CN107034193A - 治疗b细胞白血病及b细胞淋巴瘤的治疗组合物 - Google Patents
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Abstract
本发明提出了一种转基因淋巴细胞、一种构建体和一种治疗癌症的治疗组合物,本发明所提出的转基因淋巴细胞的细胞表面免疫检查点被沉默以及表达嵌合抗原受体。本发明所提出的转基因淋巴细胞的细胞因子分泌增多,对CD19+肿瘤细胞的靶向杀伤作用强,尤其对B细胞淋巴瘤及B细胞白血病的CD19+肿瘤细胞定向杀伤作用显著提高。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药领域,具体地,本发明涉及一种T淋巴细胞、一种慢病毒、一种转基因淋巴细胞、一种构建体、一种用于治疗癌症的治疗组合物和一种提高淋巴细胞活性的方法。
背景技术
肿瘤可以避免免疫监视,肿瘤细胞通过诱导免疫抑制性受体的表达,而关闭其受到免疫反应。在免疫调节机制方面,激活的细胞毒性T淋巴细胞(CTLs)表达负调控的监管机制,即在细胞表面表达免疫检查点分子,其中,一种主要的免疫检查点分子——程序性细胞死亡受体1(PD1)表达在活化CTLs上,其与肿瘤细胞上表达的程序性死亡配体1(PD-L1B7-H1)相互作用,可以抑制抗肿瘤T细胞反应。许多肿瘤,包括淋巴瘤、肺癌、卵巢癌、黑色素瘤、胰腺肿瘤,表达PD-L1。PD-L1与其配体PD1的结合,会导致T淋巴细胞增生性反应的下调,细胞因子的分泌减少,和T细胞的无能或凋亡。细胞毒性T淋巴细胞抗原4(CTLA4)是另一个T细胞的关键负面调节因子,其可抑制T细胞活化,抑制机制是通过与表达在抗原递呈细胞上的配体B7.1、B7.2(CD80和CD86)在相互作用实现。
T细胞攻击并摧毁肿瘤的潜力一直是公认的。过继T细胞疗法是将来自体内的T细胞在体外活化、扩张,随后回输入体内进行自身免疫治疗的一种疗法。
然而,过继T细胞疗法仍有待进一步开发。
发明内容
本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。
本发明是基于发明人的下列发现而完成的:
CD19靶向性的嵌合抗原受体T细胞可有效地杀伤CD19+的恶性B细胞。但许多CD19+恶性B细胞淋巴瘤患者,仍然对于CD19靶向性的嵌合抗原受体T细胞疗法没有反应。本发明针对上述问题,提出了一种携带沉默细胞表面免疫检查点的核酸分子和编码CD19靶向性的嵌合抗原受体的核酸分子的构建体和以此构建体导入后形成的转基因淋巴细胞,本发明提出的构建体和转基因淋巴细胞用于过继T细胞的免疫治疗,可以大大提高T淋巴细胞的细胞因子产生以及对肿瘤细胞的杀伤能力,尤其对CD19+恶性B细胞淋巴瘤或白血病的CD19+肿瘤细胞的杀伤效果显著增强。
在本发明的第一方面,本发明提出了一种T淋巴细胞。根据本发明的实施例,所述T淋巴细胞的细胞表面免疫检查点被沉默;以及表达嵌合抗原受体,其中,所述嵌合抗原受体包括:胞外区,所述胞外区包括单链抗体的重链可变区和轻链可变区,所述单链抗体特异性识别抗原CD19;跨膜区,所述跨膜区与所述胞外区相连,并且嵌入到所述T淋巴细胞的细胞膜中;胞内区,所述胞内区与所述跨膜区相连,并且所述胞内区包括CD28的胞内段以及CD3ζ链。根据本发明的实施例,本发明提出的T淋巴细胞的细胞因子产生以及对肿瘤细胞杀伤能力显著增强,尤其对CD19+恶性B细胞淋巴瘤或白血病的CD19+肿瘤细胞的杀伤效果大大提高。
在本发明的第二方面,本发明提出了一种慢病毒。根据本发明的实施例,所述慢病毒携带下列核酸分子:编码嵌合抗原受体的核酸分子,所述嵌合抗原受体具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列,所述编码嵌合抗原受体的核酸分子具有SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列;以及沉默细胞表面免疫检查点的核酸分子,所述沉默细胞表面免疫检查点的核酸分子的核苷酸序列为选自SEQ ID NO:3~68的至少之一。
M L L L V T S L L L C E L P H P A F L L I P D I Q M T Q T T S S L S A S L G D R V T I SC R A S Q D I S K Y L N W Y Q Q K P D G T V K L L I Y H T S R L H S G V P S R F S G S GS G T D Y S L T I S N L E Q E D I A T Y F C Q Q G N T L P Y T F G G G T K L E I T G S T SG S G K P G S G E G S T K G E V K L Q E S G P G L V A P S Q S L S V T C T V S G V S L PD Y G V S W I R Q P P R K G L E W L G V I W G S E T T Y Y N S A L K S R L T I I K D N SK S Q V F L K M N S L Q T D D T A I Y Y C A K H Y Y Y G G S Y A M D Y W G Q G T S V TV S S A A A F V P V F L P A K P T T T P A P R P P T P A P T I A S Q P L S L R P E A C R P A AG G A V H T R G L D F A C D I Y I W A P L A G T C G V L L L S L V I T L Y C N H R N K RG R K K L L Y I F K Q P F M R P V Q T T Q E E D G C S C R F P E E E E G G C E L R V K FS R S A D A P A Y Q Q G Q N Q L Y N E L N L G R R E E Y D V L D K R R G R D P E M G GK P R R K N P Q E G L Y N E L Q K D K M A E A Y S E I G M K G E R R R G K G H D G L YQ G L S T A T K D T Y D A L H M Q A L P P R(SEQ ID NO:1)。
ATGCTTCTCCTGGTGACAAGCCTTCTGCTCTGTGAGTTACCACACCCAGCATTCCTCCTGATCCCAGACATCCAGATGACACAGACTACATCCTCCCTGTCTGCCTCTCTGGGAGACAGAGTCACCATCAGTTGCAGGGCAAGTCAGGACATTAGTAAATATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGATGGAACTGTTAAACTCCTGATCTACCATACATCAAGATTACACTCAGGAGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGAACAGATTATTCTCTCACCATTAGCAACCTGGAGCAAGAAGATATTGCCACTTACTTTTGCCAACAGGGTAATACGCTTCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACTAAGTTGGAAATAACAGGCTCCACCTCTGGATCCGGCAAGCCCGGATCTGGCGAGGGATCCACCAAGGGCGAGGTGAAACTGCAGGAGTCAGGACCTGGCCTGGTGGCGCCCTCACAGAGCCTGTCCGTCACATGCACTGTCTCAGGGGTCTCATTACCCGACTATGGTGTAAGCTGGATTCGCCAGCCTCCACGAAAGGGTCTGGAGTGGCTGGGAGTAATATGGGGTAGTGAAACCACATACTATAATTCAGCTCTCAAATCCAGACTGACCATCATCAAGGACAACTCCAAGAGCCAAGTTTTCTTAAAAATGAACAGTCTGCAAACTGATGACACAGCCATTTACTACTGTGCCAAACATTATTACTACGGTGGTAGCTATGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCAGCGGCCGCATTCGTGCCGGTCTTCCTGCCAGCGAAGCCCACCACGACGCCAGCGCCGCGACCACCAACACCGGCGCCCACCATCGCGTCGCAGCCCCTGTCCCTGCGCCCAGAGGCGTGCCGGCCAGCGGCGGGGGGCGCAGTGCACACGAGGGGGCTGGACTTCGCCTGTGATATCTACATCTGGGCGCCCTTGGCCGGGACTTGTGGGGTCCTTCTCCTGTCACTGGTTATCACCCTTTACTGCAACCACAGGAACAAACGGGGCAGAAAGAAACTCCTGTATATATTCAAACAACCATTTATGAGACCAGTACAAACTACTCAAGAGGAAGATGGCTGTAGCTGCCGATTTCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAACTGAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGCTAA(SEQ ID NO:2)。
GGCCAGGATGGTTCTTAGACT(SEQ ID NO:3)。
GGATTTCCAGTGGCGAGAGAA(SEQ ID NO:4)。
GCCUGUGUUCUCUGUGGACUAUG(SEQ ID NO:5)。
GGUGCUGCUAGUCUGGGUCCUGG(SEQ ID NO:6)。
GACAGAGAGAAGGGCAGAAGUGC(SEQ ID NO:7)。
CAGCUUCUCCAACACAUCGGAGA(SEQ ID NO:8)。
CCGUGUCACACAACUGCCCAACG(SEQ ID NO:9)。
UAUGCCACCAUUGUCUUUCCUAG(SEQ ID NO:10)。
UGCUAAACUGGUACCGCAUGAGC(SEQ ID NO:11)。
GUGACAGAGAGAAGGGCAGAAGU(SEQ ID NO:12)。
CUGAGGAUGGACACUGCUCUUGG(SEQ ID NO:13)。
AUCGGAGAGCUUCGUGCUAAACU(SEQ ID NO:14)。
GGCAACGGAACCCAGATTTAT(SEQ ID NO:15)。
GGAACCCAAATTACGTGTACT(SEQ ID NO:16)。
GAACCCAAATTACGTGTACTA(SEQ ID NO:17)。
GGGAGAAGACTATATTGTACA(SEQ ID NO:18)。
GACGTTTATAGCCGAAATGAT(SEQ ID NO:19)。
GACACTAATACACCAGGTAGA(SEQ ID NO:20)。
ACCUCACUAUCCAAGGACUGAGG(SEQ ID NO:21)。
AUGAGUUGACCUUCCUAGAUGAU(SEQ ID NO:22)。
GGGGAAUGAGUUGACCUUCCUAG(SEQ ID NO:23)。
CUCUGGAUCCUUGCAGCAGUUAG(SEQ ID NO:24)。
CUCCUCUGGAUCCUUGCAGCAGU(SEQ ID NO:25)。
UUUGUGUGUGAGUAUGCAUCUCC(SEQ ID NO:26)。
CACCUCCAGUGGAAAUCAAGUGA(SEQ ID NO:27)。
CACGGGACUCUACAUCUGCAAGG(SEQ ID NO:28)。
UUCUGACUUCCUCCUCUGGAUCC(SEQ ID NO:29)。
AAGUCUGUGCGGCAACCUACAUG(SEQ ID NO:30)。
GGTCGGTCAGAATGCCTATCT(SEQ ID NO:31)。
GCCAATGACTTACGGGACTCT(SEQ ID NO:32)。
GCAGAGGGAATTCGCTCAGAA(SEQ ID NO:33)。
GGAAATTCGGGCACATCATAT(SEQ ID NO:34)。
GATTAAGAGATGACTGGACTA(SEQ ID NO:35)。
GAGATGACTGGACTAGGTCTA(SEQ ID NO:36)。
AGGAAAUUCGGGCACAUCAUAUG(SEQ ID NO:37)。
GACUGAUGAAAGGGAUGUGAAUU(SEQ ID NO:38)。
GCCACUGAUUUUCAAAGAGAUCU(SEQ ID NO:39)。
AGCAGAGUUUUCCCAUUUUCAGA(SEQ ID NO:40)。
AACUUAAACAGGCAUGUCAUUGC(SEQ ID NO:41)。
UUCAGAAGAUAAUGACUCACAUG(SEQ ID NO:42)。
GCCUCUGUAUUUAAGCCAACAGA(SEQ ID NO:43)。
UGCUCAUGUGAUUGUGGAGUAGA(SEQ ID NO:44)。
AUGUUUUCACAUCUUCCCUUUGA(SEQ ID NO:45)。
GAGAGACUUCACUGCAGCCUUUC(SEQ ID NO:46)。
GATTGCCTCTACTCATCACTA(SEQ ID NO:47)。
UCCUAAUGACAAUGGGUCAUACC(SEQ ID NO:48)。
AAGACAUUGCCUGCCAUGCUUGG(SEQ ID NO:49)。
GUCAUACCGCUGUUCUGCAAAUU(SEQ ID NO:50)。
CUCCUGUAUAGUUUACUUCCUUU(SEQ ID NO:51)。
UACCGCUGUUCUGCAAAUUUUCA(SEQ ID NO:52)。
AAAACAAACCAGGCAUUGUUUAU(SEQ ID NO:53)。
AACUAGAAUGCCCUGUGAAAUAC(SEQ ID NO:54)。
GUGACUUGGUGCAAGCUCAAUGG(SEQ ID NO:55)。
AUCCAUGGGAAAGAAUCAUGUGA(SEQ ID NO:56)。
UGGUGCAAGCUCAAUGGAACAAC(SEQ ID NO:57)。
GCTGCTCACCCTTATGAACCT(SEQ ID NO:58)。
AGGACAUGGUGGUGGACGAGUGC(SEQ ID NO:59)。
UGCUCUUCCUGCACGAUAUCAGU(SEQ ID NO:60)。
ACCUCUACUGGUUCCUGUACAUC(SEQ ID NO:61)。
CCCUCCAACUCUGCUCCUCUAGG(SEQ ID NO:62)。
CCCUGAGUGGACAGUCGUCUUCG(SEQ ID NO:63)。
CUGCUCCAGGGAAGCUUCUAUGG(SEQ ID NO:64)。
CGCUCAAGGUCCUGUAUGCCACC(SEQ ID NO:65)。
GAGUUCACCAAGCUCAACAUUUA(SEQ ID NO:66)。
UGCUGCUGCUCACCCUUAUGAAC(SEQ ID NO:67)。
CCCAUCUCCGUGCUCUUCUUUGA(SEQ ID NO:68)。
根据本发明的实施例,将本发明的慢病毒导入淋巴细胞所得的转基因淋巴细胞,该T淋巴细胞的细胞因子产生以及对肿瘤细胞杀伤能力大大提高,尤其对CD19+恶性B细胞淋巴瘤或白血病的CD19+肿瘤细胞的杀伤效果尤为显著。
在本发明的第三方面,本发明提出了一种慢病毒。根据本发明的实施例,所述慢病毒携带含有SEQ ID NO:69所示的核苷酸序列。
AGATCTACTAGTTCTAGAATGCTTCTCCTGGTGACAAGCCTTCTGCTCTGTGAGTTACCACACCCAGCATTCCTCCTGATCCCAGACATCCAGATGACACAGACTACATCCTCCCTGTCTGCCTCTCTGGGAGACAGAGTCACCATCAGTTGCAGGGCAAGTCAGGACATTAGTAAATATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGATGGAACTGTTAAACTCCTGATCTACCATACATCAAGATTACACTCAGGAGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGAACAGATTATTCTCTCACCATTAGCAACCTGGAGCAAGAAGATATTGCCACTTACTTTTGCCAACAGGGTAATACGCTTCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACTAAGTTGGAAATAACAGGCTCCACCTCTGGATCCGGCAAGCCCGGATCTGGCGAGGGATCCACCAAGGGCGAGGTGAAACTGCAGGAGTCAGGACCTGGCCTGGTGGCGCCCTCACAGAGCCTGTCCGTCACATGCACTGTCTCAGGGGTCTCATTACCCGACTATGGTGTAAGCTGGATTCGCCAGCCTCCACGAAAGGGTCTGGAGTGGCTGGGAGTAATATGGGGTAGTGAAACCACATACTATAATTCAGCTCTCAAATCCAGACTGACCATCATCAAGGACAACTCCAAGAGCCAAGTTTTCTTAAAAATGAACAGTCTGCAAACTGATGACACAGCCATTTACTACTGTGCCAAACATTATTACTACGGTGGTAGCTATGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCAGCGGCCGCAATTGAAGTTATGTATCCTCCTCCTTACCTAGACAATGAGAAGAGCAATGGAACCATTATCCATGTGAAAGGGAAACACCTTTGTCCAAGTCCCCTATTTCCCGGACCTTCTAAGCCCTTTTGGGTGCTGGTGGTGGTTGGGGGAGTCCTGGCTTGCTATAGCTTGCTAGTAACAGTGGCCTTTATTATTTTCTGGGTGAGGAGTAAGAGGAGCAGGCTCCTGCACAGTGACTACATGAACATGACTCCCCGCCGCCCCGGGCCCACCCGCAAGCATTACCAGCCCTATGCCCCACCACGCGACTTCGCAGCCTATCGCTCCAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGCTAAAAGCTTGGTACCCTCGAGCGACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATGCTGGGGATGCGGTGGGCTCTATGGGTCGACCAAGGTCGGGCAGGAAGAGGGCCTATTTCCCATGATTCCTTCATATTTGCATATACGATACAAGGCTGTTAGAGAGATAATTAGAATTAATTTGACTGTAAACACAAAGATATTAGTACAAAATACGTGACGTAGAAAGTAATAATTTCTTGGGTAGTTTGCAGTTTTAAAATTATGTTTTAAAATGGACTATCATATGCTTACCGTAACTTGAAAGTATTTCGATTTCTTGGCTTTATATATCTTGTGGAAAGGACGAAACACCTCCCCAGGCGCAGATCAAAGAGAGTTCAAGAGACTCTCTTTGATCTGCGCCTTTTTTAGCTATCGATATC(SEQ ID NO:69)。
根据本发明的实施例,将本发明实施例的慢病毒导入淋巴细胞所得的转基因淋巴细胞,该转基因淋巴细胞的细胞因子的产生以及对肿瘤细胞的杀伤能力大大提高,尤其对CD19+恶性B细胞淋巴瘤或白血病的CD19+肿瘤细胞的杀伤效果尤为显著。
在本发明的第四方面,本发明提出了一种慢病毒。根据本发明的实施例,所述慢病毒携带含有SEQ ID NO:70所示的核苷酸序列。
AGATCTACTAGTTCTAGAATGCTTCTCCTGGTGACAAGCCTTCTGCTCTGTGAGTTACCACACCCAGCATTCCTCCTGATCCCAGACATCCAGATGACACAGACTACATCCTCCCTGTCTGCCTCTCTGGGAGACAGAGTCACCATCAGTTGCAGGGCAAGTCAGGACATTAGTAAATATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGATGGAACTGTTAAACTCCTGATCTACCATACATCAAGATTACACTCAGGAGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGAACAGATTATTCTCTCACCATTAGCAACCTGGAGCAAGAAGATATTGCCACTTACTTTTGCCAACAGGGTAATACGCTTCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACTAAGTTGGAAATAACAGGCTCCACCTCTGGATCCGGCAAGCCCGGATCTGGCGAGGGATCCACCAAGGGCGAGGTGAAACTGCAGGAGTCAGGACCTGGCCTGGTGGCGCCCTCACAGAGCCTGTCCGTCACATGCACTGTCTCAGGGGTCTCATTACCCGACTATGGTGTAAGCTGGATTCGCCAGCCTCCACGAAAGGGTCTGGAGTGGCTGGGAGTAATATGGGGTAGTGAAACCACATACTATAATTCAGCTCTCAAATCCAGACTGACCATCATCAAGGACAACTCCAAGAGCCAAGTTTTCTTAAAAATGAACAGTCTGCAAACTGATGACACAGCCATTTACTACTGTGCCAAACATTATTACTACGGTGGTAGCTATGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCAGCGGCCGCAATTGAAGTTATGTATCCTCCTCCTTACCTAGACAATGAGAAGAGCAATGGAACCATTATCCATGTGAAAGGGAAACACCTTTGTCCAAGTCCCCTATTTCCCGGACCTTCTAAGCCCTTTTGGGTGCTGGTGGTGGTTGGGGGAGTCCTGGCTTGCTATAGCTTGCTAGTAACAGTGGCCTTTATTATTTTCTGGGTGAGGAGTAAGAGGAGCAGGCTCCTGCACAGTGACTACATGAACATGACTCCCCGCCGCCCCGGGCCCACCCGCAAGCATTACCAGCCCTATGCCCCACCACGCGACTTCGCAGCCTATCGCTCCAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGCTAAAAGCTTGGTACCCTCGAGCGACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATGCTGGGGATGCGGTGGGCTCTATGGGTCGACCAAGGTCGGGCAGGAAGAGGGCCTATTTCCCATGATTCCTTCATATTTGCATATACGATACAAGGCTGTTAGAGAGATAATTAGAATTAATTTGACTGTAAACACAAAGATATTAGTACAAAATACGTGACGTAGAAAGTAATAATTTCTTGGGTAGTTTGCAGTTTTAAAATTATGTTTTAAAATGGACTATCATATGCTTACCGTAACTTGAAAGTATTTCGATTTCTTGGCTTTATATATCTTGTGGAAAGGACGAAACACCTCCCCGCATCACTTGGGATTAATATTCAAGAGATATTAATCCCAAGTGATGCTTTTTAGCTATCGATATC(SEQ ID NO:70)。
根据本发明的实施例,将本发明实施例的慢病毒导入淋巴细胞所得的转基因淋巴细胞,该转基因淋巴细胞的细胞因子的产生以及对肿瘤细胞的杀伤能力大大提高,尤其对CD19+恶性B细胞淋巴瘤或白血病的CD19+肿瘤细胞的杀伤效果尤为显著。
在本发明的第五方面,本发明提出了一种慢病毒。根据本发明的实施例,所述慢病毒携带含有SEQ ID NO:71所示的核苷酸序列。
ATGCTTCTCCTGGTGACAAGCCTTCTGCTCTGTGAGTTACCACACCCAGCATTCCTCCTGATCCCAGACATCCAGATGACACAGACTACATCCTCCCTGTCTGCCTCTCTGGGAGACAGAGTCACCATCAGTTGCAGGGCAAGTCAGGACATTAGTAAATATTTAAATTGGTATCAGCAGAAACCAGATGGAACTGTTAAACTCCTGATCTACCATACATCAAGATTACACTCAGGAGTCCCATCAAGGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGAACAGATTATTCTCTCACCATTAGCAACCTGGAGCAAGAAGATATTGCCACTTACTTTTGCCAACAGGGTAATACGCTTCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACTAAGTTGGAAATAACAGGCTCCACCTCTGGATCCGGCAAGCCCGGATCTGGCGAGGGATCCACCAAGGGCGAGGTGAAACTGCAGGAGTCAGGACCTGGCCTGGTGGCGCCCTCACAGAGCCTGTCCGTCACATGCACTGTCTCAGGGGTCTCATTACCCGACTATGGTGTAAGCTGGATTCGCCAGCCTCCACGAAAGGGTCTGGAGTGGCTGGGAGTAATATGGGGTAGTGAAACCACATACTATAATTCAGCTCTCAAATCCAGACTGACCATCATCAAGGACAACTCCAAGAGCCAAGTTTTCTTAAAAATGAACAGTCTGCAAACTGATGACACAGCCATTTACTACTGTGCCAAACATTATTACTACGGTGGTAGCTATGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCAGCGGCCGCATTCGTGCCGGTCTTCCTGCCAGCGAAGCCCACCACGACGCCAGCGCCGCGACCACCAACACCGGCGCCCACCATCGCGTCGCAGCCCCTGTCCCTGCGCCCAGAGGCGTGCCGGCCAGCGGCGGGGGGCGCAGTGCACACGAGGGGGCTGGACTTCGCCTGTGATATCTACATCTGGGCGCCCTTGGCCGGGACTTGTGGGGTCCTTCTCCTGTCACTGGTTATCACCCTTTACTGCAACCACAGGAACAAACGGGGCAGAAAGAAACTCCTGTATATATTCAAACAACCATTTATGAGACCAGTACAAACTACTCAAGAGGAAGATGGCTGTAGCTGCCGATTTCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAACTGAGAGTGAAGTTCAGCAGGAGCGCAGACGCCCCCGCGTACCAGCAGGGCCAGAACCAGCTCTATAACGAGCTCAATCTAGGACGAAGAGAGGAGTACGATGTTTTGGACAAGAGACGTGGCCGGGACCCTGAGATGGGGGGAAAGCCGAGAAGGAAGAACCCTCAGGAAGGCCTGTACAATGAACTGCAGAAAGATAAGATGGCGGAGGCCTACAGTGAGATTGGGATGAAAGGCGAGCGCCGGAGGGGCAAGGGGCACGATGGCCTTTACCAGGGTCTCAGTACAGCCACCAAGGACACCTACGACGCCCTTCACATGCAGGCCCTGCCCCCTCGCTAATCCTACTGCGTCGACTTCGAACTCGAGCGACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATGCTGGGGATGCGGTGGGCTCTATGGGTCGACCAAGGTCGGGCAGGAAGAGGGCCTATTTCCCATGATTCCTTCATATTTGCATATACGATACAAGGCTGTTAGAGAGATAATTAGAATTAATTTGACTGTAAACACAAAGATATTAGTACAAAATACGTGACGTAGAAAGTAATAATTTCTTGGGTAGTTTGCAGTTTTAAAATTATGTTTTAAAATGGACTATCATATGCTTACCGTAACTTGAAAGTATTTCGATTTCTTGGCTTTATATATCTTGTGGAAAGGACGAAACACCTCCCCAGGCGCAGATCAAAGAGAGTTCAAGAGACTCTCTTTGATCTGCGCCTTTTTTAGCTATCGATATCGATAGCTAAAAAGCATCACTTGGGATTAATATCTCTTGAATATTAATCCCAAGTGATGCGGGGAAGATCTGTGGTCTCATACAGAACTTATAAGATTCCCAAATCCAAAGACATTTCACGTTTATGGTGATTTCCCAGAACACATAGCGACATGCAAATATTGCAGGGCGCCACTCCCCTGTCCCTCACAGCCATCTTCCTGCCAGGGCGCACGCGCGCTGGGTGTTCCCGCCTAGTGACACTGGGCCCGCGATTCCTTGGAGCGGGTTGATGACGTCAGCGTTCGAATTGTCGAC(SEQ IDNO:71)。
根据本发明的实施例,将本发明实施例的慢病毒导入淋巴细胞所得的转基因淋巴细胞,该转基因淋巴细胞的细胞因子的产生以及对肿瘤细胞的杀伤能力大大提高,尤其对CD19+恶性B细胞淋巴瘤或白血病的CD19+肿瘤细胞的杀伤效果尤为显著。
在本发明的第六方面,本发明提出了一种转基因淋巴细胞。根据本发明的实施例,所述淋巴细胞细胞表面免疫检查点被沉默;以及表达嵌合抗原受体,其中,所述嵌合抗原受体包括:胞外区,所述胞外区能够与抗原特异性结合;跨膜区;以及胞内区,所述胞内区包括免疫共刺激分子胞内段,所述抗原是肿瘤抗原,所述胞外区包括抗体的重链可变区和轻链可变区,所述抗体结合所述抗原,所述抗体为单链抗体,所述抗原为CD19。发明人惊奇的发现,细胞表面免疫检查点被沉默和表达特异性结合CD19的嵌合抗原受体的淋巴细胞,该淋巴细胞的细胞因子产生以及对CD19+肿瘤细胞的杀伤能力大大提高。
根据本发明的实施例,上述转基因淋巴细胞还可以具有下列附加技术特征至少之一:
根据本发明的实施例,所述淋巴细胞细胞表面免疫检查点独立地选自CTLA4、PD1、TIM3、BTLA、LAG3至少之一。上述分子具有负向调控和减弱细胞免疫应答的作用。在本发明中,细胞表面免疫检查点的成功沉默,进一步提高了转基因淋巴细胞,该转基因淋巴细胞的细胞因子产生以及对肿瘤细胞杀伤能力进一步加强。
根据本发明的实施例,所述淋巴细胞细胞表面免疫检查点被沉默是通过shRNA、反义核酸、核酶、显性负突变和锌指核酸酶至少之一实现的。根据本发明的实施例,细胞表面免疫检查点的成功沉默,进一步提高了转基因淋巴细胞的细胞因子产生以及对肿瘤细胞的杀伤能力进一步加强。
根据本发明的实施例,所述免疫共刺激分子胞内段独立地选自4-1BB、OX-40、CD40L、CD27、CD30、CD28以及他们的衍生物的至少一种。免疫共刺激分子胞内段的表达和细胞表面免疫检查点的沉默的联合具有正向调控和增强细胞免疫应答的作用,使得转基因淋巴细胞对肿瘤的定向杀伤作用效果更加显著。
根据本发明的实施例,所述淋巴细胞细胞表面免疫检查点是CTLA4或PD1。根据本发明的时候例,细胞细胞表面免疫检查点CTLA4或PD1被沉默,使得转基因淋巴细胞的细胞因子产生以及对肿瘤细胞杀伤能力更加显著。
根据本发明的实施例,所述淋巴细胞细胞表面免疫检查点被沉默是通过shRNA实现的。根据本发明的实施例,本发明所提出的shRNA具有高效、特异性的沉默细胞表面免疫检查点的作用,细胞表面免疫检查点的成功沉默,使得转基因淋巴细胞的细胞因子产生以及对肿瘤细胞杀伤能力进一步提高,对肿瘤的定向杀伤作用效果更加显著。
根据本发明的实施例,所述免疫共刺激分子胞内段是4-1BB或CD28的胞内段。本发明中的转基因淋巴细胞的嵌合抗原受体的免疫共刺激分子胞内段是CD28或者4-1BB的胞内段。根据本发明的实施例,免疫共刺激分子胞内段是CD28或者4-1BB的胞内段,显著增强了转基因淋巴细胞的定向杀伤作用。
根据本发明的实施例,所述淋巴细胞是CD3+T淋巴细胞或自然杀伤细胞或自然杀伤T细胞。在本发明中,上述淋巴细胞的细胞表面免疫检查点被沉默和表达嵌合抗原受体,使得上述淋巴细胞的细胞免疫作用靶向性更强,该T淋巴细胞的细胞因子产生以及对肿瘤细胞杀伤能力进一步提高,对肿瘤的定向杀伤作用效果更加显著。
在本发明的第七方面,本发明提出了一种构建体。根据本发明的实施例,所述构建体包括:第一核酸分子,所述第一核酸分子沉默细胞表面免疫检查点;以及第二核酸分子,所述第二核酸分子编码嵌合抗原受体,其中,所述细胞表面免疫检查点和所述嵌合抗原受体如前所述。根据本发明的实施例,上述构建成功导入上述淋巴细胞并成功沉默细胞表面免疫检查点和表达嵌合抗原受体后,使得淋巴细胞的细胞因子产生以及对肿瘤细胞杀伤能力大幅提高,对肿瘤细胞的杀伤作用更加显著。
根据本发明的实施例,上述构建体还可以进一步包括下列附加技术特征至少之一:
根据本发明的实施例,其特征在于所述第一核酸分子与所述第二核酸分子被设置在前面所述的淋巴细胞中沉默细胞表面免疫检查点和表达所述嵌合抗原受体。根据本发明的实施例,成功设置上述第一核酸分子和第二核酸分子的淋巴细胞具有更强的肿瘤杀伤效果。
根据本发明的实施例,所述构建体进一步包括:第一启动子,所述第一启动子与所述第一核酸分子可操作地连接;以及第二启动子,所述第二启动子与所述第二核酸分子可操作地连接。根据本发明的实施例,第一和第二启动子的引入,使得第一核酸分子和第二核酸分子分别独立的表达,有效沉默了细胞表面免疫检查点和保证了嵌合抗原受体的生物学作用,使得淋巴细胞靶向作用更强,对肿瘤的定向杀伤作用更加显著。
根据本发明的实施例,所述第一启动子和所述第二启动子分别独立地选自U6,H1,CMV,EF-1,RSV启动子。根据本发明的实施例,上述启动子具有启动效率高的特点,从而保证了细胞表面免疫检查点的高效沉默和嵌合抗原受体的高效表达,使得淋巴细胞的细胞因子产生以及对肿瘤细胞杀伤能力大大提高,对肿瘤的定向杀伤效果更加显著。
根据本发明的实施例,所述构建体载体是非致病性病毒。非致病性病毒载体的引入大大提高了构建体在淋巴细胞中的复制和扩增效率,从而大大提高了细胞表面免疫检查点的沉默和嵌合抗原受体在淋巴细胞中的高效表达,使得淋巴细胞的细胞因子产生以及对肿瘤细胞杀伤能力大大提高,淋巴细胞的靶向作用进一步增强,对肿瘤细胞的杀伤作用更加显著
根据本发明的实施例,所述非致病性病毒载体选自反转录病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体和腺关联病毒载体的至少之一。根据本发明的实施例,本发明实施例的病毒的载体在病毒包装和感染过程中,病毒感染范围广泛,既可感染终末分化细胞,又可感染处于分裂期的细胞,既可整合到宿主染色体,又可游离在宿主染色体之外,实现广谱而高效的感染效率,从而细胞表面免疫检查点被高效沉默和嵌合抗原受体在淋巴细胞中的高效表达,使得淋巴细胞的细胞因子产生以及对肿瘤细胞杀伤能力大大提高,淋巴细胞的靶向作用进一步增强,对肿瘤细胞的杀伤作用更加显著。
在本发明的第八方面,本发明提出了一种制备前面所述的T淋巴细胞或者转基因淋巴细胞的方法。根据本发明的实施例,所述方法包括:将前面所述的构建体或者前面所述的慢病毒引入到淋巴细胞中或者T淋巴细胞。所述构建体或慢病毒成功引入上述淋巴细胞或者T淋巴细胞中,实现了淋巴细胞的细胞表面免疫检查被沉默和特异性结合抗原CD19的嵌合抗原受体的表达,从而使得所得淋巴细胞或T淋巴细胞的细胞因子产生以及对肿瘤细胞杀伤能力大大提高,淋巴细胞或T淋巴细胞对CD19+肿瘤细胞的靶向杀伤作用更强。
在本发明的第九方面,本发明提出了一种用于治疗癌症的治疗组合物。根据本发明的实施例,所述治疗组合物包括:上述构建体、慢病毒、T淋巴细胞或者转基因淋巴细胞。上述任意一种治疗组合物的组成均可实现转基因淋巴细胞或T淋巴细胞的细胞表面免疫检查点的沉默和特异性结合抗原CD19的嵌合抗原受体在转基因淋巴细胞或T淋巴细胞中的高效表达,从而使得所得转基因淋巴细胞或T淋巴细胞的细胞因子产生以及对肿瘤细胞杀伤能力大大提高,转基因淋巴细胞或T淋巴细胞对CD19+肿瘤细胞的靶向杀伤作用更强。
根据本发明的实施例,上述治疗组合物还可以进一步包括下列附加技术特征至少之一:
根据本发明的实施例,所述癌症包括选自B细胞淋巴瘤和B细胞白血病的至少之一。细胞表面免疫检查点的沉默和嵌合抗原受体在转基因淋巴细胞或T淋巴细胞中的高效表达,使得所得淋巴细胞或T淋巴细胞对B细胞淋巴瘤或白血病的CD19+肿瘤细胞的靶向杀伤作用更强。
在本发明的第十方面,本发明提出了一种提高淋巴细胞活性的方法,根据本发明的实施例,所述淋巴细胞携带嵌合抗原受体,其特征在于,所述方法包括:使所述淋巴细胞的细胞表面免疫检查点被沉默,所述细胞表面免疫检查点、所述淋巴细胞和所述嵌合抗原受体是如前所定义的,所述淋巴细胞活性包括所述淋巴细胞的细胞因子的分泌能力和所述淋巴细胞杀伤肿瘤细胞能力的至少一种。根据本发明的实施例,淋巴细胞的细胞表面免疫检查点被沉默,细胞因子分泌增多,对肿瘤细胞的靶向杀伤作用更强。
需要说明的是,本发明中所使用的术语“细胞表面免疫检查点”是一种淋巴细胞表面的膜蛋白,它是一种负调控的监管机构,其与肿瘤细胞上表达的配体相互作用,可以抑制抗肿瘤淋巴细胞反应。本发明中所提到的“细胞因子分泌增多”是细胞生理功能增强的表现。
附图说明
图1是根据本发明实施例的共表达CD19抗原特异性的嵌合抗原受体和沉默人细胞表面免疫检查点的慢病毒载体的结构示意图;
图2是根据本发明实施例的共表达CD19抗原特异性的嵌合抗原受体和沉默PD1的淋巴细胞杀伤肿瘤细胞的结果图;以及
图3是根据本发明实施例的共表达CD19抗原特异性的嵌合抗原受体和沉默PD1的淋巴细胞分泌干扰素-γ的结果图。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例,下面描述的实施例是示例性的,旨在用于解释本发明,而不能理解为对本发明的限制。
T淋巴细胞或转基因淋巴细胞
在本发明的第一方面,本发明提出了一种T淋巴细胞或转基因淋巴细胞。根据本发明的实施例,所述T淋巴细胞的细胞表面免疫检查点被沉默;以及表达嵌合抗原受体,其中,所述嵌合抗原受体包括:胞外区,所述胞外区包括单链抗体的重链可变区和轻链可变区,所述单链抗体特异性识别抗原CD19;跨膜区,所述跨膜区与所述胞外区相连,并且嵌入到所述T淋巴细胞的细胞膜中;胞内区,所述胞内区与所述跨膜区相连,并且所述胞内区包括CD28的胞内段以及CD3ζ链。根据本发明的实施例,本发明提出的T淋巴细胞杀伤能力显著增强,尤其对CD19+恶性B细胞淋巴瘤或白血病的CD19+肿瘤细胞的杀伤效果大大提高。
肿瘤可以避免免疫监视,通过刺激免疫抑制性受体的表达而关闭免疫反应。作为免疫负调节机制,激活的细胞毒性T淋巴细胞(CTLs)表达负调控的监管机构,即细胞表面的免疫检查点分子。程序性细胞死亡1受体(PD1)表达在活化CTLs上,其与肿瘤细胞上表达的程序性死亡配体1(PD-L1 B7-H1)相互作用,可以抑制抗肿瘤T细胞反应。许多肿瘤,包括淋巴瘤、肺癌、卵巢癌、黑色素瘤、胰腺肿瘤,表达PD-L1。PD-L1与其配体PD1的结合,导致CTLs增生性反应的下调,细胞因子的分泌减少,和T细胞的无能或凋亡。细胞毒性T淋巴细胞抗原4(CTLA4)是另一个T细胞的关键负面调节因子,其可抑制T细胞活化,其通过与表达在抗原递呈细胞上的配体B7.1、B7.2(CD80和CD86)的相互作用而抑制T细胞的活化。因此,本发明中提出的T淋巴细胞或转基因淋巴细胞的免疫检查点被沉默,T淋巴细胞或转基因淋巴细胞的在肿瘤病人体内的增殖和生存能力以及细胞因子的分泌能力显著提高。
根据本发明的实施例,所述抗体为单链抗体。单链抗体可去除非特异性反应的竞争性表面蛋白,同时单链抗体更易渗透肿瘤组织增加药物治疗浓度。本发明提出的转基因淋巴细胞表达单链抗体的嵌合抗原受体,大大提高了转基因淋巴细胞对靶向肿瘤细胞的定向杀伤作用。
根据本发明的实施例,所述抗原为CD19。因此所述转基因淋巴细胞针对表达抗原CD19的细胞具有定向性杀伤作用,抗原抗体的特异性结合作用更强,大大提高了本发明的转基因淋巴细胞对CD19抗原表达肿瘤细胞的定向杀伤作用。
根据本发明的实施例,所述淋巴细胞细胞表面免疫检查点独立地选自CTLA4、PD1、TIM3、BTLA、LAG3至少之一。上述分子能够与肿瘤细胞表面表达的抗原特异性结合,负向调控和减弱细胞免疫应答。在本发明中,细胞表面免疫检查点的成功沉默,进一步提高了转基因淋巴细胞对肿瘤细胞的定向杀伤作用进一步加强。
根据本发明的实施例,所述淋巴细胞细胞表面免疫检查点被沉默是通过shRNA、反义核酸、核酶、显性负突变和锌指核酸酶至少之一实现的。
小发夹RNA或短发夹RNA(shRNA)是siRNA(小干扰RNA)的导入形式,siRNA是一种小RNA分子(由21~25个核苷酸组成),由Dicer(RNAase Ⅲ家族中对双链RNA具有特异性剪切作用的酶)加工而成;siRNA在RNA沉默通路中起中心作用,对特定信使RNA(mRNA)进行降解,为转录水平后调控。
反义核酸包括反义RNA和反义DNA,反义RNA是指能和mRNA完全互补的一段小分子RNA或寡聚核苷酸片段,反义DNA是指能与基因DNA双链中的有义链互补结合的短小DNA分子,反义RNA和反义DNA主要是通过mRNA的翻译和基因DNA的转录而发挥作用的;反义核酸一方面通过与靶mRNA结合形成空间位阻效应,阻止核糖体与mRNA结合,另一方面其与mRNA结合后激活内源性RNA酶或核酶,进而降解mRNA;反义DNA与基因DNA双螺旋的调控区特异结合形成DNA三聚体,或与DNA编码区结合,终止正在转录的mRNA链的延长;反义核酸还可抑制转录后mRNA的加工修饰,如5'端加帽、3'端加尾、中间剪接和内部碱基甲基化等,并阻止成熟mRNA由细胞核向细胞浆内运输,因此,反义RNA是一种有效的沉默目的基因的技术。
核酶是具有催化功能的RNA分子,是生物催化剂,可降解特异的mRNA序列,核酶通过催化转磷酸酯和磷酸二酯键水解反应参与RNA自身剪切、加工过程,与一般的反义RNA相比,核酶具有较稳定的空间结构,不易受到RNA酶的攻击,更重要的是,核酶在切断mRNA后,又可从杂交链上解脱下来,重新结合和切割其它的mRNA分子。
显性负性突变是指某些信号转导蛋白突变后不仅自身无功能,还能抑制或阻断同一细胞内的野生型信号转导蛋白的作用,其主要通过和野生型蛋白形成二聚物的方式实现,这种突变毒性作用大,能显著抑制或阻断细胞内目标信号转导蛋白的作用。
锌指核酸酶由一个DNA识别域和一个非特异性核酸内切酶构成,DNA识别域是由一系列Cys2-His2锌指蛋白串联组成(一般3~4个),每个锌指蛋白识别并结合一个特异的三联体碱基,锌指蛋白形成α-β-β二级结构,其中α螺旋的16氨基酸残基决定锌指的DNA结合特异性,骨架结构保守,对决定DNA结合特异性的氨基酸引入序列的改变可以获得新的DNA结合特异性,从而可以针对不同的目的基因设计不同的氨基酸引入序列,实现不同目的基因的特异性沉默。
综上所述,shRNA、反义核酸、核酶、显性负突变、CRISPR、锌指核酸酶为特异性沉默目标基因的有效手段,沉默基因的手段不受特别限制,本领域技术人员可根据具体的实验目的和条件选择,如本发明实施例所采用的shRNA、反义核酸、核酶、显性负突变,或锌指核酸酶的至少之一,实现目的基因的特异性沉默。
根据本发明的实施例,淋巴细胞细胞表面免疫检查点被沉默优选采用shRNA实现。ShRNA所携带的siRNA分子通常是一个长度在10和30之间的碱基对的双重区域。本发明实施例的PD1或CTLA4 siRNA被设计为同源于PD1或CTLA4 mRNA的编码区域,通过mRNA的降解来抑制基因表达。siRNA关联于被称为诱导RNA沉默复合物(RISC)的多重蛋白复合物,在此期间正义链被酶裂解。被激活的RISC中基于序列同源性,指引RISC到对应的mRNA;相同的核酸酶切割靶向PD1或CTLA4 mRNA,产生特定基因PD1或CTLA4沉默,抑制特定基因PD1或CTLA4的表达。siRNA以shRNA的形式导入细胞(shRNA包含大约18-23的核苷酸siRNA序列,后跟一个9-15长度的核苷酸环和一个siRNA序列的反向补充),shRNA的设计较好的避免了在3’UTR细胞基因中的匹配点;确保了适当的链选择。一个单一siRNA分子可被重复应用于多靶向mRNA分子的分裂。RNAi(RNA干扰)可通过引入合成siRNA的方式被诱导。根据本发明的实施例,本发明实施例的shRNA不断产自细胞内,因此其效果更加持久,从而延长shRNA周期,本发明实施例采用的shRNA具有高效、特异性的沉默细胞表面免疫检查点的作用,细胞表面免疫检查点的成功沉默,使得转基因淋巴细胞具有显著的抵抗肿瘤介导的免疫抑制的特性,对肿瘤的定向杀伤作用效果更加显著。
根据本发明的实施例,所述免疫共刺激分子胞内段独立地选自4-1BB、OX-40、CD40L、CD27、CD30、CD28以及他们的衍生物的至少一种。免疫共刺激分子胞内段的表达和细胞表面免疫检查点的沉默的联合具有正向调控和增强细胞免疫应答的作用,使得转基因淋巴细胞对肿瘤的定向杀伤作用效果更加显著。
根据本发明的实施例,所述淋巴细胞细胞表面免疫检查点是CTLA4或PD1。根据本发明的时候例,细胞细胞表面免疫检查点CTLA4或PD1被沉默,使得转基因淋巴细胞在肿瘤病人体内的增殖和生存能力得到进一步提高,对肿瘤的定向杀伤作用效果更加显著。
本发明中的淋巴细胞是CD3+淋巴细胞或自然杀伤细胞或自然杀伤T细胞。CD3+淋巴细胞是总T细胞,自然杀伤细胞是免疫细胞的一种,非特异性性识别靶细胞,自然杀伤T细胞是具有T细胞和自然杀伤细胞受体的T细胞亚群。上述淋巴细胞中免疫共刺激分子被沉默和表达嵌合抗原受体,使得上述淋巴细胞的细胞免疫作用靶向性更强,对肿瘤细胞的杀伤作用效果更加显著。
慢病毒或构建体
在本发明的第二方面,本发明提出了一种慢病毒或构建体。根据本发明的实施例,所述慢病毒或构建体携带下列核酸分子:编码嵌合抗原受体的核酸分子,所述嵌合抗原受体具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列,所述编码嵌合抗原受体的核酸分子具有SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列;以及沉默细胞表面免疫检查点的核酸分子,所述沉默细胞表面免疫检查点的核酸分子的核苷酸序列为选自SEQ ID NO:3~68的至少之一。其中,SEQ ID NO:3~14是人类程序性细胞死亡受体1(PD1)siRNA的核苷酸序列,SEQ ID NO:15~30是人类细胞毒性T淋巴细胞抗原4(CTLA4)siRNA的核苷酸序列,SEQ ID NO:31~46是人类T细胞免疫球蛋白粘蛋白分子3(TIM3)siRNA的核苷酸序列,SEQ ID NO:47~57是人类T淋巴细胞衰减因子(BTLA)siRNA的核苷酸序列,SEQ ID NO:58~68是人类淋巴细胞活化基因3蛋白(LAG3)siRNA的核苷酸序列。根据本发明的实施例,将本发明的慢病毒或构建体导入淋巴细胞所得的转基因淋巴细胞,其细胞表面的免疫检查点PD1、CTLA4、TIM3、BTLA、LAG3被特异性沉默,特意向结合抗原CD19的嵌合抗原受体高效表达,使得转基因淋巴细胞抗调亡能力和增殖能力增强、定向杀伤能力显著提高,从而使得基因淋巴细胞对CD19+恶性B细胞淋巴瘤或白血病的CD19+肿瘤细胞的杀伤效果尤为显著。
根据本发明地实施例,本发明提出的慢病毒或构建体携带含有SEQ ID NO:69、70或71所示的核苷酸序列。其中,SEQ ID NO:69是共表达抗CD19嵌合抗原受体和沉默细胞表面免疫检查点PD-1的核酸分子(CD19-CAR/iPD1),SEQ ID NO:70是共表达抗CD19嵌合抗原受体和沉默细胞表面免疫检查点CTLA4的核酸分子(CD19-CAR/iCTLA4),SEQID NO:71是共表达抗CD19嵌合抗原受体和沉默细胞表面免疫检查点PD-1和CTLA4的核酸分子(CD19-CAR/iPD1/iCTLA4)。根据本发明的实施例,将本发明的慢病毒导入淋巴细胞所得的转基因淋巴细胞,其细胞表面的免疫检查点PD1、CTLA4被特异性沉默,抗CD19的嵌合抗原受体高效表达,使得转基因淋巴细胞抗调亡能力和增殖能力增强、定向杀伤能力显著提高,从而使得转基因淋巴细胞对CD19+恶性B细胞淋巴瘤或白血病的CD19+肿瘤细胞的杀伤效果尤为显著。
根据本发明的实施例,发明人是通过如下方式实现上述细胞嵌合抗原受体以及细胞表面免疫检查点shRNA分别独立地表达的,其中,需要说明的是,此处的表达既指蛋白的表达又指RNA转录。
启动子:第一启动子,所述第一启动子与编码嵌合抗原受体的核酸分子可操作地连接;以及第二启动子,所述第二启动子与沉默免疫检查点的核酸分子可操作地连接。根据本发明的实施例,所述第一启动子和所述第二启动子分别独立地选自U6,H1,CMV,EF-1,RSV启动子,第一和第二启动子的引入,使得编码嵌合抗原受体的核酸分子和沉默细胞表面免疫检查点的核酸分子分别独立的表达,有效沉默了细胞表面免疫检查点和保证了嵌合抗原受体的高效表达,使得淋巴细胞的靶向作用更强,对肿瘤的定向杀伤作用更加显著。
根据本发明的实施例,也可进一步引入第三启动子,第三启动子与沉默细胞表面的免疫检查点的核酸分子可操作的连接,第三启动子和第二启动子所连接的沉默细胞表面的免疫检查的核酸分子不同,第三启动子和第二启动子分别启动沉默不同免疫检查点的shRNA。
通过上述第一、第二启动子或进一步第三启动子的的引入,使得免疫检查点被高效沉默和嵌合抗原受体高效地表达在上述转基因淋巴细胞膜上,从而高效抑制了免疫检查点的免疫负调控和保证了嵌合抗原受体的生物学作用,从而使得淋巴细胞靶向杀伤作用更加显著。
根据本发明的实施例,所述构建体的载体是非致病性病毒载体。非致病性病毒载体的引入大大提高了构建体在淋巴细胞中的复制和扩增效率,使得淋巴细胞的靶向作用进一步增强,对肿瘤细胞的杀伤作用更加显著。
根据本发明的实施例,所述非致病性病毒载体选自反转录病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体和腺病毒关联病毒载体的至少之一。根据本发明的实施例,上述构建体病毒感染范围广泛,既可感染终末分化细胞,又可感染处于分裂期的细胞,既可整合到宿主染色体,又可游离在宿主染色体之外,实现广谱而高效的感染效率,从而细胞表面免疫检查点被高效沉默和抗CD19的嵌合抗原受体在淋巴细胞中的高效表达,使得淋巴细胞的靶向作用进一步增强,对CD19+肿瘤细胞的杀伤作用更加显著。
根据本发明的具体实施例,以构建一个慢病毒载体为例,发明人为了构建一个慢病毒载体,在某些病毒序列的位置,将目的核酸插入到病毒基因组中,从而产生复制缺陷的病毒。为了产生病毒体,发明人进而构建包装细胞系(包含gag,pol和env基因,但不包括LTR和包装成分)。发明人将含有目的基因的重组质粒,连同慢病毒LTR和包装序列,一起引入包装细胞系中。包装序列允许重组质粒RNA转录产物被包装到病毒颗粒中,然后被分泌到培养基中。进而发明人收集包含重组慢病毒的基质,有选择性地浓缩,并用于基因转移。慢载体可以感染多种细胞类型,包括可分裂细胞和不可分裂细胞。
另外,根据本发明的实施例,本发明实施例的慢病毒是复合慢病毒,除了常见的慢病毒基因gag,pol和env,还包含有调控和结构功能的其他基因。慢病毒载体是本领域技术人员所熟知的,慢病毒包括:人类免疫缺陷病毒HIV–1,HIV–2和猿猴免疫缺陷病毒SIV。慢病毒载体通过多重衰减艾滋病毒致病基因产生,例如全部删除基因env,vif,vpr,vpu和nef,使慢病毒载体形成生物安全型载体。重组慢病毒载体能够感染非分裂细胞,同时可用于体内和体外基因转移和核酸序列表达。例如:在合适的宿主细胞中,和带有包装功能(gag,pol,env,rev和tat)的两个或更多的载体一起,能够感染非分裂细胞。重组病毒的靶向性,是通过抗体或特定配体(靶向特定细胞类型受体)与膜蛋白的结合来实现的。同时,重组病毒的靶向性通过插入一个有效序列(包括调控区域)到病毒载体中,连同另一个编码了特定靶细胞上的受体的配体的基因,使载体具有了特定的靶向。各种有用的慢病毒载体,以及各种方法和操作等产生的载体,用于改变细胞的表达。根据本发明的实施例,本发明实施例的慢病毒载体可有效运送和共表达shRNA(siRNA的转运形式),该小shRNA可以有效抑制PD1或CTLA4的表达。根据本发明的实施例,本发明实施例的腺关联病毒载体(AAV)可使用一种或多种为人熟知的血清类型腺关联病毒载体的DNA构建。本领域技术人员构建一个合适的腺关联病毒载体,以此携带和共表达小发夹RNA,该小发夹RNA可以抑制PD1或CTLA4基因的表达。
根据本发明的实施例,本发明实施例的腺关联病毒载体(AAV)可使用一种或多种为人熟知的血清类型腺关联病毒载体的DNA构建。本领域技术人员构建一个合适的腺关联病毒载体,以此携带和共表达小发夹RNA,该小发夹RNA可以抑制PD1或CTLA4基因的表达。
另外,根据本发明的实施例,本发明实施例的也包含微基因。微基因意味着用组合(选定的核苷酸序列和可操作的必要的相关连接序列)来指导转化、转录和/或基因产物在体内或体外的宿主细胞中的表达。应用“可操作的连接”序列包含连续目的基因的表达控制序列,和作用于反式或远距离控制目的基因的表达控制序列。
另外,本发明实施例的载体还包括常规控制元素,在和质粒载体一起的细胞转染或/和病毒载体一起的细胞感染中,这些元素允许转录、转化和/或小发夹RNA的表达。大量的表达控制序列(包括天然的,可诱导和/或特定组织的启动子)可能被使用。根据本发明的实施例,表达shRNA的启动子为RNA聚合酶启动子。同时,根据本发明的实施例,启动子为选自U6,H1,polI,polII和polIII的RAN聚合酶启动子。根据本发明的实施例,启动子为组织特异型启动子。根据本发明的实施例,启动子为诱导型启动子。根据本发明的实施例,启动子为选自基于所选载体的启动子。根据本发明的实施例,当选择慢病毒载体时,启动子为U6,H1,CMV IE基因,EF-1α,泛素C,或磷酸甘油激酶(PGK)启动子。其他常规表达控制序列包括可选标记或报告基因,包括编码遗传霉素,潮霉素,氨苄青霉素或嘌呤霉素耐药性等的核苷酸序列。载体的其他组件包括复制起点。
构建载体的技术为本领域技术人员所熟知的,这些技术包括常规克隆技术,例如在本发明实施例中所使用的shRNA、聚合酶链反应和任何适当的提供所需的核苷酸序列的方法。
根据本发明的实施例,发明人构建了共表达小发夹RNA(shRNA)(用来抑制免疫检查点)以及嵌合抗原受体(CAR)的病毒载体。本发明实施例的运送沉默PD1或CTLA4的siRNA的小发夹RNA以及表达嵌合抗原受体(CAR)的病毒载体或质粒是复合的,此病毒载体或质粒可结合聚合物或其他材料来增加其稳定性,或协助其靶向运动。
制备转基因淋巴细胞的方法
本发明提出了一种制备前面所述的T淋巴细胞或者转基因淋巴细胞的方法。根据本发明的实施例,所述方法包括:将前面所述的构建体或者前面所述的慢病毒引入到淋巴细胞中或者T淋巴细胞。引入方式可以选自电转或病毒感染宿主细胞的方式引入。所述构建体或慢病毒成功引入上述淋巴细胞或者T淋巴细胞中,实现了淋巴细胞的细胞表面免疫检查被沉默和抗CD19的嵌合抗原受体的表达,从而使得所得淋巴细胞或T淋巴细胞对肿瘤细胞的靶向杀伤作用更强。
治疗癌症的治疗组合物
本发明的提出了一种用于治疗癌症的治疗组合物。根据本发明的实施例,所述治疗组合物包括:上述构建体、慢病毒、T淋巴细胞或者转基因淋巴细胞。上述任意一种治疗组合物的组成均可实现转基因淋巴细胞或T淋巴细胞的细胞表面免疫检查点的沉默和抗CD19嵌合抗原受体在转基因淋巴细胞或T淋巴细胞中的高效表达,从而使得所得转基因淋巴细胞或T淋巴细胞对肿瘤细胞的靶向杀伤作用更强。
提供给患者的这些治疗组合物,较好的应用于生物兼容溶液或可接受的药学运载载体。作为准备的各种治疗组合物被悬浮或溶解在医药上或生理上可接受的载体,如生理盐水;等渗的盐溶液或其他精于此道的人的比较明显的配方中。适当的载体在很大程度上取决于给药途径。其他有水和无水的等渗无菌注射液和有水和无水的无菌悬浮液,是医药上可接受的载体。
足够数量的病毒载体被转导入靶向T细胞中,并提供足够强度的转基因,沉默PD1或CTLA4和表达特有的抗CD19嵌合抗原受体。治疗试剂的剂量主要取决于治疗状况,年龄,体重,病人的健康程度,从而可能造成病人的变异性。
沉默PD1或CTLA4或沉默PD1和CTLA4和表达特有的CD19嵌合抗原受体的这些方法是联合治疗的一部分。这些病毒载体和用于过继免疫治疗的抗肿瘤T细胞,可以被单独或结合其他治疗癌症的方法一起执行。在合适的条件下,一个治疗方法的发明包括使用一个或多个药物疗法。
根据本发明的实施例,所述癌症包括选自B细胞淋巴瘤或B细胞白血病的至少之一。细胞表面免疫检查点的沉默和抗CD19的嵌合抗原受体在转基因淋巴细胞或T淋巴细胞中的高效表达,使得所得淋巴细胞或T淋巴细胞的细胞因子产生以及对对B细胞淋巴瘤或白血病的CD19+肿瘤细胞的靶向杀伤作用更强。
提高淋巴细胞活性的方法
本发明提出了一种提高淋巴细胞活性的方法,根据本发明的实施例,所述淋巴细胞携带嵌合抗原受体,其特征在于,所述方法包括:使所述淋巴细胞的细胞表面免疫检查点被沉默,所述细胞表面免疫检查点、所述淋巴细胞和所述嵌合抗原受体是如前所定义的,所述淋巴细胞活性所述淋巴细胞活性包括所述淋巴细胞的细胞因子的分泌能力和所述淋巴细胞杀伤肿瘤细胞能力的至少一种。根据本发明的实施例,淋巴细胞的细胞表面免疫检查点被沉默,细胞因子分泌增多,对肿瘤细胞的靶向杀伤作用更强。
下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。
本领域技术人员将会理解,下面的实施例仅用于说明本发明,而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的,按照本领域内的文献所描述的技术或条件(例如参考J.萨姆布鲁克等著,黄培堂等译的《分子克隆实验指南》,第三版,科学出版社)或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者,均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1
本发明实施例中所用到的细胞系和基本实验技术如下所述:
细胞系
实施例中用到下述细胞系:OCI-LY3细胞(CD19+弥漫性大B细胞淋巴瘤细胞系(DLBCL)),Jurkat细胞(CD19-T淋巴细胞瘤细胞系),和K562(自然杀伤细胞的靶细胞)。以上细胞均都来自于ATCC(美国细胞库)及DSMZ(德国细胞库),并且培养于加有10%或20%胎牛血清和2毫升的左旋谷胺酰胺的RPMI–1640培养基中(购自Gibco-BRL,San Francisco,CA,USA)。
慢病毒的产生和人T淋巴细胞的转导
产生复制缺陷的慢病毒载体,并将慢病毒载体离心收集用于人T淋巴细胞的转导。下面简要介绍慢病毒载体的产生、收集的实验过程:将293T细胞铺在底面积为150-平方厘米的细胞培养皿中,并根据说明书,使用Express-In(购自Open Biosystems/Thermo Scientific,Waltham,MA)对293T细胞进行病毒转导。每盘细胞加入15μg的慢病毒转基因质粒、5μg的pVSV-G(VSV糖蛋白表达质粒)、10μg的pCMVR8.74质粒(Gag/Pol/Tat/Rev表达质粒)和174μl的Express-In(浓度为1μg/μl)。分别于24小时和48小时收集上清,并使用超速离心机在28,000rpm(离心机转子为Beckman SW 32Ti,购自Beckman Coulter,Brea,CA)的条件下离心2小时。最后用0.75ml的RPMI-1640培养基对病毒质粒沉淀进行重悬。
从健康志愿者供体上分离人原代T淋巴细胞。人T淋巴细胞培养在RPMI-1640培养基中并使用抗CD3和CD28的单克隆抗体包被的磁珠(购自Invitrogen,Carlsbad,CA)进行刺激激活。人T淋巴细胞激活后的18~24小时,采用自旋-接种的方法对T淋巴细胞进行转导,转导过程如下所述:在24-孔板中,每孔铺有0.5×106T淋巴细胞,向每孔细胞中加入0.75ml的上述重悬的病毒上清和Polybrene(浓度为8μg/ml)。细胞和病毒质粒的混合液在台式离心机(购自Sorvall ST 40;Thermo Scientific)中离心,离心条件是室温,2500rpm,时间为90分钟。人重组白细胞介素-2(IL-2;购自Novartis,Basel,Switzerland)每隔2~3天加入T淋巴细胞培养液中,IL-2的终浓度为100-IU/ml,在T淋巴细胞培养过程中,保持细胞的密度为0.5×106~1×106/ml。一旦被转导的T淋巴细胞出现休眠,例如细胞生长速度变慢和细胞变小,其中,细胞生长速度和大小是通过Multisizer 3 Coulter Counter(购自Beckman Coulter)评估的,或被转导的T淋巴细胞在某个计划的时间点上,T淋巴细胞即可用来做功能分析。
本申请的实施例中所用的流式细胞仪为BD FACSCanto II(购自BD Biosciences),并且流式细胞分析数据使用FlowJo version 7.2.5软件(购自Tree Star,Ashland,OR)进行分析。
测定细胞因子的分泌
在慢病毒载体转导T细胞(细胞个数是1×106/孔)与OCI-LY3淋巴瘤细胞(OCI-LY3细胞表达CD19和PD-L1)共培养,实验过程中改变不同的效靶细胞比例。应用特定的酶联免疫吸附测定法(细胞因子酶联免疫吸附测试剂盒,购自R&D Systems,Inc.,Minneapolis,MN,USA)检测细胞上清液中细胞因子的产量。上述细胞上清液取自培养了24小时、48小时和72小时之后的细胞的上清,测定结果用来衡量有代表性的细胞因子(干扰素-γ)(IFNγ)的产量。
简要测定过程如下:酶标板中加入100微升/孔的作为一系列标准对照的细胞因子稀释溶液(如IFNγ)或待测细胞上清溶液,并将酶标板在室温下放置2小时。2小时后吸弃酶标板中溶液并用400微升的洗液润洗酶标板,润洗四次。润洗后,向酶标板每个孔中加入200微升的酶联抗细胞因子抗体。继续在室温下放置2个小时,之后向每孔中加入200微升的底物溶液。加入底物溶液后,将酶标板在室温下放置30分钟,之后,向每孔中加入50微升的终止反应液。在30分钟内测定酶标板每孔的光密度。酶标仪设置在450nm。
铬释放实验
实施例中应用4–小时51铬释放法分析评估表达抗CD19嵌合抗原受体T细胞的细胞毒活性。
具体步骤如下:目标测试细胞用51Cr在37摄氏度下标记1小时。标记后,用含有10%胎牛血清(FCS)的RPMI培养基润洗细胞。润洗后,将细胞重悬在相同的培养基中,重悬细胞的浓度是1×105/ml。转导后T细胞以不同的效靶细胞比值(E:T)加入目标测试细胞悬浮液中,并将细胞种在96-孔中,每孔体积是200微升。将细胞培养在37度培养箱中培养4小时。4小时后,从每孔中取出30微升的上清放于计数器的96-微孔板进行计数分析。分析仪器是顶级计数NXT微闪烁计数器(购自Packard Bioscience)。所有计数孔中效应细胞的数目是基于T细胞总数来计算的。被标记的目标测试细胞包括OCI-LY3(CD19+,PD-L1+),和Jurkat(CD19–)细胞.
实施例2 构建共表达PD1-shRNA和抗CD19嵌合抗原受体的载体
本实施例中,发明人将编码有抗人体CD19的单链抗体的序列、CD28胞内段和T细胞受体组合的ζ-链序列克隆到LV慢病毒载体上,克隆过程中,选择的限制性酶切是XbaI和NotI双酶切,以及NotI和XhoI双酶切,通过酶切、连接、筛选和目的质粒的扩增,生成连接有编码抗CD19嵌合抗原受体核苷酸序列的慢病毒质粒(LV-CD19 CAR);U6启动子和PD1-shRNA(shPD1)的序列被克隆进上述LV-CD19 CAR的慢病毒质粒,生成连接有shPD1序列和编码抗CD19嵌合抗原受体的核苷酸序列的慢病毒质粒(LV-CD19 CAR-shPD1)。载体示意图如图1所示。图1显示了构建相关LV慢病毒载体的示意图(包含U6启动子、编码人体shPD1的序列和编码抗CD19嵌合抗原受体序列)。
实施例3 共表达PD1-shRNA和抗CD19嵌合抗原受体的T细胞的靶向杀伤能力增强
在本实施例中,外周血淋巴细胞取自不记名供血者。外周血淋巴细胞通过梯度离心进行分离,梯度离心机为Ficoll-Hypaque。T淋巴细胞与T细胞激活因子磁珠CD3/CD28(购自Invitrogen,Carlsbad,CA)在5%CO2、37摄氏度下孵育培养72小时,培养基是加有2mmol/L谷氨酰胺,10%高温灭活的胎牛血清(FCS)(购自Sigma-Aldrich Co.)和100U/ml的青霉素/链霉素双抗的RPMI培养基1640(购自Invitrogen Gibco Cat.no.12633-012)。激活培养72小时后,用洗液润洗细胞,将磁珠洗去。将T细胞种在铺有重组纤连蛋白片段(FN ch-296;Retronectin)细胞培养皿上,并用慢病毒载体转导,转导载体分别为LV-CD19 CAR-shPD1,LV-CD19 CAR,LV-shPD1或空载(LV-GFP)。转导过程如实施例1所述。转导后的T细胞培养在RPMI-1640培养基中并用重组人类IL-2因子(100ng/ml;购自R&D Systems)进行诱导扩增7-10天,然后进行功能测试实验。发明人测量转导了不同慢病毒载体转导的T细胞对(CD19-和CD19+)淋巴瘤细胞的杀伤作用,效靶细胞比例是10:1,测量方法采用标准4–小时51铬释放法,4–小时51铬释放法如实施例1所述。结果如图2所示。
如图2结果所示,共表达shPD1和抗CD19嵌合抗原受体的人T细胞比单独表达抗CD19嵌合抗原受体或shPD1的T细胞,可更为有效的杀死OCI-LY3淋巴瘤细胞(CD19+,PDL1+)。单独表达shPD1的T细胞对CD19+淋巴瘤细胞没有明显的细胞毒性。表达抗CD19嵌合抗原受体的T细胞或共表达shPD1和抗CD19嵌合抗原受体的T细胞对Jurkat(CD19-)淋巴瘤细胞没有显著杀伤作用。空载质粒转导T淋巴细胞(对照T淋巴细胞)对CD19+或CD19-淋巴瘤细胞均为明显杀伤作用。
实施例4 共表达shPD1和抗CD19嵌合抗原受体的T淋巴细胞具有细胞因子分泌更的特点
在T淋巴细胞激活因子磁珠CD3/CD28存在下,被激活的T淋巴细胞经过慢病毒载体转导、体外扩增培养,方法如上所述.在慢病毒载体转导T细胞(细胞个数是1×106/孔)与CD19+/PDL1+的OCI-LY3淋巴瘤细胞共培养,3天后,用酶联免疫吸附(ELISA)法评估细胞因子的分泌和细胞的活性,ELISA实验方法如实施例1所述。实验结果如图3所示。图3结果表明,转导了LV-CD19 CAR-shPD1的T淋巴细胞比转导了LV-CD19 CAR或LV-shPD1载体的T淋巴细胞分泌更多的IFNγ(P<0.05;LV-CD19 CAR-shPD1 vs.LV-CD19 CAR)。
实施例5 共表达CTLA4-shRNA和抗CD19嵌合抗原受体的T细胞和共表达CTLA4-shRNA、PD1-shRNA和抗CD19嵌合抗原受体的T细胞的靶向杀伤能力增强,并且具有细胞因子分泌更多的特点
在本实施例中,发明人还考察共表达CTLA4-shRNA和抗CD19嵌合抗原受体的T细胞的靶向杀伤能力、细胞因子分泌能力,实验过程与实施例3和实施例4相同,实验结论与共表达PD1-shRNA和抗CD19嵌合抗原受体的T细胞类似,即共表达CTLA4-shRNA和抗CD19嵌合抗原受体的T细胞比单独表达抗CD19嵌合抗原受体或CTLA4-shRNA的T细胞的靶向杀伤能力增强,细胞因子分泌增多。
发明人还考察共表达CTLA4-shRNA、PD1-shRNA和抗CD19嵌合抗原受体的T细胞的靶向杀伤能力、细胞因子分泌能力,实验过程与实施例3和实施例4相同,发现共表达CTLA4-shRNA、PD1-shRNA和抗CD19嵌合抗原受体的T细胞的靶向杀伤能力和细胞因子分泌能力强于共表达CTLA4-shRNA和抗CD19嵌合抗原受体的T细胞或共表达PD1-shRNA和抗CD19嵌合抗原受体的T细胞。
在本说明书的描述中,参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中,对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且,描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外,在不相互矛盾的情况下,本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例,可以理解的是,上述实施例是示例性的,不能理解为对本发明的限制,本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。
Claims (25)
1.一种T淋巴细胞,其特征在于,所述T淋巴细胞的细胞表面免疫检查点被沉默;
以及表达嵌合抗原受体,其中,
所述嵌合抗原受体包括:
胞外区,所述胞外区包括单链抗体的重链可变区和轻链可变区,所述单链抗体特异性识别抗原CD19;
跨膜区,所述跨膜区与所述胞外区相连,并且嵌入到所述T淋巴细胞的细胞膜中;
胞内区,所述胞内区与所述跨膜区相连,并且所述胞内区包括CD28的胞内段以及CD3ζ链。
2.一种慢病毒,其特征在于,所述慢病毒携带下列核酸分子:
编码嵌合抗原受体的核酸分子,所述嵌合抗原受体具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列;以及
沉默细胞表面免疫检查点的核酸分子,所述沉默细胞表面免疫检查点的核酸分子的核苷酸序列为选自SEQ ID NO:3~68的至少之一。
3.一种慢病毒,其特征在于,所述慢病毒携带含有SEQ ID NO:69所示的核苷酸序列。
4.一种慢病毒,其特征在于,所述慢病毒携带含有SEQ ID NO:70所示的核苷酸序列。
5.一种慢病毒,其特征在于,所述慢病毒携带含有SEQ ID NO:71所示的核苷酸序列。
6.一种转基因淋巴细胞,其特征在于,所述淋巴细胞细胞表面免疫检查点被沉默;以及表达嵌合抗原受体,
其中,所述嵌合抗原受体包括:
胞外区,所述胞外区能够与抗原特异性结合;
跨膜区;以及
胞内区,所述胞内区包括免疫共刺激分子胞内段,
所述抗原是肿瘤抗原,
所述胞外区包括抗体的重链可变区和轻链可变区,所述抗体结合所述抗原,所述抗体为单链抗体,所述抗原为CD19。
7.根据权利要求6所述的转基因淋巴细胞,其特征在于,所述淋巴细胞细胞表面免疫检查点独立地选自CTLA4、PD1、TIM3、BTLA、LAG3的至少之一。
8.根据权利要求6所述的转基因淋巴细胞,其特征在于,所述淋巴细胞细胞表面免疫检查点被沉默是通过shRNA、反义核酸、核酶、显性负突变和锌指核酸酶至少之一实现的。
9.根据权利要求6所述的转基因淋巴细胞,其特征在于,所述免疫共刺激分子胞内段独立地选自4-1BB、OX-40、CD40L、CD27、CD30、CD28以及他们的衍生物的至少一种。
10.根据权利要求7所述的转基因淋巴细胞,其特征在于,所述淋巴细胞细胞表面免疫检查点是CTLA4或PD1。
11.根据权利要求8所述的转基因淋巴细胞,其特征在于,所述淋巴细胞细胞表面免疫检查点被沉默是通过shRNA实现的。
12.根据权利要求9所述的转基因淋巴细胞,其特征在于,所述免疫共刺激分子胞内段是4-1BB或CD28的胞内段。
13.根据权利要求6所述的转基因淋巴细胞,其特征在于,所述淋巴细胞是CD3+T淋巴细胞。
14.根据权利要求6所述的转基因淋巴细胞,其特征在于,所述淋巴细胞是自然杀伤细胞。
15.根据权利要求6所述的转基因淋巴细胞,其特征在于,所述淋巴细胞是自然杀伤T细胞。
16.一种构建体,其特征在于,所述构建体包括:
第一核酸分子,所述第一核酸分子沉默细胞表面免疫检查点;以及
第二核酸分子,所述第二核酸分子编码嵌合抗原受体,
其中,所述细胞表面免疫检查点和所述嵌合抗原受体是如权利要求6~15任一项中所定义的。
17.根据权利要求16所述的构建体,其特征在于,所述第一核酸分子与所述第二核酸分子被设置为在权利要求6~15任一项所述的淋巴细胞中沉默细胞表面免疫检查点和表达所述嵌合抗原受体。
18.根据权利要求17所述的构建体,其特征在于,进一步包括:
第一启动子,所述第一启动子与所述第一核酸分子可操作地连接;以及
第二启动子,所述第二启动子与所述第二核酸分子可操作地连接。
19.根据权利要求18所述的构建体,其特征在于,所述第一启动子和所述第二启动子分别独立地选自U6,H1,CMV,EF-1,RSV启动子。
20.根据权利要求16所述的构建体,其特征在于,所述构建体的载体是非致病性病毒载体。
21.根据权利要求20所述的构建体,其特征在于,所述非致病性病毒载体选自反转录病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体、腺关联病毒载体的至少之一。
22.一种制备权利要求1所述的T淋巴细胞或者权利要求6~15任一项所述的转基因淋巴细胞的方法,其特征在于,包括:
将权利要求16~21任一项所述的构建体或者权利要求2~5任一项所述的慢病毒引入到淋巴细胞中或者T淋巴细胞。
23.一种用于治疗癌症的治疗组合物,其特征在于,包括:
权利要求16~21任一项所述的构建体、权利要求2~5任一项所述的慢病毒、权利要求1所述的T淋巴细胞或者权利要求6~15任一项所述的转基因淋巴细胞。
24.根据权利要求23所述的治疗组合物,其特征在于,所述癌症包括选自B细胞淋巴瘤和B细胞白血病的至少之一。
25.一种提高淋巴细胞活性的方法,所述淋巴细胞携带嵌合抗原受体,其特征在于,所述方法包括:使所述淋巴细胞的细胞表面免疫检查点被沉默,
所述细胞表面免疫检查点、所述淋巴细胞和所述嵌合抗原受体是如权利要求6~15任一项中所定义的,
所述淋巴细胞活性包括所述淋巴细胞的细胞因子的分泌能力和所述淋巴细胞杀伤肿瘤细胞能力的至少一种。
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