CN107586341A - 重组免疫检查点受体及免疫检查点抑制分子的共表达及应用 - Google Patents

重组免疫检查点受体及免疫检查点抑制分子的共表达及应用 Download PDF

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Abstract

本发明提出了一种转基因淋巴细胞、一种构建体和一种治疗癌症的治疗组合物，该转基因淋巴细胞的细胞免疫检查点被沉默以及表达重组受体，该重组受体包括：细胞免疫检查点分子片段；免疫刺激分子片段；以及T细胞受体zeta链。该转基因淋巴细胞具有抵抗肿瘤细胞介导的免疫抑制的特性，对肿瘤细胞的杀伤能力显著增强。

Description

重组免疫检查点受体及免疫检查点抑制分子的共表达及应用
技术领域
本发明涉及生物医药领域，具体地，本发明涉及重组免疫检查点受体及免疫检查点抑制分子的共表达及应用，更具体地，本发明涉及重组受体、核酸、慢病毒、转基因淋巴细胞、构建体、制备转基因淋巴细胞的方法、治疗癌症的治疗组合物以及提高淋巴细胞免疫杀伤能力的方法。
背景技术
癌症，由于细胞内基因突变导致细胞增殖失控的一种疾病。目前已成为人类健康的重大威胁，是导致人类死亡的主要原因之一。世界卫生组织(WHO)在发表的《全球癌症报告2014》中指出，2012年全球癌症患者和死亡病例都在迅速增加，而新增癌症病例有近一半出现在亚洲，其中大部分在中国，中国新增癌症病例高居第一位。《2012年中国肿瘤登记年报》数据显示，中国每年新增癌症病例约350万，约有250万人因此死亡。因此，寻找高效特异的癌症治疗方法具有重大的临床价值。
传统的肿瘤治疗方法主要包括手术、放疗和化疗，但这几种方法都具有较大的局限性，比如由于癌细胞的近端入侵或远端转移，手术切除后的肿瘤转移复发率较高，而放疗和化疗对于机体自身的正常细胞尤其是造血系统和免疫系统会造成严重的损害，因此对于已发生肿瘤转移的患者也很难达到较好的远期疗效。随着肿瘤分子机制的深入研究和生物技术的进一步发展，靶向药物治疗和免疫治疗在肿瘤的综合治疗中发挥着愈来愈大的作用。靶向疗法主要包括单克隆抗体(有时归为被动胞回输和肿瘤疫苗等。免疫疗法通过调动机体的免疫系统，增强肿瘤微环境抗肿瘤免免疫疗法)和小分子靶向药物，而免疫疗法主要包括细胞因子疗法、免疫检验点单抗、过继免疫疗法，从而控制和杀伤肿瘤细胞，因此有效率高，特异性强，耐受性好的优点，在肿瘤治疗中具有广阔的前景。
然而，肿瘤的免疫疗法，仍有待进一步深入研究和开发，来增强临床疗效。
发明内容
本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。为此，本发明的一个目的在于提出一种重组受体及利用其有效增强淋巴细胞免疫杀伤肿瘤细胞的方法。
在本发明的第一方面，本发明提出了一种重组受体。根据本发明的实施例，所述重组受体包括：细胞免疫检查点分子片段；免疫刺激分子片段；以及T细胞受体zeta链。根据本发明的实施例，使淋巴细胞表达本发明实施例的重组受体，可有效增强淋巴细胞对肿瘤细胞的特异性杀伤效果。
根据本发明的实施例，上述重组受体还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：
根据本发明的实施例，所述细胞免疫检查点分子为PD1。PD1可与肿瘤细胞上特异性表达的PD-L1或PD-L2相结合。进而，淋巴细胞表达本发明实施例的重组受体，其对肿瘤细胞，尤其是PD-L1或PD-L2阳性肿瘤细胞的靶向杀伤性进一步增强。
根据本发明的实施例，所述细胞免疫检查点分子片段包括所述PD1的胞外区以及任选的跨膜区，所述免疫刺激分子片段包括CD28的胞内区以及任选的跨膜区。PD1的胞外区具有与肿瘤细胞上特异性表达的PD-L1或PD-L2相结合的功能区，CD28的胞内区具有激活免疫刺激信号通路的功能区，进而淋巴细胞细胞表达本发明实施例的重组受体，其对肿瘤细胞的靶向性杀伤效果进一步提高。
根据本发明的实施例，所述重组受体包括：(a)所述PD1的胞外区和跨膜区；以及(b)所述CD28的胞内区，或者包括：(i)所述PD1的胞外区；以及(ii)所述CD28的胞内区和跨膜区。这两种组合方式均保留了PD1与肿瘤细胞上特异性表达的PD-L1或PD-L2相结合的功能区以及CD28激活免疫刺激信号通路的功能区，同时不论是PD1跨膜区还是CD28的跨膜区，均可使重组受体跨膜表达，进而淋巴细胞细胞表达本发明实施例的重组受体，其对肿瘤细胞的靶向性杀伤效果进一步提高。
根据本发明的实施例，所述T细胞受体zeta链为CD3zeta链。CD3zeta链可特异性激活下游T细胞受体信号通路，进而淋巴细胞细胞表达本发明实施例的重组受体，其对肿瘤细胞的杀伤效果进一步提高。
根据本发明的实施例，所述细胞免疫检查点分子片段的C端与所述免疫刺激分子片段的N端相连，所述免疫刺激分子片段的C端与所述T细胞受体zeta链的N端相连。本发明实施例的重组受体的相关片段在上述连接顺序下，有利于相关片段在细胞中的定位，进而更有利于发挥相应的功能-靶向、跨膜、激活免疫刺激信号通路以及激活T细胞受体信号通路，其对肿瘤细胞的靶向性杀伤能力进一步提高。
在本发明的第二方面，本发明提出了一种重组受体。根据本发明的实施例，所述重组受体具有SEQ ID NO：1或2所示的氨基酸序列。
M Q I P Q A P W P V V W A V L Q L G W R P G W F L D S P D R P W N P PT F S P A L L V V T E G D N A T F T C S F S N T S E S F V L N W Y R M S P S NQ T D K L A A F P E D R S Q P G Q D C R F R V T Q L P N G R D F H M S V V R AR R N D S G T Y L C G A I S L A P K A Q I K E S L R A E L R V T E R R A E V PT A H P S P S P R P A G Q F Q T L V V G V V G G L L G S L V L L V W V L A V IS K R S R L L H S D Y M N M T P R R P G P T R K H Y Q P Y A P P R D F A A Y RS R V K F S R S A D A P A Y Q Q G Q N Q L Y N E L N L G R R E E Y D V L D K RR G R D P E M G G K P R R K N P Q E G L Y N E L Q K D K MA E A Y S E I G M KG E R R R G K G H D G L Y Q G L S T A T K D T Y D A L H M Q A L P P R(SEQ IDNO：1)。
M Q I P Q A P W P V V W A V L Q L G W R P G W F L D S P D R P W N P PT F S P A L L V V T E G D N A T F T C S F S N T S E S F V L N W Y R M S P S NQ T D K L A A F P E D R S Q P G Q D C R F R V T Q L P N G R D F H MS V V R AR R N D S G T Y L C G A I S L A P K A Q I K E S L R A E L R V T E R R A E V PT A H P S P L F P G P S K P F W V L V V V G G V L A C Y S L L V T V A F I I FW V R S K R S R L L H S D Y M N MT P R R P G P T R K H Y Q P Y A P P R D F AA Y R S R V K F S R S A D A P A Y Q Q G Q N Q L Y N E L N L G R R E E Y D V LD K R R G R D P E M G G K P R R K N P Q E G L Y N E L Q K D K M A E A Y S E IG M K G E R R R G K G H D G L Y Q G L S T A T K D T Y D A L H M Q A L P P R(SEQ ID NO：2)。
根据本发明的实施例，使淋巴细胞表达本发明实施例的重组受体，可有效增强淋巴细胞对肿瘤细胞，特别是PD-L1或PD-L2阳性肿瘤细胞的特异性杀伤效果。
在本发明的第三方面，本发明提出了一种核酸。根据本发明的实施例，所述核酸编码前面所述的重组受体，任选地，所述核酸具有SEQ ID NO：3或4所示的核苷酸序列。
ATGCAGATCCCACAGGCGCCCTGGCCAGTCGTCTGGGCGGTGCTACAACTGGGCTGGCGGCCAGGATGGTTCTTAGACTCCCCAGACAGGCCCTGGAACCCCCCCACCTTCTCCCCAGCCCTGCTCGTGGTGACCGAAGGGGACAACGCCACCTTCACCTGCAGCTTCTCCAACACATCGGAGAGCTTCGTGCTAAACTGGTACCGCATGAGCCCCAGCAACCAGACGGACAAGCTGGCCGCCTTCCCCGAGGACCGCAGCCAGCCCGGCCAGGACTGCCGCTTCCGTGTCACACAACTGCCCAACGGGCGTGACTTCCACATGAGCGTGGTCAGGGCCCGGCGCAATGACAGCGGCACCTACCTCTGTGGGGCCATCTCCCTGGCCCCCAAGGCGCAGATCAAAGAGAGCCTGCGGGCAGAGCTCAGGGTGACAGAGAGAAGGGCAGAAGTGCCCACAGCCCACCCCAGCCCCTCACCCAGGCCAGCCGGCCAGTTCCAAACCCTGGTGGTTGGTGTCGTGGGCGGCCTGCTGGGCAGCCTGGTGCTGCTAGTCTGGGTCCTGGCCGTCATCAGTAAGAGGAGCAGGCTCCTGCACAGTGACTACATGAACATGACTCCCCGCCGCCCCGGGCCCACCCGCAAGCATTACCAGCCCTATGCCCCACCACGCGACTTCGCAGCCTATCGCTCCAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGCTAA(SEQ ID NO：3)。
ATGCAGATCCCACAGGCGCCCTGGCCAGTCGTCTGGGCGGTGCTACAACTGGGCTGGCGGCCAGGATGGTTCTTAGACTCCCCAGACAGGCCCTGGAACCCCCCCACCTTCTCCCCAGCCCTGCTCGTGGTGACCGAAGGGGACAACGCCACCTTCACCTGCAGCTTCTCCAACACATCGGAGAGCTTCGTGCTAAACTGGTACCGCATGAGCCCCAGCAACCAGACGGACAAGCTGGCCGCCTTCCCCGAGGACCGCAGCCAGCCCGGCCAGGACTGCCGCTTCCGTGTCACACAACTGCCCAACGGGCGTGACTTCCACATGAGCGTGGTCAGGGCCCGGCGCAATGACAGCGGCACCTACCTCTGTGGGGCCATCTCCCTGGCCCCCAAGGCGCAGATCAAAGAGAGCCTGCGGGCAGAGCTCAGGGTGACAGAGAGAAGGGCAGAAGTGCCCACAGCCCACCCAAGTCCCCTATTTCCCGGACCTTCTAAGCCCTTTTGGGTGCTGGTGGTGGTTGGTGGAGTCCTGGCTTGCTATAGCTTGCTAGTAACAGTGGCCTTTATTATTTTCTGGGTGAGGAGTAAGAGGAGCAGGCTCCTGCACAGTGACTACATGAACATGACTCCCCGCCGCCCCGGGCCCACCCGCAAGCATTACCAGCCCTATGCCCCACCACGCGACTTCGCAGCCTATCGCTCCAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGCTAA(SEQ ID NO：4)。
将本发明实施例的核酸导入受体淋巴细胞中，核酸所编码的重组受体在淋巴细胞中跨膜表达，该淋巴细胞对肿瘤细胞的特异性杀伤效果显著提高。
在本发明的第四方面，本发明提出了一种慢病毒。根据本发明的实施例，所述慢病毒携带下列核酸分子：(a)编码前面所述重组受体的核酸分子，所述重组受体具有SEQ IDNO：1或2所示的氨基酸序列，所述编码重组受体的核酸分子具有SEQ ID NO：3或4所示的核苷酸序列；(b)沉默细胞免疫检查点的核酸分子，所述沉默细胞免疫检查点的核酸分子的核苷酸序列为选自SEQ ID NO：5～137的至少之一。
GGCCAGGATGGTTCTTAGACT(SEQ ID NO：5)。
GGATTTCCAGTGGCGAGAGAA(SEQ ID NO：6)。
GCCUGUGUUCUCUGUGGACUAUG(SEQ ID NO：7)。
GGUGCUGCUAGUCUGGGUCCUGG(SEQ ID NO：8)。
GACAGAGAGAAGGGCAGAAGUGC(SEQ ID NO：9)。
CAGCUUCUCCAACACAUCGGAGA(SEQ ID NO：10)。
CCGUGUCACACAACUGCCCAACG(SEQ ID NO：11)。
UAUGCCACCAUUGUCUUUCCUAG(SEQ ID NO：12)。
UGCUAAACUGGUACCGCAUGAGC(SEQ ID NO：13)。
GUGACAGAGAGAAGGGCAGAAGU(SEQ ID NO：14)。
CUGAGGAUGGACACUGCUCUUGG(SEQ ID NO：15)。
AUCGGAGAGCUUCGUGCUAAACU(SEQ ID NO：16)。
GGCAACGGAACCCAGATTTAT(SEQ ID NO：17)。
GGAACCCAAATTACGTGTACT(SEQ ID NO：18)。
GAACCCAAATTACGTGTACTA(SEQ ID NO：19)。
GGGAGAAGACTATATTGTACA(SEQ ID NO：20)。
GACGTTTATAGCCGAAATGAT(SEQ ID NO：21)。
GACACTAATACACCAGGTAGA(SEQ ID NO：22)。
ACCUCACUAUCCAAGGACUGAGG(SEQ ID NO：23)。
AUGAGUUGACCUUCCUAGAUGAU(SEQ ID NO：24)。
GGGGAAUGAGUUGACCUUCCUAG(SEQ ID NO：25)。
CUCUGGAUCCUUGCAGCAGUUAG(SEQ ID NO：26)。
CUCCUCUGGAUCCUUGCAGCAGU(SEQ ID NO：27)。
UUUGUGUGUGAGUAUGCAUCUCC(SEQ ID NO：28)。
CACCUCCAGUGGAAAUCAAGUGA(SEQ ID NO：29)。
CACGGGACUCUACAUCUGCAAGG(SEQ ID NO：30)。
UUCUGACUUCCUCCUCUGGAUCC(SEQ ID NO：31)。
AAGUCUGUGCGGCAACCUACAUG(SEQ ID NO：32)。
GGTCGGTCAGAATGCCTATCT(SEQ ID NO：33)。
GCCAATGACTTACGGGACTCT(SEQ ID NO：34)。
GCAGAGGGAATTCGCTCAGAA(SEQ ID NO：35)。
GGAAATTCGGGCACATCATAT(SEQ ID NO：36)。
GATTAAGAGATGACTGGACTA(SEQ ID NO：37)。
GAGATGACTGGACTAGGTCTA(SEQ ID NO：38)。
AGGAAAUUCGGGCACAUCAUAUG(SEQ ID NO：39)。
GACUGAUGAAAGGGAUGUGAAUU(SEQ ID NO：40)。
GCCACUGAUUUUCAAAGAGAUCU(SEQ ID NO：41)。
AGCAGAGUUUUCCCAUUUUCAGA(SEQ ID NO：42)。
AACUUAAACAGGCAUGUCAUUGC(SEQ ID NO：43)。
UUCAGAAGAUAAUGACUCACAUG(SEQ ID NO：44)。
GCCUCUGUAUUUAAGCCAACAGA(SEQ ID NO：45)。
UGCUCAUGUGAUUGUGGAGUAGA(SEQ ID NO：46)。
AUGUUUUCACAUCUUCCCUUUGA(SEQ ID NO：47)。
GAGAGACUUCACUGCAGCCUUUC(SEQ ID NO：48)。
GATTGCCTCTACTCATCACTA(SEQ ID NO：49)。
UCCUAAUGACAAUGGGUCAUACC(SEQ ID NO：50)。
AAGACAUUGCCUGCCAUGCUUGG(SEQ ID NO：51)。
GUCAUACCGCUGUUCUGCAAAUU(SEQ ID NO：52)。
CUCCUGUAUAGUUUACUUCCUUU(SEQ ID NO：53)。
UACCGCUGUUCUGCAAAUUUUCA(SEQ ID NO：54)。
AAAACAAACCAGGCAUUGUUUAU(SEQ ID NO：55)。
AACUAGAAUGCCCUGUGAAAUAC(SEQ ID NO：56)。
GUGACUUGGUGCAAGCUCAAUGG(SEQ ID NO：57)。
AUCCAUGGGAAAGAAUCAUGUGA(SEQ ID NO：58)。
UGGUGCAAGCUCAAUGGAACAAC(SEQ ID NO：59)。
GCTGCTCACCCTTATGAACCT(SEQ ID NO：60)。
AGGACAUGGUGGUGGACGAGUGC(SEQ ID NO：61)。
UGCUCUUCCUGCACGAUAUCAGU(SEQ ID NO：62)。
ACCUCUACUGGUUCCUGUACAUC(SEQ ID NO：63)。
CCCUCCAACUCUGCUCCUCUAGG(SEQ ID NO：64)。
CCCUGAGUGGACAGUCGUCUUCG(SEQ ID NO：65)。
CUGCUCCAGGGAAGCUUCUAUGG(SEQ ID NO：66)。
CGCUCAAGGUCCUGUAUGCCACC(SEQ ID NO：67)。
GAGUUCACCAAGCUCAACAUUUA(SEQ ID NO：68)。
UGCUGCUGCUCACCCUUAUGAAC(SEQ ID NO：69)。
CCCAUCUCCGUGCUCUUCUUUGA(SEQ ID NO：70)。
GGGACATCGTCGAGCTATTCA(SEQ ID NO：71)。
GGACATCGTCGAGCTATTCAT(SEQ ID NO：72)。
GCCAATGTCACCGTGGATAAT(SEQ ID NO：73)。
GTCATCTGTGGCAGTATATCA(SEQ ID NO：74)。
GGATGTAGAGTAGTGTTAGAT(SEQ ID NO：75)。
GGCAAAGTTAAGACCATCAAT(SEQ ID NO：76)。
GACCAAATCCACGCTCAATTA(SEQ ID NO：77)。
UACUGCUUAAAUCUUCCAUCAGC(SEQ ID NO：78)。
GACUGAGAAGUUCUGUCUGAUUU(SEQ ID NO：79)。
CUGUUUCAUCACCCAAACAUACU(SEQ ID NO：80)。
GAAGAUCCUCCCACAUCACUAAA(SEQ ID NO：81)。
UAGACCAAGGUAAAAGUGGAACA(SEQ ID NO：82)。
AAGAGGUUUUUAUCUGAGCUUGA(SEQ ID NO：83)。
UACCUGCACAACGUUCAACCAUG(SEQ ID NO：84)。
GCCUGGAUUCAUGUCUCUCAUUU(SEQ ID NO：85)。
CCCUCGGAAUUUCUCUGCCAAGC(SEQ ID NO：86)。
UGCUGAAGAUCCUCCCACAUCAC(SEQ ID NO：87)。
GCACCTCCTACCTCTTCATGT(SEQ ID NO：88)。
CGCACUUCCGCACAUUCCGUUCG(SEQ ID NO：89)。
GGGGAGGGUCUCUGGCUUUAUUU(SEQ ID NO：90)。
CAGCAUUAACUGGGAUGCCGUGU(SEQ ID NO：91)。
CCAGGACCUGAACUCGCACCUCC(SEQ ID NO：92)。
UACAUAUACCCAGUAUCUUUGCA(SEQ ID NO：93)。
GCCGACAAUGCAGUCUCCACAGC(SEQ ID NO：94)。
CCCCUGGUUGUUGUAGCAGCUUA(SEQ ID NO：95)。
CUGCUGUGCAGAAUCCUAUUUUA(SEQ ID NO：96)。
UGGGAUGCCGUGUUAUUUUGUUA(SEQ ID NO：97)。
UCGCACCUCCUACCUCUUCAUGU(SEQ ID NO：98)。
GCGGAAAGCTGTGAAGATACG(SEQ ID NO：99)。
ACAAAGCCCTCATCGACAGAA(SEQ ID NO：100)。
ATGCCACTTCTCAGTACATGT(SEQ ID NO：101)。
GTGGACTTCAGTACAACTCAC(SEQ ID NO：102)。
GTGGAATTTACTTGCCTCTCC(SEQ ID NO：103)。
GTTGGATGAAGCTAACTTACC(SEQ ID NO：104)。
ACTGGGAAGACGTGTAACTCT(SEQ ID NO：105)。
AAGGAATTGCATCCAAGGTAT(SEQ ID NO：106)。
GGAATTGCATCCAAGGTATAC(SEQ ID NO：107)。
GGATGAGACTGGCAATGGTCA(SEQ ID NO：108)。
UCCUCAGUUUCGGGAGAUCAUCC(SEQ ID NO：109)。
GAGUCUCUCAAAUCUCAGGAAUU(SEQ ID NO：110)。
AGCUCUAGUCCUUUUUGUGUAAU(SEQ ID NO：111)。
CACUGGAAAUGUUCAGAACUUGC(SEQ ID NO：112)。
AUGAUGAAUGGGACAAUCUUAUC(SEQ ID NO：113)。
CACACUGUGUUUCAUCGAGUACA(SEQ ID NO：114)。
GCAGAACCAUCCAUGGACUGUGA(SEQ ID NO：115)。
AAAGAUGUGGCCUUUUGUGAUGG(SEQ ID NO：116)。
UUCAGAACUUGCCAGUUUUGUCC(SEQ ID NO：117)。
AUGAGACUGGCAAUGGUCACAGG(SEQ ID NO：118)。
GTCAATTCCAGGGAGATAACT(SEQ ID NO：119)。
GCCTGGAAGCAATGGCTCTAA(SEQ ID NO：120)。
GCACCAAACCCGGAAGCTATA(SEQ ID NO：121)。
GTTGCACTCGATTGGGACAGT(SEQ ID NO：122)。
GGATTATGTGAACCTACACCT(SEQ ID NO：123)。
GGAATCACAGCGAGTTCAAAT(SEQ ID NO：124)。
GCAAGGCATAGTCTCATTGAA(SEQ ID NO：125)。
GGTGAAGAGAGCCTTAGAGAT(SEQ ID NO：126)。
GTGAAGAGAGCCTTAGAGATA(SEQ ID NO：127)。
AGGAGCUAAGGUCUUUUCCAAUG(SEQ ID NO：128)。
AUGUCGAUGCAAAAAUUGCAAAA(SEQ ID NO：129)。
GUCACAUGCUGGCAGAAAUCAAA(SEQ ID NO：130)。
UCCAGGUUACAUGGCAUUUCUCA(SEQ ID NO：131)。
UUGAACUUUGAACCUGUGAAAUG(SEQ ID NO：132)。
UCCACAUCAACAGCUAAAUCAUU(SEQ ID NO：133)。
AUGCUGGCAGAAAUCAAAGCAAU(SEQ ID NO：134)。
UGCAGAGAAUGACAAAGAUGUCA(SEQ ID NO：135)。
GGCAGAACUCACCAGUCACAUCA(SEQ ID NO：136)。
UCGGUCCUGUGAUAAUGGUCACU(SEQ ID NO：137)。
将本发明实施例的慢病毒导入受体淋巴细胞中，前面所述的重组受体在淋巴细胞中跨膜表达，同时淋巴细胞膜表面的免疫检查点分子被特异性沉默，进而在重组受体发挥加强淋巴细胞对肿瘤细胞的特异性杀伤功能的同时，免疫抑制机制也被阻遏。将本发明实施例的慢病毒导入受体淋巴细胞中，淋巴细胞对肿瘤细胞的特异性杀伤强大而有效。
根据本发明的实施例，上述慢病毒还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：
根据本发明的实施例，上述慢病毒还可以进一步携带编码无功能EGFR的核酸分子，所述无功能EGFR具有SEQ ID NO：138所示的氨基酸序列，所述编码无功能EGFR的核酸分子具有SEQ ID NO：139所示的核苷酸序列。
MA L P V T A L L L P L A L L L H A A R P G S R K V C N G I G I G E FK D S L S I N A T N I K H F K N C T S I S G D L H I L P V A F R G D S F T H TP P L D P Q E L D I L K T V K E I T G F L L I Q A W P E N R T D L H A F E N LE I I R G R T K Q H G Q F S L A V V S L N I T S L G L R S L K E I S D G D V II S G N K N L C Y A N T I N W K K L F G T S G Q K T K I I S N R G E N S C K AT G Q V C H A L C S P E G C W G P E P R D C V S C R N V S R G R E C V D K C NL L E G E P R E F V E N S E C I Q C H P E C L P Q A M N I T C T G R G P D N CI Q C A H Y I D G P H C V K T C P A G V M G E N N T L V W K Y A D A G H V C HL C H P N C T Y G C T G P G L E G C P T N G P K I P S I A T G M V G A L L L LL V V A L G I G L F M R R(SEQ ID NO:138)。
ATGGCTCTGCCCGTCACCGCTCTGCTGCTGCCTCTGGCTCTGCTGCTGCACGCCGCACGCCCTGGGAGTCGCAAAGTCTGTAATGGGATCGGCATCGGCGAGTTCAAGGACAGCCTGTCCATCAACGCCACCAATATCAAGCACTTTAAGAATTGCACATCTATCAGCGGCGACCTGCACATCCTGCCAGTGGCCTTCCGGGGCGATTCTTTTACCCACACACCCCCTCTGGACCCTCAGGAGCTGGATATCCTGAAGACCGTGAAGGAGATCACAGGCTTCCTGCTGATCCAGGCCTGGCCTGAGAACAGAACCGATCTGCACGCCTTTGAGAATCTGGAGATCATCCGGGGCAGAACAAAGCAGCACGGCCAGTTCTCCCTGGCCGTGGTGTCTCTGAACATCACCAGCCTGGGCCTGAGGTCCCTGAAGGAGATCTCTGACGGCGATGTGATCATCTCCGGCAACAAGAACCTGTGCTACGCCAACACAATCAATTGGAAGAAGCTGTTTGGCACCTCTGGCCAGAAGACAAAGATCATCTCTAACCGGGGCGAGAATAGCTGCAAGGCAACCGGACAGGTGTGCCACGCACTGTGCAGCCCAGAGGGATGTTGGGGCCCAGAGCCACGGGACTGCGTGAGCTGTAGAAACGTGTCCAGGGGCCGCGAGTGCGTGGATAAGTGTAATCTGCTGGAGGGCGAGCCAAGGGAGTTCGTGGAGAACTCCGAGTGCATCCAGTGTCACCCCGAGTGCCTGCCTCAGGCCATGAACATCACCTGTACAGGCCGCGGCCCCGACAATTGCATCCAGTGTGCCCACTATATCGATGGCCCTCACTGCGTGAAGACCTGTCCAGCCGGCGTGATGGGCGAGAACAATACACTGGTGTGGAAGTACGCAGACGCAGGACACGTGTGCCACCTGTGCCACCCCAATTGCACCTATGGCTGTACAGGACCAGGCCTGGAGGGATGCCCAACCAACGGCCCTAAGATCCCAAGCATCGCCACAGGCATGGTGGGGGCACTGCTGCTGCTGCTGGTGGTGGCTCTGGGGATTGGGCTGTTTATGAGAAGGTAA(SEQ ID NO:139)。
根据本发明的实施例，无功能EGFR受体缺少N-端配体结合区和细胞内受体酪氨酸激酶活性，但包括野生型EGFR受体的跨膜区和完整的与抗EGFR抗体结合的序列，所以无功能EGFR受体可作为淋巴细胞的自杀标记。本发明实施例的慢病毒导入受体淋巴细胞中，无功能EGFR受体的表达可在有效保证淋巴细胞的对肿瘤细胞的靶向杀伤作用的前提下，如果病人出现严重不良反应，淋巴细胞可被抗EGFR抗体清除，进而提高了本发明实施例的慢病毒、淋巴细胞等治疗肿瘤病人的安全性。
在本发明的第五方面，本发明提出了一种慢病毒。根据本发明的实施例，所述慢病毒携带含有SEQ ID NO：140～156所示的核苷酸序列。
ATGCAGATCCCACAGGCGCCCTGGCCAGTCGTCTGGGCGGTGCTACAACTGGGCTGGCGGCCAGGATGGTTCTTAGACTCCCCAGACAGGCCCTGGAACCCCCCCACCTTCTCCCCAGCCCTGCTCGTGGTGACCGAAGGGGACAACGCCACCTTCACCTGCAGCTTCTCCAACACATCGGAGAGCTTCGTGCTAAACTGGTACCGCATGAGCCCCAGCAACCAGACGGACAAGCTGGCCGCCTTCCCCGAGGACCGCAGCCAGCCCGGCCAGGACTGCCGCTTCCGTGTCACACAACTGCCCAACGGGCGTGACTTCCACATGAGCGTGGTCAGGGCCCGGCGCAATGACAGCGGCACCTACCTCTGTGGGGCCATCTCCCTGGCCCCCAAGGCGCAGATCAAAGAGAGCCTGCGGGCAGAGCTCAGGGTGACAGAGAGAAGGGCAGAAGTGCCCACAGCCCACCCCAGCCCCTCACCCAGGCCAGCCGGCCAGTTCCAAACCCTGGTGGTTGGTGTCGTGGGCGGCCTGCTGGGCAGCCTGGTGCTGCTAGTCTGGGTCCTGGCCGTCATCAGTAAGAGGAGCAGGCTCCTGCACAGTGACTACATGAACATGACTCCCCGCCGCCCCGGGCCCACCCGCAAGCATTACCAGCCCTATGCCCCACCACGCGACTTCGCAGCCTATCGCTCCAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGCTAAAAGCTTGGTACCCTCGAGGTTAACGAATTCGAATTTAAATCGGATCCGCGGCCGCGCCCCTCTCCCTCCCCCCCCCCTAACGTTACTGGCCGAAGCCGCTTGGAATAAGGCCGGTGTGCGTTTGTCTATATGTTATTTTCCACCATATTGCCGTCTTTTGGCAATGTGAGGGCCCGGAAACCTGGCCCTGTCTTCTTGACGAGCATTCCTAGGGGTCTTTCCCCTCTCGCCAAAGGAATGCAAGGTCTGTTGAATGTCGTGAAGGAAGCAGTTCCTCTGGAAGCTTCTTGAAGACAAACAACGTCTGTAGCGACCCTTTGCAGGCAGCGGAACCCCCCACCTGGCGACAGGTGCCTCTGCGGCCAAAAGCCACGTGTATAAGATACACCTGCAAAGGCGGCACAACCCCAGTGCCACGTTGTGAGTTGGATAGTTGTGGAAAGAGTCAAATGGCTCTCCTCAAGCGTATTCAACAAGGGGCTGAAGGATGCCCAGAAGGTACCCCATTGTATGGGATCTGATCTGGGGCCTCGGTGCACATGCTTTACATGTGTTTAGTCGAGGTTAAAAAAACGTCTAGGCCCCCCGAACCACGGGGACGTGGTTTTCCTTTGAAAAACACGATGATAATATGGCCACAACCATGGCGTCCGGAATGGCTCTGCCCGTCACCGCTCTGCTGCTGCCTCTGGCTCTGCTGCTGCACGCCGCACGCCCTGGGAGTCGCAAAGTCTGTAATGGGATCGGCATCGGCGAGTTCAAGGACAGCCTGTCCATCAACGCCACCAATATCAAGCACTTTAAGAATTGCACATCTATCAGCGGCGACCTGCACATCCTGCCAGTGGCCTTCCGGGGCGATTCTTTTACCCACACACCCCCTCTGGACCCTCAGGAGCTGGATATCCTGAAGACCGTGAAGGAGATCACAGGCTTCCTGCTGATCCAGGCCTGGCCTGAGAACAGAACCGATCTGCACGCCTTTGAGAATCTGGAGATCATCCGGGGCAGAACAAAGCAGCACGGCCAGTTCTCCCTGGCCGTGGTGTCTCTGAACATCACCAGCCTGGGCCTGAGGTCCCTGAAGGAGATCTCTGACGGCGATGTGATCATCTCCGGCAACAAGAACCTGTGCTACGCCAACACAATCAATTGGAAGAAGCTGTTTGGCACCTCTGGCCAGAAGACAAAGATCATCTCTAACCGGGGCGAGAATAGCTGCAAGGCAACCGGACAGGTGTGCCACGCACTGTGCAGCCCAGAGGGATGTTGGGGCCCAGAGCCACGGGACTGCGTGAGCTGTAGAAACGTGTCCAGGGGCCGCGAGTGCGTGGATAAGTGTAATCTGCTGGAGGGCGAGCCAAGGGAGTTCGTGGAGAACTCCGAGTGCATCCAGTGTCACCCCGAGTGCCTGCCTCAGGCCATGAACATCACCTGTACAGGCCGCGGCCCCGACAATTGCATCCAGTGTGCCCACTATATCGATGGCCCTCACTGCGTGAAGACCTGTCCAGCCGGCGTGATGGGCGAGAACAATACACTGGTGTGGAAGTACGCAGACGCAGGACACGTGTGCCACCTGTGCCACCCCAATTGCACCTATGGCTGTACAGGACCAGGCCTGGAGGGATGCCCAACCAACGGCCCTAAGATCCCAAGCATCGCCACAGGCATGGTGGGGGCACTGCTGCTGCTGCTGGTGGTGGCTCTGGGGATTGGGCTGTTTATGAGAAGGTAATCCTACTGCGAATTCTCGAGCGACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATGCTGGGGATGCGGTGGGCTCTATGGGTCGACCAAGGTCGGGCAGGAAGAGGGCCTATTTCCCATGATTCCTTCATATTTGCATATACGATACAAGGCTGTTAGAGAGATAATTAGAATTAATTTGACTGTAAACACAAAGATATTAGTACAAAATACGTGACGTAGAAAGTAATAATTTCTTGGGTAGTTTGCAGTTTTAAAATTATGTTTTAAAATGGACTATCATATGCTTACCGTAACTTGAAAGTATTTCGATTTCTTGGCTTTATATATCTTGTGGAAAGGACGAAACACCTCCCCAGGCGCAGATCAAAGAGAGTTCAAGAGACTCTCTTTGATCTGCGCCTTTTTT(SEQ ID NO：140)。
ATGCAGATCCCACAGGCGCCCTGGCCAGTCGTCTGGGCGGTGCTACAACTGGGCTGGCGGCCAGGATGGTTCTTAGACTCCCCAGACAGGCCCTGGAACCCCCCCACCTTCTCCCCAGCCCTGCTCGTGGTGACCGAAGGGGACAACGCCACCTTCACCTGCAGCTTCTCCAACACATCGGAGAGCTTCGTGCTAAACTGGTACCGCATGAGCCCCAGCAACCAGACGGACAAGCTGGCCGCCTTCCCCGAGGACCGCAGCCAGCCCGGCCAGGACTGCCGCTTCCGTGTCACACAACTGCCCAACGGGCGTGACTTCCACATGAGCGTGGTCAGGGCCCGGCGCAATGACAGCGGCACCTACCTCTGTGGGGCCATCTCCCTGGCCCCCAAGGCGCAGATCAAAGAGAGCCTGCGGGCAGAGCTCAGGGTGACAGAGAGAAGGGCAGAAGTGCCCACAGCCCACCCCAGCCCCTCACCCAGGCCAGCCGGCCAGTTCCAAACCCTGGTGGTTGGTGTCGTGGGCGGCCTGCTGGGCAGCCTGGTGCTGCTAGTCTGGGTCCTGGCCGTCATCAGTAAGAGGAGCAGGCTCCTGCACAGTGACTACATGAACATGACTCCCCGCCGCCCCGGGCCCACCCGCAAGCATTACCAGCCCTATGCCCCACCACGCGACTTCGCAGCCTATCGCTCCAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGCTAAAAGCTTGGTACCCTCGAGGTTAACGAATTCGAATTTAAATCGGATCCGCGGCCGCGCCCCTCTCCCTCCCCCCCCCCTAACGTTACTGGCCGAAGCCGCTTGGAATAAGGCCGGTGTGCGTTTGTCTATATGTTATTTTCCACCATATTGCCGTCTTTTGGCAATGTGAGGGCCCGGAAACCTGGCCCTGTCTTCTTGACGAGCATTCCTAGGGGTCTTTCCCCTCTCGCCAAAGGAATGCAAGGTCTGTTGAATGTCGTGAAGGAAGCAGTTCCTCTGGAAGCTTCTTGAAGACAAACAACGTCTGTAGCGACCCTTTGCAGGCAGCGGAACCCCCCACCTGGCGACAGGTGCCTCTGCGGCCAAAAGCCACGTGTATAAGATACACCTGCAAAGGCGGCACAACCCCAGTGCCACGTTGTGAGTTGGATAGTTGTGGAAAGAGTCAAATGGCTCTCCTCAAGCGTATTCAACAAGGGGCTGAAGGATGCCCAGAAGGTACCCCATTGTATGGGATCTGATCTGGGGCCTCGGTGCACATGCTTTACATGTGTTTAGTCGAGGTTAAAAAAACGTCTAGGCCCCCCGAACCACGGGGACGTGGTTTTCCTTTGAAAAACACGATGATAATATGGCCACAACCATGGCGTCCGGAATGGCTCTGCCCGTCACCGCTCTGCTGCTGCCTCTGGCTCTGCTGCTGCACGCCGCACGCCCTGGGAGTCGCAAAGTCTGTAATGGGATCGGCATCGGCGAGTTCAAGGACAGCCTGTCCATCAACGCCACCAATATCAAGCACTTTAAGAATTGCACATCTATCAGCGGCGACCTGCACATCCTGCCAGTGGCCTTCCGGGGCGATTCTTTTACCCACACACCCCCTCTGGACCCTCAGGAGCTGGATATCCTGAAGACCGTGAAGGAGATCACAGGCTTCCTGCTGATCCAGGCCTGGCCTGAGAACAGAACCGATCTGCACGCCTTTGAGAATCTGGAGATCATCCGGGGCAGAACAAAGCAGCACGGCCAGTTCTCCCTGGCCGTGGTGTCTCTGAACATCACCAGCCTGGGCCTGAGGTCCCTGAAGGAGATCTCTGACGGCGATGTGATCATCTCCGGCAACAAGAACCTGTGCTACGCCAACACAATCAATTGGAAGAAGCTGTTTGGCACCTCTGGCCAGAAGACAAAGATCATCTCTAACCGGGGCGAGAATAGCTGCAAGGCAACCGGACAGGTGTGCCACGCACTGTGCAGCCCAGAGGGATGTTGGGGCCCAGAGCCACGGGACTGCGTGAGCTGTAGAAACGTGTCCAGGGGCCGCGAGTGCGTGGATAAGTGTAATCTGCTGGAGGGCGAGCCAAGGGAGTTCGTGGAGAACTCCGAGTGCATCCAGTGTCACCCCGAGTGCCTGCCTCAGGCCATGAACATCACCTGTACAGGCCGCGGCCCCGACAATTGCATCCAGTGTGCCCACTATATCGATGGCCCTCACTGCGTGAAGACCTGTCCAGCCGGCGTGATGGGCGAGAACAATACACTGGTGTGGAAGTACGCAGACGCAGGACACGTGTGCCACCTGTGCCACCCCAATTGCACCTATGGCTGTACAGGACCAGGCCTGGAGGGATGCCCAACCAACGGCCCTAAGATCCCAAGCATCGCCACAGGCATGGTGGGGGCACTGCTGCTGCTGCTGGTGGTGGCTCTGGGGATTGGGCTGTTTATGAGAAGGTAATCCTACTGCGAATTCTCGAGCGACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATGCTGGGGATGCGGTGGGCTCTATGGGTCGACCAAGGTCGGGCAGGAAGAGGGCCTATTTCCCATGATTCCTTCATATTTGCATATACGATACAAGGCTGTTAGAGAGATAATTAGAATTAATTTGACTGTAAACACAAAGATATTAGTACAAAATACGTGACGTAGAAAGTAATAATTTCTTGGGTAGTTTGCAGTTTTAAAATTATGTTTTAAAATGGACTATCATATGCTTACCGTAACTTGAAAGTATTTCGATTTCTTGGCTTTATATATCTTGTGGAAAGGACTCCCCGCATCACTTGGGATTAATATTCAAGAGATATTAATCCCAAGTGATGCTTTTT(SEQ ID NO：141)。
ATGCAGATCCCACAGGCGCCCTGGCCAGTCGTCTGGGCGGTGCTACAACTGGGCTGGCGGCCAGGATGGTTCTTAGACTCCCCAGACAGGCCCTGGAACCCCCCCACCTTCTCCCCAGCCCTGCTCGTGGTGACCGAAGGGGACAACGCCACCTTCACCTGCAGCTTCTCCAACACATCGGAGAGCTTCGTGCTAAACTGGTACCGCATGAGCCCCAGCAACCAGACGGACAAGCTGGCCGCCTTCCCCGAGGACCGCAGCCAGCCCGGCCAGGACTGCCGCTTCCGTGTCACACAACTGCCCAACGGGCGTGACTTCCACATGAGCGTGGTCAGGGCCCGGCGCAATGACAGCGGCACCTACCTCTGTGGGGCCATCTCCCTGGCCCCCAAGGCGCAGATCAAAGAGAGCCTGCGGGCAGAGCTCAGGGTGACAGAGAGAAGGGCAGAAGTGCCCACAGCCCACCCCAGCCCCTCACCCAGGCCAGCCGGCCAGTTCCAAACCCTGGTGGTTGGTGTCGTGGGCGGCCTGCTGGGCAGCCTGGTGCTGCTAGTCTGGGTCCTGGCCGTCATCAGTAAGAGGAGCAGGCTCCTGCACAGTGACTACATGAACATGACTCCCCGCCGCCCCGGGCCCACCCGCAAGCATTACCAGCCCTATGCCCCACCACGCGACTTCGCAGCCTATCGCTCCAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGCTAAAAGCTTGGTACCCTCGAGGTTAACGAATTCGAATTTAAATCGGATCCGCGGCCGCGCCCCTCTCCCTCCCCCCCCCCTAACGTTACTGGCCGAAGCCGCTTGGAATAAGGCCGGTGTGCGTTTGTCTATATGTTATTTTCCACCATATTGCCGTCTTTTGGCAATGTGAGGGCCCGGAAACCTGGCCCTGTCTTCTTGACGAGCATTCCTAGGGGTCTTTCCCCTCTCGCCAAAGGAATGCAAGGTCTGTTGAATGTCGTGAAGGAAGCAGTTCCTCTGGAAGCTTCTTGAAGACAAACAACGTCTGTAGCGACCCTTTGCAGGCAGCGGAACCCCCCACCTGGCGACAGGTGCCTCTGCGGCCAAAAGCCACGTGTATAAGATACACCTGCAAAGGCGGCACAACCCCAGTGCCACGTTGTGAGTTGGATAGTTGTGGAAAGAGTCAAATGGCTCTCCTCAAGCGTATTCAACAAGGGGCTGAAGGATGCCCAGAAGGTACCCCATTGTATGGGATCTGATCTGGGGCCTCGGTGCACATGCTTTACATGTGTTTAGTCGAGGTTAAAAAAACGTCTAGGCCCCCCGAACCACGGGGACGTGGTTTTCCTTTGAAAAACACGATGATAATATGGCCACAACCATGGCGTCCGGAATGGCTCTGCCCGTCACCGCTCTGCTGCTGCCTCTGGCTCTGCTGCTGCACGCCGCACGCCCTGGGAGTCGCAAAGTCTGTAATGGGATCGGCATCGGCGAGTTCAAGGACAGCCTGTCCATCAACGCCACCAATATCAAGCACTTTAAGAATTGCACATCTATCAGCGGCGACCTGCACATCCTGCCAGTGGCCTTCCGGGGCGATTCTTTTACCCACACACCCCCTCTGGACCCTCAGGAGCTGGATATCCTGAAGACCGTGAAGGAGATCACAGGCTTCCTGCTGATCCAGGCCTGGCCTGAGAACAGAACCGATCTGCACGCCTTTGAGAATCTGGAGATCATCCGGGGCAGAACAAAGCAGCACGGCCAGTTCTCCCTGGCCGTGGTGTCTCTGAACATCACCAGCCTGGGCCTGAGGTCCCTGAAGGAGATCTCTGACGGCGATGTGATCATCTCCGGCAACAAGAACCTGTGCTACGCCAACACAATCAATTGGAAGAAGCTGTTTGGCACCTCTGGCCAGAAGACAAAGATCATCTCTAACCGGGGCGAGAATAGCTGCAAGGCAACCGGACAGGTGTGCCACGCACTGTGCAGCCCAGAGGGATGTTGGGGCCCAGAGCCACGGGACTGCGTGAGCTGTAGAAACGTGTCCAGGGGCCGCGAGTGCGTGGATAAGTGTAATCTGCTGGAGGGCGAGCCAAGGGAGTTCGTGGAGAACTCCGAGTGCATCCAGTGTCACCCCGAGTGCCTGCCTCAGGCCATGAACATCACCTGTACAGGCCGCGGCCCCGACAATTGCATCCAGTGTGCCCACTATATCGATGGCCCTCACTGCGTGAAGACCTGTCCAGCCGGCGTGATGGGCGAGAACAATACACTGGTGTGGAAGTACGCAGACGCAGGACACGTGTGCCACCTGTGCCACCCCAATTGCACCTATGGCTGTACAGGACCAGGCCTGGAGGGATGCCCAACCAACGGCCCTAAGATCCCAAGCATCGCCACAGGCATGGTGGGGGCACTGCTGCTGCTGCTGGTGGTGGCTCTGGGGATTGGGCTGTTTATGAGAAGGTAATCCTACTGCGAATTCTCGAGCGACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATGCTGGGGATGCGGTGGGCTCTATGGGTCGACCAAGGTCGGGCAGGAAGAGGGCCTATTTCCCATGATTCCTTCATATTTGCATATACGATACAAGGCTGTTAGAGAGATAATTAGAATTAATTTGACTGTAAACACAAAGATATTAGTACAAAATACGTGACGTAGAAAGTAATAATTTCTTGGGTAGTTTGCAGTTTTAAAATTATGTTTTAAAATGGACTATCATATGCTTACCGTAACTTGAAAGTATTTCGATTTCTTGGCTTTATATATCTTGTGGAAAGGACTCCCCAACACAGACGCCATGATTTGCTTCAAGAGAGCAAATCATGGCGTCTGTGTTTTTTT(SEQ ID NO：142)。
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ATGCAGATCCCACAGGCGCCCTGGCCAGTCGTCTGGGCGGTGCTACAACTGGGCTGGCGGCCAGGATGGTTCTTAGACTCCCCAGACAGGCCCTGGAACCCCCCCACCTTCTCCCCAGCCCTGCTCGTGGTGACCGAAGGGGACAACGCCACCTTCACCTGCAGCTTCTCCAACACATCGGAGAGCTTCGTGCTAAACTGGTACCGCATGAGCCCCAGCAACCAGACGGACAAGCTGGCCGCCTTCCCCGAGGACCGCAGCCAGCCCGGCCAGGACTGCCGCTTCCGTGTCACACAACTGCCCAACGGGCGTGACTTCCACATGAGCGTGGTCAGGGCCCGGCGCAATGACAGCGGCACCTACCTCTGTGGGGCCATCTCCCTGGCCCCCAAGGCGCAGATCAAAGAGAGCCTGCGGGCAGAGCTCAGGGTGACAGAGAGAAGGGCAGAAGTGCCCACAGCCCACCCCAGCCCCTCACCCAGGCCAGCCGGCCAGTTCCAAACCCTGGTGGTTGGTGTCGTGGGCGGCCTGCTGGGCAGCCTGGTGCTGCTAGTCTGGGTCCTGGCCGTCATCAGTAAGAGGAGCAGGCTCCTGCACAGTGACTACATGAACATGACTCCCCGCCGCCCCGGGCCCACCCGCAAGCATTACCAGCCCTATGCCCCACCACGCGACTTCGCAGCCTATCGCTCCAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGCTAAAAGCTTGGTACCCTCGAGGTTAACGAATTCTCCTACTGCGAATTCTCGAGCGACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATGCTGGGGATGCGGTGGGCTCTATGGGTCGACCAAGGTCGGGCAGGAAGAGGGCCTATTTCCCATGATTCCTTCATATTTGCATATACGATACAAGGCTGTTAGAGAGATAATTAGAATTAATTTGACTGTAAACACAAAGATATTAGTACAAAATACGTGACGTAGAAAGTAATAATTTCTTGGGTAGTTTGCAGTTTTAAAATTATGTTTTAAAATGGACTATCATATGCTTACCGTAACTTGAAAGTATTTCGATTTCTTGGCTTTATATATCTTGTGGAAAGGACTCCCCAACACGCACTTCCGCACATTCTTCAAGAGAGAATGTGCGGAAGTGCGTGTTTTTTT(SEQ ID NO：151)。
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ATGCAGATCCCACAGGCGCCCTGGCCAGTCGTCTGGGCGGTGCTACAACTGGGCTGGCGGCCAGGATGGTTCTTAGACTCCCCAGACAGGCCCTGGAACCCCCCCACCTTCTCCCCAGCCCTGCTCGTGGTGACCGAAGGGGACAACGCCACCTTCACCTGCAGCTTCTCCAACACATCGGAGAGCTTCGTGCTAAACTGGTACCGCATGAGCCCCAGCAACCAGACGGACAAGCTGGCCGCCTTCCCCGAGGACCGCAGCCAGCCCGGCCAGGACTGCCGCTTCCGTGTCACACAACTGCCCAACGGGCGTGACTTCCACATGAGCGTGGTCAGGGCCCGGCGCAATGACAGCGGCACCTACCTCTGTGGGGCCATCTCCCTGGCCCCCAAGGCGCAGATCAAAGAGAGCCTGCGGGCAGAGCTCAGGGTGACAGAGAGAAGGGCAGAAGTGCCCACAGCCCACCCAAGTCCCCTATTTCCCGGACCTTCTAAGCCCTTTTGGGTGCTGGTGGTGGTTGGTGGAGTCCTGGCTTGCTATAGCTTGCTAGTAACAGTGGCCTTTATTATTTTCTGGGTGAGGAGTAAGAGGAGCAGGCTCCTGCACAGTGACTACATGAACATGACTCCCCGCCGCCCCGGGCCCACCCGCAAGCATTACCAGCCCTATGCCCCACCACGCGACTTCGCAGCCTATCGCTCCAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGCTAAAAGCTTGGTACCCTCGAGGTTAACGAATTCGAATTTAAATCGGATCCGCGGCCGCGTCCTACTGCGAATTCTCGAGCGACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATGCTGGGGATGCGGTGGGCTCTATGGGTCGACCAAGGTCGGGCAGGAAGAGGGCCTATTTCCCATGATTCCTTCATATTTGCATATACGATACAAGGCTGTTAGAGAGATAATTAGAATTAATTTGACTGTAAACACAAAGATATTAGTACAAAATACGTGACGTAGAAAGTAATAATTTCTTGGGTAGTTTGCAGTTTTAAAATTATGTTTTAAAATGGACTATCATATGCTTACCGTAACTTGAAAGTATTTCGATTTCTTGGCTTTATATATCTTGTGGAAAGGACTCCCCGCATCACTTGGGATTAATATTCAAGAGATATTAATCCCAAGTGATGCTTTTT(SEQ ID NO：153)。
ATGCAGATCCCACAGGCGCCCTGGCCAGTCGTCTGGGCGGTGCTACAACTGGGCTGGCGGCCAGGATGGTTCTTAGACTCCCCAGACAGGCCCTGGAACCCCCCCACCTTCTCCCCAGCCCTGCTCGTGGTGACCGAAGGGGACAACGCCACCTTCACCTGCAGCTTCTCCAACACATCGGAGAGCTTCGTGCTAAACTGGTACCGCATGAGCCCCAGCAACCAGACGGACAAGCTGGCCGCCTTCCCCGAGGACCGCAGCCAGCCCGGCCAGGACTGCCGCTTCCGTGTCACACAACTGCCCAACGGGCGTGACTTCCACATGAGCGTGGTCAGGGCCCGGCGCAATGACAGCGGCACCTACCTCTGTGGGGCCATCTCCCTGGCCCCCAAGGCGCAGATCAAAGAGAGCCTGCGGGCAGAGCTCAGGGTGACAGAGAGAAGGGCAGAAGTGCCCACAGCCCACCCAAGTCCCCTATTTCCCGGACCTTCTAAGCCCTTTTGGGTGCTGGTGGTGGTTGGTGGAGTCCTGGCTTGCTATAGCTTGCTAGTAACAGTGGCCTTTATTATTTTCTGGGTGAGGAGTAAGAGGAGCAGGCTCCTGCACAGTGACTACATGAACATGACTCCCCGCCGCCCCGGGCCCACCCGCAAGCATTACCAGCCCTATGCCCCACCACGCGACTTCGCAGCCTATCGCTCCAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGCTAAAAGCTTGGTACCCTCGAGGTTAACGAATTCGAATTTAAATCGGATCCGCGGCCGCGTCCTACTGCGAATTCTCGAGCGACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATGCTGGGGATGCGGTGGGCTCTATGGGTCGACCAAGGTCGGGCAGGAAGAGGGCCTATTTCCCATGATTCCTTCATATTTGCATATACGATACAAGGCTGTTAGAGAGATAATTAGAATTAATTTGACTGTAAACACAAAGATATTAGTACAAAATACGTGACGTAGAAAGTAATAATTTCTTGGGTAGTTTGCAGTTTTAAAATTATGTTTTAAAATGGACTATCATATGCTTACCGTAACTTGAAAGTATTTCGATTTCTTGGCTTTATATATCTTGTGGAAAGGACTCCCCAACACAGACGCCATGATTTGCTTCAAGAGAGCAAATCATGGCGTCTGTGTTTTTTT(SEQ ID NO：154)。
ATGCAGATCCCACAGGCGCCCTGGCCAGTCGTCTGGGCGGTGCTACAACTGGGCTGGCGGCCAGGATGGTTCTTAGACTCCCCAGACAGGCCCTGGAACCCCCCCACCTTCTCCCCAGCCCTGCTCGTGGTGACCGAAGGGGACAACGCCACCTTCACCTGCAGCTTCTCCAACACATCGGAGAGCTTCGTGCTAAACTGGTACCGCATGAGCCCCAGCAACCAGACGGACAAGCTGGCCGCCTTCCCCGAGGACCGCAGCCAGCCCGGCCAGGACTGCCGCTTCCGTGTCACACAACTGCCCAACGGGCGTGACTTCCACATGAGCGTGGTCAGGGCCCGGCGCAATGACAGCGGCACCTACCTCTGTGGGGCCATCTCCCTGGCCCCCAAGGCGCAGATCAAAGAGAGCCTGCGGGCAGAGCTCAGGGTGACAGAGAGAAGGGCAGAAGTGCCCACAGCCCACCCAAGTCCCCTATTTCCCGGACCTTCTAAGCCCTTTTGGGTGCTGGTGGTGGTTGGTGGAGTCCTGGCTTGCTATAGCTTGCTAGTAACAGTGGCCTTTATTATTTTCTGGGTGAGGAGTAAGAGGAGCAGGCTCCTGCACAGTGACTACATGAACATGACTCCCCGCCGCCCCGGGCCCACCCGCAAGCATTACCAGCCCTATGCCCCACCACGCGACTTCGCAGCCTATCGCTCCAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGCTAAAAGCTTGGTACCCTCGAGGTTAACGAATTCGAATTTAAATCGGATCCGCGGCCGCGTCCTACTGCGAATTCTCGAGCGACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATGCTGGGGATGCGGTGGGCTCTATGGGTCGACCAAGGTCGGGCAGGAAGAGGGCCTATTTCCCATGATTCCTTCATATTTGCATATACGATACAAGGCTGTTAGAGAGATAATTAGAATTAATTTGACTGTAAACACAAAGATATTAGTACAAAATACGTGACGTAGAAAGTAATAATTTCTTGGGTAGTTTGCAGTTTTAAAATTATGTTTTAAAATGGACTATCATATGCTTACCGTAACTTGAAAGTATTTCGATTTCTTGGCTTTATATATCTTGTGGAAAGGACTCCCCAACACGCACTTCCGCACATTCTTCAAGAGAGAATGTGCGGAAGTGCGTGTTTTTTT(SEQ ID NO：155)。
利用根据本发明实施例的上述慢病毒，可将表达前面所述重组受体、沉默免疫检查点以及任选的表达无功能EGFR的核酸导入受体淋巴细胞，进而实现前面所述重组受体、任选的无功能EGFR在受体细胞膜上的高效表达，实现免疫抑制机制的阻遏，所获得的受体淋巴细胞的对肿瘤细胞，尤其是PD-L1或PD-L2阳性肿瘤细胞的特异性杀伤强大、有效、安全。
在本发明的第六方面，本发明提出了一种转基因淋巴细胞。根据本发明的实施例，所述转基因淋巴细胞的细胞免疫检查点被沉默，并且所述转基因淋巴细胞表达前面所述的重组受体，任选地，所述转基因淋巴细胞进一步表达无功能EGFR。本发明实施例的转基因淋巴细胞对肿瘤细胞，尤其是PD-L1或PD-L2阳性肿瘤细胞的特异性杀伤强大、有效、安全。
根据本发明的实施例，上述转基因淋巴细胞还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：
根据本发明的实施例，所述淋巴细胞细胞免疫检查点独立地选自CTLA4、PD1、TIM3、BTLA、LAG-3、IRAK-M、SOCS1、A20、CBL-B的至少之一，优选地，所述淋巴细胞细胞免疫检查点为CTLA4、PD1、SOCS1或CBL-B。上述免疫检查点分子在淋巴细胞中发挥着免疫抑制机制，上述免疫检查点分子的特异性沉默，可有效阻遏免疫抑制机制，进一步提高了本发明实施例的转基因淋巴细胞对肿瘤细胞的特异性杀伤效果。
根据本发明的实施例，所述淋巴细胞细胞免疫检查点被沉默是通过shRNA、反义核酸、核酶、显性负突变、CRISPR-Cas9，CRISPR-Cpf1和锌指核酸酶至少之一实现的。发明人通过实验发现，上述方式的任意一种或几种均能够沉默细胞免疫检查点，进而免疫抑制机制被显著阻遏。
根据本发明的实施例，所述淋巴细胞细胞免疫检查点被沉默是通过shRNA实现的。通过shRNA沉默淋巴细胞细胞免疫检查点是一种简便、有效方式。
根据本发明的实施例，所述淋巴细胞是抗原特异性T淋巴细胞，任选地，所述淋巴细胞是肿瘤浸润T淋巴细胞，任选地，所述淋巴细胞是外周血T淋巴细胞，任选地，所述淋巴细胞是自然杀伤T淋巴细胞，任选地，所述淋巴细胞是自然杀伤细胞。根据本发明实施例的抗原特异性T淋巴细胞、肿瘤浸润T淋巴细胞、自然杀伤T淋巴细胞或自然杀伤细胞，可实现对肿瘤细胞的特异性免疫杀伤，特异性强、杀伤力度大、安全性高。
在本发明的第七方面，本发明提出了一种构建体。根据本发明的实施例，所述构建体包括：第一核酸分子，所述第一核酸分子编码前面所述的重组受体；第二核酸分子，所述第二核酸分子沉默细胞免疫检查点；以及任选地，所述构建体进一步包括：第三核酸分子，所述第三核酸分子编码无功能EGFR，其中，所述细胞免疫检查点、所述无功能EGFR是如前面所定义的。利用根据本发明实施例的上述构建体，可将表达前面所述重组受体、沉默免疫检查点以及任选的表达无功能EGFR的核酸导入受体淋巴细胞，进而实现前面所述重组受体、任选的无功能EGFR在受体细胞膜上的高效表达，实现免疫抑制机制的阻遏，所获得的受体淋巴细胞的对肿瘤细胞，尤其是PD-L1或PD-L2阳性肿瘤细胞的特异性杀伤强大、有效、安全。
根据本发明的实施例，上述构建体还可以进一步包括如下附加技术特征至少之一：
根据本发明的实施例，所述第一核酸分子、所述第二核酸分子和任选的所述第三核酸分子被设置在前面所述的淋巴细胞中表达所述重组受体、沉默细胞免疫检查点和表达任选的无功能EGFR，并且所述重组受体与任选的所述无功能EGFR呈非融合形式。利用根据本发明实施例的上述构建体导入前面所述的淋巴细胞，所获得的淋巴细胞对肿瘤细胞的特异性杀伤更强大、更有效、更安全。
根据本发明的实施例，所述构建体进一步包括：第一启动子，所述第一启动子与所述第一核酸分子可操作地连接；第二启动子，所述第二启动子与所述第二核酸分子可操作地连接；以及任选的第三启动子，所述任选的第三启动子与所述第三核酸分子可操作地连接。上述第一、第二以及任选的第三启动子可分别独立地启动表达第一、第二以及任选的第三核酸分子，进而更加有利于相应核酸分子表达的调控。
根据本方明的实施例，所述第一启动子、所述第二启动子、所述第三启动子分别独立地选自U6，H1，CMV，EF-1，LTR或RSV启动子。发明人发现，U6，H1，CMV，EF-1，LTR或RSV启动子能够高效启动表达第一、第二以及任选的第三核酸分子，第一、第二以及任选的第三核酸分子的表达效率显著提高。
根据本发明的实施例，所述构建体包括第一核酸分子、第二核酸分子和第三核酸分子，并且所述构建体进一步包括：内部核糖体进入位点序列，所述内部核糖体进入位点序列设置在所述第一核酸分子与所述第三核酸分子之间，所述内部核糖体进入位点具有SEQID NO：156所示的核苷酸序列。
CCCCTCTCCCTCCCCCCCCCCTAACGTTACTGGCCGAAGCCGCTTGGAATAAGGCCGGTGTGCGTTTGTCTATATGTTATTTTCCACCATATTGCCGTCTTTTGGCAATGTGAGGGCCCGGAAACCTGGCCCTGTCTTCTTGACGAGCATTCCTAGGGGTCTTTCCCCTCTCGCCAAAGGAATGCAAGGTCTGTTGAATGTCGTGAAGGAAGCAGTTCCTCTGGAAGCTTCTTGAAGACAAACAACGTCTGTAGCGACCCTTTGCAGGCAGCGGAACCCCCCACCTGGCGACAGGTGCCTCTGCGGCCAAAAGCCACGTGTATAAGATACACCTGCAAAGGCGGCACAACCCCAGTGCCACGTTGTGAGTTGGATAGTTGTGGAAAGAGTCAAATGGCTCTCCTCAAGCGTATTCAACAAGGGGCTGAAGGATGCCCAGAAGGTACCCCATTGTATGGGATCTGATCTGGGGCCTCGGTGCACATGCTTTACATGTGTTTAGTCGAGGTTAAAAAAACGTCTAGGCCCCCCGAACCACGGGGACGTGGTTTTCCTTTGAAAAACACGATGATAATATGGCCACAACC(SEQ ID NO：156)。
内部核糖体进入位点序列的引入，使得第三核酸分子的起始表达不依赖5’帽子结构，并且第一和第三核酸分子成比例表达，进而更加有利于表达调控，所获得的转基因淋巴细胞的治疗安全性更高。
根据本发明的实施例，所述构建体包括第一核酸分子、第二核酸分子和第三核酸分子，并且所述构建体进一步包括:第四核酸分子，所述第四核酸分子设置在所述第一核酸分子与所述第三核酸分子之间，并且所述第四核酸分子编码连接肽，所述连接肽能够在所述淋巴细胞中被切割。第四连接肽的引入使得所表达的重组受体以及无功能EGFR呈非融合状态表达在淋巴细胞膜上。
根据本发明的实施例，所述连接肽具有SEQ ID NO：157～160所示的氨基酸序列。
E G R G S L L T C G D V E E N P G P(SEQ ID NO：157)。
A T N F S L L K Q A G D V E E N P G P(SEQ ID NO：158)。
Q C T N Y A L L K L A G D V E S N P G P(SEQ ID NO：159)。
V K Q T L N F D L L K L A G D V E S N P G P(SEQ ID NO：160)。
具有SEQ ID NO：157～160所示的氨基酸序列的连接肽，能够自身切割断裂，进而所获得的重组受体以及无功能EGFR呈非融合状态表达在淋巴细胞膜上的效率和成功率显著提高。
根据本发明的实施例，所述构建体的载体是非致病性病毒载体。本发明实施例中的构建体载体的致病位点经过修饰或突变，已丧失病毒的致病性，进而在根据本发明实施例的非致病性病毒载体介导下的治疗的安全性更高。
根据本发明的实施例，所述病毒载体包括选自反转录病毒载体、慢病毒载体或腺病毒相关病毒载体的至少之一。上述载体可实现所携带核酸在受体细胞的高效表达，治疗效率高。
在本发明的第八方面，本发明提出了一种制备前面所述的转基因淋巴细胞的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：将前面所述的构建体或者前面所述的慢病毒引入到淋巴细胞中或者T淋巴细胞。利用根据本发明实施例的上述方法，可简便、高效地获得前面所述的转基因淋巴细胞，如前所述，所获得的转基因淋巴细胞对肿瘤细胞，尤其是PD-L1或PD-L2阳性肿瘤细胞的特异性杀伤强大、有效、安全。
在本发明的第九方面，本发明提出了一种用于治疗癌症的治疗组合物。根据本发明的实施例，所述治疗组合物包括：前面所述的构建体、前面所述的慢病毒、前面所述的转基因淋巴细胞、前面所述的重组受体或者前面所述的核酸。利用根据本发明实施例的治疗组合物，能够实现对肿瘤细胞，尤其是PD-L1或PD-L2阳性肿瘤细胞的特异、强大、有效、安全地杀伤。
在本发明的第十方面，本发明提出了一种提高淋巴细胞免疫杀伤能力的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：使所述淋巴细胞的细胞免疫检查点被沉默，以及使所述淋巴细胞表前面所述的重组受体。利用根据本发明实施例上述方法，能够有效提高淋巴细胞对肿瘤细胞，尤其是PD-L1或PD-L2阳性肿瘤细胞的特异性免疫杀伤。
附图说明
图1是根据本发明实施例慢病毒载体的结构示意图；
图2是根据本发明实施例的共表达PD1-CD28-CD3zeta重组受体、无功能EGFR受体和shPD1的淋巴细胞被抗EGFR抗体介导ADCC杀伤清除的结果图；以及
图3是根据本发明实施例的共表达PD1-CD28-CD3zeta重组受体、无功能EGFR受体和shPD1的淋巴细胞杀伤PD-L1阳性肿瘤细胞的结果图。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例。下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
需要说明的是，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。进一步地，在本发明的描述中，除非另有说明，“多个”的含义是两个或两个以上。
重组受体
一方面，本发明提出了一种重组受体。根据本发明的实施例，该重组受体包括：细胞免疫检查点分子片段；免疫刺激分子片段；以及T细胞受体zeta链。根据本发明的实施例，使淋巴细胞表达本发明实施例的重组受体，可有效增强淋巴细胞对肿瘤细胞的特异性杀伤效果。
根据本发明的具体实施例，所述细胞免疫检查点分子为PD1。PD1可与肿瘤细胞上特异性表达的PD-L1或PD-L2相结合，进而，淋巴细胞表达本发明实施例的重组受体，淋巴细胞在PD1的引导下，特异性靶向肿瘤细胞，其对肿瘤细胞的靶标性进一步增强。
根据本发明的再一具体实施例，细胞免疫检查点分子片段包括PD1的胞外区以及任选的跨膜区，免疫刺激分子片段包括CD28的胞内区以及任选的跨膜区。例如，根据本发明的实施例，重组受体可以包括：(a)PD1的胞外区和跨膜区；以及(b)CD28的胞内区，或者包括：(i)PD1的胞外区；以及(ii)CD28的胞内区和跨膜区。PD1的胞外区具有与肿瘤细胞上特异性表达的PD-L1或PD-L2相结合的功能区，CD28的胞内区具有激活免疫刺激信号通路的功能区，同时不论是PD1跨膜区还是CD28的跨膜区，均可使重组受体跨膜表达，进而淋巴细胞细胞表达本发明实施例的重组受体，其对肿瘤细胞的靶向性杀伤效果进一步提高。
另外，根据本发明的再一实施例，T细胞受体zeta链为CD3zeta链。CD3zeta链关联T细胞受体(TCR)信号通路，CD3zeta链触发后，Zeta链可以同一胞浆内称为zeta链相关蛋白70(ZAP-70)相结合，ZAP-70为一种胞浆内具有酪氨酸激酶(PTK)活性的信号蛋白，含有两个SH-2(srchomology region 2，SH-2)结构域，ZAP-70分子中SH-2与zeta链中磷酸化的酪氨酸残基相结合，ZAP-70激活可进一步激活Ras蛋白，进而最终活化淋巴细胞。CD3zeta链可特异性激活下游T细胞受体信号通路，进而淋巴细胞表达本发明实施例的重组蛋白，在免疫刺激分子活化功能片段以及CD3zeta链活化作用的协同作用下，其对肿瘤细胞的杀伤效果进一步提高。
最后，根据本发明的实施例，上述重组受体中相应分子片段的连接顺序可为：细胞免疫检查点分子片段的C端与免疫刺激分子片段的N端相连，免疫刺激分子片段的C端与T细胞受体zeta链的N端相连。发明人发现，本发明实施例的重组受体的相关片段在上述连接顺序下，有利于相关片段在细胞中的定位，进而更有利于发挥相应的功能-靶向、跨膜、激活免疫刺激信号通路以及激活T细胞受体信号通路，其对肿瘤细胞的靶向性杀伤能力进一步提高。
具体地，根据本发明的实施例，重组受体具有SEQ ID NO：1或2所示的氨基酸序列。其中，SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列是包括PD1的胞外区和跨膜区、CD28的胞内区以及CD3zeta的重组受体(PD1-ECD-TM-CD28-ICD-CD3zeta)的氨基酸序列。SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列是包括PD1的胞外区、CD28的跨膜区和胞内区以及CD3zeta的重组受体(PD1-ECD-TM-CD28-ICD-CD3zeta)的氨基酸序列。根据本发明的实施例，重组受体具有上述氨基酸序列，使其表达在淋巴细胞中，可有效增强淋巴细胞对肿瘤细胞的特异性杀伤效果。
核酸
另一方面，本发明提出了一种核酸。根据本发明的实施例，该核酸编码前面所述的重组受体，任选地，所述核酸具有SEQ ID NO：3或4所示的核苷酸序列。其中，SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列编码具有SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的重组受体，SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列编码具有SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的重组受体。将本发明实施例的核酸导入受体淋巴细胞中，核酸所编码的重组受体在淋巴细胞中跨膜表达，该淋巴细胞对肿瘤细胞的特异性杀伤效果显著提高。
慢病毒
另一方面，本发明提出了一种慢病毒。根据本发明的实施例，所述慢病毒携带下列核酸分子：(a)编码前面所述重组受体的核酸分子，所述核酸分子具有SEQ ID NO：3或4所示的核苷酸序列；(b)沉默细胞免疫检查点的核酸分子，所述沉默细胞免疫检查点的核酸分子的核苷酸序列为选自SEQ ID NO：5～137的至少之一，其中，SEQ ID NO：5～16是人类程序性死亡受体1(PD1)siRNA核苷酸序列，SEQ ID NO：17～32是人类细胞毒T淋巴细胞相关抗原4(CTLA4)siRNA序列，SEQ ID NO：33～48是人类T细胞免疫球蛋白粘蛋白分子3(TIM3)siRNA序列，SEQ ID NO：49～59是人类T淋巴细胞衰减因子(BTLA)siRNA序列，SEQ ID NO：60～70是人类淋巴细胞活化基因3蛋白(LAG1)siRNA序列，SEQ ID NO：71～87是人类IRAK-M(白细胞介素-1受体相关激酶3)siRNA核苷酸序列，SEQ ID NO：88～98是人类SOCS1(细胞因子信号转导抑制因子1)siRNA序列，SEQ ID NO：99～118是人类A20(肿瘤坏死因子-α诱导蛋白A20)siRNA序列，SEQ ID NO：119～137是人类CBL-B(E3泛素蛋白连接酶CBL-B)siRNA序列。将本发明实施例的慢病毒导入受体淋巴细胞中，前面所述的重组受体在淋巴细胞中跨膜表达，同时淋巴细胞膜表面的免疫检查点分子被特异性沉默，进而在重组受体发挥加强淋巴细胞对肿瘤细胞的特异性杀伤功能的同时，免疫抑制机制也被阻遏。将本发明实施例的慢病毒导入受体淋巴细胞中，淋巴细胞对肿瘤细胞的特异性杀伤强大而有效。
另外，根据本发明的实施例，上述慢病毒还可以进一步携带编码无功能EGFR的核酸分子。根据本发明的具体实施例，无功能EGFR受体缺少N-端配体结合区和细胞内受体酪氨酸激酶活性，但包括野生型EGFR受体的跨膜区和完整的与抗EGFR抗体结合的序列。发明人发现，上述无功能EGFR受体可作为淋巴细胞的自杀标记，无功能EGFR受体的表达可在有效保证淋巴细胞的对肿瘤细胞的靶向杀伤作用的前提下，如果病人出现严重不良反应，淋巴细胞可被抗EGFR抗体清除，进而提高了本发明实施例的慢病毒、淋巴细胞等治疗肿瘤病人的安全性。
具体地，所述慢病毒携带含有SEQ ID NO：140～155所示的核苷酸序列。其中，SEQID NO：140是共表达前面所述重组受体(包括PD1的胞外区和跨膜区、CD28的胞内区以及CD3Zeta链)、无功能EGFR和沉默细胞免疫检查点PD1的核酸分子【PD1(ECD-TM)-CD28(IC)-CD3zeta-IRES-tEGFR-pA-U6-shPD1)】；SEQ ID NO：141是共表达前面所述重组受体(包括PD1的胞外区和跨膜区、CD28的胞内区以及CD3Zeta链)、无功能EGFR和沉默细胞免疫检查点CTLA4的核酸分子【PD1(ECD-TM)-CD28(IC)-CD3zeta-IRES-tEGFR-pA-U6-shCTLA4)】；SEQID NO：142是共表达前面所述重组受体(包括PD1的胞外区和跨膜区、CD28的胞内区以及CD3Zeta链)、无功能EGFR和沉默细胞免疫检查点CBL-B的核酸分子【PD1(ECD-TM)-CD28(IC)-CD3zeta-IRES-tEGFR-pA-U6-shCBL-B)】；SEQ ID NO：143是共表达前面所述重组受体(包括PD1的胞外区和跨膜区、CD28的胞内区以及CD3Zeta链)、无功能EGFR和沉默细胞免疫检查点SOCS1的核酸分子【PD1(ECD-TM)-CD28(IC)-CD3zeta-IRES-tEGFR-pA-U6-shSOCS1)】；SEQ ID NO：144是共表达前面所述重组受体(包括PD1的胞外区、CD28的跨膜区和胞内区以及CD3Zeta链)、无功能EGFR和沉默细胞免疫检查点PD1的核酸分子【PD1(ECD)-CD28(TM-IC)-CD3zeta-IRES-tEGFR-pA-U6-sh PD1)】；SEQ ID NO：145是共表达前面所述重组受体(包括PD1的胞外区、CD28的跨膜区和胞内区以及CD3Zeta链)、无功能EGFR和沉默细胞免疫检查点CTLA4的核酸分子【PD1(ECD)-CD28(TM-IC)-CD3zeta-IRES-tEGFR-pA-U6-shCTLA4)】；SEQ ID NO：146是共表达前面所述重组受体(包括PD1的胞外区、CD28的跨膜区和胞内区以及CD3Zeta链)、无功能EGFR和沉默细胞免疫检查点CBL-B的核酸分子【PD1(ECD)-CD28(TM-IC)-CD3zeta-IRES-tEGFR-pA-U6-sh CBL-B)】；SEQ ID NO：147是共表达前面所述重组受体(包括PD1的胞外区、CD28的跨膜区和胞内区以及CD3Zeta链)、无功能EGFR和沉默细胞免疫检查点SOCS1的核酸分子【PD1(ECD)-CD28(TM-IC)-CD3zeta-IRES-tEGFR-pA-U6-shSOCS1)】；SEQ ID NO：148是共表达前面所述重组受体(包括PD1的胞外区和跨膜区、CD28的胞内区以及CD3Zeta链)和沉默细胞免疫检查点PD1的核酸分子【PD1(ECD-TM)-CD28(IC)-CD3zeta-pA-U6-shPD1)】；SEQ ID NO：149是共表达前面所述重组受体(包括PD1的胞外区和跨膜区、CD28的胞内区以及CD3Zeta链)和沉默细胞免疫检查点CTLA4的核酸分子【PD1(ECD-TM)-CD28(IC)-CD3zeta-pA-U6-sh CTLA4)】；SEQ ID NO：150是共表达前面所述重组受体(包括PD1的胞外区和跨膜区、CD28的胞内区以及CD3Zeta链)和沉默细胞免疫检查点CBL-B的核酸分子【PD1(ECD-TM)-CD28(IC)-CD3zeta-pA-U6-sh CBL-B)】；SEQ ID NO：151是共表达前面所述重组受体(包括PD1的胞外区和跨膜区、CD28的胞内区以及CD3Zeta链)和沉默细胞免疫检查点SOCS1的核酸分子【PD1(ECD-TM)-CD28(IC)-CD3zeta-pA-U6-shSOCS1)】；SEQ ID NO：152是共表达前面所述重组受体(包括PD1的胞外区、CD28的跨膜区和胞内区以及CD3Zeta链)和沉默细胞免疫检查点PD1的核酸分子【PD1(ECD)-CD28(TM-IC)-CD3zeta-pA-U6-sh PD1)】；SEQ ID NO：153是共表达前面所述重组受体(包括PD1的胞外区、CD28的跨膜区和胞内区以及CD3Zeta链)和沉默细胞免疫检查点CTLA4的核酸分子【PD1(ECD)-CD28(TM-IC)-CD3zeta-pA-U6-sh CTLA4)】；SEQ ID NO：154是共表达前面所述重组受体(包括PD1的胞外区、CD28的跨膜区和胞内区以及CD3Zeta链)和沉默细胞免疫检查点CBL-B的核酸分子【PD1(ECD)-CD28(TM-IC)-CD3zeta-pA-U6-sh CBL-B)】；SEQ ID NO：155是共表达前面所述重组受体(包括PD1的胞外区、CD28的跨膜区和胞内区以及CD3Zeta链)和沉默细胞免疫检查点SOCS1的核酸分子【PD1(ECD)-CD28(TM-IC)-CD3zeta-pA-U6-shSOCS1)】。利用根据本发明实施例的上述慢病毒，可将表达前面所述重组受体、沉默免疫检查点以及任选的表达无功能EGFR的核酸导入受体淋巴细胞，进而实现前面所述重组受体、任选的无功能EGFR在受体细胞膜上的高效表达，实现免疫抑制机制的阻遏，所获得的受体淋巴细胞的对肿瘤细胞的特异性杀伤强大、有效、安全。
转基因淋巴细胞
另一方面，本发明提出了一种转基因淋巴细胞。根据本发明的实施例，所述转基因淋巴细胞的细胞免疫检查点被沉默，并且所述转基因淋巴细胞表达前面所述的重组受体，任选地，所述转基因淋巴细胞进一步表达无功能EGFR。本发明实施例的转基因淋巴细胞对肿瘤细胞的特异性杀伤强大、有效、安全。
需要说明的是，待沉默的淋巴细胞免疫检查点的选择不受特别限制，根据本发明的实施例，所述淋巴细胞细胞免疫检查点独立地选自CTLA4、PD1、TIM3、BTLA、LAG-3、IRAK-M、SOCS1、A20、CBL-B的至少之一。上述免疫检查点分子在淋巴细胞中发挥着免疫抑制机制，上述免疫检查点分子的特异性沉默，可有效阻遏免疫抑制机制，进一步提高了本发明实施例的转基因淋巴细胞对肿瘤细胞的特异性杀伤效果。
另外，沉默淋巴细胞免疫检查点的方式也不受特别限制，根据本发明的实施例，所述淋巴细胞细胞免疫检查点被沉默可通过shRNA、反义核酸、核酶、显性负突变、CRISPR-Cas9，CRISPR-Cpf1和锌指核酸酶至少之一实现的。
小发夹RNA或短发夹RNA(shRNA)是siRNA(小干扰RNA)的导入形式，siRNA是一种小RNA分子(由21～25个核苷酸组成)，由Dicer(RNAaseⅢ家族中对双链RNA具有特异性剪切作用的酶)加工而成；siRNA在RNA沉默通路中起中心作用，对特定信使RNA(mRNA)进行降解，为转录水平后调控。
反义核酸包括反义RNA和反义DNA，反义RNA是指能和mRNA完全互补的一段小分子RNA或寡聚核苷酸片段，反义DNA是指能与基因DNA双链中的有义链互补结合的短小DNA分子，反义RNA和反义DNA主要是通过mRNA的翻译和基因DNA的转录而发挥作用的；反义核酸一方面通过与靶mRNA结合形成空间位阻效应，阻止核糖体与mRNA结合，另一方面其与mRNA结合后激活内源性RNA酶或核酶，进而降解mRNA；反义DNA与基因DNA双螺旋的调控区特异结合形成DNA三聚体，或与DNA编码区结合，终止正在转录的mRNA链的延长；反义核酸还可抑制转录后mRNA的加工修饰，如5'端加帽、3'端加尾、中间剪接和内部碱基甲基化等，并阻止成熟mRNA由细胞核向细胞浆内运输，因此，反义RNA是一种有效的沉默目的基因的技术。
核酶是具有催化功能的RNA分子，是生物催化剂，可降解特异的mRNA序列，核酶通过催化转磷酸酯和磷酸二酯键水解反应参与RNA自身剪切、加工过程，与一般的反义RNA相比，核酶具有较稳定的空间结构，不易受到RNA酶的攻击，更重要的是，核酶在切断mRNA后，又可从杂交链上解脱下来，重新结合和切割其它的mRNA分子。
显性负性突变是指某些信号转导蛋白突变后不仅自身无功能，还能抑制或阻断同一细胞内的野生型信号转导蛋白的作用，其主要通过和野生型蛋白形成二聚物的方式实现，这种突变毒性作用大，能显著抑制或阻断细胞内目标信号转导蛋白的作用。
锌指核酸酶由一个DNA识别域和一个非特异性核酸内切酶构成，DNA识别域是由一系列Cys2-His2锌指蛋白串联组成(一般3～4个)，每个锌指蛋白识别并结合一个特异的三联体碱基，锌指蛋白形成α-β-β二级结构，其中α螺旋的16氨基酸残基决定锌指的DNA结合特异性，骨架结构保守，对决定DNA结合特异性的氨基酸引入序列的改变可以获得新的DNA结合特异性，从而可以针对不同的目的基因设计不同的氨基酸引入序列，实现不同目的基因的特异性沉默。
CRISPR(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats规律成簇间隔短回文重复)，是一种基因编辑器，是细菌用以保护自身对抗病毒的一个系统。它可以用来删除、添加、激活或抑制其他生物体的目标基因，这些目标基因包括人细胞内的目标基因。
CRISPR簇是一个广泛存在于细菌和古生菌基因组中的特殊DNA重复序列家族，其序列由一个前导区(Leader)、多个短而高度保守的重复序列(Repeat)和多个间隔区(Spacer)组成。前导区一般位于CRISPR簇上游，是富含AT长度为300～500bp的区域，被认为可能是CRISPR簇的启动子序列。重复序列区长度为21～48bp，含有回文序列，可形成发卡结构。重复序列之间被长度为26～72bp的间隔区隔开。Spacer区域由俘获的外源DNA组成，当含有同样序列的外源DNA入侵时，可被细菌机体识别，并进行剪切使之表达沉默，达到保护自身安全的目的。通过对CRISPR簇的侧翼序列分析发现，在其附近存在一个多态性家族基因。该家族编码的蛋白质均含有可与核酸发生作用的功能域(具有核酸酶、解旋酶、整合酶和聚合酶等活性)，并且与CRISPR区域共同发挥作用，因此被命名为CRISPR关联基因(CRISPR associated)，缩写为Cas。目前发现的Cas包括Cas1～Cas10等多种类型。Cas基因与CRISPR共同进化，共同构成一个高度保守的系统。当细菌抵御噬菌体等外源DNA入侵时，在前导区的调控下，CRISPR被转录为长的RNA前体(Pre RISPR RNA，pre-crRNA)，然后加工成一系列短的含有保守重复序列和间隔区的成熟crRNA，最终识别并结合到与其互补的外源DNA序列上发挥剪切作用。pre-crRNA的加工由Cas家族中的Cas9参与。Cas9含有在氨基末端的RuvC和蛋白质中部的HNH2个独特的活性位点，在crRNA成熟和双链DNA剪切中发挥作用。pre-crRNA转录的同时，与其重复序列互补的反式激活crRNA(Trans-activatingcrRNA，tracrRNA)也转录出来，并且激发Cas9和双链RNA特异性RNase III核酸酶对pre-crRNA进行加工。加工成熟后，crRNA、tracrRNA和Cas9组成复合体，识别并结合于crRNA互补的序列，然后解开DNA双链，形成R-loop，使crRNA与互补链杂交，另一条链保持游离的单链状态，然后由Cas9中的HNH活性位点剪切crRNA的互补DNA链，RuvC活性位点剪切非互补链，最终引入DNA双链断裂(DSB)。通过人工设计RNA，可以改造形成具有引导作用的sgRNA(short guide RNA)，足以引导Cas9对DNA的定点目标基因切割。
综上所述，shRNA、反义核酸、核酶、显性负突变、CRISPR锌指核酸酶为特异性沉默目标基因的有效手段，沉默基因的手段不受特别限制，本领域技术人员可根据具体的实验目的和条件选择，如本发明实施例所采用的shRNA、反义核酸、核酶、显性负突变，CRISPR或锌指核酸酶的至少之一，实现目的基因的特异性沉默。根据本发明的实施例，淋巴细胞细胞免疫检查点被沉默优选采用shRNA实现。ShRNA所携带的siRNA分子通常是一个长度在10和30之间的碱基对的双重区域。本发明实施例的PD1siRNA被设计为同源于PD1的编码区域，通过mRNA的降解来抑制基因表达。siRNA关联于被称为诱导RNA沉默复合物(RISC)的多重蛋白复合物，在此期间正义链被酶裂解。被激活的RISC中基于序列同源性，指引RISC到对应的mRNA；相同的核酸酶切割靶向PD1，产生特定基因PD1沉默，抑制特定基因PD1的表达。siRNA以shRNA的形式导入细胞(shRNA包含大约18-23的核苷酸siRNA序列，后跟一个9-15长度的核苷酸环和一个siRNA序列的反向补充)，shRNA的设计较好的避免了在3’UTR细胞基因中的匹配点；确保了适当的链选择。一个单一siRNA分子可被重复应用于多靶向mRNA分子的分裂。RNAi(RNA干扰)可通过引入合成siRNA的方式被诱导。根据本发明的实施例，本发明实施例的shRNA不断产自细胞内，因此其效果更加持久，从而延长shRNA周期，本发明实施例采用的shRNA具有高效、特异性的沉默细胞免疫检查点的作用，细胞免疫检查点的成功沉默，使得转基因淋巴细胞具有显著的抵抗肿瘤介导的免疫抑制的特性，在肿瘤病人体内的增殖和生存能力得到进一步提高，对肿瘤的定向杀伤作用效果更加显著。
具体地，根据本发明的实施例，所述淋巴细胞是抗原特异性T淋巴细胞或肿瘤浸润T淋巴细胞或自然杀伤T淋巴细胞或自然杀伤细胞。根据本发明实施例的抗原特异性T淋巴细胞、肿瘤浸润T淋巴细胞、外周血T淋巴细胞、自然杀伤T淋巴细胞或自然杀伤细胞，可实现对肿瘤细胞的特异性免疫杀伤，特异性强、杀伤力度大、安全性高。
构建体
另一方面，本发明提出了一种构建体。根据本发明的实施例，所述构建体包括：第一核酸分子，所述第一核酸分子编码前面所述的重组受体；第二核酸分子，所述第二核酸分子沉默细胞免疫检查点；以及任选地，所述构建体进一步包括：第三核酸分子，所述第三核酸分子编码无功能EGFR，其中，所述细胞免疫检查点、所述无功能EGFR是如前面所定义的。利用根据本发明实施例的上述构建体，可将表达前面所述重组受体、沉默免疫检查点以及任选的表达无功能EGFR的核酸导入受体淋巴细胞，进而实现前面所述重组受体、任选的无功能EGFR在受体细胞膜上的高效表达，实现免疫抑制机制的阻遏，所获得的受体淋巴细胞的对肿瘤细胞的特异性杀伤强大、有效、安全。
具体地，所述第一核酸分子、所述第二核酸分子和任选的所述第三核酸分子被设置在前面所述的淋巴细胞中表达所述重组受体、沉默细胞免疫检查点和表达任选的无功能EGFR，并且所述重组受体与任选的所述无功能EGFR呈非融合形式。利用根据本发明实施例的上述构建体导入前面所述的淋巴细胞，所获得的淋巴细胞对肿瘤细胞的特异性杀伤更强大、更有效、更安全。
根据本发明的实施例，发明人是通过如下方式的至少之一实现上述重组受体、细胞免疫检查点shRNA以及任选的无功能EGFR受体分别独立地表达的，其中，需要说明的是，此处的表达既指受体的表达又指RNA转录。
启动子：根据本发明具体的实施例，所述构建体可进一步包括：第一启动子，所述第一启动子与所述第一核酸分子可操作地连接；第二启动子，所述第二启动子与所述第二核酸分子可操作地连接；以及任选的第三启动子，所述任选的第三启动子与所述第三核酸分子可操作地连接。上述第一、第二以及任选的第三启动子可分别独立地启动表达第一、第二以及任选的第三核酸分子，进而更加有利于相应核酸分子表达的调控。
其中，根据本方明的实施例，所述第一启动子、所述第二启动子、所述第三启动子分别独立地选自U6，H1，CMV，EF-1，LTR或RSV启动子。发明人发现，U6，H1，CMV，EF-1，LTR或RSV启动子能够高效启动表达第一、第二以及任选的第三核酸分子，第一、第二以及任选的第三核酸分子的表达效率显著提高。
内部核糖体进入位点序列(IRES)：当所述构建体包括第一核酸分子、第二核酸分子和第三核酸分子，所述构建体进一步包括：内部核糖体进入位点序列，所述内部核糖体进入位点序列设置在所述第一核酸分子与所述第三核酸分子之间。内部核糖体进入位点序列的引入，使得第三核酸分子的起始表达不依赖5’帽子结构，并且第一和第三核酸分子成比例表达，进而更加有利于表达调控，所获得的转基因淋巴细胞的治疗安全性更高。
连接肽：当所述构建体包括第一核酸分子、第二核酸分子和第三核酸分子，所述构建体进一步包括:第四核酸分子，所述第四核酸分子设置在所述第一核酸分子与所述第三核酸分子之间，并且所述第四核酸分子编码连接肽，所述连接肽能够在所述淋巴细胞中被切割。第四连接肽的引入使得所表达的重组受体以及无功能EGFR呈非融合状态表达在淋巴细胞膜上。
根据本发明的实施例，上述连接肽具有SEQ ID NO：157～160所示的氨基酸序列，这些连接肽为2A自切割连接肽。2A连接肽在口足病病毒(FMDV)中被发现，通常为具有19～22个氨基酸的寡肽，定位在小核糖核酸病毒家族的膜蛋白之间。FMDV病毒的2A自切割肽能够自切割，进而产生成熟病毒蛋白，这就是所熟知的翻译效应“停止前进”或“停止搬运”。切割位点位于C-末端的最后一个甘氨酸和2B下游蛋白的第一个脯氨酸之间(-LLNFDLLKLAGDVESNPG↓P-)。目前，已经成功在其他病毒mRNA分子发现了2A类似序列，包括猪捷申病毒-1 2A(P2A，序列如SEQ ID NO：158所示)，thosea asigna病毒2A(T2A，序列如SEQID NO：157所示)，马鼻炎A病毒2A(E2A，序列如SEQ ID NO：159)，质型多角体病毒(BmCPV2A)和软化病病毒(BmIFV 2A)。发明人通过筛选实验发现，具有自身切割能力的SEQ ID NO：157～160所示氨基酸序列的连接肽设置在第一核酸分子与第三核酸分子之间，其自身切割的功能在受体细胞中能够得到很好地发挥，获得的重组受体以及无功能EGFR呈非融合状态表达在淋巴细胞膜上的效率和成功率进一步显著提高。
通过上述内部核糖体进入位点序列、或第一、第二、第三启动子或第三核酸分子的引入，使得细胞免疫检查点被高效沉默和无功能EGFR受体高效地表达以及上述重组受体高效地表达在本发明实施例的转基因淋巴细胞膜上，并且无功能EGFR受体和重组受体呈非融合状态表达在淋巴细胞膜上，从而高效抑制了免疫检查点的免疫负调控和保证了重组受体增强免疫的生物学作用，或有效实现了转基因淋巴细胞的及时清除，从而使得淋巴细胞在肿瘤环境中的成活率大大提高，淋巴细胞的靶向杀伤作用更加显著，免疫杀伤的安全性进一步提高。
另外，根据本发明的具体实施例，所述构建体的载体是非致病性病毒载体，所述病毒载体包括选自反转录病毒载体、慢病毒载体或腺病毒相关病毒载体的至少之一。本发明实施例中的构建体载体的致病位点经过修饰或突变，已丧失病毒的致病性，进而在根据本发明实施例的非致病性病毒载体介导下的治疗的安全性更高。本发明实施例的病毒的载体在病毒包装和感染过程中，病毒感染范围广泛，既可感染终末分化细胞，又可感染处于分裂期的细胞，既可整合到宿主染色体，又可游离在宿主染色体之外，进而可实现广谱而高效的感染效率。
根据本发明的具体实施例，以构建一个慢病毒载体为例，发明人为了构建一个慢病毒载体，在某些病毒序列的位置，将目的核酸插入到病毒基因组中，从而产生复制缺陷的病毒。为了产生病毒体，发明人进而构建包装细胞系(包含gag，pol和env基因，但不包括LTR和包装成分)。发明人将含有目的基因的重组质粒，连同慢病毒LTR和包装序列，一起引入包装细胞系中。包装序列允许重组质粒RNA转录产物被包装到病毒颗粒中，然后被分泌到培养基中。进而发明人收集包含重组慢病毒的基质，有选择性地浓缩，并用于基因转移。慢载体可以感染多种细胞类型，包括可分裂细胞和不可分裂细胞。
另外，根据本发明的实施例，本发明实施例的慢病毒是复合慢病毒，除了常见的慢病毒基因gag，pol和env，还包含有调控和结构功能的其他基因。慢病毒载体是本领域技术人员所熟知的，慢病毒包括：人类免疫缺陷病毒HIV–1，HIV–2和猿猴免疫缺陷病毒SIV。慢病毒载体通过多重衰减艾滋病毒致病基因产生，例如全部删除基因env，vif，vpr，vpu和nef，使慢病毒载体形成生物安全型载体。重组慢病毒载体能够感染非分裂细胞，同时可用于体内和体外基因转移和核酸序列表达。例如：在合适的宿主细胞中，和带有包装功能(gag，pol，env，rev和tat)的两个或更多的载体一起，能够感染非分裂细胞。重组病毒的靶向性，是通过抗体或特定配体(靶向特定细胞类型受体)与膜蛋白的结合来实现的。同时，重组病毒的靶向性通过插入一个有效序列(包括调控区域)到病毒载体中，连同另一个编码了特定靶细胞上的受体的配体的基因，使载体具有了特定的靶向。各种有用的慢病毒载体，以及各种方法和操作等产生的载体，用于改变细胞的表达。根据本发明的实施例，本发明实施例的慢病毒载体可有效运送和共表达shRNA(siRNA的转运形式)，该小shRNA可以有效抑制PD1或CTLA4或CBL-B的表达。
根据本发明的实施例，本发明实施例的腺关联病毒载体(AAV)可使用一种或多种为人熟知的血清类型腺关联病毒载体的DNA构建。本领域技术人员构建一个合适的腺关联病毒载体，以此携带和共表达小发夹RNA，该小发夹RNA可以抑制PD1等基因的表达。
另外，根据本发明的实施例，本发明实施例的也包含微基因。微基因意味着用组合(选定的核苷酸序列和可操作的必要的相关连接序列)来指导转化、转录和/或基因产物在体内或体外的宿主细胞中的表达。应用“可操作的连接”序列包含连续目的基因的表达控制序列，和作用于反式或远距离控制目的基因的表达控制序列。
另外，本发明实施例的载体还包括常规控制元素，在和质粒载体一起的细胞转染或/和病毒载体一起的细胞感染中，这些元素允许转录、转化和/或小发夹RNA的表达。大量的表达控制序列(包括天然的，可诱导和/或特定组织的启动子)可能被使用。根据本发明的实施例，表达shRNA的启动子为RNA聚合酶启动子。同时，根据本发明的实施例，启动子为选自U6，H1，pol I，pol II and pol III的RAN聚合酶启动子。根据本发明的实施例，启动子为组织特异型启动子。根据本发明的实施例，启动子为诱导型启动子。根据本发明的实施例，启动子为选自基于所选载体的启动子。根据本发明的实施例，当选择慢病毒载体时，启动子为U6，H1，CMV IE基因，EF-1α，泛素C，或磷酸甘油激酶(PGK)启动子。其他常规表达控制序列包括可选标记或报告基因，包括编码遗传霉素，潮霉素，氨苄青霉素或嘌呤霉素耐药性等的核苷酸序列。载体的其他组件包括复制起点。
构建载体的技术为本领域技术人员所熟知的，这些技术包括常规克隆技术，例如在本发明实施例中所使用的shRNA、聚合酶链反应和任何适当的提供所需的核苷酸序列的方法。
根据本发明的实施例，发明人构建了共表达小发夹RNA(shRNA)(用来抑制免疫检查点)和任选的无功能EGFR受体以及重组受体的病毒载体。本发明实施例的运送沉默PD1siRNA的小发夹RNA和表达任选的无功能EGFR受体的核酸分子以及表达重组受体的病毒载体或质粒是复合的，此病毒载体或质粒可结合聚合物或其他材料来增加其稳定性，或协助其靶向运动。
制备转基因淋巴细胞的方法
再一方面，本发明提出了一种制备前面所述的转基因淋巴细胞的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：将前面所述的构建体或者前面所述的慢病毒引入到淋巴细胞中或者T淋巴细胞。利用根据本发明实施例的上述方法，可简便、高效地获得前面所述的转基因淋巴细胞，如前所述，所获得的转基因淋巴细胞对肿瘤细胞的特异性杀伤强大、有效、安全。
治疗癌症的治疗组合物
再一方面，本发明提出了一种用于治疗癌症的治疗组合物。根据本发明的实施例，所述治疗组合物包括：前面所述的构建体、前面所述的慢病毒、前面所述的转基因淋巴细胞、前面所述的重组受体或者前面所述的核酸。利用根据本发明实施例的治疗组合物，能够实现对肿瘤细胞的特异、强大、有效、安全地杀伤。
根据本发明的实施例，提供给患者的本发明实施例的治疗组合物，较好的应用于生物兼容溶液或可接受的药学运载载体。作为准备的各种治疗组合物被悬浮或溶解在医药上或生理上可接受的载体，如生理盐水；等渗的盐溶液或其他精于此道的人的比较明显的配方中。适当的载体在很大程度上取决于给药途径。其他有水和无水的等渗无菌注射液和有水和无水的无菌悬浮液，是医药上可接受的载体。
根据本发明的实施例，足够数量的病毒载体被转导入靶向T细胞中，并提供足够强度的转基因，沉默PD1等免疫检查点和表达任选的无功能EGFR受体以及表达特有的重组受体。治疗试剂的剂量主要取决于治疗状况，年龄，体重，病人的健康程度，从而可能造成病人的变异性。
沉默PD1等免疫检查点和表达任选的无功能EGFR受体以及表达特有的上述重组受体这些方法是联合治疗的一部分。这些病毒载体和用于过继免疫治疗的抗肿瘤T细胞，可以被单独或结合其他治疗癌症的方法一起执行。在合适的条件下，一个治疗方法的包括使用一个或多个药物疗法。
根据本发明的实施例，所治疗癌症的类型不受特别限制。利用根据本发明实施例的治疗组合物，对PD-L1或PD-L2阳性肿瘤细胞的特异性杀伤效果显著。
提高淋巴细胞免疫杀伤能力的方法
在本发明最后一方面，本发明提出了一种提高淋巴细胞免疫杀伤能力的方法。根据本发明的实施例，该方法包括：使所述淋巴细胞的细胞免疫检查点被沉默，以及使所述淋巴细胞表前面所述的重组受体。利用根据本发明实施例的上述方法，能够有效提高淋巴细胞对肿瘤细胞的特异性免疫杀伤。
需要说明的是，本发明中所涉及的“重组受体”为重组蛋白或融合蛋白，该重组受体表达在受体细胞(如淋巴细胞)的膜上，发挥受体蛋白的功能，即能与细胞外专一信号分子结合进而激活细胞内一系列生物化学反应，使细胞对外界刺激产生相应的效应。
下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。
本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件(例如参考J.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社)或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
在以下实施例中所用到的细胞系和基本实验技术如下所述：
慢病毒的产生和人T淋巴细胞的转导
目的是产生复制缺陷的慢病毒载体，并将慢病毒载体离心收集用于人T淋巴细胞的转导。
下面简要介绍慢病毒载体的产生、收集的实验过程：将293T细胞铺在底面积为150-平方厘米的细胞培养皿中，并根据说明书，使用Express-In(购自Open Biosystems/Thermo Scientific，Waltham，MA)对293T细胞进行病毒转导。每盘细胞加入15μg的慢病毒转基因质粒、5μg的pVSV-G(VSV糖蛋白表达质粒)、10μg的pCMVR8.74质粒(Gag/Pol/Tat/Rev表达质粒)和174μl的Express-In(浓度为1μg/μl)。分别于24小时和48小时收集上清，并使用超速离心机在28，000rpm(离心机转子为Beckman SW 32Ti，购自Beckman Coulter，Brea，CA)的条件下离心2小时。最后用0.75ml的RPMI-1640培养基对病毒质粒沉淀进行重悬。
从志愿者供体上分离人原代T淋巴细胞。人T淋巴细胞培养在RPMI-1640培养基中并使用抗CD3和CD28的单克隆抗体包被的珠(购自Invitrogen，Carlsbad，CA)进行刺激激活。人T淋巴细胞激活后的18～24小时，采用自旋-接种的方法对T淋巴细胞进行转导，转导过程如下所述：在24-孔板中，每孔铺有0.5×106T淋巴细胞，向每孔细胞中加入0.75ml的上述重悬的病毒上清和Polybrene(浓度为8μg/ml)。细胞和病毒质粒的混合液在台式离心机(购自Sorvall ST 40；Thermo Scientific)中离心，离心条件是室温，2500rpm，时间为90分钟。人重组白细胞介素-2(IL-2；购自Novartis，Basel，Switzerland)每隔2～3天加入T淋巴细胞培养液中，IL-2的终浓度为100-IU/ml，在T淋巴细胞培养过程中，保持细胞的密度为0.5×106～1×106/ml。一旦被转导的T淋巴细胞出现休眠，例如细胞生长速度变慢和细胞变小，其中，细胞生长速度和大小是通过Coulter Counter(购自Beckman Coulter)评估的，或被转导的T淋巴细胞在某个计划的时间点上，T淋巴细胞即可用来做功能分析。
本申请的实施例中所用的流式细胞仪为BD FACSCanto II(购自BDBiosciences)，并且流式细胞分析数据使用FlowJo version 7.2.5软件(购自Tree Star，Ashland，OR)进行分析。
抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用(ADCC)
在以下实施例中，采用4小时-51Cr-释放法评估抗-EGFR抗体诱导表达无功能EGFR受体的淋巴细胞的细胞依赖性裂解的能力。被转导了慢病毒载体的人类T淋巴细胞被用作靶细胞。100μCi Na251CrO4(购自GE Healthcare Life Sciences，Marlborough，MA)标定2～5x 106靶细胞，标定条件是37℃下震荡孵育1小时。细胞采用PBS润洗三次，并且用培养基重悬(细胞密度是1x 105/ml)。继而，被标定的细胞铺在96-孔板中(每孔铺有5×103个细胞，加有50μl培养基)，并加入50μl的抗-EGFR抗体(购自Erbitux，Genentech)(终浓度为20μg/ml)，在常温条件下预培养30分钟.继而将含有抗体的培养基换成普通培养基，由此来检测51Cr的自发释放。加入终浓度为1％的Triton X-100以保证51Cr的最大释放量。在以下具体实施中，人PBMC(效应细胞)加入孔板中(每孔5×105个细胞)并将细胞在37℃培养过夜。第二天，收集细胞上清，并利用γ计数器计算cpm以此来确定51Cr的释放。细胞毒性比例用以下公式计算：％特异性裂解＝(实验释放cpm数据-自发释放cpm数据)/(最大释放cpm数据-自发释放cpm数据)*100，其中，最大释放cpm数据通过靶细胞中加入Triton X-100实现的，自发释放cpm数据是在没有抗EGFR抗体和效应细胞的条件下测量的。
铬释放实验
实施例中应用4–小时51铬释放法分析评估重组受体T细胞的细胞毒活性。具体步骤如下：目标测试细胞用51Cr在37摄氏度下标记1小时。标记后，用含有10％胎牛血清(FCS)的RPMI培养基润洗细胞。润洗后，将细胞重悬在相同的培养基中，重悬细胞的浓度是1×105/ml。转导后T细胞以不同的效靶细胞比值(E：T)加入目标测试细胞悬浮液中，并将细胞种在96-孔中，每孔体积是200微升。将细胞在37度培养箱中培养4小时。4小时后，从每孔中取出30微升的上清放于计数器的96-微孔板进行计数分析。分析仪器是顶级计数NXT微闪烁计数器(购自Packard Bioscience)。所有计数孔中效应细胞的数目是基于T细胞总数来计算的。被标记的目标测试细胞是PD-L1阳性肿瘤细胞。
实施例1构建共表达无功能EGFR受体、沉默PD1的shRNA(shPD1，iPD1)和PD1-CD28-CD3zeta重组受体的载体
本实施例中，发明人将编码有人PD1胞外片段序列、CD28穿膜及胞内段和T细胞受体组合的ζ-链序列克隆到含有EF-1启动子的慢病毒载体(lentiviral vector)上，克隆过程中，选择的限制性酶切是XbaI和NotI双酶切，以及NotI和XhoI双酶切，通过酶切、连接、筛选和目的质粒的扩增，生成表达重组受体的慢病毒质粒(LV-PD1-CD28-CD3ζ(LV-PD1-CD28z)。包含IRES和表达无功能EGFR受体的序列被克隆进LV-PD1-CD28-CD3ζ载体质粒，构建成LV-PD1-CD28-CD3ζ-tEGFR(M)(LV-PD1-CD28z/M)。包含U6和沉默免疫检查点的shRNA的序列，如shPD1的序列被克隆进LV-PD1-CD28-CD3ζ-tEGFR，构成LV-PD1-CD28-CD3ζ-tEGFR(M)-U6-shPD1(LV-PD1-CD28z/M/iPD1)。图1是慢病毒载体的示意图(tEGFR表示无功能EGFR(M))，包含编码PD1-CD28-CD3ζ重组受体的序列、IRES、编码无功能EGFR受体序列、U6及沉默PD1、CTLA4、Cbl-B或SOCS1的shRNA，。编码PD1-CD28-CD3ζ重组受体的序列在启动子EF-1的启动调控下，沉默免疫检查点的shRNA的序列，如沉默PD1的shRNA序列在启动子U6的启动调控下，表达无功能EGFR受体的序列作为一个单独的mRNA转录单元从IRES序列后开始翻译。
另外，将编码有人PD1胞外片段和跨膜段序列、CD28胞内段和T细胞受体组合的ζ-链序列克隆到含有EF-1启动子的慢病毒载体的过程如上所述。
实施例2抗EGFR抗体可有效杀伤清除共表达无功能EGFR受体、重组受体和沉默PD1的shRNA(shPD1，iPD1)的T淋巴细胞
在本实施例中，外周血淋巴细胞取自不记名供血者。外周血淋巴细胞通过梯度离心进行分离，梯度离心机为Ficoll-Hypaque。T淋巴细胞与T细胞激活因子磁珠CD3/CD28(购自Invitrogen，Carlsbad，CA)在5％CO2、37摄氏度下孵育培养72小时，培养基是加有2mmol/L谷氨酰胺，10％高温灭活的胎牛血清(FCS)(购自Sigma-Aldrich Co.)和100U/ml的青霉素/链霉素双抗的RPMI培养基1640(购自Invitrogen Gibco Cat.no.12633-012)。激活培养72小时后，用洗液润洗细胞，将磁珠洗去。将T细胞种在铺有重组纤连蛋白片段(FN ch-296；Retronectin)细胞培养皿上，并用慢病毒转导，转导慢病毒分别为LV-PD1-CD28z/M/iPD1，LV-PD1-CD28z，或空载(LV-GFP)转导过程如前所述。转导后表达无功能EGFR受体的T细胞用抗EGFR抗体染色后，然后流式细胞细胞(FACS)分离，分离后T细胞培养在RPMI-1640培养基中并用重组人类IL-2因子(100ng/ml；购自R&D Systems)进行诱导扩增7-10天，然后作为实验的靶细胞。发明人用ADCC检测法测量抗EGFR抗体介异的对转导了不同慢病毒的T细胞的杀伤作用，测量方法采用标准4–小时51铬释放法，4–小时51铬释放法如实施例1所述。结果如图2所示。如图2所示，抗EGFR抗体可有效介异杀伤共表达PD1-CD28-CD3ζ重组受体、shPD1和无功能EGFR受体的T淋巴细胞(LV-PD1-CD28z/M/iPD1转导T淋巴细胞)，但抗EGFR抗体不能介异杀伤只表达PD1-CD28-CD3ζ重组受体的T淋巴细胞(LV-PD1-CD28z转导T淋巴细胞)和只表达GFP的T淋巴细胞(LV-GFP转导T淋巴细胞)，统计数据代表三个孔的平均值±SEM。
实施例3共表达无功能EGFR受体、shPD1和PD1-CD28-CD3ζ重组受体的T淋巴细胞肿瘤细胞溶解能力
在本实施例中，外周血淋巴细胞通过梯度离心进行分离，梯度离心机为Ficoll-Hypaque。T淋巴细胞与T细胞激活因子磁珠CD3/CD28(购自Invitrogen，Carlsbad，CA)在5％CO2、37摄氏度下孵育培养72小时，培养基是加有2mmol/L谷氨酰胺，10％高温灭活的胎牛血清(FCS)(购自Sigma-Aldrich Co.)和100U/ml的青霉素/链霉素双抗的RPMI培养基1640(购自Invitrogen Gibco Cat.no.12633-012)。激活培养72小时后，用洗液润洗细胞，将磁珠洗去。将T细胞种在铺有重组纤连蛋白片段(FN ch-296；Retronectin)细胞培养皿上，并用慢病毒转导，转导慢病毒分别为LV-PD1-CD28z/M/iPD1，LV-PD1-CD28z/M，LV-M，或空载(LV-GFP)，转导过程如前所述。转导后的T细胞培养在RPMI-1640培养基中并用重组人类IL-2因子(100ng/ml；购自R&D Systems)进行诱导扩增7-10天，然后进行功能测试实验。发明人测量转导了不同慢病毒的T细胞对PD-L1阳性的脑胶质瘤细胞的杀伤作用，效靶细胞比例是10：1或25：1或50:1，测量方法采用标准4–小时51铬释放法，其中，4–小时51铬释放法如前所述。
测试结果如图3所示，图3结果显示：共表达PD1-CD28-CD3ζ受体、无功能EGFR受体和shPD1的慢病毒转导的T淋巴细胞(LV-PD1-CD28z/M/iPD1转导的T淋巴细胞)及共表达PD1-CD28-CD3ζ受体和无功能EGFR受体的T淋巴细胞(LV-PD1-CD28z/M转导的T淋巴细胞)都有杀伤PD-L1+的脑瘤细胞能力。但是，共表达PD1-CD28-CD3ζ受体、无功能EGFR受体和shPD1的慢病毒转导的T淋巴细胞(LV-PD1-CD28z/M/iPD1转导的T淋巴细胞)比共表达PD1-CD28-CD3ζ受体和无功能EGFR受体的T淋巴细胞(LV-PD1-CD28z/M转导的T淋巴细胞)具有更强杀伤PD-L1+的脑瘤细胞的能力。仅表达无功能EGFR受体的慢病毒转导的T淋巴细胞(LV-M转导的淋巴细胞)或空载慢病毒转导的T淋巴细胞(对照LV-GFP转导的T淋巴细胞)对PD-L1+脑瘤细胞无明显杀伤作用。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

Claims (27)

1.一种重组受体，其特征在于，包括：
细胞免疫检查点分子片段；
免疫刺激分子片段；以及
T细胞受体zeta链。
2.根据权利要求1所述的重组受体，其特征在于，所述细胞免疫检查点分子为PD1。
3.根据权利要求2所述的重组受体，其特征在于，所述细胞免疫检查点分子片段包括PD1的胞外区以及任选的跨膜区，所述免疫刺激分子片段包括CD28的胞内区以及任选的跨膜区。
4.根据权利要求3所述的重组受体，其特征在于，包括：
(a)所述PD1的胞外区和跨膜区；以及
(b)所述CD28的胞内区，
或者包括：
(i)所述PD1的胞外区；以及
(ii)所述CD28的胞内区和跨膜区。
5.根据权利要求1所述的重组受体，其特征在于，所述T细胞受体zeta链为CD3zeta链。
6.根据权利要求1所述的重组受体，其特征在于，所述细胞免疫检查点分子片段的C端与所述免疫刺激分子片段的N端相连，所述免疫刺激分子片段的C端与所述T细胞受体zeta链的N端相连。
7.一种重组受体，其特征在于，所述重组受体具有SEQ ID NO：1或2所示的氨基酸序列。
8.一种核酸，其特征在于，所述核酸编码权利要求1～7任一项所述的重组受体，
任选地，所述核酸具有SEQ ID NO：3或4所示的核苷酸序列。
9.一种慢病毒，其特征在于，所述慢病毒携带下列核酸分子：
(a)编码权利要求1～7任一项所述重组受体的核酸分子，所述重组受体具有SEQ IDNO：1或2所示的氨基酸序列，所述编码重组受体的核酸分子具有SEQ ID NO：3或4所示的核苷酸序列；
(b)沉默细胞免疫检查点的核酸分子，所述沉默细胞免疫检查点的核酸分子的核苷酸序列为选自SEQ ID NO：5～137的至少之一；
任选地，进一步携带编码无功能EGFR的核酸分子，所述无功能EGFR具有SEQ ID NO：138所示的氨基酸序列，所述编码无功能EGFR的核酸分子具有SEQ ID NO：139所示的核苷酸序列。
10.一种慢病毒，其特征在于，所述慢病毒携带含有SEQ ID NO：140～155所示的核苷酸序列。
11.一种转基因淋巴细胞，其特征在于，所述转基因淋巴细胞的细胞免疫检查点被沉默，并且所述转基因淋巴细胞表达权利要求1～7任一项所述的重组受体，
任选地，所述转基因淋巴细胞进一步表达无功能EGFR。
12.根据权利要求11所述的转基因淋巴细胞，其特征在于，所述淋巴细胞细胞免疫检查点独立地选自CTLA4、PD1、TIM3、BTLA、LAG-3、IRAK-M、SOCS1、A20、CBL-B的至少之一；
优选地，所述淋巴细胞细胞免疫检查点为CTLA4、PD1、SOCS1或CBL-B。
13.根据权利要求12所述的转基因淋巴细胞，其特征在于，所述淋巴细胞细胞免疫检查点被沉默是通过shRNA、反义核酸、核酶、显性负突变、CRISPR-Cas9，CRISPR-Cpf1，和锌指核酸酶至少之一实现的。
14.根据权利要求13所述的转基因淋巴细胞，其特征在于，所述淋巴细胞细胞免疫检查点被沉默是通过shRNA实现的。
15.根据权利要求11所述的转基因淋巴细胞，其特征在于，所述淋巴细胞是抗原特异性T淋巴细胞，
任选地，所述淋巴细胞是肿瘤浸润T淋巴细胞，
任选地，所述淋巴细胞是外周血T淋巴细胞，
任选地，所述淋巴细胞是自然杀伤T淋巴细胞，
任选地，所述淋巴细胞是自然杀伤细胞。
16.一种构建体，其特征在于，所述构建体包括：
第一核酸分子，所述第一核酸分子编码权利要求1～7任一项所述的重组受体；
第二核酸分子，所述第二核酸分子沉默细胞免疫检查点；以及
任选地，所述构建体进一步包括：第三核酸分子，所述第三核酸分子编码无功能EGFR，
其中，所述细胞免疫检查点、所述无功能EGFR是如权利要求9、12任一项中所定义的。
17.根据权利要求16所述的构建体，其特征在于，所述第一核酸分子、所述第二核酸分子和任选的所述第三核酸分子被设置在权利要求11～15任一项所述的淋巴细胞中表达所述重组受体、沉默细胞免疫检查点和表达任选的无功能EGFR，并且所述重组受体与任选的所述无功能EGFR呈非融合形式。
18.根据权利要求16所述的构建体，其特征在于，进一步包括：
第一启动子，所述第一启动子与所述第一核酸分子可操作地连接；
第二启动子，所述第二启动子与所述第二核酸分子可操作地连接；以及
任选的第三启动子，所述任选的第三启动子与所述第三核酸分子可操作地连接。
19.根据权利要求18所述的构建体，其特征在于，所述第一启动子、所述第二启动子、所述第三启动子分别独立地选自U6，H1，CMV，EF-1，LTR或RSV启动子。
20.根据权利要求16所述的构建体，其特征在于，所述构建体包括第一核酸分子、第二核酸分子和第三核酸分子，并且所述构建体进一步包括：
内部核糖体进入位点序列，所述内部核糖体进入位点序列设置在所述第一核酸分子与所述第三核酸分子之间，所述内部核糖体进入位点具有SEQ ID NO：156所示的核苷酸序列。
21.根据权利要求16所述的构建体，其特征在于，所述构建体包括第一核酸分子、第二核酸分子和第三核酸分子，并且所述构建体进一步包括:
第四核酸分子，所述第四核酸分子设置在所述第一核酸分子与所述第三核酸分子之间，并且所述第四核酸分子编码连接肽，所述连接肽能够在所述淋巴细胞中被切割。
22.根据权利要求21所述的构建体，其特征在于，所述连接肽具有SEQ ID NO：157～160所示的氨基酸序列。
23.根据权利要求16所述的构建体，其特征在于，所述构建体的载体是非致病性病毒载体。
24.根据权利要求23所述的构建体，其特征在于，所述病毒载体包括选自反转录病毒载体、慢病毒载体或腺病毒相关病毒载体的至少之一。
25.一种制备权利要求11～15任一项所述的转基因淋巴细胞的方法，其特征在于，包括：
将权利要求16～24任一项所述的构建体或者权利要求9～10任一项所述的慢病毒引入到淋巴细胞中或者T淋巴细胞。
26.一种用于治疗癌症的治疗组合物，其特征在于，包括：
权利要求16～24任一项所述的构建体、权利要求9～10任一项所述的慢病毒、权利要求11～15任一项所述的转基因淋巴细胞、权利要求1～7任一项所述的重组受体或者权利要求8所述的核酸。
27.一种提高淋巴细胞免疫杀伤能力的方法，其特征在于，包括：
使所述淋巴细胞的细胞免疫检查点被沉默，以及
使所述淋巴细胞表达权利要求1～7任一项所述的重组受体。
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