JP7217970B2 - 融合タンパク質を用いてｔ細胞受容体をリプログラミングするための組成物及び方法 - Google Patents

融合タンパク質を用いてｔ細胞受容体をリプログラミングするための組成物及び方法 Download PDF

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Description

相互参照
本出願は、２０１６年１０月７日に出願された米国仮出願第６２／４０５，５５１号、及び、２０１７年５月２３日に出願された米国仮出願第６２／５１０，１０８号の利益を主張するものであり、それら出願の全内容を、参照により本明細書に援用する。
末期の固形腫瘍を有するほとんどの患者は、標準的治療では治癒不可能である。加えて、従来の治療法の選択肢は、多くの場合、重篤な副作用がある。がん性細胞を拒絶するために患者の免疫系を誘導する数多くの試み、別名、がん免疫療法と呼ばれている方法が行われている。しかしながら、幾つかの障害が、その臨床効果の達成を困難なものにしている。何百ものいわゆる腫瘍抗原が特定されているが、これらは多くの場合、自己由来であるため、がん免疫療法を健康な組織に対して実施する可能性もあるし、あるいは、免疫原性に乏しい。さらに、がん細胞は、多重機構を用いて、それら自身を見えなくしたり、あるいは、がん免疫療法での免疫攻撃の開始及び伝播に敵対したりする。
がん細胞の適切な細胞表面分子に、遺伝子操作したＴ細胞に改めて指示をするキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）変性自己Ｔ細胞治療を用いた最近の展開は、免疫系の作用を、Ｂ細胞悪性腫瘍の処置において利用することが期待できる結果を示している（例えば、Ｓａｄｅｌａｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ３：３８８－３９８（２０１３）を参照されたい）。ＣＤ１９特異的ＣＡＲ Ｔ細胞（別名、ＣＴＬ０１９）での臨床結果は、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）ならびに小児急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）の患者に完全寛解を示した（例えば、Ｋａｌｏｓ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ ３：９５ｒａ７３（２０１１）， Ｐｏｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＮＥＪＭ ３６５：７２５－７３３（２０１１），Ｇｒｕｐｐ ｅｔ ａｌ．，ＮＥＪＭ ３６８：１５０９－１５１８（２０１３）を参照されたい）。代替的な方法は、自己Ｔ細胞の遺伝子操作のために、腫瘍－関連ペプチド抗原に選ばれたＴ細胞受容体（ＴＣＲ）アルファ及びベータ鎖の使用である。これらのＴＣＲ鎖は、完全なＴＣＲ複合体を形成し、そして、当該Ｔ細胞に第二の定義された特異性に対するＴＣＲをもたらす。ＮＹ－ＥＳＯ－１特異的ＴＣＲアルファ及びベータ鎖を発現する改変自己Ｔ細胞によって、滑膜癌の患者で有望な結果が得られた。
ＣＡＲまたは第二のＴＣＲを発現する遺伝子組換えＴ細胞に関するインビトロ／エキソビボでそれぞれの標的細胞を認識及び破壊する能力に加えて、改変Ｔ細胞を用いた患者の治療の成功には、当該Ｔ細胞に強力な活性化、増殖、経時的な持続性の能力があること、及び、再発性疾患の場合、「記憶」応答を有効にすることを必要とする。ＣＡＲ Ｔ細胞の高度で扱いやすい臨床効果は、現在のところ、ＢＣＭＡ－及びＣＤ－１９－陽性Ｂ細胞悪性腫瘍、及び、ＨＬＡ－Ａ２を発現するＮＹ－ＥＳＯ－１－ペプチド発現滑膜肉腫患者に限定されている。遺伝子操作されたＴ細胞を、様々なヒトの悪性腫瘍に対して、より広く作用するように改良する明確な必要性がある。本明細書では、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ３ガンマ、及び、ＣＤ３デルタを含むＴＣＲサブユニット、ならびに、既存の方法の限界を克服する可能性を有する細胞表面抗原に特異的な結合ドメインを備えたＴＣＲアルファ及びＴＣＲベータ鎖の新規の融合タンパク質を記載している。本明細書では、ＣＡＲよりも標的細胞を効率的に死滅するが、炎症性サイトカインを同等またはそれよりも低レベルで放出する新規の融合タンパク質を記載している。これらサイトカイン値の上昇は、養子ＣＡＲ－Ｔ療法に対する用量制限毒性と関連しているため、これらの融合タンパク質及びそれらの使用方法は、ＣＡＲと比較して、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）融合タンパク質（ＴＦＰ）の有効性を示す。
本明細書では、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）融合タンパク質（ＴＦＰ）、１つ以上のＴＦＰを発現するように改変されたＴ細胞、及び、疾患の処置のためにそれらを使用する方法を提供する。
ある態様において、本明細書では、ＴＣＲサブユニットと、抗メソテリン抗原結合ドメインを含むヒトまたはヒト化抗体ドメインとを含む、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）融合タンパク質（ＴＦＰ）をコードする単離した組換え核酸分子を提供する。
ある態様において、本明細書では、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）融合タンパク質（ＴＦＰ）をコードする単離した組換え核酸分子であって、当該ＴＦＰが、ＴＣＲ細胞外ドメインの少なくとも一部、及び、ＣＤ３イプシロンの細胞内シグナル伝達ドメイン由来の刺激ドメインを含むＴＣＲ細胞内ドメインを含むＴＣＲサブユニット、ならびに、抗原結合ドメインを含むヒトまたはヒト化抗体ドメインを含み、当該ＴＣＲサブユニット及び当該抗体ドメインを、作動可能に連結し、当該ＴＦＰは、Ｔ細胞で発現する際にＴＣＲを取り込む、当該分子を提供する。
ある態様において、本明細書では、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）融合タンパク質（ＴＦＰ）をコードする単離した組換え核酸分子であって、当該ＴＦＰが、ＴＣＲ細胞外ドメインの少なくとも一部、及び、ＣＤ３ガンマの細胞内シグナル伝達ドメイン由来の刺激ドメインを含むＴＣＲ細胞内ドメインを含むＴＣＲサブユニット、ならびに、抗原結合ドメインを含むヒトまたはヒト化抗体ドメインを含み、当該ＴＣＲサブユニット及び当該抗体ドメインを、作動可能に連結し、当該ＴＦＰは、Ｔ細胞で発現する際にＴＣＲを取り込む、当該分子を提供する。
ある態様において、本明細書では、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）融合タンパク質（ＴＦＰ）をコードする単離した組換え核酸分子であって、当該ＴＦＰが、ＴＣＲ細胞外ドメインの少なくとも一部、及び、ＣＤ３デルタの細胞内シグナル伝達ドメイン由来の刺激ドメインを含むＴＣＲ細胞内ドメインを含むＴＣＲサブユニット、ならびに、抗原結合ドメインを含むヒトまたはヒト化抗体ドメインを含み、当該ＴＣＲサブユニット及び当該抗体ドメインを、作動可能に連結し、当該ＴＦＰは、Ｔ細胞で発現する際にＴＣＲを取り込む、当該分子を提供する。
ある態様において、本明細書では、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）融合タンパク質（ＴＦＰ）をコードする単離した組換え核酸分子であって、当該ＴＦＰが、ＴＣＲ細胞外ドメインの少なくとも一部、及び、ＴＣＲアルファの細胞内シグナル伝達ドメイン由来の刺激ドメインを含むＴＣＲ細胞内ドメインを含むＴＣＲサブユニット、ならびに、抗原結合ドメインを含むヒトまたはヒト化抗体ドメインを含み、当該ＴＣＲサブユニット及び当該抗体ドメインを、作動可能に連結し、当該ＴＦＰは、Ｔ細胞で発現する際にＴＣＲを取り込む、当該分子を提供する。
ある態様において、本明細書では、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）融合タンパク質（ＴＦＰ）をコードする単離した組換え核酸分子であって、当該ＴＦＰが、ＴＣＲ細胞外ドメインの少なくとも一部、及び、ＴＣＲベータの細胞内シグナル伝達ドメイン由来の刺激ドメインを含むＴＣＲ細胞内ドメインを含むＴＣＲサブユニット、ならびに、抗原結合ドメインを含むヒトまたはヒト化抗体ドメインを含み、当該ＴＣＲサブユニット及び当該抗体ドメインを、作動可能に連結し、当該ＴＦＰは、Ｔ細胞で発現する際にＴＣＲを取り込む、当該分子を提供する。
ある態様において、本明細書では、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）融合タンパク質（ＴＦＰ）をコードする単離した組換え核酸分子であって、該ＴＦＰがＴＣＲサブユニット及び、抗メソテリン抗原結合ドメインである抗原結合ドメインを含むヒトまたはヒト化抗体ドメインを含む、当該分子を提供する。
幾つかの例では、当該ＴＣＲサブユニット及び当該抗体ドメインを、作動可能に連結する。幾つかの例では、当該ＴＦＰは、Ｔ細胞で発現する際にＴＣＲを取り込む。幾つかの例では、コードした当該抗原結合ドメインは、リンカー配列で、当該ＴＣＲ細胞外ドメインと連結する。幾つかの例では、コードした当該リンカー配列は、（Ｇ４Ｓ）ｎを含み、式中、ｎ＝１～４である。幾つかの例では、当該ＴＣＲサブユニットは、ＴＣＲ細胞外ドメインを含む。幾つかの例では、当該ＴＣＲサブユニットは、ＴＣＲ膜貫通ドメインを含む。幾つかの例では、当該ＴＣＲサブユニットは、ＴＣＲ細胞内ドメインを含む。幾つかの例では、当該ＴＣＲサブユニットは、（ｉ）ＴＣＲ細胞外ドメイン、（ｉｉ）ＴＣＲ膜貫通ドメイン、及び、（ｉｉｉ）ＴＣＲ細胞内ドメインを含み、（ｉ）、（ｉｉ）、及び（ｉｉｉ）の内の少なくとも２つは同じＴＣＲサブユニットに由来する。幾つかの例では、当該ＴＣＲサブユニットは、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ３ガンマ、もしくはＣＤ３デルタの細胞内シグナル伝達ドメインから選択される刺激ドメイン、または、それらに対する少なくとも１つ、２つ、または、３つの修飾を有するアミノ酸配列を含むＴＣＲ細胞内ドメインを含む。幾つかの例では、当該ＴＣＲサブユニットは、４－１ＢＢの機能的シグナル伝達ドメイン、及び／または、ＣＤ３ゼータの機能的シグナル伝達ドメインから選択される刺激ドメイン、または、それらに対する少なくとも１つの修飾を有するアミノ酸配列を含む細胞内ドメインを含む。幾つかの例では、当該ヒトまたはヒト化抗体ドメインは、抗体断片を含む。幾つかの例では、当該ヒトまたはヒト化抗体ドメインは、ｓｃＦｖまたはＶＨドメインを含む。幾つかの例では、当該単離した核酸分子は、（ｉ）本明細書に記載した抗メソテリン軽鎖結合ドメインの軽鎖（ＬＣ）ＣＤＲ１、ＬＣ ＣＤＲ２、及び、ＬＣ ＣＤＲ３に対して、それぞれ、７０～１００％の配列同一性を有する、抗メソテリン軽鎖結合ドメインアミノ酸配列の軽鎖（ＬＣ）ＣＤＲ１、ＬＣ ＣＤＲ２、及び、ＬＣ ＣＤＲ３、及び／または、（ｉｉ）本明細書に記載した抗メソテリン重鎖結合ドメインの重鎖（ＨＣ）ＣＤＲ１、ＨＣ ＣＤＲ２、及び、ＨＣ ＣＤＲ３に対して、それぞれ、７０～１００％の配列同一性を有する、抗メソテリン重鎖結合ドメインアミノ酸配列の重鎖（ＨＣ）ＣＤＲ１、ＨＣ ＣＤＲ２、及び、ＨＣ ＣＤＲ３をコードする。幾つかの例では、当該単離した核酸分子は、軽鎖可変領域をコードし、当該軽鎖可変領域が、本明細書に記載した軽鎖可変領域の軽鎖可変領域アミノ酸配列の少なくとも１つ、最大で３０個までの修飾を有するアミノ酸配列、または、本明細書に記載した軽鎖可変領域の軽鎖可変領域アミノ酸配列に対して９５～９９％が同一である配列を含む。幾つかの例では、当該単離した核酸分子は、重鎖可変領域をコードし、当該重鎖可変領域が、本明細書に記載した重鎖可変領域の重鎖可変領域アミノ酸配列の少なくとも１つ、最大で３０個までの修飾を有するアミノ酸配列、または、本明細書に記載した重鎖可変領域の重鎖可変領域アミノ酸配列に対して９５～９９％が同一である配列を含む。幾つかの例では、当該ＴＦＰは、ＴＣＲアルファ鎖、ＴＣＲベータ鎖、ＣＤ３イプシロンＴＣＲサブユニット、ＣＤ３ガンマＴＣＲサブユニット、ＣＤ３デルタＴＣＲサブユニット、それらの機能的断片、及び、少なくとも１つ、最大で２０個までの修飾を有するそれらのアミノ酸配列からなる群から選択されるタンパク質の細胞外ドメイン、または、その一部を含むＴＣＲサブユニットの細胞外ドメインを含む。幾つかの例では、コードした当該ＴＦＰは、ＴＣＲアルファ鎖、ＴＣＲベータ鎖、ＣＤ３イプシロンＴＣＲサブユニット、ＣＤ３ガンマＴＣＲサブユニット、ＣＤ３デルタＴＣＲサブユニット、それらの機能的断片、及び、少なくとも１つ、最大で２０個までの修飾を有するそれらのアミノ酸配列からなる群から選択されるタンパク質の膜貫通ドメインを含む膜貫通ドメインを含む。幾つかの例では、コードした当該ＴＦＰは、ＴＣＲアルファ鎖、ＴＣＲベータ鎖、ＴＣＲゼータ鎖、ＣＤ３イプシロンＴＣＲサブユニット、ＣＤ３ガンマＴＣＲサブユニット、ＣＤ３デルタＴＣＲサブユニット、ＣＤ４５、ＣＤ２、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ２８、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４、それらの機能的断片、及び、少なくとも１つ、最大で２０個までの修飾を有するそれらのアミノ酸配列からなる群から選択されるタンパク質の膜貫通ドメインを含む膜貫通ドメインを含む。幾つかの例では、当該単離した核酸分子は、共刺激ドメインをコードする配列をさらに含む。幾つかの例では、当該共刺激ドメインは、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＣＤ３０、ＬＩＧＨＴ、ＯＸ４０、ＣＤ２、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ－１、ＬＦＡ－１（ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８）、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）、及び、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）、及び、少なくとも１つ、最大で２０個までのそれに対する修飾を有するそれらのアミノ酸配列からなる群から選択されるタンパク質から得られる機能的シグナル伝達ドメインである。幾つかの例では、当該単離した核酸分子は、リーダー配列をさらに含む。幾つかの例では、当該単離した核酸分子は、ｍＲＮＡである。
幾つかの例では、当該ＴＦＰは、ＴＣＲサブユニットの免疫受容活性化チロシンモチーフ（ＩＴＡＭ）を含み、同サブユニットは、ＣＤ３ゼータＴＣＲサブユニット、ＣＤ３イプシロンＴＣＲサブユニット、ＣＤ３ガンマＴＣＲサブユニット、ＣＤ３デルタＴＣＲサブユニット、ＴＣＲゼータ鎖、Ｆｃイプシロン受容体１鎖、Ｆｃイプシロン受容体２鎖、Ｆｃガンマ受容体１鎖、Ｆｃガンマ受容体２ａ鎖、Ｆｃガンマ受容体２ｂ１鎖、Ｆｃガンマ受容体２ｂ２鎖、Ｆｃガンマ受容体３ａ鎖、Ｆｃガンマ受容体３ｂ鎖、Ｆｃベータ受容体１鎖、ＴＹＲＯＢＰ（ＤＡＰ１２）、ＣＤ５、ＣＤ１６ａ、ＣＤ１６ｂ、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ３２、ＣＤ６４、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ８９、ＣＤ２７８、ＣＤ６６ｄ、それらの機能的断片、及び、少なくとも１つ、最大で２０個までのそれらに対する修飾を有するそれらのアミノ酸配列からなる群から選択されるタンパク質のＩＴＡＭまたはその一部を含む。幾つかの例では、当該ＩＴＡＭを、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ３デルタ、または、ＣＤ３イプシロンのＩＴＡＭと置き換える。幾つかの例では、当該ＩＴＡＭを、ＣＤ３ゼータＴＣＲサブユニット、ＣＤ３イプシロンＴＣＲサブユニット、ＣＤ３ガンマＴＣＲサブユニット、及び、ＣＤ３デルタＴＣＲサブユニットからなる群から選択し、かつ、ＣＤ３ゼータＴＣＲサブユニット、ＣＤ３イプシロンＴＣＲサブユニット、ＣＤ３ガンマＴＣＲサブユニット、及び、ＣＤ３デルタＴＣＲサブユニットからなる群から選択される異なるＩＴＡＭと置き換える。
幾つかの例では、当該核酸は、ヌクレオチド類似体を含む。幾つかの例では、当該ヌクレオチド類似体は、２’－Ｏ－メチル、２’－Ｏ－メトキシエチル（２’－Ｏ－ＭＯＥ）、２’－Ｏ－アミノプロピル、２’－デオキシ、Ｔ－デオキシ－２’－フルオロ、２’－Ｏ－アミノプロピル（２’－Ｏ－ＡＰ）、２’－Ｏ－ジメチルアミノエチル（２’－Ｏ－ＤＭＡＯＥ）、２’－Ｏ－ジメチルアミノプロピル（２’－Ｏ－ＤＭＡＰ）、Ｔ－Ｏ－ジメチルアミノエチルオキシエチル（２’－Ｏ－ＤＭＡＥＯＥ）、修飾した２’－Ｏ－Ｎ－メチルアセトアミド（２’－Ｏ－ＮＭＡ）、ロックド核酸（ＬＮＡ）、エチレン核酸（ＥＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、１’，５’－アンヒドロヘキシトール核酸（ＨＮＡ）、モルホリノ、メチルホスホン酸ヌクレオチド、チオールホスホン酸ヌクレオチド、及び、２’－フルオロＮ３－Ｐ５’－ホスホルアミダイトからなる群から選択される。
ある態様において、本明細書では、本明細書で提供した核酸分子がコードした単離したポリペプチド分子を提供する。
ある態様において、本明細書では、ヒトまたはヒト化抗メソテリン結合ドメイン、ＴＣＲ細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び、細胞内ドメインを含む、単離したＴＦＰ分子を提供する。
ある態様において、本明細書では、ヒトまたはヒト化抗メソテリン結合ドメイン、ＴＣＲ細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び、細胞内シグナル伝達ドメインを含む、単離したＴＦＰ分子であって、内因性ＴＣＲ複合体、及び／または、少なくとも１つの内因性ＴＣＲポリペプチドと機能的に相互作用することができる当該ＴＦＰ分子を提供する。
幾つかの実施形態では、当該核酸がコードする抗メソテリン結合ドメインである抗原結合ドメイン、または、当該抗メソテリン結合ドメインを含む抗体、または、当該核酸がコードする当該抗メソテリン結合ドメインを発現する細胞を含む、当該ヒトまたはヒト化抗体ドメインは、最大で、約２００ｎＭ、１００ｎＭ、７５ｎＭ、５０ｎＭ、２５ｎＭ、２０ｎＭ、１５ｎＭ、１４ｎＭ、１３ｎＭ、１２ｎＭ、１１ｎＭ、１０ｎＭ、９ｎＭ、８ｎＭ、７ｎＭ、６ｎＭ、５ｎＭ、４ｎＭ、３ｎＭ、２ｎＭ、１ｎＭ、０．９ｎＭ、０．８ｎＭ、０．７ｎＭ、０．６ｎＭ、０．５ｎＭ、０．４ｎＭ、０．３ｎＭ、０．２ｎＭ、０．１ｎＭ、０．０９ｎＭ、０．０８ｎＭ、０．０７ｎＭ、０．０６ｎＭ、０．０５ｎＭ、０．０４ｎＭ、０．０３ｎＭ、０．０２ｎＭ、または、０．０１ｎＭ、及び／または、少なくとも約１００ｎＭ、７５ｎＭ、５０ｎＭ、２５ｎＭ、２０ｎＭ、１５ｎＭ、１４ｎＭ、１３ｎＭ、１２ｎＭ、１１ｎＭ、１０ｎＭ、９ｎＭ、８ｎＭ、７ｎＭ、６ｎＭ、５ｎＭ、４ｎＭ、３ｎＭ、２ｎＭ、１ｎＭ、０．９ｎＭ、０．８ｎＭ、０．７ｎＭ、０．６ｎＭ、０．５ｎＭ、０．４ｎＭ、０．３ｎＭ、０．２ｎＭ、０．１ｎＭ、０．０９ｎＭ、０．０８ｎＭ、０．０７ｎＭ、０．０６ｎＭ、０．０５ｎＭ、０．０４ｎＭ、０．０３ｎＭ、０．０２ｎＭ、または、０．０１ｎＭ、及び／または、約２００ｎＭ、１００ｎＭ、７５ｎＭ、５０ｎＭ、２５ｎＭ、２０ｎＭ、１５ｎＭ、１４ｎＭ、１３ｎＭ、１２ｎＭ、１１ｎＭ、１０ｎＭ、９ｎＭ、８ｎＭ、７ｎＭ、６ｎＭ、５ｎＭ、４ｎＭ、３ｎＭ、２ｎＭ、１ｎＭ、０．９ｎＭ、０．８ｎＭ、０．７ｎＭ、０．６ｎＭ、０．５ｎＭ、０．４ｎＭ、０．３ｎＭ、０．２ｎＭ、０．１ｎＭ、０．０９ｎＭ、０．０８ｎＭ、０．０７ｎＭ、０．０６ｎＭ、０．０５ｎＭ、０．０４ｎＭ、０．０３ｎＭ、０．０２ｎＭ、または、０．０１ｎＭの親和性値を有する。
ある態様において、本明細書では、ヒトまたはヒト化抗メソテリン結合ドメイン、ＴＣＲ細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び、細胞内シグナル伝達ドメインを含む単離したＴＦＰ分子であって、内因性ＴＣＲ複合体に機能的に統合することができる当該ＴＦＰ分子を提供する。
幾つかの例では、当該単離したＴＦＰ分子は、ヒトまたはヒト化抗メソテリン結合ドメイン、ＴＣＲ細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び、細胞内ドメインを含む抗体または抗体断片を含む。幾つかの例では、当該抗メソテリン結合ドメインは、ｓｃＦｖまたは、ＶＨドメイン、または、ラクダＶＨＨドメインである。幾つかの例では、当該抗メソテリン結合ドメインは、本明細書に記載した重鎖のアミノ酸配列に対して９５～１００％の同一性の有する重鎖、それらの機能的断片、または、少なくとも１つ、最大で３０個までの修飾を有するそれらのアミノ酸配列を含む。幾つかの例では、当該抗メソテリン結合ドメインは、本明細書に記載した軽鎖のアミノ酸配列に対して９５～１００％の同一性の有する軽鎖、それらの機能的断片、または、少なくとも１つ、最大で３０個までの修飾を有するそれらのアミノ酸配列を含む。幾つかの例では、当該単離したＴＦＰ分子は、ＴＣＲアルファ鎖、ＴＣＲベータ鎖、ＣＤ３イプシロンＴＣＲサブユニット、ＣＤ３ガンマＴＣＲサブユニット、ＣＤ３デルタＴＣＲサブユニット、それらの機能的断片、及び、少なくとも１つ、最大で２０個までの修飾を有するそれらのアミノ酸配列からなる群から選択されるタンパク質の細胞外ドメインまたはその一部を含むＴＣＲ細胞外ドメインを含む。幾つかの例では、当該抗メソテリン結合ドメインは、リンカー配列で、当該ＴＣＲ細胞外ドメインと連結する。幾つかの例では、当該リンカー領域は、（Ｇ４Ｓ）ｎを含み、式中、ｎ＝１～４である。
幾つかの例では、当該単離したＴＦＰ分子は、共刺激ドメインをコードする配列をさらに含む。幾つかの例では、当該単離したＴＦＰ分子は、細胞内シグナル伝達ドメインをコードする配列をさらに含む。幾つかの例では、当該単離したＴＦＰ分子は、リーダー配列をさらに含む。
ある態様において、本明細書では、本明細書で提供したＴＦＰをコードする核酸分子を含むベクターを提供する。幾つかの例では、当該ベクターは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、プラスミド、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ベクター、または、レトロウイルスベクターからなる群から選択される。幾つかの例では、当該ベクターは、プロモーターをさらに含む。幾つかの例では、当該ベクターは、インビトロで転写したベクターである。幾つかの例では、当該ベクターの核酸配列は、ポリ（Ａ）尾部をさらに含む。幾つかの例では、当該ベクターの核酸配列は、３’ＵＴＲをさらに含む。
ある態様において、本明細書では、本明細書で提供したベクターを含む細胞を提供する。幾つかの例では、当該細胞は、ヒトＴ細胞である。幾つかの例では、当該Ｔ細胞は、ＣＤ８＋またはＣＤ４＋Ｔ細胞である。幾つかの例では、当該Ｔ細胞は、ガンマデルタＴ細胞である。幾つかの例では、当該Ｔ細胞は、ＮＫ－Ｔ細胞である。幾つかの例では、当該細胞は、阻害分子の少なくとも一部を含む第１のポリペプチドを含み、細胞内シグナル伝達ドメインからのポジティブシグナルを含む第２のポリペプチドと会合した阻害分子をコードする核酸をさらに含む。幾つかの例では、当該阻害分子は、ＰＤ１の少なくとも一部を含む第１のポリペプチドと、共刺激ドメイン及び一次シグナル伝達ドメインを含む第２のポリペプチドとを含む。
ある態様において、本明細書では、ヒトＣＤ８＋またはＣＤ４＋Ｔ細胞であって、少なくとも２つのＴＦＰ分子を含み、当該ＴＦＰ分子が、ヒトまたはヒト化抗メソテリン結合ドメイン、ＴＣＲ細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び、細胞内ドメインを含み、当該ＴＦＰ分子が、当該ヒトＣＤ８＋またはＣＤ４＋Ｔ細胞において、同細胞にて、及び／または、同細胞の表面で、内因性ＴＣＲ複合体、及び／または、少なくとも１つの内因性ＴＣＲポリペプチドと機能的に相互作用することができる当該ヒトＣＤ８＋またはＣＤ４＋Ｔ細胞を提供する。
ある態様において、本明細書では、ヒトまたはヒト化抗メソテリン結合ドメイン、ＴＣＲ細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び、細胞内ドメインを含むＴＦＰ分子、ならびに、少なくとも１つの内因性ＴＣＲ複合体を含むタンパク質複合体を提供する。
幾つかの例では、当該ＴＣＲは、ＴＣＲアルファ鎖、ＴＣＲベータ鎖、ＣＤ３イプシロンＴＣＲサブユニット、ＣＤ３ガンマＴＣＲサブユニット、及び、ＣＤ３デルタＴＣＲサブユニットからなる群から選択されるタンパク質の細胞外ドメイン、または、その一部を含む。幾つかの例では、当該抗メソテリン結合ドメインは、リンカー配列で、当該ＴＣＲ細胞外ドメインと連結する。幾つかの例では、当該リンカー領域は、（Ｇ４Ｓ）ｎを含み、式中、ｎ＝１～４である。
ある態様では、本明細書において、本明細書で提供したタンパク質複合体あたり、少なくとも２つの異なるＴＦＰタンパク質を含むヒトＣＤ８＋またはＣＤ４＋Ｔ細胞を提供する。
ある態様では、本明細書において、本明細書で提供したベクターでＴ細胞に形質導入することを含む、細胞の作製方法を提供する。
ある態様では、本明細書において、インビトロで転写したＲＮＡ、または、合成ＲＮＡを細胞に導入することを含む、ＲＮＡ改変細胞の集団を生成する方法であって、当該ＲＮＡが、本明細書で提供したＴＦＰ分子をコードする核酸を含む、当該方法を提供する。
ある態様では、本明細書において、哺乳動物に抗腫瘍免疫を付与する方法であって、当該哺乳動物に対して、本明細書で提供したＴＦＰ分子を発現する、または、本明細書で提供したポリペプチド分子を発現する有効量の細胞を投与することを含む、当該方法を提供する。
幾つかの例では、当該細胞は、自己Ｔ細胞である。幾つかの例では、当該細胞は、同種異系Ｔ細胞である。幾つかの例では、当該哺乳動物は、ヒトである。
ある態様では、本明細書において、メソテリンの発現に関連した疾患を有する哺乳動物を処置する方法であって、当該哺乳動物に対して、有効量の本明細書に記載したＴＦＰ分子、本明細書に記載した細胞、または、本明細書に記載したポリペプチド分子を投与することを含む、当該方法を提供する。幾つかの例では、メソテリンの発現に関連した当該疾患は、増殖性疾患、がん、悪性腫瘍、及び、メソテリンの発現を伴う非がん関連の適応症からなる群から選択される。幾つかの例では、当該疾患は、中皮腫、腎細胞癌、胃癌、乳癌、肺癌、卵巣癌、前立腺癌、結腸癌、子宮頸癌、脳腫瘍、肝臓癌、膵臓癌、甲状腺癌、膀胱癌、尿管癌、腎臓癌、子宮内膜癌、食道癌、胃癌、胸腺癌、胆管癌、及び、胃癌からなる群より選択されるがんである。
幾つかの例では、当該疾患は、がんである。幾つかの例では、当該疾患は、中皮腫、乳頭状漿液性卵巣腺癌、明細胞卵巣癌、混合型ミュラー管卵巣癌、子宮内膜粘液性卵巣癌、悪性胸膜癌、膵臓腺癌、乳管腺癌、子宮漿液性癌、肺腺癌、肝外胆管癌、胃腺癌、食道腺癌、結腸直腸腺癌、乳腺腺癌、メソテリン発現に関連する疾患、メソテリン発現に関連する疾患、非粘液性卵巣癌、浸潤性管腺癌、肺腺癌、胃／食道癌腺癌、結腸直腸腺癌、白血病、小児急性骨髄性白血病、浸潤性管内乳頭粘液性腫瘍（ＩＰＭＮ）、子宮内膜腺癌、胃／食道腺癌、肺腺癌、乳腺癌、及び、これらの組合せからなる群から選択される。
幾つかの例では、ＴＦＰ分子を発現する当該細胞は、ＴＦＰ分子を発現する細胞の有効性を増大させる作用物質と組み合わせて投与する。幾つかの例において、抗メソテリンキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するＴ細胞の有効量を投与した哺乳動物と比較して、少ないサイトカインを哺乳動物において放出する。幾つかの例では、ＴＦＰ分子を発現する当該細胞を、ＴＦＰ分子を発現する細胞の投与に関連する１つ以上の副作用を軽減する作用物質と組み合わせて投与する。幾つかの例では、ＴＦＰ分子を発現する当該細胞を、メソテリンに関連する疾患を処置する作用物質と組み合わせて投与する。
ある態様において、本明細書で提供した単離した核酸分子、本明細書で提供した単離したポリペプチド分子、本明細書で提供した単離したＴＦＰ、本明細書で提供した複合体、本明細書で提供したベクター、または、本明細書で提供した細胞は、医薬として使用するためのものである。
ある態様において、本明細書では、有効量の本明細書で提供したＴＦＰ分子、本明細書で提供した細胞、または、本明細書で提供したポリペプチド分子を、哺乳動物に投与することを含み、抗メソテリンキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するＴ細胞の有効量を投与した哺乳動物と比較して、少ないサイトカインを哺乳動物において放出する、メソテリンの発現に関連する疾患を有する哺乳動物を処置する方法を提供する。
参照による組み込み
本明細書において引用したすべての刊行物、特許、及び、特許出願を、個々の刊行物、特許、及び、特許出願のそれぞれが、参照により援用されることを個別かつ具体的に明示されているものと同然に、参照により本明細書に援用する。
本発明の新規の特徴は、添付した特許請求の範囲に詳細に記載している。本発明の原理を利用している例示的な実施形態を記載した以下の詳細な説明、ならびに、添付した図面を参照することで、本発明の特徴及び利点についての理解を深める。
本発明のＴ細胞受容体融合ポリペプチド（ＴＦＰ）の使用を実証する概略図である。例示的なＴＦＰは、（Ｇ４Ｓ）３リンカー配列を介して融合した、抗メセテリンｓｃＦｖと、全長ＣＤ３イプシロンポリペプチドとを含む。Ｔ細胞によって産生、または、そこに導入されると、当該ＴＦＰは、内因性Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）の他のポリペプチド（２つのＣＤ３イプシロンポリペプチド、１つのＣＤ３ガンマポリペプチド、１つのＣＤ３デルタポリペプチド、２つのＣＤ３ゼータポリペプチド、１つのＴＣＲアルファサブユニット、及び、１つのＴＣＲベータサブユニットを含むことが示されており、水平方向の灰色セグメントは、原形質膜を表している）と会合して、当該内因性ＣＤ３イプシロンポリペプチドの一方または双方が、当該ＴＦＰによって置換されているリプログラミングしたＴＣＲを形成する。 本発明のリプログラミングしたＴ細胞受容体融合ポリペプチド（ＴＦＰ）の例示的な変化を実証する概略図を示す。ｓｃＦｖ：ＴＣＲ－Ｖαと表記した図は、（Ｇ４Ｓ）３リンカー配列を介して融合した、抗メソテリンｓｃＦｖと、全長ＴＣＲ－Ｖαポリペプチドとを含むＴＦＰを含む例示的なリプログラミングしたＴＣＲを示す。ｓｃＦｖ：ＴＣＲ－Ｖα：ＴＣＲ－Ｖβと表記した図は、ｉ）（Ｇ４Ｓ）３リンカー配列を介して融合した、抗メソテリンｓｃＦｖと全長ＴＣＲ－Ｖαポリペプチド、及び、ｉｉ）（Ｇ４Ｓ）３リンカー配列を介して融合した、抗メソテリンｓｃＦｖと全長ＴＣＲ－Ｖβポリペプチドを含む複数のＴＦＰを含む例示的なリプログラミングしたＴＣＲを示す。ｓｃＦｖ：ΔＴＣＲ－Ｖα：ＣＤ３εと表記した図は、ｉ）（Ｇ４Ｓ）３リンカー配列を介して融合した、抗メソテリンｓｃＦｖと短縮型（Δ）ＴＣＲポリペプチド、及び、ｉｉ）（Ｇ４Ｓ）３リンカー配列を介して融合した、抗メソテリンｓｃＦｖと全長ＣＤ３イプシロンポリペプチドを含む複数のＴＦＰを含む例示的なリプログラミングしたＴＣＲを示す。当該短縮型（Δ）ＴＣＲポリペプチドは、Ｖαの欠失を受けて短縮している。ｓｃＦｖ：ΔＴＣＲ－Ｖα：ΔＴＣＲ－Ｖβと表記した図は、ｉ）（Ｇ４Ｓ）３リンカー配列を介して融合した、抗メソテリンｓｃＦｖと短縮型（Δ）ＴＣＲ Ｖαポリペプチド、及び、ｉｉ）（Ｇ４Ｓ）３リンカー配列を介して融合した、抗メソテリンｓｃＦｖと短縮型（Δ）ＴＣＲ Ｖβポリペプチドを含む複数のＴＦＰを含む例示的なリプログラミングしたＴＣＲを示す。当該短縮型（Δ）ＴＣＲポリペプチドは、Ｖβの欠失を受けて短縮している。 本発明のＴ細胞受容体融合ポリペプチド（ＴＦＰ）の使用を示す概略図である。例示的なＴＦＰは、（Ｇ４Ｓ）３リンカー配列を介して融合した、抗メソテリンＶＨドメインと全長ＣＤ３イプシロンポリペプチドを含む。Ｔ細胞によって産生、または、Ｔ細胞に導入されると、当該ＴＦＰは、内因性Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）の他のポリペプチド（２つのＣＤ３イプシロンポリペプチド、１つのＣＤ３ガンマポリペプチド、１つのＣＤ３デルタポリペプチド、２つのＣＤ３ゼータポリペプチド、１つのＴＣＲアルファサブユニット、及び、１つのＴＣＲベータサブユニットを含むことが示されており、水平方向の灰色セグメントは、原形質膜を表している）と会合して、当該内因性ＣＤ３イプシロンポリペプチドの一方または双方が、当該ＴＦＰによって置換されているリプログラミングしたＴＣＲを形成する。 様々なＴＦＰをコードするＤＮＡ構築物を実証する一連の概略図である。 活性化ＰＢＭＣ細胞でのＴＦＰの例示的な表面発現分析を示しており、また、ＭＳＬＮ ＴＦＰで活性化し、そして、ＣＤ８（抗ＣＤ８ ＡＰＣＣｙ７、ｙ軸）とメソテリン（「ＭＳＬＮ」）（Ｚｅｎｏｎ（登録商標）Ｒ－フィコエリスリン標識ｈＭＳＬＮ ＩｇＧ、ｘ軸）について染色したＣＤ３＋細胞（抗ＣＤ３ ＡＰＣ、ゲート）を示す。左から右に向かって、非形質導入細胞、または、抗ＭＳＬＮ－ＣＤ３εＴＦＰ、抗ＭＳＬＮ－ＣＤ２８ζＣＡＲ、及び、抗ＭＳＬＮ－４１ＢＢζＣＡＲ構築物のいずれかで形質導入した細胞を示す。 活性化ＰＢＭＣ細胞でのＴＦＰの例示的な表面発現分析を示しており、また、組織内の単一ドメインＴＦＰで活性化し、そして、ＭＳＬＮ Ｆｃについて染色を行い、そして、ＧＦＰについて分析をした細胞を示す。最上列は（左から右へ）、非形質導入細胞、そして、コントロール抗ＭＳＬＮ－ＣＤ３εＴＦＰ（「ＳＳ１」）で形質導入した細胞を示す。第２～４列は、ＧＦＰタグを付けた（左から右へ）ＣＤ３εＴＦＰ、ＣＤ３γＴＦＰ、ＴＣＲβＴＦＰ、及び、ＣＤ２８ζＣＡＲ構築物で形質導入された細胞における抗ＭＳＬＮバインダーＳＤ１、ＳＤ４、及び、ＳＤ６のそれぞれを示す。 抗ＭＳＬＮ－ＴＦＰ構築物によるメソテリン（ＭＳＬＮ）ポジティブＨｅＬａ（子宮頸部腺癌、ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＣＬ－２（商標））標的細胞の経時的な死滅を示す例示的なグラフである。活性化したＰＢＭＣを、処置せず（トレース＃１）、形質導入せず（トレース＃２）、または、空のベクター（トレース＃３）、抗ＭＳＬＮ－ＣＤ３εＴＦＰ（トレース＃４）、抗ＭＳＬＮ－ＣＤ２８ζＣＡＲ、または、抗ＭＳＬＮ－４１ＢＢζＣＡＲで形質導入を行い、そして、１×１０４個のＭＳＬＮポジティブＨｅＬａ標的細胞とインキュベートする前に、８日間、増殖させた。 抗ＭＳＬＮ－ＴＦＰ構築物によるＭＳＬＮネガティブＨｅＬａ（子宮頸部腺癌、ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＣＬ－２（商標））標的細胞の経時的な死滅を示す例示的なグラフである。活性化したＰＢＭＣを、処置せず（トレース＃１）、形質導入せず（トレース＃２）、または、空のベクター（トレース＃３）、抗ＭＳＬＮ－ＣＤ３εＴＦＰ（トレース＃４）、抗ＭＳＬＮ－ＣＤ２８ζＣＡＲ、または、抗ＭＳＬＮ－４１ＢＢζＣＡＲで形質導入を行い、そして、１×１０４個のＭＳＬＮポジティブＨｅＬａ標的細胞とインキュベートする前に、８日間、増殖させた。 ２名の異なるヒトドナー由来のＴ細胞（上部及び下部）を用いて、ＭＳＬＮ高発現細胞株（ＨｅＬａ細胞）におけるＭＳＬＮポジティブ細胞の死滅を示す。組織内抗ＭＳＬＮバインダーＳＤ１（図７Ａ）、ＳＤ４（中央）、及び、ＳＤ６（右）を有するＴＦＰ Ｔ細胞についての細胞死滅トレースを示している。活性化したＰＢＭＣを、形質導入せず（トレース＃１）、または、ＣＤ３εＴＦＰ（トレース＃２）、ＣＤ３γＴＦＰ（トレース＃３）、ＴＣＲβＴＦＰ（トレース＃４）、または、ＣＯ２８ζＣＡＲで形質導入した。細胞傷害性を示す正規化細胞指数を、リアルタイム細胞分析器（ＲＴＣＡ）アッセイで決定した。 メソテリンを高レベルで発現する標的細胞株（ＨｅＬａ－Ｌｕｃ（ＭＳＬＮ ｈｉｇｈ））に対する抗ＭＳＬＮ ＣＡＲ Ｔ細胞、及び、ＴＦＰ Ｔ細胞の結合活性を示す一連のグラフである。Ｔ細胞を含まない（「標的のみ」）、空ベクターを形質導入したもの（「ＮＴ」）、抗ＭＳＬＮ（ポジティブコントロール）、または、組織内抗メソテリンバインダーＳＤ１（図７Ａ）、ＳＤ４（図７Ｂ）、及び、ＳＤ６（図７Ｃ）を有しており、それぞれが、ＣＤ３εＴＦＰ、ＣＤ３γＴＦＰ、ＴＣＲβＴＦＰ、及び、ＣＤ２８ζＣＡＲのフォーマットである抗メソテリンＴＦＰ Ｔ細胞を含む試料での死滅した細胞の％を示している。各グラフにおいて、黒色棒は、標的細胞に対するＴ細胞の比率が１：１であることを表しており、そして、灰色棒は、標的細胞に対するＴ細胞の比率が１：５であることを表す。第２のＴ細胞ドナーについても、同様の結果が得られた。 メソテリンを高レベルで発現する標的細胞株（ＨｅＬａ－Ｌｕｃ（ＭＳＬＮ ｈｉｇｈ））に対する抗ＭＳＬＮ ＣＡＲ Ｔ細胞、及び、ＴＦＰ Ｔ細胞の結合活性を示す一連のグラフである。Ｔ細胞を含まない（「標的のみ」）、空ベクターを形質導入したもの（「ＮＴ」）、抗ＭＳＬＮ（ポジティブコントロール）、または、組織内抗メソテリンバインダーＳＤ１（図７Ａ）、ＳＤ４（図７Ｂ）、及び、ＳＤ６（図７Ｃ）を有しており、それぞれが、ＣＤ３εＴＦＰ、ＣＤ３γＴＦＰ、ＴＣＲβＴＦＰ、及び、ＣＤ２８ζＣＡＲのフォーマットである抗メソテリンＴＦＰ Ｔ細胞を含む試料での死滅した細胞の％を示している。各グラフにおいて、黒色棒は、標的細胞に対するＴ細胞の比率が１：１であることを表しており、そして、灰色棒は、標的細胞に対するＴ細胞の比率が１：５であることを表す。第２のＴ細胞ドナーについても、同様の結果が得られた。 メソテリンを高レベルで発現する標的細胞株（ＨｅＬａ－Ｌｕｃ（ＭＳＬＮ ｈｉｇｈ））に対する抗ＭＳＬＮ ＣＡＲ Ｔ細胞、及び、ＴＦＰ Ｔ細胞の結合活性を示す一連のグラフである。Ｔ細胞を含まない（「標的のみ」）、空ベクターを形質導入したもの（「ＮＴ」）、抗ＭＳＬＮ（ポジティブコントロール）、または、組織内抗メソテリンバインダーＳＤ１（図７Ａ）、ＳＤ４（図７Ｂ）、及び、ＳＤ６（図７Ｃ）を有しており、それぞれが、ＣＤ３εＴＦＰ、ＣＤ３γＴＦＰ、ＴＣＲβＴＦＰ、及び、ＣＤ２８ζＣＡＲのフォーマットである抗メソテリンＴＦＰ Ｔ細胞を含む試料での死滅した細胞の％を示している。各グラフにおいて、黒色棒は、標的細胞に対するＴ細胞の比率が１：１であることを表しており、そして、灰色棒は、標的細胞に対するＴ細胞の比率が１：５であることを表す。第２のＴ細胞ドナーについても、同様の結果が得られた。 メソテリンを低レベルで発現する標的細胞株（ＰＣ３－ＭＳＬＮ（－／ｌｏｗ））に対する抗ＭＳＬＮ ＣＡＲ Ｔ細胞、及び、ＴＦＰ Ｔ細胞の活性を示す一連のグラフである。Ｔ細胞を含まない（「標的のみ」）、空ベクターを形質導入したもの（「ＮＴ」）、抗ＭＳＬＮ（ポジティブコントロール、「ＳＳ１」）、または、ＣＤ３ε（図８Ａ）、ＣＤ３γ（図８Ｂ）、ＴＣＲβ（図８Ｃ）、及び、ＣＤ２８ζＣＡＲ（図８Ｄ）のＴＦＰフォーマットである組織内抗メソテリン構築物ＳＤ１、ＳＤ４、及び、ＳＤ６を含む試料での死滅した細胞の％を示している。各グラフにおいて、黒色棒は、標的細胞に対するＴ細胞の比率が１：１であることを表しており、そして、灰色棒は、標的細胞に対するＴ細胞の比率が１：５であることを表す。第２のＴ細胞ドナーについても、同様の結果が得られた。 メソテリンを低レベルで発現する標的細胞株（ＰＣ３－ＭＳＬＮ（－／ｌｏｗ））に対する抗ＭＳＬＮ ＣＡＲ Ｔ細胞、及び、ＴＦＰ Ｔ細胞の活性を示す一連のグラフである。Ｔ細胞を含まない（「標的のみ」）、空ベクターを形質導入したもの（「ＮＴ」）、抗ＭＳＬＮ（ポジティブコントロール、「ＳＳ１」）、または、ＣＤ３ε（図８Ａ）、ＣＤ３γ（図８Ｂ）、ＴＣＲβ（図８Ｃ）、及び、ＣＤ２８ζＣＡＲ（図８Ｄ）のＴＦＰフォーマットである組織内抗メソテリン構築物ＳＤ１、ＳＤ４、及び、ＳＤ６を含む試料での死滅した細胞の％を示している。各グラフにおいて、黒色棒は、標的細胞に対するＴ細胞の比率が１：１であることを表しており、そして、灰色棒は、標的細胞に対するＴ細胞の比率が１：５であることを表す。第２のＴ細胞ドナーについても、同様の結果が得られた。 メソテリンを低レベルで発現する標的細胞株（ＰＣ３－ＭＳＬＮ（－／ｌｏｗ））に対する抗ＭＳＬＮ ＣＡＲ Ｔ細胞、及び、ＴＦＰ Ｔ細胞の活性を示す一連のグラフである。Ｔ細胞を含まない（「標的のみ」）、空ベクターを形質導入したもの（「ＮＴ」）、抗ＭＳＬＮ（ポジティブコントロール、「ＳＳ１」）、または、ＣＤ３ε（図８Ａ）、ＣＤ３γ（図８Ｂ）、ＴＣＲβ（図８Ｃ）、及び、ＣＤ２８ζＣＡＲ（図８Ｄ）のＴＦＰフォーマットである組織内抗メソテリン構築物ＳＤ１、ＳＤ４、及び、ＳＤ６を含む試料での死滅した細胞の％を示している。各グラフにおいて、黒色棒は、標的細胞に対するＴ細胞の比率が１：１であることを表しており、そして、灰色棒は、標的細胞に対するＴ細胞の比率が１：５であることを表す。第２のＴ細胞ドナーについても、同様の結果が得られた。 メソテリンを低レベルで発現する標的細胞株（ＰＣ３－ＭＳＬＮ（－／ｌｏｗ））に対する抗ＭＳＬＮ ＣＡＲ Ｔ細胞、及び、ＴＦＰ Ｔ細胞の活性を示す一連のグラフである。Ｔ細胞を含まない（「標的のみ」）、空ベクターを形質導入したもの（「ＮＴ」）、抗ＭＳＬＮ（ポジティブコントロール、「ＳＳ１」）、または、ＣＤ３ε（図８Ａ）、ＣＤ３γ（図８Ｂ）、ＴＣＲβ（図８Ｃ）、及び、ＣＤ２８ζＣＡＲ（図８Ｄ）のＴＦＰフォーマットである組織内抗メソテリン構築物ＳＤ１、ＳＤ４、及び、ＳＤ６を含む試料での死滅した細胞の％を示している。各グラフにおいて、黒色棒は、標的細胞に対するＴ細胞の比率が１：１であることを表しており、そして、灰色棒は、標的細胞に対するＴ細胞の比率が１：５であることを表す。第２のＴ細胞ドナーについても、同様の結果が得られた。 ＭＳＬＮ＋細胞と共培養した場合に、抗ＭＳＬＮ ＣＡＲ及びＴＦＰ構築物を発現するＴ細胞の活性化を実証するＦＡＣＳ分析の結果を示す。図９Ａに示したように、左から右に記載したものは、形質導入をしていないＴ細胞、空ベクターで形質導入したＴ細胞、抗ＭＳＬＮ－ＣＤ３εＴＦＰ、抗ＭＳＬＮ－２８ζＣＡＲ、または、抗ＭＳＬＮ－４１ＢＢζＣＡＲで形質導入したＴ細胞である。ＭＳＬＮ－細胞と共培養した細胞を最上列に示し、そして、ＭＳＬＮ＋標的細胞と共培養した細胞を最下列に示す。これらの細胞を、次いで、表面活性化マーカーＣＤ６９及びＣＤ２５、または、細胞溶解性顆粒成分グランザイムＢ（ＧｒＢ）に特異的な抗体で染色した。抗ＣＤ６９で染色した細胞の数はｘ軸に対応しており、そして、抗ＣＤ２５で染色した細胞の数はｙ軸に対応する。示したように、抗メソテリンＣＡＲ及びＴＦＰ構築物を発現するＴ細胞は、ＭＳＬＮ＋細胞との培養によって活性化されており、このことは、ＭＳＬＮ－細胞との共培養と比較して、ＣＤ６９及びＣＤ２５が高レベルで発現していることで実証されている（図９Ｂ）。ＭＳＬＮ－（白色棒）及びＭＳＬＮ＋（黒色棒）細胞における各構築物についてのＣＤ２５＋細胞のパーセンテージを示す。形質導入していないＴ細胞、または、抗ＭＳＬＮポジティブコントロールバインダーで形質導入したＴ細胞（「５１０－ＳＳ１－ＣＤ３８」）のいずれかで、Ｋ５６２ ＭＳＬＮ－細胞（丸）、及び、Ｋ５６２－ＭＳＬＮ＋細胞（四角）を用いて、同様の実験を行った（図９Ｃ）。データは、ＣＤ２５＋、ＣＤ６９＋、及び、ＣＤ２５＋／ＣＤ６９＋細胞の合計を表す。図９Ｄにおいて、ＴＦＰフォーマットＣＤ３ε、ＣＤ３γ、ＴＣＲβ、及びＣＤ２８ζＣＡＲを有するドナーＴ細胞と組み合わせたＫ５６２ ＭＳＬＮ－標的細胞（左パネル）、及び、Ｋ５６２ ＭＳＬＮ＋細胞（右パネル）における組織内抗ＭＳＬＮバインダーＳＤ１（四角）、ＳＤ４（丸）、及び、ＳＤ６（三角）についてのデータを示す。第２のＴ細胞ドナー由来の細胞を用いて、同様の結果が認められた。 ＭＳＬＮ＋細胞と共培養した場合に、抗ＭＳＬＮ ＣＡＲ及びＴＦＰ構築物を発現するＴ細胞の活性化を実証するＦＡＣＳ分析の結果を示す。図９Ａに示したように、左から右に記載したものは、形質導入をしていないＴ細胞、空ベクターで形質導入したＴ細胞、抗ＭＳＬＮ－ＣＤ３εＴＦＰ、抗ＭＳＬＮ－２８ζＣＡＲ、または、抗ＭＳＬＮ－４１ＢＢζＣＡＲで形質導入したＴ細胞である。ＭＳＬＮ－細胞と共培養した細胞を最上列に示し、そして、ＭＳＬＮ＋標的細胞と共培養した細胞を最下列に示す。これらの細胞を、次いで、表面活性化マーカーＣＤ６９及びＣＤ２５、または、細胞溶解性顆粒成分グランザイムＢ（ＧｒＢ）に特異的な抗体で染色した。抗ＣＤ６９で染色した細胞の数はｘ軸に対応しており、そして、抗ＣＤ２５で染色した細胞の数はｙ軸に対応する。示したように、抗メソテリンＣＡＲ及びＴＦＰ構築物を発現するＴ細胞は、ＭＳＬＮ＋細胞との培養によって活性化されており、このことは、ＭＳＬＮ－細胞との共培養と比較して、ＣＤ６９及びＣＤ２５が高レベルで発現していることで実証されている（図９Ｂ）。ＭＳＬＮ－（白色棒）及びＭＳＬＮ＋（黒色棒）細胞における各構築物についてのＣＤ２５＋細胞のパーセンテージを示す。形質導入していないＴ細胞、または、抗ＭＳＬＮポジティブコントロールバインダーで形質導入したＴ細胞（「５１０－ＳＳ１－ＣＤ３８」）のいずれかで、Ｋ５６２ ＭＳＬＮ－細胞（丸）、及び、Ｋ５６２－ＭＳＬＮ＋細胞（四角）を用いて、同様の実験を行った（図９Ｃ）。データは、ＣＤ２５＋、ＣＤ６９＋、及び、ＣＤ２５＋／ＣＤ６９＋細胞の合計を表す。図９Ｄにおいて、ＴＦＰフォーマットＣＤ３ε、ＣＤ３γ、ＴＣＲβ、及びＣＤ２８ζＣＡＲを有するドナーＴ細胞と組み合わせたＫ５６２ ＭＳＬＮ－標的細胞（左パネル）、及び、Ｋ５６２ ＭＳＬＮ＋細胞（右パネル）における組織内抗ＭＳＬＮバインダーＳＤ１（四角）、ＳＤ４（丸）、及び、ＳＤ６（三角）についてのデータを示す。第２のＴ細胞ドナー由来の細胞を用いて、同様の結果が認められた。 ＭＳＬＮ＋細胞と共培養した場合に、抗ＭＳＬＮ ＣＡＲ及びＴＦＰ構築物を発現するＴ細胞の活性化を実証するＦＡＣＳ分析の結果を示す。図９Ａに示したように、左から右に記載したものは、形質導入をしていないＴ細胞、空ベクターで形質導入したＴ細胞、抗ＭＳＬＮ－ＣＤ３εＴＦＰ、抗ＭＳＬＮ－２８ζＣＡＲ、または、抗ＭＳＬＮ－４１ＢＢζＣＡＲで形質導入したＴ細胞である。ＭＳＬＮ－細胞と共培養した細胞を最上列に示し、そして、ＭＳＬＮ＋標的細胞と共培養した細胞を最下列に示す。これらの細胞を、次いで、表面活性化マーカーＣＤ６９及びＣＤ２５、または、細胞溶解性顆粒成分グランザイムＢ（ＧｒＢ）に特異的な抗体で染色した。抗ＣＤ６９で染色した細胞の数はｘ軸に対応しており、そして、抗ＣＤ２５で染色した細胞の数はｙ軸に対応する。示したように、抗メソテリンＣＡＲ及びＴＦＰ構築物を発現するＴ細胞は、ＭＳＬＮ＋細胞との培養によって活性化されており、このことは、ＭＳＬＮ－細胞との共培養と比較して、ＣＤ６９及びＣＤ２５が高レベルで発現していることで実証されている（図９Ｂ）。ＭＳＬＮ－（白色棒）及びＭＳＬＮ＋（黒色棒）細胞における各構築物についてのＣＤ２５＋細胞のパーセンテージを示す。形質導入していないＴ細胞、または、抗ＭＳＬＮポジティブコントロールバインダーで形質導入したＴ細胞（「５１０－ＳＳ１－ＣＤ３８」）のいずれかで、Ｋ５６２ ＭＳＬＮ－細胞（丸）、及び、Ｋ５６２－ＭＳＬＮ＋細胞（四角）を用いて、同様の実験を行った（図９Ｃ）。データは、ＣＤ２５＋、ＣＤ６９＋、及び、ＣＤ２５＋／ＣＤ６９＋細胞の合計を表す。図９Ｄにおいて、ＴＦＰフォーマットＣＤ３ε、ＣＤ３γ、ＴＣＲβ、及びＣＤ２８ζＣＡＲを有するドナーＴ細胞と組み合わせたＫ５６２ ＭＳＬＮ－標的細胞（左パネル）、及び、Ｋ５６２ ＭＳＬＮ＋細胞（右パネル）における組織内抗ＭＳＬＮバインダーＳＤ１（四角）、ＳＤ４（丸）、及び、ＳＤ６（三角）についてのデータを示す。第２のＴ細胞ドナー由来の細胞を用いて、同様の結果が認められた。 ＭＳＬＮ＋細胞と共培養した場合に、抗ＭＳＬＮ ＣＡＲ及びＴＦＰ構築物を発現するＴ細胞の活性化を実証するＦＡＣＳ分析の結果を示す。図９Ａに示したように、左から右に記載したものは、形質導入をしていないＴ細胞、空ベクターで形質導入したＴ細胞、抗ＭＳＬＮ－ＣＤ３εＴＦＰ、抗ＭＳＬＮ－２８ζＣＡＲ、または、抗ＭＳＬＮ－４１ＢＢζＣＡＲで形質導入したＴ細胞である。ＭＳＬＮ－細胞と共培養した細胞を最上列に示し、そして、ＭＳＬＮ＋標的細胞と共培養した細胞を最下列に示す。これらの細胞を、次いで、表面活性化マーカーＣＤ６９及びＣＤ２５、または、細胞溶解性顆粒成分グランザイムＢ（ＧｒＢ）に特異的な抗体で染色した。抗ＣＤ６９で染色した細胞の数はｘ軸に対応しており、そして、抗ＣＤ２５で染色した細胞の数はｙ軸に対応する。示したように、抗メソテリンＣＡＲ及びＴＦＰ構築物を発現するＴ細胞は、ＭＳＬＮ＋細胞との培養によって活性化されており、このことは、ＭＳＬＮ－細胞との共培養と比較して、ＣＤ６９及びＣＤ２５が高レベルで発現していることで実証されている（図９Ｂ）。ＭＳＬＮ－（白色棒）及びＭＳＬＮ＋（黒色棒）細胞における各構築物についてのＣＤ２５＋細胞のパーセンテージを示す。形質導入していないＴ細胞、または、抗ＭＳＬＮポジティブコントロールバインダーで形質導入したＴ細胞（「５１０－ＳＳ１－ＣＤ３８」）のいずれかで、Ｋ５６２ ＭＳＬＮ－細胞（丸）、及び、Ｋ５６２－ＭＳＬＮ＋細胞（四角）を用いて、同様の実験を行った（図９Ｃ）。データは、ＣＤ２５＋、ＣＤ６９＋、及び、ＣＤ２５＋／ＣＤ６９＋細胞の合計を表す。図９Ｄにおいて、ＴＦＰフォーマットＣＤ３ε、ＣＤ３γ、ＴＣＲβ、及びＣＤ２８ζＣＡＲを有するドナーＴ細胞と組み合わせたＫ５６２ ＭＳＬＮ－標的細胞（左パネル）、及び、Ｋ５６２ ＭＳＬＮ＋細胞（右パネル）における組織内抗ＭＳＬＮバインダーＳＤ１（四角）、ＳＤ４（丸）、及び、ＳＤ６（三角）についてのデータを示す。第２のＴ細胞ドナー由来の細胞を用いて、同様の結果が認められた。 ＭＳＬＮ＋細胞と共培養した場合に、抗ＭＳＬＮ ＣＡＲ及びＴＦＰ構築物を発現するＴ細胞の活性化を実証するＦＡＣＳ分析の結果を示す。細胞の固定、浸透化、及び、抗グランザイムＢ Ａｌｅｘａｆｌｕｏｒ７００（ｘ軸）を用いた染色を行う前に、同細胞を、抗ＣＤ３ ＡＰＣ（ゲート）、及び、抗ＣＤ８ ＡＰＣｃｙ７（ｙ軸）で表面抗原について染色をした。図１０Ａに示したように、左から右に記載したものは、形質導入をしていないＴ細胞、空ベクターで形質導入したＴ細胞、抗ＭＳＬＮ－ＣＤ３εＴＦＰ、抗ＭＳＬＮ－２８ζＣＡＲ、または、抗ＭＳＬＮ－４１ＢＢζＣＡＲで形質導入したＴ細胞である。ＭＳＬＮ－細胞と共培養した細胞を最上列に示し、そして、ＭＳＬＮ＋標的細胞と共培養した細胞を最下列に示す。抗メソテリンＣＡＲ及びＴＦＰ構築物を発現するＣＤ８ Ｔ細胞は、ＭＳＬＮ＋細胞との培養によって活性化されており、このことは、ＭＳＬＮ－細胞との共培養と比較して、細胞内ＧｒＢレベルが上昇していることで実証されている（図１０Ｂ）。ＭＳＬＮ－（白色棒）またはＭＳＬＮ＋（黒色棒）細胞と共培養したときの、各構築物についてのグランザイムＢ（「ＧｒＢ＋」）細胞のパーセンテージを示す。 ＭＳＬＮ＋細胞と共培養した場合に、抗ＭＳＬＮ ＣＡＲ及びＴＦＰ構築物を発現するＴ細胞の活性化を実証するＦＡＣＳ分析の結果を示す。細胞の固定、浸透化、及び、抗グランザイムＢ Ａｌｅｘａｆｌｕｏｒ７００（ｘ軸）を用いた染色を行う前に、同細胞を、抗ＣＤ３ ＡＰＣ（ゲート）、及び、抗ＣＤ８ ＡＰＣｃｙ７（ｙ軸）で表面抗原について染色をした。図１０Ａに示したように、左から右に記載したものは、形質導入をしていないＴ細胞、空ベクターで形質導入したＴ細胞、抗ＭＳＬＮ－ＣＤ３εＴＦＰ、抗ＭＳＬＮ－２８ζＣＡＲ、または、抗ＭＳＬＮ－４１ＢＢζＣＡＲで形質導入したＴ細胞である。ＭＳＬＮ－細胞と共培養した細胞を最上列に示し、そして、ＭＳＬＮ＋標的細胞と共培養した細胞を最下列に示す。抗メソテリンＣＡＲ及びＴＦＰ構築物を発現するＣＤ８ Ｔ細胞は、ＭＳＬＮ＋細胞との培養によって活性化されており、このことは、ＭＳＬＮ－細胞との共培養と比較して、細胞内ＧｒＢレベルが上昇していることで実証されている（図１０Ｂ）。ＭＳＬＮ－（白色棒）またはＭＳＬＮ＋（黒色棒）細胞と共培養したときの、各構築物についてのグランザイムＢ（「ＧｒＢ＋」）細胞のパーセンテージを示す。 ＭＳＬＮを過剰発現するＫ５６２細胞と共培養した場合に、抗ＭＳＬＮ ＣＡＲ及びＴＦＰ構築物を発現する活性化Ｔ細胞におけるサイトカイン産生のＥＬＩＳＡ分析の結果を示す。ＢＣＭＡを過剰発現しているＫ５６２細胞を、ネガティブコントロールとして使用した。２４時間後に、細胞を、ＥＬＩＳＡで、ＩＦＮ－γ（図１１Ａ）、及び、ＩＬ－２（図１１Ｂ）の発現について分析をした。各図において、左から右に記載したものは、形質導入をしていないＴ細胞、空ベクターで形質導入したＴ細胞、抗ＭＳＬＮ－ＣＤ３εＴＦＰ、抗ＭＳＬＮ－２８ζＣＡＲ、または、抗ＭＳＬＮ－４１ＢＢζＣＡＲで形質導入したＴ細胞である。ＭＳＬＮ－細胞と共培養した細胞を白色棒で表し、また、ＭＳＬＮ＋標的細胞と共培養した細胞を黒色棒で表す。 ＭＳＬＮを過剰発現するＫ５６２細胞と共培養した場合に、抗ＭＳＬＮ ＣＡＲ及びＴＦＰ構築物を発現する活性化Ｔ細胞におけるサイトカイン産生のＥＬＩＳＡ分析の結果を示す。ＢＣＭＡを過剰発現しているＫ５６２細胞を、ネガティブコントロールとして使用した。２４時間後に、細胞を、ＥＬＩＳＡで、ＩＦＮ－γ（図１１Ａ）、及び、ＩＬ－２（図１１Ｂ）の発現について分析をした。各図において、左から右に記載したものは、形質導入をしていないＴ細胞、空ベクターで形質導入したＴ細胞、抗ＭＳＬＮ－ＣＤ３εＴＦＰ、抗ＭＳＬＮ－２８ζＣＡＲ、または、抗ＭＳＬＮ－４１ＢＢζＣＡＲで形質導入したＴ細胞である。ＭＳＬＮ－細胞と共培養した細胞を白色棒で表し、また、ＭＳＬＮ＋標的細胞と共培養した細胞を黒色棒で表す。 中皮腫異種移植マウスモデルにおけるインビボでのＭＳＬＮ特異的ｓｄＡｂ ＴＦＰ Ｔ細胞の有効性を示す一連のグラフである。マウス１匹あたりに１×１０６個の細胞を、ルシフェラーゼ標識ＭＳＴＯ－２１１Ｈ－ＦＬ－ＭＳＬＮ－Ｌｕｃを用いて接種し、そして、腫瘍体積が約３００ｍｍ３になるまで腫瘍を増殖させ、１×１０７個のＴ細胞を、それぞれの動物に対して静脈内注射した。図１２Ａは、左から右にかけて、Ｔ細胞を含まないコントロール、ＳＤ１ ＣＤ３ε－ＴＦＰ、及び、ＳＤ４ ＣＤ３ε－ＴＦＰを含むＴ細胞を注射した後の腫瘍体積を示す。図１２Ｂは、ＳＤ１、及び、ＳＤ４バインダー、ならびに、ＳＤ１ ＣＤ２８ζＣＡＲを有するＣＤ３γ－ＴＦＰを示す。図１２Ｃ～Ｄは、腫瘍細胞を再接種した１２Ａ－Ｂでの生存マウスから得た結果であり、マウスが２回目のＴ細胞注射が無くとも、それらの抗ＭＳＬＮ免疫を維持するかどうかを決定する。ＳＤ１ ＣＤ３ε－ＴＦＰ Ｔ細胞（１２Ｃ）、及び、ＳＤ１ ＣＤ３γ－ＴＦＰ Ｔ細胞（１２Ｄ）の投与を受け、また、それらの腫瘍を以前に除去したマウスに対して、ＭＳＬＮ＋（ＭＳＴＯ）またはＭＳＬＮ－（ラージ）腫瘍細胞株を再接種した。腫瘍体積を測定し、そして、ｘ軸に示した。 中皮腫異種移植マウスモデルにおけるインビボでのＭＳＬＮ特異的ｓｄＡｂ ＴＦＰ Ｔ細胞の有効性を示す一連のグラフである。マウス１匹あたりに１×１０６個の細胞を、ルシフェラーゼ標識ＭＳＴＯ－２１１Ｈ－ＦＬ－ＭＳＬＮ－Ｌｕｃを用いて接種し、そして、腫瘍体積が約３００ｍｍ３になるまで腫瘍を増殖させ、１×１０７個のＴ細胞を、それぞれの動物に対して静脈内注射した。図１２Ａは、左から右にかけて、Ｔ細胞を含まないコントロール、ＳＤ１ ＣＤ３ε－ＴＦＰ、及び、ＳＤ４ ＣＤ３ε－ＴＦＰを含むＴ細胞を注射した後の腫瘍体積を示す。図１２Ｂは、ＳＤ１、及び、ＳＤ４バインダー、ならびに、ＳＤ１ ＣＤ２８ζＣＡＲを有するＣＤ３γ－ＴＦＰを示す。図１２Ｃ～Ｄは、腫瘍細胞を再接種した１２Ａ－Ｂでの生存マウスから得た結果であり、マウスが２回目のＴ細胞注射が無くとも、それらの抗ＭＳＬＮ免疫を維持するかどうかを決定する。ＳＤ１ ＣＤ３ε－ＴＦＰ Ｔ細胞（１２Ｃ）、及び、ＳＤ１ ＣＤ３γ－ＴＦＰ Ｔ細胞（１２Ｄ）の投与を受け、また、それらの腫瘍を以前に除去したマウスに対して、ＭＳＬＮ＋（ＭＳＴＯ）またはＭＳＬＮ－（ラージ）腫瘍細胞株を再接種した。腫瘍体積を測定し、そして、ｘ軸に示した。 中皮腫異種移植マウスモデルにおけるインビボでのＭＳＬＮ特異的ｓｄＡｂ ＴＦＰ Ｔ細胞の有効性を示す一連のグラフである。マウス１匹あたりに１×１０６個の細胞を、ルシフェラーゼ標識ＭＳＴＯ－２１１Ｈ－ＦＬ－ＭＳＬＮ－Ｌｕｃを用いて接種し、そして、腫瘍体積が約３００ｍｍ３になるまで腫瘍を増殖させ、１×１０７個のＴ細胞を、それぞれの動物に対して静脈内注射した。図１２Ａは、左から右にかけて、Ｔ細胞を含まないコントロール、ＳＤ１ ＣＤ３ε－ＴＦＰ、及び、ＳＤ４ ＣＤ３ε－ＴＦＰを含むＴ細胞を注射した後の腫瘍体積を示す。図１２Ｂは、ＳＤ１、及び、ＳＤ４バインダー、ならびに、ＳＤ１ ＣＤ２８ζＣＡＲを有するＣＤ３γ－ＴＦＰを示す。図１２Ｃ～Ｄは、腫瘍細胞を再接種した１２Ａ－Ｂでの生存マウスから得た結果であり、マウスが２回目のＴ細胞注射が無くとも、それらの抗ＭＳＬＮ免疫を維持するかどうかを決定する。ＳＤ１ ＣＤ３ε－ＴＦＰ Ｔ細胞（１２Ｃ）、及び、ＳＤ１ ＣＤ３γ－ＴＦＰ Ｔ細胞（１２Ｄ）の投与を受け、また、それらの腫瘍を以前に除去したマウスに対して、ＭＳＬＮ＋（ＭＳＴＯ）またはＭＳＬＮ－（ラージ）腫瘍細胞株を再接種した。腫瘍体積を測定し、そして、ｘ軸に示した。 中皮腫異種移植マウスモデルにおけるインビボでのＭＳＬＮ特異的ｓｄＡｂ ＴＦＰ Ｔ細胞の有効性を示す一連のグラフである。マウス１匹あたりに１×１０６個の細胞を、ルシフェラーゼ標識ＭＳＴＯ－２１１Ｈ－ＦＬ－ＭＳＬＮ－Ｌｕｃを用いて接種し、そして、腫瘍体積が約３００ｍｍ３になるまで腫瘍を増殖させ、１×１０７個のＴ細胞を、それぞれの動物に対して静脈内注射した。図１２Ａは、左から右にかけて、Ｔ細胞を含まないコントロール、ＳＤ１ ＣＤ３ε－ＴＦＰ、及び、ＳＤ４ ＣＤ３ε－ＴＦＰを含むＴ細胞を注射した後の腫瘍体積を示す。図１２Ｂは、ＳＤ１、及び、ＳＤ４バインダー、ならびに、ＳＤ１ ＣＤ２８ζＣＡＲを有するＣＤ３γ－ＴＦＰを示す。図１２Ｃ～Ｄは、腫瘍細胞を再接種した１２Ａ－Ｂでの生存マウスから得た結果であり、マウスが２回目のＴ細胞注射が無くとも、それらの抗ＭＳＬＮ免疫を維持するかどうかを決定する。ＳＤ１ ＣＤ３ε－ＴＦＰ Ｔ細胞（１２Ｃ）、及び、ＳＤ１ ＣＤ３γ－ＴＦＰ Ｔ細胞（１２Ｄ）の投与を受け、また、それらの腫瘍を以前に除去したマウスに対して、ＭＳＬＮ＋（ＭＳＴＯ）またはＭＳＬＮ－（ラージ）腫瘍細胞株を再接種した。腫瘍体積を測定し、そして、ｘ軸に示した。 卵巣癌患者由来のＭＳＬＮ－ＴＦＰ Ｔ細胞の産生及び機能分析を示す。図１３Ａは、実験計画の概略図である。図１３Ｂ～Ｃは、患者のＳＤ１ε－ＴＦＰ Ｔ細胞が、ＭＳＴＯ－ＭＳＬＮ－Ｌｕｃ腫瘍細胞をインビトロで死滅させることを示す。ＭＳＴＯ－ＭＳＬＮ－Ｌｕｃ腫瘍細胞（標的細胞）は、メソテリン発現が確認されており（１３Ｂ）、ＳＤ１ε－ＴＦＰ Ｔ細胞（エフェクター細胞）、及び、適合する形質導入していないコントロールを、Ｅ：Ｔ（エフェクター：標的）比率を、５：１、１：１、または、１：５として、２４時間添加した。ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ（登録商標）Ｍ５プレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｄｅｖｉｃｅｓ）で、標的細胞の発光を相対発光単位（ＲＬＵ）で測定した。図中の各線は、３回の反復実験の平均を表す（１３Ｃ）。図１３Ｄ～Ｌは、ＩＦＮγ（１３Ｄ）、ＧＭ－ＣＳＦ（１３Ｅ）、グランザイムＡ（１３Ｆ）、グランザイムＢ（１３Ｇ）、ＩＬ－２（１３Ｈ）、ＭＩＰ－１α（１３Ｉ）、ＭＩＰ－１β（１３Ｊ）、ＴＮＦα（１３Ｋ）、及び、パーフォリン（１３Ｌ）を含む卵巣癌患者由来のＳＤ１ε－ＴＦＰ Ｔ細胞のサイトカインプロファイルの測定値を示す。ＭＳＴＯ－ＭＳＬＮ－Ｌｕｃ腫瘍細胞（標的細胞）を、９６平底プレートに、１００００細胞／ウェルで播種した。ＳＤ１ε－ＴＦＰ Ｔ細胞（エフェクター細胞）、及び、適合する形質導入していないコントロールを、１対１の比率で、２４時間添加した。細胞上清を回収し、サイトカインを、Ｌｕｍｉｎｅｘ（登録商標）アッセイを用いて測定した。 卵巣癌患者由来のＭＳＬＮ－ＴＦＰ Ｔ細胞の産生及び機能分析を示す。図１３Ａは、実験計画の概略図である。図１３Ｂ～Ｃは、患者のＳＤ１ε－ＴＦＰ Ｔ細胞が、ＭＳＴＯ－ＭＳＬＮ－Ｌｕｃ腫瘍細胞をインビトロで死滅させることを示す。ＭＳＴＯ－ＭＳＬＮ－Ｌｕｃ腫瘍細胞（標的細胞）は、メソテリン発現が確認されており（１３Ｂ）、ＳＤ１ε－ＴＦＰ Ｔ細胞（エフェクター細胞）、及び、適合する形質導入していないコントロールを、Ｅ：Ｔ（エフェクター：標的）比率を、５：１、１：１、または、１：５として、２４時間添加した。ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ（登録商標）Ｍ５プレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｄｅｖｉｃｅｓ）で、標的細胞の発光を相対発光単位（ＲＬＵ）で測定した。図中の各線は、３回の反復実験の平均を表す（１３Ｃ）。図１３Ｄ～Ｌは、ＩＦＮγ（１３Ｄ）、ＧＭ－ＣＳＦ（１３Ｅ）、グランザイムＡ（１３Ｆ）、グランザイムＢ（１３Ｇ）、ＩＬ－２（１３Ｈ）、ＭＩＰ－１α（１３Ｉ）、ＭＩＰ－１β（１３Ｊ）、ＴＮＦα（１３Ｋ）、及び、パーフォリン（１３Ｌ）を含む卵巣癌患者由来のＳＤ１ε－ＴＦＰ Ｔ細胞のサイトカインプロファイルの測定値を示す。ＭＳＴＯ－ＭＳＬＮ－Ｌｕｃ腫瘍細胞（標的細胞）を、９６平底プレートに、１００００細胞／ウェルで播種した。ＳＤ１ε－ＴＦＰ Ｔ細胞（エフェクター細胞）、及び、適合する形質導入していないコントロールを、１対１の比率で、２４時間添加した。細胞上清を回収し、サイトカインを、Ｌｕｍｉｎｅｘ（登録商標）アッセイを用いて測定した。 卵巣癌患者由来のＭＳＬＮ－ＴＦＰ Ｔ細胞の産生及び機能分析を示す。図１３Ａは、実験計画の概略図である。図１３Ｂ～Ｃは、患者のＳＤ１ε－ＴＦＰ Ｔ細胞が、ＭＳＴＯ－ＭＳＬＮ－Ｌｕｃ腫瘍細胞をインビトロで死滅させることを示す。ＭＳＴＯ－ＭＳＬＮ－Ｌｕｃ腫瘍細胞（標的細胞）は、メソテリン発現が確認されており（１３Ｂ）、ＳＤ１ε－ＴＦＰ Ｔ細胞（エフェクター細胞）、及び、適合する形質導入していないコントロールを、Ｅ：Ｔ（エフェクター：標的）比率を、５：１、１：１、または、１：５として、２４時間添加した。ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ（登録商標）Ｍ５プレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｄｅｖｉｃｅｓ）で、標的細胞の発光を相対発光単位（ＲＬＵ）で測定した。図中の各線は、３回の反復実験の平均を表す（１３Ｃ）。図１３Ｄ～Ｌは、ＩＦＮγ（１３Ｄ）、ＧＭ－ＣＳＦ（１３Ｅ）、グランザイムＡ（１３Ｆ）、グランザイムＢ（１３Ｇ）、ＩＬ－２（１３Ｈ）、ＭＩＰ－１α（１３Ｉ）、ＭＩＰ－１β（１３Ｊ）、ＴＮＦα（１３Ｋ）、及び、パーフォリン（１３Ｌ）を含む卵巣癌患者由来のＳＤ１ε－ＴＦＰ Ｔ細胞のサイトカインプロファイルの測定値を示す。ＭＳＴＯ－ＭＳＬＮ－Ｌｕｃ腫瘍細胞（標的細胞）を、９６平底プレートに、１００００細胞／ウェルで播種した。ＳＤ１ε－ＴＦＰ Ｔ細胞（エフェクター細胞）、及び、適合する形質導入していないコントロールを、１対１の比率で、２４時間添加した。細胞上清を回収し、サイトカインを、Ｌｕｍｉｎｅｘ（登録商標）アッセイを用いて測定した。 卵巣癌患者由来のＭＳＬＮ－ＴＦＰ Ｔ細胞の産生及び機能分析を示す。図１３Ａは、実験計画の概略図である。図１３Ｂ～Ｃは、患者のＳＤ１ε－ＴＦＰ Ｔ細胞が、ＭＳＴＯ－ＭＳＬＮ－Ｌｕｃ腫瘍細胞をインビトロで死滅させることを示す。ＭＳＴＯ－ＭＳＬＮ－Ｌｕｃ腫瘍細胞（標的細胞）は、メソテリン発現が確認されており（１３Ｂ）、ＳＤ１ε－ＴＦＰ Ｔ細胞（エフェクター細胞）、及び、適合する形質導入していないコントロールを、Ｅ：Ｔ（エフェクター：標的）比率を、５：１、１：１、または、１：５として、２４時間添加した。ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ（登録商標）Ｍ５プレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｄｅｖｉｃｅｓ）で、標的細胞の発光を相対発光単位（ＲＬＵ）で測定した。図中の各線は、３回の反復実験の平均を表す（１３Ｃ）。図１３Ｄ～Ｌは、ＩＦＮγ（１３Ｄ）、ＧＭ－ＣＳＦ（１３Ｅ）、グランザイムＡ（１３Ｆ）、グランザイムＢ（１３Ｇ）、ＩＬ－２（１３Ｈ）、ＭＩＰ－１α（１３Ｉ）、ＭＩＰ－１β（１３Ｊ）、ＴＮＦα（１３Ｋ）、及び、パーフォリン（１３Ｌ）を含む卵巣癌患者由来のＳＤ１ε－ＴＦＰ Ｔ細胞のサイトカインプロファイルの測定値を示す。ＭＳＴＯ－ＭＳＬＮ－Ｌｕｃ腫瘍細胞（標的細胞）を、９６平底プレートに、１００００細胞／ウェルで播種した。ＳＤ１ε－ＴＦＰ Ｔ細胞（エフェクター細胞）、及び、適合する形質導入していないコントロールを、１対１の比率で、２４時間添加した。細胞上清を回収し、サイトカインを、Ｌｕｍｉｎｅｘ（登録商標）アッセイを用いて測定した。 卵巣癌患者由来のＭＳＬＮ－ＴＦＰ Ｔ細胞の産生及び機能分析を示す。図１３Ａは、実験計画の概略図である。図１３Ｂ～Ｃは、患者のＳＤ１ε－ＴＦＰ Ｔ細胞が、ＭＳＴＯ－ＭＳＬＮ－Ｌｕｃ腫瘍細胞をインビトロで死滅させることを示す。ＭＳＴＯ－ＭＳＬＮ－Ｌｕｃ腫瘍細胞（標的細胞）は、メソテリン発現が確認されており（１３Ｂ）、ＳＤ１ε－ＴＦＰ Ｔ細胞（エフェクター細胞）、及び、適合する形質導入していないコントロールを、Ｅ：Ｔ（エフェクター：標的）比率を、５：１、１：１、または、１：５として、２４時間添加した。ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ（登録商標）Ｍ５プレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｄｅｖｉｃｅｓ）で、標的細胞の発光を相対発光単位（ＲＬＵ）で測定した。図中の各線は、３回の反復実験の平均を表す（１３Ｃ）。図１３Ｄ～Ｌは、ＩＦＮγ（１３Ｄ）、ＧＭ－ＣＳＦ（１３Ｅ）、グランザイムＡ（１３Ｆ）、グランザイムＢ（１３Ｇ）、ＩＬ－２（１３Ｈ）、ＭＩＰ－１α（１３Ｉ）、ＭＩＰ－１β（１３Ｊ）、ＴＮＦα（１３Ｋ）、及び、パーフォリン（１３Ｌ）を含む卵巣癌患者由来のＳＤ１ε－ＴＦＰ Ｔ細胞のサイトカインプロファイルの測定値を示す。ＭＳＴＯ－ＭＳＬＮ－Ｌｕｃ腫瘍細胞（標的細胞）を、９６平底プレートに、１００００細胞／ウェルで播種した。ＳＤ１ε－ＴＦＰ Ｔ細胞（エフェクター細胞）、及び、適合する形質導入していないコントロールを、１対１の比率で、２４時間添加した。細胞上清を回収し、サイトカインを、Ｌｕｍｉｎｅｘ（登録商標）アッセイを用いて測定した。 卵巣癌患者由来のＭＳＬＮ－ＴＦＰ Ｔ細胞の産生及び機能分析を示す。図１３Ａは、実験計画の概略図である。図１３Ｂ～Ｃは、患者のＳＤ１ε－ＴＦＰ Ｔ細胞が、ＭＳＴＯ－ＭＳＬＮ－Ｌｕｃ腫瘍細胞をインビトロで死滅させることを示す。ＭＳＴＯ－ＭＳＬＮ－Ｌｕｃ腫瘍細胞（標的細胞）は、メソテリン発現が確認されており（１３Ｂ）、ＳＤ１ε－ＴＦＰ Ｔ細胞（エフェクター細胞）、及び、適合する形質導入していないコントロールを、Ｅ：Ｔ（エフェクター：標的）比率を、５：１、１：１、または、１：５として、２４時間添加した。ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ（登録商標）Ｍ５プレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｄｅｖｉｃｅｓ）で、標的細胞の発光を相対発光単位（ＲＬＵ）で測定した。図中の各線は、３回の反復実験の平均を表す（１３Ｃ）。図１３Ｄ～Ｌは、ＩＦＮγ（１３Ｄ）、ＧＭ－ＣＳＦ（１３Ｅ）、グランザイムＡ（１３Ｆ）、グランザイムＢ（１３Ｇ）、ＩＬ－２（１３Ｈ）、ＭＩＰ－１α（１３Ｉ）、ＭＩＰ－１β（１３Ｊ）、ＴＮＦα（１３Ｋ）、及び、パーフォリン（１３Ｌ）を含む卵巣癌患者由来のＳＤ１ε－ＴＦＰ Ｔ細胞のサイトカインプロファイルの測定値を示す。ＭＳＴＯ－ＭＳＬＮ－Ｌｕｃ腫瘍細胞（標的細胞）を、９６平底プレートに、１００００細胞／ウェルで播種した。ＳＤ１ε－ＴＦＰ Ｔ細胞（エフェクター細胞）、及び、適合する形質導入していないコントロールを、１対１の比率で、２４時間添加した。細胞上清を回収し、サイトカインを、Ｌｕｍｉｎｅｘ（登録商標）アッセイを用いて測定した。 卵巣癌患者由来のＭＳＬＮ－ＴＦＰ Ｔ細胞の産生及び機能分析を示す。図１３Ａは、実験計画の概略図である。図１３Ｂ～Ｃは、患者のＳＤ１ε－ＴＦＰ Ｔ細胞が、ＭＳＴＯ－ＭＳＬＮ－Ｌｕｃ腫瘍細胞をインビトロで死滅させることを示す。ＭＳＴＯ－ＭＳＬＮ－Ｌｕｃ腫瘍細胞（標的細胞）は、メソテリン発現が確認されており（１３Ｂ）、ＳＤ１ε－ＴＦＰ Ｔ細胞（エフェクター細胞）、及び、適合する形質導入していないコントロールを、Ｅ：Ｔ（エフェクター：標的）比率を、５：１、１：１、または、１：５として、２４時間添加した。ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ（登録商標）Ｍ５プレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｄｅｖｉｃｅｓ）で、標的細胞の発光を相対発光単位（ＲＬＵ）で測定した。図中の各線は、３回の反復実験の平均を表す（１３Ｃ）。図１３Ｄ～Ｌは、ＩＦＮγ（１３Ｄ）、ＧＭ－ＣＳＦ（１３Ｅ）、グランザイムＡ（１３Ｆ）、グランザイムＢ（１３Ｇ）、ＩＬ－２（１３Ｈ）、ＭＩＰ－１α（１３Ｉ）、ＭＩＰ－１β（１３Ｊ）、ＴＮＦα（１３Ｋ）、及び、パーフォリン（１３Ｌ）を含む卵巣癌患者由来のＳＤ１ε－ＴＦＰ Ｔ細胞のサイトカインプロファイルの測定値を示す。ＭＳＴＯ－ＭＳＬＮ－Ｌｕｃ腫瘍細胞（標的細胞）を、９６平底プレートに、１００００細胞／ウェルで播種した。ＳＤ１ε－ＴＦＰ Ｔ細胞（エフェクター細胞）、及び、適合する形質導入していないコントロールを、１対１の比率で、２４時間添加した。細胞上清を回収し、サイトカインを、Ｌｕｍｉｎｅｘ（登録商標）アッセイを用いて測定した。 卵巣癌患者由来のＭＳＬＮ－ＴＦＰ Ｔ細胞の産生及び機能分析を示す。図１３Ａは、実験計画の概略図である。図１３Ｂ～Ｃは、患者のＳＤ１ε－ＴＦＰ Ｔ細胞が、ＭＳＴＯ－ＭＳＬＮ－Ｌｕｃ腫瘍細胞をインビトロで死滅させることを示す。ＭＳＴＯ－ＭＳＬＮ－Ｌｕｃ腫瘍細胞（標的細胞）は、メソテリン発現が確認されており（１３Ｂ）、ＳＤ１ε－ＴＦＰ Ｔ細胞（エフェクター細胞）、及び、適合する形質導入していないコントロールを、Ｅ：Ｔ（エフェクター：標的）比率を、５：１、１：１、または、１：５として、２４時間添加した。ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ（登録商標）Ｍ５プレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｄｅｖｉｃｅｓ）で、標的細胞の発光を相対発光単位（ＲＬＵ）で測定した。図中の各線は、３回の反復実験の平均を表す（１３Ｃ）。図１３Ｄ～Ｌは、ＩＦＮγ（１３Ｄ）、ＧＭ－ＣＳＦ（１３Ｅ）、グランザイムＡ（１３Ｆ）、グランザイムＢ（１３Ｇ）、ＩＬ－２（１３Ｈ）、ＭＩＰ－１α（１３Ｉ）、ＭＩＰ－１β（１３Ｊ）、ＴＮＦα（１３Ｋ）、及び、パーフォリン（１３Ｌ）を含む卵巣癌患者由来のＳＤ１ε－ＴＦＰ Ｔ細胞のサイトカインプロファイルの測定値を示す。ＭＳＴＯ－ＭＳＬＮ－Ｌｕｃ腫瘍細胞（標的細胞）を、９６平底プレートに、１００００細胞／ウェルで播種した。ＳＤ１ε－ＴＦＰ Ｔ細胞（エフェクター細胞）、及び、適合する形質導入していないコントロールを、１対１の比率で、２４時間添加した。細胞上清を回収し、サイトカインを、Ｌｕｍｉｎｅｘ（登録商標）アッセイを用いて測定した。 卵巣癌患者由来のＭＳＬＮ－ＴＦＰ Ｔ細胞の産生及び機能分析を示す。図１３Ａは、実験計画の概略図である。図１３Ｂ～Ｃは、患者のＳＤ１ε－ＴＦＰ Ｔ細胞が、ＭＳＴＯ－ＭＳＬＮ－Ｌｕｃ腫瘍細胞をインビトロで死滅させることを示す。ＭＳＴＯ－ＭＳＬＮ－Ｌｕｃ腫瘍細胞（標的細胞）は、メソテリン発現が確認されており（１３Ｂ）、ＳＤ１ε－ＴＦＰ Ｔ細胞（エフェクター細胞）、及び、適合する形質導入していないコントロールを、Ｅ：Ｔ（エフェクター：標的）比率を、５：１、１：１、または、１：５として、２４時間添加した。ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ（登録商標）Ｍ５プレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｄｅｖｉｃｅｓ）で、標的細胞の発光を相対発光単位（ＲＬＵ）で測定した。図中の各線は、３回の反復実験の平均を表す（１３Ｃ）。図１３Ｄ～Ｌは、ＩＦＮγ（１３Ｄ）、ＧＭ－ＣＳＦ（１３Ｅ）、グランザイムＡ（１３Ｆ）、グランザイムＢ（１３Ｇ）、ＩＬ－２（１３Ｈ）、ＭＩＰ－１α（１３Ｉ）、ＭＩＰ－１β（１３Ｊ）、ＴＮＦα（１３Ｋ）、及び、パーフォリン（１３Ｌ）を含む卵巣癌患者由来のＳＤ１ε－ＴＦＰ Ｔ細胞のサイトカインプロファイルの測定値を示す。ＭＳＴＯ－ＭＳＬＮ－Ｌｕｃ腫瘍細胞（標的細胞）を、９６平底プレートに、１００００細胞／ウェルで播種した。ＳＤ１ε－ＴＦＰ Ｔ細胞（エフェクター細胞）、及び、適合する形質導入していないコントロールを、１対１の比率で、２４時間添加した。細胞上清を回収し、サイトカインを、Ｌｕｍｉｎｅｘ（登録商標）アッセイを用いて測定した。 卵巣癌患者由来のＭＳＬＮ－ＴＦＰ Ｔ細胞の産生及び機能分析を示す。図１３Ａは、実験計画の概略図である。図１３Ｂ～Ｃは、患者のＳＤ１ε－ＴＦＰ Ｔ細胞が、ＭＳＴＯ－ＭＳＬＮ－Ｌｕｃ腫瘍細胞をインビトロで死滅させることを示す。ＭＳＴＯ－ＭＳＬＮ－Ｌｕｃ腫瘍細胞（標的細胞）は、メソテリン発現が確認されており（１３Ｂ）、ＳＤ１ε－ＴＦＰ Ｔ細胞（エフェクター細胞）、及び、適合する形質導入していないコントロールを、Ｅ：Ｔ（エフェクター：標的）比率を、５：１、１：１、または、１：５として、２４時間添加した。ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ（登録商標）Ｍ５プレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｄｅｖｉｃｅｓ）で、標的細胞の発光を相対発光単位（ＲＬＵ）で測定した。図中の各線は、３回の反復実験の平均を表す（１３Ｃ）。図１３Ｄ～Ｌは、ＩＦＮγ（１３Ｄ）、ＧＭ－ＣＳＦ（１３Ｅ）、グランザイムＡ（１３Ｆ）、グランザイムＢ（１３Ｇ）、ＩＬ－２（１３Ｈ）、ＭＩＰ－１α（１３Ｉ）、ＭＩＰ－１β（１３Ｊ）、ＴＮＦα（１３Ｋ）、及び、パーフォリン（１３Ｌ）を含む卵巣癌患者由来のＳＤ１ε－ＴＦＰ Ｔ細胞のサイトカインプロファイルの測定値を示す。ＭＳＴＯ－ＭＳＬＮ－Ｌｕｃ腫瘍細胞（標的細胞）を、９６平底プレートに、１００００細胞／ウェルで播種した。ＳＤ１ε－ＴＦＰ Ｔ細胞（エフェクター細胞）、及び、適合する形質導入していないコントロールを、１対１の比率で、２４時間添加した。細胞上清を回収し、サイトカインを、Ｌｕｍｉｎｅｘ（登録商標）アッセイを用いて測定した。 卵巣癌患者由来のＭＳＬＮ－ＴＦＰ Ｔ細胞の産生及び機能分析を示す。図１３Ａは、実験計画の概略図である。図１３Ｂ～Ｃは、患者のＳＤ１ε－ＴＦＰ Ｔ細胞が、ＭＳＴＯ－ＭＳＬＮ－Ｌｕｃ腫瘍細胞をインビトロで死滅させることを示す。ＭＳＴＯ－ＭＳＬＮ－Ｌｕｃ腫瘍細胞（標的細胞）は、メソテリン発現が確認されており（１３Ｂ）、ＳＤ１ε－ＴＦＰ Ｔ細胞（エフェクター細胞）、及び、適合する形質導入していないコントロールを、Ｅ：Ｔ（エフェクター：標的）比率を、５：１、１：１、または、１：５として、２４時間添加した。ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ（登録商標）Ｍ５プレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｄｅｖｉｃｅｓ）で、標的細胞の発光を相対発光単位（ＲＬＵ）で測定した。図中の各線は、３回の反復実験の平均を表す（１３Ｃ）。図１３Ｄ～Ｌは、ＩＦＮγ（１３Ｄ）、ＧＭ－ＣＳＦ（１３Ｅ）、グランザイムＡ（１３Ｆ）、グランザイムＢ（１３Ｇ）、ＩＬ－２（１３Ｈ）、ＭＩＰ－１α（１３Ｉ）、ＭＩＰ－１β（１３Ｊ）、ＴＮＦα（１３Ｋ）、及び、パーフォリン（１３Ｌ）を含む卵巣癌患者由来のＳＤ１ε－ＴＦＰ Ｔ細胞のサイトカインプロファイルの測定値を示す。ＭＳＴＯ－ＭＳＬＮ－Ｌｕｃ腫瘍細胞（標的細胞）を、９６平底プレートに、１００００細胞／ウェルで播種した。ＳＤ１ε－ＴＦＰ Ｔ細胞（エフェクター細胞）、及び、適合する形質導入していないコントロールを、１対１の比率で、２４時間添加した。細胞上清を回収し、サイトカインを、Ｌｕｍｉｎｅｘ（登録商標）アッセイを用いて測定した。 卵巣癌患者由来のＭＳＬＮ－ＴＦＰ Ｔ細胞の産生及び機能分析を示す。図１３Ａは、実験計画の概略図である。図１３Ｂ～Ｃは、患者のＳＤ１ε－ＴＦＰ Ｔ細胞が、ＭＳＴＯ－ＭＳＬＮ－Ｌｕｃ腫瘍細胞をインビトロで死滅させることを示す。ＭＳＴＯ－ＭＳＬＮ－Ｌｕｃ腫瘍細胞（標的細胞）は、メソテリン発現が確認されており（１３Ｂ）、ＳＤ１ε－ＴＦＰ Ｔ細胞（エフェクター細胞）、及び、適合する形質導入していないコントロールを、Ｅ：Ｔ（エフェクター：標的）比率を、５：１、１：１、または、１：５として、２４時間添加した。ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ（登録商標）Ｍ５プレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｄｅｖｉｃｅｓ）で、標的細胞の発光を相対発光単位（ＲＬＵ）で測定した。図中の各線は、３回の反復実験の平均を表す（１３Ｃ）。図１３Ｄ～Ｌは、ＩＦＮγ（１３Ｄ）、ＧＭ－ＣＳＦ（１３Ｅ）、グランザイムＡ（１３Ｆ）、グランザイムＢ（１３Ｇ）、ＩＬ－２（１３Ｈ）、ＭＩＰ－１α（１３Ｉ）、ＭＩＰ－１β（１３Ｊ）、ＴＮＦα（１３Ｋ）、及び、パーフォリン（１３Ｌ）を含む卵巣癌患者由来のＳＤ１ε－ＴＦＰ Ｔ細胞のサイトカインプロファイルの測定値を示す。ＭＳＴＯ－ＭＳＬＮ－Ｌｕｃ腫瘍細胞（標的細胞）を、９６平底プレートに、１００００細胞／ウェルで播種した。ＳＤ１ε－ＴＦＰ Ｔ細胞（エフェクター細胞）、及び、適合する形質導入していないコントロールを、１対１の比率で、２４時間添加した。細胞上清を回収し、サイトカインを、Ｌｕｍｉｎｅｘ（登録商標）アッセイを用いて測定した。 ＭＳＬＮ高度異種移植片腫瘍マウスモデルにおける、患者由来のＳＤ１ ＣＤ３ε－ＴＦＰ Ｔ細胞のインビボでの有効性を示す。ＭＳＴＯ－２１１Ｈ－ＦＬ ＭＳＬＮ－Ｌｕｃ細胞を、マウス１匹あたり、１×１０６個の細胞で皮下接種した。腫瘍を注射して１０日後（腫瘍体積は約２００～３００ｍｍ３）に、５×１０６個のＴ細胞を、各動物に静脈内注射した。図中の各線は、一匹の動物を表す。データは、ＮＤ１２（１４Ａ）、患者１（１４Ｂ）、患者２（１４Ｃ）、患者３（１４Ｄ）、及び、患者４（１４Ｅ）由来のＴ細胞について示している。丸形は、形質導入していないＴ細胞を接種したマウスにおける腫瘍の大きさを示しており、四角は、ＴＦＰ Ｔ細胞を接種したマウスにおける腫瘍の大きさを示す。 ＭＳＬＮ高度異種移植片腫瘍マウスモデルにおける、患者由来のＳＤ１ ＣＤ３ε－ＴＦＰ Ｔ細胞のインビボでの有効性を示す。ＭＳＴＯ－２１１Ｈ－ＦＬ ＭＳＬＮ－Ｌｕｃ細胞を、マウス１匹あたり、１×１０６個の細胞で皮下接種した。腫瘍を注射して１０日後（腫瘍体積は約２００～３００ｍｍ３）に、５×１０６個のＴ細胞を、各動物に静脈内注射した。図中の各線は、一匹の動物を表す。データは、ＮＤ１２（１４Ａ）、患者１（１４Ｂ）、患者２（１４Ｃ）、患者３（１４Ｄ）、及び、患者４（１４Ｅ）由来のＴ細胞について示している。丸形は、形質導入していないＴ細胞を接種したマウスにおける腫瘍の大きさを示しており、四角は、ＴＦＰ Ｔ細胞を接種したマウスにおける腫瘍の大きさを示す。 ＭＳＬＮ高度異種移植片腫瘍マウスモデルにおける、患者由来のＳＤ１ ＣＤ３ε－ＴＦＰ Ｔ細胞のインビボでの有効性を示す。ＭＳＴＯ－２１１Ｈ－ＦＬ ＭＳＬＮ－Ｌｕｃ細胞を、マウス１匹あたり、１×１０６個の細胞で皮下接種した。腫瘍を注射して１０日後（腫瘍体積は約２００～３００ｍｍ３）に、５×１０６個のＴ細胞を、各動物に静脈内注射した。図中の各線は、一匹の動物を表す。データは、ＮＤ１２（１４Ａ）、患者１（１４Ｂ）、患者２（１４Ｃ）、患者３（１４Ｄ）、及び、患者４（１４Ｅ）由来のＴ細胞について示している。丸形は、形質導入していないＴ細胞を接種したマウスにおける腫瘍の大きさを示しており、四角は、ＴＦＰ Ｔ細胞を接種したマウスにおける腫瘍の大きさを示す。 ＭＳＬＮ高度異種移植片腫瘍マウスモデルにおける、患者由来のＳＤ１ ＣＤ３ε－ＴＦＰ Ｔ細胞のインビボでの有効性を示す。ＭＳＴＯ－２１１Ｈ－ＦＬ ＭＳＬＮ－Ｌｕｃ細胞を、マウス１匹あたり、１×１０６個の細胞で皮下接種した。腫瘍を注射して１０日後（腫瘍体積は約２００～３００ｍｍ３）に、５×１０６個のＴ細胞を、各動物に静脈内注射した。図中の各線は、一匹の動物を表す。データは、ＮＤ１２（１４Ａ）、患者１（１４Ｂ）、患者２（１４Ｃ）、患者３（１４Ｄ）、及び、患者４（１４Ｅ）由来のＴ細胞について示している。丸形は、形質導入していないＴ細胞を接種したマウスにおける腫瘍の大きさを示しており、四角は、ＴＦＰ Ｔ細胞を接種したマウスにおける腫瘍の大きさを示す。 ＭＳＬＮ高度異種移植片腫瘍マウスモデルにおける、患者由来のＳＤ１ ＣＤ３ε－ＴＦＰ Ｔ細胞のインビボでの有効性を示す。ＭＳＴＯ－２１１Ｈ－ＦＬ ＭＳＬＮ－Ｌｕｃ細胞を、マウス１匹あたり、１×１０６個の細胞で皮下接種した。腫瘍を注射して１０日後（腫瘍体積は約２００～３００ｍｍ３）に、５×１０６個のＴ細胞を、各動物に静脈内注射した。図中の各線は、一匹の動物を表す。データは、ＮＤ１２（１４Ａ）、患者１（１４Ｂ）、患者２（１４Ｃ）、患者３（１４Ｄ）、及び、患者４（１４Ｅ）由来のＴ細胞について示している。丸形は、形質導入していないＴ細胞を接種したマウスにおける腫瘍の大きさを示しており、四角は、ＴＦＰ Ｔ細胞を接種したマウスにおける腫瘍の大きさを示す。
ある態様において、本明細書では、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）融合タンパク質（ＴＦＰ）をコードする単離した核酸分子であって、当該ＴＦＰが、ＴＣＲサブユニット、及び、抗メソテリン結合ドメインを含むヒトまたはヒト化抗体ドメインを含む分子を説明する。幾つかの実施形態では、当該ＴＣＲサブユニットは、ＴＣＲ細胞外ドメインを含む。その他の実施形態では、当該ＴＣＲサブユニットは、ＴＣＲ膜貫通ドメインを含む。さらに他の実施形態では、当該ＴＣＲサブユニットは、ＴＣＲ細胞内ドメインを含む。さらなる実施形態では、当該ＴＣＲサブユニットは、（ｉ）ＴＣＲ細胞外ドメイン、（ｉｉ）ＴＣＲ膜貫通ドメイン、及び、（ｉｉｉ）ＴＣＲ細胞内ドメインを含み、（ｉ）、（ｉｉ）、及び、（ｉｉｉ）の少なくとも２つは、同じＴＣＲサブユニット由来である。さらに別の実施形態では、当該ＴＣＲサブユニットは、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ３ガンマ、もしくはＣＤ３デルタの細胞内シグナル伝達ドメインから選択される刺激ドメイン、または、それらに対する少なくとも１つ、２つ、もしくは３つの修飾を有するアミノ酸配列を含むＴＣＲの細胞内ドメインを含む。さらに別の実施形態では、当該ＴＣＲサブユニットは、４－１ＢＢの機能的シグナル伝達ドメイン、及び／または、ＣＤ３ゼータの機能的シグナル伝達ドメインから選択される刺激ドメイン、または、それらに対する少なくとも１つ、２つ、または、３つの修飾を有するアミノ酸配列を含む細胞内ドメインを含む。
幾つかの実施形態では、当該単離した核酸分子は、（ｉ）本明細書で提供したあらゆる抗メソテリン軽鎖結合ドメインアミノ酸配列の軽鎖（ＬＣ）ＣＤＲ１、ＬＣ ＣＤＲ２、及びＬＣ ＣＤＲ３、及び／または、（ｉｉ）本明細書で提供したあらゆる抗メソテリン重鎖結合ドメインアミノ酸配列の重鎖（ＨＣ）ＣＤＲ１、ＨＣ ＣＤＲ２、及び、ＨＣ ＣＤＲ３を含む。
幾つかの実施形態では、当該軽鎖可変領域は、本明細書で提供した軽鎖可変領域のアミノ酸配列の少なくとも１つ、２つ、または、３つの修飾から、最大で３０、２０、または、１０個までの修飾を有するアミノ酸配列、または、本明細書で提供したアミノ酸配列に対して９５～９９％の同一性を有する配列を含む。その他の実施形態では、当該重鎖可変領域は、本明細書で提供した重鎖可変領域のアミノ酸配列の少なくとも１つ、２つ、または、３つの修飾から、最大で３０、２０、または、１０個までの修飾を有するアミノ酸配列、または、本明細書で提供したアミノ酸配列に対して９５～９９％の同一性を有する配列を含む。
幾つかの実施形態では、当該ＴＦＰは、Ｔ細胞受容体の当該アルファまたはベータ鎖、ＣＤ３デルタ、ＣＤ３イプシロン、または、ＣＤ３ガンマからなる群から選択されるタンパク質の細胞外ドメインまたはその一部、または、それらの機能的断片、または、それらに対する少なくとも１つ、２つ、もしくは３つの修飾から、最大で２０、１０、または、５個までの修飾を有するアミノ酸配列を含むＴＣＲサブユニットの細胞外ドメインを含む。その他の実施形態では、コードした当該ＴＦＰは、ＴＣＲの当該アルファ鎖、ベータ鎖、または、ＴＣＲサブユニットＣＤ３イプシロン、ＣＤ３ガンマ、及び、ＣＤ３デルタからなる群から選択されるタンパク質の膜貫通ドメイン、または、それらの機能的断片、または、それらに対する少なくとも１つ、２つ、または、３つの修飾から、最大で２０、１０、または、５個までの修飾を有するアミノ酸配列を含む膜貫通ドメインを含む。
幾つかの実施形態では、コードした当該ＴＦＰは、当該ＴＣＲのアルファ、ベータ、または、ゼータ鎖、または、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ３ガンマ、及び、ＣＤ３デルタＣＤ４５、ＣＤ２、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ２８、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、及び、ＣＤ１５４からなる群から選択されるタンパク質の膜貫通ドメイン、または、それらの機能的断片、または、それらに対する少なくとも１つ、２つ、もしくは３つの修飾から、最大で２０、１０、または、５個までの修飾を有するアミノ酸配列を含む膜貫通ドメインを含む。
幾つかの実施形態では、コードした当該抗メソテリン結合ドメインを、リンカー配列で、当該ＴＣＲの細胞外ドメインと連結する。幾つかの例では、コードした当該リンカー配列は、（Ｇ４Ｓ）ｎを含み、式中、ｎ＝１～４である。幾つかの例では、コードした当該リンカー配列は、長いリンカー（ＬＬ）配列を含む。幾つかの例では、コードした当該長いリンカー配列は、（Ｇ４Ｓ）ｎを含み、式中、ｎ＝２～４である。幾つかの例では、コードした当該リンカー配列は、短いリンカー（ＳＬ）配列を含む。幾つかの例では、コードした当該短いリンカー配列は、（Ｇ４Ｓ）ｎを含み、式中、ｎ＝１～３である。
幾つかの実施形態では、当該単離した核酸分子は、共刺激ドメインをコードする配列をさらに含む。幾つかの例では、当該共刺激ドメインは、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＣＤ３０、ＬＩＧＨＴ、ＯＸ４０、ＣＤ２、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ－１、ＬＦＡ－１（ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８）、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）、及び、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）からなる群から選択されるタンパク質、または、それらに対する少なくとも１つ、２つ、または、３つの修飾から、最大で２０、１０、または、５個までの修飾を有するアミノ酸配列から得られる機能的シグナル伝達ドメインである。
幾つかの実施形態では、当該単離した核酸分子は、リーダー配列をさらに含む。
また、本明細書では、上記した核酸分子のいずれかでコードした単離したポリペプチド分子も提供する。
また、別の態様において、本明細書では、ヒトまたはヒト化抗メソテリン結合ドメイン、ＴＣＲ細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び、細胞内ドメインを含む単離したＴ細胞受容体融合タンパク質（ＴＦＰ）分子を提供する。幾つかの実施形態では、当該単離したＴＦＰ分子は、ヒトまたはヒト化抗メソテリン結合ドメイン、ＴＣＲ細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び、細胞内ドメインを含む抗体または抗体断片を含む。
幾つかの態様では、当該ヒトまたはヒト化抗体ドメインは、抗体断片を含む。幾つかの実施形態では、当該ヒトまたはヒト化抗体ドメインは、ｓｃＦｖまたはＶＨドメインを含む。
幾つかの実施形態では、当該抗メソテリン結合ドメインは、ｓｃＦｖまたはＶＨドメインである。その他の実施形態では、当該抗メソテリン結合ドメインは、本明細書で提供したアミノ酸配列の軽鎖及び重鎖、または、それらの機能的断片、または、本明細書で提供した軽鎖可変領域のアミノ酸配列の少なくとも１つ、２つ、または、３つの修飾から、最大で、３０、２０、または、１０個までの修飾を有するアミノ酸配列、または、本明細書で提供したアミノ酸配列に対して９５～９９％の同一性を有する配列を含む。
幾つかの実施形態では、当該単離したＴＦＰ分子は、Ｔ細胞受容体のアルファ、または、ベータ鎖、ＣＤ３デルタ、ＣＤ３イプシロン、または、ＣＤ３ガンマからなる群から選択されるタンパク質の細胞外ドメイン、または、その一部、または、それらに対する少なくとも１つ、２つ、または、３つの修飾から、最大で２０、１０、または、５個までの修飾を有するアミノ酸配列を含むＴＣＲ細胞外ドメインを含む。
幾つかの実施形態では、当該メソテリン結合ドメインは、リンカー配列で、当該ＴＣＲ細胞外ドメインに連結する。幾つかの例では、当該リンカー領域は、（Ｇ４Ｓ）ｎを含み、式中、ｎ＝１～４である。幾つかの例では、当該リンカー配列は、長いリンカー（ＬＬ）配列を含む。幾つかの例では、当該長いリンカー配列は、（Ｇ４Ｓ）ｎを含み、式中、ｎ＝２～４である。幾つかの例では、当該リンカー配列は、短いリンカー（ＳＬ）配列を含む。幾つかの例では、当該短いリンカー配列は、（Ｇ４Ｓ）ｎを含み、式中、ｎ＝１～３である。
幾つかの実施形態では、当該単離したＴＦＰ分子は、共刺激ドメインをコードする配列をさらに含む。その他の実施形態では、当該単離したＴＦＰ分子は、細胞内シグナル伝達ドメインをコードする配列をさらに含む。さらに他の実施形態では、当該単離したＴＦＰ分子は、リーダー配列をさらに含む。
また、本明細書では、上記したＴＦＰ分子のいずれかをコードする核酸分子を含むベクターを提供する。幾つかの実施形態では、当該ベクターは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、プラスミド、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、または、レトロウイルスベクターからなる群から選択される。幾つかの実施形態では、当該ベクターは、プロモーターをさらに含む。幾つかの実施形態では、当該ベクターは、インビトロで転写したベクターである。幾つかの実施形態では、当該ベクターの核酸配列は、ポリ（Ａ）尾部をさらに含む。幾つかの実施形態では、当該ベクターの核酸配列は、３’ＵＴＲをさらに含む。
また、本明細書では、本明細書に記載したベクターのいずれかを含む細胞を提供する。幾つかの実施形態では、当該細胞は、ヒトＴ細胞である。幾つかの実施形態では、当該細胞は、ＣＤ８＋またはＣＤ４＋Ｔ細胞である。その他の実施形態では、当該細胞は、阻害分子の少なくとも一部を含む第１のポリペプチドを含み、細胞内シグナル伝達ドメインからのポジティブシグナルを含む第２のポリペプチドと会合した阻害分子をコードする核酸をさらに含む。幾つかの例では、当該阻害分子は、ＰＤ１の少なくとも一部を含む第１のポリペプチドと、共刺激ドメイン及び一次シグナル伝達ドメインを含む第２のポリペプチドとを含む。
別の態様において、本明細書では、ヒトまたはヒト化抗メソテリン結合ドメイン、ＴＣＲ細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び、細胞内シグナル伝達ドメインを含む単離したＴＦＰ分子を提供し、当該ＴＦＰ分子は、内因性ＴＣＲ複合体、及び／または、少なくとも１つの内因性ＴＣＲポリペプチドと機能的に相互作用することができる。
別の態様において、本明細書では、ヒトまたはヒト化抗メソテリン結合ドメイン、ＴＣＲ細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び、細胞内シグナル伝達ドメインを含む単離したＴＦＰ分子を提供し、当該ＴＦＰ分子は、内因性ＴＣＲと機能的に統合することができる。
別の態様において、本明細書では、ヒトＣＤ８＋またはＣＤ４＋Ｔ細胞であって、少なくとも２つのＴＦＰ分子を含み、当該ＴＦＰ分子が、ヒトまたはヒト化抗メソテリン結合ドメイン、ＴＣＲ細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び、細胞内ドメインを含み、当該ＴＦＰ分子が、当該ヒトＣＤ８＋またはＣＤ４＋Ｔ細胞において、同細胞にて、及び／または、同細胞の表面で、内因性ＴＣＲ複合体、及び／または、少なくとも１つの内因性ＴＣＲポリペプチドと機能的に相互作用することができる当該ヒトＣＤ８＋またはＣＤ４＋Ｔ細胞を提供する。
別の態様において、本明細書では、ｉ）ヒトまたはヒト化抗メソテリン結合ドメイン、ＴＣＲ細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び、細胞内ドメインを含むＴＦＰ分子、及び、ｉｉ）少なくとも１つの内因性ＴＣＲ複合体を含む、タンパク質複合体を提供する。
幾つかの実施形態では、当該ＴＣＲは、当該Ｔ細胞受容体のアルファまたはベータ鎖、ＣＤ３デルタ、ＣＤ３イプシロン、または、ＣＤ３ガンマからなる群から選択されるタンパク質の細胞外ドメイン、または、その一部を含む。幾つかの実施形態では、当該抗メソテリン結合ドメインを、リンカー配列で、当該ＴＣＲの細胞外ドメインに連結する。幾つかの例では、当該リンカー領域は、（Ｇ４Ｓ）ｎを含み、式中、ｎ＝１～４である。幾つかの例では、当該リンカー配列は、長いリンカー（ＬＬ）配列を含む。幾つかの例では、当該長いリンカー配列は、（Ｇ４Ｓ）ｎを含み、式中、ｎ＝２～４である。幾つかの例では、当該リンカー配列は、短いリンカー（ＳＬ）配列を含む。幾つかの例では、当該短いリンカー配列は、（Ｇ４Ｓ）ｎを含み、式中、ｎ＝１～３である。
また、本明細書では、本明細書に記載したあらゆるタンパク質複合体あたり、少なくとも２つの異なるＴＦＰタンパク質を含むヒトＣＤ８＋またはＣＤ４＋Ｔ細胞を提供する。
別の態様において、本明細書では、ヒトＣＤ８＋またはＣＤ４＋Ｔ細胞の集団であって、当該集団の当該Ｔ細胞が、個々に、または、集合的に、少なくとも２つのＴＦＰ分子を含み、当該ＴＦＰ分子が、ヒトまたはヒト化抗メソテリン結合ドメイン、ＴＣＲ細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び、細胞内ドメインを含み、当該ＴＦＰ分子が、当該ヒトＣＤ８＋またはＣＤ４＋Ｔ細胞において、同細胞にて、及び／または、同細胞の表面で、内因性ＴＣＲ複合体、及び／または、少なくとも１つの内因性ＴＣＲポリペプチドと機能的に相互作用することができる当該ヒトＣＤ８＋またはＣＤ４＋Ｔ細胞の集団を提供する。
別の態様において、本明細書では、ヒトＣＤ８＋またはＣＤ４＋Ｔ細胞の集団であって、当該集団の当該Ｔ細胞が、個々に、または、集合的に、本明細書で提供した単離した核酸分子でコードした少なくとも２つのＴＦＰ分子を含む当該ヒトＣＤ８＋またはＣＤ４＋Ｔ細胞の集団を提供する。
別の態様において、本明細書では、本明細書に記載したあらゆるベクターを用いてＴ細胞に形質導入することを含む、細胞の作製方法を提供する。
別の態様において、本明細書では、インビトロで転写したＲＮＡまたは合成ＲＮＡを細胞に導入することを含む、ＲＮＡ改変細胞集団の生成方法であって、当該ＲＮＡが、本明細書に記載したＴＦＰ分子のいずれかをコードする核酸を含む、当該方法を提供する。
別の態様において、本明細書では、哺乳動物に抗腫瘍免疫を与える方法であって、当該哺乳動物に対して、本明細書に記載のＴＦＰ分子のいずれかを発現する細胞の有効量を投与することを含む、当該方法を提供する。幾つかの実施形態では、当該細胞は、自己Ｔ細胞である。幾つかの実施形態では、当該細胞は、同種異系Ｔ細胞である。幾つかの実施形態では、当該哺乳動物は、ヒトである。
別の態様において、本明細書では、メソテリンの発現に関連する疾患を有する哺乳動物を処置する方法であって、当該哺乳動物に対して、本明細書に記載のＴＦＰ分子のいずれかを含む細胞の有効量を投与することを含む、当該方法を提供する。幾つかの実施形態では、メソテリン発現に関連する当該疾患は、がんまたは悪性腫瘍などの増殖性疾患、または、膵臓癌、卵巣癌、胃癌、肺癌、または、子宮内膜癌などの前癌状態から選択され、あるいは、メソテリンの発現に関連した非がん関連の適応症である。
幾つかの実施形態では、本明細書に記載したＴＦＰ分子のいずれかを発現する細胞を、ＴＦＰ分子を発現する細胞の投与に伴う１つ以上の副作用を改善する作用物質と組み合わせて投与する。幾つかの実施形態では、本明細書に記載したＴＦＰ分子のいずれかを発現する当該細胞を、メソテリンに関連する疾患を処置する作用物質と組み合わせて投与する。
また、本明細書では、医薬として使用する、本明細書に記載した、あらゆる単離した核酸分子、あらゆる単離したポリペプチド分子、あらゆる単離したＴＦＰ、あらゆるタンパク質複合体、あらゆるベクター、または、あらゆる細胞を提供する。
定義
特に定義されていない限り、本明細書で用いるすべての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。
用語「ａ」及び「ａｎ」は、当該冠詞の文法上の目的語の１つ以上（すなわち、少なくとも１つ）のものを指す。例として、「要素」は、１つ以上の要素を意味する。
本明細書では、「約」は、状況、及び、当業者が知る、または、知り得ることに応じて、±１パーセント未満、または、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、または、３０パーセント超を意味することができる。
本明細書では、「ｓｕｂｊｅｃｔ（対象）」、または、「ｓｕｂｊｅｃｔｓ（対象）」、または、「個体」として、哺乳動物、例えば、ヒトまたは非ヒト哺乳動物、例えば、家畜、農業用、または、野生の動物、ならびに、鳥類、及び、水生動物などがあるが、これらに限定されない。「患者」は、疾患、障害、または、病態に罹患している、あるいは、その発病の危険性がある対象、さもなければ、本明細書で提供する組成物及び方法を必要とする対象である。
本明細書では、「処置する」または「処置」は、当該疾患または病態の処置または改善における、あらゆる成功の兆しのことを指す。処置するとは、例えば、当該疾患または病態の１つ以上の症状の重症度を低下させること、進行を遅らせること、または、軽減することを含む場合もあり、あるいは、患者が経験する疾患、不自由、障害、または、悪条件等の症状の頻度を減少させることを含む場合もある。本明細書では、「処置または予防」は、当該疾患または病態のある程度の処置または改善をもたらす方法を指すものとして本明細書で使用しており、また、当該病態の完全な予防など、このことに限らず、それらの目的に関する様々な結果を企図している。
本明細書では、「予防する」は、患者における疾患または病態、例えば、腫瘍形成の予防のことを指す。例えば、腫瘍またはその他のがんの形態の発症の危険性がある個体が本発明の方法で処置を受け、後に当該腫瘍またはその他のがんの形態を発症しない場合、当該疾患は、少なくともある期間にわたって、その個体において予防されている。
本明細書では、「治療有効量」は、組成物またはその活性成分の量であって、当該組成物を投与する個体に対して有益な効果を与える、さもなければ、有害な有益でない事象を減少させるのに十分な量のことである。「治療有効用量」は、本明細書では、１つ以上の所望の、または、望ましい（例えば、有益な）効果を生み出すために投与される用量のことを意味し、かかる投与は、特定期間に１回以上存在する。正確な用量は、当該治療の目的によって定まり、そして、当業者であれば、既知の技術を用いて解明することができる（例えば、Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ （ｖｏｌｓ． １－３， １９９２）；Ｌｌｏｙｄ， Ｔｈｅ Ａｒｔ， Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｃｏｍｐｏｕｎｄｉｎｇ （１９９９）；及び、Ｐｉｃｋａｒ， Ｄｏｓａｇｅ Ｃａｌｃｕｌａｔｉｏｎｓ （１９９９）を参照されたい）。
本明細書では、「Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）融合タンパク質」または「ＴＦＰ」は、当該ＴＣＲを含む様々なポリペプチド由来の組換えポリペプチドを含み、当該ＴＣＲは、一般的には、ｉ）標的細胞の表面抗原に結合すること、及び、ｉｉ）通常は、Ｔ細胞内またはその表面で同一の場所に配置された場合に、インタクトなＴＣＲ複合体の他のポリペプチド成分と相互作用することができる。「ＴＦＰ Ｔ細胞」は、（例えば、本明細書で開示した方法にしたがって）形質導入しており、そして、例えば、天然のＴＣＲに組み込まれている、ＴＦＰを発現するＴ細胞である。幾つかの実施形態では、Ｔ細胞は、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、または、ＣＤ４＋／ＣＤ８＋Ｔ細胞である。幾つかの実施形態では、当該ＴＦＰ Ｔ細胞は、ＮＫ細胞である。幾つかの実施形態では、当該ＴＦＰ Ｔ細胞は、ガンマ－デルタＴ細胞である。
本明細書では、用語「メソテリン」、別名、ＭＳＬＮ、または、ＣＡＫ１抗原、または、前巨核球増強因子は、ヒトにおいて、ＭＳＬＮ（または、巨核球増強因子（ＭＰＦ））遺伝子がコードするタンパク質のことを指す。メソテリンは、正常な中皮細胞に存在しており、また、中皮腫、卵巣、及び、膵臓腺癌などの幾つかのヒト腫瘍で過剰発現している４０ｋＤａのタンパク質である。当該メソテリン遺伝子は、グリコホスファチジルイノシトール結合、及び、巨核球増強因子（ＭＰＦ）と命名した３１ｋＤａの生成断片によって細胞膜に結合しているメソテリンを産生するように処理される前駆体タンパク質をコードする。メソテリンは、細胞接着に関与し得るかもしれないが、その生物学的機能は不明である。メソテリンは、通常は、胸膜、腹膜、及び、心膜を覆う中皮細胞に存在する腫瘍分化抗原である。メソテリンは、中皮腫細胞、卵巣癌細胞、膵臓腺癌細胞、及び、幾つかの扁平上皮癌において検出可能な抗原決定基である（例えば、Ｋｏｊｉｍａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：２１９８４－２１９９０（１９９５）、及び、Ｏｎｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１２：４２２５－４２３１（２００６）を参照されたい）。メソテリンは、ＣＡ１２５／ＭＵＣ１６と相互作用する（例えば、Ｒｕｍｐ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９：９１９０－９１９８（２００４）、及び、Ｍａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８７：３３１２３－３３１３１（２０１２）を参照されたい）。
ヒト及びマウスのアミノ酸、及び、核酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋ、ＵｎｉＰｒｏｔ、及び、Ｓｗｉｓｓ－Ｐｒｏｔなどの公共のデータベースから得ることができる。例えば、ヒトメソテリンのアミノ酸配列は、ＵｎｉＰｒｏｔ／Ｓｗｉｓｓ－Ｐｒｏｔ受託番号第Ｑ１３４２１にある。ヒトメソテリンポリペプチドの標準配列は、ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号第Ｑ１３４２１号（または、第Ｑ１３４２１－１号）である。
ＭＡＬＰＴＡＲＰＬＬＧＳＣＧＴＰＡＬＧＳＬＬＦＬＬＦＳＬＧＷＶＱＰＳＲＴＬＡＧＥＴＧＱＥＡＡＰＬＤＧＶＬＡＮＰＰＮＩＳＳＬＳＰＲＱＬＬＧＦＰＣＡＥＶＳＧＬＳＴＥＲＶＲＥＬＡＶＡＬＡＱＫＮＶＫＬＳＴＥＱＬＲＣＬＡＨＲＬＳＥＰＰＥＤＬＤＡＬＰＬＤＬＬＬＦＬＮＰＤＡＦＳＧＰＱＡＣＴＲＦＦＳＲＩＴＫＡＮＶＤＬＬＰＲＧＡＰＥＲＱＲＬＬＰＡＡＬＡＣＷＧＶＲＧＳＬＬＳＥＡＤＶＲＡＬＧＧＬＡＣＤＬＰＧＲＦＶＡＥＳＡＥＶＬＬＰＲＬＶＳＣＰＧＰＬＤＱＤＱＱＥＡＡＲＡＡＬＱＧＧＧＰＰＹＧＰＰＳＴＷＳＶＳＴＭＤＡＬＲＧＬＬＰＶＬＧＱＰＩＩＲＳＩＰＱＧＩＶＡＡＷＲＱＲＳＳＲＤＰＳＷＲＱＰＥＲＴＩＬＲＰＲＦＲＲＥＶＥＫＴＡＣＰＳＧＫＫＡＲＥＩＤＥＳＬＩＦＹＫＫＷＥＬＥＡＣＶＤＡＡＬＬＡＴＱＭＤＲＶＮＡＩＰＦＴＹＥＱＬＤＶＬＫＨＫＬＤＥＬＹＰＱＧＹＰＥＳＶＩＱＨＬＧＹＬＦＬＫＭＳＰＥＤＩＲＫＷＮＶＴＳＬＥＴＬＫＡＬＬＥＶＮＫＧＨＥＭＳＰＱＡＰＲＲＰＬＰＱＶＡＴＬＩＤＲＦＶＫＧＲＧＱＬＤＫＤＴＬＤＴＬＴＡＦＹＰＧＹＬＣＳＬＳＰＥＥＬＳＳＶＰＰＳＳＩＷＡＶＲＰＱＤＬＤＴＣＤＰＲＱＬＤＶＬＹＰＫＡＲＬＡＦＱＮＭＮＧＳＥＹＦＶＫＩＱＳＦＬＧＧＡＰＴＥＤＬＫＡＬＳＱＱＮＶＳＭＤＬＡＴＦＭＫＬＲＴＤＡＶＬＰＬＴＶＡＥＶＱＫＬＬＧＰＨＶＥＧＬＫＡＥＥＲＨＲＰＶＲＤＷＩＬＲＱＲＱＤＤＬＤＴＬＧＬＧＬＱＧＧＩＰＮＧＹＬＶＬＤＬＳＭＱＥＡＬＳＧＴＰＣＬＬＧＰＧＰＶＬＴＶＬＡＬＬＬＡＳＴＬＡ（配列番号１５）。
ヒトメソテリン転写変異体１をコードするヌクレオチド配列は、受託番号第ＮＭ００５８２３号にある。ヒトメソテリン転写変異体２をコードするヌクレオチド配列は、受託番号第ＮＭ０１３４０４号にある。ヒトメソテリン転写変異体３をコードするヌクレオチド配列は、受託番号第ＮＭ００１１７７３５５号にある。メソテリンは、中皮腫細胞、卵巣癌細胞、膵臓腺癌細胞、及び、扁平上皮癌に発現する（例えば、Ｋｏｊｉｍａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：２１９８４－２１９９０（１９９５）、及び、Ｏｎｄａ ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１２：４２２５－４２３１（２００６）を参照されたい）。メソテリンを発現するその他の細胞は、以下の「メソテリンの発現に関連する疾患」の定義において後述する。また、メソテリンは、ＣＡ１２５／ＭＵＣ１６とも相互作用する（例えば、Ｒｕｍｐ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９：９１９０－９１９８（２００４）、及び、Ｍａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８７：３３１２３－３３１３１（２０１２）を参照されたい）。一例では、ＴＦＰの抗原結合部分は、正常または悪性中皮腫細胞、卵巣癌細胞、膵臓腺癌細胞、または、扁平上皮癌細胞で発現するように、当該メソテリンタンパク質の細胞外ドメイン内のエピトープを認識し、そして、そこに結合する。
本明細書では、用語「抗体」は、抗原に特異的に結合する免疫グロブリン分子に由来するタンパク質またはポリペプチド配列のことを指す。抗体は、ポリクローナルまたはモノクローナル起源のインタクトな免疫グロブリン、あるいは、それらの断片とすることができ、また、天然または組換え起源に由来することができる。
用語「抗体断片」または「抗体結合ドメイン」は、抗体の少なくとも一部、または、それらの組換え変異体のことを指すものであり、これは、抗原結合ドメイン、すなわち、インタクトな抗体の抗原決定可変領域を含み、これは、当該抗体断片の標的、例えば、抗原、及び、その明らかなエピトープに対する認識と特異的結合とを付与するのに十分である。抗体断片の例として、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、及び、Ｆｖ断片、一本鎖（ｓｃ）Ｆｖ（「ｓｃＦｖ」）抗体断片、線状抗体、単一ドメイン抗体（「ｓｄＡｂ」と省略して表記される）（ＶＬまたはＶＨのいずれか）、ラクダ科ＶＨＨドメイン、及び、抗体断片から形成した多重特異性抗体などがあるが、これらに限定されない。
用語「ｓｃＦｖ」は、軽鎖の可変領域を含む少なくとも１つの抗体断片と、重鎖の可変領域を含む少なくとも１つの抗体断片と、を含む融合タンパク質を指しており、当該軽鎖及び重鎖の可変領域は、短い可動性ポリペプチドリンカーを介して隣接して連結されており、そして、単一のポリペプチド鎖として発現することができ、また、当該ｓｃＦｖは、それが由来するインタクトな抗体の特異性を保持している。
抗体に関する「重鎖可変領域」または「ＶＨ」（または、単一ドメイン抗体の場合、例えば、ナノボディ、「ＶＨＨ」）は、フレームワーク領域として知られているフランキングストレッチの間に介在する３つのＣＤＲを含む重鎖の断片のことを指すものであり、これらのフレームワーク領域は、一般的には、当該ＣＤＲよりも高度に保存されており、当該ＣＤＲを支持する骨格を形成する。
特に断りがない限り、本明細書では、ｓｃＦｖは、ＶＬ及びＶＨの可変領域を、例えば、当該ポリペプチドのＮ末端及びＣ末端に関して、いずれの順序にもし得るものであり、当該ｓｃＦｖは、ＶＬ－リンカー－ＶＨを含み得るものであり、または、ＶＨ－リンカー－ＶＬを含み得る。
抗体、または、それらの抗体断片を含む本発明のＴＦＰ組成物の一部は、様々な形態で存在し得るものであり、当該抗原結合ドメインは、例えば、単一ドメイン抗体断片（ｓｄＡｂ）、または、重鎖抗体ＨＣＡｂ、マウス、ヒト化、または、ヒト抗体に由来する一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）を含む、連続ポリペプチド鎖の一部として発現する（Ｈａｒｌｏｗ ｅｔ ａｌ．， １９９９， Ｉｎ： Ｕｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｎ．Ｙ．；Ｈａｒｌｏｗ ｅｔ ａｌ．， １９８９， Ｉｎ： Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎ．Ｙ．；Ｈｏｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．， １９８８， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８５：５８７９－５８８３；Ｂｉｒｄ ｅｔ ａｌ．， １９８８， Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３－４２６）。ある態様では、本発明のＴＦＰ組成物の当該抗原結合ドメインは、抗体断片を含む。さらなる態様では、当該ＴＦＰは、ｓｃＦｖまたはｓｄＡｂを含む抗体断片を含む。
用語「抗体重鎖」は、抗体分子に天然起源のコンホメーションで含まれる２つのタイプのポリペプチド鎖のうちの大きい方を指し、これは通常、当該抗体が属するクラスを決定する。
用語「抗体軽鎖」は、抗体分子に天然起源のコンホメーションで含まれる２つのタイプのポリペプチド鎖のうちの小さい方を指す。カッパ（「κ」）及びラムダ（「λ」）軽鎖は、２つの主要な抗体軽鎖のアイソタイプを指す。
用語「組換え抗体」は、組換えＤＮＡ技術を用いて生成された抗体、例えば、バクテリオファージまたは酵母の発現系によって発現される抗体のことを指す。また、当該用語は、当該抗体をコードして、抗体タンパク質を発現するＤＮＡ分子、または、当該抗体を特定するアミノ酸配列を合成して生成した抗体を意味すると解釈されるものとし、この場合、当該ＤＮＡまたはアミノ酸配列は、当技術分野で利用可能であり、かつ、周知である組換えＤＮＡまたはアミノ酸配列技術を用いて得たものである。
用語「抗原」または「Ａｇ」は、抗体によって特異的に結合することができ、さもなければ、免疫反応を誘発する分子のことを指す。この免疫反応は、抗体産生、または、特異的な免疫学的にコンピテントな細胞の活性化のいずれか、または、その両方を含み得る。
当業者であれば、実質的にすべてのタンパク質、または、ペプチドを含めたあらゆる高分子が抗原の役割を果たすであろうことは理解する。さらに、抗原は、組換え、または、ゲノムＤＮＡから誘導することができる。したがって、当業者であれば、免疫反応を惹起するタンパク質をコードするヌクレオチド配列または部分的なヌクレオチド配列を含むあらゆるＤＮＡが、本明細書で用いられる用語「抗原」をコードすることは理解する。さらに、当業者であれば、遺伝子の完全長ヌクレオチド配列によって抗原を完全にコードする必要がないことを理解する。本発明が、複数の遺伝子の部分的なヌクレオチド配列の使用を含むが、これに限定されず、そして、これらのヌクレオチド配列が、所望の免疫反応を惹起するポリペプチドをコードする様々な組合せで配置することは自明である。さらに、当業者であれば、抗原は「遺伝子」によってコードされる必要は全くないことを理解する。抗原は、生成されても、合成されてもよく、または生体試料由来であってもよく、またはポリペプチド以外の高分子でもあることは自明である。そのような生体試料として、組織試料、腫瘍試料、細胞、または、その他の生物学的成分を含む液体などがあるが、これらに限定されない。
用語「抗腫瘍効果」は、様々な手段で明らかにすることができる生物学的効果のことを指し、例えば、腫瘍体積の減少、腫瘍細胞数の減少、転移数の減少、平均余命の延長、腫瘍細胞増殖の減少、腫瘍細胞生存率の低下、または、がん性状態に関連する様々な生理学的症状の改善があるが、これらに限定されない。「抗腫瘍効果」は、本発明のペプチド、ポリヌクレオチド、細胞、及び、抗体の最初の段階での腫瘍の発生の予防能力で明らかにすることもできる。
用語「自己」は、あらゆる材料であって、後にそれが再導入される個体と同じ個体由来のもののことを指す。
用語「同種異系」は、あらゆる材料であって、同じ種の異なる動物、または、当該材料が導入される個体と異なる患者由来のもののことを指す。遺伝子が１つ以上の遺伝子座で同一ではない場合、２つ以上の個体は互いに同種異系であると言われる。幾つかの態様では、同じ種の個体由来の同種異系材料は、抗原的に相互作用するのに十分に遺伝学的に異なり得る。
用語「異種」は、異なる種の動物に由来する移植片のことを指す。
用語「がん」は、異常細胞の急速かつ制御されない増殖を特徴とする疾患のことを指す。がん細胞は、局所的にも、血流、及び、リンパ系を介して身体の他の部分に広がることもできる。様々ながんの例を本明細書で記載しており、乳癌、前立腺癌、卵巣癌、子宮頚癌、皮膚癌、膵臓癌、大腸癌、腎臓癌、肝臓癌、脳腫瘍、肺癌などがあるが、これらに限定されない。
成句「メソテリンの発現に関連する疾患」は、メソテリンの発現に関連する疾患、または、メソテリンを発現する細胞に関連する病態、例えば、がん、または、悪性腫瘍、または、前癌状態などの増殖性疾患などがあるが、これらに限定されない。ある態様では、当該がんは、中皮腫である。ある態様では、当該がんは、膵臓癌である。ある態様では、当該がんは、卵巣癌である。ある態様では、当該がんは、胃癌である。ある態様では、当該がんは、肺癌である。ある態様では、当該がんは、子宮内膜癌である。メソテリンの発現に関連するがんに関連しない適応症として、例えば、自己免疫疾患（例えば、狼瘡、慢性関節リウマチ、大腸炎）、炎症性障害（アレルギー及び喘息）、ならびに、移植があるが、これらに限定されない。
用語「保存的配列修飾」は、当該アミノ酸配列を含む抗体または抗体断片の結合特性に多大に作用しない、または、多大に変えないアミノ酸修飾のことを指す。そのような保存的修飾として、アミノ酸の置換、付加、及び、欠失がある。修飾は、当該技術分野で既知の標準的技術、例えば、部位特異的突然変異誘発法、及び、ＰＣＲ媒介突然変異誘発法などによって、本発明の抗体または抗体断片に導入することができる。保存的アミノ酸置換は、当該アミノ酸残基が、同様の側鎖を有するアミノ酸残基で置き換えるものである。同様の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当該技術分野で定義されている。これらのファミリーとして、塩基性側鎖（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン）、ベータ分岐側鎖（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）、及び、芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）のアミノ酸がある。したがって、本発明のＴＦＰ内の１つ以上のアミノ酸残基は、同じ側鎖ファミリーからの他のアミノ酸残基で置き換えることができ、かつ、変更したＴＦＰは、本明細書に記載の機能アッセイを用いて検査することができる。
用語「刺激」は、刺激ドメイン、または、刺激分子（例えば、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体）が、その同族リガンドと結合し、それによって、シグナル伝達事象を媒介することで誘導される一次応答のことを指すものであり、同伝達事象として、当該ＴＣＲ／ＣＤ３複合体を介したシグナル伝達などがあるが、これらに限定されない。刺激は、特定の分子の変化した発現、及び／または、細胞骨格構造の再構成等を媒介することができる。
用語「刺激分子」または「刺激ドメイン」は、Ｔ細胞によって発現される分子またはその一部のことを指し、当該Ｔ細胞は、一次細胞質シグナル伝達配列（複数可）を提供し、同シグナル伝達配列（複数可）は、当該Ｔ細胞のシグナル伝達経路の少なくとも幾つかの態様に対して、当該ＴＣＲ複合体の一次活性化を促進的に調節する。ある態様では、当該一次シグナルは、例えば、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体が、ペプチドを担持したＭＨＣ分子と結合することに端を発し、そして、このことが、Ｔ細胞応答の媒介につながるのであり、同Ｔ細胞応答として、増殖、活性化、分化などがあるが、これらに限定されない。促進的に作用する一次細胞質シグナル伝達配列（別名、「一次シグナル伝達ドメイン」）は、免疫受容体チロシン活性化モチーフ、または、「ＩＴＡＭ」として知られているシグナル伝達モチーフを含み得る。本発明において特に有用な一次細胞質シグナル伝達配列を含むＩＴＡＭの例として、ＴＣＲゼータ、ＦｃＲガンマ、ＦｃＲベータ、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ３デルタ、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ５、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ２７８（別名、「ＩＣＯＳ」）、及び、ＣＤ６６ｄ由来のものがあるが、これらに限定されない。
用語「抗原提示細胞」または「ＡＰＣ」は、その表面の主要組織適合複合体（ＭＨＣ）で複合化された外来抗原を提示するアクセサリー細胞（例えば、Ｂ細胞、樹状細胞など）などの免疫系細胞のことを指す。Ｔ細胞は、それらのＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を用いて、これらの複合体を認識する。ＡＰＣは、抗原を加工し、そして、それらをＴ細胞に提示する。
本明細書で用いる用語、「細胞内シグナル伝達ドメイン」は、分子の細胞内部分のことを指す。当該細胞内シグナル伝達ドメインは、ＴＦＰ含有細胞、例えば、ＴＦＰ発現Ｔ細胞の免疫エフェクター機能を促進するシグナルを生成する。例えば、ＴＦＰ発現Ｔ細胞における免疫エフェクター機能の例として、細胞溶解活性、及び、サイトカインの分泌を含めたＴヘルパー細胞活性がある。実施形態では、当該細胞内シグナル伝達ドメインは、一次細胞内シグナル伝達ドメインを含むことができる。例示的な一次細胞内シグナル伝達ドメインとして、一次刺激、または、抗原依存性刺激に関与する分子に由来するものがある。実施形態では、当該細胞内シグナル伝達ドメインは、共刺激細胞内ドメインを含むことができる。例示的な共刺激細胞内シグナル伝達ドメインとして、共刺激シグナル、または、抗原非依存性刺激に関与する分子に由来するものがある。
一次細胞内シグナル伝達ドメインは、ＩＴＡＭ（「免疫受容体チロシン活性化モチーフ」）を含むことができる。ＩＴＡＭを含む一次細胞質シグナル伝達配列の例として、ＣＤ３ゼータ、ＦｃＲガンマ、ＦｃＲベータ、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ３デルタ、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ５、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、及び、ＣＤ６６ｄ ＤＡＰ１０、及び、ＤＡＰ１２由来のものがあるが、これらに限定されない。
用語「共刺激分子」は、共刺激リガンドと特異的に結合し、それにより、例えば、Ｔ細胞による共刺激反応を媒介する、Ｔ細胞での同族結合パートナーのことを指すものであって、同共刺激反応として、増殖があるが、これに限定されない。共刺激分子は、効率的な免疫反応に必要とされる、抗原受容体またはそれらのリガンド以外の細胞表面分子である。共刺激分子として、ＭＨＣクラス１分子、ＢＴＬＡ、及び、Ｔｏｌｌリガンド受容体、ならびに、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＣＤ３０、ＬＩＧＨＴ、ＯＸ４０、ＣＤ２、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ－１、ＬＦＡ－１（ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８）、及び、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）があるが、これらに限定されない。共刺激細胞内シグナル伝達ドメインは、共刺激分子の細胞内部分とすることができる。共刺激分子は、以下のタンパク質ファミリー：ＴＮＦ受容体タンパク質、免疫グロブリン様タンパク質、サイトカイン受容体、インテグリン、シグナル伝達リンパ球活性化分子（ＳＬＡＭタンパク質）、及び、活性化ＮＫ細胞受容体で表すことができる。かような分子の例として、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＯＸ４０、ＧＩＴＲ、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＩＣＯＳ、ＢＡＦＦＲ、ＨＶＥＭ、リンパ球機能関連抗原１（ＬＦＡ－１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０、ＣＤ１６０、Ｂ７－Ｈ３、及び、ＣＤ８３に特異的に結合するリガンドなどがある。当該細胞内シグナル伝達ドメインは、それが由来する分子の細胞内部分全体、または、天然細胞内全体のシグナル伝達ドメイン、または、それらの機能的断片を含むことができる。用語「４－１ＢＢ」は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号第ＡＡＡ６２４７８．２号が付与されたアミノ酸配列、または、非ヒト種、例えば、マウス、齧歯類、サル、類人猿などに由来する同等の残基のＴＮＦＲスーパーファミリーのメンバーのことを指し、また、「４－１ＢＢ共刺激ドメイン」は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号第ＡＡＡ６２４７８．２号のアミノ酸残基２１４～２５５、または、非ヒト種、例えば、マウス、齧歯類、サル、類人猿などに由来する同等の残基として定義される。
用語「コードする」は、定義したヌクレオチド配列（例えば、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、及び、ｍＲＮＡ）、または、定義したアミノ酸配列、及び、それに起因する生物学的特性のいずれかを有する生物学的プロセスにおけるその他のポリマー及び高分子の合成のための鋳型の役割を果たす、遺伝子、ｃＤＮＡ、または、ｍＲＮＡなどのポリヌクレオチドでのヌクレオチドの特定の配列の固有の特性のことを指す。したがって、遺伝子、ｃＤＮＡ、または、ＲＮＡは、その遺伝子に対応するｍＲＮＡの転写及び翻訳が、細胞またはその他の生体系にて当該タンパク質を産生する場合には、タンパク質をコードする。そのヌクレオチド配列が、ｍＲＮＡ配列と同一であり、通常は配列表に示されているコード鎖と、遺伝子、または、ｃＤＮＡの転写の鋳型として用いられる非コード鎖との双方が、当該タンパク質、または、それらの遺伝子、または、ｃＤＮＡの他の産物をコードしている、と見なすことができる。
特に断りのない限り、「アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列」には、互いに縮重した型であり、そして、同じアミノ酸配列をコードするすべてのヌクレオチド配列が含まれる。タンパク質またはＲＮＡをコードするヌクレオチド配列という成句は、当該タンパク質をコードする当該ヌクレオチド配列が、幾つかのバージョンにおいて、１つ以上のイントロンを含む場合があるという程度まで、イントロンを含み得る。
用語「有効量」または「治療有効量」は、本明細書では互換可能に用いられており、また、特定の生物学的または治療上の効果を達成するのに有効である、本明細書に記載した化合物、製剤、材料、または、組成物の量のことを指す。
用語「内因性」は、生物、細胞、組織、または、系由来の、または、その内部で産生されるあらゆる材料のことを指す。
用語「外因性」は、生物、細胞、組織、または、系から導入される、または、その外部で産生されるあらゆる材料のことを指す。
用語「発現」は、プロモーターによって駆動する特定のヌクレオチド配列の転写、及び／または、翻訳のことを指す。
用語「転移ベクター」は、単離した核酸を含み、当該単離した核酸を細胞の内部に送達するために用いることができる組成物のことを指す。線状ポリヌクレオチド、イオン性または両親媒性化合物に会合したポリヌクレオチド、プラスミド、及び、ウイルスがあるが、これらに限定されることなく、数多くのベクターが当該技術分野では公知である。したがって、用語「転移ベクター」は、自己複製プラスミドまたはウイルスを含む。さらに、この用語は、細胞内への核酸の転移を容易にする非プラスミド及び非ウイルス性化合物、例えば、ポリリジン化合物、リポソーム等を含むとも解釈される。ウイルス性転移ベクターの例として、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクターなどがあるが、これらに限定されない。
用語「発現ベクター」は、発現されるヌクレオチド配列に作動可能に連結した発現制御配列を含む組換えポリヌクレオチドを含むベクターのことを指す。発現ベクターは、発現のために十分なシスエレメントを含み、発現用のその他の要素は、宿主細胞によって、または、インビトロ発現系で供給され得る。発現ベクターとして、組換えポリヌクレオチドを組み込んだコスミド、プラスミド（例えば、裸の、または、リポソームに含まれるもの）、及び、ウイルス（例えば、レンチウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、及び、アデノ随伴ウイルス）を含めて、当該技術分野で公知のすべてのものがある。
用語「レンチウイルス」は、レトロウイルス科の属のことを指す。レンチウイルスは、レトロウイルスの中でも、非分裂細胞に感染することができるという点で独特である。レンチウイルスは、宿主細胞のＤＮＡに大量の遺伝情報を送達することができるため、遺伝子送達ベクターの最も効率的な方法の１つである。ＨＩＶ、ＳＩＶ、及び、ＦＩＶは、すべてレンチウイルスの例である。
用語「レンチウイルスベクター」は、特に、Ｍｉｌｏｎｅ ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１７（８）：１４５３－１４６４（２００９）に示される自己不活性化レンチウイルスベクターを含めたレンチウイルスゲノムの少なくとも一部に由来するベクターのことを指す。臨床で使用され得るレンチウイルスベクターの他の例として、例えば、Ｏｘｆｏｒｄ ＢｉｏＭｅｄｉｃａのＬＥＮＴＩＶＥＣＴＯＲ（商標）遺伝子送達技術、ＬｅｎｔｉｇｅｎのＬＥＮＴＩＭＡＸ（商標）ベクターシステムなどがあるが、これらに限定されない。非臨床型のレンチウイルスベクターもまた利用可能であり、当業者に公知である。
用語「相同」または「同一性」は、２つのポリマー分子間、例えば、２つのＤＮＡ分子、または、２つのＲＮＡ分子などの２つの核酸分子間、または、２つのポリペプチド分子間のサブユニット配列の同一性のことを指す。当該２つの分子の双方のサブユニット部分が同じモノマーサブユニットで占められている場合、例えば、２つのＤＮＡ分子のそれぞれの位置がアデニンで占められている場合、それらは、その位置で相同または同一である。２配列間の相同性は、一致位置または相同位置の数の一次関数であり、例えば、２つの配列の位置の半分（例えば、長さ１０サブユニットのポリマーでの５つの位置）が相同である場合、当該２つの配列は、５０％相同であり、位置の９０％（例えば、１０のうちの９）が、一致または相同の場合、当該２つの配列は、９０％相同である。
非ヒト（例えば、マウス）抗体の「ヒト化」形態は、最小限の非ヒト免疫グロブリン由来の配列を有するキメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖、または、それらの断片（例えば、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、または、抗体のその他の抗原結合サブ配列）である。ほとんどの部分は、ヒト化抗体及びその抗体断片は、ヒト免疫グロブリン（レシピエントの抗体または抗体断片）であって、当該レシピエントの相補性決定領域（ＣＤＲ）由来の残基は、所望の特異性、親和性、及び、能力を有するマウス、ラット、またはウサギなどの非ヒト種（ドナー抗体）のＣＤＲ由来の残基で置き換えられる。幾つかの例では、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク領域（ＦＲ）残基は、対応する非ヒト残基で置き換えられている。さらに、ヒト化抗体／抗体断片は、レシピエントの抗体にも、取り込まれたＣＤＲやフレームワーク配列にも認められない残基を含むことができる。これらの修飾は、抗体または抗体断片の性能をさらに洗練及び最適化することができる。一般に、当該ヒト化抗体またはその抗体断片は、少なくとも１つ、及び、通常は２つの可変ドメインを実質的にすべて含み、すべての、または、実質的にすべてのＣＤＲ領域が非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、ＦＲ領域のすべて、または、かなりの部分が、ヒト免疫グロブリン配列のものである。ヒト化抗体または抗体断片は、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部、一般的には、ヒト免疫グロブリンの少なくとも一部も含み得る。さらなる詳細については、Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３２１：５２２－５２５，１９８６；Ｒｅｉｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３３２：３２３－３２９，１９８８；Ｐｒｅｓｔａ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．，２：５９３－５９６，１９９２を参照されたい。
「ヒト」または「完全ヒト」は、抗体または抗体断片などの免疫グロブリンであって、分子全体が、ヒト由来のものであるか、または、当該抗体または免疫グロブリンのヒト型に対して同一のアミノ酸配列からなるものを指す。
用語「単離した」は、自然状態から改変または除去した、ことを意味する。例えば、生きている動物に天然に存在する核酸またはペプチドは、「単離した」ものではないが、その自然状態の共存物質から部分的に、または、完全に分離された同じ核酸またはペプチドは「単離した」ものである。単離した核酸またはタンパク質は、実質的に精製された形で存在することも、例えば、宿主細胞などの非天然環境に存在することもできる。
本発明にあっては、一般的に存在する核酸塩基について以下の略語を使用する。「Ａ」はアデノシンを指し、「Ｃ」はシトシンを指し、「Ｇ」はグアノシンを指し、「Ｔ」はチミジンを指し、そして、「Ｕ」はウリジンを指す。
用語「作動可能に連結した」または「転写制御」は、調節配列と異種核酸配列との間の機能的連結のことを指し、後者の発現をもたらす。例えば、第１の核酸配列が第２の核酸配列と機能的な関係に置かれる場合、第１の核酸配列は、第２の核酸配列と作動可能に連結している。例えば、プロモーターがコード配列の転写または発現に影響を及ぼす場合、当該プロモーターは、コード配列に作動可能に連結している。作動可能に連結したＤＮＡ配列は、互いに隣接することができ、例えば、２つのタンパク質のコード領域を結合するために必要な場合、同じリーディングフレーム内にある。
免疫原性組成物の「非経口」投与という用語は、例えば、皮下（ｓ．ｃ．）、静脈内（ｉ．ｖ．）、筋肉内（ｉ．ｍ．）、または、胸骨内注射、腫瘍内、または、注入技術を含む。
用語「核酸」または「ポリヌクレオチド」は、一本鎖または二本鎖形態のいずれかのデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、または、リボ核酸（ＲＮＡ）、及び、それらのポリマーのことを指す。特に制限されていない限り、当該用語は、参照の核酸と同様の結合特性を有し、そして、天然に存在するヌクレオチドと同様の様式で代謝される、天然のヌクレオチドの公知の類似体を含む核酸を含む。特に断りがない限り、特定の核酸配列は、明確に示された配列だけでなく、暗黙的に、保存的に修飾されたその変異体（例えば、縮重コドン置換）、対立遺伝子、オルソログ、ＳＮＰ、及び、相補的配列も含む。特に、縮重コドン置換は、１つ以上の選択した（または、すべての）コドンの３番目の位置が、混合塩基、及び／または、デオキシイノシン残基で置換された配列を生成することによって達成され得る（Ｂａｔｚｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１９：５０８１（１９９１）；Ｏｈｔｓｕｋａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０：２６０５－２６０８（１９８５）；及び、Ｒｏｓｓｏｌｉｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｂｅｓ８：９１－９８（１９９４））。
用語「ペプチド」、「ポリペプチド」、及び、「タンパク質」は、互換可能に用いられており、そして、ペプチド結合で共有結合されたアミノ酸残基からなる化合物のことを指す。タンパク質またはペプチドは、少なくとも２つのアミノ酸を含まなくてはならず、タンパク質またはペプチドの配列を構成することができるアミノ酸の最大数に制限は無い。ポリペプチドには、ペプチド結合で互いに結合した２つ以上のアミノ酸を含むあらゆるペプチドまたはタンパク質を含む。本明細書で使用した当該用語は、当該技術分野で一般的には、例えば、ペプチド、オリゴペプチド、及び、オリゴマーと呼ばれている短鎖、及び、当該技術分野で一般的には、タンパク質と呼ばれ、数多くのタイプがある長鎖の双方のことを指す。「ポリペプチド」には、例えば、生物学的に活性な断片、実質的に相同なポリペプチド、オリゴペプチド、ホモダイマー、ヘテロダイマー、ポリペプチドの変異体、変性ポリペプチド、誘導体、類似体、融合タンパク質などが含まれる。ポリペプチドは、天然ペプチド、組換えペプチド、または、それらの組合せを含む。
用語「プロモーター」は、ポリヌクレオチド配列の特異的転写を開始するのに必要な、細胞の転写機構、または、導入がされた合成機構によって認識されるＤＮＡ配列のことを指す。
用語「プロモーター／調節配列」は、当該プロモーター／調節配列に作動可能に連結した遺伝子産物の発現に必要とされる核酸配列のことを指す。幾つかの例では、この配列は、コアプロモーター配列の場合があり、そして、その他の例では、この配列は、遺伝子産物の発現に必要とされるエンハンサー配列、及び、その他の調節エレメントも含み得る。当該プロモーター／調節配列は、例えば、組織特異的に遺伝子産物を発現するものとし得る。
用語「構成的」プロモーターは、遺伝子産物をコードまたは特定するポリヌクレオチドと作動可能に連結した場合に、当該細胞のほとんど、または、すべての生理学的条件下で、細胞内に当該遺伝子産物を産生させるヌクレオチド配列のことを指す。
用語「誘導性」プロモーターは、遺伝子産物をコードまたは特定するポリヌクレオチドと作動可能に連結した場合に、当該プロモーターに対応する誘導因子が当該細胞に存在する場合に実質的に唯一、細胞内に遺伝子産物を産生させるヌクレオチド配列のことを指す。
用語「組織特異的」プロモーターは、遺伝子によってコードまたは特定されるポリヌクレオチドと作動可能に連結した場合に、当該細胞が当該プロモーターに対応する組織型の細胞の場合に実質的に唯一、細胞内に遺伝子産物を産生させるヌクレオチド配列のことを指す。
ｓｃＦｖとの関連で用いられる用語「リンカー」及び「可動性ポリペプチドリンカー」は、単独で、または、組み合わせて用いて、可変重鎖及び可変軽鎖領域を連結するグリシン、及び／または、セリン残基などのアミノ酸からなるペプチドリンカーのことを指す。ある実施形態では、当該該可動性ポリペプチドリンカーは、Ｇｌｙ／Ｓｅｒリンカーであり、アミノ酸配列（Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｇｌｙ－Ｓｅｒ）ｎを含み、式中、ｎは１以上の正の整数である。例えば、ｎ＝１、ｎ＝２、ｎ＝３、ｎ＝４、ｎ＝５、ｎ＝６、ｎ＝７、ｎ＝８、ｎ＝９、及び、ｎ＝１０。ある実施形態では、当該可動性ポリペプチドリンカーは、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）４または（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３を含むが、これらに限定されない。別の実施形態では、当該リンカーは、（Ｇｌｙ２Ｓｅｒ）、（ＧｌｙＳｅｒ）、または（Ｇｌｙ３Ｓｅｒ）の多重反復を含む。同様に、本発明の範囲は、（参照により本明細書に援用する）ＷＯ２０１２／１３８４７５に記載のリンカーを含む。幾つかの例では、当該リンカー配列は、長いリンカー（ＬＬ）配列を含む。幾つかの例では、当該長いリンカー配列は、（Ｇ４Ｓ）ｎを含み、式中、ｎ＝２～４である。幾つかの例では、当該リンカー配列は、短いリンカー（ＳＬ）配列を含む。幾つかの例では、当該短いリンカー配列は、（Ｇ４Ｓ）ｎを含み、式中、ｎ＝１～３である。
本明細書で使用する５’キャップ（別名、ＲＮＡキャップ、ＲＮＡ７－メチルグアノシンキャップ、または、ＲＮＡ ｍ７Ｇキャップ）は、転写開始の直後に真核生物のメッセンジャーＲＮＡの「フロント」または５’末端に付加した修飾グアニンヌクレオチドである。当該５’キャップは、最初に転写したヌクレオチドに連結される末端基からなる。その存在は、リボソームによる認識、及び、ＲＮアーゼからの保護に不可欠である。キャップの付加は、転写と対になっており、各々が他方に影響を与えるように同時転写的に起こる。転写開始の直後、合成されているｍＲＮＡの５’末端は、ＲＮＡポリメラーゼと会合したキャップ合成複合体で結合される。この酵素複合体は、ｍＲＮＡのキャッピングに必要とされる化学反応を触媒する。合成は、多段階の生化学反応として進行する。当該キャッピング部分は、ｍＲＮＡの機能、例えば、その安定性や翻訳効率を調節するために修飾することができる。
本明細書で使用する、「インビトロで転写したＲＮＡ」は、インビトロで合成したＲＮＡ、好ましくは、ｍＲＮＡのことを指す。一般的に、当該インビトロで転写したＲＮＡは、インビトロ転写ベクターから生成される。当該インビトロ転写ベクターは、当該インビトロで転写したＲＮＡを生成するために用いられる鋳型を含む。
本明細書で使用する、「ポリ（Ａ）」は、ポリアデニル化によってｍＲＮＡに結合した一連のアデノシンである。一過性発現のための構築物の好ましい実施形態では、当該ポリＡは、５０～５０００、好ましくは、６４を超え、より好ましくは、１００を超え、最も好ましくは、３００または４００を超える。ポリ（Ａ）配列は、局在化、安定性、または、翻訳効率などのｍＲＮＡの機能を調節するために、化学的または酵素的に修飾することができる。
本明細書で使用する、「ポリアデニル化」は、メッセンジャーＲＮＡ分子に対するポリアデニリル部分、または、その修飾変異体の共有結合のことを指す。真核生物では、ほとんどのメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）分子は、３’末端でポリアデニル化される。当該３’ポリ（Ａ）尾部は、酵素、ポリアデニル酸ポリメラーゼの作用を介して、プレｍＲＮＡに付加された長い配列のアデニンヌクレオチド（多くの場合、数百）である。高等真核生物では、当該ポリ（Ａ）尾部は、特定の配列、すなわち、ポリアデニル化シグナルを含む転写産物に付加される。当該ポリ（Ａ）尾部、及び、それに結合したタンパク質は、エキソヌクレアーゼによる分解からｍＲＮＡを保護するのに役立つ。また、ポリアデニル化は、転写の終結、核からのｍＲＮＡの取り出し、及び、翻訳にとっても重要である。ポリアデニル化は、ＤＮＡのＲＮＡへの転写の直後に核内で起こるが、後に細胞質内でもさらに起こり得る。転写が終結した後、当該ｍＲＮＡ鎖は、ＲＮＡポリメラーゼと会合したエンドヌクレアーゼ複合体の作用を介して切断される。当該切断部位は、通常、当該切断部位近傍の塩基配列ＡＡＵＡＡＡの存在を特徴とする。当該ｍＲＮＡが切断された後、アデノシン残基が当該切断部位の遊離３’末端に付加される。
本明細書で使用する、「一過性」は、融合していない導入遺伝子の数時間、数日間、または、数週間の発現のことを指し、この場合、発現の期間は、当該遺伝子がゲノムに融合された場合、または、宿主細胞の安定なプラスミドレプリコン内に含まれた場合の発現期間よりも短い。
用語「シグナル伝達経路」は、細胞のある部分から細胞の別の部分へのシグナルの伝達に関与する様々なシグナル伝達分子間の生化学的関係のことを指す。成句「細胞表面受容体」は、シグナルを受け取り、細胞膜を越えてシグナルを伝達することが可能な分子及び分子の複合体を含む。
用語「対象」は、免疫反応が誘発され得る生物（例えば、哺乳動物、ヒト）を含むことを意図している。
用語「実質的に精製した」細胞は、その他の細胞型を本質的に含まない細胞のことを指す。また、実質的に精製した細胞は、それらが天然に存在する状態では通常会合しているその他の細胞型から分離された細胞のことも指す。幾つかの例では、実質的に精製した細胞の集団は、均質な細胞の集団のことを指す。その他の例では、この用語は、単に、それらの天然の状態では自然に会合している細胞から分離された細胞のことを指す。幾つかの態様において、当該細胞は、インビトロで培養される。他の態様において、当該細胞は、インビトロでは培養されない。
本明細書で使用する、用語「治療的」は、処置のことを意味する。治療効果は、病状の軽減、抑制、寛解、または、根絶によって得られる。
本明細書で使用する、用語「予防」は、疾患または病状に対する予防または保護的処置のことを意味する。
本発明にあっては、「腫瘍抗原」、または、「過剰増殖性疾患抗原」、または、「過剰増殖性疾患に関連する抗原」は、特定の過剰増殖性疾患に共通の抗原のことを指す。特定の態様において、本発明の当該過剰増殖性疾患抗原は、がんに由来するものであり、当該がんとして、原発性または転移性黒色腫、中皮腫、腎細胞癌、胃癌、乳癌、肺癌、卵巣癌、前立腺癌、結腸癌、子宮頸癌、脳腫瘍、肝臓癌、膵臓癌、腎臓癌、子宮内膜癌、及び、胃癌があるが、これらに限定されない。
幾つかの例において、当該疾患は、中皮腫、乳頭状漿液性卵巣腺癌、明細胞卵巣癌、混合型ミュラー管卵巣癌、子宮内膜粘液性卵巣癌、悪性胸膜疾患、膵臓腺癌、膵管腺癌、子宮漿液性癌、肺腺癌、肝外胆管癌、胃癌、食道腺癌、大腸腺癌、乳腺癌、メソテリン発現に関連する疾患、及び、それらの組合せ、メソテリン発現に関連する疾患、及び、それらの組合せからなる群から選択されるがんである。
用語「トランスフェクトした」、または、「形質転換した」、または「形質導入した」は、外因性核酸を、宿主細胞に移入または導入する過程のことを指す。「トランスフェクトした」、または、「形質転換した」、または「形質導入した」細胞は、外因性の核酸でトランスフェクトした、形質転換した、または、形質導入したものである。当該細胞は、初代の対象細胞と、その後代とを含む。
用語「特異的に結合する」は、試料に含まれる同族結合パートナー（例えば、メソテリン）を認識し、これには結合するが、当該試料でのその他の分子を必ずしも実質的に認識せず、それらに結合しない、抗体、抗体断片、または、特定のリガンドのことを指す。
範囲：本開示を通して、本発明の様々な態様は、範囲の形式で示され得る。範囲の形式での説明は、単に便宜のため、及び、簡略して表現するためであることが理解されるものとし、本発明の範囲に対する厳格な制限と解釈されるものとはしない。したがって、範囲の説明は、その範囲内の個々の数値だけでなく、具体的に開示されるすべての可能な部分的な範囲を有するものと見なす。例えば、１～６等の範囲の表記は、１～３、１～４、１～５、２～４、２～６、３～６などのように具体的に開示される部分的な範囲、そして、その範囲内の個々の数、例えば、１、２、２．７、３、４、５、５．３、及び、６を有すると見なすものとする。別の例として、９５～９９％同一などの範囲は、９５％、９６％、９７％、９８％、または、９９％が同一のものを含み、かつ、９６～９９％、９６～９８％、９６～９７％、９７～９９％、９７～９８％、及び、９８～９９％が同一であるなどの部分的な範囲を含む。このことは、当該範囲の幅にかかわらず適用する。
説明
本明細書では、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）融合タンパク質を用いた、がんなどの疾患の処置のための組成物及び使用方法を提供する。本明細書で使用する、「Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）融合タンパク質」または「ＴＦＰ」は、当該ＴＣＲを含む様々なポリペプチド由来の組換えポリペプチドを含み、同ＴＣＲは、一般的に、ｉ）標的細胞での表面抗原に結合すること、及び、ｉｉ）一般的には、Ｔ細胞内、または、その表面で、同一の場所に配置された場合に、インタクトなＴＣＲ複合体の他のポリペプチド成分と相互作用することができる。本明細書で提供するように、ＴＦＰは、キメラ抗原受容体と比較して、かなりの利点をもたらす。用語「キメラ抗原受容体」または代替的に「ＣＡＲ」は、ｓｃＦｖの形態の細胞外抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、及び、以下に定義する刺激分子由来の機能的シグナル伝達ドメインを含む細胞質シグナル伝達ドメイン（本明細書では「細胞内シグナル伝達ドメイン」とも称する）を含む組換えポリペプチドのことを指す。一般的に、ＣＡＲの中心細胞内シグナル伝達ドメインは、通常、ＴＣＲ複合体と会合して認められるＣＤ３ゼータ鎖由来である。当該ＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインは、４－１ＢＢ（すなわち、ＣＤ１３７）、ＣＤ２７、及び／または、ＣＤ２８などの少なくとも１つの共刺激分子由来の１つ以上の機能的シグナル伝達ドメインと融合することができる。
Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）融合タンパク質（ＴＦＰ）
本発明は、ＴＦＰをコードする組換えＤＮＡ構築物であって、当該ＴＦＰが、メソテリン、例えば、ヒトメソテリンに特異的に結合する抗体断片を含み、当該抗体断片の配列が、ＴＣＲサブユニットまたはその一部をコードする核酸配列と隣接し、かつ、それと同じリーディングフレーム内にある構築物を含む。本明細書で提供するＴＦＰは、１つ以上の内因性（または、代替的に、１つ以上の外因性、または、内因性及び外因性の組合せの）ＴＣＲサブユニットと会合して、機能的ＴＣＲ複合体を形成することができる。
ある態様では、本発明のＴＦＰは、標的特異的結合因子、別名、抗原結合ドメインを含む。部分の選択は、標的細胞の表面を決定する標的抗原の型と数によって変化する。例えば、当該抗原結合ドメインは、特定の病状と関連する標的細胞の細胞表面マーカーとして作用する標的抗原を認識するために選択され得る。したがって、本発明のＴＦＰにおける抗原結合ドメインに対して標的抗原の役割を果たし得る細胞表面マーカーの例として、ウイルス、細菌、及び、寄生虫感染症、自己免疫疾患、そして、がん性疾患（例えば、悪性疾患）に関連するものがある。
ある態様では、当該ＴＦＰ媒介Ｔ細胞応答は、所望の抗原に特異的に結合するＴＦＰに抗原結合ドメインを組み込む方法によって、目的の抗原に向かわせることができる。
ある態様では、当該抗原結合ドメインを含むＴＦＰの部分は、メソテリンを標的とする抗原結合ドメインを含む。ある態様では、当該抗原結合ドメインは、ヒトメソテリンを標的とする。
当該抗原結合ドメインは、抗原に結合することができるあらゆるドメインであることができ、同抗原として、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、組換え抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、及び、それらの機能的断片があるが、これらに限定されず、単一ドメイン抗体、例えば、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、及び、ラクダ科由来ナノボディの可変ドメイン（ＶＨＨ）、そして、当該技術分野で抗原結合ドメインとして機能することが公知の代替骨格、例えば、組換えフィブロネクチンドメイン、アンチカリン、ＤＡＲＰＩＮなどがあるが、これらに限定されない。同様に、当該標的抗原を特異的に認識し、そして、そこに結合する天然または合成リガンドを、当該ＴＦＰに対する抗原結合ドメインとして使用し得る。幾つかの例では、当該抗原結合ドメインを、当該ＴＦＰが最終的に用いられるのと同じ種由来とすることが有益である。例えば、ヒトでの使用については、当該ＴＦＰの抗原結合ドメインが、抗体または抗体断片の抗原結合ドメインに対して、ヒトまたはヒト化残基を含むことが有益であり得る。
したがって、ある態様では、当該抗原結合ドメインは、ヒト化またはヒト抗体、または、抗体断片、または、マウス抗体もしくは抗体断片を含む。ある実施形態では、当該ヒト化もしくはヒト抗メソテリン結合ドメインは、本明細書に記載したヒト化またはヒト抗メソテリン結合ドメインの軽鎖相補性決定領域１（ＬＣ ＣＤＲ１）、軽鎖相補性決定領域２（ＬＣ ＣＤＲ２）、及び、軽鎖相補性決定領域３（ＬＣ ＣＤＲ３）の１つ以上（例えば、３つすべて）、及び／または、本明細書に記載したヒト化またはヒト抗メソテリン結合ドメインの重鎖相補性決定領域１（ＨＣ ＣＤＲ１）、重鎖相補性決定領域２（ＨＣ ＣＤＲ２）、及び、重鎖相補性決定領域３（ＨＣ ＣＤＲ３）の１つ以上（例えば、３つすべて）を含み、例えば、ヒト化またはヒト抗メソテリン結合ドメインは、１つ以上、例えば、３つすべてのＬＣ ＣＤＲと、１つ以上、例えば、３つすべてのＨＣ ＣＤＲと、を含む。ある実施形態では、当該ヒト化またはヒト抗メソテリン結合ドメインは、本明細書に記載したヒト化もしくはヒト抗メソテリン結合ドメインの重鎖相補性決定領域１（ＨＣ ＣＤＲ１）、重鎖相補性決定領域２（ＨＣ ＣＤＲ２）、及び、重鎖相補性決定領域３（ＨＣ ＣＤＲ３）の１つ以上（例えば、３つすべて）を含み、例えば、当該ヒト化もしくはヒト抗メソテリン結合ドメインは、それぞれが、本明細書に記載したＨＣ ＣＤＲ１、ＨＣ ＣＤＲ２、及び、ＨＣ ＣＤＲ３を含む２つの可変重鎖領域を有する。ある実施形態では、当該ヒト化またはヒト抗メソテリン結合ドメインは、本明細書に記載したヒト化またはヒト軽鎖可変領域、及び／または、本明細書に記載したヒト化またはヒト重鎖可変領域を含む。ある実施形態では、当該ヒト化またはヒト抗メソテリン結合ドメインは、本明細書に記載したヒト化重鎖可変領域、例えば、本明細書に記載した少なくとも２つのヒト化またはヒト重鎖可変領域を含む。ある実施形態では、当該抗メソテリン結合ドメインは、本明細書で提供するアミノ酸配列の軽鎖及び重鎖を含むｓｃＦｖである。ある実施形態では、当該抗メソテリン結合ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）は、本明細書で提供する軽鎖可変領域のアミノ酸配列に少なくとも１つ、２つ、もしくは３つの修飾（例えば、置換）、最大で３０、２０、または、１０個までの修飾（例えば、置換）を有するアミノ酸配列、または、本明細書で提供するアミノ酸配列に対して９５～９９％の同一性がある配列を含む軽鎖可変領域、及び／または、本明細書で提供する重鎖可変領域のアミノ酸配列に少なくとも１つ、２つ、もしくは３つの修飾（例えば、置換）、最大で３０、２０、または、１０個までの修飾（例えば、置換）を有するアミノ酸配列、または、本明細書で提供するアミノ酸配列に対して９５～９９％の同一性がある配列を含む重鎖可変領域を含む。ある実施形態では、当該ヒト化またはヒト抗メソテリン結合ドメインは、ｓｃＦｖであり、また、本明細書に記載したアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域は、リンカー、例えば、本明細書に記載したリンカーを介して、本明細書に記載したアミノ酸配列を含む重鎖可変領域に取り付ける。ある実施形態では、当該ヒト化抗メソテリン結合ドメインは、（Ｇｌｙ４－Ｓｅｒ）ｎリンカーを含み、式中、ｎは、１、２、３、４、５、または、６であり、好ましくは、３または４である。ｓｃＦｖの軽鎖可変領域及び重鎖可変領域は、例えば、以下の配向：軽鎖可変領域－リンカー－重鎖可変領域、または、重鎖可変領域－リンカー－軽鎖可変領域のいずれともし得る。幾つかの例では、当該リンカー配列は、長いリンカー（ＬＬ）配列を含む。幾つかの例では、当該長いリンカー配列は、（Ｇ４Ｓ）ｎを含み、式中、ｎ＝２～４である。幾つかの例では、当該リンカー配列は、短いリンカー（ＳＬ）配列を含む。幾つかの例では、当該短いリンカー配列は、（Ｇ４Ｓ）ｎを含み、式中、ｎ＝１～３である。
幾つかの態様では、非ヒト抗体は、ヒト化され、そこで当該抗体の特定の配列または領域は、ヒトにおいて自然に産生される抗体またはその断片との類似性を増すように修飾される。ある態様では、当該抗原結合ドメインは、ヒト化される。
ヒト化抗体は、当該技術分野で公知の様々な技術を用いて産生することができ、同技術として、ＣＤＲ移植（例えば、それらの全内容を参照により本明細書に援用する、欧州特許第ＥＰ２３９，４００号、国際公開第ＷＯ９１／０９９６７号、及び、米国特許第５，２２５，５３９号、同第５，５３０，１０１号、及び、同第５，５８５，０８９号を参照されたい）、ベニアリングまたはリサーフェーシング（例えば、それらの全内容を参照により本明細書に援用する、欧州特許第ＥＰ５９２，１０６号、及び、同第ＥＰ５１９，５９６号、Ｐａｄｌａｎ，１９９１，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２８（４／５）：４８９－４９８、Ｓｔｕｄｎｉｃｋａ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，７（６）：８０５－８１４、及び、Ｒｏｇｕｓｋａ ｅｔ ａｌ．，１９９４，ＰＮＡＳ，９１：９６９－９７３を参照されたい）、鎖シャフリング（例えば、その全内容を参照により本明細書に援用する、米国特許第５，５６５，３３２号を参照されたい）、及び、例えば、それらの全内容を参照により本明細書に援用する、米国特許出願公開第ＵＳ２００５／００４２６６４号、米国特許出願公開第ＵＳ２００５／００４８６１７号、米国特許第６，４０７，２１３号、米国特許第５，７６６，８８６号、国際公開第ＷＯ９３１７１０５号、Ｔａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１６９：１１１９－２５（２００２），Ｃａｌｄａｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．，１３（５）：３５３－６０（２０００），Ｍｏｒｅａ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ，２０（３）：２６７－７９（２０００），Ｂａｃａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７２（１６）：１０６７８－８４（１９９７），Ｒｏｇｕｓｋａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．，９（１０）：８９５－９０４（１９９６），Ｃｏｕｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，５５（２３ Ｓｕｐｐ）：５９７３ｓ－５９７７ｓ（１９９５），Ｃｏｕｔｏ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．，５５（８）：１７１７－２２（１９９５），Ｓａｎｄｈｕ Ｊ Ｓ，Ｇｅｎｅ，１５０（２）：４０９－１０（１９９４），及び、Ｐｅｄｅｒｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２３５（３）：９５９－７３（１９９４）に開示された教示などがあるが、これらに限定されない。多くの場合、フレームワーク領域内のフレームワーク残基を、ＣＤＲドナー抗体由来の対応する残基で置換して、抗原結合を、変更、例えば、改善する。これらのフレームワーク置換は、当該技術分野で周知の方法によって同定されるものであり、例えば、当該ＣＤＲとフレームワーク残基との相互作用をモデル化して、抗原結合及び配列比較に重要なフレームワーク残基を特定して、特定の位置で他とは異なるフレームワーク残基を特定する（例えば、それらの全内容を参照により本明細書に援用する、Ｑｕｅｅｎ ｅｔ ａｌ．，米国特許第５，５８５，０８９号、及び、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，１９８８，Ｎａｔｕｒｅ，３３２：３２３を参照されたい）。
ヒト化抗体または抗体断片は、非ヒトを起源とするものに残存する１つ以上のアミノ酸残基を有する。これらの非ヒトアミノ酸残基は、多くの場合、「取り込み」残基と呼ばれており、これらは、一般的に、「取り込み」可変ドメインから取り出される。本明細書で提供するように、ヒト化抗体または抗体断片は、非ヒト免疫グロブリン分子及びフレームワーク領域に由来する１つ以上のＣＤＲを含み、当該フレームワークを構成するアミノ酸残基は、完全に、または、大部分がヒト生殖細胞系由来である。抗体または抗体断片のヒト化に対する数多くの技術は、当該技術分野で周知であり、また、Ｗｉｎｔｅｒと共同研究者らの方法（Ｊｏｎｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３２１：５２２－５２５（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ， ３３２：３２３－３２７ （１９８８）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ ｅｔ ａｌ．， Ｓｃｉｅｎｃｅ， ２３９：１５３４－１５３６（１９８８））に従って、齧歯類のＣＤＲまたはＣＤＲ配列を、対応する配列のヒト抗体の代わりに用いることで、すなわち、ＣＤＲ移植（それらの全内容を参照により本明細書に援用する、欧州特許第ＥＰ２３９，４００号、ＰＣＴ公開第ＷＯ９１／０９９６７号、及び、米国特許第４，８１６，５６７号、同第６，３３１，４１５号、同第５，２２５，５３９号、同第５，５３０，１０１号、同第５，５８５，０８９号、同第６，５４８，６４０号）で、基本的に行うことができる。かかるヒト化抗体及び抗体断片において、非ヒト種由来の対応する配列による置換は、インタクトなヒト可変ドメインよりかなり少ない。ヒト化抗体は、多くの場合、幾つかのＣＤＲ残基、及び、場合により幾つかのフレームワーク（ＦＲ）残基が、齧歯類抗体における類似部位由来の残基によって置換されるヒト抗体である。抗体及び抗体断片のヒト化は、ベニアリングまたはリサーフェーシング（欧州特許第ＥＰ５９２，１０６号、同第ＥＰ５１９，５９６号、Ｐａｄｌａｎ，１９９１，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，２８（４／５）：４８９－４９８；Ｓｔｕｄｎｉｃｋａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，７（６）：８０５－８１４（１９９４）；及び、Ｒｏｇｕｓｋａ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ，９１：９６９－９７３（１９９４））、または、鎖シャフリング（米国特許第５，５６５，３３２号）でも達成することができ、これらの内容は全体が、参照により本明細書に援用する。
当該ヒト化抗体の作製に用いる軽及び重の双方のヒト可変ドメインを選ぶことは、抗原性を減らすことである。いわゆる「最良適合」法では、齧歯類抗体の当該可変ドメインの配列を、既知のヒト可変ドメイン配列の全ライブラリーに対してスクリーニングする。齧歯類のものに最も近い当該ヒト配列は、次に、当該ヒト化抗体用のヒトフレームワーク（ＦＲ）として認められる（それらの全内容を参照により本明細書に援用する、Ｓｉｍｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５１：２２９６（１９９３）；Ｃｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９６：９０１（１９８７））。別の方法は、軽鎖または重鎖の特定の亜群のすべてのヒト抗体のコンセンサス配列由来の特定のフレームワークを用いる。同じフレームワークを、幾つかの異なるヒト化抗体に用いる場合がある（例えば、それらの全内容を参照により本明細書に援用する、Ｎｉｃｈｏｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎ．３４（１６－１７）：１１５７－１１６５（１９９７）；Ｃａｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：４２８５（１９９２）；Ｐｒｅｓｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５１：２６２３（１９９３）を参照されたい）。幾つかの実施形態では、当該フレームワーク領域、例えば、重鎖可変領域の４つのすべてのフレームワーク領域は、ＶＨ４－４－５９生殖細胞系列配列に由来する。ある実施形態では、当該フレームワーク領域は、例えば、対応するマウス配列でのアミノ酸から、１つ、２つ、３つ、４つ、または、５つの修飾、例えば、置換を含むことができる。ある実施形態では、当該フレームワーク領域、例えば、当該軽鎖可変領域の４つのすべてのフレームワーク領域は、ＶＫ３－１．２５生殖細胞系列配列に由来する。ある実施形態では、当該フレームワーク領域は、例えば、対応するマウス配列でのアミノ酸から、１つ、２つ、３つ、４つ、または、５つの修飾、例えば、置換を含むことができる。
幾つかの態様において、抗体断片を含む本発明のＴＦＰ組成物の部分は、標的抗原に対する高い親和性、及び、その他の有益な生物学的特性を保持しながらヒト化される。本発明のある態様によれば、ヒト化抗体及び抗体断片は、当該親配列、及び、ヒト化配列の３次元モデルを用いて、当該親配列、及び、様々な概念的ヒト化産物の分析過程によって調製される。３次元免疫グロブリンモデルは、一般に入手可能であり、当業者に周知のものである。コンピュータープログラムが利用可能であり、これは、選択した候補の免疫グロブリン配列の推定される３次元立体配座構造を説明及び表示する。これらの表示の検査は、候補の免疫グロブリン配列の機能性における当該残基の可能性のある役割の分析、例えば、当該候補の免疫グロブリンの標的抗原を結合する能力に影響を与える残基の分析を可能にする。このように、ＦＲ残基は、所望の抗体または抗体断片の特性、例えば、標的抗原に対する親和性の増加が達成されるように、当該レシピエント及び取り込み配列から選択ならびに組み合わせることができる。一般的に、当該ＣＤＲ残基は、抗原結合への影響に対して、直接に、及び、最も実質的に関与している。
ヒト化抗体または抗体断片は、元の抗体と同様の抗原特異性、例えば、本発明では、ヒトメソテリンに対する結合能を保持し得る。幾つかの実施形態では、ヒト化抗体または抗体断片では、ヒトメソテリンに対する結合の親和性、及び／または、特異性が向上する場合がある。
ある態様では、当該抗メソテリン結合ドメインは、抗体または抗体断片の特定の機能的特徴または特性によって特徴づけられる。例えば、ある態様では、抗原結合ドメインを含む本発明のＴＦＰ組成物の部分は、ヒトメソテリンに特異的に結合する。ある態様では、当該抗原結合ドメインは、Ｎｉｃｈｏｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎ．３４（１６－１７）：１１５７－１１６５（１９９７）に記載のＦＭＣ６３ ｓｃＦｖと同じ、または、同様のヒトメソテリンに対する結合特異性を有する。ある態様では、本発明は、抗体または抗体断片を含む抗原結合ドメインに関し、当該抗体結合ドメインは、メソテリンタンパク質、または、その断片に特異的に結合し、当該抗体または抗体断片は、本明細書で提供したアミノ酸配列を含む可変軽鎖、及び／または、可変重鎖を含む。特定の態様において、当該ｓｃＦｖは、リーダー配列に隣接し、及び、これと同じリーディングフレーム内にある。
ある態様では、当該抗メソテリン結合ドメインは、断片、例えば、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）である。ある態様では、当該抗メソテリン結合ドメインは、Ｆｖ、Ｆａｂ、（Ｆａｂ’）２、または、二官能性（例えば、二重特異性）ハイブリッド抗体（例えば、Ｌａｎｚａｖｅｃｃｈｉａ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７，１０５（１９８７））である。ある態様では、本明細書に開示した抗体、及び、それらの断片は、野生型または親和性が向上したメソテリンタンパク質に結合する。
また、標的抗原（例えば、メソテリン、または、融合部分結合ドメインの標的について本明細書の他の箇所に記載したあらゆる標的抗原）に特異的な抗体抗原結合ドメインを得るための方法であって、本明細書に記載のＶＨドメインのアミノ酸配列での１つ以上のアミノ酸の付加、削除、置換、または、挿入を経て、当該ＶＨドメインのアミノ酸配列変異体であるＶＨドメインを準備し、任意に、このようにして準備したＶＨドメインを１つ以上のＶＬドメインと組合せ、そして、当該ＶＨドメイン、または、ＶＨ／ＶＬの組合せ、または、複数の組合せを試験して、特定の結合メンバー、または、任意に、１つ以上の所望の特性を有する目的の標的抗原（例えば、メソテリン）に特異的な抗体抗原結合ドメインを特定する、ことを含む方法を本明細書に提供する。
幾つかの例では、ＶＨドメイン及びｓｃＦｖは、当該技術分野で公知の方法にしたがって調製することができる（例えば、Ｂｉｒｄ ｅｔ ａｌ．，（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３－４２６、及び、Ｈｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：５８７９－５８８３を参照されたい）。ｓｃＦｖ分子は、ＶＨ及びＶＬ領域を、可動性ポリペプチドリンカーを用いて連結させて生成することができる。当該ｓｃＦｖ分子は、最適化された長さ、及び／または、アミノ酸組成のリンカー（例えば、Ｓｅｒ－Ｇｌｙリンカー）を含む。当該リンカーの長さは、ｓｃＦｖの可変領域の折りたたみ方、及び、相互作用の仕方に大きく影響を受ける。実際のところ、短いポリペプチドリンカー（例えば、５～１０アミノ酸）が用いられる場合、鎖内の折りたたみは妨げられる。鎖間の折りたたみもまた、当該２つの可変領域を一緒にして機能的エピトープ結合部位を形成するために必要である。幾つかの例では、当該リンカー配列は、長いリンカー（ＬＬ）配列を含む。幾つかの例では、当該長いリンカー配列は、（Ｇ４Ｓ）ｎを含み、式中、ｎ＝２～４である。幾つかの例では、当該リンカー配列は、短いリンカー（ＳＬ）配列を含む。幾つかの例では、当該短いリンカー配列は、（Ｇ４Ｓ）ｎを含み、式中、ｎ＝１～３である。リンカーの配向、及び、大きさの例については、例えば、それらの全内容を参照により本明細書に援用する、Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．１９９３ Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９０：６４４４－６４４８、米国特許第７，６９５，９３６号、米国特許出願公開第２００５０１００５４３号、同第２００５０１７５６０６号、及び、ＰＣＴ公開第ＷＯ２００６／０２０２５８号、及び、同第ＷＯ２００７／０２４７１５号を参照されたい。
ｓｃＦｖは、そのＶＬ及びＶＨ領域間に、約１０、１１、１２、１３、１４、１５、または、１５個を超える残基のリンカーを含むことができる。当該リンカー配列は、天然に存在するあらゆるアミノ酸を含み得る。幾つかの実施形態では、当該リンカー配列は、アミノ酸のグリシン及びセリンを含む。別の実施形態では、当該リンカー配列は、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎなどのグリシンとセリンの繰り返しの組を含み、式中、ｎは、１以上の正の整数である。ある実施形態では、当該リンカーは、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）４、または、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３とし得る。当該リンカーの長さの変動は、活性を保持または向上させる場合があり、活性研究における優れた有効性を生じさせる。幾つかの例では、当該リンカー配列は、長いリンカー（ＬＬ）配列を含む。幾つかの例では、当該長いリンカー配列は、（Ｇ４Ｓ）ｎを含み、式中、ｎ＝２～４である。幾つかの例では、当該リンカー配列は、短いリンカー（ＳＬ）配列を含む。幾つかの例では、当該短いリンカー配列は、（Ｇ４Ｓ）ｎを含み、式中、ｎ＝１～３である。
安定性と突然変異
抗メソテリン結合ドメイン、例えば、ｓｃＦｖ分子（例えば、可溶性ｓｃＦｖ）の安定性は、従来のコントロールｓｃＦｖ分子または完全長抗体の生物物理学的特性（例えば、熱安定性）に関して評価することができる。ある実施形態では、当該ヒト化またはヒトｓｃＦｖは、説明をしたアッセイにおいて、親のｓｃＦｖより、約０．１、約０．２５、約０．５、約０．７５、約１、約１．２５、約１．５、約１．７５、約２、約２．５、約３、約３．５、約４、約４．５、約５、約５．５、約６、約６．５、約７、約７．５、約８、約８．５、約９、約９．５、約１０℃、約１１℃、約１２℃、約１３℃、約１４℃、または、約１５℃超の熱安定性を有する。
当該抗メソテリン結合ドメイン、例えば、ｓｃＦｖの熱安定性の改良は、続いて、メソテリン構築物全体にもたらされ、当該抗メソテリンＴＦＰ構築物の治療特性の改良につながる。当該抗メソテリン結合ドメイン、例えば、ｓｃＦｖの熱安定性は、従来の抗体と比較して、少なくとも約２℃または３℃改良することができる。ある実施形態では、当該抗メソテリン結合ドメイン、例えば、ｓｃＦｖは、従来の抗体と比較して、１℃改良された熱安定性を有する。別の実施形態では、当該抗メソテリン結合ドメイン、例えば、ｓｃＦｖは、従来の抗体と比較して、２℃改良された熱安定性を有する。別の実施形態では、当該ｓｃＦｖは、従来の抗体と比較して、４℃、５℃、６℃、７℃、８℃、９℃、１０℃、１１℃、１２℃、１３℃、１４℃、または、１５℃改良された熱安定性を有する。比較は、例えば、本明細書に開示したｓｃＦｖ分子と、当該ｓｃＦｖ ＶＨ及びＶＬが由来する抗体のｓｃＦｖ分子またはＦａｂ断片との間ですることができる。熱安定性は、当該技術分野で公知の方法を用いて測定することができる。例えば、ある実施形態では、ＴＭを測定することができる。ＴＭの測定方法、及び、タンパク質の安定性を決定するその他の方法を、以下に詳述する。
ｓｃＦｖの変異（可溶性ｓｃＦｖのヒト化または直接突然変異誘発を介して生じる）は、当該ｓｃＦｖの安定性を変化させ、そして、当該ｓｃＦｖ及び当該抗メソテリンＴＦＰ構築物の全体的な安定性を改良する。ヒト化ｓｃＦｖの安定性を、ＴＭ、温度変性、及び、温度凝集などの測定結果を用いて、マウスのｓｃＦｖに対して比較する。ある実施形態では、当該抗メソテリン結合ドメイン、例えば、ｓｃＦｖは、変異したｓｃＦｖが、当該抗メソテリンＴＦＰ構築物に改良された安定性を付与するように、当該ヒト化過程から生じる少なくとも１つの変異を含む。別の実施形態では、当該抗メソテリン結合ドメイン、例えば、ｓｃＦｖは、変異したｓｃＦｖが、当該メソテリンＴＦＰ構築物に改良された安定性を付与するように、当該ヒト化過程から生じる少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個の変異を含む。
ある態様では、当該ＴＦＰの抗原結合ドメインは、本明細書に記載した抗原結合ドメインのアミノ酸配列と相同であるアミノ酸配列を含み、当該抗原結合ドメインは、本明細書に記載した抗メソテリン抗体断片の所望の機能特性を保持する。ある特定の態様では、本発明のＴＦＰ組成物は、抗体断片を含む。さらなる態様では、その抗体断片は、ｓｃＦｖを含む。
様々な態様では、当該ＴＦＰの抗原結合ドメインは、一方または双方の可変領域（例えば、ＶＨ及び／またはＶＬ）内、例えば、１つ以上のＣＤＲ領域内、及び／または、１つ以上のフレームワーク領域内の１つ以上のアミノ酸を修飾することで改変される。ある特定の態様では、本発明のＴＦＰ組成物は、抗体断片を含む。さらなる態様では、その抗体断片は、ｓｃＦｖを含む。
当業者であれば、本発明の抗体または抗体断片が、それらがアミノ酸配列の点で（例えば、野生型とは）異なるが、所望の活性の点では変化しないように、さらに修飾してもよいことを理解する。例えば、「非必須」アミノ酸残基でアミノ酸置換をもたらす、さらなるヌクレオチド置換を、当該タンパク質に行い得る。例えば、分子内の非必須アミノ酸残基を、同じ側鎖ファミリーからの別のアミノ酸残基で置き換え得る。別の実施形態では、一連のアミノ酸を、側鎖ファミリーのメンバーの順序、及び／または、組成が異なる構造的に同様の一連のもので置き換えることができ、例えば、アミノ酸残基が同様の側鎖を有するアミノ酸残基で置き換えられる保存的置換を行うことができる。
同様の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当該技術分野で定義されており、塩基性側鎖（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、ベータ分岐側鎖（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）、及び、芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）がある。
２つ以上の核酸またはポリペプチド配列における同一性パーセントは、同じである２つ以上の配列のことを指す。２つの配列が、最大一致のために比較ウィンドウで、または、以下の配列比較アルゴリズムの１つを用いて、または、マニュアルアラインメント、及び、目視による調査で測定される指定された領域で、比較及び整列された場合に、同一であるアミノ酸残基またはヌクレオチドを特定の割合を有するとき、２つの配列は「実質的に同一」である（例えば、特定の領域にわたって、または、特定されていない場合、全配列にわたって、６０％が同一である、任意に、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または、９９％が同一である）。任意に、当該同一性は、少なくとも長さ約５０ヌクレオチド（または、１０アミノ酸）の領域にわたって、または、より好ましくは、長さ１００～５００、または、１０００以上のヌクレオチド（または、２０、５０、２００、または、それ以上のアミノ酸）の領域にわたって存在する。
配列比較については、一般的には、ある配列が、参照配列の役割を果たし、これに対して、試験配列を比較する。配列比較アルゴリズムを用いる場合、試験配列及び参照配列をコンピューターに入力し、必要に応じてサブ配列座標を指定し、そして、配列アルゴリズムプログラムのパラメーターを指定する。デフォルトのプログラムパラメーターを用いてもよく、あるいは、別のパラメーターを指定してもよい。当該配列比較アルゴリズムは、次いで、当該プログラムパラメーターに基づいて、当該参照配列に対する当該試験配列の配列同一性率を計算する。比較のための配列のアラインメント方法は、当該技術分野で公知である。比較のための配列の最適なアラインメントは、例えば、局所的相同性アルゴリズムのＳｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ，（１９７０）Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２ｃ、相同性アラインメントアルゴリズムのＮｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ，（１９７０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３、類似法検索のＰｅａｒｓｏｎ ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ，（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：２４４４、これらアルゴリズムのコンピューターによる実施（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，５７５ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．でのＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、及びｍＴＦＡＳＴＡ）、または、マニュアルアラインメント及び目視による調査（例えば、Ｂｒｅｎｔ ｅｔ ａｌ．，（２００３）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙを参照されたい）によって行うことができる。配列同一性及び配列類似性率の測定に適したアルゴリズムの２つの例は、ＢＬＡＳＴ及びＢＬＡＳＴ ２．０アルゴリズムであり、これらは、それぞれ、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，（１９７７）Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９－３４０２；及び、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３－４１０に記載されている。ＢＬＡＳＴ分析を行うためのソフトウェアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎが公開している。
ある態様では、本発明は、機能的に等価な分子を生成する出発抗体または断片（例えば、ｓｃＦｖ）のアミノ酸配列の修飾を企図する。例えば、ＴＦＰに含まれる抗メソテリン結合ドメインのＶＨまたはＶＬ、例えば、ｓｃＦｖは、当該抗メソテリン結合ドメイン、例えば、ｓｃＦｖの出発ＶＨまたはＶＬフレームワーク領域の少なくとも約７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性を保持するように修飾することができる。本発明は、全ＴＦＰ構築物の修飾、例えば、機能的に等価な分子を生成するための当該ＴＦＰ構築物の様々なドメインの１つ以上のアミノ酸配列の修飾を企図する。当該ＴＦＰ構築物は、出発ＴＦＰ構築物の少なくとも約７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の同一性を保持するように修飾することができる。
細胞外ドメイン
細胞外ドメインは、天然または組換え起源のいずれかから誘導し得る。当該起源が天然の場合、当該ドメインは、あらゆるタンパク質に由来し得るが、具体的には、膜結合または膜貫通タンパク質以外である。ある態様では、当該細胞外ドメインは、当該膜貫通ドメインと会合することができる。本発明における特定の用途の細胞外ドメインは、例えば、Ｔ細胞受容体のアルファ、ベータ、または、ゼータ鎖、または、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ３ガンマ、または、ＣＤ３デルタ、または、別の実施形態では、ＣＤ２８、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４の少なくとも細胞外領域（複数可）を含み得る。
膜貫通ドメイン
一般に、ＴＦＰ配列は、単一のゲノム配列がコードする細胞外ドメインと、膜貫通ドメインとを含む。別の実施形態では、ＴＦＰは、当該ＴＦＰの細胞外ドメインに対して異種の膜貫通ドメインを含むようにデザインすることができる。膜貫通ドメインは、当該膜貫通領域に隣接した１つ以上のさらなるアミノ酸、例えば、当該膜貫通が由来したタンパク質の細胞外領域に会合した１つ以上のアミノ酸（例えば、当該細胞外領域の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、または、１５個までのアミノ酸）、及び／または、当該膜貫通タンパク質が由来するタンパク質の細胞内領域と会合した１つ以上のさらなるアミノ酸（例えば、当該細胞内領域の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、または、１５個までのアミノ酸）を含むことができる。ある態様では、当該膜貫通ドメインは、使用される当該ＴＦＰのその他のドメインの１つと会合しているものである。幾つかの例では、当該膜貫通ドメインは、かかるドメインが、同じ、または、異なる膜表面タンパク質の膜貫通ドメインに結合しないように、例えば、当該受容体複合体のその他のメンバーとの相互作用を最小限にするために、選択、または、アミノ酸置換で修飾することができる。ある態様では、当該膜貫通ドメインは、当該ＴＦＰ－Ｔ細胞表面の別のＴＦＰとホモ二量化することができる。異なる態様では、当該膜貫通ドメインの当該アミノ酸配列を、同じＴＦＰに存在する天然の結合パートナーの結合ドメインとの相互作用を最小にするために、修飾または置換し得る。
当該膜貫通ドメインは、天然または組換え起源のいずれかから誘導し得る。当該起源が天然の場合、当該ドメインは、あらゆる膜結合または膜貫通タンパク質由来とし得る。ある態様では、当該膜貫通ドメインは、当該ＴＦＰが標的に結合している場合はいつでも、当該細胞内ドメイン（複数可）にシグナル伝達することができる。本発明において、特定の用途の膜貫通ドメインは、例えば、Ｔ細胞受容体のアルファ、ベータ、または、ゼータ鎖、ＣＤ２８、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４の少なくとも膜貫通領域（複数可）を含み得る。
幾つかの例では、当該膜貫通ドメインは、当該ＴＦＰの細胞外領域、例えば、当該ＴＦＰの当該抗原結合ドメインに、ヒンジ、例えば、ヒトタンパク質由来のヒンジを介して結合させることができる。例えば、ある実施形態では、当該ヒンジを、ヒト免疫グロブリン（Ｉｇ）ヒンジ、例えば、ＩｇＧ４ヒンジ、または、ＣＤ８ａのヒンジとし得る。
リンカー
任意に、長さが２～１０個のアミノ酸の短いオリゴ、または、ポリペプチドリンカーは、当該ＴＦＰの当該膜貫通ドメインと当該細胞質領域間との間に結合を形成し得る。グリシン－セリンダブレットは、特に適切なリンカーを提供する。例えば、ある態様では、当該リンカーは、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号５３）のアミノ酸配列を含む。幾つかの実施形態では、当該リンカーは、ＧＧＴＧＧＣＧＧＡＧＧＴＴＣＴＧＧＡＧＧＴＧＧＡＧＧＴＴＣＣ（配列番号５４）のヌクレオチド配列によってコードされる。
細胞質ドメイン
当該ＴＦＰの当該細胞質ドメインは、当該ＴＦＰが、ＣＤ３ガンマ、デルタ、または、イプシロンポリペプチドを含む場合、細胞内シグナル伝達ドメインを含むことができ、すなわち、ＴＣＲアルファ及びＴＣＲベータサブユニットは、一般的に、シグナル伝達ドメインを欠いている。細胞内シグナル伝達ドメインは、一般的に、当該ＴＦＰが導入されている免疫細胞の少なくとも１つの正常なエフェクター機能の活性化に関与する。用語「エフェクター機能」は、細胞の特殊な機能のことを指す。Ｔ細胞のエフェクター機能は、例えば、細胞溶解活性、または、サイトカインの分泌を含めたヘルパー活性であり得る。したがって、用語「細胞内シグナル伝達ドメイン」は、当該エフェクター機能シグナルを伝達し、そして、当該細胞に特殊機能を行うように指示するタンパク質の部分のことを指す。通常は、全細胞内シグナル伝達ドメインを使用することができるが、多くの場合、全鎖を使用する必要はない。当該細胞内シグナル伝達ドメインの切断部分が用いられる限りでは、かかる切断部分は、それがエフェクター機能のシグナルを伝達する限り、インタクトな鎖の代わりに使用し得る。細胞内シグナル伝達ドメインという用語は、したがって、当該エフェクター機能のシグナルを伝達するのに十分な当該細胞内シグナル伝達ドメインのあらゆる切断部分を含めることを意味する。
本発明の当該ＴＦＰに用いる細胞内シグナル伝達ドメインの例として、同時に作用して、抗原受容体係合後にシグナル伝達を開始するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）及び共受容体の細胞質配列、ならびに、これらの配列のあらゆる誘導体または変異体、及び、同じ機能を有するあらゆる組換え配列がある。
当該ＴＣＲだけを介して生成されるシグナルは、ナイーブＴ細胞の完全な活性化には不十分であること、ならびに、二次、及び／または、共刺激シグナルが必要であることが知られている。したがって、ナイーブＴ細胞の活性化は、２つの異なるクラスの細胞質シグナル伝達配列、すなわち、当該ＴＣＲを介して抗原依存性の一次活性化を開始するもの（一次細胞内シグナル伝達ドメイン）、及び、抗原非依存的方法で作用し、二次または共刺激シグナルを与えるもの（二次細胞質ドメイン、例えば、共刺激ドメイン）によって媒介されると言うことができる。
一次シグナル伝達ドメインは、促進的方法、または、抑制的方法のいずれかで、当該ＴＣＲ複合体の一次活性化を調節する。促進的な方法で作用する一次細胞内シグナル伝達ドメインは、免疫受容体チロシン活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）として知られるシグナル伝達モチーフを含み得る。
本発明において特に有用である一次細胞内シグナル伝達ドメインを含むＩＴＡＭの例として、ＣＤ３ゼータ、ＦｃＲガンマ、ＦｃＲベータ、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ３デルタ、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ５、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、及び、ＣＤ６６ｄのものがある。ある実施形態では、本発明のＴＦＰは、細胞内シグナル伝達ドメイン、例えば、ＣＤ３イプシロンの一次シグナル伝達ドメインを含む。ある実施形態では、一次シグナル伝達ドメインは、変性ＩＴＡＭドメイン、例えば、天然のＩＴＡＭドメインと比較して、活性が変化（例えば、増加または減少）している変異ＩＴＡＭドメインを含む。ある実施形態では、一次シグナル伝達ドメインは、変性ＩＴＡＭ含有一次細胞内シグナル伝達ドメイン、例えば、最適化された、及び／または、切断されたＩＴＡＭ含有一次細胞内シグナル伝達ドメインを含む。ある実施形態では、一次シグナル伝達ドメインは、１つ、２つ、３つ、４つ、または、それより多いＩＴＡＭモチーフを含む。
当該ＴＦＰの当該細胞内シグナル伝達ドメインは、当該ＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインをそれ自体で含むことも、あるいは、本発明のＴＦＰとの関連で有用なその他のあらゆる所望の細胞内シグナル伝達ドメイン（複数可）と組み合わせることもできる。例えば、当該ＴＦＰの当該細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３イプシロン鎖部分、及び、共刺激シグナル伝達ドメインを含むことができる。当該共刺激シグナル伝達ドメインは、共刺激分子の当該細胞内ドメインを含む当該ＴＦＰの部分のことを指す。共刺激分子は、抗原に対するリンパ球の効率的な反応に必要とされる、抗原受容体、または、そのリガンド以外の細胞表面分子である。そのような分子の例として、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＯＸ４０、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ１、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原１（ＬＦＡ－１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７－Ｈ３、及び、ＣＤ８３に特異的に結合するリガンドなどがある。例えば、ＣＤ２７共刺激は、ヒトＴＦＰ－Ｔ細胞のインビトロでの増殖、エフェクター機能、及び、生存性を高めること、そして、インビボでヒトＴ細胞の持続性と抗腫瘍活性とを増大させることが実証されている（Ｓｏｎｇ ｅｔ ａｌ． Ｂｌｏｏｄ． ２０１２；１１９（３）：６９６－７０６）。
本発明の当該ＴＦＰの当該細胞質部分内の当該細胞内シグナル伝達配列は、ランダムまたは特定の順序で互いに連結し得る。任意に、例えば、長さが２～１０個のアミノ酸（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、または、１０個のアミノ酸）の短いオリゴ、または、ポリペプチドリンカーは、細胞内シグナル伝達配列間の結合を形成し得る。
ある実施形態では、グリシン－セリンダブレットが適切なリンカーとして使用され得る。ある実施形態では、単一のアミノ酸、例えば、アラニン、グリシンを、適切なリンカーとして使用することができる。
ある態様では、本明細書に記載の当該ＴＦＰ発現細胞は、第２のＴＦＰ、例えば、異なる抗原結合ドメイン、例えば、同じ標的（メソテリン）、または、異なる標的（例えば、ＣＤ１２３）に対するものを含む第２のＴＦＰをさらに含むことができる。ある実施形態では、当該ＴＦＰ発現細胞が２つ以上の異なるＴＦＰを含む場合、当該異なるＴＦＰの当該抗原結合ドメインを、当該抗原結合ドメインが互いに相互作用しないようなものにすることができる。例えば、第１及び第２のＴＦＰを発現する細胞は、第１のＴＦＰの抗原結合ドメインを、例えば、断片、例えば、ｓｃＦｖとして有することができ、これは、当該第２のＴＦＰの当該抗原結合ドメインと会合を形成しないものであり、例えば、当該第２のＴＦＰの当該抗原結合ドメインは、ＶＨＨである。
別の態様では、本明細書に記載したＴＦＰ発現細胞は、別の作用物質、例えば、ＴＦＰ発現細胞の活性を高める作用物質をさらに発現することができる。例えば、ある実施形態では、当該作用物質は、抑制分子を阻害する作用物質とすることができる。抑制分子、例えば、ＰＤ１は、幾つかの実施形態では、ＴＦＰ発現細胞の免疫エフェクター反応の開始能力を弱めることができる。抑制分子の例としては、ＰＤ１、ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ４、ＴＩＭ３、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４、及び、ＴＧＦＲベータがある。ある実施形態では、抑制分子を阻害する当該作用物質は、第１のポリペプチド、例えば、ポジティブシグナルを、細胞、例えば、本明細書に記載した細胞内シグナル伝達ドメインに与える第２のポリペプチドに会合した抑制分子を含む。ある実施形態では、当該作用物質は、第１のポリペプチド、例えば、ＰＤ１、ＬＡＧ３、ＣＴＬＡ４、ＣＤ１６０、ＢＴＬＡ、ＬＡＩＲ１、ＴＩＭ３、２Ｂ４、及び、ＴＩＧＩＴ、または、これらのあらゆる断片（例えば、これらのいずれかの細胞外ドメインの少なくとも一部）などの抑制分子のもの、及び、本明細書に記載した細胞内シグナル伝達ドメイン（例えば、共刺激ドメイン（例えば、４－１ＢＢ、ＣＤ２７、または、ＣＤ２８、例えば、本明細書に記載したもの）及び／または、一次シグナル伝達ドメイン（例えば、本明細書に記載したＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメイン）を含む）である第２のポリペプチドを含む。ある実施形態では、当該作用物質は、ＰＤ１の第１のポリペプチドまたはその断片（例えば、ＰＤ１の細胞外ドメインの少なくとも一部）、及び、本明細書に記載した細胞内シグナル伝達ドメインの第２のポリペプチド（例えば、本明細書に記載したＣＤ２８シグナル伝達ドメイン、及び／または、本明細書に記載したＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメイン）を含む。ＰＤ１は、ＣＤ２８、ＣＴＬＡ－４、ＩＣＯＳ、及び、ＢＴＬＡも含む受容体のＣＤ２８ファミリーの抑制性メンバーである。ＰＤ－１は、活性化Ｂ細胞、Ｔ細胞、及び、骨髄細胞で発現される（Ａｇａｔａ ｅｔ ａｌ．１９９６ Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ ８：７６５－７５）。ＰＤ１に対する２つのリガンド、すなわち、ＰＤ－Ｌ１、及び、ＰＤ－Ｌ２が、ＰＤ１への結合時、Ｔ細胞の活性化をダウンレギュレートすることが示された（Ｆｒｅｅｍａｎ ｅｔ ａｌ．２０００ Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １９２：１０２７－３４；Ｌａｔｃｈｍａｎ ｅｔ ａｌ． ２００１ Ｎａｔ Ｉｍｍｕｎｏｌ ２：２６１－８；Ｃａｒｔｅｒ ｅｔ ａｌ．２００２ Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ ３２：６３４－４３）。ＰＤ－Ｌ１は、ヒトのがんに豊富に含まれている（Ｄｏｎｇ ｅｔ ａｌ．２００３ Ｊ Ｍｏｌ Ｍｅｄ ８１：２８１－７；Ｂｌａｎｋ ｅｔ ａｌ．２００５ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ ５４：３０７－３１４；Ｋｏｎｉｓｈｉ ｅｔ ａｌ．２００４ Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ １０：５０９４）。免疫抑制は、ＰＤ１とＰＤ－Ｌ１の局所的相互作用を阻害することによって覆され得る。
ある実施形態では、当該作用物質は、当該抑制分子の当該細胞外ドメイン（ＥＣＤ）を含み、例えば、プログラム死１（ＰＤ１）は、膜貫通ドメイン、及び、任意に細胞内シグナル伝達ドメイン、例えば、４１ＢＢ及びＣＤ３ゼータ（本明細書ではＰＤ１ ＴＦＰとも称する）と融合することができる。ある実施形態では、当該ＰＤ１ ＴＦＰは、本明細書に記載した抗メソテリンＴＦＰと組み合わせて使用した場合、Ｔ細胞の持続性を改善する。ある実施形態では、当該ＴＦＰは、ＰＤ１の細胞外ドメインを含むＰＤ１ ＴＦＰである。選択的に、例えば、プログラム死リガンド１（ＰＤ－Ｌ１）またはプログラム死リガンド２（ＰＤ－Ｌ２）に特異的に結合するｓｃＦｖなどの抗体または抗体断片を含むＴＦＰを提供する。
別の態様では、本発明は、ＴＦＰ発現Ｔ細胞、例えば、ＴＦＰ－Ｔ細胞の集団を提供する。幾つかの実施形態では、ＴＦＰ発現Ｔ細胞の当該集団は、異なるＴＦＰを発現する細胞の混合物を含む。例えば、ある実施形態では、ＴＦＰ－Ｔ細胞の当該集団は、本明細書に記載した抗メソテリン結合ドメインを有するＴＦＰを発現する第１の細胞、及び、異なる抗メソテリン結合ドメイン、例えば、当該第１の細胞によって発現されるＴＦＰ内の抗メソテリン結合ドメインとは異なる本明細書に記載した抗メソテリン結合ドメインを有するＴＦＰを発現する第２の細胞含むことができる。別の例として、ＴＦＰ発現細胞の当該集団は、抗メソテリン結合ドメイン、例えば、本明細書に記載したものを含むＴＦＰを発現する第１の細胞、及び、メソテリン以外の標的（例えば、別の腫瘍関連抗原）に対する抗原結合ドメインを含むＴＦＰを発現する第２の細胞を含むことができる。
別の態様では、本発明は、当該集団内の少なくとも１つの細胞が本明細書に記載した抗メソテリンドメインを有するＴＦＰを発現する細胞の集団、及び、別の作用物質、例えば、ＴＦＰ発現細胞の活性を高める作用物質を発現する第２の細胞を提供する。例えば、ある実施形態では、当該作用物質は、抑制分子を阻害する作用物質とすることができる。抑制分子は、例えば、幾つかの実施形態では、ＴＦＰ発現細胞の免疫エフェクター反応の開始能力を弱めることができる。抑制分子の例として、ＰＤ１、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２、ＣＴＬＡ４、ＴＩＭ３、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４、及び、ＴＧＦＲベータがある。ある実施形態では、抑制分子を阻害する当該作用物質は、第１のポリペプチド、例えば、ポジティブシグナルを、細胞、例えば、本明細書に記載した細胞内シグナル伝達ドメインに与える第２のポリペプチドに会合した抑制分子を含む。
本明細書では、ＴＦＰをコードする、インビトロで転写したＲＮＡの生成方法を開示する。また、本発明は、細胞に直接トランスフェクトすることができるＴＦＰをコードするＲＮＡ構築物を含む。トランスフェクションに用いるｍＲＮＡの生成方法は、特別にデザインしたプライマーを用いた鋳型のインビトロ転写（ＩＶＴ）に続く、ポリＡ付加に関与しており、３’及び５’非翻訳配列（「ＵＴＲ」）、５’キャップ、及び／または、配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）、発現される核酸、及び、一般的には、５０～２０００塩基の長さのポリＡ尾部を含む、構築物を生成することができる。このようにして生成したＲＮＡは、異なる種類の細胞を効率的にトランスフェクトすることができる。ある態様では、当該鋳型は、当該ＴＦＰに対する配列を含む。
ある態様では、当該抗メソテリンＴＦＰは、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）によってコードされる。ある態様では、当該抗メソテリンＴＦＰをコードするｍＲＮＡは、Ｔ細胞に導入されて、ＴＦＰ－Ｔ細胞を産生する。ある実施形態では、当該インビトロで転写したＲＮＡ ＴＦＰは、一過性トランスフェクションとして細胞に導入することができる。当該ＲＮＡは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）で生成される鋳型を用いたインビトロ転写で生成される。あらゆる供給源に由来する目的のＤＮＡは、ＰＣＲによって、インビトロｍＲＮＡ合成用の鋳型に、適切なプライマー及びＲＮＡポリメラーゼを用いて、直接変換することができる。当該ＤＮＡの供給源は、例えば、ゲノムＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、ファージＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡ配列、または、あらゆる他の適切なＤＮＡの供給源とすることができる。インビトロ転写用の当該所望の鋳型は、本発明のＴＦＰである。ある実施形態では、ＰＣＲに使用される当該ＤＮＡは、オープンリーディングフレームを含む。当該ＤＮＡは、生物の当該ゲノムに由来する天然ＤＮＡ配列由来とすることができる。ある実施形態では、当該核酸は、５’及び／または３’非翻訳領域（ＵＴＲ）の一部または全部を含むことができる。当該核酸は、エクソン及びイントロンを含むことができる。ある実施形態では、ＰＣＲに使用される当該ＤＮＡは、ヒト核酸配列である。別の実施形態では、ＰＣＲに使用される当該ＤＮＡは、５’及び３’ＵＴＲを含むヒト核酸配列である。当該ＤＮＡは、代替的に、自然界に存在する生物で通常は発現されない人工ＤＮＡ配列とすることができる。例示的な人工ＤＮＡ配列は、融合タンパク質をコードするオープンリーディングフレームを形成するために一緒に連結する遺伝子の部分を含むものである。一緒に連結するＤＮＡの当該部分は、単一の生物由来、あるいは、複数の生物に由来することができる。
ＰＣＲを用いて、トランスフェクションに用いられるｍＲＮＡのインビトロ転写用の鋳型を生成する。ＰＣＲの実施方法は、当該技術分野で周知である。ＰＣＲ用のプライマーは、当該ＰＣＲ用の鋳型として用いられるＤＮＡの領域に実質的に相補的な領域を有するようにデザインする。本明細書で用いる「実質的に相補的」とは、当該プライマー配列における塩基の大部分またはすべてが相補的である、または、１つ以上の塩基が非相補的である、または、不一致であるヌクレオチド配列のことを指す。実質的に相補的な配列は、ＰＣＲに用いられるアニーリング条件下で、アニーリングまたは目的のＤＮＡ標的とのハイブリッドを形成することができる。当該プライマーは、当該ＤＮＡ鋳型のあらゆる部分と実質的に相補的になるようにデザインすることができる。例えば、当該プライマーは、通常は細胞内で転写される核酸（オープンリーディングフレーム）の部分を、５’及び３’ＵＴＲを含めて、増幅するようにデザインすることができる。また、当該プライマーは、目的の特定のドメインをコードする核酸の部分を増幅するようにデザインすることもできる。ある実施形態では、当該プライマーを、ヒトｃＤＮＡのコード領域を、５’及び３’ＵＴＲのすべてまたは一部を含めて、増幅するようにデザインする。ＰＣＲに有用なプライマーは、当該技術分野で周知の合成方法で生成することができる。「フォワードプライマー」は、増幅される当該ＤＮＡ配列の上流である当該ＤＮＡ鋳型でのヌクレオチドに実質的に相補的なヌクレオチドの領域を含むプライマーである。「上流」は、当該コード鎖に関して増幅される当該ＤＮＡ配列に対する、５の位置を指すために、本明細書で使用する。「リバースプライマー」は、増幅される当該ＤＮＡ配列の下流である二本鎖ＤＮＡ鋳型に実質的に相補的なヌクレオチドの領域を含むプライマーである。「下流」は、当該コード鎖に関して増幅される当該ＤＮＡ配列に対する、３’の位置を指すために、本明細書で使用する。
ＰＣＲに有用なあらゆるＤＮＡポリメラーゼを、本明細書に開示した方法に用いることができる。それらの試薬とポリメラーゼは、複数の供給元から市販されている。
安定性、及び／または、翻訳効率を促進する能力がある化学構造も用い得る。当該ＲＮＡは、好ましくは、５’及び３’ＵＴＲを有する。ある実施形態では、当該５’ＵＴＲは、１～３０００ヌクレオチドの長さである。当該コード領域に付加される５’及び３’ＵＴＲ配列の長さは、異なる方法によって変更することができ、同方法として、当該ＵＴＲの異なる領域にアニーリングするＰＣＲ用のプライマーのデザインがあるが、これに限定されない。この方法を用いて、当業者であれば、転写したＲＮＡのトランスフェクションに続いて、最適な翻訳効率を達成するために必要とされる５’及び３’ＵＴＲの長さを改変することができる。
当該５’及び３’ＵＴＲを、目的の核酸に対する自然界に存在する内因性５’及び３’ＵＴＲとすることができる。あるいは、目的の核酸にとって内因性でないＵＴＲ配列を、当該ＵＴＲ配列をフォワード及びリバースプライマーに組み込むことで、または、当該鋳型のあらゆる他の修飾によって、付加することができる。目的の核酸にとって内因性でないＵＴＲ配列の使用は、当該ＲＮＡの安定性、及び／または、翻訳効率を改変するために有用なものとすることができる。例えば、３’ＵＴＲ配列内のＡＵリッチ領域は、ｍＲＮＡの安定性を弱めることができることが知られている。したがって、３’ＵＴＲは、当該技術分野で周知のＵＴＲの特性に基づいて、当該転写したＲＮＡの安定性を高めるように選択またはデザインすることができる。
ある実施形態では、当該５’ＵＴＲは、当該内因性核酸のコザック配列を含むことができる。あるいは、当該目的の核酸にとって内因性でない５’ＵＴＲが上記した通りにＰＣＲによって付加される場合、コンセンサスコザック配列は、当該５’ＵＴＲ配列の付加によって改めてデザインすることができる。コザック配列は、幾つかのＲＮＡ転写産物の翻訳効率を高めることができるが、効率的な翻訳を可能にするために、すべてのＲＮＡに必要であるとは思われない。多くのｍＲＮＡに対するコザック配列の必要性は、当該技術分野で公知である。他の実施形態では、当該５’ＵＴＲを、そのＲＮＡゲノムが細胞内で安定であるＲＮＡウイルスの５’ＵＴＲとすることができる。他の実施形態では、当該３’または５’ＵＴＲに様々なヌクレオチド類似体を用いて、当該ｍＲＮＡのエキソヌクレアーゼ分解を妨げることができる。
遺伝子クローニングを必要とせずに、ＤＮＡ鋳型からのＲＮＡ合成を可能にするために、転写プロモーターは、転写される配列の上流のＤＮＡ鋳型に取り付けられるべきである。ＲＮＡポリメラーゼに対するプロモーターとして機能する配列が、当該フォワードプライマーの５’末端に付加される場合、当該ＲＮＡポリメラーゼのプロモーターは、転写されるオープンリーディングフレームの上流のＰＣＲ産物に取り込まれる。ある好ましい実施形態では、当該プロモーターは、本明細書の他の箇所に記載したＴ７ポリメラーゼプロモーターである。その他の有用なプロモーターとしては、Ｔ３及びＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼプロモーターがあるが、これらに限定されない。Ｔ７、Ｔ３、及び、ＳＰ６プロモーターに対するコンセンサスヌクレオチド配列は、当該技術分野で公知である。
好ましい実施形態では、当該ｍＲＮＡは、５’末端のキャップ、及び、３’ポリ（Ａ）尾部の双方を有しており、これらは、細胞内でのｍＲＮＡのリボソーム結合、転写の開始、及び、安定性を決定する。環状ＤＮＡ鋳型、例えば、プラスミドＤＮＡで、ＲＮＡポリメラーゼは、真核細胞での発現に適さない長い鎖状体産物を生成する。３’ＵＴＲの末端で線形化したプラスミドＤＮＡの転写で、通常のサイズのｍＲＮＡができるが、これが転写後にポリアデニル化されても、真核生物のトランスフェクションには有効ではない。
線状ＤＮＡ鋳型で、ファージＴ７ ＲＮＡポリメラーゼを、当該転写産物の３’末端を当該鋳型の最後の塩基を越えて延長することができる（Ｓｃｈｅｎｂｏｒｎ ａｎｄ Ｍｉｅｒｅｎｄｏｒｆ，Ｎｕｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，１３：６２２３－３６（１９８５）；Ｎａｃｈｅｖａ ａｎｄ Ｂｅｒｚａｌ－Ｈｅｒｒａｎｚ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２７０：１４８５－６５（２００３）。
ＤＮＡ鋳型内へのポリＡ／Ｔストレッチの従来の組込み法は、分子クローニングである。しかしながら、プラスミドＤＮＡ内に組み込んだポリＡ／Ｔ配列は、プラスミドの不安定性の原因となるため、細菌の細胞由来のプラスミドＤＮＡ鋳型は、多くの場合、欠失及びその他の異常によって非常に不純である。このことが、クローニング法を面倒で時間がかかるだけでなく、しばしば信頼できないものにする。それ故に、クローニングせずに、ポリＡ／Ｔ３’ストレッチを備えたＤＮＡ鋳型の構築を可能にする方法が待望されている。
当該転写ＤＮＡ鋳型のポリＡ／Ｔセグメントは、ポリＴ尾部、例えば、１００Ｔ尾部（サイズは、５０～５０００Ｔとすることができる）を含むリバースプライマーを用いて、ＰＣＲの過程で、または、あらゆる他の方法によるＰＣＲの後に生成することができ、同方法として、ＤＮＡ連結反応、または、インビトロ組換えがあるが、これらに限定されない。また、ポリ（Ａ）尾部は、ＲＮＡに安定性をもたらし、そして、それらの分解を減少させる。一般的に、ポリ（Ａ）尾部の長さは、当該転写したＲＮＡの安定性と正の相関がある。ある実施形態では、当該ポリ（Ａ）尾部は、１００～５０００アデノシンである。
ＲＮＡのポリ（Ａ）尾部は、ポリ（Ａ）ポリメラーゼ、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉのポリＡポリメラーゼ（Ｅ－ＰＡＰ）を用いて、インビトロ転写した後にさらに延長することができる。ある実施形態では、ポリ（Ａ）尾部の長さを１００ヌクレオチドから３００～４００ヌクレオチドまで増加させると、当該ＲＮＡの翻訳効率は約２倍に増加する。加えて、３’末端に異なる化学基を連結すると、ｍＲＮＡの安定性を増加させることができる。かかる連結は、変性／人工ヌクレオチド、アプタマー、及び、その他の化合物を含むことができる。例えば、ポリ（Ａ）ポリメラーゼを用いて、当該ポリ（Ａ）尾部に、ＡＴＰ類似体を組み込むことができる。ＡＴＰ類似体は、当該ＲＮＡの安定性をさらに高めることができる。
５’キャップを付けることも、ＲＮＡ分子に安定性をもたらす。好ましい実施形態では、本明細書に開示した方法で生成するＲＮＡは、５’キャップを含む。この５’キャップは、当該技術分野で公知であり、かつ、本明細書に記載した技術を用いて提供する（Ｃｏｕｇｏｔ，ｅｔ ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．，２９：４３６－４４４（２００１）；Ｓｔｅｐｉｎｓｋｉ，ｅｔ ａｌ．，ＲＮＡ，７：１４６８－９５（２００１）；Ｅｌａｎｇｏ，ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，３３０：９５８－９６６（２００５））。
本明細書に開示した方法で生成したＲＮＡは、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）配列も含むことができる。当該ＩＲＥＳ配列は、あらゆるウイルス、染色体、または、人工的にデザインした配列とし得るものであり、これが、ｍＲＮＡに対するキャップ非依存性リボソーム結合を開始し、翻訳の開始を促す。糖類、ペプチド類、脂質類、タンパク質、酸化防止剤、及び、界面活性剤などの細胞の透過性及び生存能力を促進する因子を含むことができる、細胞のエレクトロポレーションに適したあらゆる溶質を含めることができる。
ＲＮＡは、複数の異なる方法、例えば、商業利用可能なあらゆる方法を用いて、標的細胞に導入することができ、同方法として、エレクトロポレーション（Ａｍａｘａ Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ－ＩＩ（Ａｍａｘａ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｃｏｌｏｇｎｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ））、（ＥＣＭ ８３０（ＢＴＸ）（Ｈａｒｖａｒｄ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｂｏｓｔｏｎ，Ｍａｓｓ．）、または、Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ ＩＩ（ＢｉｏＲａｄ，Ｄｅｎｖｅｒ，Ｃｏｌｏ．）、Ｍｕｌｔｉｐｏｒａｔｏｒ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｔ，Ｈａｍｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、リポフェクションを用いたカチオン性リポソーム媒介トランスフェクション、ポリマーカプセル化、ペプチド媒介トランスフェクション、または、微粒子銃粒子送達システム、例えば、「遺伝子銃」（例えば、Ｎｉｓｈｉｋａｗａ，ｅｔ ａｌ．Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，１２（８）：８６１－７０（２００１）を参照されたい）があるが、これらに限定されない。
ＴＦＰをコードする核酸構築物
本発明は、本明細書に記載した１つ以上のＴＦＰ構築物をコードする核酸分子も提供する。ある態様では、当該核酸分子を、メッセンジャーＲＮＡ転写物として提供する。ある態様では、当該核酸分子を、ＤＮＡ構築物として提供する。
所望の分子をコードする当該核酸配列は、当該技術分野で公知の組換え法、例えば、当該遺伝子を発現する細胞のライブラリーのスクリーニング、同核酸を含むことが分かっているベクターからの当該遺伝子の抽出、または、同核酸を含む細胞及び組織からの直接単離を用いて、標準的な技術を用いて得ることができる。あるいは、目的の遺伝子は、クローンではなく、合成的に生成することができる。
本発明は、本発明のＤＮＡが挿入されるベクターも提供する。レンチウイルスなどのレトロウイルス由来のベクターは、それらが長期間にわたって安定した導入遺伝子の取り込みと、娘細胞におけるその増殖とを可能にするので、長期間にわたる遺伝子導入を達成するのに適したツールである。レンチウイルスベクターは、それらが肝細胞などの非増殖性細胞を形質導入することができるという点で、マウス白血病ウイルスなどのオンコレトロウイルス由来のベクターには無い利点を有する。また、それらは、低免疫原性というさらなる利点を有する。
別の実施形態では、本発明の所望のＴＦＰをコードする当該核酸を含むベクターは、アデノウイルスベクター（Ａ５／３５）である。別の実施形態では、ＴＦＰをコードする核酸の発現は、スリーピングビューティー、クリスパー、ＣＡＳ９、及び、ジンクフィンガーヌクレアーゼなどのトランスポゾンを用いて達成することができる（参照により本明細書に援用する、Ｊｕｎｅ ｅｔ ａｌ．２００９ Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｉｍｍｕｎｏｌ．９．１０：７０４－７１６を参照されたい）。
本発明の発現構築物は、標準的な遺伝子導入プロトコルを用いて、核酸免疫付与、及び、遺伝子治療にも用い得る。遺伝子送達の方法は、当該技術分野で公知である（例えば、それらの全内容を参照により本明細書に援用する、米国特許第５，３９９，３４６号、同第５，５８０，８５９号、同第５，５８９，４６６号を参照されたい）。別の実施形態では、本発明は、遺伝子治療ベクターを提供する。
当該核酸は、複数のタイプのベクターにクローニングすることができる。例えば、当該核酸は、ベクターにクローニングすることができ、同ベクターとして、プラスミド、ファージミド、ファージ誘導体、動物ウイルス、及び、コスミドがあるが、これらに限定されない。特に興味深いベクターとして、発現ベクター、複製ベクター、プローブ生成ベクター、及び、配列決定ベクターがある。
さらに、当該発現ベクターを、ウイルスベクターの形態で細胞に提供し得る。ウイルスベクター技術は、当該技術分野で公知のものであり、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，２０１２，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，ｖｏｌｕｍｅｓ １－４，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ、及び、その他のウイルス学、及び、分子生物学マニュアルに記載されている。ベクターとして有用なウイルスとして、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、及び、レンチウイルスがあるが、これらに限定されない。一般的に、適切なベクターは、少なくとも１つの生物で機能する複製起点、プロモーター配列、好都合な制限エンドヌクレアーゼ部位、及び、１つ以上の選択マーカーを含む（例えば、ＷＯ０１／９６５８４、ＷＯ０１／２９０５８、及び、米国特許第６，３２６，１９３号）。
複数のウイルスベースの系が、哺乳動物細胞への遺伝子導入のために開発されてきた。例えば、レトロウイルスは、遺伝子導入系に好都合なプラットフォームを提供する。選択した遺伝子は、ベクターに挿入され、そして、当該技術分野で公知の技術を用いてレトロウイルス粒子内に格納することができる。当該組換えウイルスは、次に、単離され、そして、インビボまたはエキソビボのいずれかで、目的の細胞に導入することができる。複数のレトロウイルス系が、当該技術分野で公知である。幾つかの実施形態では、アデノウイルスベクターを用いる。複数のアデノウイルスベクターが、当該技術分野で公知である。ある実施形態では、レンチウイルスベクターを用いる。
さらなるプロモーター要素、例えば、エンハンサーは、転写開始の頻度を調節する。一般的に、これらは、開始部位の３０～１１０ｂｐ上流の領域に位置しているが、複数のプロモーターが、当該開始部位の下流に同様に機能要素を含むことが示されている。要素が互いに反転または連動される場合、プロモーターの機能が保存されるように、プロモーター要素間の間隔に柔軟性があることが多い。チミジンキナーゼ（ｔｋ）プロモーターでは、プロモーター要素間の間隔は、活性が落ち始める前に５０ｂｐ離れるまで、大きくすることができる。当該プロモーターに応じて、個々の要素は、協調的または独立的に機能して、転写を活性化することができると思われる。
哺乳動物のＴ細胞においてＴＦＰ導入遺伝子を発現することができるプロモーターの例は、ＥＦ１ａプロモーターである。天然ＥＦ１ａプロモーターは、アミノアシルｔＲＮＡのリボソームへの酵素的導入に関与する伸長因子１複合体のアルファサブユニットの発現を駆動する。当該ＥＦ１ａプロモーターは、哺乳動物の発現プラスミドに広く用いられており、また、レンチウイルスベクターにクローニングした導入遺伝子からのＴＦＰ発現を駆動させるのに有効であることが示されている（例えば、Ｍｉｌｏｎｅ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．１７（８）：１４５３－１４６４ （２００９）を参照されたい）。プロモーターの別の例は、前初期サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター配列である。このプロモーター配列は、それに作動可能に連結したあらゆるポリヌクレオチド配列の高レベルの発現を駆動させることができる強力な構成的プロモーター配列である。しかしながら、その他の構成的プロモーター配列もまた使用し得るものであり、同プロモーターとして、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）初期プロモーター、マウス乳癌ウイルス（ＭＭＴＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）の長い末端反復（ＬＴＲ）プロモーター、ＭｏＭｕＬＶプロモーター、トリ白血病ウイルスプロモーター、エプスタイン・バーウイルス前初期プロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーターがあるが、これらに限定されず、ならびに、ヒト遺伝子のプロモーターとして、例えば、アクチンプロモーター、ミオシンプロモーター、伸長因子１ａプロモーター、ヘモグロビンプロモーター、及び、クレアチンキナーゼプロモーターがあるが、これらに限定されない。さらに、本発明は、構成的プロモーターの使用に限定されない。誘導性プロモーターもまた、本発明の一部として企図している。誘導性プロモーターの使用は、作動可能に連結したポリヌクレオチド配列の発現を、かかる発現を望む場合にオンにすること、または、発現を望まない場合には当該発現をオフにすることが可能な分子スイッチを提供する。誘導性プロモーターの例として、メタロチオニンプロモーター、グルココルチコイドプロモーター、プロゲステロンプロモーター、及び、テトラサイクリン調節プロモーターがあるが、これらに限定されない。
ＴＦＰポリペプチド、または、その一部の発現を評価するため、細胞に導入される発現ベクターはまた、選択マーカー遺伝子もしくはレポーター遺伝子のいずれか、または、その双方を含んで、ウイルスベクターを介してトランスフェクトまたは感染させようとする細胞の集団からの発現細胞の特定及び選択を容易にすることができる。他の態様において、当該選択マーカーは、ＤＮＡの別々の片上に担持され、そして、同時トランスフェクション法に用い得る。選択マーカーとレポーター遺伝子の双方が、当該宿主細胞内での発現を可能にするために、適切な調節配列に隣接し得る。有用な選択マーカーとして、例えば、抗生物質抵抗性遺伝子、例えば、ｎｅｏなどがある。
レポーター遺伝子は、トランスフェクトされた可能性のある細胞を同定するため、及び、調節配列の機能を評価するために用いる。一般的に、レポーター遺伝子は、レシピエントの生物または組織内に存在せず、または、それらによって発現されず、そして、その発現が、幾分容易に検出が可能である特性、例えば、酵素活性で示されるポリペプチドをコードする遺伝子である。当該レポーター遺伝子の発現は、当該ＤＮＡが当該レシピエント細胞に導入された後の適切な時点でアッセイされる。適切なレポーター遺伝子として、ルシフェラーゼ、ベータガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、分泌アルカリホスファターゼをコードする遺伝子、または、緑色蛍光タンパク質遺伝子がある（例えば、Ｕｉ－Ｔｅｉ ｅｔ ａｌ．，２０００ ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ ４７９：７９－８２）。適切な発現系は周知であり、また、公知の技術を用いて調製してもよく、あるいは、市販品を入手し得る。一般的に、レポーター遺伝子の最大の発現レベルを示す最小の５’隣接領域を備えた構築物は、プロモーターとして同定される。かようなプロモーター領域は、レポーター遺伝子に連結され、そして、プロモーター駆動転写を調節する能力について、作用物質を評価するために使用し得る。
細胞内に遺伝子を導入及び発現させる方法は、当該技術分野で公知である。発現ベクターとの関連では、当該ベクターは、宿主細胞、例えば、哺乳動物、細菌、酵母、または、昆虫の細胞に、当該技術分野のあらゆる方法で、容易に導入することができる。例えば、当該発現ベクターは、物理的、化学的、または、生物学的手段によって宿主細胞に移植することができる。
宿主細胞内にポリヌクレオチドを導入するための物理的方法として、リン酸カルシウム沈殿、リポフェクション、微粒子銃、マイクロインジェクション、エレクトロポレーションなどがある。ベクター、及び／または、外因性核酸を含む細胞の産生方法は、当該技術分野で周知である（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，２０１２， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，ｖｏｌｕｍｅｓ １－４，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹを参照されたい）。宿主細胞内へポリヌクレオチドを導入するための好ましい一方法は、リン酸カルシウムトランスフェクションである。
目的のポリヌクレオチドを宿主細胞内に導入するための生物学的方法として、ＤＮＡ及びＲＮＡベクターの使用がある。ウイルスベクター、特に、レトロウイルスベクターは、哺乳動物、例えば、ヒト細胞に遺伝子を挿入するために最も広く用いられる方法となっている。その他のウイルスベクターは、レンチウイルス、ポックスウイルス、単純ヘルペスウイルスＩ型、アデノウイルス、及び、アデノ随伴ウイルスなどから誘導され得る（例えば、米国特許第５，３５０，６７４号、及び、同第５，５８５，３６２号を参照されたい）。
宿主細胞内にポリヌクレオチドを導入するための化学的手段として、コロイド分散系、例えば、高分子複合体、ナノカプセル、ミクロスフェア、ビーズ、そして、水中油型エマルション、ミセル、混合ミセル、及び、リポソームを含む脂質ベース系がある。インビトロ及びインビボでの送達媒体として使用するための例示的なコロイド系は、リポソーム（例えば、人工膜小胞）である。その他の最先端の核酸の標的化送達方法、例えば、標的化ナノ粒子またはその他の適切なサブミクロンサイズの送達システムでのポリヌクレオチドの送達などが利用可能である。
非ウイルス送達システムを利用する場合、例示的な送達媒体は、リポソームである。脂質製剤の使用は、宿主細胞内への核酸の導入（インビトロ、エキソビボ、または、インビボ）を企図している。別の態様では、当該核酸は、脂質と会合され得る。脂質に会合した当該核酸は、リポソームの水性内部に封入し、リポソームの脂質二重層内に散在し、リポソーム及びオリゴヌクレオチドの双方に会合した連結分子を介してリポソームに付着し、リポソーム内に封入し、リポソームと複合体化し、脂質含有溶液に分散し、脂質と混合し、脂質と合わせ、脂質に懸濁液として含有し、ミセルとともに含有または複合化し、または、その他の場合には、脂質と会合し得る。脂質、脂質／ＤＮＡ、または、脂質／発現ベクター関連組成物は、溶液においては、いかなる特定の構造にも限定されない。例えば、それらは二層構造で、ミセルとして存在してもよく、または、「崩壊した」構造で存在してもよい。それらはまた、単に溶液に散在されてもよく、大きさも形状も均一でない凝集体を形成すると思われる。脂質は、脂肪性の物質であり、自然界に存在する脂質、または、合成脂質とし得る。例えば、脂質として、当該細胞質に自然に存在する脂肪小滴、ならびに、長鎖脂肪族炭化水素、及び、それらの誘導体、例えば、脂肪酸、アルコール類、アミン類、アミノアルコール類、及び、アルデヒド類を含む化合物のクラスがある。
使用に適した脂質は、市販元から入手することができる。例えば、ジミリスチルホスファチジルコリン（「ＤＭＰＣ」）は、Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏから入手することができ、リン酸ジセチル（「ＤＣＰ」）は、Ｋ ＆ Ｋ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，Ｎ．Ｙ．）から入手可能であり、コレステロール（「Ｃｈｏｉ」）は、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ－Ｂｅｈｒｉｎｇから入手可能であり、ジミリスチルホスファチジルグリセロール（「ＤＭＰＧ」）、及び、その他の脂質は、Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ，Ｉｎｃ．（Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ，Ａｌａ）から入手し得る。脂質のクロロホルムまたはクロロホルム／メタノールでの原液は、約－２０℃で保存することができる。クロロホルムは、メタノールより容易に蒸発するため、唯一の溶媒として使用する。「リポソーム」は、封入された脂質二重層または凝集体の生成によって形成される様々な単層または多重膜の脂質媒体を含む総称である。リポソームは、リン脂質二重膜及び内側の水性媒体を備えた小胞構造を有することを特徴とすることができる。多重膜リポソームは、水性媒体によって分離された複数の脂質層を有する。それらは、リン脂質が過剰の水溶液に懸濁された場合に自然に生じる。当該脂質成分は、自己再編成を経て、閉鎖構造を形成し、そして、当該脂質二重層の間に水と溶解した溶質とを封入する（Ｇｈｏｓｈ ｅｔ ａｌ．，１９９１ Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ ５：５０５－１０）。しかしながら、通常の小胞構造とは溶液内での構造が異なる組成物も包含している。例えば、当該脂質は、ミセル構造をとってもよいし、あるいは、単に脂質分子の不均一な凝集体として存在し得る。リポフェクタミン・核酸複合体も企図している。
宿主細胞内へ外因性核酸を導入するのに用いる方法、または、その他の場合には、本発明の阻害剤に細胞を暴露するのに用いる方法にかかわらず、宿主細胞内での組換えＤＮＡ配列の存在を確認するために、様々なアッセイが行われ得る。かかるアッセイとして、例えば、当業者に周知の「分子生物学的」アッセイ、例えば、サザン及びノーザンブロット法、ＲＴ－ＰＣＲ、及び、ＰＣＲ、「生化学的」アッセイ、例えば、特定のペプチドの有無を、例えば、免疫学的手段（ＥＬＩＳＡ及びウェスタンブロット法）によって、または、本明細書に記載したアッセイで検出して、本発明の範囲に含まれる作用物質を特定するものがある。
また、本発明は、ＴＦＰをコードする核酸分子を含むベクターを提供する。ある態様では、ＴＦＰベクターは、細胞、例えば、Ｔ細胞に直接導入することができる。ある態様では、当該ベクターとして、クローニングまたは発現ベクター、例えば、１つ以上のプラスミド（例えば、発現プラスミド、クローニングベクター、ミニサークル、ミニベクター、二重微小染色体）、レトロウイルスベクター構築物、及び、レンチウイルスベクター構築物があるが、これらに限定されない。ある態様では、当該ベクターは、哺乳動物のＴ細胞でＴＦＰ構築物を発現することができる。ある態様では、当該哺乳動物のＴ細胞は、ヒトＴ細胞である。
Ｔ細胞の供給源
増殖及び遺伝子組換えに先立って、Ｔ細胞の供給源を、対象から取得する。用語「対象」は、免疫反応を誘発することができる生体（例えば、哺乳動物）を含むことを意図している。対象の例としては、ヒト、イヌ、ネコ、マウス、ラット、及び、それらのトランスジェニック種がある。Ｔ細胞は、末梢血単核細胞、骨髄、リンパ節組織、臍帯血、胸腺組織、感染部位由来の組織、腹水、胸水、脾臓組織、及び、腫瘍を含めた複数の供給源から採取することができる。本発明の特定の態様において、当該技術分野で入手可能な様々なＴ細胞株を使用し得る。本発明の特定の態様において、Ｔ細胞は、当業者に公知の様々な技術、例えば、Ｆｉｃｏｌｌ（商標）分離を用いて、対象から回収して、血液の単位から得ることができる。ある好ましい態様において、個体の循環血液由来の細胞は、アフェレーシスによって採取される。当該アフェレーシス産物は、一般的には、Ｔ細胞を含めたリンパ球、単球、顆粒球、Ｂ細胞、その他の有核白血球細胞、赤血球、及び、血小板を含む。ある態様では、アフェレーシスによって回収した細胞を洗浄して、血漿画分を除去し、そして、当該細胞を、その後の処理段階に向けて、適切な緩衝液または媒体に配置し得る。本発明のある態様では、当該細胞を、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄する。別の態様では、当該洗浄液は、カルシウムを欠いており、かつ、マグネシウムを欠く場合も、２価カチオンのすべてではないが、その多くを欠く場合もある。カルシウムの非存在下での最初の活性化段階は、活性化の拡大につなげることができる。洗浄段階は、当業者に公知の方法、例えば、半自動の「フロースルー」遠心分離（例えば、Ｃｏｂｅ ２９９１細胞プロセッサー、ｔｈｅ Ｂａｘｔｅｒ ＣｙｔｏＭａｔｅ、または、ｔｈｅ Ｈａｅｍｏｎｅｔｉｃｓ Ｃｅｌｌ Ｓａｖｅｒ ５）を用いて、製造業者の指示に従うことで達成し得ることを当業者であれば容易に理解する。洗浄を終えた後に、当該細胞を、様々な生体適合性緩衝液、例えば、Ｃａ不含、Ｍｇ不含のＰＢＳ、ＰｌａｓｍａＬｙｔｅ Ａ、または、緩衝液を含有する、または、含有しないその他の生理食塩水に再懸濁され得る。あるいは、当該アフェレーシス試料の望ましくない成分を除去し、そして、当該細胞を直接に培地で再懸濁し得る。
ある態様では、赤血球を溶解し、単球を、例えば、ＰＥＲＣＯＬＬ（商標）勾配を介した遠心分離によって、または、向流遠心水簸によって枯渇させることで、Ｔ細胞を末梢血リンパ球から単離する。Ｔ細胞の特定の亜集団、例えば、ＣＤ３＋、ＣＤ２８＋、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋、ＣＤ４５ＲＡ＋、及び、ＣＤ４５ＲＯ＋Ｔ細胞を、ポジティブまたはネガティブの選択技術によって、さらに単離することができる。例えば、ある態様では、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８（例えば、３×２８）結合ビーズ、例えば、ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（商標）Ｍ－４５０ ＣＤ３／ＣＤ２８ Ｔを用いて、所望のＴ細胞のポジティブの選択に十分な期間をかけてインキュベートして、Ｔ細胞を単離する。ある態様では、当該期間は、約３０分である。さらなる態様において、当該期間は、３０分～３６時間、または、それ以上、及び、その間のすべての整数値にまで及ぶ。さらなる態様では、当該期間は、少なくとも１、２、３、４、５、または、６時間である。なおもさらに別の好ましい態様では、当該期間は、１０～２４時間である。ある態様では、当該インキュベート期間は、２４時間である。腫瘍組織または免疫不全の個体から腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を単離するなど、その他の細胞型と比較してＴ細胞が少ないあらゆる状況でＴ細胞を単離するために、より長いインキュベート時間を用い得る。さらに、より長いインキュベート時間の使用は、ＣＤ８＋Ｔ細胞の捕捉の効率を高めることができる。したがって、Ｔ細胞を、当該ＣＤ３／ＣＤ２８ビーズに結合させる時間を単に短縮または延長することで、及び／または、（本明細書にさらに記載したように）Ｔ細胞に対する当該ビーズの割合を増加または減少させることで、Ｔ細胞の亜集団が優先的に、培養開始時、または、当該工程のその他の時点で選択または反選択することができる。加えて、当該ビーズまたはその他の表面にて抗ＣＤ３、及び／または、抗ＣＤ２８抗体の比率を増加または減少させることで、Ｔ細胞の亜集団は優先的に、培養開始時またはその他の所望の時点で選択または反選択することができる。当業者であれば、本発明において複数の選択期間を使用することもできることを認識する。特定の態様において、当該選択手順を行い、そして、「選択されていない」細胞を、活性化及び増殖工程で用いることが望ましい場合がある。「選択されていない」細胞を、さらなる選択期間に供することもできる。
ネガティブ選択によるＴ細胞集団の濃縮は、当該ネガティブに選択した細胞に特有の表面マーカーに対する抗体の組合せを用いて達成することができる。ある方法は、ネガティブに選択した細胞に存在する細胞表面マーカーに対するモノクローナル抗体のカクテルを用いるネガティブ磁気免疫接着、または、フローサイトメトリーを介した細胞選別、及び／または、選択である。例えば、ネガティブの選択によってＣＤ４＋細胞を濃縮するためには、モノクローナル抗体カクテルは、一般的には、ＣＤ１４、ＣＤ２０、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１６、ＨＬＡ－ＤＲ、及び、ＣＤ８に対する抗体を含む。特定の態様において、一般的には、ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋、ＣＤ６２Ｌｈｉ、ＧＩＴＲ＋、及び、ＦｏｘＰ３＋を発現する調節性Ｔ細胞を濃縮またはポジティブに選択することが望ましい場合がある。あるいは、特定の態様において、調節性Ｔ細胞を、抗Ｃ２５結合ビーズ、または、その他の同様の選択方法によって枯渇する。
ある実施形態では、ＩＦＮ－γ、ＴＮＦ－アルファ、ＩＬ－１７Ａ、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－４、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１０、ＩＬ－１３、グランザイムＢ、及び、パーフォリン、または、その他の適切な分子、例えば、その他のサイトカインの１つ以上を発現するＴ細胞集団を選択することができる。細胞発現のスクリーニング方法は、例えば、ＰＣＴ公開第ＷＯ２０１３／１２６７１２号に記載の方法で、決定することができる。
ポジティブまたはネガティブの選択による所望の細胞集団の単離のため、細胞濃度、及び、表面（例えば、ビーズ等の粒子）を変更することができる。特定の態様では、ビーズと細胞を混合する体積を大幅に減少させて（例えば、細胞濃度を増加させて）、細胞とビーズを最大に接触させることが望ましい場合がある。例えば、ある態様では、２０億個の細胞／ｍＬの濃度を用いる。ある態様では、１０億個の細胞／ｍＬの濃度を用いる。さらなる態様において、１億個超の細胞／ｍＬを用いる。さらなる態様では、１０００万、１５００万、２０００万、２５００万、３０００万、３５００万、４０００万、４５００万、または、５０００万個の細胞／ｍＬの細胞濃度を用いる。なおもさらにある態様では、７５００万、８０００万、８５００万、９０００万、９５００万、または、１億個の細胞／ｍＬの細胞濃度を用いる。さらなる態様では、１億２５００万または１億５０００万個の細胞／ｍＬの濃度を用いることができる。高濃度の使用は、細胞収率、細胞活性化、及び、細胞増殖の増加をもたらすことができる。さらに、高細胞濃度の使用は、目的の標的抗原の発現が弱い可能性がある細胞、例えば、ＣＤ２８ネガティブＴ細胞、または、多くの腫瘍細胞が存在する試料（例えば、白血病血液、腫瘍組織など）からの細胞を、より効率的に捕捉することを可能にする。かような細胞集団は、治療的価値を有する場合があり、また、得ることが望ましい。例えば、高細胞濃度の使用は、通常は、ＣＤ８の発現が弱いＣＤ２８＋Ｔ細胞のより効率的な選択を可能にする。
関連する態様では、より低濃度の細胞を使用することが望ましい場合がある。Ｔ細胞と表面（例えば、ビーズ等の粒子）の混合物を大胆に希釈することで、当該粒子と細胞との間の相互作用が最小化される。これは、当該粒子に結合する所望の抗原を豊富に発現する細胞を選択する。例えば、ＣＤ４＋Ｔ細胞は、ＣＤ２８を高レベルで発現し、そして、希釈濃度において、ＣＤ８＋Ｔ細胞より効率的に捕捉される。ある態様では、使用する細胞濃度は、５×１０６／ｍＬである。その他の態様では、使用する濃度は、約１×１０５／ｍＬ～１×１０６／ｍＬ、及び、その間のあらゆる整数値であり得る。その他の態様では、当該細胞は、回転装置上で、様々な長さの時間、様々な速度で、２～１０℃、または、室温のいずれかでインキュベートし得る。
刺激用のＴ細胞を、洗浄工程の後に、凍結させることもできる。理論に拘束されることを望むものではないが、凍結と、それに続く解凍工程とは、当該細胞集団での顆粒球、及び、ある程度の単球を除去することで、より均一な産物を提供する。血漿及び血小板を除去する洗浄工程の後に、当該細胞は、凍結溶液に懸濁し得る。数多くの凍結溶液とパラメーターとが当該技術分野で公知であり、また、このことに関して有用であるが、ある方法は、２０％ＤＭＳＯ、及び、８％ヒト血清アルブミンを含むＰＢＳ、または、１０％デキストラン４０、及び、５％デキストロース、２０％ヒト血清アルブミン、及び、７．５％ＤＭＳＯ、または、３１．２５％Ｐｌａｓｍａｌｙｔｅ－Ａ、３１．２５％デキストロース５％、０．４５％ＮａＣｌ、１０％デキストラン４０、及び、５％デキストロース、２０％ヒト血清アルブミン、及び、７．５％ＤＭＳＯを含む培地、または、例えば、Ｈｅｓｐａｎ及びＰｌａｓｍａＬｙｔｅ Ａを含むその他の適切な細胞凍結媒体の使用を含み、当該細胞を、その後、－８０℃になるまで毎分１の速度で凍結し、そして、液体窒素貯蔵タンクの気相で保存する。その他の制御凍結法は、－２０℃、または、液体窒素中での制御されていない即時凍結と同様に使用し得る。特定の態様では、凍結保存細胞は、本明細書に記載した通りに解凍及び洗浄され、そして、室温で１時間静置され、その後に、本発明の方法を用いて活性化させる。
本発明において同様に企図しているものは、本明細書に記載した増殖細胞を必要とし得る前の期間における、対象からの血液試料またはアフェレーシス産物の採取である。したがって、増殖する当該細胞の供給源は、あらゆる必要な時点で採取され、そして、所望の細胞、例えば、Ｔ細胞を、Ｔ細胞療法で恩恵を受ける様々な疾患または病態、例えば、本明細書に記載したもののためのＴ細胞療法の後での使用のために、単離及び凍結する。ある態様では、血液試料またはアフェレーシスは、一般的に、健康な対象から採取する。特定の態様では、血液試料またはアフェレーシスは、疾患の発症の危険性があるが、未だ発病していない概して健康な対象から採取し、そして、目的の細胞を、後の使用のために単離及び凍結する。特定の態様では、当該Ｔ細胞は、増殖され、凍結され、その後に使用され得る。特定の態様では、試料は、本明細書に記載した特定の疾患の診断の直後で、いずれかの治療の前の患者から採取される。さらなる態様では、当該細胞は、様々な関連する治療法に先立って、対象由来の血液試料またはアフェレーシスから単離するものであり、同治療法として、ナタリズマブ、エファリズマブ、抗ウイルス剤、化学療法、放射線、免疫抑制剤、例えば、シクロスポリン、アザチオプリン、メトトレキサート、ミコフェノール酸、及び、ＦＫ５０６、抗体、または、その他の免疫消失薬、例えば、アレムツズマブ、抗ＣＤ３抗体、シトキサン、フルダラビン、シクロスポリン、ＦＫ５０６、ラパマイシン、ミコフェノール酸、ステロイド、ＦＲ９０１２２８、及び、放射線照射などの作用物質を用いた治療があるが、これに限定されない。
本発明のさらなる態様では、Ｔ細胞を、当該対象に機能的Ｔ細胞を残す治療の後に、患者から直接に採取する。その点について、特定のがん治療の後、免疫系に損傷を与える薬物での特定の治療において、治療の直後、患者が当該治療から通常回復する期間に、得られたＴ細胞の品質は、エキソビボでのそれらの増殖能が最適であるか、または、改善されている可能性があることが観察されている。同様に、本明細書に記載した方法を用いたエキソビボ操作の後、これらの細胞は、生着及びインビボ増殖の向上に好ましい状態にあり得る。したがって、本発明において、Ｔ細胞を含めた血液細胞、樹状細胞、または、造血系の他の細胞を、この回復期に採取することを企図している。さらに、特定の態様では、動員（例えば、ＧＭ－ＣＳＦでの動員）、及び、前処置レジメンを用いて、特定の細胞型の再増殖、再循環、再生、及び／または、増殖を促進する対象における、特に治療後の所定の時間窓での条件を作成することができる。例示的な細胞型として、Ｔ細胞、Ｂ細胞、樹状細胞、及び、免疫系のその他の細胞がある。
Ｔ細胞の活性化及び増殖
Ｔ細胞は、一般的に、例えば、米国特許第６，３５２，６９４号、同第６，５３４，０５５号、同第６，９０５，６８０号、同第６，６９２，９６４号、同第５，８５８，３５８号、同第６，８８７，４６６号、同第６，９０５，６８１号、同第７，１４４，５７５号、同第７，０６７，３１８号、同第７，１７２，８６９号、同第７，２３２，５６６号、同第７，１７５，８４３号、同第５，８８３，２２３号、同第６，９０５，８７４号、同第６，７９７，５１４号、同第６，８６７，０４１号、及び、同７，５７２，６３１号に記載の方法を用いて、活性化及び増殖し得る。
一般的に、本発明のＴ細胞は、ＣＤ３／ＴＣＲ複合体関連シグナルを刺激する作用物質を付着した表面、及び、当該Ｔ細胞の表面の共刺激分子を刺激するリガンドとの接触によって増殖し得る。特に、Ｔ細胞集団は、本明細書に記載したように、例えば、抗ＣＤ３抗体、または、その抗原結合断片、または、表面に固定化された抗ＣＤ２抗体との接触によって、または、カルシウムイオノフォアと組み合わせてプロテインキナーゼＣ活性化剤（例えば、ブリオスタチン）との接触によって刺激し得る。Ｔ細胞表面のアクセサリー分子の共刺激に対しては、当該アクセサリー分子に結合するリガンドが用いられる。例えば、Ｔ細胞の集団は、当該Ｔ細胞の増殖を刺激するために適切な条件下で、抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体と接触し得る。ＣＤ４＋Ｔ細胞、または、ＣＤ８＋Ｔ細胞のいずれかの増殖を刺激するためには、抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体。抗ＣＤ２８抗体の例として、９．３、Ｂ－Ｔ３、ＸＲ－ＣＤ２８（Ｄｉａｃｌｏｎｅ，Ｂｅｓａｎｃｏｎ，Ｆｒａｎｃｅ）があり、また、当該技術分野で一般的に公知のその他の方法（Ｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．、Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ Ｐｒｏｃ．３０（８）：３９７５－３９７７、１９９８；Ｈａａｎｅｎ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ． １９０（９）：１３１９１３２８、１９９９；Ｇａｒｌａｎｄ ｅｔ ａｌ．、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．２２７（１－２）：５３－６３、１９９９）を用いることができる。
多様な刺激時間に曝露されたＴ細胞は、異なる特性を呈し得る。例えば、典型的な血液またはアフェレーシスで得た末梢血の単核細胞産物は、ヘルパーＴ細胞集団（ＴＨ、ＣＤ４＋）を有し、これは、細胞傷害性やサプレッサーＴ細胞集団（ＴＣ、ＣＤ８＋）より多い。ＣＤ３及びＣＤ２８受容体を刺激することによるＴ細胞のエキソビボでの増殖は、約８～９日目より前には、主にＴＨ細胞からなるＴ細胞集団を産生するが、約８～９日目より後は、Ｔ細胞集団は、次第に増加するＴＣ細胞集団を含む。したがって、処置の目的に応じて、主にＴＨ細胞を含むＴ細胞集団を対象に注入することが有利な場合がある。同様に、抗原特異的なＴＣ細胞のサブセットを単離した場合、このサブセットをさらに増殖させることが有益な場合がある。
さらに、ＣＤ４及びＣＤ８のマーカーに加えて、当該細胞増殖工程において、その他の表現型のマーカーは大きく変化するが、大部分は再現性がよい。したがって、かかる再現性が、活性化Ｔ細胞産物を特定の目的用に調整する能力を可能にする。
抗メソテリンＴＦＰが構築されると、様々なアッセイを用いて当該分子の活性を評価することができ、同活性として、例えば、抗原刺激後のＴ細胞を増殖する能力、再刺激の非存在下でＴ細胞増殖を維持する能力、及び、適切なインビトロ及び動物モデルでの抗がん活性などがあるが、これらに限定されない。抗メソテリンＴＦＰの効果を評価するアッセイの詳細は、以下で、さらに説明する。
初代Ｔ細胞におけるＴＦＰ発現のウエスタンブロット分析を用いて、モノマー及びダイマーの存在を検出することができる（例えば、Ｍｉｌｏｎｅ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ １７（８）：１４５３－１４６４（２００９）を参照されたい）。極めて簡潔に述べると、当該ＴＦＰを発現するＴ細胞（ＣＤ４＋とＣＤ８＋Ｔ細胞との１：１混合物）を、インビトロで１０日間よりも長く増殖させ、次いで、溶解して、還元条件下でＳＤＳ－ＰＡＧＥに供する。ＴＦＰを、ＴＣＲ鎖に対する抗体を用いて、ウエスタンブロット法で検出する。同じＴ細胞のサブセットを、非還元条件で、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析に用いて、共有結合ダイマーの生成の評価を可能にする。
抗原刺激した後のＴＦＰ＋Ｔ細胞のインビトロでの増殖は、フローサイトメトリーで測定することができる。例えば、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞の混合物を、アルファＣＤ３／アルファＣＤ２８、及び、ＡＰＣで刺激し、次いで、分析されるプロモーターの制御下で、ＧＦＰを発現するレンチウイルスベクターで形質導入する。例示的なプロモーターとして、ＣＭＶ ＩＥ遺伝子、ＥＦ－１アルファ、ユビキチンＣ、または、ホスホグリセロキナーゼ（ＰＧＫ）プロモーターがある。ＧＦＰの蛍光を、ＣＤ４＋及び／またはＣＤ８＋Ｔ細胞のサブセットでの培養の６日目に、フローサイトメトリーで評価する（例えば、Ｍｉｌｏｎｅ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ １７（８）：１４５３－１４６４（２００９）を参照されたい）。あるいは、ＣＤ４＋とＣＤ８＋Ｔ細胞との混合物を、アルファＣＤ３／アルファＣＤ２８被覆磁気ビーズで、０日目に、刺激し、そして、１日目に、ＴＦＰを発現するバイシストロニックなレンチウイルスベクターを用いて、ｅＧＦＰと一緒に、２Ａリボソームスキッピング配列を用いて、ＴＦＰで形質導入する。培養物を洗浄した後に、メソテリン＋Ｋ５６２細胞（Ｋ５６２－メソテリン）、野生型Ｋ５６２細胞（Ｋ５６２野生型）、または、抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８抗体の存在下でｈＣＤ３２及び４－１ＢＢＬを発現するＫ５６２細胞（Ｋ５６２－ＢＢＬ３／２８）のいずれかで再刺激する。外因性ＩＬ－２を、当該培養物に、１日おきに、１００ＩＵ／ｍＬで加える。ＧＦＰ＋Ｔ細胞は、ビーズに基づく計数を用いて、フローサイトメトリーで数える（例えば、Ｍｉｌｏｎｅ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ １７（８）：１４５３－１４６４（２００９）を参照されたい）。
再刺激を実施せずとも持続するＴＦＰ＋Ｔ細胞の増殖も測定することができる（例えば、Ｍｉｌｏｎｅ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ １７（８）：１４５３－１４６４（２００９）を参照されたい）。要するに、アルファＣＤ３／アルファＣＤ２８被覆磁気ビーズで、０日目に、刺激を与え、そして、示したＴＦＰで、１日目に、形質導入した後に、培養の８日目に、平均Ｔ細胞体積（ｆｌ）を、Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｍｕｌｔｉｓｉｚｅｒ ＩＩＩ粒子計測器を用いて測定する。
動物モデルを用いてＴＦＰ－Ｔ活性を測定することもできる。例えば、免疫不全マウスにおいて、がんを治療するためのヒトメソテリン特異的ＴＦＰ＋Ｔ細胞を用いた異種移植モデルを用いることができる（例えば、Ｍｉｌｏｎｅ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ １７（８）：１４５３－１４６４ （２００９）を参照されたい）。極めて簡潔に述べると、がんの定着後に、マウスを治療群に応じてランダム化する。異なる数の改変Ｔ細胞を、１：１の比率で、がんを担持しているＮＯＤ／ＳＣＩＤ／γ－／－マウスに同時注入する。マウス由来の脾臓ＤＮＡにおける各ベクターのコピー数を、Ｔ細胞の注入後の様々な時点で評価する。動物を、１週間間隔で、がんについて評価する。末梢血メソテリン＋がん細胞数を、アルファメソテリン－ゼータＴＦＰ＋Ｔ細胞、または、モック（ｍｏｃｋ）形質導入Ｔ細胞を注入したマウスで測定する。これらの群についての生存曲線を、ログランク検定を用いて比較する。加えて、ＮＯＤ／ＳＣＩＤ／γ－／－マウスにＴ細胞を注入して４週間後の末梢血ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞の絶対数も分析することができる。マウスにがん細胞を注入し、そして、３週間後に、ｅＧＦＰに連結したＴＦＰをコードするバイシストロニックレンチウイルスベクターで、ＴＦＰを発現するように改変したＴ細胞を注入する。Ｔ細胞を、注入に先立って、モック（ｍｏｃｋ）形質導入細胞と混合することで、４５～５０％インプットＧＦＰ＋Ｔ細胞に対して正規化し、そして、フローサイトメトリーで確認をする。動物を、１週間の間隔でがんについて評価する。ＴＦＰ＋Ｔ細胞群についての生存曲線を、ログランク検定を用いて比較する。
用量依存的なＴＦＰ処置反応を、評価することができる（例えば、Ｍｉｌｏｎｅ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ １７（８）：１４５３－１４６４（２００９）を参照されたい）。例えば、末梢血を、２１日目にＴＦＰ Ｔ細胞、同数のモック（ｍｏｃｋ）形質導入Ｔ細胞を注入したマウス、または、Ｔ細胞を注入していないマウスにおいて、がんが確立して３５～７０日後に採取する。３５日目及び４９日目に、各群のマウスから無作為に採血して、末梢血メソテリン＋がん細胞数の測定を行い、その後に、殺処分する。残りの動物は、５７日目及び７０日目に評価する。
細胞増殖及びサイトカイン産生の評価については、以前に、例えば、Ｍｉｌｏｎｅ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ １７（８）：１４５３－１４６４（２００９）に記載されている。要するに、ＴＦＰ媒介増殖の評価は、マイクロタイタープレートにて、洗浄したＴ細胞を、メソテリンを発現する細胞、または、ＣＤ３２、及び、ＣＤ１３７を発現する細胞（ＫＴ３２－ＢＢＬ）と、最終的なＴ細胞：メソテリンを発現する細胞の比率が２：１になるように混合して行われる。メソテリンを発現する細胞には、使用に先立って、ガンマ線を照射する。抗ＣＤ３（クローンＯＫＴ３）、及び、抗ＣＤ２８（クローン９．３）モノクローナル抗体を、ＫＴ３２－ＢＢＬ細胞を含む培養物に加えると、Ｔ細胞増殖刺激のポジティブコントロールとなるが、これは、これらのシグナルが、長期的なＣＤ８＋Ｔ細胞のエキソビボでの増殖を支持しているためである。Ｔ細胞は、ＣｏｕｎｔＢｒｉｇｈｔ（商標）蛍光ビーズ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、及び、フローサイトメトリーを用いて、培養下で、製造業者の指示に従って計数をする。ＴＦＰ＋Ｔ細胞は、ｅＧＦＰ－２Ａが連結されたＴＦＰ発現レンチウイルスベクターで改変したＴ細胞を用いて、ＧＦＰの発現によって特定される。ＧＦＰを発現しないＴＦＰ＋Ｔ細胞については、当該ＴＦＰ＋Ｔ細胞は、ビオチン化組換えメソテリンタンパク質、及び、二次アビジン－ＰＥ複合体で検出する。Ｔ細胞でのＣＤ４＋及びＣＤ８＋の発現は、特定のモノクローナル抗体（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）でも同時に検出される。サイトカインの測定は、再刺激の２４時間後に採取した上清で、ヒトＴＨ１／ＴＨ２サイトカインサイトメトリービーズアレイキット（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて、製造業者の指示にしたがって行う。蛍光は、ＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒフローサイトメーターを用いて評価し、また、データは、製造業者の指示にしたがって分析を行う。
細胞傷害性は、標準的な５１Ｃｒ放出アッセイによって評価することができる（例えば、Ｍｉｌｏｎｅ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ １７（８）：１４５３－１４６４（２００９）を参照されたい）。要するに、標的細胞に、５１Ｃｒ（ＮａＣｒＯ４として、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｎｕｃｌｅａｒ）を、３７℃で、２時間、頻繁に攪拌しながらロードし、これを完全ＲＰＭＩ培地で２度洗浄し、そして、マイクロタイタープレートに播種する。エフェクターＴ細胞と標的細胞とを、当該ウェル内の完全ＲＰＭＩにて、様々なエフェクター細胞：標的細胞（Ｅ：Ｔ）の比率で混合する。培地のみを含む（自然放出、ＳＲ）、または、界面活性剤トリトン－Ｘ１００の１％溶液（総放出、ＴＲ）を含有する、さらなるウェルも用意する。３７℃で、４時間のインキュベートの後に、各ウェルから上清を採取する。次いで、放出された５１Ｃｒを、ガンマ粒子カウンター（Ｐａｃｋａｒｄ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ Ｃｏ．，Ｗａｌｔｈａｍ，Ｍａｓｓ．）を用いて測定する。各条件を、少なくとも３連で行い、そして、溶解率を、式：溶解％＝（ＥＲ－ＳＲ）／（ＴＲ－ＳＲ）（式中、ＥＲは、各実験条件について放出された平均５１Ｃｒを表す）を用いて計算する。
画像技術を用いて、腫瘍担持動物モデルにおけるＴＦＰの特異的輸送、及び、増殖を評価することができる。かかるアッセイは、例えば、Ｂａｒｒｅｔｔ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ２２：１５７５－１５８６（２０１１）に記載されている。要するに、ＮＯＤ／ＳＣＩＤ／γｃ－／－（ＮＳＧ）マウスに、がん細胞に続いて７日後に、ＴＦＰ構築物でのエレクトロポレーションの４時間後に、Ｔ細胞を静注する。当該Ｔ細胞を、ホタルルシフェラーゼを発現させるために、レンチウイルス構築物を安定的にトランスフェクトし、そして、マウスを生物発光に対して撮像する。あるいは、がん異種移植モデルにおけるＴＦＰ＋Ｔ細胞の単回注射の治療効果、及び、特異性は、以下のようにして測定することができる。ＮＳＧマウスに、ホタルルシフェラーゼを安定的に発現するように形質導入したがん細胞を注射し、続いて、７日後に、メソテリンＴＦＰをエレクトロポレーションしたＴ細胞を、単回、尾静脈注射する。動物を注射した後の様々な時点で撮像する。例えば、代表的なマウスにおけるホタルルシフェラーゼ陽性がんの光子密度ヒートマップを、５日目（処置の２日前）、及び、８日目（ＴＦＰ＋ＰＢＬの２４時間後）に生成することができる。
本明細書の実施例の節に記載のもの、ならびに、当該技術分野で公知のものを含めたその他のアッセイもまた、本発明の抗メソテリンＴＦＰ構築物を評価するために用いることができる。
治療への応用
メソテリン関連疾患及び／または障害
ある態様では、本発明は、メソテリンの発現を伴う疾患を処置するための方法を提供する。ある態様では、本発明は、腫瘍の一部がメソテリンに対して陰性であり、かつ、腫瘍の一部がメソテリンに対して陽性である、疾患を処置する方法を提供する。例えば、本発明のＴＦＰは、メソテリンの発現の上昇を伴う疾患の処置を受けた対象の処置に有用であり、メソテリンのレベルを高める処置を受けた当該対象は、メソテリンのレベルの上昇を伴う疾患を呈する。
ある態様では、本発明は、哺乳動物Ｔ細胞における発現のためのプロモーターに作動可能に連結した抗メソテリンＴＦＰを含むベクターに関する。ある態様では、本発明は、メソテリンを発現する腫瘍の処置における使用のためのメソテリンＴＦＰを発現する組換えＴ細胞を提供し、当該メソテリンＴＦＰを発現する組換えＴ細胞は、メソテリンＴＦＰ－Ｔと称する。ある態様では、本発明のメソテリンＴＦＰ－Ｔは、腫瘍細胞を、その表面に発現した少なくとも１つの本発明のメソテリンＴＦＰと接触させることが可能であり、当該ＴＦＰ－Ｔは、当該腫瘍細胞を標的とし、かつ、当該腫瘍の成長を阻害する。
ある態様では、本発明は、メソテリンを発現する腫瘍細胞の成長の阻害方法であって、当該腫瘍細胞を、本発明のメソテリンＴＦＰ Ｔ細胞と接触させることを含み、当該ＴＦＰ－Ｔが、抗原に応答して活性化され、かつ、当該がん細胞を標的化し、当該腫瘍の成長を阻害する、当該方法に関する。
ある態様では、本発明は、対象におけるがんを処置する方法に関する。当該方法は、本発明のメソテリンＴＦＰ Ｔ細胞を、当該対象に投与することを含み、当該がんが、当該対象において処置される。本発明のメソテリンＴＦＰ Ｔ細胞で処置可能ながんの例として、メソテリンの発現を伴うがんがある。ある態様では、当該がんは、中皮腫である。ある態様では、当該がんは、膵臓癌である。ある態様では、当該がんは、卵巣癌である。ある態様では、当該がんは、胃癌である。ある態様では、当該がんは、肺癌である。ある態様では、当該がんは、子宮内膜癌である。幾つかの実施形態では、メソテリンＴＦＰ療法は、１つ以上のさらなる療法と組み合わせて使用することができる。
本発明は、Ｔ細胞がＴＦＰを発現するように遺伝子組換えされ、かつ、当該ＴＦＰ発現Ｔ細胞を、それを必要とするレシピエントに注入する、一種の細胞療法を含む。注入した細胞は、レシピエントの腫瘍細胞を死滅させることが可能である。抗体療法と異なり、ＴＦＰ発現Ｔ細胞は、インビボで複製することができ、長期にわたって持続し、そのことは、腫瘍の持続的制御につなげることができる。様々な態様では、患者に投与した当該Ｔ細胞、または、それらの後代は、患者に当該Ｔ細胞を投与した後に、少なくとも１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、４ヶ月、５ヶ月、６ヶ月、７ヶ月、８ヶ月、９ヶ月、１０ヶ月、１１ヶ月、１２ヶ月、１３ヶ月、１４ヶ月、１５ヶ月、１６ヶ月、１７ヶ月、１８ヶ月、１９ヶ月、２０ヶ月、２１ヶ月、２２ヶ月、２３ヶ月、２年、３年、４年、または、５年間、当該患者内に留まる。
また、本発明は、Ｔ細胞が、ＴＦＰを一過的に発現するように、例えば、インビトロで転写したＲＮＡで改変し、かつ、当該ＴＦＰ発現Ｔ細胞を、それを必要とするレシピエントに注入する、一種の細胞療法も含む。注入した細胞は、レシピエントの腫瘍細胞を死滅させることができる。したがって、様々な態様では、患者に投与した当該Ｔ細胞は、患者に当該Ｔ細胞を投与した後に、１ヶ月未満、例えば、３週間、２週間、または、１週間は留まる。
いかなる特定の理論にも拘束されることを望むものではないが、当該ＴＦＰ発現Ｔ細胞によって誘発される抗腫瘍免疫反応は、能動または受動免疫反応とし得るものであり、あるいは、直接対間接免疫反応によるものとし得る。ある態様では、当該ＴＦＰを形質導入したＴ細胞は、当該メソテリン抗原を発現するヒトがん細胞に反応して特定の炎症性サイトカイン分泌及び強力な細胞溶解反応を呈し、可溶性メソテリン阻害に耐性であり、バイスタンダー死滅を媒介し、及び／または、定着したヒト腫瘍の退行を媒介する。例えば、メソテリンを発現する腫瘍の異種フィールド内の抗原を持たない腫瘍細胞は、隣接する抗原陽性がん細胞にすでに反応しているメソテリン再指向性Ｔ細胞による間接的な破壊に対して敏感になり得る。
ある態様では、本発明のヒトＴＦＰ改変Ｔ細胞は、哺乳動物における、エキソビボでの免疫付与、及び／または、インビボ療法のための一種のワクチンであり得る。ある態様では、当該哺乳動物は、ヒトである。
エキソビボでの免疫付与に関しては、当該細胞を哺乳動物に投与する前に、以下のうちの少なくとも１つ、ｉ）当該細胞の増殖、ｉｉ）ＴＦＰをコードする核酸を当該細胞に導入する、または、ｉｉｉ）当該細胞の凍結保存、がインビトロで行われる。
エキソビボ手順は、当該技術分野で周知であり、その詳細を以下に述べる。要するに、細胞を、哺乳動物（例えば、ヒト）から単離し、そして、本明細書に開示したＴＦＰを発現するベクターで、遺伝子組換えする（すなわち、インビトロで、形質導入またはトランスフェクトする）。当該ＴＦＰで改変した細胞を、哺乳動物レシピエントに投与して、治療効果を得ることができる。当該哺乳動物レシピエントを、ヒトとし得るものであり、そして、当該ＴＦＰで改変した細胞は、当該レシピエントに関して自己移植とすることができる。あるいは、当該細胞は、当該レシピエントに関して同種異系、同系、または、異種とすることができる。
造血幹細胞及び前駆細胞のエキソビボでの増殖手順は、参照により本明細書に援用する米国特許第５，１９９，９４２号に記載されており、それを、本発明の細胞に適用することができる。その他の適切な方法は、当該技術分野で公知であり、したがって、本発明は、当該細胞のあらゆる特定のエキソビボでの増殖方法に限定されない。要するに、Ｔ細胞のエキソビボでの培養及び増殖は、（１）末梢血採取、または、骨髄外植片から、哺乳動物由来のＣＤ３４＋造血幹細胞及び前駆細胞を採取し、及び、（２）かかる細胞を、エキソビボで増殖させることを含む。米国特許第５，１９９，９４２号に記載の細胞増殖因子に加えて、ｆｌｔ３－Ｌ、ＩＬ－１、ＩＬ－３、及び、ｃ－ｋｉｔリガンドなどのその他の因子を、当該細胞の培養及び増殖のために用いることができる。
エキソビボでの免疫付与に関する細胞ベースのワクチンの使用に加えて、本発明は、患者の抗原に対する免疫反応を誘発するインビボでの免疫付与のための組成物及び方法もまた提供する。
一般的に、本明細書に記載した活性化及び増殖した細胞は、免疫不全の個体で生じる疾患の処置及び予防に利用し得る。特に、本発明のＴＦＰで改変したＴ細胞を、メソテリンの発現を伴う疾患、障害、及び、病態の処置に用いる。特定の態様では、本発明の細胞を、メソテリンの発現を伴う疾患、障害、及び、病態を発症する危険性がある患者の処置に用いる。したがって、本発明は、治療有効量の本発明のＴＦＰで改変したＴ細胞を、メソテリンの発現を伴う疾患、障害、及び、病態の処置または予防を必要とする対象に投与することを含む、当該処置または予防のための方法を提供する。
ある態様では、本発明のＴＦＰ－Ｔ細胞は、がん、または、悪性腫瘍、または、前癌状態などの増殖性疾患を処置するために使用し得る。ある態様では、当該がんは、中皮腫である。ある態様では、当該がんは、膵臓癌である。ある態様では、当該がんは、卵巣癌である。ある態様では、当該がんは、胃癌である。ある態様では、当該がんは、肺癌である。ある態様では、当該がんは、子宮内膜癌である。さらに、メソテリン発現に関連する疾患としては、例えば、非定型、及び／または、非古典的癌、悪性腫瘍、前癌状態、または、メソテリンを発現する増殖性疾患があるが、これらに限定されない。メソテリンの発現に関連するがんに関連しない適応症としては、例えば、自己免疫疾患（例えば、紅斑性狼瘡）、炎症性障害（アレルギー、及び、喘息）、及び、移植があるが、これらに限定されない。
本発明のＴＦＰで改変したＴ細胞は、単独で投与し得るものであり、または、希釈剤、及び／または、その他の成分、例えば、ＩＬ－２、あるいは、その他のサイトカイン、または、細胞集団と組み合わせて医薬組成物として投与し得る。
また、本発明は、メソテリンを発現する細胞集団の当該増殖を阻害、または、当該集団を減少させる方法であって、メソテリンを発現する細胞を含む細胞集団を、メソテリンを発現する細胞に結合する本発明の抗メソテリンＴＦＰ－Ｔ細胞と接触させる、ことを含む方法を提供する。特定の態様では、本発明は、メソテリンを発現するがん細胞集団の増殖を阻害、または、当該集団を減少させる方法であって、メソテリンを発現するがん細胞集団を、メソテリンを発現する細胞に結合する本発明の抗メソテリンＴＦＰ－Ｔ細胞と接触させる、ことを含む方法を提供する。ある態様では、本発明は、メソテリンを発現するがん細胞集団の増殖を阻害、または、当該集団を減少させる方法であって、メソテリンを発現するがん細胞集団を、メソテリンを発現する細胞に結合する本発明の抗メソテリンＴＦＰ－Ｔ細胞と接触させる、ことを含む方法を提供する。特定の態様では、本発明の抗メソテリンＴＦＰ－Ｔ細胞は、細胞、及び／または、がん細胞の分量、数、量、または、割合を、メソテリンを発現する細胞に関連するがんを有する対象、または、動物モデルにおいて、ネガティブコントロールと比較して、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６５％、少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９５％、または、少なくとも９９％低下させる。ある態様では、当該対象は、ヒトである。
また、本発明は、メソテリンを発現する細胞に関連する疾患（例えば、メソテリンを発現するがん）を予防、処置、及び／または、管理する方法であって、必要とする対象に対して、メソテリンを発現する細胞に結合する本発明の抗メソテリンＴＦＰ－Ｔ細胞を投与する、ことを含む方法を提供する。ある態様では、当該対象は、ヒトである。メソテリンを発現する細胞に関連する疾患の例として、自己免疫疾患（紅斑性狼瘡など）、炎症性疾患（アレルギー、及び、喘息など）、及び、がん（膵臓癌、卵巣癌、胃癌、肺癌、または、子宮内膜癌、あるいは、メソテリンを発現する非定型がんなど）があるが、これらに限定されない。
また、本発明は、メソテリンを発現する細胞に関連する疾患を予防、処置、及び／または、管理する方法であって、必要とする対象に対して、メソテリンを発現する細胞に結合する本発明の抗メソテリンＴＦＰ－Ｔ細胞を投与する、ことを含む方法を提供する。ある態様では、当該対象はヒトである。
本発明は、メソテリンを発現する細胞に関連するがんの再発を予防する方法であって、それを必要とする対象に対して、メソテリンを発現する細胞に結合する本発明の抗メソテリンＴＦＰ－Ｔ細胞を投与する、ことを含む方法を提供する。ある態様では、当該方法は、それを必要とする対象に対して、メソテリンを発現する細胞に結合する本明細書に記載した抗メソテリンＴＦＰ－Ｔ細胞の有効量を、別の治療の有効量と組み合わせて投与することを含む。
併用療法
本明細書に記載したＴＦＰ－発現細胞は、他の公知の作用物質及び治療と組み合わせて使用し得る。本明細書で使用する「組み合わせて」投与したとは、当該対象に対して、２つ（または、それ以上）の異なる治療が、障害を負った当該対象の苦痛の過程において送達されること、例えば、当該２つ以上の処置が、当該対象が当該障害と診断された後、当該障害が治癒または除去される前、または、処置が他の理由のために中止される前に送達されることを意味する。幾つかの実施形態では、投与に関して重複があるように、１つの処置の送達は、第２の送達の開始時に依然として行われている。このことは、本明細書では「同時」または「同時送達」と称することがある。その他の実施形態では、一方の処置の送達は、他方の処置の送達の開始前に終了する。いずれかの場合の幾つかの実施形態では、当該処置は、併用投与が故に、より効果的である。例えば、当該第１の処置が無いままに、当該第２の処置を施す場合、または、類似の状況が当該第１の治療で認められる場合よりも、当該第２の処置は、例えば、当該第２の処置で少なくとも同等の効果が認められ、または、当該第２の治療が症状を大幅に減少するなど、より効果的である。幾つかの実施形態では、送達は、症状、または、障害に関連するその他のパラメーターの減少が、他方の非存在下で送達される１つの処置で認められるものよりも大きくなるようにする。当該２つの処置の効果は、一部相加的、完全相加的、または、相加的を超えることがある。当該送達は、送達された第１の処置の効果が、第２の処置が送達される際に、依然として検出可能とすることができる。
幾つかの実施形態では、「少なくとも１つの追加の治療薬」は、ＴＦＰ発現細胞を含む。また、同じもしくは異なる標的抗原、または同じ標的抗原にある同じもしくは異なるエピトープに結合する複数のＴＦＰを発現するＴ細胞を提供する。また、Ｔ細胞の第１のサブセットが第１のＴＦＰを発現し、かつ、Ｔ細胞の第２のサブセットが第２のＴＦＰを発現するＴ細胞の集団を提供する。
本明細書に記載したＴＦＰ発現細胞、及び、少なくとも１つの追加の治療薬は、同時に、同じもしくは別々の組成物で、または、連続的に投与することができる。連続投与については、本明細書に記載したＴＦＰ発現細胞を最初に投与し、次いで、当該追加の作用物質を投与することができ、あるいは、当該投与の順序を逆にすることもできる。
さらなる態様では、本明細書に記載したＴＦＰ発現細胞は、手術、化学療法、放射線、免疫抑制剤、例えば、シクロスポリン、アザチオプリン、メトトレキサート、ミコフェノール酸、及び、ＦＫ５０６、抗体、または、その他の免疫消失薬、例えば、アレムツズマブ、抗ＣＤ３抗体、または、その他の抗体療法、サイトキシン、フルダラビン、シクロスポリン、ＦＫ５０６、ラパマイシン、ミコフェノール酸、ステロイド、ＦＲ９０１２２８、サイトカイン類、及び、放射線照射と組み合わせて治療計画に使用し得る。また、本明細書に記載したＴＦＰ発現細胞は、ペプチドワクチン、例えば、Ｉｚｕｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．２００８ Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ １０８：９６３－９７１に記載のものと組み合わせて使用し得る。さらなる態様では、本明細書に記載したＴＦＰ発現細胞は、骨髄細胞分化のプロモーター（例えば、オールトランスレチノイン酸）、骨髄由来サプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）増殖の阻害剤（例えば、ｃ－キット受容体の阻害剤、または、ＶＥＧＦ阻害剤）、ＭＤＳＣ機能の阻害剤（例えば、ＣＯＸ２阻害剤、または、ホスホジエステラーゼ－５阻害剤）、または、ＭＤＳＣの治療的除去（例えば、ドキソルビシン及びシクロホスファミドを用いた処置などの化学療法レジメンを使用するもの）とも組み合わせて使用し得る。ＭＤＳＣの増殖を予防し得るその他の治療薬として、アミノ－ビホスホネート、ビホスファナート、シルデナフィル、及び、タダラフィル、ニトロアスピリン、ビタミンＤ３、及び、ゲムシタビンがある（例えば、Ｇａｂｒｉｌｏｖｉｃｈ ａｎｄ Ｎａｇａｒａｊ、Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ、（２００９）ｖ９（３）：１６２－１７４）を参照されたい）。
ある実施形態では、当該対象に、ＴＦＰ発現細胞の投与に伴う副作用を減少または改善する作用物質を投与することができる。ＴＦＰ発現細胞の投与に伴う副作用として、サイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）、及び、マクロファージ活性化症候群（ＭＡＳ）、別名、血球貪食性リンパ組織球症（ＨＬＨ）があるが、これらに限定されない。ＣＲＳの症状として、高熱、吐き気、一過性低血圧、低酸素症などがある。したがって、本明細書に記載した方法は、本明細書に記載したＴＦＰ発現細胞を対象に投与し、そして、さらにＴＦＰ発現細胞での処置に起因する可溶性因子レベルの上昇を管理する作用物質を投与することを含むことができる。ある実施形態では、当該対象内で上昇する可溶性因子は、ＩＦＮ－γ、ＴＮＦα、ＩＬ－２、ＩＬ－６、及び、ＩＬ－８の１つ以上である。したがって、この副作用を処置するために投与する作用物質は、これらの可溶性因子の１つ以上を中和する作用物質とすることができる。かかる作用物質として、ステロイド、ＴＮＦαの阻害剤、及び、ＩＬ－６の阻害剤があるが、これらに限定されない。ＴＮＦα阻害剤の例は、エンタネルセプトである。ＩＬ－６阻害剤の例は、トシリズマブ（ｔｏｃ）である。
ある実施形態では、当該対象に、ＴＦＰ発現細胞の活性を高める作用物質を投与することができる。例えば、ある実施形態では、当該作用物質は、抑制分子を阻害する作用物質とすることができる。抑制分子、例えば、プログラム死１（ＰＤ１）は、幾つかの実施形態では、ＴＦＰ発現細胞の免疫エフェクター応答の開始能力を弱めることができる。抑制分子の例として、ＰＤ１、ＰＤ－Ｌ１、ＣＴＬＡ４、ＴＩＭ３、ＬＡＧ３、ＶＩＳＴＡ、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４、及び、ＴＧＦＲベータがある。抑制分子の、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、または、タンパク質レベルでの阻害による阻害は、ＴＦＰ発現細胞の性能を最適化することができる。実施形態では、抑制性核酸、例えば、抑制性核酸、例えば、ｄｓＲＮＡ、例えば、ｓｉＲＮＡ、または、ｓｈＲＮＡは、当該ＴＦＰ発現細胞において、抑制分子の発現を阻害するために使用することができる。ある実施形態では、当該阻害剤は、ｓｈＲＮＡである。ある実施形態では、当該抑制分子は、ＴＦＰ発現細胞内で阻害される。これらの実施形態では、当該抑制分子の発現を阻害するｄｓＲＮＡ分子を、当該ＴＦＰの成分、例えば、すべての成分をコードする核酸に結合する。ある実施形態では、抑制シグナルの阻害剤は、例えば、抑制分子に結合する抗体または抗体断片とすることができる。例えば、当該作用物質を、ＰＤ１、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２、または、ＣＴＬＡ４（例えば、イピリムマブ（別名、ＭＤＸ－０１０、及び、ＭＤＸ－１０１、Ｙｅｒｖｏｙ（商標）として市販されている、Ｂｒｉｓｔｏｌ－Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ、トレメリムマブ（Ｐｆｉｚｅｒから入手可能なＩｇＧ２モノクローナル抗体、チシリムマブとして公知であった、ＣＰ－６７５，２０６））に結合する抗体また抗体断片とすることができる。ある実施形態では、当該作用物質は、ＴＩＭ３に結合する抗体または抗体断片である。ある実施形態では、当該作用物質は、ＬＡＧ３に結合する抗体または抗体断片である。
幾つかの実施形態では、当該Ｔ細胞は、レンチウイルス、例えば、ＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞を特異的に標的とするレンチウイルスを介して、インビボで（例えば、遺伝子導入で）改変し得る。（例えば、Ｚｈｏｕ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（２０１５）１９５：２４９３－２５０１を参照されたい）。
幾つかの実施形態では、ＴＦＰ発現細胞の活性を高める作用物質を、例えば、第１のドメイン及び第２のドメインを含む融合タンパク質とすることができ、当該第１のドメインは、抑制分子またはその断片であり、かつ、当該第２のドメインは、ポジティブシグナルに関連するポリペプチド、例えば、本明細書に記載した細胞内シグナル伝達ドメインを含むポリペプチドである。幾つかの実施形態では、ポジティブシグナルに関連している当該ポリペプチドは、ＣＤ２８、ＣＤ２７、ＩＣＯＳの共刺激ドメイン、例えば、ＣＤ２８、ＣＤ２７、及び／または、ＩＣＯＳの細胞内シグナル伝達ドメイン、及び／または、一次シグナル伝達ドメイン、例えば、ＣＤ３ゼータ、例えば、本明細書に記載したものを含むことができる。ある実施形態では、当該融合タンパク質は、当該ＴＦＰを発現するのと同じ細胞で発現される。別の実施形態では、当該融合タンパク質は、細胞、例えば、抗メソテリンＴＦＰを発現しないＴ細胞によって発現される。
幾つかの実施形態では、当該核酸がコードする抗メソテリン結合ドメインである抗原結合ドメイン、または、抗メソテリン結合ドメインを含む抗体、または、当該核酸がコードする抗メソテリン結合ドメインを発現する細胞を含む、ヒトまたはヒト化抗体ドメインは、最大で、約２００ｎＭ、１００ｎＭ、７５ｎＭ、５０ｎＭ、２５ｎＭ、２０ｎＭ、１５ｎＭ、１４ｎＭ、１３ｎＭ、１２ｎＭ、１１ｎＭ、１０ｎＭ、９ｎＭ、８ｎＭ、７ｎＭ、６ｎＭ、５ｎＭ、４ｎＭ、３ｎＭ、２ｎＭ、１ｎＭ、０．９ｎＭ、０．８ｎＭ、０．７ｎＭ、０．６ｎＭ、０．５ｎＭ、０．４ｎＭ、０．３ｎＭ、０．２ｎＭ、０．１ｎＭ、０．０９ｎＭ、０．０８ｎＭ、０．０７ｎＭ、０．０６ｎＭ、０．０５ｎＭ、０．０４ｎＭ、０．０３ｎＭ、０．０２ｎＭ、または、０．０１ｎＭ、及び／または、少なくとも約１００ｎＭ、７５ｎＭ、５０ｎＭ、２５ｎＭ、２０ｎＭ、１５ｎＭ、１４ｎＭ、１３ｎＭ、１２ｎＭ、１１ｎＭ、１０ｎＭ、９ｎＭ、８ｎＭ、７ｎＭ、６ｎＭ、５ｎＭ、４ｎＭ、３ｎＭ、２ｎＭ、１ｎＭ、０．９ｎＭ、０．８ｎＭ、０．７ｎＭ、０．６ｎＭ、０．５ｎＭ、０．４ｎＭ、０．３ｎＭ、０．２ｎＭ、０．１ｎＭ、０．０９ｎＭ、０．０８ｎＭ、０．０７ｎＭ、０．０６ｎＭ、０．０５ｎＭ、０．０４ｎＭ、０．０３ｎＭ、０．０２ｎＭ、または、０．０１ｎＭ、及び／または、約２００ｎＭ、１００ｎＭ、７５ｎＭ、５０ｎＭ、２５ｎＭ、２０ｎＭ、１５ｎＭ、１４ｎＭ、１３ｎＭ、１２ｎＭ、１１ｎＭ、１０ｎＭ、９ｎＭ、８ｎＭ、７ｎＭ、６ｎＭ、５ｎＭ、４ｎＭ、３ｎＭ、２ｎＭ、１ｎＭ、０．９ｎＭ、０．８ｎＭ、０．７ｎＭ、０．６ｎＭ、０．５ｎＭ、０．４ｎＭ、０．３ｎＭ、０．２ｎＭ、０．１ｎＭ、０．０９ｎＭ、０．０８ｎＭ、０．０７ｎＭ、０．０６ｎＭ、０．０５ｎＭ、０．０４ｎＭ、０．０３ｎＭ、０．０２ｎＭ、または、０．０１ｎＭの親和性値を有する。
医薬組成物
本発明の医薬組成物は、ＴＦＰ発現細胞、例えば、本明細書に記載した複数のＴＦＰ発現細胞を、医薬的または生理学的に許容される担体、希釈剤、または、賦形剤の１つ以上と組み合わせて含み得る。かかる組成物は、緩衝液、例えば、中性緩衝生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水など、炭水化物、例えば、グルコース、マンノース、スクロース、または、デキストラン、マンニトール、タンパク質、ポリペプチド、または、アミノ酸、例えば、グリシン、酸化防止剤、キレート剤、例えば、ＥＤＴＡ、または、グルタチオン、アジュバント（例えば、水酸化アルミニウム）、及び、保存料を含み得る。本発明の組成物を、ある態様では、静脈内投与のために製剤する。
本発明の医薬組成物は、処置（または、予防）する疾患に適切な方法で投与し得る。投与の量及び頻度は、当該患者の病態、及び、当該患者の疾患のタイプ及び重症度などの要因によって決定するが、適切な用量は、臨床試験で決定し得る。
ある実施形態では、当該医薬組成物は、例えば、エンドトキシン、マイコプラズマ、複製可能なレンチウイルス（ＲＣＬ）、ｐ２４、ＶＳＶ－Ｇ核酸、ＨＩＶ ｇａｇ、残存抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８被覆ビーズ、マウス抗体、保存ヒト血清、ウシ血清アルブミン、ウシ血清、培地成分、ベクターパッケージング細胞、または、プラスミド成分、細菌、及び、真菌からなる群から選択した混入物質を実質的に含んでおらず、例えば、当該混入物質が検出レベルで存在しない。ある実施形態では、当該細菌は、Ａｌｃａｌｉｇｅｎｅｓ ｆａｅｃａｌｉｓ、Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ ｉｎｆｌｕｅｎｚａ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｅｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａ、及び、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ａ群からなる群から選択される少なくとも１つである。
「免疫学的有効量」、「抗腫瘍有効量」「腫瘍阻害有効量」、または、「治療量」が示される場合、投与する本発明の組成物の正確な量は、当該患者（対象）の年齢、体重、腫瘍の大きさ、感染または転移の程度、及び、病態の個体差を考慮して、医師が決定することができる。本明細書に記載したＴ細胞を含む医薬組成物は、１０４～１０９細胞／体重ｋｇ、幾つかの例では、１０５～１０６細胞／体重ｋｇで、これらの範囲内のすべての整数値を含めた用量で投与できる、ということが一般的には言える。また、Ｔ細胞組成物は、これらの用量において複数回投与し得る。当該細胞は、免疫療法で広く知られている注入技術を用いて、投与することができる（例えば、Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎｅｗ Ｅｎｇ．Ｊ．ｏｆ Ｍｅｄ．３１９：１６７６，１９８８を参照されたい）。
特定の態様では、望ましくは、活性化Ｔ細胞を対象に投与し、そして、次いで、再採血を行い（または、アフェレーシスを行い）、そこから本発明にしたがってＴ細胞を活性化し、及び、これらの活性化、及び、増殖したＴ細胞を当該患者に再注入し得る。このプロセスは、数週間ごとに複数回行うことができる。特定の態様では、Ｔ細胞は、１０ｃｃ～４００ｃｃの採血から活性化することができる。特定の態様では、Ｔ細胞は、２０ｃｃ、３０ｃｃ、４０ｃｃ、５０ｃｃ、６０ｃｃ、７０ｃｃ、８０ｃｃ、９０ｃｃ、または、１００ｃｃの採血から活性化される。
目的の組成物の投与は、エアロゾル吸入、注射、経口摂取、輸液、注入、または、移植を含むあらゆる好都合な方法で行い得る。本明細書に記載した組成物は、患者に対して、経動脈的に、皮下に、皮内に、腫瘍内に、節内に、髄内に、筋肉内に、静脈内（ｉ．ｖ．）に注射し、または、腹腔内に投与し得る。ある態様では、本発明のＴ細胞組成物は、患者に対して、皮内または皮下注射で投与する。ある態様では、本発明のＴ細胞組成物は、ｉ．ｖ．注射で投与する。当該Ｔ細胞組成物は、腫瘍、リンパ節、または、感染部位に直接に注入し得る。
特定の例示的な態様では、対象は、白血球を採取し、エキソビボで濃縮または枯渇させて目的の細胞、例えば、Ｔ細胞を選択、及び／または、単離する白血球除去療法を受け得る。これらのＴ細胞分離株は、当該技術分野で公知の方法で増殖され、そして、１つ以上の本発明のＴＦＰ構築物が導入し得るように処理され、それによって、本発明のＴＦＰ発現Ｔ細胞を生成し得る。それを必要とする対象は、その後に、標準的な大量化学療法での治療に続いて、末梢血幹細胞移植を受け得る。特定の態様では、当該移植の後、または、それと同時に、対象は、本発明の増殖したＴＦＰ Ｔ細胞の注入を受ける。さらなる態様では、増殖した細胞を、手術の前または後に投与する。
患者に投与する上記処置での用量は、処置を受ける病態の正確な性質、及び、処置のレシピエントによって変わる。ヒトへの投与に対する用量のスケーリングは、当該技術分野で公知の慣行にしたがって行うことができる。例えば、アレムツズマブの投与量は、一般的には、成人患者に対して、１～約１００ｍｇの範囲であり、通常は、１～３０日間、毎日、投与する。好ましい１日用量は、１～１０ｍｇ／日であるが、幾つかの例では、（米国特許第６，１２０，７６６号に記載された）さらに大量の４０ｍｇ／日までを使用し得る。
ある実施形態では、当該ＴＦＰを、例えば、インビトロ転写を用いてＴ細胞内に導入し、当該対象（例えば、ヒト）は、本発明のＴＦＰ Ｔ細胞の最初の投与、及び、それに続く１回以上の本発明のＴＦＰ Ｔ細胞の投与を受けるが、当該それに続く１回以上の投与は、先の投与の後、１５日未満で、例えば、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、または、２日で実施される。ある実施形態では、本発明のＴＦＰ Ｔ細胞の複数回の投与が、当該対象（例えば、ヒト）に対して１週間ごとに施され、例えば、本発明のＴＦＰ－Ｔ細胞の２、３、または、４回の投与が、１週間ごとに施される。ある実施形態では、当該対象（例えば、ヒト対象）は、１週間ごとに複数回のＴＦＰ Ｔ細胞の投与（例えば、１週間ごとに２、３、または、４回の投与）（本明細書ではサイクルとも称する）を受け、続いて、１週間は、ＴＦＰ Ｔ細胞の投与をせず、その後に、１回以上のさらなるＴＦＰ Ｔ細胞の投与（例えば、１週間ごとに複数回の当該ＴＦＰ Ｔ細胞の投与）が当該対象に施される。別の実施形態では、当該対象（例えば、ヒト対象）は、複数サイクルのＴＦＰ Ｔ細胞を受け、そして、各サイクルの間隔は、１０、９、８、７、６、５、４、または、３日未満である。ある実施形態では、当該ＴＦＰ Ｔ細胞は、１週間ごとに３回の投与のために、１日おきに投与される。ある実施形態では、本発明のＴＦＰ Ｔ細胞を、少なくとも２、３、４、５、６、７、８週間、または、それ以上投与する。
ある態様では、メソテリンＴＦＰ Ｔ細胞を、レンチウイルスなどのレンチウイルス性ウイルスベクターを用いて生成する。その方法で生成するＴＦＰ－Ｔ細胞は、安定的にＴＦＰを発現する。
ある態様では、ＴＦＰ Ｔ細胞は、形質導入後、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５日間、ＴＦＰベクターを一過性に発現する。ＴＦＰの一過性の発現は、ＲＮＡ ＴＦＰベクターの送達によってもたらすことができる。ある態様では、当該ＴＦＰ ＲＮＡを、エレクトロポレーションによってＴ細胞に形質導入する。
一過性に発現するＴＦＰ Ｔ細胞（特に、マウスｓｃＦｖ担持ＴＦＰ Ｔ細胞）を用いて処置する患者に生じ得る潜在的な問題は、複合的処置後のアナフィラキシーである。
この理論に拘束されるものではないが、かかるアナフィラキシー反応は、体液性抗ＴＦＰ反応を発症している患者、すなわち、抗ＩｇＥアイソタイプを有する抗ＴＦＰ抗体によって引き起こされる可能性があると考えられる。患者の抗体産生細胞は、抗原への曝露が１０～１４日間中断された場合に、ＩｇＧアイソタイプ（このものはアナフィラキシーを引き起こさない）からＩｇＥアイソタイプへのクラススイッチを受けていると思われる。
患者が一過性ＴＦＰ処置（ＲＮＡ形質導入によって生成されるものなど）の過程で抗ＴＦＰ抗体反応を生成する危険性が高い場合、ＴＦＰ Ｔ細胞注入の中断は、１０～１４日より長く続けるべきではない。
本発明を、以下の実験実施例を参照して、さらに詳細に説明する。これらの実施例は、例示の目的でのみ提供し、特に明記しない限りは、限定することを意図していない。したがって、本発明は、以下の実施例には一切限定されないものと解釈されるものとし、本明細書で提供する教示の結果として明らかになる、ありとあらゆる変形を包含すると解釈されるものとする。さらに説明することなく、当業者には、上記した説明及び以下の例示的な実施例を用いて、本発明の化合物を製造及び利用すること、ならびに、特許請求の範囲に記載の方法を実施することが可能であると考えられる。以下の実施例は、本発明の様々な態様を具体的に挙げるが、これらは、本開示の残余の部分を限定する、とは一切解釈されない。
実施例１：ＴＦＰ構築物
抗メソテリンＴＦＰ構築物を、短いリンカー（ＳＬ）：ＡＡＡＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＬＥ（配列番号２）、または、長いリンカー（ＬＬ）：ＡＡＡＩＥＶＭＹＰＰＰＹＬＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＬＥ（配列番号３）をコードするＤＮＡ配列のいずれかで、ＣＤ３またはＴＣＲ ＤＮＡ断片に連結した抗メソテリン ｓｃＦｖ ＤＮＡ断片を、ＸｂａＩ及びＥｃｏＲ１部位でｐ５１０ベクター（（Ｓｙｓｔｅｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（ＳＢＩ））にクローニングして、操作する。
生成した抗メソテリンＴＦＰ構築物は、ｐ５１０＿抗メソテリン＿ＬＬ＿ＴＣＲα（抗メソテリンｓｃＦｖ－長いリンカー－ヒト完全長Ｔ細胞受容体α鎖）、ｐ５１０＿抗メソテリン＿ＬＬ＿ＴＣＲαＣ（抗メソテリンｓｃＦｖ－長いリンカー－ヒトＴ細胞受容体α定常ドメイン鎖）、ｐ５１０＿抗メソテリン＿ＬＬ＿ＴＣＲβ（抗メソテリンｓｃＦｖ－長いリンカー－ヒト完全長Ｔ細胞受容体β鎖）、ｐ５１０＿抗メソテリン＿ＬＬ＿ＴＣＲβＣ（抗メソテリンｓｃＦｖ－長いリンカー－ヒトＴ細胞受容体β定常ドメイン鎖）、ｐ５１０＿抗メソテリン＿ＬＬ＿ＣＤ３γ（抗メソテリンｓｃＦｖ－長いリンカー－ヒトＣＤ３γ鎖）、ｐ５１０＿抗メソテリン＿ＬＬ＿ＣＤ３δ（抗メソテリンｓｃＦｖ－長いリンカー－ヒトＣＤ３δ鎖）、ｐ５１０＿抗メソテリン＿ＬＬ＿ＣＤ３ε（抗メソテリンｓｃＦｖ－長いリンカー－ヒトＣＤ３ε鎖）、ｐ５１０＿抗メソテリン＿ＳＬ＿ＴＣＲβ（抗メソテリンｓｃＦｖ－短いリンカー－ヒト完全長Ｔ細胞受容体β鎖）、ｐ５１０＿抗メソテリン＿ＳＬ＿ＣＤ３γ（抗メソテリンｓｃＦｖ－短いリンカー－ヒトＣＤ３γ鎖）、ｐ５１０＿抗メソテリン＿ＳＬ＿ＣＤ３δ（抗メソテリンｓｃＦｖ－短いリンカー－ヒトＣＤ３δ鎖）、ｐ５１０＿抗メソテリン＿ＳＬ＿ＣＤ３ε（抗メソテリンｓｃＦｖ－短いリンカー－ヒトＣＤ３ε鎖）である。
抗メソテリンＣＡＲ構築物であるｐ５１０＿抗メソテリン＿２８ζは、抗メソテリン、部分的なＣＤ２８の細胞外ドメイン、ＣＤ２８の膜貫通ドメイン、ＣＤ２８の細胞内ドメイン、及び、ＣＤ３ゼータをコードする合成ＤＮＡを、ＸｂａＩ及びＥｃｏＲ１部位で、ｐ５１０ベクターにクローニングすることで生成する。
実施例２：抗体配列
抗体配列の生成
ヒトメソテリンポリペプチドの標準的な配列は、Ｕｎｉｐｒｏｔ受託番号Ｑ１３４２１（または、Ｑ１３４２１－１）である。ヒトメソテリンポリペプチド、及び、その断片またはドメインに特異的に結合することができる抗体ポリペプチドを提供する。抗メソテリン抗体を、様々な技術を用いて生成することができる（例えば、（Ｎｉｃｈｏｌｓｏｎ ｅｔ ａｌ，１９９７）を参照されたい）。マウス抗メソテリン抗体を出発物質として使用する場合、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）融合タンパク質（ＴＦＰ）処置、すなわち、このＴＦＰ．メソテリン構築物で形質導入したＴ細胞で処置を受ける対象では、これらマウス特異的残基が、ヒト－抗マウス抗原（ＨＡＭＡ）応答を誘導し得るマウス抗メソテリン抗体のヒト化が臨床環境では望まれる。ヒト化は、マウス抗メソテリン抗体由来のＣＤＲ領域を、適切なヒト生殖細胞系列のアクセプターフレームワークに移植すること、任意にＣＤＲ、及び／または、フレームワーク領域に対する他の修飾によって達成される。本明細書で提供した、抗体及び抗体断片残基の番号付けは、Ｋａｂａｔに従う（Ｋａｂａｔ Ｅ．Ａ． ｅｔ ａｌ，１９９１；Ｃｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ，１９８７）。
ｓｃＦｖの生成
ヒトまたはヒト化抗メソテリンＩｇＧを用いてＴＦＰ構築物のためのｓｃＦｖ配列を生成する。ヒトまたはヒト化ＶＬ及びＶＨドメインをコードするＤＮＡ配列を取得し、これら構築物のコドンを、任意に、ヒト由来の細胞での発現に最適化する。当該ｓｃＦｖに現れるＶＬ及びＶＨドメインの順序は様々であり（すなわち、ＶＬ－ＶＨ、または、ＶＨ－ＶＬ配向）、及び、「Ｇ４Ｓ」または「Ｇ４Ｓ」サブユニットの３つのコピー（Ｇ４Ｓ）３が、これら可変ドメインを連結して、ｓｃＦｖドメインを生成する。抗メソテリンｓｃＦｖプラスミド構築物は、任意のＦｌａｇ、Ｈｉｓ、または、その他のアフィニティタグを有することができ、ＨＥＫ２９３またはその他の適切なヒトまたは哺乳動物の細胞株にエレクトロポレートして、そして、精製する。検証アッセイとして、ＦＡＣＳによる結合分析、Ｐｒｏｔｅｏｎを用いる動態解析、及び、メソテリン発現細胞の染色がある。
例示的な抗メソテリンＶＬ及びＶＨドメイン、ＣＤＲ、及び、それらをコードするヌクレオチド配列は、米国特許第９，２７２，００２号、同第８，２０６，７１０号、同第９，０２３，３５１号、同第７，０８１，５１８号、同第８，９１１，７３２号、同第９，１１５，１９７号、及び、同第９，４１６，１９０号、及び、米国特許公開第２００９００４７２１１号、に記載のものとすることができる。その他の例示的な抗メソテリンＶＬ及びＶＨドメイン、ＣＤＲ、及び、それらをそれぞれコードするヌクレオチド配列を、それぞれ、以下のモノクローナル抗体、ラット抗メソテリン抗体４２０４１１、ラット抗メソテリン抗体４２０４０４、マウス抗メソテリン抗体ＭＮ－１、マウス抗メソテリン抗体ＭＢ－Ｇ１０、マウス抗メソテリン抗体ＡＢＩＮ２３３７５３、ウサギ抗メソテリン抗体ＦＱＳ３７９６（３）、ウサギ抗メソテリン抗体ＴＱ８５、マウス抗メソテリン抗体ＴＡ３０７７９９、ラット抗メソテリン抗体２９５Ｄ、ラット抗メソテリン抗体Ｂ３５、マウス抗メソテリン抗体５Ｇ１５７、マウス抗メソテリン抗体１２９５８８、ウサギ抗メソテリン抗体１１Ｃ１８７、マウス抗メソテリン抗体５Ｂ２、ウサギ抗メソテリン抗体ＳＰ７４、ウサギ抗メソテリン抗体Ｄ４Ｘ７Ｍ、マウス抗メソテリン抗体Ｃ－２、マウス抗メソテリン抗体Ｃ－３、マウス抗メソテリン抗体Ｇ－１、マウス抗メソテリン抗体Ｇ－４、マウス抗メソテリン抗体Ｋ１、マウス抗メソテリン抗体Ｂ－３、マウス抗メソテリン抗体２００－３０１－Ａ８７、マウス抗メソテリン抗体２００－３０１－Ａ８８、ウサギ抗メソテリン抗体ＥＰＲ２６８５（２）、ウサギ抗メソテリン抗体ＥＰＲ４５０９、または、ウサギ抗メソテリン抗体ＰＰＩ－２ｅ（ＩＨＣ）とすることができる。
幾つかの実施形態では、配列番号５８、５９、及び、５５（それぞれ、ＳＤ１、ＳＤ４、及び、ＳＤ６）に記載されたものなど、単一ドメイン（ＶＨＨ）バインダーを使用する。
ＴＣＲサブユニットの供給源
ヒトＴ細胞受容体（ＴＣＲ）複合体のサブユニットは、すべて、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び、細胞内ドメインを含む。ヒトＴＣＲ複合体は、ＣＤ３イプシロンポリペプチド、ＣＤ３ガンマポリペプチド、ＣＤ３デルタポリペプチド、ＣＤ３ゼータポリペプチド、ＴＣＲアルファ鎖ポリペプチド、及び、ＴＣＲベータ鎖ポリペプチドを含む。ヒトＣＤ３イプシロンポリペプチドの標準的な配列は、Ｕｎｉｐｒｏｔ受託番号Ｐ０７７６６である。ヒトＣＤ３ガンマポリペプチドの標準的な配列は、Ｕｎｉｐｒｏｔ受託番号Ｐ０９６９３である。ヒトＣＤ３デルタポリペプチドの標準的な配列は、Ｕｎｉｐｒｏｔ受託番号Ｐ０４３２３４である。ヒトＣＤ３ゼータポリペプチドの標準的な配列は、Ｕｎｉｐｒｏｔ受託番号Ｐ２０９６３である。ヒトＴＣＲアルファ鎖の標準的な配列は、Ｕｎｉｐｒｏｔ受託番号Ｑ６ＩＳＵ１である。ヒトＴＣＲベータ鎖Ｃ領域の標準的な配列は、Ｕｎｉｐｒｏｔ受託番号Ｐ０１８５０であり、ヒトＴＣＲベータ鎖Ｖ領域の配列は、Ｐ０４４３５である。
ヒトＣＤ３イプシロンポリペプチドの標準的な配列は、
ＭＱＳＧＴＨＷＲＶＬＧＬＣＬＬＳＶＧＶＷＧＱＤＧＮＥＥＭＧＧＩＴＱＴＰＹＫＶＳＩＳＧＴＴＶＩＬＴＣＰＱＹＰＧＳＥＩＬＷＱＨＮＤＫＮＩＧＧＤＥＤＤＫＮＩＧＳＤＥＤＨＬＳＬＫＥＦＳＥＬＥＱＳＧＹＹＶＣＹＰＲＧＳＫＰＥＤＡＮＦＹＬＹＬＲＡＲＶＣＥＮＣＭＥＭＤＶＭＳＶＡＴＩＶＩＶＤＩＣＩＴＧＧＬＬＬＬＶＹＹＷＳＫＮＲＫＡＫＡＫＰＶＴＲＧＡＧＡＧＧＲＱＲＧＱＮＫＥＲＰＰＰＶＰＮＰＤＹＥＰＩＲＫＧＱＲＤＬＹＳＧＬＮＱＲＲＩ（配列番号４）である。
ヒトＣＤ３ガンマポリペプチドの標準的な配列は、
ＭＥＱＧＫＧＬＡＶＬＩＬＡＩＩＬＬＱＧＴＬＡＱＳＩＫＧＮＨＬＶＫＶＹＤＹＱＥＤＧＳＶＬＬＴＣＤＡＥＡＫＮＩＴＷＦＫＤＧＫＭＩＧＦＬＴＥＤＫＫＫＷＮＬＧＳＮＡＫＤＰＲＧＭＹＱＣＫＧＳＱＮＫＳＫＰＬＱＶＹＹＲＭＣＱＮＣＩＥＬＮＡＡＴＩＳＧＦＬＦＡＥＩＶＳＩＦＶＬＡＶＧＶＹＦＩＡＧＱＤＧＶＲＱＳＲＡＳＤＫＱＴＬＬＰＮＤＱＬＹＱＰＬＫＤＲＥＤＤＱＹＳＨＬＱＧＮＱＬＲＲＮ（配列番号５）である。
ヒトＣＤ３デルタポリペプチドの標準的な配列は、
ＭＥＨＳＴＦＬＳＧＬＶＬＡＴＬＬＳＱＶＳＰＦＫＩＰＩＥＥＬＥＤＲＶＦＶＮＣＮＴＳＩＴＷＶＥＧＴＶＧＴＬＬＳＤＩＴＲＬＤＬＧＫＲＩＬＤＰＲＧＩＹＲＣＮＧＴＤＩＹＫＤＫＥＳＴＶＱＶＨＹＲＭＣＱＳＣＶＥＬＤＰＡＴＶＡＧＩＩＶＴＤＶＩＡＴＬＬＬＡＬＧＶＦＣＦＡＧＨＥＴＧＲＬＳＧＡＡＤＴＱＡＬＬＲＮＤＱＶＹＱＰＬＲＤＲＤＤＡＱＹＳＨＬＧＧＮＷＡＲＮＫＳ（配列番号６）である。
ヒトＣＤ３ゼータポリペプチドの標準的な配列は、
ＭＫＷＫＡＬＦＴＡＡＩＬＱＡＱＬＰＩＴＥＡＱＳＦＧＬＬＤＰＫＬＣＹＬＬＤＧＩＬＦＩＹＧＶＩＬＴＡＬＦＬＲＶＫＦＳＲＳＡＤＡＰＡＹＱＱＧＱＮＱＬＹＮＥＬＮＬＧＲＲＥＥＹＤＶＬＤＫＲＲＧＲＤＰＥＭＧＧＫＰＱＲＲＫＮＰＱＥＧＬＹＮＥＬＱＫＤＫＭＡＥＡＹＳＥＩＧＭＫＧＥＲＲＲＧＫＧＨＤＧＬＹＱＧＬＳＴＡＴＫＤＴＹＤＡＬＨＭＱＡＬＰＰＲ（配列番号７）である。
ヒトＴＣＲアルファ鎖の標準的な配列は、
ＭＡＧＴＷＬＬＬＬＬＡＬＧＣＰＡＬＰＴＧＶＧＧＴＰＦＰＳＬＡＰＰＩＭＬＬＶＤＧＫＱＱＭＶＶＶＣＬＶＬＤＶＡＰＰＧＬＤＳＰＩＷＦＳＡＧＮＧＳＡＬＤＡＦＴＹＧＰＳＰＡＴＤＧＴＷＴＮＬＡＨＬＳＬＰＳＥＥＬＡＳＷＥＰＬＶＣＨＴＧＰＧＡＥＧＨＳＲＳＴＱＰＭＨＬＳＧＥＡＳＴＡＲＴＣＰＱＥＰＬＲＧＴＰＧＧＡＬＷＬＧＶＬＲＬＬＬＦＫＬＬＬＦＤＬＬＬＴＣＳＣＬＣＤＰＡＧＰＬＰＳＰＡＴＴＴＲＬＲＡＬＧＳＨＲＬＨＰＡＴＥＴＧＧＲＥＡＴＳＳＰＲＰＱＰＲＤＲＲＷＧＤＴＰＰＧＲＫＰＧＳＰＶＷＧＥＧＳＹＬＳＳＹＰＴＣＰＡＱＡＷＣＳＲＳＡＬＲＡＰＳＳＳＬＧＡＦＦＡＧＤＬＰＰＰＬＱＡＧＡＡ（配列番号８）である。
ヒトＴＣＲα鎖Ｃ領域の標準的な配列は、
ＰＮＩＱＮＰＤＰＡＶＹＱＬＲＤＳＫＳＳＤＫＳＶＣＬＦＴＤＦＤＳＱＴＮＶＳＱＳＫＤＳＤＶＹＩＴＤＫＴＶＬＤＭＲＳＭＤＦＫＳＮＳＡＶＡＷＳＮＫＳＤＦＡＣＡＮＡＦＮＮＳＩＩＰＥＤＴＦＦＰＳＰＥＳＳＣＤＶＫＬＶＥＫＳＦＥＴＤＴＮＬＮＦＱＮＬＳＶＩＧＦＲＩＬＬＬＫＶＡＧＦＮＬＬＭＴＬＲＬＷＳＳ（配列番号９）である。
ヒトＴＣＲα鎖Ｖ領域ＣＴＬ－Ｌ１７の標準的な配列は、
ＭＡＭＬＬＧＡＳＶＬＩＬＷＬＱＰＤＷＶＮＳＱＱＫＮＤＤＱＱＶＫＱＮＳＰＳＬＳＶＱＥＧＲＩＳＩＬＮＣＤＹＴＮＳＭＦＤＹＦＬＷＹＫＫＹＰＡＥＧＰＴＦＬＩＳＩＳＳＩＫＤＫＮＥＤＧＲＦＴＶＦＬＮＫＳＡＫＨＬＳＬＨＩＶＰＳＱＰＧＤＳＡＶＹＦＣＡＡＫＧＡＧＴＡＳＫＬＴＦＧＴＧＴＲＬＱＶＴＬ（配列番号１０）である。
ヒトＴＣＲベータ鎖Ｃ領域の標準的な配列は、
ＥＤＬＮＫＶＦＰＰＥＶＡＶＦＥＰＳＥＡＥＩＳＨＴＱＫＡＴＬＶＣＬＡＴＧＦＦＰＤＨＶＥＬＳＷＷＶＮＧＫＥＶＨＳＧＶＳＴＤＰＱＰＬＫＥＱＰＡＬＮＤＳＲＹＣＬＳＳＲＬＲＶＳＡＴＦＷＱＮＰＲＮＨＦＲＣＱＶＱＦＹＧＬＳＥＮＤＥＷＴＱＤＲＡＫＰＶＴＱＩＶＳＡＥＡＷＧＲＡＤＣＧＦＴＳＶＳＹＱＱＧＶＬＳＡＴＩＬＹＥＩＬＬＧＫＡＴＬＹＡＶＬＶＳＡＬＶＬＭＡＭＶＫＲＫＤＦ（配列番号１１）である。
ヒトＴＣＲベータ鎖Ｖ領域ＣＴＬ－Ｌ１７の標準的な配列は、
ＭＧＴＳＬＬＣＷＭＡＬＣＬＬＧＡＤＨＡＤＴＧＶＳＱＮＰＲＨＮＩＴＫＲＧＱＮＶＴＦＲＣＤＰＩＳＥＨＮＲＬＹＷＹＲＱＴＬＧＱＧＰＥＦＬＴＹＦＱＮＥＡＱＬＥＫＳＲＬＬＳＤＲＦＳＡＥＲＰＫＧＳＦＳＴＬＥＩＱＲＴＥＱＧＤＳＡＭＹＬＣＡＳＳＬＡＧＬＮＱＰＱＨＦＧＤＧＴＲＬＳＩＬ（配列番号１２）である。
ヒトＴＣＲベータ鎖Ｖ領域ＹＴ３５の標準的な配列は、
ＭＤＳＷＴＦＣＣＶＳＬＣＩＬＶＡＫＨＴＤＡＧＶＩＱＳＰＲＨＥＶＴＥＭＧＱＥＶＴＬＲＣＫＰＩＳＧＨＮＳＬＦＷＹＲＱＴＭＭＲＧＬＥＬＬＩＹＦＮＮＮＶＰＩＤＤＳＧＭＰＥＤＲＦＳＡＫＭＰＮＡＳＦＳＴＬＫＩＱＰＳＥＰＲＤＳＡＶＹＦＣＡＳＳＦＳＴＣＳＡＮＹＧＹＴＦＧＳＧＴＲＬＴＶＶ（配列番号１３）である。
ＴＣＲドメイン及びｓｃＦｖからのＴＦＰの生成
メソテリンｓｃＦｖを、リンカー配列、例えば、Ｇ４Ｓ、（Ｇ４Ｓ）２、（Ｇ４Ｓ）３、または、（Ｇ４Ｓ）４を用いて、ＣＤ３イプシロン、または、その他のＴＣＲサブユニット（１Ｃを参照されたい）に、組換え技術で連結する。様々なリンカー、及び、ｓｃＦｖの構造を利用する。ＴＦＰの生成のため、ＴＣＲアルファ鎖、及び、ＴＣＲベータ鎖を、完全長ポリペプチド、または、それらの定常ドメインのみのいずれかとして用いた。ＴＣＲアルファ及びＴＣＲベータ鎖のあらゆる可変配列が、ＴＦＰの作製を可能にする。
ＴＦＰ発現ベクター
提供するものは、プロモーター（サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）エンハンサー－プロモーター）、分泌を可能にするためのシグナル伝達配列、ポリアデニル化シグナル、及び、転写ターミネーター（ウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）遺伝子）、エピソーム複製、及び、原核生物における複製を可能にする要素（例えば、ＳＶ４０起点、及び、ＣｏｌＥ１、または、当該技術分野で公知のその他のもの）、及び、選択を可能にする要素（アンピシリン耐性遺伝子、及び、ゼオシンマーカー）を含む発現ベクターである。
好ましくは、ＴＦＰをコードする核酸構築物を、レンチウイルス発現ベクターにクローニングし、そして、発現を、メソテリン＋標的細胞に応答するＴＦＰ．メソテリン形質導入Ｔ細胞（「メソテリン．ＴＦＰ」または「メソテリン．ＴＦＰ Ｔ細胞」または「ＴＦＰ．メソテリン」または「ＴＦＰ．メソテリンＴ細胞」）のエフェクターＴ細胞応答の量と質に基づいて検証する。エフェクターＴ細胞応答として、細胞拡大、増殖、倍加、サイトカイン産生、及び、標的細胞溶解または細胞溶解活性（すなわち、脱顆粒）があるが、これらに限定されない。
ＴＦＰ．メソテリンレンチウイルス転移ベクターを、ＶＳＶ－Ｇ偽型レンチウイルス粒子にパッケージされるゲノム材料を産生するために用いる。レンチウイルス転移ベクターのＤＮＡを、ＶＳＶ－Ｇの３つのパッケージング成分、ｇａｇ／ｐｏｌ、及び、ｒｅｖをリポフェクタミン（登録商標）試薬と組み合わせて混合して、それらを、一緒に、ＨＥＫ－２９３細胞（胚腎臓、ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ－１５７３（商標））にトランスフェクトする。２４及び４８時間後に、培地を回収し、濾過し、超遠心分離で濃縮する。得られたウイルス調製物を、－８０Ｃで保存する。形質導入単位の数は、Ｓｕｐ－Ｔ１（Ｔ細胞リンパ芽球性リンパ腫、ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ－１９４２（商標））細胞での滴定で決定する。再指向性ＴＦＰ．メソテリンＴ細胞は、新たなナイーブＴ細胞を、例えば、抗ＣＤ３抗ＣＤ２８ビーズで２４時間活性化し、その後、適切な数の形質導入単位を加えて、所望の割合の形質導入Ｔ細胞を得ることで、産生する。これらの改変Ｔ細胞を、細胞が休止し、そして、その大きさが減少するまで増殖させ、その時点で細胞を後の分析用に凍結保存する。細胞の数と大きさは、Ｃｏｕｌｔｅｒ Ｍｕｌｔｉｓｉｚｅｒ（商標）ＩＩＩを用いて測定する。凍結保存の前に、形質導入した（ＴＦＰ．メソテリンを細胞表面で発現する）細胞の割合、及び、その発現の相対的蛍光強度を、フローサイトメトリー分析で決定する。ヒストグラムのプロットから、これらのＴＦＰの相対的発現レベルを、形質導入した割合とそれらの相対的蛍光強度とを比較することで調べる。
幾つかの実施形態では、複数のウイルスベクターを用いたＴ細胞形質導入によって複数のＴＦＰの導入を行う。
ヒト化ＴＦＰ再指向性Ｔ細胞の細胞溶解活性、増殖能力、及び、サイトカイン分泌の評価
ＴＦＰ．メソテリンＴ細胞が、細胞表面で発現したＴＦＰを産生すること、標的腫瘍細胞を死滅させること、増殖すること、及び、サイトカインを分泌することの機能的能力を、当該技術分野で公知のアッセイを用いて決定する。
ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ、例えば、ナイーブＴ細胞が、Ｔ細胞、すなわち、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋リンパ球に対するネガティブ選択で得られる正常なアフェレーシスドナー由来の血液）を、ヒトインターロイキン－２（ＩＬ－２）で処理し、その後、抗ＣＤ３ｘ抗ＣＤ２８ビーズで、例えば、１０％ＲＰＭＩにて、３７℃、５％ＣＯ２で活性化し、その後、ＴＦＰをコードするレンチウイルスベクターで形質導入する。フローサイトメトリーアッセイを用いて、例えば、抗ＦＬＡＧ抗体、または、抗マウス可変ドメイン抗体によって、ＴＦＰの細胞表面での存在を確認する。サイトカイン（例えば、ＩＦＮ－γ）産生は、ＥＬＩＳＡ、または、その他のアッセイを用いて測定する。
実施例３：ヒトＡＬＬマウスモデルにおけるヒトＴＦＰ Ｔ細胞の有効性
初代ヒトＡＬＬ細胞は、インビトロでそれらを培養せずに、免疫不全マウス（例えば、ＮＳＧまたはＮＯＤ）で成長することができる。同様に、培養ヒトＡＬＬ細胞株は、かかるマウスにおいて白血病を誘導することができる。ＡＬＬ担持マウスは、例えば、ＨＡＬＬＸ５４４７モデルにおいて、ヒトＴＦＰ．メソテリンＴ細胞の効力を調べるために用いることができる。このモデルでの読み出しは、ＡＬＬ細胞を静脈内（ｉ．ｖ．）注入した後のヒトＴＦＰ．メソテリンＴ細胞のｉ．ｖ．投与の非存在下及び存在下でのマウスの生存率である。
実施例４：多重ＴＦＰポリペプチドの実証、及び、多重ヒト化ＴＦＰ再指向性Ｔ細胞の使用
本明細書で提供したＴＦＰポリペプチドは、内因性ＴＣＲサブユニットのポリペプチドと機能的に会合して、機能的ＴＣＲ複合体を形成することができる。ここで、レンチウイルスベクターにおける複数のＴＦＰを用いて、機能的多重組換えＴＣＲ複合体を生成するために、Ｔ細胞を形質導入する。例えば、ｉ）ＣＤ３デルタポリペプチド由来の細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び、細胞内ドメインと、メソテリン特異的ｓｃＦｖ抗体断片とを有する第１のＴＦＰ、及び、ｉｉ）ＣＤ３ガンマポリペプチド由来の細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び、細胞内ドメインと、メソテリン特異的抗体断片を有する第２のＴＦＰを含むＴ細胞を提供する。当該第１のＴＦＰ及び第２のＴＦＰは、互いに相互作用することができ、また、内因性ＴＣＲサブユニットのポリペプチドと相互作用することができ、それにより、機能的ＴＣＲ複合体を形成する。
これらの多重ヒト化ＴＦＰ．メソテリンＴ細胞の使用は、上記した実施例２及び３に示す通り、液性及び固形腫瘍で実証することができる。
実施例５：ＴＦＰで形質導入したＴ細胞の調製
レンチウイルスの産生
適切な構築物をコードするレンチウイルスを、以下のようにして調製する。５×１０６個のＨＥＫ２９３ＦＴ細胞を、１００ｍｍのディッシュに播種し、培養密度７０～９０％になるまで一晩置く。示されたＤＮＡプラスミド２．５μｇ、及び、レンチウイルスパッケージングミックス（ＡＬＳＴＥＭ、カタログ番号ＶＰ１００）２０μＬを、０．５ｍＬの血清を含まないＤＭＥＭまたはＯｐｔｉ－ＭＥＭ（登録商標）Ｉ培地で希釈し、そして、緩やかに混合する。別のチューブで、ＮａｎｏＦｅｃｔ（登録商標）トランスフェクション試薬（ＡＬＳＴＥＭ、カタログ番号ＮＦ１００）の３０μＬを、０．５ｍＬの血清を含まないＤＭＥＭまたはＯｐｔｉ－ＭＥＭ（登録商標）Ｉ培地で希釈し、そして、緩やかに混合する。これらＮａｎｏＦｅｃｔ／ＤＭＥＭ、及び、ＤＮＡ／ＤＭＥＭ溶液を、その後に混合し、そして、１０～１５秒間ボルテックスし、その後に、このＤＭＥＭ－プラスミド－ＮａｎｏＦｅｃｔ混合物を、室温で、１５分間、インキュベートする。前段階からの完全トランスフェクション複合体を、細胞のプレートに滴下し、そして、揺動してプレート内のトランスフェクション複合体を均等に分散させる。このプレートを、その後、加湿した５％ＣＯ２インキュベーター内で、３７℃で、一晩、インキュベートする。翌日、上清を、１０ｍＬの新たな培地で置換し、ＶｉｒａｌＢｏｏｓｔ（５００ｘ、ＡＬＳＴＥＭ、カタログ番号ＶＢ１００）の２０μＬを追加する。これらのプレートを、その後、さらに２４時間、３７℃で、インキュベートする。レンチウイルスを含む上清を、その後、５０ｍＬの滅菌蓋つきコニカル遠心チューブに採取し、そして、氷上に置く。４℃で、１５分間、３０００ｒｐｍで遠心分離した後に、透明な上清を、低タンパク質結合性０．４５μｍ滅菌フィルターで濾過し、続いて、ウイルスを、４℃で、１．５時間、２５，０００ｒｐｍの超遠心分離（Ｂｅｃｋｍａｎｎ、Ｌ８－７０Ｍ）で単離する。このペレットを取り出し、そして、ＤＭＥＭ培地に再懸濁し、次に、レンチウイルス濃度／力価を、定量的ＲＴ－ＰＣＲで、Ｌｅｎｔｉ－Ｘ ｑＲＴ－ＰＣＲ滴定キット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ；カタログ番号６３１２３５）を用いて確立する。あらゆる残余のプラスミドＤＮＡは、ＤＮａｓｅＩで処理して除去する。このウイルスストック調製物は、すぐに感染に用いるか、あるいは、等分して、後の使用のために－８０℃で保存する。
ＰＢＭＣ単離
末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）は、全血またはバフィーコートのいずれかから調製する。全血は、１０ｍＬのヘパリンバキュテナーに採取し、すぐに処理するか、あるいは、４℃で、一晩、保存する。抗凝固処理した全血約１０ｍＬを、５０ｍＬのコニカル遠心チューブで、滅菌リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）緩衝液と総体積２０ｍＬになるまで混合する（ＰＢＳ、ｐＨ７．４、Ｃａ２＋／Ｍｇ２＋を含まない）。この血液／ＰＢＳ混合物の２０ｍＬを、その後、静かに１５ｍＬのＦｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅ（登録商標）ＰＬＵＳ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、１７－１４４０－０３）の表面に載せ、その後、４００ｇで、３０～４０分間、室温で、ブレーキをかけずに遠心分離する。
バフィーコートは、Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｂｌｏｏｄ Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ（Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）から購入した。Ｌｅｕｃｏｓｅｐ（登録商標）チューブ（Ｇｒｅｉｎｅｒ ｂｉｏ－ｏｎｅ）は、１５ｍＬのＦｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅ（登録商標）（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈ Ｃａｒｅ）を加えて準備し、そして、１０００ｇで、１分間、遠心分離する。バフィーコートは、ＰＢＳ（ｐＨ７．４、Ｃａ２＋もＭｇ２＋も含まない）で１：３に希釈する。この希釈バフィーコートを、Ｌｅｕｃｏｓｅｐチューブに移し、そして、１０００ｇで、１５分間、ブレーキをかけずに遠心分離する。希釈血漿／Ｆｉｃｏｌｌ界面に認められたＰＢＭＣを含む細胞層を、Ｆｉｃｏｌｌの混入を最小限にするように注意深く取り出す。次いで、残余のＦｉｃｏｌｌ、血小板、及び、血漿タンパク質は、このＰＢＭＣを、４０ｍＬのＰＢＳで、３回、室温で、２００ｇで、１０分間の遠心分離することで洗浄して除去する。次いで、これらの細胞を、血球計で計数する。この洗浄ＰＢＭＣを、ＣＡＲ－Ｔ培地（ＡＩＭ Ｖ－ＡｌｂｕＭＡＸ（登録商標）（ＢＳＡ）（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で、一度、洗浄を行い、同培地は、５％ＡＢ血清、及び、１．２５μｇ／ｍＬアンホテリシンＢ（Ｇｅｍｉｎｉ Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｗｏｏｄｌａｎｄ，ＣＡ）、１００Ｕ／ｍＬペニシリン、及び、１００μ／ｍＬストレプトマイシン）を含む。あるいは、この洗浄ＰＢＭＣを断熱バイアルに移し、そして、－８０℃で、２４時間凍結し、その後、後の使用のために液体窒素にて保存する。
Ｔ細胞の活性化
全血またはバフィーコートのいずれかから調製したＰＢＭＣを、ウイルスの形質導入に先立って、抗ヒトＣＤ２８及びＣＤ３抗体結合磁気ビーズで、２４時間刺激する。新たに単離したＰＢＭＣを、５％ＡＢ血清、及び、１．２５μｇ／ｍＬアンホテリシンＢ（Ｇｅｍｉｎｉ Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ）、１００Ｕ／ｍＬペニシリン、及び、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンを含む）ＣＡＲ－Ｔ培地（ＡＩＭ Ｖ－ＡｌｂｕＭＡＸ（ＢＳＡ）（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で、ｈｕＩＬ－２を用いずに、一度、洗浄を行い、その後、３００ＩＵ／ｍＬのヒトＩＬ－２（１０００ｘストックから；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含むＣＡＲ－Ｔ培地に、１×１０６細胞／ｍＬの最終濃度で再懸濁する。前もってＰＢＭＣを凍結していた場合には、これらを解凍し、そして、予め温めておいた（３７℃）ｃＤＭＥＭ培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）の９ｍＬに、１×１０７細胞／ｍＬで再懸濁して、１０％ＦＢＳ、１００Ｕ／ｍＬペニシリン、及び、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシンの存在下で、１×１０６細胞／ｍＬの濃度とし、次いで、ＣＡＲ－Ｔ培地で、一度、洗浄し、続いて、ＣＡＲ－Ｔ培地に、１×１０６細胞／ｍＬで再懸濁し、そして、上記のようにして、ＩＬ－２を添加する。
活性化の前に、抗ヒトＣＤ２８及びＣＤ３抗体結合磁気ビーズ（例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから入手可能）を、磁気ラックを使用して、１ｍＬの滅菌１ｘＰＢＳ（ｐＨ７．４）で、３回、洗浄をして、ビーズをこの溶液から分離し、その後、３００ＩＵ／ｍＬのヒトＩＬ－２と共にＣＡＲ－Ｔ培地に再懸濁し、最終濃度を４×１０７ビーズ／ｍＬにする。次いで、ＰＢＭＣ及びビーズを、２５μＬ（１×１０６個のビーズ）のビーズを、１ｍＬのＰＢＭＣに移して、ビーズ対細胞の比率を１：１にして混合する。次いで、所望の数の分割量を、１２ウェルの低付着性または未処理の細胞培養プレートの単一のウェルに分配し、そして、ウイルスの形質導入の前に、３７℃、５％ＣＯ２で、２４時間、インキュベートする。
Ｔ細胞の形質導入／トランスフェクション及び増殖
ＰＢＭＣの活性化後、細胞を、３７℃、５％ＣＯ２で、４８時間、インキュベートする。レンチウイルスを氷上で解凍し、そして、５×１０６個のレンチウイルスを、培地１ｍＬ当たり２μＬのＴｒａｎｓｐｌｕｓ（商標）（Ａｌｓｔｅｍ）（最終希釈１：５００）と共に、１×１０６個の細胞を各ウェルに加える。細胞を、さらに２４時間インキュベートし、続いて、ウイルスの添加を繰り返す。あるいは、レンチウイルスを氷上で解凍し、それぞれのウイルスを、５μｇ／ｍＬのポリブレン（Ｓｉｇｍａ）の存在下、５または５０ＭＯＩで加える。細胞を、室温で、１００分間、１００ｇで遠心する。次いで、細胞を、３００ＩＵ／ｍＬのヒトＩＬ－２の継続的な存在下で、６～１４日間成長させる（総インキュベート時間は、必要とする最終的なＣＡＲ－Ｔ細胞の数による）。細胞濃度を、２～３日ごとに分析し、その際に、培地を追加して細胞懸濁液を１×１０６細胞／ｍＬに維持する。
幾つかの例では、活性化したＰＢＭＣを、インビトロで転写した（ＩＶＴ）ｍＲＮＡでエレクトロポレートする。ある実施形態では、ヒトＰＢＭＣを、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）で、１対１の比率で、３日間、３００ＩＵ／ｍｌの組換えヒトＩＬ－２（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍ）（Ｍｉｌｙｅｎｉ ＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓのＴｒａｎｓＡｃｔ Ｔ細胞などのその他の刺激試薬を使用し得る）の存在下で、刺激する。これらのビーズを、エレクトロポレーションの前に除去する。これらの細胞を洗浄し、ＯＰＴＩ－ＭＥＭ培地（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）に、２．５×１０７細胞／ｍＬの濃度で、再懸濁した。この細胞懸濁液（５×１０６細胞）の２００μＬを、２ｍｍのギャップのＥｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏｎ Ｃｕｖｅｔｔｅｓ Ｐｌｕｓ（商標）（Ｈａｒｖａｒｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓ ＢＴＸ）に移し、そして、氷上で、予冷する。１０μｇのＩＶＴ ＴＦＰ ｍＲＮＡを、この細胞懸濁液に加える。次いで、このｍＲＮＡ／細胞混合物を、ＥＣＭ８３０ Ｅｌｅｃｔｒｏ Ｓｑｕａｒｅ Ｗａｖｅ Ｐｏｒａｔｏｒ（Ｈａｒｖａｒｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓ ＢＴＸ）を用いて、２００Ｖで、２０ミリ秒間エレクトロポレートする。このエレクトロポレーションの直後に、これらの細胞を、新たな細胞培養培地（ＡＩＭ Ｖ ＡｌｂｕＭＡＸ（ＢＳＡ）無血清培地＋５％ヒトＡＢ血清＋３００ＩＵ／ｍｌ ＩＬ－２）に移し、そして、３７℃で、インキュベートする。
細胞染色によるＴＦＰ発現の検証
レンチウイルスの形質導入、または、ｍＲＮＡのエレクトロポレーションに続いて、抗メソテリンＴＦＰの発現を、抗マウスＦａｂ抗体を用いてフローサイトメトリーにて確認し、マウス抗メソテリンｓｃＦｖを検出する。Ｔ細胞を、３ｍＬの染色用緩衝液（ＰＢＳ、４％ＢＳＡ）で３回洗浄し、そして、ウェル当たり１×１０６個の細胞で、ＰＢＳに再懸濁する。死細胞の排除のため、細胞を、ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ（登録商標）Ｆｉｘａｂｌｅ Ａｑｕａ Ｄｅａｄ Ｃｅｌｌ Ｓｔａｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で、３０分間、氷上で、インキュベートする。細胞を、ＰＢＳで２回洗浄し、そして、５０μＬの染色用緩衝液に再懸濁する。Ｆｃ受容体をブロックするため、１μＬの１：１００希釈正常ヤギＩｇＧ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を各チューブに加え、そして、氷中で、１０分間、インキュベートする。ＦＡＣＳ緩衝液１．０ｍＬを、各チューブに加え、よく混合し、そして、細胞を、３００ｇで、５分間、遠心分離してペレットにする。ｓｃＦｖ ＴＦＰの表面発現を、Ｚｅｎｏｎ（登録商標）Ｒ－フィコエリスリン標識ヒトＭＳＬＮ ＩｇＧ１ Ｆｃ、または、ヒトＩｇＧ１アイソタイプコントロールで検出する。１μｇの抗体を、それぞれの試料に添加し、そして、氷上で、３０分間、インキュベートする。次いで、細胞を、２回洗浄し、そして、ＢＤ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅからのＡｎｔｉ－ＣＤ３ ＡＰＣ（クローン、ＵＣＨＴ１）、ａｎｔｉ－ＣＤ４－Ｐａｃｉｆｉｃ ｂｌｕｅ（クローンＲＰＡ－Ｔ４）、ｎｔｉ－ＣＤ８ＡＰＣＣｙ７（クローンＳＫＩ）を用いて、表面マーカーについて染色する。フローサイトメトリーを、ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａＴＭ Ｘ２０（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて行い、そして、データを、ＦＡＣＳ ｄｉｖａソフトウェアを用いて取得し、そして、ＦｌｏｗＪｏ（登録商標）（Ｔｒｅｅｓｔａｒ，Ｉｎｃ．Ａｓｈｌａｎｄ，ＯＲ）で解析する。
例示的な結果を図５Ａに示しており、同図は、ＣＤ８（抗ＣＤ８ ＡＰＣＣｙ７、ｙ軸）とメソテリン（「ＭＳＬＮ」）（Ｚｅｎｏｎ（登録商標）Ｒ－フィコエリスリン標識ｈＭＳＬＮ ＩｇＧ、ｘ軸）について染色した活性化ＰＢＭＣ細胞の表面発現分析を示す。左から右に向かって、非形質導入細胞、または、抗ＭＳＬＮ－ＣＤ３ε、抗ＭＳＬＮ－ＣＤ２８ζ、及び、抗ＭＳＬＮ－４１ＢＢζ構築物のいずれかで形質導入した細胞を示す。ＣＤ８＋、ＭＳＬＮ＋細胞の割合を、各パネルの右上隅に示す。
図５Ｂは、組織内単一ドメイン（「ＳＤ」）メソテリンバインダーを含むＴＦＰ構築物で形質導入した、ＭＳＬＮ及びＧＦＰについて染色した活性化ＰＢＭＣ細胞からの同様の結果を示す。最上列は（左から右へ）、非形質導入細胞、及び、ポジティブコントロール抗ＭＳＬＮ－ＣＤ３εＴＦＰ（「ＳＳＩ」）で形質導入した細胞を示す。第２～４列は、ＧＦＰタグを付けた（左から右へ）ＣＤ３εＴＦＰ、ＣＤ３γＴＦＰ、ＴＣＲβＴＦＰ、及び、ＣＤ２８ζＣＡＲ構築物で形質導入した細胞における、抗ＭＳＬＮバインダーＳＤ１、ＳＤ４、及び、ＳＤ６のそれぞれを示す。ＧＦＰ＋、ＭＳＬＮ＋細胞の割合を、各パネルの右上隅に示す。
実施例６：フローサイトメトリーによる細胞傷害性アッセイ
メソテリンに対してポジティブまたはネガティブのいずれかである標的細胞を、蛍光染料であるカルボキシフルオレセイン二酢酸サクシニミジルエステル（ＣＦＳＥ）で標識する。これらの標的細胞を、形質導入していないか、あるいは、コントロールのＣＡＲ－Ｔ構築物で形質導入、または、ＴＦＰで形質導入したエフェクターＴ細胞と混合する。示されたインキュベーション時間の後、死対生ＣＦＳＥ標識標的細胞、及び、ネガティブコントロールの標的細胞のパーセンテージを、各エフェクター／標的細胞培養に対して、フローサイトメトリーで決定する。各Ｔ細胞ポジティブ標的細胞培養における標的細胞の生存率を、標的細胞のみを含むウェルに対して計算する。
エフェクターＴ細胞の細胞傷害活性は、エフェクター及び標的細胞の共インキュベーション後のエフェクターＴ細胞を含まない、または、含む標的細胞における生存標的細胞の数を、フローサイトメトリーを用いて比較することで測定する。メソテリンＴＦＰまたはＣＡＲ－Ｔ細胞での実験において、当該標的細胞は、メソテリンポジティブ細胞であり、一方で、ネガティブコントロールとして使用する細胞は、メソテリンネガティブコントロール細胞である。
標的細胞を、一度、洗浄し、そして、ＰＢＳに、１×１０６細胞／ｍＬで再懸濁する。蛍光染料のカルボキシフルオレセイン二酢酸サクシニミジルエステル（ＣＦＳＥ）（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を、濃度０．０３μＭで、この細胞懸濁液に加え、そして、これらの細胞を、室温で、２０分間、インキュベートする。反応体積の５倍の体積で、完全細胞培養培地（ＲＰＭＩ－１６４０＋１０％ＨＩ－ＦＢＳ）を、この細胞懸濁液に加えることで、この標識化反応を停止し、そして、室温で、さらに２分間、これらの細胞をインキュベートする。これらの細胞を、遠心分離してペレットにし、そして、細胞傷害性培地（フェノールレッドを含まないＲＰＭＩ１６４０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）プラス５％ＡＢ血清（Ｇｅｍｉｎｉ Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ）に、２×１０５細胞／ｍＬで、再懸濁する。ＣＦＳＥ標識標的細胞懸濁液（１０，０００細胞に相当する）の５０マイクロリットルを、９６ウェルのＵ底プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）の各ウェルに加える。
抗メソテリンＴＦＰ構築物で形質導入したエフェクターＴ細胞を、ネガティブコントロールとしての未形質導入Ｔ細胞と一緒に洗浄し、そして、細胞傷害性培地に２×１０６細胞／ｍＬ、または、１×１０６細胞／ｍＬで懸濁した。エフェクターＴ細胞懸濁液５０μＬ（１００，０００または５０，０００細胞に相当する）を、播種した標的細胞に加えて、総体積１００μＬにて、それぞれ、エフェクター対標的の比率を、１０対１または５対１にする。次いで、これらの培養物を混合し、沈降させ、そして、３７℃で、５％ＣＯ２で、４時間、インキュベートする。このインキュベートの直後に、７ＡＡＤ（７－アミノアクチノマイシンＤ）（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）を、製造業者が推奨するようにして、この培養細胞に加え、ＢＤ ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａ（商標）Ｘ－２０（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）でフローサイトメトリーを行う。フローサイトメトリーデータの解析は、ＦｌｏｗＪｏ（登録商標）ソフトウェア（ＴｒｅｅＳｔａｒ，Ｉｎｃ．）を用いて行う。
標的細胞の生存率は、エフェクターＴ細胞と標的細胞とを含む試料での生存標的細胞数（ＣＦＳＥ＋７－ＡＡＤ－）を、標的細胞だけを含む試料での生存標的細胞数（ＣＦＳＥ＋７－ＡＡＤ－）で除して計算する。エフェクター細胞の細胞傷害性は、標的細胞の死滅率＝１００％－細胞の生存率として計算する。
抗ＭＳＬＮ－２８ζＣＡＲ構築物で形質導入されたＴ細胞は、未形質導入のＴ細胞、あるいは、非メソテリン特異的ＣＡＲコントロールで形質導入したＴ細胞との比較で、メソテリン発現細胞に対する細胞傷害性を実証し得る。しかしながら、抗メソテリン－ＣＤ３εで形質導入したＴ細胞は、抗メソテリンＣＡＲコントロールよりも標的に対して効果的な細胞傷害性を誘導し得る。また、抗メソテリン－ＣＤ３γＴＦＰも、５～１０：１のエフェクター：標的の比率で、抗メソテリンＣＡＲで認められるよりも高い強力な細胞傷害性を媒介し得る。多少の細胞傷害性が、抗メソテリン－ＴＣＲα、及び、抗メソテリン－ＴＣＲβＴＦＰで認められ得る。同様の結果が、代替ヒンジ領域で構築した抗メソテリンＴＦＰで得られ得る。また、メソテリン発現標的細胞に対する細胞傷害性は、抗メソテリン－ＣＤ３ε、または、抗メソテリン－ＣＤ３γＴＦＰで形質導入したＴ細胞の方が、抗メソテリン－ＣＡＲで形質導入したＴ細胞よりも大きくなり得る。
また、メソテリンに特異的なＴＦＰをコードするｍＲＮＡでエレクトロポレートしたＴ細胞も、メソテリン発現細胞に対する強い細胞傷害性を示し得る。コントロールまたは抗メソテリンＴＦＰ構築物のいずれでもメソテリンネガティブ細胞の有意な死滅は認められなかったが、メソテリン発現細胞のメソテリン特異的な死滅は、抗メソテリン－ＣＤ３εＳＬまたは抗メソテリン－ＣＤ３γＳＬ ＴＦＰのいずれかで形質導入したＴ細胞で認められ得る。
実施例８：リアルタイム細胞傷害性アッセイによる細胞傷害性の決定
また、抗メソテリンＴＦＰは、リアルタイム細胞傷害性アッセイ（ＲＴＣＡ）形式でも抗メソテリンＣＡＲよりも優れた細胞傷害性を示し得る。このＲＴＣＡアッセイは、特殊な９６ウェルプレートの各ウェルで、リアルタイムで、接着性の標的細胞単層の電気インピーダンスを測定し、そして、最終的な読み出しを、細胞指数と呼ばれる値として示す。細胞指数の変化は、同時にインキュベートしたＴ細胞エフェクターによる標的細胞の死滅の結果として、標的細胞単層の破壊を示す。したがって、エフェクターＴ細胞の細胞傷害性は、標的細胞及びエフェクターＴ細胞の双方を含むウェルの細胞指数と、標的細胞のみを含むウェルのものとを比較した変化として評価することができる。
接着性標的細胞を、ＤＭＥＭ、１０％ＦＢＳ、１％抗生物質－抗真菌剤（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で培養する。当該ＲＴＣＡの調製のため、５０μＬの、例えば、ＤＭＥＭ培地を、Ｅプレート（ＡＣＥＡ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ，カタログ番号：ＪＬ－１０－１５６０１０－１Ａ）の適切なウェルに加える。次いで、このプレートを、ＲＴＣＡ ＭＰ機器（ＡＣＥＡ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．）内に配置し、そして、適切なプレートのレイアウトとアッセイスケジュールとを、製造業者のマニュアルの記載に従って、ＲＴＣＡ２．０ソフトウェアに入力する。ベースラインの測定は、１００回の測定に対して、１５分毎に行う。次いで、体積１００μＬの１×１０４個の標的細胞を、各アッセイウェルに加え、そして、これらの細胞を、１５分間沈殿させる。このプレートを、読み取り機に戻し、そして、読み取りを再開する。
翌日、エフェクターＴ細胞を洗浄し、そして、細胞傷害性培地（フェノールレッドを含まないＲＰＭＩ１６４０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）プラス５％ＡＢ血清（Ｇｅｍｉｎｉ Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ；１００－３１８））に再懸濁する。次いで、このプレートを、機器から取り出し、そして、細胞傷害性培地（フェノールレッドを含まないＲＰＭＩ１６４０＋５％ＡＢ血清）に懸濁したエフェクターＴ細胞を、１００，０００細胞または５０，０００細胞で各ウェルに加えて、エフェクター対標的の比率を、それぞれ、１０対１または５対１にする。そして、このプレートを、機器に戻す。測定は、１００測定について２分ごとに行い、そして、１０００測定について１５分ごとに行う。
当該ＲＴＣＡアッセイにおいて、メソテリンで形質導入した細胞の死滅は、エフェクター細胞を添加した後に、細胞のみ、または、コントロールのＣＡＲ構築物で形質導入したＴ細胞と共インキュベートした細胞と比較して、細胞指数の時間依存性の減少によって示されるように、抗メソテリン－２８ζＣＡＲで形質導入したＴ細胞で形質導入したＴ細胞によって認められ得る。しかしながら、抗メソテリン－ＣＤ３εＴＦＰ発現Ｔ細胞による標的細胞の死滅は、抗メソテリンＣＡＲで認められるよりも深く、迅速であり得る。例えば、抗メソテリン－ＣＤ３ε ＴＦＰで形質導入したＴ細胞を添加して４時間以内に、メソテリン発現標的細胞の死滅は基本的に完了し得る。その他のＣＤ３及びＴＣＲ構築物を含み複数のＴＦＰ構築物で形質導入したＴ細胞には、殆どまたは全く死滅が観察され得ない。同様の結果が、代替ヒンジ領域で構築した抗メソテリンＴＦＰで取得し得る。メソテリンで形質導入した標的細胞に対する細胞傷害性は、抗メソテリン－ＣＤ３εまたは抗メソテリン－ＣＤ３γ ＴＦＰで形質導入したＴ細胞の方が、抗メソテリン－ＣＡＲで形質導入したＴ細胞よりも大きくなり得る。
ＴＦＰで形質導入したＴ細胞の細胞傷害活性は、形質導入に使用したウイルス量（ＭＯＩ）に対して用量依存的となり得る。メソテリンポジティブ細胞の死滅の増加は、抗メソテリン－ＣＤ３εＴＦＰレンチウイルスのＭＯＩの増加とともに観察され、そして、ＴＦＰの形質導入と細胞傷害活性の関係をさらに強化し得る。
ＲＴＣＡアッセイの例示的な結果を、図６に示す。リンカー：ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＬＥ（配列番号１）をコードするＤＮＡ配列でＣＤ３εＤＮＡ断片に連結した抗ＭＳＬＮ ｓｃＦｖ ＤＮＡ断片を、ＸｂａＩ及びＥｃｏＲＩ部位で（ＳＢＩの）ｐ５１０ベクターにクローニングすることによって、抗ＭＳＬＮ ＴＦＰ構築物を改変した。生成したこの抗ＭＳＬＮ ＴＦＰ構築物は、ｐ５１０＿抗ＭＳＬＮ＿ＳＳ１＿ＣＤ３ε（抗ＭＳＬＮ ＳＳ１ ｓｃＦｖ－リンカー－ヒトＣＤ３ε鎖）であった。
全長メソテリン（ＮＭ＿００５８２３）を、ｐＣＭＶ６＿ＸＬ４＿Ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ（Ｏｒｉｇｅｎｅ）からＰＣＲ増幅し、そして、ギブソンリコンビナント反応によって、ＸｂａＩ及びＥｃｏＲＩ制限消化したｐ５２７ａ（ｐＣＤＨ－ＥＦ１－ＭＣＳ－Ｔ２Ａ－Ｐｕｒｏ）（ＳＢＩ）にクローニングした。
当該ＲＴＣＡの標的細胞は、メソテリンポジティブＨｅＬａ細胞（子宮頸部腺癌、ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＣＬ－２（商標））であり、そして、メソテリンネガティブＰＣ－３細胞（前立腺腺癌、ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ－１４３５（商標））は、ネガティブコントロールとして用いた。接着性標的細胞を、１０％ＦＢＳと１％抗生物質－抗真菌剤（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）とを含むＤＭＥＭで培養した。
細胞傷害性を示す正規化細胞指数を決定した。活性化ＰＢＭＣは、未処理のもの（トレース＃１）、非形質導入のもの（トレース＃２）、または、空のベクター（トレース＃３）、抗ＭＳＬＮ ＴＦＰ（「抗ＭＳＬＮ－ＣＤ３ε ＴＲｕＣ」、トレース＃４）、ＣＤ２８ζ（トレース＃５）、または、４１ＢＢζ（トレース＃６）シグナル伝達ドメインを有する抗ＭＳＬＮ ＣＡＲ（それぞれ「抗ＭＳＬＮ－２８ζＣＡＲ」及び「抗ＭＳＬＮ－４１ＢＢζＣＡＲ」）で形質導入したものであった。
図６Ａに示すように、抗ＭＳＬＮ ＴＦＰ形質導入Ｔ細胞は、ネガティブコントロールと比較して、当該標的ＭＳＬＮポジティブＨｅＬａ細胞を効率的に死滅した。対照的に、いずれの構築物も、当該ＭＳＬＮネガティブＰＣ－３細胞を、効率的に死滅しなかった（図６Ｂ）。
単一ドメイン抗メソテリンバインダーを有する組織内ＴＦＰ構築物を用いて、同様の実験を行った。図６Ｃは、２名の別個のヒトドナー由来のＴ細胞（上と下）を用いた、高密度標的細胞株（ＨｅＬａ－（ＭＳＬＮｈｉｇｈ））におけるＭＳＬＮポジティブ細胞の死滅を示す。抗ＭＳＬＮバインダーＳＤ１（左）、ＳＤ４（中央）、及び、ＳＤ６（右）を有するＴＦＰ Ｔ細胞についての細胞死滅トレースを示す。活性化ＰＢＭＣを、非形質導入（トレース＃１）、または、ＣＤ３εＴＦＰ（トレース＃２）、ＣＤ３γＴＦＰ（トレース＃３）、ＴＣＲβＴＦＰ（トレース＃４）、または、ＣＤ２８ζＣＡＲ（トレース＃５）で形質導入した。細胞傷害性を示す正規化細胞指数を、リアルタイム細胞分析器（ＲＴＣＡ）アッセイで決定した。図示したように、非形質導入のもの以外は、すべてのＴ細胞が、癌細胞を死滅することができた。
実施例７：高密度または低密度の標的を有する細胞におけるルシフェラーゼベースの細胞障害性アッセイ
当該ルシフェラーゼベースの細胞傷害性アッセイ（「Ｌｕｃ－Ｃｙｔｏ」アッセイ）は、共培養した後の残存生標的細胞におけるルシフェラーゼ酵素活性を間接的に測定することで、ＴＦＰ Ｔ細胞及びＣＡＲ Ｔ細胞の細胞傷害性を評価する。Ｌｕｃ－Ｃｙｔｏアッセイに使用される高密度標的細胞は、ＨｅＬａ－ＭＳＬＮｈｉｇｈ細胞であり、また、使用された低密度標的細胞は、低レベルのメソテリンを発現するＰＣ３細胞（ＰＣ３－ＭＳＬＮｌｏｗ）であり、それぞれは、ホタルルシフェラーゼを発現するように安定に形質導入した。ホタルルシフェラーゼをコードする当該ＤＮＡを、ＧｅｎｅＡｒｔ（登録商標）（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ（登録商標））で合成し、そして、単一プロモーターレンチウイルスベクターｐＣＤＨ５２７Ａ－１（Ｓｙｓｔｅｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）のマルチクローニングサイトに挿入した。
当該ホタルルシフェラーゼを担持するレンチウイルスを、上記したようにしてパッケージした。次いで、ＨｅＬａ－ＭＳＬＮｈｉｇｈまたはＰＣ３－ＭＳＬＮｌｏｗ細胞を、当該レンチウイルスを担持するホタルルシフェラーゼ構築物で、２４時間、形質導入し、そして、ピューロマイシン（５μｇ／ｍＬ）で選択した。ＨｅＬａ－ｌｕｃ－ＭＳＬＮｈｉｇｈ及びＰＣ３－ｌｕｃ－ＭＳＬＮｌｏｗ－ルシフェラーゼ細胞の生成を、当該細胞内のルシフェラーゼ酵素活性をＢｒｉｇｈｔ－Ｇｌｏ（商標）ルシフェラーゼアッセイシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて測定して確認をした。
２名の異なるヒトドナーに由来する別々の集団に、空の発現ベクター（「ＮＴ」）、または、以下のＴＦＰまたはＣＡＲ、すなわち、抗ＭＳＬＮ（ポジティブコントロール、「ＳＳ１」、親和性１１ｎＭ）、抗ＭＳＬＮ－ＳＤ１（親和性２５ｎＭ）、抗ＭＳＬＮ－ＳＤ４（親和性６ｎＭ）、または、抗ＭＳＬＮ ＳＤ６（親和性０．５９ｎＭ）を、それぞれ、ＣＤ３εＴＦＰ、ＣＤ３γＴＦＰ、ＴＣＲβＴＦＰ、及び、ＣＨ２８ζＣＡＲのフォーマットにて形質導入をした。形質導入したＴ細胞の２つの集団を、ＨｅＬａ－ＭＳＬＮｈｉｇｈ（図７）、または、ＰＣ３－ＭＳＬＮｌｏｗ（図８）とインキュベートした。
標的細胞を、９６ウェルプレートに、１ウェルあたり５０００個の細胞で播種した。ＴＦＰ Ｔ、ＣＡＲ Ｔ、または、コントロール細胞を、標的細胞に対して、エフェクターと標的とを、１：１（黒色棒）または１：５（灰色棒）の比率で加えた。次いで、生体標的細胞でのルシフェラーゼ酵素活性を、Ｂｒｉｇｈｔ－Ｇｌｏ（登録商標）ルシフェラーゼアッセイシステムで測定する前に、細胞の混合物を、３７℃で、５％ＣＯ２で、２４時間培養した。これらの細胞をペレットにして、そして、ルシフェラーゼ基質を含む培地に再懸濁した。ルシフェラーゼは、細胞溶解によって放出されるので、したがって、ルシフェラーゼ活性が強くなると、それに対応して細胞死の割合が大きくなる。
高レベルのＭＳＬＮを発現している細胞を用いた結果を、図７に示す。Ｔ細胞を含まない（「標的のみ」）、形質導入した空ベクター（「ＮＴ」）、抗ＭＳＬＮ（ポジティブコントロール、「ＳＳ１」）、または、組織内の抗メソテリンバインダーＳＤ１（図７Ａ）、ＳＤ４（図７Ｂ）、及び、ＳＤ６（図７Ｃ）を、それぞれ、ＣＤ３εＴＦＰ、ＣＤ３γＴＦＰ、ＴＣＲβＴＦＰ、及び、ＣＤ２８ζＣＡＲのフォーマットで含む抗メソテリンＴＦＰ Ｔ細胞を含むサンプルでの死滅した細胞の％を示す。各グラフにおいて、黒色棒は、標的細胞に対するＴ細胞の比率が１：１であることを表し、灰色棒は、標的細胞に対するＴ細胞の比率が１：５であることを表している。図示したように、すべてのＴＦＰ－Ｔ細胞、ＣＡＲ－Ｔ細胞、及び、ポジティブコントロールＳＳ１は、ＭＳＬＮを効率的に死滅する。
図８は、低レベルのメソテリンを発現する標的細胞株（ＰＣ３－ＭＳＬＮｌｏｗ）に対する抗ＭＳＬＮ ＣＡＲ Ｔ細胞、及び、ＴＦＰ Ｔ細胞の活性を示す一連のグラフである。Ｔ細胞を含まない（「標的のみ」）、形質導入した空ベクター（「ＮＴ」）、抗ＭＳＬＮ（ポジティブコントロール、「ＳＳ１」）、または、ＴＦＰフォーマットＣＤ３ε（図８Ａ）、ＣＤ３γ（図８Ｂ）、ＴＣＲβ（図８Ｃ）、及び、ＣＤ２８ζＣＡＲ（図８Ｄ）における抗メソテリン構築物ＳＤ１、ＳＤ４、及び、ＳＤ６を含むサンプルでの死滅した細胞の％を示す。各グラフにおいて、黒色棒は、標的細胞に対するＴ細胞の比率が１：１であることを表し、灰色棒は、標的細胞に対するＴ細胞の比率が１：５であることを表している。第２のＴ細胞ドナーについても、同様の結果が認められた。
図示したように、標的細胞に対するＴ細胞の１：１の比率は、予期した通り、標的細胞の最高レベルの死滅をもたらした。加えて、すべてのＴＦＰ Ｔ細胞及びＣＡＲ Ｔ細胞は、高レベルのＭＳＬＮを発現する細胞において、同様の活性を示した。
実施例８：ＦＡＣＳによるＴ細胞の活性化の測定
抗ＭＳＬＮ ＣＡＲ及びＴＦＰ構築物を発現するＴ細胞の活性化を、ＭＳＬＮ＋及びＭＳＬＮ－Ｋ５６２細胞を用いて行い、そして、図９に示す。上記したようにして、活性化ＰＢＭＣを、２日間連続して５０ＭＯＩのＬＶで形質導入し、そして、増殖させた。形質導入して８日後に、ＰＢＭＣの共培養物を、細胞傷害性培地（フェノールレッドを含まないＲＰＭＩ１６４０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）プラス５％ＡＢ血清（Ｇｅｍｉｎｉ Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ；１００－３１８）において、Ｅ：Ｔが１：１の比率（０．２×１０６個の各細胞型）である標的細胞（ＭＳＬＮを過剰発現するＫ５６２細胞）と組み合わせた。ＢＣＭＡを過剰発現しているＫ５６２細胞を、ネガティブコントロールとして使用した。共培養を開始して２４時間後に、細胞を採取し、ＰＢＳで３回洗浄し、そして、氷上で、３０分間、Ｌｉｖｅ／Ｄｅａｄ Ａｑｕａで染色した。Ｆｃ受容体をブロックするために、ヒトＦｃブロック（ＢＤ）を添加し、そして、室温で、１０分間、インキュベートした。続いて、これらの細胞を、抗ＣＤ３ ＡＰＣ（クローン、ＵＣＨＴ１）、抗ＣＤ８ ＡＰＣｃｙ７（クローンＳＫ１）、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓの抗ＣＤ６９－Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）７００（クローンＦＮ５０）、及び、抗ＣＤ２５－ＰＥ（クローンＢＣ９６、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）で染色した。これらの細胞を、２回洗浄し、そして、ＢＤ ＬＳＲＩＩ－Ｆｏｒｔｅｓｓａによって分析した。ＦｌｏｗＪｏ（登録商標）分析ソフトウェア（Ｔｒｅｅ ｓｔａｒ、Ｉｎｃ．）を用いて、データを上記したようにして分析した。
図９Ａに示したように、図中の左から右に、非形質導入のＴ細胞、空のベクターで形質導入したＴ細胞、抗ＭＳＬＮ－ＣＤ３ε ＴＦＰ、抗ＭＳＬＮ－２８ζ ＣＡＲ、または、抗ＭＳＬＮ－４１ＢＢζＣＡＲで形質導入したＴ細胞である。ＭＳＬＮ－細胞と共培養した細胞を最上列に示し、そして、ＭＳＬＮ＋標的細胞と共培養した細胞を最下列に示す。次いで、表面活性化マーカーＣＤ６９及びＣＤ２５に特異的な抗体で細胞を染色した。抗ＣＤ６９で染色した細胞の数はｘ軸に対応しており、そして、抗ＣＤ２５で染色した細胞の数はｙ軸に対応している。示したように、抗メソテリンＣＡＲ及びＴＦＰ構築物を発現するＴ細胞は、ＭＳＬＮ－細胞との共培養と比較して、高レベルのＣＤ６９及びＣＤ２５発現によって実証されているように、ＭＳＬＮ＋細胞との培養によって活性化された（図９Ｂ）。ＭＳＬＮ－（白色棒）、及び、ＭＳＬＮ＋（黒色棒）細胞における各構築物についてのＣＤ２５＋細胞のパーセンテージを示している。
形質導入していないＴ細胞、または、抗ＭＳＬＮポジティブコントロールバインダーで形質導入したＴ細胞（「５１０－ＳＳ１－ＣＤ３ε」）のいずれかにおいて、Ｋ５６２ ＭＳＬＮ－細胞（図９Ｃ、丸形）、及び、Ｋ５６２－ＭＳＬＮ＋細胞（図９Ｃ、四角）を用いて、同様の実験を行った。データは、ＣＤ２５＋、ＣＤ６９＋、及び、ＣＤ２５＋／ＣＤ６９＋細胞の合計を表す。図９Ｄでは、ＴＦＰフォーマットＣＤ３ε、ＣＤ３γ、ＴＣＲβ、及び、ＣＤ２８ζＣＡＲを有するドナーＴ細胞と組み合わせたＫ５６２ ＭＳＬＮ－標的細胞（左パネル）、及び、Ｋ５６２ ＭＳＬＮ＋細胞（右パネル）における組織内抗ＭＳＬＮバインダーＳＤ１（四角）、ＳＤ４（丸形）、及び、ＳＤ６（三角）についてのデータを示す。第２のＴ細胞ドナー由来の細胞を用いても、同様の結果が認められた。
Ｔ細胞の活性化は、グランザイムＢ産生の分析によって同様に評価し得る。Ｔ細胞を、上記したように培養し、増殖させ、そして、グランザイムＢについての細胞内染色を、製造業者のキットの説明書（Ｇｅｍｉｎｉ Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ；１００－３１８）に従って行う。細胞を回収し、ＰＢＳで３回洗浄し、そして、ヒトＦｃブロックで、１０分間ブロックした。細胞を、抗ＣＤ３ ＡＰＣ（クローン、ＵＣＨＴ１）、及び、抗ＣＤ８ ＡＰＣｃｙ７（クローンＳＫ１）を用いて、４℃で、３０分間、表面抗原について染色した。次いで、細胞を、固定／透過処理液（ＢＤ Ｃｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍ固定／透過化キットカタログ番号５５４７１４）で、４℃で、２０分間、固定し、そして、ＢＤ Ｐｅｒｍ／Ｗａｓｈ緩衝液で洗浄した。続いて、細胞を、抗グランザイムＢ Ａｌｅｘａｆｌｕｏｒ７００（Ｃｌｏｎｅ ＧＢ１１）で染色し、ＢＤ Ｐｅｒｍ ／Ｗａｓｈ緩衝液で２回洗浄し、そして、ＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁した。ＢＤ ＬＳＲＩＩ－Ｆｏｒｔｅｓｓａでデータを取得し、そして、ＦｌｏｗＪｏ（登録商標）（Ｔｒｅｅ ｓｔａｒ Ｉｎｃ．）を使用して分析をした。
図１０Ａに示したように、図中の左から右に、非形質導入のＴ細胞、空のベクターで形質導入したＴ細胞、抗ＭＳＬＮ－ＣＤ３εＴＦＰ、抗ＭＳＬＮ－２８ζＣＡＲ、または、抗ＭＳＬＮ－４１ＢＢζＣＡＲで形質導入したＴ細胞である。ＭＳＬＮ－細胞と共培養した細胞を最上列に示し、そして、ＭＳＬＮ＋標的細胞と共培養した細胞を最下列に示す。抗ＧｒＢで染色した細胞の数はｘ軸に対応しており、そして、抗ＣＤ８で染色した細胞の数はｙ軸に対応している。示したように、抗メソテリンＣＡＲ及びＴＦＰ構築物を発現するＴ細胞は、ＭＳＬＮ＋細胞と培養することで活性化したが、ＭＳＬＮ－細胞では活性化されなかった。これらの結果を、図１０Ｂに改めて示しており、図中、メソテリンネガティブ（「ＭＳＬＮ－」、白色棒）、及び、メソテリンポジティブ（「ＭＳＬＮ＋」、黒色棒）細胞での各構築物についてのＧｒＢ＋細胞のパーセンテージを示す。これらのデータは、ＭＳＬＮ発現細胞が、Ｔ細胞を特異的に活性化する能力を実証している。
実施例９：ＥＬＩＳＡによるＩＬ－２及びＩＦＮ－γ分泌
同族抗原を担持する細胞の認識と関連するエフェクターＴ細胞活性化と増殖との別の尺度は、インターロイキン－２（ＩＬ－２）及びインターフェロン－ガンマ（ＩＦＮ－γ）などのエフェクターサイトカインの産生である。
ヒトＩＬ－２（カタログ番号ＥＨ２ＩＬ２、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、及び、ＩＦＮ－γ（カタログ番号ＫＨＣ４０１２、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に対するＥＬＩＳＡアッセイを、製品添付文書に記載の通りに行う。ある例では、５０μＬの再構成した標準物または試料を、二連で、９６ウェルプレートの各ウェルに加え、続いて、ビオチン化抗体試薬５０μＬを加える。プレートを数回静かにタップして、これらの試料を混合する。その後、標準物も試料も含まないウェルのすべてに対して標準希釈剤を５０μＬ加え、そして、このプレートを慎重に接着プレートカバーで密封し、その後、室温（２０～２５℃）で、３時間、インキュベートする。次いで、このプレートカバーを外し、プレートの中を空にし、そして、各ウェルに洗浄用緩衝液を満たす。この洗浄手順を合計３回繰り返し、そして、このプレートを、紙タオルやその他の吸収材料にあてる。調製ストレプトアビジン－ＨＲＰ溶液１００μＬを各ウェルに加え、そして、新しいプレートカバーを取り付けた後に、室温で、３０分間、インキュベートする。このプレートカバーを再び外し、このプレートの内容物を廃棄し、そして、ＴＭＢ基質溶液１００μＬを各ウェルに加える。室温の暗所で、３０分間、反応させ、その後、停止液１００μＬを各ウェルに加える。このプレートを評価する。反応停止の３０分以内に、４５０ｎｍ及び５５０ｎｍに設定したＥＬＩＳＡプレートリーダーで吸光度を測定する。４５０ｎｍの値から５５０ｎｍの値を引き、未知の試料のＩＬ－２量を、ＩＬ－２標準曲線から得られる値と比較して計算する。
あるいは、２－プレックスアッセイを、ヒトＩＬ－２磁気ビーズキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＬＨＣ００２１Ｍ）と、ヒトＩＦＮ－γ磁気ビーズキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＬＨＣ４０３１Ｍ）とを具備した、ヒトサイトカイン磁気緩衝液試薬キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＬＨＢ０００１Ｍ）を用いて行う。要するに、２５μＬのヒトＩＬ－２及びＩＦＮ－γ抗体ビーズを、９６ウェルプレートの各ウェルに加え、以下のガイドラインを用いて、すなわち、１ｘ洗浄液の２００μＬで２回洗浄して、プレートを磁気９６ウェルプレートセパレーター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ａ１４１７９）に接触させて置き、ビーズを１分間沈殿させ、そして、液体をデカントして洗浄する。次いで、インキュベーション緩衝液の５０μＬを、プレートの各ウェルに、二連で再構成標準の１００μＬ、または、三連で試料（細胞傷害性アッセイからの上清）の５０μＬとアッセイ用希釈剤の５０μＬとを加えて、合計体積を１５０μＬにする。試料を、暗所にて、軌道半径３ｍｍのオービタルシェーカーを用いて、室温で、２時間、６００ｒｐｍで混合する。同じ洗浄ガイドラインにしたがって、このプレートを洗浄し、そして、１００μＬのヒトＩＬ－２及びＩＦＮ－γビオチン化検出抗体を各ウェルに加える。試料を、暗所にて、軌道半径３ｍｍのオービタルシェーカーを用いて、室温で、１時間、６００ｒｐｍで混合する。同じ洗浄ガイドラインにしたがって、このプレートを洗浄し、ストレプトアビジン－Ｒ－フィコエリトリンの１００μＬを各ウェルに加える。試料を、暗所にて、軌道半径３ｍｍのオービタルシェーカーを用いて、室温で、３０分間、６００ｒｐｍで混合する。同じ洗浄ガイドラインを用いて、このプレートを３回洗浄し、そして、液体をデカントした後に、これらの試料を１ｘ洗浄液の１５０μＬに再懸濁する。これらの試料を、軌道半径３ｍｍのオービタルシェーカーを用いて、６００ｒｐｍで、３分間、混合し、そして、４℃で、一晩保存する。その後、同じ洗浄ガイドラインにしたがって、このプレートを洗浄し、そして、これらの試料を、１ｘ洗浄液の１５０μＬに再懸濁する。
このプレートを、ＭＡＧＰＩＸシステム（Ｌｕｍｉｎｅｘ）、及び、ｘＰＯＮＥＮＴソフトウェアを用いて読み取る。このデータの解析は、標準曲線とサイトカイン濃度を与えるＭＩＬＬＩＰＬＥＸ Ａｎａｌｙｓｔソフトウェアを用いて行う。
非形質導入、または、コントロールのＣＡＲで形質導入されたＴ細胞に対して、抗メソテリンＴＦＰで形質導入したＴ細胞は、内因的にメソテリンを発現する細胞、または、メソテリンで形質導入した細胞のいずれかと共培養した場合に高レベルのＩＬ－２及びＩＦＮ－γの双方を産生し得る。対照的に、メソテリンネガティブ細胞または非形質導入細胞との共培養では、ＴＦＰで形質導入したＴ細胞からサイトカインは殆ど、または、全く放出し得ない。先の細胞傷害性のデータと一致して、代替ヒンジ領域で構築した抗メソテリンＴＦＰは、メソテリンを担持する標的細胞との共培養で、同様の結果をもたらし得る。
先の細胞傷害性のデータと一致して、抗メソテリン－ＣＤ３ε、及び、抗メソテリン－ＣＤ３γは、当該ＴＦＰ構築物で最大レベルのＩＬ－２及びＩＦＮ－γを生じ得る。しかしながら、抗メソテリン－ＣＤ３ε、及び、抗メソテリン－ＣＤ３γＴＦＰで形質導入したＴ細胞によるサイトカイン産生は、これらのＴＦＰが、さらに高レベルの標的細胞の死滅を示しているにもかかわらず、抗メソテリン－２８ζＣＡＲを発現するＴ細胞のそれと同程度であり得る。ＴＦＰは、ＣＡＲよりも効率的に標的細胞を死滅させるが、同程度、または、より低レベルの炎症性サイトカインを放出し得る可能性があるということは、高レベルのこれらサイトカインが、養子ＣＡＲ－Ｔ療法に対する用量制限毒性と関連していることから、ＣＡＲと比べてＴＦＰの潜在的な利点を表している。
例示的な結果を図１１に示す。上記したように、活性化ＰＢＭＣに、２日間連続して、５０ＭＯＩレンチウイルスを形質導入し、そして、増殖させた。形質導入の８日後に、ＰＢＭＣの共培養物を、細胞傷害性培地（フェノールレッドを含まないＲＰＭＩ１６４０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）プラス５％ＡＢ血清（Ｇｅｍｉｎｉ Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ；１００－３１８））において、Ｅ：Ｔが１：１の比率（０．２×１０６個の各細胞型）である標的細胞（ＭＳＬＮを過剰発現するＫ５６２細胞）と組み合わせた。ＢＣＭＡを過剰発現しているＫ５６２細胞を、ネガティブコントロールとして使用した。２４時間後、細胞を、ＩＦＮ－γ（図１１Ａ）、及び、ＩＬ－２（図１１Ｂ）の発現について、上記したようにしてＥＬＩＳＡで分析した。各図において、左から右に、非形質導入のＴ細胞、空のベクターで形質導入したＴ細胞、抗ＭＳＬＮ－ＣＤ３εＴＦＰ、抗ＭＳＬＮ－２８ζＣＡＲ、または、抗ＭＳＬＮ－４１ＢＢζＣＡＲで形質導入したＴ細胞である。ＭＳＬＮ－細胞と共培養した細胞を、白色棒で表しており、また、ＭＳＬＮ＋標的細胞と共培養した細胞は黒色棒で表している。図示した通り、抗メソテリンＣＡＲ及びＴＦＰ構築物を発現するＴ細胞は、ＩＦＮ－γ及びＩＬ－２双方の産生が証明しているように、ＭＳＬＮ－細胞ではなく、ＭＳＬＮ＋細胞と共培養することで活性化されており、ＭＳＬＮ発現細胞が、Ｔ細胞を特異的に活性化する能力をさらに実証している。
実施例１０：フローサイトメトリーによるＣＤ１０７ａの曝露
Ｔ細胞活性化のさらなるアッセイは、休止細胞における細胞質細胞溶解性顆粒の膜に位置するリソソーム関連膜タンパク質（別名、ＬＡＭＰ－１）であるＣＤ１０７ａの表面発現である。エフェクターＴ細胞の脱顆粒、すなわち、細胞溶解活性の必要条件は、活性化誘導の顆粒エキソサイトーシスの後に、ＣＤ１０７ａの細胞表面への動員をもたらす。したがって、ＣＤ１０７ａの曝露は、細胞傷害性と密接に相関するサイトカイン産生に加えて、Ｔ細胞活性化のさらなる尺度を与える。
標的及びエフェクター細胞を、別々に洗浄し、そして、細胞傷害性培地（ＲＰＭＩ＋５％ヒトＡＢ血清＋１％抗生物質抗真菌剤）に再懸濁する。このアッセイは、Ｕ底９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）にて、最終体積１００μＬで、０．５μＬ／ウェルのＰＥ／Ｃｙ７標識抗ヒトＣＤ１０７ａ（ＬＡＭＰ－１）抗体（クローンＨ４Ａ３、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）の存在下、２×１０５個のエフェクター細胞と、２×１０５個の標的細胞とを混合して行う。次いで、これらの培養物を、３７℃、５％ＣＯ２で、１時間、インキュベートする。このインキュベーションの直後に、１：１０希釈の分泌阻害剤モネンシン（１０００ｘ溶液、ＢＤ ＧｏｌｇｉＳｔｏｐ（商標））の１０μＬを、細胞を攪乱しないように慎重に、各ウェルに加える。次いで、これらのプレートを、３７℃、５％ＣＯ２で、さらに２．５時間インキュベートする。このインキュベーションに続いて、これらの細胞を、ＡＰＣ抗ヒトＣＤ３抗体（クローンＵＣＨＴ１、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ＰｅｒＣＰ／Ｃｙ５．５抗ヒトＣＤ８抗体（クローンＳＫ１、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、及び、パシフィックブルー抗ヒトＣＤ４抗体（クローンＲＰＡ－Ｔ４、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で染色し、その後、３７℃、５％ＣＯ２で、３０分間、インキュベートする。次いで、これらの細胞を、ＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄し、（分析に先立って、ＦＡＣＳ緩衝液１００μＬ及びＩＣ固定緩衝液１００ｕｌに再懸濁する。
Ｔ細胞表面でのＣＤ１０７ａの曝露は、フローサイトメトリーによって検出する。フローサイトメトリーは、ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａ（商標）Ｘ２０（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で行い、そして、フローサイトメトリーデータの解析は、ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（Ｔｒｅｅｓｔａｒ，Ｉｎｃ．Ａｓｈｌａｎｄ，ＯＲ）を用いて行う。ＣＤ１０７＋ｖｅであるＣＤ３ゲート内のＣＤ８＋エフェクター細胞の割合を、各エフェクター／標的細胞培養について決定する。
先の細胞傷害性及びサイトカインのデータと一致して、メソテリン発現標的細胞と抗メソテリン－２８ζＣＡＲで形質導入したエフェクターＴ細胞との共培養は、メソテリンネガティブ標的細胞とともにインキュベートしたエフェクターと比較して、表面ＣＤ１０７ａ発現の増加を誘導し得る。同じ条件下で比較すると、抗メソテリン－ＣＤ３ε ＬＬ、または、抗メソテリン－ＣＤ３γ ＬＬ ＴＦＰ発現エフェクターは、ＣＤ１０７ａ発現の５～７倍の誘導を呈し得る。代替ヒンジ領域で構築した抗メソテリンＴＦＰは、メソテリンを担持する標的細胞との共培養で同様の結果をもたらし得る。
実施例１１：インビボでのマウスの有効性の研究
抗メソテリンＴＦＰで形質導入したエフェクターＴ細胞のインビボでの抗腫瘍応答を達成する能力を評価するために、抗メソテリン－２８ζＣＡＲ、抗メソテリン－ＣＤ３εＬＬ ＴＦＰ、または、抗メソテリン－ＣＤ３γＬＬ ＴＦＰのいずれかで形質導入したエフェクターＴ細胞を、予めメソテリン＋ヒト癌細胞株を接種したＮＯＤ／ＳＣＩＤ／ＩＬ－２Ｒγ－／－（ＮＳＧ－ＪＡＸ）マウスに養子移入する。
本研究の開始前に、少なくとも６週齢の雌のＮＯＤ／ＳＣＩＤ／ＩＬ－２Ｒγ－／－（ＮＳＧ－ＪＡＸ）マウスを、Ｔｈｅ Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（ストック番号００５５５７）から入手し、そして、実験的使用の前に３日間、順化する。接種用のヒトメソテリン発現細胞株を、対数期の培養に維持し、その後、採取を行い、そして、トリパンブルーで計数して生細胞数を決定する。腫瘍投与の当日、これらの細胞を、３００ｇで、５分間、遠心分離し、そして、予め温めた滅菌ＰＢＳに、０．５～１×１０６細胞／１００μＬのいずれかで再懸濁する。非形質導入、または、抗メソテリン－２８ζＣＡＲ、抗メソテリン－ＣＤ３εＬＬ ＴＦＰ、または、抗ＣＤ３γＬＬ ＴＦＰ構築物で形質導入した養子移入用のＴ細胞を調製する。本研究の０日目に、実験群あたり１０匹の動物に対して、０．５～１×１０６のメソテリン発現細胞を静脈内投与する。３日後に、滅菌ＰＢＳの１００μＬで、エフェクターＴ細胞集団の５×１０６個を、各動物に対して静脈内に移入する。これら動物における詳細な臨床観察を、安楽死させるまで、毎日、記録する。死亡または安楽死まで、すべての動物に対して、毎週、体重測定を行う。被験物質及び対照物質を養子移入して３５日後に、すべての動物を安楽死させる。本研究中において、瀕死と思われたすべての動物は、獣医師と協議した上で、本研究の責任者の判断で安楽死させる。
非形質導入Ｔ細胞と比較して、抗メソテリン－２８ζＣＡＲ、抗メソテリン－ＣＤ３εＬＬ ＴＦＰ、または、抗メソテリン－ＣＤ３γＬＬ ＴＦＰのいずれかで形質導入したＴ細胞の養子移入は、メソテリンを発現する細胞株腫瘍担持マウスの生存を延長させ、かつ、抗メソテリンＣＡＲ及びＴＦＰで形質導入したＴ細胞の双方が、これらのマウスモデルにおける対応する生存の延長と共に、標的細胞の死滅を媒介することができることを示し得る。まとめると、これらのデータは、ＴＦＰが、インビトロ及びインビボの双方で、第１世代のＣＡＲよりも優れた抗原特異的な死滅を示すキメラ受容体を改変するための代替的なプラットフォームを表す、ということを示し得る。
実施例１２：インビボ固形腫瘍異種移植片マウスモデルでのヒトＴＦＰ Ｔ細胞処置
ヒトメソテリンを発現するＡＬＬ、ＣＬＬ、ＮＨＬ、または、ＭＳＴＯヒト細胞株に由来する皮下固形腫瘍を担持する免疫不全マウスモデルにおいて、ヒトＴＦＰ．メソテリンＴ細胞による処置の有効性を試験することもできる。ヒトＴＦＰ．メソテリンＴ細胞による処置に応答した腫瘍の縮小は、腫瘍サイズのキャリパー測定、あるいは、ＧＦＰ発現腫瘍細胞が放出する緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）シグナルの強度を追跡することで、評価することができる。
初代ヒト固形腫瘍細胞を、それらをインビトロで培養せずとも、免疫不全のマウスにおいて増殖させることができる。例示的な固形癌細胞として、Ｔｈｅ Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｏｍｅ Ａｔｌａｓ（ＴＣＧＡ）、及び／または、ｔｈｅ Ｂｒｏａｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎｅ Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ（ＣＣＬＥ、Ｂａｒｒｅｔｉｎａ ｅｔ ａｌ．， Ｎａｔｕｒｅ ４８３：６０３（２０１２）を参照されたい）に記載されたものなどの固形腫瘍細胞株がある。例示的な固形癌細胞として、中皮腫、腎細胞癌、胃癌、乳癌、肺癌、卵巣癌、前立腺癌、結腸癌、子宮頸癌、脳腫瘍、肝臓癌、膵臓癌、腎臓、子宮内膜、または、胃癌から単離した初代腫瘍細胞がある。幾つかの実施形態では、処置するがんは、中皮腫、乳頭状漿液性卵巣腺癌、明細胞卵巣癌、混合型ミュラー管卵巣癌、子宮内膜粘液性卵巣癌、膵臓腺癌、乳管腺癌、子宮漿液性癌、肺腺癌、肝外胆管癌、胃腺癌、食道腺癌、結腸直腸腺癌、及び、乳腺腺癌からなる群から選択される。これらのマウスは、ヒト腫瘍異種移植片モデルにおけるＴＦＰ．メソテリンＴ細胞の有効性を試験するために使用することができる（例えば、Ｍｏｒｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｐｒｏｃｏｌ．２：２４７（２００７）を参照されたい）。１×１０６～１×１０７個の初代細胞（ＥＣマトリックス材料でのコラゲナーゼ処理したバルク腫瘍懸濁液）、または、腫瘍断片（ＥＣマトリックス材料での初代腫瘍断片）を移植または皮下注射した後に、治療開始前に、腫瘍を、２００～５００ｍｍ３にまで増殖させる。
上記したように、中皮腫異種移植片マウスモデルにおいて、インビボで、ＭＳＬＮ特異的単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）活性の有効性を試験するために、そのような実験の１つを行った。ルシフェラーゼ標識ＭＳＴＯ－２１１Ｈ－ＦＬ－ＭＳＬＮ－Ｌｕｃ）を、マウス当たり１×１０６個の細胞で、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）と１：１の比率で、皮下に接種した。腫瘍体積を、キャリパー測定によって、週に２回、モニターした。腫瘍注射から１４日後に、腫瘍体積が約３００ｍｍ３になったときに、１×１０７個のＴ細胞を、各動物に静脈内注射した。使用したＴ細胞として、ＣＤ３ε－ＳＤ１ ＴＦＰ、ＣＤ３γ－ＳＤ１ ＴＦＰ、ＣＤ３ε－ＳＤ４ ＴＦＰ、ＣＤ３γ－ＳＤ４ ＴＦＰ、ＣＤ２８ζＳＤ１ ＣＡＲ、及び、ＣＤ２８ζＳＤ１ ＣＡＲで形質導入したものがある。Ｔ細胞の注射をしていないマウスの群を、ネガティブコントロールとして使用した。
結果を図１２Ａに示す。ＣＤ３ε－ＳＤ１ ＴＦＰ、及び、ＣＤ３γ－ＳＤ１ ＴＦＰ Ｔ細胞を注射したマウスは、腫瘍体積の最大かつ最速の減少を示したが、Ｔ細胞コントロールを注射したマウスでは、Ｔ細胞を注射した後も、腫瘍体積の減少を示さなかった。
中皮腫異種移植片マウスモデルにおいて生存したマウスを再投与することで、ＳＤ１ε－、及び、γ－ＴＦＰ Ｔ細胞の持続的有効性をインビボで試験した。
マウス１匹あたり１×１０６個の腫瘍細胞（ＭＳＴＯ ２１１Ｈ ＦＬ ＭＳＬＮ Ｌｕｃ）を、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）（１対１の比率）と共に、マウスに皮下接種した。ラージ細胞を注射した１群のマウスを、ネガティブコントロールとし、そして、ＭＳＴＯ細胞のみを注射した１群のマウスも、ネガティブコントロールとした。週に２回、キャリパー測定して、腫瘍体積をモニターした。腫瘍注射をして１４日後（腫瘍体積が約３００ｍｍ３に達したとき）に、１×１０７個のＭＳＴＯ（ＭＳＬＮ＋）、または、ラージ（ＭＳＬＮ－、ネガティブコントロールとして）を、各動物に静脈内注射した。結果を図１２Ｂに示す。図中の各線は、一匹の動物を表している。図示したように、以前に抗ＭＳＬＮ ＴＦＰ Ｔ細胞で処置したマウスは、腫瘍体積を、再び減少させるか、あるいは、腫瘍を根絶できており、このことは、最初に注射したＴ細胞がマウス内で持続していたこと、または、当該マウスが、抗ＭＳＬＮメモリー応答を有することを示している。対照的に、ラージ（ＭＳＬＮ－）細胞を再接種したマウスは、ラージ腫瘍の増殖を制御することができず、したがって、ＴＦＰ Ｔ細胞応答の特異性を示している。
実施例１３：ＭＳＬＮ腫瘍異種移植マウスモデルにおける患者由来のＭＳＬＮε－ＴＦＰ Ｔ細胞のインビボ有効性
卵巣癌患者由来のＳＤ１ε－ＴＦＰ Ｔ細胞を用いて、メソテリン発現腫瘍細胞（ＭＳＴＯ－ＭＳＬＮ－Ｌｕｃ）に対するＳＤ１ε－ＴＦＰ Ｔ細胞のインビトロ及びインビボでの抗腫瘍効果を試験した。
レンチウイルスを、上記したようにして調製した。
卵巣癌患者の全血からのＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞の調製
ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞は、以下のようにして、卵巣癌患者の全血から精製した（概略図を図１３Ａに示す）。卵巣癌患者のヘパリン処理全血の４０～５０ｍＬを採取し、そして、Ｃｏｎｖｅｒｓａｎｔ Ｂｉｏ（Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ，Ａｌａｂａｍａ）より急送した。当該血液を、等容量のＰＢＳで希釈し、そして、５０ｍＬコニカルチューブで、３５ｍＬの希釈全血を、１５ｍＬのＦｉｃｏｌｌ－Ｐａｑｕｅ（登録商標）（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、カタログ番号：１７－５４４２－０２）上に注意深く重層した。次いで、それを、揺動バケットローターにて、ブレーキをかけずに、室温で、２０分間、８００×ｇで遠心分離した。上層を吸引し、単核細胞層（リンパ球、単球、及び、血小板）を間期に撹乱せずに残した。当該単核細胞層を、新たな５０ｍＬコニカルチューブに移し、３０ｍＬのＰＢＳを加え、室温で、１０分間、３００×ｇで遠心分離した。１～２ｍＬのＡＣＫ溶解緩衝液（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、カタログ番号：Ａ１０４９２０１）をペレットに添加し、十分に混合し、そして、室温で、２分間、インキュベートし、２０ｍＬのＰＢＳを添加し、室温で、３００×ｇで、１０分間、遠心分離した。細胞ペレットを、１０ｍＬの氷冷ＭＡＣ緩衝液に再懸濁し、そして、細胞を、Ｃｅｌｌｏｍｅｔｅｒ Ａｕｔｏ ２０００を介して計数した。ＭｉｌｔｅｎｙｉヒトＣＤ４／８マイクロビーズ（カタログ番号：１３０－０４５－１０１；１３０－０４５－２０１）を製造業者の指示に従って使用をして、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋ Ｔ細胞の単離を行った。
ＴＦＰ Ｔ細胞を、上記したようにして産生し、そして、形質導入をＦＡＣＳで決定した。メソテリンの発現は、標的細胞（ＭＳＬＮｈｉｇｈ細胞株ＭＳＴＯ－２１１Ｈ－ＦＬ ＭＳＬＮ（親ＭＳＴＯ－２１１Ｈ、ＡＴＣＣ、ＣＲＬ－２０８１から組織内産生した））で確認しており、また、ＭＳＬＮ－Ｆｃ発現は、ルシフェラーゼアッセイと同日に行ったフローサイトメトリーによって、ＳＤ１ε－ＴＦＰ Ｔで確認した。ルシフェラーゼ標識標的細胞（ＭＳＴＯ－２１１Ｈ－ＦＬ ＭＳＬＮ－Ｌｕｃ、または、ＭＳＬＮ－細胞株Ｃ３０－Ｌｕｃ（Ａ２７８０、Ｓｉｇｍａ））の単一懸濁液を、Ｒ１０培地で調製した。１００μＬにおける１×１０４個の標的細胞を、９６ウェル平底プレートに添加した。ＴＦＰ Ｔ細胞を、示したような異なるエフェクター対標的比（Ｅ：Ｔ）で、１００μＬに加えた。
ＦＡＣＳに基づく形質導入効率及びＴ細胞活性化決定
ＴＦＰ Ｔ細胞を解凍し、脱ビーズ化を行い（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ＋ＩＬ－２条件にてエクスビボで増殖させた場合）、洗浄し、次いで、サイトカインを含まないＴ細胞培養培地に再懸濁した。所望の数のＴ細胞（１００μＬにおいて）を加えて、エフェクター対標的の比率を、それぞれ、５対１、１対１、及び、１対５とした。試験した比率で各タイプのＴ細胞について、３つの複製物を調製した。次いで、細胞を、５％ＣＯ２で、３７℃で、２４時、間培養した。２４時間の共培養をした後に、当該プレートを、３００×ｇで、２分間、遠心分離して細胞を沈降させた。各ウェルからの１００μｌの培養上清を、Ｌｕｍｉｎｅｘアッセイのために慎重に取り出した。Ｂｒｉｇｈｔ－Ｇｌｏ（商標）Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ Ａｓｓａｙ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ、＃Ｅ２６５０）からのアッセイ緩衝液１００μＬを、各ウェルに加えた。各ウェルの内容物を静かに上下にピペッティングして混合した。細胞－試薬の混合物を、３分間、室温で、暗所に放置して、細胞を完全に溶解させた。各ウェルからの２００μＬの細胞溶解物を、Ｇｒｅｉｎｅｒ－Ｏｎｅ白色壁９６ウェルプレートに移した。発光は、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ Ｍ５プレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｄｅｖｉｃｅｓ）で、相対発光単位（ＲＬＵ）を測定した。
腫瘍溶解率（％）は、下記の式で算出した。
発光（腫瘍＋Ｔ細胞）
腫瘍溶解％＝ １００×［１－ －－－－－－－－－－－－－－－－－－］
発光（腫瘍）
Ｌｕｍｉｎｅｘ（登録商標）アッセイ
腫瘍－Ｔ細胞共培養物からの上清を採取し、そして、前記したようにして、－８０℃で保存した。製造業者の指示に従って、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｌｕｍｉｎｅｘキット（ＨＣＤ８ＭＡＧ－１５Ｋ）を用いて、サイトカインプロファイルを検出した。上清を希釈せずにプレーティングし、そして、Ｍａｇｐｉｘ ｘＭＡＰ（登録商標）Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙを用いて読み取り値を測定した。
皮下中皮腫異種移植マウスモデル及びインビボでの評価
この試験では、６週齢の雌ＮＳＧマウス（ＮＯＤ．Ｃｇ－ＰｒｋｄｃｓｃｉｄＩｌ２ｒｇｔｍ１Ｗｊｌ／ＳｚＪ，カタログ番号：００５５５７，Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を使用した。これらの動物を、試験と同じ条件下で、最低３日間、順応させた。ＭＳＴＯ－２１１Ｈ－ＦＬＭＳＬＮ－Ｌｕｃ細胞を、１×１０６細胞／１００μＬの濃度で、無菌ＰＢＳに懸濁した。次いで、ＰＢＳ細胞懸濁液を、氷冷Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）と１対１で混合して、各マウスについて、最終注射容量を２００μＬとした。得られたＰＢＳ／Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）細胞懸濁液を、マウスの後側腹部に皮下投与するまで、氷上に保った。腫瘍増殖は、キャリパー測定を用いて、腫瘍体積としてモニターした。腫瘍体積は、以下のようにして計算した。
腫瘍体積＝１／２（長さ×幅２）
腫瘍細胞を注射して１０日後に、動物を、腫瘍体積（２００～３００ｍｍ３）に応じて無作為化を行い、そして、１０の群に分けて、異なる患者に由来するＳＤ１ε－ＴＦＰ Ｔ細胞を注射した（１群あたりのマウスの数は、注射の日に回収したＳＤ１ε－ＴＦＰ Ｔ細胞の数に応じて変わる）。Ｔ細胞の注射日を、試験の０日目と見なした。Ｔ細胞を、５×１０６細胞／１００μＬの濃度で、無菌ＰＢＳで調製した。次いで、細胞懸濁液を、尾静脈からマウスに静脈内注射した。
卵巣癌患者由来のＳＤ１ε－ＴＦＰ Ｔ細胞のエクスビボ増殖
ＭＳＬＮを標的とするＳＤ１バインダーを有するＴＦＰのＣＤ３εフォーマットをコードするレンチウイルスを用いて、ＭＳＬＮ特異的ｓｄＡｂ ＴＦＰ Ｔ細胞を調製した。１０日目の生存細胞数によって決定された増殖倍率は、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）＋ＩＬ－２を用いて調製した細胞では、０日目と比較して、８．５８～２８．２倍（１７．８±３．３）の範囲であり、そして、ＴｒａｎｓＡｃｔ（登録商標）＋ＩＬ－７／１５を用いて調製した細胞では、０日目と比較して、１０～３３．６倍（２２．９±５．０）であった。ＳＤ１ε－ＴＦＰ Ｔ細胞についての形質導入効率は、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋集団に関するＧＦＰ及びＭＳＬＮ－Ｆｃの存在についての表面染色によって、増殖の１０日目に決定した。形質導入効率は、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ＋ＩＬ－２を用いて調製した細胞では、２８．６％～５２．１％（４０．９±４．０％）であり、そして、ＴｒａｎｓＡｃｔ＋ＩＬ－７／１５を用いて調製した細胞では、５．７％～４６．９％（２６．８±６．３％）の範囲であり、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ＋ＩＬ－２条件と、ＴｒａｎｓＡｃｔ＋ＩＬ－７／１５条件との間で、増殖倍率及び形質導入効率に有意差はなかった。細胞あたりのベクターコピー数は、形質導入効率と一致しており、細胞あたり０．３８のベクターコピー数を有する患者１を除いて、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ＋ＩＬ－２条件、または、ＴｒａｎｓＡｃｔ＋ＩＬ７／１５条件のいずれかにおいても、細胞あたり約１～２コピー数であった。
卵巣癌患者由来のＳＤ１ε－ＴＦＰ Ｔ細胞のインビトロでの抗腫瘍活性
卵巣癌患者由来のＳＤ１ε－ＴＦＰ Ｔ細胞のインビトロでの有効性を、ルシフェラーゼレポーター腫瘍細胞溶解アッセイを用いて試験した。メソテリンの発現は、アッセイ当日に、ＭＳＴＯ－２１１Ｈ－ＦＬＭＳＬＮ－Ｌｕｃ細胞株で確認されており（図１３Ｂ）、すべてのＳＤ１ε－ＴＦＰ Ｔ細胞は、異なるレベルの腫瘍死滅を示した。安定した腫瘍細胞溶解が、患者１、２、４、及び、５で観察された（７５％～９７％）。ＭＳＬＮε－ＴＦＰ Ｔ細胞を、ＭＳＴＯ－２１１Ｈ－ＦＬＭＳＬＮ－Ｌｕｃ（ＭＳＬＮ高発現体）と、５対１のエフェクター対標的の比率で共培養した場合に、患者３は、５対１のエフェクター対標的の比率で、約３５％の腫瘍溶解を示しており、５名の患者のうちの４名（患者１、２、４、及び、５）は、１対１のエフェクター対標的の比率で、平均５０％の腫瘍溶解を示しており、５名の患者のうちの２名（患者４、及び、５）は、１対５のエフェクター対標的の比率で、約５０％の腫瘍溶解を示した。すべてのＴ細胞は、腫瘍細胞を急速に死滅させたことを示した。メソテリンネガティブ細胞株Ｃ３０－Ｌｕｃと共培養した場合、すべてのＭＳＬＮε－ＴＦＰ（商標）Ｔ細胞については、腫瘍溶解は認められなかった（図１３Ｃ）。５名の患者でのＭＳＬＮε－ＴＦＰのサイトカインプロファイルを、ヒトＣＤ８ Ｌｕｍｉｎｅｘ（登録商標）パネルを用いて分析し、ＩＦＮ－γ、ＧＭ－ＣＳＦ、グランザイム－Ａ／Ｂ、ＩＬ－２、ＭＩＰ－１α／β、及び、パーフォリンなどの細胞溶解性サイトカインは、非形質導入Ｔ細胞と比較して、ＭＳＬＮε－ＴＦＰ（商標）Ｔ細胞において、有意に増加した（図１３Ｄ～Ｌ）。
ＭＳＬＮ発現腫瘍マウス異種移植片モデルにおけるＭＳＬＮε－ＴＦＰ Ｔ細胞のインビボでの有効性
ＭＳＴＯ－２１１Ｈ－ＦＬＭＳＬＮ－Ｌｕｃを使用して、皮下異種移植したメソテリン発現腫瘍マウスモデルを確立した。腫瘍体積を、週に２回測定した。腫瘍を注射して１０日後に、平均腫瘍体積は、２００～３００ｍｍ３に達しており、そして、１０日目に、１名の正常ドナー（ＮＤ１２、図１４Ａ）、及び、患者１～４（図１４Ｂ～Ｅ）に由来するＭＳＬＮε－ＴＦＰ Ｔ細胞を増殖し、そして、これらを解凍し、その後に、形質導入効率を確認した。マウス１匹あたり５×１０６個のＭＳＬＮε－ＴＦＰ Ｔ細胞、または、対応する非形質導入Ｔ細胞を、静脈内に注射し、そして、その後に腫瘍の体積をモニターした。４名の患者のうち３名（患者１、２、及び、４）に由来するＭＳＬＮε－ＴＦＰ Ｔ細胞は、Ｔ細胞を注射して２０日後までに完全な腫瘍クリアランスを示した。腫瘍クリアランスは、４０日目まで維持された。６匹のマウスのうち５匹に、患者３に由来するＭＳＬＮε－ＴＦＰ Ｔ細胞を与えると、部分的な防御を示した。ＮＤ１２に由来するＭＳＬＮε－ＴＦＰ Ｔ細胞を投与した４名の患者全員では、１名は完全な腫瘍クリアランスを示し、２人は部分的な腫瘍クリアランスを示した。
文末注
本発明の好ましい実施形態を本明細書に示し説明してきたが、当業者には、かかる実施形態が例としてのみ提供していることは明らかであろう。多くの変形、変更、及び、置換は、本発明から逸脱することなく、当業者には直ちに想起されるであろう。本明細書に記載した本発明の実施形態に対する様々な代替が、本発明の実践において採用される場合があることを理解されたい。以下の特許請求の範囲は、本発明の範囲を規定すること、ならびに、これら特許請求の範囲内の方法、及び、構造、ならびに、それらの等価物が、その適用を受けることを意図している。
本願は以下の発明を包含する。

［項目１］ Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）融合タンパク質（ＴＦＰ）をコードする、単離した組換え核酸分子であって、前記ＴＦＰが、
（ａ）
（ｉ）ＴＣＲ細胞外ドメインの少なくとも一部、及び
（ｉｉ）ＣＤ３εの細胞内シグナル伝達ドメイン由来の刺激ドメインを含むＴＣＲ細胞内ドメインを含む、ＴＣＲサブユニット、及び
（ｂ）抗メソテリン抗原結合ドメインである、抗原結合ドメインを含むヒトまたはヒト化抗体ドメインを含み、
前記ＴＣＲサブユニット及び前記抗体ドメインを、作動可能に連結し、及び、
前記ＴＦＰは、Ｔ細胞で発現する際にＴＣＲを取り込む、前記単離した組換え核酸分子。
［項目２］ Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）融合タンパク質（ＴＦＰ）をコードする、単離した組換え核酸分子であって、前記ＴＦＰが、
（ａ）
（ｉ）ＴＣＲ細胞外ドメインの少なくとも一部、及び、
（ｉｉ）ＣＤ３εの細胞内シグナル伝達ドメイン由来の刺激ドメインを含むＴＣＲ細胞内ドメインを含む、ＴＣＲサブユニット、及び
（ｂ）抗メソテリン抗原結合ドメインである、抗原結合ドメインを含むヒトまたはヒト化抗体ドメインを含み、
前記ＴＣＲサブユニット及び前記抗体ドメインを、作動可能に連結し、及び、
前記ＴＦＰは、Ｔ細胞で発現する際にＴＣＲを取り込む、前記単離した組換え核酸分子。
［項目３］ Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）融合タンパク質（ＴＦＰ）をコードする、単離した組換え核酸分子であって、前記ＴＦＰが、
（ａ）
（ｉ）ＴＣＲ細胞外ドメインの少なくとも一部、及び
（ｉｉ）ＣＤ３γの細胞内シグナル伝達ドメイン由来の刺激ドメインを含むＴＣＲ細胞内ドメインを含む、ＴＣＲサブユニット、及び
（ｂ）抗メソテリン抗原結合ドメインである、抗原結合ドメインを含むヒトまたはヒト化抗体ドメインを含み、
前記ＴＣＲサブユニット及び前記抗体ドメインを、作動可能に連結し、及び、
前記ＴＦＰは、Ｔ細胞で発現する際にＴＣＲを取り込む、前記単離した組換え核酸分子。
［項目４］ Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）融合タンパク質（ＴＦＰ）をコードする、単離した組換え核酸分子であって、前記ＴＦＰが、
（ａ）
（ｉ）ＴＣＲ細胞外ドメインの少なくとも一部、及び
（ｉｉ）ＣＤ３δの細胞内シグナル伝達ドメイン由来の刺激ドメインを含むＴＣＲ細胞内ドメインを含む、ＴＣＲサブユニット、及び
（ｂ）抗メソテリン抗原結合ドメインである、抗原結合ドメインを含むヒトまたはヒト化抗体ドメインを含み、
前記ＴＣＲサブユニット及び前記抗体ドメインを、作動可能に連結し、及び、
前記ＴＦＰは、Ｔ細胞で発現する際にＴＣＲを取り込む、前記単離した組換え核酸分子。
［項目５］ Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）融合タンパク質（ＴＦＰ）をコードする、単離した組換え核酸分子であって、前記ＴＦＰが、
（ａ）
（ｉ）ＴＣＲ細胞外ドメインの少なくとも一部、及び
（ｉｉ）ＴＣＲαの細胞内シグナル伝達ドメイン由来の刺激ドメインを含むＴＣＲ細胞内ドメインを含む、ＴＣＲサブユニット、及び
（ｂ）抗メソテリン抗原結合ドメインである、抗原結合ドメインを含むヒトまたはヒト化抗体ドメインを含み、
前記ＴＣＲサブユニット及び前記抗体ドメインを、作動可能に連結し、及び、
前記ＴＦＰは、Ｔ細胞で発現する際にＴＣＲを取り込む、前記単離した組換え核酸分子。
［項目６］ Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）融合タンパク質（ＴＦＰ）をコードする、単離した組換え核酸分子であって、前記ＴＦＰが、
（ａ）
（ｉ）ＴＣＲ細胞外ドメインの少なくとも一部、及び
（ｉｉ）ＴＣＲβの細胞内シグナル伝達ドメイン由来の刺激ドメインを含むＴＣＲ細胞内ドメインを含む、ＴＣＲサブユニット、及び
（ｂ）抗メソテリン抗原結合ドメインである、抗原結合ドメインを含むヒトまたはヒト化抗体ドメインを含み、
前記ＴＣＲサブユニット及び前記抗体ドメインを、作動可能に連結し、及び、
前記ＴＦＰは、Ｔ細胞で発現する際にＴＣＲを取り込む、前記単離した組換え核酸分子。
［項目７］ Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）融合タンパク質（ＴＦＰ）をコードする単離した組換え核酸分子であって、ＴＣＲサブユニットと、抗メソテリン抗原結合ドメインである、抗原結合ドメインを含むヒトまたはヒト化抗体ドメインとを含む、前記単離した組換え核酸分子。
［項目８］ 前記ＴＣＲサブユニット、及び、前記抗体ドメインを、作動可能に連結する、項目７に記載の単離した組換え核酸分子。
［項目９］ 前記ＴＦＰは、Ｔ細胞で発現する際にＴＣＲを取り込む、項目７または８に記載の単離した組換え核酸分子。
［項目１０］ 前記コードした抗原結合ドメインを、リンカー配列で前記ＴＣＲ細胞外ドメインに連結する、項目１～９のいずれか１項に記載の単離した組換え核酸分子。
［項目１１］ 前記コードしたリンカー配列が、（Ｇ ４ Ｓ） ｎ を含み、式中、ｎ＝１～４である、項目１０に記載の単離した組換え核酸分子。
［項目１２］ 前記ＴＣＲサブユニットが、ＴＣＲ細胞外ドメインを含む、項目１～１１のいずれか１項に記載の単離した組換え核酸分子。
［項目１３］ 前記ＴＣＲサブユニットが、ＴＣＲ膜貫通ドメインを含む、項目１～１２のいずれか１項に記載の単離した組換え核酸分子。
［項目１４］ 前記ＴＣＲサブユニットが、ＴＣＲ細胞内ドメインを含む、項目１～１３のいずれか１項に記載の単離した組換え核酸分子。
［項目１５］ 前記ＴＣＲサブユニットが、（ｉ）ＴＣＲ細胞外ドメイン、（ｉｉ）ＴＣＲ膜貫通ドメイン、及び、（ｉｉｉ）ＴＣＲ細胞内ドメインを含み、（ｉ）、（ｉｉ）、及び、（ｉｉｉ）の少なくとも２つが、同じＴＣＲサブユニットに由来する、項目１～１４のいずれか１項に記載の単離した組換え核酸分子。
［項目１６］ 前記ＴＣＲサブユニットが、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、もしくはＣＤ３δの細胞内シグナル伝達ドメインから選択される刺激ドメインを含むＴＣＲ細胞内ドメイン、または、それらに対する少なくとも１つの修飾を有するアミノ酸配列を含む、項目１～１５のいずれか１項に記載の単離した組換え核酸分子。
［項目１７］ 前記ＴＣＲサブユニットが、４－１ＢＢの機能的シグナル伝達ドメイン、及び／または、ＣＤ３ζの機能的シグナル伝達ドメインから選択される刺激ドメインを含む細胞内ドメイン、または、それらに対する少なくとも１つの修飾を有するアミノ酸配列を含む、項目１～１６のいずれか１項に記載の単離した組換え核酸分子。
［項目１８］ 前記ヒトまたはヒト化抗体ドメインが、抗体断片を含む、項目１～１７のいずれか１項に記載の単離した組換え核酸分子。
［項目１９］ 前記ヒトまたはヒト化抗体ドメインが、ｓｃＦｖまたはＶ Ｈ ドメインを含む、項目１～１８のいずれか１項に記載の単離した組換え核酸分子。
［項目２０］ 前記ヒトまたはヒト化抗体ドメインが、ｓｄＡｂまたはＶ ＨＨ ドメインを含む、項目１～１９のいずれか１項に記載の単離した組換え核酸分子。
［項目２１］ （ｉ）本明細書に記載した抗メソテリン軽鎖結合ドメインの軽鎖（ＬＣ）ＣＤＲ１、ＬＣ ＣＤＲ２、及び、ＬＣ ＣＤＲ３に対して、それぞれ、７０～１００％の配列同一性を有する、抗メソテリン軽鎖結合ドメインアミノ酸配列の軽鎖（ＬＣ）ＣＤＲ１、ＬＣ ＣＤＲ２、及び、ＬＣ ＣＤＲ３、及び／または、（ｉｉ）本明細書に記載した抗メソテリン重鎖結合ドメインの重鎖（ＨＣ）ＣＤＲ１、ＨＣ ＣＤＲ２、及び、ＨＣ ＣＤＲ３に対して、それぞれ、７０～１００％の配列同一性を有する、抗メソテリン重鎖結合ドメインアミノ酸配列の重鎖（ＨＣ）ＣＤＲ１、ＨＣ ＣＤＲ２、及び、ＨＣ ＣＤＲ３をコードする、項目１～２０のいずれか１項に記載の単離した組換え核酸分子。
［項目２２］ 軽鎖可変領域をコードする項目１～２１のいずれか１項に記載の単離した組換え核酸分子であって、前記軽鎖可変領域が、本明細書に記載した軽鎖可変領域の軽鎖可変領域アミノ酸配列の少なくとも１つ、最大で３０個までの修飾を有するアミノ酸配列、または、本明細書に記載した軽鎖可変領域の軽鎖可変領域アミノ酸配列に対して９５～９９％が同一である配列を含む、前記単離した組換え核酸分子。
［項目２３］ 重鎖可変領域をコードする項目１～２２のいずれか１項に記載の単離した組換え核酸分子であって、前記重鎖可変領域が、本明細書に記載した重鎖可変領域の重鎖可変領域アミノ酸配列の少なくとも１つ、最大で３０個までの修飾を有するアミノ酸配列、または、本明細書に記載した重鎖可変領域の重鎖可変領域アミノ酸配列に対して９５～９９％が同一である配列を含む、前記単離した組換え核酸分子。
［項目２４］ 重鎖可変領域をコードする項目１～２３のいずれか１項に記載の単離した組換え核酸分子であって、前記重鎖可変領域が、本明細書に記載した重鎖可変領域の重鎖可変領域アミノ酸配列の少なくとも１つ、最大で３０個までの修飾を有するアミノ酸配列、または、本明細書に記載したＶ ＨＨ 領域の単一ドメイン抗体アミノ酸配列に対して９５～９９％が同一である配列を含む、前記単離した組換え核酸分子。
［項目２５］ 前記Ｖ ＨＨ 領域の前記配列が、本明細書に記載した配列に記載のものである、項目２４に記載の単離した組換え核酸分子。
［項目２６］ 前記ＴＦＰが、ＴＣＲα鎖、ＴＣＲβ鎖、ＣＤ３εＴＣＲサブユニット、ＣＤ３γＴＣＲサブユニット、ＣＤ３δＴＣＲサブユニット、それらの機能的断片、及び、少なくとも１つ、最大で２０個までの修飾を有するそれらのアミノ酸配列からなる群から選択されるタンパク質の細胞外ドメインまたはそれらの一部を含むＴＣＲサブユニットの細胞外ドメインを含む、項目１～２３のいずれか１項に記載の単離した組換え核酸分子。
［項目２７］ 前記コードしたＴＦＰが、ＴＣＲα鎖、ＴＣＲβ鎖、ＣＤ３εＴＣＲサブユニット、ＣＤ３γＴＣＲサブユニット、ＣＤ３δＴＣＲサブユニット、それらの機能的断片、及び、少なくとも１つ、最大で２０個までの修飾を有するそれらのアミノ酸配列からなる群から選択されるタンパク質の膜貫通ドメインを含む膜貫通ドメインを含む、項目１～２６のいずれか１項に記載の単離した組換え核酸分子。
［項目２８］ 前記コードしたＴＦＰが、ＴＣＲα鎖、ＴＣＲβ鎖、ＴＣＲζ鎖、ＣＤ３εＴＣＲサブユニット、ＣＤ３γＴＣＲサブユニット、ＣＤ３δＴＣＲサブユニット、ＣＤ４５、ＣＤ２、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ２８、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４、それらの機能的断片、及び、少なくとも１つ、最大で２０個までの修飾を有するそれらのアミノ酸配列からなる群から選択されるタンパク質の膜貫通ドメインを含む膜貫通ドメインを含む、項目１～２７のいずれか１項に記載の単離した組換え核酸分子。
［項目２９］ 共刺激ドメインをコードする配列をさらに含む、項目１～２８のいずれか１項に記載の単離した組換え核酸分子。
［項目３０］ 前記共刺激ドメインが、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＣＤ３０、ＬＩＧＨＴ、ＯＸ４０、ＣＤ２、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ－１、ＬＦＡ－１（ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８）、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）、及び、４－１ＢＢ（ＣＤ１３７）、及び、それらに対する少なくとも１つ、最大で２０個までの修飾を有するそれらのアミノ酸配列からなる群から選択されるタンパク質から得られる機能的シグナル伝達ドメインである、項目２９に記載の単離した組換え核酸分子。
［項目３１］ それらに対する少なくとも１つ、最大で２０個までの前記修飾が、細胞のシグナル伝達を媒介するアミノ酸の修飾、または、前記ＴＦＰへのリガンド結合に反応してリン酸化するアミノ酸の修飾を含む、項目１～３０のいずれか１項に記載の単離した組換え核酸分子。
［項目３２］ ｍＲＮＡである、項目１～３１のいずれか１項に記載の単離した組換え核酸分子。
［項目３３］ 前記ＴＦＰが、ＴＣＲサブユニットの免疫受容体活性化チロシンモチーフ（ＩＴＡＭ）を含み、前記サブユニットが、ＣＤ３ζＴＣＲサブユニット、ＣＤ３εＴＣＲサブユニット、ＣＤ３γＴＣＲサブユニット、ＣＤ３δＴＣＲサブユニット、ＴＣＲζ鎖、Ｆｃε受容体１鎖、Ｆｃε受容体２鎖、Ｆｃγ受容体１鎖、Ｆｃγ受容体２ａ鎖、Ｆｃγ受容体２ｂ１鎖、Ｆｃγ受容体２ｂ２鎖、Ｆｃγ受容体３ａ鎖、Ｆｃγ受容体３ｂ鎖、Ｆｃβ受容体１鎖、ＴＹＲＯＢＰ（ＤＡＰ１２）、ＣＤ５、ＣＤ１６ａ、ＣＤ１６ｂ、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ３２、ＣＤ６４、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ８９、ＣＤ２７８、ＣＤ６６ｄ、それらの機能的断片、及び、それらに対する少なくとも１つ、最大で２０個までの修飾を有するそれらのアミノ酸配列からなる群から選択されるタンパク質のＩＴＡＭ、または、それらの一部を含む、項目１～３２のいずれか１項に記載の単離した組換え核酸分子。
［項目３４］ 前記ＩＴＡＭが、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、または、ＣＤ３εのＩＴＡＭを置き換える、項目３３に記載の単離した組換え核酸分子。
［項目３５］ 前記ＩＴＡＭが、ＣＤ３ζＴＣＲサブユニット、ＣＤ３εＴＣＲサブユニット、ＣＤ３γＴＣＲサブユニット、及び、ＣＤ３δＴＣＲサブユニットからなる群から選択され、かつ、ＣＤ３ζＴＣＲサブユニット、ＣＤ３εＴＣＲサブユニット、ＣＤ３γＴＣＲサブユニット、及び、ＣＤ３δＴＣＲサブユニットからなる群から選択される異なるＩＴＡＭを置き換える、項目３３に記載の単離した組換え核酸分子。
［項目３６］ 前記核酸が、ヌクレオチド類似体を含む、項目１～３５のいずれか１項に記載の単離した組換え核酸分子。
［項目３７］ 前記ヌクレオチド類似体が、２’－Ｏ－メチル、２’－Ｏ－メトキシエチル（２’－Ｏ－ＭＯＥ）、２’－Ｏ－アミノプロピル、２’－デオキシ、Ｔ－デオキシ－２’－フルオロ、２’－Ｏ－アミノプロピル（２’－Ｏ－ＡＰ）、２’－Ｏ－ジメチルアミノエチル（２’－Ｏ－ＤＭＡＯＥ）、２’－Ｏ－ジメチルアミノプロピル（２’－Ｏ－ＤＭＡＰ）、Ｔ－Ｏ－ジメチルアミノエチルオキシエチル（２’－Ｏ－ＤＭＡＥＯＥ）、修飾をした２’－Ｏ－Ｎ－メチルアセトアミド（２’－Ｏ－ＮＭＡ）、ロックド核酸（ＬＮＡ）、エチレン核酸（ＥＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、１’，５’－アンヒドロヘキシトール核酸（ＨＮＡ）、モルホリノ、メチルホスホン酸ヌクレオチド、チオールホスホン酸ヌクレオチド、及び、２’－フルオロＮ３－Ｐ５’－ホスホルアミダイトからなる群から選択される、項目３６に記載の単離した組換え核酸分子。
［項目３８］ リーダー配列をさらに含む、項目１～３７のいずれか１項に記載の単離した組換え核酸分子。
［項目３９］ 前記核酸がコードする抗メソテリン結合ドメインである抗原結合ドメイン、または、前記抗メソテリン結合ドメインを含む抗体、または、前記核酸がコードする前記抗メソテリン結合ドメインを発現する細胞を含む、前記ヒトまたはヒト化抗体ドメインは、最大で、約２００ｎＭ、１００ｎＭ、７５ｎＭ、５０ｎＭ、２５ｎＭ、２０ｎＭ、１５ｎＭ、１４ｎＭ、１３ｎＭ、１２ｎＭ、１１ｎＭ、１０ｎＭ、９ｎＭ、８ｎＭ、７ｎＭ、６ｎＭ、５ｎＭ、４ｎＭ、３ｎＭ、２ｎＭ、１ｎＭ、０．９ｎＭ、０．８ｎＭ、０．７ｎＭ、０．６ｎＭ、０．５ｎＭ、０．４ｎＭ、０．３ｎＭ、０．２ｎＭ、０．１ｎＭ、０．０９ｎＭ、０．０８ｎＭ、０．０７ｎＭ、０．０６ｎＭ、０．０５ｎＭ、０．０４ｎＭ、０．０３ｎＭ、０．０２ｎＭ、または、０．０１ｎＭ、及び／または、少なくとも約１００ｎＭ、７５ｎＭ、５０ｎＭ、２５ｎＭ、２０ｎＭ、１５ｎＭ、１４ｎＭ、１３ｎＭ、１２ｎＭ、１１ｎＭ、１０ｎＭ、９ｎＭ、８ｎＭ、７ｎＭ、６ｎＭ、５ｎＭ、４ｎＭ、３ｎＭ、２ｎＭ、１ｎＭ、０．９ｎＭ、０．８ｎＭ、０．７ｎＭ、０．６ｎＭ、０．５ｎＭ、０．４ｎＭ、０．３ｎＭ、０．２ｎＭ、０．１ｎＭ、０．０９ｎＭ、０．０８ｎＭ、０．０７ｎＭ、０．０６ｎＭ、０．０５ｎＭ、０．０４ｎＭ、０．０３ｎＭ、０．０２ｎＭ、または、０．０１ｎＭ、及び／または、約２００ｎＭ、１００ｎＭ、７５ｎＭ、５０ｎＭ、２５ｎＭ、２０ｎＭ、１５ｎＭ、１４ｎＭ、１３ｎＭ、１２ｎＭ、１１ｎＭ、１０ｎＭ、９ｎＭ、８ｎＭ、７ｎＭ、６ｎＭ、５ｎＭ、４ｎＭ、３ｎＭ、２ｎＭ、１ｎＭ、０．９ｎＭ、０．８ｎＭ、０．７ｎＭ、０．６ｎＭ、０．５ｎＭ、０．４ｎＭ、０．３ｎＭ、０．２ｎＭ、０．１ｎＭ、０．０９ｎＭ、０．０８ｎＭ、０．０７ｎＭ、０．０６ｎＭ、０．０５ｎＭ、０．０４ｎＭ、０．０３ｎＭ、０．０２ｎＭ、または、０．０１ｎＭの親和性値を有する、項目１～３８のいずれか１項に記載の単離した組換え核酸分子。
［項目４０］ 項目１～３９のいずれか１項に記載の単離した組換え核酸分子がコードした単離したポリペプチド分子。
［項目４１］ ヒトまたはヒト化抗メソテリン結合ドメイン、ＴＣＲ細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び、細胞内ドメインを含む単離した組換えＴＦＰ分子。
［項目４２］ ヒトまたはヒト化抗メソテリン結合ドメイン、ＴＣＲ細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び、細胞内シグナル伝達ドメインを含む単離した組換えＴＦＰ分子であって、前記ＴＦＰ分子が、内因性ＴＣＲ複合体、及び／または、少なくとも１つの内因性ＴＣＲポリペプチドと機能的に相互作用することができる、前記単離した組換えＴＦＰ分子。
［項目４３］ ヒトまたはヒト化抗メソテリン結合ドメイン、ＴＣＲ細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び、細胞内シグナル伝達ドメインを含む単離した組換えＴＦＰ分子であって、前記ＴＦＰ分子が、内因性ＴＣＲ複合体に機能的に統合することができる、前記単離した組換えＴＦＰ分子。
［項目４４］ ヒトまたはヒト化抗メソテリン結合ドメイン、ＴＣＲ細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び、細胞内ドメインを含む抗体または抗体断片を含む、項目４１に記載の単離した組換えＴＦＰ分子。
［項目４５］ 前記抗メソテリン結合ドメインが、ｓｃＦｖまたはＶ Ｈ ドメインである、項目４１～４４のいずれか１項に記載の単離した組換えＴＦＰ分子。
［項目４６］ 前記抗メソテリン結合ドメインが、本明細書に記載した抗メソテリン軽鎖のアミノ酸配列、その機能的断片、または、少なくとも１つ、最大で３０個までの修飾を有するそれらのアミノ酸配列に対して９５～１００％の同一性を有する重鎖を含む、項目４１～４５のいずれか１項に記載の単離した組換えＴＦＰ分子。
［項目４７］ 前記抗メソテリン結合ドメインが、本明細書に記載した抗メソテリン重鎖のアミノ酸配列、その機能的断片、または、少なくとも１つ、最大で３０個までの修飾を有するそれらのアミノ酸配列に対して９５～１００％の同一性を有する軽鎖を含む、項目４１～４６のいずれか１項に記載の単離した組換えＴＦＰ分子。
［項目４８］ ＴＣＲα鎖、ＴＣＲβ鎖、ＣＤ３εＴＣＲサブユニット、ＣＤ３γＴＣＲサブユニット、ＣＤ３δＴＣＲサブユニット、それらの機能的断片、及び、少なくとも１つ、最大で２０個までの修飾を有するそれらのアミノ酸配列からなる群から選択されるタンパク質の細胞外ドメインまたはその一部を含むＴＣＲ細胞外ドメインを含む、項目４１～４７のいずれか１項に記載の単離した組換えＴＦＰ分子。
［項目４９］ 前記ＴＣＲが、Ｔ細胞受容体の前記α鎖または前記β鎖、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、または、ＣＤ３γからなる群から選択されるタンパク質の細胞外ドメインまたはその一部を含む、項目４１～４８のいずれか１項に記載の単離した組換えＴＦＰ分子。
［項目５０］ 前記抗メソテリン結合ドメインを、リンカー配列によって、前記ＴＣＲ細胞外ドメインに連結する、項目４１～４９のいずれか１項に記載の単離した組換えＴＦＰ分子。
［項目５１］ 前記リンカー領域が、（Ｇ ４ Ｓ） ｎ を含み、式中、ｎ＝１～４である、項目５０に記載の単離した組換えＴＦＰ分子。
［項目５２］ 共刺激ドメインをコードする配列をさらに含む、項目４１～５１のいずれか１項に記載の単離した組換えＴＦＰ分子。
［項目５３］ 細胞内シグナル伝達ドメインをコードする配列をさらに含む、項目４１～５２のいずれか１項に記載の単離した組換えＴＦＰ分子。
［項目５４］ リーダー配列をさらに含む、項目４１～５３のいずれか１項に記載の単離した組換えＴＦＰ分子。
［項目５５］ 項目４１～５４のいずれか１項に記載のＴＦＰをコードする配列を含む核酸。
［項目５６］ 前記核酸が、ＤＮＡ及びＲＮＡからなる群から選択される、項目５５に記載の核酸。
［項目５７］ 前記核酸が、ｍＲＮＡである、項目５５または５６に記載の核酸。
［項目５８］ 前記核酸が、ヌクレオチド類似体を含む、項目５５～５７のいずれか１項に記載の核酸。
［項目５９］ 前記ヌクレオチド類似体が、２’－Ｏ－メチル、２’－Ｏ－メトキシエチル（２’－Ｏ－ＭＯＥ）、２’－Ｏ－アミノプロピル、２’－デオキシ、Ｔ－デオキシ－２’－フルオロ、２’－Ｏ－アミノプロピル（２’－Ｏ－ＡＰ）、２’－Ｏ－ジメチルアミノエチル（２’－Ｏ－ＤＭＡＯＥ）、２’－Ｏ－ジメチルアミノプロピル（２’－Ｏ－ＤＭＡＰ）、Ｔ－Ｏ－ジメチルアミノエチルオキシエチル（２’－Ｏ－ＤＭＡＥＯＥ）、修飾をした２’－Ｏ－Ｎ－メチルアセトアミド（２’－Ｏ－ＮＭＡ）、ロックド核酸（ＬＮＡ）、エチレン核酸（ＥＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、１’，５’－アンヒドロヘキシトール核酸（ＨＮＡ）、モルホリノ、メチルホスホン酸ヌクレオチド、チオールホスホン酸ヌクレオチド、及び、２’－フルオロＮ３－Ｐ５’－ホスホルアミダイトからなる群から選択される、項目５８に記載の核酸。
［項目６０］ プロモーターをさらに含む、項目５５～５９のいずれか１項に記載の核酸。
［項目６１］ 前記核酸が、インビトロで転写した核酸である、項目５５～６０のいずれか１項に記載の核酸。
［項目６２］ ポリ（Ａ）尾部をコードする配列をさらに含む、項目５５～６１のいずれか１項に記載の核酸。
［項目６３］ ３’ＵＴＲ配列をさらに含む、項目５５～６２のいずれか１項に記載の核酸。
［項目６４］ 項目４１～５４のいずれか１項に記載のＴＦＰをコードする核酸分子を含むベクター。
［項目６５］ ＤＮＡ、ＲＮＡ、プラスミド、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ベクター、または、レトロウイルスベクターからなる群から選択される、項目６４に記載のベクター。
［項目６６］ プロモーターをさらに含む、項目６４または６５に記載のベクター。
［項目６７］ インビトロで転写したベクターである、項目６４～６６のいずれか１項に記載のベクター。
［項目６８］ 前記ベクターの核酸配列が、ポリ（Ａ）尾部をさらに含む、項目６４～６７のいずれか１項に記載のベクター。
［項目６９］ 前記ベクターの核酸配列が、３’ＵＴＲをさらに含む、項目６４～６８のいずれか１項に記載のベクター。
［項目７０］ 項目１～３９のいずれか１項に記載の単離した組換え核酸分子、項目４０に記載の前記ポリペプチド分子、項目４１～５４のいずれか１項に記載のＴＦＰ分子、項目５５～６３のいずれか１項に記載の核酸、項目６４～６９のいずれか１項に記載のベクターを含む細胞。
［項目７１］ 前記細胞が、ヒトＴ細胞である、項目７０に記載の細胞。
［項目７２］ 前記Ｔ細胞が、ＣＤ８＋またはＣＤ４＋Ｔ細胞である、項目７１に記載の細胞。
［項目７３］ 前記Ｔ細胞が、γδＴ細胞である、項目７１に記載の細胞。
［項目７４］ 前記Ｔ細胞が、ＮＫＴ細胞である、項目７１に記載の細胞。
［項目７５］ 阻害分子の少なくとも一部を含む第１のポリペプチドを含み、細胞内シグナル伝達ドメインからのポジティブシグナルを含む第２のポリペプチドと会合した阻害分子をコードする核酸をさらに含む、項目７０～７３のいずれか１項に記載の細胞。
［項目７６］ 前記阻害分子が、ＰＤ１の少なくとも一部を含む第１のポリペプチドと、共刺激ドメイン及び一次シグナル伝達ドメインを含む第２のポリペプチドとを含む、項目７５に記載の細胞。
［項目７７］ 少なくとも２つのＴＦＰ分子を含むヒトＣＤ８＋またはＣＤ４＋Ｔ細胞であって、前記ＴＦＰ分子が、ヒトまたはヒト化抗メソテリン結合ドメイン、ＴＣＲ細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び、細胞内ドメインを含み、前記ＴＦＰ分子が、前記ヒトＣＤ８＋またはＣＤ４＋Ｔ細胞において、前記ヒトＣＤ８＋またはＣＤ４＋Ｔ細胞にて、及び／または、前記ヒトＣＤ８＋またはＣＤ４＋Ｔ細胞の表面で、内因性ＴＣＲ複合体、及び／または、少なくとも１つの内因性ＴＣＲポリペプチドと機能的に相互作用することができる、前記ヒトＣＤ８＋またはＣＤ４＋Ｔ細胞。
［項目７８］ タンパク質複合体であって、
ｉ）ヒトまたはヒト化抗メソテリン結合ドメイン、ＴＣＲ細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び、細胞内ドメインを含むＴＦＰ分子、及び
ｉｉ）少なくとも１つの内因性ＴＣＲサブユニット、または、内因性ＴＣＲ複合体、を含む前記タンパク質複合体。
［項目７９］ 前記ＴＣＲが、ＴＣＲα鎖、ＴＣＲβ鎖、ＣＤ３εＴＣＲサブユニット、ＣＤ３γＴＣＲサブユニット、及び、ＣＤ３δＴＣＲサブユニットからなる群から選択されるタンパク質の細胞外ドメイン、または、それらの一部を含む、項目７８に記載のタンパク質複合体。
［項目８０］ 前記抗メソテリン結合ドメインを、リンカー配列で前記ＴＣＲ細胞外ドメインに連結する、項目７８または７９に記載のタンパク質複合体。
［項目８１］ 前記リンカー領域が、（Ｇ ４ Ｓ） ｎ を含み、式中、ｎ＝１～４である、項目８０に記載のタンパク質複合体。
［項目８２］ タンパク質複合体であって、
（ａ）項目１～３９のいずれか１項に記載の単離した組換え核酸分子がコードしたＴＦＰ、及び
（ｂ）少なくとも１つの内因性ＴＣＲサブユニットまたは内因性ＴＣＲ複合体、を含む前記タンパク質複合体。
［項目８３］ 項目７８～８２のいずれか１項に記載のタンパク質複合体あたり、少なくとも２つの異なるＴＦＰタンパク質を含む、ヒトＣＤ８＋またはＣＤ４＋Ｔ細胞。
［項目８４］ 項目１～３９のいずれか１項に記載の単離した組換え核酸分子がコードした少なくとも２つの異なるＴＦＰ分子を含む、ヒトＣＤ８＋またはＣＤ４＋Ｔ細胞。
［項目８５］ ヒトＣＤ８＋またはＣＤ４＋Ｔ細胞の集団であって、前記集団のＴ細胞が、個々に、または、集合的に、少なくとも２つのＴＦＰ分子を含み、前記ＴＦＰ分子が、ヒトまたはヒト化抗メソテリン結合ドメイン、ＴＣＲ細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、及び、細胞内ドメインを含み、前記ＴＦＰ分子が、前記ヒトＣＤ８＋またはＣＤ４＋Ｔ細胞において、前記ヒトＣＤ８＋またはＣＤ４＋Ｔ細胞にて、及び／または、前記ヒトＣＤ８＋またはＣＤ４＋Ｔ細胞の表面で、内因性ＴＣＲ複合体、及び／または、少なくとも１つの内因性ＴＣＲポリペプチドと機能的に相互作用することができる、前記ヒトＣＤ８＋またはＣＤ４＋Ｔ細胞の集団。
［項目８６］ ヒトＣＤ８＋またはＣＤ４＋Ｔ細胞の集団であって、前記集団のＴ細胞が、個々に、または、集合的に、項目１～３９のいずれか１項に記載の単離した組換え核酸分子がコードした少なくとも２つのＴＦＰ分子を含む、前記ヒトＣＤ８＋またはＣＤ４＋Ｔ細胞の集団。
［項目８７］ 項目１～３９のいずれか１項に記載の単離した組換え核酸分子、項目５５～６３のいずれか１項に記載の核酸、または、項目６４～６９のいずれか１項に記載のベクターを用いて、Ｔ細胞に形質導入する、ことを含む細胞の作製方法。
［項目８８］ インビトロで転写したＲＮＡまたは合成ＲＮＡを細胞に導入することを含む、ＲＮＡ改変細胞集団の生成方法であって、前記ＲＮＡが、項目４１～５４のいずれか１項に記載の単離した組換えＴＦＰ分子をコードする核酸を含む、前記方法。
［項目８９］ 哺乳動物に抗腫瘍免疫を付与する方法であって、前記哺乳動物に対して、有効量の項目１～３９のいずれか１項に記載の単離した組換え核酸分子、項目４０に記載の単離したポリペプチド分子、項目４０に記載の単離したポリペプチド分子を発現する細胞、項目４１～５４のいずれか１項に記載の単離した組換えＴＦＰ分子、項目５５～６３のいずれか１項に記載の核酸、項目６４～６９のいずれか１項に記載のベクター、または、項目７０～７７及び８３～８７のいずれか１項に記載の細胞を投与することを含む、前記方法。
［項目９０］ 前記細胞が、自己Ｔ細胞である、項目８９に記載の方法。
［項目９１］ 前記細胞が、同種異系Ｔ細胞である、項目８９に記載の方法。
［項目９２］ 前記哺乳動物が、ヒトである、項目８９～９１のいずれか１項に記載の方法。
［項目９３］ メソテリンの発現に関連した疾患を有する哺乳動物を処置する方法であって、前記哺乳動物に対して、有効量の項目１～３９のいずれか１項に記載の単離した組換え核酸分子、項目４０に記載の単離したポリペプチド分子、項目４０に記載の単離したポリペプチド分子を発現する細胞、項目４１～５４のいずれか１項に記載の単離した組換えＴＦＰ分子、項目５５～６３のいずれか１項に記載の核酸、項目６４～６９のいずれか１項に記載のベクター、または、項目７０～７７及び８３～８６のいずれか１項に記載の細胞を投与することを含む、前記方法。
［項目９４］ メソテリンの発現に関連した前記疾患が、増殖性疾患、がん、悪性腫瘍、及び、メソテリンの発現を伴う非がん関連の適応症からなる群から選択される、項目９３に記載の方法。
［項目９５］ 前記疾患が、中皮腫、腎細胞癌、胃癌、乳癌、肺癌、卵巣癌、前立腺癌、結腸癌、子宮頸癌、脳腫瘍、肝臓癌、膵臓癌、甲状腺癌、膀胱癌、尿管癌、腎臓癌、子宮内膜癌、食道癌、胃癌、胸腺癌、胆管癌、及び、胃癌からなる群から選択されるがんである項目９３に記載の方法。
［項目８６］ 前記疾患が、中皮腫、乳頭状漿液性卵巣腺癌、明細胞卵巣癌、混合型ミュラー管卵巣癌、子宮内膜粘液性卵巣癌、膵臓腺癌、乳管腺癌、子宮漿液性癌、肺腺癌、肝外胆管癌、胃腺癌、食道腺癌、結腸直腸腺癌、乳腺腺癌、メソテリン発現に関連する疾患、及び、これらの組み合わせからなる群から選択されるがんである項目９３に記載の方法。
［項目９７］ ＴＦＰ分子を発現する前記細胞を、ＴＦＰ分子を発現する細胞の有効性を増大させる作用物質と組み合わせて投与する、項目９３に記載の方法。
［項目９８］ 前記哺乳動物では、抗メソテリンキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するＴ細胞の有効量を投与した哺乳動物と比較して、サイトカインの放出が少ない、項目９３～９７のいずれか１項に記載の方法。
［項目９９］ ＴＦＰ分子を発現する前記細胞を、ＴＦＰ分子を発現する細胞の投与に伴う１つ以上の副作用を改善する作用物質と組み合わせて投与する、項目９３～９８のいずれか１項に記載の方法。
［項目１００］ ＴＦＰ分子を発現する前記細胞を、メソテリンに関連する疾患を処置する作用物質と組み合わせて投与する、項目９３～９９のいずれか１項に記載の方法。
［項目１０１］ 医薬として使用するための、項目１～３９のいずれか１項に記載の単離した組換え核酸分子、項目４０に記載の単離したポリペプチド分子、項目４０に記載の単離したポリペプチド分子を発現する細胞、項目４１～５４のいずれか１項に記載の単離した組換えＴＦＰ、項目５５～６３のいずれか１項に記載の核酸、項目６４～６９のいずれか１項に記載のベクター、項目７８～８２のいずれか１項に記載の複合体、または、項目７０～７７及び８３～８６のいずれか１項に記載の細胞。
［項目１０２］ メソテリンの発現に関連した疾患を有する哺乳動物を処置する方法であって、前記哺乳動物に対して、有効量の項目１～３９のいずれか１項に記載の単離した組換え核酸分子、項目４０に記載の単離したポリペプチド分子、項目４０に記載の単離したポリペプチド分子を発現する細胞、項目４１～５４のいずれか１項に記載のＴＦＰ分子、項目５５～６３のいずれか１項に記載の核酸、項目６４～６９のいずれか１項に記載のベクター、または、項目７０～７７及び８３～８６のいずれか１項に記載の細胞を投与することを含み、前記哺乳動物では、抗メソテリンキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するＴ細胞の有効量を投与した哺乳動物と比較して、サイトカインの放出が少ない、前記方法。
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Figure 0007217970000027
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Claims (15)

  1. Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）融合タンパク質（ＴＦＰ）をコードする、組換え核酸分子であって、前記ＴＦＰは、
    （ａ）
    （ｉ）ＴＣＲ細胞外ドメインの少なくとも一部、
    （ｉｉ）ＴＣＲ膜貫通ドメイン、及び、
    （ｉｉｉ）ＣＤ３ε、ＣＤ３δ、またはＣＤ３γの細胞内シグナル伝達ドメイン由来の刺激ドメインを含むＴＣＲ細胞内ドメイン、
    を含むＴＣＲサブユニット、ここで、ＴＣＲ細胞外ドメイン、ＴＣＲ膜貫通ドメイン、及びＴＣＲ細胞内ドメインは、ＣＤ３ε、ＣＤ３δ、またはＣＤ３γである同じＴＣＲ鎖に由来する、及び
    （ｂ）抗メソテリン結合ドメインを含むヒトまたはヒト化ｓｃＦｖまたはｓｄＡｂ、
    を含み、
    前記抗メソテリン結合ドメインは前記ＴＣＲ細胞外ドメインの少なくとも一部のＮ末端に作動可能に連結され、
    前記ＴＦＰは、Ｔ細胞で発現する際に内因性ＴＣＲ複合体に機能的に統合される、組換え核酸分子。
  2. 前記抗メソテリン結合ドメインが、コードしたリンカー配列によって、前記ＴＣＲ細胞外ドメインの少なくとも一部に連結される、請求項１に記載の組換え核酸分子。
  3. 前記コードしたリンカー配列が（Ｇ４Ｓ）ｎを含み、式中、ｎ＝１～４である、請求項２に記載の組換え核酸分子。
  4. 前記ＴＣＲサブユニットが、全長のＴＣＲ細胞外ドメインを含む、請求項１に記載の組換え核酸分子。
  5. 同じＴＣＲ鎖が、ＣＤ３εである、請求項１に記載の組換え核酸分子。
  6. 前記組換え核酸分子が、ウイルスベクターまたはレトロウイルスベクターである、請求項１に記載の組換え核酸分子。
  7. コードした抗メソテリン結合ドメインが、配列番号５８または配列番号５９で表されるＶＨＨ抗体ドメインの重鎖（ＨＣ）ＣＤＲ１、ＨＣ ＣＤＲ２、及び、ＨＣ ＣＤＲ３の配列を含み、ＣＤＲ配列は、Ｋａｂａｔの番号付けによって決定される、請求項１に記載の組換え核酸分子。
  8. 前記抗メソテリン結合ドメインをコードする配列が、ｉ）配列番号５８に対して７０～１００％の配列同一性、または、ｉｉ）配列番号５９に対して７０～１００％の配列同一性、を有する配列を含むＶＨＨ抗体ドメインをコードする、請求項７に記載の組換え核酸分子。
  9. 抗メソテリン結合ドメインを含むヒトまたはヒト化ｓｃＦｖまたはｓｄＡｂ、ＴＣＲ細胞外ドメイン、ＴＣＲ膜貫通ドメイン、及び、ＴＣＲ細胞内ドメインを含む組換えＴＦＰ分子であって、抗メソテリン結合ドメインはＴＣＲ細胞外ドメインのＮ末端に作動可能に連結され、ＴＣＲ細胞外ドメイン、ＴＣＲ膜貫通ドメイン、及びＴＣＲ細胞内ドメインは、ＣＤ３ε、ＣＤ３δ、またはＣＤ３γである同じＴＣＲ鎖に由来し、組換えＴＦＰ分子は、Ｔ細胞で発現する際に、内因性ＴＣＲ複合体に取り込まれる、組換えＴＦＰ分子。
  10. 前記抗メソテリン結合ドメインが、配列番号５８または配列番号５９で表されるＶＨＨ抗体ドメインの重鎖（ＨＣ）ＣＤＲ１、ＨＣ ＣＤＲ２、及びＨＣ ＣＤＲ３の配列を含み、ＣＤＲ配列は、Ｋａｂａｔの番号付けによって決定される、請求項９に記載の組換えＴＦＰ分子。
  11. 請求項１～８のいずれか１つの組換え核酸分子、または請求項９または１０に記載の組換えＴＦＰ分子を含むヒト細胞。
  12. ヒト細胞が、ＴＦＰを含まないＴ細胞と比較して、メソテリンを発現する細胞に対する細胞傷害性の増加を随意に示すＴ細胞；ＣＤ８＋Ｔ細胞；ＣＤ４＋Ｔ細胞；ＣＤ４＋ＣＤ８＋Ｔ細胞；γδＴ細胞；αβＴ細胞；またはＮＫ Ｔ細胞である、請求項１１に記載のヒト細胞。
  13. Ｔ細胞によるＩＬ－２またはＩＦＮγの産生が、メソテリンを発現する細胞の存在下で増加し、あるいは、Ｔ細胞が、（ａ）抗メソテリン結合ドメインを含み、（ｂ）ＣＤ２８細胞外ドメインの少なくとも一部、（ｃ）ＣＤ２８膜貫通ドメイン、（ｄ）ＣＤ２８細胞内ドメインの少なくとも一部、および（ｅ）ＣＤ３ζ細胞内ドメインに作動可能に連結するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸を含むＣＤ８＋Ｔ細胞またはＣＤ４＋Ｔ細胞よりも大きなまたは効率的な細胞傷害活性を有する、請求項１２に記載のヒト細胞。
  14. 癌、中皮腫、腎細胞癌、胃癌、乳癌、肺癌、卵巣癌、前立腺癌、結腸癌、子宮頸癌、脳腫瘍、肝臓癌、膵臓癌、甲状腺癌、膀胱癌、尿管癌、腎臓癌、子宮内膜癌、食道癌、胃癌、胸腺癌、胆管癌、及び、これらの転移から選択される、メソテリンの発現に関連する疾患を有する哺乳動物を処置する方法で使用するための、請求項１～８のいずれか１つの組換え核酸分子、または請求項９または１０に記載の組換えＴＦＰ分子を含む細胞を含む組成物。
  15. 細胞が、自己Ｔ細胞または同種異系Ｔ細胞である、請求項１４に記載の組成物。
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