CN109750067A - 分泌型抗免疫检查点抗体及tEGFR分子共表达的细胞及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提出了一种表达载体、慢病毒、转基因细胞、分泌型抗体以及用于治疗癌症的治疗组合物。该表达载体携带下列核酸分子：第一核酸分子，所述第一核酸分子编码分泌型免疫检查点抑制分子片段；任选地，进一步携带第二核酸分子，所述第二核酸分子编码无功能EGFR。将本发明实施例的表达载体导入受体细胞中，分泌型抗免疫检查点抗体在受体细胞中高效表达并分泌到细胞外，由免疫检查点介导的免疫逃逸机制被阻遏。将本发明实施例的表达载体导入受体细胞，如淋巴细胞中，淋巴细胞对肿瘤细胞的特异性杀伤强大而有效。

Description

分泌型抗免疫检查点抗体及tEGFR分子共表达的细胞及其 应用

技术领域

本发明涉及生物医药领域，具体地，本发明涉及共表达分泌型抗免疫检查点抗体及 tEGFR表面标记的细胞及其应用，更具体地，本发明涉及表达载体、慢病毒、转基因细胞、分泌型抗体以及用于治疗癌症的治疗组合物。

背景技术

癌症，由于细胞内基因突变导致细胞增殖失控的一种疾病。目前已成为人类健康的重大威胁，是导致人类死亡的主要原因之一。世界卫生组织(WHO)在发表的《全球癌症报告2014》中指出，2012年全球癌症患者和死亡病例都在迅速增加。因此，寻找高效特异的癌症治疗方法具有重大的临床价值。

传统的肿瘤治疗方法主要包括手术、放疗和化疗，但这几种方法都具有较大的局限性，比如由于癌细胞的近端入侵或远端转移，手术切除后的肿瘤转移复发率较高，而放疗和化疗对于机体自身的正常细胞尤其是造血系统和免疫系统会造成严重的损害，因此对于已发生肿瘤转移的患者也很难达到较好的远期疗效。随着肿瘤分子机制的深入研究和生物技术的进一步发展，靶向药物治疗和免疫治疗在肿瘤的综合治疗中发挥着愈来愈大的作用。靶向疗法主要包括单克隆抗体和小分子靶向药物，而免疫疗法主要包括细胞因子疗法、免疫检查点单抗、过继免疫疗法，肿瘤疫苗等，通过调动机体的抗肿瘤免疫反应，从而控制和杀伤肿瘤细胞，因此有效率高，特异性强，耐受性好的优点，在肿瘤治疗中具有广阔的前景。

然而，肿瘤的免疫疗法只对部分病人有效，仍有待进一步深入研究和开发，来增强临床疗效。

发明内容

本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。

在本发明的第一方面，本发明提出了一种表达载体。根据本发明的实施例，所述表达载体携带下列核酸分子：第一核酸分子，所述第一核酸分子编码分泌型免疫检查点抑制分子片段；任选地，进一步携带第二核酸分子，所述第二核酸分子编码无功能EGFR表面标记。将本发明实施例的表达载体导入受体细胞中，分泌型抗免疫检查点抗体在受体细胞中高效表达并分泌到细胞外，由免疫检查点介导的免疫逃逸机制被阻遏。将本发明实施例的表达载体导入受体细胞，如淋巴细胞中，淋巴细胞对肿瘤细胞的特异性杀伤强大而有效。

根据本发明的实施例，上述表达载体还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：

根据本发明的实施例，所述分泌型免疫检查点抑制分子片段包括：抗免疫检查点单链抗体分子以及IgG Fc，任选地，所述IgG Fc为IgG1Fc或IgG4Fc。由此，分泌型免疫检查点抑制分子片段分泌到细胞外，并且与细胞表面的免疫检查点特异性结合，进而有效阻遏免疫检查点介导的免疫逃逸机制。

根据本发明的实施例，所述免疫检查点分子包括选自CTLA4、PD-1、PD-L1、PD-L2、TIM3、BTLA、LAG-3的至少之一。将本发明实施例的表达载体导入受体淋巴细胞，分泌型免疫检查点抑制分子片段分泌出后与上述免疫检查点分子结合，进而竞争性抑制肿瘤细胞的免疫逃逸，进而淋巴细胞对肿瘤细胞的特异性杀伤进一步显著增强。

根据本发明的实施例，所述分泌型免疫检查点抑制分子片段为抗PD-L1单链抗体和 IgG1Fc融合蛋白分子。

根据本发明的实施例，所述分泌型免疫检查点抑制分子片段为抗PD-1单链抗体和IgG4 Fc融合蛋白分子。

根据本发明的实施例，所述分泌型免疫检查点抑制分子片段为抗LAG3单链抗体和IgG4Fc融合蛋白分子，

根据本发明的实施例，所述分泌型免疫检查点抑制分子片段为抗CTLA4单链抗体和 IgG4Fc融合蛋白分子。

根据本发明的实施例，所述第一核酸分子具有SEQ ID NO：1～5所示的核苷酸序列。

ATGCTTCTCCTGGTGACAAGCCTTCTGCTCTGTGAGTTACCACACCCAGCATTCCTCCTGATCCCAGACATTGTGCTCACCCAATCTCCAGCTTCTTTGGCTCTGTCTCCCGGGGAGAGAGCCACCCTCTCCTGCAGAGCCACTGAAAGTGTTGAATACTATGGCACAAGTTTAGTGCAGTGGTACCAACAGAAACCAGGACAGCCACCCAAACTCCTCATCTATGCTGCATCCAGCGTAGATTCTGGGGTCCCTTCCAGGTTTAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACCCTCACCATCAATTCTCTGGAGGAGGAGGATGCTGCAATGTATTTCTGTCAGCAAAGTAGGAGGGTTCCGTACACGTTCGGACAGGGGACCAAGCTGGAGATAAAAGGCTCCACCTCTGGATCCGGCAAGCCCGGATCTGGCGAGGGATCCACCAAGGGCGAGGTCCAGCTGGTGCAGTCTGGAGCTGAGGTGAAAAAGCCTGGGGCTTCAGTGAAGATGTCCTGCAAGGCTTCTGGATACACATTCACTAGCTATGTTATGCACTGGGTGAAGCAGGCCCCTGGGCAGCGCCTTGAGTGGATTGGATATGTTAATCCTTTCAATGATGGTACTAAGTACAATGAGATGTTCAAAGGCAGGGCCACACTGACTTCAGACAAATCCACCAGCACAGCCTACATGGAGCTCAGCAGCCTGAGGTCTGAGGACACTGCGGTCTATTACTGTGCAAGACAGGCTTGGGGTTACCCCTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTTCTGCGGCCGCAGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACCAACTGATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGCTGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCT CCCTGTCTCCGGGTAAA(SEQ ID NO：1)。

ATGGTTCTCCTGGTGACAAGCCTTCTGCTCTGTGAGTTACCACACCCAGCATTCCTCCTGATCCCAGAGATTGTGCTGACACAGTCTCCTGCTACCTTATCTCTGTCTCCAGGGCAGAGGCTCACCATCTCATGCAGGGCCAGCCAAAGTGTCAGTACATCTGGCTATAGTTATATGCACTGGTACCAACAGAAACCAGACCAGTCCCCCAAACTCCTCATCAAGTTTGGCTCCAACCTAGAATCTGGCATCCCTGCCAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACCCTCACCATCTCTTCTCTGGAGCCTGAGGATTTTGCAACATATTACTGTCAGCACAGTTGGGAGATTCCGTACACGTTCGGACAGGGGACCAAGCTGGAAATAAAAGGCTCCACCTCTGGATCCGGCAAGCCCGGATCTGGCGAGGGATCCACCAAGGGCCAGGTCCAGCTTGTGCAGTCTGGGCATGAAGTGAAACAGCCTGGGGCCTCAGTGAAGATGTCCTGCAAGGCTTCTGGCTACAGTTTTACTAGCTCCTGGATACACTGGGTGAGACAGGCTCCTGGACAGGGTCTGGAATGGATTGGATACATTTATCCTAGCACTGGTTTTACTGAGTACAATCAGAAGTTCAAGGACAGGGCCACATTGACTGCAGACAAATCCACCAGCACAGCCTACATGGAACTGAGCAGCCTGAGATCTGAGGACACTGCAGTCTATTACTGTGCAAGATGGAGGGACAGCTCGGGCTACCATGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGCTAGCCCCCCATGCCCATCATGCCCAGCACCTGAGTTCCTGGGGGGACCATCAGTCTTCCTGTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACTCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACGTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCAGGAAGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGTACGTGGATGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTTCAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGGCCTCCCGTCCTCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAGCCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCAGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAGGCTAACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGGAGGGGAATGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACACAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAA(SEQ ID NO：2)。

ATGGCTCTGCCCGTGACCGCTCTGCTGCTGCCTCTGGCTCTGCTGCTGCATGCTGCTAGACCCGACATTGTGCTGACCCAGTCCCCAGACTCCCTGGCCGTGTCTCTGGGAGAGAGGGCCACCATCAACTGCAGAGCCTCTGAGAGCGTGGAGTACTATGGCACATCCCTGATGCAGTGGTATCAGCAGAAGCCTGGCCAGCCCCCTAAGCTGCTGATCTATGCCGCCAGCAATGTGGAGTCCGGCGTGCCAGACAGGTTCTCCGGCTCTGGCAGCGGCACCGACTTCACCCTGACAATCAGCTCCCTGCAGGCAGAGGACGTGGCCGTGTACTATTGCCAGCAGTCCCGCAAGGACCCCAGCACCTTCGGCGGAGGCACAAAGGTGGAGATCAAGGGCTCCACCTCTGGCAGCGGCAAGCCCGGCTCTGGAGAGGGCAGCACAAAGGGACAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGAGCAGAGGTGAAGAAGCCTGGCGCATCCGTGAAGGTGTCTTGTAAGGCCAGCGGCTACACCTTCACAAGCTATAACATGCACTGGGTGCGGCAGGCCCCTGGCCAGGGCCTGGAGTGGATCGGCGACATCTACCCAGGCCAGGGCGATACCTCCTATAATCAGAAGTTTAAGGGCAGAGCCACCATGACAGCCGACAAGTCCACCTCTACAGTGTACATGGAGCTGTCTAGCCTGAGGAGCGAGGACACAGCCGTGTACTATTGCGCCCGCGTGGGAGGAGCATTCCCTATGGACTATTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACAGTGTCCTCTGCTAGCCCACCATGCCCTTCCTGTCCTGCACCAGAGTTTCTGGGCGGCCCAAGCGTGTTCCTGTTTCCTCCAAAGCCCAAGGACACCCTGATGATCTCCCGGACCCCAGAGGTGACATGCGTGGTGGTGGACGTGTCTCAGGAGGACCCCGAGGTGCAGTTCAACTGGTACGTGGATGGCGTGGAGGTGCACAATGCCAAGACCAAGCCTCGGGAGGAGCAGTTTAACTCTACCTACAGAGTGGTGAGCGTGCTGACAGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTATAAGTGCAAGGTGAGCAATAAGGGCCTGCCCAGCTCCATCGAGAAGACCATCTCCAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGAGAGCCTCAGGTGTACACACTGCCCCCTTCTCAGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTGAGCCTGACATGTCTGGTGAAGGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGTCCAATGGCCAGCCTGAGAACAATTACAAGACCACACCACCCGTGCTGGACTCTGATGGCAGCTTCTTTCTGTATTCCAGGCTGACCGTGGATAAGTCTCGCTGGCAGGAGGGCAACGTGTTCAGCTGTTCCGTGATGCACGAAGCACTGCACAACCACTACACTCAGAAGTCACTGTCCCTGTC ACTGGGCAAG(SEQ IDNO：3)。

ATGGCTCTGCCCGTGACCGCTCTGCTGCTGCCTCTGGCTCTGCTGCTGCATGCTGCCAGACCTGAAATTGTCCTGACCCAGAGCCCCGCAACACTGTCCCTGAGCCCCGGCGAAAGAGCCACCCTGTCCTGTAGAGCCTCCCAGAGCATCAGCTCCTACCTGGCCTGGTATCAGCAGAAGCCAGGACAGGCTCCACGACTGCTGATCTACGACGCATCCAACCGGGCCACAGGGATTCCAGCTAGATTCTCAGGAAGCGGCTCCGGGACTGACTTTACCCTGACAATCTCTAGTCTGGAGCCTGAAGATTTCGCCGTGTACTATTGCCAGCAGCGGTCTAACTGGCCACTGACCTTTGGACAGGGCACAAATCTGGAGATTAAGGGCTCTACCAGTGGGTCAGGAAAACCCGGCTCCGGGGAAGGATCTACAAAGGGACAGGTGCAGCTGCAGCAGTGGGGAGCAGGGCTGCTGAAACCTAGTGAGACTCTGTCACTGACCTGTGCCGTCTACGGCGGGAGCTTCTCCGATTACTATTGGAACTGGATTCGACAGCCCCCTGGAAAGGGCCTGGAGTGGATCGGGGAAATTAATCACAGGGGATCTACCAACAGTAATCCCTCACTGAAAAGCCGCGTCACTCTGAGCCTGGACACCTCCAAGAATCAGTTCTCTCTGAAACTGAGAAGTGTGACAGCCGCTGATACTGCTGTCTACTATTGCGCATTTGGCTATAGCGATTATGAATACAACTGGTTTGATCCTTGGGGGCAGGGGACTCTGGTCACTGTCTCCTCCGCTAGCCCACCATGCCCTTCCTGTCCTGCACCAGAGTTTCTGGGCGGCCCAAGCGTGTTCCTGTTTCCTCCAAAGCCCAAGGACACCCTGATGATCTCCCGGACCCCAGAGGTGACATGCGTGGTGGTGGACGTGTCTCAGGAGGACCCCGAGGTGCAGTTCAACTGGTACGTGGATGGCGTGGAGGTGCACAATGCCAAGACCAAGCCTCGGGAGGAGCAGTTTAACTCTACCTACAGAGTGGTGAGCGTGCTGACAGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTATAAGTGCAAGGTGAGCAATAAGGGCCTGCCCAGCTCCATCGAGAAGACCATCTCCAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGAGAGCCTCAGGTGTACACACTGCCCCCTTCTCAGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTGAGCCTGACATGTCTGGTGAAGGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGTCCAATGGCCAGCCTGAGAACAATTACAAGACCACACCACCCGTGCTGGACTCTGATGGCAGCTTCTTTCTGTATTCCAGGCTGACCGTGGATAAGTCTCGCTGGCAGGAGGGCAACGTGTTCAGCTGTTCCGTGATGCACGAAGCACTGCACAACCACTACACTCAGAAGTCACTGTCCCTGTCACTGGGCAA GTAA(SEQ ID NO：4)。

ATGGTTCTCCTGGTGACAAGCCTTCTGCTCTGTGAGTTACCACACCCAGCATTCCTCCTGATCCCAGAGATCGTGCTGACCCAGTCCCCCGGCACCCTGTCCCTGTCCCCCGGCGAGCGGGCCACCCTGTCCTGCCGGGCCTCCCAGTCCGTGGGCTCCTCCTACCTGGCCTGGTACCAGCAGAAGCCCGGCCAGGCCCCCCGGCTGCTGATCTACGGCGCCTTCTCCCGGGCCACCGGCATCCCCGACCGGTTCTCCGGCTCCGGCTCCGGCACCGACTTCACCCTGACCATCTCCCGGCTGGAGCCCGAGGACTTCGCCGTGTACTACTGCCAGCAGTACGGCTCCTCCCCCTGGACCTTCGGCCAGGGCACCAAGGTGGAGATCAAGGGCTCCACCTCTGGATCCGGCAAGCCCGGATCTGGCGAGGGATCCACCAAGGGCCAGGTGCAGCTGGTGGAGTCCGGCGGCGGCGTGGTGCAGCCCGGCCGGTCCCTGCGGCTGTCCTGCGCCGCCTCCGGCTTCACCTTCTCCTCCTACACCATGCACTGGGTGCGGCAGGCCCCCGGCAAGGGCCTGGAGTGGGTGACTTTCATCTCCTACGACGGCAACAACAAGTACTACGCCGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGGGACAACTCCAAGAACACCCTGTACCTGCAGATGAACTCCCTGCGGGCCGAGGACACCGCCATCTACTACTGCGCCCGGACCGGCTGGCTGGGCCCCTTCGACTACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTGTCCTCCGCTAGCCCCCCATGCCCATCATGCCCAGCACCTGAGTTCCTGGGGGGACCATCAGTCTTCCTGTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACTCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACGTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCAGGAAGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGTACGTGGATGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTTCAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGGCCTCCCGTCCTCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAGCCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCAGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAGGCTAACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGGAGGGGAATGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACACAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAA (SEQ ID NO：5)。

其中，SEQ ID NO：1是编码分泌型免疫检查点抑制分子片段-抗人PD-L1单链抗体和人IgG1Fc融合蛋白分子(Anti-PD-L1scFv-IgG1Fc)的核苷酸序列；SEQ ID NO：2是编码分泌型免疫检查点抑制分子片段-抗人PD-1单链抗体和人IgG4Fc融合蛋白分子(Anti-PD-1scFv-IgG4Fc)的核苷酸序列；SEQ ID NO：3是编码分泌型免疫检查点抑制分子片段-抗人TIM3单链抗体和人IgG4Fc融合蛋白分子(Anti-TIM3scFv-IgG4Fc)的核苷酸序列；SEQ IDNO：4是编码分泌型免疫检查点抑制分子片段-抗人LAG3单链抗体和人IgG4Fc融合蛋白分子(Anti-LAG3scFv-IgG4Fc)的核苷酸序列；SEQ ID NO：5是编码分泌型免疫检查点抑制分子片段-抗人CTLA4单链抗体和人IgG4Fc融合蛋白分子 (Anti-CTLA4scFv-IgG4Fc)的核苷酸序列。

根据本发明的实施例，所述第二核酸分子具有SEQ ID NO：6所示的核苷酸序列。

ATGGCTCTGCCCGTCACCGCTCTGCTGCTGCCTCTGGCTCTGCTGCTGCACGCCGCACGCCCTGGGAGTCGCAAAGTCTGTAATGGGATCGGCATCGGCGAGTTCAAGGACAGCCTGTCCATCAACGCCACCAATATCAAGCACTTTAAGAATTGCACATCTATCAGCGGCGACCTGCACATCCTGCCAGTGGCCTTCCGGGGCGATTCTTTTACCCACACACCCCCTCTGGACCCTCAGGAGCTGGATATCCTGAAGACCGTGAAGGAGATCACAGGCTTCCTGCTGATCCAGGCCTGGCCTGAGAACAGAACCGATCTGCACGCCTTTGAGAATCTGGAGATCATCCGGGGCAGAACAAAGCAGCACGGCCAGTTCTCCCTGGCCGTGGTGTCTCTGAACATCACCAGCCTGGGCCTGAGGTCCCTGAAGGAGATCTCTGACGGCGATGTGATCATCTCCGGCAACAAGAACCTGTGCTACGCCAACACAATCAATTGGAAGAAGCTGTTTGGCACCTCTGGCCAGAAGACAAAGATCATCTCTAACCGGGGCGAGAATAGCTGCAAGGCAACCGGACAGGTGTGCCACGCACTGTGCAGCCCAGAGGGATGTTGGGGCCCAGAGCCACGGGACTGCGTGAGCTGTAGAAACGTGTCCAGGGGCCGCGAGTGCGTGGATAAGTGTAATCTGCTGGAGGGCGAGCCAAGGGAGTTCGTGGAGAACTCCGAGTGCATCCAGTGTCACCCCGAGTGCCTGCCTCAGGCCATGAACATCACCTGTACAGGCCGCGGCCCCGACAATTGCATCCAGTGTGCCCACTATATCGATGGCCCTCACTGCGTGAAGACCTGTCCAGCCGGCGTGATGGGCGAGAACAATACACTGGTGTGGAAGTACGCAGACGCAGGACACGTGTGCCACCTGTGCCACCCCAATTGCACCTATGGCTGTACAGGACCAGGCCTGGAGGGATGCCCAACCAACGGCCCTAAGATCCCAAGCATCGCCACAGGCATGGTGGGGGCACTGCTGCTGCTGCTGGTGGTGGCTCTGGGGATTGGGCTGTTTATGA GAAGGTAA(SEQ ID NO:6)。

根据本发明的实施例，无功能EGFR受体(tEGFR)缺少N-端配体结合区和细胞内受体酪氨酸激酶活性，但包括野生型EGFR受体的跨膜区和完整的与抗EGFR抗体结合的序列，所以无功能EGFR受体可作为淋巴细胞的自杀标记。本发明实施例的慢病毒导入受体淋巴细胞中，无功能EGFR受体的表达可在有效保证淋巴细胞的对肿瘤细胞的靶向杀伤作用的前提下，如果病人出现严重不良反应，淋巴细胞可被抗EGFR抗体清除，进而提高了本发明实施例的慢病毒、淋巴细胞等治疗肿瘤病人的安全性。

根据本发明的实施例，所述表达载体进一步包括：第一启动子，所述第一启动子与所述第一核酸分子可操作地连接；以及任选的第二启动子，所述任选的第二启动子与所述第二核酸分子可操作地连接。上述第一、第二启动子可分别独立地启动表达第一、第二核酸分子，进而更加有利于相应核酸分子表达的调控。

根据本方明的实施例，所述第一启动子、所述第二启动子分别独立地选自U6，H1，CMV，EF-1，LTR或RSV启动子。发明人发现，U6，H1，CMV，EF-1，LTR或RSV启动子能够高效启动表达第一、第二核酸分子，第一、第二核酸分子的表达效率显著提高。

根据本发明的实施例，所述表达载体包括第一核酸分子、第二核酸分子，并且所述表达载体进一步包括：内部核糖体进入位点序列，所述内部核糖体进入位点序列设置在所述第一核酸分子与所述第三核酸分子之间，所述内部核糖体进入位点具有SEQ ID NO：7所示的核苷酸序列。

CCCCTCTCCCTCCCCCCCCCCTAACGTTACTGGCCGAAGCCGCTTGGAATAAGGCCGGTGTGCGTTTGTCTATATGTTATTTTCCACCATATTGCCGTCTTTTGGCAATGTGAGGGCCCGGAAACCTGGCCCTGTCTTCTTGACGAGCATTCCTAGGGGTCTTTCCCCTCTCGCCAAAGGAATGCAAGGTCTGTTGAATGTCGTGAAGGAAGCAGTTCCTCTGGAAGCTTCTTGAAGACAAACAACGTCTGTAGCGACCCTTTGCAGGCAGCGGAACCCCCCACCTGGCGACAGGTGCCTCTGCGGCCAAAAGCCACGTGTATAAGATACACCTGCAAAGGCGGCACAACCCCAGTGCCACGTTGTGAGTTGGATAGTTGTGGAAAGAGTCAAATGGCTCTCCTCAAGCGTATTCAACAAGGGGCTGAAGGATGCCCAGAAGGTACCCCATTGTATGGGATCTGATCTGGGGCCTCGGTGCACATGCTTTACATGTGTTTAGTCGAGGTTAAAAAAACGTCTAGGCCCCCCGAACCACGGGGACGTGGTTTTCCTTTGAAAAACACGA TGATAATATGGCCACAACC(SEQ ID NO：7)。

内部核糖体进入位点序列的引入，使得第二核酸分子的起始表达不依赖5’帽子结构，并且第一和第二核酸分子成比例表达，进而更加有利于表达调控，所获得的转基因淋巴细胞的治疗安全性更高。

根据本发明的实施例，所述表达载体包括第一核酸分子、第二核酸分子，并且所述表达载体进一步包括:第三核酸分子，所述第三核酸分子设置在所述第一核酸分子与所述第二核酸分子之间或多个所述第一核酸分子之间，并且所述第三核酸分子编码连接肽。连接肽的引入使得所表达的分泌型免疫检查点抑制分子片段以及无功能EGFR呈非融合状态，所表达的多个分泌型免疫检查点抑制分子片段呈非融合状态。

根据本发明的具体实施例，所述连接肽具有SEQ ID NO：8～11所示的氨基酸序列。

E G R G S L L T C G D V E E N P G P(SEQ ID NO：8)。

A T N F S L L K Q A G D V E E N P G P(SEQ ID NO：9)。

Q C T N Y A L L K L A G D V E S N P G P(SEQ ID NO：10)。

V K Q T L N F D L L K L A G D V E S N P G P(SEQ ID NO：11)。

具有SEQ ID NO：8～11所示的氨基酸序列的连接肽，所述连接肽能够在所述受体细胞中被切割。连接肽的引入使得所表达的分泌型免疫检查点抑制分子片段以及无功能EGFR 呈非融合状态，所表达的多个分泌型免疫检查点抑制分子片段呈非融合状态。

根据本发明的实施例，所述表达载体是非致病性病毒载体。

根据发明的具体实施例，所述病毒载体包括选自反转录病毒载体、慢病毒载体或腺病毒相关病毒载体的至少之一。发明实施例中的构建体载体的致病位点经过修饰或突变，已丧失病毒的致病性，进而在根据本发明实施例的非致病性病毒载体介导下的治疗的安全性更高。本发明实施例的病毒的载体在病毒包装和感染过程中，病毒感染范围广泛，既可感染终末分化细胞，又可感染处于分裂期的细胞，既可整合到宿主染色体，又可游离在宿主染色体之外，进而可实现广谱而高效的感染效率。

在本发明的第二方面，本发明提出了一种慢病毒。根据本发明的实施例，所述慢病毒携带具有SEQ ID NO：12～16所示的核苷酸序列的核酸。

GCGGCCGCAATGCTTCTCCTGGTGACAAGCCTTCTGCTCTGTGAGTTACCACACCCAGCATTCCTCCTGATCCCAGACATTGTGCTCACCCAATCTCCAGCTTCTTTGGCTCTGTCTCCCGGGGAGAGAGCCACCCTCTCCTGCAGAGCCACTGAAAGTGTTGAATACTATGGCACAAGTTTAGTGCAGTGGTACCAACAGAAACCAGGACAGCCACCCAAACTCCTCATCTATGCTGCATCCAGCGTAGATTCTGGGGTCCCTTCCAGGTTTAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACCCTCACCATCAATTCTCTGGAGGAGGAGGATGCTGCAATGTATTTCTGTCAGCAAAGTAGGAGGGTTCCGTACACGTTCGGACAGGGGACCAAGCTGGAGATAAAAGGCTCCACCTCTGGATCCGGCAAGCCCGGATCTGGCGAGGGATCCACCAAGGGCGAGGTCCAGCTGGTGCAGTCTGGAGCTGAGGTGAAAAAGCCTGGGGCTTCAGTGAAGATGTCCTGCAAGGCTTCTGGATACACATTCACTAGCTATGTTATGCACTGGGTGAAGCAGGCCCCTGGGCAGCGCCTTGAGTGGATTGGATATGTTAATCCTTTCAATGATGGTACTAAGTACAATGAGATGTTCAAAGGCAGGGCCACACTGACTTCAGACAAATCCACCAGCACAGCCTACATGGAGCTCAGCAGCCTGAGGTCTGAGGACACTGCGGTCTATTACTGTGCAAGACAGGCTTGGGGTTACCCCTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACTGTCTCTTCTGCGGCCGCAGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACCAACTGATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGCTGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAAGGCAGCGGCGAGGGCAGGGGCAGCCTGCTGACCTGCGGCGACGTGGAGGAGAACCCCGGCCCCATGGCTCTGCCCGTCACCGCTCTGCTGCTGCCTCTGGCTCTGCTGCTGCACGCCGCACGCCCTGGGAGTCGCAAAGTCTGTAATGGGATCGGCATCGGCGAGTTCAAGGACAGCCTGTCCATCAACGCCACCAATATCAAGCACTTTAAGAATTGCACATCTATCAGCGGCGACCTGCACATCCTGCCAGTGGCCTTCCGGGGCGATTCTTTTACCCACACACCCCCTCTGGACCCTCAGGAGCTGGATATCCTGAAGACCGTGAAGGAGATCACAGGCTTCCTGCTGATCCAGGCCTGGCCTGAGAACAGAACCGATCTGCACGCCTTTGAGAATCTGGAGATCATCCGGGGCAGAACAAAGCAGCACGGCCAGTTCTCCCTGGCCGTGGTGTCTCTGAACATCACCAGCCTGGGCCTGAGGTCCCTGAAGGAGATCTCTGACGGCGATGTGATCATCTCCGGCAACAAGAACCTGTGCTACGCCAACACAATCAATTGGAAGAAGCTGTTTGGCACCTCTGGCCAGAAGACAAAGATCATCTCTAACCGGGGCGAGAATAGCTGCAAGGCAACCGGACAGGTGTGCCACGCACTGTGCAGCCCAGAGGGATGTTGGGGCCCAGAGCCACGGGACTGCGTGAGCTGTAGAAACGTGTCCAGGGGCCGCGAGTGCGTGGATAAGTGTAATCTGCTGGAGGGCGAGCCAAGGGAGTTCGTGGAGAACTCCGAGTGCATCCAGTGTCACCCCGAGTGCCTGCCTCAGGCCATGAACATCACCTGTACAGGCCGCGGCCCCGACAATTGCATCCAGTGTGCCCACTATATCGATGGCCCTCACTGCGTGAAGACCTGTCCAGCCGGCGTGATGGGCGAGAACAATACACTGGTGTGGAAGTACGCAGACGCAGGACACGTGTGCCACCTGTGCCACCCCAATTGCACCTATGGCTGTACAGGACCAGGCCTGGAGGGATGCCCAACCAACGGCCCTAAGATCCCAAGCATCGCCACAGGCATGGTGGGGGCACTGCTGCTGCTGCTGGTGGTGGCTCTGGGGATTGGGCTGTTTATGAGAAGGTAATCCTACTGCGAATTCTCG AGCGA(SEQ ID NO：12)。

ATGgTTCTCCTGGTGACAAGCCTTCTGCTCTGTGAGTTACCACACCCAGCATTCCTCCTGATCCCAGAGATTGTGCTGACACAGTCTCCTGCTACCTTATCTCTGTCTCCAGGGCAGAGGCTCACCATCTCATGCAGGGCCAGCCAAAGTGTCAGTACATCTGGCTATAGTTATATGCACTGGTACCAACAGAAACCAGACCAGTCCCCCAAACTCCTCATCAAGTTTGGCTCCAACCTAGAATCTGGCATCCCTGCCAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACCCTCACCATCTCTTCTCTGGAGCCTGAGGATTTTGCAACATATTACTGTCAGCACAGTTGGGAGATTCCGTACACGTTCGGACAGGGGACCAAGCTGGAAATAAAAGGCTCCACCTCTGGATCCGGCAAGCCCGGATCTGGCGAGGGATCCACCAAGGGCCAGGTCCAGCTTGTGCAGTCTGGGCATGAAGTGAAACAGCCTGGGGCCTCAGTGAAGATGTCCTGCAAGGCTTCTGGCTACAGTTTTACTAGCTCCTGGATACACTGGGTGAGACAGGCTCCTGGACAGGGTCTGGAATGGATTGGATACATTTATCCTAGCACTGGTTTTACTGAGTACAATCAGAAGTTCAAGGACAGGGCCACATTGACTGCAGACAAATCCACCAGCACAGCCTACATGGAACTGAGCAGCCTGAGATCTGAGGACACTGCAGTCTATTACTGTGCAAGATGGAGGGACAGCTCGGGCTACCATGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGCTAGCCCCCCATGCCCATCATGCCCAGCACCTGAGTTCCTGGGGGGACCATCAGTCTTCCTGTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACTCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACGTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCAGGAAGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGTACGTGGATGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTTCAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGGCCTCCCGTCCTCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAGCCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCAGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAGGCTAACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGGAGGGGAATGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACACAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAAGGCAGCGGCGAGGGCAGGGGCAGCCTGCTGACCTGCGGCGACGTGGAGGAGAACCCCGGCCCCATGGCTCTGCCCGTCACCGCTCTGCTGCTGCCTCTGGCTCTGCTGCTGCACGCCGCACGCCCTGGGAGTCGCAAAGTCTGTAATGGGATCGGCATCGGCGAGTTCAAGGACAGCCTGTCCATCAACGCCACCAATATCAAGCACTTTAAGAATTGCACATCTATCAGCGGCGACCTGCACATCCTGCCAGTGGCCTTCCGGGGCGATTCTTTTACCCACACACCCCCTCTGGACCCTCAGGAGCTGGATATCCTGAAGACCGTGAAGGAGATCACAGGCTTCCTGCTGATCCAGGCCTGGCCTGAGAACAGAACCGATCTGCACGCCTTTGAGAATCTGGAGATCATCCGGGGCAGAACAAAGCAGCACGGCCAGTTCTCCCTGGCCGTGGTGTCTCTGAACATCACCAGCCTGGGCCTGAGGTCCCTGAAGGAGATCTCTGACGGCGATGTGATCATCTCCGGCAACAAGAACCTGTGCTACGCCAACACAATCAATTGGAAGAAGCTGTTTGGCACCTCTGGCCAGAAGACAAAGATCATCTCTAACCGGGGCGAGAATAGCTGCAAGGCAACCGGACAGGTGTGCCACGCACTGTGCAGCCCAGAGGGATGTTGGGGCCCAGAGCCACGGGACTGCGTGAGCTGTAGAAACGTGTCCAGGGGCCGCGAGTGCGTGGATAAGTGTAATCTGCTGGAGGGCGAGCCAAGGGAGTTCGTGGAGAACTCCGAGTGCATCCAGTGTCACCCCGAGTGCCTGCCTCAGGCCATGAACATCACCTGTACAGGCCGCGGCCCCGACAATTGCATCCAGTGTGCCCACTATATCGATGGCCCTCACTGCGTGAAGACCTGTCCAGCCGGCGTGATGGGCGAGAACAATACACTGGTGTGGAAGTACGCAGACGCAGGACACGTGTGCCACCTGTGCCACCCCAATTGCACCTATGGCTGTACAGGACCAGGCCTGGAGGGATGCCCAACCAACGGCCCTAAGATCCCAAGCATCGCCACAGGCATGGTGGGGGCACTGCTGCTGCTGCTGGTGGTGGCTCTGGGGATTGGGCTGTTTATGAGAAGGTAATCCTACTGCGAATTCTCGAGCGA (SEQ ID NO：13)。

ATGGCTCTGCCCGTGACCGCTCTGCTGCTGCCTCTGGCTCTGCTGCTGCATGCTGCTAGACCCGACATTGTGCTGACCCAGTCCCCAGACTCCCTGGCCGTGTCTCTGGGAGAGAGGGCCACCATCAACTGCAGAGCCTCTGAGAGCGTGGAGTACTATGGCACATCCCTGATGCAGTGGTATCAGCAGAAGCCTGGCCAGCCCCCTAAGCTGCTGATCTATGCCGCCAGCAATGTGGAGTCCGGCGTGCCAGACAGGTTCTCCGGCTCTGGCAGCGGCACCGACTTCACCCTGACAATCAGCTCCCTGCAGGCAGAGGACGTGGCCGTGTACTATTGCCAGCAGTCCCGCAAGGACCCCAGCACCTTCGGCGGAGGCACAAAGGTGGAGATCAAGGGCTCCACCTCTGGCAGCGGCAAGCCCGGCTCTGGAGAGGGCAGCACAAAGGGACAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGAGCAGAGGTGAAGAAGCCTGGCGCATCCGTGAAGGTGTCTTGTAAGGCCAGCGGCTACACCTTCACAAGCTATAACATGCACTGGGTGCGGCAGGCCCCTGGCCAGGGCCTGGAGTGGATCGGCGACATCTACCCAGGCCAGGGCGATACCTCCTATAATCAGAAGTTTAAGGGCAGAGCCACCATGACAGCCGACAAGTCCACCTCTACAGTGTACATGGAGCTGTCTAGCCTGAGGAGCGAGGACACAGCCGTGTACTATTGCGCCCGCGTGGGAGGAGCATTCCCTATGGACTATTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACAGTGTCCTCTGCTAGCCCACCATGCCCTTCCTGTCCTGCACCAGAGTTTCTGGGCGGCCCAAGCGTGTTCCTGTTTCCTCCAAAGCCCAAGGACACCCTGATGATCTCCCGGACCCCAGAGGTGACATGCGTGGTGGTGGACGTGTCTCAGGAGGACCCCGAGGTGCAGTTCAACTGGTACGTGGATGGCGTGGAGGTGCACAATGCCAAGACCAAGCCTCGGGAGGAGCAGTTTAACTCTACCTACAGAGTGGTGAGCGTGCTGACAGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTATAAGTGCAAGGTGAGCAATAAGGGCCTGCCCAGCTCCATCGAGAAGACCATCTCCAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGAGAGCCTCAGGTGTACACACTGCCCCCTTCTCAGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTGAGCCTGACATGTCTGGTGAAGGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGTCCAATGGCCAGCCTGAGAACAATTACAAGACCACACCACCCGTGCTGGACTCTGATGGCAGCTTCTTTCTGTATTCCAGGCTGACCGTGGATAAGTCTCGCTGGCAGGAGGGCAACGTGTTCAGCTGTTCCGTGATGCACGAAGCACTGCACAACCACTACACTCAGAAGTCACTGTCCCTGTCACTGGGCAAGGGCAGCGGCGAGGGCAGGGGCAGCCTGCTGACCTGCGGCGACGTGGAGGAGAACCCCGGCCCCATGGCTCTGCCCGTCACCGCTCTGCTGCTGCCTCTGGCTCTGCTGCTGCACGCCGCACGCCCTGGGAGTCGCAAAGTCTGTAATGGGATCGGCATCGGCGAGTTCAAGGACAGCCTGTCCATCAACGCCACCAATATCAAGCACTTTAAGAATTGCACATCTATCAGCGGCGACCTGCACATCCTGCCAGTGGCCTTCCGGGGCGATTCTTTTACCCACACACCCCCTCTGGACCCTCAGGAGCTGGATATCCTGAAGACCGTGAAGGAGATCACAGGCTTCCTGCTGATCCAGGCCTGGCCTGAGAACAGAACCGATCTGCACGCCTTTGAGAATCTGGAGATCATCCGGGGCAGAACAAAGCAGCACGGCCAGTTCTCCCTGGCCGTGGTGTCTCTGAACATCACCAGCCTGGGCCTGAGGTCCCTGAAGGAGATCTCTGACGGCGATGTGATCATCTCCGGCAACAAGAACCTGTGCTACGCCAACACAATCAATTGGAAGAAGCTGTTTGGCACCTCTGGCCAGAAGACAAAGATCATCTCTAACCGGGGCGAGAATAGCTGCAAGGCAACCGGACAGGTGTGCCACGCACTGTGCAGCCCAGAGGGATGTTGGGGCCCAGAGCCACGGGACTGCGTGAGCTGTAGAAACGTGTCCAGGGGCCGCGAGTGCGTGGATAAGTGTAATCTGCTGGAGGGCGAGCCAAGGGAGTTCGTGGAGAACTCCGAGTGCATCCAGTGTCACCCCGAGTGCCTGCCTCAGGCCATGAACATCACCTGTACAGGCCGCGGCCCCGACAATTGCATCCAGTGTGCCCACTATATCGATGGCCCTCACTGCGTGAAGACCTGTCCAGCCGGCGTGATGGGCGAGAACAATACACTGGTGTGGAAGTACGCAGACGCAGGACACGTGTGCCACCTGTGCCACCCCAATTGCACCTATGGCTGTACAGGACCAGGCCTGGAGGGATGCCCAACCAACGGCCCTAAGATCCCAAGCATCGCCACAGGCATGGTGGGGGCACTGCTGCTGCTGCTGGTGGTGGCTCTGGGGATTGGGCTGTTTATGAGAAGGTAATCCTACTGCGAATTCTCGAGCGA(SEQ ID NO：14)。

ATGGCTCTGCCCGTGACCGCTCTGCTGCTGCCTCTGGCTCTGCTGCTGCATGCTGCCAGACCTGAAATTGTCCTGACCCAGAGCCCCGCAACACTGTCCCTGAGCCCCGGCGAAAGAGCCACCCTGTCCTGTAGAGCCTCCCAGAGCATCAGCTCCTACCTGGCCTGGTATCAGCAGAAGCCAGGACAGGCTCCACGACTGCTGATCTACGACGCATCCAACCGGGCCACAGGGATTCCAGCTAGATTCTCAGGAAGCGGCTCCGGGACTGACTTTACCCTGACAATCTCTAGTCTGGAGCCTGAAGATTTCGCCGTGTACTATTGCCAGCAGCGGTCTAACTGGCCACTGACCTTTGGACAGGGCACAAATCTGGAGATTAAGGGCTCTACCAGTGGGTCAGGAAAACCCGGCTCCGGGGAAGGATCTACAAAGGGACAGGTGCAGCTGCAGCAGTGGGGAGCAGGGCTGCTGAAACCTAGTGAGACTCTGTCACTGACCTGTGCCGTCTACGGCGGGAGCTTCTCCGATTACTATTGGAACTGGATTCGACAGCCCCCTGGAAAGGGCCTGGAGTGGATCGGGGAAATTAATCACAGGGGATCTACCAACAGTAATCCCTCACTGAAAAGCCGCGTCACTCTGAGCCTGGACACCTCCAAGAATCAGTTCTCTCTGAAACTGAGAAGTGTGACAGCCGCTGATACTGCTGTCTACTATTGCGCATTTGGCTATAGCGATTATGAATACAACTGGTTTGATCCTTGGGGGCAGGGGACTCTGGTCACTGTCTCCTCCGCTAGCCCACCATGCCCTTCCTGTCCTGCACCAGAGTTTCTGGGCGGCCCAAGCGTGTTCCTGTTTCCTCCAAAGCCCAAGGACACCCTGATGATCTCCCGGACCCCAGAGGTGACATGCGTGGTGGTGGACGTGTCTCAGGAGGACCCCGAGGTGCAGTTCAACTGGTACGTGGATGGCGTGGAGGTGCACAATGCCAAGACCAAGCCTCGGGAGGAGCAGTTTAACTCTACCTACAGAGTGGTGAGCGTGCTGACAGTGCTGCACCAGGATTGGCTGAACGGCAAGGAGTATAAGTGCAAGGTGAGCAATAAGGGCCTGCCCAGCTCCATCGAGAAGACCATCTCCAAGGCCAAGGGCCAGCCCAGAGAGCCTCAGGTGTACACACTGCCCCCTTCTCAGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTGAGCCTGACATGTCTGGTGAAGGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGTCCAATGGCCAGCCTGAGAACAATTACAAGACCACACCACCCGTGCTGGACTCTGATGGCAGCTTCTTTCTGTATTCCAGGCTGACCGTGGATAAGTCTCGCTGGCAGGAGGGCAACGTGTTCAGCTGTTCCGTGATGCACGAAGCACTGCACAACCACTACACTCAGAAGTCACTGTCCCTGTCACTGGGCAAGGGCAGCGGCGAGGGCAGGGGCAGCCTGCTGACCTGCGGCGACGTGGAGGAGAACCCCGGCCCCATGGCTCTGCCCGTCACCGCTCTGCTGCTGCCTCTGGCTCTGCTGCTGCACGCCGCACGCCCTGGGAGTCGCAAAGTCTGTAATGGGATCGGCATCGGCGAGTTCAAGGACAGCCTGTCCATCAACGCCACCAATATCAAGCACTTTAAGAATTGCACATCTATCAGCGGCGACCTGCACATCCTGCCAGTGGCCTTCCGGGGCGATTCTTTTACCCACACACCCCCTCTGGACCCTCAGGAGCTGGATATCCTGAAGACCGTGAAGGAGATCACAGGCTTCCTGCTGATCCAGGCCTGGCCTGAGAACAGAACCGATCTGCACGCCTTTGAGAATCTGGAGATCATCCGGGGCAGAACAAAGCAGCACGGCCAGTTCTCCCTGGCCGTGGTGTCTCTGAACATCACCAGCCTGGGCCTGAGGTCCCTGAAGGAGATCTCTGACGGCGATGTGATCATCTCCGGCAACAAGAACCTGTGCTACGCCAACACAATCAATTGGAAGAAGCTGTTTGGCACCTCTGGCCAGAAGACAAAGATCATCTCTAACCGGGGCGAGAATAGCTGCAAGGCAACCGGACAGGTGTGCCACGCACTGTGCAGCCCAGAGGGATGTTGGGGCCCAGAGCCACGGGACTGCGTGAGCTGTAGAAACGTGTCCAGGGGCCGCGAGTGCGTGGATAAGTGTAATCTGCTGGAGGGCGAGCCAAGGGAGTTCGTGGAGAACTCCGAGTGCATCCAGTGTCACCCCGAGTGCCTGCCTCAGGCCATGAACATCACCTGTACAGGCCGCGGCCCCGACAATTGCATCCAGTGTGCCCACTATATCGATGGCCCTCACTGCGTGAAGACCTGTCCAGCCGGCGTGATGGGCGAGAACAATACACTGGTGTGGAAGTACGCAGACGCAGGACACGTGTGCCACCTGTGCCACCCCAATTGCACCTATGGCTGTACAGGACCAGGCCTGGAGGGATGCCCAACCAACGGCCCTAAGATCCCAAGCATCGCCACAGGCATGGTGGGGGCACTGCTGCTGCTGCTGGTGGTGGCTCTGGGGATTGGGCTGTTTATGAGAAGGTAATCCTACTGCGAATTCTCGAGCGA(SEQ ID NO：15)。

ATGGTTCTCCTGGTGACAAGCCTTCTGCTCTGTGAGTTACCACACCCAGCATTCCTCCTGATCCCAGAGATCGTGCTGACCCAGTCCCCCGGCACCCTGTCCCTGTCCCCCGGCGAGCGGGCCACCCTGTCCTGCCGGGCCTCCCAGTCCGTGGGCTCCTCCTACCTGGCCTGGTACCAGCAGAAGCCCGGCCAGGCCCCCCGGCTGCTGATCTACGGCGCCTTCTCCCGGGCCACCGGCATCCCCGACCGGTTCTCCGGCTCCGGCTCCGGCACCGACTTCACCCTGACCATCTCCCGGCTGGAGCCCGAGGACTTCGCCGTGTACTACTGCCAGCAGTACGGCTCCTCCCCCTGGACCTTCGGCCAGGGCACCAAGGTGGAGATCAAGGGCTCCACCTCTGGATCCGGCAAGCCCGGATCTGGCGAGGGATCCACCAAGGGCCAGGTGCAGCTGGTGGAGTCCGGCGGCGGCGTGGTGCAGCCCGGCCGGTCCCTGCGGCTGTCCTGCGCCGCCTCCGGCTTCACCTTCTCCTCCTACACCATGCACTGGGTGCGGCAGGCCCCCGGCAAGGGCCTGGAGTGGGTGACTTTCATCTCCTACGACGGCAACAACAAGTACTACGCCGACTCCGTGAAGGGCCGGTTCACCATCTCCCGGGACAACTCCAAGAACACCCTGTACCTGCAGATGAACTCCCTGCGGGCCGAGGACACCGCCATCTACTACTGCGCCCGGACCGGCTGGCTGGGCCCCTTCGACTACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTGACCGTGTCCTCCGCTAGCCCCCCATGCCCATCATGCCCAGCACCTGAGTTCCTGGGGGGACCATCAGTCTTCCTGTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACTCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACGTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCAGGAAGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGTACGTGGATGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTTCAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGGCCTCCCGTCCTCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAGCCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCAGGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAGGCTAACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGGAGGGGAATGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACACAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAAGGCAAGGAGGGCAGGGGCAGCCTGCTGACCTGCGGCGACGTGGAGGAGAACCCCGGCCCCATGGCTCTGCCCGTCACCGCTCTGCTGCTGCCTCTGGCTCTGCTGCTGCACGCCGCACGCCCTGGGAGTCGCAAAGTCTGTAATGGGATCGGCATCGGCGAGTTCAAGGACAGCCTGTCCATCAACGCCACCAATATCAAGCACTTTAAGAATTGCACATCTATCAGCGGCGACCTGCACATCCTGCCAGTGGCCTTCCGGGGCGATTCTTTTACCCACACACCCCCTCTGGACCCTCAGGAGCTGGATATCCTGAAGACCGTGAAGGAGATCACAGGCTTCCTGCTGATCCAGGCCTGGCCTGAGAACAGAACCGATCTGCACGCCTTTGAGAATCTGGAGATCATCCGGGGCAGAACAAAGCAGCACGGCCAGTTCTCCCTGGCCGTGGTGTCTCTGAACATCACCAGCCTGGGCCTGAGGTCCCTGAAGGAGATCTCTGACGGCGATGTGATCATCTCCGGCAACAAGAACCTGTGCTACGCCAACACAATCAATTGGAAGAAGCTGTTTGGCACCTCTGGCCAGAAGACAAAGATCATCTCTAACCGGGGCGAGAATAGCTGCAAGGCAACCGGACAGGTGTGCCACGCACTGTGCAGCCCAGAGGGATGTTGGGGCCCAGAGCCACGGGACTGCGTGAGCTGTAGAAACGTGTCCAGGGGCCGCGAGTGCGTGGATAAGTGTAATCTGCTGGAGGGCGAGCCAAGGGAGTTCGTGGAGAACTCCGAGTGCATCCAGTGTCACCCCGAGTGCCTGCCTCAGGCCATGAACATCACCTGTACAGGCCGCGGCCCCGACAATTGCATCCAGTGTGCCCACTATATCGATGGCCCTCACTGCGTGAAGACCTGTCCAGCCGGCGTGATGGGCGAGAACAATACACTGGTGTGGAAGTACGCAGACGCAGGACACGTGTGCCACCTGTGCCACCCCAATTGCACCTATGGCTGTACAGGACCAGGCCTGGAGGGATGCCCAACCAACGGCCCTAAGATCCCAAGCATCGCCACAGGCATGGTGGGGGCACTGCTGCTGCTGCTGGTGGTGGCTCTGGGGATTGGGCTGTTTATGAGAAGGTAATCCTACTGCGAATTCTCGAGCGA(SEQ ID NO：16)。

其中，SEQ ID NO：12是αPD-L1Ab/M(tEGFR)(αPDL1scFv-IgG1Fc-(2A)-M(tEGFR))的核苷酸序列；SEQ ID NO：13是αPD-1Abl/M(αPD1scFv-IgG4Fc-(2A)-M(tEGFR))的核苷酸序列；SEQ ID NO：14是αTIM3Ab/M(αTim3scFv-IgG4Fc-(2A)-M(tEGFR))的核苷酸序列；LSEQID NO：15是αLAG3Ab/M(αLAG3scFv-IgG4Fc-(2A)-M(tEGFR))的核苷酸序列；LSEQ ID NO：16是αCTLA4Abl/M(αCTLA4scFv-IgG4Fc-(2A)-M(tEGFR))的核苷酸序列。根据本发明实施例的上述慢病毒导入淋巴细胞或浸染淋巴细胞，可实现前面所述分泌型免疫检查点抑制分子片段在淋巴细胞中的表达，任选的无功能EGFR在受体细胞膜上的高效表达，实现免疫抑制机制的阻遏，所获得的淋巴细胞的对肿瘤细胞特异性杀伤强大、有效、安全。

在本发明的第三方面，本发明提出了一种转基因细胞。根据本发明的实施例，所述转基因细胞是通过将前面所述的表达载体或前面所述的慢病毒导入受体细胞获得的。根据本发明实施例的上述慢病毒或表达载体导入受体细胞，所获得的转基因细胞可实现前面所述分泌型免疫检查点抑制分子片段的表达，任选的无功能EGFR在受体细胞膜上的高效表达，并且实现免疫抑制机制的阻遏。

根据本发明的实施例，上述受体细胞为干细胞、免疫细胞、肿瘤浸润T淋巴细胞、外周血T淋巴细胞、自然杀伤T淋巴细胞、自然杀伤细胞、B淋巴细胞、浆细胞、肿瘤相关抗原特异的杀伤T细胞(CTL)、肿瘤突变新抗原特异的杀伤T细胞(CTL)、肿瘤相关抗原特异的T淋巴细胞、肿瘤突变新抗原特异的T淋巴细胞。需要说明的是，本申请所述的肿瘤相关抗原特异的杀伤T细胞是指特异性针对表达肿瘤相关抗原的肿瘤的杀伤T细胞；本申请所述的肿瘤突变新抗原特异的杀伤T细胞是指特异性针对表达肿瘤突变新抗原的肿瘤的杀伤T细胞；本申请所述的肿瘤相关抗原特异的T淋巴细胞是指特异性针对表达肿瘤相关抗原的肿瘤的T淋巴细胞；肿瘤突变新抗原特异的T淋巴细胞是指特异性针对表达肿瘤突变新抗原的肿瘤的T淋巴细胞。

根据本发明的实施例，所述受体细胞是PD-1⁺免疫细胞，肿瘤浸润PD-1⁺CD3⁺T淋巴细胞，肿瘤浸润PD-1⁺CD8⁺T淋巴细胞，外周血PD-1⁺CD3⁺T淋巴细胞或外周血PD-1⁺CD8⁺ T淋巴细胞。

在本发明的第四方面，本发明提出了一种分泌型免疫检查点抑制分子融合蛋白。根据本发明的实施例，所述融合蛋白是由前面所述的转基因细胞分泌的，又可称为分泌型抗免疫检查点抗体。根据本发明实施例的分泌型融合蛋白可有效拮抗肿瘤细胞的免疫逃逸，进而利用根据本发明实施例的分泌型融合蛋白可增强免疫系统对肿瘤细胞的免疫杀伤。

在本发明的第五方面，本发明提出了一种分泌型免疫检查点抑制分子融合蛋白。根据本发明的实施例，所述融合蛋白包括免疫检查点分子胞外段以及IgG Fc。

根据本发明的实施例，上述分泌型免疫检查点抑制分子融合蛋白还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：

根据本发明的实施例，所述IgG Fc为IgG1Fc或IgG4Fc。

根据本发明的实施例，所述融合蛋白包括：PD-1胞外段和IgG1Fc。

根据本发明的实施例，所述融合蛋白包括：PD-L1胞外段和IgG4Fc。

根据本发明的实施例，所述融合蛋白包括：PD-L2胞外段和IgG4Fc。

根据本发明的实施例，所述融合蛋白包括：TIM3胞外段和IgG1Fc。

根据本发明的实施例，所述融合蛋白包括：LAG3胞外段和IgG1Fc。

在本发明的第六方面，本发明提出了一种用于治疗癌症的治疗组合物。根据本发明的实施例，所述组合物包括：前面所述的表达载体、前面所述的慢病毒、前面所述的转基因细胞或前面所述的分泌型免疫检查点抑制分子融合蛋白。利用根据本发明实施例的治疗组合物，可有效实现和促进免疫系统对癌症细胞的特异性杀伤，且安全度高。

附图说明

图1是根据本发明实施例的重组慢病毒载体结构示意图；

图2是根据本发明实施例的PD-1⁺CD8⁺T细胞对同一病人肿瘤细胞具有杀伤活性的结果图；

图3是根据本发明实施例的慢病毒载体LV-αPDL1/M转导增强PD-1⁺CD8⁺T细胞杀伤活性，但没有明显增强PD-1^-CD8⁺T细胞及未分离CD8⁺T细胞杀伤活性；以及

图4是根据本发明实施例的慢病毒载体LV-αPDL1/M转导，比慢病毒载体LV-M转导，更有效增强PD-1⁺CD8⁺T细胞对同一病人肿瘤细胞杀伤活性的结果图。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例。下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

表达载体

在本发明的第一方面，本发明提出了一种表达载体。根据本发明的实施例，所述表达载体携带下列核酸分子：第一核酸分子，所述第一核酸分子编码分泌型免疫检查点抑制分子片段；任选地，进一步携带第二核酸分子，所述第二核酸分子编码无功能EGFR。将本发明实施例的表达载体导入受体细胞中，分泌型抗免疫检查点抗体在受体细胞中高效表达并分泌到细胞外，由免疫检查点介导的免疫逃逸机制被阻遏。将本发明实施例的表达载体导入受体细胞，如淋巴细胞中，淋巴细胞对肿瘤细胞的特异性杀伤强大而有效。

根据本发明的实施例，所述分泌型免疫检查点抑制分子片段包括：抗免疫检查点单链抗体分子以及IgG Fc，任选地，所述IgG Fc为IgG1 Fc或IgG4 Fc。由此，分泌型免疫检查点抑制分子片段分泌到细胞外，并且与细胞表面的免疫检查点特异性结合，进而有效阻遏免疫检查点介导的免疫逃逸机制。

人类抗体有一个150kDa的基础结构，这个基础结构包括两个免疫球蛋白轻链和两个免疫球蛋白重链，重链和轻链间以共价键或非共价键连接，进而导致形成三个独立的蛋白区-两个Fab区和一个Fc区。Fab区和Fc区通过作为铰链区的有弹性的连接部连接的。抗体中的Fab区是一样的结构，Fab区有一个特异性的抗原结合位点，Fc区与配体的相互作用位点，该位点能够诱导效应器功能，包括细胞Fc受体和C1q补体成份。治疗性抗体的生理学活性由两个独立的天然免疫球蛋白机制介导：治疗性抗体的效力由它的特异性和与目标抗原的二价结合引起(如，阻断或中和靶抗原或诱导细胞凋亡)，也可由Fc和效应器配体(Fc受体和C1q部件)形成的免疫复合体激活的效应器功能引起。

单链抗体(scFv)是一种基因工程抗体的形式，其中VH和VL域与柔性多肽连接体相连。与整体抗体和Fab相比，单链抗体表现出更好的组织渗透药动学，并且由于抗原结合表面未被改变而具有完全的结合特异性。然而，单链抗体在血液中的半衰期短，没有Fc片段效应功能，因为单链抗体中没有Fc分子片段。

抗体的Fc区介导其血清半衰期和效应功能，如补体依赖的细胞毒(CDC)，抗体依赖性细胞毒作用(ADCC)和抗体依赖性细胞吞噬(ADCP)。Fc片段用于与单链抗体连接，以增加单链抗体在血液中的半衰期，并具有Fc效应功能。五类免疫球蛋白(IgM、IgD和 IgE，IgG，IgA，IgG亚类)和四个IgG亚类(IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)是存在于人类。人血清中IgG含量最高。四亚类IgG1、IgG2、IgG3和IgG4是高度保守的，在他们的恒定区不同，尤其是在铰链上CH2域。这些地区的参与结合IgG Fc受体(FcγR)和补体C1q。结果，不同的子类有不同的效应功能，在触发FCγr表达细胞，从而引起吞噬或抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用，并激活补体。IgG1和IgG3能有效触发这一经典途径补体，但 IgG2和IgG4并不那么有效。IgG的FcγRs或C1q结合取决于残基位于铰链区和CH2域。许多突变已在人类IgG1CH2域来改变抗体CDC及ADCC效应。值得注意的是，在位置333 的丙氨酸置换报道提高ADCC和CDC。

PD-L1免疫检查点分子往往是在肿瘤细胞中高表达。根据本发明的实施例，针对肿瘤细胞表达PD-L1的单链抗体融合了IgG1Fc，此单链抗体的半衰期延长，并且此单链抗体与PD-L1结合能力增强，从而阻断PD-1和PD-L1相互作用，增强CTL杀伤肿瘤细胞。IgG1 Fc能够有效的触发效应功能，如补体依赖的细胞毒(CDC)，抗体依赖性细胞毒作用(ADCC) 和抗体依赖性细胞吞噬(ADCP)，来进一步杀伤肿瘤细胞。

免疫调控分子，如PD-1、Tim-3、LAG3，和CTLA4，往往在T细胞高表达。由于其效应功能缺失，IgG4抗体有抗体结合阻断功能，而无细胞Fc介导杀伤清除功能。对于抗免疫细胞表面免疫检查点分子的抗体，特别是那些有效应功能的免疫细胞，需要消除Fc介导杀伤清除功能。根据本发明的实施例的抗免疫细胞表面免疫检查点的抗体与IgG4Fc亚类融合，半衰期延长，scFv抗体能与PD-1的结合，但不会引起有效应功能损伤免疫细胞。

根据本发明的实施例，所述免疫检查点分子包括选自PD-L1、PD-L2、CTLA4、PD-1、TIM3、BTLA、LAG-3的至少之一。将本发明实施例的表达载体导入受体淋巴细胞，分泌型免疫检查点抑制分子片段分泌出后与上述免疫检查点分子结合，进而竞争性抑制肿瘤细胞的免疫逃逸，进而淋巴细胞对肿瘤细胞的特异性杀伤进一步显著增强。

根据本发明的实施例，所述分泌型免疫检查点抑制分子片段为抗PD-L1单链抗体和 IgG1Fc融合蛋白分子。

根据本发明的实施例，所述分泌型免疫检查点抑制分子片段为抗PD-1单链抗体和IgG4Fc融合蛋白分子。

根据本发明的实施例，所述分泌型免疫检查点抑制分子片段为抗LAG3单链抗体和IgG4Fc融合蛋白分子，

根据本发明的实施例，所述分泌型免疫检查点抑制分子片段为抗CTLA4单链抗体和 IgG4Fc融合蛋白分子。

根据本发明的实施例，所述第一核酸分子具有SEQ ID NO：1～5所示的核苷酸序列。

根据本发明的实施例，所述第二核酸分子具有SEQ ID NO：6所示的核苷酸序列。

根据本发明的实施例，无功能EGFR受体缺少N-端配体结合区和细胞内受体酪氨酸激酶活性，但包括野生型EGFR受体的跨膜区和完整的与抗EGFR抗体结合的序列，所以无功能EGFR受体可作为淋巴细胞的自杀标记。本发明实施例的慢病毒导入受体淋巴细胞中，无功能EGFR受体的表达可在有效保证淋巴细胞的对肿瘤细胞的靶向杀伤作用的前提下，如果病人出现严重不良反应，淋巴细胞可被抗EGFR抗体清除，进而提高了本发明实施例的慢病毒、淋巴细胞等治疗肿瘤病人的安全性。

根据本发明的实施例，所述表达载体进一步包括：第一启动子，所述第一启动子与所述第一核酸分子可操作地连接；以及任选的第二启动子，所述任选的第二启动子与所述第二核酸分子可操作地连接。上述第一、第二启动子可分别独立地启动表达第一、第二核酸分子，进而更加有利于相应核酸分子表达的调控。

根据本方明的实施例，所述第一启动子、所述第二启动子分别独立地选自U6，H1，CMV，EF-1，LTR或RSV启动子。发明人发现，U6，H1，CMV，EF-1，LTR或RSV启动子能够高效启动表达第一、第二核酸分子，第一、第二核酸分子的表达效率显著提高。

根据本发明的实施例，所述表达载体包括第一核酸分子、第二核酸分子，并且所述表达载体进一步包括：内部核糖体进入位点序列，所述内部核糖体进入位点序列设置在所述第一核酸分子与所述第二核酸分子之间，所述内部核糖体进入位点具有SEQ ID NO：7所示的核苷酸序列。

内部核糖体进入位点序列的引入，使得第二核酸分子的起始表达不依赖5’帽子结构，并且第一和第二核酸分子成比例表达，进而更加有利于表达调控，所获得的转基因淋巴细胞的治疗安全性更高。

根据本发明的实施例，所述表达载体包括第一核酸分子、第二核酸分子，并且所述表达载体进一步包括:第三核酸分子，所述第三核酸分子设置在所述第一核酸分子与所述第二核酸分子之间或多个所述第一核酸分子之间，并且所述第三核酸分子编码连接肽。连接肽的引入使得所表达的分泌型免疫检查点抑制分子片段以及无功能EGFR呈非融合状态，所表达的多个分泌型免疫检查点抑制分子片段呈非融合状态。

根据本发明的具体实施例，所述连接肽具有SEQ ID NO：8～11所示的氨基酸序列。具有SEQ ID NO：8～11所示的氨基酸序列的连接肽，所述连接肽能够在所述受体细胞中被切割。连接肽的引入使得所表达的分泌型免疫检查点抑制分子片段以及无功能EGFR呈非融合状态，所表达的多个分泌型免疫检查点抑制分子片段呈非融合状态。根据本发明的实施例，上述连接肽为2A自切割连接肽。2A连接肽在口足病病毒(FMDV)中被发现，通常为具有19～22个氨基酸的寡肽，定位在小核糖核酸病毒家族的膜蛋白之间。FMDV病毒的 2A自切割肽能够自切割，进而产生成熟病毒蛋白，这就是所熟知的翻译效应“停止前进”或“停止搬运”。切割位点位于C-末端的最后一个甘氨酸和2B下游蛋白的第一个脯氨酸之间(-LLNFDLLKLAGDVESNPG↓P-)。目前，已经成功在其他病毒mRNA分子发现了 2A类似序列，包括猪捷申病毒-1 2A(P2A，序列如SEQ ID NO：9所示)，thoseaasigna病毒2A(T2A，序列如SEQID NO：8所示)，马鼻炎A病毒2A(E2A，序列如SEQ ID NO：10)，质型多角体病毒(BmCPV 2A)和软化病病毒(BmIFV 2A)(F2A，序列如SEQ ID NO： 11)。发明人通过筛选实验发现，具有自身切割能力的SEQ ID NO：8～11所示氨基酸序列的连接肽设置在第一核酸分子与第二核酸分子之间，其自身切割的功能在受体细胞中能够得到很好地发挥，获得的分泌型融合蛋白以及无功能EGFR呈非融合状态表达在淋巴内的效率和成功率进一步显著提高。

根据本发明的实施例，所述表达载体是非致病性病毒载体。

根据发明的具体实施例，所述病毒载体包括选自反转录病毒载体、慢病毒载体或腺病毒相关病毒载体的至少之一。发明实施例中的构建体载体的致病位点经过修饰或突变，已丧失病毒的致病性，进而在根据本发明实施例的非致病性病毒载体介导下的治疗的安全性更高。本发明实施例的病毒的载体在病毒包装和感染过程中，病毒感染范围广泛，既可感染终末分化细胞，又可感染处于分裂期的细胞，既可整合到宿主染色体，又可游离在宿主染色体之外，进而可实现广谱而高效的感染效率。

根据本发明的具体实施例，以构建一个慢病毒载体为例，发明人为了构建一个慢病毒载体，在某些病毒序列的位置，将目的核酸插入到病毒基因组中，从而产生复制缺陷的病毒。为了产生病毒体，发明人进而构建包装细胞系(包含gag，pol和env基因，但不包括LTR和包装成分)。发明人将含有目的基因的重组质粒，连同慢病毒LTR和包装序列，一起引入包装细胞系中。包装序列允许重组质粒RNA转录产物被包装到病毒颗粒中，然后被分泌到培养基中。进而发明人收集包含重组慢病毒的培养基，有选择性地浓缩，并用于基因转移。慢病毒载体可以感染多种细胞类型，包括可分裂细胞和不可分裂细胞。

另外，根据本发明的实施例，本发明实施例的慢病毒是复合慢病毒，除了常见的慢病毒基因gag，pol和env，还包含有调控和结构功能的其他基因。慢病毒载体是本领域技术人员所熟知的，慢病毒包括：人类免疫缺陷病毒HIV–1，HIV–2和猿猴免疫缺陷病毒 SIV。慢病毒载体通过多重衰减艾滋病毒致病基因产生，例如全部删除基因env，vif，vpr， vpu和nef，使慢病毒载体形成生物安全型载体。重组慢病毒载体能够感染非分裂细胞，同时可用于体内和体外基因转移和核酸序列表达。例如：在合适的宿主细胞中，和带有包装功能(gag，pol，env，rev和tat)的两个或更多的载体一起，能够感染非分裂细胞。重组病毒的靶向性，是通过抗体或特定配体(靶向特定细胞类型受体)与膜蛋白的结合来实现的。同时，重组病毒的靶向性通过插入一个有效序列(包括调控区域)到病毒载体中，连同另一个编码了特定靶细胞上的受体的配体的基因，使载体具有了特定的靶向。各种有用的慢病毒载体，以及各种方法和操作等产生的载体，用于改变细胞的表达。

根据本发明的实施例，本发明实施例的腺关联病毒载体(AAV)可使用一种或多种为人熟知的血清类型腺关联病毒载体的DNA构建。本领域技术人员构建一个合适的腺关联病毒载体，以此携带和共表达小发夹RNA，该小发夹RNA可以抑制PD1等基因的表达。

另外，根据本发明的实施例，本发明实施例的也包含微基因。微基因意味着用组合(选定的核苷酸序列和可操作的必要的相关连接序列)来指导转化、转录和/或基因产物在体内或体外的宿主细胞中的表达。应用“可操作的连接”序列包含连续目的基因的表达控制序列，和作用于反式或远距离控制目的基因的表达控制序列。

另外，本发明实施例的载体还包括常规控制元素，在和质粒载体一起的细胞转染或/和病毒载体一起的细胞感染中，这些元素允许转录、转化和/或小发夹RNA的表达。大量的表达控制序列(包括天然的，可诱导和/或特定组织的启动子)可能被使用。根据本发明的实施例，表达shRNA的启动子为RNA聚合酶启动子。同时，根据本发明的实施例，启动子为选自U6，H1，pol I，pol II和pol III的RAN聚合酶启动子。根据本发明的实施例，启动子为组织特异型启动子。根据本发明的实施例，启动子为诱导型启动子。根据本发明的实施例，启动子为选自基于所选载体的启动子。根据本发明的实施例，当选择慢病毒载体时，启动子为U6，H1，CMV IE基因，EF-1α，泛素C或磷酸甘油激酶(PGK)启动子。其他常规表达控制序列包括可选标记或报告基因，包括编码遗传霉素，潮霉素，氨苄青霉素或嘌呤霉素耐药性等的核苷酸序列。载体的其他组件包括复制起点。

构建载体的技术为本领域技术人员所熟知的，这些技术包括常规克隆技术，例如在本发明实施例中所使用的聚合酶链反应和任何适当的提供所需的核苷酸序列的方法。根据本发明的实施例，发明人构建了共表达任选的无功能EGFR受体以及分泌型融合蛋白的病毒载体。本发明实施例的运送表达任选的无功能EGFR受体的核酸分子以及表达分泌型融合蛋白的病毒载体或质粒是复合的，此病毒载体或质粒可结合聚合物或其他材料来增加其稳定性，或协助其靶向运动。

慢病毒

在本发明的第二方面，本发明提出了一种慢病毒。根据本发明的实施例，所述慢病毒携带具有SEQ ID NO：12～16所示的核苷酸序列的核酸。根据本发明实施例的上述慢病毒导入淋巴细胞或浸染淋巴细胞，可实现前面所述分泌型免疫检查点抑制分子片段在淋巴细胞中的表达，任选的无功能EGFR在受体细胞膜上的高效表达，实现免疫抑制机制的阻遏，所获得的淋巴细胞的对肿瘤细胞特异性杀伤强大、有效、安全。

转基因细胞

在本发明的第三方面，本发明提出了一种转基因细胞。根据本发明的实施例，所述转基因细胞是通过将前面所述的表达载体或前面所述的慢病毒导入受体细胞获得的。根据本发明实施例的上述慢病毒或表达载体导入受体细胞，所获得的转基因细胞可实现前面所述分泌型免疫检查点抑制分子片段的表达，任选的无功能EGFR在受体细胞膜上的高效表达，并且实现免疫抑制机制的阻遏。

根据本发明的实施例，上述受体细胞为干细胞、免疫细胞、肿瘤浸润T淋巴细胞、外周血T淋巴细胞、然杀伤T淋巴细胞、自然杀伤细胞、B淋巴细胞或浆细胞。

根据本发明的实施例，所述受体细胞是PD-1⁺免疫细胞，肿瘤浸润PD-1⁺CD3⁺T淋巴细胞，肿瘤浸润PD-1⁺CD8⁺T淋巴细胞，外周血PD-1⁺CD3⁺T淋巴细胞或外周血PD-1⁺CD8+ T淋巴细胞。

自体肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)过继性细胞治疗在治疗转移性黑色素瘤中，有一半患者的肿瘤复发得到有效控制，约四分之一的患者能得到长期的完全控制。TIL识别目标分子的2大类：自身抗原和突变的新抗原。然而，TIL是一种异质细胞群。最近的研究表明，肿瘤浸润PD1⁺CD8⁺细胞富集了针对肿瘤突变新抗原CD8⁺T淋巴细胞。此外，肿瘤患者外周血中的PD1⁺CD8⁺T细胞也富集了针对肿瘤突变新抗原CD8⁺T淋巴细胞。根据本发明实施例的表达载体导入癌症患者体内的PD1⁺CD8⁺T淋巴细胞，有利于针对肿瘤突变新抗原，肿瘤特异的杀伤细胞(CTLs)的肿瘤杀伤活性。

分泌型免疫检查点抑制分子融合蛋白

在本发明的第四方面，本发明提出了一种分泌型免疫检查点抑制分子融合蛋白。根据本发明的实施例，所述融合蛋白是由前面所述的转基因细胞分泌的。根据本发明实施例的分泌型融合蛋白可有效拮抗肿瘤细胞的免疫逃逸，进而利用根据本发明实施例的分泌型融合蛋白可增强免疫系统对肿瘤细胞的免疫杀伤。

根据本发明的实施例，所述融合蛋白包括免疫检查点分子胞外段以及IgG Fc。

根据本发明的实施例，所述IgG Fc为IgG1Fc或IgG4Fc。

根据本发明的实施例，所述融合蛋白包括：PD-1胞外段和IgG1Fc。

根据本发明的实施例，所述融合蛋白包括：PD-L1胞外段和IgG4Fc。

根据本发明的实施例，所述融合蛋白包括：PD-L2胞外段和IgG4Fc。

根据本发明的实施例，所述融合蛋白包括：TIM3胞外段和IgG1Fc。

根据本发明的实施例，所述融合蛋白包括：LAG3胞外段和IgG1Fc

治疗组合物

在本发明的再一方面，本发明提出了一种用于治疗癌症的治疗组合物。根据本发明的实施例，所述组合物包括：前面所述的表达载体、前面所述的慢病毒、前面所述的转基因细胞或前面所述的分泌型免疫检查点抑制分子融合蛋白。利用根据本发明实施例的治疗组合物，可有效实现和促进免疫系统对癌症细胞的特异性杀伤，且安全度高。

根据本发明的实施例，提供给患者的本发明实施例的治疗组合物，较好的应用于生物兼容溶液或可接受的药学运载载体。作为准备的各种治疗组合物被悬浮或溶解在医药上或生理上可接受的载体，如生理盐水；等渗的盐溶液或其他精于此道的人的比较明显的配方中。适当的载体在很大程度上取决于给药途径。其他有水和无水的等渗无菌注射液和有水和无水的无菌悬浮液，是医药上可接受的载体。

根据本发明的实施例，足够数量的病毒载体被转导入靶向T细胞中，并提供足够强度的转基因，和表达任选的无功能EGFR受体以及表达特有的分泌型免疫检查点抑制分子融合蛋白。治疗试剂的剂量主要取决于治疗状况，年龄，体重，病人的健康程度，从而可能造成病人的变异性。

表达任选的无功能EGFR受体以及表达特有的上述分泌型免疫检查点抑制分子融合蛋白这些方法是联合治疗的一部分。这些病毒载体和用于过继免疫治疗的抗肿瘤T细胞，可以被单独或结合其他治疗癌症的方法一起执行。在合适的条件下，一个治疗方法的包括使用一个或多个药物疗法。

根据本发明的实施例，所治疗癌症的类型不受特别限制。利用根据本发明实施例的治疗组合物，对PD-L1或PD-L2阳性肿瘤细胞的特异性杀伤效果显著。

提高淋巴细胞免疫杀伤能力的方法

在本发明最后一方面，本发明提出了一种提高淋巴细胞免疫杀伤能力的方法。根据本发明的实施例，该方法包括：使所述淋巴细胞表前面所述的分泌型免疫检查点抑制分子融合蛋白。利用根据本发明实施例的上述方法，能够有效提高淋巴细胞对肿瘤细胞的特异性免疫杀伤。

在以下实施例中所用到的细胞系和基本实验技术如下所述：

慢病毒的产生和人T淋巴细胞的转导

目的是产生复制缺陷的慢病毒载体，并将慢病毒载体离心收集用于人T淋巴细胞的转导。

下面简要介绍慢病毒载体的产生、收集的实验过程：将293T细胞铺在底面积为150- 平方厘米的细胞培养皿中，并根据说明书，使用Express-In(购自Open Biosystems/Thermo Scientific，Waltham，MA)对293T细胞进行病毒转导。每盘细胞加入15μg的慢病毒转基因质粒、5μg的pVSV-G(VSV糖蛋白表达质粒)、10μg的pCMVR8.74质粒 (Gag/Pol/Tat/Rev表达质粒)和174 μl的Express-In(浓度为1μg/μl)。分别于24小时和48 小时收集上清，并使用超速离心机在28，000 rpm(离心机转子为Beckman SW 32Ti，购自Beckman Coulter，Brea，CA)的条件下离心2小时。最后用0.75 ml的RPMI-1640培养基对病毒质粒沉淀进行重悬。

从健康及肿瘤病人志愿者供体上分离人原代T淋巴细胞。人T淋巴细胞培养在RPMI-1640培养基中并使用抗CD3和CD28的单克隆抗体包被的珠(购自Invitrogen，Carlsbad，CA)进行刺激激活。人T淋巴细胞激活后的18～24小时，采用自旋-接种的方法对T淋巴细胞进行转导，转导过程如下所述：在24-孔板中，每孔铺有0.5×10⁶T淋巴细胞，向每孔细胞中加入0.75 ml的上述重悬的病毒上清和Polybrene(浓度为8 μg/ml)。细胞和病毒质粒的混合液在台式离心机(购自Sorvall ST 40；Thermo Scientific)中离心，离心条件是室温，2500rpm，时间为90分钟。人重组白细胞介素-2(IL-2；购自Novartis，Basel，Switzerland)每隔2～3天加入T淋巴细胞培养液中，IL-2的终浓度为100-IU/ml，在T淋巴细胞培养过程中，保持细胞的密度为0.5×10⁶～1×10⁶/ml。一旦被转导的T淋巴细胞出现休眠，例如细胞生长速度变慢和细胞变小，其中，细胞生长速度和大小是通过CoulterCounter (购自Beckman Coulter)评估的，或被转导的T淋巴细胞在某个计划的时间点上，T淋巴细胞即可用来做功能分析。

本申请的实施例中所用的流式细胞仪为BD FACSCanto II(购自BDBiosciences)，并且流式细胞分析数据使用FlowJo version 7.2.5软件(购自Tree Star，Ashland，OR)进行分析。

抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用(ADCC)

在以下实施例中，采用4小时-⁵¹Cr-释放法评估抗-EGFR抗体诱导表达无功能EGFR受体的淋巴细胞的细胞依赖性裂解的能力。被转导了慢病毒载体的人类T淋巴细胞被用作靶细胞。100μCi Na₂ ⁵¹CrO₄(购自GE Healthcare Life Sciences，Marlborough，MA)标定2～5 x 10⁶靶细胞，标定条件是37℃下震荡孵育1小时。细胞采用PBS润洗三次，并且用培养基重悬(细胞密度是1x 10⁵/ml)。继而，被标定的细胞铺在96-孔板中(每孔铺有5×10³个细胞，加有50μl培养基)，并加入50μl的抗-EGFR抗体(购自Erbitux，Genentech)(终浓度为20μg/ml)，在常温条件下预培养30分钟.继而将含有抗体的培养基换成普通培养基，由此来检测⁵¹Cr的自发释放。加入终浓度为1％的Triton X-100以保证⁵¹Cr的最大释放量。在以下具体实施中，人PBMC(效应细胞)加入孔板中(每孔5×10⁵个细胞)并将细胞在37℃培养过夜。第二天，收集细胞上清，并利用γ计数器计算cpm以此来确定⁵¹Cr 的释放。细胞毒性比例用以下公式计算：％特异性裂解＝(实验释放cpm数据-自发释放cpm 数据)/(最大释放cpm数据-自发释放cpm数据)*100，其中，最大释放cpm数据通过靶细胞中加入Triton X-100实现的，自发释放cpm数据是在没有抗EGFR抗体和效应细胞的条件下测量的。

铬释放实验

实施例中应用4–小时⁵¹铬释放法分析评估重组受体T细胞的细胞毒活性。具体步骤如下：目标测试细胞用⁵¹Cr在37摄氏度下标记1小时。标记后，用含有10％胎牛血清(FCS) 的RPMI培养基润洗细胞。润洗后，将细胞重悬在相同的培养基中，重悬细胞的浓度是1× 10⁵/ml。转导后T细胞以不同的效靶细胞比值(E：T)加入目标测试细胞悬浮液中，并将细胞种在96-孔中，每孔体积是200微升。将细胞在37度培养箱中培养4小时。4小时后，从每孔中取出30微升的上清放于计数器的96-微孔板进行计数分析。分析仪器是顶级计数NXT微闪烁计数器(购自Packard Bioscience)。所有计数孔中效应细胞的数目是基于T细胞总数来计算的。被标记的目标测试细胞是PD-L1阳性肿瘤细胞。

实施例1构建共表达分泌型抗免疫检查点抗体及无功能EGFR受体的载体

本实施例中，发明人将编码抗人PD-L1单链抗体及人IgG1Fc融合基因克隆到含有EF-1 启动子的慢病毒载体(lentiviral vector)上。克隆过程中，选择的限制性酶切是XbaI和NotI 双酶切，以及NotI和XhoI双酶切，通过酶切、连接、筛选和目的质粒的扩增，生成表达分泌型抗免疫检查点抗体的慢病毒质粒(LV-αPDL1scFv-Fc(LV-αPDL1)。发明人将编码抗人 PD-1单链抗体及人IgG4Fc融合基因克隆到含有EF-1启动子的慢病毒载体(lentiviral vector) 上。克隆过程中，选择的限制性酶切是XbaI和NotI双酶切，以及NotI和XhoI双酶切，通过酶切、连接、筛选和目的质粒的扩增，生成表达分泌型抗免疫检查点抗体的慢病毒质粒(LV-αPD1scFv-Fc(LV-αPD-1)。包含IRES和表达无功能EGFR受体(M)的序列被克隆进LV-αPD-L1或LV-αPD-1载体质粒，构建成LV-αPD-L1/M或LV-αPD-1/M。图1是慢病毒载体的示意图，包含编码分泌型抗免疫检查点(PD-L1，PD-1，TIM3，LAG3， CTLA4)scFv和IgGFc融合蛋白的序列、IRES、编码无功能EGFR受体序列(M)。编码分泌型抗免疫检查点抗体的序列在启动子EF-1的启动调控下，表达无功能EGFR受体(M) 的序列作为一个单独的mRNA转录单元从IRES序列后开始翻译。

实施例2从肿瘤病人分离的PD-1⁺CD8⁺T细胞对自体肿瘤细胞具有杀伤活性。

从HLA-A2⁺转移性黑色素瘤患者身上取PBLs(外周血)和新鲜的肿瘤样本。通过静脉穿刺取出PBLs，并进行梯度离心(LSM；ICN Biomedicals Inc.)，冷冻保存直至分析待用。新鲜的肿瘤样本在无菌条件下切碎，利用酶进行消化处理(消化液的组成为：RPMI-1640 培养基，培养基中含有L-glutamine[Lonza]，1mg/ml胶原酶IV[Sigma-Aldrich]，30U/ml DNA酶以及抗生素)，消化条件是在室温条件下消化过夜或在37℃条件下消化数小时，并间歇使用gentleMACS(Miltenyi Biotech)进行机械分离。肿瘤单细胞悬液被用来获得原代肿瘤细胞系和用来分离和扩增PD-1⁺CD8⁺T细胞。来自于肿瘤单细胞悬液的PD-1⁺CD8⁺⁺T 细胞是通过FCAS筛选和在T25烧瓶中扩增获得的，所述扩增是在T细胞培养基中进行的，培养基中含有30ng/ml可溶性抗CD3抗体(OKT3，Miltenyi)，3，000IU/ml重组人类IL-2(Chiron)，和来自3个异体移植捐赠者的3×10⁷PBMCs。5天后，每隔一天更换新鲜培养基，培养基中含有IL-2。当细胞密度超过3×10⁶cells/ml时，将细胞进行扩瓶培养。在第14–15天，大量扩增的细胞计数后冷冻保存。通过机械或酶解分离的方法从HLA-A2⁺同一病人或不同病人肿瘤样本中的单细胞悬液中获得人类原代黑色素瘤细胞系的方法可根据标准的操作指南进行。人类原代黑色素瘤细胞系培养在含有10％FBS(Sigma-Aldrich)、 100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素的RPMI 1640中，培养条件是37℃，5％CO₂。

在细胞毒检测试验中，靶细胞系负载100μCi(1Ci＝37GBq)⁵¹Cr(PerkinElmer)，并洗脱两次。标记的黑色素瘤靶细胞与来自同一个病人匹配的PD-1⁺CD8⁺效应T细胞在培养皿中以指定的效/靶比铺在96-孔U-底培养皿中，在37℃培养4小时。⁵¹Cr释放量通过γ计数进行计算，三个样本计算一个溶解率。图2显示PD-1⁺CD8⁺T细胞具有强的杀伤自体肿瘤细胞的活性。相反，PD-1^-CD8⁺T细胞和未分离的CD8⁺T细胞没有杀伤自体肿瘤细胞的能力。

实施例3慢病毒载体LV-αPDL1/M转导增强PD-1⁺CD8⁺T细胞的肿瘤杀伤活性.

转移性黑色素瘤患者分离得到PD1⁺CD8⁺T细胞，PD1^-CD8⁺T细胞及未分离CD8⁺T细胞种在铺有重组纤连蛋白片段(FN ch–296；Retronectin)细胞培养皿上，并用慢病毒转导，转导慢病毒分别为LV-αPDL1/M或空载LV-M转导。转导T细胞扩增后用于细胞杀伤试验. 黑色素瘤靶细胞与来自同一个病人作为靶细胞。该靶细胞用100μCi(1Ci＝37GBq)⁵¹Cr(PerkinElmer)标记，洗脱两次后，匹配的来自同一个病人效应T细胞在培养皿中以指定的效/靶比铺在96-孔U-底培养皿中，在37℃培养4小时。⁵¹Cr释放量通过γ计数进行计算，三个样本计算一个溶解率。图3显示慢病毒载体LV-αPDL1转导增强PD-1⁺CD8⁺T细胞肿瘤杀伤活性，但没有明显增强PD-1^-CD8⁺T细胞及未分离CD8⁺T细胞肿瘤杀伤活性。这结果显示了慢病毒载体LV-αPDL1/M能有效的增强PD-1⁺CD8⁺T细胞肿瘤特异的杀伤作用。

实施例4慢病毒载体LV-αPDL1/M转导，比慢病毒载体LV-M转导，更有效增强 PD-1⁺CD8⁺T细胞对自体肿瘤细胞杀伤活性。

转移性黑色素瘤患者分离得到PD1⁺CD8⁺T细胞及未分离CD8⁺T细胞种在铺有重组纤连蛋白片段(FN ch–296；Retronectin)细胞培养皿上，并用慢病毒转导，转导慢病毒分别为LV-αPDL1/M或空载LV-M转导。转导T细胞扩增后用于细胞杀伤试验。黑色素瘤靶细胞与来自同一个病人作为靶细胞。该靶细胞用100μCi(1Ci＝37GBq)⁵¹Cr(PerkinElmer)标记，洗脱两次后，与匹配的来自同一个病人转导效应T细胞在培养皿中以指定的效/靶比铺在96-孔U-底培养皿中，在37℃培养4小时。⁵¹Cr释放量通过γ计数进行计算，三个样本计算一个溶解率。图4显示慢病毒载体LV-αPDL1/M转导，比慢病毒载体LV-M转导，更有效增强PD-1⁺CD8⁺T细胞对病人自体肿瘤细胞杀伤活性。这结果显示了慢病毒载体LV-αPDL1/M能使转导的PD-1⁺CD8⁺T细胞表达分泌型PD-L1抗体，来有效的促进肿瘤特异的杀伤作用.

在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

Claims (21)

1.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体携带下列核酸分子：

第一核酸分子，所述第一核酸分子编码分泌型免疫检查点抑制分子片段；

任选地，进一步携带第二核酸分子，所述第二核酸分子编码无功能EGFR。

2.根据权利要求1所述的表达载体，其特征在于，所述分泌型免疫检查点抑制分子片段包括：抗免疫检查点单链抗体分子以及IgG Fc，

任选地，所述IgG Fc为IgG1Fc或IgG4Fc。

3.根据权利要求1所述的表达载体，其特征在于，所述免疫检查点包括选自PD-L1，CTLA4、PD-1、TIM3、BTLA、LAG-3的至少之一。

4.根据权利要求1所述的表达载体，其特征在于，所述分泌型免疫检查点抑制分子片段为抗PD-L1单链抗体和IgG1Fc融合蛋白分子，

任选地，所述分泌型免疫检查点抑制分子片段为抗PD-1单链抗体和IgG4Fc融合蛋白分子，

任选地，所述分泌型免疫检查点抑制分子片段为抗TIM3单链抗体和IgG4Fc融合蛋白分子，

任选地，所述分泌型免疫检查点抑制分子片段为抗LAG3单链抗体和IgG4Fc融合蛋白分子，

任选地，所述分泌型免疫检查点抑制分子片段为抗CTLA4单链抗体和IgG4Fc融合蛋白分子。

5.根据权利要求1所述的表达载体，其特征在于，所述第一核酸分子具有SEQ ID NO：1～5所示的核苷酸序列。

6.根据权利要求1所述的表达载体，其特征在于，所述第二核酸分子具有SEQ ID NO：6所示的核苷酸序列。

7.根据权利要求1所述的表达载体，其特征在于，进一步包括：

第一启动子，所述第一启动子与所述第一核酸分子可操作地连接；以及

任选的第二启动子，所述任选的第二启动子与所述第二核酸分子可操作地连接。

8.根据权利要求7所述的表达载体，其特征在于，所述第一启动子、所述第二启动子、分别独立地选自U6，H1，CMV，EF-1，LTR或RSV启动子。

9.根据权利要求1所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体包括第一核酸分子、第二核酸分子，所述表达载体进一步包括：

内部核糖体进入位点序列，所述内部核糖体进入位点序列设置在所述第一核酸分子与所述第二核酸分子之间，所述内部核糖体进入位点具有SEQ ID NO：7所示的核苷酸序列。

10.根据权利要求1所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体包括第一核酸分子、第二核酸分子，并且所述表达载体进一步包括:

第三核酸分子，所述第三核酸分子设置在所述第一核酸分子与所述第二核酸分子之间或多个所述第一核酸分子之间，并且所述第三核酸分子编码连接肽。

11.根据权利要求10所述的表达载体，其特征在于，所述连接肽具有SEQ ID NO：8～11所示的氨基酸序列。

12.根据权利要求1所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体是非致病性病毒载体。

13.根据权利要求12所述的表达载体，其特征在于，所述病毒载体包括选自反转录病毒载体、慢病毒载体或腺病毒相关病毒载体的至少之一。

14.一种慢病毒，其特征在于，所述慢病毒携带具有SEQ ID NO：12～16所示的核苷酸序列的核酸。

15.一种转基因细胞，其特征在于，所述转基因细胞是通过将权利要求1～13任一项所述的表达载体或权利要求14所述的慢病毒导入受体细胞获得的。

16.根据权利要求15所述的转基因细胞，其特征在于，所述受体细胞为干细胞，

任选地，所述受体细胞为免疫细胞，

任选地，所述受体细胞是肿瘤浸润T淋巴细胞，

任选地，所述受体细胞是外周血T淋巴细胞，

任选地，所述受体细胞是自然杀伤T淋巴细胞，

任选地，所述受体细胞是自然杀伤细胞，

任选地，所述受体细胞是B淋巴细胞，

任选地，所述受体细胞是浆细胞，

任选地，所述受体细胞是肿瘤相关抗原特异的杀伤T细胞，

任选地，所述受体细胞是肿瘤突变新抗原特异的杀伤T细胞，

任选地，所述受体细胞是肿瘤相关抗原特异的T淋巴细胞，

任选地，所述受体细胞是肿瘤突变新抗原特异的T淋巴细胞。

17.根据权利要求15所述的转基因细胞，其特征在于，所述受体细胞为PD-1⁺免疫细胞，

任选地，所述受体细胞是肿瘤浸润PD-1⁺CD3⁺T淋巴细胞，

任选地，所述受体细胞是肿瘤浸润PD-1⁺CD8⁺T淋巴细胞，

任选地，所述受体细胞是外周血PD-1⁺CD3⁺T淋巴细胞，

任选地，所述受体细胞是外周血PD-1⁺CD8⁺T淋巴细胞。

18.一种分泌型免疫检查点抑制分子融合蛋白，其特征在于，是由权利要求15～17任一项所述的转基因细胞分泌的。

19.一种分泌型免疫检查点抑制分子融合蛋白，其特征在于，包括：免疫检查点分子胞外段以及IgG Fc。

20.根据权利要求19所述的融合蛋白，其特征在于，所述IgG Fc为IgG1Fc或IgG4Fc，

任选地，所述融合蛋白包括：PD-1胞外段和IgG1Fc，

任选地，所述融合蛋白包括：PD-L1胞外段和IgG4Fc，

任选地，所述融合蛋白包括：PD-L2胞外段和IgG4Fc，

任选地，所述融合蛋白包括：TIM3胞外段和IgG1Fc，

任选地，所述融合蛋白包括：LAG3胞外段和IgG1Fc。

21.一种用于治疗癌症的治疗组合物，其特征在于，包括：

权利要求1～13任一项所述的表达载体、权利要求14所述的慢病毒、权利要求15～17任一项所述的转基因细胞或权利要求18～20任一项所述的分泌型免疫检查点抑制分子融合蛋白。