CN107810267A - 修饰的γδ细胞及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了用于治疗人类中的癌症或感染性疾病的组合物和方法。本发明包括γδT细胞的产生和施用，所述γδT细胞表达嵌合抗原受体(CAR)，所述嵌合抗原受体(CAR)包含抗原结合结构域、铰链结构域、跨膜结构域、包含或不包含CD3ζ信号传导结构域的共刺激信号传导结构域。省略CD3ζ信号传导结构域的CAR序列在γδT细胞中的表达提供了体内CAR‑T治疗，其将仅对提供配体以便活化γδT细胞受体(TCR)的靶细胞产生细胞溶解。

Description

修饰的γδ细胞及其用途
技术领域
本申请涉及制备和使用gamma delta T细胞(γδT细胞)的方法，适当地涉及γδT细胞在同种异体或自体受体受试者中用于治疗包括病毒感染、真菌感染、原生动物感染和癌症的状况的用途，具体涉及嵌合抗原受体(CAR)修饰的γδT细胞的用途。本发明还涉及用于产生表达嵌合抗原受体的γδT细胞和用于检测CAR表达的方法。另外，本发明涉及用本文讨论的方法产生的细胞在治疗疾病诸如癌症和感染性疾病中的制药用途。
γδT淋巴细胞代表人类外周血的较小亚群(小于10％)。表达Vγ9Vδ2(γ9δ2)T细胞受体的γδT细胞识别癌细胞中由于甲羟戊酸途径的调节异常而过度产生的内源异戊烯焦磷酸(IPP)。γδT淋巴细胞产生丰富的促炎细胞因子如IFN-γ，其强有力的细胞毒性效应功能和不依赖MHC的抗原识别的能力使其成为癌症免疫治疗的重要角色。已经表明γδT细胞能够在体外杀死许多不同类型的肿瘤细胞系和肿瘤，包括白血病、成神经细胞瘤和多种癌。此外，已经证明，γδT细胞可以自发地或在用不同的二膦酸(bisphosphonate)(包括唑来膦酸(zoledronate))处理之后识别并杀死许多不同的分化的肿瘤细胞。人类肿瘤细胞可以有效地将氨基二膦酸和焦磷酸单酯(pyrophosphomonoester)化合物呈递至γδT细胞，诱导其增殖并产生IFN-γ。
γδT细胞的自体移植策略已经用于克服与同种异体干细胞移植相关的缺点。作为此类自体移植技术的一部分，诱导和培养足够数目的γδT细胞以用于发挥自体治疗作用的方法先前已经被例如，US 2002/0107392公开。然而，自体治疗策略受到许多缺点的影响。
因此，需要使用γδT细胞的替代和/或改进的治疗策略。
发明概述
鉴定和扩增癌症特异性T细胞克隆的困难导致嵌合抗原受体(CAR)的开发。不依赖TCR-MHC/肽识别，CAR使用单克隆抗体重新定向针对靶抗原的T细胞特异性。迄今，多项临床研究已经采用alpha beta(αβ)T细胞的CAR转导，而没有一项临床研究使用gamma delta(γδ)T细胞/淋巴细胞这样做。本发明人已经确定，γδT细胞/淋巴细胞的CAR转导可以是有利的。
如以上列出的，外周血内大部分γδT淋巴细胞为Vγ9Vδ2同种型。表达Vγ9Vδ2T细胞受体的γδT细胞识别癌细胞中由于甲羟戊酸途径的调节异常而过度产生的内源异戊烯焦磷酸(isopentenyl pyrophosphate，IPP)。本发明人认为gamma delta(γδ)T淋巴细胞产生丰富的促炎细胞因子如IFN-γ，其强有力的细胞毒性效应功能及其不依赖MHC识别抗原的能力使其成为癌症免疫治疗的重要角色。
已经进行了有限的体外研究来研究CAR增加gamma delta(γδ)T细胞效力的能力(Rischer等，2004,Deniger等，2013)。然而，此类研究尚未认识到利用来自一个受试者的CAR修饰的γδT细胞为第二个不同受试者提供治疗(同种异体用途)的潜力。此类研究还未认识到能够提供CAR修饰的γδT细胞以提供“可调节的(tunable)”应答的方式。
因此，本发明的第一方面提供了一种修饰的γδT细胞，所述修饰的γδT细胞表达嵌合抗原受体，其中所述嵌合抗原受体对疾病抗原具有结合特异性。
合适地，修饰的γδΤ细胞可以包含嵌合抗原受体，其中所述嵌合抗原受体包含对疾病抗原具有结合特异性的细胞外抗原结合结构域、铰链、跨膜结构域、和
(i)一个或更多个共刺激信号传导区域和无功能性CD3ζ活化/信号传导结构域(可调节CAR)，或
(ii)CD3ζ活化/信号传导结构域，或
(iii)一个或更多个共刺激信号传导区域和功能性CD3ζ活化/信号传导结构域。
在实施方案中，修饰的γδΤ细胞可以包含嵌合抗原受体，其中所述嵌合抗原受体包含对疾病抗原具有结合特异性的细胞外抗原结合结构域、铰链、跨膜结构域和一个或更多个共刺激信号传导区域和无功能性CD3ζ活化结构域。
在实施方案中，修饰的γδΤ细胞可以包含无功能性CD3ζ活化结构域，所述无功能性CD3ζ活化结构域通过嵌合抗原受体中不存在CD3ζ活化结构域提供。
合适地，在实施方案中，γδT细胞表达来自Vγ1至Vγ9和Vδ1至Vδ8的任何γδTCR配对的TCR。在实施方案中，γδΤ细胞为Vγ9Vδ2亚型。
根据本发明的第二方面，提供了本发明的第一方面的修饰的γδT细胞在治疗状况诸如癌症或感染中的用途。
根据本发明的第三方面，提供了一种核酸序列，所述核酸序列编码嵌合抗原受体(CAR)，其中所述CAR包含细胞外抗原识别结构域诸如单链可变片段(scFv)、铰链和跨膜结构域、一个或更多个共刺激信号传导区域以及任选地CD3ζ活化结构域。合适地，CD3ζ结构域也可以被认为是CD3ζ活化或信号传导结构域。认为，无功能性CD3ζ结构域不提供信号传导或提供不足以引起活化的信号传导。
在实施方案中，核酸序列可以编码嵌合抗原受体(CAR)，其中所述CAR包含细胞外抗原识别结构域、铰链、跨膜结构域、和
(i)一个或更多个共刺激信号传导区域和无功能性CD3ζ活化结构域，或
(ii)CD3ζ活化结构域，或
(iii)一个或更多个共刺激信号传导区域和CD3ζ活化结构域。
在实施方案中，无功能性CD3ζ活化结构域可通过嵌合抗原受体中不存在CD3ζ活化结构域提供。
如以上指出的，嵌合抗原受体(CAR)T细胞治疗为一种免疫治疗技术，其中T细胞被遗传工程化为具有合成受体以识别和靶向特定的抗原或蛋白(细胞表面靶)而不依赖HLA限制。
通常，“经典的”第2代或第3代CAR以模块化方式来设计，通常包含细胞外靶结合结构域(通常为单链可变片段(scFv))、铰链区域、跨膜结构域(其将CAR锚定至细胞膜)和一个或更多个细胞内信号传导结构域。信号传导结构域通常包含提供TCR样刺激(被称为信号1)的CD3zeta(CD3ζ)链活化结构域的元件和提供共刺激信号(被称为信号2)的CD28、CD137(4-1BB)、CD134(OX40)、CD244或ICOS信号传导部分的元件。在此类典型的表达CAR的T细胞中，需要信号1和信号2两者以使T细胞从静息状态释放。在不存在另外的共刺激信号(信号2)时，单独的信号1的存在不足以活化T细胞并且可能使它们无应答/无反应性(anergic)。因此，两种信号的存在为诱导T细胞活化所必需的。
采用表达CAR的T细胞(CAR-T)的临床试验已经展示了CAR-T方法，并且在2014年，抗CD19CAR T细胞治疗被美国FDA批准。尽管在CAR-T试验中已经观察到令人印象深刻的应答率，但当前该技术受到缺乏真实疾病抗原(即仅在病态细胞中表达而不在健康细胞中表达的抗原)的某种程度的限制。迄今，绝大部分CAR-T治疗均为CD19靶向的。CD19在B细胞恶性肿瘤中表达，但也在健康B细胞中表达。在该背景下，靶向CD19的CAR-T治疗可以被容忍，然而，当患者免疫系统严重受损时其面临增加的感染风险。对于大部分其他肿瘤类型，特别是实体瘤，情况并非如此，其中对健康组织的靶向将是不能容忍的。
迄今，临床试验的CAR-T疗法的另一个限制是由于对CAR-T治疗的耐受性的发展导致的复发的发生。这已经在靶向CD19的CAR-T治疗的临床试验中观察到，并且通过表现出靶(CD19)基因的选择性剪接(alternate splicing)和/或有害突变的癌细胞的出现来实现。这些‘逃逸变体(escape variant)’产生不能被CAR的scFv部分识别(同时保留足够的基因功能)的修饰的靶(CD19)蛋白。这是对任何单一靶向方法的限制；在增殖性细胞(proliferating cells)即癌症的情况下，这提供了消除靶抗原表达的阳性选择压力。
本发明利用γδT细胞特异性识别应激/病态细胞(即癌细胞或感染的细胞)的天然能力与嵌合抗原受体技术的强有力的抗原定向的细胞毒性效应功能的组合。用经典CAR转染的γδT细胞表现出针对表达CAR触发抗原的靶细胞的增强的效应功能和增加的体内存留。本发明人认为CAR修饰的γδT细胞可以使可能耐受正常γδT细胞的癌性细胞或感染的细胞易受γδΤ细胞介导的杀伤影响。合适地，不希望受理论束缚，本发明人认为，共表达经典CAR的γδT细胞将能够识别表达磷酸抗原或CAR定向抗原的细胞，并因此靶向表达磷酸抗原或CAR定向抗原的细胞以使其发生细胞溶解，因此增加可以被此类修饰的γδT细胞靶向的细胞范围。还认为，现有CAR-T治疗的限制，即由于不表达CAR抗原的癌细胞的阳性选择引起的耐受性的发展，将被将具有双重抗原特异性的表达CAR的γδT细胞来减轻。合适地，此类CAR修饰的γδT细胞可以被提供至同种异体受试者，即与最初从其获得γδT细胞的受试者不同的受试者。
如本领域技术人员将理解的，如本文讨论的通过将CAR序列提供至γδT细胞获得的作用及其用途可以适当地通过将CAR序列提供至γδT样细胞来获得。合适地，γδT样细胞可以包括被遗传工程化为表达功能性γδTCR的任何细胞。例如，αβT细胞或NKT细胞被遗传工程化为表达功能性γδTCR，因此将细胞的特异性重新定向至针对指定的γδTCR抗原(诸如在Vγ9Vδ2TCR的情况下是IPP)。
常规CAR-T技术被认为受到许多安全问题阻碍，这些安全问题阻碍了该方法在体内应用时的成功，即由于CAR触发抗原在健康组织上的表达而导致的“击中靶(on-target)”但“未击中肿瘤(off-tumour)”的毒性。在实施方案中，提供了一种CAR修饰的γδT细胞，其中CD3ζ结构域已经被去除或被致使为无功能性的，同时保留不依赖MHC的抗原识别功能(例如经由scFv)和共刺激功能(经由一个或更多个共刺激结构域)。
在实施方案中，无功能性或失活的CD3ζ结构域不能提供如本文讨论的信号1。合适地，可以提供一种修饰的γδΤ细胞，所述修饰的γδΤ细胞包含嵌合抗原受体，其中所述嵌合抗原受体包含对疾病相关抗原具有结合特异性的细胞外抗原结合结构域、铰链、跨膜结构域、一个或更多个共刺激信号传导区域，且功能性信号1提供结构域不存在。如本领域技术人员将理解的，信号1可以由CD3ζ结构域等提供。
在此类实施方案中，在一个或更多个共刺激结构域不存在时，CAR不能提供信号1，但是保留信号2功能。有利地，这导致CAR在不存在TCR信号/信号1时不能引发细胞毒性效应功能。不希望受理论束缚，本发明人认为，虽然该CAR设计由于缺乏信号1在多克隆αβT细胞群体中将是无效的，但当γδTCR被活化时，此类CAR在体外扩增的γδT细胞群体中的表达提供了有效的CAR。在实施方案中，可以提供一种表达CAR的Vγ9Vδ2同种型的γδΤ细胞，其中CAR CD3ζ结构域已经被去除或被失活或无功能化。在此类实施方案中，信号1可以通过磷酸抗原刺激Vγ9Vδ2TCR来提供。在此类实施方案中，合适地仅在磷酸抗原的存在下，CAR才可以引发细胞介导的细胞溶解和细胞因子产生。合适地，此类CAR设计可以利用Vγ9Vδ2T细胞针对磷酸抗原(仅存在于应激细胞上)的指定的特异性并允许活化，所述活化可以通过T细胞受体信号传导调节。
在实施方案中，提出了本发明的γδT细胞，特别地，γδT细胞的Vγ9Vδ2细胞或细胞群体可以被修饰为包含嵌合抗原受体以将γδT细胞定向为针对指定的抗原或蛋白(细胞表面靶(其中细胞表面靶可以包括在特定细胞环境(即肿瘤环境)中发现但不与靶细胞连接的配体))。在实施方案中，细胞表面靶可以与靶细胞连接。这允许嵌合抗原受体(CAR)γT细胞被带到与靶细胞，特别是包括细胞表面靶的靶细胞接近，并触发γδT细胞的活化。此类嵌合抗原受体(CAR)γT细胞形成本发明的一个方面。
在实施方案中，CAR构建体的抗原识别结构域可以是选自特异性识别并且能够结合细胞表面靶或接合(engage)靶细胞上的其同源受体的天然配体的文库的单链可变片段(ScFv)或抗原结合片段(Fab)结构域。
在实施方案中，如本文讨论的嵌合抗原受体所结合的疾病抗原可以是细胞表面靶、疾病相关抗原，例如，诸如在癌症或感染中与疾病状态相关的抗原，其中所述疾病相关抗原可以在被γδT细胞靶向的细胞上或其附近，使得γδT细胞可以靶向所述待靶向的细胞。在实施方案中，细胞表面靶可以是在细胞感染、细菌感染、真菌感染或原生动物感染中发现的抗原，或者可以是来自此类病毒的有活性的或失活的病毒片段、肽、蛋白、抗原区段等。可选地，细胞表面靶可以包括肿瘤特异性抗原和/或肿瘤相关抗原。
在实施方案中，提供在γδT细胞的细胞外表面上的CAR例如ScFv可以经由间隔区或直接与穿过细胞膜并与细胞内信号传导结构域连接的跨膜结构域融合。
在实施方案中，CAR例如ScFv可以经由跨膜结构域与CD3ζ(提供信号1)和共刺激免疫受体酪氨酸活化基序(co-stimulatory immunoreceptor tyrosine-based activationmotif)(ITAM)(信号2)融合。
CAR通常被认为将T细胞特异性重新定向至细胞表面靶，并克服与T细胞耐受性相关的问题。如将理解的，通常可以选择细胞表面靶，以确保γδT细胞优先于健康细胞地靶向感兴趣的细胞，例如，肿瘤细胞或病毒感染的细胞。
如将理解的，例如，在表达细胞表面靶的靶肿瘤细胞上和在正常组织两者上，嵌合抗原受体技术虽然都高度有效，但可能易发生“击中靶，未击中肿瘤的毒性(on target,off-tumour toxicity)”。
如以上讨论的，在嵌合抗原受体将信号1和信号2组分融合到单个构建体中的CAR靶向系统中，它们可以提供高度有效和敏感的靶依赖性效应应答。然而，此类CAR靶向系统对于靶细胞上表达的细胞表面靶的水平是不可调节的。
认为Vγ9Vδ2TCR介导的识别提供了另外的不依赖CAR的靶向策略，该策略允许CAR应答被“调节”，使得来自CAR的刺激信号将仅在Vγ9Vδ2TCR刺激的情况下转变为功能性应答。这允许例如广泛范围的肿瘤靶标(HMBPP/IPP应激相关途径靶)与另外的细胞表面靶被CAR修饰的γδT细胞靶向。本发明的这些CAR修饰的γδT细胞提供可调节的应答，其中对于给定的肿瘤相关抗原，焦磷酸(pyrophosphate)/膦酸(phosphonate)(药物)剂量产生次优(suboptional)信号1强度应答，具有与来自特定“共刺激CAR”的信号2协同作用的能力。
在实施方案中，体外活化测定可以用于确定用于最佳“调节应答”的相关药物剂量，以允许最大辨别表达高水平的肿瘤相关抗原(较高信号2强度)的靶肿瘤细胞与表达水平较低(产生较低信号强度)的相关未转化的细胞。在实施方案中，可利用多种(multiple)CAR靶向不同的肿瘤/细胞类型。此类多种CAR可以被提供于一个γδT细胞，特别是Vγ9Vδ2细胞上或者提供于多个γδT细胞，特别是多个Vγ9Vδ2细胞上，其中可在每一个细胞上产生不同的CAR(治疗库(treatment bank))，并且各个CARγδ细胞可用于特定肿瘤和/或细胞类型。
认为异源二聚体γδTCR在不识别MHC分子的γδT细胞上的表达意味着此类γδ细胞能够发挥有效的效应应答。特别地，此类细胞(例如Vγ9Vδ2)可以是高度细胞毒性的，产生高水平的Th1细胞因子，包括1FNγ和TNFα。
在实施方案中，γδT细胞还可以包含抑制性嵌合抗原受体(ICAR)，其中ICAR使在脱靶细胞，例如其中细胞表面靶虽是肿瘤相关但不是肿瘤特异性抗原的非肿瘤细胞中的活化最小化。为了使例如此类“击中靶、未击中肿瘤的毒性”最小化，脱靶细胞上的可以被抑制性CAR结合的第二抗原的存在将引起通过CAR对细胞表面靶的任意结合提供的信号被抑制。
在实施方案中，γδ细胞可以包含另外的CAR，所述另外的CAR能够结合靶细胞上存在的不同抗原或例如肿瘤或病毒感染的细胞环境中存在的可溶性信号传导蛋白例如可以刺激γδT细胞活化和募集的IL-12。
在实施方案中，具有至少第一嵌合抗原受体和任选地至少第一抑制性嵌合抗原受体的γδT细胞为Vγ9Vδ2T细胞。
将嵌合抗原受体提供至γδT细胞可以通过本领域已知的将嵌合抗原受体提供至T细胞的方法。
根据本发明的第四方面，提供了一种提供CAR修饰的γδT细胞的方法，其中第三方面所述的核酸被掺入/转导到γδT细胞中以遗传修饰γδT细胞。合适地，该方法可以利用慢病毒CAR构建体。合适地，该方法同时将CAR构建体转导到细胞中并选择性地扩增CAR转导的γδT细胞。
认为该方法的实施方案将能够提供“TCR可调节”或“共刺激”CAR。
如以上讨论的，在此类实施方案中，表达共刺激CAR的γδT细胞将仅在磷酸抗原(存在于感染或癌症期间的细胞表面)的存在下才被活化而不被健康细胞活化。认为，这将规避在常规CAR-T治疗中观察到的“击中靶”但“未击中肿瘤”的毒性。在此类实施方案中，认为共刺激CAR的活性可被通过γδT细胞受体的并行TCR信号传导调节。
在本发明的第三方面的实施方案中，编码CAR的核酸序列可以包含将指导蛋白定向至细胞膜的前导序列(诸如GMCSF-R分泌信号或CD8)、抗原结合结构域、铰链和跨膜结构域、一个或更多个共刺激信号传导区以及存在或不存在的CD3ζ信号传导结构域。如本文讨论的，CD3ζ信号传导结构域的不存在可以由失活或无功能性CD3ζ结构域提供。
在包含CD3ζ结构域的核酸的实施方案中，CAR被认为是‘经典’或‘不可调节的’。在其中已经省略了CD3ζ结构域的实施方案中，CAR为‘共刺激’CAR或‘TCR可调节’CAR。
在实施方案中，编码‘经典’或‘不可调节’CAR的核酸序列可以包含识别B细胞蛋白CD19的scFv。在具体实施方案中，“经典”CAR可以包含核苷酸序列SEQ ID NO:1，所述核苷酸序列SEQ ID NO:1可合适地编码氨基酸序列SEQ ID NO:2至6。
在其中核酸序列编码‘共刺激’CAR或‘TCR可调节’CAR的实施方案中，核酸序列可以包含识别B细胞蛋白CD19的scFv。在具体实施方案中，核酸序列可以包含核苷酸序列SEQID NO:7，所述核苷酸序列SEQ ID NO:7可以编码氨基酸序列SEQ ID NO:8至11。
在实施方案中，核酸可以编码细胞外抗原结合结构域，所述细胞外抗原结合结构域为特异性识别细胞表面靶并且能够结合细胞表面靶的单个scFv。合适地，在实施方案中，细胞外抗原结合结构域，优选地scFv识别并结合先前描述的被称为FMC63的克隆的B细胞抗原CD19(Nicholson IC等，1997)。
在实施方案中，CAR的抗原结合结构域与细胞表面靶、肿瘤抗原和/或肿瘤相关抗原结合。在实施方案中，细胞表面靶可以是在细胞感染、细菌感染、真菌感染、原生动物感染或病毒感染中发现的抗原，或者可以是来自此类病毒的有活性的或失活的病毒片段、肽、蛋白、抗原区段等。
合适地，在本发明的实施方案中，细胞外抗原结合结构域可以识别并结合仅存在于肿瘤细胞上而在任何其他细胞上不存在的肿瘤特异性抗原和/或存在于在一些肿瘤细胞上且也存在于在一些正常细胞上的肿瘤相关抗原。此类肿瘤特异性抗原可以包括，但不限于，CD19、EGFRvRIII、ErbB2、GM3、GD2、GD3、CD20、CD22、gp100、NY-ESO-1、碳酸酐酶IX、WT1、癌胚抗原、CA-125、MUC-1、MUC-3、上皮肿瘤抗原和MAGE型抗原(包括MAGEA1、MAGEA3、MAGEA4、MAGEA12、MAGEC2)、BAGE、GAGE、XAGE1B、CTAG2、CTAG1、SSX2、或LAGE1或病毒抗原或其组合或翻译后修饰的蛋白，其可以包括但不限于氨基甲酰化蛋白和瓜氨酸化(citrunillated)蛋白。
在实施方案中，细胞表面抗原可以是免疫检查点(checkpoint)配体，例如PD-L1。
在实施方案中，抗原结合结构域可以是细胞表面受体的细胞外部分，其然后与如以上描述的跨膜和共刺激结构域融合。
在实施方案中，CAR的跨膜结构域可以包括CD3或CD4或CD8或CD28的跨膜结构域中的一个或更多个。
在实施方案中，CAR的共刺激信号传导区域可以包含CD28、CD137(4-1BB)、ICOS、CD27、OX40、LFA1、PD-1、CD150、CD244、NKG2D的细胞内结构域中的一个或更多个。
合适地，用于在本发明中使用的γδT细胞可以从血液单核细胞(BMC)或来自癌症或被感染的组织的活组织检查产生。合适地，BMC可以经由本领域技术人员已知的任何密度离心方法从全血、白细胞分离术材料(leukapheresis material)或脐带血(UCB)中获得。密度离心方法可以包括，但不限于，ficoll梯度或淋巴细胞分离(lymphoprep)。另外，细胞分离可以通过磁性活化细胞分选(MACS)或荧光活化细胞分选(FACS)进行。
合适地，在实施方案中，γδT细胞可以在化学成分确定的培养基(chemicallydefined culture medium)中从外周血单核细胞(PBMC)、脐带血单核细胞(CBMC)或组织来源的细胞扩增，所述化学成分确定的培养基可以包括，但不限于，RPMI、TexMACS、IMDM、CTSOpTmizer或AIM-V培养基。细胞培养基可以补充有例如胎牛血清(FCS)、人AB型血清、自体血浆、人血小板裂解物或化学成分确定的血清替代物(serum replacement substitute)。此外，将血清/血浆/替代物以0.1％(v/v)至20％(v/v)的量添加至培养溶液中。
合适地，在实施方案中，Vγ9亚型的γδT细胞可以在包含IL-2、血清/血浆的化学成分确定的培养基中从PBMC或CBMC或组织来源的细胞中选择性地扩增并通过提供氨基二膦酸(aminobisphosphonate)诸如唑来膦酸(zoledronic acid)活化。可以使用来自Vγ1-9和Vδ1-8的任何γδTCR配对的多种γδTCR同种型。本领域技术人员将理解，培养条件，特别是TCR活化的方法将定义待扩增的同种型。例如，δ2T细胞通过氨基二膦酸等活化和扩增，而δ1T细胞可以使用NKG2D配体诸如MICA或MICB优先扩增。分离的PBMC/CBMC可以是新鲜分离的或冷冻保存的，然后在培养物中扩增。
二膦酸为焦磷酸的类似物，并且为其中焦磷酸骨架P-O-P的O(氧原子)被C(碳原子)取代(P-C-P)的化合物。它通常用作骨质疏松症的治疗药物。氨基二膦酸指在二膦酸中具有N(氮原子)的化合物。例如，在本发明中使用的氨基二膦酸不受特别限制；其实例包括帕米膦酸(pamidronic acid)、其盐和/或其水合物，阿仑膦酸(alendronic acid)、其盐和/或其水合物，以及唑来膦酸、其盐和/或其水合物。氨基二膦酸的浓度优选地如下：对于帕米膦酸、其盐和/或其水合物为1μM至30μM，对于阿仑膦酸、其盐和/或其水合物为1μM至30μM，并且对于唑来膦酸、其盐和/或其水合物为0.1μM至10μM。在此，作为举例，添加5μM唑来膦酸。
合适地，也可以包含50IU/ml至2000IU/mL，更优选地400IU/mL至1000IU/mL的细胞因子IL-2。合适地，培养物还可补充有50IU/ml至2000IU/ml的一种或更多种细胞因子诸如IL-15、IL-18或IL-21。
合适地，经由氨基二膦酸提供抗原可以用合成抗原诸如异戊烯焦磷酸(IPP)、溴醇焦磷酸(phosphostim)/溴醇焦磷酸(bromohydrin pyrophosphate)(BrHPP)、(E)-4-羟基-3-甲基-丁-2-烯基焦磷酸(HMBPP)或DMAPP替代。抗原刺激也可以通过与辐照的抗原呈递细胞和/或人工抗原呈递细胞(aAPC)共培养来提供。添加此类组分提供了培养环境，所述培养环境允许γδT细胞的阳性选择，通常在占培养样品中总细胞数目的70％-100％。
γδT细胞的扩增也可以用针对CD3、γδTCR、CD28和CD137的一种或更多种抗体来刺激。这些可以是可溶性的、结合至培养板的或与适当的珠，诸如dynabeads或MACSibeads缀合的。
γδT细胞可以使用先前公开的任何方法学来繁殖和扩增。
合适地，表达CAR的细胞可以通过使用被CAR识别的重组蛋白(例如，在靶向CD19的CAR的情况下是重组CD19-Fc嵌合体或重组CD19)来选择性地扩增。这可以是结合至培养板的、可溶性的或在适当的珠，诸如dynabeads或MACSibeads上的。任何同种型的γδT细胞可以被选择性地扩增至少7天，更优选地14天的时间段。合适地，培养的时间段可以持续进行约9天或更长时间，以达到数量高的基本上纯化的表达CAR的γδT细胞群体。γδT细胞可以使用TCR抗原或NKG2D配体诸如MICA或MICB扩增。分离的PBMC可以是新鲜分离或冷冻保存的，然后在培养物中扩增。扩增的γδT细胞可以被冷冻保存并在以后的时间点复苏以便进一步扩增培养。
遗传修饰γδT细胞以掺入编码CAR的核酸的方法设计可以包括本领域技术人员已知的任何技术。合适的方法包括，但不限于，用慢病毒/逆转录病毒/腺病毒的病毒转导、通过电穿孔、基于脂质的转染试剂、纳米颗粒、基于氯化钙的转染方法或细菌来源的转座子的细胞转染。
在实施方案中，当慢病毒/逆转录病毒/腺病毒可以用于转导时，可以使用如本领域技术人员理解的将增强该方法的化学试剂的纳入。这些包括，例如，但不限于：海地美溴铵(hexadimethrine bromide)(聚凝胺(Polybrene))、重组人纤连蛋白(诸如RetroNectin-Takara Clontech)和TransPlus病毒转导增强剂(ALSTEM Cell Advancements)。
合适地，可以在培养周期内的任何时间点将掺入的编码CAR的核酸导入至PBMC、CBMC或组织来源扩增的γδT细胞中。
检测γδT细胞的转导和表达CAR构建体的效率可以包括本领域技术人员已知的任何技术，并且可以包括，但不限于，定量PCR和基于抗体的检测方法，诸如流式细胞术或蛋白质印迹。
根据本发明的一个方面，提供了一种使用至少一种引物对在经典CAR与共刺激性CAR之间进行检测的方法，所述至少一种引物对选自组SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:13、以及SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:15
合适地，所述方法可以允许定量检测经典CAR和共刺激CAR。合适地，所述方法允许辨别经典CAR与共刺激CAR。
在一个实施方案中，可以采用流式细胞术，例如可以使用针对scFv独特型的抗体，所述抗体可以与用第二试剂诸如荧光标记的链霉亲和素检测的荧光染料或抗原缀合。在实施方案中，用于检测CAR的试剂可以是包含CAR识别的与哺乳动物抗体Fc部分融合的重组蛋白的嵌合蛋白，例如，CD19-Fc嵌合体。这可以用针对蛋白的Fc部分的抗体来检测。这些试剂可以与针对免疫分型标志物的荧光染料缀合的抗体组合，所述免疫分型标志物可以包括但不限于Vγ9、CD3、γδTCR、αβTCR、CD4、CD8和CD56。
使用CAR修饰的γδ细胞的治疗方法
在本发明的第二方面的实施方案中，可以将表达可调节/共刺激CAR或经典CAR的γδT细胞施用至患者，以治疗疾病诸如病毒感染、细菌感染、真菌感染或原生动物感染或癌症。
在实施方案中，表达可调节/共刺激CAR的γδT细胞可以与氨基二膦酸或其替代物共施用至受试者，其中所述替代物能够经由调节异常的生理甲羟戊酸途径来增强靶细胞上存在的磷酸抗原的水平。认为此类共施用可以有利于利用Vγ9Vδ2TCR识别来通过磷酸抗原结合的γδTCR实现信号1强度的‘药物可调节’的滴定。可调节/共刺激CAR可以基于CAR靶向的疾病相关抗原提供限制于细胞的新的信号2。
在具体实施方案中，对于给定的疾病相关抗原，可以调节氨基二膦酸或其替代物的剂量以产生次优(suboptimal)的信号1强度，以与来自特定可调节/共刺激CAR的信号2协同作用。体外活化可以用于估计用于最佳‘调谐’的相关药物剂量，以允许最大程度的辨别表达疾病相关抗原的表达高水平抗原的(较高信号2强度)细胞系与表达水平较低(产生较低信号2强度)的未转化细胞。例如，在本发明中使用的共施用的氨基二膦酸可以包括唑来膦酸、其盐和/或其水合物，阿仑膦酸、其盐和/或其水合物，以及帕米膦酸、其盐和/或其水合物。
认为通常由于与免疫系统介导的排斥相关的潜在问题，本发明的γδT细胞在治疗(其中所述γδ细胞使用本发明的CAR修饰的γδT细胞)中的同种异体使用未被考虑。本发明人认为，γδT细胞通常不引起移植物抗宿主病(graft versus host disease)，并且用于同种异体移植的γδT细胞的选择将允许将T细胞以最小的移植物抗宿主病风险提供至接受者。认为，由于γδT细胞不是MHC限制性的，同种异体移植将是一种可行的治疗，其中γδT细胞能够不依赖MHC-单倍型地靶向待被细胞溶解的细胞。鉴于γδT细胞缺乏对MHC呈递的抗原的识别，本发明人认为在高纯度同种异体移植从包括B细胞和αβT细胞受体(TCR)T细胞在内的其他白细胞中充分纯化的γδT细胞时，GVHD的风险将被最小化。另外，认为，由于接受者在某些疾病状态，包括但不限于患有严重病毒感染，例如埃博拉病毒(Ebola)、HIV和流感的患者，以及PTLD-EBV患者和患有其他癌症类型的那些患者中的免疫受损状态，将存在较低的移植物排斥几率。
如提到的，先前的治疗策略已经包括在同种异体干细胞移植之前使用阴性选择或阳性选择方法从供体血液，特别地外周血中取出T细胞。
提供了一种治疗方法，所述治疗方法包括：从供体受试者收集细胞，处理此类供体细胞以允许将足够数目的γδT细胞同种异体地提供至受体受试者，其中所述处理包括修饰γδT细胞以掺入嵌合抗原受体使得修饰的γδT细胞可以被提供至同种异体受试者以对受体受试者发挥治疗作用的步骤。
例如，γδT细胞扩增方法可以包括使用密度梯度离心从血液或白细胞分离术材料中分离外周血单核细胞(PBMC)。分离的PBMC可以被冷冻保存，然后在培养物中扩增，同时血浆作为自体赋形剂被共提取并保留用于随后的γδT细胞培养步骤。在实施方案中，可以将新鲜分离的PBMC(或从冷冻保存复苏的那些)接种到包含人重组IL-2(例如在高达1000U/ml的浓度)和唑来膦酸(例如5μM)的生长培养基中。γδT淋巴细胞群体可以经由添加唑来膦酸(第0天)和在14天培养期内连续包含IL-2从PBMC活化并选择性增殖。细胞悬浮液可以在该时间段内连续扩增(通常以1:2的分割比(split ratio))。在培养开始之后14天，可以收获细胞并重悬于乳酸林格溶液(lactated ringers solution)和HSA中，然后转移至包含100ml盐水溶液的输注瓶中。可选地，细胞可以被冷冻保存以用于在以后的时间复苏。
在实施方案中，在扩增后，γδT细胞产物满足以下最小规范；大于80％的总细胞为T淋巴细胞(CD3阳性)，γδT淋巴细胞占总T淋巴细胞群体的60％或更多(Vδ9阳性)，NK细胞少于总T淋巴细胞群体的25％(CD3阴性/CD56阳性)，细胞毒性T细胞低于总T淋巴细胞群体的10％(CD3/CD8阳性)，且辅助性T细胞低于总T淋巴细胞群体的5％(CD3/CD4阳性)。在实施方案中，满足这些规范的细胞群体可以被用作用于产生将旨在具有大于99％的γδT细胞的高纯度同种异体细胞库的起始材料。
因此，提供了一种用于将γδT细胞同种异体地提供至第二受试者的方法，所述方法包括以下步骤
-提供来自第一受试者的γδT细胞样品；
-培养γδT细胞以允许其被施用至第二受试者，其中γδT细胞被修饰以提供CAR修饰的γδT细胞。
在实施方案中，提供步骤可以包括从第一受试者收集γδT细胞的步骤。收集物可以来自供体受试者，其中供体受试者没有即刻感知的健康状况(immediate perceivedhealth conditions)。合适地，受体受试者可以是脊椎动物，例如哺乳动物，例如人或有商业价值的牲畜、研究动物、马、牛(cow)、山羊、大鼠、小鼠、兔、猪等。在实施方案中，第一和第二受试者可以是人类。如将理解的是，在本发明的上下文中，第一受试者为从其收集γδT细胞的供体受试者，并且所述细胞被用于同种异体治疗不同的第二(受体)受试者。合适地，第一个受试者具有疾病前状态(pre-disease state)。如本文使用的术语“疾病前”状态涵盖绝对性术语“健康”、“无疾病”、以及相对性术语“疾病潜在进展中的等级”、“比”患病后状态更健康或“比”患病后状态患病轻。由于“疾病前”可以由在第一受试者被诊断为患有一种疾病之前的时间定义，所以第一受试者以绝对性术语讲可以是健康的，或者可能已经患有所述疾病，其中所述疾病尚未表现出来或尚未被诊断或检测到。在实施方案中，该方法可以包括培养从第一受试者获得的γδT细胞以允许该γδT细胞被提供至第二受试者的步骤。
在实施方案中，γδT细胞可以从在清血法(apheresis)或白细胞分离术后或从脐带血获得的外周血或外周血单核细胞中收集。当用磷酸抗原或氨基二膦酸活化时，来自外周血的γδT细胞的离体扩增将优先产生Vγ9Vδ2表型的γδT细胞。使用脐带血作为离体扩增的起始材料允许依赖于活化抗原选择性扩增几种T细胞受体(TCR)亚型。这些TCR同种型可以包括从Vγ1-9和Vδ1-8(例如，但不限于Vδ1、Vδ2和Vδ3TCR变体)配对的任何γδTCR。不同亚型的γδT细胞识别不同的抗原，并且因此依赖于由靶细胞呈递的抗原将表现出不同水平的细胞毒性。每一个δTCR亚型的相对丰度主要取决于培养条件和呈递的特定抗原。可以调节培养条件以从脐带血优先扩增期望的TCR同种型。例如，表达单一TCR同种型的γδT细胞可能在治疗特定癌症类型或治疗特定病毒感染方面更为有效。
在实施方案中，收集步骤可以包括在从第一受试者收集γδT细胞之前将γδT细胞强化剂施用至第一受试者的步骤。
在实施方案中，收集γδT细胞的方法可以包括将强化剂施用至第一受试者的步骤，所述强化剂诸如诱导白细胞从骨髓动员的生长因子，诸如G-CSF，氨基二膦酸，特别是帕米膦酸、阿仑膦酸、唑来膦酸、利塞膦酸(risedronic acid)、伊班膦酸(ibandronic acid)、英卡膦酸(incadronic acid)、其盐和/或其水合物。
在一个实施方案中，处理或方法可以包括以下步骤中的任何一个或更多个：
-提供来自第一受试者(供体)的血液，例如脐带血或清血术/白细胞分离术获得的细胞，
-从血液分离外周血单核细胞，
-将氨基二膦酸和靶抗原添加至外周血单核细胞中，以及
-培养外周血单核细胞以增殖/诱导靶抗原特异性细胞毒性T细胞(CTL)和γδT细胞，
-修饰γδT细胞以提供如本文讨论的CAR修饰的γδT细胞，以及任选地将PBMC或CBMC或T细胞与人工抗原呈递细胞(aAPC)共培养以增殖/诱导靶抗原特异性细胞毒性T细胞(CTL)和γδT细胞。
本发明人认为，当这些基本上分离的γδT细胞被同种异体施用至第二受试者时，提供基本上与全血的其他组分分离的γδT细胞将降低移植失败。因此，本发明的方法可以包括从全血或其组分纯化γδT细胞的步骤。由于外周血细胞总数目的不足10％由γδT细胞构成，因此例如使用抗-γδT细胞抗体纯化全血样品或其组分，使得按样品质量多于10％由γδT细胞组成，被认为是增强同种异体治疗受体受试者的有效性。因此，本发明的方法可以包括纯化全血样品或其组分以达到在纯化的样品中大于总细胞数目的10％、25％、50％、75％、85％、90％、95％或98％为γδT细胞的步骤。
本领域技术人员已知的能够从全血、脐血或其组分纯化γδT细胞的任何方法可以形成本发明的一部分。清楚地，纯化步骤应该不影响或最小程度地影响γδT细胞的存活力。例如，以下步骤可以组合或单独使用以实现以上提及的γδT细胞纯化：-透析程序(例如清血术和/或白细胞分离术)；差速离心；培养物中γδT细胞的生长(例如在培养物中的优先生长)。
纯化步骤可至少部分地在培养步骤期间进行。例如，在培养步骤期间，添加特定组分诸如氨基二膦酸，特别是帕米膦酸、阿仑膦酸、唑来膦酸、利塞膦酸、伊班膦酸、英卡膦酸、其盐和/或其水合物中的至少一种或组合允许γδT细胞在培养物中扩增。在细胞培养期间的纯化也可以通过添加合成抗原诸如溴醇焦磷酸/溴醇焦磷酸(BrHPP)、合成的异戊烯焦磷酸(IPP)、(E)-4-羟基-3-甲基-丁-2-烯基焦磷酸(HMBPP)或与人工抗原呈递细胞(aAPC)共培养(Wang等,2011)来实现。添加此类组分提供了允许阳性选择的γδT细胞通常在纯化的样品中占总细胞数目的70％或更大的培养环境。添加此类组分提供了允许阳性选择的γδT细胞通常在纯化的样品中占总细胞数目的70％的培养环境。
氨基二膦酸可以在从培养γδT细胞的第一天的任何时间被添加。氨基二膦酸可以以0.05μM至100μM，优选地0.1μM至30μM的浓度被添加至外周血单核细胞中。合适地，二膦酸为焦磷酸的类似物，并且为其中焦磷酸骨架P-O-P的O(氧原子)被C(碳原子)取代(P-C-P)的化合物。它通常用作骨质疏松症的治疗药物。氨基二膦酸指在二膦酸中具有N(氮原子)的化合物。例如，在本发明中使用的氨基二膦酸不被特别地限制；可以使用如在WO 2006/006720和WO 2007/029689中公开的氨基二膦酸等。其具体实例包括帕米膦酸、其盐和/或其水合物，阿仑膦酸、其盐和/或其水合物，以及唑来膦酸、其盐和/或其水合物。氨基二膦酸的浓度优选地如下：对于帕米膦酸、其盐和/或其水合物为1μM至30μM，对于阿仑膦酸、其盐和/或其水合物为1μM至30μM，并且对于唑来膦酸、其盐和/或其水合物为0.1μM至10μM。在此，作为实例，添加5μM唑来膦酸。
合适地，当培养周期为7天或更长时，可以以高纯度获得包含γδT细胞的细胞群；然而，培养优选进行约14天以进一步增加γδT细胞的数目。
在实施方案中，培养周期可以是约7天或更长。合适地，培养周期可进行约14天或更长以达到大量基本上纯化的γδT细胞群体。培养通常进行14天，在该时间之后，γδT细胞停止继续指数增殖。然而，某些实施方案提供γδT细胞延长培养和选择性扩增至更大数目。此类实施方案包括向培养物提供合成抗原(例如，合成的IPP、DMAPP、Br-HPP、HMB-PP)、周期性暴露于人工或辐照的抗原呈递细胞，提供固定的抗原或抗体或使用脐带血作为用于细胞培养的起始物质。
合适地，细胞可以在该环境中培养至少7天的时间以在最小至少两次群体倍增后重新设定其细胞表面受体谱。
任选地，培养γδT细胞的步骤可以包括用于改变γδT细胞表面受体谱的步骤。
例如，培养步骤可以包括降低或消除存在于来自第一受试者的样品中提供的γδT细胞中的一种或更多种γδT细胞表面受体类型的一个或更多个子步骤。可以观察到此类步骤将γδT细胞的受体谱“重新设定”或“部分地重新设定”回到幼稚或部分幼稚的形式。预期此类重新设定增强γδT细胞治疗癌症和病毒感染的能力。已知一些T细胞受体可以由T细胞所源自的受试者中的癌症或病毒的存在诱导，并且已经发现这些受体在一些情况下可以抑制T细胞对肿瘤或病毒感染的应答性。因此，去除此类受体可以增加本发明的γδT细胞的有效性。
减少或消除一种或更多种γδT细胞受体类型可以通过本发明的方法通过培养来自第一受试者的γδT细胞数天(在这些天内细胞群体尺寸增加数倍)来实现。例如，细胞可以被培养至少7天的时间以在最小至少两次群体倍增后重新设定其细胞表面受体谱。
在其中γδT细胞表面受体谱已经被重新设定的情况下，在原代未培养的γδ细胞上存在的细胞表面受体诸如肿瘤特异性细胞表面受体B7-H1/PD-L1、B7-DC/PD-L2、PD-1和CTLA-4在培养扩增周期期间可变得不存在或数目上大幅减少。
培养步骤还可以包括监测γδT细胞的表面受体谱以确定为了显著减少或去除所选择的γδT细胞表面受体(例如，以上讨论的受体的任何一种或任何组合)所需的培养步骤的适当持续时间的步骤。监测γδT细胞受体的方法可以例如使用流式细胞术技术，诸如由Chan等，Genes and Immunity(2014)15、25至32所概述的那些技术进行。简言之，对免疫检查点抑制剂受体和/或配体特异性的抗体将用于鉴定在其细胞表面上表达免疫检查点抑制剂的γδT细胞亚群(例如用抗-Vγ9共染色)。
另外地或任选地，本发明的培养步骤可以包括在γδT细胞中诱导γδT细胞表面受体类型的表达的步骤(当从第一受试者中提取时所述γδT细胞表面受体类型在未培养的γδ细胞表面上不存在，或者包括诱导当从第一受试者中提取时存在于未培养的γδ细胞表面上的细胞表面受体类型的表达量增加的步骤。这可以通过用来源于癌症、细菌、真菌、原生动物或病毒的抗原刺激γδT细胞来实现。可以将该抗原添加至培养扩增培养基中以增加扩增的γδT细胞的功效、抗原呈递潜力和细胞毒性。合适地，抗原可以以多种形式来提供，所述多种形式包括但不限于，固定的抗原或抗体、辐照的肿瘤细胞系、人工抗原呈递细胞和添加合成的可溶性抗原。可以在培养的第一天将抗原添加至培养扩增培养基中。在实施方案中，病毒可以选自流感病毒、HIV病毒、丙型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、疱疹变体病毒、巨细胞病毒(CMV)、爱泼斯坦-巴尔病毒、水痘病毒、乳头瘤病毒、埃博拉病毒、水痘-带状疱疹病毒或天花病毒。可选地，抗原可以是在细胞感染、细菌感染、真菌感染或原生动物感染中发现的抗原。特别地，靶抗原可以来自流感病毒、HIV病毒、丙型肝炎病毒、乙型肝炎病毒、疱疹变体病毒、巨细胞病毒(CMV)、埃博拉病毒、爱泼斯坦-巴尔病毒、水痘病毒、乳头瘤病毒、水痘-带状疱疹病毒或天花病毒。
合适地，抗原可以包括来自此类病毒生物体的有活性的或失活的病毒片段、肽、蛋白、抗原区段等。
合适地，抗原可以包括仅在肿瘤细胞上存在而在任何其他细胞上不存在的肿瘤特异性抗原和/或在一些肿瘤细胞上存在且也在一些正常细胞上存在的肿瘤相关抗原。此类肿瘤特异性抗原可以包括，但不限于，癌胚抗原、CA-125、MUC-1、上皮肿瘤抗原和MAGE型抗原(包括MAGEA1、MAGEA3、MAGEA4、MAGEA12、MAGEC2)、BAGE、GAGE、XAGE1B、CTAG2、CTAG1、SSX2、或LAGE1或其组合。
合适地，感染的细胞、坏死细胞或癌细胞的裂解物可以用于提供合适的抗原。在实施方案中，抗原可以是合成的抗原，例如合成肽。可选地，可以从受试者获得抗原。合适地，在培养步骤期间，可以将约0.02-2微克/ml的抗原提供至细胞。
在实施方案中，促进γδT细胞增殖和细胞表型维持的因子诸如IL-2、IL-15或IL-18(Garcia V.等,1998,Nussbaumer O.等,2013)可以在培养外周血单核细胞的步骤中提供。合适地，在此类实施方案中，可以将50-2000U/ml、更优选地400-1000U/ml范围内的IL-2、IL-15或IL-18或其组合提供至培养基中。培养通常在2％至10％、更优选地5％CO2的存在下、在34摄氏度至38摄氏度、更优选地37摄氏度进行。可以根据培养的细胞数目来添加培养基。合适地，血清可以以0.1％至20％的量添加至培养物溶液中。作为血清，例如可以使用胎牛血清、AB型血清或自体血浆。合适地，可以使用化学成分确定的血清替代物替代血清或血浆。
在实施方案中，可以将促进耗尽的或无反应性γδT细胞复活的因子添加至培养基中。合适地，这些因子可以包括细胞因子诸如IL-15或IL-18或靶向特定免疫检查点抑制剂受体或配体的抗体例如抗-PD-L1抗体的配体(Chang K.等,2014)，但也可以包括针对CTLA-4、PD-1、PD-2、LAG3、CD80、CD86、B7-H3、B7-H4、HVEM、BTLA、KIR、TIM3或A2aR的抗体。
在实施方案中，提供步骤可以包括从供体受试者收集血液或脐带血。此类血液收集可以是约例如约15-25ml来自供体受试者的血液。在实施方案中，提供步骤可以包括收集步骤，其中收集步骤为在单次收集程序中从第一受试者收集至少γδT细胞。在实施方案中，收集步骤可以跨越多个收集期段。
在本发明的实施方案中，用于提供γδT细胞的方法可以包括确定从第一受试者收集的细胞的至少一种特征的分析步骤。在实施方案中，细胞的至少一个特征可以是细胞的DNA或RNA序列或氨基酸序列、细胞的蛋白质组或细胞的细胞表面标志物。在实施方案中，该方法可以包括对γδT细胞组织分型的步骤。γδ细胞表面标志物特征可以包括(但不限于)CD3、CD4、CD8、CD69、CD56、CD27、CD45RA、CD45、TCR-Vg9、TCR-Vd2、TCR-Vd1、TCR-Vd3、TCR-pan g/d、NKG2D，单克隆趋化因子受体抗体CCR5、CCR7、CXCR3或CXCR5或其组合。这种分型可以包括基因型信息或表型信息。表型信息可以包括在微观、细胞或分子水平的可观察或可测量的特征。基因型信息可涉及例如人类白细胞抗原(供体的HLA类型)的特定遗传多样性或突变。
合适地，本发明的γδT细胞可以提供临床级细胞系库，其可以被扩增和分化用于在大量患者中使用。在实施方案中，γδT细胞可以从脐带血起始物质离体扩增，并从多个供体组合以产生足够数目的γδT细胞以填充细胞库。此类细胞库形成本发明的单独的方面，且在此类细胞库中的分离的细胞形成本发明的单独的方面。在实施方案中，此类库将适合填充从O型血组的健康志愿者供体获得的γδT细胞，其被选择以使人类白细胞抗原(HLA)匹配的机会最大化，并且从而使同种异体移植排斥或需要大量使用免疫抑制药物的风险最小化。例如，针对UK/EU患者的此类库可以包括以下内容，这将允许以降低的排斥风险治疗相当大比例的UK/EU群体：
在实施方案中，本发明的收集和处理的γδT细胞可以被存储在细胞库或保藏机构(depository)中以备将来使用。因此，细胞可以被储存在冷冻保护剂诸如DMSO或CryoStorTM中，并在液氮中经历受控的冷冻和储存速率。γδT细胞可以根据单个或多个处理步骤要求的特定单位或剂量被储存在单位化储存器具中。
在一个实施方案中，该方法可以包括用增强收集的样品内的γδT细胞的储存、存活力或治疗能力的剂处理从第一受试者收集的细胞群体的步骤。在一个实施方案中，该方法可以包括保存步骤，其中将冷冻保存剂提供至γδT细胞样品中的γδT细胞。
在实施方案中，γδT细胞可以是磷酸抗原异戊烯焦磷酸(IPP)扩增的人类Vγ9Vδ2T细胞。
主要的外周血γδT细胞亚群表达典型的(canonical)Vγ9Vδ2TCR，Vγ9Vδ2TCR经由感测增强水平的小分子量(～350Da)焦磷酸抗原，基于调节异常的甲羟戊酸途径以TCR依赖的方式识别靶细胞。这些可以是外源性来源的，指示细菌感染(诸如HMBPP)，或者内源性的，指示在肿瘤发生期间增强的类异戊二烯合成(诸如IPP)。
Vγ9Vδ2细胞表现为识别在极宽范围的靶细胞上表达的细胞表面糖蛋白BTN3A1，Vγ9Vδ2细胞包含特异性结合焦磷酸抗原、导致BTN3A1簇集和富有成效的(productive)TCR识别的细胞质B30.2结构域。重要地，尽管Vγ9Vδ2活化依赖于经由CD3ζ和ZAP-70介导的TCR信号传导，但它受到可以通过共刺激受体诸如CD28或“应激聚焦型(stress-focussed)”受体诸如NKG2D介导的共刺激途径的强烈影响，这增强最终与TCR介导的信号传导整合的PI3-激酶途径信号。
在实施方案中，γδT细胞可以是扩增的人类Vδ1T、Vδ2T或Vδ3T细胞。
还提供了一种治疗个体中的感染或癌症的方法，所述方法包括将从不同个体获得的γδT细胞提供至所述个体的步骤。因此，供体γδT细胞被用于治疗例如病毒、细菌、真菌或原生动物的感染，或者用于治疗受体受试者中的癌症，其中供体和受体不是相同的个体。如将理解的，在将γδT细胞提供至第二受试者之前，这些γδT细胞如本文讨论的那样被修饰，以提供CAR修饰的γδT细胞。
合适地，将γδT细胞提供至受体受试者的施用方法可以包括静脉内、皮内或皮下注射。施用可以进入个体受影响的区域或全身。合适地，施用方法可以是预防性的，其中提供了足以显示对个体益处的γδT细胞的“预防有效量”或“治疗有效量”(尽管预防可以被认为是治疗，但可以视情况而定)。施用的实际量以及施用的速率和时程将取决于所治疗的状况的性质和严重程度。治疗处方，例如关于剂量等的决定，在全科医师(generalpractitioners)和其他医学医师的责任内。
在实施方案中，提供了来自第一受试者的γδT细胞，用于在治疗被病毒、细菌、真菌或原生动物感染的第二不同受试者中使用，其中受试者的所述治疗为同种异体的。
在实施方案中，提供了来自第一受试者的γδT细胞，用于治疗被病毒感染的第二不同受试者中使用，其中所述病毒选自HIV病毒、流感病毒或肝炎病毒，其中所述治疗为同种异体的。在一个实施方案中，病毒可以是乙型肝炎病毒或丙型肝炎病毒、流感病毒、疱疹变体病毒、巨细胞病毒(CMV)、爱泼斯坦-巴尔病毒、水痘病毒、乳头瘤病毒、水痘-带状疱疹病毒或天花病毒。
在实施方案中，流感病毒可以是甲型流感(Flu A)病毒。在实施方案中，流感病毒可以是禽或猪(swine)起源的大流行性流感病毒，例如，H5N1、H7N3、H7N7、H7N9和H9N2(禽亚型)或H1N1、H1N2、H2N1、H3N1、H3N2、H2N3(猪亚型)。
在实施方案中，提供了γδT细胞，用于治疗患有癌症的受试者，其中所述治疗为同种异体的。
在实施方案中，提供了来自第一受试者的γδT细胞，用于在治疗第二受试者中使用，其中第二受试者罹患病毒感染、细菌感染、真菌感染或原生动物感染中的至少一种。在实施方案中，被提供了γδT细胞的受试者可以被同时、依次或单独施用免疫抑制药物。免疫抑制药物的施用可以帮助减轻对γδT细胞的任何有害的全身应答。
在实施方案中，提供了γδT细胞，用于治疗患有爱泼斯坦-巴尔病毒诱导的淋巴组织增生性疾病(EBV-LPD)的受试者。
爱泼斯坦-巴尔病毒(EBV)为γ疱疹病毒家族的成员，并且在西方群体中普遍存在(>90％的成年人为血清阳性的)。EBV被宿主的细胞毒性T细胞(CTL)维持为潜伏性感染，这阻止病毒再活化，因此允许EBV在宿主β细胞中作为潜伏性感染无症状地持续存在。
除了与上皮起源的癌症诸如鼻咽癌(UPC)和胃癌相关以外，EBV还与许多β细胞起源的恶性肿瘤，诸如伯基特淋巴瘤(BL)、霍奇金淋巴瘤(HL)和移植后淋巴增生性疾病(PTLD)相关。
PTLD是与实体器官移植和造血干细胞移植相关的常见风险。
在实施方案中，提供了来自第一受试者的γδT细胞，用于在治疗患有EBV相关恶性肿瘤的第二受试者中使用。
在实施方案中，提供了γδT细胞，特别是包含至少一种共刺激CAR的Vγ9Vδ2细胞，用于自体地或同种异体地治疗受试者中使用。
在实施方案中，提供了一种或更多种特异性γδTCR同种型的γδT细胞，用于治疗不同病毒适应症。例如，Vδ2pos亚型可以在治疗HIV和流感感染中是最有效的(Wallace M.等，1996,Tu W.等，2011)，但是存在至少两种γδT细胞亚型Vδ1pos(Farnault L,等，2013)和Vδ2pos细胞(Xiang Z.等，2014)控制EBV感染的作用的证据。合适地，可以选择γδT细胞亚型的组合并将其施用至患者以增加γδT细胞治疗的有效性。合适地，这些可以包括使用不同的培养条件产生的单同种型γδT细胞群体或伴随使用特定的单独的一组细胞培养参数产生的多价γδT细胞群体。
在实施方案中，提供了γδT细胞，特别是Vγ9Vδ2细胞和焦磷酸/膦酸药物用于在自体地或同种异体地治疗受试者中使用。
还提供了一种用于将γδT细胞自体地提供至受试者的方法，所述方法包括以下步骤
-提供来自受试者的γδT细胞样品
-培养γδT细胞以允许其被施用返回至受试者，其中所述培养步骤包括修饰γδT细胞以提供CAR修饰的γδT细胞，CAR优选地是如本文讨论的‘共刺激’或‘TCR可调节’CAR。
以上描述的提供和培养步骤中的任一个可以适用于可以应用于本发明的γδT细胞。例如，如以上讨论的，培养γδT细胞的步骤可以包括用于改变γδT细胞表面受体谱的步骤。
还提供了一种治疗个体中的感染或癌症的方法，所述方法包括将从该个体获得的γδT细胞提供至所述个体的步骤，其中γδT细胞已经通过如由本发明描述的方法提供。
在实施方案中，癌症可以是骨髓瘤或黑素瘤。在实施方案中，癌症可以包括但不限于包括胃癌、肾细胞癌、肝细胞癌、胰腺癌、急性骨髓性白血病、多发性骨髓瘤和急性淋巴细胞白血病、非小细胞肺癌、EBV-LPD、伯基特淋巴瘤和霍奇金病的肿瘤类型。
根据本发明的另外的方面，提供了如在本发明中使用的分离的γδT细胞，特别是包含至少一种共刺激CAR的Vγ9Vδ2细胞。在实施方案中，提供了分离的γδT细胞，特别是Vγ9Vδ2细胞，具体地是γδT细胞，例如包含至少一种共刺激CAR的Vγ9Vδ2细胞和焦磷酸/膦酸药物，作为以组合使用以自体地或同种异体地治疗受试者的试剂盒。
根据本发明的另外的方面，提供了包含本发明的γδT细胞或本发明的任何方法的γδT细胞的药物组合物。
在实施方案中，组合物包含适合提供至个体以提供治疗作用的统一剂量的γδT细胞。
在实施方案中，药物组合物可以包括每人超过25x109个γδT细胞的总剂量。
在实施方案中，提供了用于在治疗癌症中使用的包含本发明的γδT细胞和抗体免疫治疗剂的药物组合物。
在实施方案中，抗体免疫治疗剂可以是免疫级联阻断剂诸如PD-1、PDL-1和/或CTLA-4抑制剂(inhibitor)、PD-1、PDL-1和CTLA-4抑制剂，例如如由Roche和Bristol MyersSquibb开发的。
在实施方案中，药物组合物可以包括能够阻断CTLA-4抑制性信号的抗体。阻断CTLA-4信号允许T淋巴细胞识别和破坏细胞。在实施方案中，此类抗体可以是伊匹单抗(Ipilimumab)(MDX-010、MDX-101)。
在实施方案中，抗体可以抑制程序性死亡-配体1(PDL-1)。在实施方案中，此类抗体可以选自MPDL3280A(Roche)或MDX-1105。
在实施方案中，药物组合物可以与细胞因子，例如，IL-2或IL-12组合。在实施方案中，药物组合物可以包括干扰素γ。
在实施方案中，提供了用于在治疗癌症中使用的包含本发明的γδT细胞和化学治疗剂的药物组合物。
在实施方案中，提供了用于在治疗病毒中使用的包含本发明的γδT细胞和治疗剂的药物组合物。
在实施方案中，药物组合物可以被用作癌症或感染的治疗剂或预防剂。
在本发明的实施方案中，γδT细胞可以是Vγ9Vδ2T细胞。
合适地，在实施方案中，本发明可以涵盖将共刺激CAR序列提供至具有指定的抗原特异性的T细胞或T细胞样细胞，例如针对α-GalCer具有特异性的NKT细胞，或者例如，对维生素B相关抗原具有特异性的粘膜相关恒定T(MAIT)细胞。在实施方案中，CAR(经典的(包括功能性CD3ζ结构域)或共刺激的(具有无功能性/不存在的CD3ζ结构域))可以被提供至γδT样细胞，其中γδT样细胞为遗传工程化以表达功能性γδT细胞受体的αβT细胞。合适地，此类修饰的细胞形成本发明的一个方面。在实施方案中，CAR(经典或共刺激的)可以被提供至γδT样细胞，其中γδT样细胞为遗传工程化以表达功能性γδT细胞受体的任何T细胞。合适地，此类修饰的细胞形成本发明的一个方面。
在实施方案中，共刺激CAR(具有无功能性/不存在的CD3ζ结构域)可以被提供至具有指定的抗原特异性的T细胞受体的任何T细胞(常规或非常规)。此类修饰的细胞形成本发明的方面。合适地，关于本发明的第一方面讨论的实施方案可以应用成为本发明的另外的方面的这些修饰的细胞。合适地，此类修饰的细胞可以如本文讨论的关联本发明的第一方面及其实施方案的细胞使用。
除非上下文另有要求，本发明的每一个方面的优选特征和实施方案加以必要的细节修改被用于每一个其他方面。
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现在将仅通过参考附图举例来描述本发明的实施方案，在附图中：
图1.(1A)提供了表达经典CAR的Vγ9亚型的γδT细胞的优点和缺点的图解表示。这些γδT细胞将被表达CAR触发抗原的健康细胞活化，并且因此易于产生“击中靶、未击中肿瘤”毒性(上图)。然而，由于通过CAR和γδTCR的双重信号传导，这些细胞可以表现出针对表达CAR-靶向抗原的感染的细胞或癌细胞的增加的活化(下图)。(1B)提供了表达共刺激CAR的Vγ9型的γδT细胞的优点的图解表示。表达共刺激CAR的γδT细胞将没有“击中靶、未击中肿瘤”毒性(由于缺乏CD3ζ结构域/信号1)，但将针对表达高水平的磷酸抗原(因此经由γδTCR提供信号1)和CAR-触发抗原的感染的细胞或转化的细胞引发增加的细胞毒性活性。
图2.提供了经典和共刺激构建体设计的说明性实施方案。(A)阐释了包含GMCSF-R分泌信号结构域、靶向针对CD19的scFv、CD28铰链、跨膜和活化结构域、CD137(4-1BB)活化结构域和CD3ζ活化结构域的经典CAR构建体设计。(B)阐释了包含GMCSF-R分泌信号结构域、针对CD19的scFv、CD28铰链、跨膜和活化结构域和CD137(4-1BB)活化结构域的共刺激CAR构建体。
图3.提供了在本发明中使用的经典CAR构建体的序列。提供了“经典”/“不可调节”CAR的核苷酸序列(A)和氨基酸序列(B)。在氨基酸序列内注释了每一个功能性结构域，这包括抗CD19scFv序列、CD28铰链、跨膜结构域、细胞内活化结构域、CD137(4-1BB)活化结构域和CD3ζ细胞内活化结构域。
图4.提供了在本发明中使用的共刺激CAR构建体的序列。提供了“共刺激”/“TCR可调节”CAR的核苷酸序列(A)和氨基酸序列(B)。在氨基酸序列内注释了每一个功能性结构域，这包括抗CD19scFv序列、CD28铰链、跨膜结构域、细胞内活化结构域和CD-137(4-1BB)活化结构域。
图5.阐释了被设计为扩增跨越存在于经典和共刺激CAR两者中的CD28序列和CD137(4-1BB)序列的靶的通用引物对。鉴别引物对被设计为从包含CD137(4-1BB)序列和CD3ζ活化结构域的序列产生扩增子，因此能够从经典CAR而不是共刺激CAR核苷酸序列扩增产物。(A)提供了用于检测经典CAR和共刺激CAR序列的两个引物对的核苷酸序列。(B)针对关于经典CAR设计的通用和鉴别引物的退火位置的按比例图示。(C)针对关于共刺激CAR设计的通用引物的退火位置的按比例图示。
图6.阐示了使用通用引物来产生经典CAR质粒(r2＝0.998)(A)和共刺激CAR质粒(r2＝0.987)(C)的标准曲线的连续稀释的质粒DNA的qPCR扩增。因此，通用引物对可以用于通过qPCR定量检测两个序列的水平。对用任一病毒转导的细胞进行qPCR。在40个循环的PCR扩增之后进行的解链曲线分析(melt curve analysis)表明，两个引物对均由来源于经典CAR转导的细胞的RNA产生单一扩增子(B)，而仅通用引物对(浅灰色)可以从自共刺激CAR转导的细胞的提取的RNA产生扩增子(D)。该数据表明两个引物对均是特异性的，因为它们仅扩增出一种产物，并且鉴别引物对(深灰色)可以区分两种转录物。
图7.通过流式细胞术评价两种B细胞淋巴瘤细胞系的CD19靶抗原表达；Daudi(上图)和Ramos(下图)伯基特淋巴瘤细胞。每一个细胞系内98％的细胞表达CD19，其中Daudi细胞展示出更高的强度/表达水平，如通过MFI确定的(A)。观察到与未转导的γδT细胞相比，表达经典CAR构建体的Vγ9γδT细胞针对CD19+癌细胞系的细胞毒性能力增加。在用唑来膦酸刺激PBMC之后48小时用包含经典CAR序列的慢病毒载体转导PBMC。将转导的细胞另外扩增7天，并通过流式细胞术研究其针对CD19阳性细胞系Daudi(上图)和Ramos(下图)的细胞溶解能力。将Daudi和Ramos细胞用无毒细胞膜标志物PKH67进行荧光标记，这允许其通过流式细胞术检测。将荧光靶细胞与经典CAR转导的(右侧)或未转导的γδT细胞(左侧)共培养4.5小时。靶癌细胞系的存活力通过膜联蛋白V和PI染色评价(B)。表达膜联蛋白V或膜联蛋白V和PI的癌细胞分别被认为是早期和晚期凋亡。Daudi细胞对γδT细胞介导的杀伤表现出较高的相对敏感度(76.4％特异性细胞死亡)，并且当Daudi细胞与经典CARγδT细胞共培养时，这种敏感度进一步增加(86.4％的特异性细胞死亡)。相比较而言，Ramos细胞对γδT细胞介导的杀伤不太敏感(39％特异性细胞死亡)，然而当Ramos细胞与经典CARγδT细胞共培养时，这种敏感度显著增加。观察到显著更高的细胞溶解水平(55％特异性细胞死亡)。该数据清楚地表明，当与未转导的γδT细胞相比时，表达经典CAR的γδT细胞针对CD19阳性癌细胞系具有增加的细胞溶解能力。用经典CARγδT细胞的特异性细胞死亡的增加百分比在Ramos细胞系(～46％)中比在Daudi细胞系(～13％)中高(C)。该数据表明，用经典CAR转导的γδT细胞可以增加耐受细胞系对细胞溶解的易感性。
图8.从白细胞分离术材料分离的PBMC用5μM唑来膦酸和1000IU/mL IL-2开始培养。在培养48小时之后，将细胞以10的MOI用包含经典CAR构建体的慢病毒转导，并包括5μg/mL聚凝胺以增强病毒转导效率。在24小时后(第3天)重复慢病毒转导。在第10天，使用抗CD3和抗Vγ9抗体通过流式细胞术评价细胞的γδT细胞纯度。不管被转导的构建体是何，在所有细胞群体中一致性地产生了高纯度γδT细胞群体；未转导的对照(81％γδT细胞)、经典CAR(86％γδT细胞)、共刺激CAR(89％γδT细胞)(A)。在第5天，从1x105个细胞中提取RNA，使用随机六聚体和逆转录酶合成cDNA，并且使用SYBR green和先前描述的通用引物进行qPCR。在转导后第5天，转导的细胞中经典CARmRNA和共刺激CAR mRNA的CAR转录物表达的相对定量表明，在转导的细胞中检测到等效水平的CAR转录物表达，而与构建体无关(数据针对18S核糖体RNA水平归一化，并被相对于基于纤维连接蛋白的转导中的CAR表达表示)(B)。测试转导的细胞针对CD19阳性细胞系Daudi和Ramos的细胞溶解能力。对Daudi和Ramos细胞进行24小时的+/-5μM唑来膦酸预处理，并且然后用无毒细胞膜标志物PKH67进行荧光标记，这允许其通过流式细胞术检测。将荧光靶细胞与经典CAR、共刺激CAR转导的(或未转导的)γδT细胞共培养4.5小时。靶癌细胞系的存活力通过膜联蛋白V和PI染色评价。Daudi细胞对γδT细胞介导的细胞溶解敏感(36％特异性细胞死亡)，并且这种敏感度通过唑来膦酸预处理被提高(48％特异性细胞死亡)。当Daudi细胞与表达经典CAR(64％特异性细胞死亡)或共刺激CAR(54％特异性细胞死亡)的γδT细胞共培养时，凋亡水平进一步增加(C)。这表明，不能独立地提供两种信号的共刺激CAR，当在活化的γδT细胞的背景下表达时，能够表现出叠加效应。为了延伸这一观察现象，使用不太敏感的Ramos细胞系。γδT细胞在这些细胞中介导较低水平的凋亡(11％特异性细胞死亡)，而唑来膦酸预处理没有作用(10％特异性细胞死亡)。然而，当γδT细胞表达经典CAR(25％特异性细胞死亡)或共刺激CAR(30％特异性细胞死亡)时，凋亡水平显著增加(D)。该数据提供对当在活化的γδT细胞的情况下接合抗原时，CD3ζ缺陷CAR(即共刺激CAR)的功能性的进一步支持。
实施例
实施例1
将PBMC通过密度离心(淋巴细胞分离)从白细胞分离术材料中分离并冷冻保存。将PBMC复苏，并将唑来膦酸(5μM)刺激的PBMC在IL-2(1000IU/mL)和5％人类AB血清的存在下培养在生长培养基中。在培养(37℃，5％CO2，潮湿气氛)48小时之后，将细胞以10的MOI用包含具有经典CAR序列(抗CD19scFv-CD28-CD137-CD3ζ)或共刺激CAR序列(抗CD19scFv-CD28-CD137)的lenti-CMV-MCS-EF1a-puro构建体的慢病毒和5μg/mL聚凝胺进行转导。在24小时后重复转导。在第5天时使用检测两个构建体表达的通用引物通过QPCR验证CAR mRNA表达。每一个构建体的特异性表达使用鉴别引物和通用引物的组合来证实(根据图5、6)。
实施例2
将细胞如实施例1中描述的用包含经典CAR序列的慢病毒来转导并扩增。在转导后7天，细胞毒性活性通过将转导的或未转导的γδT细胞与CD19阳性靶细胞系，Daudi或Ramos共培养来评价。将靶细胞系用无毒膜染料PKH67(5μM)染色，以便使用流式细胞术对CD19靶群体进行特异性可视化。在与γδT细胞或表达经典CAR的γδT细胞共孵育4.5小时后，共培养物用膜联蛋白V和碘化丙啶(PI)染色以可视化凋亡细胞。仅在靶细胞群体中计算％特异性细胞死亡。与未转导的γδT细胞相比，CAR转导的γδT细胞在CD19阳性靶细胞中引发增加的效力(图7)。
实施例3
将细胞如实施例1中描述的用包含经典CAR序列或共刺激CAR序列的慢病毒来转导并扩增。对CD19阳性靶细胞系Daudi和Ramos进行24小时的+/-5μM唑来膦酸预处理。如在实施例2中描述的评价细胞毒性活性。将PKH67染色的靶细胞(+/-zometa预处理)与转导的或未转导的γδT细胞共培养。表达共刺激CAR的γδT细胞针对CD19阳性靶细胞表现出与表达经典CAR的γδT细胞相似的细胞毒性，尽管CD3ζ活化结构域不存在，信号1转而经由IPP感测通过γδTCR的活化提供。当与未转导的γδT细胞相比时，两种CAR均为γδT细胞提供增强的细胞毒性(图8)。
尽管已经参考具体实施例特别地展示和描述了本发明，但本领域技术人员将会理解，可以对其进行形式和细节的多种改变而不偏离本发明的范围。
序列表
<110> 特希生物制药有限公司
<120> 修饰的γδ T细胞及其用途
<130> P180458.WO.01
<150> GB1506423.1
<151> 2015-04-15
<150> PCT/GB2015/051985
<151> 2015-07-08
<160> 15
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1599
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 不可调节/经典CAR的核酸序列
<400> 1
atgcttctcc tggtgacaag ccttctgctc tgtgagttac cacacccagc attcctcctg 60
atcccagaca tccagatgac acagactaca tcctccctgt ctgcctctct gggagacaga 120
gtcaccatca gttgcagggc aagtcaggac attagtaaat atttaaattg gtatcagcag 180
aaaccagatg gaactgttaa actcctgatc taccatacat caagattaca ctcaggagtc 240
ccatcaaggt tcagtggcag tgggtctgga acagattatt ctctcaccat tagcaacctg 300
gagcaagaag atattgccac ttacttttgc caacagggta atacgcttcc gtacacgttc 360
ggagggggga ctaagttgga aataacaggc tccacctctg gatccggcaa gcccggatct 420
ggcgagggat ccaccaaggg cgaggtgaaa ctgcaggagt caggacctgg cctggtggcg 480
ccctcacaga gcctgtccgt cacatgcact gtctcagggg tctcattacc cgactatggt 540
gtaagctgga ttcgccagcc tccacgaaag ggtctggagt ggctgggagt aatatggggt 600
agtgaaacca catactataa ttcagctctc aaatccagac tgaccatcat caaggacaac 660
tccaagagcc aagttttctt aaaaatgaac agtctgcaaa ctgatgacac agccatttac 720
tactgtgcca aacattatta ctacggtggt agctatgcta tggactactg gggtcaagga 780
acctcagtca ccgtctcctc agcggccgca attgaagtta tgtatcctcc tccttaccta 840
gacaatgaga agagcaatgg aaccattatc catgtgaaag ggaaacacct ttgtccaagt 900
cccctatttc ccggaccttc taagcccttt tgggtgctgg tggtggttgg gggagtcctg 960
gcttgctata gcttgctagt aacagtggcc tttattattt tctgggtgag gagtaagagg 1020
agcaggctcc tgcacagtga ctacatgaac atgactcccc gccgccccgg gcccacccgc 1080
aagcattacc agccctatgc cccaccacgc gacttcgcag cctatcgctc caaacggggc 1140
agaaagaaac tcctgtatat attcaaacaa ccatttatga gaccagtaca aactactcaa 1200
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<223> 分泌信号
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20
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> 抗-CD19 scFv
<400> 3
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1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr
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Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Thr Gly Ser Thr Ser Gly
100 105 110
Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr Lys Gly Glu Val Lys
115 120 125
Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln Ser Leu Ser
130 135 140
Val Thr Cys Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr Gly Val Ser
145 150 155 160
Trp Ile Arg Gln Pro Pro Arg Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly Val Ile
165 170 175
Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser Arg Leu
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Thr Ile Ile Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu Lys Met Asn
195 200 205
Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Lys His Tyr
210 215 220
Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser
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Val Thr Val Ser Ser Ala Ala Ala
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<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<223> CD28铰链跨膜结构域共刺激结构域
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Ile Glu Val Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Leu Asp Asn Glu Lys Ser Asn
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20 25 30
Phe Pro Gly Pro Ser Lys Pro Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly
35 40 45
Val Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe
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Trp Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn
65 70 75 80
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<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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<223> CD3ζ活化结构域
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<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
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ggcgagggat ccaccaaggg cgaggtgaaa ctgcaggagt caggacctgg cctggtggcg 480
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<212> DNA
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<220>
<223> 鉴别引物–反向
<400> 15
catcgtactc ctctcttcgt cc 22

Claims (54)

1.一种修饰的γδΤ细胞，所述修饰的γδΤ细胞包含嵌合抗原受体，其中所述嵌合抗原受体包含对疾病抗原具有结合特异性的细胞外抗原结合结构域、铰链、跨膜结构域，和
(i)一个或更多个共刺激信号传导区域，其中CD3ζ结构域不存在(可调节)，或
(ii)一个或更多个共刺激信号传导区域和无功能性CD3ζ结构域(可调节)，或
(iii)CD3ζ结构域，或
(iv)一个或更多个共刺激信号传导区域和功能性CD3ζ结构域。
2.一种修饰的γδΤ细胞，所述修饰的γδΤ细胞包含嵌合抗原受体，其中所述嵌合抗原受体包含对疾病抗原具有结合特异性的细胞外抗原结合结构域、铰链、跨膜结构域、一个或更多个共刺激信号传导区域和无功能性CD3ζ结构域。
3.如权利要求1或权利要求2所述的修饰的γδΤ细胞，其中所述无功能性CD3ζ结构域通过所述嵌合抗原受体中不存在CD3ζ结构域来提供。
4.如任一项前述权利要求所述的修饰的γδΤ细胞，所述修饰的γδΤ细胞包含至少两种嵌合抗原受体，其中所述嵌合抗原受体具有对不同疾病抗原的结合特异性。
5.如任一项前述权利要求所述的修饰的γδΤ细胞，所述修饰的γδΤ细胞还包含抑制性嵌合抗原受体(ICAR)，其中所述抑制性嵌合抗原受体对抗原的结合将引起由嵌合抗原受体对疾病抗原的任意结合提供的信号被抑制，以使所述γδΤ细胞在脱靶细胞中的活化最小化，所述嵌合抗原受体包含对所述疾病抗原具有结合特异性的细胞外抗原结合结构域、铰链、跨膜结构域和
(i)一个或更多个共刺激信号传导区域，其中CD3ζ结构域不存在(可调节)，或
(ii)一个或更多个共刺激信号传导区域和无功能性CD3ζ结构域(可调节)，或
(iii)CD3ζ结构域，或
(iv)一个或更多个共刺激信号传导区域和功能性CD3ζ结构域。
6.如任一项前述权利要求所述的γδΤ细胞，其中γδ配对是来自Vγ1至Vγ9和Vδ1至Vδ8。
7.如任一项前述权利要求所述的γδΤ细胞，其中所述γδΤ细胞是Vγ9Vδ2亚型。
8.如任一项前述权利要求所述的γδΤ细胞，其中所述嵌合抗原受体的抗原识别结构域能够结合在细胞感染、细菌感染、真菌感染或原生动物感染中发现的或与细胞感染、细菌感染、真菌感染或原生动物感染相关的细胞表面靶或天然配体，来自病毒的有活性的或失活的病毒片段、肽、蛋白、抗原区段，肿瘤特异性抗原或肿瘤相关抗原。
9.如权利要求1至8中任一项所述的修饰的γδΤ细胞，用于在治疗癌症或感染中使用。
10.如权利要求2至8中任一项所述的修饰的γδΤ细胞，用于在治疗癌症或感染中使用。
11.如权利要求9所述的用于在治疗癌症或感染中使用的修饰的γδT细胞，其中所述修饰的γδT细胞通过同种异体移植被提供至受试者。
12.如权利要求10所述的用于在治疗癌症或感染中使用的修饰的γδT细胞，其中所述修饰的γδT细胞通过同种异体移植被提供至受试者。
13.如在权利要求9至12任一项中要求保护的用于在治疗感染中使用的修饰的γδT细胞，其中所述感染选自病毒感染、细菌感染、真菌感染或原生动物感染。
14.如权利要求9中要求保护的用于在治疗癌症或感染中使用的修饰的γδT细胞，其中所述修饰的γδT细胞通过自体移植被提供至受试者。
15.如权利要求10中要求保护的用于在治疗癌症或感染中使用的修饰的γδT细胞，其中所述修饰的γδT细胞通过自体移植被提供至受试者。
16.如在权利要求14或15任一项中要求保护的用于在治疗感染中使用的修饰的γδT细胞，其中所述感染选自病毒感染、细菌感染、真菌感染或原生动物感染。
17.如在权利要求9至15中任一项中要求保护的用于在治疗癌症或感染中使用的修饰的γδT细胞，其中所述修饰的γδT细胞与氨基二膦酸或其替代物被共施用至受试者，其中所述替代物能够经由生理甲羟戊酸途径的调节异常增强在靶细胞上存在的磷酸抗原的水平。
18.一种核酸序列，所述核酸序列编码嵌合抗原受体(CAR)，其中所述CAR包含细胞外抗原识别结构域、铰链、跨膜结构域和
(i)一个或更多个共刺激信号传导区域，其中CD3ζ结构域不存在(可调节)，或
(ii)一个或更多个共刺激信号传导区域和无功能性CD3ζ结构域(可调节)，或
(iii)CD3ζ结构域，或
(iv)一个或更多个共刺激信号传导区域和功能性CD3ζ结构域。
19.如权利要求18所述的核酸序列，所述核酸序列编码嵌合抗原受体(CAR)，所述嵌合抗原受体(CAR)包含对疾病抗原具有结合特异性的细胞外抗原结合结构域、铰链、跨膜结构域、一个或更多个共刺激信号传导区域和无功能性CD3ζ结构域。
20.如权利要求18或权利要求19所述的核酸序列，其中所述无功能性CD3ζ结构域通过所述嵌合抗原受体中不存在CD3ζ结构域来提供。
21.如在权利要求18中要求保护的核酸序列，所述核酸序列包含核苷酸序列SEQ IDNO:1或由核苷酸序列SEQ ID NO:1组成，所述核苷酸序列SEQ ID NO:1能够编码氨基酸序列SEQ ID NO:2至6。
22.如权利要求18至20中任一项所述的核酸序列，所述核酸序列编码嵌合抗原受体(CAR)，其中所述CAR包含细胞外抗原识别结构域、铰链、跨膜结构域、一个或更多个共刺激信号传导区域，但在所述一个或更多个共刺激信号传导区域中不存在功能性CD3ζ结构域，其中所述细胞外抗原识别结构域为识别B细胞蛋白CD19的scFv。
23.如权利要求18所述的核酸序列，所述核酸序列包含核苷酸序列SEQ ID NO:7或由核苷酸序列SEQ ID NO:7组成，所述核苷酸序列SEQ ID NO:7能够编码氨基酸序列SEQ ID NO:8至11。
24.一种提供CAR修饰的γδT细胞的方法，所述方法包括将如权利要求18至23中任一项所述的核酸掺入或转导到γδT细胞中以遗传修饰所述γδT细胞的步骤。
25.如权利要求24所述的方法，其中转导步骤使用慢病毒CAR构建体。
26.如权利要求24或25所述的方法，所述方法包括同时将如权利要求18至23中任一项所述的核酸转导到细胞中并选择性扩增CAR转导的γδT细胞的步骤。
27.一种在包含一个或更多个共刺激信号传导区域和CD3ζ结构域的CAR与其中CD3ζ结构域不存在的CAR之间进行检测的方法，所述方法包括使引物对结合至编码待测试的CAR的核酸的步骤，所述引物对选自组SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:13以及SEQ ID NO:14和SEQ IDNO:15
28.一种治疗方法，所述治疗方法包括：将供体细胞施用至有相应需要的受体受试者，所述供体细胞从供体受试者收集并且被处理为允许治疗有效量的γδT细胞对受体受试者的同种异体施用，其中所述处理包括修饰所述γδT细胞以掺入嵌合抗原受体的步骤。
29.一种治疗方法，所述治疗方法包括将供体细胞施用至有相应需要的受体受试者，所述供体细胞从供体受试者收集并且被处理为允许治疗有效量的γδT细胞对供体受试者的施用，其中所述处理包括修饰所述γδT细胞以掺入嵌合抗原受体的步骤，其中所述嵌合抗原受体包含对疾病抗原具有结合特异性的细胞外抗原结合结构域、铰链、跨膜结构域、一个或更多个共刺激信号传导区域和无功能性CD3ζ结构域。
30.如权利要求28中要求保护的治疗方法，其中所述嵌合抗原受体包含对疾病抗原具有结合特异性的细胞外抗原结合结构域、铰链、跨膜结构域、一个或更多个共刺激信号传导区域和无功能性CD3ζ结构域。
31.如权利要求29或30所述的治疗方法，其中所述无功能性CD3ζ结构域通过所述嵌合抗原受体中不存在CD3ζ结构域来提供。
32.如权利要求28至31中任一项所述的治疗方法，其中被施用γδT细胞的受试者患有病毒感染、细菌感染、真菌感染或原生动物感染或癌症。
33.如权利要求28至32中任一项所述的治疗方法，其中被施用γδT细胞的受试者被同时、顺序性地或单独施用免疫抑制药物。
34.一种试剂盒，所述试剂盒包含如权利要求1至8中任一项所述的γδT细胞和焦磷酸/膦酸药物，用于组合使用以通过自体移植或同种异体移植来治疗受试者。
35.一种试剂盒，所述试剂盒包含如权利要求2至8中任一项所述的γδT细胞和焦磷酸/膦酸药物，用于组合使用以通过自体移植或同种异体移植来治疗受试者。
36.一种药物组合物，所述药物组合物包含如权利要求1至8中任一项所述的γδT细胞。
37.一种药物组合物，所述药物组合物包含如权利要求2至8中任一项所述的γδT细胞。
38.如权利要求36或37所述的药物组合物，其中所述组合物包含适于提供给个体以提供治疗作用的统一剂量的γδT细胞。
39.如权利要求36至38中的一项所述的药物组合物和抗体免疫治疗，用于在治疗癌症中使用。
40.如权利要求36至权利要求39中任一项所述的药物组合物和细胞因子、干扰素γ、IL-2、化学治疗剂、生物剂或其组合，用于在治疗癌症中使用。
41.如权利要求36至38中任一项所述的药物组合物和治疗剂，用于在治疗病毒中使用。
42.一种准备治疗的方法，所述方法包括：处理从供体受试者收集的供体细胞以允许将治疗有效量的γδT细胞同种异体施用至受体受试者，其中所述处理包括修饰所述γδT细胞以掺入嵌合抗原受体以及任选地将所述γδT细胞施用至所述受体受试者的步骤。
43.一种准备治疗的方法，所述方法包括处理从供体受试者收集的供体细胞以允许将治疗有效量的γδT细胞施用至所述供体受试者，其中所述处理包括修饰所述γδT细胞以掺入嵌合抗原受体以及任选地将所述γδT细胞施用至所述供体受试者的步骤，其中所述嵌合抗原受体包含对疾病抗原具有结合特异性的细胞外抗原结合结构域、铰链、跨膜结构域、一个或更多个共刺激信号传导区域和无功能性CD3ζ结构域。
44.如权利要求42或权利要求43中要求保护的准备治疗的方法，其中所述无功能性CD3ζ结构域通过所述嵌合抗原受体中不存在CD3ζ结构域来提供。
45.一种慢病毒CAR构建体，所述慢病毒CAR构建体包含如权利要求18至23中任一项所要求保护的核酸。
46.一种试剂盒，所述试剂盒在包含一个或更多个共刺激信号传导区域和CD3ζ结构域的CAR与其中CD3ζ结构域不存在的CAR之间进行检测，所述试剂盒包含选自组SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:13以及SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:15的至少一个引物对
47.一种修饰的γδΤ细胞，所述修饰的γδΤ细胞包含嵌合抗原受体，其中所述嵌合抗原受体包含对疾病抗原具有结合特异性的细胞外抗原结合结构域、铰链、跨膜结构域、一个或更多个共刺激信号传导区域并且功能性信号1提供结构域不存在。
48.一种γδT样细胞，其中所述γδT样细胞是被遗传工程化为表达包含嵌合抗原受体的功能性γδT细胞受体的T细胞，其中所述嵌合抗原受体包含对疾病抗原具有结合特异性的细胞外抗原结合结构域、铰链、跨膜结构域和
(i)一个或更多个共刺激信号传导区域，其中CD3ζ结构域不存在(可调节)，或
(ii)一个或更多个共刺激信号传导区域和无功能性CD3ζ结构域(可调节)，或
(iii)CD3ζ结构域，或
(iv)一个或更多个共刺激信号传导区域和功能性CD3ζ结构域。
49.如权利要求48所述的γδT样细胞，其中所述γδT样细胞为被遗传工程化为表达功能性γδT细胞受体的αβT细胞。
50.一种具有指定的抗原特异性的Τ细胞或Τ细胞样细胞，所述Τ细胞或Τ细胞样细胞包含嵌合抗原受体，其中所述嵌合抗原受体包含对疾病抗原具有结合特异性的细胞外抗原结合结构域、铰链、跨膜结构域、和
(i)一个或更多个共刺激信号传导区域，其中CD3ζ结构域不存在(可调节)，或
(ii)一个或更多个共刺激信号传导区域和无功能性CD3ζ结构域(可调节)，或
(iii)CD3ζ结构域，或
(iv)一个或更多个共刺激信号传导区域和功能性CD3ζ结构域。
51.如在权利要求50中要求保护的具有指定的抗原特异性的T细胞或T细胞样细胞，所述T细胞或T细胞样细胞选自具有针对α-GalCer的特异性的NKT细胞和对维生素B相关抗原具有特异性的粘膜相关恒定T(MAIT)细胞。
52.一种治疗方法，所述治疗方法包括将如权利要求1至8或47至51中任一项所述的细胞施用至有相应需要的受试者。
53.如权利要求52中要求保护的治疗方法，其中所述施用是通过自体移植。
54.如权利要求52中要求保护的治疗方法，其中所述施用是通过同种异体移植。
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