KR20240000614A - 형질도입된 ｔ 세포의 투여 적합성을 평가하는 방법 - Google Patents

형질도입된 ｔ 세포의 투여 적합성을 평가하는 방법 Download PDF

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cell
antigen
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car
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칼 에이치. 준
브루스 엘. 레빈
마이클 디. 칼로스
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더 트러스티스 오브 더 유니버시티 오브 펜실베니아
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Abstract

본 발명은 인간 피검자에게 투여하기 위해 지정된 T 세포를 형질도입하는데 유용한 벡터 상층액을 분석하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 인간 피검자에게 투여하기 위해 지정된 형질도입된 T 세포를 분석하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 유전적으로 변형된 T 세포를 분석하여 오염물을 검출하는 방법을 제공하여, 여기서 상기 유전적으로 변형된 T 세포는 키메라 항원 수용체(CAR)를 암호화하는 핵산을 포함하고, 여기서 상기 CAR은 항원 결합 도메인, 전이막 도메인, 공자극 신호 영역, 및 신호 도메인을 포함한다. 하나의 실시형태에서, 상기 오염물은 내독소, 마이코플라스마, 복제 적격 렌티바이러스(RCL), p24, VSV-G 핵산, HIV gag, 잔류 항-CD3/항-CD28 피복된 비드, 마우스 항체, 혼주된 인간 혈청, 소 혈청 알부민, 소 혈청, 배양 배지 성분, 벡터 패키징 세포(vector packaging cell) 또는 플라스미드 성분, 세균 및 진균으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 적어도 하나이다.

Description

형질도입된 Ｔ 세포의 투여 적합성을 평가하는 방법{Methods of assessing the suitability of transduced T cells for administration}
[미국 정부가 후원하는 연구 또는 개발에 관한 설명]
본 발명은 미국 국립보건원(National Institutes of Health: NIH)이 인식하고 있는, 승인 번호 제K24 CA11787901호, 제1PN2-EY016586호, 제1R01CA105216호, 제1R01CA120409호, 제RO1AI057838호, 및 제R01113482호 하에 미국 정부 지원으로 이루어졌다. 미국 정부는 본 발명에 대해 일정한 권리를 갖는다.
[관련 출원에 대한 교차-참조]
본 출원은 2012년 7월 13일자로 출원된 미국 가특허원 제61/671,495호에 대한 우선권을 주장하며, 이의 내용은, 본 명세서에 이의 전문이 참조로 포함된다.
[기술분야]
본 발명은 인간 피검자에게 투여하기 위해 지정된 T 세포를 형질도입하는데 유용한 벡터 상층액을 분석하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 인간 피검자에게 투여하기 위해 지정된 형질도입된 T 세포를 분석하는 방법에 관한 것이다.
발명의 배경
만성 림프구 백혈병(CLL)을 포함하는, β-세포 악성 종양이 있는 환자의 대부분은 이들의 질병으로 사망할 것이다. 이들 환자를 치료하기 위한 한가지 시도는 T 세포를 유전적으로 변형시켜 키메라 항원 수용체(CAR)의 발현을 통해 종양 세포에서 발현된 항원을 표적화하는 것이다. CAR은 인간 백혈구 항원과는 독립적인 방식으로 세포 표면 항원을 인식하도록 설계된 항원 수용체이다. CAR을 발현하는 유전적으로 변형된 세포를 사용하여 이러한 유형의 환자를 치료하기 위한 시도는, 성공이 매우 제한적이었다(참조: 예를 들면, Brentjens et al., 2010, Molecular Therapy, 18:4, 666-668; Morgan et al., 2010, Molecular Therapy, published online February 23, 2010, pages 1-9; 및 Till et al., 2008, Blood, 112:2261-2271).
CAR은 내인성 T-세포 수용체와 유사한 방식으로 T-세포 활성화를 개시할 수 있지만, 지금까지 이러한 기술의 임상 적용에 대한 주요한 장애는 CAR+ T 세포의 생체내 발현, 주입 후 당해 세포의 신속한 소실, 및 기대에 못 미치는 임상 활성으로 제한되어 왔다(참조: Jena, et al., Blood, 2010, 116:1035-1044; Uckun, et al. Blood, 1988, 71:13-29). 인간에게 투여하기 위해 유전적으로 변형된 T 세포를 생성시키는 방법은 투여 후 유전적으로 변형된 T 세포의 지속성 및 기능에 부정적으로 영향을 미칠 수 있는 원치않는 오염물을 생산할 잠재력을 가진다.
따라서, 유전적으로 변형된 세포의 지속성 및 기능에 부정적으로 영향을 미칠 수 있는 오염물의 검출을 통해, 인간 피검자에게 투여하기 위한 이들의 적합성에 대해 형질도입된 T 세포를 분석하는 것이 당해 분야에서 요구되고 있다. 본 발명은 이러한 요구를 해결한다.
발명의 요약
본 발명은 항원 결합 도메인, 전이막 도메인(transmembrane domain), 공자극 신호 영역(costimulatory signaling region), 및 신호 도메인(signaling domain)을 포함하는 키메라 항원 수용체(CAR)를 암호화하는 핵산을 포함하는 유전적으로 변형된 T 세포를 분석하여 오염물을 검출하는 방법을 제공한다.
하나의 실시형태에서, 유전적으로 변형된 T 세포는 렌티바이러스 벡터를 사용한 형질도입에 의해 유전적으로 변형되었다.
하나의 실시형태에서, 오염물은 내독소, 마이코플라즈마, 복제 적격 렌티바이러스(replication competent lentivirus: RCL), p24, VSV-G 핵산, HIV gag, 잔류 항-CD3/항-CD28 피복된 비드(bead), 마우스 항체, 혼주된 인간 혈청, 소 혈청 알부민, 소 혈청, 배양 배지 성분, 벡터 패키징 세포(vector packaging cell) 또는 플라스미드 성분, 세균 및 진균으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 적어도 하나의 것이다.
하나의 실시형태에서, 세균은 알칼리게네스 파에칼리스(Alcaligenes faecalis), 칸디다 알비칸스(Candida albicans), 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli), 해모필루스 인플루엔자(Haemophilus influenza), 나이세리아 메닌기티데스(Neisseria meningitides), 슈도모나스 아에루기노사(Pseudomonas aeruginosa), 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 스트렙토코쿠스 뉴모니아(Streptococcus pneumonia), 및 스트렙토코쿠스 피오게네스(Streptococcus pyogenes) 그룹 A로 이루어진 그룹 중에서 선택된 적어도 하나의 것이다.
하나의 실시형태에서, 신호 도메인은 CD3 제타 신호 도메인이다.
하나의 실시형태에서, 항원 결합 도메인은 항체 또는 이의 항원-결합 단편이다.
하나의 실시형태에서, 항원-결합 단편은 Fab 또는 scFv이다.
하나의 실시형태에서, 항원 결합 도메인은 종양 항원에 결합한다.
하나의 실시형태에서, 종양 항원은 혈액 악성종양(hematologic malignancy)과 관련되어 있다.
하나의 실시형태에서, 종양 항원은 고형 종양과 관련되어 있다.
하나의 실시형태에서, 종양 항원은 CD19, CD20, CD22, ROR1, 메소텔린(mesothelin), CD33/IL3Ra, c-Met, PSMA, 당지질(Glycolipid) F77, EGFRvIII, GD-2, NY-ESO-1 TCR, MAGE A3 TCR, 및 이의 특정 조합으로 이루어진 그룹 중에서 선택된다.
하나의 실시형태에서, 공자극 신호 영역은 CD27, CD28, 4-1BB, OX40, CD30, CD40, PD-1, ICOS, 림프구 기능-관련 항원-1(LFA-1), CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, CD83과 특이적으로 결합하는 리간드, 및 이의 특정 조합으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 공자극 분자의 세포내 도메인을 포함한다.
하나의 실시형태에서, 유전적으로 변형된 T 세포는 오염물의 확인 및 정량화로 인하여 인간 피검자에게 투여되지 않는다.
하나의 실시형태에서, 유전적으로 변형된 T 세포는, 오염물의 품질이 상응하는 대조군 수준과 비교하여 과도하기 때문에 인간 피검자에게 투여되지 않는다.
본 발명은 인간 피검자에게 투여하도록 예정된 T 세포의 형질도입에 적합한 키메라 항원 수용체(CAR)를 암호화하는 핵산을 포함하는 벡터를 생산하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 인간 피검자에게 키메라 항원 수용체(CAR)를 암호화하는 핵산을 포함하는 벡터를 투여하도록 예정된 T 세포를 형질도입시키는 방법에 관한 것이다. 바람직한 실시형태에서, 벡터는 렌티바이러스 벡터이다. 본 발명은 CAR을 발현하도록 렌티바이러스 벡터로 형질도입된 T 세포의 양자 세포 전달(adoptive cell transfer)에 관한 것이다. CAR은 목적한 표적 항원(예를 들면, 종양 항원)에 대한 항체-계 특이성을 T 세포 수용체-활성화 세포내 도메인과 합하여 특이적인 항-종양 세포 면역 활성을 나타내는 키메라 단백질을 생성하는 분자이다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 방법은 인간 피검자에게 투여하도록 예정된 T 세포를 형질도입시키는데 유용한 벡터 상층액을 분석하는 방법에 관한 것이다. 다른 실시형태에서, 본 발명의 방법은 인간 피검자에게 투여하도록 예정된 형질도입된 T 세포를 분석하는 방법에 관한 것이다. 각종 실시형태에서, 본 발명의 분석 방법은 T 세포 생존 능력, T 세포 특징(예를 들면, CD3, CD4, CD8, CD25, CD27, CD45RA, CD57, CD62L, CD95, CD127, CD134, CD244. CCR7, CD40L, CTLA4, PD-1, HLA-DR, TIM3, Ki-67, 페르포린, 및/또는 그란자임 발현), 형질도입 효능을 분석하는 방법, 및 또한 내독소, 마이코플라스마, 복제 적격 렌티바이러스(RCL), p24, VSV-G 핵산, HIVgag, 잔류성 항-CD3/항-CD28 피복된 비드, 마우스 항체, 혼주된 인간 혈청, 소 혈청 알부민, 소 혈청, 배양 배지 성분, 벡터 패키징 세포 또는 플라스미드 성분, 세균[예를 들면, 알칼리게네스 파에칼리스, 칸디다 알비칸스, 에스케리키아 콜라이, 해모필루스 인플루엔자, 나이세리아 메닝기티데스, 슈도모나스 아에루기노사, 스타필로코쿠스 아우레우스, 스트렙토코쿠스 뉴모니아, 및 스트렙토코쿠스 피오게네스 그룹 A], 및 진균과 같은, 제조 공정과 관련된 오염물을 검출하고 정량화하는 방법을 포함한다. 본 발명은 임의의 특수한 오염물에 한정되지 않는다. 오히려, 본 발명은 형질도입된 T 세포의 안전성 또는 효능에 영향을 미치는 특정 오염물에 대한 분석 방법을 포함한다.
본 발명은 일반적으로 벡터를 사용하여 T 세포를 유전적으로 개질시킴으로써 목적한 CAR을 안정하게 발현시키는 것에 관한 것이다. CAR을 발현하는 T 세포는 본 명세서에서 CAR T 세포 또는 CAR 변형된 T 세포로 언급된다. 바람직하게는, 세포는 유전적으로 변형시켜 이의 표면에 항체 결합 도메인을 안정하게 발현시킴으로써 MHC 독립적인 신규한 항원 특이성을 부여할 수 있다. 일부 예에서, T 세포는 유전적으로 변형시켜 특이적인 항체의 항원 인식 도메인과 CD3-제타 쇄 또는 FcγRI 단백질의 세포내 도메인을 결합하는 CAR을 단일 키메라 단백질내로 안정하게 발현시킨다.
하나의 실시형태에서, 본 발명의 CAR은 항원 인식 도메인, 전이막 도메인, 및 세포질성 도메인을 갖는 세포외 도메인을 포함한다. 하나의 실시형태에서, CAR내 도메인 중 하나와 천연적으로 관련된 전이막 도메인이 사용된다. 다른 실시형태에서, 전이막 도메인은 아미노산 치환에 의해 변형되거나 선택됨으로써 동일하거나 상이한 표면 막 단백질의 전이막 도메인에 대한 이러한 도메인의 결합을 피함으로써 수용체 복합체의 다른 구성원과의 상호작용을 최소화할 수 있다. 바람직하게는, 전이막 도메인은 CD8α 힌지 도메인이다.
세포질성 도메인과 관련하여, 본 발명의 CAR은 자체에 의해 CD28 및/또는 4-1BB 신호 도메인을 포함하도록 설계될 수 있거나 본 발명의 CAR의 내용에 유용한 임의의 다른 바람직한 세포질성 도메인(들)과 결합될 수 있다. 하나의 실시형태에서, CAR의 세포질성 도메인은 CD3-제타의 신호 도메인을 추가로 포함하도록 설계될 수 있다. 예를 들어, CAR의 세포질성 도메인은 CD3-제타, 4-1BB 및 CD28 신호 모듈 및 이의 조합을 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 따라서, 본 발명은 CAR T 세포 및 입양 치료요법(adoptive therapy)을 위한 이들의 사용 방법을 제공한다.
본 발명은 CD3-제타 및 4-1BB 공자극 도메인 둘 다를 포함하는 항-CD19 CAR을 암호화하는 핵산을 포함하는 벡터를 생산하는 방법을 포함한다. 하나의 실시형태에서, 상기 벡터는 목적한 CAR, 예를 들면, 항-CD19, CD8α 힌지 및 전이막 도메인, 및 인간 4-1BB 및 CD3제타 신호 도메인을 포함하는 CAR을 포함한다. 본 발명은 항-CD19를 포함하는 CAR에 한정되지 않으나, 또한 CD137(4-1BB) 신호 도메인, CD28 신호 도메인, CD3제타 신호 도메인, 및 이의 임의의 조합의 그룹 중에서 선택된 하나 이상의 세포내 도메인과 융합된 특정의 항원 결합 잔기를 포함한다. 바람직한 실시형태에서, 벡터는 렌티바이러스 벡터이다.
정의
달리 정의하지 않는 한, 본 명세서에 사용된 모든 기술 및 과학 용어는, 본 발명이 속한 분야에서 통상의 기술자에 의해 일반적으로 이해된 바와 동일한 의미를 갖는다. 본 명세서에 기술된 것과 유사하거나 동일한 임의의 방법 및 물질이 본 발명의 시험을 위한 실시에 사용될 수 있다고 해도, 바람직한 물질 및 방법이 본 명세서에 기술되어 있다. 본 발명을 설명하고 청구하는데 있어서, 다음의 용어가 사용될 것이다.
본 명세서에 사용된 전문 용어는 단지 특수 실시형태를 설명하기 위한 목적이며, 제한하는 것으로 의도되지 않는다.
관사("a" 및 "an")는 본 명세서에서 관사의 문법적 대상 하나 또는 하나 이상을 나타내기 위해 사용된다. 예로서, "성분"은 하나의 성분 또는 하나 이상의 성분을 의미한다.
양, 일시적 기간 등과 같은 측정가능한 값을 언급하는 경우에 본 명세서에 사용된 것으로서 "약"은 명시된 값으로부터 ±20% 또는 ±10%, 일부 예에서 ±5%, 일부 예에서 ±1%, 및 일부 예에서 ±0.1%의 변화를 포함함을 의미하며, 이러한 변화는 기재된 방법을 수행하는데 적절하다.
본 명세서에 사용된 것으로서 "활성화"는 충분히 자극되어 검출가능한 세포 증식을 유도하는 T 세포의 상태를 나타낸다. 활성화는 또한 유도된 사이토킨 생산, 및 검출가능한 효과기 기능과 관련될 수 있다. 용어 "활성화된 T 세포"는 다른 것들 중에서, 세포 분열을 겪는 T 세포를 나타낸다.
본 명세서에 사용된 것으로서 용어 "항체"는 항원에 특이적으로 결합하는 면역글로불린 분자를 나타낸다. 항체는 재조합체 공급원으로부터 또는 천연 공급원으로부터 기원한 완전한 면역글로불린일 수 있으며 완전한 면역글로불린의 면역반응성 부위일 수 있다. 항체는 전형적으로 면역글로불린 분자의 사량체이다. 본 발명에서 항체는 예를 들면, 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체, Fv, Fab 및 F(ab)2, 및 또한 단일 사슬 항체 및 인간화된 항체를 포함하는 다양한 형태로 존재할 수 있다(참조: Harlow et al., 1999, In: Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY; Harlow et al., 1989, In: Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, New York; Houston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883; Bird et al., 1988, Science 242:423-426).
용어 "항체 단편"은 완전한 항체의 부위를 말하며 완전한 항체의 항원성 결정 가변 영역을 말한다. 항체 단편의 예는 Fab, Fab', F(ab')2, 및 Fv 단편, 선형 항체, scFv 항체, 및 항체 단편으로부터 형성된 다특이적 항체를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
본 명세서에 사용된 것으로서 "항체 중쇄"는 이들의 천연적으로 존재하는 구조 내 모든 항체 분자 속에 존재하는 2개 유형의 보다 큰 폴리펩타이드 쇄를 말한다.
본 명세서에 사용된 것으로서 "항체 경쇄"는 이들의 천연적으로 존재하는 구조에서 모든 항체 분자 속에 존재하는 2개 유형의 보다 작은 폴리펩타이드 쇄를 말한다. κ 및 λ 경쇄는 2개의 주요 항체 경쇄 동형을 말한다.
본 명세서에 사용된 것으로서 용어 "합성 항체"는 예를 들면, 본 명세서에 기술된 바와 같은 박테리오파아지에 의해 발현된 항체와 같은 재조합체 DNA 기술을 사용하여 생성된 항체를 의미한다. 상기 용어는 또한 항체를 암호화하는 DNA 분자의 합성에 의해 생성된 항체를 의미하는 것으로 고려되어야 하며 상기 DNA 분자는 항체 단백질, 또는 당해 항체를 규정하는 아미노산 서열을 발현하며, 여기서 DNA 또는 아미노산 서열은 당해 분야에서 이용가능하고 잘 공지된 아미노산 서열 기술 또는 합성 DNA를 사용하여 수득되어 왔다.
본 명세서에 사용된 것으로서 용어 "항원" 또는 "Ag"는 면역 반응을 유발하는 분자로 정의된다. 이러한 면역 반응은 항체 생산, 또는 특이적인 면역학적으로-적격인 세포, 또는 이들 둘 다를 포함할 수 있다. 숙련가는, 실제로 모든 단백질 또는 펩타이드를 포함하는 임의의 거대분자도 항원으로서 제공될 수 있음을 이해할 것이다. 또한, 항원은 재조합체 또는 게놈성 DNA로부터 기원할 수 있다. 숙련가는, 면역 반응을 유발하는 단백질을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열 또는 부분적인 뉴클레오타이드를 포함하는 임의의 DNA도 따라서, 당해 용어가 본 명세서에 사용된 바와 같이 "항원"을 암호화함을 이해할 것이다. 또한, 당해 분야의 숙련가는, 항원이 유전자의 완전한 길이의 뉴클레오타이드 서열에 의해 단독으로 암호화될 필요가 없음을 이해할 것이다. 본 발명은 하나 이상의 유전자의 부분적 뉴클레오타이드 서열의 용도를 포함하나, 이에 한정되지 않으며 이들 뉴클레오타이드 서열은 다양한 조합으로 배열되어 바람직한 면역 반응을 유발함이 명백하다. 더욱이, 숙련가는, 항원이 "유전자"에 의해 결코 암호화될 필요가 없음을 이해할 것이다. 항원은 일반적으로 합성될 수 있거나 생물학적 시료로부터 기원할 수 있음이 명백하다. 이러한 생물학적 시료는 조직 시료, 종양 시료, 세포 또는 생물학적 유액을 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
본 명세서에 사용된 것으로서, 용어 "항-종양 효과"는 종양 용적의 감소, 종양 세포 수의 감소, 전이의 수의 감소, 기대 수명의 증가, 또는 암 상태와 관련된 다양한 생리학적 증상의 완화에 의해 나타낼 수 있는 생물학적 효과를 말한다. "항-종양 효과"는 또한 첫째로 종양의 발생의 예방시 본 발명의 펩타이드, 폴리펩타이드, 세포 및 항체의 능력에 의해 나타낼 수 있다.
용어 "자가-항원"은, 본 발명에 따라서, 면역계가 외부의 것으로 잘못 인식한 임의의 자가-항원을 의미한다. 자가-항원은 세포 단백질, 인단백질, 세포 표면 단백질, 세포 지질, 핵산, 세포 표면 수용체를 포함하는 당단백질을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
본 명세서에 사용된 것으로서 용어 "자가면역병"은 자가면역 반응으로부터 생성되는 장애로 정의된다. 자가면역병은 자가-항원에 대한 부적절하고 과도한 반응의 결과이다. 자가면역병의 예는 다른 것들 중에서도 애디슨병(Addision's disease), 탈모증(alopecia greata), 강직척추염, 자가면역 간염, 자가면역 볼거리, 크론병(Crohn's disease), 당뇨병(제I형), 위축물집표피박리증(dystrophic epidermolysis bullosa), 부고환염, 사구체신염, 그레이브스병(Graves' disease), 길랭-바레 증후군(Guillain-Barr syndrome), 하시모토병(Hashimoto's disease), 용혈 빈혈, 전신 홍반 루푸스, 다발경화증, 중증근육무력증, 보통천포창, 건선, 류마티스열, 류마티스 관절염, 사코이드증, 피부경화증, 소그렌 증후군(Sjogren's syndrome), 척추관절병, 갑상샘염, 혈관염, 백반증, 점액부종, 악성 빈혈, 궤양성 대장염을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
본 명세서에 사용된 것으로서, 용어 "자가"는 후에 개체내로 재-도입될 동일한 개체로부터 기원한 임의의 물질을 나타냄을 의미한다.
"동종이계"는 동일한 종의 상이한 동물로부터 기원한 이식체를 말한다.
"이종계"는 상이한 종의 동물로부터 기원한 이식체를 말한다.
본 명세서에 사용된 것으로서 용어 "암"은 이상 세포의 신속하고 조절되지 않은 성장을 특징으로 하는 질병으로 정의된다. 암 세포는 국소적으로 또는 혈류 및 림프계를 통해 신체의 다른 부분으로 확산될 수 있다. 각종 암의 예는 유방암, 전립샘암, 난소암, 경부암, 피부암, 췌장암, 직장결장암, 신장암, 간암, 뇌암, 림프구암, 백혈병, 폐암 등을 포함하나 이에 한정되지 않는다.
본 명세서에 사용된 용어로서 "공-자극성 리간드"는 T 세포에서 동족 공-자극 분자에 특이적으로 결합함으로써, 예를 들면, TCR/CD3 복합체와 펩타이드가 로딩된 MHC 분자의 결합에 의해 제공된 주요 신호 외에, 증식, 활성화, 차등화 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는 T 세포 반응을 매개하는 신호를 제공하는 항원 제시 세포(예를 들면, αAPC, 수지상 세포, B 세포 등) 상의 분자를 포함한다. 공-자극성 리간드는 CD7, B7-1(CD80), B7-2(CD86), PD-L1, PD-L2, 4-1BBL, OX40L, 유도성 공자극 리간드(ICOS-L), 세포내 부착 분자(ICAM), CD30L, CD40, CD70, CD83, HLA-G, MICA, MICB, HVEM, 림프독소 베타 수용체, 3/TR6, ILT3, ILT4, HVEM, 톨 리간드(Toll ligand) 수용체에 결합하는 효능제 또는 항체 및 B7-H3와 특이적으로 결합하는 리간드를 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 공-자극 리간드는, 특히 CD27, CD28, 4-1BB, OX40, CD30, CD40, PD-1, ICOS, 림프구 기능-관련 항원-1(LFA-1), CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, 및 CD83과 특이적으로 결합하는 리간드와 같은, 그러나 이에 한정되지 않는 T 상에 존재하는 공-자극 분자와 특이적으로 결합하는 항체를 또한 포함한다.
"공-자극 분자"는 공-자극 리간드와 특이적으로 결합합으로써 증식과 같은, 그러나 이에 한정되지 않는 T 세포에 의한 공-자극 반응을 매개하는 T 세포 상의 동족 결합 파트너를 말한다. 공-자극 분자는 MHC 제I 부류 분자, BTLA 및 톨 리간드 수용체를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
본 명세서에 사용된 것으로서 "공-자극 신호"는 TCR/CD3 연결과 같은 주요 신호와 함께 T 세포 증식 및/또는 주요 분자의 상향조절 또는 하향조절을 초래하는 신호를 말한다.
"질병"은 항상성을 유지할 수 없는 동물의 건강 상태이며, 여기서 상기 질병이 완화되지 않는 경우 동물의 건강은 지속적으로 악화된다. 대조적으로, 동물에서 "장애"는, 동물이 항상성을 유지할 수 있지만, 동물의 건강 상태가 장애의 부재 하에서 존재할 수 있는 것보다 양호하지 않은 건강 상태이다. 치료되지 않은채 남은, 장애는 동물의 건강 상태에서 추가의 저하를 필수적으로 유발하지 않는다.
본 명세서에 사용된 것으로서 "유효량"은 치료학적 또는 예방학적 이익을 제공하는 양을 의미한다.
"암호화하는"은 정의된 뉴클레오타이드 서열(즉, rRNA, tRNA 및 mRNA) 또는 정의된 아미노산 서열 및 이로부터 생성되는 생물학적 특성을 갖는 생물학적 공정내 다른 중합체 및 거대분자의 합성을 위한 주형으로서 제공되기 위한 유전자, cDNA, 또는 mRNA와 같은 폴리뉴클레오타이드 내 뉴클레오타이드의 특이적인 서열의 고유 특성을 말한다. 따라서, 유전자는, 이러한 유전자에 상응하는 mRNA의 전사 및 해독이 세포 또는 다른 생물학적 시스템 내에서 단백질을 생산하는 경우, 당해 단백질을 암호화한다. 암호화 쇄, 이의 뉴클레오타이드 서열 둘다는 mRNA 서열과 동일하며 일반적으로 서열 목록에서 제공되며, 유전자 또는 cDNA의 전사용 주형으로서 사용된, 비-암호화 쇄는 유전자 또는 cDNA의 단백질 또는 다른 생성물을 암호화하는 것으로 언급될 수 있다.
본 명세서에 사용된 것으로서 "내인성"은 유기체, 세포, 조직 또는 시스템으로부터 또는 내부에서 생산된 특정 물질을 말한다.
본 명세서에 사용된 것으로서, 용어 "외인성"은 유기체, 세포, 조직 또는 시스템으로부터 도입되거나 외부에서 생산된 특정 물질을 말한다.
본 명세서에 사용된 것으로서 용어 "발현"은 이의 프로모터에 의해 구동된 특수 뉴클레오타이드 서열의 전사 및/또는 해독으로 정의된다.
"발현 벡터"는 발현될 뉴클레오타이드 서열에 작동적으로 연결된 발현 조절 서열을 포함하는 재조합체 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터를 말한다. 발현 벡터는 발현에 충분한 시스-작용 성분; 숙주 세포 또는 시험관내 발현 시스템에 의해 공급될 수 있는 발현용 다른 성분을 포함한다. 발현 벡터는 재조합체 폴리뉴클레오타이드를 혼입하는 코스미드, 플라스미드(예를 들면, 노출(naked)되거나 리포좀 속에 함유됨) 및 바이러스(예를 들면, 렌티바이러스, 레트로바이러스, 아데노바이러스, 및 아데노-관련 바이러스)와 같이, 당해 분야에 공지된 모든 것들을 포함한다.
"상동"은 2개의 폴리펩타이드 사이에 또는 2개의 핵산 분자 사이에 서열 유사성 또는 서열 동질성을 말한다. 2개의 비교된 서열 둘 다의 위치가 동일한 염기 또는 아미노산 단량체 소단위에 의해 점유되는 경우, 예를 들어, 2개의 DNA 분자 각각에서의 내부의 위치가 아데닌에 의해 점유되는 경우, 당해 분자는 당해 위치에서 상동성이다. 2개의 서열 사이의 상동성 퍼센트는 2개의 서열에 의해 공유된 일치하거나 상동성인 위치의 수를 비교 위치들의 수로 나누어 100을 곱한 함수이다. 예를 들어, 2개의 서열 내 위치 10개 중 6개가 일치하거나 상동성인 경우 2개의 서열은 60% 상동성이다. 예로서, DNA 서열 ATTGCC 및 TATGGC는 50% 상동성을 공유한다. 일반적으로 2개 서열이 정렬되어 최대 상동성을 제공하는 경우를 비교한다.
본 명세서에 사용된 것으로서 용어 "면역글로불린" 또는 "Ig"는 항체로서 기능하는 단백질의 부류로서 정의된다. B 세포에 의해 발현된 항체는 때때로 BCR(B 세포 수용체) 또는 항원 수용체로 언급된다. 단백질의 당해 부류에 포함된 5개의 구성원은 IgA, IgG, IgM, IgD, 및 IgE이다. IgA는 타액, 눈물, 젖, 위장 분비물 및 호흡기 및 요생식로의 점액 분비물과 같은 신체의 분비물 속에 존재하는 주요 항체이다. IgG는 가장 일반적인 순환 항체이다. IgM은 대부분의 피검자에서 주요 면역 반응시 생산된 주요 면역글로불린이다. 이는 응집, 상보체 고정, 및 다른 항체 반응에서 가장 효율적인 면역글로불린이며 세균 및 바이러스에 대한 방어 시 중요하다. IgD는, 항체 기능이 알려져 있지 않은 면역글로불린이지만, 항원 수용체로서 제공될 수 있다. IgE는 알레르기원에 대한 노출 시 비만 세포 및 호염기구로부터의 중재인자의 방출을 유발함으로써 즉각적인 고민감성을 매개하는 면역글로불린이다.
본 명세서에 사용된 것으로서, "교육물"은 출판물, 기록물, 도해, 또는 본 발명의 조성물 및 방법의 유용성을 알리기 위해 사용될 수 있는 다른 임의의 표시 매체를 포함한다. 본 발명의 키트의 교육물은 예를 들면, 본 발명의 핵산, 펩타이드, 및/또는 조성물을 함유하거나 핵산, 펩타이드, 및/또는 조성물을 함유하는 용기와 함께 발송될 용기에 고정될 수 있다. 달리는, 교육물은, 당해 교육물 및 화합물이 수용체에 의해 협조적으로 사용될 의도로 용기와는 별도로 발송될 수 있다.
"분리된"는 천연 상태로부터 변경되거나 제거됨을 의미한다. 예를 들어, 살아있는 동물 속에 천연적으로 존재하는 핵산 또는 펩타이드는 "분리되지" 않지만, 이의 천연 상태의 동시존재하는 물질로부터 부분적으로 또는 완전히 분리된 동일한 핵산 또는 펩타이드는 "분리된"다. 분리된 핵산 또는 단백질은 실질적으로 정제된 형태로 존재할 수 있거나, 예를 들면, 숙주 세포와 같은 비-천연적인 환경 속에 존재할 수 있다.
본 발명과 관련하여, 일반적으로 존재하는 핵산 염기에 대한 다음의 약자가 사용된다. "A"는 아데노신을 말하며, "C"는 사이토신을 말하고, "G"는 구아노신을 말하며, "T"는 티미딘을 말하고, "U"는 우리딘을 말한다.
본 명세서에 사용된 것으로서 "렌티바이러스"는 레트로비리다에 게열의 속을 말한다. 렌티바이러스는 분열하지 않는 세포를 감염시킬 수 있다는 점에서 레트로바이러스 중에서 유일하며; 이들은 유의적인 양의 유전 정보를 숙주 세포의 DNA 내로 전달할 수 있으므로, 이들은 유전자 전달 벡터의 가장 효율적인 방법중 하나이다. HIV, SIV, 및 FIV는 모두 렌티바이러스의 예이다. 렌티바이러스로부터 기원한 벡터는 생체 내에서 유의적인 수준의 유전자 전달을 달성하는 수단을 제공한다.
본 명세서에 사용된 것으로서, 용어 "조절하는"은 치료 또는 화합물의 부재 하에서 피검자의 반응의 수준과 비교하고/하거나 달리는 동일하지만 치료되지 않은 피검자의 반응 수준과 비교하여 피검자에서 반응의 수준에서의 검출가능한 증가 또는 감소를 매개함을 의미한다. 당해 용어는 천연의 신호 또는 반응을 교란시키고/시키거나 영향을 미쳐서 피검자, 바람직하게는 인간에서 유리한 치료학적 반응을 매개하는 것을 포함한다.
달리 설명하지 않는 한, "아미노산 서열을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열"은 서로의 축퇴된 버젼이며 동일한 아미노산 서열을 암호화하는 모든 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 단백질 및 RNA를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 인트론을 포함할 수 있다.
용어 "작동적으로 연결된"은 후자의 발현을 초래하는 조절 서열과 이종 핵산 서열 사이의 기능적 연결을 말한다. 예를 들어, 제1의 핵산 서열은, 이것이 제2의 핵산 서열과 기능적 관계로 위치하는 경우 제2의 핵산 서열과 작동적으로 연결된다. 예를 들어, 프로모터가 암호화 서열의 전사 또는 발현에 영향을 미치는 경우 당해 프로모터는 암호화 서열과 작동적으로 연결된다. 일반적으로, 작동적으로 연결된 DNA 서열은 연속적이고, 2개의 단백질 암호화 영역을 연결하는데 필수적인 경우, 동일한 판독 프레임(reading frame) 내에 있다.
용어 "과발현된" 종양 항원 또는 종양 항원의 "과발현"은 특이적인 조직 또는 기관으로부터의 정상 세포에서 발현의 수준과 비교하여 환자의 상기 조직 또는 기관내 고형 종양과 같은 질병 부위로부터 세포내 종양 항원의 발현의 비정상적인 수준을 나타냄을 의도한다. 고형 종양 또는 종양 항원의 과발현에 의해 특징화된 혈액 악성종양을 지닌 환자는 당해 분야에 공지된 표준 검정으로 측정할 수 있다.
면역원성 조성물의 "비경구" 투여는 예를 들면, 피하(s.c.), 정맥내(i.v.), 근육내(i.m.) 또는 흉골내 주사, 또는 주입 기술을 포함한다.
용어 "환자", "피검자", "개체" 등은 본 명세서에서 상호교환적으로 사용되며, 본 명세서에 기술된 방법에 시험관내 또는 자체내 처리되는 것에 상관없이, 임의의 동물, 또는 이의 세포를 말한다. 특정의 비제한 실시형태에서, 상기 환자, 피검자 또는 개체는 인간이다.
본 명세서에 사용된 것으로서 용어 "폴리뉴클레오타이드"는 뉴클레오타이드의 쇄로서 정의된다. 또한, 핵산은 뉴클레오타이드의 중합체이다. 따라서, 본 명세서에 사용된 것으로서 핵산 및 폴리뉴클레오타이드는 상호교환가능하다. 당해 분야의 숙련가는, 핵산이 단량체성 "뉴클레오타이드"로 가수분해될 수 있는 폴리뉴클레오타이드라는 일반적인 지식을 가지고 있다. 단량체성 뉴클레오타이드는 뉴클레오사이드로 가수분해될 수 있다. 본 명세서에 사용된 것으로서 폴리뉴클레오타이드는 통상의 클로닝 기술 및 PCR 등을 사용하는 재조합체 수단, 즉, 재조합체 라이브러리 또는 세포 게놈으로부터 핵산 서열의 클로닝, 및 합성 수단에 의해 수득되는 모든 핵산 서열을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
본 명세서에 사용된 것으로서, 용어 "펩타이드", "폴리펩타이드", 및 "단백질"은 상호교환적으로 사용되며, 펩타이드 결합에 의해 공유결합으로 연결된 아미노산 잔기로 구성된 화합물을 말한다. 단백질 또는 펩타이드는 적어도 2개의 아미노산을 함유하며, 단백질 서열 또는 펩타이드 서열을 포함할 수 있는 아미노산의 최대 수에 제한은 없다. 폴리펩타이드는 펩타이드 결합에 의해 서로 연결된 2개 이상의 아미노산을 포함하는 임의의 펩타이드 또는 단백질도 포함한다. 본 명세서에 사용된 것으로서, 상기 용어는 단쇄 둘 다를 말하며, 이는 또한 일반적으로 당해 분야에서 예를 들면, 펩타이드, 올리고펩타이드 및 올리고머, 및 일반적으로 당해 분야에서 단백질(이는 많은 유형이 존재한다)로 언급된 보다 긴 쇄 둘 다를 말한다. "폴리펩타이드"는 다른 것들 중에서, 예를 들면, 생물학적으로 활성인 단편, 실질적으로 동종인 폴리펩타이드, 올리고펩타이드, 동종이량체, 이종이량체, 폴리펩타이드의 변이체, 변형된 폴리펩타이드, 유도체, 유사체, 융합 단백질을 포함한다. 폴리펩타이드는 천연 펩타이드, 재조합체 펩타이드, 합성 펩타이드, 또는 이의 조합을 포함한다.
본 명세서에 사용된 것으로서 용어 "프로모터"는 세포의 합성 기구(synthetic machinery), 또는 폴리뉴클레오타이드 서열의 특이적인 전사를 개시하는데 필요한 도입된 합성 기구에 의해 인식된 DNA 서열로서 정의된다.
본 명세서에 사용된 것으로서, 용어 "프로모터/조절 서열"은 프로모터/조절 서열에 작동적으로 연결된 유전자 생성물의 발현에 필요한 핵산 서열을 의미한다. 일부 예에서, 당해 서열은 코어 프로모터 서열일 수 있으며 다른 예에서, 당해 서열은 또한 유전자 생성물의 발현에 필요한 인핸서 서열(enhancer sequence) 및 다른 조절 성분을 포함할 수 있다. 프로모터/조절 서열은 예를 들면, 조직 특이적인 방식으로 유전자 생성물을 발현하는 것일 수 있다.
"구성적" 프로모터는, 유전자 생성물을 암호화하거나 규정하는 폴리뉴클레오타이드와 작동적으로 연결되는 경우, 세포의 대부분 또는 모든 생리학적 조건 하에서 유전자 생성물이 세포 속에서 생산되도록 하는, 뉴클레오타이드 서열이다.
"유도성" 프로모터는, 유전자 생성물을 암호화하거나 명시하는 폴리뉴클레오타이드와 작동적으로 연결되는 경우, 프로모터에 상응하는 유도인자가 세포 속에 존재하는 경우에만 유전자 생성물이 세포내에서 실질적으로 생산되도록 하는 뉴클레오타이드 서열이다.
"조직-특이적인" 프로모터는, 폴리뉴클레오타이드와 작동적으로 연결되는 경우 유전자에 의해 암호화되거나 명시되어, 당해 세포가 프로모터에 상응하는 조직 유형의 세포인 경우에만 유전자 생성물이 세포 속에서 실질적으로 생산되도록 하는 뉴클레오타이드 서열이다.
본 명세서에 사용된 것으로서 용어 "특이적으로 결합하는"은 특이적인 항원을 인식하지만 시료 속에서 다른 분자를 실질적으로 인식하거나 이에 결합하지 않는 항체를 의미한다. 예를 들어, 하나의 종으로부터 항원에 특이적으로 결합하는 항체는 또한 하나 이상의 종으로부터의 항원에 결합할 수 있다. 그러나, 이러한 교차-종 반응성은 자체로서 항체의 분류를 특이적인 것으로 변경시키지 않는다. 다른 예에서, 항원에 특이적으로 결합하는 항체는 또한 항원의 상이한 대립형질 형태에 결합할 수 있다. 그러나, 이러한 교차 반응성은 자체로 항체의 분류를 특이적인 것으로 변경시키지 않는다. 일부 예에서, 용어 "특이적인 결합" 또는 "특이적으로 결합하는"은 항체, 단백질, 또는 펩타이드와 제2의 화학 종의 상호작용을 참조하여, 당해 상호작용이 화학 종의 특수 구조(예를 들면, 항원성 결정인자 또는 에피토프)의 존재에 의존적임을 의미하는데 사용될 수 있으며; 예를 들어, 항체는 일반적으로 단백질 보다는 특이적인 단백질 구조를 인식하여 이에 결합한다. 항체가 에피토프 "A"에 대해 특이적인 경우, 표지된 "A" 및 항체를 함유하는 반응에서 에피토프 A(또는 유리되거나, 표지되지 않은 A)의 존재는 항체에 결합된 표지된 A의 양을 감소시킬 것이다.
용어 "자극"은 자극성 분자(예를 들면, TCR/CD3 복합체)와 이의 동족 리간드의 결합에 의해 TCR/CD3 복합체를 통한 신호 형질도입과 같지만, 이에 한정되지 않는 신호 형질도입 사건을 매개함으로써 유도된 주요 반응을 의미한다. 자극은 TGF-β의 하향조절, 및/또는 세포골격 구조의 재구조화 등과 같은 특정 분자의 변경된 발현을 매개할 수 있다.
본 명세서에 사용된 것으로서 "자극성 분자"는 항원 제시 세포에 존재하는 동족 자극성 리간드와 특이적으로 결합하는 T 세포 상의 분자를 의미한다.
본 명세서에 사용된 것으로서 "자극성 리간드"는 항원 제시 세포(예를 들면, APC, 수지 세포, B-세포 등) 상에 존재하는 경우 T 세포 상의 동족 결합 파트너(본 명세서에서 "자극성 분자"로 언급됨)와 특이적으로 결합함으로써, 면역 반응의 활성화, 개시, 증식 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는 T 세포에 의한 주요 반응을 매개하는 리간드를 의미한다. 자극성 리간드는 당해 분야에 잘 공지되어 있으며 특히 펩타이드가 로딩된 MHC 제I 부류 분자, 항-CD3 항체, 과작용제(superagonist) 항-CD28 항체, 및 과작용제 항-CD 항체를 포함한다.
용어 "피검자"는, 면역 반응이 유발될 수 있는 살아있는 유기체(예를 들면, 포유동물)을 포함하는 것으로 의도된다. 피검자의 예는 인간, 개, 고양이, 마우스, 랫트, 및 이의 전이유전자 종을 포함한다.
본 명세서에 사용된 것으로서, "실질적으로 정제된" 세포는 다른 세포 유형을 필수적으로 포함하지 않는 세포이다. 실질적으로 정제된 세포는 또한 이의 천연적으로 발생하는 상태와 일반적으로 관련된 다른 세포 유형과는 별개인 세포를 말한다. 일부 예에서, 실질적으로 정제된 세포의 집단은 세포의 동종 집단을 말한다. 다른 예에서, 당해 용어는 단순히, 이들의 천연 상태와 천연적으로 관련된 세포와는 별개인 세포를 말한다. 일부 실시형태에서, 세포는 시험관내에서 배양된다. 다른 실시형태에서, 세포는 시험관내에서 배양되지 않는다.
본 명세서에 사용된 것으로서 용어 "치료제"는 치료 및/또는 예방을 의미한다. 치료학적 효과는 질병 상태의 억제, 완화, 또는 근절로 수득된다.
용어 "치료학적 유효량"은 연구자, 수의학자, 의학자 또는 다른 임상의가 고려하고 있는 조직, 시스템, 또는 피검자의 생물학적 또는 의학적 반응을 유발할 대상 화합물의 양을 말한다. 용어 "치료학적 유효량"은 투여되는 경우, 치료되는 장애 또는 질병의 하나 이상의 신호 또는 증상의 발달을 예방하거나, 이를 어느 정도 완화시키는데 충분한 화합물의 양을 포함한다. 치료학적 유효량은 화합물, 질병 및 이의 중증도, 치료되는 피검자의 연령, 체중 등에 따라 변할 것이다.
본 명세서에 사용된 용어 질병을 "치료하다"는, 피검자가 경험한 질병 또는 장애의 적어도 하나의 신호 또는 증상의 빈도 또는 중증도를 감소시키는 것을 의미한다.
본 명세서에 사용된 것으로서 용어 "형질감염된" 또는 "형질전환된" 또는 "형질도입된"은, 이에 의해 외인성 핵산이 숙주 세포내로 형질감염되거나 도입되는 공정을 말한다. "형질감염된" 또는 "형질전환된" 또는 "형질도입된" 세포는 외인성 핵산으로 형질감염되거나, 형질전환되거나 형질도입된 것이다. 상기 세포는 주요 피검자 세포 및 이의 후대세포를 포함한다.
본 명세서에 사용된 것으로서 어구 "전사 조절 하에" 또는 "작동적으로 연결된"은, 프로모터가 RNA 폴리머라제에 의한 전사의 개시 및 폴리뉴클레오타이드의 발현을 조절하기 위해 폴리뉴클레오타이드와 관련하여 정확한 위치 및 배향으로 존재함을 의미한다.
"벡터"는 분리된 핵산을 포함하고 세포의 내부로 핵산을 전달하는데 사용될 수 있는 물질의 조성물이다. 선형 폴리뉴클레오타이드, 이온성 또는 양쪽성 화합물과 관련된 폴리뉴클레오타이드, 플라스미드, 및 바이러스를 포함하나, 이에 한정되지 않는 다수의 벡터가 당해 분야에 공지되어 있다. 따라서, 용어 '벡터"는 자가 복제하는 플라스미드 또는 바이러스를 포함한다. 당해 용어는 또한 핵산을 세포내로 형질전달하기에 용이한 비-플라스미드 및 비-바이러스 화합물, 예를 들면, 폴리라이신 화합물, 리포좀 등을 포함하는 것으로 해석될 수 있다. 바이러스 벡터의 예는 아데노바이러스 벡터, 아데노-관련 바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터 등을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
범위: 당해 기재내용 전체에서, 본 발명의 다양한 국면이 범위 양식으로 제공될 수 있다. 범위 양식의 기술은 단지 편의성 및 간결성을 위한 것이며 본 발명의 영역을 융통성없이 제한하는 것으로 해석되지 않아야 한다. 따라서, 범위의 기술은 모든 가능한 소범위 및 또한 당해 범위 내 개개 수치적 범위를 구체적으로 기재한 것으로 고려되어야 한다. 예를 들어, 1 내지 6과 같은 범위의 기술은 1 내지 3, 1 내지 4, 1 내지 5, 2 내지 4, 2 내지 6, 3 내지 6 등과 같은 소 범위, 및 또한 당해 범위 내 개개의 수, 예를 들면, 1, 2, 2.7, 3, 4, 5, 5.3 및 6을 구체적으로 기재한 것으로 고려되어야 한다. 이것은 범위의 크기와 관계없이 적용된다.
설명
본 발명은 인간 피검자에게 투여하도록 예정된 T 세포를 형질도입하는데 유용한 벡터 상층액을 분석하는 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 인간 피검자에게 투여하도록 예정된, 형질도입된 T 세포, 및 이들의 상층액을 분석하는 방법을 제공한다. 다양한 실시형태에서, 본 발명의 분석 방법은 T 세포 생존능, T 세포 특성(예를 들면, CD3, CD4, CD8, CD25, CD27, CD45RA, CD57, CD62L, CD95, CD127, CD134, CD244. CCR7, CD40L, CTLA4, PD-1, HLA-DR, TIM3, Ki-67, 페르포린, 및/또는 그란자임 발현), 형질도입 효능, 내독소의 존재 및 양, 마이코플라스마의 존재 및 양, 복제 적격 렌티바이러스(RCL)의 존재 및 양, p24의 존재 및 양, 렌티바이러스 플라스미드를 패키징하는데 사용된 플라스미드 각각으로부터 기원한 핵산 및/또는 단백질의 존재 및 양, VSV-G 핵산 및/또는 단백질의 존재 및 양, HIVgag, 잔류성 항-CD3/항-CD28 피복된 비드, 마우스 항체, 혼주된 인간 혈청, 소 혈청 알부민, 소 혈청, 배양 배지 성분, 벡터 패키징 세포 또는 플라스미드 성분, 세균[예를 들면, 알칼리게네스 파에칼리스, 칸디다 알비칸스, 에스케리키아 콜라이, 해모필루스 인플루엔자, 나이세리아 메닝기티데스, 슈도모나스 아에루기노사, 스타필로코쿠스 아우레우스, 스트렙토코쿠스 뉴모니아, 및 스트렙토코쿠스 피오게네스 그룹 A], 또는 면역계(예, LPS, 핵산, RNA, 등)를 활성화시키고/시키거나 조절하는 세균 생성물의 존재 및 양, 및 진균의 존재 및 양을 분석하는 방법을 포함한다.
일부 실시형태에서, 인간 피검자는 암을 지닐 수 있다. 각종 실시형태에서, 암은 혈액 악성종양, 고형 종양, 일차 또는 전이성 종양일 수 있다. 바람직하게는, 암은 혈액학적 악성종양이고, 보다 바람직하게는, 암은 만성 림프세포성 백혈병(CLL)이다. 본 발명의 조성물 및 방법을 사용하여 치료가능한 다른 질병은 바이러스, 세균 및 기생충 감염 및 또한 자가면역병을 포함한다.
하나의 구현에에서, 벡터는 CAR을 암호화하는 핵산 서열을 포함하며, 여기서 CAR은 T 세포에 의해 발현되고 CAR T 세포는 항종양 특성을 나타낸다. CAR은 가공되어 T 세포 항원 수용체 복합체 제타 쇄(예를 들면, CD3 제타)의 세포내 신호 도메인에 융합된 항원 결합 도메인을 갖는 세포외 도메인을 포함할 수 있다. CAR은, T 세포 내에서 발현되는 경우 항원 결합 특이성을 기반으로 한 항원 인식을 재지시할 수 있다. 예시적인 항원은 CD19인데, 이 이유는, 당해 항원이 악성 B 세포 상에서 발현되기 때문이다. 그러나, 본 발명은 CD19를 인식하는 CAR에 한정되지 않는다. 오히려, 본 발명은 이의 동족 항원에 결합하는 경우, 종양 세포에 영향을 미쳐서 종양 세포가 성장하지 못하도록 하고, 사멸하도록 하거나, 달리는 당해 종양 세포에 영향을 미쳐서 환자 내 종양 부담(tumor burden)이 약화되거나 제거되는 임의의 항원 결합 잔기를 포함한다. 당해 항원 결합 잔기는 바람직하게는 하나 이상의 공자극 분자 및 제타 쇄로부터의 세포내 도메인과 융합된다. 바람직하게는, 항원 결합 잔기는 CD137(4-1BB) 신호 도메인, CD28 신호 도메인, CD3 제타 신호 도메인, 및 이의 임의의 조합의 그룹 중에서 선택된 하나 이상의 세포 내 도메인과 융합된다.
하나의 구현에에서, 본 발명의 벡터는 CD137(4-1BB) 신호 도메인을 암호화하는 핵산 서열을 포함한다. 이는, CAR-중재된 T-세포 반응이 공자극 도메인의 첨가로 추가로 향상될 수 있기 때문이다. 예를 들어, CD137(4-1BB) 신호 도메인의 포함은 CD137(4-1BB)를 발현하도록 가공되지 않은 다른 동일한 CAR T 세포와 비교하여 CAR T 세포의 생체내 지속성 및 항-종양 활성을 유의적으로 증가시킨다. CAR을 사용하여 T 세포를 유전적으로 변형시키는 방법은, 이의 전문이 본 명세서에 참조로 포함된 제PCT/US11/64191호에 기술되어 있다.
조성물
본 발명은 CAR을 암호화하는 핵산을 포함하는 벡터를 제공하며, 여기서 CAR은 세포외 및 세포내 도메인을 포함한다. 세포외 도메인은 달리 항원 결합 잔기로 언급된 표적-특이적인 결합 성분을 포함한다. 세포내 도메인 또는 달리는 세포질성 도메인은 공자극 신호 영역 및 제타 쇄 부위를 포함한다. 공자극 신호 영역은 공자극 분자의 세포내 도메인을 포함하는 CAR의 부위를 말한다. 공자극 분자는 항원에 대한 림프구의 충분한 반응에 요구되는 이들의 리간드 또는 항원 수용체 이외의 세포 표면 분자이다.
CAR의 세포외 도메인과 전이막 도메인(transmembrane domain) 사이에, 또는 CAR의 세포질 도메인과 전이막 도메인 사이에는, 스페이서 도메인(spacer domain)이 포함될 수 있다. 본 명세서에 사용된 것으로서, 용어 "스페이서 도메인"은 일반적으로 전이막 도메인이 세포외 도메인 또는, 폴리펩타이드 쇄내 세포질 도메인에 연결되도록 기능하는 임의의 올리고- 또는 폴리펩타이드도 의미한다. 스페이서 도메인은 300개 이하의 아미노산, 바람직하게는 10 내지 100개의 아미노산 및 가장 바람직하게는 25 내지 50개의 아미노산을 포함할 수 있다.
항원 결합 잔기
하나의 실시형태에서, 본 발명의 벡터는 CAR을 암호화하는 핵산을 포함하며, 여기서 상기 CAR은 달리 항원 결합 잔기로 언급된 표적-특이적인 결합 성분을 포함한다. 잔기의 선택은 표적 세포의 표면을 정의하는 리간드의 유형 및 수에 의존한다. 예를 들어, 항원 결합 도메인은 특수한 질병 상태와 관련된 표적 세포에서 세포 표면 마커로 작용하는 리간드를 인식하도록 선택될 수 있다. 따라서, 본 발명의 CAR 내의 항원 잔기 도메인에 대한 리간드로서 작용할 수 있는 세포 표면 마커의 예는 바이러스, 세균 및 기생충 감염, 자가면역병 및 암 세포와 관련된 것들을 포함한다.
하나의 실시형태에서, 본 발명의 벡터는 CAR을 암호화하는 핵산을 포함하며, 여기서 상기 CAR은 종양 세포 상의 항원에 특이적으로 결합하는 목적한 항원 결합 잔기를 가공하는 방식으로 목적한 종양 항원을 표적화하도록 가공된다. 본 발명의 내용에서, "종양 항원" 또는 "고증식성 장애 항원" 또는 "고증식성 장애와 관련된 항원"은 암과 같은 특이적인 고증식성 장애에 대해 일반적인 항원을 말한다. 본 명세서에 기재된 항원은 단지 예로서 포함된다. 당해 목록은 배타적인 것으로 의도되지 않으며 추가의 예는 당해 분야의 숙련가에게 용이하게 명백할 것이다.
종양 항원은 면역 반응, 특히 T-세포 매개된 면역 반응을 유발하는 종양 세포에 의해 생산된 단백질이다. 본 발명의 항원 결합 잔기의 선택은 치료되는 암의 특수 유형에 의존할 것이다. 종양 항원은 당해 분야에 잘 공지되어 있으며 예를 들면, 신경아교종-관련 항원, 암배아 항원(CEA), β-인간 융모성 고나도트로핀, 알파페노단백질(AFP), 렉틴-반응성 AFP, 티로글로불린, RAGE-1, MN-CA IX, 인간 텔로마제 역 전사효소(human telomerase reverse transcriptase), RU1, RU2(AS), 장 카복실 에스테라제, mut hsp70-2, M-CSF, 프로스타제, 전립샘-특이적인 항원(PSA), PAP, NY-ESO-1, LAGE-1a, p53, 프로스테인, PSMA, Her2/neu, 수르비빈 및 텔로머라제, 전립샘-암종 종양 항원-1(PCTA-1), MAGE, ELF2M, 호중구 엘라스타제, 에프린B2, CD22, 인슐린 성장 인자(IGF)-I, IGF-II, IGF-I 수용체 및 메소텔린을 포함한다.
하나의 실시형태에서, 종양 항원은 악성 종양과 관련된 하나 이상의 항원성 암 에피토프를 포함한다. 악성 종양은 면역 공격에 대해 표적 항원으로서 작용할 수 있는 다수의 단백질을 발현한다. 이들 분자는 흑색종에서 MART-1, 티로시나제 및 GP 100 및, 전립샘 암에서 전립선 산 포스파타제(PAP) 및 전립샘-특이적인 항원(PSA)을 포함하나 이에 한정되지 않는다. 다른 표적 분자는 종양유전자 HER-2/Neu/ErbB-2와 같은 형질전환 관련 분자의 그룹에 속한다. 표적 항원의 여전히 다른 그룹은 암배아 항원(CEA)과 같은 종양-태아 항원(onco-fetalantigen)이다. B-세포 림프종에서 종양-특이적인 유전자형 면역글로불린은 개개 종양에 대해 유일한 실제 종양-특이적인 면역글로불린 항원을 구성한다. CD19, CD20 및 CD37과 같은 B-세포 차등화 항원은 B-세포 림프종에서 표적 항원에 대한 다른 후보물질이다. 이들 항원들 중 일부(CEA, HER-2, CD19, CD20, 유전자형)은 제한된 성공으로 모노클로날 항체를 사용한 수동적 면역치료요법을 위한 표적으로서 사용되어 왔다.
본 발명에서 언급된 종양 항원의 유형은 또한 종양-특이적인 항원(TSA) 또는 종양-관련된 항원(TAA)일 수있다. TSA는 종양 세포에 대해 유일하며 체내 다른 세포에서 발생하지 않는다. TAA 관련된 항원은 종양 세포에 대해 유일하지 않은 대신 또한 항원에 대한 면역원성 내성의 상태를 유도하지 못하는 조건 하에서 정상 세포에서 발현된다. 종양에서 항원의 발현은, 면역계가 항원에 반응하도록 할 수 있는 조건하에서 발생할 수 있다. TAA는, 면역계가 미성숙하여 반응할 수 없거나 이들이 정상 세포에서 극도로 낮은 수준으로 일반적으로 존재하지만 종양 세포에서는 훨씬 높은 수준으로 발현되는 항원일 수 있는 경우 태아 발달 동안에 정상 세포에서 발현되는 항원일 수 있다.
TSA 또는 TAA 항원의 비-제한적 예는 다음을 포함한다: MART-1/MelanA(MART-I), gp100(Pmel 17), 타이로시나제, TRP-1, TRP-2와 같은 분화 항원, 및 MAGE-1, MAGE-3, BAGE, GAGE-1, GAGE-2, p15와 같은 종양-특이적인 다중계통 항원; CEA와 같은 과발현된 배아 항원; p53, Ras, HER-2/neu와 같은 과발현된 종양유전자 및 돌연변이된 종양-억제인자 유전자; BCR-ABL, E2A-PRL, H4-RET, IGH-IGK, MYL-RAR와 같은 염색체 전좌로부터 생성되는 유일한 종양 항원; 및 엡슈타인 바르 바이러스 항원 EBVA 및 인간 파필로마바이러스(HPV) 항원 E6 및 E7과 같은 바이러스 항원. 다른 거대한, 단백질계 항원은 TSP-180, MAGE-4, MAGE-5, MAGE-6, RAGE, NY-ESO, p185erbB2, p180erbB-3, c-met, nm-23H1, PSA, TAG-72, CA 19-9, CA 72-4, CAM 17.1, NuMa, K-ras, 베타-카테닌, CDK4, Mum-1, p15, p16, 43-9F, 5T4, 791Tgp72, 알파-페토단백질, 베타-HCG, BCA225, BTAA, CA 125, CA 15-3＼CA 27.29＼BCAA, CA 195, CA 242, CA-50, CAM43, CD68＼P1, CO-029, FGF-5, G250, Ga733＼EpCAM, HTgp-175, M344, MA-50, MG7-Ag, MOV18, NB/70K, NY-CO-1, RCAS1, SDCCAG16, TA-90＼Mac-2 결합 단백질＼사이클로필린 C-관련 단백질, TAAL6, TAG72, TLP, 및 TPS를 포함한다.
바람직한 실시형태에서, CAR의 항원 결합 잔기 부위는 CD19, CD20, CD22, ROR1, 메소텔린, CD33/IL3Ra, c-Met, PSMA, 당지질 F77, EGFRvIII, GD-2, MY-ESO-1 TCR, MAGE A3 TCR 등을 포함하나 이에 한정되지 않는 항원을 표적화한다.
표적화될 목저한 항원에 따라, 본 발명의 CAR은 목적한 항원 표적에 대해 특이적인 적절한 항원 결합 잔기를 포함하도록 가공될 수 있다. 예를 들어, CD19가 표적화될 바람직한 항원인 경우, CD19에 대한 항체는 본 발명의 CAR내로 혼입시키기 위한 항원결합 잔기로서 사용될 수 있다.
하나의 실시형태에서, 본 발명의 벡터는 CAR을 암호화하는 핵산을 포함하며, 여기서 본 발명의 CAR의 항원 결합 잔기 부위는 CD19를 표적화한다.
전이막 도메인
CAR의 전이막 도메인은 CAR의 세포외 도메인에 융합된 전이막 도메인을 포함하도록 설계될 수 있다. 하나의 실시형태에서, CAR내 도메인 중 하나와 천연적으로 관련된 전이막 도메인이 사용된다. 일부 예에서, 전이막 도메인은 아미노산 치환에 의해 선택되거나 변형되어 이러한 도메인이 동일하거나 상이한 표면 막 단백질의 전이막 도메인에 결합하는 것을 피하도록 함으로써 수용체 복합체의 다른 막과의 상호작용을 최소화하도록 할 수 있다.
전이막 도메인은 천연 또는 합성 공급원으로부터 기원할 수 있다. 공급원이 천연인 경우, 당해 도메인은 특정의 막-결합되거나 전이막 단백질로부터 기원할 수 있다. 본 발명에서 특수한 용도의 전이막 영역은 T-세포 수용체의 알파, 베타 또는 제타 쇄, CD28, CD3 엡실론, CD45, CD4, CD5, CD8, CD9, CD16, CD22, CD33, CD37, CD64, CD80, CD86, CD134, CD137, CD154(의 적어도 전이막 영역(들)을 포함함)로부터 기원할 수 있다. 달리는, 전이막 도메인은 합성일 수 있으며, 이 경우 이는 루이신 및 발린과 같은 주로 소수성 잔기를 포함할 것이다. 바람직하게는, 페닐알라닌, 트립토판 및 발린의 삼중자(triplet)는 합성의 전이막 도메인의 각각의 말단에서 발견될 것이다. 임의로, 길이가 2 내지 10개 아미노산 사이인 짧은 올리고- 또는 폴리뉴클레오타이드 링커는 CAR의 전이막 도메인과 세포질성 신호 도메인 사이의 연결을 형성할 수 있다. 글리신-세린 이중자(doublet)는 특히 적합한 링커를 제공한다.
바람직하게는, 본 발명의 벡터의 CAR내 전이막 도메인은 CD8 전이막 도메인이다. 일부 예에서, 본 발명의 CAR의 전이막 도메인은 CD8 α 힌지 도메인을 포함한다.
세포질성 도메인
본 발명의 벡터의 CAR의 세포질성 도메인 또는 기타의 경우 세포 내 신호 도메인은, CAR이 위치하는 면역 세포의 정상적인 효과기(effector) 기능 중의 적어도 하나의 활성화에 관여한다. 용어 "효과기 기능"은 세포의 특수화된 기능을 말한다. 예를 들어, T 세포의 효과기 기능은 사이토킨의 분비를 포함하는 세포분해 활성 또는 헬퍼 활성(helper activity)일 수 있다. 따라서, 용어 "세포내 신호 도메인"은 효과기 기능 신호를 형질도입하여 세포가 특수화된 기능을 수행하도록 지시하는 단백질 중의 일부를 말한다. 일반적으로 전체 세포내 신호 도메인이 사용될 수 있다고 해도, 많은 경우에서 전체 쇄를 사용하는 것이 필수적이지는 않다. 세포내 신호 도메인의 트렁케이트된 부위(truncated portion)가 사용되는 정도까지, 이러한 트렁케이트된 부위는, 이것이 효과기 기능 신호를 형질도입시키는 한 완전한 쇄 대신에 사용될 수 있다. 따라서, 용어 세포내 신호 도메인은 효과기 기능 신호를 형질도입시키는데 충분한 세포 내 신호 도메인의 임의의 트렁케이트된 부위도 포함함을 의미한다.
본 발명의 벡터의 CAR에서 사용하기 위한 세포 내 신호 도메인의 바람직한 예는 항원 수용체 관여 후 신호 형질도입을 개시하는 것과 관련하여 작용하는 T 세포 수용체(TCR)와 공-수용체의 세포질성 서열 및 또한 동일한 기능적 능력을 갖는 임의의 합성 서열도 포함한다.
TCR 만을 통해 생성된 시그날이 T 세포의 완전한 활성화에 불충분하며 제2의 또는 공-자극 시그날이 또한 요구된다는 것은 알려져 있다. 따라서, T 세포 활성화는 세포질성 신호 서열의 2개의 명확한 부류: TCR(주요 세포질성 신호 서열)을 통한 항원-의존적 주요 활성화를 개시하는 것들 및 항원-독립적인 방식으로 작용하여 제2의 또는 공-자극 신호를 제공하는 것들(제2의 세포질성 신호 서열)에 의해 매개되는 것으로 일컬어질 수 있다.
주요 세포질성 신호 서열은 자극성 방식, 또는 억제성 방식으로 TCR 복합체의 주요 활성화를 조절한다. 자극성 방식으로 작용하는 주요 세포질성 신호 서열은 면역수용체 타이로신계 활성화 모티프(motif) 또는 ITAM으로서 공지된 신호 모티프를 함유할 수 있다.
본 발명에서 특수하게 사용되는 주요 세포질성 신호 서열을 함유하는 ITAM의 예는 TCR 제타, FcR 감마, FcR 베타, CD3 감마, CD3 델타, CD3 엡실론, CD5, CD22, CD79a, CD79b, 및 CD66d로부터 기원한 것들을 포함한다. 본 발명의 CAR의 세포질성 신호 분자는 CD3 제타로부터 기원한 세포질성 신호 서열을 포함하는 것이 특히 바람직하다.
바람직한 실시형태에서, CAR의 세포질성 도메인은 자체로서 또는 본 발명의 CAR과 관련하여 유용한 임의의 다른 바람직한 세포질성 도메인(들)과 함께 CD3-제타 신호 도메인을 포함하도록 설계될 수 있다. 예를 들어, CAR의 세포질성 도메인은 CD3 제타 쇄 부위 및 공자극 신호 영역을 포함할 수 있다. 공자극 신호 영역은 공자극 분자의 세포내 영역을 포함하는 CAR의 부위를 말한다. 공자극 분자는 림프구의 항원에 대한 효과적인 반응에 요구되는 항원 수용체 또는 이들의 리간드 이외의 세포 표면 분자이다. 이러한 분자의 예는 CD27, CD28, 4-1BB(CD137), OX40, CD30, CD40, PD-1, ICOS, 림프구 기능-관련된 항원-1(LFA-1), CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, 및 CD83과 특이적으로 결합하는 리간드 등을 포함한다. 따라서, 본 발명이 공-자극성 신호 성분으로서 주로 4-1BB와 함께 예시되어 있다고 해도, 다른 공자극 성분도 본 발명의 영역 내에 있다.
본 발명의 CAR의 세포질성 신호 부위내 세포질성 신호 서열은 무작위적인 또는 명시된 순서로 서로 연결될 수 있다. 임의로, 바람직하게는, 길이가 2 내지 10개 아미노산인 짧은 올리고- 또는 폴리펩타이드 링커는 결합을 형성할 수 있다. 글리신-세린 이중자가 특히 적합한 링커를 제공한다.
하나의 실시형태에서, 세포질성 도메인은 CD3-제타의 신호 도메인 및 CD28의 신호 도메인을 포함하도록 설계된다. 다른 실시형태에서, 세포질성 도메인은 CD3-제타의 신호 도메인 및 4-1BB의 신호 도메인을 포함하도록 설계된다. 여전히 다른 구현에에서, 세포질성 도메인은 CD3-제타의 신호 도메인 및 CD28 및 4-1BB의 신호 도메인을 포함하도록 설계된다.
하나의 실시형태에서, 본 발명의 CAR내 세포질성 도메인은 4-1BB의 신호 도메인 및 CD3-제타의 신호 도메인을 포함하도록 설계된다.
벡터
본 발명은 CAR의 서열을 포함하는 벡터를 생산하는 방법을 포함하며, 여기서 당해 서열은 세포내 도메인의 핵산 서열에 작동적으로 연결된 항원 결합 잔기의 핵산 서열을 포함한다. 본 발명의 벡터의 CAR 속에 사용될 수 있는 예시적인 세포내 도메인은 CD3-제타, CD28, 4-1BB 등의 세포내 도메인을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 일부 예에서, CAR은 CD3-제타, CD28, 4-1BB 등의 임의의 조합도 포함할 수 있다.
하나의 구현에에서, 본 발명의 벡터의 CAR은 항-CD19 scFv, 인간 CD8 힌지 및 전이막 도메인, 및 인간 4-1BB 및 CD3제타 신호 도메인을 포함한다.
목적한 분자를 암호화하는 핵산 서열은 예를 들면, 유전자를 발현하는 세포로부터의 라이브러리(library)를 스크리닝하거나, 유전자를 포함하는 것으로 공지된 벡터로부터 이를 유도시키거나, 유전자를 함유하는 세포 및 조직으로부터 표준 기술을 사용하여 직접 분리함으로서 수득할 수 있다. 달리는, 목적한 유전자는 클로닝되기보다는, 합성적으로 생산될 수 있다.
본 발명은 또한, 본 발명의 DNA가 삽입된 벡터를 제공한다. 렌티바이러스와 같은 레트로바이러스로부터 기원한 벡터는 딸 세포(daughter cell) 내에서 이식유전자 및 이의 후대의 장기간의, 안정한 통합을 허용하므로 장기간 유전자 전달을 달성하는데 적합한 도구이다. 렌티바이러스 벡터는, 이들이 간세포와 같은 비-증식성 세포를 형질도입할 수 있다는 점에서 쥐 백혈병 바이러스와 같은 종양-레트로바이러스로부터 기원한 벡터보다 추가된 장점을 가진다. 이들은 또한 낮은 면역원성의 추가된 장점을 가진다.
요약하면, CAR을 암호화하는 천연의 또는 합성 핵산의 발현은 CAR 폴리펩타이드 또는 이의 부위를 암호호하는 핵산을 프로모터에 작동적으로 연결시키고, 당해 작제물을 발현 벡터 내로 도입시킴으로써 전형적으로 달성된다. 벡터는 복제 및 통합 진핵세포에 적합할 수 있다. 대표적인 클로닝 벡터는 목적한 핵산 서열의 발현의 조절에 유용한 전사 및 해독 종결인자, 개시 서열, 및 프로모터를 함유한다.
본 발명의 발현 작제물은 또한 표준 유전자 전달 프로토콜을 사용하여, 핵산 면역화 및 유전자 치료요법에 사용할 수 있다. 유전자 전달 방법은 당해 분야에 공지되어 있다. 예를 들면, 이의 전문이 본 명세서에 참조로 포함된, 미국 특허 제5,399,346호, 제5,580,859호, 제5,589,466호를 참조한다. 또 다른 실시형태에서, 본 발명은 유전자 치료요법 벡터를 제공한다.
핵산은 다수의 유형의 벡터 내로 클로닝될 수 있다. 예를 들어, 핵산은 플라스미드, 파지미드, 파지 유도체, 동물 바이러스, 및 코스미드를 포함하나, 이에 한정되지 않는 벡터내로 클로닝될 수 있다. 특히 흥미있는 벡터는 발현 벡터, 복제 벡터, 프로브 생성 벡터(probe generation vector), 및 서열분석 벡터를 포함한다.
또한, 발현 벡터는 바이러스 벡터의 형태로 세포에 제공될 수 있다. 바이러스 벡터 기술은 당해 분야에 잘 공지되어 있으며 예를 들면, 샘브룩(Sambrook) 등의 문헌(참조: 2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York), 및 다른 바이러스학 및 분자 생물학 매뉴얼에 기술되어 있다. 벡터로서 유용한 바이러스는 레트로바이러스, 아데노바이러스, 아데노-관련 바이러스, 헤르페스 바이러스, 및 렌티바이러스를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 일반적으로, 적합한 벡터는 적어도 하나의 유기체, 프로모터 서열, 편리한 제한 엔도뉴클레아제 부위, 및 하나 이상의 선택가능한 마커내에서 기능성인 복제 오리진(origin of replication)을 함유한다(예를 들면, 제WO 01/96584호; 제WO 01/29058호; 및 미국 특허 제6,326,193호).
다수의 바이러스계 시스템은 포유동물 세포내로의 유전자 전달을 위해 개발되어 왔다. 예를 들어, 레트로바이러스는 유전자 전달 시스템을 위한 편리한 플랫포옴을 제공한다. 선택된 유전자는 당해 분야에 공지된 기술을 사용하여 벡터 내로 삽입하거나 레트로바이러스 입자내에 패키징할 수 있다. 이후에, 재조합체 바이러스는 분리하여 피검자의 세포 내로 생체내 또는 생체외에서 전달할 수 있다. 다수의 레트로바이러스 시스템은 당해 분야에 공지되어 있다. 일부 실시형태에서, 아데노바이러스 벡터가 사용된다. 다수의 아데노바이러스 벡터는 당해 분야에 공지되어 있다. 하나의 실시형태에서, 렌티바이러스 벡터가 사용된다.
추가의 프로모터 성분, 예를 들면, 인핸서는 전사 개시의 빈도를 조절한다. 전형적으로, 이들은, 다수의 프로모터가 최근에 출발 부위의 하부의 기능성 성분을 또한 함유한다고 해도, 출발 부위의 30 내지 110bp 영역 내에 위치한다. 프로모터 성분들 사이의 스페이스화(spacing)는 흔히 굴곡성이어서, 성분이 삽입되거나 서로에 대해 이동하는 경우에 프로모터 기능은 보존된다. 티미딘 키나제(tk) 프로모터에 있어서, 프로모터 성분들 사이의 스페이스화는 활성이 감소되기 시작하기 전에 50bp 떨어져서 증가될 수 있다. 프로모터에 따라서, 개개 성분은 협동적으로 또는 독립적으로 기능하여 전사를 활성화시킬 수 있는 것으로 여겨진다.
적합한 프로모터의 하나의 예는 이미디어트 얼리 사이토메갈로바이러스(immediate early cytomegalovirus: CMV) 프로모터 서열이다. 당해 프로모터 서열은 이에 작동적으로 연결된 임의의 폴리뉴클레오타이드 서열의 고수준의 발현을 구동시킬 수 있는 강력한 구성적 프로모터 서열이다. 적합한 프로모터의 다른 예는 연장 성장 인자-1α(EF-1α)이다. 그러나, 시미안 바이러스 40(SV40) 얼리 프로모터, 마우스 유방 종양 바이러스(MMTV), 인간 면역결핍성 바이러스(HIV) 긴 말단 반복체(LTR) 프로모터, MoMuLV 프로모터, 조류 백혈병 바이러스 프로모터, 엡슈타인-바르 바이러스 이미디트 얼리 프로모터, 로우스 육종 바이러스 프로모터, 및 또한 액틴 프로모터, 미오신 프로모터, 헤모글로빈 프로모터, 및 크레아틴 키나제 프로모터와 같은, 그러나 이에 한정되지 않는 인간 유전자 프로모터를 포함하나, 이에 한정되지 않는 다른 구성적 프로모터 서열이 또한 사용될 수 있다. 또한, 본 발명은 구성적 프로모터의 용도에 한정되지 않아야 한다. 유도성 프로모터 또한 본 발명의 일부로 고려된다. 유도성 프로모터의 사용은, 발현이 요구되는 경우, 이것이 작동적으로 연결된 폴리뉴클레오타이드 서열의 발현을 작동시킬 수 있거나, 발현이 요구되지 않는 경우 발현을 작동시키지 않을 수 있는 분자 스위치를 제공한다. 유도성 프로모터의 예는 메탈로티오닌 프로모터, 글루코코르티코이드 프로모터, 프로게스테론 프로모터, 및 테트라사이클린 프로모터를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
CAR 폴리펩타이드 또는 이의 일부의 발현을 평가하기 위하여, 세포 내로 도입될 발현 벡터는 또한 선택가능한 마커 유전자 또는 리포터 유전자(reporter gene) 또는 이들 둘 다를 함유함으로써 바이러스 벡터를 통해 형질감염시키거나 감염시키는 것이 추구되는 세포의 집단으로부터의 발현 세포의 확인 및 선택을 촉진시킬 수 있다. 다른 국면에서, 선택가능한 마커는 DNA의 별도의 조각에서 수행될 수 있으며 공-형질감염 과정에 사용될 수 있다. 선택가능한 마커 및 리포터 유전자 둘 다는 적절한 조절 서열과 함께 플랭킹(flanking)되어 숙주 세포 내에서 발현될 수 있다. 유용한 선택가능한 마커는 예를 들면, neo 등과 같은 항생제-내성 유전자를 포함한다.
리포터 유전자는 잠재적으로 형질감염된 세포를 확인하고 조절 서열의 기능성을 평가하는데 사용된다. 일반적으로, 리포터 유전자는 수용체 유기체 또는 조직 속에 존재하지 않거나 이에 의해 발현되지 않고 이의 발현이 일부 용이하게 검출가능한 특성, 예를 들면, 효소 활성에 의해 나타나는 폴리펩타이드를 암호화하는 유전자이다. 리포터 유전자의 발현은, DNA가 수용체 세포내로 도입된 후 적절한 시기에 검정된다. 적합한 리포터 유전자는 루시퍼라제, 베타-갈락토시다제, 클로람페니콜 아세틸 트랜스퍼라제, 분비된 알칼린 포스파타제, 또는 녹색 형광성 단백질 유전자를 암호화하는 유전자를 포함할 수 있다(예를 들면, Ui-Tei et al., 2000 FEBS Letters 479: 79-82). 적합한 발현 시스템은 잘 공지되어 있으며 공지된 기술을 사용하여 제조할 수 있거나 상업적으로 수득될 수 있다. 일반적으로, 리포터 유전자의 최대 수준의 발현을 나타내는 최소의 5' 플랭킹 영역을 지닌 작제물은 프로모터로 확인된다. 이러한 프로모터 영역은 리포터 유전자에 연결되어 프로모터-구동된 전사를 조절하기 위한 능력에 대해 제제를 평가하는데 사용될 수 있다.
유전자를 세포 내로 도입시키고 발현시키는 방법은 당해 분야에 공지되어 있다. 발현 벡터와 관련하여, 벡터는 숙주 세포, 예를 들면, 포유동물, 세균, 효모, 또는 곤충 세포 내로 당해 분야의 임의의 방법에 의해서도 용이하게 도입될 수 있다. 예를 들어, 발현 벡터는 물리적, 화학적, 또는 생물학적 수단에 의해 숙주 세포 내로 전달될 수 있다.
폴리뉴클레오타이드를 숙주 세포 내로 도입시키는 물리적 방법은 인산칼슘 침전, 지질감염, 입자 충격(particle bombardment), 미세주입, 전기천공(electroporation) 등을 포함한다. 벡터 및/또는 외인성 핵산을 포함하는 세포를 생산하는 방법은 당해 분야에 잘 공지되어 있다[참조: 예를 들면, Sambrook et al.(2001), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York]. 폴리뉴클레오타이드를 숙주 세포 내로 도입시키기 위한 바람직한 방법은 인산칼슘 형질감염이다.
목적한 폴리뉴클레오타이드를 숙주 세포 내로 도입시키기 위한 생물학적 방법은 DNA 및 RNA 벡터의 사용을 포함한다. 바이러스 벡터, 및 특히 레트로바이러스 벡터는 유전자를 포유동물, 예를 들면, 인간 세포내로 삽입시키기 위해 가장 광범위하게 사용된 방법이 되어 왔다. 다른 바이러스 벡터는 렌티바이러스, 폭스바이러스, 헤르페스 단성 바이러스 I, 아데노바이러스 및 아데노-관련 바이러스 등으로부터 기원할 수 있다(참조: 예를 들면, 미국 특허 제5,350,674호 및 제5,585,362호).
폴리뉴클레오타이드를 숙주 세포 내로 도입시키기 위한 화학적 수단은 거대분자 복합체, 나노캡슐, 미세구, 비드, 및 수중유 유액((oil-in-water emulsion), 미셀(micelle), 혼합된 미셀, 및 리포좀을 포함하는 지질계 시스템과 같은 콜로이드성 분산 시스템을 포함한다. 시험관내 및 생체 내에서 전달 비히클로서 사용하기 위한 예시적인 콜로이드성 시스템은 리포좀(예를 들면, 인공 막 소낭)이다.
비-바이러스 전달 시스템이 이용되는 경우에, 예시적인 전달 비히클은 리포좀이다. 지질 제형의 사용은 핵산을 숙주 세포(시험관내, 생체외 또는 생체내)내로 도입시키기 위해 고려된다. 다른 국면에서, 핵산은 지질과 연합될 수 있다. 지질과 연합된 핵산은 리포좀의 수성 내부 속에 봉입되거나 리포좀의 지질 이층 내에 배치되거나, 리포좀 및 올리고뉴클레오타이드 둘다와 연합된 연결 분자를 통해 리포좀에 부탁되거나, 리포좀 속에 엔트랩핑(entrapping)되거나, 리포좀과 복합체화되거나, 지질을 함유하는 용액 속에 분산되거나, 지질과 혼합되거나, 지질화 합해지거나, 지질 속에 현탁액으로서 함유되거나, 미셀과 함께 함유되거나 복합체화되거나, 또는 달리는 지질과 연합될 수 있다. 지질, 지질/DNA 또는 지질/발현 벡터 관련된 조성물은 용액 속의 임의의 특수 구조에 한정되지 않는다. 예를 들면, 이들은 미셀로서 이층 구조 속에, 또는 "붕괴된(collapsed)" 구조로 존재할 수 있다. 이들은 또한 단순히 용액 속에 배치되어, 가능하게는 크기 또는 유형에 있어서 균일하지 않은 응집체를 형성할 수 있다. 지질은 천연적으로 존재하거나 합성 지질일 수 있는 지방 물질이다. 예를 들어, 지질은 세포질 속에서 천연적으로 발생할 수 있는 지방 소적 및 또한 장쇄 지방 탄화수소 및 이들의 유도체, 예를 들면, 지방산, 알코올, 아민, 아미노 알코올, 및 알데하이드를 함유하는 화합물의 부류를 포함한다.
사용하기에 적합한 지질은 시판 공급원으로부터 수득될 수 있다. 예를 들면, 디미리스틸 포스파티딜콜린("DMPC")은 미주리주 세인트 루이스 소재의 Sigma로부터 수득될 수 있으며; 디세틸 포스페이트("DCP")는 뉴욕주 플레인뷰 소재의 K & K Laboratories로부터 수득될 수 있으며; 콜레스테롤("Choi")은 Calbiochem-Behring으로부터 수득될 수 있으며; 디미리스틸 포스파티딜글리세롤("DMPG") 및 다른 지질은 알라바마주 버밍햄 소재의 Avanti Polar Lipids, Inc.로부터 수득될 수 있다. 클로로포름 또는 클로로포름/메탄올 중 지질의 스톡 용액(stock solution)은 약 -20℃에서 저장할 수 있다. 클로로포름은 메탄올보다 더 용이하게 증발되므로 단지 용매로 사용된다. "리포좀"은 내포된 지질 이층 또는 응집체의 생성에 의해 형성된 각종의 단일 및 다층라멜라 지질 비히클을 포함하는 일반적인 용어이다. 리포좀은 인지질 이층 막 및 내부 수성 매질을 지닌 소낭 구조를 갖는 것으로 특징화될 수 있다. 다중라멜라 리포좀은 수성 매질에 의해 분리된 다중 지질 층을 갖는다. 이들은, 인지질이 과량의 수용액 속에 현탁되는 경우 자발적으로 형성된다. 지절 성분은, 밀폐된 구조의 형성 전에 자가-재배열을 겪고 지질 이층 사이에 물과 용해된 용질을 엔트래핑한다(참조: Ghosh et al., 1991 Glycobiology 5: 505-10). 그러나, 정상 소낭 구조보다 용액 중에서 상이한 구조를 갖는 조성물이 또한 포함된다. 예를 들면, 지질은 미셀 구조로 추정될 수 있거나 지질 분자의 불균일한 응집체로서 단지 존재할 수 있다. 또한 리포펙타민-핵산 복합체가 고려된다.
외인성 핵산을 숙주 세포 내로 도입하거나 또한 세포를 본 발명의 억제제에 노출시키는데 사용된 방법과 무관하게, 숙주 세포 내에서 재조합체 DNA 서열의 존재를 확인하기 위하여, 각종 검정을 수행할 수 있다. 이러한 검정은 예를 들면, 서던 및 노던 블롯팅(Southern and Northern blotting), RT-PCR 및 PCR과 같이, 당해 분야의 숙련가에게 잘 공지된 "분자 생물학적" 검정; 예를 들면, 면역학적 수단(ELISA 및 웨스턴 블롯(Western blots))에 의해 또는 본 명세서에 기술된 검정에 의해 특수 펩타이의 존재 또는 부재를 검출하여 본 발명의 영역 내에 속하는 제제를 확인하는 것과 같은 "생화학적" 검정을 포함한다.
T 세포의 공급원
본 발명의 T 세포의 확장 및 유전적 변형 전에, T 세포의 공급원을 피검자로부터 수득한다. T 세포는 말초 혈액 단핵 세포, 골수, 림프절 조직, 제대혈, 흉선 조직, 감염 부위로부터의 조직, 복수액, 흉막 삼출액, 비장 조직, 및 종양을 포함하는 다수의 공급원으로부터 수득될 수 있다. 본 발명의 특정의 실시형태에서, 당해 분야에서 이용가능한 임의의 수의 T 세포주도 사용될 수 있다. 본 발명의 특정의 실시형태에서, T 세포는 FicollTM 분리와 같은, 숙련가에게 공지된 임의의 수의 기술을 사용하여 피검자로부터 수집된 혈액의 단위로부터 수득될 수 있다. 하나의 바람직한 실시형태에서, 개체의 순환하는 혈액으로부터의 세포는 성분채집술에 의해 수득된다. 성분채집술 생성물은 전형적으로 T 세포, 단핵구, 과립구, B 세포, 다른 핵화된 백혈구 세포, 적혈구 세포, 및 혈소판을 포함하는 림프구를 함유한다. 하나의 실시형태에서, 성분채집술에 의해 수집된 세포를 세척하여 혈장 분획을 제거하고 세포를 후속적인 공정 단계를 위한 적절한 완충액 또는 매질 속에 둘 수 있다. 본 발명의 하나의 실시형태에서, 세포를 인산염 완충액 염수(PBS)로 세척한다. 대안적인 실시형태에서, 세척 용액은 칼슘을 결여하며 마그네슘을 결여할 수 있거나 모든 2가 양이온은 아니라 해도 많은 것을 결여할 수 있다. 다시, 놀랍게도, 칼슘의 부재 하에서 초기 활성화 단계는 확대된 활성화를 초래한다. 당해 분야의 통상의 기술자가 용이하게 인식할 수 있는 바와 같이, 세척 단계는 표준 원심분리, 반-자동화된 "유동-통과(flow-through)" 원심분리(예를 들면, Cobe 2991 세포 프로세서, Baxter CytoMate, 또는 Haemonetics Cell Saver 5)를 사용하는 것과 같은, 당해 분야에 공지된 방법에 의해 제조업자의 지시에 따라 달성할 수 있다. 세척 후, 세포는 예를 들면, Ca2+가 없는, Mg2+가 없는 PBS, PlasmaLyte A, 0.45% 염화나트륨 중 5% 덱스트로즈, 또는 완충제의 임의의 조합이 있거나 없는 다른 염수 용액과 같은 다양한 생물적합성 완충액 속에 재현탁시킬 수 있다. 달리는, 성분채집술 시료의 바람직하지 않은 성분을 제거할 수 있고 세포를 배양 배지 속에 직접 재현탁시켰다.
다른 실시형태에서, T 세포는 예를 들면, PERCOLLTM 구배를 통한 원심분리 또는 역류 원심분리 용출 또는 Miltenyi CliniMACS, 또는 자기 비드, 또는 항체에 커플링된 자기 비드에 의해 적혈구 세포를 분해하고 단핵구를 고갈시켜 말초 혈액 림프구로부터 분리한다. CD3+, CD28+, CD4+, CD8+, CD45RA+, CD45RO+, CD62L+, CD127+ T 세포와 같은 T 세포의 특이적인 소집단은 양성 또는 음성 선택 기술에 의해 추가로 분리하거나 고갈시킬 수 있다. 예를 들면, 하나의 실시형태에서, T 세포는 항-CD3/항-CD28(즉, 3x28)-접합된 비드, 예를 들면, DYNABEADS® M-450 CD3/CD28 T와 함께 바람직한 T 세포의 긍정적인 선택에 충분한 기간 동안 항온처리하여 분리한다. 하나의 실시형태에서, 상기 기간은 약 30분이다. 추가의 실시형태에서, 상기 기간은 30분 내지 36시간 이상 및 이들 사이의 모든 정수 값의 범위이다. 추가의 실시형태에서, 상기 기간은 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 또는 6 시간이다. 여전히 다른 바람직한 실시형태에서, 상기 기간은 10 내지 24시간이다. 하나의 바람직한 실시형태에서, 항온처리 기간은 24시간이다. 백혈병 환자로부터 T 세포의 분리를 위해, 보다 긴 항온처리 시간, 예를 들면 24시간의 사용은 세포 수율을 증가시킬 수 있다. 보다 긴 항온처리 시간을 사용하여 종양 조직 또는 면역-약화된 개체로부터의 종양 침윤 림프구(TIL)를 분리하는 것에서와 같이, 다른 세포 유형과 비교하여 T 세포가 거의 존재하지 않는 임의의 상황에서도 T 세포를 분리하는데 사용될 수 있다. 또한, 보다 긴 항온처리 시간의 사용은 CD8+ T 세포의 포획 효능을 증가시킬 수 있다. 따라서, 상기 시간을 단순히 단축시키거나 연장시킴으로써 T 세포가 CD3/CD28 비드에 결합하도록 하고/하거나 T 세포에 대한 비드의 비율을 증가시키거나 감소시킴으로써(본 명세서에 추가로 기술된 바와 같음), T 세포의 소집단을 상기 공정 동안 배양 개시 또는 다른 시점에서 배양 개시를 위해 또는 이에 대해 우선적으로 선택할 수 있다. 추가로, 비드 또는 다른 표면 위의 항-CD3 및/또는 항-CD28 항체의 비율을 증가시키거나 감소시킴으로써, T 세포의 소집단을 배양 개시 또는 다른 바람직한 시점 동안 또는 이에 대해 우선적으로 선택할 수 있다. 당해 분야의 숙련가는, 다수 라운드의 선택을 또한 본 발명의 내용에서 사용할 수 있음을 인식할 것이다. 특정의 실시형태에서, 선택 과정을 수행하고 활성화 및 확장 공정에서 "선택되지 않은" 세포를 사용하는 것이 바람직할 수 있다. "선택되지 않은" 세포는 또한 선택의 추가의 라운드에 처리할 수 있다.
음성적인 선택에 의한 T 세포 집단의 농축은 부정적으로 선택된 세포에 대해 독특한 표면 마커에 대해 지시된 항체의 조합으로 달성할 수 있다. 다른 방법은 음성적으로 선택된 세포 상에 존재하는 세포 표면 마커에 대해 지시된 모노클로날 항체의 콕테일(cocktail)을 사용하는 유동 세포분석 또는 음성 자기 면역부착을 통한 세포 분류 및/또는 선택이다. 예를 들어, 음성적 선택에 의해 CD4+ 세포를 농축시키기 위해, 모노클로날 항체 콕테일은 전형적으로 CD14, CD20, CD11b, CD16, HLA-DR, 및 CD8에 대한 항체를 포함한다. 특정의 실시형태에서, CD4+, CD25+, CD62Lhi, GITR+, 및 FoxP3+를 전형적으로 발현하는 조절성 T 세포에 대해 농축시키거나 양성적으로 선택하는 것이 바람직할 수 있다. 달리는, 특정의 실시형태에서, T 조절 세포는 항-CD25 접합된 비드 또는 다른 유사한 선택 방법에 의해 고갈된다.
양성 또는 음성적 선택에 의한 바람직한 세포 집단의 분리를 위해, 세포 및 표면(예를 들면, 비드와 같은 입자)의 농축은 변할 수 있다. 특정의 실시형태에서, 용적을 유의적으로 감소시키는 것이 바람직할 수 있는데, 여기서 비드 및 세포는 함께 혼합되어(즉, 세포의 농도를 증가시켜), 세포 및 비드의 최대 접촉이 보증된다. 예를 들면, 하나의 실시형태에서, 20억개의 세포/ml의 농도가 사용된다. 하나의 실시형태에서, 10억개의 세포/ml의 농도가 사용된다. 추가의 실시형태에서, 1억개 이상의 세포/ml가 사용된다. 추가의 실시형태에서, 1,000, 1,500, 2,000, 2,500, 3,000, 3,500, 4,000, 4,500, 또는 5,000만개의 세포/ml의 농도가 사용된다. 여전히 다른 실시형태에서, 7,500, 8,000, 8,500, 9,000, 9,500만개 또는 1억개의 세포/ml의 농도가 사용된다. 추가의 실시형태에서, 1억 2천 500만개 또는 1억 5천만개의 세포/ml의 농도가 사용될 수 있다. 고 농도의 사용은 증가된 세포 수율, 세포 활성화, 및 세포 확장을 초래할 수 있다. 또한, 높은 세포 농도의 사용은 CD28-음성 T 세포와 같은, 목적한 표적 항원을 약하게 발현할 수 있는 세포, 또는 많은 종양 세포가 존재하는 경우의 시료(즉, 백혈구 혈액, 종양 조직 등)로부터 세포의 보다 효율적인 포획을 허용한다. 이러한 세포의 집단은 치료학적 가치를 가질 수 있으며 수득하기에 바람직할 수 있다. 예를 들어, 고 농도의 세포를 사용하는 것은 일반적으로 보다 약한 CD28 발현을 가지는 CD8+ T 세포의 보다 효율적인 선택을 허용한다.
관련 실시형태에서, 세포의 보다 낮은 농도를 사용하는 것이 바람직할 수 있다. T 세포 및 표면(예를 들면, 비드와 같은 입자)의 혼합물을 유의적으로 희석시킴으로써, 입자와 세포 사이의 상호작용을 최소화시킨다. 이는 입자에 결합될 목적한 항원의 높은 양을 발현하는 세포를 선택한다. 예를 들어, CD4+ T 세포는 보다 높은 수준의 CD28을 발현하며 희석 농도에서 CD8+ T 세포보다 더 효율적으로 포획된다. 하나의 실시형태에서, 사용된 세포의 농도는 5×106/ml이다. 다른 실시형태에서, 사용된 농도는 약 1×105/ml 내지 1×106/ml, 및 이들 사이의 임의의 정수일 수 있다.
다른 실시형태에서, 세포는 2 내지 37℃에서 다양한 속도로 다양한 기간 동안 회전기 위에서 항온처리될 수 있다.
자극용 T 세포는 또한 세척 단계 후 동결될 수 있다. 이론에 얽메일 필요없이, 동결 및 후속적인 해동 단계는 세포 집단 속의 과립구 및 어느 정도 단핵구를 제거함으로써 보다 균일한 생성물을 제공한다. 혈장 및 혈소판을 제거하는 세척 단계 후에, 세포를 동결 용액 속에 현탁시킬 수 있다. 많은 동결 용액 및 매개변수가 당해 분야에 공지되어 있고 이와 관련하여 유용할 것이지만, 한가지 방법은 20% DMSO 및 8% 인간 혈청 알부민을 함유하는 PBS, 또는 10% 덱스트란 40 및 5% 덱스트로즈, 20% 인간 혈청 알부민 및 7.5% DMSO, 또는 31.25% Plasmalyte-A, 31.25% 덱스트로즈 5%, 0.45% NaCl, 10% 덱스트란 40 및 5% 덱스트로즈, 20% 인간 혈청 알부민, 및 7.5% DMSO를 함유하는 배양 배지 또는 예를 들면, 헤스판 또는 펜타스타치(pentastarch), 및 플라스마라이트(PlasmaLyte) A를 함유하는 다른 적합한 세포 동결 매질을 포함하며, 이후에 세포는 -80℃에서 분당 1°의 속도로 동결시켜 액체 질소 저장 탱크의 진공 상 속에 저장한다. 조절된 동결 및 또한 조절되지 않은 동결의 다른 방법을 -20℃에서 또는 액체 질소 속에서 즉시 사용할 수 있다.
특정의 실시형태에서, 동결보존된 세포를 본 명세서에 기술된 바와 같이 해동시켜 세척하여 본 발명의 방법을 사용한 활성화 전에 실온에서 1시간 동안 둘 수 있다.
또한 본 명세서에 기재된 바와 같은 확장된 세포가 요구될 수 있는 때 이전의 시기에 피검자로부터 혈액 시료 또는 성분채집 생성물의 수집이 본 명세서의 내용에서 또한 고려된다. 이와 같이, 확장될 세포의 공급원은 필요한 임의의 시기에, 및 본 명세서에 기술된 것과 같은, T 세포 치료요법으로부터 유리할 수 있는 특정 수의 질병 또는 상태에 대한 T 세포 치료요법에서 이후에 사용하기 위해 분리되거나 동결된, T 세포와 같은 바람직한 세포에서 수집될 수 있다. 하나의 실시형태에서, 혈액 시료 또는 성분채집은 일반적으로 건강한 피검자로부터 취한다. 특정의 실시형태에서, 혈액 시료 또는 성분채집은 질병으로 진행될 위험이 있지만, 아직 질병으로 진행되지 않은, 일반적으로 건강한 피검자로부터 취하며, 목적한 세포는 추후 사용을 위해 분리하여 동결시킨다. 특정의 실시형태에서, T 세포는 확장되고, 동결된 다음, 나중에 사용될 수 있다. 특정한 실시형태에서, 시료는 본 명세서에 기술된 바와 같이 그러나 임의의 치료 전에 특수 질병의 진단 직후 환자로부터 수집된다. 추가의 실시형태에서, 세포는 혈액 시료 또는 피검자의 성분분석으로부터 나탈리주맙, 에팔리주맙, 항바이러스제, 화학치료요법, 방사선, 면역억제제, 예를 들면, 사이클로스포린, 아자티오프린, 메토트렉세이트, 마이코페놀레이트, 및 FK506, 항체, 또는 CAMPATH, 항-CD3 항체, 사이톡산, 플루다라빈, 사이클로스포린, FK506, 라파마이신, 마이코페놀산, 스테로이드, FR901228, 및 조사(irradiation)와 같은 면역 제제를 사용한 치료를 포함하나 이에 한정되지 않는 임의의 수의 관련 치료 양상 전에 환자로부터 분리된다. 이들 약물은 칼슘 포스페이트 의존성 포스파타제 칼시네우린(사이클로스포린 및 FK506)을 억제하거나 성장 인자 유도된 신호에 중요한 p70S6 키나제(라파마이신)을 억제한다(참조: Liu et al., Cell 66:807-815, 1991; Henderson et al., Immun. 73:316-321, 1991; Bierer et al., Curr. Opin. Immun. 5:763-773, 1993). 추가의 실시형태에서, 세포는 환자로부터 분리되어 골수 또는 줄기 세포 이식, 풀루다라빈, 외부-빔 방사선 치료요법(XRT), 사이클로포스파미드, 또는 OKT3 또는 CAMPATH와 같은 항체와 같은 화학치료 요법제를 사용하는 T 세포 치료요법과 함께(예를 들면, 전에, 동시에 또는 이후에) 후속 사용을 위해 동결된다. 다른 실시형태에서, 세포는 CD20과 반응하는 제제, 예를 들면, 리툭산과 같은 B-세포 제거 치료요법 후 치료용 후속 사용을 위해 동결시킬 수 있다.
본 발명의 추가의 실시형태에서, T 세포는 환자로부터 치료 후 직접 수득된다. 이와 관련하여, 특정의 암 치료 후, 환자가 일반적으로 치료로부터 회복될 수 있는 기간 동안의 치료 직후, 면역계를 손상시키는 약물을 사용한 특수 치료시, 수득된 T 세포의 질은 생체외에서 확장되는 이들의 능력에 대해 최적이거나 개선될 수 있다. 유사하게, 본 명세서에 기술된 방법을 사용한 생체외 조작 후, 이들 세포는 향상된 이식(engraftment) 및 생체내 확장을 위한 바람직한 상태에 있을 수 있다. 따라서, 본 발명의 내용 내에서 T 세포, 수지 세포, 또는 조혈 계통의 다른 세포를 포함하는 혈액 세포를 당해 회수 상 동안에 수집하는 것이 고려된다. 또한, 특정의 실시형태에서, 기동(mobilization)(예를 들면, GM-CSF를 사용한 기동) 및 조건화 요법을 사용하여 피검자의 상태를 생성시킬 수 있으며, 여기서 특수한 세포 유형의 재집단화, 재순환, 재생, 및/또는 확장이 특히 치료요법 후 시간의 정의된 윈도우(defined window of time) 동안에 선호된다. 예시적인 세포 유형은 T 세포, B 세포, 수지 세포, 및 면역계의 다른 세포를 포함한다.
T 세포의 활성화 및 확장
T 세포의 유전적 변형 전 또는 후에 바람직한 CAR를 발현시키는 것에 상관없이, T 세포는 예를 들면, 미국 특허 제6,352,694호; 제6,534,055호; 제6,905,680호; 제6,692,964호; 제5,858,358호; 제6,887,466호; 제6,905,681호; 제7,144,575호; 제7,067,318호; 제7,172,869호; 제7,232,566호; 제7,175,843호; 제5,883,223호; 제6,905,874호; 제6,797,514호; 제6,867,041호; 및 미국 특허원 공보 제20060121005호에 기술된 방법을 사용하여 일반적으로 활성화시키고 확장시킬 수 있다.
일반적으로, 본 발명의 T 세포는 CD3/TCR 복합체 관련 신호를 자극하는 제제 및 T 세포의 표면에서 공-자극성 분자를 자극하는 리간드를 이에 부착된 표면과 접촉시켜 확장시킨다. 특히, T 세포 집단은 본 명세서에 기술된 바와 같이, 항-CD3 항체, 또는 이의 항원-결합 단편, 또는 표면에 고정된 항-CD22 항체와 접촉시키거나, 칼슘 이온투과담체(calcium ionophore)와 함께 단백질 키나제 C 활성화제(예를 들면, 브리오스타틴)과 접촉시키는 것과 같이 자극시킬 수 있다. T 세포의 표면에서 보조 분자의 공-자극을 위해, 보조 분자에 결합하는 리간드를 사용한다. 예를 들면, T 세포의 집단을 T 세포의 증식을 자극시키기에 적절한 조건 하에서, 항-CD3 항체 및 항-CD28 항체와 접촉시킬 수 있다. CD4+ T 세포 또는 CD8+ T 세포의 증식을 자극시키기 위해, 항-CD3 항체 및 항-CD28 항체를 사용할 수 있다. 항-CD28 항체의 예는 당해 분야에 일반적으로 공지된 다른 방법을 사용할 수 있는 바와 같이 9.3, B-T3, XR-CD28(제조원: 프랑스 베사콘 소재의 Diaclone)을 포함한다[참조: Berg et al., Transplant Proc. 30(8):3975-3977, 1998; Haanen et al., J. Exp. Med. 190(9):13191328, 1999; Garland et al., J. Immunol Meth. 227(1-2):53-63, 1999].
특정의 실시형태에서, T 세포용 주요 자극 신호 및 공-자극 신호는 상이한 프로토콜에 의해 제공될 수 있다. 예를 들어, 각각의 신호를 제공하는 제제는 용액 속에 존재하거나 표면에 커플링될 수 있다. 표면에 커플링되는 경우, 당해 제제는 동일한 표면(즉, "시스" 형성)에 커플링되거나 표면(즉, "트랜스" 형성에서)을 분리시킬 수 있다. 달리는, 하나의 제제를 표면에 커플링시키고 다른 제제를 용액 속에 커플링시킬 수 있다. 하나의 실시형태에서, 공-자극 신호를 제공하는 제제를 세포 표면에 결합시키고 주요 활성화 신호를 제공하는 제제는 용액 속에 존재하거나 표면에 커플링된다. 특정의 실시형태에서, 제제 둘 다는 용액 속에 존재할 수 있다. 다른 구현에에서, 상기 제제는 가용성 형태일 수 있으며, 이후 Fc 수용체를 발현하는 세포 또는 상기 제제에 결합할 항체 또는 다른 결합제와 같은, 표면에 교차-결합될 수 있다. 이와 관련하여, 본 발명에서 T 세포를 활성화시키고 확장하는데 사용하기 위해 고려되는 인공 항원 제시 세포(aAPCs)에 대해 예를 들면, 미국 특허원 공보 제20040101519호 및 제20060034810호를 참조한다.
하나의 실시형태에서, 2개의 제제가 비드 상에, 동일한 비드 상에, 즉 "시스"로 또는 별도의 비드로, 즉, "트랜스"로 고정될 수 있다. 예로서, 주요 활성화 신로를 제공하는 제제는 항-CD3 항체 또는 이의 항원-결합 단편이며 공-자극 신호를 제공하는 제제는 항-CD28 항체 또는 이의 항원 결합 단편이며; 제제 둘 다는 동일한 비드에 동일한 분자량으로 동시-고정화된다. 하나의 실시형태에서, CD4+ T 세포 확장 및 T 세포 성장을 위해 비드에 결합된 각각의 항체의 1:1 비를 사용한다. 본 발명의 특정의 국면에서, 비드에 결합된 항 CD3:CD28 항체의 비는, T 세포 확장에 있어서의 증가가 1:1의 비를 사용하여 관찰된 확장과 비교하여 관찰되도록 사용된다. 하나의 특수한 실시형태에서 약 1 내지 약 3배의 증가가 1:1의 비를 사용하여 관찰된 확장과 비교하여 관찰된다. 하나의 실시형태에서, 비드에 결합된 CD3:CD28 항체의 비는100:1 내지 1:100 및 이들 사이의 모든 정수 값의 범위이다. 본 발명의 하나의 국면에서, 보다 많은 항-CD28 항체가 항-CD3 항체보다 입자에 결합되는데, 즉, CD3:CD28의 비는 1 미만이다. 본 발명의 특정의 실시형태에서, 비드에 결합된 항-CD28 항체 대 항-CD3 항체의 비는 2:1 이상이다. 하나의 특수한 실시형태에서, 비드에 결합된 항체의 1:100의 CD3:CD28 비가 사용된다. 다른 실시형태에서 비드에 결합된 항체의 1:75의 CD3:CD28 비가 사용된다. 추가의 실시형태에서, 비드에 결합된 항체의 1:50의 CD3:CD28 비가 사용된다. 다른 실시형태에서, 비드에 결합된 항체의 1:30의 CD3:CD28 비가 사용된다. 하나의 바람직한 실시형태에서, 비드에 결합된 항체의 1:10의 CD3:CD28 비가 사용된다. 다른 실시형태에서, 비드에 결합된 항체의 1:3의 CD3:CD28 비가 사용된다. 여전히 다른 실시형태에서, 비드에 결합된 항체의 3:1의 CD3:CD28 비가 사용된다.
1:500 내지 500:1 및 이들 사이의 임의의 정수 값의 입자 대 임의의 정수 값의 세포의 비를 사용하여 T 세포 또는 다른 표적 세포를 자극시킬 수 있다. 당해 분야의 숙련가가 용이하게 인식할 수 있는 바와 같이, 입자 대 세포의 비는 표적 세포에 대한 입자 크기에 의존할 수 있다. 예를 들어, 보다 큰 비드가 많이 결합할 수 있다고 해도, 작은 크기의 비드만이 약간의 세포에 결합할 수 있다. 특정의 실시형태에서, 세포 대 입자의 비는 1:100 내지 100:1 및 이들 사이의 임의의 정수 값의 범위이며 추가의 실시형태에서 당해 비는 1:9 내지 9:1 및 이들 사이의 임의의 정수 값을 포함하며, T 세포를 자극하는데 사용될 수 있다. 항-CD3- 및 항-CD28-커플링된 입자 대 T 세포 자극을 초래하는 T 세포의 비는 위에서 나타낸 바와 같이 변할 수 있지만, 특정의 바람직한 값은 1:100, 1:50, 1:40, 1:30, 1:20, 1:10, 1:9, 1:8, 1:7, 1:6, 1:5, 1:4, 1:3, 1:2, 1:1, 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 6:1, 7:1, 8:1, 9:1, 10:1, 및 15:1을 포함하며, 하나의 바람직한 비는 T 세포당 적어도 1:1의 입자이다. 하나의 실시형태에서, 1:1 이하의 입자 대 세포의 비가 사용된다. 하나의 특수 실시형태에서, 바람직한 입자: 세포 비는 1:5이다. 추가의 실시형태에서, 입자 대 세포의 비는 자극 일에 따라 변할 수 있다. 예를 들면, 하나의 실시형태에서, 입자 대 세포의 비는 첫째날에 1:1 내지 10:1이며 추가의 입자를 이후 매일 또는 격일로 10일까지 세포에 첨가하면 최종 비는 1:1 내지 1:10(첨가 일에 세포 수를 기준으로 함)이다. 하나의 특수 실시형태에서, 입자 대 세포의 비는 자극 첫째 날에 1:1이고 자극의 셋째 및 다섯째 날에 1:5로 조절된다. 다른 실시형태에서, 입자는 자극의 첫째날에 1:1의 최종 비로, 및 자극의 셋째 및 다섯째 날에 1:5의 최종 비로 매일 또는 격일 기준으로 첨가된다. 다른 실시형태에서, 입자 대 세포의 비는 자극의 첫째 날에 2:1이고 자극의 셋째 및 다섯째 날에 1:10으로 조절된다. 다른 실시형태에서, 입자는 매일 또는 격일 기준으로 자극의 첫째날에 1:1의 최종 비로, 및 자극 셋째 및 다섯째 날에 1:10의 최종 비로 첨가된다. 당해 분야의 숙련가는, 다양한 다른 비가 본 발명에 사용하기에 적합할 수 있음을 인식할 것이다. 특히, 비는 입자 크기 및 세포 크기 및 유형에 따라 변할 것이다.
본 발명의 추가의 실시형태에서, T 세포와 같은 세포는 제제-피복된 비드와 결합되며, 당해 비드 및 세포는 후속적으로 분리한 후 세포를 배양한다. 대안적인 실시형태에서, 배양 전에, 제제-피복된 비드 및 세포를 분리하지 않지만 함께 배양된다. 추가의 실시형태에서, 비드 및 세포를 우선 자기력과 같은 힘을 적용하여 농축시켜, 세포 표면 마커의 증가된 연결을 생성함으로서 세포 자극을 유도한다.
예로서, 세포 표면 단백질은, 이에 항-CD3 및 항-CD28이 부착된 상자성 비드(3x28 비드)가 T 세포에 접촉하도록 함으로써 연결될 수 있다. 하나의 실시형태에서, 세포(예를 들면, 104 내지 109개의 T 세포) 및 비드(예를 들면, 1:1 비의 DYNABEADS® M-450 CD3/CD28 T 상자성 비드)를 완충액, 바람직하게는 PBS(칼슘 및 마그네슘과 같은 2가 양이온 부재) 속에서 합한다. 다시, 당해 분야의 통상의 기술자들은, 임의의 세포 농도도 사용될 수 있음을 용이하게 인식할 수 있다. 예를 들어, 표적 세포는 시료 속에서 매우 드물 수 있으며 시료 중 단지 0.01%만을 차지하거나 전체 시료(즉, 100%)는 목적한 표적 세포를 포함할 수 있다. 따라서, 임의의 세포 수도 본 발명의 내용 내에 있다. 특정의 실시형태에서, 입자 및 세포를 함께 혼합하여(즉, 세포의 농도를 증가시킴), 세포 및 입자의 최대 접촉을 보증하는 것이 바람직할 수 있다. 예를 들면, 하나의 실시형태에서, 약 20억개의 세포/ml의 농도를 사용한다. 다른 실시형태에서, 1억개 이상의 세포/ml를 사용한다. 추가의 실시형태에서, 1,000, 1,500, 2,000, 2,500, 3,000, 3,500, 4,000, 4,500, 또는 5,000만개의 세포/ml를 사용한다. 여전히 다른 실시형태에서, 7,500, 8,000, 8,500, 9,000, 9,500 만개, 또는 1억개의 세포/ml를 사용한다. 추가의 실시형태에서, 1억 2500만 또는 1억 5000만개의 세포/ml의 농도를 사용할 수 있다. 고 농도의 사용은 증가된 세포 수율, 세포 활성화, 및 세포 확장을 초래할 수 있다. 또한, 고 세포 농도의 사용은 CD28-음성 T 세포와 같은 목적한 표적 항원을 약하게 발현할 수 있는 세포의 보다 충분한 포획을 가능하도록 한다. 이러한 세포 집단은 치료학적 가치가 있으며 특정 실시형태에서 수득하기에 바람직할 수 있다. 예를 들면, 고 농도의 세포의 사용은 일반적으로 보다 약한 CD28 발현을 갖는 CD8+ T 세포의 보다 효율적인 선택을 허용한다.
본 발명의 하나의 실시형태에서, 혼합물은 수시간(약 3시간) 내지 약 14시간 또는 이들 사이의 임의의 시간당 정수 값 동안 배양될 수 있다. 다른 실시형태에서, 혼합물은 21일 동안 배양될 수 있다. 본 발명의 하나의 실시형태에서 비드 및 T 세포는 약 8일 동안 함께 배양된다. 다른 실시형태에서, 비드 및 T 세포는 2 내지 3일 동안 함께 배양된다. 수개 주기의 자극이 또한 바람직할 수 있으므로 T 세포의 배양 시간은 60일 이상일 수 있다. T 세포 배양에 적절한 조건은 혈청(예를 들면, 태아 소 또는 인간 혈청), 인터루킨-2(IL-2), 인슐린, IFN-γ, IL-4, IL-7, GM-CSF, IL-10, IL-12, IL-15, TGFβ, 및 TNF-α 또는 당해 분야의 숙련가에게 공지된 세포의 성장을 위한 임의의 다른 첨가제를 포함하는, 증식 및 생존능에 필수적인 인자를 함유할 수 있는 적절한 배지(예를 들면, 최소 필수 배지 또는 RPMI 배지 1640 또는, X-vivo 15(Lonza))를 포함한다. 세포의 성장을 위한 다른 첨가제는 표면활성제, 플라스마네이트, 및 N-아세틸-시스테인 및 2-머캅토에탄올과 같은 환원제를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 배지는, 혈청이 포함되지 않거나 T 세포의 성장 및 확장에 충분한 적절한 양의 혈청(또는 혈장) 또는 규정된 세트의 호르몬, 및/또는 소정량의 사이토킨(들)이 보충된, RPMI 1640, AIM-V, DMEM, MEM, α-MEM, F-12, X-Vivo 15, 및 X-Vivo 20, 아미노산, 피루브산나트륨, 및 비타민이 첨가된 Optimizer를 포함할 수 있다. 항생제, 예를 들어, 페니실린 및 스트렙토마이신은 단지 실험 배양물 속에 포함되며 피검자에게 주입되어야 할 세포의 배양물 속에는 포함되지 않는다. 표적 세포는 성장을 지지하는데 필수적인 조건, 예를 들면, 적절한 온도(예를 들면, 37℃) 및 대기(예를 들면, 공기 및 5% CO2) 하에서 유지된다.
다양한 자극 시간에 노출된 T 세포는 상이한 특성을 나타낼 수 있다. 예를 들면, 대표적인 혈액 또는 성분채집된 말초 혈액 단핵 세포 생성물은 세포독성 또는 억제인자 T 세포 집단(TC, CD8+)보다 더 큰 헬퍼 T 세포 집단(TH, CD4+)를 갖는다. CD3 및 CD28 수용체를 자극함에 의한 T 세포의 생체외 확장은 약 8 내지 9일 전에 주로 TH 세포로 이루어진 T 세포의 잡단을 생산하는 반면, 약 8 내지 9일 후, T 세포의 집단은 TC 세포의 매우 더 큰 집단을 포함한다. 따라서, 치료 목적에 따라, 피검자에게 TH 세포를 주로 포함하는 T 세포 집단을 주입하는 것이 유리할 수 있다. 유사하게, TC 세포의 항원-특이적인 소세트가 분리되는 경우, 이는 당해 소세트를 보다 큰 정도로 확장시키는데 유리할 수 있다.
또한, CD4 및 CD8 마커 외에도, 다른 표현형 마커는 유의적으로, 그러나 큰 부분에서, 세포 확장 공정의 과정 동안 재생가능하게 변한다. 따라서, 이러한 재생능은 특정한 목적으로 활성화된 T 세포 생성물을 조절하는 능력이 가능하도록 한다.
치료학적 용도
본 발명은 벡터(예를 들면, 렌티바이러스 벡터(LV))로 형질도입된 세포(예를 들면, T 세포)를 포함한다. 예를 들어, LV는 특이적인 항체의 항원 이식 도메인과 CD3-제타, CD28, 4-1BB, 또는 이의 임의의 조합의 세포내 도메인을 결합시키는 CAR을 암호화한다. 따라서, 일부 예에서, 형질도입된 T 세포는 CAR-중재된 T-세포 반응을 유발할 수 있다.
본 발명은 종양 항원에 대한 원시 T 세포의 특이성을 재지시하는 CAR의 사용을 제공한다. 따라서, 본 발명은 또한 포유동물에게 CAR을 발현하는 T 세포를 투여하는 단계를 포함하여, 포유동물에서 표적 세포 집단 또는 조직에 대한 T 세포-매개된 면역 반응을 자극시키는 방법을 제공하며, 여기서 상기 CAR은 예정된 표적, 인간 CD3제타, 및 공자극 신호 영역의 세포내 도메인을 포함하는 제타 쇄 부위와 특이적으로 상호작용하는 결합 잔기를 포함한다.
하나의 실시형태에서, 본 발명은, T 세포가 유전적으로 변형되어 CAR을 발현하고 CAR T 세포가 이를 필요로 하는 수용체에게 주입되는 유형의 세포 치료요법을 포함한다. 주입된 세포는 수용체에서 종양 세포를 사멸시킬 수 있다. 항체 치료요법과는 달리, CAR T 세포는 생체내에서 복제하여 지속된 종양 조절을 초래할 수 있는 장기간 지속성을 생성할 수 있다.
하나의 실시형태에서, 본 발명의 CAR T 세포는 풍부한 생체내 T 세포 확장을 겪을 수 있고 연장된 시간 동안 지속될 수 있다. 다른 실시형태에서, 본 발명의 CAR T 세포는 재활성화되어 임의의 추가의 종양 형성 또는 성장을 억제할 수 있는 특이적인 기억 T 세포로 발전한다. 예를 들면, 본 발명의 CART19 세포는 강한 생체내 T 세포 확장을 겪을 수 있으며 혈액 및 골수내에서 연장된 시간 동안 높은 수준을 지속하고 특이적인 기억 T 세포를 형성할 수 있다. 임의의 특수 이론에 얽메이려는 의도없이, CAR T 세포는 대리 항원을 발현하는 표적 세포의 직면한 및 후속적인 제거 시 중심 기억-유사 상태로 생체 내에서 분화될 수 있다.
임의의 특수 이론에 얽메이려는 의도없이, CAR-변형된 T 세포에 의해 유발된 항-종양 면역성 반응은 활성 또는 수동적 면역 반응일 수 있다. 또한, CAR 매개된 면역 반응은, CAR-변형된 T 세포가 CAR에서 항원 결합 잔기에 대해 특이적인 면역 반응을 유도할 수 있는 양자 면역치료요법 시도의 부분일 수 있다. 예를 들면, CART19 세포는 CD19를 발현하는 세포에 대해 특이적인 면역 반응을 유발한다.
본 명세서에 기재된 데이타가 FMC63 쥐 모노클로날 항체로부터 기원한 항-CD19 scFv, 인간 CD8α 힌지 및 전이막 도메인, 및 인간 4-1BB 및 CD3제타 신호 도메인을 포함하는 렌티바이러스 벡터를 상세히 기재하고 있지만, 본 발명은 본 명세서에 또한 기술된 바와 같은 작제물의 성분들 각각에 대한 특정 수의 변이를 포함하는 것으로 해석될 수 있다. 즉, 본 발명은 임의의 항원 결합 잔기에 대해 특이적인 CAR-매개된 T-세포 반응을 생성하기 위한 CAR내 특정 항원 결합 잔기의 용도를 포함한다. 예를 들면, 본 발명의 CAR내 항원 결합 잔기는 암을 치료하기 위한 목적의 종양 항원을 표적화할 수 있다.
치료될 수 있는 암은 혈관화되지 않거나 여전히 실질적으로 혈관화되지 않은 종양, 및 또한 혈관화된 종양을 포함한다. 암은 비-고형 종양(혈액 종양, 예를 들면, 백혈병 및 림프종)을 포함할 수 있거나 고형 종양을 포함할 수 있다. 본 발명의 CAR로 치료되는 암의 유형은 암종, 모세포종, 및 육종, 및 특정의 백혈병 또는 림프구 악성종양, 양성 및 악성 종양, 및 악성 암, 예를 들면, 육종, 상피성암, 및 흑색종을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 성인 종양/암 및 소아 종양/암이 또한 포함된다.
혈액암은 혈액 또는 골수의 암이다. 혈액(또는 조혈) 암의 예는 급성 백혈병(예: 급성 림프구성 백혈병, 급성 골수성 백혈병(acute myelocytic leukemia), 급성 골수성 백혈암(acute myelogenous leukemia) 및 골수아구성, 전골수구성, 골수성단구, 단핵구성 및 적백혈병), 만성 백혈병(예: 만성 골수성(과립구성) 백혈병, 만성 백혈암, 및 만성 림프구성 백혈병), 진성다혈구증, 림프종, 호지킨병(Hodgkin's disease), 비-호지킨 림프종(non-Hodgkin's lymphoma)(무통성 및 고 등급 형태), 다발 골수종, 발덴스트롬 마크로글로불린혈증, 중쇄 질병, 골수형성이상증후군, 털 세포 백혈병 및 척수형성이상증을 포함하는 백혈병을 포함한다.
고형 종양은 낭(cysts) 또는 액체 부위를 일반적으로 함유하지 않는 조직의 비정상적인 덩어리이다. 고형 종양은 양성 또는 악성일 수 있다. 상이한 유형의 고형 종양이 이들을 형성하는 세포의 유형(예를 들면, 육종, 암종 및 림프종)에 대해 명명된다. 육종 및 암종과 같은 고형 종양의 예는 섬유육종, 점액육종, 지방육종, 연골육종, 골육종, 및 다른 육종, 윤활막종, 중피종, 유잉종양(Ewing's tumor), 평활근육종, 횡문근육종, 결장암종, 림프암, 췌장암, 유방암, 폐암, 난소암, 전립샘암, 간세포 암종, 편평 세포 암종, 기저 세포 암종, 선암종, 땀샘 암종, 거대종격동전이암, 유두상갑상선암, 크롬친화성 피지선 암종(pheochromocytomas sebaceous gland carcinoma), 유두암, 유두상선암, 수질 암종, 기관지원성 암종, 신장 세포 암종, 간세포암, 담관 암종, 융모막 암종, 빌름스 종양(Wilms' tumor), 경부암, 고환 종양, 정상피종, 방광 암종, 흑색종, 및 CNS 종양[예를 들면, 신경아교종(예를 들면, 뇌간 신경교종 및 복합 신경교종), 교아세포종(또한 다형교아종으로 공지됨) 성상세포종, CNS 림프종, 배세포종, 수모세포종, 신경초종 두개인두종(Schwannoma craniopharyogioma), 뇌실막종, 송과체종, 혈관모세포종, 청신경초종, 희소돌기아교세포종, 수막종(menangioma), 신경아세포종, 망막아종 및 전이성 뇌종양]을 포함한다.
하나의 실시형태에서, 본 발명의 CAR의 잔기 부위에 결합하는 항원은 특수한 암을 치료하기 위해 설계된다. 예를 들면, CD19를 표적화하도록 설계된 CAR을 사용하여 전-B ALL(소아과 증상), 성인 ALL, 대뇌피질 세포 림프종, 확산 거대 B-세포 림프종, 동형 골형 골수 이주 등을 포함하나 이에 한정되지 않는 질병 및 암을 치료하는데 사용될 수 있다.
다른 실시형태에서, CAR은 CD22를 표적화하여 확산성 거대 B-세포 림프종을 표적화하도록 설계될 수 있다.
하나의 실시형태에서, 암 및 장애는 전-B ALL(소아과 증상), 성인 ALL, 대뇌피질 세포 림프종, 확산성 거대 B-세포 림프종, 동종 골형 골수 이주 등을 포함하나 이에 한정되지 않으며, CD19, CD20, CD22, 및 ROR1을 표적화하는 CAR의 조합을 사용하여 치료할 수 있다.
하나의 실시형태에서, CAR은 메소텔린을 표적화하여 중피종, 췌장암, 난소암 등을 치료하도록 설계할 수 있다.
하나의 실시형태에서, CAR은 CD33/IL3Ra를 치료하여 급성 골수백혈병 등을 치료하도록 설계할 수 있다.
하나의 실시형태에서, CAR은 c-Met를 표적화하여 삼중 음성 유방암, 비-소세포 폐암 등을 치료하도록 설계될 수 있다.
하나의 실시형태에서, CAR은 PSMA를 표적화하여 전립샘 암 등을 치료하도록 설계될 수 있다.
하나의 실시형태에서, CAR은 당지질 F77을 표적화하여 전립샘 암 등을 치료하도록 설계될 수 있다.
하나의 실시형태에서, CAR은 EGFRvIII을 표적화하여 교아세포종 등을 치료하도록 설계될 수 있다.
하나의 실시형태에서, CAR은 GD-2를 표적화하여 신경아세포종, 흑색종 등을 치료하도록 설계될 수 있다.
하나의 실시형태에서, CAR은 NY-ESO-1 TCR을 표적화하여 골수종, 육종, 흑색종 등을 치료하도록 설계될 수 있다.
하나의 실시형태에서, CAR은 MAGE A3 TCR을 표적화하여 흑색종, 골수종, 육종, 흑색종 등을 치료하도록 설계될 수 있다.
그러나, 본 발명은 본 명세서에 기재된 항체 표적물 및 질병에만 한정되는 것으로 해석되지는 않는다. 오히려, 본 발명은, CAR이 질병을 치료하는데 사용될 수 있는 질병과 관련된 임의의 항원성 표적을 포함하도록 구성될 수 있다.
본 발명의 CAR-변형된 T 세포는 또한 포유동물에서 생체외 면역화 및/또는 생체내 치료요법을 위한 백신 유형으로서 제공될 수 있다. 바람직하게는, 포유동물은 인간이다.
생체외 면역화와 관련하여, 다음 중 적어도 하나가 세포를 포유동물에게 투여하기 전에 실험관내에서 발생한다: i) 세포의 확장, CAR을 암호화하는 핵산의 세포내로의 도입, ii) 세포에 대한 CAR을 암호화하는 핵산을 도입 및/또는 iii) 세포의 동결보존.
생체외 과정은 당해 분야에 잘 공지되어 있으며 하기에서 보다 충분히 논의된다. 요약하면, 세포는 포유동물(바람직하게는 인간)으로부터 분리되어 본 명세서에 기재된 CAR을 발현하는 벡터를 사용하여 유전적으로 변형시킨다(즉, 시험관 내에서 형질도입되거나 형질감염됨). CAR-변형된 세포는 포유동물 수용체에게 투여되어 치료학적 이점을 제공할 수 있다. 포유동물 수용체는 인간일 수 있으며 CAR-변형된 세포는 수용체와 관련하여 자가조직일 수 있다. 달리는, 세포는 동종이계, 동계 또는 이종일 수 있다.
조혈 줄기 및 후대 세포의 생체외 확장을 위한 과정은 본 명세서에 참조로 혼입된 미국 특허 제5,199,942호에 기술되어 있으며 본 발명의 세포에 적용될 수 있다. 다른 적합한 방법은 당해 분야에 공지되어 있으므로, 본 발명은 세포의 생체외 확장의 어느 특수 방법에 한정되지 않는다. 요약하면, T 세포의 생체외 배양 및 확장은 (1) 말초 혈액 수거 또는 골수 이식편으로부터 포유동물로부터의 CD34+ 조혈 줄기 및 후대 세포의 수집; 및 (2) 생체외에서 이러한 세포의 확장을 포함한다. 미국 특허 제5,199,942호에 기술된 세포 성장 인자 외에, flt3-L, IL-1, IL-3 및 c-kit 리간드와 같은 다른 인자를 세포의 배양 및 확장에 사용할 수 있다.
생체외 면역화의 측면에서 세포-계 백신을 사용하는 것 외에, 본 발명은 또한 환자에서 항원에 대해 지시된 면역 반응을 유발하기 위한 생체내 면역화를 위한 조성물 및 방법을 제공한다.
일반적으로, 본 명세서에 기술된 바와 같이 활성화되고 확장된 세포를 면역약화된 개인에서 유발되는 질병의 치료 및 예방에 이용할 수 있다. 특히, 본 발명의 CAR-변형된 T 세포가 CLL의 치료에 사용된다. 특정의 실시형태에서, 본 발명의 세포는 CLL로 진행될 위험이 있는 환자의 치료시 사용된다. 따라서, 본 발명은 이를 필요로 하는 피검자에게 치료학적 유효량의 본 발명의 CAR-변형된 T 세포를 투여함을 포함하는, CLL의 치료 또는 예방 방법을 제공한다.
본 발명의 CAR-변형된 T 세포는 단독으로, 또는 희석제 및/또는 IL-2 또는 다른 사이토킨 또는 세포 집단과 같은 다른 성분과 함께 투여될 수 있다. 요약하면, 본 발명의 약제학적 조성물은 본 명세서에 기술된 바와 같은 표적 세포 집단을 하나이상의 약제학적으로 또는 생리학적으로 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제와 함께 포함할 수 있다. 이러한 조성물은 천연 완충 염수, 인산염 완충된 염수 등과 같은 완충제; 글루코즈, 만노즈, 슈크로즈 또는 덱스트란, 만니톨과 같은 탄수화물; 단백질; 폴리펩타이드 또는 글리신과 같은 아미노산; 항산화제; EDTA 또는 글루타티온과 같은 킬레이트제; 아쥬반트(예를 들면, 수산화알루미늄); 및 방부제를 포함할 수 있다. 본 발명의 조성물은 바람직하게는 정맥내 투여용으로 제형화된다.
본 발명의 약제학적 조성물은 치료(또는 예방)될 질병에 적절한 방식으로 투여될 수 있다. 투여량 및 횟수는, 적절한 용량이 임상 시도에 의해 결정될 수 있다고 해도, 환자의 상태, 및 환자 질병의 유형 및 중증도와 같은 인자에 의해 결정될 것이다.
"면역학적 유효량", "항-종양 유효량", "항-종양 억제유효량", 또는 "치료량"이 나타난 경우, 투여될 본 발명의 조성물의 정확한 양은, 임상의가 연령, 체중, 종양 크기, 감염 또는 전이 정도, 및 환자(피검자)의 상태를 고려하여 결정할 수 있다. 일반적으로, 본 명세서에 기술된 T 세포를 포함하는 약제학적 조성물은 이들 범위내 모든 정수 값을 포함하는, 104 내지 109개의 세포/kg 체중, 바람직하게는 105 내지 106개의 세포/kg 체중이 용량에서 투여될 수 있다. T 세포 조성물은 또한 이들 용량에서 다수의 횟수로 투여될 수 있다. 세포는 면역치료요법에 일반적으로 공지된 주입 기술을 사용하여 투여될 수 있다(참조: 예를 들면, Rosenberg et al., New Eng. J. of Med. 319:1676, 1988). 특수 환자에 대한 최적 투여량 및 치료 요법은 환자를 질병의 신호에 대해 모니터링하고 치료를 상응하게 조절함으로써 의약 분야의 숙련가가 용이하게 결정할 수 있다.
특정의 실시형태에서, 활성화된 T 세포를 피검자에게 투여한 후 후속적으로 혈액을 재수거하여(또는 성분채집술을 수행함), 본 발명에 따라 이로부터 T 세포를 활성화시키고, 이들 활성화되고 확장된 T 세포를 환자에게 재주입한다. 당해 공정은 매 수주마다 다수 수행될 수 있다. 특정의 실시형태에서, T 세포는 10cc 내지 400cc의 혈액 수거물로부터 활성화될 수 있다. 특정의 실시형태에서, T 세포는 20cc, 30cc, 40cc, 50cc, 60cc, 70cc, 80cc, 90cc, 또는 100cc의 혈액 수거물로부터 활성화된다. 이론에 얽메이지 않지만, 이러한 다수의 혈액 수거/다수의 재주입 프로토콜을 사용하는 것을 제공하여 T 세포의 특정 집단을 선택할 수 있다.
본 발명의 조성물의 투여는 에어로졸 흡입, 주사, 소화, 수혈, 이식(implantation 또는 transplantation)을 포함하는 임의의 편리한 방식으로도 수행할 수 있다. 본 명세서에 기술된 조성물은 환자에게 피하, 피내, 종양내, 절내(intranodally), 수질내, 균육내, 정맥내(i.v.) 주사 또는 복강 내로 투여할 수 있다. 하나의 실시형태에서, 본 발명의 T 세포 조성물은 환자에게 피내 또는 피하 주사로 투여된다. 다른 실시형태에서, 본 발명의 T 세포 조성물은 정맥내, 또는 복강내 주사에 의해 바람직하게 투여된다. T 세포의 조성물은 종양, 림프절, 또는 감염 부위내로 직접 주사할 수 있다.
본 발명의 특정의 실시형태에서, 본 명세서에 기술된 방법, 또는 당해 분야에 공지된 다른 방법을 사용하여 활성화되고 확장된 T 세포를 치료학적 수준으로 확장하여 항바이러스 치료요법과 같은 제제, 시도포비르 및 인터루킨-2, MS 환자용의 사이타라빈(또한 ARA-C로 공지됨) 또는 나탈리주맙 치료, 건선 환자용 에팔리주맙 치료 또는 PML 환자용 다른 치료를 포함하나, 이에 한정되지 않는 특정 수의 관련 치료 양상과 함께(예를 들면, 전에, 동시에 또는 후에) 환자에게 투여된다. 추가의 실시형태에서, 본 발명의 T 세포는 화학치료요법, 방사선, 사이클로스포린, 아자티오프린, 메토트렉세이트, 마이코페놀레이트, 및 FK506과 같은 면역억제성 제제, CAM PATH, 항-CD3 항체 또는 다른 항체 치료요법과 같은 항체 또는 다른 면역절제성 제제(immunoablative agent), 사이톡신, 플루다라빈, 사이클로스포린, FK506, 라파마이신, 마이코페놀산, 스테로이드, FR901228, 사이토킨, 및 방사선 조사와 함께 사용될 수 있다. 이들 약물은 칼슘 의존성 포스파타제 칼시네우린(사이클로스포린 및 FK506)을 억제하거나 성장 인자 유도된 신호에 중요한 p70S6 키나제를 억제한다(참조: Liu et al., Cell 66:807-815, 1991; Henderson et al., Immun. 73:316-321, 1991; Bierer et al., Curr. Opin. Immun. 5:763-773, 1993). 추가의 실시형태에서, 본 발명의 세포 조성물은 환자에게 골수 이식, 플루다라빈, 외부-빔 방사선 치료요법(XRT), 사이클로포스파미드와 같은 화학치료요법 제제, 또는 OKT3 또는 CAMPATH와 같은 항체를 사용하는 T 세포 절제 치료요법과 함께(예를 들면, 전에, 동시에 또는 이후에) 투여된다. 다른 실시형태에서, 본 발명의 세포 조성물은 CD20과 반응하는 제제, 예를 들면, 리툭산과 같은 B-세포 절제 치료요법 후 투여된다. 예를 들면, 하나의 실시형태에서, 피검자는 고 투여량 화학치료요법 후 말초 혈액 줄기 세포 이식을 사용한 표준 치료를 겪을 수 있다. 특정의 실시형태에서, 이식 후, 피검자에게 본 발명의 확장된 면역 세포의 주입을 제공한다. 추가의 실시형태에서, 확장된 세포는 수술 전 또는 후에 투여된다.
환자에게 투여될 상기 치료의 용량은 치료되는 상태 및 치료의 수용체의 정확한 특성에 따라 변할 것이다. 인간 투여용의 용량의 규모는 당해 분야에서 허용된 실시에 따라 수행될 수 있다. 예를 들어, CAMPATH에 대한 용량은 성인 환자의 경우, 1 내지 약 100 mg의 범위로서, 일반적으로 1 내지 30일의 기간 동안 매일 투여될 것이다. 일부 예에서 1 일당 40mg 이하의 보다 많은 투여량이 사용될 수 있다고 해도(미국 특허 제6,120,766호에 기술됨) 바람직한 1일 투여량은 1 일당 1 내지 10 mg이다.
본 발명은 인간 피검자에게 투여하기 위해 지정된 T 세포를 형질도입하는데 유용한 벡터 상층액을 분석하는 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 인간 피검자에게 투여하기 위해 지정된 형질도입된 T 세포를 분석하는 방법을 제공한다. 본 발명은 유전적으로 변형된 T 세포를 분석하여 오염물을 검출하는 방법을 제공하는데, 여기서 상기 유전적으로 변형된 T 세포는 키메라 항원 수용체(CAR)를 암호화하는 핵산을 포함하고, 여기서 상기 CAR은 항원 결합 도메인, 전이막 도메인, 공자극 신호 영역, 및 신호 도메인을 포함한다.
본 발명의 바람직한 실시형태의 다음의 상세한 설명은 첨부된 도면과 함께 판독시 보다 잘 이해될 것이다. 본 발명을 나열할 목적으로, 현재 바람직한 실시형태를 도면에 나타낸다. 그러나, 본 발명이 도면에 나타낸 실시형태의 정확한 배열 및 기기장치에 한정되지 않음을 이해하여야 한다.
도 1a 내지 도 1b를 포함하는 도 1은 유전자 전달 벡터 및 이식유전자의 개략도, 유전자 변형된 T 세포 제조 및 임상 프로토콜 설계의 일련의 영상이다. 도 1a는 주요 기능 성분을 나타내는 렌티바이러스 벡터 및 이식유전자의 개략도의 일련의 이미지이다. FMC63 쥐 모노클로날 항체로부터 기원한 항-CD19 scFv, 인간 CD8α 힌지(hinge) 및 전이막 도메인, 및 인간 4-1BB 및 CD3제타 신호 도메인의 발현을 지시하는 수포성 구내염 바이러스 단백질 G 위형(pseudotyped) 임상 등급 렌티바이러스 벡터(pELP 19BBz로 지정)를 제조하였다. 전이유전자의 구성적 발현은 EF-1α(연장 인자-1α 프로모터); LTR, 긴 말단 반복체(long terminal repeat); RRE, rev 반응 성분(cPPT) 및 중심 말단 서열(CTS)에 의해 지시되었다. 도는 축척화되어 있지 않다. 도 1b는, T 세포 제조를 나타낸다. 자가 세포는 성분채집술을 통해 수득되었으며, 비-CLL 연구를 위해 피검자 T 세포를 단핵 세포 현탁분리(elutriation)로 농축시켰다. CLL 피검자의 경우, 잔류 백혈병 세포는 T 세포의 양성적 선택 및 활성화를 위해 항-CD3/CD28 피복된 상자성 비드를 첨가하여 고갈시켰다. 비-CLL 피검자의 경우, 현탁분리된(elutriated) 세포는 T 세포의 활성화를 위해 세척한 후 항-CD3/CD28 피복된 상자성 비드를 가하였다. 렌티바이러스 벡터를 세포 활성화 시기에 가하고 배양 개시 후 3일째에 세척하였다. 2일 후, 세포를 록킹 플랫폼 장치(rocking platform device)(제조원: WAVE Bioreactor System) 위에서 추가로 3 내지 7일 동안 확대시켰다. 배양 마지막 날에 비드를 자기장 위에 통과시켜 제거하고 CART19 T 세포를 수거하고, 세척하며 불용성 배지 속에서 동결보존하였다. 환자에게 기술된 바와 같은 림프고갈 화학치료요법을 제공한 후 15 내지 20분의 기간에 걸쳐 정맥내 중력식 유동 드립(i.v. gravity flow drip)에 의해 CART19 주입 #1을 제공하였다. 당해 주입은 화학치료요법을 완료한 후 1 내지 5일째에 시작하여 3일에 걸쳐 나눈 투여량 시도(10%, 30%, 60%)를 사용하여 제공하였다. 종료점 검정은 연구 4 주째에 수행하였다. 활성 모니터링의 종결시, 피검자를 FDA 지침에 따라 장기간 속행 동안 지정 프로토콜로 이전하였다.
도 2는 CART-19 세포의 제조 공정을 나타낸다.
도 3은 형질도입된 T 세포에서 수행된 분석의 유형을 나열하는 표이다.
도 4는 생체외 배양 기간 동안 VSV-G 핵산을 정량화하는 분석의 결과를 나타낸다.
도 5는 생체외 배양 기간 동안 HIVgag 핵산을 정량화하는 분석의 결과를 나타낸다.
실험 실시예
본 발명은 다음의 실험 실시예를 참조로 상세히 추가로 기술한다. 이들 실시예는 단지 설명할 목적으로 제공되며, 달리 규정하지 않는 한 제한하는 것으로 의도되지 않는다. 따라서, 본 발명은 다음의 실시예에 한정되는 것이 아니라, 오히려 본 명세서에 제공된 교시의 결과로서 명백해지는 특정의 및 모든 변형을 포함하는 것으로 해석되어야 한다.
추가의 설명없이, 당해 분야의 통상의 기술자는 앞서의 설명 및 다음의 나열된 실시예를 사용하여 본 발명의 화합물을 제조하고 이용하여 특허청구된 방법을 실시하는 것으로 여겨진다. 따라서, 다음의 작업 실시예는 본 발명의 바람직한 실시형태를 구체적으로 지적하며, 기재내용의 나머지를 임의의 방식으로도 제한하는 것으로 고려되지 않아야 한다.
실시예 1: 오염물에 대한 분석
인간 피검자에게 투여하도록 지정된 키메라 항원 수용체(CAR)를 발현하도록 형질도입된 림프구를 분석하여 형질도입의 공정 동안에 도입된 가능한 오염물을 검출하고 정량화한다.
일반적인 실험실 설명
연구 시료 프로세싱, 동결, 및 실험실 분석을 시료 수용, 프로세싱, 동결, 및 분석을 위한 확립된 SOP 및/또는 프로토콜을 사용하여 우수한 제조 실시(Good Manufacturing Practices) 또는 우수한 실험실 실시(Good Laboratory Practices)의 원리 하에 수행하였다.
벡터 생산
CD19-BB-z 유전자이식(GeMCRIS 0607-793)을 설계하여 기술된 바와 같이 작제하였다(참조: Milone et al., 2009, Mol Ther. 17:1453-1464). 렌티바이러스 벡터를 기술된 바와 같이 렌티겐 코포레이션(Lentigen Corporation)에서 3개-플라스미드 생산 시도를 사용하는 현재의 우수한 제조 실시에 따라 생산하였다(참조: Zufferey et al., 1997, Nature Biotechnol 15:871-875). 자가-불활성화 렌티바이러스 벡터(GeMCRIS 0607-793)를 설계하고, 이를 앞서 보고한 바와 같이(참조: Milone et al., 2009, Mol Ther, 17: 1453-64) 전임상 안전성 시험에 적용시켰다. T-세포 제조 방법은 또한 앞서 기술되어 왔다(참조: Porter et al, 2006, Blood, 107:1325-31).
CART-19 T 세포의 제조
자가 T 세포를 가공하여 CD19에 대해 특이성을 지닌 세포외 단일 사슬 항체(scFv)를 발현시킨다. 세포외 scFv는 악성 세포의 표면 및 정상 B 세포에서 발현시 제한되는 분자인, CD19를 발현하는 세포에 대한 형질도입된 T 세포의 특이성을 재지시할 수 있다. CD19 scFv 외에도, 세포를 형질도입시켜 TCRξ 쇄 또는 4-1BB 및 TCRξ 신호 모듈로 구성된 탄뎀 신호 도메인(tandem signaling domain)으로 구성된 세포 내 신호 분자를 발현시킨다. scFv는 마우스 모노클로날 항체로부터 기원하므로, 마우스 서열을 함유하며, 신호 도메인은 전적으로 천연의 인간 서열이다. CART-19 T 세포는 T 세포를 성분채집으로 분리하고, 렌티바이러스 벡터 기술(참조: Dropulic et al., 2006, Human Gene Therapy, 17: 577-88; Naldini et al., 1996, Science, 272: 263-7; Dull et al., 1998, J Virol, 72: 8463-71)을 사용하여 scFv:TCRξ:4-1BB를 CD4 및 CD8 T 세포내로 도입시킴으로써 제조한다. 일부 환자에서, 대조군 scFv:TCRξ를 경쟁적 재증식 실험을 위해 세포의 일부내에 도입한다. 이들 수용체는, 이들이 MHC-의존적 양상으로 항원에 결합한다는 점에서 "공통적"이므로, 하나의 수용체 작제물을 사용하여 CD19 항원-양성 종양을 지닌 환자의 집단을 치료하는데 사용할 수 있다.
CAR 작제물은 펜실베이니아 대학에서 개발되었으며, 임상 등급 벡터는 Lentigen Corporation에서 제조하였다. CART-19 세포는 펜실베이니아 대학의 임상 세포 및 백신 생산 시설에서 도 2에 나타낸 공정에 따라 제조한다. 세포 배양 말기에, 세포를 주입가능한 동결배지 속에서 동결보존한다.
T 세포 생존능
형질도입 후 T 세포 생존능을 트리판 블루 배제 검정(0.4% 트리판 블루 염색(Gibco BRL 제품 번호 15250-061 및 배지 또는 희석제 및 Bright-Line Hemacytometer(제조원: Hausser Scientific Company)) 또는 7-AAD를 사용하여 살아있는 세포의 퍼센트(BD ViaProbe(제품 번호: 555815, 제조원: BD Biosciences Pharmingen))를 측정하고 유세포분석(flow cytometer)하였다.
T 세포 특성
본 명세서의 어딘가에 기술된 특수한 T 세포 마커를 발현하거나 발현하지 않는 형질도입된 세포의 퍼센트를 세포 염색 및 유세포분석을 사용하여 측정하였다.
형질도입 효능
T 세포의 형질도입 효능을 유세포분석, 정량적 PCR 또는 유세포분석 및 정량적 PCR 둘 다를 사용하여 측정하였다.
내독소의 존재 및 양
형질도입된 T 세포 배양물의 내독소의 존재를 겔 응집 검정을 사용하여 평가하였다.
3.1.1 Endosafe PTS-역학적 판독기
챨스 리버 실험실(Charles River Laboratories),
3.1.2 PTS 로거 소프트웨어(Logger software)
3.1.3 일회용/향상 카트릿지
챨스 리버/제품 번호 PTS220
3.1.4 일회용 LAL 원심분리 시험 카트릿지(0.01-1.0/mL) & 각각의 로트에 대해 A의 C
챨스 리버/제품 번호 PTS2001F
3.1.5 일회용 LAL 카트릿지 시험 카트릿지(0.005-0.5EU/mL) & 각각의 로트에 대해 A의 C
챨스 리버/제품 번호 PTS20005F
색원체성 종료점 검정 - 분광광도계에서 판독
3.1.6 중지 시약: 20% w/v 아세트산, 빙초산 제품 번호 BP2401-212, 제조원: 미국 펜실베이니아주 피츠버그 소재의 Fisher Scientific
전화 번호: 1-800-766-7000
3.1.7 리물루스 아메보사이트 라이세이트 시험 키트(Limulus Amebocyte Lysate Test Kit)
제품 번호 50-648U(300개 시험) 또는 50-647U(120개 시험), 메릴랜드주 21793 워커스빌 비그스 포드 로드 캄브렉스 8830 소재의 Cambrex
전화 번호: 800-654-4452, 내선 번호: 7822, 팩스 번호: 301-845-2924
3.1.7.1 이. 콜라이 내독소
3.1.7.2 색원체성 기질
3.1.7.3 색원체성 리물루스 아메보사이트 라이세이트(LAL)
3.1.7.4 LAL 시약 수(Reagent Water)(120개 시험 키트만)
3.1.8 LAL 시약 수
제품 번호 W50-640, 메릴랜드주 21793 워커스빌 빅스 포드 로드 8830 소재의 Cambrex
전화 번호: 800-654-4452, 팩스 번호: 301-845-2924
색원체성 역학적 검정 - 분광광도계에서 판독
3.1.9 중지 시약: 20% w/v 아세트산, 빙초산
제품 번호 BP2401-212, 제조원: Fisher Scientific
3.1.10 리물루스 아메보사이트 라이세이트(LAL) 역학적-QCL 내독소 검정 키트
제품 번호 50-650U(192개 시험), Lonza/Cambrex
3.1.10.1 이. 콜라이 내독소
3.1.10.2 역학적-QCL 시약(LAL/색원체성 기질의 혼합물)
LAL 시약 수
Gel 응고 검정
4.1.1 다중-시험 리물루스 아메보사이트 라이세이트, PYROGENT® 및 200 시험 0.125 EU/mL 민감성
제품 번호 N294-125, 제조원: Lonza
4.1.1.1 민감성이 0.125 EU/mL인 리물루스 아메보사이트 라이세이트(LAL)
4.1.1.1.1 4 x 50개의 시험 바이알(5.2 mL/바이알)
4.1.1.2 이. 콜라이 내독소 O55:B5, 10ng/바이알, 동결건조됨, 대조군 표준 내독소(CSE)
4.1.1.2.1 주목: EU/mL 중 CSE 효능은 분석의 원심분리시 규정된다. COA는 당해 키트로 더 이상 제공되지 않는다.
4.1.1.2.2 분석 증명서를 수령하기 위해서는, http://www.lonzabio.com/2506.html를 방문하여, 키트 박스 전면의 제품 표지에 위치한 카탈로그 번호 및 로트 번호를 치시오.
4.1.2 LAL 시약, 분해물 민감성 0.125 EU/mL(제조원: Charles River Laboratories, 제품 번호 R11012)
4.1.2.1 12 팩
4.1.3 대조군 표준 내독소 10ng/바이알(제조원: Charles River Laboratories, 제품 번호 E120_
4.1.3.1 6 팩
4.1.4 LAL 시약 수(LRW), 30 mL/바이알
제품 번호 W130, 제조원: Charles River Laboratories
마이코플라즈마의 존재 및 양
형질도입된 T 세포 배양물 중의 마이코플라즈마의 존재를 마이코알럿트 검정(mycoalert assay)을 사용하여 평가하였다.
3.1.11 마이코알러트 마이코플라즈마 검출 키트(MycoAlert Mycoplasma Detection kit)(제조원: Lonza, 제품 번호 LT07-318)-100 시험
3.1.12 마이코알러트 검정 대조군 세트(제조원: Lonza 제품 번호 LT07-518)
3.1.13 96웰, 불투명, 백색 바닥 미세-플레이트(제조원: Corning Incorporated 제품 번호 3912)
매사츄세츠주 01720 액톤 나곡 파크 45 소재의 Corning Incorporated Life Sciences
전화 번호: 1-978-635-2200, 팩스 번호: 1-978-635-2476
광도계에서 판독.
마이코프로브 마이코플라즈마(MycoProbe Mycoplasma ELISA): http://www.rndsystems.com/pdf/CUL001B.pdf
복제 적격 렌티바이러스의 존재 및 양(RCL)
형질도입된 T 세포 배양물에서 RCL의 존재를 VSV-G 및 HIVgag에 대해 평가하는 PCR 검정, 및 p24에 대해 ELISA를 사용하여 평가하였다.
p24의 존재 및 양
형질도입된 T 세포 배양물 중의 p24의 존재를 ELISA 검정을 사용하여 평가하였다.
5.1.1 PerkinElmer HIV-1 p24 ELISA Kit
제품 번호 NEK050(1x96-웰 플레이트),
NEK050A(2x96-웰 플레이트)
NEK050B(5x96-웰 플레이트)
매사츄세츠주 02451 왈탐 윈터 스트리트 940 소재의 PerkinElmer, Inc
전화 번호: 800-762-4000
VSV-G 핵산의 존재 및 양
형질도입된 T 세포 배양물 중의 VSV-G 핵산의 존재를 표준 ABI 증폭 조건 하에서 VSV-G 서열을 특이적으로 증폭시켜 검출하는 프라이머/프로브 조합을 사용하는 정량적 PCR 검정으로 평가하였다. 상기 프라이머를 사용하여 VSV-G DNA를 정량화하기 위한 정량화된 QPCR 검정을 확립하였다. 정량화된 검정은 VSV-G 유전자 서열을 함유하는 플라스미드 pC1-VSV-G로 스파이킹된 PBMC로부터 분리한 게놈 DNA로부터 생성된 표준 곡선을 이용하며; 당해 표준 곡선은 1×106-10개 카피 VSV-G/100 ng PBMC의 범위이다. 각각의 최종 생성물에 대해 잔류 VSV-G DNA의 존재를 생성물로부터 분리한 대략 200 ng의 게놈성 DNA를 사용하여 3회 반응으로 평가한다. 잔류 VSV-G 플라스미드의 양을 표준 곡선으로부터 측정하여 도입 DNA의 양에 대해 교정하고 표준화한 후 카피 VSV-G 플라스미드/마이크로그램의 게놈성 DNA로서 기록한다. 각각의 추가의 패키징 플라스미드(LIST)에 대한 오염성 플라스미드 핵산의 존재는 이러한 방식으로 패키징 단계에서 사용된 각각의 플라스미드에 대해 특이적인 프라이머/프로브 조합(VSVG, Gag pol, P24, pRSV.rev)을 사용하여 측정할 수 있다.
세균의 존재 및 정량화
형질도입된 T 세포 배양물 중의 세균의 존재는 형질도입된 T 세포 배양물로부터의 물질을 사용하여 세균을 배양하는 시도에 의해 평가하였다. BACTEC 검정을 사용하여 세균 오염에 대해 시험한다. BACTEC 배양물 바이알은 일반적인 호기성 미생물의 성장을 지지하며, 이들은 1 내지 3 ml의 배양 배지를 함유하는 멸균 주사기로 접종된다. 성장의 검출은 BACTEC 9050 장치를 사용하여 수행하며, 당해 장치는 시간에 따른 CO2 농도의 증가를 측정한다. 당해 검정은 CVPF에서 SOP 0361에 따라 수행하며, 이는 또한 본 명세서에 제공된다. CVPF 실험실에서 당해 시험의 민감성은 확인되어 있지 않지만, 발표된 연구는, BACTEC가 CFR 방법보다 더 민감하며, 검출에 대해 시간이 더 빠르고, 거짓-양성 결과를 제공하는 경향이 거의 없음을 나타낸다(참조: Khuu et al, 2004 and 2006).
진균의 존재 및 정량화
형질도입된 T 세포 배양물 중의 진균의 존재는 형질도입된 T 세포 배양물로부터의 물질을 사용하여 세균을 배양하는 시도에 의해 평가하였다. 진균의 오염에 대한 시험은 HUP 임상 미생물 실험실(HUP Clinical Microbiology laboratories)에서 문헌(참조: Gorman, 1967)의 제형을 기반으로 한 사보라우 뇌 심장 주입 아가(Sabouraud Brain Heart Infusion Agar)를 사용하여 수행한다. 당해 배지는 진균 회수를 개선시키는데 최적화되어 있으며, 또한 진균 성장과 경쟁할 수 있는 세균의 과다성장을 방해하기 위한 각종의 항미생물제를 함유한다. 배양 배지는 스트라이킹(streaking)으로 접종한다. 배양물은 14일 동안 음성인 것으로 측정된다. 당해 검정의 민감성은 임상 미생물 실험실에서 측정되지 않았다. 당해 검정에 대한 양성 대조군은 3개의 진균, 블라스토마이세스 데르마티티디스(Blastomyces dermatitidis), 칸디다 알비칸스(Candida albicans), 및 트리초파이톤 멘타그로피테스(Trichophyton mentagrophytes)를 포함하며, 이들은 다양한 배지를 나타내기 위해 성장시켜야 한다. 항미생물 제제의 효능에 대해 모니터링하기 위해, 대조군 플레이트에 에스케리키아 콜라이 및 일부를 접종하고 일부 내지 완전한 억제를 관찰하여야 한다.
저장
CART-19-형질도입된 T 세포를 함유하는 백(10 내지 100 ml의 용량)을 모니터링된 -135℃ 냉동실 속의 혈액 은행 조건에서 저장한다. 주입 백은 필요할 때까지 냉동실에 저장한다.
세포 해동
조사 조제실에서 세포를 로깅(logging)한 후, 동결된 세포를 무수 얼음 속에서 피검자 침대옆으로 수송한다. 세포를 36℃ 내지 38℃로 유지된 수 욕을 사용하여 당해 시간에 침대 옆의 하나의 백에서 해동시킨다. 당해 백을 세포가 해동되기 직전까지 부드럽게 마사지한다. 용기 속에 동결된 무더기가 남아있지 않아야 한다.
투여/주입
주입은 화학치료요법의 완료 후 1 내지 2일에 개시한다. 화학치료요법은 부분적으로 림프구감소증을 유발하기 위해 제공되므로, 첫번째 주입일에, 환자는 차등적인 CBC, 및 CD3, CD4 및 CD8 수의 평가를 갖는다. 임의의 특수한 이론에 의해 얽메일 필요없이, 2.5 내지 5×109개의 CART-19 세포의 초기 정맥내 투여량은 당해 프로토콜에 최적인 것으로 여겨진다. 건강한 성인에 약 1×1012개의 T 세포가 존재하므로, 제안된 총 투여량은 T 세포의 전체 신체 질량의 약 0.5%와 동등하다(참조: Roederer, 1995, Nat Med, 1: 621-7; Macallan et al., 2003, Eur J Immunol, 33: 2316-26). 당해 제1 투여량을 0일(10%), 1일(30%) 및 2일(60%) 째에 분할된 투여량을 사용하여 투여한다. 피검자는 독립된 방에서 주사를 받는다. 세포를 본 명세서의 어딘가에 기술된 바와 같이 환자의 침대 옆에서 해동시킨다. 해동된 세포는, 주입의 기간이 대략 10 내지 15분이 되도록 하는 견딜 수 있는 한 신속한 주입 속도에서 제공된다. 형질도입된 T 세포는 분당 대략 10mL 내지 20mL의 유동 속도에서 3-방식 정지콕(stopcock)이 장착된 18-게이지의 라텍스가 없는 Y자-형 혈액 세트를 통해 투여한다. 주입 기간은 대략 15분이다. CART-19 변형된 세포의 1 또는 2개의 백을 빙상에 전달하고, 세포를 냉장된 동안 피검자에게 투여한다. CART-19 세포의 혼합물을 제공받는 피검자에서, 혼합을 촉진시키기 위하여, 세포를 Y-어댑터(adapter)를 사용하여 동시 투여한다. 피검자에게 본 명세서의 어딘가에 기술된 바와 같이 주입하고 예비약제 처리한다. 피검자의 활력 징후를 평가하고 맥박 산소 측정법을 투여 전, 주입 말기에 및 이후 매 15분마다 1시간 동안 및 이것이 안정성이 있고 만족스럽게 될 때까지 수행한다. 기본선 CART-19 수준의 측정을 위한 혈액 시료는 주입 전 및 주입 후 20분째에 수득한다. 이들의 앞서의 세포감소성 화학치료요법으로부터의 독성을 경험한 환자는, 이들 독성이 해독될 때까지 이들의 주입 스케쥴이 지연된다. T 세포 주입의 지연을 정당화하는 특이적인 독성은: 1) 폐: 95% 이상의 포화 상태를 유지하기 위한 보충되는 산소의 요건 또는 진행성인 심장 x-선에서 방사선사진의 비정상의 존재; 2) 심장: 새로운 심장 부정맥이 의학적 처치에 의해 조절되지 않음. 3) 승압 지원이 요구되는 저혈압. 4) 활성 감염: T 세포 주입 48시간내 세균, 진균, 또는 바이러스에 대한 양성 혈액 배양물. 칼륨 및 뇨산에 대한 혈청 시료는, 제1의 주입 전 및 또한 각각의 후속적인 주입 후 2시간 전에 수집한다.
본 명세서에 인용된 각각 및 모든 특허, 특허원, 및 공보의 기재내용은, 이의 전문이 참조로 본 명세서에 포함된다. 본 발명을 구체적인 실시형태를 참조로 기재하였다고 해도, 본 발명의 다른 실시형태 및 변화가 본 발명의 실제 취지 및 영역에 벗어남이 없이 당해 분야의 다른 숙련가에 의해 고안될 수 있음은 명백하다. 첨부된 특허청구범위는, 이러한 실시형태 및 등가의 변형 모두를 포함하는 것으로 해석되는 것으로 의도된다.

Claims (14)

  1. 항원 결합 도메인, 전이막 도메인(transmembrane domain), 공자극 신호 영역(costimulatory signaling region), 및 신호 도메인을 포함하는, 키메라 항원 수용체(CAR)를 암호화하는 핵산을 포함하는 유전적으로 변경된 T 세포를, 오염물을 검출하기 위하여 분석하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 유전적으로 변형된 T 세포가 렌티바이러스 벡터를 사용한 형질도입에 의해 유전적으로 변형된 것인, 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 오염물이 내독소, 마이코플라스마(mycoplasma), 복제 적격 렌티바이러스(replication competent lentivirus: RCL), p24, VSV-G 핵산, HIV gag, 잔류 항-CD3/항-CD28 피복된 비드, 마우스 항체, 혼주된 인간 혈청, 소 혈청 알부민, 소 혈청, 배양 배지 성분, 벡터 패키징 세포 또는 플라스미드 성분, 세균 및 진균으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 적어도 하나인, 방법.
  4. 제3항에 있어서, 상기 세균이 알칼리게네스 파에칼리스(Alcaligenes faecalis), 칸디다 알비칸스(Candida albicans), 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli), 해모필루스 인플루엔자(Haemophilus influenza), 나이세리아 메닌기티데스(Neisseria meningitides), 슈도모나스 아에루기노사(Pseudomonas aeruginosa), 스타필로코쿠스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 스트렙토코쿠스 뉴모니아(Streptococcus pneumonia), 및 스트렙토코쿠스 피오게네스(Streptococcus pyogenes) 그룹 A로 이루어진 그룹 중에서 선택된 적어도 하나인, 방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 신호 도메인이 CD3 제타 신호 도메인인, 방법.
  6. 제1항에 있어서, 상기 항원 결합 도메인이 항체 또는 이의 항원-결합 단편인, 방법.
  7. 제6항에 있어서, 상기 항원-결합 단편이 Fab 또는 scFv인, 방법.
  8. 제1항에 있어서, 상기 항원 결합 도메인이 종양 항원에 결합하는, 방법.
  9. 제8항에 있어서, 상기 종양 항원이 혈액 악성종양(hematologic malignancy)과 관련되어 있는, 방법.
  10. 제8항에 있어서, 상기 종양 항원이 고형 종양과 관련되어 있는, 방법.
  11. 제8항에 있어서, 상기 종양 항원이 CD19, CD20, CD22, ROR1, 메소텔린(mesothelin), CD33/IL3Ra, c-Met, PSMA, 당지질 F77(Glycolipid F77), EGFRvIII, GD-2, NY-ESO-1 TCR, MAGE A3 TCR, 및 이의 특정 조합으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는, 방법.
  12. 제1항에 있어서, 상기 공자극 신호 영역이 CD27, CD28, 4-1BB, OX40, CD30, CD40, PD-1, ICOS, 림프구 기능-관련 항원-1(LFA-1), CD2, CD7, LIGHT, NKG2C, B7-H3, CD83과 특이적으로 결합하는 리간드, 및 이의 특정 조합으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 공자극 분자의 세포내 도메인을 포함하는, 방법.
  13. 제1항에 있어서, 상기 유전적으로 변형된 T 세포가 오염물의 확인 및 정량화로 인하여 인간 피검자에게 투여되지 않는 것인, 방법.
  14. 제1항에 있어서, 상기 유전적으로 변형된 T 세포가, 오염물의 양이 상응하는 대조군 수준과 비교하여 과도하기 때문에 인간 피검자에게 투여되지 않는 것인, 방법.
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