CN106459924A - 用于疗法中的嵌合抗原受体(car)及其制备方法 - Google Patents

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H·G·卡鲁索
S·奥利瓦雷斯
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Abstract

本发明提供了嵌合抗原受体(CAR)和CAR‑表达T细胞，其可以特异性地靶向表达升高水平的靶抗原的细胞。同样，提供了用CAR T细胞疗法特异性地靶向表达升高水平的抗原的细胞(例如癌细胞)的方法。

Description

用于疗法中的嵌合抗原受体(CAR)及其制备方法
本申请要求2014年4月23日提交的美国临时申请号61/983,103和2014年4月23日提交的美国临时申请号61/983,298的优先权权益，这些申请的全部内容以引用的方式并入本文。
并入序列表
在文件名“UTFC.P1238WOST25.txt”中所包含的序列表是11KB(如Microsoft中所测量)并且于2015年4月23日创建，其随同电子投稿一起提交并且以引用的方式并入本文。
发明背景
1.发明领域
本发明一般涉及医学、免疫学、细胞生物学以及分子生物学领域。在某些方面，本发明的领域涉及免疫疗法。更具体地说，本文所述的实施方案涉及嵌合抗原受体(CAR)和CAR-表达T细胞的产生，所述T细胞可特异性地靶向具有升高的靶抗原表达的细胞。
2.相关领域的描述
临床级T细胞的效力可通过将基因疗法与免疫疗法组合以工程化具有以下优良特征的潜力的生物产物而改善：(i)肿瘤相关抗原(TAA)的识别，(ii)输注之后的持久性，(iii)迁移到肿瘤部位的潜力，以及(iv)在肿瘤微环境内重复利用效应子功能的能力。基因疗法与免疫疗法的这种组合可重定向T细胞对于B谱系抗原的特异性并且患有晚期B细胞恶性肿瘤的患者受益于这种肿瘤特异性T细胞的输注(Jena等人,2010；Till等人,2008；Porter等人,2011；Brentjens等人,2011；Cooper等人,2012；Kalos等人,2011；Kochenderfer等人,2010；Kochenderfer等人,2012；Brentjens等人,2013)。遗传操纵针对人类应用工程化的T细胞的大多数方法已经使用逆转录病毒和慢病毒用于嵌合抗原受体(CAR)的稳定表达(Jena等人,2010；Ertl等人,2011；Kohn等人,2011)。此方法，尽管依从当前良好的生产规范(cGMP)，但因其依赖于临床级重组病毒从有限数量的生产设备的制造和释放而可能较昂贵。
基于CAR T细胞的疗法的一个缺点是当靶抗原也在正常的非患病组织中表达时脱靶效应的潜能。因此，需要新型CAR T细胞疗法，其提供对患病细胞的特异性靶向，同时减少对正常组织的副作用。
发明概述
本文所述的某些实施方案是基于以下发现：嵌合抗原受体(CAR)T细胞可用于靶向过度表达抗原的细胞。因此，在一些方面中，CAR T细胞的细胞毒性活性可仅仅集中在具有高水平的抗原表达的预定靶细胞(例如癌细胞)，而相对于具有低水平的抗原表达的细胞的细胞毒性作用减到最小。具体说来，发现通过使用具有中等水平的靶标亲和力的CAR，可产生对具有高抗原表达水平的细胞具有选择性细胞毒性的CAR T细胞。不希望受任何具体机制的约束，所观察到的作用可归因于多价抗原与CAR T细胞的结合以促进细胞靶向。或者或另外，CAR的表达水平可在所选择的CAR T细胞中被调整以便降低细胞的脱靶细胞毒性。
因此，在第一实施方案中，提供包含靶向抗原的所表达的CAR的转基因细胞(例如，经分离的转基因细胞)，所述CAR相对于所述抗原具有约5nM至约500nM的Kd。在又一实施方案中，提供一种包含靶向抗原的所表达的CAR的转基因T细胞，所述T细胞仅当抗原被T细胞多价结合时展现显著的细胞毒性活性。一方面，实施方案的经分离的细胞为T细胞或T细胞祖细胞。又一方面，所述细胞为哺乳动物细胞，如人细胞。
在又一实施方案中，提供在受试者中选择性地靶向表达抗原的细胞的方法，所述方法包括(a)选择包含结合至抗原的所表达的CAR的CAR T细胞，所述CAR T细胞具有：(i)只有当抗原被T细胞多价结合时的细胞毒性活性；和/或(ii)相对于所述抗原具有约5nM至约500nM的Kd的CAR；以及(b)向所述受试者施用有效量的所选择的CAR T细胞以提供选择性地靶向具有增加表达的所述抗原的细胞的T细胞应答。因此，在某些方面中，实施方案的一种方法进一步被定义为一种治疗与患病细胞上的增加水平的抗原表达有关的疾病的方法。举例来说，实施方案的方法可用于治疗过度增殖性疾病，如癌症或自体免疫疾病；或用于治疗感染，如病毒、细菌或寄生虫感染。
在又一实施方案中，提供在混合细胞群中选择性地靶向表达抗原的细胞的方法，所述方法包括(a)选择包含结合至抗原的所表达的CAR的CAR T细胞，所述CAR T细胞具有：(i)只有当抗原被T细胞多价结合时的细胞毒性活性；和/或(ii)相对于所述抗原具有约5nM至约500nM的Kd的CAR；以及(b)将混合细胞群与所选择的CAR T细胞接触以选择性地靶向具有增加表达的抗原的细胞，所述细胞群包括表达不同水平的抗原的细胞。举例来说，在某些方面，混合细胞群包含表达抗原的非癌细胞和具有增加表达的抗原的癌细胞。在一些方面中，抗原的增加水平可指的是比在被CAR T细胞靶向的细胞中高至少约0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、75、100、200、300、400、500、600、700、800、900或1,000倍的表达水平。
在又一实施方案中，提供选择CAR T细胞的方法，所述方法包括(a)获得多个表达结合至抗原的CAR的CAR T细胞，所述多个细胞包含(i)对抗原具有不同亲和力(或对抗原具有不同结合/解离速率)的CAR和/或(ii)在细胞中以不同水平表达(即以不同水平存在于细胞表面上)的CAR；(b)评价细胞对表达抗原的对照细胞和表达增加水平的抗原的靶细胞的细胞毒性活性；以及(c)选择对靶细胞有选择性细胞毒性的CAR T细胞。在进一步的方面中，实施方案的方法进一步包括扩增和/或储存所选择的CAR T细胞或所选择的T细胞群。在又进一步的方面中，实施方案的方法包括用有效量的实施方案的所选择的CAR T细胞治疗受试者。在某些方面中，获得多个CAR T细胞可包括生成表达结合至抗原的CAR的CAR T细胞文库。举例来说，CAR T细胞文库可包含CAR中的随机或工程化的点突变(例如，由此调节CAR的亲和力或结合/解离速率)。另一方面，CAR T细胞文库包含在提供变化的CAR表达水平的不同启动子元件的控制下CAR-表达细胞。
在又一实施方案中，提供包含靶向EGFR抗原的所表达的CAR的转基因细胞(例如，经分离的转基因细胞)，所述CAR具有尼妥珠单抗的CDR序列(参见，例如SEQ ID NO:1和SEQID NO:2)或西妥昔单抗的CDR序列(参见，例如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4)。在一些方面中，实施方案的细胞为包含所表达的CAR序列的人T细胞，所述CAR序列具有SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2的CDR或抗原结合部分。在进一步的方面中，实施方案的细胞为包含所表达的CAR序列的人T细胞，所述CAR序列具有SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4的CDR或抗原结合部分。
实施方案的方面涉及由CAR结合的抗原。在一些方面中，所述抗原是在癌细胞中、在自体免疫细胞中或在被病毒、细菌或寄生虫感染的细胞中增加的抗原。在某些方面，所述抗原为CD19、CD20、ROR1、CD22、癌胚抗原、甲胎蛋白、CA-125、5T4、MUC-1、上皮肿瘤抗原、前列腺特异性抗原、黑色素瘤相关抗原、突变的p53、突变的ras、HER2/Neu、叶酸结合蛋白、HIV-1包膜糖蛋白gp120、HIV-1包膜糖蛋白gp41、GD2、CD123、CD33、CD138、CD23、CD30、CD56、c-Met、间皮素、GD3、HERV-K、IL-11Rα、κ链、λ链、CSPG4、ERBB2、EGFRvIII或VEGFR2。在一些特定方面中，所述抗原为GP240、5T4、HER1、CD-33、CD-38、VEGFR-1、VEGFR-2、CEA、FGFR3、IGFBP2、IGF-1R、BAFF-R、TACI、APRIL、Fn14、ERBB2或ERBB3。在一些进一步方面中，所述抗原为生长因子受体，如EGFR、ERBB2或ERBB3。
实施方案的某些方面涉及一种所选择的CAR(或包含CAR的所选择的细胞)，其结合至抗原并且相对于所述抗原具有约2nM至约500nM的Kd。举例来说，在一些方面中，CAR相对于抗原具有2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20nM或更大的Kd。在更进一步方面中，CAR相对于抗原具有约5nM至约450、400、350、300、250、200、150、100或50nM的Kd。在更进一步方面中，CAR相对于抗原具有约5nM至500nM、5nM至200nM、5nM至100nM、或5nM至50nM的Kd。如本文所用，提及“CAR的Kd”可指的是针对用于形成CAR的单克隆抗体所测量的Kd。
在一些方面中，实施方案的所选择的CAR每CAR分子可结合至2、3、4或更多个抗原分子。在一些方面中，所选择的CAR的每个抗原结合结构域相对于抗原具有2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20nM或更大的Kd。在更进一步方面中，所选择的CAR的每个抗原结合结构域相对于抗原具有约5nM至约450、400、350、300、250、200、150、100或50nM的Kd。在更进一步方面中，所选择的CAR的每个抗原结合结构域相对于抗原具有约5nM至500nM、5nM至200nM、5nM至100nM、或5nM至50nM的Kd。
在实施方案的一些方面中，根据实施方案使用的所选择的CAR为结合至EGFR的CAR。例如，CAR可包含尼妥珠单抗的CDR序列。例如，在一些方面中，实施方案的CAR包含尼妥珠单抗的所有六个CDR(提供为SEQ ID NO:5-10)。在一些方面中，CAR包含SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2的抗原结合部分。在一些方面中，CAR包含与SEQ ID NO:1和/或SEQ ID NO:2至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一的序列。在又一方面中，根据实施方案使用的CAR不包含尼妥珠单抗的CDR序列。
在又一实施方案中，提供经分离的细胞，其包含所选择的CAR和至少一种第二表达转基因，如表达的膜结合的IL-15。例如，在一些方面中，膜结合的IL-15包含介于IL-15与IL-15Rα之间的融合蛋白。在一些情况下，所述第二转基因是由RNA或DNA(例如，染色体外或游离型载体)编码的。在某些方面中，所述细胞包含编码整合到细胞基因组中的膜结合的IL-15的DNA(例如，侧接有转座子重复序列的编码DNA)。在某些方面中，实施方案的细胞(例如，表达膜结合的细胞因子的人CAR T细胞)可用于治疗患有疾病的受试者(或在受试者中提供免疫应答)，其中患病细胞表达增加水平的抗原。
在一些方面中，实施方案的方法涉及用编码所选择的CAR且在一些情况下编码转座酶的DNA(或RNA)转染T细胞。转染细胞的方法在本领域中是公知的，但在某些方面中，采用高效转染方法，如电穿孔或病毒转导。例如，可使用核转染装置将核酸引入细胞中。然而，优选地，转染步骤不包括用病毒感染或转导细胞，病毒可引起遗传毒性和/或在所治疗的受试者中产生对含有病毒序列的细胞的免疫应答。
实施方案的某些方面涉及用编码所选CAR的表达载体转染细胞。用于CAR的各种各样的表达载体是本领域中已知的且在本文中进一步详述。例如，在一些方面中，CAR表达载体为DNA表达载体，如质粒、线性表达载体或游离体。在某些方面中，所述载体包含额外的序列，如促进CAR表达的序列，如启动子、增强子、聚-A信号和/或一个或多个内含子。在优选方面中，CAR编码序列侧接有转座子序列，以便转座酶的存在使编码序列整合到转染细胞的基因组中。
如上所详述，在某些方面中，细胞进一步被转座酶转染，所述转座酶促进CAR编码序列整合到所转染细胞的基因组中。在一些方面中，转座酶被提供为DNA表达载体。然而，在优选方面中，转座酶被提供为可表达的RNA或蛋白质以使得转座酶的长期表达不在转基因细胞中发生。可根据实施方案使用任何转座酶系统。然而，在一些方面中，转座酶是鲑鱼型Tc1样转座酶(SB)。举例来说，转座酶可为“睡美人(Sleeping beauty)”转座酶，参见，例如美国专利6,489,458，其以引用的方式并入本文。
在更进一步方面中，实施方案的所选择的CAR T细胞还包含表达载体，用于表达刺激T细胞增殖的膜结合的细胞因子。具体说来，包含这种细胞因子的所选择的CAR T细胞可在几乎没有或没有离体培养下在抗原呈递细胞下增殖，由于通过细胞因子表达所提供的模拟。同样，这种CAR T细胞可在体内增殖，即使当由CAR识别的大量抗原不存在时(例如，象在处于缓解中的癌症患者或患有最小残留疾病的患者的情形下)。在一些方面中，CAR T细胞包含DNA或RNA表达载体用于表达Cγ细胞因子和元件(例如，跨膜结构域)以提供细胞因子的表面表达。举例来说，CAR细胞可包含IL-7、IL-15或IL-21的膜结合形式。在一些方面中，细胞因子通过细胞因子编码序列与细胞因子受体的融合连接至膜。例如，细胞可包含用于表达IL-15-IL-15Rα融合蛋白的载体。在更进一步方面中，编码膜结合Cγ细胞因子的载体为DNA表达载体，如整合到CAR细胞基因组中的载体或染色体外载体(例如，游离型载体)。在更进一步方面中，膜结合的Cγ细胞因子的表达是在诱导型启动子(例如，药物诱导型启动子)的控制下以便细胞因子在CAR细胞中的表达(及由此CAR细胞的增殖)可通过诱导或抑制启动子活性受到控制。
实施方案的方面涉及获得T细胞或T细胞祖细胞用于表达所选择的CAR。在一些方面中，细胞是从第三方(如组织库)获得。在进一步方面中，使用来自包含T细胞或T细胞祖细胞的患者的细胞样品。举例来说，在一些情况下，样品是脐带血样品、外周血样品(例如，单核细胞部分)或来自包含多能细胞的受试者的样品。在一些方面中，可培养来自受试者的样品以生成诱导的多能干(iPS)细胞以及用于产生T细胞的这些细胞。细胞样品可直接从受试者培养或可在使用之前冷冻保存。在一些方面中，获得细胞样品包括收集细胞样品。在其他方面中，样品是由第三方获得。在更进一步方面中，来自受试者的样品可被处理以纯化或富集样品中的T细胞或T细胞祖细胞。举例来说，样品可经受梯度纯化、细胞培养选择和/或细胞分选(例如，经由荧光激活细胞分选(FACS))。
在一些方面中，实施方案的一种方法进一步包括获得、产生或使用抗原呈递细胞(APC)。举例来说，在一些方面中，抗原呈递细胞包括树突细胞，如表达或已加载目标抗原的树突细胞。在进一步方面中，抗原呈递细胞可包括呈现目标抗原的人工抗原呈递细胞。例如，人工抗原呈递细胞可以是灭活的(例如辐照的)人工抗原呈递细胞(aAPC)。用于产生这种aAPC的方法在本领域中是已知的且在本文中进一步详述。
因此，在一些方面中，实施方案的转基因CAR细胞与抗原呈递细胞(例如灭活的aAPC)离体共培养一段受限的时间以便扩增CAR细胞群。CAR细胞与抗原呈递细胞共培养的步骤可在包含例如白介素-21(IL-21)和/或白介素-2(IL-2)的培养基中完成。在一些方面中，共培养是在约10:1至约1:10；约3:1至约1:5；或约1:1至约1:3的CAR细胞与APC的比率下进行。例如，CAR细胞与APC的共培养可在约1:1、约1:2或约1:3的比率下。
在一些方面中，用于所选择的CAR细胞的培养的APC被工程化以表达特定多肽，以增强CAR细胞的生长。例如，APC可包含(i)由转基因CAR细胞上表达的CAR靶向的抗原；(ii)CD64；(ii)CD86；(iii)CD137L；和/或(v)在APC表面上表达的膜结合的IL-15。在一些方面中，APC包含在APC的表面上表达的CAR结合抗体或其片段(参见，例如国际PCT专利公开WO/2014/190273，其以引用的方式并入本文)。优选地，对本发明方法中使用的APC进行测试并证实其不含感染性材料和/或经测试和证实是灭活的和非增殖的。
虽然APC的扩增可增加培养中的CAR细胞的数量或浓度，但此过程是劳动密集的且花费多的。此外，在一些方面中，应在尽可能短的时间内用转基因CAR细胞重新输注需要疗法的受试者。因此，在一些方面中，所选择的CAR细胞的离体培养不超过14天、不超过7天或不超过3天。例如，离体培养(例如，在APC存在下的培养)可进行持续转基因CAR细胞的小于一个群倍增。在更进一步方面中，转基因细胞不在APC存在下离体培养。
在更进一步方面中，实施方案的一种方法包括在向群体施用细胞或将细胞与群体接触之前(例如，在细胞转染之后或在细胞离体扩增之后)富集所选择的CAR表达T细胞的细胞群的步骤。例如，富集步骤可包括例如通过使用由CAR或CAR结合抗体结合的抗原对细胞进行分选(例如，经由荧光激活细胞分选(FACS))。在更进一步方面中，富集步骤包括非T细胞的耗竭或缺乏CAR表达的细胞的耗竭。例如，培养群中的CD56+细胞可耗竭。在又进一步方面中，当向受试者施用细胞时CAR细胞的样品被保留(或保持培养)。例如，样品可冷冻保存以用于后面的扩增或分析。
在某些方面中，实施方案的转基因CAR细胞是灭活的以用于表达内源性T细胞受体和/或内源性HLA。例如，T细胞可被工程化以消除内源性α/βT细胞受体(TCR)的表达。在特定的实施方案中，对CAR+T细胞进行遗传修饰以消除TCR的表达。在一些方面中，在CAR表达T细胞中存在内源性T细胞受体的破环。例如，在一些情况下，使用锌指核酸酶(ZFN)或CRISPR/Cas9系统使内源性TCR(例如，α/β或γ/δTCR)缺失或灭活。在某些方面中，CAR表达T细胞中的T细胞受体αβ-链例如通过使用锌指核酸酶被敲除。
如本文中进一步详述，实施方案的CAR细胞可用于治疗各种各样的疾病和病状。基本上涉及特定抗原的增强表达的任何疾病都可通过CAR细胞靶向抗原来治疗。例如，自体免疫疾病、感染以及癌症可用实施方案的方法和/或组合物治疗。这些包括癌症，如原发性、转移性、复发性、疗法敏感性、疗法难治性癌症(例如，化学难治性癌症)。所述癌症可为血液、肺、脑、结肠、前列腺、乳腺、肝脏、肾脏、胃、子宫颈、卵巢、睾丸、脑垂体、食道、脾、皮肤、骨骼等等(例如，B细胞淋巴瘤或黑色素瘤)。在某些方面中，实施方案的一种方法进一步被定义为治疗神经胶质瘤(如弥漫性内生性脑桥胶质瘤)的方法。在癌症治疗的情况下，CAR细胞通常靶向癌细胞抗原(也称为肿瘤相关抗原(TAA))，如EGFR。
实施方案的方法可用于制造(例如，用于临床试验)各种肿瘤抗原(例如，CD19、ROR1、CD56、EGFR、CD123、c-met、GD2)的CAR+T细胞。使用此项技术生成的CAR+T细胞可用于治疗患有白血病(AML、ALL、CML)、感染和/或实体肿瘤的患者。例如，实施方案的方法可用于治疗细胞增殖性疾病、真菌、病毒、细菌或寄生虫感染。可靶向的病原体包括但不限于疟原虫、锥虫、曲霉、念珠菌、HSV、RSV、EBV、CMV、JC病毒、BK病毒或埃博拉病原体。可由实施方案的CAR细胞靶向的抗原的其他实例包括但不限于CD19、CD20、癌胚抗原、甲胎蛋白、CA-125、5T4、MUC-1、上皮肿瘤抗原、黑色素瘤相关抗原、突变的p53、突变的ras、HER2/Neu、ERBB2、叶酸结合蛋白、HIV-1包膜糖蛋白gp120、HIV-1包膜糖蛋白gp41、GD2、CD123、CD23、CD30、CD56、c-Met、间皮素、GD3、HERV-K、IL-11Rα、κ链、λ链、CSPG4、ERBB2、EGFRvIII或VEGFR2。在某些方面中，实施方案的方法涉及CD19或HERV-K表达细胞的靶向。例如，靶向HERV-K的CAR细胞可包含含有单克隆抗体6H5的scFv序列的CAR。在更进一步方面中，实施方案的CAR可与细胞因子如IL-2、IL-7、IL-15、IL-21或其组合缀合或融合。
在一些实施方案中，提供用于治疗具有医学病状的个体的方法，所述方法包括向受试者提供有效量的来自表达T细胞或T细胞祖细胞的CAR(例如，表达选择性地杀伤具有增加表达水平的靶抗原的细胞的T细胞的CAR)群的细胞的步骤。在一些方面中，可向个体施用细胞一次以上(例如，2、3、4、5或更多次)。在进一步的方面中，相隔至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或更多天向个体施用细胞。在特定的实施方案中，所述个体患有癌症，如淋巴瘤、白血病、非何杰金氏淋巴瘤、急性淋巴母细胞性白血病、慢性成淋巴细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病或B细胞相关的自体免疫疾病。
在又一实施方案中，提供一种包含靶向EGFR的所表达的CAR的经分离的转基因细胞(例如，T细胞或T细胞祖细胞)。例如，CAR可包含尼妥珠单抗的CDR序列。例如，在一些方面中，实施方案的细胞包含CAR，所述CAR包含尼妥珠单抗的所有六个CDR(提供为SEQ ID NO:5-10)。在一些方面中，CAR包含SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2的抗原结合部分。在进一步的方面中，CAR包含与SEQ ID NO:1和/或SEQ ID NO:2至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一的序列。在更进一步的方面中，实施方案的细胞包含不含尼妥珠单抗的CDR序列的CAR。在一些方面中，提供一种药物组合物，其包含实施方案的经分离的转基因细胞。在进一步相关的实施方案中，提供一种治疗患有EGFR阳性癌症的受试者的方法，所述方法包括向受试者施用有效量的转基因人T细胞，所述T细胞包含靶向EGFR并包含SEQ ID NO:5-10的CDR序列的所表达的CAR。
在又一实施方案中，提供一种包括表达的CAR的经分离的转基因细胞(例如，T细胞或T细胞祖细胞)，所表达的CAR包含西妥昔单抗的CDR序列。例如，在一些方面中，实施方案的细胞包含一种CAR，所述CAR包含西妥昔单抗的所有六个CDR(提供为SEQ ID NO:11-16)。在一些方面中，CAR包含SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4的抗原结合部分。在进一步的方面中，CAR包含与SEQ ID NO:3和/或SEQ ID NO:4至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一的序列。在更进一步的方面中，实施方案的细胞包含不含西妥昔单抗的CDR序列的CAR。在一些方面中，提供一种药物组合物，其包含实施方案的经分离的转基因细胞。在进一步相关的实施方案中，提供一种治疗患有EGFR阳性癌症的受试者的方法，所述方法包括向受试者施用有效量的转基因人T细胞，所述T细胞包含靶向EGFR并包含SEQ ID NO:11-16的CDR序列的所表达的CAR。
如本文所用，在说明书和权利要求书中，“一(a)”或“一个(an)”可意指一个或多个。如本文说明书和权利要求书中所用，当词“一个”与词“包含”连接使用时，可意指一个或一个以上。如本文说明书和权利要求书中所用，“另一”或“又一”可意指至少第二或更多。
如本文说明书和权利要求书中所用，术语“大约”用来说明这样的值，其包括装置和用来测定所述值的方法的误差的固有变化，或者研究受试者之间存在的变化。
本发明的其他目标、特征及优点将由以下详细说明显而易见。然而，应当理解详细说明和具体实施例仅以例举的方式给出，这是因为对于本领域的技术人员而言，根据这一详细说明，本发明主旨和范围内的各种改变和修改将变得显而易见。
附图简述
图1A-B.用加载有抗CD3的人工抗原呈递细胞数值扩增人原代T细胞。(A)加载K562克隆4的表型以表达抗CD3(OKT3)并且通过流式细胞术所测量，辐照至100戈瑞。(B)在用低密度的OKT3加载的aAPC(10个T细胞比1个aAPC)或高密度的OKT3加载的K562(1个T细胞比2个aAPC)刺激之后CD3+T细胞的数值扩增。通过刺激周期之后的扩增倍数乘以刺激周期之前的T细胞总数来计算推断的细胞计数。数据表示为平均值±SD，n＝6，****p<0.0001，双因素ANOVA(Tukey氏事后检验(Tukey’s post-test))。
图2A-D.在低密度aAPC上扩增的T细胞含有更高比率的CD8+T细胞。(A)用低密度aAPC(10个T细胞比1个aAPC)扩增的T细胞含有比用高密度aAPC(1个T细胞比2个aAPC)扩增的T细胞显著更多的CD8+T细胞和显著更少的CD4+T细胞，如两个刺激周期之后通过流式细胞术所测量。数据表示为平均值，n＝6，***p<0.001，****p<0.0001，双因素ANOVA(Tukey氏事后检验)。(B)在用低密度aAPC和高密度aAPC扩增的T细胞中CD4/CD8比率的差异归因于当用低密度aAPC扩增时CD4+T细胞扩增倍数的减小。数据表示为平均值±SD，n＝6，****p<0.0001，双因素ANOVA(Tukey氏后检验)。(C)在用低密度aAPC和高密度aAPC扩增的T细胞中CD4/CD8比率的差异不归因于细胞存活力的差异。细胞存活力通过在两个刺激周期之后针对膜联蛋白V和PI染色的流式细胞术来测定，其中膜联蛋白Vneg PIneg细胞被视为活细胞。数据表示为平均值±SD，n＝3。(D)当刺激为低密度aAPC时CD4+T细胞比高密度aAPC具有更少增殖。通过细胞内流式细胞术测量Ki-67作为两个刺激周期之后细胞增殖的标记物。示出了来自三个独立供体的代表性直方图。
图3.在用低或高密度aAPC刺激的T细胞中的差异基因表达。在两个刺激周期之后通过mRNA物质的多元数字分布(multiplexed digital profiling)测量用低或高密度aAPC刺激的CD4+与CD8+T细胞之间的差异基因表达。显著上调或下调的转录物通过在2/3供体中在转录水平上大于1.5倍差异和p<0.01来确定。数据由倍数差异的热图表示，n＝3。
图4A-C.用低密度aAPC扩增的T细胞具有更多的中央记忆表型T细胞。(A)用低密度或高密度aAPC扩增的T细胞的记忆标记物分析通过两个刺激周期之后针对CCR7和CD45RA的流式细胞术来测量。在门控CD4+和CD8+T细胞群中的细胞群定义如下：效应记忆＝CCR7negCD45RAneg，中央记忆＝CCR7+CD45RAneg,首次用于试验＝CCR7+CD45RA+，效应记忆RA＝CCR7negCD45RA+。数据表示为平均值±SD，n＝3，*p<0.05，双因素ANOVA(Tukey氏事后检验)。(B)两个刺激周期之后在T细胞中针对粒酶和穿孔素的细胞内染色通过在CD4+和CD8+门控T细胞群中的流式细胞术来测量。数据表示为平均值±SD，n＝3，*p<0.05，***p<0.001，双因素ANOVA(Tukey氏事后检验)。(C)在用PMA/离子霉素刺激之后的细胞因子产生通过两个刺激周期之后T细胞中的细胞内细胞因子染色来测量，所述细胞内细胞因子染色通过CD4+和CD8+门控T细胞群中的流式细胞术来测量。数据表示为平均值±SD，n＝3，*p<0.05，***p<0.001，双因素ANOVA(Tukey氏事后检验)。
图5.T细胞在aAPC上数值扩增之后TCR Vα的多样性。在用低或高密度aAPC扩增的T细胞中TCR Vα的多样性通过mRNA物质的数字多元分布来测量并且每个TCR Vα的相对丰度被计算为总TCR Vα转录物的百分比。数据表示为平均值±SD，n＝3。
图6.T细胞在aAPC上数值扩增之后TCR Vβ的多样性。在用低或高密度aAPC扩增的T细胞中TCR Vβ的多样性在分选的CD4+和CD8+T细胞中通过mRNA物质的数字多元分布来测量并且每个TCR Vα的相对丰度被计算为总TCR Vα转录物的百分比。数据表示为平均值±SD，n＝3。
图7.在aAPC上数值扩增之后CDR3序列的多样性。TCR Vβ链的CDR3序列通过在ImmunoSEQ平台上的高通量序列来测定。将在数值扩增之前每个单一序列的数目相对于用低密度(10个T细胞比1个aAPC)或高密度(1个T细胞比2个aAPC)aAPC数值扩增之后同一序列的数目进行绘图。将数据用线性回归拟合并测定斜率。数据代表两个个体供体。
图8A-D.RNA向用aAPC数值扩增的T细胞转移的优化。(A)用aAPC扩增之后GFP RNA的表达和用各种工序电穿孔的T细胞的存活力。GFP的中值荧光强度通过流式细胞术测定。通过PI染色和流式细胞术测定存活力。数据代表两个个体供体。(B)在一个、两个或三个刺激周期之后在用低密度(10个T细胞比1个aAPC)aAPC扩增的T细胞中GFP RNA的表达和细胞存活力。通过流式细胞术测定表达GFP的T细胞的百分比。通过PI染色和流式细胞术测定存活力。数据代表两个个体供体。(C)在用各种工序电穿孔之后在10个T细胞比1个aAPC的aAPC密度下刺激持续两个刺激周期的T细胞的GFP RNA的表达和T细胞的存活力。通过流式细胞术测定表达GFP的T细胞的百分比。通过PI染色和流式细胞术测定存活力。数据代表两个个体供体。(D)在用10个T细胞比1个aAPC的密度下的aAPC刺激两个周期之后，在无RNA的模拟电穿孔和有RNA的电穿孔的CD4+和CD8+门控T细胞中通过流式细胞术测量的记忆标记物CCR7和CD45RA的表达。数据表示为平均值±SD，n＝3.
图9A-B.通过DNA和RNA修饰的CAR表达的示意图。(A)通过用SB转座子/转座酶电穿孔的T细胞的DNA修饰。用含有CAR的SB转座子和SB11转座酶电穿孔正常的供体PBMC以在一小部分T细胞中产生稳定的CAR表达。在IL-21(30ng/mL)和IL-2(50U/mL)存在下用表达aAPC的γ辐照的抗原的刺激随时间剔除CAR+T细胞，在5个刺激周期之后产生>85％CAR+T细胞并且评估T细胞的CAR介导的功能。(B)通过RNA电转移的T细胞修饰。用加载了K562克隆4aAPC的γ辐照的抗CD3(OKT3)刺激正常的供体PBMC。第二刺激之后三至五天，用RNA电穿孔T细胞以在RNA电转移之后24小时产生>95％CAR+T细胞，并且评估T细胞的CAR介导的功能。
图10A-E.通过DNA和RNA修饰的Cetux-CAR+T细胞的表型。(A)通过在CD4+和CD8+门控T细胞群中针对CAR的IgG区的流式细胞术测定的在RNA修饰的和DNA修饰的T细胞中CAR表达的中值荧光强度。数据表示为平均值±SD，n＝8。(B)通过在CAR+门控T细胞中针对CD4和CD8的流式细胞术测定的在RNA和DNA修饰的T细胞中CD4+和CD8+T细胞群的比例。数据表示为平均值±SD，n＝8。(C)通过在CD4+和CD8+门控T细胞群中的流式细胞术测定的记忆标记物CCR7和CD45RA的表达。记忆群定义如下：效应记忆＝CCR7negCD45RAneg，中央记忆＝CCR7+CD45RAneg，首次用于试验＝CCR7+CD45RA+，效应记忆RA＝CCR7negCD45RA+。数据表示为平均值±SD，n＝3，****p<0.0001，双因素ANOVA(Tukey氏事后检验)。(D)如通过流式细胞术在CD4+和CD8+门控T细胞群中测定的抑制性受体PD-1和复制衰老CD57的标记物的表达。数据表示为平均值±SD，n＝3，**p<0.01，双因素ANOVA(Tukey氏事后检验)。(E)通过流式细胞术，通过CD4+和CD8+门控T细胞群中的细胞内细胞因子染色测定的粒酶B和穿孔素的表达。数据表示为平均值±SD，n＝3。
图11A-C. DNA修饰的CAR+T细胞产生更多细胞因子并且比RNA修饰的CAR+T细胞展现稍微增加的细胞毒性。(A)DNA修饰的(5个刺激周期之后)和RNA修饰的CAR+T细胞(RNA转移后24小时)的细胞因子产生是在CD8+门控T细胞中用靶标或PMA/离子霉素4小时培养之后通过细胞内染色和流式细胞术来测量。数据表示为平均值±SD，n＝3，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001，双因素ANOVA(Tukey氏事后检验)。(B)通过标准的4小时铬释放测定来测定DNA修饰的(5个刺激周期之后)和RNA修饰的CAR+T细胞(RNA转移后24小时)的特异性细胞毒性。数据表示为平均值±SD，n＝3，*p<0.05，双因素ANOVA(Tukey氏事后检验)。(C)相对于CAR的中值荧光强度作图的在10:1效应子:靶标比率下RNA修饰的CAR+T细胞对A431的特异性细胞毒性。将线性回归拟合至数据，得到斜率＝0.0237±0.030，并不显著不同于0的斜率，p＝0.4798。
图12A-C. Cetux-CAR通过T细胞的RNA修饰的瞬时表达。(A)在没有细胞因子或刺激添加到T细胞中的情况下，通过针对CAR的IgG部分的流式细胞术每天测量的CAR表达。数据代表三个独立的供体。(B)在RNA转移之后24小时添加IL-2(50U/mL)和IL-21(30ng/mL)之后通过针对CAR的IgG部分的流式细胞术每天测量的CAR表达。数据代表三个独立的供体。(C)在RNA转移之后24小时添加tEGFR+EL4细胞之后通过针对CAR的IgG部分的流式细胞术每天测量的CAR表达。数据代表三个独立的供体。
图13A-C. Cetux-CAR通过RNA修饰的瞬时表达减少细胞因子产生和对EGFR-表达细胞的细胞毒性。(A)在用靶细胞或PMA/离子霉素培养4小时之后，在RNA转移之后24小时和120小时在DNA修饰的和RNA修饰的CD8+T细胞中通过细胞内染色和流式细胞术测量的IFN-γ的产生。数据表示为平均值±SD，n＝3，*p<0.05，双因素ANOVA(Tukey氏事后检验)。(B)在RNA转移之后24小时和120小时通过标准铬释放测定测量的DNA修饰的和RNA修饰的T细胞的特异性细胞毒性。数据表示为平均值±SD，n＝3，*p<0.05，**p<0.01，****p<0.0001，双因素ANOVA(Tukey氏事后检验)。(C)在10:1的效应子与靶标比率下通过标准铬释放测定测量的从RNA转移后24小时至RNA转移后120小时DNA修饰的和RNA修饰的T细胞的特异性细胞毒性的变化。数据表示为平均值±SD，n＝3，*p<0.05，双因素ANOVA(Tukey氏事后检验)。
图14A-D. Cetux-CAR+和Nimo-CAR+T细胞的数值扩增。(A)通过流式细胞术测定的γ辐照的tEGFR+K562克隆27的表型。(B)Cetux-CAR+和Nimo-CAR+T细胞的数值扩增。在每个刺激周期之前，通过流式细胞术测定CD3+CAR+T细胞的百分比。通过刺激周期之后的扩增倍数乘以所刺激的CAR+T细胞数目来计算推断的细胞计数。数据表示为平均值±SD，n＝7。(C)在CAR电穿孔之后24小时和在扩增28天之后，通过针对CAR的IgG部分的流式细胞术测定CAR在CD3+T细胞中的表达。数据表示为平均值，n＝7。(D)在扩增28天之后，通过针对CAR的IgG部分的流式细胞术测定CAR表达的中值荧光强度。数据表示为平均值±SD，n＝7。
图15A-C. Cetux-CAR+和Nimo-CAR+T细胞在表型上相似。(A)在扩增28天之后，通过对门控CD3+CAR+细胞的流式细胞术测量CD4和CD8T细胞在总T细胞群中的比例。数据表示为平均值±SD，n＝7。(B,C)在T细胞扩增28天之后，通过在门控CD4+和CD8+T细胞群中的流式细胞术测量T细胞记忆和分化标记物的表达。数据表示为平均值±SD，n＝4。
图16A-F.Cetux-CAR+和Nimo-CAR+T细胞同样地经由CAR的亲和力依赖性触发而活化。(A)在EGFR阻断单克隆抗体存在下响应于EGFR+A431的IFN-γ的产生。将CAR+T细胞与具有抗EGFR阻断抗体或同种型对照的A431共培养并通过细胞内流式细胞术测量IFN-γ产生。产生百分比被计算为相对于未阻断的CD8+T细胞产生在门控CD8+T细胞中IFN-γ的平均荧光强度。数据表示为平均值±SD，n＝3，***p<0.001，双因素ANOVA(Tukey氏事后检验)。(B)相对于抗原阴性细胞系，tEGFR(上图)和CAR-L(下图)在EL4细胞上的经表达的代表性直方图。通过定量流式细胞术测定EGFR表达的密度。(C)通过细胞内染色和流式细胞术测量在与CD19+、tEGFR+或CARL+EL4细胞共培养之后在门控CD8+CAR+T细胞中的IFN-γ产生。数据表示为平均值±SD，n＝4，**p<0.01，双因素ANOVA(Tukey氏事后检验)。(D)在与CD19+、EGFR+或CARL+EL4细胞共培养之后30分钟在门控CD8+CAR+T细胞中通过磷酸流式细胞术(phosflowcytometry)的p38和Erk1/2的磷酸化。数据表示为平均值±SD，n＝2，*p<0.05，双因素ANOVA(Tukey氏事后检验)。(E)通过标准4小时铬释放测定测量的CD19+、EGFR+及CARL+EL4细胞的特异性裂解。数据表示为平均值±SD，n＝4，****p<0.0001，双因素ANOVA(Tukey氏事后检验)。(F)在长期共培养中T细胞与EL4细胞的相对比例。通过在非物种交叉反应性抗体下分别针对人和鼠CD3的流式细胞术测量含有T细胞与EL4细胞的共培养的级分。数据表示为平均值±SD，n＝4，**p<0.01，双因素ANOVA(Tukey氏事后检验)。
图17A-C.Nimo CAR T细胞的活化和功能应答受到EGFR表达密度的影响。A)通过流式细胞术测量的在A431、T98G、LN18、U87及NALM-6细胞系上的EGFR表达的代表性直方图。通过定量流式细胞术测定每细胞的分子数目。数据代表三个重复实验。B)通过CD8+细胞上门控的细胞内流式细胞术测量的响应于与A431、T98G、LN18、U87及NALM-6细胞系的共培养的CD8+CAR+T细胞中的IFN-γ产生。数据表示为平均值±SD，n＝4，***p<0.001，双因素ANOVA(Tukey氏事后检验)C.通过标准4小时铬释放测定测量的CAR+T细胞对A431、T98G、LN18、U87及NALM-6的特异性裂解。数据表示为平均值±SD，n＝4，****p<0.0001，**p<0.01，*p<0.05，双因素ANOVA(Tukey氏事后检验)。
图18A-E. Nimo-CAR+T细胞功能的活化与EGFR表达密度直接并且正相关。(A)通过流式细胞术测量的在四个U87来源的肿瘤细胞系(U87、U87low、U87med及U87high)系列上的EGFR表达的代表性直方图。通过定量流式细胞术测定每细胞的分子数目。数据代表一式三份的实验。(B)通过磷酸流式细胞术测量的与U87或U87high共培养5、45及120分钟之后在门控CD8+T细胞中的Erk1/2和p38的磷酸化。数据表示为平均荧光强度±SD，n＝2。(C)通过磷酸流式细胞术测量的在与具有增加水平的EGFR的U87细胞系共培养45分钟之后在门控CD8+T细胞中的Erk1/2和p38MAP激酶家族成员的磷酸化。数据表示为平均荧光强度±SD，n＝4，****p<0.0001，***p<0.001，**p<0.01，双因素ANOVA(Tukey氏事后检验)。(D)通过细胞内染色和流式细胞术测量的响应于与具有增加水平的EGFR的U87细胞系共培养的在门控CD8+CAR+T细胞中IFN-γ和TNF-α的产生。数据表示为平均值±SD，n＝4，****p<0.0001，***p<0.001，**p<0.01，双因素ANOVA(Tukey氏事后检验)。(E)通过标准4小时铬释放测定测量的CAR+T细胞对具有增加水平的EGFR的U87细胞系的特异性裂解。数据表示为平均值±SD，n＝5，****p<0.0001，**p<0.01，*p<0.05，双因素ANOVA(Tukey氏事后检验)。
图19A-B.增加相互作用时间不恢复响应于低EGFR密度的Nimo-CAR+T细胞功能。(A)在CD8+门控细胞中不同的孵育期之后，在用U87或U87high刺激之后通过细胞内染色和流式细胞术测量IFN-γ的产生。数据表示为平均值±SD，n＝3。(B)在与Cetux-CAR+或Nimo-CAR+T细胞共培养之后剩余的U87和U87high细胞的级分。将U87细胞系与CAR+T细胞一式三份在1:5的E:T比率下共培养。将混悬液T细胞从粘附的靶细胞中分离，并且通过台盼蓝排除法对粘附级分进行计数。存活百分比被计算为[共培养之后收获的细胞数目]/[无T细胞的细胞数目]*100。数据表示为平均值±SD，n＝3，***p<0.001，双因素ANOVA(Tukey氏事后检验)。
图20A-B.在T细胞表面上增加的CAR密度不恢复Nimo-CAR+T细胞对低密度EGFR的敏感性。A)经由SB系统通过RNA转移和传统的DNA电穿孔修饰的T细胞中的CAR表达的代表性直方图。数据代表2个独立实验。B)响应于低和高抗原密度，通过RNA电转移在过度CAR-表达T细胞中IFN-γ的产生。在用U87或U87high靶细胞刺激之后，在CD8+门控细胞中通过细胞内流式细胞术测量IFN-γ的产生。数据表示为平均值±SD，n＝2。
图21A-C. Nimo-CAR+T细胞响应于正常肾上皮细胞上的基础EGFR水平与Cetux-CAR+T细胞相比具有较低的活性。(A)通过流式细胞术测量的EGFR在HRCE上的经表达的代表性直方图。通过定量流式细胞术测定每细胞的分子数目。数据代表三个重复实验。(B)通过细胞内染色和CD8+细胞上门控的流式细胞术测量响应于与HRCE共培养的CD8+CAR+T细胞中IFN-γ和TNF-α的产生。数据表示为平均值±SD，n＝4，**p<0.01，*p<0.05，双因素ANOVA(Tukey氏事后检验)。(C)通过标准4小时铬释放测定测量的CAR+T细胞对HRCE的特异性裂解。数据表示为平均值±SD，n＝3，****p<0.0001，***p<0.001，双因素ANOVA(Tukey氏事后检验)。
图22A-B. Cetux-CAR+T细胞在刺激之后比Nimo-CAR+T细胞增殖更少，但不具有增加的AICD倾向。(A)通过对于在CD8+细胞上门控的Ki-67的细胞内流式细胞术测量的用U87或U87high刺激之后的CD8+CAR+T细胞的增殖。数据表示为平均荧光强度±SD，n＝4，**p<0.01，双因素ANOVA(Tukey氏事后检验)。(B)通过对于在CD8+细胞上门控的膜联蛋白V和7-AAD的流式细胞术测量的用U87或U87high刺激之后的T细胞的存活力。通过Annevin Vneg 7-AADneg百分比测定活细胞百分比。数据表示为平均值±SD，n＝4，***p<0.001，双因素ANOVA(Tukey氏事后检验)。
图23A-C. Cetux-CAR+T细胞显示CAR的增强下调。(A)通过针对CAR的IgG部分的流式细胞术测量的与U87或U87high共培养(E:T 1:5)期间CAR的表面表达。剩余CAR的百分比被计算为[共培养中的CAR+％]/[非刺激培养中的CAR+％]x 100。数据表示为平均值±SD，n＝3，**p<0.01，*p<0.05，双因素ANOVA(Tukey氏事后检验)。(B)在CD8+门控T细胞中与U87或U87high共培养24小时之后通过流式细胞术测定的CAR的细胞内和表面表达的代表性直方图。数据代表三个独立的供体。(C)通过针对CAR的Fc部分的流式细胞术测量的与EGFR+EL4或CAR-L+EL4共培养(E:T 1:1)期间CAR的表面表达。剩余CAR的百分比被计算为[共培养中的CAR+％]/[非刺激培养中的CAR+％]x 100。数据表示为平均值，n＝2，*p<0.05，双因素ANOVA(Tukey氏事后检验)。
图24. Cetux-CAR+T细胞具有对抗原的重新攻击的降低应答。在用U87或U87high培养24小时之后，将CAR+T细胞用U87或U87high再次攻击并且通过细胞内染色和在CD8+细胞上门控的流式细胞术测量IFN-γCAR+T细胞的产生。数据表示为平均值±SD，n＝3，***p<0.001，**p<0.01，*p<0.05，双因素ANOVA(Tukey氏事后检验)。
图25A-B.动物模型和治疗方案的示意图。(A)导螺杆位置的示意图。钻一个1mm孔用于将导螺杆插入右侧额叶中，距离冠状缝1mm且距离矢状缝2.5mm。(B)治疗方案的时间线。在注入肿瘤之前不少于14天将导螺杆植入小鼠的右侧额叶中，这天被指定为研究第0天。在开始T细胞治疗前一天通过BLI对肿瘤进行成像。每周经由导螺杆头颅内施用CAR+T细胞持续三周。当小鼠主动地接受治疗时，在T细胞治疗之前和之后通过BLI评价肿瘤生长，然后在剩余实验期间每周进行评价。
图26A-C.在T细胞治疗之前U87med和CAR+T细胞表型的植入。(A)在肿瘤注入之后四天，在用D-荧光素注入并培养10分钟之后通过BLI对肿瘤进行成像。(B)如通过第4天BLI通量测量所测定，将小鼠分成三组以均匀地分布相对肿瘤负荷。(C)通过流式细胞术就CAR表达和CD4/CD8比率对经由4个刺激周期扩增的Cetux-CAR+和Nimo-CAR+T细胞进行评估。
图27A-B. Cetux-CAR+和Nimo-CAR+T细胞抑制U87med颅内异种移植物的生长。(A)连续的BLI评价肿瘤的相对尺寸。(B)如通过肿瘤的连续BLI评价相对肿瘤生长。本底发光(灰色阴影)是由没有肿瘤的小鼠的BLI来定义。在第18天时，在无治疗对比Cetux-CAR+T细胞(n＝7，p<0.01)治疗(n＝7)的小鼠之间和无治疗(n＝7)对比Nimo-CAR+T细胞(n＝7，p<0.05)治疗的小鼠之间在BLI中有显著差异，双因素ANOVA(Sidak氏事后检验)。
图28A-B.用Cetux-CAR+和Nimo-CAR+T细胞治疗的带有U87med颅内异种移植物的小鼠的存活期。(A)在7天T细胞治疗内，来自两个独立实验的具有U87med-ffLuc-mKate颅内异种移植物的小鼠的存活期。通过Mantel-Cox对数秩检验，p＝0.0006所测定，相对于未治疗的小鼠(14/14存活)在Cetux-CAR+T细胞治疗小鼠8/14存活)中的存活明显减少。(B)接受无治疗、Cetux-CAR+T细胞或Nimo-CAR+T细胞的具有U87med-ffLuc-mKate颅内异种移植物的小鼠的存活期。通过Mantel-Cox对数秩检验，p＝0.0269所测定，在Nimo-CAR+T细胞治疗组中存活期的显著延长。
图29A-C.在T细胞治疗之前U87和CAR+T细胞表型的植入。(A)在肿瘤注入之后四天，在用D-荧光素注入并培养10分钟之后通过BLI对肿瘤进行成像。(B)如通过第4天BLI通量测量所测定，将小鼠分成三组以均匀地分布相对肿瘤负荷。(C)通过流式细胞术就CAR表达和CD4/CD8比率对经由4个刺激周期扩增的Cetux-CAR+和Nimo-CAR+T细胞进行评估。
图30A-B. Cetux-CAR+，而非Nimo-CAR+T细胞抑制U87颅内异种移植物的生长。(A)连续的BLI评价肿瘤的相对尺寸。(B)如通过肿瘤的连续BLI评价相对肿瘤生长。在第25天达到的在无治疗对比Cetux-CAR+T细胞(n＝6，p<0.01)治疗(n＝6)的小鼠之间在BLI中有显著差异，双因素ANOVA(Sidak氏事后检验)。
图31.用Cetux-CAR+和Nimo-CAR+T细胞治疗的带有U87颅内异种移植物的小鼠的存活期。接受无治疗、Cetux-CAR+T细胞或Nimo-CAR+T细胞的具有U87-ffLuc-mKate颅内异种移植物的小鼠的存活期。通过Mantel-Cox对数秩检验，p＝0.0150所测定，在Cetux-CAR+T细胞治疗组中存活期的显著延长。
图32.对于CAR+T细胞疗法安全扩增抗原库的策略概述。策略分成三个主要类别：(i)通过药物诱导的自杀或瞬时CAR表达限制CAR表达，(ii)通过将表达限制在缺氧区或共表达归巢受体使CAR靶向肿瘤部位，以及(iii)通过分裂信号以需要两个抗原识别肿瘤来限制CAR活化，表达抑制性CAR以防止正常组织的活化，或表达通过高抗原密度有条件地活化的CAR。
图33A-F.所构建的质粒的载体图。(A)西妥昔单抗来源的CAR转座子。注释如下：HEF-1α/p：人延长因子-1α的启动子；BGH：牛生长激素聚腺苷酸化序列；IR/DR：反向重复/同向重复；ColE1：最小大肠杆菌复制起点；Kan/R：卡那霉素抗性基因；Kan/p：卡那霉素抗性基因的启动子。(B)尼妥珠单抗来源的CAR转座子。注释如下：HEF-1α/p：人延长因子-1α的启动子；BGH：牛生长激素聚腺苷酸化序列；IR/DR：反向重复/同向重复；ColE1：最小大肠杆菌复制起点；Kan/R：卡那霉素抗性基因；Kan/p：卡那霉素抗性基因的启动子。(C)西妥昔单抗来源的CAR/pGEM-A64质粒。注释如下：amp/R：氨苄青霉素抗性基因；SpeI：线性化的限制位点。(D)尼妥珠单抗来源的CAR/pGEM-A64质粒。注释如下：amp/R：氨苄青霉素抗性基因；SpeI：线性化的限制位点。(E)tEGFR-F2A-Neo转座子。注释如下：HEF-1α/p：人延长因子-1α的启动子；BGH：牛生长激素聚腺苷酸化序列；F2A：自身可裂解的肽F2A；Neo/r：新霉素抗性基因；IR/DR：反向重复/同向重复；ColE1：最小大肠杆菌复制起点；Kan/R：卡那霉素抗性基因；Kan/p：卡那霉素抗性基因的启动子。(F)CAR-L转座子。注释如下：HEF-1α/p：人延长因子-1α的启动子；Zeocin R：博莱霉素抗性基因；BGH：牛生长激素聚腺苷酸化序列；IR/DR：反向重复/同向重复；ColE1：最小大肠杆菌复制起点；Kan/R：卡那霉素抗性基因；Kan/p：卡那霉素抗性基因的启动子。
图34. pLVU3G-effLuc-T2A-mKateS158A的载体图。注释如下：B1：Gateway供体位点B1；effLuc：增强的萤火虫荧光素酶；T2A：T2A核糖体滑动位点；mKateS158A：增强的mKate红色荧光蛋白；B2：Gateway供体位点B2，HBV PRE：乙型肝炎翻译后调控元件；HIV SIN LTR：HIV自灭活长末端重复；ampR：氨苄青霉素抗性；LTR：长末端重复；HIV cPPT：HIV中央多嘌呤段。
图35.用于将MFI与ABC相关联用于定量流式细胞术的标准曲线。在用饱和量的抗EGFR-PE培养之后，在流式细胞仪上获取具有已知抗体结合能力的微球珠标准样品。通过相对于通过流式细胞术获得的平均荧光强度对已知的抗体结合能力作图生成标准曲线。
发明详述
I.实施方案的方面
EGFR特异性CAR通过RNA修饰的瞬时表达
已经提出了CAR通过RNA转移的瞬时表达降低针对具有正常组织表达的抗原的CART细胞疗法的长期、靶标上、组织外毒性的可能性。在RNA转移之前T细胞的数值扩增有望获得为患者输注所需的临床上相关的T细胞数量。本发明者通过在加载有抗CD3抗体OKT3的aAPC上的共培养探究T细胞的数值扩增不依赖于抗原特异性。更改培养中的抗原呈递细胞(例如aAPC)与T细胞的比率改变了所生成的T细胞群的表型。用低密度aAPC(10个T细胞比1个aAPC)扩增的T细胞相对于用高密度aAPC扩增的T细胞来说与CD8+T细胞的比例增加、中央记忆表型T细胞的存在增加、IFN-γ和TNF-α的产生减少而IL-2的产生增加、以及扩增之后TCR多样性的潜在更少克隆损失有关。用低密度aAPC扩增的T细胞更易于RNA电转移，在电转移之后显示与用高密度aAPC扩增的T细胞相比RNA转录物的更多表达和提高的T细胞存活力。
使用aAPC用于T细胞扩增的潜在益处是借助于粘附分子LFA-3和ICAM-1的表达形成与T细胞的稳定相互作用的能力(Suhoski等人,2007；Paulos等人,2008)。另外，aAPC可相对容易被修饰以表达所需系列的共刺激分子。因此，用于数值T细胞扩增的aAPC提供评估用于T细胞扩增的共刺激分子的各种组合的平台以实现对于过继性T细胞疗法的最佳T细胞表型。除aAPC的修饰之外，本发明者已经描述了在T细胞培养中aAPC的密度对所生成的T细胞群的表型的影响。虽然CD8+T细胞或细胞毒性T细胞经常被认为是用于抗肿瘤免疫疗法的理想的T细胞群，但证据表明CD8+T细胞在体内需要CD4+T细胞的帮助以实现最佳抗肿瘤应答和记忆形成(Kamphorts等人,2013；Bourgeois等人,2002；Sun等人,20013)。然而，CD4+与CD8+T细胞的理想比率是未知的(Muranski等人,2009)。通过改变扩增培养中的aAPC密度以歪斜(skew)用于过继性免疫疗法的T细胞中的CD4/CD8比率，不管其是从患者分离的TIL抑或基因修饰的T细胞，这些问题可在临床试验中得到解决。最终，培养中降低的aAPC密度产生比用高密度aAPC扩增的T细胞更多的具有中央记忆表型(CCR7+CD45RAneg)的T细胞。虽然中央记忆表型T细胞的持久性增强的益处不能扩展至RNA修饰的T细胞，其仅为肿瘤抗原瞬时重定向，但T细胞的持久性已显示改善T细胞疗法的抗肿瘤功效(Kowolik等人,2006；Robbins等人,2004；Stephan等人,2007；Wu等人,2013)。因此，用低密度aAPC的离体扩增可用于将稳定遗传修饰的T细胞或TIL重新编码成中央记忆表型用于提高持久性。
发现在离体扩增的T细胞中通过RNA修饰的CAR的表达比通过非病毒DNA修饰和经由抗原的CAR识别的T细胞扩增的CAR的表达更多变。在不同密度下CAR的表达不影响T细胞特异性地裂解靶标的能力，但是合理地预期到低于某一阈值，低CAR表达将对靶标的特异性裂解具有负面影响，如先前所报道(Weijtens等人,2000)。别人已经描述了通过T细胞的RNA修饰的CAR的可调表达，以使得RNA的剂量决定转基因表达水平(Rabinovich等人,2006；Yoon等人,2009；Barrett等人,2011)。因此，使用相同量的RNA进行本研究中T细胞的RNA修饰，这不说明通过改变RNA剂量的CAR表达的可变性。反而，很可能供体之间的可变性说明电移转之后CAR表达强度的差异。目前描述的在RNA转移之前T细胞扩增的方案可在改变来自某些供体的T细胞对RNA摄取的敏感性中发挥作用，并且增加电转移中的RNA量可增加这些供体中的CAR表达。通过转移相对较大量的RNA的CAR的高表达可产生延长的CAR表达以及在延长时间段内的CAR介导的活性(Barrett等人,2011)。来自RNA转移的延长的CAR表达可有益于抗肿瘤活性，特别是因为T细胞的刺激似乎加速CAR表达的损失。然而，延长CAR的表达也可响应于需要CAR表达优化的正常组织抗原提高T细胞活性以确定表达的最佳持续时间，从而使抗肿瘤活性最大，同时降低正常组织毒性。
T细胞的RNA修饰不改变在RNA的电转移之前离体扩增的T细胞中所见的效应记忆与中央记忆T细胞的比例，类似于先前的报道(Schaft等人,2006)。只有在相对较低aAPC密度(10个T细胞比1个aAPC)下扩增的T细胞能够有效RNA转录摄取，而无明显毒性，即使是用不同的电穿孔条件。此T细胞群还显示相当大比例的具有中央记忆表型(CCR7+CD45RAneg)的T细胞，其具有产生减少的IFN-γ和TNF-α、以及细胞毒性效应分子粒酶B和穿孔素。因此，RNA修饰的T细胞比DNA修饰的T细胞含有显著更多的中央记忆表型T细胞，显示响应于EGFR-表达细胞产生减少的IFN-γ和TNF-α和在低E:T比率下稍微较少的特异性裂解。因此，RNA修饰的前体T细胞群对RNA转移之后的CAR介导的T细胞功能具有强大影响并且RNA修饰的T细胞的减少的细胞因子产生和稍微较少的特异性裂解可在体内模型中转换成降低的抗肿瘤功效，其中T细胞的细胞毒性潜能是短暂的并且中央记忆T细胞群的增加的持久性可能没有益处。以1个T细胞比2个aAPC扩增的T细胞的RNA修饰类似于DNA修饰的CAR+T细胞显示更显著比例的效应记忆表型T细胞，且因此需要更高的IFN-γ和TNF-α产生能力。RNA转移之前细胞因子的添加可改善存活力并且额外的电穿孔工序可有效地将RNA转移到这些T细胞中。
经由RNA转移引入T细胞的Cetux-CAR被瞬时表达，并且表达损失通过对T细胞的刺激(包括添加细胞因子IL-2和IL-21)以及经由添加EGFR-表达细胞系的抗原刺激来促进。伴随有CAR表达的损失，RNA修饰的T细胞显示针对EGFR-表达细胞系(包括肿瘤细胞和正常人肾细胞)的降低的细胞毒性。使用RNA修饰的T细胞的一个顾虑在于其对靶肿瘤随时间的固有降低的能力将相对于稳定修饰的T细胞造成降低的抗肿瘤功效。通过RNA转移被修饰以表达间皮素特异性CAR用于治疗鼠的间皮瘤模型的T细胞的多次注射表明每两周的肿瘤内注射显示对肿瘤生长的控制，但在治疗停止之后，肿瘤复发(Zhao等人,2010)。体内播散性白血病鼠模型的治疗表明虽然对CD19有特异性的RNA修饰的CAR+T细胞在单次注射之后具有抗肿瘤活性，但在符合CAR降解的一段时间之后肿瘤经常复发(Barrett等人,2011)。相比之下，稳定表达间皮素特异性CAR的T细胞的单次肿瘤内注射介导优良的抗肿瘤活性并且能够治愈大多数小鼠。RNA修饰的T细胞的优化给药表明在后续输注和加权、分次给药方案之前消除残留CARneg T细胞的环磷酸酰胺的组合在控制疾病负担上更有效，并且在抗肿瘤功效方面与稳定修饰的T细胞相似(Barrett等人,2013)。因此，优化给药方案可改善RNA修饰的T细胞的抗肿瘤活性。
B. CAR+T细胞可基于EGFR密度将恶性细胞与正常细胞相区分
Cetux-CAR+T细胞可识别正常组织抗原，其可产生靶标上、组织外毒性。因此，本发明者研究CAR作为RNA物质的表达作为一种经由CAR的瞬时表达控制靶标上、组织外毒性的方法。虽然CAR表达是瞬时的并且降低CAR降解之后针对正常组织EGFR的细胞毒性的可能性，但其不能解决在CAR的相当多的降解之前一旦识别正常组织EGFR之后的即时T细胞效应功能的可能性。另外，通过限制CAR表达，致使T细胞在CAR降解之后不响应于EGFR-表达肿瘤，并且持续的抗肿瘤活性的可能性受到此方法的危害。因此，研究了在正常组织存在下控制CAR活性以限制有害的靶标上、组织外毒性而无损抗肿瘤活性的机制。
内源性T细胞活化取决于TCR的亲和力和经由MHC存在的肽的密度(Hemmer等人,1998；Viola等人,1996；Gottschalk等人,2012；Gottschalk 2010)。T细胞通过经由TCR的累积信号超过诱发效应功能所需的某一阈值而活化(Hemmer等人,1998；Rosette等人,2001；Viola等人,1996)。对于高亲和力TCR，相对较低的抗原密度足以触发T细胞应答；然而，低亲和力TCR需要更高抗原密度来实现类似的效应T细胞应答(Gottschalk等人,2012)。许多肿瘤在比其正常组织表达更高的密度下过度表达TAA(Barker等人,2001；Lacunza等人,2010；Hirsch等人,2009)。EGFR在神经胶质瘤中的扩增和过度表达突显了这个关系，因为EGFR在神经胶质瘤中相对于正常组织过度表达，并且过度表达与肿瘤分级有关，由此IV级成胶质细胞瘤表达最高密度的EGFR(Smith等人,2001；Hu等人,2013；Galanis等人,1998)。因此，本发明者确定EGFR特异性CAR修饰的T细胞是否可通过降低CAR的结合亲和力基于EGFR密度将恶性细胞与正常细胞相区分。
赋予抗原特异性的Cetux-CAR的部分来源于单克隆抗体西妥昔单抗的scFv部分，其特征是高亲和力(Kd＝1.9x10-9)(Talavera等人,2009)。因此，本发明者由单克隆抗体尼妥珠单抗生成CAR，其与西妥昔单抗共享高度重叠的表位和10倍降低的解离常数(Kd＝2.1x10-8)，特征为59倍降低的结合速率(Talavera等人,2009；Garrido等人,2011；Adams等人,Zuckier等人,2000)。降低的结合速率及随后减小的总体亲和力对EGFR的二价识别提出了要求，只有当EGFR以高密度表达时其才发生。因此，来源于尼妥珠单抗的CAR可使得T细胞能够基于EGFR表达的密度将恶性组织与正常组织相区分。
最近在CLL和ALL中的临床成功注意到在具有对CD19-CAR+T细胞疗法的完全肿瘤应答的患者中的持续的B细胞发育不全，但此毒性被认为是可容忍的，因为CD19是谱系限制性抗原且B细胞发育不全在晚期淋巴瘤的情形下被认为是可耐受的毒性(Grupp等人,2013；Porter等人,2011)。在用CAR修饰的T细胞靶向HER2和CAIX的临床试验中的严重不良事件突显了控制针对正常组织抗原表达的CAR T细胞活性的需要以加宽除谱系和肿瘤限制性抗原以外的安全可靶向的抗原的范围(Lamers等人,2013；Morgan等人,2010)。异常表达的TAA相对于正常组织经常在肿瘤上过度表达，如在成胶质细胞瘤中的EGFR表达(Smith等人,2001；Hu等人,2013；Galanis等人,1998)。本发明者开发了一种对EGFR有特异性的CAR，其对低抗原密度具有降低的响应能力以使对正常组织的可能性减到最小，同时维持响应于高抗原密度的充分的效应功能。这通过开发来自尼妥珠单抗的EGFR特异性CAR来实现，尼妥珠单抗是一种与西妥昔单抗相比具有高度重叠表位但降低的结合动力学的单克隆抗体(Talavera等人,2009；Garrido等人,2011)。Cetux-CAR+T细胞能够靶向低和高EGFR密度，而Nimo-CAR+T细胞能够针对抗原密度调整T细胞活性并且应答取决于在靶细胞上表达的EGFR密度。虽然Nimo-CAR+T细胞显示在肿瘤细胞和正常肾细胞上响应于低EGFR密度相对于Cetux-CAR+T细胞的降低的活性，但其能够响应于高EGFR密度等价重定向特异性与功能。CAR亲和力影响抗原攻击之后的增殖并且Cetux-CAR+T细胞当与抗原攻击之后的Nimo-CAR+T细胞相比时显示削弱的增殖，而不是对活化诱导的细胞死亡(AICD)的增加的倾向。另外，CAR亲和力影响与抗原相互作用之后来自T细胞表面的CAR的下调。Cetux-CAR展现在与高EGFR密度相互作用之后比Nimo-CAR更快速和更延长的来自细胞表面的下调。Cetux-CAR+T细胞具有响应于抗原的重新攻击的削弱的能力，这可能是CAR下调或Cetux-CAR+T细胞的潜在功能衰竭的结果(James等人,2010；Lim等人,2002)。
在描述scFv对CAR功能的影响中的困难来源于围绕最佳预测T细胞功能的内源性TCR结合的生化参数的相当多的争论。TCR结合的动力学可通过以下方程式来描述：
由此解离常数Kd等于解离速率(koff)与结合速率(kon)的比率(14)。解离常数(Kd)和解离速率(koff)两者都被报道为pepMHC的TCR识别之后的T细胞功能的重要决定因素，然而，这两个参数经常强相关，因此难以分割其对T细胞功能的相应影响(Kersh等人,1998；McKeithan T.W.1995；Nauerth等人,2013)。T细胞触发的动力学校正模型指出koff影响T细胞功能，由此需要足够长的停留时间来触发T细胞信号传导和活化。已对此进行修正以包括最佳停留时间窗，其中延长的停留时间可通过削弱多个TCR由单个pepMHC复合体连续触发的能力对T细胞活化不利(Kalergis等人,2001)。然而，这些模型与极短的停留时间相互作用能够产生功能性T细胞应答的报道相抵触(Govern等人,2010；Tian等人,2007；Aleksic等人,2010；Gottschalk等人,2012)。最近的分析旨在通过降低Kd与koff值之间的高度相关性并扩大kon值的动态范围减小先前的数据集偏差，该分析揭示了在kon对T细胞活化的贡献中的重要作用，涵盖在T细胞触发的T细胞限制模型中，其中T细胞功能与来源于结合速率、解离速率以及在其相对膜中的TCR和pepMHC的扩散之间的数学关系式的T细胞限制的持续时间直接相关(Tain等人,2007；Aleksic等人,2010)。有趣的是，随着kon变低，TCR和pepMHC能够在反弹之前在其相对膜中扩散，因此，相互作用的持续时间缩短至koff值。相反，随着kon变高，TCR能够快速反弹以延长停留时间，并且相互作用的持续时间和所得的T细胞功能通过Kd最佳预测。限定控制T细胞功能亲合力的TCR亲和力组分的作用的一直以来的争论对依赖一个结合生化参数作为优于其他的优良功能指标的通用模型进行提醒。相反，可能是结合速率与解离速率以及自由移动穿过靶细胞膜的抗原的密度的组合限定功能应答。
内源性TCR应答一般被描述为比单克隆抗体的结合低得多的亲和力，所述单克隆抗体被用于获得CAR特异性(Stone等人,2009)。然而，用于测量TCR结合亲和力的SPR技术通常在三维空间中进行，并且不概括T细胞与抗原呈递细胞的生理相互作用，其中两个结合配偶体被限制在其相应的膜中，由于受限的胞间隙和适当的分子定向而提高结合概率(Huppa等人,2010)。在2D中TCR结合动力学的测量表明TCR结合比通过3D测量所提出的具有更高亲和力，3D测量的特征为提高的结合速率和降低的解离速率(Huang等人,2010；Robert等人,2012)。然而，其他配体/受体对如ICAM-1或LFA-1的结合动力学不显示在3D或2D测定中所采集的亲和力测量值之间的差异。有趣的是，细胞骨架聚合的消除将2D中得到的测量值减至3D中得到的测量值，突显了动态细胞和细胞骨架过程在增加T细胞与抗原的结合中的作用(Robert等人,2012)。类似的细胞骨架相互作用或CAR结合亲和力的提高是否发生目前并不知道，且因此，不清楚是否关于CAR的scFv结构域的结合亲和力所进行的假设可直接由3D测定中单克隆抗体亲和力的测量值作出。另外，几个因素有助于提高总体T细胞结合亲合力，如与MHC的共受体结合以及在T细胞活化之前和之后T细胞表面上的TCR纳米团簇和微团簇形成(Holler等人,2003；Schamel等人,2005；Schamel等人,2013；Kumar等人,2011；Yokosuka等人,2010)。虽然CAR似乎可在T细胞表面上以低聚形式表达，但CAR与内源性T细胞信号复合体的牵连程度尚不清楚。仅通过CD3-ζ信号传导的第一代CAR的报道显示需要与内源性CD3-ζ结合来实现CAR依赖性T细胞活化，而通过跨膜CD28以及细胞内CD28和CD3-ζ信号传导的第二代CAR显示当内源性TCR-CD3复合体从T细胞表面开始限制时在CAR依赖性活化能力上无差异(Bridgeman等人,2010；Torikai等人,2012)。因此，CAR与内源性TCR信号传导机构的结合可取决于CAR构型。
解决scFv亲和力在CAR设计中的作用的特异性研究受到限制，并且集中于解离常数Kd的作用。最近关于ROR1特异性CAR的研究比较得出6倍降低的Kd，由此更高的亲和力，这是由提高的kon和降低的koff两者一起造成，并且显示更高亲和力的ROR-1特异性CAR在体外提高T细胞功能，包括细胞因子的产生和特异性裂解，而无AICD的倾向提高(Hudecek等人,2013)。另外，高亲和力ROR-1特异性CAR+T细胞在体内介导优良的抗肿瘤活性。类似地，Cetux-CAR+T细胞的更高亲和力不增加AICD的倾向，并且响应于降低的EGFR密度提高T细胞功能，包括细胞因子的产生和特异性裂解。然而，来源于具有宽的Kd值范围的一组亲和力成熟的HER2特异性单克隆抗体的一系列CAR前期研究发现存在亲和力阈值，低于该阈值，CAR依赖性T细胞活化被削弱；而高于此阈值，响应于不同HER2水平的T细胞的活化在提高的亲和力下并不改善(Chmielewski等人,2004)。相比之下，本发明的研究鉴定高亲和力CAR和低亲和力CAR基于抗原密度靶向的不同能力。较高亲和力的Cetux-CAR+T细胞与响应于降低的EGFR密度相对于Nimo-CAR+T细胞增加的细胞因子产生和特异性裂解有关。虽然Nimo-CAR相对于Cetux-CAR具有降低的亲和力，但Nimo-CAR的Kd值高于亲和力阈值并且在通过先前研究预测以具有效应功能的范围内。类似于内源性TCR的研究，这些结果表明CAR亲和力的描述不应仅通过解离常数来描述，并且支持出于CAR设计将个体解离速率与结合速率之间的关系考虑在内。
研究之间亲和力对CAR功能的影响之间的矛盾可通过构成解离常数Kd的生化参数koff和kon的独特关系来说明。HER2特异性CAR来源于呈现宽的Kd值范围的抗体，Kd主要在koff上不同，并且有最小的kon值相关性(Chmielewski等人,2004)。因此，较高亲和力相互作用不提高结合速率，但增加与抗原相互作用的持续时间。相反，ROR-1特异性CAR和Cetux-CAR的较高亲和力都受到提高的结合速率的影响。用于获得ROR-1特异性CAR的较高亲和力单克隆抗体具有6倍降低的Kd，由提高的kon和降低的koff两者共同造成，由此较高亲和力的特征是提高的结合速率和增加的相互作用持续时间(Hudecek等人,2013)。西妥昔单抗与尼妥珠单抗之间在Kd上的10倍差异主要受到西妥昔单抗的kon的59倍增加和koff的5.3x增加的影响，由此西妥昔单抗相对于尼妥珠单抗具有大大提高的结合速率，但与大多数的较高亲和力相互作用、较短的相互作用持续时间形成对比(Talavera等人,2009)。因此，在CAR设计中改变scFv结构域的结合速率而非解离速率可对T细胞功能具有更大影响。
先前研究已确定，最小CAR密度为T细胞活化所需，低于该密度，T细胞活化将被消除(James等人,2010)。然而，足够高的抗原表达可削弱此要求并且当CAR以低密度表达时实现CAR依赖性T细胞活化(James等人,2010)。在研究中使用高和低亲和力HER特异性CAR评估CAR表达密度、抗原密度及CAR亲和力之间的相互作用以及对CAR+T细胞功能的影响。此研究报道，响应于低抗原密度具有低CAR密度的T细胞的降低的T细胞功能仅当T细胞表达较高亲和力HER2特异性CAR时是明显的(Turatti等人,2007)。然而，当CAR以较高密度表达时，CAR介导的细胞毒性与亲和力或抗原密度无关。作者把当表达低密度时高亲和力CAR的降低的应答归因于不能诱导连续触发的低HER2密度。虽然据报道CAR不像内源性TCR一样连续触发(James等人,2010)，但有可能这是CAR特异性的，并且不同的跨膜区、内功能域及scFv亲和力都可影响连续触发的能力。本发明者未观察到在对低抗原密度的初始响应中Cetux-CAR+T细胞中的任何缺陷，然而，通过对EGFR+aAPC的反复刺激剔除的CAR表达水平可针对最佳CAR密度来选择，其中表达次优水平的CAR的T细胞未能扩增且因此脱离全部组成部分。相比之下，本研究结果发现降低亲和力的Nimo-CAR+T细胞显示对低抗原表达的降低的敏感性，但Nimo-CAR的增加的密度不恢复Nimo-CAR+T细胞对低抗原的敏感性，因此其可能通过不同的机制来控制。
虽然CAR在低密度下的表达可降低对抗原的敏感性，但这不可能是体内选择性地靶向高抗原密度的最佳策略，主要是因为在低密度下表达的CAR显示对所有水平抗原的降低的敏感性，且因此有抗肿瘤活性降低的可能性(James等人,2010；Weijtens等人,2000)。另外，CAR在恒定数目的CAR/抗原下从T细胞表面开始下调(James等人,2010)。因此，在较低密度下CAR-表达T细胞在低于最小密度下更易于下调以实现T细胞活化。
在此研究中，经预测相对于Cetux-CAR因降低的结合速率而具有降低亲和力的Nimo-CAR介导与EGFR表达密度直接相关的T细胞活化并且响应于具有低EGFR密度的正常肾细胞具有降低的活性。另外，Nimo-CAR+T细胞相对于Cetux-CAR+T细胞显示增强的增殖和减弱的CAR下调。通过Nimo-CAR+T细胞靶向成胶质细胞瘤上的EGFR具有介导抗肿瘤活性的潜力，同时降低靶标上、组织外毒性的可能性。
C. Cetux-CAR+和Nimo-CAR+T细胞在颅内神经胶质瘤模型中的体内抗肿瘤功效
一些肿瘤如成胶质细胞瘤相对于正常组织表达在高密度下过度表达EGFR并且据猜测改变CAR的scFv结构域以降低结合亲和力可在高EGFR密度存在下优先活化T细胞但在低EGFR密度存在下降低T细胞活性。Cetux-CAR和Nimo-CAR以独特的亲和力和结合动力学结合EGFR上的重叠表位，以使得Cetux-CAR具有5.3倍降低的解离常数，且由此更高的亲和力，特征为59倍增高的结合速率。体外研究还表明Cetux-CAR在外源性细胞因子不存在下具有响应于抗原的减少的增殖、增强的CAR下调(取决于CAR结合EGFR的scFv结构域和EGFR的密度)、以及响应于抗原的重新攻击的削弱的细胞因子产生。
Cetux-CAR+和Nimo-CAR+T细胞在治疗颅内神经胶质瘤异种移植物中的功效的评价通过显示以下来支持体外结论：Cetux-CAR+T细胞和Nimo-CAR+T细胞两者可介导针对表达中等EGFR密度的U87med的抗肿瘤活性，但仅Cetux-CAR+T细胞显示针对具有内源性低EGFR密度的U87的抗肿瘤活性。
一些研究表明更高亲和力的TCR相互作用可产生优良的体内活性(Nauerth等人,2013；Zhong等人,2013)；然而，已显示体外T细胞活性不一定反映体内功效(Chervin等人,2013；Janicki等人,2008)。具有高体外效力的高亲和力T细胞已显示具有削弱的体内应答，特征为减弱的信号传导、扩增及T细胞介导功能(Corse等人,2010)。类似地，低亲和力相互作用已显示具有缩减的体内T细胞扩增，造成在免疫应答的每个阶段存在较少的T细胞(Zehn等人,2009)。评价TCR亲和力在抗肿瘤功效中的作用的模型已显示高亲和力TCR相互作用具有削弱的抗肿瘤功能，特征为肿瘤中的减少存在和削弱的溶细胞功能(Chervin等人,2013；Engels等人,2012；Janicki等人,2008)。因此，已经提出具有中等亲和力的T细胞相对于高亲和力T细胞可能更好地控制肿瘤生长(Corse等人,2010；Janicki等人,2008)。将这些观察结果与以下体外观察结果综合，Cetux-CAR+T细胞可具有降低的体内抗肿瘤功效，体外观察结果包括Cetux-CAR+T细胞当在外源性细胞因子不存在下刺激时具有降低的增殖能力，在与抗原结合之后具有增加的CAR下调，以及响应于抗原的重新攻击的降低的能力。本发明者没有观察到相对于Nimo-CAR+T细胞的削弱的抗肿瘤功效；然而，在肿瘤内注射之后CAR+的历程没有接着，且因此，不评价体内扩增的差异。选择CAR+T细胞的肿瘤内注射以避免当评估抗肿瘤活性时CAR+T细胞归巢于肿瘤的不同能力的混杂变量；然而，Cetux-CAR+T细胞可能由于保持在肿瘤周边中而具有减少的肿瘤浸润。
Nimo-CAR+T细胞治疗响应于U87上的低EGFR密度相对于未治疗的小鼠没有显著地减少肿瘤负荷或改善小鼠的存活期，其比正常肾脏上皮细胞上测量的EGFR密度高约2倍(图18和图21)。相比之下，Cetux-CAR+T细胞在具有低EGFR密度的3/6小鼠中显示肿瘤控制和延长的存活期。虽然Nimo-CAR+T细胞治疗针对具有极低EGFR密度的正常组织可具有减小的细胞毒性潜能，但它们还对表达低EGFR密度的肿瘤逃逸变体具有潜能。然而，由于在成胶质细胞瘤中的实质异质性，单一靶标不太可能在给定患者内的所有肿瘤细胞上表达(Little等人,2012；Szerlip等人,2012)。用HER2特异性CAR+T细胞治疗实验成胶质细胞瘤模型还显示HER2无效肿瘤细胞的逃逸(Ahmed等人,2010；Hegde等人,2013)。剖析患者肿瘤可鉴定靶向给定肿瘤中的最大数量细胞的抗原的组合，并且由CAR+T细胞靶向多重抗原已显示改善具有单一特异性的CAR+T细胞治疗的治疗功效(Hegde等人,2013)。具有均匀EGFR密度的U87的体内实验没有概括说明患者肿瘤中的抗原异质性，因此，Cetux-CAR+T细胞或Nimo-CAR+T细胞与不同特异性的CAR+T细胞组合的评价可针对来源于可能更好地概括说明体内肿瘤异质性的患者的成胶质细胞瘤样本进行评估(Ahmed等人,2010)。
出人意料地，Cetux-CAR+T细胞在T细胞治疗7天内显示出显著毒性，其中在T细胞注射7天内有6/14小鼠死亡。先前，据报道通过在不带有肿瘤的小鼠中T细胞输注之后48小时的肝酶测量所示，EGFR特异性CAR没有可检测的体内毒性(Zhou等人,2013)。因为此CAR来源于鼠抗体，所以EGFR特异性CAR不可能识别正常组织上的鼠EGFR。另外，在抗原不存在下毒性的测量在肿瘤上表达抗原的患者中不重复生理CAR+T细胞活化，因为这些细胞将活化、增殖并响应于肿瘤裂解产生细胞因子，这些都可促成可测量的毒性(Barrett等人,2014)。实际上，在本研究中，用Cetux-CAR+T细胞治疗带有低抗原肿瘤或不带有肿瘤的小鼠不会产生可检测的毒性(图4)，突出显示了体内T细胞活化对所观察到的T细胞毒性的作用。
因为西妥昔单抗不识别鼠EGFR，所以靶标上、组织外毒性不可能是Cetux-CAR+T细胞相关毒性的原因(Mutsaers等人,2009)。在此模型中Cetux-CAR介导毒性的可能机制包括由T细胞活化造成的细胞因子相关毒性或由于成簇、免疫突触形成或与降低抗原特异性的T细胞细胞骨架缔合所致的Cetux-CAR亲合力的可能提高，如在CD8共受体结合以提高高亲和力TCR的亲合力，由此导致特异性损失的作用中所述(Stone等人,2013)。
概括地说，Nimo-CAR+T细胞在颅内原位异种移植物模型中显示与更高亲和力的Cetux-CAR+T细胞相当的抗肿瘤活性和改善的存活期，而无与Cetux-CAR+T细胞有关的T细胞相关毒性。相反，Cetux-CAR+T细胞而非Nimo-CAR+T细胞显示针对具有低EGFR密度的肿瘤的抗肿瘤活性。这些研究结果与体外观察结果一致：Nimo-CAR+T细胞响应于低EGFR密度具有降低的活性。
D.为了CAR+T细胞疗法安全扩增抗原库
开发以实现CAR+T细胞的安全性的方法可被分为三个主要策略：(i)将CAR+T细胞限于肿瘤组织，(ii)限制CAR表达/T细胞持久性，以及(iii)将CAR介导的T细胞活化限于肿瘤(图32)。在归巢于肿瘤部位的T细胞中归巢分子与CAR的共表达(如CCR2、CCR4及CXCR2)已被描述为隔离CAR+T细胞与肿瘤部位(Peng等人,2010；Moon等人,2011；Di Stasi等人,2009)。虽然CAR+T细胞当与无归巢受体的CAR+T细胞相比时在肿瘤组织中增浓，但不清楚何种百分比的表达归巢受体的CAR+T细胞不会有效地归巢于肿瘤且会因此靶向正常组织。同样，由肿瘤分泌的趋化因子也可在组织创伤和治愈期间在正常组织中分泌。因此，将这些治疗与其他治疗方式如手术、化疗及放射线组合将担当在治疗期间T细胞被吸引至非特异性地受损的正常组织的风险。对于优先在低氧条件下(常见于许多肿瘤中)表达的CAR的开发已通过将CAR与氧依赖性降解结构域融合以限制常氧下的CAR表达和对靶组织的能力来实现(Chan等人,2005)。因为在从低氧移动到常氧的T细胞中的CAR降解可耗费几分钟至几小时，所以有可能靶标上、组织外毒性在CAR降解之前出现。另外，虽然许多肿瘤的中心是低氧的，但充分血管化的边缘肿瘤区域可具有足够的氧浓度来降解CAR，从而保护边缘区域免于CAR介导的T细胞活性(Vartanian等人,2014)。
暂时限制CAR+T细胞存在的策略包括T细胞的自杀基因修饰，如CAR作为瞬时RNA物质的表达；和iCaspase9自杀开关(suicide switch)的引入，其是通过二聚化(CID)的化学诱导物来特异性地活化以导致T细胞死亡(Zhao等人,2010；DiStassi等人,2011；Budde等人,2013；Barrett等人,2011；Barrett等人,2013)。两种方法都具有高外显率并且导致CAR+T细胞的几乎完全废除，在通过药物递送诱导细胞凋亡抑或RNA转基因表达随时间损失之后。因为两种策略都永久地去除CAR+T细胞，所以它们在保护正常组织的同时还限制针对肿瘤的治疗功效。这些策略的一个限制在于，在CAR减少或T细胞去除之前，针对正常细胞的有效活性存在，并且不存在毒性的短期限制。来自T细胞疗法的严重不良事件可从临床症状开始快速进展，因此，需要一种策略能够一输注CAR+T细胞就保护正常组织(Grupp等人,2013；Porter等人,2011)。
双重特异性、互补CAR响应于仅在肿瘤上共同表达的两种抗原的共表达通过解离信号传导结构域并表达具有两种特异性的两个嵌合受体实现选择性活化。在此策略中，一个特异性与CD3ζ融合以表达第一代CAR且不同的互补特异性与共刺激内功能域(称为嵌合共刺激受体(CCR))融合，以使得完全活化及T细胞功能仅在通过抗原的共表达的CAR与CCR同时结合下获得(Wilkie等人,2014；Lanitis等人,2013；Kloss等人,2013)。此方法已用针对以下具有重定向特异性的不同的CAR与CCR对来试行：乳腺癌的HER2和MUC1、前列腺癌的PSMA和PSCA以及卵巢癌治疗的间皮素和α-叶酸受体。早期研究显示T细胞活化和裂解功能可在CCR活化不存在下经由第一代CAR表达针对表达靶标的单抗原出现。虽然此细胞毒性比在第二代CAR下所观察到的要低，但仍然有CAR靶向表达单抗原的正常组织的一些残余风险(Wilkie等人,2014；Lanitis等人,2013)。克服此限制的一个策略是开发具有次优亲和力的第一代CAR，以使得当由单抗原激活时其几乎不能赋予T细胞功能并且毒性仅仅通过CCR的连接来挽救(Kloss等人,2013)。然而，此策略通过钝化T细胞对肿瘤抗原的敏感性来起作用。虽然此策略预防识别并靶向单抗原表达组织，由此潜在地降低正常组织毒性，但其同样降低抗肿瘤活性。另外，出于有效的T细胞活化和肿瘤消除而要表达两种抗原的要求减少了能够CAR活化的肿瘤的级分并且提高肿瘤逃逸变体发展的可能性。
仅见于正常组织上而未见于肿瘤上的抗原对于PD-1信号传导内功能域的抑制性CAR(iCAR)融合特异性能够显著地抑制T细胞介导的杀伤和响应于结合正常组织抗原的细胞因子产生(Fedorov等人,2013)。令人印象深刻的是，T细胞功能的iCAR抑制是可逆性的，并且T细胞随后在与肿瘤抗原相遇时能够完成功能有效的应答。此策略的成功依赖于CAR、iCAR及两种抗原的化学计量。因此，合理地预测如果iCAR表达或抗原在占绝对优势的CAR/肿瘤抗原表达存在下不充分的话，那么可出现正常组织毒性。此化学计量参数必须评估并针对每组抗原严格控制以便此策略能够奏效。
本文描述了一种基于CAR设计中使用的scFv的亲和力控制肿瘤部位的T细胞活化以响应于正常组织上低密度的EGFR减轻CAR+T细胞的活化同时响应于肿瘤组织上的高EGFR密度介导T细胞的细胞毒性的方法。此方法的优点在于(i)正常组织毒性的降低与响应于肿瘤的活性减弱无关，和(ii)T细胞的活化/抑制不需要多重抗原的识别，为此表达的化学计量和与相对受体的结合必须受到严格控制。另外，对用于T细胞活化的多重抗原的需要进一步降低将被有效靶向的肿瘤的比例。限制T细胞靶标上、组织外的组织毒性的方法都不是互相排斥的，并且多种策略的组合可提供对避免正常组织损伤的改善。
E.临床意义
成胶质细胞瘤患者可以是用于对EGFR有特异性的T细胞对于癌症免疫疗法的安全性的初始评价的理想患者群。EGFR在40-50％患有成胶质细胞瘤的患者中过度表达(Parsons等人,2008；Hu等人,2013)。另外，未在正常脑组织中报道有EGFR表达(Yano等人,2003)。因为EGFR广泛分布在正常上皮表面上，所以肿瘤切除之后T细胞的腔内递送可使抗肿瘤潜能最大化，同时使与CNS外的上皮表面的相互作用的可能性减至最低。在患有成胶质细胞瘤的患者中的初始安全评价之后，可能延长对于以下其他EGFR-表达恶性肿瘤的EGFR特异性CAR+T细胞疗法，这包括乳腺癌、卵巢癌、肺癌、头颈部癌、结肠直肠癌及肾细胞癌(Hynes等人,2005)。
虽然CAR通过T细胞的RNA修饰的瞬时表达可由于CAR+T细胞的存在受限而导致降低的抗肿瘤功效，但RNA修饰的T细胞的多次输注，尤其是以加权的初始剂量，可以克服这些潜在的限制，如先前在晚期白血病鼠模型中通过RNA转移修饰的CD19CAR+T细胞的情况下所示(Barrett等人,2013)。虽然用通过RNA表达转移的间皮素特异性CAR的临床试验已显示过敏的可能性，这可归因于响应于反复的CAR输注对CAR部分有特异性的IgE抗体应答的发生，已提出在CAR+T细胞输注与治疗之间不超过10天以便在21天过程内完成的给药策略避免了IgG抗体与IgE抗体的同种型转换并且目前正在评估中(Maus等人,2013)。尽管有这些挑战，CAR-表达RNA修饰在临床应用中仍存在许多有吸引力的优点。首先，T细胞的RNA修饰不涉及转基因的基因组整合，且因此可能减少监管机构审批的繁琐手续，这可以缩短CAR+T细胞疗法的临床前开发期。另外，通过RNA转移的CAR修饰的T细胞的生成比使用睡美人转座子/转座酶系统的DNA修饰快得多，从而在大约一半的离体培养时间中产生如T细胞的DNA修饰所需要>90％CAR+T细胞。提高监管机构审批手续的速度和减少离体制造时间可使新颖的CAR+T细胞疗法更快地被诊所利用，加快从实验室到病床的通信时间并且返回调整在为临床应用微调这些疗法中的提高的效率。
RNA修饰还可提供测试对在患者中广泛表达的正常组织抗原如EGFR有特异性的瞬时修饰的T细胞的平台以便在评估永久整合的CAR作为安全性的另一量度之前测定CAR结构的安全概况。因为Cetux-CAR显示T细胞活化和裂解活性响应于低EGFR密度，所以永久表达Cetux-CAR的T细胞的DNA修饰由于正常组织毒性的高风险而不可能是可行的临床策略。然而，通过RNA转移修饰的Nimo-CAR+T细胞的最初临床评价可确定Nimo-CAR+T细胞在瞬时CAR表达的额外安全特征下介导正常组织毒性的能力以减轻长期正常组织毒性的问题。
虽然Nimo-CAR+T细胞介导针对低密度EGFR的细胞毒性的能力降低可以降低正常组织毒性，但其也可降低针对表达低密度EGFR的肿瘤的效力，从而提高长出表达低密度EGFR的肿瘤逃逸变体的可能性。相比之下，Cetux-CAR+T细胞针对所有水平的EGFR表达的特异性裂解活性可降低长出表达低EGFR的肿瘤逃逸变体的风险，但是以针对具有低EGFR表达的正常组织的潜在毒性为代价。另外，Cetux-CAR+T细胞似乎不依赖于靶向EGFR-表达正常组织而介导一定程度的T细胞相关毒性，如在表达中等密度EGFR的颅内U87的治疗中所示，这或许是由于增加的细胞因子产生或局部炎症的诱发。Cetux-CAR+与Nimo-CAR+T细胞之间的关系突显了在基因修饰的T细胞疗法的安全性与功效之间必须达成平衡。选择何种策略可能具有更佳的临床结果，Cetux-CAR+T细胞具有提高的毒性风险但有更强的肿瘤控制的潜力或者Nimo-CAR+T细胞具有降低的毒性风险但有更大的发生肿瘤逃逸变体的可能性，并没有一个简单的解决方案。应对此平衡的一个潜在的临床策略可为输注通过DNA修饰的Nimo-CAR+T细胞用于稳定控制表达高EGFR的肿瘤变体，组合多次输注通过RNA修饰的Cetux-CAR+T细胞以消除表达低EGFR的肿瘤细胞。
II.定义
如本文所用的术语“嵌合抗原受体(CAR)”可指的是例如人工T细胞受体、嵌合T细胞受体、或嵌合免疫受体，并且包括工程化受体，其将人工特异性移植到特定的免疫效应细胞上。CAR可用于向T细胞上的单克隆抗体赋予特异性，由此允许生成大量特异性T细胞，例如用于过继性细胞疗法中。在具体的实施方案中，CAR将细胞的特异性导向例如肿瘤相关抗原。在一些实施方案中，CAR包含细胞内活化结构域、跨膜结构域、及包含肿瘤相关抗原结合区的细胞外结构域。在具体的方面中，CAR包含来源于单克隆抗体的单链可变片段(scFv)融合至CD3-ζ跨膜结构域和内功能域的融合物。其他CAR设计的特异性可来源于受体(例如肽)的配体或来源于模式识别受体，如Dectin。在一些实施方案中，可以通过使用对B谱系分子CD19有特异性的CAR重定向T细胞的特异性来靶向恶性B细胞。在某些实施方案中，抗原识别结构域的间距可被修改以减少活化诱导的细胞死亡。在某些实施方案中，CAR可包含用于额外的共刺激信号传导的结构域，如CD3-ζ、FcR、CD27、CD28、CD137、DAP10、和/或OX40。在一些实施方案中，以下分子可与CAR共表达，包括共刺激分子、用于成像(例如，用于电子发射断层扫描)的报道基因、当添加前药时有条件地去除T细胞的基因产物、归巢受体、趋化因子、趋化因子受体、细胞因子以及细胞因子受体。
如本文所用的术语“T细胞受体(TCR)”是指T细胞上的蛋白质受体，其是由alpha(α)和beta(β)链的异源二聚体构成，但在一些细胞中，TCR是由gamma和delta(γ/δ)链组成。在一些实施方案中，TCR可在包含TCR的任何细胞上被修饰，包括例如辅助T细胞、细胞毒性T细胞、记忆T细胞、调控T细胞、天然杀伤T细胞及γδT细胞。
如本文所用，术语“抗原”为能够被抗体或T细胞受体结合的分子。抗原一般可用于诱导体液免疫应答和/或产生B和/或T淋巴细胞的细胞免疫应答。
术语“肿瘤相关抗原”与“癌细胞抗原”在本文中可互换使用。在每个情况下，该术语指的是特异性地或优先地通过癌细胞表达的蛋白质、糖蛋白或糖类。
如本文所用的短语“有此需要”关于治疗受试者或选择性地靶向受试者中的细胞时是指具有可受益于选择性杀伤表达靶抗原(或增加水平的靶抗原)的细胞的疾病状况的受试者。在一些方面中，该疾病状况可以是相对于在受试者中无癌细胞的情况表达增加水平的靶抗原的癌症。举例来说，该癌症可以是相对于在受试者中无癌细胞的情况表达增加水平的EGFR的神经胶质瘤。
如本文所用的短语“有效量”相对于CAR T细胞或包含CAR T细胞的药物组合物是指当向受试者施用时足以杀伤表达(或表达增加水平的)由CAR结合的靶抗原的细胞的CART细胞的量。
III.嵌合抗原受体
本文所述的实施方案涉及生成与鉴定编码抗原特异性嵌合抗原受体(CAR)多肽的核酸。在一些实施方案中，CAR被人源化以降低免疫原性(hCAR)。
在一些实施方案中，CAR可识别在一个或多个抗原之间包含共享空间的表位。模式识别受体如Dectin-1可用于获得针对糖抗原的特异性。在某些实施方案中，结合区可包含单克隆抗体的互补决定区、单克隆抗体的可变区、和/或其抗原结合片段。在一些实施方案中，结合区为scFv。在另一实施方案中，结合至受体或细胞靶标的肽(例如，细胞因子)可包括在内作为CAR结合区中的scFv区的可能或替代。因此，在一些实施方案中，CAR可由多个编码多重scFv区的载体和/或其他靶蛋白生成。互补决定区(CDR)是见于抗原受体(例如，免疫球蛋白和T细胞受体)蛋白的可变结构域中的短氨基酸序列，其与抗原互补且因此提供对于那个特定抗原有其特异性的受体。抗原受体的每条多肽链含有三个CDR(CDR1、CDR2及CDR3)。由于抗原受体通常由两条多肽链构成，所以对于每个抗原受体存在六个可与抗原接触的CDR--重链和轻链各含有三个CDR。因为与免疫球蛋白和T细胞受体选择性有关的大多数序列变异一般见于CDR中，所以这些区有时被称为高变结构域。在这些当中，CDR3显示最大的变异性，因为它是通过VJ(VDJ，在重链和TCRαβ链的情况下)区的重组来编码。
经由实施方案生成的CAR编码核酸可包含一个或多个人基因或基因片段以增强对于人患者的细胞免疫疗法。在一些实施方案中，全长CAR cDNA或编码区可经由本文所述的方法生成。抗原结合区或结构域可包含来源于特定的人单克隆抗体的单链可变片段(scFv)的VH和VL链的片段，如美国专利7,109,304中所述的那些，该专利以引用的方式并入本文。在一些实施方案中，scFv包含人抗原特异性抗体的抗原结合结构域。在一些实施方案中，scFv区为由为在人细胞中表达的人密码子选择而优化的序列编码的抗原特异性scFv。
CAR的抗原结合结构域的排列可以是多聚体的，如二聚抗体或多聚体。多聚体可通过将轻链和重链的可变部分交叉配对到可被称为二聚抗体的物质中而形成。在一些实施方案中，CAR的铰链部分可被缩短或排除(即，生成仅包含抗原结合结构域、跨膜区及细胞内信号传导结构域的CAR)。许多铰链可在本实施方案中使用，例如如表1所示。在一些实施方案中，绞链区可保留第一半胱氨酸，或通过脯氨酸或丝氨酸取代而突变，或被截短至第一半胱氨酸。Fc部分可从用作抗原结合区的scFv上缺失以生成根据实施方案的CAR。在一些实施方案中，抗原结合区可仅编码一个Fc结构域，例如，来自人免疫球蛋白的CH2或CH3结构域。还可包括人免疫球蛋白的铰链、CH2及CH3区，该人免疫球蛋白已被修饰以增强二聚和低聚。在一些实施方案中，铰链部分可包含或由8-14个氨基酸肽(例如，12个AA肽)、CD8α的一部分或IgG4Fc组成。在一些实施方案中，抗原结合结构域可使用促进低聚的结构域如CD8α悬挂于细胞表面。在一些实施方案中，抗原结合结构域可使用由单克隆抗体(mAb)克隆2D3(mAb克隆2D3，描述于例如Singh等人,2008中)识别的结构域悬挂于细胞表面。
CAR的内功能域或细胞内信号传导结构域一般可引起或促进包含CAR的免疫细胞的正常效应功能中的至少一种的活化。举例来说，内功能域可促进T细胞的效应功能，例如像，溶细胞活性或包括分泌细胞因子的辅助活性。在首次用于试验、记忆、或记忆型T细胞中的效应功能可包括抗原依赖性增殖。术语“细胞内信号传导结构域”或“内功能域”是指可转导效应功能信号和/或引导细胞进行特殊功能的CAR的部分。虽然整个细胞内信号传导结构域都可包括在CAR中，但在一些情况下，可包括内功能域的截短部分。一般来说，内功能域包括截短的内功能域，其中截短的内功能域保留转导细胞中的效应功能信号的能力。
在一些实施方案中，内功能域包含T细胞受体的ζ链或其任何同源物(例如，η、δ、γ或ε)、MB1链、B29、Fc RIII、Fc RI以及信号传导分子的组合，如CD3ζ和CD28、CD27、4-1BB、DAP-10、OX40、及其组合、以及其他相似的分子和片段。可使用活化蛋白家族的其他成员的细胞内信号传导部分，如FcγRIII和FcεRI。这些替代的跨膜和细胞内结构域的实例可见于例如Gross等人(1992)、Stancovski等人(1993)、Moritz等人(1994)、Hwu等人(1995)、Weijtens等人(1996)及Hekele等人(1996)中，其以引用的方式整体并入本文。在一些实施方案中，内功能域可包含人CD3ζ细胞内结构域。
抗原特异性细胞外结构域与细胞内信号传导结构域优选地通过跨膜结构域连接。可包括在CAR中的跨膜结构域包括例如人IgG4Fc铰链和Fc区、人CD4跨膜结构域、人CD28跨膜结构域、跨膜人CD3ζ结构域、或半胱氨酸突变的人CD3ζ结构域、或来自人跨膜信号传导蛋白的跨膜结构域，例如像CD16和CD8及促红细胞生成素受体。跨膜结构域的实例提供于例如表1中。
在一些实施方案中，内功能域包含编码共刺激受体的序列，例如像修饰的CD28细胞内信号传导结构域、或CD28、CD27、OX-40(CD134)、DAP10或4-1BB(CD137)共刺激受体。在一些实施方案中，由CD3ζ起始的原始信号、由人共刺激受体提供的额外信号都可包括在CAR中以便更有效地活化转化的T细胞，这可有助于改善过继性免疫疗法的体内持久性和治疗成功。如表1中所示，内功能域或细胞内受体信号传导结构域可包含单独或以与以下FcγRIII共刺激信号传导结构域组合的CD3的ζ链，例如像CD28、CD27、DAP10、CD137、OX40、CD2、4-1BB。在一些实施方案中，内功能域包含以下一种或多种的一部分或全部：TCRζ链、CD28、CD27、OX40/CD134、4-1BB/CD137、FcεRIγ、ICOS/CD278、IL-2Rβ/CD122、IL-2Rα/CD132、DAP10、DAP12及CD40。在一些实施方案中，1、2、3、4或更多个胞质结构域可包括在内功能域中。举例来说，在一些CAR中，已观察到至少两个或三个融合在一起的信号传导结构域可产生相加或协同效应。
在一些方面中，可生成经分离的核酸区段和包括编码CAR的DNA序列的表达盒。可使用多种载体。在一些优选实施方案中，载体可使得递送编码CAR的DNA以便免疫如T细胞。CAR表达可在调控的真核生物启动子的控制下，例如像MNDU3启动子、CMV启动子、EF1α启动子或泛素启动子。而且，载体可含有可选择的标记物，至少，用来促进其体外操纵。在一些实施方案中，CAR可由从DNA模板体外转录来的mRNA来表达。
嵌合抗原受体分子为重组的且以其经由存在于其胞质尾中的免疫受体活化基序(ITAM)结合抗原和转导活化信号的能力为特征。利用抗原结合部分(例如由单链抗体(scFv)生成)的受体构建体提供“通用的”的额外益处是在于：它们可以HLA非依赖性方式结合靶细胞表面上的天然抗原。例如，scFv构建体可融合至编码CD3复合体ζ链(ζ)的细胞内部分、Fc受体重链及sky酪氨酸激酶的序列(Eshhar等人,1993；Fitzer-Attas等人,1998)。包括肿瘤识别和通过CTL的裂解的重定向的T细胞效应机制已经记录在若干个鼠及人抗原-scFv:ζ系统中(Eshhar等人,1997；Altenschmidt等人,1997；Brocker等人,1998)。
抗原结合区可例如来自于人或非人scFv。使用非人抗原结合区(如鼠单克隆抗体)的一个可能的问题是降低的人效应功能和降低渗透到肿瘤块中的能力。此外，非人单克隆抗体可由人宿主识别为外源蛋白，且因此，重复注射这种外源抗体可能造成免疫应答的诱发，由此导致有害的超敏反应。对于基于鼠的单克隆抗体，此效应被称为人抗小鼠抗体(HAMA)应答。在一些实施方案中，在CAR中包含人抗体或scFv序列与一些鼠抗体相比可几乎没造成或不造成HAMA应答。类似地，在CAR中包含人序列可用于降低或避免免疫介导的识别或由驻留在受体中的内源性T细胞造成的消除的风险并且可能基于HLA识别加工过的抗原。
在一些实施方案中，CAR包含：a)细胞内信号传导结构域，b)跨膜结构域，c)绞链区，及d)包含抗原结合区的细胞外结构域。在一些实施方案中，细胞内信号传导结构域和跨膜结构域与内功能域一起通过可与编码绞链区的载体和编码抗原结合区的载体融合(例如，经由转座子定向的同源重组)的单一载体来编码。在其他实施方案中，细胞内信号传导区和跨膜区可通过融合(例如，经由转座子定向的同源重组)在一起的两个单独的载体来编码。
在一些实施方案中，CAR的抗原特异性部分，也被称为包含抗原结合区的细胞外结构域，选择性地靶向肿瘤相关抗原。肿瘤相关抗原可以是任何种类，只要其在肿瘤细胞的细胞表面上表达。可以经由实施方案生成的CAR靶向的肿瘤相关抗原的实例包括例如CD19、CD20、癌胚抗原、甲胎蛋白、CA-125、MUC-1、CD56、EGFR、c-Met、AKT、Her2、Her3、上皮肿瘤抗原、黑色素瘤相关抗原、突变的p53、突变的ras、Dectin-1等等。在一些实施方案中，CAR的抗原特异性部分为scFv。靶向肿瘤的scFv的实例提供于表1中。在一些实施方案中，CAR可与膜结合的细胞因子共表达，以便例如当存在少量肿瘤相关抗原时提高持久性。例如，CAR可与膜结合的IL-15共表达。
在一些实施方案中，细胞内肿瘤相关抗原，例如像HA-1、存活素、WT1及p53可以CAR来靶向。这可通过在通用的T细胞上表达的CAR来实现，该CAR识别在HLA的情形下由细胞内肿瘤相关抗原所述的加工过的肽。另外，通用的T细胞可被遗传修饰以表达识别在HLA的情形下细胞内加工的肿瘤相关抗原的T细胞受体对。
根据实施方案使用的靶抗原的另外的实例包括但不限于CD19、CD20、ROR1、CD22、癌胚抗原、甲胎蛋白、CA-125、5T4、MUC-1、上皮肿瘤抗原、前列腺特异性抗原、黑色素瘤相关抗原、突变的p53、突变的ras、HER2/Neu、叶酸结合蛋白、HIV-1包膜糖蛋白gp120、HIV-1包膜糖蛋白gp41、GD2、CD123、CD33、CD138、CD23、CD30、CD56、c-Met、间皮素、GD3、HERV-K、IL-11Rα、κ链、λ链、CSPG4、ERBB2、EGFRvIII、VEGFR2、GP240、CD-33、CD-38、VEGFR-1、VEGFR-2、CEA、FGFR3、IGFBP2、IGF-1R、BAFF-R、TACI、APRIL、Fn14、ERBB2或ERBB35T4、MUC-1及EGFR。在某些特定方面中，实施方案的所选CAR包含尼妥珠单抗的CDR或抗原结合部分，如SEQ ID NO:1-2中所列。举例来说，CAR可包含VL CDR1RSSQNIVHSNGNTYLD(SEQ ID NO:5)；VL CDR2KVSNRFS(SEQ ID NO:6)；VL CDR3FQYSHVPWT(SEQ ID NO:7)；VH CDR1NYYIY(SEQ ID NO:8)；VHCDR2GINPTSGGSNFNEKFKT(SEQ ID NO:9)及VH CDR3QGLWFDSDGRGFDF(SEQ ID NO:10)，参见，例如Mateo等人,1997，其以引用的方式并入本文。在其他特定方面中，实施方案的CAR包含西妥昔单抗的CDR或抗原结合部分，如SEQ ID NO:3-4中所列。举例来说，CAR可包含VLCDR1RASQSIGTNIH(SEQ ID NO:11)；VL CDR2ASEIS(SEQ ID NO:12)；VL CDR3QQNNNWPTT(SEQID NO:13)；VH CDR1NYGVH(SEQ ID NO:14)；VH CDR2VIWSGGNTDYNTPFTS(SEQ ID NO:15)及VH CDR3ALTYYDYEFAY(SEQ ID NO:16)，参见，例如国际(PCT)专利公布WO2012100346，其以引用的方式并入本文。
如上所论述，在一些方面中，所选的CAR结合至抗原并且相对于该抗原具有在约2nM与约500nM之间的Kd，其中包含所选CAR的T细胞针对表达该抗原的靶细胞(例如癌细胞)展现细胞毒性。举例来说，在一些方面中，CAR相对于抗原具有2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20nM或更大的Kd并且包含所选CAR的T细胞针对表达该抗原的靶细胞展现细胞毒性。在更进一步的方面中，CAR相对于抗原具有在约5nM与约450、400、350、300、250、200、150、100或50nM之间的Kd。在更进一步的方面中，CAR相对于抗原具有在约5nM至500nM、5nM至200nM、5nM至100nM、或5nM至50nM的Kd并且包含所选CAR的T细胞针对表达该抗原的靶细胞展现细胞毒性。
在一些方面中，实施方案的所选CAR每CAR分子可结合至2、3、4或更多个抗原分子并且包含所选CAR的T细胞针对表达该抗原的靶细胞(例如癌细胞)展现细胞毒性。在一些方面中，所选CAR的每个抗原结合结构域相对于抗原具有2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20nM或更大的Kd并且包含所选CAR的T细胞针对表达该抗原的靶细胞展现细胞毒性。在更进一步的方面中，所选CAR的每个抗原结合结构域相对于抗原具有约5nM至约450、400、350、300、250、200、150、100或50nM的Kd并且包含所选CAR的T细胞针对表达该抗原的靶细胞展现细胞毒性。在更进一步的方面中，所选CAR的每个抗原结合结构域相对于抗原具有约5nM至500nM、5nM至200nM、5nM至100nM、或5nM至50nM的Kd并且包含所选CAR的T细胞针对表达该抗原的靶细胞展现细胞毒性。
由CAR识别的病原体可以是基本上任何种类的病原体，但在一些实施方案中，病原体为真菌、细菌或病毒。示例性病毒病原体包括以下那些：腺病毒科、埃-巴二氏病毒(EBV)、巨细胞病毒(CMV)、呼吸道合胞病毒(RSV)、JC病毒、BK病毒、HSV、HHV病毒科、小核糖核酸病毒科、疱疹病毒科、肝病毒科、黄病毒科、逆转录病毒科、正粘病毒科、副粘病毒科、乳多空病毒科、多瘤病毒科、弹状病毒科以及披膜病毒科。示例性致病病毒引起天花、流感、腮腺炎、麻疹、水痘、埃博拉及风疹。示例性致病真菌包括念珠菌属、曲菌属、隐球酵母属、组织胞浆菌属、肺孢子虫属及葡萄状穗霉属。示例性致病细菌包括链球菌属、假单胞菌属、志贺氏菌属、弯曲杆菌属、葡萄球菌属、螺杆菌属、大肠杆菌、立克次氏体属、杆菌属、博代氏杆菌属、衣原体属、螺旋体属及沙门氏菌属。在一些实施方案中，病原体受体Dectin-1可用于生成识别如曲菌属的真菌的细胞壁上的糖结构的CAR。在另一实施方案中，CAR可基于识别病毒决定簇(例如，来自CMV和埃博拉的糖蛋白)以阻断病毒感染和病理的抗体来制作。
在一些实施方案中，编码CAR的裸DNA或合适的载体可引入受试者的T细胞(例如，从患有癌症或其他疾病的人患者中获得的T细胞)中。通过使用裸DNA的电穿孔稳定转染T细胞的方法在本领域中是已知的。参见，例如美国专利号6,410,319。裸DNA一般是指编码以适用于表达的方向包含在质粒表达载体中的实施方案的嵌合受体的DNA。在一些实施方案中，裸DNA的使用可缩短产生表达经由实施方案方法生成的CAR的T细胞所需的时间。
或者，病毒载体(例如，逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体或慢病毒载体)可用于将嵌合构建体引入到T细胞中。一般来说，用于转染来自受试者的T细胞的编码CAR的载体一般在受试者的T细胞中应为非复制的。已知大量基于病毒的载体，其中保持在细胞中的病毒拷贝数低得足以维持细胞的存活力。说明性载体包括pFB-neo载体以及基于HIV、SV40、EBV、HSV或BPV的载体。
一旦已确认转染或转导的T细胞能够在所需的调控下和所需水平下表达CAR作为表面膜蛋白，便可确定嵌合受体在宿主细胞中是否具有功能性以提供所期望的信号诱导。随后，转导的T细胞可再引入受试者中或向受试者施用以激活受试者中的抗肿瘤应答。为了便于施用，转导的T细胞可在适当的载体或稀释剂下被制成药物组合物或被制成适于体内施用的植入物，所述载体或稀释剂优选为药学上可接受的。制得这种组合物或植入物的手段已在本领域中有所描述(参见，例如Remington's Pharmaceutical Sciences,第16版,Mack编著(1980))。适当时，CAR-表达转导的T细胞可被配制成半固体或液体形式的制剂，如胶囊、溶液、注射剂、吸入剂或气溶胶，以用于它们相应的施用途径的常规方式。可利用本领域中已知的手段来防止组合物的释放和吸收或使组合物的释放和吸收减到最少直到其到达靶组织或器官或确保组合物的定时释放。一般来说，优选采用不影响表达嵌合受体的细胞的药学上可接受的形式。因此，转导的T细胞理想地可由含有平衡盐溶液(如汉氏平衡盐溶液)或生理盐水的药物组合物制成。
IV.与实施方案有关的方法和组合物
在某些方面中，本文所述的实施方案包括一种制备和/或扩增抗原特异性重定向T细胞的方法，所述方法包括用含有编码hCAR的DNA构建体的表达载体转染T细胞，然后任选地用抗原阳性细胞、重组抗原或受体的抗体刺激这些细胞以致使细胞增殖。
另一方面，提供一种通过电穿孔或使用裸DNA的其他非病毒基因转移(如但不限于声致穿孔)稳定转染和重定向T细胞的方法。大多数研究者将病毒载体用于携带异源基因到T细胞中。通过使用裸DNA，可缩短产生重定向的T细胞所需的时间。“裸DNA”意指编码以适用于表达的方向包含在表达盒或载体中的嵌合T细胞受体(cTCR)的DNA。根据实施方案的电穿孔方法产生表达和携带在嵌合TCR(cTCR)的表面上的稳定转染子。
在某些方面中，T细胞为原代人T细胞，如来源于人外周血单核细胞(PBMC)、用G-CSF、骨髓或脐带血刺激之后收集的PBMC的T细胞。条件包括mRNA和DNA的使用及电穿孔。转染之后，细胞可立即被输注或可被储存。在某些方面中，转染之后，细胞可离体繁殖数天、数周或数月作为在基因转移到细胞中之后约1、2、3、4、5天或更多天内的混合群体。另一方面，转染之后，转染子被克隆并且显示存在单一整合的或游离体维持的表达盒或质粒和表达嵌合受体的克隆被离体扩增。选出用于扩增的克隆显示特异性地识别和裂解表达CD19的靶细胞的能力。重组T细胞可通过用IL-2或结合共有γ链的其他细胞因子(例如IL-7、IL-12、IL-15、IL-21等)刺激来扩增。重组T细胞可通过用人工抗原呈递细胞刺激来扩增。重组T细胞可在人工抗原呈递细胞上或在抗体如OKT3(其与T细胞表面的CD3交联)下扩增。重组T细胞的亚群可在人工抗原呈递细胞上或在抗体如Campath(其结合T细胞表面的CD52)下缺失。另一方面，可将遗传修饰的细胞冷冻保存。
输注之后的T细胞繁殖(存活)可通过以下来评价：(i)使用对CAR有特异性的引物的q-PCR；(ii)使用对CAR有特异性的抗体的流式细胞术；和/或(iii)可溶性TAA。
本文所述的实施方案还涉及使用重定向的免疫T细胞用具有CD19特异性的细胞表面表位对包括B细胞的B细胞恶性肿瘤或病症的靶向。恶性B细胞为用于重定向的T细胞的极佳靶标，因为B细胞可充当T细胞的免疫刺激抗原呈递细胞。临床前研究支持：用带有人或人源化CAR的供体来源的CD19特异性T细胞的过继性疗法的抗肿瘤活性包括(i)CD19+靶标的重定向杀伤，(ii)在与CD19+靶标/刺激细胞培养之后细胞因子的重定向的分泌/表达，以及(iii)在与CD19+靶标/刺激细胞培养之后的持续增殖。
在某些实施方案中，CAR细胞被递送给有此需要的个体，如患有癌症或感染的个体。然后细胞增强个体的免疫系统以攻击相应的癌症或致病细胞。在一些情况下，向个体提供一个或多个剂量的抗原特异性CAR T细胞。在向个体提供两个或更多个剂量的抗原特异性CAR T细胞的情况下，施用之间的持续时间应足以使得个体中的增殖时间，并且在特定的实施方案中，给药之间的持续时间为1、2、3、4、5、6、7天或更多天。
被修饰以包括嵌合抗原受体并缺失功能性TCR的同种异体T细胞的来源可以是任何种类，但在特定的实施方案中，细胞是从例如脐带血、外周血、人胚胎干细胞或诱导的多能干细胞库中获得的。治疗效果的合适剂量将为例如每剂量至少105或约105至约1010个细胞，优选地在一系列给药周期中。示例性给药方案是由四个逐步升高剂量的一周给药周期组成，起始于第0天至少约105个细胞，举例来说在启动患者内剂量逐步增加方案的几周内逐渐增加至约1010个细胞的靶剂量。合适的施用方式包括静脉内、皮下、腔内(例如通过储集器接入装置)、腹膜内、以及直接注射到肿瘤块中。
实施方案的药物组合物可单独或以与适用于治疗癌症的其他广为接受的试剂组合使用。无论是单独抑或以与其他试剂组合的形式递送，实施方案的药物组合物都可经由各种途径递送到哺乳动物(尤其是人)体内的不同部位以实现特定的效应。本领域技术人员将认识到，尽管超过一个途径可用于施用，但特定的途径可提供比另一途径更即时且更有效的作用。
实施方案的组合物可以单位剂型提供，其中每个剂量单位(例如注射剂)含有预定量的组合物，单独或以与其他活性剂的适当组合形式。如本文所用的术语单位剂型是指物理上离散的、适宜作为用于人和动物受试者的单位剂量的单位，每个单位含有预定量的实施方案的组合物，单独或以与其他活性剂组合的形式，以足以产生预期效果的量来计算，适当时联合药学上可接受的稀释剂、载体或媒介物。用于实施方案的新颖单位剂型的规格取决于与具体受试者中的药物组合物有关的具体药效学。
理想地，有效量或足够数量的分离转导的T细胞存在于组合物中并引入受试者中以使得长期的、特异性的抗肿瘤应答被建立以减小肿瘤尺寸或消除在不存在这种治疗下将出现的肿瘤生长或再生长。理想地，再引入受试者中的转导的T细胞的量当与其中不存在转导的T细胞的相同病状相比时造成肿瘤尺寸10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％或100％减小。
因此，所施用的转导的T细胞的量应考虑施用途径并且应如此以使得足够数量的转导T细胞将被引入以实现期望的治疗反应。此外，包括在本文所述的组合物中的每种活性剂的量(例如，每个有待接触的细胞的量或每一定体重的量)在不同的应用中可变化。一般说来，转导的T细胞的浓度理想地应足以在所治疗的受试者中提供至少约1×106至约×109个转导的T细胞，甚至更理想地，约1×107至约5×108个转导的T细胞，但是可利用任何合适的量，超过，例如大于5×108个细胞，或者低于，例如小于1×107个细胞。给药方案可基于广为接受的基于细胞的疗法(参见，例如Topalian和Rosenberg,1987；美国专利号4,690,915)，或者可采用交替连续输注策略。
这些值提供当优化实施方案的方法时由专业人员利用的转导T细胞的范围的一般指导。在本文中的所述范围的详述并没有排除使用更高或较低量的组分，如在特殊的应用中可能被考虑。例如，实际剂量和方案可视组合物是否与其他药物组合物组合施用或者可视CAR-表达细胞中的个体间差异(如，与靶标抗原的CAR结合亲和力)而变化。本领域技术人员可易于根据具体情况的紧急程度作出任何必要的调整。
V.抗原呈递细胞
在一些情况下，APC适用于制备基于CAR的治疗组合物和细胞疗法产物。根据实施方案使用的APC包括但不限于树突细胞、巨噬细胞及人工抗原呈递细胞。关于抗原呈递系统的制备和使用的一般指导，参见，例如美国专利号6,225,042、6,355,479、6,362,001及6,790,662；美国专利申请公布号2009/0017000和2009/0004142；以及国际公布号WO2007/103009)。
APC可用于扩增CAR-表达T细胞。在与肿瘤抗原相遇期间，由抗原呈递细胞递送给T细胞的信号可实现T细胞编程及其后续的治疗功效。这对产生对提供给T细胞的信号允许最佳控制的人工抗原呈递细胞有促进动力(Turtle等人,2010)。除目标抗体或抗原之外，APC系统还可包含至少一种外源性辅助分子。可采用任何合适数量和组合的辅助分子。辅助分子可选自如共刺激分子和粘附分子的辅助分子。示例性共刺激分子包括CD70和B7.1(也称为B7或CD80)，其可结合至T细胞表面上的CD28和/或CTLA-4，由此实现例如T细胞扩增、Th1分化、短期T细胞存活以及细胞因子分泌，如白介素(IL)-2(参见Kim等人,2004)。粘附分子可包括糖结合的糖蛋白如选择素、跨膜结合糖蛋白如整联蛋白、钙依赖性蛋白如钙粘素、以及单程跨膜免疫球蛋白(Ig)超家族蛋白如细胞间粘附分子(ICAM)，它们促进例如细胞与细胞或细胞与基质的接触。示例性粘附分子包括LFA-3和ICAM，如ICAM-1。适用于示例性辅助分子(包括共刺激分子和粘附分子)的选择、克隆、制备及表达的技术、方法及试剂举例说明在例如美国专利号6,225,042、6,355,479及6,362,001中。
被选出变成aAPC的细胞优选地在细胞内抗原加工、细胞内肽运输和/或细胞内MHCI类或II类分子肽装载中具有缺陷，或为变温的(即，对温度攻击没有哺乳动物细胞系敏感)，或具有缺陷和变温特性两者。优选地，被选出变成aAPC的细胞还缺乏表达引入细胞中的外源性MHC I类或II类分子和辅助分子组分的至少一种内源性对应物(例如，内源性MHCI类或II类分子和/或如上所述的内源性辅助分子)的能力。此外，aAPC优选地保留在其修饰以生成aAPC之前细胞所具有的缺陷和变温特性。示例性aAPC构成或来源于与抗原加工(TAP)缺乏的细胞系(如昆虫细胞系)有关的转运子。示例性变温昆虫细胞系为果蝇细胞系，如Schneider 2细胞系(例如，Schneider,J.m 1972)。用于Schneider 2细胞的制备、生长及培养的说明性方法提供于美国专利号6,225,042、6,355,479及6,362,001中。
APC可经受冻融循环。例如，APC可通过将含有APC的合适容器与适量的液氮、固体二氧化碳(干冰)或类似低温材料接触以使得冷冻快速发生来冷冻。然后通过将APC从低温材料中移除并暴露于周围室温条件，或者通过便利的解冻过程对冷冻的APC进行解冻，在便利的解冻过程中温水浴或温暧的手被用于促成较短的解冻时间。另外，APC可在解冻之前被冷冻和储存一段延长的时间。也可对冷冻的APC进行解冻，然后在进一步使用之前冻干。可能不利地影响冻融过程的防腐剂，如二甲亚砜(DMSO)、聚乙二醇(PEG)及其他防腐剂，不宜存在于经历冻融循环的含有APC的介质中或者如通过将APC转移到基本上不含这种防腐剂的介质中被基本上去除。
在其他实施方案中，异种核酸和aAPC内源性核酸可通过交联而灭活，以使得在灭活之后基本上没有细胞生长、核酸的复制或表达。例如，aAPC可在表达外源性MHC和辅助分子、将所述分子呈递在aAPC表面上并用所选的一种或多种肽装载所呈递的MHC分子之后的一点处灭活。因此，所述灭活和选出的肽装载的aAPC基本上不能增殖或复制，但可保留所选肽的呈递功能。交联也可产生基本上不含污染微生物如细菌和病毒的aAPCS，而实质上不会降低aAPC的抗原呈递细胞功能。因此，交联可用于维持aAPC的重要的APC功能，同时有助于缓和关于使用aAPC开发的细胞疗法产物的安全性问题。关于与交联有关的方法和aAPC，参见，例如美国专利申请公布号20090017000，其以引用的方式并入本文。
VI.试剂盒
本文所述的任何组合物都可包含在试剂盒中。在一些实施方案中，同种异体的CART细胞提供于试剂盒中，所述试剂盒还可包括适用于扩增细胞的试剂，如介质、抗原呈递细胞(例如aAPC)、生长因子、抗体(例如用于分选或表征CAR T细胞)和/或编码CAR或转座酶的质粒。
在非限制性实施例中，嵌合受体表达构建体、生成嵌合受体表达构建体的一种或多种试剂、用于转染表达构建体的细胞和/或获得用于转染表达构建体的同种异体细胞的一种或多种仪器(这类仪器可以是注射器、移液管、镊子和/或任何这类医学上认可的装置)。
在一些实施方案中，用于消除内源性TCRα/β表达的表达构建体、生成构建体的一种或多种试剂和/或CAR+T细胞被提供于试剂盒中。在一些实施方案中，还包括编码锌指核酸酶的表达构建体。
在一些方面中，试剂盒包括用于细胞电穿孔的试剂或装置。
试剂盒可包含实施方案的一种或多种适当等分的组合物或生成实施方案组合物的试剂。试剂盒的组分可以含水介质或冻干形式包装。试剂盒的容器装置可包括至少一个小瓶、试管、烧瓶、瓶子、注射器或其他容器装置，组分可位于且优选地适当等分于所述容器装置中。当试剂盒中存在一种以上组分时，该试剂盒一般还将含有第二、第三或其他额外的容器，额外的组分可单独位于这些容器中。然而，组分的各种组合可包含在小瓶中。实施方案的试剂盒通常还将包括用于容纳嵌合受体构建体和任何其他试剂容器的装置，密封以用于商业销售。这类容器可包括例如注射成模或吹模成型的塑料容器，其中保留了所需小瓶。
VII.实施例
以下特定和非限制性实施例被视为仅为说明性的，且无论如何不以任何方式限制本公开。据信本领域技术人员可基于本文中的说明书在最大程度上利用本公开内容，而不需要进一步的详细说明。本文所引用的所有出版物都在此以引用的方式整体并入。当参考URL或其他这类标识或地址时，应理解这类标识可变化并且因特网上的特定信息可能变来变去，但是通过在因特网上进行搜索可以找到等同的信息。对其的参考证实了这些信息的可用性及其公众传播。
实施例1–材料和方法
质粒
西妥昔单抗来源的CAR转座子。西妥昔单抗来源的CAR是由以下物质组成：来自人GMCSFR2信号肽的信号肽(氨基酸1-22；NP_758452.1)、西妥昔单抗的可变轻链(PDB:1YY9_C)甲沟炎接头(AAE37780.1)、西妥昔单抗的可变重链(PDB:1YY9_D)、人IgG4(氨基酸161-389，AAG00912.1)、人CD28跨膜和信号传导结构域(氨基酸153-220，NP_006130)、以及人CD3-ζ细胞内结构域(氨基酸52至164，NP_932170.1)。GMCSFR2序列、可变轻链、甲沟炎接头、可变重链以及部分IgG4是人密码子优化的并且通过GeneART(Regensburg,Germany)生成为0700310/pMK。在人类延长因子1-α(HEF1α)控制下的先前所述的CD19CD28mZ(CoOp)/pSBSO被选为SB转座子的主链。0700310/pMK和先前所述的CD19CD28mZ/pSBSO(93,94)经历用NheI和XmnI限制酶的双消化。CAR插入物与转座子主链通过在0.8％琼脂糖凝胶中在150伏下运行45分钟的琼脂糖凝胶电泳并用溴化乙锭染色以便在紫外曝光下目测而分别被鉴定为1.3kb和5.2kb的DNA片段。将条带切除并纯化(Qiaquick凝胶提取试剂盒，Qiagen,Valencia,CA)，然后使用T4DNA连接酶(Promega,Madison,WI)在3:1的插入物与主链摩尔比下连接。TOP10化学感受态细菌(Invitrogen,Grand Island,NY)的热激转化和在37℃下培养12-16小时的含卡那霉素的琼脂板上的选择鉴定了细菌克隆对于转座子主链呈阳性。六个克隆被选出在37℃下在卡那霉素选择下在TB培养基中微型培养8小时。DNA由微型培养物的制备经由MiniPrep试剂盒(Qiagen)完成，并且随后用限制酶进行分析消化且通过琼脂糖凝胶电泳对片段尺寸分析将克隆鉴定为CetuxCD28mZ(CoOp)/pSBSO阳性的(图33A)。将阳性克隆1:1000接种到具有卡那霉素抗生素选择的TB培养基中的大型培养中并且在37℃下在振荡器上培养16小时直到实现对数期生长。使用EndoFree Maxi Prep试剂盒(Qiagen)将DNA从细菌中分离。DNA的分光光度分析证实通过OD260/280读数的纯度为1.8至2.0。
尼妥珠单抗来源的CAR转座子。尼妥珠单抗来源的CAR是由以下物质组成：来自人GMCSFR2信号肽的信号肽(氨基酸1-19，NP_001155003.1)、尼妥珠单抗的可变轻链(PDB:3GKW_L)、甲沟炎接头(GenBank：AAE37780.1)、尼妥珠单抗的可变重链(PDB:3GKW_H)、人IgG4(氨基酸161-389，AAG00912.1)、人CD28跨膜和信号传导结构域(氨基酸153-220，NP_006130)以及人CD3-ζ细胞内结构域(氨基酸52至164，NP_932170.1)。GMCSFR2序列、可变轻链、甲沟炎接头、可变重链以及部分IgG4是人密码子优化的并且通过GeneART生成为0841503/pMK。08541503/pMK和先前所述的CD19CD28mZ/pSBSO(Singh等人,2013；Singh等人,2008)经历用NheI和XmnI限制酶的双消化，连接，转化，大规模扩增及质粒NimoCD28mZ(CoOp)/pSBSO的纯化如上所述进行(图33B)。
SB11转座酶。在CMV启动子(Kan-CMV-SB11)控制下的高活性SB11转座酶如先前所述使用(Singh等人,2008；Davies等人,2010)。
pGEM/GFP/A64。在T7启动子控制下的GFP，然后是64个A-T碱基对和SpeI位点被用于体外转录GFP RNA。先前已经描述了pGEM/GFP/A64的克隆(Boczkowski等人,2000)。
西妥昔单抗来源的CAR/pGEM-A64。将西妥昔单抗来源的CAR通过CetuxCD28mZ(CoOp)/pSBSO和CD19CD28mZ(CoOp)/pSBSO-MCS的NheI和XmnI双消化克隆到中间载体pSBSO-MCS中。在电泳之后通过从琼脂糖凝胶中的提取来分离Cetux-CAR插入物和pSBS O-MCS主链并且连接，转化和如CetuxCD28mZ(CoOp)/pSBSO的生成中所述大规模扩增。将CetuxCD28mZ(CoOp)克隆到pGEM/GFP/A 64质粒中以便将Cetux-CAR置于T7启动子的控制下以用于体外转录。具有64个核苷酸长度的人工聚A尾的RNA在37℃下用NheI和EcoRV消化CetuxCD28mZ(CoOp)/pSBSO-MCS，而在37℃下用X baI然后在25℃下用SmaI依序消化pGEM/GFP/A64。将消化的Cetu x-CAR插入物与pGEM/A64主链通过在0.8％琼脂糖凝胶中在150伏下运行45分钟的电泳分离，并且通过溴化乙锭染色和UV曝光来目测。将片段从凝胶上切除并通过Qiaquick凝胶提取(Qiagen)进行纯化并且在3:1插入物与载体摩尔比下使用T4DNA连接酶(Promega)来连接并在16℃下孵育过夜。Dam-/-C2925化学感受态细菌(Invitrogen)通过热激进行转化并且在37℃下在含氨苄青霉素的琼脂上培养过夜以用于含pGEM/A64主链的克隆的选择。将八个克隆通过在氨苄青霉素抗生素选择下在TB培养基中接种选出进行小规模的DNA扩增并且在37℃下在振荡器上培养8小时。使用MiniPrep试剂盒(Qiag en)和分析型限制酶消化进行DNA的纯化，且随后的电泳确定哪些克隆表达正确的连接产物CetuxCD28mZ/pGEM-A64(图33C)。选出阳性克隆1:1000接种在含氨苄青霉素的TB中。在37℃下培养18小时之后，使用EndoFree质粒纯化试剂盒(Qiagen)纯化DNA。分光光度分析通过OD260/280比率在1.8与2.0之间证实高质量DNA。
尼妥珠单抗来源的CAR/pGEM-A64。
在37℃下用NheI且在50℃下用SfiI依序消化NimoCD28mZ(CoOp)/pSBSO，而在37℃下用XbaI且在50℃下用SfiI依序消化pGEM/GFP/A64。将NimoCD28mZ(CoOp)克隆到pGEM/GFP/A64质粒中以便将Nimo-CAR置于T7启动子的控制下用于体外转录具有64个核苷酸长度的人工聚A尾的RNA。将消化的Nimo-CAR插入物和pGEM/A64主链通过在0.8％琼脂糖凝胶中在150伏下运行45分钟的电泳分离，并且通过溴化乙锭染色和UV曝光来目测。将片段从凝胶上切除并通过Qiaquick凝胶提取(Qiagen)进行纯化并且在3:1插入物与载体摩尔比下使用T4DNA连接酶(Promega)来连接并在16℃下孵育过夜。Dam-/-C2925化学感受态细菌(Invitrogen)通过热激进行转化并且在37℃下在含氨苄青霉素的琼脂上培养过夜用于含pGEM/A64主链的克隆的选择。将八个克隆通过在氨苄青霉素抗生素选择下在TB培养基中接种选出进行小规模的DNA扩增并且在37℃下在振荡器上培养8小时。使用MiniPrep试剂盒(Qiagen)和分析型限制酶消化进行DNA的纯化且随后的电泳确定哪些克隆表达正确的连接产物NimoCD28mZ/pGEM-A64(图33D)。选出阳性克隆1:1000接种在含氨苄青霉素的TB中。在37℃下培养18小时之后，使用EndoFree质粒纯化试剂盒(Qiagen)纯化DNA。分光光度分析通过OD260/280比率在1.8与2.0之间证实高质量DNA。
截短的EGFR转座子。将截短的EGFR克隆到经由自剪切肽序列F2A连接到新霉素抗性基因上的SB转座子中。仅含细胞外和跨膜结构域的人EGFR(登录NP_005219.2)的密码子优化的截短形式0909312ErbB1/pMK-RQ通过GeneArt(Regensburg,Germany)来合成。在37℃下用NheI和SmaI消化ErbB1/pMK-RQ，而在37℃下用NheI、然后在37℃下用NruI依序消化tCD19-F2A-Neo/pSBSO，两次消化之间有纯化步骤(Qiaquick凝胶提取试剂盒，Qiagen)。通过在0.8％琼脂糖凝胶上在150伏下运行45分钟的凝胶电泳分离tEGFR插入物与F2A-Neo/pSBSO主链。分离具有预测尺寸的条带(Qiaquick凝胶提取试剂盒，Qiagen)并在16℃下用T4DNA连接酶(Promega)连接。TOP10化学感受态细胞(Invitrogen)被热激转化伴随连接产生并且在含卡那霉素的琼脂上培养过夜。接种五个克隆以通过在含卡那霉素的TB中培养8小时进行小规模DNA扩增。通过Mini Prep试剂盒(Qiagen)的DNA纯化及随后的分析型限制酶消化鉴定克隆为tErbB1-F2A-Neo/pSBSO阳性的(图33E)。将阳性克隆以1:1000接种到培养物中用于在37℃下在振荡器上培养16小时的大规模DNA扩增。使用EndoFree质粒纯化试剂盒(Qiagen)进行来自对数期生长的细菌的DNA的纯化并且分光光度法通过OD 260/280读数在1.8与2.0之间证实DNA纯度。
CAR-L转座子。将先前所述的2D3杂交瘤(94)用于获得CAR-L的scFv序列。简单说来，根据制造商说明书，通过RNeasy微型试剂盒(Qiagen)从杂交瘤中提取RNA。经由Superscript III First Strand试剂盒(Invitrogen)的逆转录生成cDNA文库。使用FR1区的简并引物的PCR扩增小鼠可变重链和轻链，它们随后被连接到TOPO TA载体中。CAR-L被如下构建成为密码子优化序列：在人GMCSFR信号肽(氨基酸1-22；NP_758452.1)之后，2D3-来源的scFv融合至人CD8α细胞外结构域(氨基酸136-182；NP_001759.3)及人CD28的跨膜和细胞内结构域(氨基酸56-123；NP_001230006.1)并且以CD3ζ的人细胞内结构域(氨基酸48-163；NP_000725.1)终止。CAR-L蛋白在GeneArt合成，然后切除并且用融合至博莱霉素抗性基因的可自剪切的2A肽连接到SB转座子中，表示为CAR-L-2A-Zeo(图33F)(Rushworth等人,2014)。
细胞系：增殖和修饰
除非另作说明，否则将所有细胞系都保持在5％CO2、95％湿度及37℃下的完全培养基杜尔贝科改良伊格尔培养基(Dulbecco’s modified eagle medium,DMEM)(LifeTechnologies,Grand Island,NY)中，该培养基中补充有10％热灭活胎牛血清(FBS)(HyClone,ThermoScientific)和2mM Glutamax-100(Gibco,Life Technologies)。将粘附细胞系常规地培养至70-80％汇合，然后1:10传代，之后用0.05％胰蛋白酶-EDTA(Gibco)解离。根据制造商说明书，使用AmpF_STR标识试剂盒(Applied Biosystems，目录号4322288)通过STR DNA指纹图谱验证细胞系的身份。将STR曲线与已知的ATCC指纹图谱(ATCC.org)并且与细胞系集成分子认证数据库(Cell Line Integrated Molecular Authenticationdatabase,CLIMA)0.1.200808版(在万维网上的bioinformatics.istge.it/clima/网址处)(Nucleic Acids Research 37:D925-D932PMCID:PMC2686526)相比。STR曲线匹配已知的DNA指纹图谱。
OKT3装载的K562克隆4。K562克隆4作为礼物获赠于宾夕法尼亚大学(Universityof Pennsylvania)的Carl June,M.D.并且先前已有描述(Suhoski等人,2007；Paulos等人,2008)。克隆4被修饰以表达tCD19、CD86、CD137L、CD64及膜IL15-GFP融合蛋白并且已被制造作为工作细胞库用于在PACT下的临床前和临床研究。可使K562克隆4通过结合至CD64高亲和力Fc受体而表达抗CD3抗体OKT3。为了将OKT3装载到K562克隆4上，将细胞在含有1x 20％N-乙酰半胱氨酸的X-VIVO无血清培养基(Lonza,Cologne,Germany)中以1x106个细胞/mL的密度培养过夜。此步骤为OKT3的最佳结合清除Fc受体。次日，将细胞洗涤并且以1x106个细胞/mL再悬浮于含有1x 20％N-乙酰半胱氨酸的X-VIVO培养基中并且在达到100Gy下辐照。将细胞洗涤并以1x106个细胞/mL再悬浮于PBS中并且以1mg/mL的浓度添加OKT3(eBioscience,San Diego,CA)并在4℃下在滚筒上孵育30分钟。再次洗涤细胞，染色以通过流式细胞术证实共刺激分子和OKT3的表达，并且冷冻保存。
tEGFR+K562克隆27。K562克隆27来源于K562克隆9，后者作为礼物获赠于宾夕法尼亚大学的Carl June,M.D.。如先前所述(Suhoski等人,2007；Paulos等人,2008)，将K562克隆9慢病毒转导以表达tCD19、CD86、CD137L及CD64。克隆27经由SB转染由克隆9修饰以稳定地表达膜栓系的IL15-IL15Rα融合蛋白(Hurton,L.V.,2014)，通过有限稀释进行克隆，并且通过流式细胞术证实具有所有转基因的高表达。K562克隆27通过tErbB1-F2A-Neo/pSBSO的SB转染修饰以表达截短的EGFR。用PE标记的EGFR特异性抗体(BD Biosciences,Carlsbad,CA，目录号555997)和抗PE珠(Miltenyi Biotec,Auburn,CA)孵育表达EGFR的K562克隆27，然后通过流过磁性柱(Miltenyi Biotec)与非标记的细胞分离。磁选择之后，在1mg/mLG418(Invivogen,San Diego,CA)存在下培养tEGFR+K562克隆27以维持高EGFR表达。
EL4、CD19+EL4、tEGFR+EL4及CAR-L+EL4。EL4是从ATCC获得的并且通过SB非病毒基因修饰而修饰以表达tCD19-F2A-Neo、tEGFR-F2A-Neo或CAR-L-F2A-Neo。根据制造商说明书，使用Amaxa Nucelofector(Lonza)和原代小鼠T细胞试剂盒(Lonza)对EL4进行电穿孔。简单说来，在90xg下旋转2x106个EL4细胞10分钟并且再悬浮于100uL含有3μg转座子(tCD19-F2A-Neo、tEGFR-F2A-Neo或CAR-L-2A-Zeo)和2ug SB11转座酶的原代小鼠T细胞缓冲液中，并使用Amaxa程序X-001进行电穿孔。电穿孔之后，将细胞立即转移到以试剂盒(Lonza)供应的预热的和补充的原代小鼠T细胞培养基中。次日，添加1mg/mL G418以选出经修饰以表达转基因的EL4细胞。修饰后7天通过流式细胞术证实表达。
U87、U87low、U87med及U87high。U87(正式表示为U87MG)是从ATCC(Manassas,VA)获得的。根据制造商说明书，使用Amaxa Nucleofector和细胞系Nucleofector试剂盒T(Lonza，目录号VACA-1002)，通过用tErbB1-F2A-Neo/pSBSO和SB11电穿孔生成U87low和U87med以过度表达EGFR。简单说来，U87细胞被培养至80％汇合，然后通过在0.05％胰蛋白酶-EDTA(Gibco)中解离来收获并使用自动细胞计数器(Cellometer，自动T4细胞计数器，Nexcelcom,Lawrence,MA)经由台盼蓝排除来计数。将1x106个U87细胞在3μg tErbB1-F2A-Neo/pSBSO转座子和2μg SB11转座酶存在下悬浮于100μL细胞系试剂盒T电穿孔缓冲液中，转移到槽中并且经由程序U-029电穿孔。电穿孔之后立即将细胞转移到6孔板中并使其回收于完全DMEM培养基中。次日，添加0.35mg/mL G418(Invivogen)以针对转基因表达来选择。在增殖至至少1x106个细胞之后，进行流式细胞术来评价EGFR表达。电穿孔的U87细胞证实EGFR表达相对于未修饰的U87的适度增加并且被表示为U87low。为了生成U87med细胞，根据制造商说明书，使用Lipofectamine 2000(Invitrogen)用tErbB1-F2A-Neo和SB11对U87细胞进行阳离子脂质体-转移。次日，添加0.35mg/mL G418到培养物中以针对新霉素抗性来选择。在细胞增殖至显著数目之后，流式细胞术展现两个峰值群，相对于U87细胞有互相排斥的中等或高等EGFR过度表达。用抗EGFR-PE染色细胞并且针对前50％最高峰进行FACS分选。当细胞达到不大于70％汇合时进行小心的亚克隆并且常规地进行流式细胞术分析以确保细胞维持EGFR表达。U87high是过度表达wtEGFR的U87-172b细胞，并且是Oliver博士的馈赠。
U87-ffLuc-mKate和U87med-ffLuc-mKate。将U87和U87med细胞慢病毒转导以表达ffLuc-mKate转基因(图34)，类似于先前所述的方案(Turkman等人,2011)。简单说来，根据制造商说明书，在Lipofectamine 2000(Invitrogen)存在下用pcMVR8.2、VSV-G及pLVU3GeffLuc-T2AmKates158A转染293-METR包装细胞。48小时之后，收获病毒样颗粒(VLP)并在100kDa NMWL过滤器(Millipore,Billerica,MA)上浓缩。为了转导U87和U87med，将细胞铺于6孔板中直到70-80％汇合，然后将ffLucmKate VLP连同8μg/mL聚凝胺一起添加。将该板在1800rpm下离心1.5小时，然后孵育6小时。孵育之后，去除上清液。转导之后二十四小时，细胞达到汇合并继代培养并且针对表达中等水平ffLuc-mKate的细胞进行FACS分选。
人肾皮层上皮细胞(HRCE)。HRCE是从Lonza获得的，经描述是从健康个体的近端和远端肾小管中采集的，并培养于完全肾生长培养基(Lonza，目录号CC-3190)中，该培养基中补充有重组人表皮生长因子(rhEGFR)、肾上腺素、胰岛素、三碘甲腺原氨酸、氢化可的松、转铁蛋白、10％热灭活的FBS(HyClone)以及2mM Glutamax-100(Gibco)。HRCE具有有限的体外寿命，因此，所有测定都用经历小于10个群体倍增的细胞进行。培养细胞至70-80％汇合，然后通过0.05％胰蛋白酶-EDTA(Gibco)分离并于新鲜的完全肾生长培养基中1:5传代。
NALM-6、T98G、LN18及A431。NALM-6、T98G、LN18及A431全部都从ATCC中获得的并且如针对细胞系所述来培养。
T细胞修饰和培养。外周血单核细胞是从来自墨西哥湾沿岸地区血库(Gulf CoastRegional Blood Bank)的健康供体中获得的并且通过Ficoll-Paque(GE Healthcare,Milwaukee,WI)分离并冷冻保存。所有T细胞培养物都保持在补充有10％FBS(HyClone)和2mM Glutamax(Gibco)的完全RPMI-1640(HyClone)中。
用SB转座子/转座酶的电穿孔。如先前所述进行SB电穿孔(Singh等人,2008)。在电穿孔当天解冻PBMC并且以1x106个细胞/mL的密度静置于无细胞因子的培养基完全RPMI-1640中2小时。静置期之后，在200xg下离心细胞8分钟，然后再悬浮于培养基中并且使用自动细胞计数器(Cellometer，自动T4细胞计数器，Nexcelcom)通过台盼蓝排除来计数。再次离心PBMC并且以2x108/mL再悬浮于人T细胞电穿孔缓冲液(Lonza，目录号VPA-1002)中，然后将100μL细胞悬液与15μg转座子(Cetux-或Nimo-CAR)和5μg SB11转座酶混合，转移到电穿孔槽中并且使用用于未刺激的人T细胞的程序U-014，经由Amaxa Nucleofector(Lonza)进行电穿孔。电穿孔之后，将细胞立即转移到补充有20％热灭活的FBS(HyClone)和2mMGlutamax-100(Gibco)的无苯酚的RPMI中以便回收过夜。次日，通过流式细胞术就CD3和Fc(以测定CAR表达)对细胞进行分析以便测定转座子的瞬时表达。
CAR+T细胞的刺激和培养。在电穿孔之后二十四小时，用100Gy辐照的EGFR+K562克隆27人工抗原呈递细胞(aAPC)在2个CAR+T细胞:1个aAPC的比率下刺激细胞。在通过流式细胞术评价CAR表达之后每7-9天再刺激T细胞。整个培养期间，T细胞每2-3天接受添加到培养物中的30ng/mL IL-21(Peprotech,Rocky Hill,NJ)。每2-3天，IL-2(Aldeleukin,Novartis,Switzerland)以50U/mL在第二刺激周期之后添加到培养物中。在第14天，就NK细胞的存在对培养物进行评估，其被指定为存在于培养物中的CD3negCD56+细胞。如果NK细胞代表>10％的细胞群体，那么通过用CD56特异性磁珠(Miltenyi Biotec)标记NK细胞并在LS柱(Miltenyi Biotec)上分选来进行NK细胞耗竭。通过含有CAR+T细胞的阴性流的流式细胞术证实来自培养物的NK细胞亚群的成功耗竭。当CAR在>85％的CD3+T细胞上表达时，通常在5个刺激周期之后，评估培养物的功能。
RNA的体外转录。将CetuxCD28mZ/pGEM-A64、NimoCD28mZ/pGEM-A64或GFP/pGEM-A64在37℃下用SpeI消化4小时以提供用于体外RNA转录的线性模板。通过在0.8％琼脂糖凝胶中的琼脂糖凝胶电泳和单条带的存在证实模板的完全线性化，并通过QiaQuick PCR纯化(Qiagen)纯化剩余的消化物并且以小体积洗脱以获得0.5μg/μL的浓度。根据制造商方案，使用T7mMACHINE mMESSAGE Ultra(Ambion,Life Technologies，目录号AM1345)进行体外转录反应并且在37℃下孵育2小时。在mRNA转录之后，通过添加以1单位/μg DNA模板的供应的Turbo DNA酶降解DNA模板并在37℃下再孵育30分钟。使用RNeasy微型试剂盒(Qiagen)纯化转录的RNA。通过分光光度法测定浓度和纯度(OD 260/280值＝2.0-2.2)并且在-80℃下在单解冻的等分试样中冷冻。通过以下操作评估RNA产物的质量：在含甲醛的琼脂糖凝胶(1％琼脂糖、10％10x MOPS运行缓冲液、6.7％甲醛)上在75伏下在1xMOPS运行缓冲液中凝胶电泳80分钟，并且目测单个划出的条带。
多克隆T细胞扩增。通过用100Gy辐照的K562克隆4的培养实现不依赖于抗原的T细胞的数值扩增，该克隆装载有通过交联CD3递送增殖性刺激的OKT3。每7-10天以10:1或1:2T细胞:aAPC的密度添加aAPC，每2-3天添加50U/mL IL-2。在整个培养期间进行培养基更换以将T细胞保持在0.5-2x106个细胞/mL之间的密度下。
RNA电转移到T细胞中。在RNA转移之前3-5天，通过如上所述与100Gy辐照的OKT3-装载的K562克隆4共培养使T细胞经历刺激。在电转移之前，收获T细胞并且使用自动细胞计数器(Cellometer，自动T4细胞计数器，Nexcelcom)通过台盼蓝排除来计数。在细胞制备期间，将RNA从-80℃冷冻器中移出并在冰上解冻。将T细胞在90xg下离心10分钟，并且小心地吸出上清液以确保完全去除而不会破坏细胞沉淀。将T细胞悬浮在P3原代细胞4D-Nucleofector缓冲液(Lonza，目录号V4XP-3032)中至1x108/mL的浓度并且将20μL每个T细胞悬液与3μg体外转录的RNA混合，然后转移到Nucleofector槽带(Lonza，目录号V4XP-3032)。使用程序DQ-115在Amaxa 4D Nucleofector(Lonza)中对细胞进行电穿孔，然后使其静置在槽中长达15分钟。静置期之后，将温恢复培养基，补充有2mM Glutamax-100(Gibco)和20％热灭活的FBS(HyClone)的无苯酚的RPMI 1640(HyClone)添加到槽中并将细胞轻轻地转移到含有恢复培养基的6孔板中并转移到组织培养孵育箱中。4小时之后，添加50U/mLIL-2和30ng/mL IL-21到T细胞中。RNA转移之后四至二十四小时，通过用于Fc的流式细胞术就CAR的表达对T细胞进行分析。在RNA转移后24小时时进行所有功能测定。
免疫染色和流式细胞术
获取和分析。在FACS Calibur(BD Biosciences,San Jose,CA)上收集流式细胞术数据并使用CellQuest软件(3.3版,BD Biosciences)获取。使用FlowJo软件(x.0.6版,TreeStar,Ashland,OR)进行流式细胞术数据的分析。
表面免疫染色和抗体。(除非另有说明)用在以下稀释度下缀合至以下染料的单克隆抗体进行高达1x106个细胞的免疫染色：荧光素(FITC，1:25)、藻红蛋白(PE，1:40)、缀合至花青染料的多甲藻素叶绿素蛋白(PerCPCy5.5，1:25)、别藻蓝蛋白(APC，1:40)、AlexaFluor488(1:20)、AlexaFluor647(1:20)。除非另有说明，否则所有抗体都购自BDBiosciences。使用对以下各物有特异性的抗体：CD3(克隆SK7)、CD4(克隆RPA-T4)、CD8(克隆SK1)、CD19(HIB19)、CD27(克隆L128)、CD28(克隆L293)、CD45RA(克隆HI100)、CD45RO(克隆HI100)、CD56(克隆B159)、CD62L(克隆DREG-56)、CCR7(克隆GD43H7，Biolegend,SanDiego，用CAR PerCPCy5.5以1:45稀释)、EGFR(克隆EGFR.1，用PE以1:13.3稀释)、Fc(以检测CAR，克隆HI10104，Invitrogen)、IL15(克隆34559，R&D Systems,Minneapolis,MN，用PE以1:20稀释)、鼠F(ab’)2(以检测装载在K562上的OKT3，Jackson Immunoresearch,WestGrove,PA，目录号115-116-072，用PE以1:100稀释)、TNF-α(克隆mAb11，1:40PE稀释)和IFN-γ(克隆27，1:66.7APC稀释)、pErk1/2(克隆20A，AlexaFluor 647)、pp38(克隆36/p38，PE)以及Ki-67(克隆B56，FITC，1:20，BD Biosciences)。在4℃下，在黑暗中将表面分子在FACS缓冲液(PBS、2％FBS、0.5％叠氮化钠)中染色30分钟。
定量流式细胞术。使用Quantum Simply Cellular聚苯乙烯珠(BangsLaboratories,Fishers,IN)进行定量流式细胞术。提供五个珠群，四个群具有增加量的抗鼠IgG及由此已知的抗体结合能力(ABC)和一个空白群。用饱和浓度(1:3稀释，按照制造商建议)的珠孵育EGFR-PE(BD Biosciences，目录号555997)，同时对靶细胞进行免疫染色。结合至微球的EGFR-PE的MFI被用于生成标准曲线，使用QuickCal数据分析程序(2.3版，BangsLaboratories)将线性回归拟合至该标准曲线(图35)。将结合至靶细胞的EGFR-PE的所测量的MFI减去本底自体荧光量施加于线性回归产生每细胞表达的EGFR分子的平均数量。
细胞内细胞因子染色和流式细胞术。在4000x稀释的GolgiStop(BD Biosciences)存在下将T细胞与靶细胞以1:1的比率共培养4-6小时。非刺激的T细胞充当阴性对照，而用含有1000x稀释的PMA/离子霉素和布雷菲德菌素A(BD Biosciences)的用白细胞活化混合物处理的T细胞充当阳性对照。EGFR特异性单克隆抗体(克隆LA1，Millipore)用于阻断CAR与EGFR的相互作用。细胞内细胞因子染色如下进行：在4℃下在黑暗中通过在Cytofix/Cytoperm缓冲液(BD Biosciences)中固定/透化20分钟进行表面免疫染色，继之以在4℃下、在黑暗中在1x Perm/洗涤缓冲液(BD Biosciences)中进行细胞内细胞因子染色30分钟。所用抗体是TNF-α(BD Biosciences，克隆mAb11，用PE以1:40稀释)和IFN-γ(BDBiosciences，克隆27，用APC以1:66.7稀释)。细胞内细胞因子染色之后，将细胞用0.5％多聚甲醛(CytoFix,BD Biosciences)固定直到在FACS Calibur上获取样品。
通过流式细胞术测量磷酸化。除非另有说明，否则将T细胞与靶细胞在1:1的比率下共培养45分钟。活化之后，在300xg下离心T细胞5min并且倾析上清液。通过添加20体积的1x PhosFlow裂解/固定缓冲液(BD Biosciences)裂解并固定T细胞，预温至37℃并且在37℃下孵育10分钟。离心之后，通过添加冰冷的PhosFlow Perm III缓冲液(BD Biosciences)对细胞进行透化，同时在黑暗中在冰上涡流并孵育20分钟。孵育之后，用FACS缓冲液洗涤细胞并且再悬浮于100μL染色溶液中。染色溶液由针对CD4(克隆SK3，FITC)、CD8(克隆SK1，PerCPCy5.5)、pErk1/2(克隆20A，AlexaFluor 647)、pp38(克隆36/p38，PE)的抗体和FACS缓冲液组成，所有都以相同比率存在并且在室温下在黑暗中孵育20分钟。用0.5％多聚甲醛固定细胞并且在24小时之内通过流式细胞术分析。
存活力染色。膜联蛋白V(BD Biosciences)和7-AAD(BD Biosciences)的染色用于测定细胞存活力并且在1x膜联蛋白结合缓冲液中进行，在室温下在黑暗中针对CD4或CD8染色20分钟。活细胞的百分比被测定为在CD4或CD8门控T细胞群中的AnnexinVneg7-AADneg％。
对于细胞增殖标记物Ki-67的染色。通过细胞内流式细胞术测量增殖标记物Ki-67。将T细胞与粘附靶细胞以1:5的比率共培养36小时，然后通过去除上清液并在300xg下离心从培养物中收获T细胞。然后通过逐滴添加冰冷的70％乙醇同时在高速下涡流来固定并透化T细胞。然后在染色之前将T细胞贮藏在-20℃下持续2-24小时。将细胞在室温下在黑暗中在100μL FAC缓冲液中用Ki-67(克隆B56，FITC，1:20，BD Biosciences)、CD4(克隆RPA-T4)及CD8(克隆SK1)染色30min，然后立即通过流式细胞术来分析。
T细胞功能测定
CAR下调。收获CAR+T细胞和靶标并且使用自动细胞计数器(Cellometer，自动T4细胞计数器，Nexcelcom)通过台盼蓝排除来计数，然后以1:1比率在12孔板中混合，并且在每个时间点收获单个孔以测量T细胞上的CAR表面表达。用于下调的阴性对照是无刺激涂铺的T细胞。通过CD3、CD4和CD8表达对T细胞染色以及通过Fc对CAR共染色是在流式细胞仪上分析的。CAR的下调百分比被计算为[刺激之后的CAR表达]/[无刺激的CAR表达]x 100。
二次活化和细胞因子产生。收获CAR+T细胞和粘附靶标并且使用自动细胞计数器(Cellometer，自动T4细胞计数器，Nexcelcom)通过台盼蓝排除来计数，然后以1:1的比率在12孔板中混合。共培养24小时之后，通过去除上清液并用PBS洗涤粘附细胞从培养中收获T细胞。在300xg下旋转T细胞5分钟，然后再悬浮于培养基中并且使用自动细胞计数器(Cellometer，自动T4细胞计数器，Nexcelcom)通过台盼蓝排除来计数。用靶标以1:1比率刺激T细胞并且如上所述分析细胞内细胞因子产生。
长期细胞毒性测定。在开始测定的前一天，收获粘附的U87和U87high细胞，计数，并且将40,000个靶细胞涂铺在6孔板的每个孔中的完全DMEM内并在组织培养孵育箱中孵育过夜。在测定当天，收获CAR+T细胞，通过台盼蓝排除计数，并且以1:5E:T比率添加到涂铺的靶细胞中。阴性对照孔中没有添加T细胞。在每个测定时间点，通过丢弃上清液并用PBS洗涤孔来去除T细胞。通过0.05％胰蛋白酶-EDTA(Gibco)从孔中分离粘附细胞。进行显微镜检查以目测确保细胞从孔中完全分离。将收获的细胞旋转沉降并且再悬浮于100μL培养基中，然后使用血球计通过台盼蓝排除来计数。存活细胞百分比被计算为[T细胞共培养之后的细胞数目]/[没有T细胞共培养的细胞数目]x 100。
铬释放测定。特异性细胞毒性经由标准4小时铬释放测定来评价，如先前所述(Singh等人,2008)。收获靶细胞并且使用自动细胞计数器(Cellometer，自动T4细胞计数器)通过台盼蓝排除来计数。将不少于250,000个细胞等分，然后在300xg下离心5分钟并丢弃上清液。随后，将0.1μCi的51Cr添加到每个靶标中并且在37℃下在组织培养孵育箱中孵育1-1.5小时。将每孔100,000个T细胞一式三份涂铺并且以1:2比率连续稀释以在96孔V形底板(Corning,Corning,NY)中得到20:1、10:1、5:1、2.5:1及1.25:1的最终效应物与靶标(E:T)比率，并置于组织培养孵育箱中。仅将培养基置于孔中用于最小铬释放对照。用铬标记之后，将靶标用10mL PBS洗涤三次，然后以125,000个细胞/mL的最终浓度再悬浮，充分混合，并将100μL添加到每排中，包括所有含T细胞的排、最小释放排及最大释放排。在300xg下离心板3分钟。离心之后，将100μL的0.1％Triton X-100(Sigma-Aldrich,St.Louis,MO)添加到最大释放排中，并且将板置于组织培养孵育箱中4小时。孵育之后，然后通过小心地去除50μL上清液而没有破坏细胞沉淀来收获板，并且将板转移到LumaPlate-96(Perkin-Elmer,Waltham,MA)中并使其干燥过夜。次日，用顶部密封件(Perkin-Elmer)密封板并且在TopCount NXT(Perkin-Elmer)上测量闪烁。特异性裂解百分比被计算为[(所释放的51Cr-最小值)/(最大值-最小值)]x 100，其中最大值和最小值是每一式三份的平均值。
高通量基因表达和CDR3测序
通过mRNA转录物的直接成像对基因表达分析。如先前所述(319-322)进行mRNA分子的直接成像和量化。通过分别用CD4和CD8磁珠(Miltenyi Biotec)孵育并在LS柱上分选就CD4和CD8表达在扩增之前或之后对细胞进行阳性分选。流式细胞术用于证实CD4和CD8分离的群体的纯度。将1x106个T细胞在165μL的RLT缓冲液(Qiagen)中裂解并且在-80℃下以单次解冻的等分试样冷冻。将RNA裂解物解冻并在65℃下与多重靶标特异性、颜色编码的报道基因和生物素化的捕获探针杂交12小时。鉴定目标淋巴细胞特异性mRNA转录物并且将由RefSeq登录物生成的两个编码集用于生成报道基因和捕获探针对、淋巴细胞编码集以及TCR Vα和Vβ编码集。淋巴细胞编码集含有用于以下基因的探针：ABCB1；ABCG2；ACTB；ADAM19；AGER；AHNAK；AIF1；AIM2；AIMP2；AKIP1；AKT1；ALDH1A1；ANXA1；ANXA2P2；APAF1；ARG1；ARRB2；ATF3；ATM；ATP2B4；AXIN2；B2M；B3GAT1；BACH2；BAD；BAG1；BATF；BAX；BCL10；BCL11B；BCL2；BCL2L1；BCL2L1；BCL2L11；BCL2L11；BCL6；BCL6B；BHLHE41；BID；BIRC2；BLK；BMI1；BNIP3；BTLA；C21orf33；CA2；CA9；CARD9；CASP1；CAT；CBLB；CCBP2；CCL3；CCL4；CCL5；CCNB1；CCND1；CCR1；CCR2；CCR4；CCR5；CCR6；CCR7；CD160；CD19；CD19R-scfv；CD19RCD28；CD2；CD20-scfv利妥昔单抗)；CD226；CD244；CD247；CD27；CD274；CD276；CD28；CD300A；CD38；CD3D；CD3E；CD4；CD40LG；CD44；CD45R-scfv；CD47；CD56R-scfv；CD58；CD63；CD69；CD7；CD80；CD86；CD8A；CDH1；CDK2；CDK4；CDKN1A；CDKN1B；CDKN2A；CDKN2C；CEBPA；CFLAR；CFLAR；CHPT1；CIITA；CITED2；CLIC1；CLNK；c-MET-scfv；CREB1；CREM；CRIP1；CRLF2；CSAD；CSF2；CSNK2A1；CTGF；CTLA4；CTNNA1；CTNNB1；CTNNBL1；CTSC；CTSD；CX3CL1；CX3CR1；CXCL10；CXCL12；CXCL9；CXCR1；CXCR3；CXCR4；DAPL1；DEC1；DECTIN-1R；DGKA；DOCK5；DOK2；DPP4；DUSP16；EGFR-scfv(NIMO CAR)；EGLN1；EGLN3；EIF1；ELF4；ELOF1；ENTPD1；EOMES；EPHA2；EPHA4；EPHB2；ETV6；FADD；FAM129A；FANCC；FAS；FASLG；FCGR3B；FGL2；FLT1；FLT3LG；FOS；FOXO1；FOXO3；FOXP1；FOXP3；FYN；FZD1；G6PD；GABPA；GADD45A；GADD45B；GAL3ST4；GAS2；GATA2；GATA3；gBAD-1R-scfv；GEMIN2；GFI1；GLIPR1；GLO1；GNLY；GSK3B；GZMA；GZMB；GZMH；HCST；HDAC1；HDAC2；HER2-scfv；HERV-K 6H5-scfv；HLA-A；HMGB2；HOPX；HOXA10；HOXA9；HOXB3；HOXB4；HPRT1；HRH1；HRH2；人CD19R-scfv；ICOS；ICOSLG；ID2；ID3；IDO1；IFNA1；IFNG；IFNGR1；IGF1R；IKZF1；IKZF2；IL10；IL10RA；IL12A；IL12B；IL12RB1；IL12RB2；IL13；IL15；IL15RA；IL17A；IL17F；IL17RA；IL18；IL18R1；IL18RAP；IL1A；IL1B；IL2；IL21R；IL22；IL23A；IL23R；IL27；IL2RA；IL2RB；IL2RG；IL4；IL4R；IL5；IL6；IL6R；IL7R；IL9；IRF1；IRF2；IRF4；ITCH；ITGA1；ITGA4；ITGA5；ITGAL；ITGAM；ITGAX；ITGB1；ITGB7；ITK；JAK1；JAK2；JAK3；JUN；JUNB；KIR2DL1；KIR2DL2；KIR2DL3；KIR2DL4；KIR2DL5A；KIR2DS1；KIR2DS2；KIR2DS3；KIR2DS4；KIR2DS5；KIR3DL1；KIR3DL2；KIR3DL3；KIR3DS1；KIT；KLF10；KLF2；KLF4；KLF6；KLF7；KLRAP1；KLRB1；KLRC1；KLRC2；KLRC3；KLRC4；KLRD1；KLRF1；KLRG1；KLRK1；LAG3；LAIR1；LAT；LAT2；LCK；LDHA；LEF1；LGALS1；LGALS3；LIFR；LILRB1；LOC282997；LRP5；LRP6；LRRC32；LTA；LTBR；LYN；MAD1L1；MAP2K1；MAPK14；MAPK3；MAPK8；MBD2；MCL1；MIF；MMP14；MPL；MTOR；MXD1；MYB；MYC；MYO6；NANOG；NBEA；NCAM1；NCL；NCR1；NCR2；NCR3；NCRNA00185；NEIL1；NEIL2；NFAT5；NFATC1；NFATC2；NFATC3；NFKB1；NOS2；NOTCH1；NR3C1；NR4A1；NREP；NRIP1；NRP1；NT5E；OAZ1；OPTN；P2RX7；PAX5；PDCD1；PDCD1LG2；PDE3A；PDE4A；PDE7A；PDK1；PDXK；PECAM1；PHACTR2；PHC1；POLR1B；POLR2A；POP5；POU5F1；PPARA；PPP2R1A；PRDM1；PRF1；PRKAA2；PRKCQ；PROM1；PTGER2；PTK2；PTPN11；PTPN4；PTPN6；PTPRK；RAB31；RAC1；RAC2；RAF1；RAP1GAP2；RARA；RBPMS；RHOA；RNF125；RORA；RORC；RPL27；RPS13；RUNX1；RUNX2；RUNX3；S100A4；S100A6；SATB1；SCML1；SCML2；SEL1L；SELL；SELPLG；SERPINE2；SH2B3；SH2D2A；SIT1；SKAP1；SKAP2；SLA2；SLAMF1；SLAMF7；SLC2A1；SMAD3；SMAD4；SNAI1；SOCS1；SOCS3；SOD1；SOX13；SOX2；SOX4；SOX5；SPI1；SPN；SPRY2；STAT1；STAT3；STAT4；STAT5A；STAT5B；STAT6；STMN1；SYK；TAL1；TBP；TBX21；TBXA2R；TCF12；TCF3；TCF7；TDGF1；TDO2；TEK；TERF1；TERT；TF；TFRC；TGFA；TGFB1；TGFB2；TGFBR1；胸苷激酶；TIE1；TLR2；TLR8；TNF；TNFRSF14；TNFRSF18；TNFRSF1B；TNFRSF4；TNFRSF9；TNFSF10；TNFSF11；TNFSF14；TOX；TP53；TRAF1；TRAF2；TRAF3；TSC22D3；TSLP；TXK；TYK2；TYROBP；UBASH3A；VAX2；VEGFA；WEE1；XBP1；XBP1；YY1AP1；ZAP70；ZBTB16；ZC2HC1A；ZEB2；ZNF516。TCR Vα和Vβ编码集含有用于以下基因的探针：TRAV1-1；TRAV1-2；TRAV2；TRAV3；TRAV4；TRAV5；TRAV6；TRAV7；TRAV8-1；TRAV8-2；TRAV8-3；TRAV8-6；TRAV9-1；TRAV9-2；TRAV10；TRAV11；TRAV12-1；TRAV12-2；TRAV12-3；TRAV13-1；TRAV13-2；TRAV14；TRAV16；TRAV17；TRAV18；TRAV19；TRAV20；TRAV21；TRAV22；TRAV23；TRAV24；TRAV25；TRAV26-1；TRAV26-2；TRAV27；TRAV29；TRAV30；TRAV34；TRAV35；TRAV36；TRAV38-1；TRAV38-2；TRAV39；TRAV40；TRAV41；TRBV2；TRBV3-1；TRBV4-1；TRBV4-2；TRBV4-3；TRBV5-1；TRBV5-4；TRBV5-5；TRBV5-6；TRBV5-8；TRBV6-1；TRBV6-2；TRBV6-4；TRBV6-5；TRBV6-6；TRBV6-8；TRBV6-9；TRBV7-2；TRBV7-3；TRBV7-4；TRBV7-6；TRBV7-7；TRBV7-8；TRBV7-9；TRBV9；TRBV10-1；TRBV10-2；TRBV10-3；TRBV11-1；TRBV11-2；TRBV11-3；TRBV12-3；TRBV12-5；TRBV13；TRBV14；TRBV15；TRBV16；TRBV18；TRBV19；TRBV20-1；TRBV24-1；TRBV25-1；TRBV27；TRBV28；TRBV29-1；TRBV30。杂交之后，将样品在nCounter Prep(NanoString Technologies,Seattle,WA)中处理，并在nCounter数字分析仪(nCounter Digital Analyzer)(NanoStringTechnologies)中分析。鉴定参照基因，其跨越以下大范围的RNA表达水平：ACTB、G6PD、OA21、POLR1B、RPL27、RPS13及TBP，并且用于归一化数据。使用nCounter RCC Collector(1.6.0版,NanoString Technologies)针对阳性基因、阴性基因及管家基因进行归一化。针对数字基因表达图谱表征的统计检验用于确定样品对之间的基因差异表达(O’Connor等人,2012；Audic等人,1997)。归一化之后，通过p<0.01与在至少2/3对中大于1.5的倍数变化的组合鉴定淋巴细胞编码集中的显著的差异基因表达，如先前所述(O’Connor等人,2012)。通过分级聚类和TreeView软件1.1版进行差异性RNA转录物的归一化值的热作图(Eisen等人,1998)。归一化之后，TCR Vα和Vβ的百分比来源于计数数据，如先前所述(Zhang等人,2012)。
高通量CDR3深度测序。扩增TCRβCDR3区并从1x106个T细胞提取的DNA测序(QiagenDNeasy血液和组织试剂盒，Qiagen)并且在ImmunoSEQ平台(Adaptive Technologies,Seattle,WA)上进行，如先前所述(Robins等人,2009)。
在颅内神经胶质瘤异种移植物鼠模型中的T细胞的体内评估
在批准的动物方案ACUF下，在MD Anderson癌症中心的实验动物照管与使用委员会(Institutional Animal Care and Use Committee)(IACUC)的指导和规定下进行所有动物实验。所用的所有小鼠都是7-8周龄的雌性NOD.Cg-PrkdcscidIL2Rγtm1Wjl/Sz品系(NSG)(Jackson Laboratory,Bar Harbor,ME)。
导螺杆的植入。使用剂量为0.1mL/10g的氯胺酮/赛拉嗪混合物(10mg/mL氯胺酮，0.5mg/mL赛拉嗪)麻醉7-8周龄的小鼠。如先前所述进行导螺杆的植入(Lal等人,2000)。一旦对刺激无反应，便通过剃去毛发来制备头部的手术区域并用聚维酮-碘(聚乙烯吡咯烷酮与元素碘复合)抗菌溶液处理。使用手术无菌技术，在头盖骨的中间作出一个1cm的切口。使用1mm钻头(DH#60,Plastics One,Roanoke,VA)作出一个开口，使用稳固的环形压力从钻孔(DH-0,Plastics One)延伸1mm。使用螺丝刀(SD-80,Plastics One)将在中心有0.50mm开口和1.57mm轴径的导螺杆(Plastics One，目录号C212SG)插入钻头部位中。缝合切口部位并且给予小鼠剂量为0.1mL/10g的0.01mg/mL丁丙诺啡作为术后镇痛药。将小鼠在低功率热源上从手术中恢复直到恢复完全移动性。
U87-ffLucm-Kate或U87med-ffLuc-mKate肿瘤细胞的植入。确定在颅内肿瘤之前2-3周小鼠从导螺杆植入中恢复，如先前所述(Lal等人,2000)。在室温下用无酶的细胞解离缓冲液PBS(Gibco)孵育10分钟之后，将U87-ffLuc-mKate或U87med-ffLuc-mKate从组织培养容器中分离。使用血球计通过台盼蓝排除对细胞计数并在200xg下离心8分钟。离心之后，将细胞再悬浮于无菌PBS中至50,000个细胞/μL的最终浓度。用异氟烷(2-氯代-2-(二氟甲氧基)-1,1,1-三氟-乙烷)使小鼠麻醉，并且如上所述为切口做准备。在小鼠经历手术准备时，通过在距离注射器末端2.5mm处放置塑料防护器并且装载含有250,000个细胞的5μL细胞悬液来准备具有钝针的26号的10μL Hamilton注射器(Hamilton Company,Reno,NV目录号80300)。在打开切口部位后，将注射器插入导螺杆开口中并且以恒定缓慢的压力注射细胞。注射完成之后，将注射器就地额外30秒以使颅内压力消散，然后慢慢移除。缝合切口并将小鼠从异氟烷暴露中移除。植入之日被指定为研究第0天。在第1和第4天，如上所述经由非侵入式生物发光成像对肿瘤进行成像以确保成功的肿瘤植入。然后将小鼠分成三个组以均匀地分布相对肿瘤通量，接着随机分配以接受Cetux-CAR+T细胞治疗、Nimo-CAR+T细胞治疗和无治疗。
U87-ffLuc-mKate或U87med-ffLuc-mKate的非侵入式生物发光成像。对颅内神经胶质瘤进行非侵入式和依序成像并用作相对肿瘤负荷的量度。在215μg D-荧光素钾盐(Caliper Life Sciences,Perkin-Elmer)皮下注射之后十分钟，使用Xenogen谱(CaliperLife Sciences,Perkin-Elmer)和Living Image软件(2.50版,Caliper Life Sciences,Perkin-Elmer)测量肿瘤通量(光子/s/cm2/球面度)。在包括整个小鼠颅骨区的所划定的目标区域中测量肿瘤通量。
将CAR+T细胞颅内递送到建立的U87-ffLuc-mKate或U87med-ffLuc-mKate神经胶质瘤中。在建立肿瘤第5天开始颅内神经胶质瘤异种移植物的治疗并持续每周一次，总共3次T细胞注射。已完成3个刺激周期的CAR+T细胞通过流式细胞术被证实有>85％CAR表达，然后使用自动细胞计数器(Cellometer，自动T4细胞计数器，Nexcelcom)通过台盼蓝排除对活细胞进行计数。将CAR+T细胞在300xg下旋转5分钟，并且以0.6x106/μL的浓度再悬浮于无菌PBS中。如上所述为颅骨切口对小鼠做准备，并通过异氟烷暴露来麻醉。在准备小鼠时，通过在距离注射器末端2.5mm处放置塑料防护器并且装载含有3x106个T细胞的5μL细胞悬液来准备具有钝针的26号的10μL Hamilton注射器(Hamilton Company，目录号80300)。将注射器插入导螺杆中，延伸2.5mm到颅内腔中，并且在缓慢的恒压下注射。在注射器排空之后，将其就地保持额外30秒以使颅内压力消散。注射之后，缝合封闭切口并将小鼠从异氟烷暴露中移除。
评价小鼠存活期。当小鼠出现进行性重量减轻(>25％体重)、快速的重量减轻(在48小时内>10％体重减轻)或后肢麻痹、或以下疾病临床症状的任意两个时将小鼠处死：共济失调、蜷缩姿势、不规则的呼吸率、所暴露肿瘤的溃疡、或直径超过1.5cm的可触知的肿瘤。
统计学
在GraphPad Prism,6.03版中进行所有统计分析。所有体外细胞培养实验的统计分析，包括细胞因子产生、存活力、增殖及表面表型的流式细胞术分析、细胞扩增的动力学、长期细胞毒性、以及通过具有供体匹配和多重比较的Tukey氏事后检验的双因素ANOVA的铬释放测定。功能与抗原密度的相关性是通过具有针对线性趋势的事后检验的单因素ANOVA进行。使用具有重复测量和针对多重比较的Sidak氏后检验的双因素ANOVA进行肿瘤的体内生物发光成像分析。通过对数秩(Mantel-Cox)检验进行动物存活期数据的统计分析。结果的显著性定义如下：*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001。
实施例2–通过装载有抗CD3的人工抗原呈递细胞的T细胞的数值扩增
通过由DNA整合实现的稳定CAR表达的抗原依赖性刺激可用于将CAR+T细胞数值扩增至临床上可行的数量。经由RNA转移的CAR表达的瞬时特性需要将T细胞数值扩增至临床上可行的数量以便在CAR的RNA转移之前实现。为了测定aAPC数值扩增不依赖于抗原的T细胞的能力，经由高亲和力Fc受体CD64的稳定表达将抗CD3(OKT3)装载到K562上(图1A)。K562还表达CD86、41BB-L、以及膜结合的IL-15用于额外的T细胞共刺激。为了确定aAPC密度在共培养中刺激T细胞扩增的影响，将来源于健康人供体的外周血单核细胞(PBMC)与低密度(10个T细胞比1个aAPC，10:1)或高密度(1个T细胞比2个aAPC，1:2)的γ-辐照的aAPC在IL-2存在下共培养。在9天之后用aAPC再刺激T细胞。aAPC添加两个周期之后，当用aAPC 10:1和1:2刺激时T细胞进行数值扩增；然而，在更高密度的aAPC(1:2)下的T细胞实现统计上优良的数值扩增(10:1＝1083±420倍扩增，1:2＝1891±376倍扩增，平均值±S.D.，n＝6)(p<0.0001)(图1B)。
在较低密度的aAPC下扩增的T细胞与在更多aAPC下扩增的T细胞相比含有更高比例的CD8+T细胞(10:1＝53.9±11.6％CD8，1:2＝28.1±16.2％CD8，平均值±S.D.，n＝6)(p<0.001)(图2A)。CD8+T细胞当用任一比率的aAPC刺激时显示相似的T细胞倍数扩增，然而，CD4+T细胞当用更少的aAPC刺激时显示更低的倍数扩增(10:1＝369±227CD4+倍扩增，1:2＝1267±447CD4+倍扩增，平均值±S.D.，n＝6)(p<0.0001)(图2B)。为了确定降低的倍数扩增是否归因于在具有较少aAPC的培养物中增加的CD4+T细胞死亡，用膜联蛋白V和碘化丙啶(PI)对CD4+和CD8+T细胞进行染色并且通过流式细胞术来分析以确定细胞存活力。当用低或高密度aAPC刺激时，在CD4+或CD8+T细胞中活细胞的比例无差异(图2C)。为了确定降低的CD4+T细胞倍数扩增是否归因于降低的增殖速率，在用aAPC刺激之后9天对T细胞进行染色用于细胞内Ki-67表达并且通过流式细胞术来分析。当用低或者高密度的aAPC刺激时，CD8+T细胞显示相似的增殖，然而，当用低密度aAPC刺激时相比于高密度aAPC，CD4+T细胞显示减少的增殖(图2D)。这些数据表明用低密度aAPC刺激T细胞与用高密度aAPC刺激的T细胞相比产生更少的总T细胞扩增，其特征为由于CD4+T细胞响应于低密度aAPC而增殖减少所致的增加的CD8+T细胞比例。
实施例3–在更低密度aAPC下扩增的T细胞显示比用更高密度aAPC扩增的T细胞更多的记忆样表型。
为了确定用低密度或高密度aAPC进行的扩增是否影响T细胞表型，使用nCounter分析(Nanostring Technologies,Seattle,WA)通过多路数字图谱表征分析一组mRNA转录物(淋巴细胞特异性编码集)的表达。显著的差异基因表达通过p<0.01和在用低密度(10:1T细胞:aAPC)或高密度(1:2T细胞:aAPC)aAPC扩增的分选CD4+或CD8+T细胞中倍数变化大于1.5来确定。用高密度aAPC扩增的CD4+和CD8+T细胞显示与T细胞活化有关的基因表达的增加，如在CD4+T细胞中的CD38和粒酶A以及在CD8+T细胞中的CD38和NCAM-1(图3)。相比之下，用低密度aAPC扩增的CD4+和CD8+T细胞显示与中心记忆或首次用于试验T细胞有关的基因表达增加，包括Wnt信号传导途径转录因子Lef1和Tcf7、CCR7、CD28及IL7Rα(Gattinoni等人,2009；Gattinoni等人,2012)。
为了进一步评估用低或高密度aAPC扩增的T细胞的差异表型，通过流式细胞术就表型标记物对T细胞进行分析并且通过CCR7和CD45RA的共表达评估亚群，其中CCR7+CD45RA+表示首次用于试验表型，CCR7+CD45RAneg表示中央记忆表型，CCR7negCD45RAneg表示效应记忆，并且CCR7negCD45RA+表示CD45RA+效应记忆表型(Geginat等人,2003)。用低密度aAPC扩增的CD4+T细胞含有显著更少的具有效应记忆表型的T细胞(10:1＝61.9±9.1％，1:2＝92.1±3.9％，平均值±S.D.，n＝3)(p<0.05)，但更多的中央记忆表型(10:1＝36.5±9.4％，1:2＝13.6±2.4％，平均值±S.D.，n＝3)(p<0.05)T细胞(图4A)。类似地，用低密度aAPC扩增的CD8+T细胞含有显著更少的具有效应记忆表型的T细胞(10:1＝66.1±12.5％，1:2＝89.1±1.7％，平均值±S.D.，n＝3)(p<0.05)，但更多的中央记忆表型(10:1＝32.3±11.7％，1:2＝6.5±2.8％，平均值±S.D.，n＝3)(p<0.05)。用低密度aAPC刺激的显著更少的CD4+T细胞产生粒酶B(p<0.001)，而用低密度aAPC刺激的更少的CD8+T细胞产生粒酶B(p<0.05)或穿孔素(p<0.001)(图4B)。当用PMA/离子霉素刺激时，用低和高密度aAPC扩增的CD4+T细胞显示IFN-γ、TNF-α及IL-2的等量产生，而用低密度aAPC刺激的CD8+T细胞显示显著更少的IFN-γ(p<0.001)和TNF-α(p<0.05)产生，但更多的IL-2(p<0.05)产生(图4C)。总的来说，这些数据显示用低密度aAPC扩增的T细胞与用更高密度aAPC扩增的T细胞相比含有增加比例的具有中央记忆表型的T细胞、效应分子粒酶B和穿孔素的产生减少以及效应细胞因子IFN-γ和TNF-α产生减少。
实施例4–T细胞的数值扩增产生TCRαβ多样性的最小变化
使用nCounter分析(Nanostring Technologies,Seattle,WA)通过多路数字图谱表征在用低和高密度aAPC扩增之前和之后以图谱表征TCRα和TCRβ多样性，并且将每条TCRα和TCRβ链的相对丰度计算为总T细胞群的百分比。在用低和高密度aAPC离体扩增之后，CD4+和CD8+T细胞表达不同的TCRα和TCRβ等位基因，表明所得的群体保持寡克隆TCRα和TCRβ库(图5和图6)。在用低和高密度aAPC扩增之前和之后在T细胞的TCRβ链中使用ImmunoSEQ平台(Adaptive TCR Technologies,Seattle,WA)进行CDR3区的高通量测序以确定离体扩增是否在T细胞的克隆组合物中产生变化。对扩增之前和之后的单独CDR3序列的相对计数作图并且用线性回归拟合。如果扩增之前和之后的CDR3序列数目相同，那么线性回归的斜率预期将为1.0。在用低密度aAPC扩增的T细胞中，线性回归的斜率是0.75±0.001，而在用高密度aAPC扩增的T细胞中，线性回归的斜率是0.29±0.003(图7)。这表明用低密度aAPC扩增的T细胞群保持比用高密度aAPC扩增的T细胞更多的来自输入T细胞群的CDR3序列。总之，当用低和高密度aAPC扩增时，T细胞的离体扩增产生寡克隆T细胞群，但用低密度aAPC扩增的T细胞可在扩增之后显示较少的克隆损失。
实施例5–RNA转移到用aAPC数值扩增的T细胞中
为了测定用低和高密度aAPC刺激的T细胞通过电转移接受RNA的能力，使用多种电穿孔程序(包括程序EO-115，制造商推荐的用于以aAPC刺激之后4天的受刺激的T细胞的程序)，使用Amaxa Nucleofector 4D转染系统(Lonza,Cologne,Germany)电转移编码绿色荧光蛋白(GFP)的体外转录的RNA。用GFP的平均荧光强度(MFI)针对通过PI染色测定的T细胞存活力作图揭示在RNA转移之后GFP表达与T细胞存活力的负相关。与用低密度aAPC刺激的T细胞相比，用高密度aAPC刺激的T细胞显示通过RNA转移导致的GFP表达减少和响应于所测试的每个电穿孔程序存活力降低(图8A)。因此，用低密度aAPC(10个T细胞比1个aAPC)刺激的T细胞用于所有进一步实验中。因为需要在RNA转移之前进行T细胞数值扩增以获得供输注的临床上相关的T细胞数量，所以评价通过每9天循环添加aAPC经历多轮刺激的T细胞通过电转移接受RNA转录物的能力。在每个连续轮次的刺激中，RNA电转移之后的GFP表达减少(图8B，左图)。然而，两轮刺激之后，T细胞与经历单轮刺激或三轮刺激的T细胞相比显示电转移之后的提高的存活力(图8B，右图)。因此，用10个T细胞比1个aAPC的两轮刺激的刺激方案被选出用于进一步优化RNA转录物转移。因为RNA与DNA相比对细胞的毒性较小并且更容易转移到许多细胞类型中(165)，所以这就是RNA转移效率可在不损害T细胞存活力下通过减小制造商推荐的用于刺激T细胞的电穿孔程序EO-115的强度而得以提高的原因。通过将表达GFP的细胞百分比针对通过PI染色测定的存活力进行绘图，鉴定在电穿孔之后24小时产生～100％GFP表达以及与未电穿孔的T细胞相似的T细胞存活力的程序为程序DQ-115(图8C)。在用优化方案电穿孔之后评价T细胞表型以确定RNA的电转移是否将改变T细胞表型。在有或没有RNA转录物下的电穿孔之后没有检测到T细胞表型的变化(图8D)。因此，开发一种平台用于将RNA转移到经由与aAPC共培养的数值扩增之后的T细胞中，该平台产生RNA转录物的高表达而不损害T细胞存活力。
实施例6-通过DNA或RNA转移修饰的T细胞的CAR表达和表型
为了比较通过RNA和DNA修饰制造的CAR+T细胞的CAR表达和功能，由西妥昔单抗(一种临床上可用的抗EGFR单克隆抗体)的scFv产生EGFR特异性CAR。西妥昔单抗的scFv融合至IgG4绞链区、CD28跨膜和胞质结构域、以及CD3-ζ胞质结构域以形成第二代CAR，称为Cetux-CAR，并且在睡美人转座子中表达用于永久性DNA整合以及在T7启动子下在pGEM/A64载体中用于RNA转录物的体外转录。T细胞的RNA修饰通过在第二刺激之后四天将体外转录的Cetux-CAR电转移到用装载OKT3的K562aAPC刺激两次的T细胞中来实现(图9A)。在电转移之后24小时评估CAR表达。对于稳定的DNA整合，将在SB转座子中表达的Cetux-CAR用SB11转座酶电穿孔到人原代T细胞中，SB11转座酶是一种剪切和粘贴酶，其将CAR从转座子上切除并在反向TA重复序列处插入宿主T细胞基因组中。用γ-辐照的EGFR+K562aAPC循环刺激产生CAR-表达T细胞随时间的选择性扩增，并且在由5个循环aAPC添加周期组成的28天之后，每7天评估T细胞的CAR表达(图9B)。如通过流式细胞术对于CAR的IgG4绞链区所测定的在CD4+和CD8+中通过RNA修饰和DNA修饰的Cetux-CAR的表达并非统计上不同的(p>0.05)，然而，RNA修饰在表达强度上产生更大的变化(图10A)。在Cetux-CAR-表达T细胞中，CD4+和CD8+T细胞的比例在用RNA或DNA修饰的T细胞之间并非统计上不同的，然而，与RNA修饰的CAR+T细胞相比，在DNA修饰的CAR+T细胞中存在的CD4+和CD8+T细胞的比例存在更大可变性(图10B)。
为了比较通过RNA修饰或DNA修饰的表达Cetux-CAR的T细胞群的表型，通过流式细胞术分析表型标记物。CD4+RNA-修饰的CAR+T细胞比CD4+DNA-修饰的CAR+T细胞具有显著更多的具有中央记忆表型的T细胞(CCR7+CD45RAneg)(DNA-修饰的＝6.6±1.9％，RNA-修饰的＝49.6±3.0％，平均值±S.D.，n＝3)(p<0.0001)，但具有显著更少的具有效应记忆表型的T细胞(CCR7negCD45RAneg)(DNA-修饰的＝89.8±2.6％，RNA-修饰的＝48.1±3.3％，平均值±S.D.，n＝3)(p<0.0001)(图10C)。类似地，CD8+RNA-修饰的CAR+T细胞比CD8+DNA-修饰的CAR+T细胞具有显著更多的具有中央记忆表型的T细胞(DNA-修饰的＝10.4±4.9％，RNA-修饰的＝32.8±4.2％，平均值±S.D.，n＝3)(p<0.001)，但具有显著更少的具有效应记忆表型的T细胞(DNA-修饰的＝83.5±5.4％，RNA-修饰的＝51.1±6.6％，平均值±S.D.，n＝3)(p>0.0001)。通过RNA修饰的CD4+Cetux-CAR+T细胞与CD4+Cetux-CAR+T细胞相比还显示显著更高的抑制性受体程序性死亡受体1(PD-1)表达(p<0.01)，但CD57(一种T细胞衰老标记物)的相似低表达(图10D)。CD8+Cetux-CAR+T细胞表达低水平的PD-1和CD57并且在RNA-修饰的与DNA-修饰的CAR+T细胞之间不存在可察觉的差异。最终，细胞毒性分子穿孔素和粒酶B的表达在通过Cetux-CAR的DNA或RNA转移修饰的CD4+和CD8+T细胞中是相似的(图10E)。总之，CAR+T细胞的RNA-修饰和DNA-修饰产生相似的CAR表达水平，尽管RNA转移造成CAR表达强度可变性增加。RNA-修饰的T细胞与DNA-修饰的T细胞相比表达更多的中央记忆表型CD4+和CD8+T细胞、较少的效应记忆表型CD4+和CD8+T细胞，并且在CD4+CAR+T细胞上具有抑制性受体PD-1的更高表达。
实施例7–DNA-修饰的CAR+T细胞与RNA-修饰的CAR+T细胞相比产生更多细胞因子并展现稍微更大的细胞毒性
响应于被修饰以表达截短的EGFR(tEGFR+EL4)或不相关抗原CD19的小鼠T细胞淋巴瘤细胞系EL4及包括人成胶质细胞瘤细胞系U87、T98G、LN18及人表皮样癌细胞系A431的EGFR+细胞系来评估RNA-修饰或DNA-修饰的CAR+T细胞的细胞因子产生。更少的通过RNA转移修饰的CD8+CAR+T细胞响应于所有EGFR-表达细胞系产生IFN-γ(图11A，左图)。因为更少的RNA-修饰的T细胞响应于用PMA/离子霉素进行的抗原非依赖性刺激产生IFN-γ，所以减少的IFN-γ产生不可能归因于CAR对抗原的敏感性降低，而宁可说是通过RNA-修饰表达CAR的T细胞产生细胞因子的能力下降。注意到DNA-修饰的CAR+T细胞在T细胞刺激不存在下还显示IFN-γ的更高本底产生。类似地，与DNA-修饰的CD8+CAR+T细胞相比，更少的RNA-修饰的CD8+CAR+T细胞响应于来自T98G、LN18、A431的EGFR-特异性刺激以及来自PMA/离子霉素的抗原非依赖性刺激产生TNF-α(图11A，右图)。
因为RNA-修饰的CAR+T细胞相对于DNA-修饰的CAR+T细胞显示降低的产生细胞因子的能力，所以比较RNA-修饰的与DNA-修饰的T细胞的细胞毒性以确定RNA-修饰的CAR+T细胞相对于DNA-修饰的CAR+T细胞的细胞毒性潜力。响应于CD19+EL4细胞，RNA-修饰的和DNA-修饰的CAR+T细胞具有低水平的本底杀伤，尽管在高效应物与靶标比率(E:T＝20:1)下，RNA-修饰的CAR+T细胞显示比DNA-修饰的CAR+T细胞显著更多的本底裂解(p<0.05)(图11B)。类似地，RNA-修饰和DNA-修饰的CAR+T细胞显示针对B细胞淋巴瘤细胞系NALM-6的低水平和相等水平的本底裂解。响应于tEGFR+EL4和A431，在由RNA-修饰或DNA-修饰的CAR+T细胞介导的细胞毒性中不存在可察觉的差异。响应于三种神经胶质瘤细胞系U87、T98G及LN18，DNA-修饰的CAR+T细胞显示比仅在低E:T比率下检测的RNA-修饰的CAR+T细胞稍微增加的细胞毒性。因为RNA-修饰的T细胞比DNA-修饰的T细胞在供体与供体之间在CAR表达方面具有更多的可变性，所以评估如通过CAR表达的中值荧光强度所测定的CAR表达对A431的特异性裂解的影响。将CAR表达的中值荧光强度针对A431的特异性裂解作图，并且线性回归关系产生显著不等于零的斜率，且因此显示在CAR表达与特异性裂解之间没有检测到显著的趋势(斜率＝0.0237±0.030，p＝0.4798)(图11C)。总之，这些研究结果表明DNA-修饰的CAR+T细胞相对于RNA-修饰的CAR+T细胞具有效应细胞因子IFN-γ和TNF-α的显著增加的产生，当在低E:T比率下存在时可显示稍微更大的细胞毒性，并且在RNA-修饰的CAR+T细胞中的CAR表达的可变性不显著影响靶标的特异性裂解。
实施例8–Cetux-CAR通过T细胞的RNA修饰的瞬时表达
为了测定通过RNA转移的CAR表达的稳定性，通过RNA转移修饰T细胞以表达CAR，并且通过流式细胞术测量随时间的CAR表达。RNA转移之后，T细胞上Cetux-CAR的表达随时间减少，并且在电转移之后96小时，CAR以低水平表达(图12A)。因为RNA转录物在T细胞增殖期间在子细胞之间分配，所以T细胞增殖的刺激应加速通过RNA修饰表达的CAR的损失。为了确定细胞因子刺激对CAR表达水平的影响，在RNA转移之后24小时将外源性IL-2和IL-21添加到RNA-修饰的CAR+T细胞培养物中，并通过流式细胞术监测CAR表达。用IL-1和IL-21刺激CAR+T细胞加速CAR表达的损失(图12B)。72小时之后，在RNA-修饰的T细胞上的CAR表达较低，并且在转移之后96小时，T细胞不再以可检测的水平表达CAR。在RNA转移之后24小时用tEGFR+EL4刺激RNA-修饰的CAR+T细胞甚至进一步加速CAR表达的损失(图12C)。虽然在添加tEGFR+EL4之前在RNA-修饰的CAR+T细胞中检测到高水平的CAR，但在tEGFR+EL4添加之后24小时(RNA转移之后48小时)CAR表达是低的。总而言之，这些数据表明通过RNA转移的CAR表达在RNA转移之后长达120小时是瞬时的、可检测的、低水平的，然而，通过细胞因子或抗原识别刺激T细胞加速了CAR表达的损失。
实施例9–Cetux-CAR通过RNA修饰的瞬时表达减少细胞因子产生和对EGFR-表达细胞的细胞毒性
在RNA转移之后24和120小时测量通过RNA转移被修饰以表达Cetux-CAR的T细胞的活性以确定CAR表达的损失响应于EGFR-表达细胞对T细胞活性的影响。尽管当在RNA转移之后24小时和120小时评价时，RNA-修饰的T细胞显示通过PMA/离子霉素刺激的等同的IFN-γ产生，在RNA转移之后24小时通过T细胞响应于tEGFR+EL4的IFN-γ产生在RNA转移之后120小时消除(24小时＝14.2±2.5％，120小时＝1.1±0.03％，平均值±S.D.，n＝3)(p＝0.012)(图13A)。相比之下，DNA-修饰的CAR+T细胞在所评价的两个时间点响应于tEGFR+EL4显示相等的IFN-γ产生(24小时＝40.3±9.6％，120小时＝48.6±10.0％，平均值±S.D.，n＝3)(p＝0.490)。类似地，测量针对表皮样癌细胞系A431和表达EGFR的人正常肾上皮细胞(HRCE)的特异性细胞毒性。RNA-修饰和DNA-修饰的CAR+T细胞显示A431的等同特异性裂解和针对HRCE的类似细胞毒性，在更高的效应物与靶标比率下在统计上是等同的(20:1和10:1，p>0.05)(图13B)。类似于对其他细胞系的观察结果，DNA-修饰的CAR+T细胞在较低的E:T比率下介导比RNA-修饰的CAR+T细胞稍微更高的HRCE的特异性裂解(5:1，p<0.05；2.5:1，p<0.01；1.25:1，p<0.05)。然而，在RNA转移之后120小时，当消除RNA-修饰的T细胞的CAR表达时，DNA-修饰的T细胞在所评估的每个E:T比率下响应于A431和HRCE而介导显著更高的特异性裂解(A431，所有E:T比率，p<0.0001；HRCE，所有E:T比率，p<0.0001)。尽管DNA-修饰的T细胞在每个时间点在HRCE的特异性裂解方面没有显示变化(10:1E:T比率，24小时＝45.5±8.0％，120小时＝51.6±7.8％，p>0.05，n＝3)，RNA-修饰的T细胞截至RNA转移之后120小时显著减少HRCE的特异性裂解(10:1E:T比率，24小时＝39.5±5.9％，120小时＝19.8±10.2％，平均值±S.D.，n＝3)(图13C)。这些数据表明RNA-修饰的而不是DNA-修饰的T细胞响应于EGFR-表达靶标的活性由于CAR表达的损失而降低。
实施例10–Cetux-CAR+与Nimo-CAR+T细胞在表型上是相似的
来源于尼妥珠单抗的第二代CAR(称为Nimo-CAR)是通过将尼妥珠单抗的scFv与IgG4绞链区、CD28跨膜结构域及CD28和CD3ζ细胞内结构域融合而在睡美人转座子中以与Cetux-CAR相同的构型生成。Cetux-CAR和Nimo-CAR通过用SB11转座酶将每个转座子电穿孔到外周血单核细胞(PBMC)中在原代人T细胞中表达。具有Cetux-CAR或Nimo-CAR的稳定整合的T细胞通过用γ辐照的tEGFR+K562人工抗原呈递细胞(aAPC)的每周循环刺激而选择性地增殖(图14A)。两种CAR在与aAPC共培养的28天内都介导CAR+T细胞的～1000倍扩增，产生几乎全部都表达CAR的T细胞(Cetux-CAR＝90.8±6.2％，Nimo-CAR＝90.6±6.1％；平均值±SD，n＝7)(图14B和14C)。表达CAR的Cetux-CAR和Nimo-CAR+T细胞的比例在数值扩增28天之后在统计上是类似的(p＝0.92，学生双尾t检验)。由中值荧光强度表示的CAR表达的密度是通过流式细胞术来测量的并且在Cetux-CAR+与Nimo-CAR+T细胞群之间在统计上是类似的(Cetux-CAR＝118.5±25.0A.U.，Nimo-CAR＝112.6±21.2A.U.；平均值±SD，n＝7)(p＝0.74)(图14D)。
为了确定CAR scFv对T细胞功能的影响，建立Cetux-CAR+和Nimo-CAR+T细胞的电穿孔和增殖以产生表型上类似的T细胞群。每个供体产生可变比率的CD4+与CD8+T细胞(表1)，然而，在Cetux-CAR+与Nimo-CAR+T细胞之间在CD4/CD8比率上不存在统计学差异(p＝0.44，学生双尾t检验)(图15A)。分化标记物CD45RO、CD45RA、CD28、CD27、CCR7及CD62L的表达在统计上不显著(p>0.05)，并且表示异质T细胞群(图18B)。同样，发现衰老的标记物CD57和KLRG1及抑制性受体程序性死亡受体1(PD-1)是低的并且在Cetux-CAR+与Nimo-CAR+T细胞群之间在统计上是不同的(p>0.05)(图15C)。总之，这些研究结果表明Cetux-CAR+与Nimo-CAR+T细胞在电穿孔和增殖之后没有可检测的表型差异(包括CAR表达)，使得能够直接比较。
表1.在Cetux-CAR+和Nimo CAR+T细胞中CD4与CD8的比率。
通过流式细胞术测定扩增28天之后Cetux-CAR+和Nimo-CAR+T细胞中CD4和CD8的表达。数据来自7个独立的供体。
实施例11–Cetux-CAR+和Nimo-CAR+T细胞对CAR依赖性T细胞活化具有相同能力
为了证实Cetux-CAR和Nimo-CAR响应于EGFR刺激的功能性，将CAR+T细胞与A431表皮样癌细胞系一起孵育，该细胞系据报告表达高水平的EGFR，约1x106个EGFR分子/细胞(Garrido等人,2011)。Cetux-和Nimo-CAR+T细胞在与A431共培养期间产生IFN-γ，IFN-γ在阻断结合至EGFR的抗EGFR单克隆抗体存在下是减少的(图16A)。为了证实Cetux-CAR和Nimo-CAR能够等同地活化T细胞，生成可由不依赖于scFv结构域的两种CAR识别的靶标。这通过在无限增殖的小鼠T细胞系EL4上表达对CAR(CAR-L)的IgG4区有特异性的活化抗体的scFv区而实现(Rushworth等人,2014)。比较通过CAR-L+EL4的T细胞的活化与通过表达tEGFR的EL4细胞系的活化。进行定量流式细胞术以测量在EL4上表达的tEGFR的密度。在此方法中，通过流式细胞术测量来自具有用荧光抗体标记的已知抗体结合能力的微球的荧光强度并用于生成标准曲线，其定义已知抗体结合能力与平均荧光强度(MFI)之间的线性关系。然后该标准曲线可用于由用相同荧光抗体标记的未知样品的平均荧光强度得到抗原表达的平均密度。tEGFR+EL4表达相对较低密度的tEGFR，约45,000个分子/细胞(图16B)。Cetux-CAR+和Nimo-CAR+CD8+T细胞显示响应于CAR-L+EL4的IFN-γ的统计上相似的量，表明对于CAR依赖性活化的等同能力(p>0.05)(图16C)。虽然Cetux-CAR+T细胞响应于EGFR+产生IFN-γ，但不存在来自Nimo-CAR+T细胞的可察觉的IFN-γ产生(图16C)，这与响应于低抗原密度影响T细胞活化的CAR的scFv的亲和力一致。除测量细胞因子产生之外，还就T细胞活化的分子下游(Erk1/2和p38)的磷酸化对CD8+T细胞进行分析。在Cetux-CAR+与Nimo-CAR+T细胞之间在响应于CAR-L+EL4的Erk1/2(p>0.05)或p38(p>0.05)的磷酸化方面不存在统计上的差异(图16D)。尽管Cetux-CAR+T细胞展现响应于tEGFR+EL4的Erk1/2和p38的磷酸化，Nimo-CAR+T细胞不能明显磷酸化任一个分子。类似地，Cetux-CAR和Nimo-CAR两者都显示针对CAR-L+EL4等同的特异性裂解(10:1E:T比率，Cetux-CAR＝64.5±6.7％，Nimo-CAR＝57.5±12.9％，平均值±SD，n＝4)(p>0.05)。尽管Cetux-CAR+T细胞显示响应于tEGFR+EL4比非特异性靶标CD19+EL4显著的特异性裂解(tEGFR+EL4＝57.5±9.4％，tCD19+EL4＝17.3±13.0，平均值±SD，n＝4)(p<0.0001)，对于Nimo-CAR+T细胞不存在tEGFR+EL4的显著裂解(tEGFR+EL4＝21.2±16.9％，CD19+EL4＝12.3±13.0，平均值±SD，n＝4)(p>0.05)(图16E)。内源性低亲和力T细胞应答可需要更久与抗原相互作用以实现效应功能(Rosette等人,2001)，因此，CAR+T细胞控制t EGFR+和CAR-L+EL4细胞生长的能力是通过将T细胞与EL4以1:1的比率混合并且评估在长期共培养期间T细胞与EL4细胞的比例来评估的。Cetux-CAR+T细胞和Nimo-CAR+T细胞等同地控制CAR-L+EL4的生长(p>0.05)，如5天之后CAR-L+EL4细胞在共培养物中的低比例所示(图16F)。Cetux-CAR+T细胞控制tEGFR+EL4的生长，导致5天之后在共培养物中小于10％的tEGFR+EL4。Nimo-CAR+T细胞不太能够控制tEGFR+EL4细胞生长，导致5天之后tEGFR+EL4占80％的共培养物，显著多于与Cetux-CAR+T细胞的共培养物(p<0.01)。因此，Nimo-CAR+T细胞对tEGFR+EL4上的低tEGFR密度的应答减少不太可能是由于活化时间的不足。总之，这些数据表明Cetux-CAR+和Nimo-CAR+T细胞对EGFR具有功能特异性并且可通过CAR依赖性、scFv非依赖性刺激同等地被活化。Cetux-CAR+T细胞能够响应于tEGFR+EL4上的低tEGFR密度进行特异性活化；然而，EGFR表达的此密度不足以活化Nimo-CAR+T细胞以产生细胞因子、磷酸化下游分子Erk1/2和p38、或引发特异性裂解。
实施例12–Nimo-CAR+T细胞的活化和功能应答受到靶细胞上的EGFR表达密度的影响
为了研究EGFR表达密度对Cetux-CAR+和Nimo-CAR+T细胞活化的影响，针对具有一系列EGFR表达密度的细胞系比较T细胞功能：NALM-6、U87、LN18、T98G及A431。首先，通过定量流式细胞术评估EGFR表达密度(图17A)。NALM-6，一种B细胞白血病细胞系，不表达EGFR。U87，一种人成胶质细胞瘤细胞系，表达低密度的EGFR(～30,000个分子/细胞)。LN18和T98G(两种人成胶质细胞瘤细胞系)表达中等密度的EGFR(分别为～160,000和～205,000个分子/细胞)，并且发现A431表达高密度的EGFR(～780,000个分子/细胞)，类似于先前的报告(Garrido等人,2011)。Cetux-CAR+和Nimo-CAR+CD8+T细胞显示响应于具有高EGFR密度的A431(p>0.05)和具有中等EGFR密度的LN18(p>.05)的统计上相似的IFN-γ产生。然而，Nimo-CAR+T细胞显示相对于Cetux-CAR+T细胞响应于具有中等EGFR密度的T98G(p<0.001)和具有低EGFR密度的U87(p<0.001)的减少的IFN-γ产生(图17B)。类似地，尽管Cetux-CAR+和Nimo-CAR+T细胞显示统计上相当的A431细胞(5:1E:T比率，p>0.05)和T98G细胞(5:1E:T比率，p>0.05)裂解，Nimo-CAR+T细胞显示对于LN18细胞特异性裂解能力一定程度的降低(5:1E:T比率，p<0.05)和对于U87细胞特异性裂解的能力降低(5:1E:T比率，p<0.01)(图17C)。这些数据支持Nimo-CAR+T细胞的活化受到EGFR表达密度的影响。然而，评估在不同细胞本底环境中针对EGFR密度的功能是不理想的，这是由于不同的细胞系可具有不同T细胞活化倾向并且对T细胞介导的裂解具有不同易感性。
实施例13–Nimo-CAR+T细胞功能的活化与EGFR表达密度直接并且正相关
为了确定EGFR表达密度对同基因细胞本底的影响，开发一系列表达变化密度的EGFR的U87细胞系：未修饰的、亲代U87(～30,000个EGFR分子/细胞)、U87low(130,000个EGFR分子/细胞)、U87med(340,000个EGFR分子/细胞)、以及U87high(630,000个EGFR分子/细胞)(图18A)。为了比较scFv依赖性CAR刺激之后Erk1/2和p38的磷酸化，确保在刺激U87和U87high之后在Nimo-CAR+T细胞与Cetux-CAR+T细胞之间在磷酸化动力学方面没有差别。两种CD8+CAR+T细胞都显示在相互作用之后45分钟Erk1/2和p38的峰值磷酸化并且磷酸化在截至相互作用之后120分钟时开始减少(图18B)。在Cetux-CAR+T细胞与Nimo-CAR+T细胞之间在磷酸化动力学方面不存在可察觉的差别并且未来的实验评估相互作用之后45分钟Erk1/2和p38的磷酸化以用于所有未来的实验。Cetux-CAR+CD8+T细胞响应于所有四个U87细胞系对Erk1/2和p38进行磷酸化并且显示与EGFR表达密度无相关性(单因素ANOVA，对于线性趋势采用事后检验；Erk1/2，p＝0.88；p38，p＝0.09)(图18C)。相比之下，Nimo-CAR+CD8+T细胞对Erk1/2和p38的磷酸化直接与EGFR表达密度相关(单因素ANOVA，对于线性趋势采用事后检验，Erk1/2p＝0.0030和p38p＝0.0044)。注意到Nimo-CAR+T细胞显示比Cetux-CAR+T细胞显著更少的pf Erk1/2和p38的磷酸化，甚至响应于U87high上的高EGFR密度时也如此(Erk1/2，p<0.0001；p38,p<0.01)。类似地，Cetux-CAR+CD8+T细胞响应于U87、U87low、U87med及U87high时产生IFN-γ和TNF-α，并且产生与EGFR表达密度不相关(单因素ANOVA，对于线性趋势采用事后检验；IFN-γ，p＝0.5703和TNF-α，p＝0.6189)(图18D)。相比之下，Nimo-CAR+CD8+T细胞在与EGFR表达密度直接相关下产生IFN-γ和TNF-α(单因素ANOVA，对于线性趋势采用事后检验；IFN-γ，p＝0.0124和TNF-α，p＝0.0006)。Cetux-CAR+CD8+T细胞响应于U87(IFN-γ，p<0.0001；TNFα，p<0.01)或U87low(IFN-γ，p<0.001；TNFα，p<0.01)的刺激产生比Nimo-CAR+CD8+T细胞显著更多的细胞因子，然而，Cetux-CAR+T细胞和Nimo-CAR+T细胞响应于U87med(IFN-γ，p>0.05；TNFα，p>0.05)或U87high(IFN-γ，p>0.05；TNFα，p>0.05)的刺激显示统计上相似的细胞因子产生。同样，Cetux-CAR+T细胞显示比Nimo-CAR+T细胞显著更多的U87裂解(10:1E:T比率，p<0.0001)和U87low裂解(10:1E:T比率，p<0.05)，但在统计上相似的U87med(10:1E:T比率，p>0.05)和U87high(10:1E:T比率，p>0.05)的特异性裂解(图18E)。总之，这些数据表明Nimo-CAR+T细胞的活化直接与靶标上的EGFR表达密度相关。因此，Cetux-CAR+与Nimo-CAR+T细胞响应于高EGFR密度显示相等的T细胞活化，但Nimo-CAR+T细胞响应于低EGFR密度显示显著减少的活化。
因为内源性、低亲和力T细胞应答可能需要更久的与抗原的相互作用以获得效应功能(Rossette等人,2001)，经证实在Cetux-CAR+T细胞与Nimo-CAR+T细胞之间观察到的T细胞活性的差异不是由于对T细胞的相似要求。CAR+T细胞与靶标的长期相互作用基本上没有增加细胞因子产生并且没有改变Cetux-CAR+与Nimo-CAR+CD8+T细胞之间的细胞因子产生的关系(图19A)。类似地，评估Cetux-CAR+和Nimo-CAR+T细胞随时间控制U87和U87high生长的能力并发现Cetux-CAR+和Nimo-CAR+T细胞显示统计上相似的控制U87high生长的能力，导致相对于在CAR+T细胞不存在下生长的对照，80％的细胞数目减少(p>0.05)。Cetux-CAR+T细胞在内源性低EGFR表达下控制U87生长，导致相对于CAR+T细胞不存在下生长的对照，40％的细胞数目减少。然而，Nimo-CAR+T细胞显示显著更少的U87生长控制，在细胞数目上没有明显的减少(p<0.001)(图19B)。这些数据表明响应于U87上的低EGFR的Nimo-CAR+T细胞活性没有通过增加T细胞与靶标的相互作用时间而改善，从而使得Nimo-CAR+T细胞活性降低不可能是由于对活化T细胞的长期相互作用的要求导致的。
高于最小密度的CAR的表达为CAR依赖性T细胞活化所需，并且已显示增加密度的CAR表达影响CAR对抗原的敏感性(Weijtens等人,2000；Turatti等人,2007)。因此，为了确定在更高密度下表达Nimo-CAR是否改善低EGFR密度的识别，应设法在人原代T细胞中过度表达Cetux-CAR和Nimo-CAR。在电穿孔转染中装载DNA由于DNA对细胞的毒性而受限，然而，RNA的转移相对无毒并且更易于通过增加递送的CAR RNA转录物的量而过度表达。因此，将Cetux-CAR和Nimo-CAR在体外转录为RNA物质并且电转移到人原代T细胞中。当与供体-匹配的DNA-修饰的T细胞相比时，RNA转移造成CAR表达的2-5倍增加(图20A)。CAR的过度表达没有致使Nimo-CAR+T细胞对U87上的低EGFR密度更敏感，并且Cetux-CAR和Nimo-CAR两者均显示响应于U87high的相似的细胞因子产生(图20B)。这表明增加Nimo-CAR+T细胞上的CAR密度不提高对低EGFR密度的敏感性。
实施例14–Nimo-CAR+T细胞响应于正常肾上皮细胞上的基础EGFR水平具有降低的活性
为了确定Nimo-CAR+T细胞是否响应于正常细胞上的低的基础EGFR水平具有减少的活化，响应于正常人肾皮质上皮细胞HRCE来评估Nimo-CAR+T细胞的活性。HRCE表达～15,000个EGFR分子/细胞，比肿瘤细胞系(包括U87)上的表达要低(图21A)。尽管Cetux-CAR+T细胞响应于HRCE产生IFN-γ和TNF-α，Nimo-CAR+T细胞响应于HRCE产生显著更少的IFN-γ或TNF-α(IFN-γ，p<0.05；TNF-α，p<0.01)(图21B)。实际上，Nimo-CAR+T细胞没有显示超过无刺激时的本底产生的显著的IFN-γ或TNF-α产生(IFN-γ，p>0.05；TNF-α，p>0.05)。Nimo-CAR+T细胞呈现由Cetux-CAR+T细胞进行的响应于HRCE小于50％的特异性裂解(Cetux-CAR＝81.1±4.5％，Nimo-CAR＝30.4±16.7％，平均值±SD，n＝3)，其显著更少(10:1E:T比率，p<0.001)(图21C)。这些研究结果表明Nimo-CAR+T细胞响应于具有极低EGFR密度的细胞具有降低的T细胞功能。
实施例15–Cetux-CAR+T细胞在刺激之后比Nimo-CAR+T细胞增殖更少，但不具有增加的AICD倾向
受到结合亲和力和抗原密度影响的内源性TCR信号的强度可响应于抗原刺激影响T细胞增殖(Gottschalk等人,2012；Gottschalk等人,2010)。为了评估用抗原刺激之后Cetux-CAR+T细胞和Nimo-CAR+T细胞的增殖应答，在外源性细胞因子不存在下与U87或U87high共培养两天之后通过流式细胞术测量Ki-67的细胞内表达。响应于U87上的低EGFR密度，Cetux-CAR+和Nimo-CAR+T细胞显示统计上相似的增殖(p>0.05)(图22A)。响应于U87high，Nimo-CAR+T细胞显示比Cetux-CAR+增加的增殖(p<0.01)，其在响应于U87和U87high的增殖方面没有显示任何统计上的差异(p>0.05)。
为了确定CAR亲和力或抗原密度是否增加CAR+T细胞经历AICD的倾向，将Cetux-CAR+和Nimo-CAR+T细胞与U87或U87high在外源性细胞因子不存在下共培养并且通过膜联蛋白V和7-AAD染色评估T细胞存活力。响应于U87，Cetux-CAR+T显示与未刺激的Cetux-CAR+T细胞相比存活力降低，然而，Nimo-CAR+T细胞在存活力方面没有显示任何可察觉的变化(图22B)。响应于U87high，Cetux-CAR+和Nimo-CAR+T细胞相对于未刺激的CAR+T细胞显示统计上相似的存活力降低(p>0.05)。注意到用U87high刺激的Cetux-CAR+T细胞相对于用U87刺激的Cetux-CAR+T细胞在存活力方面没有显示任何统计上的差异(p>0.05)。这些数据表明抗原密度影响Nimo-CAR+T细胞而非Cetux-CAR+T细胞的AICD的诱发，从而支持Nimo-CAR的活性取决于抗原密度的先前数据。然而，响应于能够进行Cetux-CAR+T细胞和Nimo-CAR+T细胞活化的高抗原密度，CAR的scFv结构域的亲和力似乎不影响AICD的诱发。
实施例16–Cetux-CAR+T细胞显示增强的CAR下调
内源性TCR可在与抗原相互作用之后下调，并且下调程度受TCR结合强度的影响(Cai等人,1997)。类似地，CAR可在与抗原相互作用之后下调，但亲和力对CAR下调的影响是未知的(James等人,2008；James等人,2010)。因此，应设法确定Cetux-CAR+T细胞是否对抗原诱导的下调具有更高倾向。为了实现此点，将Cetux-CAR+T细胞和Nimo-CAR+T细胞与U87或U87high共培养并相对于未刺激的对照监测CAR表达。响应于U87上的低EGFR密度，在相互作用12小时之后，Cetux-CAR表达显著少于Nimo-CAR(Cetux-CAR＝68.0±27.8％，Nimo-CAR＝126.5±34.9％，平均值±SD，n＝3)(p<0.05)(图23A，左图)。截至与低密度EGFR相互作用48小时，Cetux-CAR回到T细胞表面，并且Cetux-CAR与Nimo-CAR在统计上相似比例的T细胞中表达(Cetux-CAR＝95.5±40.7，Nimo-CAR＝94.4±11.8％，平均值±SD，n＝3)(p>0.05)。响应于U87high上的高EGFR密度，Cetux-CAR的表达相对于Nimo-CAR是显著减少的，Nimo-CAR在相互作用12小时之后不显示可察觉的下调(Cetux-CAR＝37.4±11.5％，Nimo-CAR＝124.4±15.3％，平均值±SD，n＝3)(p<0.01)(12小时，p<0.01；24小时，p<0.01；48小时，p<0.05)(图23A，右图)。然而，与低EGFR密度的刺激相反，Cetux-CAR在相互作用48小时之后没有恢复表面表达且相对于Nimo-CAR表达保持统计上的减少(Cetux-CAR＝42.6±5.9％，Nimo-CAR＝95.7±11.6％，平均值±SD，n＝3)(p<0.05)。刺激之后在细胞内检测到Cetux-CAR和Nimo-CAR两者，即使当Cetux-CAR由T细胞表面减少时也如此，预示着减少的CAR表达是归因于CAR的内化而不是遗传未修饰的T细胞的产物(图23B)。响应于通过CAR-L+EL4的CAR依赖性的、scFv非依赖性刺激，Cetux-CAR和Nimo-CAR显示～20％的轻度和统计上相似的下调(图23C)。类似于先前的结果，Cetux-CAR显示响应于tEGFR+EL4的略微下调，而Nimo-CAR显示不可察觉的下调。总之，这些数据表明Cetux-CAR相对于Nimo-CAR显示更快速的和延长的下调，这取决于CAR的scFv结构域与抗原的相互作用和抗原密度。
实施例17–Cetux-CAR+T细胞对抗原重新攻击具有降低的应答
在内源性CD8+T细胞应答中先前刺激的强度可与用抗原重新攻击后的T细胞应答相关(Lim等人,2002)。因此，评估Cetux-CAR+和Nimo-CAR+T细胞响应于抗原重新攻击的能力。将CAR+T细胞与U87或U87high共培养24小时，然后收获并用U87或U87high重新攻击以评价IFN-γ的产生。用U87和U87high初始攻击之后，响应于用U87和U87high两者的重新攻击，Cetux-CAR+T细胞具有减少的IFN-γ产生(图24)。然而，在用U87或U87high初始攻击之后，Nimo-CAR+T细胞响应于用U87和U87high的重新攻击保持IFN-γ产生。因此，Nimo-CAR+T细胞响应于U87显示统计上相似的IFN-γ产生(p>0.05)并且响应于用U87high的重新攻击显示统计上更多的IFN-γ(用U87的初始攻击，p<0.001；用U87high的初始攻击，p<0.01)。这与响应于初始攻击的IFN-γ产生相反，其中Nimo-CAR+T细胞响应于U87产生更少的IFN-γ(p<0.05)并且响应于U87high显示统计上相似的IFN-γ产生(p>0.05)。因此，Nimo-CAR+T细胞保持其识别和响应于抗原的能力，而Cetux-CAR+T细胞具有响应于与抗原的后续相遇的降低的能力，这可能至少部分由于CAR的下调并且可显示在初始抗原暴露之后Cetux-CAR+T细胞的功能性耗竭倾向增大。
实施例18–在NSG小鼠中使用U87细胞建立颅内神经胶质瘤模型
为了评估Cetux-CAR+T细胞和Nimo-CAR+T细胞的体内抗肿瘤功效，建立经修饰以表达萤火虫荧光素酶(ffLuc)报道基因的U87细胞的颅内神经胶质瘤异种移植物，用于通过生物发光(BLI)对相对肿瘤负荷进行连续的、非侵入式成像。采用先前所述的导螺杆方法将肿瘤和T细胞定向输注到精确的坐标中(Lal等人,2000)。将导螺杆植入到NOD/Scid/IL2Rg-/-(NSG)小鼠头盖骨的右侧额叶中并使小鼠恢复两周(图25A)。导螺杆植入至T细胞治疗和通过BLI评估相对肿瘤负荷的时间线描绘在图25B中。将250,000个通过tEGFR的强制表达而具有内源性低EGFR或中等EGFR表达的U87细胞以2.5mm的深度注射穿过导螺杆的中心。在T细胞治疗之前对小鼠进行成像以评估肿瘤负荷，并将小鼠分层以均匀地分配肿瘤负荷到三个组中：不接受治疗、治疗Cetux-CAR+T细胞的小鼠或接受Nimo-CAR+T细胞的小鼠。注射肿瘤之后五天，将4x106个T细胞的初始剂量注射穿过导螺杆中心。每周通过导螺杆施用后续的T细胞剂量一次，持续总共三个T细胞剂量。在每次T细胞治疗之后六天时的BLI测量被用于评价相对肿瘤负荷。治疗之后，就终点标准对小鼠进行评估，包括在24小时期间大于5％身体质量的快速重量减轻、大于25％身体质量的进行性重量减轻、或明显的临床疾病征象，包括共济失调、呼吸困难以及后肢麻痹。当满足终点标准(提示临近动物死亡)时将小鼠处死，并且相对于不接受治疗的小鼠评价Cetux-CAR+T细胞治疗的小鼠和Nimo-CAR+T细胞治疗的小鼠的存活期。
实施例19–Nimo-CAR+T细胞抑制具有中等EGFR密度的异种移植物的生长，与Cetux-CAR+T细胞类似，但无T细胞相关毒性
U87med注射之后四天，通过BLI对小鼠成像以评价肿瘤负荷(图26A)。将小鼠分配到三个组中以均匀地分布相对肿瘤负荷，然后随机分派治疗：无治疗、Cetux-CAR+T细胞或Nimo-CAR+T细胞(图26B)。在T细胞治疗当天，通过流式细胞术分析已在EGFR+aAPC上经历3轮刺激和数值扩增的CAR+T细胞的表型以测定CAR表达以及CD8+与CD4+T细胞的比率(图26C)。CAR表达在Cetux-CAR+T细胞与Nimo-CAR+T细胞之间是相似的(分别为92％和85％)。Cetux-CAR+和Nimo-CAR+T细胞都含有CD4+与CD8+T细胞的混合物，然而Cetux-CAR+T细胞含有比Nimo-CAR+T细胞少约20％的CD8+T细胞(分别为31.8％和51.2％)。Cetux-CAR+T细胞和Nimo-CAR+T细胞两者都能够抑制肿瘤生长，如通过BLI所测定(第18天；Cetux-CAR，p<0.01和Nimo-CAR，p<0.05)(图27A、B)。在Cetux-CAR+T细胞与Nimo-CAR+T细胞控制肿瘤生长的能力之间不存在差异(p>0.05)。当所有没有接受治疗的小鼠都已死于疾病时，通过BLI评价的降低的肿瘤负荷在肿瘤注射后过去的100天内在用Cetux-CAR+T细胞治疗的3/7小鼠和用Nimo-CAR+T细胞治疗的4/7小鼠中是明显的。
Cetux-CAR+T细胞治疗的小鼠在两个独立实验的T细胞治疗的7天内展示显著的毒性，导致6/14小鼠死亡(p＝0.0006)(图28A)。总体上，Cetux-CAR+T细胞治疗与未治疗的小鼠相比在统计上没有改善存活期，可能是由于T细胞治疗后不久的早期死亡(未治疗的中值存活期＝88天，Cetux-CAR中值存活期＝105天，p＝0.19)(图28B)。有趣的是，存活曲线描绘一个拐点，在该点之前，Cetux-CAR+T细胞治疗与未治疗的小鼠相比导致缩短的存活期，而在该点之后，经受得住初始T细胞毒性的小鼠显示改善的存活期。当仅考虑经受得住初始T细胞相关毒性的小鼠时，Cetux-CAR+T细胞相对于未治疗的小鼠改善3/4小鼠(p＝0.0065)。相比之下，Nimo-CAR+T细胞在4/7小鼠中介导有效的肿瘤消退和延长存活期而没有注意到任何毒性(未治疗的中值存活期＝88天，Nimo-CAR中值存活期＝158天，p＝0.0269)。这些结果表明Cetux-CAR+T细胞和Nimo-CAR+T细胞在控制具有中等抗原密度的肿瘤的生长方面是有效的，然而，Cetux-CAR+T细胞在T细胞治疗之后不久显示明显的毒性。
实施例20–Cetux-CAR+T细胞而非Nimo-CAR+T细胞抑制具有低EGFR密度的异种移植物的生长
用U87注射小鼠，接着在四天后，通过BLI评价相对肿瘤负荷(图29A)。将相对肿瘤负荷均匀分配到三个组中并且随机分派治疗：无治疗、Cetux-CAR+T细胞或Nimo-CAR+T细胞(图29B)。在T细胞治疗当天，通过流式细胞术分析已在EGFR+aAPC上经历3轮刺激和数值扩增的CAR+T细胞的表型以测定CAR表达以及CD8+与CD4+T细胞的比率(图29C)。CAR表达在Cetux-CAR+T细胞与Nimo-CAR+T细胞之间是相似的(分别为92％和85％)。Cetux-CAR+和Nimo-CAR+T细胞都含有CD4+与CD8+T细胞的混合物，然而，Cetux-CAR+T细胞含有比Nimo-CAR+T细胞少约20％的CD8+T细胞(分别为31.8％和51.2％)。
小鼠接受T细胞治疗并且如先前所述通过BLI评价肿瘤(图25B)。用Cetux-CAR+T细胞治疗小鼠造成与未治疗的小鼠相比肿瘤负荷的明显降低(第25天，p<0.01)(图30A和30B)。相反，用Nimo-CAR+T细胞的治疗与未治疗的小鼠相比没有显著降低肿瘤负荷(Nimo-CAR，p>0.05)。在用Cetux-CAR+T细胞治疗的小鼠中降低的肿瘤负荷是瞬时的，然而，在T细胞治疗中止之后，肿瘤恢复生长。
Cetux-CAR+T细胞治疗与没有接受治疗的小鼠相比显著延长3/6小鼠中的存活期(未治疗的中值存活期＝38.5天，Cetux-CAR中值存活期＝53天，p＝0.0150)(图31)。相反，用Nimo-CAR+T细胞的治疗没有显著改善存活期(未治疗的中值存活期38.5天，Nimo-CAR中值存活期46天，p＝0.0969)。这些数据表明尽管Cetux CAR T细胞针对低抗原密度是有效的，Nimo-CAR+T细胞没有有效地识别低密度EGFR表达。
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参考文献
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序列表
<110> L·J·N·库珀(COOPER, LAURENCE J. N.)
H·G·卡鲁索(CARUSO, HILLARY GIBBONS)
S·奥利瓦雷斯(OLIVARES, SIMON)
S·安(ANG, SONNY)
<120> 嵌合抗原受体(CAR)及其制备和使用方法
<130> UTFC.P1238WO
<150> 61/983,103
<151> 2014-04-23
<150> 61/983,298
<151> 2014-04-23
<160> 16
<170> PatentIn 3.5版
<210> 1
<211> 219
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体轻链
<400> 1
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ser Ser Gln Asn Ile Val His Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Asp Trp Tyr Gln Gln Thr Pro Gly Lys Ala
35 40 45
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile
65 70 75 80
Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Phe Gln Tyr
85 90 95
Ser His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Gln Ile Thr
100 105 110
Arg Glu Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
115 120 125
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
130 135 140
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
145 150 155 160
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
165 170 175
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
180 185 190
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
195 200 205
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210 215
<210> 2
<211> 222
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体重链
<400> 2
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Tyr Ile Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Gly Ile Asn Pro Thr Ser Gly Gly Ser Asn Phe Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Thr Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Ser Thr Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Phe Tyr Phe Cys
85 90 95
Thr Arg Gln Gly Leu Trp Phe Asp Ser Asp Gly Arg Gly Phe Asp Phe
100 105 110
Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly
115 120 125
Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly
130 135 140
Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val
145 150 155 160
Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe
165 170 175
Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val
180 185 190
Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val
195 200 205
Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Pro
210 215 220
<210> 3
<211> 213
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体轻链
<400> 3
Asp Ile Leu Leu Thr Gln Ser Pro Val Ile Leu Ser Val Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Arg Val Ser Phe Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Thr Asn
20 25 30
Ile His Trp Tyr Gln Gln Arg Thr Asn Gly Ser Pro Arg Leu Leu Ile
35 40 45
Lys Tyr Ala Ser Glu Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser Ile Asn Ser Val Glu Ser
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Asn Asn Trp Pro Thr
85 90 95
Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Ala
210
<210> 4
<211> 221
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗体重链
<400> 4
Gln Val Gln Leu Lys Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Gln Pro Ser Gln
1 5 10 15
Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asn Tyr
20 25 30
Gly Val His Trp Val Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu
35 40 45
Gly Val Ile Trp Ser Gly Gly Asn Thr Asp Tyr Asn Thr Pro Phe Thr
50 55 60
Ser Arg Leu Ser Ile Asn Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Phe
65 70 75 80
Lys Met Asn Ser Leu Gln Ser Asn Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Ala Leu Thr Tyr Tyr Asp Tyr Glu Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe
115 120 125
Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu
130 135 140
Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp
145 150 155 160
Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu
165 170 175
Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser
180 185 190
Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro
195 200 205
Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser
210 215 220
<210> 5
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR序列
<400> 5
Arg Ser Ser Gln Asn Ile Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Asp
1 5 10 15
<210> 6
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR序列
<400> 6
Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser
1 5
<210> 7
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR序列
<400> 7
Phe Gln Tyr Ser His Val Pro Trp Thr
1 5
<210> 8
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR序列
<400> 8
Asn Tyr Tyr Ile Tyr
1 5
<210> 9
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR序列
<400> 9
Gly Ile Asn Pro Thr Ser Gly Gly Ser Asn Phe Asn Glu Lys Phe Lys
1 5 10 15
Thr
<210> 10
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR序列
<400> 10
Gln Gly Leu Trp Phe Asp Ser Asp Gly Arg Gly Phe Asp Phe
1 5 10
<210> 11
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR序列
<400> 11
Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Thr Asn Ile His
1 5 10
<210> 12
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR序列
<400> 12
Ala Ser Glu Ile Ser
1 5
<210> 13
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR序列
<400> 13
Gln Gln Asn Asn Asn Trp Pro Thr Thr
1 5
<210> 14
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR序列
<400> 14
Asn Tyr Gly Val His
1 5
<210> 15
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR序列
<400> 15
Val Ile Trp Ser Gly Gly Asn Thr Asp Tyr Asn Thr Pro Phe Thr Ser
1 5 10 15
<210> 16
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR序列
<400> 16
Ala Leu Thr Tyr Tyr Asp Tyr Glu Phe Ala Tyr
1 5 10

Claims (91)

1.一种经分离的转基因细胞，其包含靶向至抗原的经表达的嵌合T细胞受体(CAR)，所述CAR相对于所述抗原具有约5nM至约500nM的Kd。
2.如权利要求1所述的经分离的细胞，其中所述细胞为人细胞。
3.如权利要求1所述的经分离的细胞，其中所述抗原为CD19、CD20、ROR1、CD22癌胚抗原、甲胎蛋白、CA-125、5T4、MUC-1、上皮肿瘤抗原、前列腺特异性抗原、黑色素瘤相关抗原、突变的p53、突变的ras、HER2/Neu、叶酸结合蛋白、HIV-1包膜糖蛋白gp120、HIV-1包膜糖蛋白gp41、GD2、CD123、CD33、CD138、CD23、CD30、CD56、c-Met、间皮素、GD3、HERV-K、IL-11Rα、κ链、λ链、CSPG4、ERBB2、EGFRvIII、VEGFR2、HER2-HER3组合或HER1-HER2组合。
4.如权利要求3所述的经分离的细胞，其中所述抗原为GP240、5T4、HER1、CD-33、CD-38、VEGFR-1、VEGFR-2、CEA、FGFR3、IGFBP2、IGF-1R、BAFF-R、TACI、APRIL、Fn14、ERBB2或ERBB3。
5.如权利要求1所述的经分离的细胞，其中所述抗原为生长因子受体。
6.如权利要求5所述的经分离的细胞，其中所述抗原为EGFR、ERBB2或ERBB3。
7.如权利要求1所述的经分离的细胞，其中所述CAR相对于所述抗原具有6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20nM或更大的Kd。
8.如权利要求1所述的经分离的细胞，其中所述CAR相对于所述抗原具有约5nM至约450、400、350、300、250、200、150、100或50nM的Kd。
9.如权利要求1所述的经分离的细胞，其中所述CAR相对于所述抗原具有约5nM至50nM的Kd。
10.如权利要求1所述的经分离的细胞，其中所述抗原为EGFR。
11.如权利要求1所述的经分离的细胞，其中所述CAR包含SEQ ID NO:5-10的CDR序列。
12.如权利要求1所述的经分离的细胞，其中所述CAR包含SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2的抗原结合部分。
13.如权利要求1所述的经分离的细胞，其中编码所述CAR的DNA被整合到所述细胞的基因组中。
14.如权利要求1所述的经分离的细胞，其中编码所述CAR的DNA侧接有转座子重复序列。
15.一种药物组合物，其包含在药学上可接受的载体中的根据权利要求1-14中任一项所述的经分离的细胞。
16.如权利要求15所述的药物组合物，其包含约1x103个至1x108个的根据权利要求1-14中任一项所述的细胞。
17.一种在患有疾病的人受试者中提供T细胞应答的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的根据权利要求1所述的转基因细胞。
18.一种经分离的转基因细胞，其包含靶向至抗原的经表达的嵌合T细胞受体(CAR)，所述CAR包含西妥昔单抗的CDR序列。
19.如权利要求18所述的细胞，其中所述CAR包含SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4的抗原结合部分。
20.一种选择CAR T细胞的方法，所述方法包括：
(a)获得多个表达结合至抗原的CAR的CAR T细胞，所述多个细胞包含：
(i)对所述抗原具有不同亲和力的CAR；或
(ii)在所述细胞中以不同水平表达的CAR；
(b)评价所述细胞对表达所述抗原的对照细胞和对相对于所述对照细胞表达升高水平的抗原的靶细胞的细胞毒性活性；以及
(c)选择对靶细胞有选择性细胞毒性的CAR T细胞。
21.如权利要求20所述的方法，其还包括培养所选择的CAR T细胞以生成并扩增CAR T细胞群。
22.一种经分离的转基因人T细胞，其包含靶向至EGFR的经表达的嵌合T细胞受体(CAR)，所述CAR包含尼妥珠单抗的CDR序列，其中VL CDR1包含RSSQNIVHSNGNTYLD(SEQ IDNO:5)；VL CDR2包含KVSNRFS(SEQ ID NO:6)；VL CDR3包含FQYSHVPWT(SEQ ID NO:7)；VHCDR1包含NYYIY(SEQ ID NO:8)；VH CDR2包含GINPTSGGSNFNEKFKT(SEQ ID NO:9)并且VHCDR3包含QGLWFDSDGRGFDF(SEQ ID NO:10)，所述T细胞对EGFR-表达癌细胞展现细胞毒性。
23.一种药物组合物，其包含如权利要求22所述的经分离的转基因人T细胞。
24.一种治疗患有EGFR阳性癌症的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的根据权利要求22所述的转基因人T细胞。
25.一种经分离的转基因人T细胞，其包含靶向至EGFR的经表达的嵌合T细胞受体(CAR)，所述CAR包含西妥昔单抗的CDR序列，其中VL CDR1包含RASQSIGTNIH(SEQ ID NO:11)；VL CDR2包含ASEIS(SEQ ID NO:12)；VL CDR3包含QQNNNWPTT(SEQ ID NO:13)；VH CDR1包含NYGVH(SEQ ID NO:14)；VH CDR2包含VIWSGGNTDYNTPFTS(SEQ ID NO:15)并且VH CDR3包含ALTYYDYEFAY(SEQ ID NO:16)，所述T细胞对EGFR-表达癌细胞展现细胞毒性。
26.一种药物组合物，其包含如权利要求25所述的经分离的转基因人T细胞。
27.一种治疗患有EGFR阳性癌症的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的根据权利要求25所述的转基因人T细胞。
28.一种在有此需要的受试者中选择性地靶向表达抗原的细胞的方法，所述方法包括：
(a)培养包含结合至所述抗原的经表达的CAR的嵌合抗原受体(CAR)T细胞，所述CAR T细胞具有：
(i)只有当所述抗原被所述T细胞多价结合后的细胞毒性活性；或
(ii)相对于所述抗原具有约5nM至约500nM的Kd的CAR；以及
(b)向所述受试者施用有效量的所培养的CAR T细胞以提供选择性地靶向具有升高的所述抗原表达的细胞的T细胞应答。
29.一种在有此需要的受试者中选择性地靶向表达抗原的细胞的方法，所述方法包括：
(a)选择包含结合至所述抗原的经表达的CAR的嵌合抗原受体(CAR)T细胞，所述CAR T细胞具有：
(i)只有当所述抗原被所述T细胞多价结合后的细胞毒性活性；或
(ii)相对于所述抗原具有约5nM至约500nM的Kd的CAR；以及
(b)向所述受试者施用有效量的所选择的CAR T细胞以提供选择性地靶向具有升高的所述抗原表达的细胞的T细胞应答。
30.一种治疗有此需要的受试者的癌症的方法，所述方法包括：
施用包含有效量的嵌合抗原受体(CAR)T细胞的组合物以提供选择性地靶向具有升高的抗原表达的癌细胞的T细胞应答，其中所述CAR T细胞包含结合至所述抗原的经表达的CAR，所述CAR T细胞具有：
(i)只有当所述抗原被所述T细胞多价结合后的细胞毒性活性；或
(ii)相对于所述抗原具有约5nM至约500nM的Kd的CAR。
31.如权利要求28-30中任一项所述的方法，其中所述抗原为CD19、CD20、ROR1、CD22癌胚抗原、甲胎蛋白、CA-125、5T4、MUC-1、上皮肿瘤抗原、前列腺特异性抗原、黑色素瘤相关抗原、突变的p53、突变的ras、HER2/Neu、叶酸结合蛋白、HIV-1包膜糖蛋白gp120、HIV-1包膜糖蛋白gp41、GD2、CD123、CD33、CD138、CD23、CD30、CD56、c-Met、间皮素、GD3、HERV-K、IL-11Rα、κ链、λ链、CSPG4、ERBB2、EGFRvIII、VEGFR2、HER2-HER3组合或HER1-HER2组合。
32.如权利要求30所述的方法，其中所述抗原为GP240、5T4、HER1、CD-33、CD-38、VEGFR-1、VEGFR-2、CEA、FGFR3、IGFBP2、IGF-1R、BAFF-R、TACI、APRIL、Fn14、ERBB2或ERBB3。
33.如权利要求28-30中任一项所述的方法，其中所述抗原为生长因子受体。
34.如权利要求33所述的方法，其中所述抗原为EGFR、ERBB2或ERBB3。
35.如权利要求28或29中任一项所述的方法，其中所述表达抗原的细胞包括表达所述抗原的非癌细胞和具有升高的所述抗原表达的癌细胞。
36.如权利要求28-30中任一项所述的方法，其中所述CAR相对于所述抗原具有6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20nM或更大的Kd。
37.如权利要求28-30中任一项所述的方法，其中所述CAR相对于所述抗原具有约5nM至约450、400、350、300、250、200、150、100或50nM的Kd。
38.如权利要求28-30中任一项所述的方法，其中所述CAR相对于所述抗原具有约5nM至50nM的Kd。
39.如权利要求28-30中任一项所述的方法，其中所述抗原为EGFR。
40.如权利要求39所述的方法，其中所述CAR包含尼妥珠单抗的CDR序列。
41.如权利要求40所述的方法，其中所述CAR包含SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2的抗原结合部分。
42.如权利要求28-30中任一项所述的方法，其中所选择或培养的CAR T细胞被灭活用于表达内源性T细胞受体和/或内源性HLA。
43.如权利要求28-30中任一项所述的方法，其中所选择或培养的CAR T细胞还包含编码膜结合的Cγ细胞因子的经表达的核酸。
44.如权利要求43所述的方法，其中所述膜结合的Cγ细胞因子为膜结合的IL-7、IL-15或IL-21。
45.如权利要求43所述的方法，其中所述膜结合的Cγ细胞因子为IL-15-IL-15Rα融合蛋白。
46.如权利要求28-30中任一项所述的方法，其中所选择或培养的CAR T细胞包含编码所述CAR的经整合的DNA。
47.如权利要求28-30中任一项所述的方法，其中所选择或培养的CAR T细胞包含编码所述CAR的外源mRNA。
48.如权利要求46所述的方法，其中所述编码所述CAR的经整合的DNA侧接有转座子重复序列。
49.如权利要求28-30中任一项所述的方法，其中选择或培养CAR T细胞还包括用编码相对于所述抗原具有约5nM至约500nM的Kd的所选择的CAR的DNA转染T细胞或T细胞祖细胞。
50.如权利要求49所述的方法，其还包括用侧接有转座子重复序列的编码所选择的或培养的CAR的DNA和转座酶转染所述细胞，所述转座酶有效地将编码所选择的或培养的CAR的DNA整合到所述细胞的基因组中。
51.如权利要求50所述的方法，其中所述转座酶被提供为mRNA。
52.如权利要求50所述的方法，其中所述转座酶被提供为多肽或可表达的RNA。
53.如权利要求50所述的方法，其中所述转座酶是鲑鱼型Tc1样转座酶(SB)。
54.如权利要求28所述的方法，其中培养或选择所述CAR T细胞包括在抗原呈递细胞存在下培养所述CAR T细胞。
55.如权利要求28所述的方法，其中所述抗原呈递细胞包括树突细胞。
56.如权利要求28所述的方法，其中所述抗原呈递细胞包括刺激所述CAR T细胞扩增的人工抗原呈递细胞(aAPC)。
57.如权利要求56所述的方法，其中所述aAPC为转基因K562细胞。
58.如权利要求56所述的方法，其中所述aAPC包含(i)由在所述转基因CAR细胞上表达的CAR靶向的抗原；(ii)CD64；(ii)CD86；(iii)CD137L；和/或(v)在所述aAPC的表面上表达的膜结合的IL-15。
59.如权利要求56所述的方法，其中所述aAPC包含在所述aAPC表面上表达的CAR结合抗体或其片段。
60.如权利要求56所述的方法，其中所述aAPC包含激活或共刺激T细胞的额外分子。
61.如权利要求60所述的方法，其中所述额外分子包含膜结合的Cγ细胞因子。
62.如权利要求54所述的方法，其中所述抗原呈递细胞被灭活。
63.如权利要求62所述的方法，其中所述抗原呈递细胞被辐照。
64.如权利要求54所述的方法，其中所述抗原呈递细胞已被测试和证实不含感染性材料。
65.如权利要求54所述的方法，其中在抗原呈递细胞存在下培养所述CAR T细胞包括在包含IL-21和/或IL-2的培养基中培养所述转基因CAR细胞。
66.如权利要求54所述的方法，其中在抗原呈递细胞存在下培养所述CAR T细胞包括以约10:1至约1:10的比率(CAR T细胞比抗原呈递细胞)培养所述细胞。
67.如权利要求28所述的方法，其中培养所述转基因细胞不超过7、14、21、28、35或42天。
68.如权利要求49所述的方法，其中所述T细胞或T细胞祖细胞是从细胞库中获得的。
69.如权利要求49所述的方法，其中所述T细胞或T细胞祖细胞是从受试者的样品中获得的。
70.如权利要求69所述的方法，其中所述样品为单核细胞级分。
71.如权利要求69所述的方法，其中所述样品为冷冻保存的样品。
72.如权利要求69所述的方法，其中所述样品来自于脐带血。
73.如权利要求69所述的方法，其中所述样品为来自于受试者的外周血样品。
74.如权利要求69所述的方法，其中所述样品为T细胞亚群。
75.如权利要求49所述的方法，其中转染所述T细胞或T细胞祖细胞包括将编码所选择的CAR的DNA电穿孔到所述细胞中。
76.如权利要求49所述的方法，其中转染所述T细胞或T细胞祖细胞包括用编码所选择的CAR的病毒载体转导所述细胞。
77.如权利要求28-30中任一项所述的方法，其中选择或培养嵌合抗原受体(CAR)T细胞还包括在所述施用之前纯化或富集CAR T细胞。
78.如权利要求77所述的方法，其中所述富集包括荧光激活细胞分选(FACS)。
79.如权利要求77所述的方法，其中所述富集包括对所选择的CAR T细胞的分选。
80.如权利要求77所述的方法，其中所述富集包括在顺磁珠上对所选择的CAR T细胞的分选。
81.如权利要求79所述的方法，其中对CAR-表达细胞的分选包括使用CAR-结合抗体。
82.如权利要求77所述的方法，其中所述富集包括CD56+细胞的耗竭。
83.如权利要求28-30中任一项所述的方法，其还包括在所述施用之前冷冻保存所述CAR T细胞的样品。
84.如权利要求28所述的方法，其中所述受试者患有细胞增殖性疾病。
85.如权利要求84所述的方法，其中所述细胞增殖性疾病为自体免疫疾病并且其中所述CAR结合至在自体免疫细胞中以升高水平表达的抗原。
86.如权利要求84所述的方法，其中所述细胞增殖性疾病为癌症。
87.如权利要求30所述的方法，其中所述受试者已经历先前的抗癌疗法。
88.如权利要求87所述的方法，其中所述受试者处于缓解中。
89.如权利要求87所述的方法，其中所述受试者没有癌症症状但包含可检测的癌细胞。
90.如权利要求86所述的方法，其中所述癌症为神经胶质瘤。
91.如权利要求90所述的方法，其中所述神经胶质瘤为弥漫性内生性脑桥胶质瘤。
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