CN104357394B - 一种自体外周血淋巴细胞dc‑cik的培养方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种自体外周血淋巴细胞DC‑CIK的培养方法，包括如下步骤：（1）外周血单个核细胞的分离；（2）DC细胞的分离培养；（3）CIK细胞的诱导培养；（4）DC和CIK的共培养制备DC‑CIK细胞，并添加CTLA‑4mAb 100ng/mL、PD‑1mAb 100ng/mL；(5)离心收集培养的DC‑CIK细胞。本发明通过向无血清培养基中添加多种单抗及细胞因子，提高效应细胞群活化效率和扩增效率。特别是体外加载CTLA4 抗体、PD‑1抗体以覆盖所有CIK细胞表面的CTLA4、PD‑1分子,使其不能和DC上相应受体结合，有效的降低了T调节细胞的含量，进一步提高CIK细胞对肿瘤的杀伤作用。
Description
技术领域
本发明属于免疫细胞体外培养技术领域，特别涉及一种自体外周血淋巴细胞DC-CIK的培养方法。
背景技术
过继性免疫疗法是将致敏淋巴细胞（具有特异免疫力）或其产物输给细胞免疫功能低下者（如肿瘤病人），使其获得抗肿瘤免疫力，它是用来治疗肿瘤的一种免疫疗法。
树突状细胞（Dendritic cells）是体内功能最强的抗原递呈细胞（Antigenpresenting cell, APC）,是唯一能够刺激初始T淋巴细胞成熟的APC，能够将抗原递呈给CD8+T淋巴细胞，从而发挥T淋巴细胞的杀伤作用。
细胞因子诱导的杀伤细胞（cytokine induced killer cells, CIK）是将人外周血单个核细胞在体外用多种细胞因子（如抗CD3单克隆抗体、IL-2和IFN-γ等）共同培养一段时间后获得的一群异质细胞。由于该种细胞同时表达CD3+和CD56+两种膜蛋白分子,故又被称为NK细胞样T淋巴细胞,兼具有T淋巴细胞强大的抗瘤活性和NK细胞的非MHC限制性杀瘤优点。
DC-CIK细胞是指将肿瘤抗原诱导成熟的DC细胞与CIK细胞共培养，既可以促进DC细胞的成熟，又能增强CIK细胞的细胞毒T细胞的含量，从而发挥对肿瘤特异性的杀伤作用，达到清除肿瘤微小病灶的目的。
肿瘤组织的免疫逃逸性就是指肿瘤细胞通过多种机制逃避机体免疫系统识别和攻击，从而得以在体内生存和增殖的现象。机体免疫系统具有免疫监视功能，当体内出现恶变细胞时，免疫系统能够识别并通过免疫机制特异地清除这些“非己”细胞，抵御肿瘤的发生发展。然而，恶变细胞在某些情况下能通过多种机制逃避机体的免疫监视，在体内迅速增殖，形成肿瘤。也就是说：一方面，机体可通过天然和获得性免疫抵抗肿瘤的发生；另一方面，肿瘤细胞可通过多种机制逃避机体免疫的识别和攻击。其分子机理在于免疫T细胞包括CIK细胞，在其细胞表面表达着一类受体，它们的作用是一旦与其相应的配体结合，就能产生一系列信号来抑制或削弱T细胞的活力。生物体通过这一机制来控制T细胞的杀伤作用，以避免它们攻击自身细胞，产生自身免疫反应。而CTLA4、PD-1分子就是这类受体。在免疫T细胞被激活、扩增的各个步骤中，一旦遭遇到表达着辅助激活配体（B7-1、CD80和CD86）的树突细胞或肿瘤细胞时，激活的T细胞通过提高CTLA-4、PD-1分子的表达，其中CTLA-4分子使之替代CD28与B7-1结合，而PD-1分子与PD-L分子接合，从而提高了T调节细胞的负调节功能，降低T细胞的杀伤功能。
目前现有的DC-CIK技术的不足：在肿瘤的微环境中CIK细胞表面CTLA4和PD-1的表达量升高，与DC上的相应配体接合，从而介导免疫负调控机制，抑制CIK细胞的杀伤功能。现有的DC-CIK技术没有考虑到T调节细胞含量对肿瘤免疫逃逸的影响。用CTLA-4和PD-1单克隆抗体来抑制T调节细胞在理论上和实验中均得到证实。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，提供一种自体外周血淋巴细胞DC-CIK的培养方法。
本发明中一些常用的术语说明如下；
PBMC ：外周血单个核细胞；
IL-2 ：白细胞介素2 ；
PHA-p ：植物凝集素P ；
IL-1α ：白细胞介素1α ；
IFN-γ ：干扰素γ ；
GM-CSF ：粒细胞巨噬细胞集落刺激因子；
IL-4 ：白细胞介素4；
TNF-a ：肿瘤坏死因子a；
CD3mAb ：细胞表面分子3 单克隆抗体；
CD28mAb ：细胞表面分子28 单克隆抗体；
CTLA4mAb ：CTLA4单克隆抗体；
PD-1mAb ：PD-1单克隆抗体。
本发明的技术方案如下：
一种自体外周血淋巴细胞DC-CIK的培养方法，包括如下步骤：
（1）外周血单个核细胞的分离；
（2）DC细胞的分离培养；
（3）CIK细胞的诱导培养；
（4）DC和CIK的共培养制备DC-CIK细胞，并添加CTLA-4mAb 100ng/mL、PD-1mAb100ng/mL；
(5) 离心收集成熟DC-CIK细胞。
其中，步骤（1）的外周血单个核细胞的分离为：从外周血中分离外周血单个核细胞，重悬于X-VIVO15无血清培养基中，使外周血单个核细胞的细胞浓度为（1～2）×106个/mL，静置培养2小时。
其中，步骤（2）的DC细胞的分离培养为：从步骤（1）中制得的培养液中吸出悬浮细胞；贴壁细胞加入含有rhGM-CSF 1000U/mL、rhIL-4 500U/mL的X-VIVO15无血清培养基15mL，静置培养；第3天半量换X-VIVO15无血清培养基，并补加rhGM-CSF1000U/mL、rhIL-4500U/mL；第5天加入肿瘤特异性抗原50ug/mL刺激；第6天加入rhTNF-a 500U/mL,继续培养到第7天。
其中，步骤（3）的CIK细胞的诱导培养为：从步骤（2）中所述的吸出的悬浮细胞静置培养；第3天后加X-VIVO15无血清培养基至100mL，同时添加IL-2 1000U/mL；第4天加X-VIVO15无血清培养基至240mL，同时添加IL-2 1000U/mL，培养至第7天。
其中，步骤（4）的DC和CIK的共培养制备DC-CIK细胞为：将步骤（2）和步骤（3）所培养的DC、CIK细胞混合，将混合后的细胞转移至1.8L培养袋中，加X-VIVO15无血清培养基至1000mL，同时添加IL-2 1000U/mL，CTLA-4mAb 100ng/mL、PD-1mAb 100ng/mL，静置培养5-7天。
其中，步骤（5）的离心收集成熟DC-CIK细胞为：第14天将培养好的DC-CIK细胞离心收集，并用0.9wt% 氯化钠溶液洗涤2次，将收集好的细胞加入体积百分比为20% 的人血清白蛋白5mL，并用0.9wt% 氯化钠溶液定容至100mL。
其中，所述X-VIVO15无血清培养基添加了以下组分：rhIFN-γ1000U/mL、胸腺法新500ng/mL、rhIL-1a 100U/mL、CD3mAb 100ng/mL、CD28mAb 100ng/mL。
其中，所述静置培养条件为在温度为37℃、CO2体积百分比为含量为7.5%、相对饱和湿度为100% 的CO2培养箱中培养。
本发明的方法是经过筛选获得的，筛选过程如下：
（1）CTLA-4浓度（ng/mL）：
0、100和500；
（2）PD-1浓度（ng/mL）：
0、100和500；
为此，本发明提出了以下9种实验筛选条件。
实验条件1：
（1）从外周血中分离外周血单个核细胞，重悬于X-VIVO15无血清培养基中，使外周血单个核细胞的细胞浓度为（1～2）×106个/mL，静置培养2小时；
（2）从步骤（1）中制得的培养液中吸出悬浮细胞；贴壁细胞加入含有rhGM-CSF1000U/mL、rhIL-4 500U/mL的X-VIVO15无血清培养基15mL，静置培养；第3天半量换X-VIVO15无血清培养基，并补加rhGM-CSF1000U/mL、rhIL-4 500U/mL；第5天加入肿瘤特异性抗原50ug/mL刺激；第6天加入rhTNF-a 500U/mL,继续培养到第7天；
（3）从步骤（2）中所述的吸出的悬浮细胞静置培养；第3天加X-VIVO15无血清培养基至100mL，同时添加IL-2 1000U/mL；第4天加X-VIVO15无血清培养基至240mL，同时添加IL-2 1000U/mL，在37℃、CO2体积比7.5%培养箱中静置培养至第7天；
（4）将步骤（2）和步骤（3）所培养的DC、CIK细胞混合，将混合后的细胞转移至1.8L培养袋中，加X-VIVO15无血清培养基至1000mL，同时添加IL-2 1000U/mL，CTLA-4mAb100ng/mL、PD-1mAb 100ng/mL，静置培养5-7天；
（5）第14天将培养好的DC-CIK细胞离心收集，制得自体淋巴细胞；
（6）取1*106个自体淋巴细胞，离心收集，并用流式细胞仪检测CD4+CD25+细胞所占百分比。
实验条件2―9，实验操作如实验条件1所示，各实验条件及实验结果如下：
以上结果表明，实验条件9的CTLA-4、PD-1浓度降低T调节细胞含量较优，实验条件5的CTLA-4、PD-1浓度降低T调节细胞含量更优。
本发明的有益效果如下：本发明可以有效抑制DC-CIK细胞中的抑制性T调节细胞的含量，提高DC-CIK细胞的杀伤活性。
附图说明
图1：培养第1天CIKCD3+CD56+细胞流式细胞仪检测结果；
图2：培养第1天CIKCD3+CD8+细胞流式细胞仪检测结果；
图3：培养第1天CIKCD4+CD25+细胞流式细胞仪检测结果；
图4：培养第7天CIKCD3+CD56+细胞流式细胞仪检测结果；
图5：培养第7天CIKCD3+CD8+细胞流式细胞仪检测结果；
图6：培养第7天CIKCD4+CD25+细胞流式细胞仪检测结果；
图7：培养第1天DC CD83+CD86+细胞流式细胞仪检测结果；
图8：培养第1天DC HLA-DR+CD80+细胞流式细胞仪检测结果；
图9：培养第7天DC CD86+CD83+细胞流式细胞仪检测结果；
图10：培养第7天DC HLA-DR+CD80+细胞流式细胞仪检测结果；
图11：加入PD-1、CTLA-4抗体培养第14天DC-CIK CD3+CD56+细胞流式细胞仪检测结果；
图12：加入PD-1、CTLA-4抗体培养第14天DC-CIK CD3+CD8+细胞流式细胞仪检测结果；
图13：加入PD-1、CTLA-4抗体培养第14天DC-CIK CD4+CD25+细胞流式细胞仪检测结果；
图14：未加入PD-1、CTLA-4抗体培养第14天DC-CIK CD3+CD56+细胞流式细胞仪检测结果；
图15：未加入PD-1、CTLA-4抗体培养第14天DC-CIK CD3+CD8+细胞流式细胞仪检测结果；
图16：未加入PD-1、CTLA-4抗体培养第14天DC-CIK CD4+CD25+细胞流式细胞仪检测结果；
图17：DC-CIK细胞生长曲线。
具体实施方式
以下通过实施例进一步说明本发明。
具体地，关于下面实施例中涉及的原料生产厂家如下：
PBMC，采自肿瘤患者外周血，经分离后得到；
Ficoll，购自GE公司；
IL-2，购自山东泉港药业有限公司；
PHA-p，购自Sigma 公司；
IL-1α，购自R&D Systems 公司；
CD3mAb，购自R&D Systems 公司；
CD28mAb，购自R&D Systems 公司；
GM-CSF，购自peprotech公司；
IL-4，购自peprotech公司；
TNF-a，购自peprotech公司；
IFN-γ，购自上海凯茂生物医药有限公司；
CTLA-4，购自Biolegend公司；
PD-1，购自Biolegend公司；
CCK-8试剂盒，购自日本同仁化工；
X-VIVO15培养基，购自LONZA公司。
实施例1 外周血单个核细胞的提取
（1）用枸橼酸钠抗凝管采集外周血30-100mL，将外周血转移至50mL离心管中，2000rmp，离心15min；
（2）弃上层血浆，用生理盐水稀释血细胞，使得血细胞:生理盐水为1:1，混匀；
（3）吸取15mLFicoll淋巴细胞分离液于50mL离心管中，将混匀的细胞悬液均匀缓慢地加至上层，形成完整的界面；
（4）1600rpm，离心20min，可见明显分层；
（5）收集界面单个核细胞，用PBS洗涤2次；
（6）用PBS重悬细胞并计数，备用。
实施例2 DC细胞的制备
（1）将分离得到的单个核细胞，用X-VIVO15无血清培养基调整细胞浓度为1*106个/mL接种到T75培养瓶中，贴壁培养2小时，分离悬浮细胞至新的T175培养瓶中；
（2）向贴壁细胞中加入X-VIVO15无血清培养基15mL，并加入rhGM-CSF1000U/mL 和rhIL-4 500U/mL，37℃，7.5%CO2 培养箱中培养；
（3）第3天半量换X-VIVO15无血清培养基，补加rhGM-CSF和rhIL-4使其浓度保持不变；
（4）第5天加入人肾癌细胞系ACHN提取的肿瘤抗原蛋白50ug/mL，第6天加入rhTNF-a 500U/mL，继续培养到第7天。
实施例3 CIK细胞的制备
（1）将实施例2步骤1分离的悬浮细胞放置37℃，7.5%CO2培养箱培养；
（2）第3天，加入X-VIVO15无血清培养基至100mL，并加入1000U/mL IL-2；
（3）第4天，加入X-VIVO15无血清培养基至240mL，并补加 IL-2使其浓度不变。
实施例4 DC-CIK细胞的制备
（1）将培养至第7天的DC与CIK细胞混合，补加X-VIVO15无血清培养基至1000mL，并添加CTLA-4mAb 100ng/mL、PD-1mAb 100ng/mL，补加IL-2使其浓度保持不变，37℃ 7.5%CO2培养静置培养；
（2）继续培养7天后，离心收集成熟的DC-CIK细胞，并用生理盐水溶液洗涤2次，将收集好的细胞加入体积百分比为20% 的人血清白蛋白5mL，并用生理盐水溶液定容至100mL。
实施例5 CIK、DC、DC-CIK不同时间细胞免疫表型检测
（1）分别取培养至第1和第7天的CIK、DC细胞，以及第14天的DC-CIK细胞，转移入流式检测管，加3mLPBS充分混匀，离心洗涤细胞（离心条件：1600rpm，5min）。倾去离心上清，根据细胞样本浓度和体积，用适量PBS悬浮细胞，调整细胞浓度为1x107 /mL；
（2）荧光标记细胞：标记流式检测管,加入待检测单克隆抗体，待检测单克隆抗体包括CD3+CD56+，CD3+CD8+，CD4+CD25+，CD83+，CD80+，HLADR+，CD80+，,每种抗体量为8μl。每管加入100ul待测细胞样本悬液；
（3）漩涡振荡器上轻轻转动混匀,室温避光孵育15min；
（4）加3mLPBS洗涤，离心，1600rpm，5min，倾去上清，加入500ulPBS悬浮沉淀，充分混匀；
（5）上机检测。结果见图1-13和表1、表2：
表1不同培养时间CIK细胞、DC-CIK细胞免疫表型（%）
表2不同培养时间DC细胞免疫表型（%）
由上述表1、表2和图1-13可知，肿瘤病人的T调节细胞含量比较高，正常人的CD4+CD25+T调节细胞占白细胞比例在1%左右。在细胞培养过程中，CD4+CD25+T调节细胞随着细胞的扩增，含量越来越多，在第7天我们加入了CTLA-4、PD-1单抗，以封闭负调节细胞。到了第14天，CD4+CD25+T调节细胞达到0.9，接近正常人水平。CD3+CD56+细胞和CD3+CD8+细胞随着培养天数的增加，所占比例逐渐增大。
CD80是DC细胞表面标志，CD83和CD86是DC细胞表面共刺激分子，HLA-DR是DC细胞免疫刺激分子。由表1结果可以看出，随着培养的进行，DC细胞所占比例不断升高。
实施例6、DC-CIK细胞生长曲线测定
分别取培养到第1、7、14、18、21天的DC-CIK细胞，用计数仪进行计数，绘制DC-CIK细胞的生长曲线。结果见表3和图17
表3 不同培养时间DC-CIK细胞的扩增数目
| 培养天数 | 第1天 | 第7天 | 第14天 | 第18天 | 第21天 |
| 细胞数目*108 | 0.48 | 12.1 | 60.1 | 73.5 | 112.3 |
由上述表3和图17可知DC-CIK培养在第1-7天细胞基本呈直线缓慢生长趋势，在第7天后开始达到对数生长期，到第21天达到最大数值。
实施例7 CIK细胞、DC-CIK细胞杀伤活性检测
取培养至第14 天的DC-CIK细胞，肾癌细胞系ACHN，（购自中国科学院上海细胞研究所）按40:1、20:1和10:1的比例铺于96孔板中在37℃、体积百分比为7.5%CO2的条件下进行共培养，培养24h 后每孔加入CCK-8试剂10μL进行染色，在培养箱中（37℃、体积百分比为7.5%CO2）孵育2h后在450nm的波长下检测每个孔的OD值，按如下公式计算CIK细胞的杀伤率，结果如表4所示。
细胞存活率(％)=（实验组A450 平均值-调零组A450 平均值）/（对照组A450 平均值-调零组A450 平均值）×100%；
杀瘤活性（%）=1-细胞存活率。
表4不同效靶比CIK对肾癌细胞系ACHN的杀伤活性（%，X±SD）
| 效靶比 | CIK | DC-CIK |
| 10:1 | 51.23±2.08 | 65.04±2.13* |
| 20:1 | 63.44±3.16 | 75.18±4.15* |
| 40:1 | 85.24±3.38 | 93.01±3.57* |
*P<0.05
由此可见，在10-40:1的效靶比范围内，CIK细胞和DC-CIK细胞对ACHN均具有较强的杀伤作用，且杀伤作用随效靶比的增加而增加；在同一效靶比情况下，DC-CIK细胞对ACHN的杀伤活性显著高于单纯的CIK细胞（P<0.05）。
实施例8 添加PD-1单抗、CTLA-4单抗与未添加PD-1单抗、CTLA-4单抗CIK细胞流式表型对比
分别取培养至第14天的添加PD-1单抗、CTLA-4单抗和未添加PD-1单抗、CTLA-4单抗的DC-CIK细胞，方法与实施例5 DC-CIK免疫表型检测相同，检测DC-CIK细胞免疫表型。结果见图11-16和表5：
表5添加PD-1单抗、CTLA-4单抗和未添加PD-1单抗、CTLA-4单抗的DC-CIK细胞的免疫表型（%）
| 免疫表型 | 未添加PD-1单抗、CTLA-4单抗 | 添加PD-1单抗、CTLA-4单抗 |
| CD3+CD56+ | 8.5 | 34.9 |
| CD3+CD8+ | 78.9 | 65.6 |
| CD4+CD25+ | 11.1 | 0.9 |
如图11-16和表5的结果可知，DC-CIK细胞在未添加PD-1单抗、CTLA-4单抗CD4+CD25+T细胞含量比较高，达到DC-CIK细胞总量的11.1%。而添加PD-1单抗、CTLA-4单抗后CD4+CD25+T细胞含量显著降低，达到DC-CIK细胞总量的0.9%。同时CD3+CD56+NK样的T细胞含量有所增加，达到DC-CIK细胞总量的34.9%。
Claims (3)
1.一种培养自体外周血淋巴细胞DC-CIK的培养方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)外周血单个核细胞的分离：从外周血中分离外周血单个核细胞，重悬于X-VIVO15无血清培养基中，使外周血单个核细胞的细胞浓度为(1～2)×106个/mL，静置培养2小时；
(2)DC细胞的分离培养：从步骤(1)中制得的培养液中吸出悬浮细胞；贴壁细胞加入含有rhGM-CSF 1000U/mL、rhIL-4 500U/mL的X-VIVO15无血清培养基15mL，静置培养；第3天半量换X-VIVO15无血清培养基，并补加rhGM-CSF1000U/mL、rhIL-4 500U/mL；第5天加入肿瘤特异性抗原50μg/mL刺激；第6天加入rhTNF-α500U/mL,继续培养到第7天；
(3)CIK细胞的诱导培养：从步骤(2)中所述的吸出的悬浮细胞静置培养；第3天后加X-VIVO15无血清培养基至100mL，同时添加IL-2 1000U/mL；第4天加X-VIVO15无血清培养基至240mL，同时添加IL-2 1000U/mL，培养至第7天；
(4)DC和CIK的共培养制备DC-CIK细胞：将步骤(2)和步骤(3)所培养的DC、CIK细胞混合，将混合后的细胞转移至1.8L培养袋中，加X-VIVO15无血清培养基至1000mL，同时添加IL-2 1000U/mL，CTLA-4mAb 100ng/mL、PD-1mAb100ng/mL，静置培养5-7天；
(5)离心收集成熟DC-CIK细胞：第14天将培养好的DC-CIK细胞离心收集，并用0.9wt％氯化钠溶液洗涤2次，将收集好的细胞加入体积百分比为20％的人血清白蛋白5mL，并用0.9wt％氯化钠溶液定容至100mL。
2.如权利要求1中所述的方法，其特征在于，所述X-VIVO15无血清培养基添加了以下组分：rhIFN-γ1000U/mL、胸腺法新500ng/mL、rhIL-1α100U/mL、CD3mAb100ng/mL、CD28mAb100ng/mL。
3.如权利要求1中所述的方法，其特征在于，所述静置培养条件为在温度为37℃、CO2含量为7.5％(V/V)、相对饱和湿度为100％的CO2培养箱中培养。
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| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| CB02 | Change of applicant information |
Address after: 310018 Hangzhou economic and Technological Development Zone, Zhejiang, No. 6 Avenue, No. 452 Applicant after: ADLAI NORTYE BIOPHARMA Co.,Ltd. Address before: 310018 Hangzhou economic and Technological Development Zone, Zhejiang, No. 6 Avenue, No. 452 Applicant before: HANGZHOU ADLAI NORTYE PHARMACEUTICAL TECHNOLOGY Co.,Ltd. |
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| COR | Change of bibliographic data | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| PE01 | Entry into force of the registration of the contract for pledge of patent right | ||
| PE01 | Entry into force of the registration of the contract for pledge of patent right |
Denomination of invention: Culture method of autologous peripheral blood lymphocyte DC-CIK (Dendritic Cell- Cytokine-induced Killer) Effective date of registration: 20171228 Granted publication date: 20170322 Pledgee: The Bank of Nanjing Limited by Share Ltd. of Hangzhou city Small and micro businesses franchise branch Pledgor: ADLAI NORTYE BIOPHARMA Co.,Ltd. Registration number: 2017330000339 |
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| PC01 | Cancellation of the registration of the contract for pledge of patent right | ||
| PC01 | Cancellation of the registration of the contract for pledge of patent right |
Date of cancellation: 20201014 Granted publication date: 20170322 Pledgee: The Bank of Nanjing Limited by Share Ltd. of Hangzhou city Small and micro businesses franchise branch Pledgor: ADLAI NORTYE BIOPHARMA Co.,Ltd. Registration number: 2017330000339 |
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| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20170322 Termination date: 20211024 |