CN107541499A - 一种靶向免疫检测点tnfr2的cik的制备及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种靶向免疫检测点TNFR2的CIK的制备，将CD8leader、人源化抗TNFR2的单链抗体、CD8的铰链区和跨膜区、CD3ζ胞内信号区依次串联构成，得到融合基因片段Leader‑scFv(TNFR2)‑CD8‑CD3ζ，将所述融合基因片段Leader‑scFv(TNFR2)‑CD8‑CD3ζ插入慢病毒表达载体，包装成携带Leader‑scFv(TNFR2)‑CD8‑CD3ζ编码基因的慢病毒，将所述携带Leader‑scFv(TNFR2)‑CD8‑CD3ζ编码基因的慢病毒感染患者自体淋巴细胞诱导的CIK，得到靶向免疫检测点TNFR2的CIK，该发明能够针对恶性肿瘤精准治疗。

Description

一种靶向免疫检测点TNFR2的CIK的制备及其应用

技术领域

本发明涉及新医药技术领域，更具体的说，是一种靶向免疫检测点TNFR2的CIK的制备及其应用。

背景技术

恶性肿瘤发病率和死亡率居高不下，是威胁人类健康的头号杀手。传统治疗方法对中晚期患者疗效非常有限，临床上亟待研究更为有效的治疗方法。免疫细胞治疗中的CIK(cytokine induced killer)细胞疗法已在临床广泛应用并取得一定的治疗效果。然而由于恶性肿瘤微环境相对复杂，免疫细胞浸润不足，且浸润的免疫细胞受不同调节性T细胞亚群(regulatory T cells，T_reg)及其产生的转化生长因子β₁(TGF-β₁)、白细胞介素(IL)4、IL-10等抑制分子的严密控制，阻止其激活与趋化，从而形成了肿瘤免疫逃逸，使免疫细胞不仅不能清除肿瘤细胞，还通过其分泌的细胞因子促进肿瘤生长。因此如何突破肿瘤微环境的限制，提高免疫治疗的效果是目前研究的热点和难点。

免疫检测点治疗如抗CTLA-4和抗PD-1/PD-L1治疗是以效应T细胞(T effectorcell，T_eff)的调节通路为靶点来提高抗肿瘤效应的治疗方法，已取得重要临床进展并成为一种新的抗癌武器。这类治疗的关键在于阻断肿瘤微环境中T_eff的免疫抑制信号，解除T_eff与肿瘤细胞之间的免疫抑制信号通路，恢复T_eff消灭肿瘤细胞的作用。肿瘤坏死因子受体II(Tumor necrosisfactor receptor 2，TNFR2)是免疫检测点的新成员之一，在肿瘤微环境中免疫抑制性的T_reg(CD4⁺CD25^hiFoxP3⁺)和很多类型的癌细胞如：肾癌、结肠癌、霍奇金淋巴瘤、骨髓瘤和卵巢癌的表面上表达中高度表达。

由此本发明选择TNFR2作为针对恶性肿瘤干细胞治疗研究的靶点，构建了靶向TNFR2靶点的抗TNFR2嵌合抗原受体[TNFR2，chimeric antigen receptor，CAR(TNFR2)]，并且将所制备的CAR(TNFR2)装载到CIK细胞表面，使其与CIK细胞融为一体发挥靶向杀伤TNFR2阳性的肿瘤细胞和T_reg细胞作用，从而突破肿瘤微环境的限制，极大的增强T_eff的增殖活性和肿瘤杀伤效果。

发明内容

本发明的目的是为了突破肿瘤微环境的限制，提高免疫效果，提供一种靶向免疫检测点TNFR2的CIK的制备及其应用。

本发明的方案是：

一种靶向免疫检测点TNFR2的CIK的制备，将CD8 leader、人源化抗TNFR2的单链抗体、CD8的铰链区和跨膜区、CD3ζ胞内信号区依次串联构成，得到融合基因片段Leader-scFv(TNFR2)-CD8-CD3ζ，将所述融合基因片段Leader-scFv(TNFR2)-CD8-CD3ζ插入慢病毒表达载体，包装成携带Leader-scFv(TNFR2)-CD8-CD3ζ编码基因的慢病毒，将所述携带Leader-scFv(TNFR2)-CD8-CD3ζ编码基因的慢病毒感染患者自体淋巴细胞诱导的CIK，得到靶向免疫检测点TNFR2的CIK。

作为优选的技术方案，所述融合基因片段Leader-scFv(TNFR2)-CD8-CD3ζ为序列表SEQ.ID.NO.1所示的核苷酸序列。

作为优选的技术方案，所述患者自体淋巴细胞诱导的CIK如下制取：取患者自体外周血，分离外周血单个核细胞；用含有重组干扰素的培养基诱导培养24小时后，加入重组白细胞介素2、OKT-3和5％的患者自体血浆诱导继续培养24小；每隔两天倍比加液，培养至第14天，流式细胞术检测T细胞中的CD3⁺、CD56⁺的阳性表达率；CD3⁺阳性率>80％，CD3⁺CD56⁺双阳性率>20％，视为CIK诱导成功，收获患者自体淋巴细胞诱导的CIK，并留取该CIK待病毒感染。

作为优选的技术方案，包装成携带Leader-scFv(TNFR2)-CD8-CD3ζ编码基因的慢病毒如下操作：将慢病毒包装细胞系293T接种于含培养皿中，37℃，5％的CO₂条件下培养，贴壁率为70％-80％后进行转染；重组质粒与慢病毒包装质粒采用磷酸钙转染法共转染293T细胞，具体方法参考分子克隆；转染后24h后，细胞明显增大、呈球形，细胞核变大，变圆，贴壁能力下降而易脱落；48h后在倒置荧光显微镜下观察到细胞内有绿色荧光蛋白表达；72h后，收集上清，过滤除菌，测定病毒滴度，在-80℃低温冰箱中保存。

本发明还提供一种识别后进行治疗恶性肿瘤的药物，其特征在于：含有权利要求1所述的靶向免疫检测点TNFR2的CIK。

含有靶向免疫检测点TNFR2的CIK用于制备治疗恶性肿瘤的药物的用途。

作为优选的技术方案，所述恶性肿瘤为肾癌、结肠癌、霍奇金淋巴瘤、骨髓瘤和卵巢癌。

由于采用了上述技术方案，一种靶向免疫检测点TNFR2的CIK的制备，将CD8leader、人源化抗TNFR2的单链抗体、CD8的铰链区和跨膜区、CD3ζ胞内信号区依次串联构成，得到融合基因片段Leader-scFv(TNFR2)-CD8-CD3ζ，将所述融合基因片段Leader-scFv(TNFR2)-CD8-CD3ζ插入慢病毒表达载体，包装成携带Leader-scFv(TNFR2)-CD8-CD3ζ编码基因的慢病毒，将所述携带Leader-scFv(TNFR2)-CD8-CD3ζ编码基因的慢病毒感染患者自体淋巴细胞诱导的CIK，得到靶向免疫检测点TNFR2的CIK，该发明由此本发明选择TNFR2作为针对恶性肿瘤干细胞治疗研究的靶点，构建了靶向TNFR2靶点的抗TNFR2嵌合抗原受体，并且将所制备的CAR(TNFR2)装载到CIK细胞表面，使其与CIK细胞融为一体发挥靶向杀伤肿瘤细胞和TNFR2阳性的T_reg细胞作用，从而突破肿瘤微环境的限制，极大的增强T_eff的增殖活性和肿瘤杀伤效果。

本发明的有益效果为：

1.首次采用为靶点构建抗TNFR2的嵌合抗原受体并装载到自体的CIK细胞。修饰的CIK细胞不但特异性识别杀伤TNFR2阳性肿瘤细胞，减轻了对非肿瘤细胞的杀伤作用，降低了肿瘤抗原逃逸的几率，而且能够自行阻断免疫检测点即特异性识别杀伤肿瘤微环境中TNFR2阳性的T_reg细胞，解除免疫系统的抑制，极大的增强T_eff的增殖活性和肿瘤杀伤效果。概括地说，抗TNFR2的嵌合抗原受体装载的CIK具有一石二鸟的作用：直接杀死肿瘤细胞和增强抗肿瘤免疫反应。

2.本发明是基于第一代嵌合抗原受体构建的抗TNFR2嵌合抗原受体，不含有会降低杀伤细胞激活所需的阈值的共刺激分子，并且修饰的CIK在较低效靶比(1:100)即可杀伤卵巢癌OVCAR3细胞系，可在之后的临床使用中会较少出现毒副作用，例如细胞因子风暴和脱靶效应等。

3.本发明的抗TNFR2的嵌合抗原受体修饰的CIK细胞可以单独应用治疗TNFR2阳性肿瘤，也可以与其它的CAR(靶向肿瘤特异性抗原)修饰的免疫细胞联合应用治疗TNFR2阴性肿瘤，减少肿瘤微环境T_reg细胞数量，相对提高了T_eff的数量及肿瘤杀伤能力。因此本发明的抗TNFR2的嵌合抗原受体修饰的CIK细胞可在肿瘤治疗中得到应用，清除患者体内肿瘤，延长患者生存期。

附图说明

图1为本发明所述的Leader-scFv(TNFR2)-CD8-CD3ζ的融合基因片段的设计图。

图2为本发明慢病毒Leader-scFv(TNFR2)-CD8-CD3ζ表达质粒的示意图。

图3为本发明靶向免疫检测点TNFR2的CIK细胞的表达CAR的效率图，其表达效率为19±2.25％。

图4为本发明靶向免疫检测点TNFR2的CIK体外杀伤能力结果图，靶向免疫检测点TNFR2的CIK细胞对TNFR2表达的肿瘤细胞的杀伤率高于TNFR2不表达的肿瘤细胞；靶向免疫检测点TNFR2的CIK细胞对肿瘤细胞杀伤作用高于CIK细胞。并且靶向免疫检测点TNFR2的CIK在较低效靶比即可杀伤卵巢癌细胞OVCAR3。

图5为本发明靶向免疫检测点TNFR2的CIK体内抑制小鼠卵巢癌细胞OVCAR3(原位移植型)的效果结果分析图，靶向免疫检测点TNFR2的CIK治疗组的肿瘤重量明显比用CIK治疗组和对照组小，不同字母代表差异显著(P<0.05)。

图6为治疗组、对照组及正常小鼠腹水T_reg(CD4⁺CD25^hiFoxP3⁺)表达情况比较分析图，正常小鼠均能检测到T_reg(CD4⁺CD25^hiFoxP3⁺)细胞；卵巢癌对照组和用CIK治疗组的T_reg(CD4⁺CD25^hiFoxP3⁺)细胞表达量明显比正常组高，差异显著(P<0.01)，但二者没有明显差异。同样移植性卵巢癌小鼠，但用靶向免疫检测点TNFR2的CIK进行治疗，其腹水中的T_reg(CD4⁺CD25^hiFoxP3⁺)细胞的水平明显比用CIK治疗组和对照组低，差异极显著(P<0.01)。以上结果表明证明靶向TNFR2的靶向免疫检测点TNFR2的CIK通过抑制T_reg(CD4⁺CD25^hiFoxP3⁺)细胞的水平达到抑制卵巢癌的生长。

图7为靶向免疫检测点TNFR2的CIK联合CAR(meso)-CIK体内抑制小鼠胰腺癌COLO357(原位移植型)的效果结果分析图，联合治疗组的肿瘤重量明显比对照组和单独治疗组小，不同字母代表差异显著(P<0.05)。

具体实施方式

为了弥补以上不足，本发明提供了一种靶向免疫检测点TNFR2的CIK的制备，以解决上述背景技术中的问题。

为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。

实施例1表达本发明核酸编码的嵌合抗原受体蛋白的慢病毒质粒的构建及病毒包装

1.将融合基因片段Leader-scFv(TNFR2)-CD8-CD3ζ插入慢病毒表达载体pLent-C-GFP。

Anti-TNFR2的CAR模块示意见图1(完整核酸序列见附录SEQ ID NO.1)。

Anti-TNFR2的CAR各模块序列

(1)CD8 Leader核酸人工序列(SEQ ID NO.2)

(2)Anti-TNFR2 antibody single chain Fv antibody(scFv)核酸人工序列(SEQID NO.3)

(3)CD8 Hinge区核酸人工序列(SEQ ID NO.4)

(4)CD8跨膜区核酸人工序列(SEQ ID NO.5)

(5)CD3ζ胞内区核酸人工序列(SEQ ID NO.6)

分别按导引子Leader的核酸人工序列、Anti-CEA的核酸人工序列、CD8Hinge区核酸人工序列、CD8跨膜区的核酸人工序列、CD3ζ的核酸人工序列委托生工生物工程(上海)有限公司合成其整个表达框，插入pLent-C-GFP载体(Invitrogen)NotI-AsiSI位点(见图2)，转化到E.coli(DH5α)，经测序正确后，使用Qiagen公司的质粒纯化试剂盒提取并纯化质粒，获得重组表达载体的高品质质粒。

2.慢病毒包装，滴度检测

将慢病毒包装细胞系293T接种于含有DMEM+10％FBS 10cm培养皿中，37℃，5％的CO₂条件下培养，贴壁率为70％-80％后进行转染。重组质粒与慢病毒包装质粒采用磷酸钙转染法共转染293T细胞，具体方法参考分子克隆。转染后24h后，细胞明显增大、呈球形，细胞核变大，变圆，贴壁能力下降而易脱落。48h后在倒置荧光显微镜下观察到细胞内有绿色荧光蛋白表达。72h后，收集上清，过滤除菌，在-80℃低温冰箱中保存备用。根据Lenti-X^TMGoStix^TM试剂盒(北京华夏远洋科技有限公司产品)测定病毒滴度，结果表明，重组慢病毒的滴度2.56×10⁶pfu/mL。

实施例2慢病毒感染CIK细胞

1.CIK的制备

取75ml患者自体外周血，用TBD样本密度分离液(购自天津灏洋华科生物)，分离外周血单个核细胞。用含有1000IU/ml的重组干扰素α2a(购自沈阳三生制药)的培养基(购自CORNING公司，88-551-CM)诱导培养24小时后，加入1000IU/ml的重组白细胞介素2(购自沈阳三生制药)、50ng/ml的OKT-3和5％的患者自体血浆诱导继续培养24小时。每隔两天倍比加液，培养至第14天，流式细胞术检测T细胞中的CD3⁺、CD56⁺的阳性表达率(CD3-FITC，CD16/CD56-PE抗体购自BECKMAN公司，A07735)。CD3⁺阳性率>80％，CD3⁺CD56⁺双阳性率>20％，视为CIK诱导成功，并留取该CIK待病毒感染。

2.慢病毒感染CIK细胞及感染后CIK细胞的扩增培养

以MOI＝5用上述重组感染CIK细胞。感染后的细胞37℃，5％CO₂培养箱中培养8小时后，收集细胞，重新加入病毒液，1000g，32℃，再次离心90分钟后，37℃，5％CO₂培养箱中继续培养，如此反复进行多重感染，提高CIK细胞的感染效率。吸弃2ml培养上清，加入2ml的新鲜CORNING培养基，继续扩大培养，培养17天至细胞扩增至足够的用量。通过荧光显微镜检测嵌合抗原受体表达，由于GFP与CAR共表达，检测GFP的阳性细胞即为表达嵌合抗原受体的阳性细胞(图3)。以未感染的CIK淋巴细胞作为阴性对照，重组慢病毒感染CIK细胞其阳性率19±2.25％，得到靶向免疫检测点TNFR2的CIK。

实施例3：靶向免疫检测点TNFR2的CIK细胞抑制小鼠卵巢癌OVCAR3及抑制T_reg(CD4⁺CD25^hiFoxP3⁺)细胞活性实验

1.体外杀伤试验

将肿瘤细胞用培养基调整到2×10⁸/ml，每孔100μL，按E：T(效应细胞和靶细胞比)为1：200、1：100、1：50、1：25、1：12.5 1：6.25、1：1，分别加入肿瘤细胞2×10⁸个、1×10⁸个、5×10⁷个、2.5×10⁷个、1.25×10⁷个、6.25×10⁶个、1×10⁶个；待细胞完全贴壁后，收集CIK细胞和靶向免疫检测点TNFR2的CIK细胞，调整细胞浓度为1×10⁶/ml，每孔100μL，培养12h。弃上清加入100μL稀释的CCK8(购自MCE公司)，孵育4～6小时，酶标仪检测OD450的吸光值。

上述肿瘤细胞为人TNFR2阳性的卵巢癌细胞OVCAR3、人TNFR2阴性的胰腺癌细胞COLO357。

检测结果如图4所示，靶向免疫检测点TNFR2的CIK细胞对TNFR2表达的肿瘤细胞的杀伤率高于TNFR2不表达的肿瘤细胞；靶向免疫检测点TNFR2的CIK细胞对肿瘤细胞杀伤作用高于CIK细胞。并且靶向免疫检测点TNFR2的CIK在较低效靶比即可杀伤卵巢癌细胞OVCAR3。

2.体内杀伤试验

试验动物为KM小鼠，SPF级，(20±2)g，6-7周龄，雌性，购自广州中医药大学。选择腹腔接种卵巢癌OVCAR3后15d，生长状况良好的荷瘤鼠，从腹腔用一次性注射器无菌吸取腹水，以生理盐水稀释细胞，洗涤2次，再用生理盐水稀释细胞数为8×10⁶个/ml，活细胞计数大于95％，取0.2ml瘤细胞悬液接种于小鼠右腋皮下。于接种7～8日皮下肿瘤长至0.3～0.4cm大小后，分离肿瘤组织，无菌条件下剪成0.3mm大小的组织，同时将30只小鼠无菌条件下进行开腔手术，露出部分卵巢，用针头将肿瘤组织推进卵巢随即用生物胶封闭开口，再将腹腔缝合。将30只经过手术的原位移植卵巢癌小鼠模型混匀后，再按A，B，C，3组每组10只分笼饲养。

A组为治疗一组，尾部静脉注射2×10⁶个细胞/只靶向免疫检测点TNFR2的CIK细胞。

B组为治疗二组，尾部静脉注射2×10⁶个细胞/只CIK细胞。

C组为空白对照组，尾部静脉注射同样剂量的生理盐水。

D组为正常对照组，选择同样大小的10只小鼠为正常对照组，不移植肿瘤但同样尾部静脉注射生理盐水。

每3天测体重1次。实验以21天为周期。实验结束之后，抽各组小鼠的腹水留取备用，并解剖小鼠分离卵巢肿瘤进行称量。

统计分析采用Graph prime统计软件分析，显著性差异按(P<0.05)；差异极显著按(P<0.01)。

结果见图5，从图中可以看出用靶向免疫检测点TNFR2的CIK治疗组的肿瘤重量明显比用CIK治疗组和对照组小，差异显著(P<0.05)。

3.靶向免疫检测点TNFR2的CIK细胞对小鼠腹水T_reg(CD4⁺CD25^hiFoxP3⁺)细胞的影响

CD4 FITC(rat anti-mouse)；CD25 PERCP-CY5.5(rat anti-mouse)；FoxP3 PE(rat anti-mouse)；同型IGG2A FITC Control荧光单抗均购自BECKMAN公司。

将以上实验获得的腹水，采用小鼠淋巴细胞分离液分离获得淋巴细胞，悬浮于2％多聚甲醛的PBS液中(4％)。荧光抗体作用后采用流式细胞仪进行三色染色，分别检测出正常小鼠腹水，治疗组和对照组腹水T_reg(CD4⁺CD25^hiFoxP3⁺)细胞的比率，采用无抗体的同型阴性作对照，结果见图6。正常小鼠均能检测到T_reg(CD4⁺CD25^hiFoxP3⁺)细胞；卵巢癌对照组和用CIK治疗组的T_reg(CD4⁺CD25^hiFoxP3⁺)细胞表达量明显比正常组高，差异极显著(P<0.01)，但二者没有明显差异。同样移植性卵巢癌小鼠，但用靶向免疫检测点TNFR2的CIK进行治疗，其腹水中的T_reg(CD4⁺CD25^hiFoxP3⁺)细胞的水平明显比用CIK治疗组和对照组低，差异极显著(P<0.01)。以上结果表明证明靶向TNFR2的靶向免疫检测点TNFR2的CIK通过抑制T_reg(CD4⁺CD25^hiFoxP3⁺)细胞的水平达到抑制卵巢癌的生长。

实施例4：靶向免疫检测点TNFR2的CIK细胞联合CAR(meso)-CIK细胞应用，能够有效地杀伤TNFR2阴性肿瘤细胞，抑制肿瘤生长

试验动物为KM小鼠，SPF级，(20±2)g，6-7周龄，雌性，购自广州中医药大学。取0.2ml胰腺癌COLO357细胞悬液接种于小鼠右腋皮下。于接种7～8日皮下肿瘤长至0.3～0.4cm大小后，分离肿瘤组织，无菌条件下剪成0.3mm大小的组织，同时将40只小鼠无菌条件下进行开腔手术，露出胰头部，用针头将肿瘤组织推进胰头部随即用生物胶封闭开口，再将胸腔缝合。将40只经过手术的原位移植胰腺癌小鼠模型混匀后，再按A，B，C，D，4组每组10只分笼饲养。

A组为联合治疗组，尾部静脉注射1×10⁶个细胞/只靶向免疫检测点TNFR2的CIK细胞和1×10⁶个细胞/只CAR(meso)-CIK(由山东兴瑞生物科技有限公司提供)。

B组为单独治疗一组，尾部静脉注射2×10⁶个细胞/只CAR(meso)-CIK细胞。

C组为单独治疗二组，尾部静脉注射2×10⁶个细胞/只靶向免疫检测点TNFR2的CIK细胞。

D组为空白对照组，尾部静脉注射同样剂量的生理盐水。

每3天测体重1次。实验以21天为周期。实验结束之后，解剖小鼠分离胰腺肿瘤进行称量。

统计分析采用Graph prime统计软件分析，显著性差异按(P<0.05)；差异极显著按(P<0.01)。

结果见图7，从图中可以看出用联合治疗组的肿瘤重量明显比对照组和单独治疗组小，差异显著(P<0.05)。

实施例5：CAR-T细胞临床应用方法：

TNFR2阳性肿瘤病人在进行嵌合抗原受体T细胞治疗前，一定要进行全身身体检查，尤其是心、肺、肝、肾功能及血液检测，以确保病人治疗安全。治疗方法是局部肿瘤注射靶向免疫检测点TNFR2的CIK细胞的总剂量为1×10⁷个，分2次回输，回输剂量比例按照3：7连续2天。同时，在回输过程中，用心电检测仪对病人生命体征进行持续监测至回输完成后3小时。病人回输完成后，若出现的副作用，给予病人激素及对应治疗，这些症状一般持续一周左右后消失。

TNFR2阴性肿瘤病人在进行嵌合抗原受体T细胞治疗前，一定要进行全身身体检查，尤其是心、肺、肝、肾功能及血液检测，以确保病人治疗安全。治疗方法是局部肿瘤注射靶向免疫检测点TNFR2的CIK和其它CAR修饰的免疫细胞的总剂量为1×10⁷个，分3次回输，回输剂量比例按照1：3：6连续3天。同时，在回输过程中，用心电检测仪对病人生命体征进行持续监测至回输完成后3小时。病人回输完成后，若出现的副作用，给予病人激素及对应治疗，这些症状一般持续一周左右后消失。

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征及本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界。

序列表

<110> 山东兴瑞生物科技有限公司

<120>一种靶向免疫检测点TNFR2的CIK的制备及其应用

<130> 2017

<160> 6

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1366

<212> DNA

<213> Anti-TNFR2的CAR人工序列

<400> 1

ggatccgcga tcgcatggcc ctgcctgtga cagccctgct gctgcctctg gctctgctgc 60

tgcatgccgc tagacccgat attgttctca cccagtctcc agcaatcatg tctgcatctc 120

caggggagaa ggtcaccata acctgcagtg ccagctcaag tgtatattac atgtattggt 180

tccagcagaa gccaggcact tctcccaaac tctggattta tagcacatcc aacctggctt 240

ctggagtccc tgttcgcttc agtggcagtg gatctgggac ctcttactct ctcacaatca 300

gccgaatgga ggctgaagat gctgccactt attactgcca gcaaaggaga aattacccgt 360

acacgttcgg aggggggacc aagctggaaa taaaacgggg aggaggagga agcggaggag 420

gaggaagcgg aggaggagga agcgaggtgc agctggtgga gtcgggggga ggcttggtac 480

agcctggggg gtccctgaga ctcgactgtg cagcctctgg attcaccttt agcagctatg 540

ccatgagctg ggtccgccag gctccaggga aggggctgga gtgggtcgca gttataagtg 600

aaaatggttc tgacacatac tacgcagact ccgtgaaggg ccggttcacc atctccagag 660

acgattccaa gaacacgctg tatctccaaa tgaacagctt gagagccgag gacacggccg 720

tatattactg tgcgagagat aggggcggag cagtttctta ctttgacgtt tggggccagg 780

gaaccctggt caccgtctcc tcagctagca ccacgacgcc agcgccgcga ccaccaacac 840

cggcgcccac catcgcgtcg cagcccctgt ccctgcgccc agaggcgtgc cggccagcgg 900

cggggggcgc agtgcacacg agggggctgg acttcgcctg tgatatctac atctgggcgc 960

ccttggccgg gacttgtggg gtccttctcc tgtcactggt tatcaccctt tactgcagag 1020

tgaagttcag caggagcgca gacgcccccg cgtacaagca gggccagaac cagctctata 1080

acgagctcaa tctaggacga agagaggagt acgatgtttt ggacaagaga cgtggccggg 1140

accctgagat ggggggaaag ccgagaagga agaaccctca ggaaggcctg tacaatgaac 1200

tgcagaaaga taagatggcg gaggcctaca gtgagattgg gatgaaaggc gagcgccgga 1260

ggggcaaggg gcacgatggc ctttaccagg gtctcagtac agccaccaag gacacctacg 1320

acgcccttca catgcaggcc ctgccccctc gcgcggccgc ctcgag 1366

<210> 2

<211> 63

<212> DNA

<213> 导引子Leader人工序列

<400> 2

atggccctgc ctgtgacagc cctgctgctg cctctggctc tgctgctgca tgccgctaga 60

ccc 63

<210> 3

<211> 726

<212> DNA

<213>Anti-TNFR2 antibody single chain Fv antibody核酸人工序列

<400> 3

gatattgttc tcacccagtc tccagcaatc atgtctgcat ctccagggga gaaggtcacc 60

ataacctgca gtgccagctc aagtgtatat tacatgtatt ggttccagca gaagccaggc 120

acttctccca aactctggat ttatagcaca tccaacctgg cttctggagt ccctgttcgc 180

ttcagtggca gtggatctgg gacctcttac tctctcacaa tcagccgaat ggaggctgaa 240

gatgctgcca cttattactg ccagcaaagg agaaattacc cgtacacgtt cggagggggg 300

accaagctgg aaataaaacg gggaggagga ggaagcggag gaggaggaag cggaggagga 360

ggaagcgagg tgcagctggt ggagtcgggg ggaggcttgg tacagcctgg ggggtccctg 420

agactcgact gtgcagcctc tggattcacc tttagcagct atgccatgag ctgggtccgc 480

caggctccag ggaaggggct ggagtgggtc gcagttataa gtgaaaatgg ttctgacaca 540

tactacgcag actccgtgaa gggccggttc accatctcca gagacgattc caagaacacg 600

ctgtatctcc aaatgaacag cttgagagcc gaggacacgg ccgtatatta ctgtgcgaga 660

gataggggcg gagcagtttc ttactttgac gtttggggcc agggaaccct ggtcaccgtc 720

tcctca 726

<211>135

<212> DNA

<213> CD8 Hinge区核酸人工序列

<400> 4

accacgacgc cagcgccgcg accaccaaca ccggcgccca ccatcgcgtc gcagcccctg 60

tccctgcgcc cagaggcgtg ccggccagcg gcggggggcg cagtgcacac gagggggctg 120

gacttcgcct gtgat 135

<210> 5

<211> 72

<212> DNA

<213> CD8跨膜区核酸人工序列

<400> 5

atctacatct gggcgccctt ggccgggact tgtggggtcc ttctcctgtc actggttatc 60

accctttact gc 72

<210> 6

<211> 126

<212> DNA

<213> CD3ζ胞内区核酸人工序列

<400> 6

agagtgaagt tcagcaggag cgcagacgcc cccgcgtaca agcagggcca gaaccagctc 60

tataacgagc tcaatctagg acgaagagag gagtacgatg ttttggacaa gagacgtggc 120

cgggaccctg agatgggggg aaagccgaga aggaagaacc ctcaggaagg cctgtacaat 180

gaactgcaga aagataagat ggcggaggcc tacagtgaga ttgggatgaa aggcgagcgc 240

cggaggggca aggggcacga tggcctttac cagggtctca gtacagccac caaggacacc 300

tacgacgccc ttcacatgca ggccctgccc cctcgc 336

Claims (7)

1.一种靶向免疫检测点TNFR2的CIK的制备，其特征在于：将CD8leader、人源化抗TNFR2的单链抗体、CD8的铰链区和跨膜区、CD3ζ胞内信号区依次串联构成，得到融合基因片段Leader-scFv(TNFR2)-CD8-CD3ζ，将所述融合基因片段Leader-scFv(TNFR2)-CD8-CD3ζ插入慢病毒表达载体，包装成携带Leader-scFv(TNFR2)-CD8-CD3ζ编码基因的慢病毒，将所述携带Leader-scFv(TNFR2)-CD8-CD3ζ编码基因的慢病毒感染患者自体淋巴细胞诱导的CIK，得到靶向免疫检测点TNFR2的CIK。

2.如权利要求1所述的一种靶向免疫检测点TNFR2的CIK的制备，其特征在于：所述融合基因片段Leader-scFv(TNFR2)-CD8-CD3ζ为序列表SEQ.ID.NO.1所示的核苷酸序列。

3.如权利要求1所述的一种靶向免疫检测点TNFR2的CIK的制备，其特征在于，所述患者自体淋巴细胞诱导的CIK如下制取：取患者自体外周血，分离外周血单个核细胞；用含有重组干扰素的培养基诱导培养24小时后，加入重组白细胞介素2、OKT-3和5％的患者自体血浆诱导继续培养24小；每隔两天倍比加液，培养至第14天，流式细胞术检测T细胞中的CD3⁺、CD56⁺的阳性表达率；CD3⁺阳性率>80％，CD3⁺CD56⁺双阳性率>20％，视为CIK诱导成功，收获患者自体淋巴细胞诱导的CIK，并留取该CIK待病毒感染。

4.如权利要求1所述的一种靶向免疫检测点TNFR2的CIK的制备，其特征在于，包装成携带Leader-scFv(TNFR2)-CD8-CD3ζ编码基因的慢病毒如下操作：将慢病毒包装细胞系293T接种于含培养皿中，37℃，5％的CO₂条件下培养，贴壁率为70％-80％后进行转染；重组质粒与慢病毒包装质粒采用磷酸钙转染法共转染293T细胞，具体方法参考分子克隆；转染后24h后，细胞明显增大、呈球形，细胞核变大，变圆，贴壁能力下降而易脱落；48h后在倒置荧光显微镜下观察到细胞内有绿色荧光蛋白表达；72h后，收集上清，过滤除菌，测定病毒滴度，在-80℃低温冰箱中保存。

5.一种识别后进行治疗恶性肿瘤的药物，其特征在于：含有权利要求1所述的靶向免疫检测点TNFR2的CIK。

6.权利要求1所述的靶向免疫检测点TNFR2的CIK用于制备治疗恶性肿瘤的药物的用途。

7.如权利要求6所述的制备治疗恶性肿瘤的药物的用途，其特征在于：所述恶性肿瘤为肾癌、结肠癌、霍奇金淋巴瘤、骨髓瘤和卵巢癌。