CN106967684A - 共表达抗EGFRvIII嵌合抗原受体和无功能EGFR受体的转基因淋巴细胞及其用途 - Google Patents
共表达抗EGFRvIII嵌合抗原受体和无功能EGFR受体的转基因淋巴细胞及其用途 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提出了一种转基因淋巴细胞、一种构建体和一种治疗癌症的治疗组合物，该转基因淋巴细胞表达无功能EGFR受体以及表达嵌合抗原受体。该转基因淋巴细胞具有对肿瘤细胞的定向杀伤能力，尤其具有对EGFRvIII突变的脑胶质母细胞瘤定向杀伤作用。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药领域，具体地，本发明涉及一种T淋巴细胞、一种慢病毒、一种转基因淋巴细胞、一种构建体、一种用于治疗癌症的治疗组合物和一种提高淋巴细胞治疗安全性的方法。
背景技术
脑胶质母细胞瘤是恶性度最高的脑瘤，占中枢神经系统恶性肿瘤的～81％，恶性胶质瘤的发病率为3-6/10万,每年中国因此病死亡人数为3万人。恶性胶质瘤呈浸润性生长，与正常脑组织无明显界限，并且多数不限于一个脑叶，呈指状深入破坏脑组织，手术不可能完全切除。虽然母前采用了最为积极的治疗手段，但中位生存期仍只有<15个月，单独使用放疗，仅有不足1％的患者可以存活5年，即使新出现的放疗与替莫唑胺(TMZ)化疗的联用方案，也只使近10％患者存活至5年以上。
由此可见，开发有效治疗脑胶质母细胞瘤的方法尤为迫切.
发明内容
本申请是基于发明人对以下事实和问题的发现和认识作出的：
EGFR突变体EGFRvIII(EGFR胞外段的267个氨基酸被去除，其是由EGFR基因的第2～7个外显子(275～1075位核苷酸)去除后的基因编码的)在约30％的胶质母细胞瘤患者中表达，但在正常组织中未检测到，因此，EGFRvIII可代表胶质母细胞瘤的特异性突变。
无功能EGFR受体缺少N-端配体结合区和细胞内受体酪氨酸激酶活性，但包括野生型EGFR受体的跨膜区和完整的与抗EGFR抗体结合的序列，无功能EGFR受体可作为淋巴细胞的自杀标记。
基于上述发现，发明人提出了一种编码无功能EGFR的核酸分子和编码嵌合抗原受体的核酸分子的构建体和一种以此构建体导入后形成的转基因淋巴细胞，其编码的嵌合抗原受体特异性结合抗原EGFRvIII。因此，本发明提出的构建体和转基因淋巴细胞具有对脑胶质母细胞瘤细胞的特异杀伤能力，并且免疫杀伤安全性高。
在本发明的第一方面，本发明提出了一种T淋巴细胞。根据本发明的实施例，所述T淋巴细胞的表达无功能EGFR受体；以及表达嵌合抗原受体，其中，所述嵌合抗原受体包括：胞外区，所述胞外区包括单链抗体的重链可变区和轻链可变区，所述单链抗体特异性识别抗原EGFRvIII；跨膜区，所述跨膜区与所述胞外区相连，并且嵌入到所述T淋巴细胞的细胞膜中；胞内区，所述胞内区与所述跨膜区相连，并且所述胞内区包括CD28或4-1BB的胞内段以及CD3ζ链。无功能EGFR受体缺少N-端配体结合区和细胞内受体酪氨酸激酶活性，但包括野生型EGFR受体的跨膜区和完整的与抗EGFR抗体结合的序列，无功能EGFR受体可作为淋巴细胞的自杀标记。本发明实施例的T淋巴细胞具有对EGFRvIII突变的脑胶质母细胞瘤的定向杀伤作用，且安全性高。
在本发明的第二方面，本发明提出了一种慢病毒。根据本发明的实施例，所述慢病毒携带下列核酸分子：编码嵌合抗原受体的核酸分子，所述嵌合抗原受体具有SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列，所述编码嵌合抗原受体的核酸分子具有SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列；以及编码无功能EGFR受体的核酸分子，所述无功能EGFR受体具有SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列，所述编码无功能EGFR受体的核酸分子具有SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列。
M A L P V T A L L L P L A L L L H A A R P G S D I Q M T Q S P S S L S A S V G D R V TI T C R A S Q G I R N N L A W Y Q Q K P G K A P K R L I Y A A S N L Q S G V P S R F T G SG S G T E F T L I V S S L Q P E D F A T Y Y C L Q H H S Y P L T S G G G T K V E I K R T GS T S G S G K P G S G E G S E V Q V L E S G G G L V Q P G G S L R L S C A A S G F T F SS Y A M S W V R Q A P G K G L E W V S A I S G S G G S T N Y A D S V K G R F T I S R D NS K N T L Y L Q M N S L R A E D T A V Y Y C A G S S G W S E Y W G Q G T L V T V S S AA A F V P V F L P A K P T T T P A P R P P T P A P T I A S Q P L S L R P E A C R P A A G G AV H T R G L D F A C D I Y I W A P L A G T C G V L L L S L V I T L Y C N H R N K R G R KK L L Y I F K Q P F M R P V Q T T Q E E D G C S C R F P E E E E G G C E L R V K F S R SA D A P A Y Q Q G Q N Q L Y N E L N L G R R E E Y D V L D K R R G R D P E M G G K P RR K N P Q E G L Y N E L Q K D K M A E A Y S E I G M K G E R R R G K G H D G L Y Q GL S T A T K D T Y D A L H M Q A L P P R(SEQ ID NO：1)。
ATGGCCTTACCAGTGACCGCCTTGCTCCTGCCGCTGGCCTTGCTGCTCCACGCCGCCAGGCCGGGATCCGACATCCAGATGACCCAGAGCCCTAGCAGCCTGAGCGCCAGCGTGGGCGACAGAGTGACCATCACCTGTCGGGCCAGCCAGGGCATCAGAAACAACCTGGCCTGGTATCAGCAGAAGCCCGGCAAGGCCCCCAAGAGACTGATCTACGCTGCCAGCAATCTGCAGAGCGGCGTGCCCAGCAGATTCACCGGAAGCGGCTCCGGCACCGAGTTCACCCTGATCGTGTCCAGCCTGCAGCCCGAGGACTTCGCCACCTACTACTGCCTGCAGCACCACAGCTACCCTCTGACCAGCGGCGGAGGCACCAAGGTGGAGATCAAGCGGACCGGCAGCACCAGCGGCAGCGGCAAGCCTGGCAGCGGCGAGGGAAGCGAGGTCCAGGTGCTGGAATCTGGCGGCGGACTGGTGCAGCCTGGCGGCAGCCTGAGACTGAGCTGTGCCGCCAGCGGCTTCACCTTCAGCAGCTACGCCATGTCTTGGGTCCGGCAGGCTCCTGGAAAGGGCCTGGAATGGGTGTCCGCCATCAGCGGCTCTGGCGGCTCCACCAACTACGCCGACAGCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCAGCCGGGACAACAGCAAGAACACCCTGTATCTGCAGATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGTGCCGGCAGCAGCGGGTGGAGCGAGTACTGGGGCCAGGGCACACTGGTCACAGTGTCTAGCGCGGCCGCATTCGTGCCGGTCTTCCTGCCAGCGAAGCCCACCACGACGCCAGCGCCGCGACCACCAACACCGGCGCCCACCATCGCGTCGCAGCCCCTGTCCCTGCGCCCAGAGGCGTGCCGGCCAGCGGCGGGGGGCGCAGTGCACACGAGGGGGCTGGACTTCGCCTGTGATATCTACATCTGGGCGCCCTTGGCCGGGACTTGTGGGGTCCTTCTCCTGTCACTGGTTATCACCCTTTACTGCAACCACAGGAACAAACGGGGCAGAAAGAAACTCCTGTATATATTCAAACAACCATTTATGAGACCAGTACAAACTACTCAAGAGGAAGATGGCTGTAGCTGCCGATTTCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAACTGAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGCTAA(SEQ ID NO：2)。
M A L P V T A L L L P L A L L L H A A R P G S R K V C N G I G I G E F K D S L S I N AT N I K H F K N C T S I S G D L H I L P V A F R G D S F T H T P P L D P Q E L D I L K T VK E I T G F L L I Q A W P E N R T D L H A F E N L E I I R G R T K Q H G Q F S L A V V S LN I T S L G L R S L K E I S D G D V I I S G N K N L C Y A N T I N W K K L F G T S G Q K TK I I S N R G E N S C K A T G Q V C H A L C S P E G C W G P E P R D C V S C R N V S R GR E C V D K C N L L E G E P R E F V E N S E C I Q C H P E C L P Q A M N I T C T G R G PD N C I Q C A H Y I D G P H C V K T C P A G V M G E N N T L V W K Y A D A G H V C H LC H P N C T Y G C T G P G L E G C P T N G P K I P S I A T G M V G A L L L L L V V A L G IG L F M R R(SEQ ID NO：3)。
ATGGCTCTGCCCGTCACCGCTCTGCTGCTGCCTCTGGCTCTGCTGCTGCACGCCGCACGCCCTGGGAGTCGCAAAGTCTGTAATGGGATCGGCATCGGCGAGTTCAAGGACAGCCTGTCCATCAACGCCACCAATATCAAGCACTTTAAGAATTGCACATCTATCAGCGGCGACCTGCACATCCTGCCAGTGGCCTTCCGGGGCGATTCTTTTACCCACACACCCCCTCTGGACCCTCAGGAGCTGGATATCCTGAAGACCGTGAAGGAGATCACAGGCTTCCTGCTGATCCAGGCCTGGCCTGAGAACAGAACCGATCTGCACGCCTTTGAGAATCTGGAGATCATCCGGGGCAGAACAAAGCAGCACGGCCAGTTCTCCCTGGCCGTGGTGTCTCTGAACATCACCAGCCTGGGCCTGAGGTCCCTGAAGGAGATCTCTGACGGCGATGTGATCATCTCCGGCAACAAGAACCTGTGCTACGCCAACACAATCAATTGGAAGAAGCTGTTTGGCACCTCTGGCCAGAAGACAAAGATCATCTCTAACCGGGGCGAGAATAGCTGCAAGGCAACCGGACAGGTGTGCCACGCACTGTGCAGCCCAGAGGGATGTTGGGGCCCAGAGCCACGGGACTGCGTGAGCTGTAGAAACGTGTCCAGGGGCCGCGAGTGCGTGGATAAGTGTAATCTGCTGGAGGGCGAGCCAAGGGAGTTCGTGGAGAACTCCGAGTGCATCCAGTGTCACCCCGAGTGCCTGCCTCAGGCCATGAACATCACCTGTACAGGCCGCGGCCCCGACAATTGCATCCAGTGTGCCCACTATATCGATGGCCCTCACTGCGTGAAGACCTGTCCAGCCGGCGTGATGGGCGAGAACAATACACTGGTGTGGAAGTACGCAGACGCAGGACACGTGTGCCACCTGTGCCACCCCAATTGCACCTATGGCTGTACAGGACCAGGCCTGGAGGGATGCCCAACCAACGGCCCTAAGATCCCAAGCATCGCCACAGGCATGGTGGGGGCACTGCTGCTGCTGCTGGTGGTGGCTCTGGGGATTGGGCTGTTTATGAGAAGGTAA(SEQ ID NO：4)。
根据本发明的实施例，将本发明实施例的慢病毒导入淋巴细胞所得的转基因淋巴细胞，其具有对肿瘤细胞的特意性杀伤能力尤其具有对EGFRvIII突变的脑胶质母细胞瘤定向杀伤作用，且安全性高。
在本发明的第三方面，本发明提出了一种慢病毒。根据本发明的实施例，所述慢病毒携带含有SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列
ATGGCCTTACCAGTGACCGCCTTGCTCCTGCCGCTGGCCTTGCTGCTCCACGCCGCCAGGCCGGGATCCGACATCCAGATGACCCAGAGCCCTAGCAGCCTGAGCGCCAGCGTGGGCGACAGAGTGACCATCACCTGTCGGGCCAGCCAGGGCATCAGAAACAACCTGGCCTGGTATCAGCAGAAGCCCGGCAAGGCCCCCAAGAGACTGATCTACGCTGCCAGCAATCTGCAGAGCGGCGTGCCCAGCAGATTCACCGGAAGCGGCTCCGGCACCGAGTTCACCCTGATCGTGTCCAGCCTGCAGCCCGAGGACTTCGCCACCTACTACTGCCTGCAGCACCACAGCTACCCTCTGACCAGCGGCGGAGGCACCAAGGTGGAGATCAAGCGGACCGGCAGCACCAGCGGCAGCGGCAAGCCTGGCAGCGGCGAGGGAAGCGAGGTCCAGGTGCTGGAATCTGGCGGCGGACTGGTGCAGCCTGGCGGCAGCCTGAGACTGAGCTGTGCCGCCAGCGGCTTCACCTTCAGCAGCTACGCCATGTCTTGGGTCCGGCAGGCTCCTGGAAAGGGCCTGGAATGGGTGTCCGCCATCAGCGGCTCTGGCGGCTCCACCAACTACGCCGACAGCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCAGCCGGGACAACAGCAAGAACACCCTGTATCTGCAGATGAACAGCCTGAGAGCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGTGCCGGCAGCAGCGGGTGGAGCGAGTACTGGGGCCAGGGCACACTGGTCACAGTGTCTAGCGCGGCCGCATTCGTGCCGGTCTTCCTGCCAGCGAAGCCCACCACGACGCCAGCGCCGCGACCACCAACACCGGCGCCCACCATCGCGTCGCAGCCCCTGTCCCTGCGCCCAGAGGCGTGCCGGCCAGCGGCGGGGGGCGCAGTGCACACGAGGGGGCTGGACTTCGCCTGTGATATCTACATCTGGGCGCCCTTGGCCGGGACTTGTGGGGTCCTTCTCCTGTCACTGGTTATCACCCTTTACTGCAACCACAGGAACAAACGGGGCAGAAAGAAACTCCTGTATATATTCAAACAACCATTTATGAGACCAGTACAAACTACTCAAGAGGAAGATGGCTGTAGCTGCCGATTTCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAACTGAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGCTAATCCTACTGCGTCGACTTCGAATTTAAATCGGATCCGCGGCCGCGCCCCTCTCCCTCCCCCCCCCCTAACGTTACTGGCCGAAGCCGCTTGGAATAAGGCCGGTGTGCGTTTGTCTATATGTTATTTTCCACCATATTGCCGTCTTTTGGCAATGTGAGGGCCCGGAAACCTGGCCCTGTCTTCTTGACGAGCATTCCTAGGGGTCTTTCCCCTCTCGCCAAAGGAATGCAAGGTCTGTTGAATGTCGTGAAGGAAGCAGTTCCTCTGGAAGCTTCTTGAAGACAAACAACGTCTGTAGCGACCCTTTGCAGGCAGCGGAACCCCCCACCTGGCGACAGGTGCCTCTGCGGCCAAAAGCCACGTGTATAAGATACACCTGCAAAGGCGGCACAACCCCAGTGCCACGTTGTGAGTTGGATAGTTGTGGAAAGAGTCAAATGGCTCTCCTCAAGCGTATTCAACAAGGGGCTGAAGGATGCCCAGAAGGTACCCCATTGTATGGGATCTGATCTGGGGCCTCGGTGCACATGCTTTACATGTGTTTAGTCGAGGTTAAAAAAACGTCTAGGCCCCCCGAACCACGGGGACGTGGTTTTCCTTTGAAAAACACGATGATAATATGGCCACAACCATGGCGTCCGGATCTAGAATGGCTCTGCCCGTCACCGCTCTGCTGCTGCCTCTGGCTCTGCTGCTGCACGCCGCACGCCCTGGGAGTCGCAAAGTCTGTAATGGGATCGGCATCGGCGAGTTCAAGGACAGCCTGTCCATCAACGCCACCAATATCAAGCACTTTAAGAATTGCACATCTATCAGCGGCGACCTGCACATCCTGCCAGTGGCCTTCCGGGGCGATTCTTTTACCCACACACCCCCTCTGGACCCTCAGGAGCTGGATATCCTGAAGACCGTGAAGGAGATCACAGGCTTCCTGCTGATCCAGGCCTGGCCTGAGAACAGAACCGATCTGCACGCCTTTGAGAATCTGGAGATCATCCGGGGCAGAACAAAGCAGCACGGCCAGTTCTCCCTGGCCGTGGTGTCTCTGAACATCACCAGCCTGGGCCTGAGGTCCCTGAAGGAGATCTCTGACGGCGATGTGATCATCTCCGGCAACAAGAACCTGTGCTACGCCAACACAATCAATTGGAAGAAGCTGTTTGGCACCTCTGGCCAGAAGACAAAGATCATCTCTAACCGGGGCGAGAATAGCTGCAAGGCAACCGGACAGGTGTGCCACGCACTGTGCAGCCCAGAGGGATGTTGGGGCCCAGAGCCACGGGACTGCGTGAGCTGTAGAAACGTGTCCAGGGGCCGCGAGTGCGTGGATAAGTGTAATCTGCTGGAGGGCGAGCCAAGGGAGTTCGTGGAGAACTCCGAGTGCATCCAGTGTCACCCCGAGTGCCTGCCTCAGGCCATGAACATCACCTGTACAGGCCGCGGCCCCGACAATTGCATCCAGTGTGCCCACTATATCGATGGCCCTCACTGCGTGAAGACCTGTCCAGCCGGCGTGATGGGCGAGAACAATACACTGGTGTGGAAGTACGCAGACGCAGGACACGTGTGCCACCTGTGCCACCCCAATTGCACCTATGGCTGTACAGGACCAGGCCTGGAGGGATGCCCAACCAACGGCCCTAAGATCCCAAGCATCGCCACAGGCATGGTGGGGGCACTGCTGCTGCTGCTGGTGGTGGCTCTGGGGATTGGGCTGTTTATGAGAAGGTAA(SEQ ID NO：5).
根据本发明的实施例，将本发明实施例的慢病毒导入淋巴细胞所得的转基因淋巴细胞，具有对肿瘤细胞的定向杀伤能力，尤其具有对EGFRvIII突变的脑胶质母细胞瘤定向杀伤作用,并且安全性高。
在本发明的第四方面，本发明提出了一种转基因淋巴细胞。根据本发明的实施例，所述淋巴细胞细胞表达无功能EGFR受体；以及表达嵌合抗原受体。发明人惊奇的发现，表达无功能EGFR受体和表达嵌合抗原受体的淋巴细胞具有对肿瘤细胞的特异性杀伤能力，尤其具有对EGFRvIII突变的脑胶质母细胞瘤的定向杀伤作用，且安全性高。
根据本发明的实施例，上述转基因淋巴细胞还可以具有下列附加技术特征至少之一：
根据本发明的实施例，所述嵌合抗原受体包括：胞外区，所述胞外区能够与抗原特异性结合；跨膜区；以及胞内区，所述胞内区包括免疫共刺激分子胞内段。具有上述结构的嵌合抗原受体的存在，进一步提高了本发明实施例的转基因淋巴细胞的靶向定位，进一步提高了本发明实施例的转基因淋巴细胞对抗原表达肿瘤细胞的定向杀伤作用。
根据本发明的实施例，所述抗原是肿瘤抗原。因此，本发明实施例的转基因淋巴细胞对肿瘤的定向杀伤作用更加显著。
根据本发明的实施例，所述胞外区包括抗体的重链可变区和轻链可变区，所述抗体结合所述抗原。抗原抗体的特异性结合作用，进一步提高了本发明实施例的转基因淋巴细胞的靶向定位和对表达抗原的肿瘤细胞的定向杀伤作用。
根据本发明的实施例，所述抗体为单链抗体。单链抗体可去除非特异性反应的竞争性表面蛋白，同时单链抗体更易渗透肿瘤组织增加药物治疗浓度。本发明实施例的转基因淋巴细胞表达单链抗体的嵌合抗原受体，进一步提高了本发明实施例的转基因淋巴细胞对靶向肿瘤细胞的定向杀伤作用。
根据本发明的实施例，所述抗原为EGFRvIII。因此所述转基因淋巴细胞针对表达抗原EGFRvIII的细胞具有定向性杀伤作用，抗原抗体的特异性结合作用更强，大大提高了本发明实施例的转基因淋巴细胞对EGFRvIII抗原表达肿瘤细胞的定向杀伤作用。
根据本发明的实施例，所述免疫共刺激分子胞内段独立地选自4-1BB、OX-40、CD40L、CD27、CD30、CD28以及他们的衍生物的至少一种。本发明实施例的免疫共刺激分子胞内段的表达具有正向调控和增强细胞免疫应答的作用，使得本发明实施例的转基因淋巴细胞对肿瘤的定向杀伤作用效果进一步提高；本发明实施例的免疫共刺激分子胞内段的表达以及无功能EGFR受体的表达的联合，使得本发明实施例的转基因淋巴细胞增殖对肿瘤的具有更加显著的定向杀伤作用，且更加安全。
根据本发明的实施例，所述免疫共刺激分子胞内段是4-1BB或CD28的胞内段。本发明中的转基因淋巴细胞的嵌合抗原受体的免疫共刺激分子胞内段是CD28或者4-1BB的胞内段。根据本发明的实施例，免疫共刺激分子胞内段是CD28或者4-1BB的胞内段，进一步增强了本发明实施例的转基因淋巴细胞的定向杀伤作用。
根据本发明的实施例，本发明实施例的转基因淋巴细胞表达的无功能EGFR受体缺少N-端配体结合区和细胞内受体酪氨酸激酶活性，但包括野生型EGFR受体的跨膜区和完整的与抗EGFR抗体结合的结构域，无功能EGFR受体可作为本发明实施例的转基因淋巴细胞的自杀标记。无功能EGFR受体的表达，联合嵌合抗原受体的表达可在有效保证转基因淋巴细胞的靶向杀伤作用的前提下，如果病人出现严重不良反应，转基因淋巴细胞可被抗EGFR抗体清除，进而可进一步提高本发明实施例的转基因淋巴细胞治疗EGFRvIII突变的肿瘤病人的安全性。
根据本发明的实施例，所述淋巴细胞是CD3+T淋巴细胞或自然杀伤细胞或自然杀伤T细胞。本发明实施例的上述淋巴细胞表达无功能EGFR受体，同时表达抗原特异性的嵌合抗原受体，如本发明的实施例的EGFRvIII抗原特异性的嵌合抗原受体，上述淋巴细胞具有对肿瘤的定向杀伤作用，且安全性更高。
在本发明的第五方面，本发明提出了一种构建体。根据本发明的实施例，所述构建体包括：第一核酸分子，所述第一核酸分子编码嵌合抗原受体；以及第二核酸分子，所述第二核酸分子编码无功能EGFR受体。其中，所述嵌合抗原受体、所述无功能EGFR受体如前所述。根据本发明的实施例，本发明实施例的构建体成功导入本发明实施例的淋巴细胞后，可高效表达无功能EGFR受体和表达抗原特异性的嵌合抗原受体，从而本发明实施例的淋巴细胞具有对肿瘤细胞，尤其对EGFRvIII突变的肿瘤细胞的具有定向杀伤作用，且安全性高。
根据本发明的实施例，上述构建体还可以进一步包括下列附加技术特征至少之一：
根据本发明的实施例，其特征在于所述第一核酸分子与所述第二核酸分子被设置在前面所述的淋巴细胞中表达所述嵌合抗原受体和表达无功能EGFR受体,并且所述嵌合抗原受体与所述无功能EGFR受体呈非融合形式。根据本发明的实施例，成功设置了上述第一核酸分子以及第二核酸分子的淋巴细胞，其淋巴细胞表面成功表达无功能EGFR受体，同时在淋巴细胞表面成功表达了抗原特异性，如本发明实施例的EGFRvIII特异性的嵌合抗原受体，且嵌合抗原受体与无功能EGFR受体在淋巴细胞膜上呈非融合形式，本发明实施例的淋巴细胞具特异性强的肿瘤杀伤效果，安全性更高。
根据本发明的实施例，所述构建体进一步包括：第一启动子，所述第一启动子与所述第一核酸分子可操作地连接；以及第二启动子，所述第二启动子与所述第二核酸分子可操作地连接。根据本发明的实施例，第一启动子以及第二启动子的引入，使得第一核酸分子以及第二核酸分子分别独立的表达，有效保证了嵌合抗原受体抗原靶向性的生物学作用及以有效表达了无功能EGFR受体，从而有效保证了本发明实施例的淋巴细胞的对肿瘤的靶向杀伤作用，尤其是对EGFRvIII突变的肿瘤细胞的定向杀伤，且保证了免疫杀伤的安全性。
根据本发明的实施例，所述第一启动子、所述第二启动子分别独立地选自CMV，EF-1,LTR,RSV启动子。根据本发明的实施例，本发明实施例的上述启动子具有启动效率高、特异性强的特点，从而保证了无功能EGFR受体的高效表达和嵌合抗原受体的高效表达，从而高效保证了本发明实施例的淋巴细胞对肿瘤的定向杀伤效果和杀伤安全性。
根据本发明的实施例，所述构建体进一步包括：内部核糖体进入位点序列，所述内部核糖体进入位点序列设置在所述第一核酸分子与所述第三核酸分子之间，所述内部核糖体进入位点具有SEQ ID NO：6所示的核苷酸序列。
TTTAAATCGGATCCGCGGCCGCGCCCCTCTCCCTCCCCCCCCCCTAACGTTACTGGCCGAAGCCGCTTGGAATAAGGCCGGTGTGCGTTTGTCTATATGTTATTTTCCACCATATTGCCGTCTTTTGGCAATGTGAGGGCCCGGAAACCTGGCCCTGTCTTCTTGACGAGCATTCCTAGGGGTCTTTCCCCTCTCGCCAAAGGAATGCAAGGTCTGTTGAATGTCGTGAAGGAAGCAGTTCCTCTGGAAGCTTCTTGAAGACAAACAACGTCTGTAGCGACCCTTTGCAGGCAGCGGAACCCCCCACCTGGCGACAGGTGCCTCTGCGGCCAAAAGCCACGTGTATAAGATACACCTGCAAAGGCGGCACAACCCCAGTGCCACGTTGTGAGTTGGATAGTTGTGGAAAGAGTCAAATGGCTCTCCTCAAGCGTATTCAACAAGGGGCTGAAGGATGCCCAGAAGGTACCCCATTGTATGGGATCTGATCTGGGGCCTCGGTGCACATGCTTTACATGTGTTTAGTCGAGGTTAAAAAAACGTCTAGGCCCCCCGAACCACGGGGACGTGGTTTTCCTTTGAAAAACACGATGATAATATGGCCACAACCATGGCG(SEQ ID NO：6).
内部核糖体进入位点序列的引入使得第一核酸分子和第二核酸分子分别独立的表达。根据本发明的实施例，内部核糖体进入位点序列的引入保证了嵌合抗原受体抗原靶向性的生物学作用和无功能EGFR受体的高效表达，进而使得本发明实施例的淋巴细胞对肿瘤的定向杀伤效果更加显著，淋巴细胞对肿瘤杀伤的安全性更高。
根据本发明的实施例，所述构建体进一步包括：第三核酸分子，设置在所述第一核酸分子与所述第二核酸分子之间，并且所述第三核酸分子编码连接肽，所述连接肽能够在所述淋巴细胞中被切割。编码连接肽的第三核酸分子的引入使得无功能EGFR受体和嵌合抗原受体成非融合状态的形式表达在淋巴细胞膜上，进而进一步保证了无功能EGFR受体和嵌合抗原受体的生物学作用，本发明实施例的淋巴细胞具有特异性更强的肿瘤杀伤效果，安全性更高。
根据本发明的实施例，所述连接肽具有SEQ ID NO：7所示的氨基酸序列。
GSGATNFSLLKQAGDVEENPGP(SEQ ID NO：7)。
SEQ ID NO：7所示的氨基酸序列是手足口病毒(一种小RNA病毒)的2A肽段。连接肽的引入使得无功能EGFR受体和嵌合抗原受体成非融合状态表达在淋巴细胞膜上。根据本发明的实施例，连接肽的引入保证了无功能EGFR受体和嵌合抗原受体的生物学作用，本发明实施例的淋巴细胞具特异性更强的肿瘤杀伤效果，安全性更高。
根据本发明的实施例，所述构建体的载体是非致病性病毒载体。非致病性病毒载体的引入大大提高了构建体在淋巴细胞中的复制和扩增效率，从而大大提高了无功能EGFR受体的表达和嵌合抗原受体在淋巴细胞中的高效表达，使得淋巴细胞的靶向作用进一步增强,安全性进一步提高。
根据本发明的实施例，所述构建体的载体是病毒载体，所述病毒载体包括选自反转录病毒载体、慢病毒载体或腺病毒相关病毒载体的至少之一。本发明实施例的病毒的载体在病毒包装和感染过程中，病毒感染范围广泛，既可感染终末分化细胞，又可感染处于分裂期的细胞，其基因组既可整合到宿主染色体，又可游离在宿主染色体之外，从而可实现广谱而高效的感染效率，无功能EGFR受体在淋巴细胞中高效表达和嵌合抗原受体在淋巴细胞中的高效表达，使得本发明实施例的淋巴细胞的靶向作用进一步增强，对肿瘤细胞，尤其是EGFRvIII突变的肿瘤细胞的定向杀伤作用更加显著，淋巴细胞的杀伤作用安全性更高。
在本发明的第六方面，本发明提出了一种制备前面所述的T淋巴细胞或者转基因淋巴细胞的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：将前面所述的构建体或者前面所述的慢病毒引入到淋巴细胞中或者T淋巴细胞。所述构建体或慢病毒成功引入上述淋巴细胞或者T淋巴细胞中，实现了淋巴细胞表达无功能EGFR受体和嵌合抗原受体的表达，从而本发明实施例的制备方法制备的转基因淋巴细胞或T淋巴细胞具有对肿瘤细胞，尤其具有对EGFRvIII突变的肿瘤细胞的靶向杀伤作用，且安全性更高。
在本发明的第七方面，本发明提出了一种用于治疗癌症的治疗组合物。根据本发明的实施例，所述治疗组合物包括：上述构建体、慢病毒、T淋巴细胞或者转基因淋巴细胞。上述任意一种治疗组合物的组成均可实现转基因淋巴细胞或T淋巴细胞无功能EGFR受体的表达和嵌合抗原受体在转基因淋巴细胞或T淋巴细胞中的高效表达，从而使得所得转基因淋巴细胞或T淋巴细胞具有对肿瘤细胞的靶向杀伤作用，本发明实施例的治疗癌症的治疗组合物具有对肿瘤细胞的靶向杀伤作用，尤其是具有对EGFRvIII突变的肿瘤细胞的靶向杀伤作用，且安全性高。
根据本发明的实施例，上述治疗组合物还可以进一步包括下列附加技术特征至少之一：
根据本发明的实施例，所述癌症包括脑胶质母细胞瘤、非小细胞肺癌、乳腺癌或卵巢癌。脑胶质母细胞瘤、非小细胞肺癌、乳腺癌或卵巢癌癌细胞具有EGFRvIII的特异性表达，本发明实施例的治疗组合物可使淋巴细胞细胞表面表达无功能EGFR受体和高效表达抗原特异性嵌合抗原受体，如本发明实施例的EGFRvIII抗原特异性嵌合抗原受体，所得淋巴细胞或T淋巴细胞具有对EGFRvIII突变的脑胶质母细胞瘤、非小细胞肺癌、乳腺癌或卵巢癌癌的肿瘤细胞的靶向杀伤，且安全性高。
在本发明的第八方面，本发明提出了一种提高淋巴细胞治疗安全性的方法，所述淋巴细胞携带嵌合抗原受体，其特征在于，所述方法包括：使所述淋巴细胞表达无功能EGFR受体，所述无功能EGFR受体、所述淋巴细胞、所述嵌合抗原受体如前所述。无功能EGFR受体缺少N-端配体结合区和细胞内受体酪氨酸激酶活性，但包括野生型EGFR受体的跨膜区和完整的与抗EGFR抗体结合的序列，无功能EGFR受体可作为淋巴细胞的自杀标记。本发明是实施例的淋巴细胞在用于治疗治疗EGFRvIII突变的肿瘤细胞时，如果病人出现严重不良反应，本发明实施例的淋巴细胞可被抗EGFR抗体清除，进而可提高本发明实施例的淋巴细胞治疗EGFRvIII突变的肿瘤病人的安全性。
附图说明
图1是根据本发明实施例的共表达抗EGFRvIII的嵌合抗原受体和无功能EGFR受体的慢病毒载体的结构示意图；以及
图2是根据本发明实施例的共表达抗EGFRvIII的嵌合抗原受体和无功能EGFR受体的淋巴细胞被抗EGFR抗体-介导ADCC杀伤清除的结果图。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例，下面描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
T淋巴细胞或转基因淋巴细胞
在本发明的一方面，本发明提出了一种T淋巴细胞或转基因淋巴细胞。根据本发明的实施例，本发明实施例的T淋巴细胞表达无功能EGFR受体；以及表达嵌合抗原受体，其中，嵌合抗原受体包括：胞外区，胞外区包括单链抗体的重链可变区和轻链可变区，单链抗体特异性识别抗原EGFRvIII；跨膜区，跨膜区与胞外区相连，并且嵌入到所T淋巴细胞的细胞膜中；胞内区，胞内区与跨膜区相连，并且胞内区包括CD28或4-1BB的胞内段以及CD3ζ链。无功能EGFR受体缺少N-端配体结合区和细胞内受体酪氨酸激酶活性，但包括野生型EGFR受体的跨膜区和完整的与抗EGFR抗体结合的序列，无功能EGFR受体可作为淋巴细胞的自杀标记。本发明实施例的T淋巴细胞或转基因淋巴细胞表达EGFRvIII抗原特异性的嵌合抗原受体，本发明实施例的T淋巴细胞或转基因淋巴细胞具有对特意性肿瘤细胞的杀伤能力，尤其具有对EGFRvIII突变的脑胶质母细胞瘤细胞的特异性杀伤；本发明实施例的T淋巴细胞或转基因淋巴细胞细胞表达无功能EGFR受体联合表达EGFRvIII抗原特异性的嵌合抗原受体，本发明实施例的T淋巴细胞或转基因淋巴细胞杀伤安全性高。
另外，根据本发明的实施例，本发明实施例的无功能EGFR受体缺少N-端配体结合区和细胞内受体酪氨酸激酶活性，但包括野生型EGFR受体的跨膜区和完整的与抗EGFR抗体结合的序列，无功能EGFR受体可作为淋巴细胞的自杀标记。无功能EGFR受体表达淋巴细胞可被抗EGFR抗体在体内清除。从而，本发明实施例的T淋巴细胞或转基因淋巴细胞表达无功能EGFR受体，在保证转基因淋巴细胞的靶向杀伤作用的前提下，如果病人出现严重不良反应，转基因淋巴细胞可被抗EGFR抗体清除，进而可进一步提高本发明实施例的转基因淋巴细胞或T淋巴细胞治疗EGFRvIII突变的肿瘤病人的安全性。
另外，根据本发明的实施例，上述嵌合抗原受体胞外区的抗体为单链抗体。发明人发现，单链抗体可去除非特异性反应的竞争性表面蛋白，同时单链抗体更易渗透肿瘤组织增加药物治疗浓度。本发明实施例的转基因淋巴细胞表达单链抗体的嵌合抗原受体，进一步提高了转基因淋巴细胞对靶向肿瘤细胞的定向杀伤作用。
根据本发明的另外一些实施例，上述抗体的结合抗原为EGFRvIII。因此本发明实施例的转基因淋巴细胞针对表达抗原EGFRvIII的细胞具有定向性杀伤作用，抗原抗体的特异性结合作用更强，进一步提高了本发明实施例的转基因淋巴细胞对EGFRvIII抗原表达肿瘤细胞的定向杀伤作用。
另外，根据本发明的实施例，所述免疫共刺激分子胞内段独立地选自4-1BB、OX-40、CD40L、CD27、CD30、CD28以及他们的衍生物的至少一种。免疫共刺激分子胞内段的表达具有正向调控和增强细胞免疫应答的作用，使得转基因淋巴细胞对EGFRvIII突变的肿瘤的定向杀伤作用效果进一步提高，免疫共刺激分子胞内段的表达联合无功能EGFR受体的表达，使得转基因淋巴细胞的免疫杀伤作用更加安全有效。
根据本发明的实施例，本发明实施例的淋巴细胞是CD3+淋巴细胞或自然杀伤细胞或自然杀伤T细胞。CD3+淋巴细胞是总T细胞，自然杀伤细胞是免疫细胞的一种，非特异性性识别靶细胞，自然杀伤T细胞是具有T细胞和自然杀伤细胞受体的T细胞亚群。上述淋巴细胞表达无功能EGFR受体和表达嵌合抗原受体，使得上述淋巴细胞的对肿瘤细胞免疫杀伤作用更加安全有效。
慢病毒或构建体
在本发明的另一方面，本发明提出了一种慢病毒或构建体。根据本发明的实施例，慢病毒或构建体携带下列核酸分子：编码嵌合抗原受体的核酸分子，嵌合抗原受体具有SEQID NO：1所示的氨基酸序列，编码嵌合抗原受体的核酸分子具有SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列；以及编码无功能EGFR受体的核酸分子，所述无功能EGFR受体具有SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列，所述编码无功能EGFR受体的核酸分子具有SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列。根据本发明的实施例，将本发明实施例的慢病毒或构建体导入淋巴细胞所得的转基因淋巴细胞中，其细胞表面表达无功能EGFR受体，同时在其细胞表面表达抗EGFRvIII的嵌合抗原受体，从而本发明实施例的转基因淋巴细胞具有了显著对肿瘤细胞的定向杀伤能力，且免疫杀伤安全性显著提高，本发明实施例的转基因淋巴细胞对EGFRvIII突变的脑胶质母细胞瘤细胞特异性杀伤效果尤为显著。
根据本发明地实施例，本发明实施例的逆转录病毒或构建体携带含有SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列。SEQ ID NO：5表示的是共表达抗EGFRvIII嵌合抗原受体和无功能EGFR受体的核苷酸序列(EGFRvIII-CAR/tEGFR)根据本发明的实施例，将本发明实施列的慢病毒导入淋巴细胞所得的转基因淋巴细胞，其表达无功能EGFR受体，以及抗EGFRvIII的嵌合抗原受体表达，使得转基因淋巴细胞对肿瘤的定向杀伤能力，免疫杀伤安全性高，尤其对EGFRvIII突变的脑胶质母细胞瘤细胞的具有特异性杀伤效果，对EGFRvIII突变的脑胶质母细胞瘤细胞的特异性杀伤安全性高。
根据本发明的实施例，发明人是通过如下方式的至少之一实现上述细胞嵌合抗原受体以及无功能EGFR受体分别独立地表达的：。
内部核糖体进入位点序列(IRES)，本发明实施例的内部核糖体进入位点序列设置在编码嵌合抗原受体的核酸分子与表达无功能EGFR受体的核酸分子之间，内部核糖体进入位点具有SEQ ID NO：6所示的核苷酸序列。内部核糖体进入位点通常位于RNA病毒基因组的5’非翻译区(UTR)，这样一个病毒蛋白的翻译就可以不依赖于5‘帽子结构，另一个蛋白通常靠5’帽子结构起始翻译，IRES前后的两个基因的表达通常是成比例的。内部核糖体进入位点序列的引入使得编码嵌合抗原受体的核酸分子与编码无功能EGFR受体的核酸分子分别独立的表达。根据本发明的实施例，本发明实施例采用内部核糖体进入位点序列有效保证了嵌合抗原受体和无功能EGFR受体的高效表达，使得淋巴细胞对肿瘤的特异性杀伤效果进一步提高，免疫杀伤安全性进一步提高。
第三核酸分子，该第三核酸分子设置在第一核酸分子与第二核酸分子之间，并且第三核酸分子编码连接肽，连接肽能够在淋巴细胞中被切割。根据本发明的实施例，连接肽具有SEQ ID NO：7所示的氨基酸序列。SEQ ID NO：7所示的氨基酸序列是手足口病毒(一种小RNA病毒)的2A肽段。第三核酸分子的引入使得无功能性EGFR受体和嵌合抗原受体成非融合状态表达在淋巴细胞膜上，从而保证了的无功能EGFR受体和嵌合抗原受体的生物学作用，其具特异性更强的肿瘤杀伤效果，安全性更高。
启动子：第一启动子，第一启动子与编码嵌合抗原受体的核酸分子可操作地连接；以及第二启动子第二启动子与表达无功能EGFR受体的核酸分子可操作地连接。根据本发明的实施例，所采用的第一启动子、第二启动子独立地选自CMV,EF-1,LTR,RSV启动子，第一以及第二启动子的引入，使得编码嵌合抗原受体的核酸分子和表达无功能EGFR受体的核酸分子分别独立的表达，从而保证了嵌合抗原受体的高效表达，淋巴细胞的靶向作用更强，对肿瘤的特异性杀伤作用更加进一步提高，免疫杀伤的安全性也进一步提高。
通过上述内部核糖体进入位点序列、或第一、第二启动子的引入，使得细胞无功能EGFR受体高效地表达和嵌合抗原受体高效地表达在本发明实施例的转基因淋巴细胞膜上，从而保证了嵌合抗原受体的生物学作用，有效实现了转基因淋巴细胞的及时清除，从而使得淋巴细胞的靶向杀伤作用更加显著，免疫杀伤的安全性进一步提高。
另外，根据本发明的实施例，本发明实施例的构建体的载体是非致病性病毒载体。非致病性病毒载体大大提高了构建体在淋巴细胞中的复制和扩增效率，进而本发明实施例的淋巴细胞靶向作用进一步增强，对肿瘤细胞的杀伤作用进一步提高，免疫杀伤安全性进一步提高。
根据本发明的实施例，本发明实施例的构建体的载体是病毒载体，病毒载体选自反转录病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体或腺病毒关联病毒载体的至少之一。根据本发明的实施例，本发明实施例的病毒的载体在病毒包装和感染过程中，病毒感染范围广泛，既可感染终末分化细胞，又可感染处于分裂期的细胞，既可整合到宿主染色体，又可游离在宿主染色体之外，实现广谱而高效的感染效率，从而无功能EGFR被高效表达和嵌合抗原受体在淋巴细胞中高效表达，本发明实施例的淋巴细胞的靶向作用进一步增强，对肿瘤细胞的杀伤作用更加显著，淋巴细胞的免疫杀伤安全性进一步提高。
根据本发明的具体实施例，以构建一个慢病毒载体为例，发明人为了构建一个慢病毒载体，在某些病毒序列的位置，将目的核酸插入到病毒基因组中，从而产生复制缺陷的病毒。为了产生病毒体，发明人进而构建包装细胞系(包含gag，pol和env基因，但不包括LTR和包装成分)。发明人将含有目的基因的重组质粒，连同慢病毒LTR和包装序列，一起引入包装细胞系中。包装序列允许重组质粒RNA转录产物被包装到病毒颗粒中，然后被分泌到培养基中。进而发明人收集包含重组慢病毒的基质，有选择性地浓缩，并用于基因转移。慢载体可以感染多种细胞类型，包括可分裂细胞和不可分裂细胞。
另外，根据本发明的实施例，本发明实施例的慢病毒是复合慢病毒，除了常见的慢病毒基因gag，pol和env，还包含有调控和结构功能的其他基因。慢病毒载体是本领域技术人员所熟知的，慢病毒包括：人类免疫缺陷病毒HIV–1，HIV–2和猿猴免疫缺陷病毒SIV。慢病毒载体通过多重衰减艾滋病毒致病基因产生，例如全部删除基因env，vif，vpr，vpu和nef，使慢病毒载体形成生物安全型载体。重组慢病毒载体能够感染非分裂细胞，同时可用于体内和体外基因转移和核酸序列表达。例如：在合适的宿主细胞中，和带有包装功能(gag，pol，env，rev和tat)的两个或更多的载体一起，能够感染非分裂细胞。重组病毒的靶向性，是通过抗体或特定配体(靶向特定细胞类型受体)与膜蛋白的结合来实现的。同时，重组病毒的靶向性通过插入一个有效序列(包括调控区域)到病毒载体中，连同另一个编码了特定靶细胞上的受体的配体的基因，使载体具有了特定的靶向。各种有用的慢病毒载体，以及各种方法和操作等产生的载体，用于改变细胞的表达。
根据本发明的实施例，本发明实施例的腺关联病毒载体(AAV)可使用一种或多种为人熟知的血清类型腺关联病毒载体的DNA构建。本领域技术人员构建一个合适的腺关联病毒载体，以此携带共表达嵌合抗原受体和无功能EGFR受体的核苷酸分子。
另外，根据本发明的实施例，本发明实施例的也包含微基因。微基因意味着用组合(选定的核苷酸序列和可操作的必要的相关连接序列)来指导转化、转录和/或基因产物在体内或体外的宿主细胞中的表达。应用“可操作的连接”序列包含连续目的基因的表达控制序列，和作用于反式或远距离控制目的基因的表达控制序列。
另外，本发明实施例的载体还包括常规控制元素，在和质粒载体一起的细胞转染或/和病毒载体一起的细胞感染中，这些元素允许转录、转化mRNA的表达。大量的表达控制序列(包括天然的，可诱导和/或特定组织的启动子)可能被使用。根据本发明的实施例，启动子为选pol I,pol II and pol III的RAN聚合酶启动子。根据本发明的实施例，启动子为组织特异型启动子。根据本发明的实施例，启动子为诱导型启动子。根据本发明的实施例，启动子为选自基于所选载体的启动子。根据本发明的实施例，当选择慢病毒载体时，启动子为CMV IE基因,EF-1α,泛素C,或磷酸甘油激酶(PGK)启动子。其他常规表达控制序列包括可选标记或报告基因，包括编码遗传霉素，潮霉素，氨苄青霉素或嘌呤霉素耐药性等的核苷酸序列。载体的其他组件包括复制起点。
构建载体的技术为本领域技术人员所熟知的，这些技术包括常规克隆技术，例如在本发明实施例中所使用聚合酶链反应和任何适当的提供所需的核苷酸序列的方法。
根据本发明的实施例，发明人构建了共表达无功能EGFR受体以及嵌合抗原受体(CAR)的病毒载体。本发明实施例的表达无功能EGFR受体的核酸分子以及表达嵌合抗原受体(CAR)的病毒载体或质粒是复合的，此病毒载体或质粒可结合聚合物或其他材料来增加其稳定性，或协助其靶向运动。
制备转基因淋巴细胞的方法
在本发明的另一方面，本发明提出了一种制备前面所述的T淋巴细胞或者转基因淋巴细胞的方法。根据本发明的实施例，该方法包括：将前面所述的构建体或者前面所述的慢病毒引入到淋巴细胞中或者T淋巴细胞。引入方式可以选自电转或病毒感染宿主细胞的方式引入。本发明实施例的构建体或慢病毒成功引入上述淋巴细胞或者T淋巴细胞中，实现了针对抗原EGFRvIII的嵌合抗原受体的表达和无功能EGFR受体的表达，从而使得所得淋巴细胞或T淋巴细胞具有对肿瘤细胞，尤其是EGFRvIII突变的脑胶质母细胞瘤细胞的靶向杀伤作用，免疫杀伤的安全性高。
治疗癌症的治疗组合物
在本发明的另一方面，本发明的提出了一种用于治疗癌症的治疗组合物。根据本发明的实施例，该治疗组合物包括：上述构建体、上述慢病毒、上述T淋巴细胞或者上述转基因淋巴细胞。上述任意一种治疗组合物的组成均可实现针对抗原EGFRvIII嵌合抗原受体在转基因淋巴细胞或T淋巴细胞中的高效表达和无功能EGFR受体在转基因淋巴细胞或T淋巴细胞表面的表达，从而使得所得转基因淋巴细胞或T淋巴细胞具有对EGFRvIII肿瘤细胞的靶向杀伤作用，免疫杀伤的安全性高。
根据本发明的实施例，提供给患者的本发明实施例的治疗组合物,较好的应用于生物兼容溶液或可接受的药学运载载体。作为准备的各种治疗组合物被悬浮或溶解在医药上或生理上可接受的载体，如生理盐水；等渗的盐溶液或其他精于此道的人的比较明显的配方中。适当的载体在很大程度上取决于给药途径。其他有水和无水的等渗无菌注射液和有水和无水的无菌悬浮液，是医药上可接受的载体。
根据本发明的实施例，足够数量的病毒载体被转导入靶向T细胞中，并提供足够强度的转基因，表达无功能EGFR受体和表达特有的EGFRvIII嵌合抗原受体。治疗试剂的剂量主要取决于治疗状况,年龄，体重，病人的健康程度，从而可能造成病人的变异性。
表达无功能EGFR受体以及表达特有的针对抗原EGFRvIII嵌合抗原受体的这些方法是联合治疗的一部分。这些病毒载体和用于过继免疫治疗的抗肿瘤T细胞，可以被单独或结合其他治疗癌症的方法一起执行。在合适的条件下，一个治疗方法的包括使用一个或多个药物疗法。
根据本发明的实施例，所述癌症包括脑胶质母细胞瘤、非小细胞肺癌、乳腺癌或卵巢癌。无功能EGFR受体的表达联合嵌合抗原受体在转基因淋巴细胞或T淋巴细胞中的高效表达，使得所得淋巴细胞或T淋巴细胞具有对脑胶质母细胞瘤、非小细胞肺癌、乳腺癌或卵巢癌的肿瘤细胞的靶向杀伤作用，尤其具有对EGFRvIII突变的上述肿瘤细胞的杀伤作用更加显著，对EGFRvIII突变的上述肿瘤细胞的免疫杀伤作用，且更加安全有效。
提高淋巴细胞治疗安全性的方法
在本发明的另一方面，本发明提出了一种提高淋巴细胞治疗安全性的方法，所述淋巴细胞携带嵌合抗原受体，其特征在于，所述方法包括：使所述淋巴细胞表达无功能EGFR受体，所述无功能EGFR受体、所述淋巴细胞、所述嵌合抗原受体如前所述。无功能EGFR受体缺少N-端配体结合区和细胞内受体酪氨酸激酶活性，但包括野生型EGFR受体的跨膜区和完整的与抗EGFR抗体结合的序列，无功能EGFR受体可作为淋巴细胞的自杀标记。本发明是实施例的淋巴细胞在用于治疗治疗EGFRvIII突变的肿瘤细胞时，如果病人出现严重不良反应，本发明实施例的淋巴细胞可被抗EGFR抗体清除，进而可提高本发明实施例的淋巴细胞治疗EGFRvIII突变的肿瘤病人的安全性。
下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。
本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件(例如参考J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社)或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1
本发明实施例中所用到的细胞系和基本实验技术如下所述：
慢病毒的产生和人T淋巴细胞的转导
产生复制缺陷的慢病毒载体，并将慢病毒载体离心收集用于人T淋巴细胞的转导。下面简要介绍慢病毒载体的产生、收集的实验过程：将293T细胞铺在底面积为150-平方厘米的细胞培养皿中，并根据说明书，使用Express-In(购自Open Biosystems/Thermo Scientific,Waltham,MA)对293T细胞进行病毒转导。每盘细胞加入15μg的慢病毒转基因质粒、5μg的pVSV-G(VSV糖蛋白表达质粒)、10μg的pCMVR8.74质粒(Gag/Pol/Tat/Rev表达质粒)和174μl的Express-In(浓度为1μg/μl)。分别于24小时和48小时收集上清，并使用超速离心机在28,000rpm(离心机转子为Beckman SW 32 Ti，购自Beckman Coulter,Brea,CA)的条件下离心2小时。最后用0.75ml的RPMI-1640培养基对病毒质粒沉淀进行重悬。
从健康志愿者供体上分离人原代T淋巴细胞。人T淋巴细胞培养在RPMI-1640培养基中并使用抗CD3和CD28的单克隆抗体包被的珠(购自Invitrogen,Carlsbad,CA)进行刺激激活。人T淋巴细胞激活后的18～24小时，采用自旋-接种的方法对T淋巴细胞进行转导，转导过程如下所述：在24-孔板中，每孔铺有0.5×106T淋巴细胞，向每孔细胞中加入0.75ml的上述重悬的病毒上清和Polybrene(浓度为8μg/ml)。细胞和病毒质粒的混合液在台式离心机(购自Sorvall ST 40；Thermo Scientific)中离心，离心条件是室温，2500rpm，时间为90分钟。人重组白细胞介素-2(IL-2；购自Novartis,Basel,Switzerland)每隔2～3天加入T淋巴细胞培养液中，IL-2的终浓度为100-IU/ml,在T淋巴细胞培养过程中，保持细胞的密度为0.5×106～1×106/ml。一旦被转导的T淋巴细胞出现休眠，例如细胞生长速度变慢和细胞变小，其中，细胞生长速度和大小是通过Coulter Counter(购自Beckman Coulter)评估的，或被转导的T淋巴细胞在某个计划的时间点上，T淋巴细胞即可用来做功能分析。
本申请的实施例中所用的流式细胞仪为BD FACSCanto II(购自BD Biosciences)，并且流式细胞分析数据使用FlowJo version 7.2.5软件(购自Tree Star,Ashland,OR)进行分析。
抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用(ADCC)
在有关ADCC实施例中，采用4小时-51Cr-释放法评估抗-EGFR抗体诱导表达无功能EGFR受体的淋巴细胞的细胞依赖性裂解的能力。被转导了慢病毒载体的人类T淋巴细胞被用作靶细胞。100μCi Na2 51CrO4(购自GE Healthcare Life Sciences,Marlborough,MA)标定2～5 x 106靶细胞，标定条件是37℃下震荡孵育1小时。细胞采用PBS润洗三次，并且用培养基重悬(细胞密度是1 x 105/ml)。继而，被标定的细胞铺在96-孔板中(每孔铺有5×103个细胞，加有50μl培养基)，并加入50μl的抗-EGFR抗体(购自Erbitux,Genentech)(终浓度为20μg/ml),在常温条件下预培养30分钟.继而将含有抗体的培养基换成普通培养基，由此来检测51Cr的自发释放。加入终浓度为1％的Triton X-100以保证51Cr的最大释放量。在以下有关ADCC实施中，人PBMC(效应细胞)加入孔板中(每孔5×105个细胞)并将细胞在37℃培养过夜。第二天，收集细胞上清，并利用γ计数器计算cpm以此来确定51Cr的释放。细胞毒性比例用以下公式计算：％特异性裂解＝(实验释放cpm数据-自发释放cpm数据)/(最大释放cpm数据-自发释放cpm数据)*100，其中，最大释放cpm数据通过靶细胞中加入Triton X-100实现的，自发释放cpm数据是在没有抗EGFR抗体和效应细胞的条件下测量的。
实施例2构建共表达无功能EGFR受体和抗EGFRvIII嵌合抗原受体的载体
本实施例中，发明人将编码有抗人EGFRvIII的单链抗体的序列、4-1BB胞内段和T细胞受体组合的ζ-链序列克隆到含有EF-1启动子的慢病毒载体(lentiviral vector)上，克隆过程中，选择的限制性酶切是XbaI和NotI双酶切,以及NotI和XhoI双酶切,通过酶切、连接、筛选和目的质粒的扩增，生成表达抗EGFRvIII嵌合抗原受体的慢病毒质粒(LV-EGFRvIIICAR)。包含合成IRES和表达无功能EGFR受体的序列被克隆进LV-EGFRvIII CAR载体质粒，构建成LV-EGFRvIII CAR/tEGFR.图1是慢病毒载体的示意图，包含编码抗EGFRvIII嵌合抗原受体的序列,IRES、及编码无功能EGFR受体序列。抗EGFRvIII嵌合抗原受体的序列在启动子EF-1的启动调控下，表达无功能EGFR受体的序列作为一个单独的mRNA转录单元从IRES序列后开始翻译。
实施例3抗EGFR抗体可有效杀伤清除共表达无功能EGFR受体和抗EGFRvIII嵌合抗原受体的T淋巴细胞
在本实施例中，外周血淋巴细胞取自不记名供血者。外周血淋巴细胞通过梯度离心进行分离，梯度离心机为Ficoll-Hypaque。T淋巴细胞与T细胞激活因子磁珠CD3/CD28(购自Invitrogen,Carlsbad,CA)在5％CO2、37摄氏度下孵育培养72小时，培养基是加有2mmol/L谷氨酰胺,10％高温灭活的胎牛血清(FCS)(购自Sigma-Aldrich Co.)和100U/ml的青霉素/链霉素双抗的RPMI培养基1640(购自Invitrogen Gibco Cat.no.12633-012)。激活培养72小时后，用洗液润洗细胞，将磁珠洗去。将T细胞种在铺有重组纤连蛋白片段(FN ch-296；Retronectin)细胞培养皿上，并用慢病毒转导,转导慢病毒分别为LV-EGFRvIII CAR/tEGFR,LV-EGFRvIII CAR或空载(LV-GFP)转导过程如实施例1所述。转导后表达无功能EGFR受体的T细胞用抗EGFR抗体染色后,然后流式细胞细胞(FACS)分离，分离后T细胞培养在RPMI-1640培养基中并用重组人类IL-2因子(100ng/ml；购自R&D Systems)进行诱导扩增7-10天，然后作为实验的靶细胞。发明人用ADCC检测法测量抗EGFR抗体介异的对转导了不同慢病毒的T细胞的杀伤作用，测量方法采用标准4–小时51铬释放法，4–小时51铬释放法如实施例1所述。结果如图2所示。如图2所示,
抗EGFR抗体可有效介异杀伤共表达抗EGFRvIII嵌合抗原受体和无功能EGFR受体的T淋巴细胞,但抗EGFR抗体不能介异杀伤只表达抗EGFRvIII嵌合抗原受体的T淋巴细胞，抗EGFR抗体不能介异杀伤空载慢病毒转导的T淋巴细胞，统计数据代表三个孔的平均值±SEM。
实施例4共表达无功能EGFR受体和抗EGFRvIII嵌合抗原受体的T淋巴细胞肿瘤细胞溶解能力。
在本实施例中，外周血淋巴细胞取自不记名供血者。外周血淋巴细胞通过梯度离心进行分离，梯度离心机为Ficoll-Hypaque。T淋巴细胞与T细胞激活因子磁珠CD3/CD28(购自Invitrogen,Carlsbad,CA)在5％CO2、37摄氏度下孵育培养72小时，培养基是加有2mmol/L谷氨酰胺,10％高温灭活的胎牛血清(FCS)(购自Sigma-Aldrich Co.)和100U/ml的青霉素/链霉素双抗的RPMI培养基1640(购自Invitrogen Gibco Cat.no.12633-012)。激活培养72小时后，用洗液润洗细胞，将磁珠洗去。将T细胞种在铺有重组纤连蛋白片段(FN ch-296；Retronectin)细胞培养皿上，并用慢病毒转导,转导慢病毒分别为LV-EGFRvIII CAR,LV-tEGFR,或空载(LV-GFP)转导过程如实施例1所述。转导后的T细胞培养在RPMI-1640培养基中并用重组人类IL-2因子(100ng/ml；购自R&D Systems)进行诱导扩增7-10天，然后进行功能测试实验。发明人测量转导了不同慢病毒的T细胞对EGFRvIII突变的脑胶质瘤细胞的杀伤作用，效靶细胞比例是10：1或1:1，测量方法采用标准4–小时51铬释放法，4–小时51铬释放法如实施例1所述。结果显示,共表达抗EGFRvIII嵌合抗原受体和无功能EGFR受体慢病毒转导的T淋巴细胞(效应细胞)可杀死EGFRvIII突变的脑瘤细胞(靶细胞)。无功能EGFR受体慢病毒转导的T淋巴细胞(LV-tEGFR T淋巴细胞)或空载慢病毒转导的T淋巴细胞(对照LV-GFP T淋巴细胞)对EGFRvIII突变的脑瘤细胞无明显杀伤作用。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。
Claims (27)
1.一种T淋巴细胞，其特征在于，所述T淋巴细胞表达无功能EGFR受体；
以及表达嵌合抗原受体，其中，
所述嵌合抗原受体包括：
胞外区，所述胞外区包括单链抗体的重链可变区和轻链可变区，所述单链抗体特异性识别抗原EGFRvIII；
跨膜区，所述跨膜区与所述胞外区相连，并且嵌入到所述T淋巴细胞的细胞膜中；
胞内区，所述胞内区与所述跨膜区相连，并且所述胞内区包括CD28或4-1BB的胞内段以及CD3ζ链。
2.一种慢病毒，其特征在于，所述慢病毒携带下列核酸分子：
编码嵌合抗原受体的核酸分子，所述嵌合抗原受体具有SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列，所述编码嵌合抗原受体的核酸分子具有SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列；以及
编码无功能EGFR受体的核酸分子，所述无功能EGFR受体具有SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列，所述编码无功能EGFR受体的核酸分子具有SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列。
3.一种慢病毒，其特征在于，所述慢病毒携带含有SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列。
4.一种转基因淋巴细胞，其特征在于，所述淋巴细胞细胞表达无功能EGFR受体；
以及表达嵌合抗原受体。
5.根据权利要求4所述的转基因淋巴细胞，其特征在于，所述嵌合抗原受体包括：
胞外区，所述胞外区能够与抗原特异性结合；
跨膜区；以及
胞内区，所述胞内区包括免疫共刺激分子胞内段。
6.根据权利要求5所述的转基因淋巴细胞，其特征在于，所述抗原是肿瘤抗原。
7.根据权利要求6所述的转基因淋巴细胞，其特征在于，所述胞外区包括抗体的重链可变区和轻链可变区，所述抗体结合所述抗原。
8.根据权利要求7所述的转基因淋巴细胞，其特征在于，所述抗体为单链抗体。
9.根据权利要求8所述的转基因淋巴细胞，其特征在于，所述抗原为EGFRvIII。
10.根据权利要求5所述的转基因淋巴细胞，其特征在于，所述免疫共刺激分子胞内段独立地选自4-1BB、OX-40、CD40L、CD27、CD30、CD28以及他们的衍生物的至少一种。
11.根据权利要求10所述的转基因淋巴细胞，其特征在于，所述免疫共刺激分子胞内段是4-1BB或CD28的胞内段。
12.根据权利要求4所述的转基因淋巴细胞，其特征在于，所述淋巴细胞是CD3+T淋巴细胞。
13.根据权利要求4所述的转基因淋巴细胞，其特征在于，所述淋巴细胞是自然杀伤细胞。
14.根据权利要求4所述的转基因淋巴细胞，其特征在于，所述淋巴细胞是自然杀伤T细胞。
15.一种构建体，其特征在于，所述构建体包括：
第一核酸分子，所述第一核酸分子编码嵌合抗原受体；以及
第二核酸分子，所述第二核酸分子编码无功能EGFR受体，
其中，所述嵌合抗原受体、所述无功能EGFR受体是如权利要求2、4～14任一项中所定义的。
16.根据权利要求15所述的构建体，其特征在于所述第一核酸分子以及所述第二核酸分子被设置为在权利要求4～14任一项所述的淋巴细胞中表达所述嵌合抗原受体和表达无功能EGFR受体，并且所述嵌合抗原受体与所述无功能EGFR受体呈非融合形式。
17.根据权利要求15所述的构建体，其特征在于，进一步包括：
第一启动子，所述第一启动子与所述第一核酸分子可操作地连接；以及
第二启动子，所述第二启动子与所述第二核酸分子可操作地连接。
18.根据权利要求17所述的构建体，其特征在于，所述第一启动子、所述第二启动子分别独立地选CMV,EF-1,LTR,或RSV启动子。
19.根据权利要求16所述的构建体，其特征在于，进一步包括：
内部核糖体进入位点序列，所述内部核糖体进入位点序列设置在所述第一核酸分子与所述第二核酸分子之间，所述内部核糖体进入位点具有SEQ ID NO：6所示的核苷酸序列。
20.根据权利要求15所述的构建体，其特征在于，进一步包括:
第三核酸分子，设置在所述第一核酸分子与所述第二核酸分子之间，并且所述第三核酸分子编码连接肽，所述连接肽能够在所述淋巴细胞中被切割。
21.根据权利要求20所述的构建体，其特征在于，所述连接肽具有SEQ ID NO：7所示的氨基酸序列。
22.根据权利要求15所述的构建体，其特征在于，所述构建体的载体是非致病性病毒载体。
23.根据权利要求22所述的构建体，其特征在于，所述构建体的载体是病毒载体，所述病毒载体包括选自反转录病毒载体、慢病毒载体或腺病毒相关病毒载体的至少之一。
24.一种制备权利要求1所述的T淋巴细胞或者权利要求4～14任一项所述的转基因淋巴细胞的方法，其特征在于，包括：
将权利要求15～23任一项所述的构建体或者权利要求2～3任一项所述的慢病毒引入到淋巴细胞中或者T淋巴细胞。
25.一种用于治疗癌症的治疗组合物，其特征在于，包括：
权利要求15～23任一项所述的构建体、权利要求2～3任一项所述的慢病毒、权利要求1所述的T淋巴细胞或者权利要求4～14任一项所述的转基因淋巴细胞。
26.根据权利要求25所述的治疗组合物，其特征在于，所述癌症包括脑胶质母细胞瘤、非小细胞肺癌、乳腺癌或卵巢癌。
27.一种提高淋巴细胞治疗安全性的方法，所述淋巴细胞携带嵌合抗原受体，其特征在于，所述方法包括：
使所述淋巴细胞表达无功能EGFR受体，
所述无功能EGFR受体、所述淋巴细胞、所述嵌合抗原受体如权利要求2、4～14任一项中所定义的。
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2016
- 2016-01-13 CN CN201610022365.3A patent/CN106967684A/zh active Pending
- 2016-02-04 WO PCT/CN2016/073480 patent/WO2017120997A1/zh active Application Filing
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2014130657A1 (en) * | 2013-02-20 | 2014-08-28 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Treatment of cancer using humanized anti-egfrviii chimeric antigen receptor |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
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| WO2019223226A1 (zh) * | 2018-05-24 | 2019-11-28 | 北京马力喏生物科技有限公司 | 改良型抗cd19 car-t细胞 |
| CN110526983A (zh) * | 2018-05-24 | 2019-12-03 | 北京马力喏生物科技有限公司 | 改良型抗cd19 car-t细胞 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
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| WO2017120997A1 (zh) | 2017-07-20 |
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| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |