CN106467906A - 构建体、转基因淋巴细胞及其制备方法和用途 - Google Patents

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Abstract

本发明提出了一种构建体、一种转基因淋巴细胞及其制备方法和用途，所述转基因淋巴细胞表达功能性免疫共刺激分子和嵌合抗原受体(CAR)，所述构建体包含第一核酸分子，所述第一核酸分子编码功能性免疫共刺激分子；以及第二核酸分子，所述第二核酸分子编码嵌合抗原受体。本发明提出的转基因淋巴细胞在肿瘤病人体内的生存能力大大提高，对肿瘤细胞的定向杀伤作用更强。

Description

构建体、转基因淋巴细胞及其制备方法和用途
技术领域
本发明涉及生物医药领域，具体地，本发明涉及一种T淋巴细胞、一种逆转录病毒、一种转基因淋巴细胞、一种构建体、一种制备转基因淋巴细胞的方法、一种用于治疗癌症的治疗组合物和一种提高淋巴细胞活性的方法。
背景技术
过继T细胞疗法是来自体内的T细胞的活化、扩增,和随后的应用。一些T细胞迁移到肿瘤位点,直接溶解肿瘤细胞。经体外适当处理的T细胞在间接体内疗法中有能力引起显著的治疗效果。
然而,使用肿瘤浸润淋巴细胞的过继T细胞疗法仍有待改进。
免疫共刺激是激活有效的T细胞抗肿瘤反应所必须的。免疫共刺激分子可分为两个重要的家族:B7/CD28家族和肿瘤坏死因子(TNF)家族，后者包括4-1BB,OX-40、CD27和CD30分子,这些分子已被证明可正向调控和增强细胞免疫应答。4-1BB(CD137，TNFRSF9)是一个30-kDa的糖蛋白质,可瞬时表达于各种白细胞，包括激活的T细胞和自然杀伤(NK)细胞。它的配位体,4-1BBL(CD137L),主要表达于各种抗原递呈细胞，如B细胞、DCs和巨噬细胞。此外,4-1BBL也被发现于淋巴瘤,结肠癌、肉瘤和黑素瘤等实体瘤中。
基于上述免疫共刺激分子的研究现状，免疫共刺激分子在T细胞抗肿瘤反应中的应用有待进一步开发。
发明内容
本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。
本发明是基于发明人的下列发现而完成的：
现有的经体外适当处理的T细胞通常不能有效的抑制癌症患者肿瘤的生长,这是由于肿瘤反应性细胞毒性T细胞的数量不足，以及肿瘤微环境中的免疫抑制机制的抵抗作用。使用抗CD19的嵌合抗原受体过继T细胞疗法，在某些B细胞淋巴瘤患者中有显著的效果，但相当部分的B细胞淋巴瘤患者没有反应。本发明针对上述问题，提出了一种携带编码全长的功能性免疫共刺激分子和嵌合抗原受体序列的构建体和以此构建体导入后形成的转基因淋巴细胞，本发明提出的构建体和转基因淋巴细胞用于过继T细胞的免疫治疗，可以大大提高T细胞在肿瘤中的存活率，显著提高T细胞的抗肿瘤效果，尤其对造血系统恶性肿瘤和淋巴瘤有显著疗效。
在本发明的第一方面，本发明提出了一种T淋巴细胞，根据本发明的是实施例，所述T淋巴细胞表达：4-1BB；以及嵌合抗原受体，其中，所述嵌合抗原受体包括：胞外区，所述胞外区包括单链抗体的重链可变区和轻链可变区，所述单链抗体特异性识别抗原CD19；跨膜区，所述跨膜区与所述胞外区相连，并且嵌入到所述T淋巴细胞的细胞膜中；以及胞内区，所述胞内区与所述跨膜区相连，并且所述胞内区包括CD28的胞内段以及CD3ζ链。根据本发明的实施例，本发明的T淋巴细胞在肿瘤中的存活率大大提高，对肿瘤的杀伤效果显著提高，尤其对造血系统恶性肿瘤和淋巴瘤有显著疗效。
在本发明的第二方面，本发明提出了一种逆转录病毒，根据本发明的实施例，所述逆转录病毒携带编码下列蛋白的核酸分子：全长4-1BB，所述全长4-1BB具有SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列，SEQ ID NO：1：MGNSCYNIVATLLLVLNFERTRSLQDPCSNCPAGTFCDNNRNQICSPCPPNSFSSAGGQRTCDICRQCKGVFRTRKECSSTSNAECDCTPGFHCLGAGCSMCEQDCKQGQELTKKGCKDCCFGTFNDQKRGICRPWTNCSLDGKSVLVNGTKERDVVCGPSPADLSPGASSVTPPAPAREPGHSPQIISFFLALTSTALLFLLFFLTLRFSVVKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL；嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体具有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列，SEQ ID NO：2：MLLLVTSLLLCELPHPAFLLIPDIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISKYLNWYQQKPDGTVKLLIYHTSRLHSGVPSRFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPYTFGGGTKLEITGSTSGSGKPGSGEGSTKGEVKLQESGPGLVAPSQSLSVTCTVSGVSLPDYGVSWIRQPPRKGLEWLGVIWGSETTYYNSALKSRLTIIKDNSKSQVFLKMNSLQTDDTAIYYCAKHYYYGGSYAMDYWGQGTSVTVSSAAAIEVMYPPPYLDNEKSNGTIIHVKGKHLCPSPLFPGPSKPFWVLVVVGGVLACYSLLVTVAFIIFWVRSKRSRLLHSDYMNMTPRRPGPTRKHYQPYAPPRDFAAYRSRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR。根据本发明的实施例，将本发明的逆转录病毒导入淋巴细胞所得的转基因淋巴细胞，其在肿瘤中的存活率大大提高，对肿瘤的杀伤效果显著提高，尤其对造血系统恶性肿瘤的杀伤效果尤为显著。
在本发明的第三方面，本发明提出了一种逆转录病毒，根据本发明的实施例，所述逆转录病毒携带含有SEQ ID NO:3或4所示的核苷酸序列。SEQ ID NO：3(人CD19CAR-IRES-4-1BB核苷酸序列)：AGATCTACTAGTTCTAGAATGCTTCTCCTGGTGACAAGCCTTCTGCTCTGTGAGTTACCACACCCAGCATTCCTCCTGATCCCAGACATCCAGATGACACAGACTACATCCTCCCTGTCTGCCTCTCTGGGAGACAGAGTCACCATCAGTTGCAGGGCAAGTCAGGACATTAGTAAATATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGATGGAACTGTTAAACTCCTGATCTACCATACATCAAGATTACACTCAGGAGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGAACAGATTATTCTCTCACCATTAGCAACCTGGAGCAAGAAGATATTGCCACTTACTTTTGCCAACAGGGTAATACGCTTCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACTAAGTTGGAAATAACAGGCTCCACCTCTGGATCCGGCAAGCCCGGATCTGGCGAGGGATCCACCAAGGGCGAGGTGAAACTGCAGGAGTCAGGACCTGGCCTGGTGGCGCCCTCACAGAGCCTGTCCGTCACATGCACTGTCTCAGGGGTCTCATTACCCGACTATGGTGTAAGCTGGATTCGCCAGCCTCCACGAAAGGGTCTGGAGTGGCTGGGAGTAATATGGGGTAGTGAAACCACATACTATAATTCAGCTCTCAAATCCAGACTGACCATCATCAAGGACAACTCCAAGAGCCAAGTTTTCTTAAAAATGAACAGTCTGCAAACTGATGACACAGCCATTTACTACTGTGCCAAACATTATTACTACGGTGGTAGCTATGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCAGCGGCCGCAATTGAAGTTATGTATCCTCCTCCTTACCTAGACAATGAGAAGAGCAATGGAACCATTATCCATGTGAAAGGGAAACACCTTTGTCCAAGTCCCCTATTTCCCGGACCTTCTAAGCCCTTTTGGGTGCTGGTGGTGGTTGGGGGAGTCCTGGCTTGCTATAGCTTGCTAGTAACAGTGGCCTTTATTATTTTCTGGGTGAGGAGTAAGAGGAGCAGGCTCCTGCACAGTGACTACATGAACATGACTCCCCGCCGCCCCGGGCCCACCCGCAAGCATTACCAGCCCTATGCCCCACCACGCGACTTCGCAGCCTATCGCTCCAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGCTAAAAGCTTGGTACCCTCGAGGTTAACGAATTCCGCCCCCCCCCCCTAACGTTACTGGCCGAAGCCGCTTGGAATAAGGCCGGTGTGCGTTTGTCTATATGTTATTTTCCACCATATTGCCGTCTTTTGGCAATGTGAGGGCCCGGAAACCTGGCCCTGTCTTCTTGACGAGCATTCCTAGGGGTCTTTCCCCTCTCGCCAAAGGAATGCAAGGTCTGTTGAATGTCGTGAAGGAAGCAGTTCCTCTGGAAGCTTCTTGAAGACAAACAACGTCTGTAGCGACCCTTTGCAGGCAGCGGAACCCCCCACCTGGCGACAGGTGCCTCTGCGGCCAAAAGCCACGTGTATAAGATACACCTGCAAAGGCGGCACAACCCCAGTGCCACGTTGTGAGTTGGATAGTTGTGGAAAGAGTCAAATGGCTCTCCTCAAGCGTATTCAACAAGGGGCTGAAGGATGCCCAGAAGGTACCCCATTGTATGGGATCTGATCTGGGGCCTCGGTGCACATGCTTTACATGTGTTTAGTCGAGGTTAAAAAAACGTCTAGGCCCCCCGAACCACGGGGACGTGGTTTTCCTTTGAAAAACACGATGATAATATGGCCACAACCATGGTCTAGAATGGGAAACAGCTGTTACAACATAGTAGCCACTCTGTTGCTGGTCCTCAACTTTGAGAGGACAAGATCATTGCAGGATCCTTGTAGTAACTGCCCAGCTGGTACATTCTGTGATAATAACAGGAATCAGATTTGCAGTCCCTGTCCTCCAAATAGTTTCTCCAGCGCAGGTGGACAAAGGACCTGTGACATATGCAGGCAGTGTAAAGGTGTTTTCAGGACCAGGAAGGAGTGTTCCTCCACCAGCAATGCAGAGTGTGACTGCACTCCAGGGTTTCACTGCCTGGGGGCAGGATGCAGCATGTGTGAACAGGATTGTAAACAAGGTCAAGAACTGACAAAAAAAGGTTGTAAAGACTGTTGCTTTGGGACATTTAACGATCAGAAACGTGGCATCTGTCGACCCTGGACAAACTGTTCTTTGGATGGAAAGTCTGTGCTTGTGAATGGGACGAAGGAGAGGGACGTGGTCTGTGGACCATCTCCAGCCGACCTCTCTCCGGGAGCATCCTCTGTGACCCCGCCTGCCCCTGCGAGAGAGCCAGGACACTCTCCGCAGATCATCTCCTTCTTTCTTGCGCTGACGTCGACTGCGTTGCTCTTCCTGCTGTTCTTCCTCACGCTCCGTTTCTCTGTTGTTAAACGGGGCAGAAAGAAACTCCTGTATATATTCAAACAACCATTTATGAGACCAGTACAAACTACTCAAGAGGAAGATGGCTGTAGCTGCCGATTTCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAACTGTGAATCCTACTGCTTCGAATTAATTAA。SEQ ID NO：4(人CD19CAR-IRES-OX40核苷酸序列)：AGATCTACTAGTTCTAGAATGCTTCTCCTGGTGACAAGCCTTCTGCTCTGTGAGTTACCACACCCAGCATTCCTCCTGATCCCAGACATCCAGATGACACAGACTACATCCTCCCTGTCTGCCTCTCTGGGAGACAGAGTCACCATCAGTTGCAGGGCAAGTCAGGACATTAGTAAATATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGATGGAACTGTTAAACTCCTGATCTACCATACATCAAGATTACACTCAGGAGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGAACAGATTATTCTCTCACCATTAGCAACCTGGAGCAAGAAGATATTGCCACTTACTTTTGCCAACAGGGTAATACGCTTCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACTAAGTTGGAAATAACAGGCTCCACCTCTGGATCCGGCAAGCCCGGATCTGGCGAGGGATCCACCAAGGGCGAGGTGAAACTGCAGGAGTCAGGACCTGGCCTGGTGGCGCCCTCACAGAGCCTGTCCGTCACATGCACTGTCTCAGGGGTCTCATTACCCGACTATGGTGTAAGCTGGATTCGCCAGCCTCCACGAAAGGGTCTGGAGTGGCTGGGAGTAATATGGGGTAGTGAAACCACATACTATAATTCAGCTCTCAAATCCAGACTGACCATCATCAAGGACAACTCCAAGAGCCAAGTTTTCTTAAAAATGAACAGTCTGCAAACTGATGACACAGCCATTTACTACTGTGCCAAACATTATTACTACGGTGGTAGCTATGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCAGCGGCCGCAATTGAAGTTATGTATCCTCCTCCTTACCTAGACAATGAGAAGAGCAATGGAACCATTATCCATGTGAAAGGGAAACACCTTTGTCCAAGTCCCCTATTTCCCGGACCTTCTAAGCCCTTTTGGGTGCTGGTGGTGGTTGGGGGAGTCCTGGCTTGCTATAGCTTGCTAGTAACAGTGGCCTTTATTATTTTCTGGGTGAGGAGTAAGAGGAGCAGGCTCCTGCACAGTGACTACATGAACATGACTCCCCGCCGCCCCGGGCCCACCCGCAAGCATTACCAGCCCTATGCCCCACCACGCGACTTCGCAGCCTATCGCTCCAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGCTAAAAGCTTGGTACCCTCGAGGTTAACGAATTCCGCCCCCCCCCCCTAACGTTACTGGCCGAAGCCGCTTGGAATAAGGCCGGTGTGCGTTTGTCTATATGTTATTTTCCACCATATTGCCGTCTTTTGGCAATGTGAGGGCCCGGAAACCTGGCCCTGTCTTCTTGACGAGCATTCCTAGGGGTCTTTCCCCTCTCGCCAAAGGAATGCAAGGTCTGTTGAATGTCGTGAAGGAAGCAGTTCCTCTGGAAGCTTCTTGAAGACAAACAACGTCTGTAGCGACCCTTTGCAGGCAGCGGAACCCCCCACCTGGCGACAGGTGCCTCTGCGGCCAAAAGCCACGTGTATAAGATACACCTGCAAAGGCGGCACAACCCCAGTGCCACGTTGTGAGTTGGATAGTTGTGGAAAGAGTCAAATGGCTCTCCTCAAGCGTATTCAACAAGGGGCTGAAGGATGCCCAGAAGGTACCCCATTGTATGGGATCTGATCTGGGGCCTCGGTGCACATGCTTTACATGTGTTTAGTCGAGGTTAAAAAAACGTCTAGGCCCCCCGAACCACGGGGACGTGGTTTTCCTTTGAAAAACACGATGATAATATGGCCACAACCATGGTCTAGAATGTGCGTGGGGGCTCGGCGGCTGGGCCGCGGGCCGTGTGCGGCTCTGCTCCTCCTGGGCCTGGGGCTGAGCACCGTGACGGGGCTCCACTGTGTCGGGGACACCTACCCCAGCAACGACCGGTGCTGCCACGAGTGCAGGCCAGGCAACGGGATGGTGAGCCGCTGCAGCCGCTCCCAGAACACGGTGTGCCGTCCGTGCGGGCCGGGCTTCTACAACGACGTGGTCAGCTCCAAGCCGTGCAAGCCCTGCACGTGGTGTAACCTCAGAAGTGGGAGTGAGCGGAAGCAGCTGTGCACGGCCACACAGGACACAGTCTGCCGCTGCCGGGCGGGCACCCAGCCCCTGGACAGCTACAAGCCTGGAGTTGACTGTGCCCCCTGCCCTCCAGGGCACTTCTCCCCAGGCGACAACCAGGCCTGCAAGCCCTGGACCAACTGCACCTTGGCTGGGAAGCACACCCTGCAGCCGGCCAGCAATAGCTCGGACGCAATCTGTGAGGACAGGGACCCCCCAGCCACGCAGCCCCAGGAGACCCAGGGCCCCCCGGCCAGGCCCATCACTGTCCAGCCCACTGAAGCCTGGCCCAGAACCTCACAGGGACCCTCCACCCGGCCCGTGGAGGTCCCCGGGGGCCGTGCGGTTGCCGCCATCCTGGGCCTGGGCCTGGTGCTGGGGCTGCTGGGCCCCCTGGCCATCCTGCTGGCCCTGTACCTGCTCCGGAGGGACCAGAGGCTGCCCCCCGATGCCCACAAGCCCCCTGGGGGAGGCAGTTTCCGGACCCCCATCCAAGAGGAGCAGGCCGACGCCCACTCCACCCTGGCCAAGATCTGATCCTACTGCTTCGAATTAATTAA。根据本发明的实施例，将本发明的逆转录病毒导入淋巴细胞所得的转基因淋巴细胞，其在肿瘤中的存活率大大提高，对肿瘤的杀伤效果显著提高，尤其对造血系统恶性肿瘤的杀伤效果尤为显著。
在本发明的第四方面，本发明提出了一种转基因淋巴细胞，根据本发明的实施例，所述淋巴细胞表达：功能性免疫共刺激分子；以及嵌合抗原受体。发明人惊奇的发现，表达功能性免疫共刺激分子和嵌合抗原受体的淋巴细胞在肿瘤微环境中的存活率大幅提高，根据本发明的实施例，本发明的淋巴细胞对肿瘤的杀伤作用更为显著，尤其对造血系统恶性肿瘤的杀伤效果尤为突出。
根据本发明的实施例，上述转基因淋巴细胞进一步具有下列附加技术特征至少之一：
根据本发明的实施例，所述嵌合抗原受体包括：胞外区，所述胞外区能够与抗原特异性结合；跨膜区；以及胞内区，所述胞内区包括免疫共刺激分子胞内段。具有上述结构的嵌合抗原受体的存在，大大提高了转基因淋巴细胞的靶向定位，提高了转基因淋巴细胞对抗原表达肿瘤细胞的定向杀伤作用。
根据本发明的实施例，所述抗原是肿瘤抗原。因此，本发明的转基因淋巴细胞对肿瘤的定向杀伤作用更加显著。
根据本发明的实施例，所述胞外区包括抗体的重链可变区和轻链可变区，所述抗体结合所述抗原。抗原抗体的特异性结合作用，大大提高了本发明的转基因淋巴细胞的靶向定位和对表达抗原的肿瘤细胞的定向杀伤作用。
根据本发明的实施例，所述抗体为单链抗体。单链抗体可去除非特异性反应的竞争性表面蛋白，同时单链抗体更易渗透肿瘤组织增加药物治疗浓度。本发明提出的转基因淋巴细胞表达单链抗体的嵌合抗原受体，大大提高了转基因淋巴细胞对靶向肿瘤细胞的定向杀伤作用。
根据本发明的实施例，所述抗原为CD19.因此所述转基因淋巴细胞针对表达抗原CD19的细胞具有定向性杀伤作用，抗原抗体的特异性结合作用更强，大大提高了本发明的转基因淋巴细胞对CD19抗原表达肿瘤细胞的定向杀伤作用。
根据本发明的实施例，所述功能性免疫共刺激分子独立地选自4-1BB、OX-40、CD40L、CD27、CD30、CD28以及他们的衍生物。上述分子具有正向调控和增强细胞免疫应答的作用。在本发明中，功能性免疫共刺激分子的成功表达，进一步提高了转基因淋巴细胞在体外扩增及肿瘤病人体内存活能力，对肿瘤细胞的定向杀伤作用进一步加强。
根据本发明的实施例，所述免疫共刺激分子胞内段独立地选自4-1BB、OX-40、CD40L、CD27、CD30、CD28以及他们的衍生物的至少一种。上述功能性免疫共刺激分子与免疫共刺激分子胞内段可以选自同一免疫共刺激分子，也可以选自不同的免疫共刺激分子，免疫共刺激分子胞内段和功能性免疫共刺激分子的联合正向调控和增强细胞免疫应答的作用，使得转基因淋巴细胞在体外扩增及肿瘤病人体内存活能力得到进一步提高，对肿瘤的定向杀伤作用效果更佳显著。
根据本发明的实施例，所述功能性免疫共刺激分子包括全长的4-1BB,OX40或者CD40L，所述免疫共刺激分子胞内段为CD28或者4-1BB胞内段。本发明中的转基因淋巴细胞表达全长的功能性免疫共刺激分子4-1BB,OX40或者CD40L，嵌合抗原受体表达CD28或者4-1BB的胞内段。根据本发明的实施例，上述免疫共刺激分子的成功表达，使得所述转基因淋巴细胞在体外扩增及肿瘤病人体内存活能力更高，对淋巴瘤的杀伤作用更加显著。
根据本发明的实施例，所述淋巴细胞是CD3+淋巴细胞或自然杀伤细胞或自然杀伤T细胞。上述淋巴细胞中表达功能性免疫共刺激分子和嵌合抗原受体，使得上述淋巴细胞的细胞免疫作用靶向性更强，对肿瘤细胞的杀伤作用效果更佳显著。
在本发明的第五方面，本发明提出了一种构建体，根据本发明的实施例，所述构建体包括：第一核酸分子，所述第一核酸分子编码功能性免疫共刺激分子；以及第二核酸分子，所述第二核酸分子编码嵌合抗原受体，其中，所述功能性免疫共刺激分子和所述嵌合抗原受体是如前所述。根据本发明的实施例，上述构建成功导入上述淋巴细胞并表达上述功能性免疫共刺激分子和抗原受体后，使得淋巴细胞的在肿瘤微环境中的存活率大幅提高，对肿瘤细胞的杀伤作用更加显著。
根据本发明实施例，上述构建体进一步包括下列附加技术特征至少之一：
根据本发明的实施例，所述第一核酸分子与所述第二核酸分子被设置在上述淋巴细胞中表达所述功能性免疫共刺激分子与所述嵌合抗原受体，并且所述功能性免疫共刺激分子与所述嵌合抗原受体呈非融合形式。根据本发明的实施例，成功设置上述第一核酸分子和第二核酸分子的淋巴细胞具有更强的肿瘤环境存活率，具有更强的肿瘤杀伤效果。
根据本发明的实施例，上述构建体进一步包括：内部核糖体进入位点序列，所述内部核糖体进入位点序列设置在所述第一核酸分子与所述第二核酸分子之间，所述内部核糖体进入位点具有SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列，SEQ ID NO：5GTTAACGAATTCCGCCCCCCCCCCCTAACGTTACTGGCCGAAGCCGCTTGGAATAAGGCCGGTGTGCGTTTGTCTATATGTTATTTTCCACCATATTGCCGTCTTTTGGCAATGTGAGGGCCCGGAAACCTGGCCCTGTCTTCTTGACGAGCATTCCTAGGGGTCTTTCCCCTCTCGCCAAAGGAATGCAAGGTCTGTTGAATGTCGTGAAGGAAGCAGTTCCTCTGGAAGCTTCTTGAAGACAAACAACGTCTGTAGCGACCCTTTGCAGGCAGCGGAACCCCCCACCTGGCGACAGGTGCCTCTGCGGCCAAAAGCCACGTGTATAAGATACACCTGCAAAGGCGGCACAACCCCAGTGCCACGTTGTGAGTTGGATAGTTGTGGAAAGAGTCAAATGGCTCTCCTCAAGCGTATTCAACAAGGGGCTGAAGGATGCCCAGAAGGTACCCCATTGTATGGGATCTGATCTGGGGCCTCGGTGCACATGCTTTACATGTGTTTAGTCGAGGTTAAAAAAACGTCTAGGCCCCCCGAACCACGGGGACGTGGTTTTCCTTTGAAAAACACGATGATAATATGGCCACAA。内部核糖体进入位点序列的引入使得第一核算分子和第二核酸分子分别独立的翻译表达，得到的功能性免疫共刺激分子和嵌合抗原受体呈非融合形式。根据本发明的实施例，内部核糖体进入位点序列的引入有效保证了功能性免疫共刺激分子和嵌合抗原受体的生物学作用，使得淋巴细胞在肿瘤环境中的成活率大大提高，对肿瘤的杀伤效果更加显著。
根据本发明的实施例，上述构建体进一步包括：第三核酸分子，设置在所述第一核酸分子与所述第二核酸分子之间，并且所述第三核酸分子编码连接肽，所述连接肽能够在所述淋巴细胞中被切割。从而功能性免疫共刺激分子和嵌合抗原受体成非融合状态表达在淋巴细胞膜上。根据本发明的实施例，第三核酸分子的引入保证了功能性免疫共刺激分子和嵌合抗原受体的生物学作用，从而使得淋巴细胞在肿瘤环境中的成活率大大提高，淋巴细胞的靶向作用更强，对肿瘤的杀伤作用更加显著。
根据本发明的实施例，所述连接肽具有SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列。SEQ ID NO：6：GSGATNFSLLKQAGDVEENPGP。SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列是手足口病毒(一种小RNA病毒)的2A肽段。连接肽的引入使得功能性免疫共刺激分子和嵌合抗原受体成非融合状态表达在淋巴细胞膜上。根据本发明的实施例，连接肽的引入保证了功能性免疫共刺激分子和嵌合抗原受体的生物学作用，使得淋巴细胞在肿瘤环境中的成活率大大提高，淋巴细胞的靶向作用更强，对肿瘤的杀伤作用更加显著。
根据本发明的实施例，所述的构建体进一步包括：第一启动子，所述第一启动子与所述第一核酸分子可操作地连接；以及第二启动子，所述第二启动子与所述第二核酸分子可操作地连接。根据本发明的实施例，第一和第二启动子的引入，使得第一核酸分子和第二核酸分子分别独立的表达，表达产物功能性免疫共刺激分子和嵌合抗原受体呈非融合状态，从而保证了功能性免疫共刺激分子和嵌合抗原受体的生物学作用，使得淋巴细胞在肿瘤环境中的成活率大大提高，淋巴细胞的靶向作用更强，对肿瘤的杀伤作用更加显著。
根据本发明的实施例，所述第一启动子和所述第二启动子分别独立地选自CMV,EF-1,RSV启动子，根据本发明的实施例，上述启动子具有启动效率高的特点，从而保证了功能性免疫共刺激分子和嵌合抗原受体的分别高效地表达，使得淋巴细胞在肿瘤环境中的成活率大大提高，淋巴细胞的靶向作用更强，对肿瘤细胞的杀伤作用更加显著。
根据本发明的实施例，所述构建体是非致病性病毒。根据本发明的实施例，非致病性病毒的引入大大提高了构建体在淋巴细胞中的复制和扩增效率，从而大大提高了功能性免疫共刺激分子和嵌合抗原受体在淋巴细胞中的高效表达，使得淋巴细胞在肿瘤环境中的成活率大大提高，淋巴细胞的靶向作用进一步增强，对肿瘤细胞的杀伤作用更加显著。
根据本发明的实施例，所述构建体是病毒，所述病毒选自反转录病毒、慢病毒和腺病毒相关病毒。根据本发明的实施例，上述构建体病毒感染范围广泛，既可感染终末分化细胞，又可感染处于分裂期的细胞，既可整合到宿主染色体，又可游离在宿主染色体之外，实现广谱而高效的感染效率，从而大大提高了功能性免疫共刺激分子和嵌合抗原受体在淋巴细胞中的高效表达，使得淋巴细胞在肿瘤环境中的成活率大大提高，淋巴细胞的靶向作用进一步增强，对肿瘤细胞的杀伤作用更加显著。
在本发明的第六方面，本发明提出了一种制备所述的T淋巴细胞或者转基因淋巴细胞的方法。根据本发明的实施例，该方法包括：将上述构建体或者慢病毒引入到淋巴细胞中或者T淋巴细胞。所述构建体或慢病毒成功引入上述淋巴细胞或者T淋巴细胞中，实现了功能性免疫共刺激分子和嵌合抗原受体的在淋巴细胞或T淋巴细胞中的表达，从而使得所得淋巴细胞或T淋巴细胞在体外扩增及肿瘤病人体内存活能力大大提高，淋巴细胞或T淋巴细胞对肿瘤细胞的靶向杀伤作用更强。
在本发明的第七方面，本发明提出了一种用于治疗癌症的治疗组合物，根据本发明的实施例，该治疗组合物包括：上述构建体、慢病毒、T淋巴细胞或者转基因淋巴细胞。上述任意一种治疗组合物的组成均可实现功能性免疫共刺激分子和嵌合抗原受体在转基因淋巴细胞或T淋巴细胞中的高效表达，从而使得所得淋巴细胞或T淋巴细胞在体外扩增及肿瘤病人体内存活能力大大提高，淋巴细胞或T淋巴细胞对肿瘤细胞的靶向杀伤作用更强。
根据本发明的实施例，上述癌症包括造血系统恶性肿瘤。功能性免疫共刺激分子和嵌合抗原受体在转基因淋巴细胞或T淋巴细胞中的高效表达，使得所得淋巴细胞或T淋巴细胞在体外扩增及造血系统恶性肿瘤的环境中的存活能力大大提高，淋巴细胞或T淋巴细胞对造血系统恶性肿瘤的肿瘤细胞的靶向杀伤作用更强。
在本发明的第八方面，本发明提出了一种提高淋巴细胞活性的方法，根据本发明的实施例，所述淋巴细胞携带嵌合抗原受体，其特征在于，所述方法包括：使所述淋巴细胞表达功能性免疫共刺激分子，所述功能性免疫共刺激分子、所述淋巴细胞和所述嵌合抗原受体是如上述所定义的。在本发明中，所述淋巴细胞活性包括所述淋巴细胞体外扩增能力、淋巴细胞在肿瘤病人体内的生存能力、以及所述淋巴细胞在肿瘤病人体内的杀伤能力的至少一种。根据本发明的实施例，功能性免疫共刺激分子在上述淋巴细胞中的表达，淋巴细胞照中的抗凋亡基因上调，从而预防了激活诱导的细胞凋亡，使得上述淋巴细胞在体外扩增及肿瘤病人体内存活能力大大提高，对肿瘤细胞的靶向杀伤作用更强。
需要说明的是，本发明中所使用的术语“共刺激分子”是指一个膜蛋白，其功能是通过与其配体的结合，来活化T细胞，这些配体表达于抗原递呈细胞表面，肿瘤细胞和一些其他类型的细胞。
附图说明
图1是根据本发明实施例2的4-1BB的激活增强了抗原特意性外周血淋巴细胞的抗肿瘤活性的结果图；
图2是根据本发明实施例3的携带编码表达抗CD19嵌合抗原受体和4-1BB或OX40的序列的逆转录病毒载体的示意图；
图3是根据本发明实施例4的共表达4-1BB显著增加了抗CD19嵌合抗原受体T细胞的细胞毒活性的结果图；以及
图4是根据本发明实施例5的共表达4-1BB和抗CD19嵌合抗原受体的T细胞具有更多细胞因子分泌和更高活细胞比率的结果图。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例。下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
T淋巴细胞或转基因淋巴细胞
本发明提出了一种T淋巴细胞或转基因淋巴细胞，T淋巴细胞或淋巴细胞表达：功能性免疫共刺激分子；以及嵌合抗原受体。其中，嵌合抗原受体包括：胞外区，胞外区包括单链抗体的重链可变区和轻链可变区，单链抗体特异性识别抗原CD19；跨膜区，所述跨膜区与所述胞外区相连，并且嵌入到T淋巴细胞或转基因淋巴细胞的细胞膜中；以及胞内区，胞内区与跨膜区相连，并且胞内区包括免疫共刺激分子的胞内段以及CD3ζ链。
功能性免疫共刺激分子可以使得T淋巴细胞或转基因淋巴细胞中Bcl-xl基因上调，Bcl-xl基因的表达产物具有稳定跨膜电位和减少膜的通透性的作用，抵抗细胞的凋亡。因此，本发明提出的T淋巴细胞或转基因淋巴细胞在肿瘤环境中的成活率大幅提高。
嵌合抗原受体的胞外区抗体为单链抗体。单链抗体可去除非特异性反应的竞争性表面蛋白，同时单链抗体更易渗透肿瘤组织增加药物治疗浓度。因此，本发明提出的转基因淋巴细胞表达单链抗体的嵌合抗原受体，大大提高了转基因淋巴细胞对靶向肿瘤细胞的定向杀伤作用。
嵌合抗原受体的胞外区特异性识别抗原CD19，因此所述转基因淋巴细胞针对表达抗原CD19的细胞具有定向性杀伤作用，抗原抗体的特异性结合作用更强，大大提高了本发明的转基因淋巴细胞对CD19抗原表达肿瘤细胞的定向杀伤作用。
上述功能性免疫共刺激分子和免疫共刺激分子的胞内段独立地选自4-1BB、OX-40、CD40L、CD27、CD30、CD28以及他们的衍生物。在本发明中，上述功能性免疫共刺激分子包括全长的4-1BB,OX40或者CD40L，免疫共刺激分子胞内段为CD28或4-1BB胞内段。上述分子具有正向调控和增强细胞免疫应答的作用。功能性免疫共刺激分子与免疫共刺激分子胞内段可以选自同一免疫共刺激分子，也可以选自不同的免疫共刺激分子，免疫共刺激分子胞内段和功能性免疫共刺激分子的联合正向调控和增强细胞免疫应答的作用，使得转基因淋巴细胞在体外扩增及肿瘤病人体内存活能力进一步提高，对肿瘤的定向杀伤作用效果更佳显著。
本发明中的淋巴细胞是CD3+淋巴细胞或自然杀伤细胞或自然杀伤T细胞。CD3+淋巴细胞是总T细胞，自然杀伤细胞是免疫细胞的一种，非特异性性识别靶细胞，自然杀伤T细胞是具有T细胞和自然杀伤细胞受体的T细胞亚群。上述淋巴细胞中表达功能性免疫共刺激分子和嵌合抗原受体，使得上述淋巴细胞的细胞免疫作用靶向性更强，对肿瘤细胞的杀伤作用效果更佳显著。
逆转录病毒或构建体
本发明的提出的构建体包括：第一核酸分子，第一核酸分子编码功能性免疫共刺激分子；以及第二核酸分子，所述第二核酸分子编码嵌合抗原受体，所述第一核酸分子与所述第二核酸分子被设置在上述淋巴细胞中表达上述功能性免疫共刺激分子与上述嵌合抗原受体，并且上述功能性免疫共刺激分子与上述嵌合抗原受体呈非融合形式。成功设置上述第一核酸分子和第二核酸分子的淋巴细胞在体外扩增及肿瘤病人体内存活能力更强，具有更强的肿瘤杀伤效果。
基于上述功能性免疫共刺激分子与上述嵌合抗原受体呈非融合形式，发明人是通过如下方式实现的：
内部核糖体进入位点序列，该内部核糖体进入位点序列设置在上述第一核酸分子与上述第二核酸分子之间。内部核糖体进入位点通常位于RNA病毒基因组的5’非翻译区(UTR)，这样一个病毒蛋白的翻译就可以不依赖于5‘帽子结构，另一个蛋白通常靠5’帽子结构起始翻译，IRES前后的两个蛋白的表达通常是成比例的。内部核糖体进入位点序列的引入使得第一核酸分子和第二核酸分子分别独立的翻译表达，得到的功能性免疫共刺激分子和嵌合抗原受体呈非融合形式，它们分别独立地被激活和发挥各自的功能。内部核糖体进入位点序列的引入有效保证了功能性免疫共刺激分子和嵌合抗原受体的生物学作用，使得淋巴细胞在肿瘤环境中的成活率大大提高，对肿瘤的靶向杀伤效果更加显著。
第三核酸分子，改第三核酸分子设置在第一核酸分子与第二核酸分子之间，并且第三核酸分子编码连接肽，连接肽能够在所述淋巴细胞中被切割。在本发明中，连接肽具有SEQ ID NO 5所示的氨基酸序列。SEQ ID NO 5所示的氨基酸序列是手足口病毒(一种小RNA病毒)的2A肽段。第三核酸分子的引入使得功能性免疫共刺激分子和嵌合抗原受体成非融合状态表达在淋巴细胞膜上，从而保证了功能性免疫共刺激分子和嵌合抗原受体的生物学作用，从而使得淋巴细胞在肿瘤环境中的成活率大大提高，淋巴细胞的靶向杀伤作用更加显著。
第一启动子，该第一启动子与上述第一核酸分子可操作地连接；以及第二启动子，该第二启动子与上述第二核酸分子可操作地连接。在本发明中，第一启动子和第二启动子分别独立地选自CMV,EF-1,RSV启动子。上述启动子具有启动效率高的特点，从而保证了功能性免疫共刺激分子和嵌合抗原受体的分别高效地表达，使得淋巴细胞在肿瘤环境中的成活率大大提高，淋巴细胞的靶向作用更强，对肿瘤细胞的杀伤作用更加显著。
通过上述内部核糖体进入位点序列、第三核酸分子或第一、第二启动子的引入，使得功能性免疫共刺激分子和嵌合抗原受体以非融合状态高效地表达在上述转基因淋巴细胞膜上，从而保证了功能性免疫共刺激分子和嵌合抗原受体的生物学作用，从而使得淋巴细胞在肿瘤环境中的成活率大大提高，淋巴细胞的靶向杀伤作用更加显著。
本发明中的构建体是非致病性病毒，所述病毒选自反转录病毒、慢病毒和腺病毒相关病毒。上述构建体病毒感染范围广泛，慢病毒可感染终末分化细胞，反转录病毒可感染处于分裂期的细胞，反转录病毒、慢病毒可整合到宿主染色体，腺病毒又可游离在宿主染色体之外，实现广谱而高效的感染效率，从而大大提高了功能性免疫共刺激分子和嵌合抗原受体在淋巴细胞中的高效表达，使得淋巴细胞在肿瘤环境中的成活率大大提高，淋巴细胞的靶向作用进一步增强，对肿瘤细胞的杀伤作用更加显著。
制备转基因淋巴细胞的方法
本发明提出了一种转基因淋巴细胞的方法。该方法包括：将上述构建体或者慢病毒引入到淋巴细胞中或者T淋巴细胞。引入方式可以选自电转或病毒感染宿主细胞的方式引入。构建体或慢病毒成功引入上述淋巴细胞或者T淋巴细胞中，实现了功能性免疫共刺激分子和嵌合抗原受体在淋巴细胞或T淋巴细胞中的表达，从而使得所得淋巴细胞或T淋巴细胞在体外扩增及肿瘤病人体内存活能力大大提高，淋巴细胞或T淋巴细胞对肿瘤细胞的靶向杀伤作用更强。
用于治疗癌症的治疗组合物
本发明提出了一种用于治疗癌症的治疗组合物，该治疗组合物包括：上述构建体、慢病毒、T淋巴细胞或者转基因淋巴细胞。
提供给患者的这些治疗组合物,较好的应用于生物兼容溶液或可接受的药学运载载体。作为准备的各种治疗组合物被悬浮或溶解在医药上或生理上可接受的载体，如生理盐水；等渗的盐溶液或其他精于此道的人的比较明显的配方中。适当的载体在很大程度上取决于给药途径。其他有水和无水的等渗无菌注射液和有水和无水的无菌悬浮液，是医药上可接受的载体。
足够数量的病毒载体被转导入靶向T细胞中，并提供足够强度的转基因，共表达4-1BB或OX40和特有的CD19嵌合抗原受体。治疗试剂的剂量主要取决于治疗状况,年龄，体重，病人的健康程度，从而可能造成病人的变异性。
共表达4-1BB或OX40和特有的CD19嵌合抗原受体的这些方法是联合治疗的一部分。这些病毒载体和用于过继免疫治疗的抗肿瘤T细胞，可以被单独或结合其他治疗癌症的方法一起执行。在合适的条件下，一个治疗方法的发明包括使用一个或多个药物疗法。
上述癌症包括造血系统恶性肿瘤。功能性免疫共刺激分子和嵌合抗原受体在转基因淋巴细胞或T淋巴细胞中的高效表达，使得所得淋巴细胞或T淋巴细胞在体外扩增及造血系统恶性肿瘤的环境中的成活率大大提高，淋巴细胞或T淋巴细胞对造血系统恶性肿瘤的肿瘤细胞的靶向杀伤作用更强。
提高淋巴细胞活性的方法
本发明提出了一种提高淋巴细胞活性的方法，上述淋巴细胞携带嵌合抗原受体，该方法包括：淋巴细胞表达功能性免疫共刺激分子。在本发明中，淋巴细胞的活性包括淋巴细胞体外扩增能力、淋巴细胞在肿瘤病人体内的生存能力、以及所述淋巴细胞在肿瘤病人体内的杀伤能力的至少一种。功能性免疫共刺激分子在上述淋巴细胞中的表达，淋巴细胞照中的抗凋亡基因上调，如Bcl-xl，从而预防了激活诱导的细胞凋亡，使得上述淋巴细胞在体外扩增及肿瘤病人体内存活能力大大提高，对肿瘤细胞的靶向杀伤作用更强。
下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。
本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件(例如参考J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社)或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1
本发明实施例中所用到的细胞系和基本实验技术如下所述：
细胞系
实施例中用到下述细胞系:Raji和Daudi(CD19+Burkitt淋巴瘤细胞系),Jurkat细胞(CD19-T淋巴细胞瘤细胞系),和K562(NK细胞靶细胞)。以上细胞均都来自于ATCC(美国细胞库)，并且培养于加有10％胎牛血清谷酰胺和2毫升的左旋谷胺酰胺的RPMI–1640培养基中(购自Gibco-BRL,San Francisco,CA,USA)。
外周血淋巴细胞的转导
逆转录病毒pMIP-CD19感染外周血淋巴细胞，使得外周血淋巴细胞稳定表达抗CD19的嵌合抗原受体和增强型绿色荧光蛋白。逆转录病毒是通过转染Phoenix包装细胞系来实现病毒的包装和扩增的，具体过程如下：2.5微克env(pVSV-G；Clontech,BD Biosciences)和3.5微克逆转录病毒质粒涡旋混合，形成的DNA混合物加入Phoenix细胞上清培养基中，轻晃混匀，细胞孵育8小时，之后吸弃上清，并用PBS润洗一次，然后加入RPMI 1640培养基进行孵育培养。孵育培养48小时后，收集含有逆转录病毒的上清夜并过滤，过滤后用RPMI 1640培养基进行稀释(稀释比例是1:2)。
收集的病毒上清液感染外周血淋巴细胞(PBMC)的过程如下：种在24孔板(购自Costar,Corning,NY)中的PBMC细胞(每孔中含有5.0×105个PBMC细胞)吸弃原培养基，每孔加入200微升的逆转录病毒上清和6微克/毫升的聚凝胶，在1800rpm、30摄氏度的条件下离心90分钟。离心后，每孔再次加入300微升的完全RPMI培养基，之后将细胞放在37摄氏度和5％CO2环境的细胞培养箱中进行培养。
测定细胞因子的分泌
在质粒转导后的2-7天，非转导或转导了嵌合抗原受体质粒的T细胞(细胞个数是1×106/孔)与CD19+Burkitt淋巴瘤细胞共培养，实验过程中改变不同的效靶细胞比例。应用特定的酶联免疫吸附测定法(细胞因子酶联免疫吸附测试剂盒，购自R&D Systems,Inc.,Minneapolis,MN,USA)检测细胞上清液中细胞因子的产量。上述细胞上清液取自培养了24小时、48小时和72小时之后的细胞的上清，测定结果用来衡量有代表性的细胞因子(干扰素-γ)(IFNγ)的产量。
简要测定过程如下：酶标板中加入100微升/孔的作为一系列标准对照的细胞因子稀释溶液(如IFNγ)或待测细胞上清溶液，并将酶标板在室温下放置2小时。2小时后吸弃酶标板中溶液并用400微升的洗液润洗酶标板，润洗四次。润洗后，向酶标板每个孔中加入200微升的酶联抗细胞因子抗体。继续在室温下放置2个小时，之后向每孔中加入200微升的底物溶液。加入底物溶液后，将酶标板在室温下放置30分钟，之后，向每孔中加入50微升的终止反应液。在30分钟内测定酶标板每孔的光密度。酶标仪设置在450nm。
铬释放实验
实施例中应用4–小时51铬释放法分析评估抗CD19嵌合抗原受体T细胞(抗CD19CAR+T淋巴细胞)的细胞毒活性。
具体步骤如下：目标测试细胞用51Cr在37摄氏度下标记1小时。标记后，用含有10％胎牛血清(FCS)的RPMI培养基润洗细胞。润洗后，将细胞重悬在相同的培养基中，重悬细胞的浓度是1×105/ml。转导后T细胞以不同的效靶细胞比值(E：T)加入目标测试细胞悬浮液中，并将细胞种在96-孔中，每孔体积是200微升。将细胞培养在37度培养箱中培养4小时。4小时后，从每孔中取出30微升的上清放于计数器的96-微孔板进行计数分析。分析仪器是顶级计数NXT微闪烁计数器(购自Packard Bioscience)。所有计数孔中效应细胞的数目是基于T细胞总数来计算的。被标记的目标测试细胞包括Raji and Daudi(CD19+),and Jurkat(CD19–)细胞.
实施例24-1BB的激活增强了抗原特异性外周血淋巴细胞的抗肿瘤效应
在本实施例中，发明人检测了激活外周血淋巴细胞的4-1BB后的效应。在实施例中，发明人向C57BL/6小鼠侧腹通过肌肉注射注入5×105个B16-OVA鼠肿瘤细胞。4天后，向小鼠中静脉注射2×106个已激活OT-1淋巴细胞(取自OT1转基因鼠的脾脏并且在体外用0.1微克/毫升的SIINFEKL肽段处理48小时以激活OT-1淋巴细胞)(OT1转基因鼠脾脏分离细胞表达T细胞受体，并特异识别SIINFEKL肽段并被激活)和腹腔注射150微克大鼠来源的抗小鼠-CD137抗体(结合4-1BB并激活4-1BB)(克隆位点是3H3)(购自BioXCell)。实验对照组小鼠分别单一静脉注射2×106已激活OT-1淋巴细胞或腹腔注射150微克大鼠来源抗小鼠-CD137抗体。空白对照组小鼠注入PBS。然后，监控肿瘤细胞的生长状况。
实验结果如图1所示。纵坐标代表小鼠的肿瘤大小。(P<0.01,OT-I vs.OT-1+α4-1BB)(n＝5)。图1结果显示：被肌肉注射了5×105个肿瘤细胞的小鼠，如果单独注射2×106激活OT-1淋巴细胞而不给抗体或给予对照抗体(鼠IgG)，小鼠体内的肿瘤细胞生长迅速。单独注射100微克的抗小鼠-CD137的抗体也没有表现出明显的治疗效果。然而，同时给予激活的OT1淋巴细胞和抗小鼠-CD137抗体，肿瘤细胞的生长被显著抑制。
实施例3构建共表达4-1BB或OX40和抗CD19嵌合抗原受体的载体
本实施例中，发明人将编码有抗人体CD19的单链抗体的序列、CD28胞内段和T细胞受体组合的ζ-链序列克隆到pMIG逆转录病毒载体上，克隆过程中，选择的限制性酶切是XbaI和NotI双酶切,以及NotI和XhoI双酶切,通过酶切、连接、筛选和目的质粒的扩增，生成pMIG-CD19嵌合抗原受体逆转录病毒质粒(RV-CD19CAR)。包含IRES和人体4-1BB或OX40的序列被克隆进pMIG-CD19嵌合抗原受体逆转录病毒质粒，或包含编码连接肽的序列和人体4-1BB或OX40的序列被克隆进pMIG-CD19嵌合抗原受体逆转录病毒质粒，或带有不同启动子，如CMV,EF-1,RSV启动子，和编码人体的4-1BB或OX40的序列被克隆进pMIG-CD19嵌合抗原受体逆转录病毒质粒，生成4-1BB或OX40-CD19嵌合抗原受体逆转录病毒质粒(RV-CD19-CAR/4-1BB，or,RV-CD19-CAR/OX40)。载体示意图如图2所示。图2A显示了pMIG逆转录病毒载体的示意图(包含IRES、编码人体4-1BB或OX40的序列和编码抗CD19嵌合抗原受体序列)；图2B显示了pMIG逆转录病毒载体的示意图(包含启动子CMV、编码人体4-1BB或OX40的序列和编码抗CD19嵌合抗原受体序列)。
实施例4共表达4-1BB和抗CD19嵌合抗原受体的T细胞的细胞溶解能力增强
在本实施例中，外周血淋巴细胞取自不记名供血者。外周血淋巴细胞通过梯度离心进行分离，梯度离心机为Ficoll-Hypaque。T淋巴细胞与T细胞激活因子磁珠CD3/CD28(购自Invitrogen,Carlsbad,CA)在5％CO2、37摄氏度下孵育培养72小时，培养基是加有2mmol/L谷氨酰胺,10％高温灭活的胎牛血清(FCS)(购自Sigma-Aldrich Co.)和100U/ml的青霉素/链霉素双抗的RPMI培养基1640(购自Invitrogen Gibco Cat.no.12633-012)。激活培养72小时后，用洗液润洗细胞，将磁珠洗去。将T细胞种在铺有重组纤连蛋白片段(FN ch-296；Retronectin)细胞培养皿上，并用逆转录病毒质粒转导,转导质粒分别为RV-CD19-CAR/4-1BB，RV-CD19CAR，RV-4-1BB或空载(RV-blank)转导过程如实施例1所述。转导后的T细胞培养在RPMI-1640培养基中并用重组人类IL-2因子(100ng/ml；购自R&D Systems)进行诱导扩增7-10天，然后功能测试实验。发明人测量转导了不同逆转录病毒的T细胞对(CD19-和CD19+)淋巴瘤细胞的杀伤作用，效靶细胞比例是10：1，测量方法采用标准4–小时51铬释放法，4–小时51铬释放法如实施例1所述。结果如图3所示。
如图3所示,共表达4-1BB和CD19嵌合抗原受体的T细胞比单独表达CD19嵌合抗原受体或4-1BB的T细胞,可更为有效的杀死CD19+淋巴瘤细胞(Raji)。单独表达4-1BB的人类T细胞对CD19+lymphoma细胞没有明显的细胞毒性。表达抗CD19嵌合抗原受体的T细胞或共表达4-1BB和抗CD19嵌合抗原受体的T细胞对CD19-(Jurkat)淋巴瘤细胞没有显著杀伤作用。空载质粒转导T淋巴细胞(对照T淋巴细胞)对CD19+或CD19-淋巴瘤细胞均为明显杀伤作用。
实施例5共表达4-1BB和抗CD19嵌合抗原受体的T淋巴细胞具有细胞因子分泌更多和活细胞比例更高的特点
在T淋巴细胞激活因子磁珠CD3/CD28存在下，被激活的T淋巴细胞经过质粒转导、体外扩增培养，方法如上所述，10天后，用酶联免疫吸附(ELISA)和Trypan蓝染色法评估细胞因子的分泌和细胞的活性，ELISA实验方法如实施例1所述。实验结果如图4所示。图4结果表明，(A)转导了RV-CD19-CAR/4-1BB或RV-4-1BB质粒的T淋巴细胞比转导了RV-CD19-CAR或空载质粒的T淋巴细胞分泌更多的IFNγ。(P<0.05；RV-CD19-CAR/4-1BB vs.RV-CD19-CAR)。(B)转导了RV-CD19-CAR/4-1BB或RV-4-1BB质粒的T淋巴细胞比转导了RV-CD19-CAR或空载的T淋巴细胞的活细胞比例显著提高，(P<0.05；RV-CD19-CAR/4-1BB vs.RV-CD19-CAR)。同时证明了转导了RV-CD19-CAR/4-1BB或RV-4-1BB质粒的T淋巴细胞比转导了RV-CD19-CAR或空载的T淋巴细胞的体外扩增能力和抗凋亡能力显著提高。
实施例6共表达OX-40和抗CD19嵌合抗原受体的T细胞的细胞溶解能力增强，并且具有细胞因子分泌更多和活细胞比例更高的特点
在本实施例中，发明人还考察共表达OX-40和抗CD19嵌合抗原受体的T细胞的溶解能力、细胞因子分泌和细胞凋亡方面的实验过程与实施例4和实施例5相同，实验结论与共表达4-1BB和抗CD19嵌合抗原受体的T细胞类似，即共表达OX-40和抗CD19嵌合抗原受体的T细胞比单独表达抗CD19嵌合抗原受体或全长OX-40的T细胞的细胞溶解能力增强，共表达OX-40和抗CD19嵌合抗原受体的T细胞或单独表达全长OX-40的T细胞比单独表达抗CD19嵌合抗原受体的T细胞细胞因子分泌增多、活细胞比例更高，共表达OX-40和抗CD19嵌合抗原受体的T细胞体外扩增能力和抗凋亡能力显著提高。
综上实施例所述，共表达功能性免疫共刺激分子和嵌合抗原受体的T淋巴细胞对抗原表达肿瘤细胞，如淋巴瘤细胞，靶向杀伤作用更强、更有效，与肿瘤细胞共培养时活细胞比例更高，即扩增能力更强和抗凋亡能力更强。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

Claims (28)

1.一种T淋巴细胞，其特征在于，所述T淋巴细胞表达：
4-1BB；以及
嵌合抗原受体，其中，
所述嵌合抗原受体包括：
胞外区，所述胞外区包括单链抗体的重链可变区和轻链可变区，所述单链抗体特异性识别抗原CD19；
跨膜区，所述跨膜区与所述胞外区相连，并且嵌入到所述T淋巴细胞的细胞膜中；以及
胞内区，所述胞内区与所述跨膜区相连，并且所述胞内区包括CD28的胞内段以及CD3ζ链。
2.一种逆转录病毒，其特征在于，所述逆转录病毒携带编码下列蛋白的核酸分子：
全长4-1BB，所述全长4-1BB具有SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列；
嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体具有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。
3.一种逆转录病毒，其特征在于，所述逆转录病毒携带含有SEQ ID NO：3或4所示的核苷酸序列。
4.一种转基因淋巴细胞，其特征在于，所述淋巴细胞表达：
功能性免疫共刺激分子；以及
嵌合抗原受体。
5.根据权利要求4所述的转基因淋巴细胞，其特征在于，所述嵌合抗原受体包括：
胞外区，所述胞外区能够与抗原特异性结合；
跨膜区；以及
胞内区，所述胞内区包括免疫共刺激分子胞内段。
6.根据权利要求5所述的转基因淋巴细胞，其特征在于，所述抗原是肿瘤抗原。
7.根据权利要求6所述的转基因淋巴细胞，其特征在于，所述胞外区包括抗体的重链可变区和轻链可变区，所述抗体结合所述抗原。
8.根据权利要求7所述的转基因淋巴细胞，其特征在于，所述抗体为单链抗体。
9.根据权利要求8所述的转基因淋巴细胞，其特征在于，所述抗原为CD19。
10.根据权利要求4所述的转基因淋巴细胞，其特征在于，所述功能性免疫共刺激分子独立地选自4-1BB、OX-40、CD40L、CD27、CD30、CD28以及他们的衍生物。
11.根据权利要求5所述的转基因淋巴细胞，其特征在于，所述免疫共刺激分子胞内段独立地选自4-1BB、OX-40、CD40L、CD27、CD30、CD28以及他们的衍生物的至少一种。
12.根据权利要求10或11所述的转基因淋巴细胞，其特征在于，所述功能性免疫共刺激分子包括全长的4-1BB、OX40或者CD40L，所述免疫共刺激分子胞内段为CD28或者4-1BB胞内段。
13.根据权利要求4所述的转基因淋巴细胞，其特征在于，所述淋巴细胞是CD3+T淋巴细胞。
14.根据权利要求13所述的转基因淋巴细胞，其特征在于，所述淋巴细胞是自然杀伤细胞。
15.根据权利要求14所述的转基因淋巴细胞，其特征在于，所述淋巴细胞是自然杀伤T细胞。
16.一种构建体，其特征在于，所述构建体包括：
第一核酸分子，所述第一核酸分子编码功能性免疫共刺激分子；以及
第二核酸分子，所述第二核酸分子编码嵌合抗原受体，
其中，所述功能性免疫共刺激分子和所述嵌合抗原受体是如权利要求4～15任一项中所定义的。
17.根据权利要求16所述的构建体，其特征在于所述第一核酸分子与所述第二核酸分子被设置为在权利要求4～15任一项所述的淋巴细胞中表达所述功能性免疫共刺激分子与所述嵌合抗原受体，并且所述功能性免疫共刺激分子与所述嵌合抗原受体呈非融合形式。
18.根据权利要求17所述的构建体，其特征在于，进一步包括：
内部核糖体进入位点序列，所述内部核糖体进入位点序列设置在所述第一核酸分子与所述第二核酸分子之间，所述内部核糖体进入位点具有SEQ ID NO：5所示的核苷酸序列。
19.根据权利要求16所述的构建体，其特征在于，进一步包括：
第三核酸分子，设置在所述第一核酸分子与所述第二核酸分子之间，并且所述第三核酸分子编码连接肽，所述连接肽能够在所述淋巴细胞中被切割。
20.根据权利要求19所述的构建体，其特征在于，所述连接肽具有SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列。
21.根据权利要求16所述的构建体，其特征在于，进一步包括：
第一启动子，所述第一启动子与所述第一核酸分子可操作地连接；以及
第二启动子，所述第二启动子与所述第二核酸分子可操作地连接。
22.根据权利要求21所述的构建体，其特征在于，所述第一启动子和所述第二启动子分别独立地选自CMV,EF-1,RSV启动子。
23.根据权利要求16所述的构建体，其特征在于，所述构建体是非致病性病毒。
24.根据权利要求23所述的构建体，其特征在于，所述构建体是病毒，所述病毒选自反转录病毒、慢病毒和腺病毒相关病毒。
25.一种制备权利要求1所述的T淋巴细胞或者权利要求4～15任一项所述的转基因淋巴细胞的方法，其特征在于，包括：
将权利要求16～24任一项所述的构建体或者权利要求2或3所述的逆转录病毒引入到淋巴细胞中或者T淋巴细胞。
26.一种用于治疗癌症的治疗组合物，其特征在于，包括：
权利要求16～24任一项所述的构建体、权利要求2或3所述的逆转录病毒、权利要求1所述的T淋巴细胞或者权利要求4～15任一项所述的转基因淋巴细胞。
27.根据权利要求26所述的治疗组合物，其特征在于，所述癌症包括造血系统恶性肿瘤。
28.一种提高淋巴细胞活性的方法，所述淋巴细胞携带嵌合抗原受体，其特征在于，所述方法包括：使所述淋巴细胞表达功能性免疫共刺激分子，
所述功能性免疫共刺激分子、所述淋巴细胞和所述嵌合抗原受体是如权利要求4～15任一项中所定义的，
所述淋巴细胞活性包括所述淋巴细胞体外扩增能力、在肿瘤病人体内的生存能力以及所述淋巴细胞在肿瘤病人体内的杀伤能力的至少一种。
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