CN106955352A - 一种用于治疗癌症的药物组合物和试剂盒 - Google Patents

一种用于治疗癌症的药物组合物和试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种用于治疗癌症的药物组合物和试剂盒，所述药物组合物包括抗细胞程序性死亡受体1抗体以及共培养的树突状细胞和细胞因子诱导的杀伤细胞；所述试剂盒包括分开放置的抗细胞程序性死亡受体1抗体，以及共培养的树突状细胞和细胞因子诱导的杀伤细胞的诱导剂。所述药物组合物或试剂盒能够更有效地用于治疗癌症，特别适用于晚期难治性实体肿瘤或血液恶性肿瘤的治疗。

Description

一种用于治疗癌症的药物组合物和试剂盒
技术领域
本发明属于癌症的免疫治疗领域，涉及一种用于治疗癌症，例如晚期难治性实体肿瘤或血液恶性肿瘤的包含抗细胞程序性死亡受体1抗体以及共培养的树突状细胞和细胞因子诱导的杀伤细胞的药物组合物和相应的试剂盒、以及它们的用途。
背景技术
目前，全球每年因癌症死亡的人数在不断增长，而常规的手术和放、化疗对恶性肿瘤的治疗效果并不理想，因此近年来新兴的癌症免疫治疗越来越引起大家的关注和重视。免疫治疗正在成为临床癌症治疗的一个重要领域，其中抑制免疫检查点通路被认为是最有前景的治疗方式之一。
肿瘤抗原特异性T细胞的诱导凋亡和无反应性是肿瘤细胞免疫逃逸的主要机制。细胞程序性死亡受体1(PD-1)和PD-1配体(PD-L1)广泛表达于多种肿瘤细胞，是许多肿瘤细胞实现免疫逃逸的重要途径。PD-1/PD-L1信号通路对T、B细胞免疫应答的调控具有重要作用，其抑制免疫应答的初始与效应阶段。PD-L1对T细胞增殖的抑制作用明显，受体与配体的结合可抑制下游NF-κB的转录并促使干扰素-δ分泌的下调，最终抑制T细胞免疫，导致免疫抑制性肿瘤微环境的形成，使肿瘤细胞逃避机体的免疫监控和杀伤。在高表达PD-L1的癌症患者体内，T细胞的数量明显减少，而肿瘤细胞及肿瘤微环境中的PD-L1经PD-1/PD-L1信号通路抑制抗肿瘤特异性T细胞的活化，抗肿瘤特异性T细胞的质量下降。此外，患者体内存在的不成熟的DC细胞，可在炎症介质如IFN-r、TNF-α的刺激下迅速上调PD-L1的表达，限制免疫应答。因而，阻断PD-1/PD-L1信号通路可以逆转肿瘤免疫微环境，恢复T细胞的抗肿瘤活性，从而增强内源性抗肿瘤免疫效应。
近几年来，研究人员已开发了多个抗PD-1和PD-L1的单抗类免疫检查点抑制剂，这些药物有力地促进了癌症免疫治疗的进展。根据默沙东公布的PD-1药物Keytruda(pembrolizumab)治疗实体瘤的一项Ib期KEYNOTE-028研究数据，Keytruda治疗在25例胸膜间皮瘤(pleuralmesothelioma，PM)患者中取得了28％的总缓解率(ORR)，并有48％的患者病情稳定，疾病控制率达到了76％。尽管抗PD-1抗体及抗PD-LI抗体对某些癌症已经显现出了较好的临床效果，但令人遗憾的是，这些抗体并不是对所有的患者都有效。
DC-CIK细胞免疫治疗是指树突状细胞(DC)以及细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK，cytokine induced killer)在体外共同培养大量扩增后，将活化的免疫细胞回输入患者体内，辅助或刺激人体自身免疫系统，完善或增强病人的免疫机能，达到抑制或杀灭肿瘤细胞的目的。DC细胞被称为寻找肿瘤细胞的雷达，能够在体内随着血液到达全身各处，主动搜索、识别肿瘤细胞，并把信息传递给免疫活性细胞，促使其激活和大量增殖。CIK细胞被称为杀伤肿瘤细胞的导弹，在DC细胞的抗原提呈作用下，CIK细胞充分发挥了CTL效应，能够更加精确杀伤肿瘤细胞。DC-CIK细胞治疗已应用到非小细胞肺癌(NSCLC)患者的联合化疗治疗中，可提高NSCLC患者体内效应细胞数量，抑制Treg细胞数量，实现靶向性良好的抗肿瘤效应，1年和2年的生存率分别是57.2％和27.0％，显著高于对照组的37.3％和10.1％。而且，这种作用对于肺腺癌和肺鳞癌没有显著性差异。
然而，目前临床上对晚期难治性实体肿瘤或血液恶性肿瘤的治疗尚缺乏有效的手段。
发明内容
为了克服现有技术中存在的缺陷，本发明所要解决的技术问题是提供一种包含抗PD-1抗体和DC-CIK的用于联合治疗癌症的药物组合物或其相应的试剂盒，所述药物组合物或试剂盒能够更有效地用于治疗癌症，特别适用于晚期难治性实体肿瘤或血液恶性肿瘤的治疗。
一方面，本发明提供一种用于治疗癌症的药物组合物，其包括抗细胞程序性死亡受体1抗体(即抗PD-1抗体)以及共培养的树突状细胞和细胞因子诱导的杀伤细胞(DC-CIK)。优选地，其中所述抗细胞程序性死亡受体1抗体与共培养的树突状细胞和细胞因子诱导的杀伤细胞的比例为1-10mg：1×107-10×107个细胞。
优选地，在所述用于治疗癌症的药物组合物中，所述抗细胞程序性死亡受体1抗体与共培养的树突状细胞和细胞因子诱导的杀伤细胞分开放置；优选地，所述抗细胞程序性死亡受体1抗体为静脉注射制剂；优选地，所述共培养的树突状细胞和细胞因子诱导的杀伤细胞为静脉注射制剂；优选地，所述抗细胞程序性死亡受体1抗体、共培养的树突状细胞和细胞因子诱导的杀伤细胞分别进行静脉注射。其中，所述抗细胞程序性死亡受体1抗体每2-3周给予一次，每次剂量为1-3mg/kg；共培养的树突状细胞和细胞因子诱导的杀伤细胞每2-3周给予一次，剂量为1×107个-10×107个细胞/kg，抗细胞程序性死亡受体1抗体治疗2周后，再进行DC-CIK细胞治疗。
优选地，所述抗PD-1抗体为细胞因子诱导的杀伤细胞的免疫检查点阻断剂；更优选地，所述抗PD-1抗体为pembrolizumab。pembrolizumab的商品名为Keytruda，生产公司为默沙东，是目前获批的用于一线治疗非小细胞肺癌的抗PD-1免疫治疗剂，该PD-1抗体是一款人源化的PD-1抗体，能够阻断T细胞表面PD-1受体与其配体的结合，从而起到激活T细胞，使其对肿瘤展开攻击的作用。所述抗PD-1抗体除了直接用于体内阻断PD-1/PD-L1信号通路，逆转肿瘤免疫微环境，恢复T细胞的抗肿瘤活性，从而增强内源性抗肿瘤免疫效应之外，还能够在体外激活CIK细胞以阻断细胞因子诱导的杀伤细胞的免疫检查点。
优选地，所述抗PD-1抗体为细胞因子诱导的杀伤细胞的免疫检查点阻断剂；更优选地，所述抗PD-1抗体为pembrolizumab。Pembrolizumab的商品名为Keytruda，生产公司为默沙东，是目前获批的用于一线治疗非小细胞肺癌的抗PD-1免疫治疗剂。该PD-1抗体是一款人源化的PD-1抗体，能阻断T细胞表面PD-1受体与其配体的结合，起到激活T细胞，让其对肿瘤展开攻击的作用。
优选地，在所述共培养的树突状细胞和细胞因子诱导的杀伤细胞中，树突状细胞与细胞因子诱导的杀伤细胞的数量比例为1：20-100；优选地，所述树突状细胞中的CD11c+和CD86+的双阳性细胞的比例≥70％和/或CD11c+和CD83+的双阳性细胞的比例≥50％。
优选地，所述共培养的树突状细胞和细胞因子诱导的杀伤细胞来自从需要治疗癌症的患者的自体外周血分离的单核细胞。
优选地，所述共培养的树突状细胞和细胞因子诱导的杀伤细胞经过抗PD-1抗体体外激活以阻断细胞因子诱导的杀伤细胞的免疫检查点。
本发明所述的DC-CIK细胞是严格按照《人体细胞治疗研究和制剂质量控制技术指导原则》进行制备的，其包括患者自体外周血单核细胞的分离，体外诱导、增殖、培养DC-CIK细胞，DC-CIK细胞的共培养以及细胞制剂的质量控制。
优选地，所述共培养的树突状细胞和细胞因子诱导的杀伤细胞的制备方法包括以下步骤：
(1)取需要治疗癌症的患者的外周血，加入抗凝剂后再加入生理盐水制得混合液；
(2)用淋巴细胞分离液分离所述混合液中的单核细胞，并用淋巴细胞培养基调节所述单核细胞的密度至1×106-5×106个/mL，得到外周血单核细胞悬液；
(3)将所述外周血单核细胞悬液用外周血处理液洗涤，离心得白膜层细胞，即单核细胞；
(4)将所述单核细胞接种至75cm2培养瓶后2-4h，取出悬浮细胞进行细胞因子诱导的杀伤细胞细胞的诱导和扩增；贴壁细胞进行树突状细胞的诱导和扩增；优选地，所述细胞因子诱导的杀伤细胞的诱导剂为γ-干扰素、CD3单克隆抗体或人白介素-2中的一种或多种，所述树突状细胞的诱导剂为GM-CSF、IL-4或TNF-α中的一种或多种；
(5)在树突状细胞在诱导成熟后，添加需要治疗的癌症的特异性肿瘤抗原，并转入细胞因子诱导的杀伤细胞中继续共培养；
(6)收集经过PD-1抗体阻断的细胞因子诱导的杀伤细胞和树突状细胞。
优选地，在上述步骤(6)之前还包括将成熟的共培养的细胞因子诱导的杀伤细胞和树突状细胞用抗PD-1抗体进行免疫检查点阻断，其中所述PD-1抗体与共培养细胞的比例为1-10mg：1×107-10×107个细胞。
优选地，所述需要治疗的癌症的特异性肿瘤抗原为需要治疗癌症的患者经手术切除得到的肿瘤细胞的裂解液。
本发明还提供了所述药物组合物在制备治疗癌症的药物中的用途，例如所述药物组合物在制备治疗难治性实体肿瘤或血液恶性肿瘤的药物中的用途；或者使用所述药物组合物治疗癌症，例如难治性实体肿瘤或血液恶性肿瘤的方法。具体地，所述难治性实体肿瘤或血液恶性肿瘤选自非小细胞肺癌(NSCLC)、HPV阳性宫颈癌、病毒性肝炎诱发的肝癌、肾细胞癌(RCC)、黑色素瘤、结肠直肠癌、卵巢癌以及急性、慢性淋巴细胞性白血病。
优选地，所述治疗可以产生一种或多种选自以下的治疗效果：肿瘤尺寸减小，转移灶的数量随时间减少，疾病稳定(SD，stable disease)，靶病灶最大径之和缩小但未达部分缓解，靶病灶最大径之和增大但未达疾病进展(PD，progressive disease)，或部分缓解(PR，partial response)，即靶病灶最大径之和减少≥30％，至少维持4周；完全缓解(CR，complete response)，即所有靶病灶消失，无新病灶出现，且肿瘤标志物正常，至少维持4周。
另一方面，本发明还提供了一种用于治疗癌症的试剂盒，其包括分开放置的抗细胞程序性死亡受体1抗体，以及共培养的树突状细胞和细胞因子诱导的杀伤细胞的诱导剂。优选地，所述树突状细胞和细胞因子诱导的杀伤细胞的诱导剂为用于对从需要治疗癌症的患者自体外周血分离的单核细胞进行诱导以获得树突状细胞和细胞因子诱导的杀伤细胞的试剂；优选地，所述树突状细胞的诱导试剂选自GM-CSF、IL-4或TNF-α中的一种或多种；优选地，所述细胞因子诱导的杀伤细胞诱导剂选自γ-干扰素、CD3单克隆抗体或人白介素-2中的一种或多种。
优选地，所述γ-干扰素与抗细胞程序性死亡受体1抗体的比例为1000-50000U：50-150mg；所述CD3单克隆抗体与抗细胞程序性死亡受体1抗体的比例为0.5-25μg：50-150mg；所述重组人白介素-2与抗细胞程序性死亡受体1抗体的比例为200-60000U：50-150mg；所述GM-CSF与抗细胞程序性死亡受体1抗体的比例为1000-50000U：50-150mg；所述IL-4与抗细胞程序性死亡受体1抗体的比例为500-25000U：50-150mg；所述TNF-α与抗细胞程序性死亡受体1抗体的比例为1000-50000U：50-150mg。
优选地，所述抗PD-1抗体为细胞因子诱导的杀伤细胞的免疫检查点阻断剂。更优选地，所述抗PD-1抗体为pembrolizumab。
优选地，所述用于治疗癌症的试剂盒还包括用于树突状细胞和细胞因子诱导的杀伤细胞扩增的试剂和工具。
在正常情况下，免疫细胞识别肿瘤细胞，从而对其进行攻击；然而在肿瘤微环境中，肿瘤细胞释放PD-L1信号给T细胞上的PD-1受体，从而使T细胞的功能失活；利用PD-1抗体封闭PD-1/PD-L1信号通路可以阻断T细胞的失活，从而达到发挥杀伤肿瘤细胞的作用。本发明人发现，通过实施抗PD-1抗体和DC-CIK细胞联合治疗，一方面，PD-1抗体可以使自身T细胞充分发挥细胞杀伤效能，同时抗PD-1抗体促进体内不成熟DC细胞减少，使成熟DC细胞增多，提呈抗原能力增强，更有效激活免疫系统；另一方面，细胞治疗可直接增加效应T细胞的数量，联合治疗使抗PD-1抗体阻断CIK细胞的PD-1/PD-L1信号通路，降低CIK细胞中Treg细胞的数量，同时使输注的DC-CIK细胞更加有效发挥CTL效应，提高抗肿瘤特异性T细胞的质量，进一步提高抗PD-1抗体药物对癌症的治愈率，达到1+1>2的协同效果。
本发明的试剂盒实现了自体DC-CIK细胞联合抗PD-1抗体治疗，能够大大提高临床有效率，延长患者寿命，提高带瘤生存率，真正达到1+1>2的协同作用。
本发明的有益效果在于提供了治疗晚期难治性实体肿瘤或血液恶性肿瘤的方法、包含抗PD-1抗体和DC-CIK细胞的药物组合物以及包含抗PD-1抗体和DC-CIK细胞培养诱导扩增试剂的试剂盒，它们能够提供PD-1抗体对经诱导后的DC-CIK细胞的阻断以及PD-1抗体与DC-CIK联合治疗，不仅能防御自身免疫逃逸机制，还能直接增强自身免疫力，两种药物的组合能够最大程度发挥CTL效应，提高杀伤癌细胞的效能，达到协同杀伤作用，在晚期癌症的治疗中具有很好的应用前景。
附图说明
以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：
图1为DC-CIK细胞的流式鉴定结果；
图2显示PD-1抗体体外激活的CIK细胞分泌TNF-α倍数的改变；
图3显示DC-CIK对肿瘤细胞的杀伤效率；
图4显示PD-1抗体联合DC-CIK细胞的体外抑制肿瘤细胞生长的活性；
图5显示DC-CIK细胞的体内杀伤活性；
图6显示PD-1抗体与DC-CIK细胞的药物组合物治疗非小细胞肺癌的临床研究方案；
图7显示CD3+T细胞和CD3+CD8+T细胞的检测结果；
图8显示本发明的PD-1抗体联合DC-CIK治疗与目前临床中单独使用PD-1抗体或DC-CIK治疗的临床缓解率的对比。
具体实施方式
以下参照具体实施例来说明本发明。本领域技术人员能够理解，这些实施例仅用于说明本发明，其不以任何方式限制本发明的范围。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的原料、试剂材料等，如无特殊说明，均为市售购买产品，例如抗PD-1抗体购自默沙东，商品名为Keytruda。
实施例1DC-CIK细胞的获取
1.外周血样单核细胞的分离：取新鲜的人外周血样，向其中加入血液抗凝剂后制得抗凝血样；向所述抗凝血样中加入1/3～2/3体积的生理盐水，充分混匀，用1～1.5倍体积的淋巴细胞分离液(天津灏洋，货号LTS1077006)分离所得混合液中的单核细胞，并用淋巴细胞培养基GT-T551(Takara，货号：DL-104)调节单核细胞密度至1×106～5×106个/mL，得到外周血单核细胞悬液；用生理盐水洗涤外周血单核细胞悬液，于室温下离心20-30min，转速为1500～2000r/min，取白膜层细胞。
2.DC和CIK细胞的分离：将单核细胞接种至75cm2培养瓶后2h，取出悬浮细胞进行细胞因子诱导的杀伤细胞的诱导；贴壁细胞进行树突状细胞的诱导。其中所述，所述细胞因子诱导的杀伤细胞的诱导剂为γ-干扰素、CD3单克隆抗体和人白介素-2，所述树突状细胞的诱导剂为GM-CSF、IL-4和TNF-α；诱导成熟的DC-CIK细胞的流式鉴定结果见图1。
采用本发明的试剂盒获得诱导剂诱导的树突状细胞和细胞因子诱导的杀伤细胞(DC-CIK)，DC细胞成熟后，经鉴定CD11c+CD86+双阳性细胞≥70％，CD11c+CD83+≥50％，将DC细胞与CIK细胞混合，混合细胞数量比例为1：30，并继续培养，直到第14天收集DC-CIK细胞。
实施例2抗PD-1抗体体外激活CIK细胞实验取经过CD3单克隆抗体刺激5天后的CIK细胞(CIK细胞单独培养，此时处于活化状态的CIK细胞的免疫检查点即被PD-1抗体阻断)铺板至96孔平底板中，孵育过夜后，加入10μg/ml的抗PD-1抗体及100ng/ml的破伤风毒素(TT)，对照组不加PD-1抗体，培养3天后收集上清液，用Thermofisher公司的TNF-αELISA检测试剂盒检测PD-1抗体组及对照组TNF-α的分泌水平。结果(见图2)显示抗PD-1抗体可刺激CIK细胞的功能，对照组、抗PD-1抗体组对TNF-α分泌量的增率分别为107.3％和275.4％，具有显著性差异，p<0.01。
实施例3DC-CIK细胞对肿瘤细胞的细胞毒作用的MTT测定
以培养12天的经PD-1抗体激活的DC-CIK共培养物作为效应细胞，A549肺癌细胞株为靶细胞。取对数生长期的A549细胞，将DC-CIK的细胞浓度分别调整为2.5×105/mL、5×105/mL、1×106/mL、2×106/mL，效应细胞与靶细胞的数量比依次为2.5∶1、5∶1、10∶1、20∶1。实验分为3组，每组3个复孔，实验组加效应细胞、靶细胞各100μL/孔，靶细胞组加入靶细胞、培养液各100μL/孔，效应细胞组加入效应细胞、培养液各100μL/孔，置37℃、5％CO2培养箱中孵育24小时，加入MTT试剂，20μL/孔，37℃下孵育4小时，再加入洗涤试剂100μL/孔，37℃下孵育2小时，待充分溶解沉淀后于酶联免疫检测仪(波长570nm)检测吸光度(A)，计算杀伤率，计算公式为：
杀伤率＝[1-(A实验孔-A效应孔/A靶细胞孔)]×100％
体外实验表明(见图3)：以A549细胞为靶细胞，在2.5-20的效靶比范围内，效靶比为10：1和20：1时具有较强的杀伤活性，并且与效靶比为2.5：1或5：1的组差异显著(P<0.05)，但效靶比为10：1与20：1组的杀伤性不具有显著性差异。
实施例4PD-1抗体联合DC-CIK细胞的体外肿瘤细胞生长抑制活性检测
本发明利用A549细胞作为细胞模型来检测PD-1抗体联合DC-CIK细胞对A549细胞的体外生长抑制作用。
在96孔细胞培养板内接种A549细胞，按照PD-1抗体阻断的DC-CIK细胞与A549细胞的数量比例为10：1将DC-CIK细胞加入到培养板内，同时将不同浓度的抗PD-1抗体(0.5μg/ml、5μg/ml、10μg/ml)加入细胞培养孔。继续培养细胞后，每孔加20μl MTT。继续孵育4小时后，吸弃细胞培养孔内的上清液，每孔加150μl二甲基亚砜(DMSO)，用酶联免疫检测仪测定各孔490nm波长下的吸收值，绘制细胞生长曲线。结果显示，较PD-1抗体组和DC-CIK细胞组，本发明的抗PD-1抗体(5μg/ml、10μg/ml)联合DC-CIK细胞的药物组合物能显著抑制A549细胞的生长，与对照组有显著差异(见图4)。
实施例5DC-CIK细胞体内杀伤实验
建立A549肺癌小鼠模型，实验组小鼠于瘤旁注射经本发明试剂盒体外诱导培养14天的PD-1抗体阻断的DC-CIK细胞，，共分为四组：对照组、107个细胞/kg、5×107个细胞/kg、108个细胞/kg，0.2ml/只/次，共进行4次注射，对照组注射PBS，0.2ml/只/次。
DC-CIK细胞能够抑制小鼠体内肿瘤的生长，注射完成4周后，108个细胞/kg组小鼠肿瘤体积明显得到抑制(见图5)。
表1 DC-CIK细胞对肿瘤的抑制作用结果
组别 肿瘤体积(cm3)
对照组 4.67±0.4
107个细胞/kg组 2.95±0.6*
5×107个细胞/kg组 2.73±0.9*
108个细胞/kg组 2.05±0.8**
注：与对照组比较**P<0.01。
实施例6PD-1抗体联合DC-CIK细胞杀伤实验
将种植瘤小鼠分为4组，每组4只，以PD-1抗体尾静脉注射至成瘤小鼠体内，用量分别为A组：0mg/kg，B组：1mg/kg，C组：3mg/kg和D组：5mg/kg。每隔一周注射1次，连续注射3次，期间注射PD-1抗体阻断的DC-CIK细胞(108个细胞/kg)，连续注射4次，记录小鼠体内肿瘤大小变化。采用本发明的试剂盒，PD-1抗体联合诱导扩增的DC-CIK细胞不仅抑制小鼠体内肿瘤的生长，同时具有缩小肿瘤的作用，以3mg/kg和10mg/kg剂量注射6周后，肿瘤体积分别缩小至初始体积的54.6％和49.7％。
表2 PD-1抗体联合DC-CIK细胞对肿瘤的抑制作用结果
组别 肿瘤大小 肿瘤体积增率
对照组 1345±48mg 1092.6％
1mg/kg组 591±81mg 517.3％
3mg/kg组 67.4±14mg** 54.6％
10mg/kg组 56.9±16mg** 49.7％
注：与对照组比较**P<0.01。
实施例7PD-1抗体与PD-1抗体阻断的DC-CIK细胞联合治疗非小细胞肺癌的临床研究
1.患者筛选
针对患有非小细胞肺部恶性肿瘤患者采用组织学或细胞学检测确认患有非小细胞肺癌；利用本研究入组条件对非小细胞肺癌患者进行筛选，确定入选患者。
入选标准：
只有符合以下所有入选标准的受试者才能入组本试验：
a.18～70周岁，KPS评分≥60分，估计生存期>6个月；
b.确诊为非小细胞肺癌患者(主要包括腺癌、鳞癌、大细胞未分化癌三类)；
c.器官功能水平必须符合下列要求：中性粒细胞绝对计数≥1.5×109/L，血小板≥80×109/L，血红蛋白≥100g/L，谷草转氨酶和谷丙转氨酶≤2.5倍正常值上限，CCr(内生肌酐清除率)≥60ml/min或Cr(血清肌酐)≤1.5倍正常值上限；
d.女性：对于所有可能怀孕的妇女必须采取医学上许可的避孕措施且进行妊娠试验，血清或尿妊娠试验必须为阴性，必须为非哺乳期；
e.男性：外科手术绝育或治疗期间及结束后的3个月内采取避孕措施；
f.无严重的精神疾病及无严重的心、肝、肾、肺功能不全，未合并其他有致命危险的疾病；
g.男性受试者和有生育能力的女性受试者，必须同意在发生异性性交行为时使用方案指定的避孕方法；
h.愿意并有能力遵从计划的访视、治疗计划、实验室检查及其他临床技术研究程序；
i.亲笔签名和注明日期的知情同意书，表示已将研究的所有相关方面告知患者；
j.受试者必须能够遵循研究药物给药的剂量指导，能够完成研究评估进度。
2.研究流程
选择30例合格患者接受本发明试剂盒中抗PD-1抗体与DC-CIK诱导扩增的DC-CIK细胞联合治疗。治疗方案如下：静脉滴注抗PD-1抗体药物(Keytruda)，剂量：2mg/kg(体重)，每3周注射一次，每次注射历时30分钟，共3次给药；该疗程内对患者进行4次体外扩增的自体DC-CIK细胞治疗(扩增周期为15天)，每次治疗持续2天，回输细胞108个细胞/kg，静脉滴注；DC-CIK细胞治疗采血时进行留样检测，观察患者疾病进展及自身免疫情况。
治疗程序如图6所示。开始给予受试者DC-CIK生物治疗的前14天(D-14)对患者进行第一次采血，采血样品用于：①分析受试者自身免疫功能；②制备第一批DC-CIK回输细胞；③冻存部分细胞，建立未给药DC-CIK后备库；
开始给予受试者DC-CIK细胞第一次回输(D1)，连续2天；
第2天(D2)对患者进行第二次采血，采血样品用于：①分析受试者自身免疫功能；②制备第二批DC-CIK回输细胞，如体外扩增给药后DC-CIK效果不良(DC-CIK制备不良)，则利用未给药DC-CIK后备库存细胞进行DC-CIK制备，用于第二次回输，并冻存部分细胞至未给药DC-CIK后备库；
第8天，给予受试者第一次抗PD-1药物，静脉滴注，剂量2mg/kg(体重)，历时30分钟；
第16天(D16)，D2采血体外扩大培养的DC-CIK细胞进行第二次回输，连续2天；
第17天(D17)，对患者进行第三次采血，采血样品用于：①分析受试者自身免疫功能；②制备第三批DC-CIK回输细胞，如体外扩增给药后DC-CIK效果不良(DC-CIK制备不良)，则利用未给药DC-CIK后备库存细胞进行DC-CIK制备，用于第三次回输，并冻存部分细胞至未给药DC-CIK后备库；
第24天(D24)给予受试者第二次抗PD-1药物，静脉滴注，剂量2mg/kg(体重)，历时30分钟；
第32天(D32)，D17采血体外扩大培养的DC-CIK细胞进行第三次回输，连续2天；
第33天(D33)对患者进行第四次采血，采血样品用于：①分析受试者自身免疫功能；②制备第四批DC-CIK回输细胞，如体外扩增给药后DC-CIK效果不良(DC-CIK制备不良)，则利用未给药DC-CIK后备库存细胞进行DC-CIK制备，用于第四次回输，并冻存部分细胞至未给药DC-CIK后备库；
第40天(D40)给予受试者第三次抗PD-1药物，静脉滴注，剂量2mg/kg(体重)，历时30分钟；
第48天(D48)，体外扩大培养的DC-CIK细胞进行第四次回输，连续2天；
整个治疗期间对抗PD-1与DC-CIK联合治疗方案进行安全监测和风险评估，并通过增强CT或MRI评估肿瘤，观察肿瘤发展与治疗效果。
患者继续接受指定治疗直至客观疾病进展、症状恶化、不可接受的毒性或撤回同意(以先发生者为准)。
3.研究结果
3.1筛选患者基本情况
共筛选合格患者50例，其中男性25例，女性25例，年龄范围从39-69岁，详见表3。
表3筛选的患者基本情况
3.2CTL检测结果
参见图7，与单独使用PD-1抗体或DC-CIK细胞相比，本发明的PD-1抗体联合生物治疗组患者血清中的CD3+T细胞比例(75.3±0.3)％和CD3+CD8+细胞比例(27.5±0.3)％均出现明显增加(p<0.05)，具有显著性差异。
3.3临床效果评估
本发明的PD-1抗体与DC-CIK细胞联合疗法对非小细胞肺癌治疗后，患者的生活质量状况出现显著变化，与单独使用PD-1抗体或DC-CIK细胞治疗相比，观察到的抗肿瘤应答更显著(PD-1单独使用组CR只有37％)，见图8。
本发明的联合疗法与PD-1抗体组、DC-CIK细胞单独治疗组相比，CR和PR均具有显著性差异(p<0.05)。
3.4不良反应及其处理
在所有参与研究的50例患者中，仅有6例出现较轻的不良反应，具体见表4。
表4出现的不良反应及相关处理
结论：上述研究表明，以PD-1抗体与DC-CIK细胞联合疗法治疗后，患者的免疫功能状况出现显著提升，患者的生存质量改善。另外，在整个研究过程中，仅出现少数的较轻不良反应，说明该组合疗法具有较高的安全性。
上述参照具体实施方式的描述是对本发明的实施方案进行的详细描述，它们是说明性的而不是限定性的，可按照本发明的权利要求所限定范围列举出若干个实施例，因此在不脱离本发明总体构思下的变化和修改应属本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种用于治疗癌症的药物组合物，其包括抗细胞程序性死亡受体1抗体以及共培养的树突状细胞和细胞因子诱导的杀伤细胞。
2.根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述抗细胞程序性死亡受体1抗体与共培养的树突状细胞和细胞因子诱导的杀伤细胞的比例为1-10mg：1×107-10×107个细胞。
3.根据权利要求1或2所述的药物组合物，其中所述抗细胞程序性死亡受体1抗体与共培养的树突状细胞和细胞因子诱导的杀伤细胞分开放置；优选地，所述抗细胞程序性死亡受体1抗体为静脉注射制剂；优选地，所述共培养的树突状细胞和细胞因子诱导的杀伤细胞为静脉注射制剂；优选地，所述抗细胞程序性死亡受体1抗体、共培养的树突状细胞和细胞因子诱导的杀伤细胞分别进行静脉注射。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的药物组合物，其中所述抗细胞程序性死亡受体1抗体为细胞因子诱导的杀伤细胞的免疫检查点阻断剂；更优选地，所述抗细胞程序性死亡受体1抗体为pembrolizumab；
优选地，在所述共培养的树突状细胞和细胞因子诱导的杀伤细胞中，树突状细胞与细胞因子诱导的杀伤细胞的数量比例为1：20-100；
优选地，所述树突状细胞中的CD11c+和CD86+的双阳性细胞的比例≥70％和/或CD11c+和CD83+的双阳性细胞的比例≥50％；
优选地，所述共培养的树突状细胞和细胞因子诱导的杀伤细胞来自从需要治疗癌症的患者的自体外周血分离的单核细胞；
优选地，所述共培养的树突状细胞和细胞因子诱导的杀伤细胞经过抗细胞程序性死亡受体1抗体体内和/或体外激活以阻断细胞因子诱导的杀伤细胞的免疫检查点。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的药物组合物，其中所述共培养的树突状细胞和细胞因子诱导的杀伤细胞的制备方法包括以下步骤：
(1)取需要治疗癌症的患者的外周血，加入抗凝剂后再加入生理盐水制得混合液；
(2)用淋巴细胞分离液分离所述混合液中的单核细胞，并用淋巴细胞培养基调节所述单核细胞的密度至1×106-5×106个/mL，得到外周血单核细胞悬液；
(3)将所述外周血单核细胞悬液用外周血处理液洗涤，离心得白膜层细胞，即单核细胞；
(4)将所述单核细胞接种至75cm2培养瓶后，取出悬浮细胞进行细胞因子诱导的杀伤细胞的诱导和扩增；贴壁细胞进行树突状细胞的诱导和扩增；
(5)在树突状细胞在诱导成熟后，添加需要治疗的癌症的特异性肿瘤抗原，并转入细胞因子诱导的杀伤细胞中继续共培养；
(6)收集经过抗细胞程序性死亡受体1抗体阻断的细胞因子诱导的杀伤细胞和树突状细胞；
优选地，在所述步骤(6)之前还包括将成熟的共培养的细胞因子诱导的杀伤细胞和树突状细胞用抗细胞程序性死亡受体1抗体进行免疫检查点阻断，其中所述抗细胞程序性死亡受体1抗体与共培养细胞的比例为1-10mg：1×107-10×107个细胞；
优选地，所述细胞因子诱导的杀伤细胞的诱导剂为γ-干扰素、CD3单克隆抗体或人白介素-2中的一种或多种，所述树突状细胞的诱导剂为GM-CSF、IL-4或TNF-α中的一种或多种；
优选地，所述需要治疗的癌症的特异性肿瘤抗原为需要治疗癌症的患者经手术切除得到的肿瘤细胞的裂解液。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的药物组合物在制备治疗癌症，例如难治性实体肿瘤或血液恶性肿瘤的药物中的用途；
优选地，所述难治性实体肿瘤或血液恶性肿瘤选自非小细胞肺癌(NSCLC)、HPV阳性宫颈癌、病毒性肝炎诱发的肝癌、肾细胞癌(RCC)、黑色素瘤、结肠直肠癌、卵巢癌以及急性、慢性淋巴细胞性白血病。
7.一种用于治疗癌症的试剂盒，其包括分开放置的抗细胞程序性死亡受体1抗体，以及共培养的树突状细胞和细胞因子诱导的杀伤细胞的诱导剂。
8.根据权利要求7所述的试剂盒，其中所述共培养的树突状细胞和细胞因子诱导的杀伤细胞的诱导剂为用于对从需要治疗癌症的患者自体外周血分离的单核细胞进行诱导以获得树突状细胞和细胞因子诱导的杀伤细胞的试剂；
优选地，所述树突状细胞的诱导试剂选自GM-CSF、IL-4或TNF-α中的一种或多种；优选地，所述细胞因子诱导的杀伤细胞诱导剂选自γ-干扰素、CD3单克隆抗体或人白介素-2中的一种或多种；
优选地，所述γ-干扰素与抗细胞程序性死亡受体1抗体的比例为1000-50000U：50-150mg；所述CD3单克隆抗体与抗细胞程序性死亡受体1抗体的比例为0.5-25μg：50-150mg；所述重组人白介素-2与抗细胞程序性死亡受体1抗体的比例为200-60000U：50-150mg；所述GM-CSF与抗细胞程序性死亡受体1抗体的比例为1000-50000U：50-150mg；所述IL-4与抗细胞程序性死亡受体1抗体的比例为500-25000U：50-150mg；所述TNF-α与抗细胞程序性死亡受体1抗体的比例为1000-50000U：50-150mg。
9.根据权利要求7或8所述的试剂盒，其中所述抗细胞程序性死亡受体1抗体为细胞因子诱导的杀伤细胞的免疫检查点阻断剂；更优选地，所述抗细胞程序性死亡受体1抗体为pembrolizumab；
优选地，所述用于治疗癌症的试剂盒还包括用于树突状细胞和细胞因子诱导的杀伤细胞扩增的试剂和工具。
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