerpo o porción de unión a antígeno de la invención. En la preparación de la composición, la cantidad terapéuticamente efectiva del anticuerpo anti-MAdCAM presente en la composición puede determinarse, por ejemplo, tomando en cuenta los volúmenes de dosis y modos de administración deseados, la naturaleza y severidad de la condición que se va a tratar, y la edad y estatura del sujeto. Ejemplos de escalas de dosis no limitativas para la administración de las composiciones farmacéuticas de la presente invención a un sujeto, son de aproximadamente 0.01 mg/kg a aproximadamente 200 mg/kg (expresadas en términos de miligramos (mg) de anticuerpo anti-MAdCAM administrado por kilogramo (kg) de peso del sujeto), de aproximadamente 0J mg/kg a aproximadamente 100 mg/kg, de aproximadamente 1.0 mg/kg a aproximadamente 50 mg/kg, de aproximadamente 5.0 mg/kg a aproximadamente 20 mg/kg, o aproximadamente 15 mg/kg. Para los propósitos de la presente ¡nvención, un sujeto humano promedio pesa aproximadamente 70 kg. Se pretende también que escalas intermedias a algunas de las concentraciones citadas en la presente, por ejemplo, aproximadamente 6 a 94 mg/kg, sean parte de esta invención. Por ejemplo, se pretende que se incluyan escalas de valores usando una combinación de algunos de los valores citados como límites superior y/o inferior. Pueden ajustarse también los regímenes de dosificación para proveer la respuesta deseada óptima (por ejemplo, una respuesta terapéutica o profiláctica), administrando varias dosis divididas a un sujeto con el tiempo, o la dosis puede reducirse o incrementarse proporcionalmente, según sea indicado por las exigencias de la situación terapéutica. Es especialmente ventajoso formular composiciones parenterales en forma de dosificación unitaria, para facilidad de administración y uniformidad de dosificación. La forma de dosificación unitaria como se usa en la presente, se refiere a unidades físicamente discretas adecuadas como dosificaciones unitarias para los sujetos mamíferos que se van a tratar, cada unidad conteniendo una cantidad predeterminada de compuesto activo, calculada para producir el efecto terapéutico deseado en asociación con el vehículo farmacéutico requerido. La especificación para las formas de dosificación unitaria de la invención es dictada por, y depende directamente de, (a) las características únicas del anticuerpo anti-MAdCAM o porción del mismo, y el efecto terapéutico o profiláctico particular que se logrará, y (b) las limitaciones inherentes en la técnica de la combinación de dicho anticuerpo para el tratamiento de sensibilidad en los individuos. Las composiciones líquidas de la presente invención, pueden prepararse como formas de dosificación unitaria. Por ejemplo, una dosificación unitaria por vial puede contener de 1 a 1000 mililitros (ml) de diferentes concentraciones de un anticuerpo anti-MAdCAM. En otras modalidades, una dosificación unitaria por vial puede contener aproximadamente 1 ml, 2 ml, 3 ml, 4 ml, 5 ml, 6 ml, 7 ml, 8 ml, 9 ml, 10 ml, 15 ml, 20 ml, 30 ml, 40 ml, 50 ml o 100 ml de diferentes concentraciones de un anticuerpo anti-MAdCAM. Si es necesario, estas preparaciones pueden ajustarse a una concentración deseada añadiendo un diluyente estéril a cada vial.
Evaluación de la estabilidad La presente invención comprende composiciones farmacéuticas líquidas estables que comprenden un anticuerpo anti-MAdCAM como se describe en la presente, y un agente quelante farmacéuticamente aceptable. Una composición estable es deseable para mantener o resisfir cambios, por ejemplo, en la apariencia e integridad del producto (incluyendo degradación física o química que lleva potencialmente a una reducción en actividad biológica). Varias técnicas analíticas e indicadores para medir la estabilidad de las proteínas se reportan en la literatura, y muchas de estas técnicas e indicadores se revisan en Peptide and Protein Drug Delivery, 247-301 , Vincent Lee ed., Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y., Pubs. (1991 ), y Jones, A. Adv. Drug Delivery Rev. 10: 29-90 (1993). En general, las composiciones farmacéuticas líquidas de la presente invención exhiben estabilidad mejorada cuando se someten a bajas temperaturas de almacenamiento durante un período, y/o cuando se someten a uno o más ciclos de congelación/descongelación. En una modalidad, la composición cuando se almacena a una temperatura de aproximadamente 2°C a aproximadamente 8°C por cuando menos aproximadamente 12 meses, de preferencia por lo menos aproximadamente 18 meses, y más preferiblemente por lo menos aproximadamente 24 meses, es más estable que una composición de otra manera idéntica que carece del agente quelante y que se almacena bajo las mismas condiciones por el mismo tiempo. En otra modalidad, la composición cuando se almacena a una temperatura de aproximadamente 25°C a aproximadamente 30°C por cuando menos aproximadamente 3 meses, de preferencia por lo menos 6 meses, y más preferiblemente por lo menos aproximadamente 12 meses, es más estable que una composición de otra manera idéntica que carece del agente quelante y que se almacena bajo las mismas condiciones por el mismo tiempo. En otra modalidad, la composición cuando se almacena a una temperatura de aproximadamente 40°C por cuando menos aproximadamente 1 mes, de preferencia por lo menos aproximadamente 2 meses, y más preferiblemente por lo menos aproximadamente 3 meses, es más estable que una composición de otra manera idéntica que carece del agente quelante y que se almacena bajo las mismas condiciones por el mismo tiempo. Como se usa en la presente, el término "un ciclo de congelación/descongelación" se refiere a técnicas para el uso de una muestra de anticuerpos líquida después de almacenamiento congelada, en donde la temperatura de la muestra es disminuida hasta una temperatura de 0°C o menor para congelar la muestra líquida, y sometiendo entonces la muestra a una temperatura que restaurará su estado líquido por un periodo suficiente para permitir el uso de la muestra, seguido de y retorno al almacenamiento congelada, de preferencia a una temperatura de 0°C o menor. Como se usa en la presente, el término "almacenamiento congelada", se refiere a congelar y mantener una muestra de anticuerpo previamente líquida a una temperatura de 0°C o menor, y de preferencia -20°C o menor. En una modalidad, la composición cuando se somete a por lo menos 1 ciclo de congelación/descongelación, de preferencia por lo menos 2 ciclos de congelación/descongelación, más preferiblemente por lo menos 3 ciclos de congelación/descongelación, aún más preferiblemente por lo menos 4 ciclos de congelación/descongelación, todavía más preferiblemente por lo menos 5 ciclos de congelación/descongelación, y aún más preferiblemente por lo menos 6 ciclos de congelación/descongelación, es más estable que una composición de otra manera idéntica que carece del agente quelante que se somete a las mismas condiciones de congelación/descongelación. En otra modalidad, la composición satisface dos o más de las siguientes condiciones: (a) la composición, cuando se almacena a una temperatura de aproximadamente 2°C a aproximadamente 8°C por cuando menos aproximadamente 12 meses, de preferencia por lo menos aproximadamente 18 meses, y más preferiblemente por lo menos aproximadamente 24 meses, es más estable que una composición de otra manera idéntica que carece del agente quelante y que se almacena bajo las mismas condiciones por el mismo tiempo; (b) la composición, cuando se almacena a una temperatura de aproximadamente 25°C a aproximadamente 30°C por cuando menos aproximadamente 3 meses, de preferencia por lo menos 6 meses, y más preferiblemente por lo menos aproximadamente 12 meses, es más estable que una composición de otra manera idéntica que carece del agente quelante y que se almacena bajo las mismas condiciones por el mismo tíempo; (c) la composición, cuando se almacena a una temperatura de aproximadamente 40°C por cuando menos aproximadamente 1 mes, de preferencia por lo menos aproximadamente 2 meses, y más preferiblemente por lo menos aproximadamente 3 meses, es más estable que una composición de otra manera idéntica que carece del agente quelante y que se almacena bajo las mismas condiciones por el mismo tiempo; o (d) la composición, cuando se somete a por lo menos 1 ciclo de congelación/descongelación, de preferencia por lo menos 2 ciclos de congelación/descongelación, más preferiblemente por lo menos 3 ciclos de congelación/descongelación, aún más preferiblemente por lo menos 4 ciclos de congelación/descongelación, todavía más preferiblemente por lo menos 5 ciclos de congelación/descongelación, y aún más preferiblemente por lo menos 6 ciclos de congelación/descongelación, es más estable que una composición de otra manera idéntica que carece del agente quelante que se somete a las mismas condiciones de congelación/descongelación. En otra modalidad, la composición satisface tres o más de las condiciones discutidas anteriormente.
Para los propósitos de la presente solicitud, pueden usarse agregación de anticuerpos, fragmentación de anticuerpos y/o decoloración de la composición, por ejemplo, como indicadores de la estabilidad de la composición. En general, las composiciones farmacéuticas líquidas de la presente invención exhiben un menor nivel de por lo menos uno de agregación de anticuerpos, fragmentación de anticuerpos y decoloración de la composición, cuando se someten a una o más de las condiciones de almacenamiento o congelación/descongelación descritas anteriormente, respecto a composiciones de otra manera idénticas que carecen del agente quelante y que se someten a las mismas condiciones. La agregación de proteínas en una composición farmacéutica líquida puede medirse mediante varios métodos conocidos en la técnica. Dichos métodos incluyen cromatografía de filtración en gel que separa las proteínas con base en su peso molecular. Un "gel" es una matriz de agua y un polímero, tal como agarosa o acrilamida polimerizada. La presente invención abarca también el uso de CLAR (cromatografía de líquidos de alto rendimiento) por filtración en gel. Otros métodos reconocidos para medir la agregación incluyen la cromatografía de intercambio catiónico, que es la técnica cromatográfica de líquidos general de cromatografía de intercambio iónico que usa columnas aniónicas. Los cationes intercambiados en la presente invención, son de las moléculas de proteína. Puesto que los agregados de proteínas multivalentes pueden tener algún múltiplo de la carga neta del monómero de la proteína de unión al antígeno, los agregados pueden ser retenidos más fuertemente, y pueden separarse de las moléculas de monómero. Un intercambiador catiónico preferido, es una columna de ácido poliaspártico. De esta manera, una proteína monomérica puede distinguirse fácilmente de un agregado. Sin embargo, los expertos en la técnica comprenderán que las pruebas de agregación de la invención no se limitan a algún tipo particular de columna de cromatografía, en tanto sean capaces de separar las dos formas de moléculas de proteína. La fragmentación de proteínas en una composición farmacéutica líquida puede medirse mediante varios métodos conocidos en la técnica. Dichos métodos incluyen, por ejemplo, cromatografía de exclusión por tamaño, detección ultravioleta (por ejemplo, a 214 nanómetros), SDS-PAGE y/o espectrometría de masa de tiempo de vuelo/ionización por desorción láser asistida por matriz (MALDI/TOF MS). La fragmentación de proteínas que resulta en una alteración de carga (por ejemplo, ocurriendo como resultado de desamidación) puede evaluarse, por ejemplo, mediante cromatografía de intercambio iónico o enfoque isoeléctrico (IEF). La decoloración de la composición puede medirse generalmente mediante observación visual de la composición misma. Las presentes composiciones farmacéuticas líquidas que comprenden un agente quelante, reducen en general la decoloración de la composición (por ejemplo, rosa o amarillo), y/o mantienen la claridad de la composición (por ejemplo, turbiedad, nubosidad y/o formación de materia en partículas) respecto a composiciones de otra manera idénticas que no contienen al agente quelante. Para los propósitos de la presente invención, el término "decoloración" se refiere a ambos cambios en color (por ejemplo, de claro e incoloro a rosa o amarillo), y a cambios en claridad (por ejemplo, de claro e incoloro a turbio, opaco y/o que tiene materia en partículas). La decoloración de la composición puede medirse generalmente usando técnicas adicionales tales como detección ultravioleta a 214 nanómetros, detección a otras longitudes de onda tal como en la escala de luz visible/UV cercana, y/o mediante comparación visual contra una escala de color estándar de las composiciones con y sin el agente quelante. Véase PhEur 5.0, monografía 2.2.2 de 2005. En una modalidad, la agregación de anticuerpos se determina después de que la composición es sometida a por lo menos una de las siguientes condiciones: (a) la composición se almacena a una temperatura de aproximadamente 2°C a aproximadamente 8°C por cuando menos aproximadamente 12 meses, de preferencia por lo menos aproximadamente 18 meses, y más preferiblemente por lo menos aproximadamente 24 meses; (b) la composición se almacena a una temperatura de aproximadamente 25°C a aproximadamente 30°C por cuando menos aproximadamente 3 meses, de preferencia por lo menos 6 meses, y más preferiblemente por lo menos aproximadamente 12 meses; (c) la composición se almacena a una temperatura de aproximadamente 40°C por cuando menos aproximadamente 1 mes, de preferencia por lo menos aproximadamente 2 meses, y más preferiblemente por lo menos aproximadamente 3 meses; o (d) la composición se somete a por lo menos 1 ciclo de congelación/descongelación, de preferencia por lo menos 2 ciclos de congelación/descongelación, más preferiblemente por lo menos 3 ciclos de congelación/descongelación, aún más preferiblemente por lo menos 4 ciclos de congelación/descongelación, todavía más preferiblemente por lo menos 5 ciclos de congelación/descongelación, y aún más preferiblemente por lo menos 6 ciclos de congelación/descongelación. Los agregados de anticuerpos se separan entonces cromatográficamente de los monómeros (por ejemplo, usando CLAR) y el grado de agregación se determina a partir del cromatograma resultante. Las composiciones farmacéuticas líquidas estables de la presente invención tienen típicamente un área pico del agregado en el cromatograma que es menor de aproximadamente 6%, menor de aproximadamente 5%, menor de aproximadamente 4%, menor de aproximadamente 3%, menor de aproximadamente 2%, o menor de aproximadamente 1.5% del área pico total en el cromatograma. En un ejemplo específico de esta técnica para medir la agregación, la composición se almacena por 24 semanas a 40°C, y la separación cromatográfica se lleva a cabo entonces usando SE-CLAR con detección ultravioleta a 214 nanómetros. En general, la diferencia entre el área pico del agregado en el cromatograma para una composición farmacéutica líquida estable de la presente invención y el área pico del agregado en el cromatograma para una composición de otra manera idéntica que carece del agente quelante y que se somete a las mismas condiciones, es de por lo menos aproximadamente 2%, por lo menos aproximadamente 3%, por lo menos aproximadamente 4%, o por lo menos aproximadamente 4.5%. En otra modalidad, la fragmentación de anticuerpos se determina después de que la composición es sometida a por lo menos una de las siguientes condiciones: (a) la composición se almacena a una temperatura de aproximadamente 2°C a aproximadamente 8°C por cuando menos aproximadamente 12 meses, de preferencia por lo menos aproximadamente 18 meses, y más preferiblemente por lo menos aproximadamente 24 meses; (b) la composición se almacena a una temperatura de aproximadamente 25°C a aproximadamente 30°C por cuando menos aproximadamente 3 meses, de preferencia por lo menos 6 meses, y más preferiblemente por lo menos aproximadamente 12 meses; (c) la composición se almacena a una temperatura de aproximadamente 40°C por cuando menos aproximadamente 1 mes, de preferencia por lo menos aproximadamente 2 meses, y más preferiblemente por lo menos aproximadamente 3 meses; o (d) la composición se somete a por lo menos 1 ciclo de congelación/descongelación, de preferencia por lo menos 2 ciclos de congelación/descongelación, más preferiblemente por lo menos 3 ciclos de congelación/descongelación, aún más preferiblemente por lo menos 4 ciclos de congelación/descongelación, todavía más preferiblemente por lo menos 5 ciclos de congelación/descongelación, y aún más preferiblemente por lo menos 6 ciclos de congelación/descongelación. Los fragmentos de anticuerpos se separan entonces electroforéticamente de la composición (por ejemplo, mediante SDS-PAGE), y el grado de fragmentación se determina a partir del electroforograma o imágenes en gel resultantes. Las composiciones farmacéuticas líquidas estables de la presente invención tienen típicamente un volumen de la banda de fragmentos en el gel de SDS-PAGE que es menor de aproximadamente 9%, menor de aproximadamente 8%, menor de aproximadamente 7%, menor de aproximadamente 6%, menor de aproximadamente 5%, o menor de aproximadamente 4.5% del volumen de la banda total en el gel. En un ejemplo específico de esta técnica para medir la fragmentación, la composición se almacena por 24 semanas a 40°C, y se analiza entonces usando SDS-PAGE reducida (rSDS-PAGE) con volúmenes de banda determinados mediante exploración con un densitómetro personal PDQC-90 de Molecular Dynamics, o un densitómetro de formación de imágenes GS800 de Bio-Rad. En general, la diferencia entre el volumen de la banda de fragmentos para una composición farmacéutica líquida estable de la presente invención y el volumen de la banda de fragmentos para una composición de otra manera idéntica que carece del agente quelante y que se somete a las mismas condiciones, es de por lo menos aproximadamente 2%, por lo menos aproximadamente 3%, por lo menos aproximadamente 4%, o por lo menos aproximadamente 5%.
Métodos de prevención/tratamiento Cualquiera de los tipos de anticuerpos descritos en la presente, puede usarse terapéuticamente. En una modalidad preferida, el anticuerpo anti-MAdCAM es un anticuerpo humano. En otra modalidad preferida, la MAdCAM es de humano, y el sujeto es un sujeto humano. En otra modalidad preferida, el anticuerpo anti-MAdCAM es un anticuerpo de lgG2 de humano. En forma alternativa, el sujeto puede ser un mamífero que expresa una proteína MAdCAM con la que el anticuerpo anti-MAdCAM reacciona en forma cruzada. El anticuerpo puede administrarse a un mamífero no humano que exprese MAdCAM con el cual el anticuerpo reacciona en forma cruzada (es decir, un primate) para propósitos veterinarios, o como un modelo animal de enfermedad humana. Dichos modelos anímales pueden ser útiles para evaluar la eficacia terapéutica de los anticuerpos de esta ¡nvención. La presente invención provee un método para el tratamiento de una enfermedad inflamatoria en un sujeto, que comprende administrar al sujeto una composición farmacéutica líquida que comprende un anticuerpo anti-MAdCAM; y un agente quelante solo o en combinación con otros excipientes seleccionados de un regulador de pH, un agente de tonicidad o un agente tensioactivo, y mezclas de los mismos. En otras modalidades, el sujeto mencionado anteriormente es uno que está en necesidad de la prevención o el tratamiento de una enfermedad inflamatoria. En otra modalidad, la presente invención provee un método para el tratamiento de una condición de enfermedad inflamatoria en un sujeto, que comprende administrar al sujeto una composición farmacéutica líquida que comprende un anticuerpo anti-MAdCAM 7J6.6; y un excipiente farmacéuticamente aceptable que comprende un agente quelante solo o en combinación con otros excipientes seleccionados de un regulador de pH, un agente de tonicidad o un agente tensioactivo, y mezclas de los mismos. En varias modalidades de esta invención, la enfermedad inflamatoria puede ser, pero no está limitada a, enfermedades inflamatorias del tracto gastrointestinal que incluyen enfermedad de Crohn, colitis ulcerativa, enfermedad diverticular, gastritis, enfermedad hepática, esclerosis biliar primaria y colangitis esclerosante. Las enfermedades inflamatorias incluyen también, pero no están limitadas a, enfermedad abdominal (incluyendo peritonitis, apendicítis y enfermedad del tracto biliar), mielitis transversa aguda, dermatitis alérgica (incluyendo piel alérgica, eczema alérgico, atopia de la piel, eczema atópico, dermatitis atópica, inflamación cutánea, eczema inflamatorio, dermatitis inflamatoria, piel debida a pulgas, dermatitis militar, eczema militar, piel por ácaros del polvo doméstico), espondilitis anquilosante (síndrome de Reiter), asma, inflamación de vías respiratorias, aterosclerosis, arteriosclerosis, atresia biliar, inflamación de la vejiga, cáncer de mama, inflamación cardiovascular (incluyendo vasculítis, infartos reumatoides del pliegue de las uñas, úlceras de la pierna, polimiositis, inflamación vascular crónica, pericarditis, enfermedad pulmonar obstructiva crónica), pancreatitis crónica, inflamación perineural, colitis (incluyendo colitis amibiana, colitis infecciosa, colitis bacteriana, colitis de Crohn, colitis isquémica, colitis ulcerativa, proctocolitis idiopática, enfermedad inflamatoria del intestino, colitis pseudomembranosa), trastornos vasculares de la colágena (artritis reumatoide, SLE, esclerosis sistémica progresiva, enfermedad mixta de tejido conectivo, diabetes mellitus), enfermedad de Crohn (enteritis regional, ileítis granulomatosa, ileocolitis, inflamación del sistema digestivo), enfermedad desmielinizante (incluyendo mielitis, esclerosis múltiple, esclerosis diseminada, encefalomielitis diseminada aguda, desmielinización perivenosa, deficiencia de vitamina B12, síndrome de Guillain-Barré, retrovirus asociado con MS), dermatomiositis, diverticulitis, diarreas exudativas, gastritis, hepatitis granulomatosa, inflamación granulomatosa, colecistitis, diabetes mellitus insulinodependiente, enfermedades inflamatorias del hígado (fibrosis hepática, cirrosis biliar primaria, hepatitis, colangitis esclerosante), inflamación pulmonar (fibrosis pulmonar idiopática, granuloma eosinofílíco del pulmón, histiocitosis X pulmonar, inflamación peribronquiolar, bronquitis aguda), hipogranuloma venéreo, melanoma maligno, glosopeda (¡ncluyendo gingivitis, enfermedad periodontal), mucositis, inflamación del sistema musculoesquelético (miositis), esteatohepatitis no alcohólica (enfermedad no alcohólica del hígado graso), inflamación ocular y orbital (incluyendo uveítis, neuritis óptica, ulceración reumatoide periférica, inflamación corneal periférica), osteoartritís, osteomielitis, inflamación faríngea, poliartritis, proctitis, psoriasis, lesión por radiación, sarcoidosis, neuropatía de células falcíformes, tromboflebitis superficial, síndrome de respuesta inflamatoria sistémica, tiroiditis, lupus eritematoso sistémico, enfermedad de injerto contra hospedero, lesión por quemadura aguda, síndrome de Beh?et y síndrome de Sjógren. En una modalidad más preferida, el anticuerpo anti-MAdCAM se administra a un sujeto con colitis.
Artículos de fabricación En otra modalidad de la invención, se provee un artículo de fabricación que comprende un contenedor, que contiene a la composición farmacéutica liquida que comprende por lo menos uno de los anticuerpos anti-MAdCAM monoclonales de la presente ¡nvención, en una composición que comprende un agente quelante solo o en combinación con otros excipientes farmacéuticamente aceptables, y provee opcionalmente instrucciones para su uso. Contenedores adecuados incluyen, por ejemplo, botellas, viales, bolsas y jeringas. El contenedor puede formarse de una variedad de materiales tales como vidrio o plástico. Un ejemplo de contenedor es un vial de vidrio de uso individual de 3 a 20 cm3. En forma alternativa, para una composición de dosis múltiples, el contenedor puede ser un vial de vidrio de 3 a 100 cm3. El contenedor contiene la composición, y la etiqueta en, o asociada con, el contenedor, puede indicar instrucciones de uso. El artículo de fabricación puede incluir además otros materiales deseables desde un punto de vista comercial y del usuario, incluyendo otros reguladores de pH, diluyentes, filtros, agujas, jeringas e inserciones de empaque con instrucciones de uso, contraindicaciones y/o listas de efectos secundarios potenciales. La presente ¡nvención provee también un equipo para preparar una composición líquida de un anticuerpo estabilizado, que comprende un primer contenedor que comprende el anticuerpo anti-MAdCAM monoclonal 7J 6.6 en solución, y un segundo contenedor que comprende una cantidad suficiente de un agente quelante solo o en combinación con otros excipientes en solución para estabilizar el anticuerpo. Los siguientes ejemplos describen modalidades de la ¡nvención.
Otras modalidades dentro del alcance de las reivindicaciones de la presente, serán evidentes para los expertos en la técnica después de considerar la especificación o la práctica de la invención como se describe en la presente. Se pretende que la especificación y los ejemplos sean considerados sólo como ejemplos, siendo indicados el alcance y espíritu de la invención por las reivindicaciones que siguen a los ejemplos. En los ejemplos, todos los porcentajes se dan sobre una base en peso, a menos que se indique de otra manera. El experto en la técnica apreciará que las cantidades en peso y/o las relaciones de peso a volumen citadas en los ejemplos, pueden ser convertidas a moles y/o molaridades, usando los pesos moleculares de los ingredientes citados reconocidos en la técnica. Las cantidades en peso ejemplificadas en la presente (por ejemplo, gramos), son para los volúmenes (por ejemplo, de soluciones de regulador de pH, composición de anticuerpo, etc.) citados. El experto en la técnica apreciará que las cantidades en peso pueden ajustarse proporcionalmente cuando se deseen diferentes volúmenes de la composición.
EJEMPLO 1 Generación de hibridomas que producen anticuerpos anti-MAdCAM Se prepararon anticuerpos de la invención, de acuerdo con el presente ejemplo. Refiérase al documento PCT/US2005/000370.
Preparación de inmunógeno primario Se prepararon dos inmunógenos para la inmunización de los ratones XenoMouse™: (i) una proteína de fusión MAdCAM-lgG-i Fc y (¡i) membranas celulares preparadas a partir de células transfectadas establemente con MAdCAM. (i) Proteína de fusión MAdCAM-lqG! Fc Construcción del vector de expresión Un fragmento de ADNc de EcoRI/BglII que codifica para el dominio tipo inmunoglobulina extracelular maduro de MAdCAM, fue separado de un clon de pINCY Incyte (3279276), y clonado en sitios EcoRI/BamHI del vector plG1 (Simmons, D. L. (1993), en Cellular Interactions in Development: A Practical Approach, ed. Hartley, D. A. (Oxford Univ. Press, Oxford), pp. 93-127)), para generar una fusión IgGi Fc en el marco de lectura. La inserción resultante fue separada con EcoRI/Notl y clonada en pCDNA3J + (Invitrogen). El ADNc de la proteina de fusión MAdCAM-lgGT Fc en el vector, fue confirmado por secuencia. La secuencia de aminoácidos de la proteína de fusión MAdCAM-lgd Fc, se muestra a continuación: Proteína de fusión MAdCAM-lgG-i Fc MDFGLALLLAGLLGLLLGQSLQVKPLQVEPPEPWA VALGAS RQLTCRLACADRGASVQWRGLDTSLGAVQSDTGRSVLTVRNASLSAAGT RVCVGSCGGRTFQHTVQLLVYAFPDQLTVSPAALVPGDPEVACTAHKVTP VDPNALSFSLLVGGQELEGAQALGPEVQEEEEEPQGDEDVLFRVTER RL PPLGTPVPPALYCQATMRLPGLELSHRQAIPVLHSPTSPEPPDTTSPESPDT TSPESPDTTSQEPPDTTSQEPPDTTSQEPPDTTSPEPPDKTSPEPAPQQGS THTPRSPGSTRTRRPEIQPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDT LMISRTPEVTCVWDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYR VVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPP SRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKATPPVLDSDGSFF LYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 5) Subrayado: péptido de señal En negritas: dominio extracelular de MAdCAM Purificación/expresión de la proteína recombinante Células CHO-DHFR fueron transfectadas con el vector pCDNA3J + que contiene ADNc de la proteína de fusión MAdCAM-lgd Fc y clones estables que expresan la proteína de fusión MAdCAM-lgG-i Fc seleccionados en medio de Iscove conteniendo 600 µg/mL de G418 y 100 ng/mL de metotrexato. Para la expresión de las proteínas, se sembró un biorreactor de fibra hueco con células CHO que expresan establemente MAdCAM-lgGi Fc en medio de Iscove conteniendo suero de bovino fetal a 10% de bajo contenido de IgG (Gibco), aminoácidos no esenciales (Gibco), glutamina 2 mM (Gibco), piruvato de sodio (Gibco), 100 µg/ml de G418 y 100 ng/mL de metotrexato, y usado para generar sobrenadante del medio concentrado. La proteína de fusión MAdCAM-lgGi Fc fue purificada a partir del sobrenadante de la cosecha mediante cromatografía de afinidad. En resumen, se aplicó sobrenadante a una columna HiTrap de proteína G Sepharose (5 mL, Pharmacia) (2 mL/min), se lavó con Tris 25 mM, pH 8, NaCI 150 mM (volumen de 5 columnas), y se eluyó con glicina 100 mM, pH 2.5 (1 mL/min), neutralizando inmediatamente las fracciones a pH 7.5 con Tris 1 M, pH 8. Las fracciones que contenían a la proteína de fusión MAdCAM-lgd Fc fueron identificadas mediante SDS-PAGE, agrupadas y aplicadas a una columna Sephacryl S100 (Pharmacia) preequilibrada con Bis Tris 35 mM, pH 6?5 y NaCI 150 mM. La filtración en gel se llevó a cabo a 0.35 mL/min, colectando un pico de proteína de fusión MAdCAM-lgd Fc en fracciones de aproximadamente 3 x 5 mL. Estas muestras se agruparon y se aplicaron a una columna Resource Q (6 mL, Pharmacia) preequilibrada en Bis Tris 35 mM, pH 6.5. La columna se lavó con el volumen de 5 columnas de Bis Tris 35 mM, pH 6.5, NaCI 150 mM (6 mL/min) y proteína de fusión MAdCAM-lgd Fc eluida en una fracción de 4 a 6 mL con Bis Tris 35 mM, pH 6.5 y NaCI 400 mM. En esta etapa, la proteína era 90% pura, y migraba como una banda individual a aproximadamente 68 kD por SDS-PAGE. Para su uso como un inmunógeno y todas las pruebas subsiguientes, el material se intercambió con regulador de pH en HEPES 25 mM, pH 7.5, EDTA 1 mM, DTT 1 mM, NaCI 100 mM y glicerol a 50%, y se almacenó como alícuotas a -80°C. (ii) Membranas celulares que expresan establemente MAdCAM Un fragmento Sacl/Notl que comprende los nucleótidos 645 a 1222 de la secuencia de MAdCAM publicada (Shyjan AM, et al., J Immunol., 156, 2851-7 (1996)), fue amplificado por PCR a partir de una colección de ADNc del colon, y clonado en los sitios Sacl/Notl del vector pIND-Hygro (Invitrogen). Un fragmento Sacl, que comprende la secuencia codificante 5' adicional, fue subclonado en esta construcción a partir de pCDNA3.1 MAdCAM-lgGi Fc, para generar el ADNc de MAdCAM de longitud completa. Un fragmento Kpnl/Notl que contiene al ADNc de MAdCAM, fue clonado entonces en sitios correspondientes en un vector pEF5FRTV5GWCAT (Invitrogen), y reemplazando la secuencia codificante CAT. La inserción de ADNc se verificó por secuencia, y se usó en transfecciones para generar clones individuales de expresión estable en células Flpln NIH 3T3 (Invitrogen) mediante tecnología de Flp recombinasa, de acuerdo a las instrucciones del fabricante. Se seleccionaron clones de expresión estable por su capacidad para sustentar la unión de una línea de células linfoblastoides B humanas a ß7+ JY (Chan BM, et al, J. Biol. Chem., 267: 8366-70 (1992)), esbozada más adelante. Clones estables de células CHO que expresan MAdCAM, se prepararon de la misma forma usando células CHO Flpln (Invitrogen). Células NIH-3T3 Flpln que expresan MAdCAM, fueron desarrolladas en medio de Eagle modificado de Dulbecco (Gibco) conteniendo L-glutamina 2 mM, suero de ternera donante a 10% (Gibco) y 200 µg/mL de higromicina B (Invitrogen), y expandidas en botellas giratorias. Células CHO Flpln que expresan MAdCAM, fueron desarrolladas en medio de Eagle modificado de Dulbecco/F12 de Ham (Gibco), conteniendo L-glutamina 2 mM, suero de ternera donante a 10% (Gibco) y 350 µg/mL de higromicina B (Invitrogen), y expandidas en botellas giratorias. Las células se cosecharon mediante el uso de una solución no enzimática de disociación de células (Sigma) y removiendo raspando, lavando en solución salina regulada en su pH con fosfato mediante centrifugación. Se prepararon membranas de células a partir de la pella de células mediante dos rondas de homogenización en polytron en Bis Tris 25 mM, pH 8, MgCI2 10 mM, aprotinina a 0.015% (p/v), 100 U/mL de bacitracina y centrifugación. La pella final se resuspendió en el mismo regulador de pH, y se distribuyó en alícuotas equivalentes a 50x106 células en tubos Eppendorf de pared gruesa, y se centrifugó a más de 100,000 g para generar pellas de membranas de células para la inmunización de ratones XenoMouse . El sobrenadante se decantó, y las membranas se almacenaron en tubos Eppendorf a -80°C hasta que se requirieran. La confirmación de la expresión de las proteínas en las membranas celulares se determinó mediante SDS-PAGE y Western blotting con un anticuerpo anti-péptido de conejo producido contra los residuos N-termínales de MAdCAM ([Cj-KPLQVEPPEP).
Inmunización y generación de hibridomas Ratones XENOMOUSE™ de ocho a diez semanas, fueron inmunizados intraperitonealmente o en los cojinetes de las patas traseras con la proteína de fusión MAdCAM-lgG-i Fc recombinante purificada (10 µg/dosis/ratón), o membranas celulares preparadas a partir de células MAdCAM-CHO o NIH 3T3 (10x106 células/dosis/ratón) de expresión estable. Esta dosis se repitió de 5 a 7 veces durante un período de tres a ocho semanas. Cuatro días antes de la fusión, los ratones recibieron una inyección final del dominio extracelular de MAdCAM de humano en PBS. Linfocitos de nodulos linfáticos y de bazo de ratones inmunizados, fueron fusionados con la línea de células P3-X63-Ag8.653 de mieloma no secretorio, y sujetos entonces a selección con HAT como se describió previamente (Galfre y Milstein, Methods Enzymol. 73: 3-46 (1981 )). Un panel de hibridomas que secretan lgG2? de humano específica de MAdCAM, fue recuperado y subclonado. El siguiente hibridoma que produce anticuerpos anti-MAdCAM designados como sigue, fue depositado en The European Collection of Cell Cultures (ECACC), H.P.A. en CAMR, Portón Down, Salisbury, Wiltshire SP4 OJG el 9 de septiembre de 2003: Hibridoma 7.16.6, No. de depósito 03090909.
EJEMPLO 2 Composiciones de anticuerpo Las siguientes composiciones son referidas en los ejemplos siguientes: CUADRO 2 CUADRO 2 (CONTINUACIÓN) CUADRO 2 (CONTINUACIÓN) > CUADRO 2 (CONTINUACIÓN) w CUADRO 2 (CONTINUACIÓN) EJEMPLO 3 Se llevó a cabo un estudio para evaluar el efecto de varios reguladores de pH diferentes sobre la agregación del anticuerpo anti-MAdCAM 7.16.6.
Preparación de las soluciones de regulador de pH Las soluciones de regulador de pH se prepararon disolviendo primero una cantidad de la especie de regulador de pH en agua (aproximadamente 90% del objetivo). El pH de cada solución de regulador de pH se ajustó entonces a 5.5 mediante la adición de una cantidad suficiente de una solución de ácido o base. Después del ajuste del pH, se añadió una cantidad adicional de agua para proveer una concentración final del regulador de pH de 20 mM. Se seleccionó la concentración de regulador de pH de 20 mM para asegurar una estabilidad de pH razonable al pH seleccionado de 5.5. La solución de regulador de pH se filtró entonces a través de un filtro de esterilización (tamaño de poro de 0.22 mieras) en un receptáculo esterilizado para uso subsiguiente.
Preparación de las composiciones de anticuerpo Las composiciones de anticuerpo se prepararon como sigue. Se obtuvo una solución global de anticuerpos como 10.5 mg/ml en regulador de pH de acetato de sodio 20 mM, pH 5.5 ± cloruro de sodio 140 mM. Los intercambios de regulador de pH de esta solución global en las soluciones de la composición se llevaron a cabo por centrifugación a 4500 xg, usando una membrana de limitación de peso molecular (por ejemplo, 30 kD). Se hicieron intercambios de aproximadamente 8 volúmenes, y la solución de anticuerpos final se preparó a una concentración de aproximadamente 10 mg/ml. Se determinaron las concentraciones de anticuerpos mediante el método de espectrometría de luz visible-ultravioleta (UV-Vis), usando un coeficiente de extinción de 1.56 (mg/ml)"1 cm'1 a 280 nm. Las composiciones con todos los ingredientes se esterilizaron entonces mediante filtración a través de un filtro de membrana estéril de 0.22 mieras. Las composiciones filtradas se llenaron entonces en viales lavados y tratados con autoclave, los cuales se cerraron con tapones revestidos de Daikyo 777-1 Flurotec®, se sellaron doblados hacia dentro y se pusieron en cámaras de estabilidad. Específicamente, se prepararon tres composiciones líquidas que comprendían anticuerpo anti-MAdCAM 7J6.6 y reguladas en su pH con acetato, EDTA, o una combinación de acetato, citrato y fosfato. Las composiciones se almacenaron entonces por 6 semanas a 40°C, y se hicieron mediciones de agregación.
CUADRO 3 * El incremento relativo en el por ciento de agregación, se calcula mediante la ecuación: [{(% de agregación a 6 semanas/40°C) - (% de agregación al inicio)}*100]/[% de agregación al inicio].
Análisis de la agregación Las composiciones de anticuerpo se almacenaron a 40°C. A seis semanas, cada composición se analizó para agregación usando cromatografía de exclusión por tamaño (SEC). La cromatografía de exclusión por tamaño se llevó a cabo usando una columna G3000SWXL-G2000SWXL de gel TSK, fosfato de sodio 0.2 M, pH 7, fase móvil, una magnitud de flujo de 0.7 mL/min y detección UV a 214 nm. Los niveles de agregación se calcularon integrando las áreas bajo los picos del cromatograma para cada composición, y reportando las áreas integradas bajo los picos de la especie de alto peso molecular como un porcentaje de área pico total. Como se muestra en el cuadro 3, la composición de EDTA regulada en su pH mostró el nivel de agregación más bajo y el incremento relativo en agregación más bajo.
EJEMPLO 4 Se llevó a cabo un estudio para evaluar el efecto de la concentración de regulador de pH y la presencia/ausencia de otros excipientes sobre la fragmentación del anticuerpo antí-MAdCAM 7.16.6. Las composiciones mostradas en el cuadro 4 se prepararon mediante los métodos descritos en el ejemplo 2, y se evaluaron mediante los métodos del ejemplo 3.
CUADRO 4 Como se muestra en el cuadro 4, la presencia de EDTA en las composiciones líquidas resulta en menos formación de LMM en las composiciones que no contienen EDTA.
EJEMPLO 5 Se llevó a cabo un estudio para evaluar el efecto de EDTA, en composiciones de anticuerpo anti-MAdCAM líquidas, sobre la agregación y fragmentación. Las soluciones de regulador de pH se prepararon mediante los métodos descritos en el ejemplo 3. Las composiciones de anticuerpo se prepararon como sigue. Una solución global de anticuerpo se obtuvo como 9.6 mg/ml en regulador de pH de acetato de sodio 20 mM, pH 5.5. Intercambios de regulador de pH de esta solución global en las soluciones de la composición se llevaron a cabo mediante centrifugación a 5000 xg usando una membrana de limitación de peso molecular (por ejemplo, 30 kD). Se hicieron intercambios de aproximadamente 8 volúmenes, y la solución de anticuerpo final se preparó a aproximadamente 8 mg/ml o aproximadamente 30 mg/ml de concentración de proteinas. Se determinaron las concentraciones de anticuerpos mediante el método de espectrometría de luz visible-ultravioleta (UV-Vis), usando un coeficiente de extinción de 1.56 (mg/ml)"1 cm"1 a 280 nm. Una solución concentrada de polisorbato 80 (PS80) (típicamente 20 mg/ml) se preparó mediante dilución y disolución de PS80 usando el regulador de pH adecuado. El concentrado de PS80 se añadió entonces a la solución de anticuerpos para obtener las composiciones finales descritas. Las composiciones con todos los ingredientes se esterilizaron entonces mediante filtración a través de un filtro de membrana estéril de 0.22 mieras. Las composiciones filtradas se llenaron entonces en viales lavados tratados con autoclave. Los viales se cerraron con tapones revestidos de Daikyo 777-1 Flurotec®, se sellaron doblados hacia dentro y se pusieron en cámaras de estabilidad. Las composiciones del cuadro 5 se almacenaron a 40°C por 26 semanas, y se evaluaron mediante el método de SEC descrito en el ejemplo 3.
CUADRO 5 ro Las composiciones del cuadro 6 se almacenaron a 25°C por 26 semanas, y se evaluaron mediante el método de SEC descrito en el ejemplo 3.
CUADRO 6 ro Este ejemplo muestra que la presencia de EDTA en la composición líquida, resulta en menos agregación y menos formación de especies de LMM.
EJEMPLO 6 Se llevó a cabo un estudio para comparar el efecto de reguladores de pH de acetato e histidina sobre la agregación y fragmentación del anticuerpo anti-MAdCAM 7.16.6. Las composiciones mostradas en los cuadros 7 y 8 se prepararon mediante los métodos descritos en el ejemplo 5. Las composiciones del cuadro 7 se almacenaron a 40°C por 26 semanas, y se analizaron mediante los métodos de SEC descritos en el ejemplo 3.
CUADRO 7 n Las composiciones del cuadro 8 se almacenaron a 25°C por 52 semanas, y se analizaron mediante los métodos de SEC descritos en el ejemplo 3.
CUADRO 8 -NI Este ejemplo muestra que las composiciones que usan histidina como un regulador de pH, tienen menos formación de agregados que las composiciones que usan acetato al mismo pH.
EJEMPLO 7 Se llevó a cabo un estudio para evaluar la propensión a la agregación del anticuerpo anti-MAdCAM 7.16.6 en composiciones a varias concentraciones de anticuerpo. En este estudio, las composiciones del cuadro 9 se prepararon mediante los métodos descritos en el ejemplo 5. Las composiciones del cuadro 9 se almacenaron a 5°C, 25°C o 40°C por 26 semanas, y se analizaron entonces mediante los métodos de SEC descritos en el ejemplo 3.
CUADRO 9 NJ CD Como se muestra en el cuadro 9, la propensión a la agregación se incrementa con las concentraciones crecientes de anticuerpo. Sin embargo, después de almacenamiento por 26 semanas, el efecto de estabilización de las composiciones mostradas en el ejemplo 9 se demuestra mediante los datos de condición acelerada (almacenamiento a 25°C y 40°C) que muestra niveles relativamente bajos de agregación con composiciones de alta concentración.
EJEMPLO 8 Se llevó a cabo un estudio para evaluar la propensión a la agregación del anticuerpo anti-MAdCAM 7.16.6 en composiciones con varios niveles de EDTA. Las composiciones se prepararon como se describió anteriormente en el ejemplo 5, salvo que la concentración final de anticuerpo se ajustó a 80±10 mg/ml. Las composiciones del cuadro 10 se almacenaron por 26 semanas a 5°C o 26°C, y se analizaron entonces mediante SEC como se describió anteriormente.
CUADRO 10 Como se muestra, existe una mejora a 0.05 mg/ml y OJO mg/mL respecto a 0.02 mg/mL de EDTA y, en cada caso, la agregación en presencia de EDTA es menor después de almacenamiento a 5°C por 26 semanas.
EJEMPLO 9 Se llevó a cabo un estudio para evaluar la estabilidad de composiciones de anticuerpo anti-MAdCAM 7.16.6 con varios niveles de polisorbato-80. Las composiciones se prepararon como se describió anteriormente, pero con la concentración final de anticuerpo ajustada a 80± mg/ml. Las composiciones del cuadro 11 se almacenaron por 26 semanas a 25°C o 40°C, y se analizaron entonces mediante SEC como se describió anteriormente.
CUADRO 11 Las composiciones del cuadro 12 se sometieron a tensión por agitación aplicada por agitación orbital a 300 rpm por 24 horas, a temperatura ambiente. Las composiciones se prepararon como se describió anteriormente, pero con la concentración final de anticuerpo ajustada a 85±mg/ml.
CUADRO 12 Aunque el estudio de estabilidad en almacenamiento descrito anteriormente muestra un ligero incremento en los niveles de agregación soluble con niveles crecientes de polisorbato-80, el estudio de tensión por agitación indica que un nivel de polisorbato-80 de 0.4 mg/mL provee protección adecuada ante la tensión por agitación.
EJEMPLO 10 Se llevó a cabo un estudio para evaluar la propensión a la agregación del anticuerpo antí-MAdCAM 7.16.6 en composiciones con varios reguladores de pH. Las composiciones se prepararon como se describió anteriormente, y se ajustaron a una concentración final de anticuerpo de 80±10 mg/ml. Las composiciones del cuadro 13 se almacenaron a 25°C o 40°C por 26 semanas.
CUADRO 13 El nivel de agregación fue más bajo en la composición con regulador de pH de histidina EJEMPLO 11 Se llevó a cabo un estudio para evaluar la propensión a la agregación del anticuerpo anti-MAdCAM 7 16 6 en composiciones con varios azúcares y políoles. Las composiciones se prepararon como se describió anteriormente, y se ajustaron a una concentración final de anticuerpo de 80±10 mg/ml. Las composiciones del cuadro 14 se almacenaron a 40°C por 26 semanas.
CUADRO 14 El nivel de agregación fue menor con la composición que contiene trehalosa EJEMPLO 12 Se llevó a cabo un estudio para evaluar la propensión a la agregación del anticuerpo anti-MAdCAM 7 16 6 en composiciones con vanos agentes tensioactivos y PEG Las composiciones se prepararon como se describió anteriormente, y se ajustaron a una concentración final de anticuerpo de 80±10 mg/ml La concentración final de agente tensioactivo de PEG en las composiciones de anticuerpo, se logro mediante la adición de una cantidad adecuada de soluciones de reserva de concentrado de agente tensioactivo o PEG Las composiciones del cuadro 15 se almacenaron a 40°C por 26 semanas CUADRO 15 Las composiciones que contienen PS80 y poloxámero 407, funcionaron marginalmente mejor que los otros agentes tensioactivos y anfífilos.
EJEMPL0 13 Se llevó a cabo un estudio para evaluar la oxidación de Met256 en composiciones con trehalosa o sacarosa. Las composiciones se prepararon como se describió anteriormente, y se ajustaron a una concentración final de anticuerpo de 80±10 mg/ml. Las composiciones del cuadro 16 se almacenaron a 5°C o 40°C por 26 semanas. Se midió la oxidación de metionina digiriendo enzimáticamente la proteína usando lisil endoproteinasa, y los fragmentos de péptido resultantes se separaron mediante CLAR de fase invertida con detección de absorbancia a 214 nm. Se monitoreó el fragmento de péptidos que contenía metíonina o su forma oxidada. Se calculó el porcentaje de oxidación mediante el área pico de metionina oxidada respecto al de metionina precursora.
CUADRO 16 Las composiciones que contienen trehalosa muestran menor propensión a la oxidación de metionina, respecto a las que contienen sacarosa EJEMPLO 14 Se llevó a cabo un estudio para evaluar la función de estabilidad química de composiciones de alta concentración de anticuerpos. Las composiciones de los cuadros 17 y 18 se prepararon como se describió anteriormente, y se ajustaron a una concentración final de anticuerpo de 80±10 mg/ml Las composiciones del cuadro 17 se almacenaron a 5°C por 26 semanas. Se evaluó la estabilidad química mediante ¡CE. Se llevaron a cabo mediciones preparando la mezcla de proteínas con marcadores de pl, metilcelulosa y farmalitos, a una concentración final de proteínas de aproximadamente 0.22 µg/µL. La prueba de electroforesis se llevó a cabo con tiempo de enfoque de 6 minutos a 3000 voltios y sonda de absorbancia a 280 nm Se determinó el porcentaje relativo de vanas especies cargadas mediante su área respectiva bajo el pico CUADRO 17 Las composiciones del cuadro 17 muestran buena estabilidad química, pero ningún cambio significante en las especies principales, así como en las especies acidas totales o especies básicas totales. Las composiciones del cuadro 18 se almacenaron a 5°C por 26 semanas, y se pusieron a prueba mediante SDS-PAGE reducida para determinar su pureza Se prepararon geles de SDS-PAGE usando gel de Bis-Tps a 4 a 12% de Nu-PAGE, y colorante azul coloidal (azul de Coomassie) Para los geles reducidos, se logró la reducción mediante agente reductor de Nu-PAGE El por ciento de pureza en los geles reducidos se estimó densitométpcamente mediante la expresión % de pureza = (% de cadena pesada + % de cadena ligera) CUADRO 18 Las composiciones del cuadro 18 no muestran cambio significante en pureza después de almacenamiento por 26 semanas a 5°C, indicando buena estabilidad química.
EJEMPLO 15 Se llevó a cabo un estudio para evaluar el desempeño de composiciones de alta concentración, contra tensión por congelación-descongelación Las composiciones del cuadro 19 se prepararon como se describió anteriormente, y se ajustaron a una concentración final de anticuerpos de 50±10 mg/ml Las composiciones del cuadro 19 se sometieron a tres ciclos de congelación-descongelación a -70°C/5°C o -20°C/5°C. Los estudios se llevaron a cabo en viales de vidrio de 2 ml con llenado a 1 ml. Se llevaron a cabo mediciones de SE-CLAR usando fosfato de sodio a 0.2 M, pH 7, fase móvil, columnas G3000SWXL de gel TSK, a una magnitud de flujo de 0.7 ml/mín, sonda a 214 nm. Se determinó la cantidad de agregados sumando los picos relacionados con el anticuerpo que se eluyeron antes del monómero de anticuerpo CUADRO 19 Las composiciones del cuadro 19 no muestran incremento en agregación después de 3 ciclos de congelación-descongelación a -70°C/5°C o -20°C/5°C Las composiciones del cuadro 20 se prepararon como describió anteriormente, y se ajustaron a una concentración final de anticuerpos de 75±15 mg/mL. Las composiciones del cuadro 20 se sometieron a cuatro ciclos de congelación-descongelación a -20°C/5°C. Estos estudios de congelación-descongelación se llevaron a cabo en viales de vidrio de 10 ml con llenado de 10 ml. Se llevaron a cabo mediciones de SEC como se indicó anteriormente en este ejemplo.
CUADRO 20 Las composiciones del cuadro 20 no muestran incremento en agregación después de cuatro ciclos de congelación-descongelación a -20°C/5°C.
EJEMPLO 16 Se llevó a cabo un estudio para evaluar la estabilidad de una composición de alta concentración durante almacenamiento congelada. La composición del cuadro 21 se preparó como se describió anteriormente, y se ajustó la concentración final de anticuerpos a aproximadamente 75 mg/ml. La composición del cuadro 21 se almacenó a -20°C por 13 semanas, y se evaluó la agregación como se describió en el ejemplo 15.
CUADRO 21 La composición de alta concentración (75 mg/ml de anficuerpo), no muestra incremento en agregación después de 13 semanas de almacenamiento a -20°C.
EJEMPLO 17 Se llevó a cabo un estudio para evaluar la viscosidad de una composición de alta concentración. La composición del cuadro 22 se preparó como se describió anteriormente, y la concentración final de anticuerpos se ajustó a aproximadamente 75 mg/ml. Se llevaron a cabo mediciones de viscosidad, aplicando una velocidad de esfuerzo cortante promedio de 300s"1 a la composición puesta sobre la placa de un reómetro.
La composición muestra una viscosidad adecuada para administración subcutánea.
Secuencias Secuencia de señal: subrayada SEQ ID NO. 1 Secuencia de nucleótidos de la cadena pesada de 7J6.6 1 atggactgga cctggagcat ccttttcttq qtqqcaqcaq caacaggtgc 51 ccactccCAG GTTCAGCTGG TGCAGTCTGG AGCTGAGGTG AAGAAGCCTG 101 GGGCCTCAGT GAAGGTCTCC TGCAAGGCTT CTGGTTACAC CTTTACCAGC 151 TATGGTATCA ACTGGGTGCG ACAGGCCCCT GGACAAGGGC TTGAGTGGAT 201 GGGATGGATC AGCGTTTACA GTGGTAACAC AAACTATGCA CAGAAGGTCC 251 AGGGCAGAGT CACCATGACC GCAGACACAT CCACGAGCAC AGCCTACATG 301 GACCTGAGGA GCCTGAGATC TGACGACACG GCCGTGTATT ACTGTGCGAG 351 AGAGGGTAGC AGCTCGTCCG GAGACTACTA TTACGGTATG GACGTCTGGG 401 GCCAAGGGAC CACGGTCACC GTCTCCTCAG CCTCCACCAA GGGCCCATCG 451 GTCTTCCCCC TGGCGCCCTG CTCCAGGAGC ACCTCCGAGA GCACAGCGGC 501 CCTGGGCTGC CTGGTCAAGG ACTACTTCCC CGAACCGGTG ACGGTGTCGT 551 GGAACTCAGG CGCTCTGACC AGCGGCGTGC ACACCTTCCC AGCTGTCCTA 601 CAGTCCTCAG GACTCTACTC CCTCAGCAGC GTGGTGACCG TGCCCTCCAG 651 CAACTTCGGC ACCCAGACCT ACACCTGCAA CGTAGATCAC AAGCCCAGCA 701 ACACCAAGGT GGACAAGACA GTTGAGCGCA AATGTTGTGT CGAGTGCCCA 751 CCGTGCCCAG CACCACCTGT GGCAGGACCG TCAGTCTTCC TCTTCCCCCC 801 AAAACCCAAG GACACCCTCA TGATCTCCCG GACCCCTGAG GTCACGTGCG 851 TGGTGGTGGA CGTGAGCCAC GAAGACCCCG AGGTCCAGTT CAACTGGTAC 901 GTGGACGGCG TGGAGGTGCA TAATGCCAAG ACAAAGCCAC GGGAGGAGCA 951 GTTCAACAGC ACGTTCCGTG TGGTCAGCGT CCTCACCGTT GTGCACCAGG 1001 ACTGGCTGAA CGGCAAGGAG TACAAGTGCA AGGTCTCCAA CAAAGGCCTC 1051 CCAGCCCCCA TCGAGAAAAC CATCTCCAAA ACCAAAGGGC AGCCCCGAGA 1101 ACCACAGGTG TACACCCTGC CCCCATCCCG GGAGGAGATG ACCAAGAACC 1151 AGGTCAGCCT GACCTGCCTG GTCAAAGGCT TCTACCCCAG CGACATCGCC 1201 GTGGAGTGGG AGAGCAATGG GCAGCCGGAG AACAACTACA AGACCACACC 1251 TCCCATGCTG GACTCCGACG GCTCCTTCTT CCTCTACAGC AAGCTCACCG 1301 TGGACAAGAG CAGGTGGCAG CAGGGGAACG TCTTCTCATG CTCCGTGATG 1351 CATGAGGCTC TGCACAACCA CTACACGCAG AAGAGCCTCT CCCTGTCTCC 1401 GGGTAAATGA SEQ ID NO. 2 Secuencia de proteínas de la cadena pesada predicha de 7J 6.6 1 mdwtwsilfl vaaatqahsQ VQLVQSGAEV KKPGASVKVS CKASGYTFTS 51 YGINWVRQAP GQGLEWMGWI SVYSGNTNYA QKVQGRVTMT ADTSTSTAYM 101 DLRSLRSDDT AVYYCAREGS SSSGDYYYGM DVWGQGTTVT VSSASTKGPS 151 VFPLAPCSRS TSESTAALGC LVKDYFPEPV TVSWNSGALT SGVHTFPAVL 201 QSSGLYSLSS VVTVPSSNFG TQTYTCNVDH KPSNTKVDKT VERKCCVECP 251 PCPAPPVAGP SVFLFPPKPK DTLMISRTPE VTCWVDVSH EDPEVQFNWY 301 VDGVEVHNAK TKPREEQFNS TFRVVSVLTV VHQDWLNGKE YKCKVSNKGL 351 PAPIEKTISK TKGQPREPQV YTLPPSREEM TKNQVSLTCL VKGFYPSDIA 401 VEWESNGQPE NNYKTTPPML DSDGSFFLYS KLTVDKSRWQ QGNVFSCSVM 451 HEALHNHYTQ KSLSLSPGK SEQ ID NO. 3 Secuencia de nucleótidos de la cadena ligera kappa de 7J6.6 1 atqaqqctcc ctqctcaqct cctqgqqctq ctaatqctct ggatacctqg 51 atccaqtqca GATATTGTGA TGACCCAGAC TCCACTCTCT CTGTCCGTCA 101 CCCCTGGACA GCCGGCCTCC ATCTCCTGCA AGTCTAGTCA GAGCCTCCTG 151 CATACTGATG GAACGACCTA TTTGTATTGG TACCTGCAGA AGCCAGGCCA 201 GCCTCCACAG CTCCTGATCT ATGAAGTTTC CAACCGGTTC TCTGGAGTGC 251 CAGATAGGTT CAGTGGCAGC GGGTCAGGGA CAGATTTCAC ACTGAAAATC 301 AGCCGGGTGG AGGCTGAGGA TGTTGGGATT TATTACTGCA TGCAAAATAT 351 ACAGCTTCCG TGGACGTTCG GCCAAGGGAC CAAGGTGGAA ATCAAACGAA 401 CTGTGGCTGC ACCATCTGTC TTCATCTTCC CGCCATCTGA TGAGCAGTTG 451 AAATCTGGAA CTGCCTCTGT TGTGTGCCTG CTGAATAACT TCTATCCCAG 501 AGAGGCCAAA GTACAGTGGA AGGTGGATAA CGCCCTCCAA TCGGGTAACT 551 CCCAGGAGAG TGTCACAGAG CAGGACAGCA AGGACAGCAC CTACAGCCTC 601 AGCAGCACCC TGACGCTGAG CAAAGCAGAC TACGAGAAAC ACAAAGTCTA 651 CGCCTGCGAA GTCACCCATC AGGGCCTGAG CTCGCCCGTC ACAAAGAGCT 701 TCAACAGGGG AGAGTGTTAG TGA SEQ ID NO. 4 Secuencia de proteínas de la cadena ligera kappa de 7J 6.6 1 mrlpaqllql Imlwipqssa DIVMTQTPLS LSVTPGQPAS ISCKSSQSLL 51 HTDGTTYLYW YLQKPGQPPQ LLIYEVSNRF SGVPDRFSGS GSGTDFTLKI 101 SRVEAEDVGI YYCMQNIQLP TFGQGTKVE IKRTVAAPSV FIFPPSDEQL 151 KSGTASWCL LNNFYPREAK VQWKVDNALQ SGNSQESVTE QDSKDSTYSL 201 SSTLTLSKAD YEKHKVYACE VTHQGLSSPV TKSFNRGEC SEQ ID NO. 5 Proteína de fusión MadCAM-lgd Fc MDFGLALLLAGLLGLLLGQSLQVKPLQVEPPEPWAVALGASRQLTC RLACADRGASVQWRGLDTSLGAVQSDTGRSVLTVRNASLSAAGTRVCVGS CGGRTFQHTVQLLVYAFPDQLTVSPAALVPGDPEVACTAHKVTPVDPNALS FSLLVGGQELEGAQALGPEVQEEEEEPQGDEDVLFRVTERWRLPPLGTPV PPALYCQATMRLPGLELSHRQAIPVLHSPTSPEPPDTTSPESPDTTSPESPD TTSQEPPDTTSQEPPDTTSQEPPDTTSPEPPDKTSPEPAPQQGSTHTPRSP GSTRTRRPEIQPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTP EVTCWVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRWSVLT VLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELT KNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKATPPVLDSDGSFFLYSKL TVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

Claims (24)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES
1.- Una composición que comprende: por lo menos un agente quelante; y por lo menos un anticuerpo que comprende: una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 90% idéntica a una secuencia de aminoácidos de cadena pesada mostrada en SEQ ID NO: 2, y una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 90% idéntica a una secuencia de aminoácidos de cadena ligera mostrada en SEQ ID NO: 4; en donde el anticuerpo se une a MAdCAM de humano.
2.- La composición de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque la composición es una composición líquida, y el anticuerpo es un anticuerpo de lgG2 de humano, y el anticuerpo no comprende una secuencia de señal.
3.- La composición de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque el anticuerpo comprende una secuencia de aminoácidos de cadena pesada con por lo menos 99% de identidad de secuencia con SEQ ID NO: 2, y una secuencia de aminoácidos de cadena ligera con por lo menos 99% de identidad de secuencia con SEQ ID NO:
4. 4.- La composición de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque el anticuerpo comprende una secuencia de aminoácidos de cadena pesada que comprende SEQ ID NO: 2, y una secuencia de aminoácidos de cadena ligera que comprende SEQ ID NO: 4.
5.- La composición de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque la composición comprende por lo menos un agente quelante que es EDTA.
6.- La composición de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque la composición comprende además un regulador de pH.
7.- La composición de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque la composición comprende por lo menos un agente quelante que es EDTA, y comprende además histidina.
8.- La composición de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque la composición comprende además un regulador de pH y un agente tensioactivo.
9.- La composición de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque la composición comprende además un regulador de pH, un agente tensioactivo y un agente de tonicidad.
10.- La composición de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque la composición comprende por lo menos un agente quelante que es EDTA, y comprende además un regulador de pH, un agente tensioactivo y un agente de tonicidad.
11.- La composición de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque la composición comprende por lo menos un agente quelante que es EDTA, y comprende además histidina, un agente tensioactivo y un agente de tonicidad.
12.- La composición de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque la composición comprende por lo menos un agente quelante que es EDTA, y comprende además histidina, polisorbato 80 y un agente de tonicidad.
13.- La composición de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque la composición comprende por lo menos un agente quelante que es EDTA, y comprende además histidina, polisorbato 80 y trehalosa.
14.- La composición de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque la composición comprende: de aproximadamente 1 mg/ml a aproximadamente 200 mg/ml de anticuerpo; de aproximadamente 0.01 milimolar a aproximadamente 5.0 mílimolar de un agente quelante; y de aproximadamente 1 mM a aproximadamente 100 mM de histidina.
15.- La composición de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque la composición comprende: de aproximadamente 1 mg/ml a aproximadamente 200 mg/ml de anticuerpo; de aproximadamente 0.01 milimolar a aproximadamente 5.0 mílimolar de EDTA; y de aproximadamente 1 mM a aproximadamente 100 mM de hístidina.
16.- La composición de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque la composición comprende: de aproximadamente 1 mg/ml a aproximadamente 200 mg/ml de anticuerpo; de aproximadamente 0.01 milimolar a aproximadamente 5.0 milimolar de un agente quelante; de aproximadamente 1 mM a aproximadamente 100 mM de un regulador de pH; de aproximadamente 0.005 milimolar a aproximadamente 10 milimolar de un agente tensioactivo; y de aproximadamente 100 milimolar a aproximadamente 400 milimolar de un agente de tonicidad.
17.- La composición de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque la composición comprende: de aproximadamente 1 mg/ml a aproximadamente 200 mg/ml de anticuerpo; de aproximadamente 0.01 milimolar a aproximadamente 5.0 milimolar de EDTA; de aproximadamente 1 mM a aproximadamente 100 mM de histídina; de aproximadamente 0.005 milimolar a aproximadamente 10 milimolar de polisorbato 80; y de aproximadamente 100 milimolar a aproximadamente 400 milimolar de un agente de tonicidad.
18.- La composición de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque la composición comprende: de aproximadamente 1 mg/ml a aproximadamente 200 mg/ml de anticuerpo; de aproximadamente 0.01 milimolar a aproximadamente 5.0 milimolar de EDTA; de aproximadamente 1 mM a aproximadamente 100 mM de histidína; de aproximadamente 0.005 milimolar a aproximadamente 10 milimolar de polisorbato 80; y de aproximadamente 100 milimolar a aproximadamente 400 milimolar de trehalosa.
19.- La composición de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque la composición comprende: de aproximadamente OJ mg/ml a aproximadamente 100 mg/ml de anticuerpo; de aproximadamente 0.001 mg/ml a aproximadamente 1.0 mg/ml de EDTA; de aproximadamente 1 mM a aproximadamente 50 mM de histidina; de aproximadamente 0.01 mg/ml a aproximadamente 10 mg/ml de polisorbato 80; y de aproximadamente 10 mg/ml a aproximadamente 100 mg/ml de trehalosa.
20.- Una composición estable que comprende por lo menos un anticuerpo anti-MAdCAM monoclonal y un agente quelante, caracterizada porque la composición comprende una cantidad del agente quelante suficiente para estabilizar la composición cuando se mantiene a una temperatura de aproximadamente 40°C por un período de por lo menos aproximadamente 26 semanas.
21.- Una composición farmacéutica líquida que comprende por lo menos un anticuerpo anti-MAdCAM monoclonal y un agente quelante farmacéuticamente aceptable, caracterizada porque la concentración molar del anticuerpo varía de aproximadamente 0.0006 milímolar a aproximadamente 1.35 milimolar, y la concentración molar del agente quelante varía de aproximadamente 0.003 milímolar a aproximadamente 50 milimolar, y en donde la relación molar de anticuerpo a agente quelante varía de aproximadamente 0.00001 a aproximadamente 450.
22.- Una composición farmacéutica líquida, que comprende: por lo menos un anticuerpo que comprende una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 95% idéntica a una secuencia de aminoácidos de cadena pesada mostrada en SEQ ID NO: 2, y que comprende además una secuencia de aminoácidos que es por lo menos 95% idéntica a una secuencia de aminoácidos de cadena ligera mostrada en SEQ ID NO: 4, en donde el anticuerpo se une a MAdCAM de humano; y un excipiente farmacéuticamente aceptable, en donde la composición contiene una concentración de anticuerpo que es de por lo menos aproximadamente 50 mg/ml.
23.- Un procedimiento para preparar una composición farmacéutica líquida, que comprende mezclar por lo menos un anticuerpo anti-MAdCAM que tiene la secuencia de aminoácidos de cadena pesada de SEQ ID NO: 2 y la secuencia de aminoácidos de cadena ligera de SEQ ID NO: 4, en solución, con por lo menos un agente quelante.
24.- El uso de una composición farmacéutica líquida que comprende: a) por lo menos un anticuerpo anti-MAdCAM; y b) un agente quelante farmacéuticamente aceptable, en la fabricación de un medicamento útil para el tratamiento de una enfermedad inflamatoria en un sujeto.
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