CN106544365A

CN106544365A - 一种人抗cd19嵌合抗原受体修饰的cik的制备方法及应用

Info

Publication number: CN106544365A
Application number: CN201610933594.0A
Authority: CN
Inventors: 刘明录; 万磊; 李言志; 冯健海; 金海峰; 强邦明; 张传鹏
Original assignee: Jinan Xingyi Medical Technology Co Ltd
Current assignee: Shandong Xinrui Biotechnology Co ltd
Priority date: 2016-10-25
Filing date: 2016-10-25
Publication date: 2017-03-29
Anticipated expiration: 2036-10-25
Also published as: CN106544365B

Abstract

本发明公开了一种人抗CD19嵌合抗原受体修饰的CIK的制备方法及应用，编码嵌合抗原受体scFv(CD19)‑CD8‑(4‑1BB)‑CD3ζ的融合基因片段，将所述融合基因片段插入慢病毒表达载体，包装成携带scFv(CD19)‑CD8‑(4‑1BB)‑CD3ζ编码基因的慢病毒，将所述携带scFv(CD19)‑CD8‑(4‑1BB)‑CD3ζ编码基因的慢病毒感染患者自体淋巴细胞诱导的CIK，该嵌合抗原受体scFv(CD19)‑CD8‑(4‑1BB)‑CD3ζ]修饰的CIK可用于B细胞淋巴瘤白血病的治疗。

Description

一种人抗CD19嵌合抗原受体修饰的CIK的制备方法及应用

技术领域

本发明属于生物与新医药技术领域，公开了一种人抗CD19嵌合抗原受体修饰的CIK的制备方法及应用。

背景技术

肿瘤的发病率逐年上升，恶性肿瘤已严重危害人类健康。目前肿瘤治疗手段却仍未取得实质性的进展，当今肿瘤的治疗手段还停留在传统的手术切除、化疗和放疗等方法。部分中晚期患者手术切除虽可以去除肿瘤病灶，但对转移病灶效果不佳，而放疗、化疗除对病变组织外，对正常组织也会造成损伤，给病人带来较大的伤害，目前恶性肿瘤的死亡率仍居高不下。因此，人们力图寻找更为稳妥有效的治疗对策，其中，通过已鉴定的肿瘤特异性抗原为基础进行肿瘤免疫治疗已成为当今肿瘤治疗的研究热点。

B细胞淋巴瘤，通常发生于儿童和成年人，是一种攻击免疫系统中B细胞的癌症类型，包括霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤。其中，经典的霍奇金淋巴瘤和结节性淋巴细胞淋巴瘤起源于B细胞的肿瘤。肿瘤由融合成片的多形性瘤细胞组成，多形性细胞类似HL中的陷窝细胞和H细胞，病变内有些区域似CHL，另一些区域似DLBCL2间质弥漫或局灶性纤维化，炎症性背景通常不明显，坏死较常见。

CD19是诊断B淋巴细胞系肿瘤和鉴定B淋巴细胞的最好标志，是典型的I型跨膜糖蛋白，拥有一个胞内C-端和胞外N-端。在正常的淋巴组织中，CD19位于生发中心细胞(B细胞和滤泡树突状细胞)、套区细胞和滤泡间散在的细胞，整体的染色方式类似于CD20和CD22，但是与后两者不同的是，CD19也表达于前B细胞，但不在成熟浆细胞中表达。在B细胞肿瘤组织中，CD19阳性见于绝大多数的B细胞中路，浆细胞淋巴瘤以及T细胞肿瘤阴性。Masir的研究表明，CD19在14％弥漫性大B细胞淋巴瘤、30％的T细胞丰富的B细胞淋巴瘤和75％的移植后B淋巴增值性疾病中阴性，在经典霍奇金病中的R-S细胞亦不表达。它主要作为B细胞共受体与CD21和CD81结合，经激活后，CD19的细胞质部分磷酸化，与Src链激素酶类结合。CD19作为一种重要的信号转导分子，调节B淋巴细胞的生长激活和活化，在调节B淋巴细胞抗原受体和其他表面受体的信号阈值中起重要作用，是与B淋巴细胞分化、活化、增殖及抗体产生有关的重要膜抗原.

CIK(多种细胞因子诱导的杀伤细胞，cytokine-induced killer)，是将人外周血单个核细胞在体外用多种细胞因子(如抗CD3单克隆抗体、IL-2和IFN-γ等)共同培养一段时间后获得的一群异质细胞。CIK细胞中的效应细胞CD3+CD56+细胞在正常人外周血中极少，仅1％～5％。由于该种细胞同时表达CD3+和CD56+两种膜蛋白，故又被称为NK细胞样T淋巴细胞，兼具有T淋巴细胞强大的抗瘤活性和非MHC限制性杀瘤优点。CIK通过三种途径杀灭肿瘤细胞和病毒感染细胞：(1)CIK对肿瘤细胞和病毒感染细胞的直接杀伤，通过释放颗粒酶/穿孔素等毒性颗粒，导致肿瘤细胞裂解。(2)CIK释放的大量炎性细胞因子(如FN-γ、TNF-α、IL-2等)具有抑瘤杀瘤活性，还可以通过调节机体免疫系统反应性间接杀伤肿瘤细胞。(3)CIK细胞在培养过程中表达FasL(II型跨膜糖蛋白)通过与肿瘤细胞膜表达的Fas(I型跨膜糖蛋白)结合，诱导肿瘤细胞的凋亡。相对与普通的T淋巴细胞，CIK具有以下优势：CIK细胞增值速度快；CIK具有识别肿瘤的机制，对正常的细胞无毒性作用；杀瘤谱广，可用于白血病、淋巴瘤、肺癌、胃癌、肠癌等多种肿瘤的治疗；典型的个性化生物治疗模式，通过转基因T细胞受体(T cell receptors，TCRs)和表达嵌合抗原受体(chimeric antigenreceptors)等基因工程方法改良CIK，可对肿瘤进行精准杀伤；由于CIK是活化的自体细胞，使用安全。

嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor，CAR)是模拟T细胞受体(T cellreceptor，TCR)功能的人工受体，由抗原识别结构域(单链抗体)和CIK细胞的一系列信号结构域(CD3，CD58)依次连接而成。根据胞内信号结构含有的结构域不同，CAR被划分为三代。第一代CAR蛋白的胞内域仅含有一个媒介TCR信号的CD3ζ或FcRγ。为增强CAR修饰T淋巴细胞在体内的增值和存活能力，一些共刺激分子(如CD28或4-1BB)的胞内信号结构域被加入到第一代CAR中，形成第二代CAR(含有一个共刺激分子)和第三代CAR(含有两个共刺激分子)，从而使激活T细胞的效率更高。CAR修饰的CIK能够通过其抗原识别结构域(单链抗体)识别肿瘤细胞表面抗原，然后通过胞内信号结构域将识别信号传递到胞内，激活CIK的杀伤活性，杀死肿瘤细胞。

CAR修饰的CIK治疗肿瘤，是一种利用人体自身或者直系亲属淋巴细胞诱导得到CIK，并对其修饰，使其能够识别肿瘤细胞进行精准杀伤的治疗手段。相对于目前临床使用的放疗、化疗而言，具有毒副作用小的特点。由于CAR修饰的CIK通过其CAR的抗原识别结构域识别肿瘤细胞，然后启动杀伤作用，因此具有靶向性的特点；由于CAR修饰的CIK通过CAR的抗原识别结构域直接识别肿瘤细胞表面抗原，并通过来源于CD8、CD28、CD137和CD3ζ的信号结构域直接将识别信号传递至胞内，激活CIK的杀伤活性，因此可以绕开常规免疫的主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex，MHC)的限制性。

发明内容

为了弥补以上不足，本发明提供了一种人抗CD19嵌合抗原受体修饰的CIK的制备方法及应用。

本发明的方案是：

一种人抗CD19嵌合抗原受体修饰的CIK的制备方法：将人源化抗人B细胞淋巴瘤抗原CD19的单链抗体、CD8的hinge区和跨膜区、4-1BB和CD3ζ的胞内信号结构域的核苷酸序列依次连接起来，得到编码嵌合抗原受体scFv(CD19)-CD8-(4-1BB)-CD3ζ的融合基因片段，将所述融合基因片段插入慢病毒表达载体，包装成携带scFv(CD19)-CD8-(4-1BB)-CD3ζ编码基因的慢病毒，将所述携带scFv(CD19)-CD8-(4-1BB)-CD3ζ编码基因的慢病毒感染患者自体淋巴细胞诱导的CIK，得到嵌合抗原受体scFv(CD19)-CD8-(4-1BB)-CD3ζ修饰的CIK。

作为优选的技术方案，所述的编码嵌合抗原受体scFv(CD19)-CD8-(4-1BB)-CD3ζ的融合基因片段为序列表SEQ.ID.NO.1所示的核苷酸序列。

作为优选的技术方案，所述携带scFv(CD19)-CD8-(4-1BB)-CD3ζ编码基因的慢病毒感染患者自体淋巴细胞诱导的CIK如下操作：所述携带scFv(CD19)-CD8-(4-1BB)-CD3ζ编码基因的慢病毒转染293T细胞后，所述293T细胞释放慢病毒颗粒，所述慢病毒颗粒感染患者自体淋巴细胞诱导的CIK。

作为优选的技术方案，所述患者自体淋巴细胞诱导的CIK如下制取：取患者自体外周血，分离外周血单个核细胞，用含有重组干扰素的培养基诱导培养24小时后，加入重组白细胞介素、OKT-3和5％的患者自体血浆诱导继续培养24小时；每隔三天倍比加液，培养至第14天，流式细胞术检测CIK细胞的分子标记CD3+、CD56+的阳性表达率；当CD3+阳性率>80％，CD3+CD56+双阳性率>20％，视为CIK诱导成功，收获患者自体淋巴细胞诱导的CIK。

作为优选的技术方案，所述编码嵌合抗原受体scFv(CD19)-CD8-(4-1BB)-CD3ζ的融合基因片段如下制取：通过基因合成技术将编码CD8的hinge区和跨膜区及4-1BB和CD3ζ的胞内信号结构域的核苷酸序列构成融合片段CD8-(4-1BB)-CD3ζ，然后通过重叠延伸PCR将[scFv(CD19)]和融合片段CD8-(4-1BB)-CD3ζ拼接成所述编码嵌合抗原受体scFv(CD19)-CD8-(4-1BB)-CD3ζ的基因片段。

本发明还提供一种治疗癌症的药物，含有权利要求1所述的嵌合抗原受体scFv(CD19)-CD8-(4-1BB)-CD3ζ修饰的CIK，作为活性成分制备而成。

含有嵌合抗原受体scFv(CD19)-CD8-(4-1BB)-CD3ζ修饰的CIK用于制备治疗恶性肿瘤的药物的用途。

所述恶性肿瘤为B细胞淋巴瘤。

由于采用了上述技术方案，一种人抗CD19嵌合抗原受体修饰的CIK的制备方法，将人源化抗人B细胞淋巴瘤抗原CD19的单链抗体、CD8的hinge区和跨膜区、4-1BB和CD3ζ的胞内信号结构域的核苷酸序列依次连接起来，得到编码嵌合抗原受体scFv(CD19)-CD8-(4-1BB)-CD3ζ的融合基因片段，将所述融合基因片段插入慢病毒表达载体，包装成携带scFv(CD19)-CD8-(4-1BB)-CD3ζ编码基因的慢病毒，将所述携带scFv(CD19)-CD8-(4-1BB)-CD3ζ编码基因的慢病毒感染患者自体淋巴细胞诱导的CIK，得到嵌合抗原受体scFv(CD19)-CD8-(4-1BB)-CD3ζ修饰的CIK。

本发明的优点：嵌合抗原受体scFv(CD19)-CD8-(4-1BB)-CD3ζ修饰的CIK对B淋巴细胞瘤具有明显杀伤作用，且增殖效果好，抗B淋巴肿瘤活性细胞可大量增殖，且细胞活性也大大增强，能够识别B淋巴细胞肿瘤，对正常的细胞无毒性作用，回输后，还能使机体免疫能力提高，产生特异的抗病毒作用，从而对B淋巴细胞瘤治疗施以双重的作用，相对于目前临床使用的放疗、化疗而言，没有明显的毒副作用并且在患者体内长期纯在，能有效防止病情的复发。

附图说明

图1为本发明所述的慢病毒表达质粒(pLent-scFv(CD19)-CD8-(4-1BB)-CD3ζ)的示意图，其中，顺时针序列为正向基因片段，逆时针为反向基因片段；

图2为本发明外周血淋巴细胞诱导的CIK体式显微镜下视野图；

图3为本发明外周血淋巴细胞诱导的CIK的表面分子标记CD3+，CD56+表达的流式图(B1+B2象限显示CD3+；B2+B4象限显示CD56+；B2象限显示CD3+，CD56+双阳性率为35.7％)；

图4为本发明所述的慢病毒表达质粒(pLent-scFv(CD19)-CD8-(4-1BB)-CD3ζ)转染293T细胞明视野图；

图5为荧光视野下观察慢病毒表达质粒(pLent-scFv(CD19)-CD8-(4-1BB)-CD3ζ)转染293T细胞的转染效率图；

图6为本发明所有的嵌合抗原受体scFv(CD19)-CD8-(4-1BB)-CD3ζ修饰的CIK体式显微镜下视野图；

图7为荧光显微镜下观察嵌合抗原受体scFv(CD19)-CD8-(4-1BB)-CD3ζ修饰的CIK表达效率图；

图8为流式细胞术分析嵌合抗原受体scFv(CD19)-CD8-(4-1BB)-CD3ζ修饰的CIK的表达效率图；

图9为编码嵌合抗原受体scFv(CD19)-CD8-(4-1BB)-CD3ζ的融合基因片段设计图。

具体实施方式

为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。

实施例1：将融合基因片段scFv(CD19)-CD8-(4-1BB)-CD3ζ插入慢病毒表达载体pLent-C-GFP

将融合基因片段scFv(CD19)-CD8-(4-1BB)-CD3ζ和慢病毒表达载体pLent-C-GFP(购自Vigene公司)用限制性内切酶KpnⅠ和AsiSⅠ双酶切，酶切体系见说明书。酶切产物经琼脂糖凝胶电泳分离后，利用琼脂糖凝胶DNA片段试剂盒(购自Omega公司)进行DNA片段回收。将回收的融合基因片段与线性载体通过T4连接酶(购自TaKaRa公司)16℃连接8小时。将连接产物转入E.coli Top10，37℃培养10小时后挑取单克隆，通过PCR筛选插入融合片段的单克隆，37℃培养12小时后用质粒提取试剂盒(购自Omega公司)提取质粒，具体步骤见说明书。并对插入的融合基因片段进行测序。将测序结果正确的重组质粒命名为pLent-scFv(CD19)-CD8-(4-1BB)-CD3ζ，见图1。

实施例2：嵌合抗原受体scFv(CD19)-CD8-(4-1BB)-CD3ζ修饰的细胞因子诱导的杀伤细胞的制备

(一)慢病毒的包装制备

Anti-CD19CAR示意见图9；

Anti-CD19各模块序列：

1)CAR引导序列(Leader)

2)人源化抗人B淋巴细胞瘤CD19单链抗体(VL-Linker-VH)

3)CD8Hinge区(CD8Hinge)

4)CD8的跨膜区(CD8Tm)

5)4-1BB的胞内结构域(4-1BB lc)

6)CD3ζ的胞内结构域(CD3lc)

(二)细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)的制备

取50ml患者自体外周血，用TBD样本密度分离液(购自天津灏洋华科生物)，900g离心25分钟，分离外周血单个核细胞。用含有1000IU/ml的重组干扰素α2a(购自沈阳三生制药)的培养基(购自CORNING公司，88-551-CM)诱导培养24小时后，加入1000IU/ml的重组白细胞介素2(购自沈阳三生制药)、50ng/ml的OKT-3和5％的患者自体血浆诱导继续培养24小时。每隔三天倍比加液，培养至第14天，流式细胞术检测CIK细胞的分子标记CD3+、CD56+的阳性表达率(CD3-FITC，CD16/CD56-PE抗体购自BECKMAN公司，A07735)。CD3+阳性率>80％，CD3+CD56+双阳性率>20％，视为CIK诱导成功，见图2和图3，并留取该CIK待病毒感染。

(三)慢病毒包装质粒脂质体转染239T细胞

1、细胞培养：转染前24小时将239T培养到六孔板中，使第二天细胞能生长至70-80％满。

2、转染前将六孔板中换成2ml的新鲜培养液，将LipoFiter^TM脂质体转染试剂(购自汉恒生物)混匀，pLent-scFv(CD19)-CD8-(4-1BB)-CD3ζ和辅助质粒psPAX2、pMDNA2.G三种质粒以4:3:1的比例将4.0μg的DNA溶解于100μL的DMEM培养基(购自美国生命技术公司)中，同时12μL的LipoFiter^TM溶于88μL的DMEM培养基中，室温静置5分钟。将以上两步中的DNA和LipoFiter^TM混合，室温孵育20分钟。

3、将LipoFiter^TM-DNA混合物加入六孔板的一个孔中，八字摇摆混匀，培养6小时后，去除LipoFiter^TM-DNA培养液，加入新鲜培养基继续培养。转染48小时后，荧光显微镜观察239T细胞中GFP的表达情况，见图4和图5，确定表达质粒pLent-scFv(CD19)-CD8-(4-1BB)-CD3ζ的转染效率。将含有病毒的细胞培养上清吸入EP管中，4℃，2000g离心10min，转移至新的EP管中，4.5μm滤器过滤后-80℃保存病毒液。

(四)慢病毒感染CIK及感染后CIK的扩增培养

从-80℃拿出2ml病毒液，加入终浓度为8μg/ml的聚凝胺(购自Sigma公司)，用该病毒液重悬1×10⁶个上述诱导的CIK细胞。将细胞悬液加入到6孔板的1个孔中，使病毒颗粒数与CIK细胞数比例约为3:1，1000g，32℃，离心90分钟。37℃，5％的CO₂培养箱中培养8小时后，收集细胞，重新加入病毒液和聚凝胺，1000g，32℃，再次离心90分钟后，37℃，5％的CO₂培养箱中继续培养，如此反复进行多重感染，提高CIK的感染效率。吸弃2ml培养上清，加入2ml的新鲜CORNING培养基，继续扩大培养，培养17天至细胞扩增至足够的用量。

(五)免疫荧光显微镜观察嵌合抗原受体scFv(CD19)-CD8-(4-1BB)-CD3ζ在CIK中的表达，利用流式细胞技术检测scFv(CD19)-CD8-(4-1BB)-CD3ζ在CIK中的表达效率；

以100μL生理盐水重选CIK细胞，取细胞悬液制作细胞涂片，用荧光显微镜观察抗原受体scFv(CD19)-CD8-(4-1BB)-CD3ζ在CIK中的表达效率，见图6和图7。

从培养瓶中取出2mL感染细胞，利用流式细胞仪检测感染细胞FITC(异硫氰酸盐)通道中感染细胞的阳性表达率见图8。

实施例3：嵌合抗原受体scFv(CD19)-CD8-(4-1BB)-CD3ζ修饰的CIK的抗肿瘤作用

(一)治疗前相关工作：

病人在嵌合抗原受体修饰T细胞治疗前，要确认病人肿瘤抗原是否表达嵌合抗原受体修饰T细胞所针对的肿瘤抗原。

病人在进行嵌合抗原受体T细胞治疗前，一定要进行全身身体检查，尤其是心、肺、肝、肾功能及血液检测，以确保病人治疗安全，具体检查如下：

1：心脏功能检查：

治疗前，对病人心脏功能进行评级，如果病人心脏功能在三级或三级以上，则病人不适宜进行此治疗。

2：肺功能检查：

肺功能检查通常包括肺通气试验和血液中血氧饱和度检查，如果用力吹气试验(FEV1)小于50％或小于200毫升，血氧饱和度低于90％，则病人不适宜进行治疗，需要进行相应的治疗后，然后考虑进行嵌合抗原受体T细胞治疗。

3：血液常规检查：

在治疗前，对病人进行血液常规检查，检查结果要求病人中性白细胞要大于1500个/mm³,血小板大于100000个/mm³,血红蛋白大于8g/dl,如果病人不能满足要求，则需要进行相应治疗以满足上述要求。

4：肝肾功能检查：

血生化检查中，谷丙转氨酶、天门冬氨酸氨基转移酶不能超出正常值上限的两倍，总胆红素不能超出正常值上限的1.5倍，肌酐要小于或等于1.6mg/ml,或肌酐清除率要大于70ml/min/1.73m²。

5：传染性疾病检查：

同时，对病人进行HIV,乙肝、丙肝等检查，以排除病人可能的医院传染。

6：同时要对适龄已婚妇女进行相关检查，排除病人已经怀孕可能。

7：与病人家属签署知情同意书。

(二)治疗前用药：

通过上述检查，病人符合进行嵌合抗原受体T细胞治疗要求，安排病人进行T细胞回输。

回输前30分钟，给予病人苯海拉明20mg,im，同时给予地塞米松5mg，iv。(三)回输治疗：

本发明中，嵌合抗原受体T细胞回输的总剂量为5x10⁵个。分3次回输，连续3天，回输剂量比例按照1:3:6。

在回输过程中，要求静脉滴注速度在5-10ml/min，如果病人因为身体原因不能耐受，可以把滴注速度适当放缓，以满足病人要求。

同时，在回输过程中，用心电检测仪对病人生命体征进行持续监测至回输完成后3小时。

(四)回输后跟踪随访：

病人回输完成后，要密切观察病人的生命体征及可能出现的副作用。

常见的副作用有：

1：皮肤发红、瘙痒

2：病人出现心慌、胸闷、呼吸困难

3：腹泻

4：皮下出血、皮疹

5：持续高热

6：谵妄，臆语等神经系统症状

如果出现上述症状，说明病人可能出现了细胞因子综合征，或者是移植物抗宿主病反应，应给予病人激素及对应治疗，这些症状一般持续一周左右后消失。

对于治疗效果的观察，一般表现为病人临床症状的改善。对于实体瘤来说，在回输后的一个月、三个月及半年、一年用影像跟踪观察瘤体大小的变化进行评价治疗效果。血液肿瘤要通过骨髓穿刺来确定骨髓造血细胞中肿瘤细胞的变化，一般在回输治疗后的一个月、三个月、半年及一年进行疗效的评估。

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征及本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界。

序列表

<110> 山东兴瑞生物科技有限公司

<120> 一种人抗CD19嵌合抗原受体修饰的CIK的制备方法及应用

<130> 2016

<160> 1

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1413

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1413

atggccctcc ctgtcaccgc cctgctgctt ccgctggctc ttctgctcca cgccgctcgg 60

cccgaaattg tgatgaccca gtcacccgcc actcttagcc tttcacccgg tgagcgcgca 120

accctgtctt gcagagcctc ccaagacatc tcaaaatacc ttaattggta tcaacagaag 180

cccggacagg ctcctcgcct tctgatctac cacaccagcc ggctccattc tggaatccct 240

gccaggttca gcggtagcgg atctgggacc gactacaccc tcactatcag ctcactgcag 300

ccagaggact tcgctgtcta tttctgtcag caagggaaca ccctgcccta cacctttgga 360

cagggcacca agctcgagat taaaggtgga ggtggcagcg gaggaggtgg gtccggcggt 420

ggaggaagcc aggtccaact ccaagaaagc ggaccgggtc ttgtgaagcc atcagaaact 480

ctttcactga cttgtactgt gagcggagtg tctctccccg attacggggt gtcttggatc 540

agacagccac cggggaaggg tctggaatgg attggagtga tttggggctc tgagactact 600

tactactctt catccctcaa gtcacgcgtc accatctcaa aggacaactc taagaatcag 660

gtgtcactga aactgtcatc tgtgaccgca gccgacaccg ccgtgtacta ttgcgctaag 720

cattactatt atggcgggag ctacgcaatg gattactggg gacagggtac tctggtcacc 780

gtgtccagca ccactacccc agcaccgagg ccacccaccc cggctcctac catcgcctcc 840

cagcctctgt ccctgcgtcc ggaggcatgt agacccgcag ctggtggggc cgtgcatacc 900

gctggtactt gcggggtcct gctgctttca ctcgtgatca ctctttactg taagcgcggt 960

cggaagaagc tgctgtacat ctttaagcaa cccttcatga ggcctgtgca gactactcaa 1020

gaggaggacg gctgttcatg ccggttccca gaggaggagg aaggcggctg cgaactgcgc 1080

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aacgaactca atcttggtcg gagagaggag tacgacgtgc tggacaagcg gagaggacgg 1200

gacccagaaa tgggcgggaa gccgcgcaga aagaatcccc aagagggcct gtacaacgag 1260

ctccaaaagg ataagatggc agaagcctat agcgagattg gtatgaaagg ggaacgcaga 1320

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gacgctcttc acatgcaggc cctgccgcct cgg 1413

<210> 2

<211> 63

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

atggccctgc ctgtgacagc cctgctgctg cctctggctc tgctgctgca tgccgctaga 60

ccc 63

<210> 3

<211> 813

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

atggccctcc ctgtcaccgc cctgctgctt ccgctggctc ttctgctcca cgccgctcgg 60

cccgaaattg tgatgaccca gtcacccgcc actcttagcc tttcacccgg tgagcgcgca 120

accctgtctt gcagagcctc ccaagacatc tcaaaatacc ttaattggta tcaacagaag 180

cccggacagg ctcctcgcct tctgatctac cacaccagcc ggctccattc tggaatccct 240

gccaggttca gcggtagcgg atctgggacc gactacaccc tcactatcag ctcactgcag 300

ccagaggact tcgctgtcta tttctgtcag caagggaaca ccctgcccta cacctttgga 360

cagggcacca agctcgagat taaaggtgga ggtggcagcg gaggaggtgg gtccggcggt 420

ggaggaagcc aggtccaact ccaagaaagc ggaccgggtc ttgtgaagcc atcagaaact 480

ctttcactga cttgtactgt gagcggagtg tctctccccg attacggggt gtcttggatc 540

agacagccac cggggaaggg tctggaatgg attggagtga tttggggctc tgagactact 600

tactactctt catccctcaa gtcacgcgtc accatctcaa aggacaactc taagaatcag 660

gtgtcactga aactgtcatc tgtgaccgca gccgacaccg ccgtgtacta ttgcgctaag 720

cattactatt atggcgggag ctacgcaatg gattactggg gacagggtac tctggtcacc 780

gtgtccagcc accaccatca tcaccatcac cat 813

<210> 4

<211> 135

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

accacgacgc cagcgccgcg accaccaaca ccggcgccca ccatcgcgtc gcagcccctg 60

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gacttcgcct gtgat 135

<210> 5

<211> 72

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

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accctttact gc 72

<210> 6

<211> 126

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

aaacggggca gaaagaaact cctgtatata ttcaaacaac catttatgag accagtacaa 60

actactcaag aggaagatgg ctgtagctgc cgatttccag aagaagaaga aggaggatgt 120

gaactg 126

<210> 7

<211> 336

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

agagtgaagt tcagcaggag cgcagacgcc cccgcgtaca agcagggcca gaaccagctc 60

tataacgagc tcaatctagg acgaagagag gagtacgatg ttttggacaa gagacgtggc 120

cgggaccctg agatgggggg aaagccgaga aggaagaacc ctcaggaagg cctgtacaat 180

gaactgcaga aagataagat ggcggaggcc tacagtgaga ttgggatgaa aggcgagcgc 240

cggaggggca aggggcacga tggcctttac cagggtctca gtacagccac caaggacacc 300

tacgacgccc ttcacatgca ggccctgccc cctcgc 336

Claims

1.一种人抗CD19嵌合抗原受体修饰的CIK的制备方法，其特征在于：将人源化抗人B细胞淋巴瘤抗原CD19的单链抗体、CD8的hinge区和跨膜区、4-1BB和CD3ζ的胞内信号结构域的核苷酸序列依次连接起来，得到编码嵌合抗原受体scFv(CD19)-CD8-(4-1BB)-CD3ζ的融合基因片段，将所述融合基因片段插入慢病毒表达载体，包装成携带scFv(CD19)-CD8-(4-1BB)-CD3ζ编码基因的慢病毒，将所述携带scFv(CD19)-CD8-(4-1BB)-CD3ζ编码基因的慢病毒感染患者自体淋巴细胞诱导的CIK，得到嵌合抗原受体scFv(CD19)-CD8-(4-1BB)-CD3ζ修饰的CIK。

2.如权利要求1所述的一种人抗CD19嵌合抗原受体修饰的CIK的制备方法，其特征在于：所述的编码嵌合抗原受体scFv(CD19)-CD8-(4-1BB)-CD3ζ的融合基因片段为序列表SEQ.ID.NO.1所示的核苷酸序列。

3.如权利要求1所述的一种人抗CD19嵌合抗原受体修饰的CIK的制备方法，其特征在于，所述患者自体淋巴细胞诱导的CIK如下制取：取患者自体外周血，分离外周血单个核细胞，用含有重组干扰素的培养基诱导培养24小时后，加入重组白细胞介素、OKT-3和5％的患者自体血浆诱导继续培养24小时；每隔三天倍比加液，培养至第14天，流式细胞术检测CIK细胞的分子标记CD3+、CD56+的阳性表达率；当CD3+阳性率>80％，CD3+CD56+双阳性率>20％，视为CIK诱导成功，收获患者自体淋巴细胞诱导的CIK。

4.如权利要求1所述的一种人抗CD19嵌合抗原受体修饰的CIK的制备方法，其特征在于，将所述携带scFv(CD19)-CD8-(4-1BB)-CD3ζ编码基因的慢病毒感染患者自体淋巴细胞诱导的CIK如下操作：所述携带scFv(CD19)-CD8-(4-1BB)-CD3ζ编码基因的慢病毒转染293T细胞后，所述293T细胞释放慢病毒颗粒，所述慢病毒颗粒感染患者自体淋巴细胞诱导的CIK。

5.如权利要求1所述的一种人抗CD19嵌合抗原受体修饰的CIK的制备方法，其特征在于，所述编码嵌合抗原受体scFv(CD19)-CD8-(4-1BB)-CD3ζ的融合基因片段如下制取：通过基因合成技术将编码CD8的hinge区和跨膜区及4-1BB和CD3ζ的胞内信号结构域的核苷酸序列构成融合片段CD8-(4-1BB)-CD3ζ，然后通过重叠延伸PCR将[scFv(CD19)]和融合片段CD8-(4-1BB)-CD3ζ拼接成所述编码嵌合抗原受体scFv(CD19)-CD8-(4-1BB)-CD3ζ的基因片段。

6.一种治疗癌症的药物，其特征在于：含有权利要求1所述的嵌合抗原受体scFv(CD19)-CD8-(4-1BB)-CD3ζ修饰的CIK。

7.权利要求1所述的一种人抗CD19嵌合抗原受体修饰的CIK用于制备治疗恶性肿瘤的药物的用途。

8.如权利要求7所述的制备治疗恶性肿瘤的药物的用途，其特征在于：所述恶性肿瘤为B细胞发生的淋巴瘤。