CN104619723A - 评估用于施用的转导t细胞的适用性的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及分析对转导T细胞目的用于施用给受试人有用的载体上清液。本发明还涉及分析转导T细胞目的用于施用给受试人的方法。本发明提供了分析基因修饰的T细胞以检测污染物的方法，其中基因修饰的T细胞包括编码嵌合抗原受体(CAR)的核酸，其中CAR包括抗原结合结构域、跨膜结构域、共刺激信号传导区和信号传导结构域。在一个实施方式中，污染物是选自内毒素、支原体、具有复制能力的慢病毒(RCL)、p24、VSV-G核酸、HIV gag、残留的抗-CD3/抗-CD28包被的珠、小鼠抗体、混合的人血清、牛血清白蛋白、牛血清、培养基组分、载体包装细胞或质粒组分、细菌和真菌中的至少一种。

Description

评估用于施用的转导T细胞的适用性的方法
关于联邦资助的研究或开发的声明
本发明在美国国立卫生研究院(NIH)给予的资助号K24CA11787901、1PN2-EY016586、1R01CA105216、1R01CA120409、RO1AI057838和R01113482下利用政府支持完成。政府拥有本发明中的某些权利。
相关申请的交叉引用
本申请要求2012年7月13日提交的美国临时申请号61/671,495的优先权，其内容在此通过引用以其全部并入本文。
背景技术
大部分具有B-细胞恶性肿瘤——包括慢性淋巴细胞白血病(CLL)的患者，将死于他们的疾病。治疗这些患者的一个方法是基因修饰T细胞以通过嵌合抗原受体(CAR)的表达靶向在肿瘤细胞上表达的抗原。CAR为设计来以人白细胞抗原-非依赖性的方式识别细胞表面抗原的抗原受体。利用表达CAR的基因修饰细胞治疗这些类型患者的尝试已经得到非常有限的成功。见例如，Brentjens等,2010,Molecular Therapy,18:4,666-668；Morgan等,2010,Molecular Therapy,2010年2月23日在线公布,1-9页；和Till等,2008,Blood,112:2261-2271。
尽管CAR可以以类似于内源T-细胞受体的方式引发T-细胞活化，但至今该技术的临床应用的主要阻碍已经限于CAR+T细胞的体内扩展、注入后细胞的快速消失和令人失望的临床活性(Jena等,Blood,2010,116:1035-1044；Uckun等,Blood,1988,71:13-29)。产生用于施用给人的基因修饰的T细胞的方法具有产生不需要的污染物的可能性，所述污染物可在施用后对基因修饰的T细胞的持续和功能造成负面影响。
因此，在本领域中需要通过检测可以对基因修饰细胞的持续和功能造成负面影响的污染物，分析用于施用给受试人的转导T细胞的适用性。本发明满足了该需要。
发明内容
本发明提供了分析基因修饰的T细胞以检测污染物的方法，其中基因修饰的T细胞包括编码嵌合抗原受体(CAR)的核酸，其中CAR包括抗原结合结构域、跨膜结构域、共刺激信号传导区和信号传导结构域。
在一个实施方式中，基因修饰的T细胞通过用慢病毒载体转导被基因修饰。
在一个实施方式中，污染物是选自内毒素、支原体、具有复制能力的慢病毒(RCL)、p24、VSV-G核酸、HIV gag、残留的抗-CD3/抗-CD28包被的珠、小鼠抗体、混合人血清、牛血清白蛋白、牛血清、培养基组分、载体包装细胞或质粒组分、细菌和真菌中的至少一种。
在一个实施方式中，细菌是选自粪产碱菌、白色念珠菌、大肠杆菌、流感嗜血杆菌、脑膜炎双球菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌和酿脓链球菌A群中的至少一种。
在一个实施方式中，信号传导结构域是CD3ζ信号传导结构域。
在一个实施方式中，抗原结合结构域是抗体或其抗原-结合片段。
在一个实施方式中，抗原-结合片段是Fab或scFv。
在一个实施方式中，抗原结合结构域结合肿瘤抗原。
在一个实施方式中，肿瘤抗原与血液学恶性肿瘤相关。
在一个实施方式中，肿瘤抗原与实体瘤相关。
在一个实施方式中，肿瘤抗原选自CD19、CD20、CD22、ROR1、间皮素、CD33/IL3Ra、c-Met、PSMA、糖脂F77、EGFRvIII、GD-2、NY-ESO-1 TCR、MAGE A3 TCR和其任何组合。
在一个实施方式中，共刺激信号传导区包括选自CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、与CD83特异性结合的配体和其任何组合的共刺激分子的胞内结构域。
在一个实施方式中，因为污染物的鉴定和定量，基因修饰的T细胞不被施用给受试人。
在一个实施方式中，因为与相应的对照水平相比污染物的量过多，基因修饰的T细胞不被施用给受试人。
附图说明
当与附图结合阅读时，将更好地理解本发明的优选实施方式的以下详细描述。为了说明本发明的目的，在附图中显示了目前优选的实施方式。然而，应当理解本发明不限于附图中所示的实施方式的精确布置和手段。
图1，包括图1A至1C，是基因转移载体和转基因、基因修饰的T细胞制造和临床方案设计的示意图的一系列图像。图1A描绘了显示主要功能元件的慢病毒载体和转基因。产生了指导源于FMC63鼠科单克隆抗体的抗-CD19scFv、人CD8α铰链和跨膜结构域、和人4-1BB与CD3ζ信号传导结构域的表达的水泡性口炎病毒G蛋白假型临床等级慢病毒载体(命名为pELPs 19BBz)。通过包括EF-lα(延伸因子-lα启动子)；LTR，长末端重复；RRE，rev应答元件(cPPT)和中央终止序列(CTS)，指导转基因的组成型表达。图不是按比例的。图1B描绘了T细胞制造。自体细胞经由单采血液成分术获得，并且对于非-CLL研究对象，T细胞通过单核细胞淘洗(elutriation)富集。对于CLL对象，残余的白血病细胞通过添加抗-CD3/CD28包被的顺磁珠用于阳性选择和T细胞活化而被耗尽。对于非-CLL对象，冲洗淘洗的细胞，然后通过添加抗-CD3/CD28包被的顺磁珠用于T细胞活化。慢病毒载体在细胞活化时被添加，并在培养开始后第3天被冲洗掉。两天后，细胞在摇动平台装置(WAVE Bioreactor System)上扩展额外的3-7天。在培养的最后一天，通过经过磁场珠被移出，并且CART19T细胞被收获、冲洗和冷藏在难溶的(infusible)培养基中。图1C描绘了临床方案设计。给予患者如上所述的淋巴耗尽(lymphodepleting)化疗，随后在15-20分钟的时期内通过静脉内重力流滴注CART19注入剂#1。在完成化疗后1至5天开始，利用在3天内的分次剂量方法(10％、30％、60％)给予注入。在研究第4周进行终点测定。在主动监测结束后，按照FDA指南，对象被转移至目标流程，以长期追踪。
图2描绘了CART-19细胞的制造方法。
图3是列出了在转导T细胞上执行的分析的类型的表格。
图4描绘了在离体培养时期期间，量化VSV-G核酸的分析的结果。
图5描绘了在离体培养时期期间，量化HIVgag核酸的分析的结果。
发明具体实施方式
本发明涉及生产包括编码嵌合抗原受体(CAR)的核酸的载体的方法，所述载体适于目的用于施用给受试人的T细胞的转导。本发明还涉及用包括编码嵌合抗原受体(CAR)的核酸的载体转导T细胞的方法，目的用于施用给受试人。在优选的实施方式中，载体是慢病毒载体。本发明涉及采用慢病毒载体转导以表达CAR的T细胞的过继细胞转移。CAR是联合对期望的靶抗原(例如肿瘤抗原)的基于抗体的特异性和T细胞受体-活化胞内结构域以产生显示特异性抗肿瘤细胞免疫活性的嵌合蛋白的分子。
在一些实施方式中，本发明的方法涉及分析对转导T细胞目的用于施用给受试人有用的载体上清液的方法。在其它实施方式中，本发明的方法涉及分析目的用于施用给受试人的转导T细胞的方法。在各种实施方式中，本发明的分析方法包括分析T细胞存活、T细胞特性(例如CD3、CD4、CD8、CD25、CD27、CD45RA、CD57、CD62L、CD95、CD127、CD134、CD244、CCR7、CD40L、CTLA4、PD-1、HLA-DR、TIM3、Ki-67、穿孔蛋白和/或粒酶表达)、转导效率的方法，以及检测和量化与制造工艺有关的污染物的方法，所述污染物例如内毒素、支原体、具有复制能力的慢病毒(RCL)、p24、VSV-G核酸、HIVgag、残留的抗-CD3/抗-CD28包被的珠、小鼠抗体、混合人血清、牛血清白蛋白、牛血清、培养基组分、载体包装细胞或质粒组分、细菌(例如粪产碱菌、白色念珠菌、大肠杆菌、流感嗜血杆菌、脑膜炎双球菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌和酿脓链球菌A群)和真菌。本发明不限制于任何具体的污染物。相反地，本发明包括影响转导T细胞的安全或功效的任何污染物的分析方法。
本发明一般地涉及使用载体以基因修饰T细胞从而稳定表达期望的CAR。表达CAR的T细胞在本文被称为CAR T细胞或CAR修饰的T细胞。优选地，该细胞可被基因修饰以在其表面上稳定表达抗体结合结构域，给予MHC非依赖性的新型抗原特异性。在一些实例中，T细胞被基因修饰以稳定表达CAR，所述CAR将特异性抗体的抗原识别结构域与CD3-ζ链或FcγRI蛋白的胞内结构域结合为单一嵌合蛋白。
在一个实施方式中，本发明的CAR包括具有抗原识别结构域的胞外结构域、跨膜结构域和胞浆结构域。在一个实施方式中，使用天然与CAR中的结构域之一相关联的跨膜结构域。在另一个实施方式中，可选择或由氨基酸置换修饰跨膜结构域，以避免这样的结构域结合至相同或不同的表面膜蛋白的跨膜结构域，以最小化与受体复合物的其它成员的相互作用。优选地，跨膜结构域为CD8α铰链结构域。
相对于胞浆结构域，本发明的CAR可被设计为由其本身包括CD28和/或4-1BB信号传导结构域，或与在本发明的CAR的内容中有用的任何其它期望的胞浆结构域(一个或多个)联合。在一个实施方式中，CAR的胞浆结构域可被设计为进一步包括CD3-ζ的信号传导结构域。例如，CAR的胞浆结构域可包括但不限于CD3-ζ、4-1BB和CD28信号传导模块和其组合。因此，本发明提供了CAR T细胞和它们用于过继疗法的方法。
本发明包括生产包括编码抗-CD19CAR的核酸的载体的方法，所述抗-CD19CAR包括CD3-ζ和4-1BB共刺激结构域二者。在一个实施方式中，载体包括期望的CAR，例如包括抗-CD19、CD8α铰链和跨膜结构域，以及人4-1BB和CD3ζ信号传导结构域的CAR。本发明不限于包括抗-CD19的CAR，而也包括与选自CD137(4-1BB)信号传导结构域、CD28信号传导结构域、CD3ζ信号结构域和其任何组合的一个或多个胞内结构域融合的任何抗原结合部分。在优选的实施方式中，载体为慢病毒载体。
定义
除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明涉及领域的技术人员通常理解的相同的含义。尽管可在测试本发明的实践中使用类似于或等同于本文描述的那些方法和材料的任何方法和材料，但优选的材料和方法在本文中进行描述。在描述和要求保护本发明时，将使用以下术语。
也应理解本文使用的术语仅是为了描述具体实施方式的目的，并不意欲是限制性的。
本文使用的冠词“一个(a)“和“一个(an)”指的是一个或多于一个(即，指的是至少一个)的该冠词语法对象。举例说明，“一个元件”表示一个元件或多于一个的元件。
如本文使用的“大约”，当指的是诸如量、时间期间等可测量的值时，表示包括从给定值的±20％或±10％，在一些实例中±5％，在一些实例中±1％，和在一些实例中±0.1％的变化，只要这些变化适于实施公开的方法。
“活化”，如本文所使用的，指的是已经被充分刺激以诱导可检测的细胞增殖的T细胞的状态。活化也可与诱导的细胞因子产生和可检测的效应子功能相关。术语“活化的T细胞”指的是经历细胞分裂的T细胞等。
术语“抗体”，如本文所用的，指的是与抗原特异性结合的免疫球蛋白分子。抗体可为源于自然源或源于重组源的完整的免疫球蛋白，并可为完整免疫球蛋白的免疫反应部分。抗体通常为免疫球蛋白分子的四聚物。本发明中的抗体可以以多种形式存在，包括例如，多克隆抗体、单克隆抗体、Fv、Fab和F(ab)2，以及单链抗体和人源化抗体(Harlow等,1999,In:Using Antibodies:A Laboratory Manual,ColdSpring Harbor Laboratory Press,NY；Harlow等,1989,In:Antibodies:ALaboratory Manual,Cold Spring Harbor,New York；Houston等,1988,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5879-5883；Bird等,1988,Science242:423-426)。
术语“抗体片段”指的是完整抗体的一部分，并指的是完整抗体的抗原决定可变区。抗体片段的实例包括但不限于Fab、Fab'、F(ab')2和Fv片段，由抗体片段形成的线性抗体、scFv抗体和多特异性抗体。
“抗体重链”，如本文所用的，指的是以其自然发生构象存在于所有抗体分子中的两种类型的多肽链中较大的链。
“抗体轻链”，如本文所用的，指的是以其自然发生构象存在于所有抗体分子中的两种类型的多肽链中较小的链。κ和λ轻链指的是两种主要的抗体轻链同种型。
如本文所用的术语“合成抗体”，指利用重组DNA技术产生的抗体，诸如例如，如本文所述的由噬菌体表达的抗体。该术语也应当被解释为指已经由DNA分子的合成产生的抗体，所述DNA分子编码该抗体并且该DNA分子表达抗体蛋白或规定该抗体的氨基酸序列，其中DNA或氨基酸序列已经利用本领域可用和公知的合成DNA或氨基酸序列技术获得。
如本文所用的术语“抗原”或“Ag”被定义为激发免疫应答的分子。该免疫应答可涉及抗体产生，或特异性免疫活性细胞的活化，或两者。技术人员将理解实际上包括所有的蛋白质或肽的任何大分子可用作抗原。此外，抗原可源自重组DNA或基因组DNA。技术人员将理解任何DNA——其包括编码引起免疫应答的蛋白质的核苷酸序列或部分核苷酸序列，因此编码如本文使用的术语“抗原”。此外，本领域技术人员将理解抗原不必单独地由基因的全长核苷酸序列编码。容易显而易见的是本发明包括但不限于多于一个的基因的部分核苷酸序列的用途，并且这些核苷酸序列以不同的组合进行布置以引起期望的免疫应答。而且，技术人员将理解抗原根本不必由“基因”进行编码。容易显而易见的是抗原可被产生、合成或可源自生物学样本。这样的生物学样本可包括但不限于组织样本、肿瘤样本、细胞或生物学流体。
如本文所用的术语“抗肿瘤效应”，指的是生物学效应，其可由肿瘤体积的减小、肿瘤细胞数目的减少、转移数目的减少、预期寿命的增加或与癌性病症相关的各种生理症状的改善清楚表示。“抗肿瘤效应”也可由本发明的肽、多核苷酸、细胞和抗体在预防肿瘤在第一位置的发生的能力清楚表示。
根据本发明，术语“自体抗原”指由免疫系统错误识别为外源的任何自身抗原。自体抗原包括但不限于细胞蛋白、磷蛋白、细胞表面蛋白、细胞脂质、核酸、糖蛋白，其包括细胞表面受体。
如本文所用的术语“自身免疫疾病”被定义为由自身免疫应答产生的紊乱。自身免疫疾病是对自身抗原的不适当和过度应答的结果。自身免疫疾病的实例包括但不限于阿狄森氏疾病、斑秃、强直性脊柱炎、自身免疫肝炎、自身免疫腮腺炎、克罗恩氏疾病、糖尿病(I型)、营养不良性大疱性表皮松解症、附睾炎、肾小球性肾炎、格雷夫斯氏疾病、吉兰-巴雷综合征、桥本氏疾病、溶血性贫血、系统性红斑狼疮、多发性硬化症、重症肌无力、寻常型天疱疮、牛皮癣、风湿热、类风湿性关节炎、结节病、硬皮病、斯耶格伦氏综合征、脊椎关节病变、甲状腺炎、血管炎、白癜风、粘液性水肿、恶性贫血、溃疡性结肠炎等等。
如本文所用的，术语“自体”指关于源自相同个体的任何物质，它随后被再次引入该个体。
“同种异基因的(allogeneic)”指的是源自相同物种的不同动物的移植物。
“异种的(xenogeneic)”指的是源自不同物种的动物的移植物。
如本文所用的术语“癌症”被定义为以畸变细胞的快速和失控生长为特征的疾病。癌症细胞可局部蔓延或通过血流和淋巴系统蔓延至身体的其它部分。各种癌症的实例包括但不限于乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、子宫颈癌、皮肤癌、胰腺癌、结肠直肠癌、肾癌、肝癌、脑癌、淋巴瘤、白血病、肺癌等等。
如本文使用的术语“共刺激配体”包括特异性结合T细胞上的关联共刺激分子的抗原呈递细胞(例如aAPC、树突细胞、B细胞等等)上的分子，由此除了通过例如将TCR/CD3复合物与用肽负载的MHC分子结合提供的初级信号之外，还提供介导T细胞应答的信号，所述T细胞应答包括但不限于增殖、活化、分化等等。共刺激配体可包括但不限于CD7、B7-1(CD80)、B7-2(CD86)、PD-L1、PD-L2、4-1BBL、OX40L、可诱导的共刺激配体(ICOS-L)、细胞间粘附分子(ICAM)、CD30L、CD40、CD70、CD83、HLA-G、MICA、MICB、HVEM、淋巴毒素β受体、3/TR6、ILT3、ILT4、HVEM、结合Toll配体受体的激动剂或抗体和与B7-H3特异性结合的配体。共刺激配体也包括，特别是与存在于T细胞上的共刺激分子特异性结合的抗体，例如，但不限于CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3和与CD83特异性结合的配体。
“共刺激分子”指的是与共刺激配体特异性结合的T细胞上的关联结合伴侣，由此通过T细胞介导共刺激应答，例如，但不限于增殖。共刺激分子包括但不限于MHC I类分子、BTLA和Toll配体受体。
如本文所用的，“共刺激信号”指的是与初级信号结合的信号，例如TCR/CD3连接作用，导致T细胞增殖和/或关键分子的上调或下调。
“疾病”是动物的一种健康状态，其中动物不能保持稳态，并且其中如果不改善该疾病，则动物的健康继续恶化。与之相比，动物中的“紊乱”是一种健康状态，其中动物能够保持稳态，但其中动物的健康状态与它没有处于该紊乱相比不太有利。保持不治疗，紊乱不必定引起动物健康状态的进一步降低。
如本文所用的“有效量”，指提供治疗性或预防性益处的量。
“编码”指的是诸如基因、cDNA或mRNA的多核苷酸中的核苷酸的特异性序列用作模板在生物学过程中合成其他多聚体和大分子的固有性质，所述多聚体和大分子具有核苷酸(即，rRNA、tRNA和mRNA)的限定序列或氨基酸的限定序列中的任一个和由其产生的生物学性质。因此，如果相应于那个基因的mRNA的转录和翻译在细胞或其他生物学系统中产生蛋白质，则基因编码蛋白质。核苷酸序列等同于mRNA序列并通常在序列表中提供的编码链和非编码链——用作转录基因或cDNA的模板，都可被称为编码那个基因或cDNA的蛋白质或其他产物。
如本文所用的“内源的”指的是来自有机体、细胞、组织或系统的或在有机体、细胞、组织或系统内产生的任何物质。
如本文所用的，术语“外源的”指的是任何从有机体、细胞、组织或系统引入的或在有机体、细胞、组织或系统外产生的任何物质。
如本文所用的术语“表达”被定义为由它的启动子驱动的特定核苷酸序列的转录和/或翻译。
“表达载体”指的是包括重组多核苷酸的载体，所述重组多核苷酸包括可操作地连接至待表达的核苷酸序列的表达控制序列。表达载体包括足够的用于表达的顺式作用元件；用于表达的其它元件可由宿主细胞供应或在体外表达系统中供应。表达载体包括所有本领域已知的那些载体，例如并入重组多核苷酸的粘粒、质粒(例如裸露或包含在脂质体中)和病毒(例如慢病毒、逆转录病毒、腺病毒和腺伴随病毒)。
“同源的”指的是两个多肽之间或两个核酸分子之间的序列相似性或序列同一性。当两个比较序列中的位置被相同的碱基或氨基酸单体亚单元占据时，例如，如果两个DNA分子的每一个中的位置被腺嘌呤占据，则所述分子在那个位置上是同源的。两个序列之间的同源性百分比为由两个序列共有的匹配或同源的位置数除以比较的位置数×100的函数。例如，如果两个序列中10个位置中的6个是匹配或同源的，则两个序列是60％同源的。举例说明，DNA序列ATTGCC和TATGGC享有50％的同源性。通常，当比对两个序列以给出最大同源性时，进行比较。
如本文所用的术语“免疫球蛋白”或“Ig”被定义为起到抗体作用的一类蛋白质。由B细胞表达的抗体有时被称为BCR(B细胞受体)或抗原受体。包括在该类蛋白质中的五个成员为IgA、IgG、IgM、IgD和IgE。IgA为存在于身体分泌物例如唾液、泪液、母乳、胃肠分泌物以及呼吸道和泌尿生殖道的粘液分泌物中的初级抗体。IgG是最常见的循环抗体。IgM是在多数对象的初级免疫应答中产生的主要免疫球蛋白。它在凝集反应、补体结合和其他抗体应答中是最有效的免疫球蛋白，并且在抵御细菌和病毒方面是很重要的。IgD是不具有已知抗体功能的免疫球蛋白，但可用作抗原受体。IgE是在暴露于过敏原后，通过引起从肥大细胞和嗜碱性粒细胞释放介体，介导速发过敏性的免疫球蛋白。
如本文所用的，“指导材料”包括出版物、记录、图表或任何其它可用于传达本发明组合物和方法的有用性的表达媒介。本发明的试剂盒的指导材料可例如被附加在包含本发明的核酸、肽和/或组合物的容器上，或与包含核酸、肽和/或组合物的容器一起运送。可选地，指导材料可与容器分开运送，目的是指导材料和化合物由接受者配合使用。
“分离的”指从自然状态改变或移出。例如，天然存在于活动物中的核酸或肽不是“分离的”，但部分或完全与它的自然状态的共存物质分离的同一核酸或肽是“分离的”。分离的核酸或蛋白可以以基本上纯化的形式存在，或例如，可存在于非自然环境，例如宿主细胞中。
在本发明的内容中，对于通常发生的核酸碱基使用以下缩写。“A”指的是腺苷，“C”指的是胞嘧啶，“G”指的是鸟苷，“T”指的是胸苷，和“U”指的是尿苷。
如本文所用的“慢病毒”指的是逆转录病毒科的属。在逆转录病毒中慢病毒是唯一能够感染非分裂细胞的；它们可传递显著量的遗传信息进入宿主细胞的DNA，所以其是基因送递载体的最有效的方法之一。HIV、SIV和FIV是所有慢病毒的实例。源自慢病毒的载体提供了完成显著水平的基因体内转移的工具。
如本文所用的术语“调节”指与缺少治疗或化合物的对象中的应答水平相比，和/或与以其他方式相同但未治疗的对象中的应答水平相比，介导对象中应答水平的可检测的增加或减少。该术语包括扰乱和/或影响天然信号或应答，由此介导对象——优选人——的有益的治疗性应答。
除非另有规定，“编码氨基酸序列的核苷酸序列”包括为彼此简并版本并编码相同的氨基酸序列的所有核苷酸序列。编码蛋白质和RNA的核苷酸序列可包括内含子。
术语“可操作地连接”指的是调节序列和异源核酸序列之间的功能连接，其产生后者的表达。例如，当第一核酸序列位于与第二核酸序列的功能关系中时，第一核酸序列与第二核酸序列可操作地连接。例如，如果启动子影响编码序列的转录或表达，则启动子被可操作地连接至编码序列。通常，可操作地连接的DNA序列是邻近的，其中在相同的阅读框中必须连接两个蛋白编码区。
术语“过表达的”肿瘤抗原或肿瘤抗原的“过表达”意欲指示相对于来自组织或器官的正常细胞的表达水平，来自疾病区如患者的特定组织或器官内的实体瘤的细胞中肿瘤抗原表达的异常水平。具有以肿瘤抗原过表达为特征的实体瘤或血液学恶性肿瘤的患者可由本领域已知的标准测定确定。
免疫原性组合物的“肠胃外”施用包括例如皮下(s.c)、静脉内(i.v.)、肌肉内(i.m.)或胸骨内注射，或注入技术。
术语“患者”、“对象”、“个体”等等在本文中可交换使用，并指的是服从本文描述方法的任何动物或其细胞，不论是体外或原位。在一些非限制性实施方式中，患者、对象或个体为人。
如本文所使用的术语“多核苷酸”被定义为核苷酸链。此外，核酸为核苷酸的多聚体。因此，如本文所使用的核酸和多核苷酸是可交换的。本领域技术人员具有核酸是可被水解成单体“核苷酸”的多核苷酸的一般常识。单体核苷酸可被水解成核苷。如本文所用的多核苷酸包括但不限于通过本领域可用的任何手段获得的所有的核酸序列，所述手段非限制性地包括重组手段，即，从重组文库或细胞基因组利用普通克隆技术和PCR等等克隆核酸序列，和合成手段。
如本文所使用的，术语“肽”、“多肽”和“蛋白质”可交换使用，并指的是由肽键共价连接的由氨基酸残基组成的化合物。蛋白质或肽必须包含至少两个氨基酸，并且对可构成蛋白质或肽的序列的氨基酸的最大数目没有限制。多肽包括任何肽或蛋白质，所述肽或蛋白质包括通过肽键相互连接的两个或多个氨基酸。如本文所使用的，该术语指的是短链，例如，其在本领域中也通常被称为肽、寡肽和寡聚体；和较长链，其在本领域中通常被称为蛋白质，其具有很多类型。“多肽”包括例如生物学活性片段、基本上同源的多肽、寡肽、同二聚体、异二聚体、多肽的变体、修饰的多肽、衍生物、类似物、融合蛋白等等。多肽包括天然肽、重组肽、合成肽或其组合。
如本文所用的术语“启动子”被定义为起始多核苷酸序列的特异性转录所需要的，由细胞的合成机器识别的，或引入合成机器的DNA序列。
如本文所用的，术语“启动子/调节序列”指可操作地连接至启动子/调节序列的基因产物的表达需要的核酸序列。在一些实例中，该序列可为核心启动子序列，并且在其它实例中，该序列也可包括基因产物表达所需的增强子序列和其它调节元件。启动子/调节序列可例如为以组织特异方式表达基因产物的序列。
“组成型”启动子为核苷酸序列，其当与编码或规定基因产物的多核苷酸可操作地连接时，使得在细胞的多数或所有生理学条件下在细胞中产生基因产物。
“诱导型”启动子为核苷酸序列，其当与编码或规定基因产物的多核苷酸可操作地连接时，使得在基本上仅当相应于启动子的诱导物存在于细胞中时，在细胞中产生基因产物。
“组织-特异性”启动子为核苷酸序列，其当与编码基因或由基因规定的多核苷酸可操作地连接时，使得基本上只要细胞为相应于启动子的组织类型的细胞，则在细胞中产生基因产物。
如本文所使用的关于抗体的术语“特异性结合”指识别特异性抗原但基本上不识别或结合样本中的其他分子的抗体。例如，特异性结合来自一个物种的抗原的抗体也可结合来自一个或多个物种的该抗原。但是，这种跨种反应性本身不改变抗体的类别为特异性的。在另一个实例中，特异性结合抗原的抗体也可结合抗原的不同等位基因形式。然而，这种交叉反应性本身不改变抗体的类别为特异性的。在一些实例中，术语“特异性的结合”或“特异性地结合”可关于抗体、蛋白质或肽与第二化学种类的相互作用使用，用于指该相互作用依赖化学种类上特定结构(例如抗原决定簇或表位)的存在；例如，抗体识别和结合特异性蛋白结构而不是一般地识别和结合蛋白质。如果抗体对表位“A”是特异的，则在包含标记的“A”和抗体的反应中存在包含表位A(或游离的、未标记的A)的分子将降低结合至抗体的标记的A的量。
术语“刺激”指通过将刺激分子(例如TCR/CD3复合物)与它的关联配体结合，由此介导信号转导事件——例如但不限于经由TCR/CD3复合物的信号转导——诱导的初级应答。刺激可介导某些分子的改变的表达，例如TGF-β的下调和/或细胞骨架结构的再组织等等。
“刺激分子”，作为本文使用的术语，指与存在于抗原呈递细胞上的关联刺激配体特异性结合的T细胞上的分子。
如本文所使用的“刺激配体”指如下配体，当存在于抗原呈递细胞(例如aAPC、树突细胞、B-细胞等等)上时，可与T细胞上的关联结合伴侣(在本文中被称为“刺激分子”)特异性结合，由此介导T细胞的初级应答，其包括但不限于，活化、免疫应答的起始、增殖等等。刺激配体在本领域中是公知的，并包括特别是利用肽、抗-CD3抗体、超激动剂抗-CD28抗体和超激动剂抗-CD2抗体负载的MHC I类分子。
术语“对象”意欲包括在其内可引起免疫应答的活的有机体(例如哺乳动物)。对象的实例包括人、狗、猫、小鼠、大鼠和其转基因物种。
如本文所用的“基本上纯化的”细胞为基本上不含其它细胞类型的细胞。基本上纯化的细胞也指的是已经与其它细胞类型分离的细胞，其在天然发生状态中与其它细胞类型正常相关联。在一些实例中，基本上纯化的细胞群指的是均质细胞群。在其它实例中，该术语简单地指的是已经与在其天然状态中与其正常相关联的细胞分离的细胞。在一些实施方式中，细胞在体外培养。在其它实施方式中，细胞不在体外培养。
如本文所用的术语“治疗性的”表示治疗和/或预防。治疗性效果通过疾病状态的抑制、缓和或根除获得。
术语“治疗有效量”指的是将引起由研究者、兽医、医学医生或其他临床医生正在寻找的组织、系统或对象的生物学或医学应答的对象化合物的量。术语“治疗有效量”包括以下的化合物的量：当被施用时，其足以预防正在治疗的紊乱或疾病的迹象或症状中的一个或多个的发展，或以一定程度减轻正在治疗的紊乱或疾病的迹象或症状中的一个或多个。治疗有效量将根据化合物、疾病和其严重性、和待治疗的对象的年龄、重量等而变化。
“治疗”疾病，作为本文使用的术语，指降低对象经历的疾病或紊乱中的至少一种迹象或症状的频率或严重性。
如本文所用的术语“转染的”或“转化的”或“转导的”指的是如下过程，通过该过程外源的核酸被转移或引入宿主细胞。“转染的”或“转化的”或“转导的”细胞是已经被转染、转化或转导外源核酸的细胞。该细胞包括原代对象细胞和其子代。
如本文所用的短语“转录控制下”或“可操作地连接”指启动子处于与多核苷酸有关的正确的位置和朝向，以控制通过RNA聚合酶进行的转录的开始和多核苷酸的表达。
“载体”为物质组合物，其包括分离的核酸，并且其可用于传递核酸至细胞内部。很多载体在本领域中是已知的，其包括但不限于线性多核苷酸、与离子或两亲化合物相关的多核苷酸、质粒和病毒。因此，术语“载体”包括自主复制的质粒或病毒。该术语也应被解释为包括便于将核酸转移入细胞的非质粒和非病毒化合物，诸如例如聚赖氨酸化合物、脂质体等等。病毒载体的实例包括但不限于腺病毒载体、腺伴随病毒载体、逆转录病毒载体等等。
范围：遍及该公开内容，本发明的多个方面可以以范围形式展示。应当理解范围形式中的描述仅是为了方便和简洁，并不应被解释为对本发明范围不可动摇的限制。因此，范围的描述应被考虑为已经具体公开了所有可能的子范围以及处于那个范围内的单个数值。例如，例如从1至6的范围的描述应被考虑为已经具体公开了子范围例如从1至3、从1至4、从1至5、从2至4、从2至6、从3至6等，以及那个范围内的单个数字，例如，1、2、2.7、3、4、5、5.3和6。不管范围的宽度如何，这一点是适用的。
描述
本发明提供了分析对转导T细胞目的用于施用给受试人有用的载体上清液的方法。本发明也提供了分析转导T细胞和其上清液的方法，目的用于施用给受试人。在各种实施方式中，本发明的分析方法包括分析T细胞存活、T细胞特性(例如CD3、CD4、CD8、CD25、CD27、CD45RA、CD57、CD62L、CD95、CD127、CD134、CD244、CCR7、CD40L、CTLA4、PD-1、HLA-DR、TIM3、Ki-67、穿孔蛋白、和/或粒酶表达)、转导效率、内毒素的存在和量、支原体的存在和量、具有复制能力的慢病毒(RCL)的存在和量、p24的存在和量、源自用于包装慢病毒质粒的各个质粒的核酸和/或蛋白质的存在和量、VSV-G核酸和/或蛋白质的存在和量、HIVgag、残留的抗-CD3/抗-CD28包被的珠、小鼠抗体、混合人血清、牛血清白蛋白、牛血清、培养基组分、载体包装细胞或质粒组分、细菌(例如粪产碱菌、白色念珠菌、大肠杆菌、流感嗜血杆菌、脑膜炎双球菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌和酿脓链球菌A群)或活化和/或调节免疫系统的细菌产物(例如LPS、核酸、RNA等等)的存在和量，和真菌的存在和量的方法。
在一些实施方式中，受试人可患有癌症。在各种实施方式中，该癌症可为血液学恶性肿瘤、实体瘤、原发肿瘤或转移性肿瘤。优选地，该癌症为血液学恶性肿瘤，和更优选地，该癌症为慢性淋巴细胞白血病(CLL)。利用本发明的组合物和方法可治疗的其它疾病包括病毒、细菌和寄生虫感染以及自身免疫疾病。
在一个实施方式中，载体包括编码CAR的核酸序列，其中当CAR是由T细胞表达时，CAR T细胞显示抗肿瘤性质。CAR可被工程改造以包括胞外结构域，其具有融合至T细胞抗原受体复合物ζ链(例如CD3ζ)的细胞内信号传导结构域的抗原结合结构域。CAR当在T细胞中表达时，能够基于抗原结合特异性改变(redirect)抗原识别。示例性抗原为CD19，因为该抗原在恶性B细胞上表达。然而，本发明不限制于识别CD19的CAR。相反地，本发明包括任何抗原结合部分，当其结合其关联抗原时，影响肿瘤细胞，以便肿瘤细胞不生长、被促使死亡或以其他方式被影响，以便患者的肿瘤负荷缩小或消除。抗原结合部分优选地与来自共刺激分子和ζ链中的一个或多个胞内结构域融合。优选地，抗原结合部分与选自CD137(4-1BB)信号传导结构域、CD28信号传导结构域、CD3ζ信号结构域和其任何组合的一个或多个胞内结构域融合。
在一个实施方式中，本发明的载体包括编码CD137(4-1BB)信号传导结构域的核酸序列。这是因为随着共刺激结构域的添加，CAR-介导的T细胞应答可被进一步加强。例如，与没有被工程改造以表达CD137(4-1BB)的其它相同的CAR T细胞相比，包括CD137(4-1BB)信号传导结构域显著增加了CAR T细胞的抗肿瘤活性和体内持久性。使用CAR基因修饰的T细胞的方法在PCT/US11/64191中描述，通过引用以其全部并入本文。
组合物
本发明提供了包括编码CAR的核酸的载体，其中CAR包括胞外和胞内结构域。胞外结构域包括靶-特异性结合元件，其另外被称为抗原结合部分。胞内结构域或另外的胞浆结构域包括共刺激信号传导区和ζ链部分。共刺激信号传导区指的是包括共刺激分子的胞内结构域的一部分CAR。共刺激分子是淋巴细胞对抗原的有效应答所需要的细胞表面分子，而不是抗原受体或它们的配体。
在CAR的胞外结构域和跨膜结构域之间，或在CAR的胞浆结构域和跨膜结构域之间，可并入间隔结构域。如本文所使用的，术语“间隔结构域”通常指起到将跨膜结构域连接至多肽链中的胞外结构域或胞浆结构域作用的任何寡肽或多肽。间隔结构域可包括上至300个氨基酸，优选地10至100个氨基酸和最优选地25至50个氨基酸。
抗原结合部分
在一个实施方式中，本发明的载体包括编码CAR的核酸，其中CAR包括另外被称为抗原结合部分的靶-特异性结合元件。部分的选择取决于限定靶细胞表面的配体的类型和数目。例如，可选择抗原结合结构域以识别用作与具体疾病状态相关的靶细胞上的细胞表面标记的配体。因此，可用作本发明的CAR中的抗原部分结构域的配体的细胞表面标记的实例包括与病毒，细菌和寄生虫感染，自身免疫疾病和癌细胞相关的那些标记。
在一个实施方式中，本发明的载体包括编码CAR的核酸，其中通过工程改造特异性结合至肿瘤细胞上抗原的期望抗原结合部分的方法，CAR被工程改造以靶向感兴趣的肿瘤抗原。在本发明的内容中，“肿瘤抗原”或“过度增生性紊乱抗原”或“与过度增生性紊乱相关的抗原”指的是对于特定过度增生性紊乱例如癌症共同的抗原。本文讨论的抗原仅以实例的方式被包括。该列举不意欲是穷尽的，并且更多的实例对于本领域技术人员将是容易显而易见的。
肿瘤抗原是由引起免疫应答，特别是T-细胞介导的免疫应答的肿瘤细胞产生的蛋白质。本发明的抗原结合部分的选择将取决于待治疗癌症的具体类型。肿瘤抗原在本领域中是公知的，并包括例如神经胶质瘤相关抗原、癌胚抗原(CEA)、β-人绒毛膜促性腺素、α-胎蛋白(AFP)、凝集素-反应性AFP、甲状腺球蛋白、RAGE-1、MN-CA IX、人端粒酶反转录酶、RU1、RU2(AS)、肠羧酸酯酶、mut hsp70-2、M-CSF、前列腺酶、前列腺-特异性抗原(PSA)、PAP、NY-ESO-1、LAGE-la、p53、prostein、PSMA、Her2/neu、存活素和端粒酶、前列腺-癌肿瘤抗原-1(PCTA-1)、MAGE、ELF2M、中性白细胞弹性蛋白酶、肝配蛋白B2、CD22、胰岛素生长因子(IGF)-I、IGF-II、IGF-I受体和间皮素。
在一个实施方式中，肿瘤抗原包括与恶性肿瘤相关的一个或多个抗原癌症表位。恶性肿瘤表达可用作免疫攻击的靶抗原的许多蛋白。这些分子包括但不限于组织-特异性抗原例如MART-1、黑素瘤中的酪氨酸酶和GP 100、和前列腺癌中的前列腺酸性磷酸酶(PAP)和前列腺-特异性抗原(PSA)。其它靶分子属于转化相关分子例如致癌基因HER-2/Neu/ErbB-2的组。而另一组的靶抗原为胎性癌抗原例如癌胚抗原(CEA)。在B-细胞淋巴瘤中，肿瘤-特异性个体基因型免疫球蛋白构成对个体肿瘤唯一的真正的肿瘤-特异性免疫球蛋白抗原。B-细胞分化抗原例如CD19、CD20和CD37是B-细胞淋巴瘤中靶抗原的其它候选物。这些抗原中的一些(CEA、HER-2、CD19、CD20、个体基因型)已经有限成功地用作利用单克隆抗体的被动免疫疗法的靶标。
本发明中提及的该类型肿瘤抗原也可为肿瘤-特异性抗原(TSA)或肿瘤相关抗原(TAA)。TSA对肿瘤细胞是唯一的，并且不发生在身体的其它细胞上。TAA相关的抗原对肿瘤细胞不是唯一的，并且相反，在不能诱导对抗原的免疫耐受状态的条件下，其也在正常细胞上表达。肿瘤上的抗原表达可在使免疫系统能够响应抗原的条件下发生。TAA可以是在胚胎发育期间，当免疫系统不成熟并且不能响应时，在正常细胞上表达的抗原，或它们可以是在正常细胞上以极低的水平正常存在的抗原，但其在肿瘤细胞上以高得多的水平进行表达。
TSA或TAA抗原的非限制性实例包括以下：分化抗原例如MART-l/MelanA(MART-I)、gp100(Pmel 17)、酪氨酸酶、TRP-1、TRP-2和肿瘤-特异性多谱系抗原例如MAGE-1、MAGE-3、BAGE、GAGE-1、GAGE-2、p15；过表达的胚胎抗原例如CEA；过表达的致癌基因和突变的肿瘤-抑制基因例如p53、Ras、HER-2/neu；由染色体易位产生的独特的肿瘤抗原，例如BCR-ABL、E2A-PRL、H4-RET、IGH-IGK、MYL-RAR；和病毒抗原，例如Epstein Barr病毒抗原EBVA和人乳头瘤病毒(HPV)抗原E6和E7。其它大的、基于蛋白的抗原包括TSP-180、MAGE-4、MAGE-5、MAGE-6、RAGE、NY-ESO、p185erbB2、p180erbB-3、c-met、nm-23H1、PSA、TAG-72、CA 19-9、CA 72-4、CAM 17.1、NuMa、K-ras、β-联蛋白、CDK4、Mum-1、p 15、p 16、43-9F、5T4、791Tgp72、α-胎蛋白、β-HCG、BCA225、BTAA、CA 125、CA 15-3\CA 27.29\BCAA、CA 195、CA 242、CA-50、CAM43、CD68\P1、CO-029、FGF-5、G250、Ga733\EpCAM、HTgp-175、M344、MA-50、MG7-Ag、MOV 18、NB/70K、NY-CO-1、RCAS1、SDCCAG16、TA-90\Mac-2结合蛋白\亲环蛋白C相关蛋白、TAAL6、TAG72、TLP和TPS。
在优选的实施方式中，CAR的抗原结合部分靶向如下抗原，所述抗原包括但不限于CD19、CD20、CD22、RORl、间皮素、CD33/IL3Ra、c-Met、PSMA、糖脂F77、EGFRvIII、GD-2、MY-ESO-1TCR、MAGEA3 TCR等等。
取决于待靶向的期望抗原，本发明的CAR可被工程改造以包括对期望抗原靶标特异的适当的抗原结合部分。例如，如果CD19是待靶向的期望抗原，则CD19的抗体可用作抗原结合部分，并入本发明的CAR。
在一个实施方式中，本发明的载体包括编码CAR的核酸，其中本发明的CAR的抗原结合部分靶向CD19。
跨膜结构域
CAR的跨膜结构域可被设计为包括融合至CAR的胞外结构域的跨膜结构域。在一个实施方式中，使用天然与CAR中的结构域之一相关联的跨膜结构域。在一些实例中，可选择或通过氨基酸置换修饰跨膜结构域，以避免将这样的结构域结合至相同或不同的表面膜蛋白的跨膜结构域，从而最小化与受体复合物的其它成员的相互作用。
跨膜结构域可源于天然来源或合成来源。当来源是天然的，该结构域可源于任何膜结合蛋白或跨膜蛋白。具体用于本发明的跨膜区可源于T-细胞受体的α、β或ζ链、CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154(即至少包括上述跨膜区(一个或多个))。可选地，跨膜结构域可为合成的，在该情况下，它将包括占主导的疏水残基例如亮氨酸和缬氨酸。优选地，将在合成跨膜结构域的每一端处发现苯丙氨酸、色氨酸和缬氨酸的三联体。任选地，短的寡肽或多肽连接体的长度，优选在2和10个氨基酸之间，可在CAR的跨膜结构域和胞浆信号传导结构域之间形成连接。甘氨酸-丝氨酸双联体提供了特别合适的连接体。
优选地，本发明的载体的CAR中的跨膜结构域是CD8跨膜结构域。在一些实例中，本发明的CAR的跨膜结构域包括CD8α铰链结构域。
胞浆结构域
本发明的载体的CAR的胞浆结构域或另外的细胞内信号传导结构域是造成其中已放置CAR的免疫细胞的至少一种正常效应子功能的活化的原因。术语“效应子功能”指的是细胞的专有功能。例如，T细胞的效应子功能可为包括细胞因子分泌的细胞溶解活性或辅助活性。因此术语“细胞内信号传导结构域”指的是转导效应子功能信号并指导细胞实施专有功能的蛋白部分。尽管通常可使用整个细胞内信号传导结构域，但在很多实例中，不必使用整个链。就使用细胞内信号传导结构域的截短部分而言，这种截短部分可用于代替完整的链，只要它转导效应子功能信号。术语细胞内信号传导结构域因此是指包括足以转导效应子功能信号的细胞内信号传导结构域的任何截短部分。
用于本发明的载体的CAR的细胞内信号传导结构域的优选实例包括T细胞受体(TCR)和协同行动以在抗原受体结合后开始信号转导的共受体的胞浆序列，以及这些序列的任何衍生物或变体和具有相同的功能能力的任何合成序列。
已知通过TCR单独产生的信号不足以完全活化T细胞，并且也需要次级或共刺激信号。因此，T细胞活化可被认为由两个不同类的胞浆信号传导序列介导：通过TCR起始抗原-依赖性初级活化的那些序列(初级胞浆信号传导序列)和以抗原-非依赖性方式起作用从而提供次级或共刺激信号的那些序列(次级胞浆信号传导序列)。
初级胞浆信号传导序列以刺激方式或以抑制方式调节TCR复合物的初级活化。以刺激方式起作用的初级胞浆信号传导序列可包含信号传导基序，其已知为基于免疫受体酪氨酸的活化基序或ITAM。
包含在本发明中具有具体用途的初级胞浆信号传导序列的ITAM的实例包括源于TCRζ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD5、CD22、CD79a、CD79b和CD66d的那些。特别优选地，本发明的CAR中的胞浆信号传导分子包括源于CD3ζ的胞浆信号传导序列。
在优选的实施方式中，CAR的胞浆结构域可被设计为本身包括CD3-ζ信号传导结构域，或可与在本发明的CAR的内容中有用的任何其它期望的胞浆结构域(一个或多个)联合。例如，CAR的胞浆结构域可包括CD3ζ链部分和共刺激信号传导区。共刺激信号传导区指的是包括共刺激分子的胞内结构域的一部分CAR。共刺激分子是淋巴细胞对抗原的有效应答所需要的细胞表面分子，而不是抗原受体或其配体。这样的分子的实例包括CD27、CD28、4-1BB(CD137)、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3和与CD83特异性结合的配体等等。因此，尽管本发明主要以4-1BB作为共刺激信号传导元件示例，但其它共刺激元件也处于本发明的范围内。
本发明的CAR的胞浆信号传导部分内的胞浆信号传导序列可以以随机或以规定的顺序相互连接。任选地，短的寡肽或多肽连接体，长度优选在2和10个氨基酸之间，可形成该连接。甘氨酸-丝氨酸双联体提供了特别合适的连接体。
在一个实施方式中，胞浆结构域被设计以包括CD3-ζ的信号传导结构域和CD28的信号传导结构域。在另一个实施方式中，胞浆结构域被设计以包括CD3-ζ的信号传导结构域和4-1BB的信号传导结构域。还在另一个实施方式中，胞浆结构域被设计以包括CD3-ζ的信号传导结构域和CD28和4-1BB的信号传导结构域。
在一个实施方式中，本发明的CAR中的胞浆结构域被设计为包括4-1BB的信号传导结构域和CD3-ζ的信号传导结构域。
载体
本发明包括产生包括CAR的序列的载体的方法，其中该序列包括可操作地连接至胞内结构域的核酸序列的抗原结合部分的核酸序列。可用于本发明的载体的CAR的示例性胞内结构域包括但不限于CD3-ζ、CD28、4-1BB等等的胞内结构域。在一些实例中，CAR可包括CD3-ζ、CD28、4-1BB等等的任何组合。
在一个实施方式中，本发明的载体的CAR包括抗-CD19scFv、人CD8铰链和跨膜结构域、和人4-1BB和CD3ζ信号传导结构域。
编码期望分子的核酸序列可利用在本领域中已知的重组方法获得，诸如例如通过从表达基因的细胞中筛选文库，通过从已知包括该基因的载体中得到该基因，或通过利用标准的技术从包含该基因的细胞和组织中直接分离。可选地，感兴趣的基因可被合成生产，而非克隆。
本发明也提供了其中插入本发明的DNA的载体。源于逆转录病毒例如慢病毒的载体是实现长期基因转移的合适工具，因为它们允许转基因长期、稳定的整合和其在子细胞中的增殖。慢病毒载体具有超过源自致癌逆转录病毒例如鼠科白血病病毒的载体的额外优点，因为它们可转导非增殖的细胞，例如肝细胞。它们也具有低免疫原性的额外优点。
简单概括，通常通过可操作地连接编码CAR多肽或其部分的核酸至启动子，并将构建体并入表达载体，实现编码CAR的天然或合成核酸的表达。该载体对于复制和整合真核细胞可以是合适的。典型的克隆载体包含对于调节期望核酸序列表达有用的转录和翻译终止子、起始序列和启动子。
本发明的表达构建体也可利用标准的基因传递方案，用于核酸免疫和基因治疗。基因传递的方法在本领域中是已知的。见例如美国专利号5,399,346、5,580,859、5,589,466，通过引用以其全部并入本文。在另一个实施方式中，本发明提供了基因治疗载体。
该核酸可被克隆入许多类型的载体。例如，该核酸可被克隆入如下载体，其包括但不限于质粒、噬菌粒、噬菌体衍生物、动物病毒和粘粒。特定感兴趣的载体包括表达载体、复制载体、探针产生载体和测序载体。
进一步，表达载体可以以病毒载体形式提供给细胞。病毒载体技术在本领域中是公知的并在例如Sambrook等(2001,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,New York)中和其它的病毒学和分子生物学手册中进行了描述。可用作载体的病毒包括但不限于逆转录病毒、腺病毒、腺伴随病毒、疱疹病毒和慢病毒。通常，合适的载体包含在至少一种有机体中起作用的复制起点、启动子序列、方便的限制酶位点和一个或多个可选择的标记(例如，WO01/96584；WO 01/29058；和美国专利号6,326,193)。
已经开发许多基于病毒的系统，用于将基因转移入哺乳动物细胞。例如，逆转录病毒提供了用于基因传递系统的方便的平台。可利用本领域中已知的技术将选择的基因插入载体并包装入逆转录病毒颗粒。该重组病毒可随后被分离和传递至体内或离体的对象细胞。许多逆转录病毒系统在本领域中是已知的。在一些实施方式中，使用腺病毒载体。许多腺病毒载体在本领域中是已知的。在一个实施方式中，使用慢病毒载体。
额外的启动子元件，例如增强子，调节转录起始的频率。通常，这些启动子元件位于起始位点上游的30-110bp区域中，尽管近来已经显示许多启动子也包含起始位点下游的功能元件。启动子元件之间的间隔经常是灵活的，以便当元件相对于另一个被倒置或移动时，保持启动子功能。在胸苷激酶(tk)启动子中，在活性开始下降前，启动子元件之间的间隔可被增加至50bp的距离。取决于启动子，表现出单个元件可合作或独立地起作用，以激活转录。
合适的启动子的一个实例为即时早期巨细胞病毒(CMV)启动子序列。该启动子序列是能够驱动可操作地连接至其上的任何多核苷酸序列高水平表达的强组成型启动子序列。合适的启动子的另一个实例为延伸生长因子-1α(EF-1α)。然而，也可使用其它组成型启动子序列，包括但不限于类人猿病毒40(SV40)早期启动子、小鼠乳癌病毒(MMTV)、人免疫缺陷病毒(HIV)长末端重复(LTR)启动子、MoMuLV启动子、鸟类白血病病毒启动子、艾伯斯坦-巴尔(Epstein-Barr)病毒即时早期启动子、鲁斯氏肉瘤病毒启动子、以及人基因启动子——例如但不限于肌动蛋白启动子、肌球蛋白启动子、血红素启动子和肌酸激酶启动子。进一步，本发明不应被限于使用组成型启动子。诱导型启动子也被考虑为本发明的一部分。诱导型启动子的使用提供了分子开关，当这样的表达是期望的时，其能够打开可操作地连接诱导型启动子的多核苷酸序列的表达，或当表达是不期望的时关闭表达。诱导型启动子的实例包括但不限于金属硫蛋白启动子、糖皮质激素启动子、孕酮启动子和四环素启动子。
为了评估CAR多肽或其部分的表达，被引入细胞的表达载体也可包含可选择的标记基因或报道基因中的任一个或两者，以便于从通过病毒载体寻求被转染或感染的细胞群中鉴定和选择表达细胞。在其它方面，可选择的标记可被携带在单独一段DNA上并用于共转染程序。可选择的标记和报道基因两者的侧翼都可具有适当的调节序列，以便能够在宿主细胞中表达。有用的可选择标记包括例如抗生素抗性基因，例如neo等等。
报道基因用于鉴定潜在转染的细胞并用于评价调节序列的功能性。通常，报道基因为以下基因：其不存在于受体有机体或组织或由受体有机体或组织表达，并且其编码多肽，该多肽的表达由一些可容易检测的性质例如酶活性清楚表示。在DNA已经被引入受体细胞后合适的时间下，测定报道基因的表达。合适的报道基因可包括编码荧光素酶、β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶、分泌型碱性磷酸酶的基因或绿色萤光蛋白基因(例如，Ui-Tei等,2000FEBS Letters 479:79-82)。合适的表达系统是公知的并可利用已知技术制备或从商业上获得。通常，显示最高水平的报道基因表达的具有最少5’侧翼区的构建体被鉴定为启动子。这样的启动子区可被连接至报道基因并用于评价试剂调节启动子-驱动转录的能力。
将基因引入和表达入细胞的方法在本领域中是已知的。在表达载体的内容中，载体可通过在本领域中的任何方法容易地引入宿主细胞，例如，哺乳动物、细菌、酵母或昆虫细胞。例如，表达载体可通过物理、化学或生物学手段转移入宿主细胞。
将多核苷酸引入宿主细胞的物理方法包括磷酸钙沉淀、脂质转染法、粒子轰击、微注射、电穿孔等等。生产包括载体和/或外源核酸的细胞的方法在本领域中是公知的。见例如Sambrook等(2001,MolecularCloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,NewYork)。将多核苷酸引入宿主细胞的优选方法为磷酸钙转染。
将感兴趣的多核苷酸引入宿主细胞的生物学方法包括使用DNA和RNA载体。病毒载体，特别是逆转录病毒载体，已经成为最广泛使用的将基因插入哺乳动物例如人细胞的方法。其它病毒载体可源自慢病毒、痘病毒、单纯疱疹病毒I、腺病毒和腺伴随病毒等等。见例如美国专利号5,350,674和5,585,362。
将多核苷酸引入宿主细胞的化学手段包括胶体分散系统，例如大分子复合物、纳米胶囊、微球、珠和基于脂质的系统——其包括水包油乳剂、胶束、混合胶束和脂质体。用作体外和体内传递工具的示例性胶体系统为脂质体(例如人造膜囊)。
在使用非病毒传递系统的情况下，示例性传递工具为脂质体。考虑使用脂质制剂，以将核酸引入宿主细胞(体外、离体或体内)。在另一个方面，该核酸可与脂质相关联。与脂质相关联的核酸可被封装入脂质体的水性内部中，散布在脂质体的脂双层内，经与脂质体和寡核苷酸两者都相关联的连接分子附接至脂质体，陷入脂质体，与脂质体复合，分散在包含脂质的溶液中，与脂质混合，与脂质联合，作为悬浮液包含在脂质中，包含在胶束中或与胶束复合，或以其他方式与脂质相关联。与组合物相关联的脂质、脂质/DNA或脂质/表达载体不限于溶液中的任何具体结构。例如，它们可存在于双分子层结构中，作为胶束或具有“坍缩的(collapsed)”结构。它们也可简单地被散布在溶液中，可能形成大小或形状不均一的聚集体。脂质为脂肪物质，其可为天然发生或合成的脂质。例如，脂质包括脂肪小滴，其天然发生在细胞质以及包含长链脂肪族烃和它们的衍生物例如脂肪酸、醇类、胺类、氨基醇类和醛类的该类化合物中。
适于使用的脂质可从商业来源中获得。例如，二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(“DMPC”)可从Sigma,St.Louis,MO获得；磷酸二鲸蜡酯(“DCP”)可从K&K Laboratories(Plainview,NY)中获得；胆固醇(“Choi”)可从Calbiochem-Behring中获得；二肉豆蔻酰磷脂酰甘油(“DMPG”)和其它脂质可从Avanti Polar Lipids,Inc.(Birmingham,AL)中获得。氯仿或氯仿/甲醇中的脂质原液可被保存在大约-20℃。氯仿被用作唯一的溶剂，因为它比甲醇更容易蒸发。“脂质体”为通用术语，其包括通过产生封闭的脂双层或聚集体而形成的多种单一和多层脂质工具。脂质体可以被表征为具有含有磷脂双层膜和内部水性介质的囊泡结构。多层脂质体具有由水性介质分开的多个脂质层。当磷脂悬浮在过量的水性溶液中时，它们自发形成。在形成封闭的结构和使水和溶解的溶质陷入脂双层之间前，该脂质成分经历自身重排(Ghosh等,1991Glycobiology 5:505-10)。然而，与正常的囊泡结构相比，也包括在溶液中具有不同结构的组合物。例如，脂质可呈现胶束结构或仅作为脂质分子的非均一聚集体而存在。同样考虑的是脂质转染胺-核酸复合物。
不管用于将外源核酸引入宿主细胞，或以其它方式将细胞暴露于本发明的抑制剂的方法，为了证实在宿主细胞中存在重组DNA序列，可实施多种测定。这样的测定包括例如本领域技术人员公知的“分子生物学”测定，例如DNA印迹法和RNA印迹法、RT-PCR和PCR；“生物化学”测定，例如，例如通过免疫学手段(ELISA和蛋白质印迹)或通过本文描述的落入本发明范围内的鉴定试剂的测定，检测特定肽的存在或不存在。
T细胞的来源
在本发明的T细胞的扩展和基因修饰前，从对象获得T细胞的来源。T细胞可从许多来源中获得，包括外周血单核细胞、骨髓、淋巴结组织、脐带血、胸腺组织、来自感染部位的组织、腹水、胸腔积液、脾组织和肿瘤。在本发明的某些实施方式中，可使用在本领域中可用的任何数量的T细胞系。在本发明的某些实施方式中，T细胞可利用技术人员已知的任何数量的技术例如FicollTM分离法自从对象中收集的单位血液中获得。在一个优选实施方式中，来自个体循环血液中的细胞通过单采血液成分术获得。单采血液成分术产物通常包含淋巴细胞——其包括T细胞、单核细胞、粒细胞、B细胞、其它成核的白细胞、红细胞和血小板。在一个实施方式中，可冲洗由单采血液成分术收集的细胞以移除血浆部分并将细胞放置在适当的缓冲液或培养基中，用于随后的处理步骤。在本发明的一个实施方式中，用磷酸盐缓冲盐水(PBS)冲洗细胞。在可选实施方式中，冲洗液缺少钙并可缺少镁，或可缺少很多——如果不是全部的话——的二价阳离子。此外，令人惊讶地，在缺少钙的情况下的初始活化步骤导致放大的活化。本领域技术人员将容易理解冲洗步骤可通过本领域技术人员已知的方法完成，例如根据制造商的使用说明通过使用标准离心机、半自动“最大限度”离心机(例如Cobe 2991细胞处理器、Baxter CytoMate或Haemonetics细胞回收器5)。在冲洗后，细胞可重悬浮在多种生物相容的缓冲液中，比如，例如无Ca2+、无Mg2+PBS、PlasmaLyte A、5％右旋糖的0.45％氯化钠溶液或含有或不含有缓冲液的任何组成的其它盐溶液。可选地，可移除单采血液成分术样本的不期望组分，并且将细胞直接重悬浮在培养基中。
在另一个实施方式中，T细胞通过溶解红细胞和耗尽单核细胞从外周血淋巴细胞中分离出来，例如，通过经过PERCOLLTM梯度的离心或通过逆流离心淘洗或Miltenyi CliniMACS、或磁珠、或结合至抗体的磁珠。T细胞的特定亚群，例如CD3+、CD28+、CD4+、CD8+、CD45RA+、CD45RO+、CD62L+、CD127+T细胞，可进一步通过阳性或阴性选择技术进行分离或耗尽。例如，在一个实施方式中，T细胞通过与抗-CD3/抗-CD28(即，3×28)-缀合珠例如M-450CD3/CD28T一起温育持续足以阳性选择期望T细胞的时间段，进行分离。在一个实施方式中，时间段为大约30分钟。在进一步的实施方式中，时间段范围为30分钟至36小时或更长，和其间的所有的整数值。在进一步的实施方式中，时间段是至少1、2、3、4、5或6小时。在还另一个优选的实施方式中，时间段为10至24小时。在一个优选实施方式中，温育时间段为24小时。对于分离来自具有白血病的患者的T细胞，使用更长的温育时间例如24小时，可增加细胞产量。更长的温育时间可用于在与其它细胞类型相比具有更少T细胞的任何情况下分离T细胞，例如，在分离来自肿瘤组织或来自无免疫应答个体的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)中。进一步，使用更长的温育时间可增加CD8+T细胞的捕获效率。因此，通过简单地缩短或延长时间，允许T细胞结合至CD3/CD28珠，和/或通过增加或减少珠与T细胞的比率(如本文中进一步描述的)，在培养初始或在该过程的其它时间点上，可优先选择或排除T细胞的亚群。此外，通过增加或减少珠或其它表面上抗-CD3和/或抗-CD28抗体的比率，在培养初始或在其它期望的时间点上，可优先选择或排除T细胞的亚群。技术人员将理解多轮选择也可用于本发明的内容中。在某些实施方式中，可期望实施选择程序并在活化和扩展过程中使用“未选择的”细胞。“未选择的”细胞也可经历更多轮的选择。
通过阴性选择T细胞群的富集可利用针对阴性选择的细胞独特的表面标记的抗体的组合而完成。一种方法为细胞分选和/或选择，其经由阴性磁性免疫粘附或使用针对存在于阴性选择的细胞上的细胞表面标记的单克隆抗体的混合物的流式细胞术进行。例如，为了通过阴性选择富集CD4+细胞，单克隆抗体混合物通常包括CD14、CD20、CD11b、CD16、HLA-DR和CD8的抗体。在某些实施方式中，可期望富集或阳性选择通常表达CD4+、CD25+、CD62Lhi、GITR+和FoxP3+的调节T细胞。可选地，在某些实施方式中，T调节细胞通过抗-C25缀合珠或其它类似的选择方法耗尽。
对于通过阳性或阴性选择分离期望的细胞群，可改变细胞和表面(例如，例如珠的颗粒)的浓度。在某些实施方式中，可期望显著减少其中珠和细胞被混合在一起的体积(即，增加细胞浓度)，以确保细胞和珠的最大接触。例如，在一个实施方式中，使用20亿细胞/ml的浓度。在一个实施方式中，使用10亿细胞/ml的浓度。在进一步的实施方式中，使用多于1亿细胞/ml。在进一步的实施方式中，使用10、15、20、25、30、35、40、45或50×106细胞/ml的细胞浓度。在还另一个实施方式中，使用75、80、85、90、95或100×106细胞/ml的细胞浓度。在进一步的实施方式中，可使用125或150×106细胞/ml的浓度。使用高浓度可导致增加的细胞产量、细胞活化和细胞扩展。进一步，使用高细胞浓度允许更有效捕获可微弱表达感兴趣的靶抗原的细胞，例如CD28-阴性T细胞，或捕获来自有很多肿瘤细胞存在的样本(即白血病血液、肿瘤组织等)的细胞。这样的细胞群可具有治疗价值并将期望获得。例如，使用高浓度的细胞允许更有效的选择正常地具有更弱CD28表达的CD8+T细胞。
在相关的实施方式中，可期望使用更低浓度的细胞。通过显著稀释T细胞和表面(例如，例如珠的颗粒)的混合物，颗粒和细胞之间的相互作用被最小化。这样选择的细胞表达高数量的待结合至颗粒的期望抗原。例如，在稀浓度，CD4+T细胞比CD8+T细胞表达更高水平的CD28并更有效地被捕获。在一个实施方式中，使用的细胞浓度为5×106/ml。在其他实施方式中，使用的浓度可从大约1×105/ml至1×106/ml，和之间的任何整数值。
在其它实施方式中，在旋转器上，细胞可在2-37℃的任一个温度下以变化的速度温育，持续变化的时间长度。
在冲洗步骤后，用于刺激的T细胞也可被冷冻。不希望被理论所束缚，通过去除细胞群中的粒细胞和以一定程度去除单核细胞，冷冻和随后的解冻步骤提供了更均一的产物。在去除血浆和血小板的冲洗步骤后，细胞可被悬浮在冷冻液中。尽管很多冷冻液和参数在本领域中是已知的，并将在本内容中是有用的，但一种方法包括使用包含20％DMSO和8％人血清白蛋白的PBS，或包含10％葡聚糖40和5％右旋糖、20％人血清白蛋白和7.5％DMSO，或31.25％Plasmalyte-A、31.25％的右旋糖5％、0.45％NaCl、10％葡聚糖40和5％右旋糖、20％人血清白蛋白和7.5％DMSO的培养基，或包含例如Hespan或喷他淀粉和PlasmaLyte A的其它合适的细胞冷冻培养基，细胞随后被以1°每分钟的速率冷冻至-80℃，并保存在液氮储罐的蒸汽相中。可使用受控冷冻的其他方法以及在-20℃下或液氮中不受控的即刻冷冻。
在某些实施方式中，冷藏的细胞如本文所述的解冻和冲洗，并允许在使用本发明的方法活化前在室温下静止1小时。
在本发明的内容下也考虑到的是在当可能需要如本文所述的扩展细胞前的时间段，从对象收集血液样本或单采血液成分术产物。因此，待扩展的细胞的来源可在必要的任何时间点收集，并且期望的细胞例如T细胞，被分离和冷冻，以便以后在T细胞治疗中用于将受益于T细胞治疗的任何数量的疾病或病症，例如本文所述的那些。在一个实施方式中，血液样本或单采血液成分术样本取自大体健康的对象。在某些实施方式中，血液样本或单采血液成分术样本取自处于患病风险下但还没有患病的大体健康的对象，并且感兴趣的细胞被分离和冷冻以便以后使用。在某些实施方式中，T细胞可在以后的时间被扩展、冷冻和使用。在某些实施方式中，在如本文所述的具体疾病的诊断后，但在任何治疗前，立刻从患者收集样本。在进一步的实施方式中，在任何数量的有关治疗形式前，从来自对象的血液样本或单采血液成分术样本分离细胞，所述治疗形式包括但不限于用以下试剂治疗：例如那他珠单抗(natalizumab)、厄法珠单抗(efalizumab)、抗病毒剂、化疗、辐射、免疫抑制剂——例如环孢菌素、硫唑嘌呤、甲氨喋呤、麦考酚酯和FK506，抗体或其它免疫烧蚀剂例如CAMPATH、抗-CD3抗体、环磷酰胺、氟达拉滨、环孢菌素、FK506、雷帕霉素、麦考酚酸、类固醇类、FR901228和照射。这些药物抑制钙依赖性磷酸酶——钙调磷酸酶(环孢菌素和FK506)或抑制对生长因子诱导的信号传导重要的p70S6激酶(雷帕霉素)(Liu等,Cell 66:807-815,1991；Henderson等,Immun.73:316-321,1991；Bierer等,Curr.Opin.Immun.5:763-773,1993)。在进一步的实施方式中，分离患者细胞并冷冻以便以后与骨髓或干细胞移植、利用化疗剂例如氟达拉滨、外部光束放射疗法(XRT)、环磷酰胺或抗体例如OKT3或CAMPATH的T细胞烧蚀疗法结合(例如，之前、同时或之后)使用。在另一个实施方式中，细胞被分离，然后可被冷冻以便以后用于B-细胞烧蚀疗法之后的治疗，例如与CD20反应的试剂，例如Rituxan。
在本发明进一步的实施方式中，在治疗后直接从患者获得T细胞。在这点上，已经观察到在某些癌症治疗后，特别是用损坏免疫系统的药物治疗后，在治疗后不久，当患者将正常地从治疗中恢复期间，获得的T细胞的质量对于其离体扩展能力可以是最佳或改善的。同样地，在利用本文描述的方法离体操纵后，这些细胞可处于提高的移植物移入和体内扩展的优选状态。因此，在本发明的内容内考虑在该恢复期期间收集血液细胞，包括T细胞、树突细胞或造血系的其它细胞。进一步，在某些实施方式中，转移(例如，用GM-CSF转移)和调节方案可用于在对象中创造以下条件，其中具体细胞类型的再群体化、再循环、再生和/或扩展是有利的，特别是在治疗后限定的时间窗口期间。说明性的细胞类型包括T细胞、B细胞、树突细胞和免疫系统的其它细胞。
T细胞的活化和扩展
不论在T细胞基因修饰以表达期望的CAR之前或之后，T细胞都可通常使用以下所述的方法活化和扩展：例如美国专利6,352,694；6,534,055；6,905,680；6,692,964；5,858,358；6,887,466；6,905,681；7,144,575；7,067,318；7,172,869；7,232,566；7,175,843；5,883,223；6,905,874；6,797,514；6,867,041；和美国专利申请公布号20060121005。
通常，本发明的T细胞通过与表面的接触进行扩展，所述表面具有附着于其上的刺激CD3/TCR复合物相关信号的试剂和刺激T细胞表面上的共刺激分子的配体。特别地，T细胞群可如本文所述的例如通过与固定在表面上的抗-CD3抗体、或其抗原-结合片段或抗-CD2抗体接触，或通过和与钙离子载体结合的蛋白激酶C激活剂(例如苔藓抑制素)接触进行刺激。对于T细胞表面上的辅助分子的共刺激，使用结合辅助分子的配体。例如，T细胞群可在适于刺激T细胞增殖的条件下与抗-CD3抗体和抗-CD28抗体接触。为了刺激CD4+T细胞或CD8+T细胞的增殖，使用抗-CD3抗体和抗-CD28抗体。可与在本领域中公知的其他方法一样，可使用包括9.3、B-T3、XR-CD28(Diacione，Besancon，France)的抗-CD28抗体的实例(Berg等,Transplant Proc.30(8):3975-3977,1998；Haanen等,J.Exp.Med.190(9):13191328,1999；Garland等,J.Immunol Meth.227(1-2):53-63,1999)。
在某些实施方式中，T细胞的初级刺激信号和共刺激信号可通过不同的方案提供。例如，提供每个信号的试剂可在溶液中或连接至表面。当连接至表面时，试剂可被连接至同一表面(即，以“cis”形式)或分开的表面(即，以“trans”形式)。可选地，一种试剂可被连接至表面且另一种试剂处于溶液中。在一个实施方式中，提供共刺激信号的试剂被结合至细胞表面，并且提供初级活化信号的试剂在溶液中或被连接至表面。在某些实施方式中，两种试剂可都在溶液中。在另一个实施方式中，试剂可以以可溶形式，随后被交联至表面，例如表达Fc受体或抗体的细胞或将结合该试剂的其它结合剂。在这点上，见例如用于人造抗原呈递细胞(aAPC)的美国专利申请公布号20040101519和20060034810，其被考虑用于活化和扩展本发明的T细胞。
在一个实施方式中，两种试剂被固定在珠上，固定在同一珠即“cis”上或固定至分开的珠即“trans”上。举例说明，提供初级活化信号的试剂为抗-CD3抗体或其抗原-结合片段，和提供共刺激信号的试剂为抗-CD28抗体或其抗原-结合片段；并且两种试剂都以相等的分子数量被共固定至同一珠。在一个实施方式中，使用结合至用于CD4+T细胞扩展和T细胞生长的珠的1∶1比率的每种抗体。在本发明的某些方面中，使用一定比率的结合至珠的抗CD3∶CD28抗体，以便与利用1∶1比率观察到的扩展相比，观察T细胞扩展的增加。在一个具体的实施方式中，与利用1∶1比率观察到的扩展相比，观察到从大约1至大约3倍的增加。在一个实施方式中，结合至珠的CD3∶CD28抗体的比率处于100∶1至1∶100的范围内和其间的所有整数值。在本发明的一个方面中，比抗-CD3抗体更多的抗-CD28抗体被结合至颗粒，即CD3∶CD28的比率小于1。在本发明的某些实施方式中，结合至珠的抗CD28抗体与抗CD3抗体的比率大于2∶1。在一个具体的实施方式中，使用结合至珠的抗体的1∶100的CD3∶CD28比率。在另一个实施方式中，使用结合至珠的抗体的1∶75的CD3∶CD28比率。在进一步的实施方式中，使用结合至珠的抗体的1∶50的CD3∶CD28比率。在另一个实施方式中，使用结合至珠的抗体的1∶30的CD3∶CD28比率。在一个优选实施方式中，使用结合至珠的抗体的1∶10的CD3∶CD28比率。在另一个实施方式中，使用结合至珠的抗体的1∶3的CD3∶CD28比率。在还另一个实施方式中，使用结合至珠的抗体的3∶1的CD3∶CD28比率。
从1∶500至500∶1和其间任何整数值的颗粒与细胞的比率可用于刺激T细胞或其它靶细胞。因为在本领域技术人员可容易地领会到，颗粒与细胞的比率可取决于相对于靶细胞的颗粒大小。例如，小尺寸的珠仅可结合一些细胞，而较大的珠能结合很多。在某些实施方式中，细胞与颗粒的比率在1∶100至100∶1的范围内和其间任何整数值，和在进一步的实施方式中，该比率包括1∶9至9∶1和其间任何整数值，也可用于刺激T细胞。产生T细胞刺激的抗-CD3-和抗-CD28-结合的颗粒与T细胞的比率可如以上记录的变化，然而某些优选的值包括1∶100、1∶50、1∶40、1∶30、1∶20、1∶10、1∶9、1∶8、1∶7、1∶6、1∶5、1∶4、1∶3、1∶2、1∶1、2∶1、3∶1、4∶1、5∶1、6∶1、7∶1、8∶1、9∶1、10∶1和15∶1，一个优选的比率为至少1∶1颗粒每个T细胞。在一个实施方式中，使用1∶1或更小的颗粒与细胞的比率。在一个具体的实施方式中，优选的颗粒∶细胞的比率为1∶5。在进一步的实施方式中，颗粒与细胞的比率可根据刺激天数而改变。例如，在一个实施方式中，颗粒与细胞的比率在第一天为1∶1至10∶1，和额外的颗粒在每天或此后每隔一天直至10天，以1∶1至1∶10的最终比率(基于添加日的细胞计数)被添加至细胞。在一个具体的实施方式中，颗粒与细胞的比率在刺激的第一天为1∶1并在刺激的第三和第五天被调节至1∶5。在另一个实施方式中，颗粒在每天或每隔一天的基础上添加，以达到第一天1∶1的最终比率，和在刺激的第三和第五天1∶5的最终比率。在另一个实施方式中，颗粒与细胞的比率在刺激的第一天为2∶1并在刺激的第三和第五天被调节至1∶10。在另一个实施方式中，颗粒在每天或每隔一天的基础上添加，以达到第一天1∶1的最终比率，和在刺激的第三和第五天1∶10的最终比率。本领域技术人员将理解多种其它比率可适于用于本发明。特别地，比率将根据颗粒大小以及细胞大小和类型而变化。
在本发明进一步的实施方式中，例如T细胞的细胞，与包被试剂的珠组合，珠和细胞随后被分离，并且随后培养该细胞。在可选实施方式中，在培养前，不分离包被试剂的珠和细胞，而是在一起进行培养。在进一步的实施方式中，珠和细胞首先通过施加例如磁力的力被聚集，这导致增加的细胞表面标记的连接作用，由此诱导细胞刺激。
举例说明，可通过允许附接抗-CD3和抗-CD28的顺磁珠(3×28珠)以接触T细胞，来连接细胞表面蛋白。在一个实施方式中，细胞(例如104至109个T细胞)和珠(例如1∶1比率的M-450 CD3/CD28T顺磁珠)在优选为PBS的缓冲液(没有例如钙和镁的二价阳离子)中组合。此外，本领域技术人员可容易理解可使用任何细胞浓度。例如，靶细胞可在样本中非常稀少并仅占样本的0.01％，或整个样本(即，100％)可包括感兴趣的靶细胞。因此，任何细胞数量都在本发明的内容中。在某些实施方式中，可期望显著降低颗粒和细胞混合在一起的体积(即，增加细胞浓度)，以确保细胞和颗粒的最大接触。例如，在一个实施方式中，使用大约20亿细胞/ml的浓度。在另一个实施方式中，使用多于1亿细胞/ml。在进一步的实施方式中，使用10、15、20、25、30、35、40、45或50×106细胞/ml的细胞浓度。还在另一个实施方式中，使用75、80、85、90、95或100×106细胞/ml的细胞浓度，在进一步的实施方式中，可使用125或150×106细胞/ml的浓度。利用高浓度可导致增加的细胞产量、细胞活化和细胞扩展。进一步，使用高细胞浓度允许更有效地捕获可微弱表达感兴趣的靶抗原的细胞，例如CD28-阴性T细胞。这样的细胞群可具有治疗价值并将在某些实施方式中期望获得。例如，利用高浓度的细胞允许更有效地选择正常地具有更弱CD28表达的CD8+T细胞。
在本发明的一个实施方式中，混合物可被培养数小时(大约3小时)至大约14天或其间任何个小时的整数值。在另一个实施方式中，混合物可被培养21天。在本发明的一个实施方式中，珠和T细胞在一起被培养大约八天。在另一个实施方式中，珠和T细胞在一起被培养2-3天。也可期望数个周期的刺激，以便T细胞的培养时间可为60天或更多天。适于T细胞培养的条件包括适当的培养基(例如，最小必需培养基或RPM1培养基1640或X-vivo 15，(Lonza))，其可包含增殖和存活必需的因子，所述因子包括血清(例如胎牛或人血清)、白细胞介素-2(IL-2)、胰岛素、IFN-γ、IL-4、IL-7、GM-CSF、IL-10、IL-12、IL-15、TGFβ和TNF-α或技术人员已知的用于细胞生长的任何其它添加剂。用于细胞生长的其它添加剂包括但不限于表面活性剂、人血浆蛋白粉(plasmanate)和例如N-乙酰基-半胱氨酸和2-巯基乙醇的还原剂。培养基可包括RPMI 1640、AIM-V、DMEM、MEM、α-MEM、F-12、X-Vivo 15和X-Vivo 20、优选子(Optimizer)，具有添加的氨基酸、丙酮酸钠和维生素、无血清或补充适当量的血清(或血浆)或限定的激素组，和/或足够T细胞生长和扩展的量的细胞因子(一种或多种)。抗生素，例如青霉素和链霉素，仅被包括在实验培养物中，而不包括在待注入对象的细胞培养物中。靶细胞被维持在支持生长必须的条件下，例如，适当的温度(例如37℃)和气氛(例如，空气加5％CO2)。
已经暴露于变化的刺激时间的T细胞可显示不同的特性。例如，典型的血液或单采的外周血单核细胞产物具有比细胞毒性或抑制T细胞群(TC，CD8+)更多的辅助T细胞群(TH，CD4+)。通过刺激CD3和CD28受体离体扩展T细胞在大约8-9天前产生主要由TH细胞组成的T细胞群，而在大约8-9天后，T细胞群包括渐增的更多的TC细胞群。因此，取决于治疗目的，用主要包括TH细胞的T细胞群注入对象可以是有利的。类似地，如果已经分离了TC细胞的抗原-特异性亚型，则它可有益于以更大的程度扩展该亚型。
进一步，除了CD4和CD8标记，其它的表型标记在细胞扩展过程期间显著地但以大部分可重复地变化。因此，这种重复性使得针对具体目的调节活化的T细胞产物的能力能够实现。
治疗性应用
本发明包括用载体(例如慢病毒载体(LV))转导的细胞(例如T细胞)。例如，LV编码将特异性抗体的抗原识别结构域与CD3-ζ、CD28、4-1BB或任何其组合的胞内结构域结合的CAR。因此，在一些实例中，转导的T细胞可引起CAR-介导的T-细胞应答。
本发明提供了CAR改变初级T细胞对肿瘤抗原的特异性的用途。因此，本发明也提供了刺激对哺乳动物的靶细胞群或组织的T细胞-介导的免疫应答的方法，其包括以下步骤：施用给哺乳动物表达CAR的T细胞，其中CAR包括特异性地与预定靶标相互作用的结合部分，包括例如人CD3ζ的胞内结构域的ζ链部分，和共刺激信号传导区。
在一个实施方式中，本发明包括一类细胞疗法，其中T细胞被基因修饰以表达CAR，并且CAR T细胞被注入需要其的接受者中。注入的细胞能够杀死接受者的肿瘤细胞。不同于抗体治疗，CAR T细胞能够在体内复制，这造成可导致持续肿瘤控制的长期持久性。
在一个实施方式中，本发明的CAR T细胞可经历稳固的体内T细胞扩展并可持续延长的时间量。在另一个实施方式中，本发明的CAR T细胞发展成可被重新活化以抑制任何额外肿瘤形成或生长的特异性记忆T细胞。例如，出乎意料的是本发明的CART19细胞可经历稳固的体内T细胞扩展并在血液和骨髓中以高水平持续延长的时间量，并形成特异性记忆T细胞。不希望被任何具体的理论所束缚，在遇到并随后消除表达替代抗原的靶细胞后，CAR T细胞可体内分化成中心记忆样状态。
不希望被任何具体的理论所束缚，由CAR-修饰的T细胞引起的抗肿瘤免疫应答可为主动或被动免疫应答。此外，CAR介导的免疫应答可为过继免疫治疗步骤的一部分，其中CAR-修饰的T细胞诱导对CAR中的抗原结合部分特异性的免疫应答。例如，CART19细胞引起抗表达CD19的细胞的特异性的免疫应答。
尽管本文公开的数据具体公开了包括源于FMC63鼠科单克隆抗体的抗-CD19scFv、人CD8α铰链和跨膜结构域、和人4-1BB和CD3ζ信号传导结构域的慢病毒载体，但本发明应被解释为包括如本文其它地方所述的构建体组成部分中的每一个的任何数量的变化。即，本发明包括CAR中任何抗原结合部分产生对抗原结合部分特异性的CAR-介导的T-细胞应答的用途。例如，本发明的CAR中的抗原结合部分可出于治疗癌症的目的靶向肿瘤抗原。
可治疗的癌症包括没有被血管化或基本上还没有被血管化的肿瘤，以及血管化的肿瘤。癌症可包括非实体瘤(例如血液学肿瘤，例如白血病和淋巴瘤)或可包括实体瘤。利用本发明的CAR治疗的癌症类型包括但不限于癌、胚细胞瘤和肉瘤，和某些白血病或淋巴恶性肿瘤、良性和恶性肿瘤、和恶性瘤——例如肉瘤、癌和黑素瘤。也包括成人肿瘤/癌症和儿童肿瘤/癌症。
血液学癌症为血液或骨髓的癌症。血液学(或血原性)癌症的实例包括白血病，其包括急性白血病(例如急性淋巴细胞白血病、急性髓细胞白血病、急性骨髓性白血病和成髓细胞性、前髓细胞性、粒-单核细胞型、单核细胞性和红白血病)、慢性白血病(例如慢性髓细胞(粒细胞性)白血病、慢性骨髓性白血病和慢性淋巴细胞白血病)、真性红细胞增多症、淋巴瘤、霍奇金氏疾病、非霍奇金氏淋巴瘤(无痛和高等级形式)、多发性骨髓瘤、瓦尔登斯特伦氏巨球蛋白血症、重链疾病、骨髓增生异常综合征、多毛细胞白血病和脊髓发育不良。
实体瘤为通常不包含囊肿或液体区的组织的异常肿块。实体瘤可为良性或恶性的。不同类型的实体瘤以形成它们的细胞类型命名(例如肉瘤、癌和淋巴瘤)。例如肉瘤和癌的实体瘤的实例包括纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、骨肉瘤和其它肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤因氏肿瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、淋巴恶性肿瘤、胰腺癌、乳腺癌、肺癌、卵巢癌、前列腺癌、肝细胞癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、甲状腺髓样癌、乳头状甲状腺癌、嗜铬细胞瘤皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、髓样癌、支气管癌、肾细胞癌、肝细胞瘤、胆管癌、绒膜癌、维尔姆斯氏肿瘤、子宫颈癌、睾丸肿瘤、精原细胞瘤、膀胱癌、黑素瘤和CNS肿瘤(例如神经胶质瘤(例如脑干神经胶质瘤和混合神经胶质瘤)、成胶质细胞瘤(也称为多形性成胶质细胞瘤)星形细胞瘤、CNS淋巴瘤、生殖细胞瘤、成神经管细胞瘤、神经鞘瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、成血管细胞瘤、听神经瘤、少突神经胶质瘤、脑膜瘤、神经细胞瘤、视网膜母细胞瘤和脑转移)。
在一个实施方式中，本发明的CAR的抗原结合部分被设计以治疗具体的癌症。例如，被设计为靶向CD19的CAR可用于治疗癌症和紊乱，包括但不限于前-B ALL(儿童指征)、成人ALL、套细胞淋巴瘤、扩散大B-细胞淋巴瘤、同种骨髓移植后的补救等等。
在另一个实施方式中，CAR可被设计为靶向CD22以治疗扩散大B-细胞淋巴瘤。
在一个实施方式中，癌症和紊乱包括但不限于前-B ALL(儿童指征)、成人ALL、套细胞淋巴瘤、扩散大B-细胞淋巴瘤、同种骨髓移植后的补救等等，其可利用靶向CD19、CD20、CD22和ROR1的CAR的组合进行治疗。
在一个实施方式中，CAR可被设计为靶向间皮素以治疗间皮瘤、胰腺癌、卵巢癌等等。
在一个实施方式中，CAR可被设计为靶向CD33/IL3Ra以治疗急性骨髓性白血病等等。
在一个实施方式中，CAR可被设计为靶向c-Met以治疗三阴性乳腺癌、非小细胞肺癌等等。
在一个实施方式中，CAR可被设计为靶向PSMA以治疗前列腺癌等等。
在一个实施方式中，CAR可被设计为靶向糖脂F77以治疗前列腺癌等等。
在一个实施方式中，CAR可被设计为靶向EGFRvIII以治疗成胶质细胞瘤等等。
在一个实施方式中，CAR可被设计为靶向GD-2以治疗神经细胞瘤、黑素瘤等等。
在一个实施方式中，CAR可被设计为靶向NY-ESO-1 TCR以治疗骨髓瘤、肉瘤、黑素瘤等等。
在一个实施方式中，CAR可被设计为靶向MAGE A3 TCR以治疗骨髓瘤、肉瘤、黑素瘤等等。
然而，本发明不应被解释为仅限于本文公开的抗原靶标和疾病。相反地，本发明应被解释为包括任何与可使用CAR治疗的疾病相关的抗原靶标来治疗该疾病。
本发明的CAR-修饰的T细胞也可用作哺乳动物离体免疫和/或体内治疗的疫苗类型。优选地，哺乳动物是人。
对于离体免疫，以下中的至少一项在将细胞施用进入哺乳动物前在体外发生：i)扩展细胞，ii)将编码CAR的核酸引入该细胞，和/或iii)冷冻保存该细胞。
离体程序在本领域中是公知的，并在下文更完全地进行讨论。简单地说，细胞从哺乳动物(优选人)中分离并用表达本文公开的CAR的载体进行基因修饰(即，体外转导或转染)。CAR-修饰的细胞可被施用给哺乳动物接受者，以提供治疗益处。哺乳动物接受者可以是人，和CAR-修饰的细胞可相对于接受者是自体的。可选地，细胞可相对于接受者是同种异基因的、同基因的或异种的。
在此通过引用并入的在美国专利号5,199,942中描述的造血干细胞和祖细胞的离体扩展程序可应用于本发明的细胞。其它合适的方法在本领域中是已知的，因此本发明不限于细胞离体扩展的任何具体方法。简单地说，T细胞的离体培养和扩展包括：(1)从外周血收获物或骨髓外植体收集来自哺乳动物的CD34+造血干细胞和祖细胞；和(2)离体扩展这样的细胞。除了美国专利号5,199,942中描述的细胞生长因子之外，其它因子例如flt3-L、IL-1、IL-3和c-kit配体也可用于培养和扩展细胞。
除了在离体免疫方面使用基于细胞的疫苗之外，本发明也提供了体内免疫以引起针对患者中抗原的免疫应答的组合物和方法。
通常，如本文所述活化和扩展的细胞可用于治疗和预防无免疫应答的个体中产生的疾病。特别地，本发明的CAR-修饰的T细胞被用于治疗CCL。在某些实施方式中，本发明的细胞被用于治疗处于形成CCL风险中的患者。因此，本发明提供了治疗或预防CCL的方法，其包括施用给需要其的对象治疗有效量的本发明的CAR-修饰的T细胞。
本发明的CAR-修饰的T细胞可被单独施用或作为药物组合物与稀释剂和/或与其它组分例如IL-2或其它细胞因子或细胞群结合施用。简单地说，本发明的药物组合物可包括如本文所述的靶细胞群，与一种或多种药学或生理学上可接受载体、稀释剂或赋形剂结合。这样的组合物可包括缓冲液例如中性缓冲盐水、硫酸盐缓冲盐水等等；碳水化合物例如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖、甘露醇；蛋白质；多肽或氨基酸例如甘氨酸；抗氧化剂；螯合剂例如EDTA或谷胱甘肽；佐剂(例如，氢氧化铝)；和防腐剂。本发明的组合物优选配制用于静脉内施用。
本发明的药物组合物可以以适于待治疗(或预防)疾病的方式施用。施用的数量和频率将由这样的因素确定，如患者的状况，和患者疾病的类型和严重度，尽管适当的剂量可由临床试验确定。
当指出“免疫学上有效量”、“抗肿瘤有效量”、“肿瘤-抑制有效量”或“治疗量”时，待施用的本发明组合物的精确量可由医师确定，其考虑患者(对象)的年龄、重量、肿瘤大小、感染或转移程度和状况的个体差异。可通常指出：包括本文描述的T细胞的药物组合物可以以104至109个细胞/kg体重的剂量，优选105至106个细胞/kg体重的剂量——包括那些范围内的所有整数值——施用。T细胞组合物也可以以这些剂量多次施用。细胞可通过使用免疫治疗中公知的注入技术(见例如Rosenberg等,New Eng.J.of Med.319:1676,1988)施用。对于具体患者的最佳剂量和治疗方案可通过监测患者的疾病迹象并因此调节治疗由医学领域技术人员容易地确定。
在某些实施方式中，可期望向对象施用活化的T细胞，并随后重新抽取血液(或实施单采血液成分术)，根据本发明，活化来自其中的T细胞，和利用这些活化和扩展的T细胞再注入该患者。该过程可每几周进行多次。在某些实施方式中，T细胞可从10cc至400cc的血液抽取中进行活化。在某些实施方式中，T细胞从20cc、30cc、40cc、50cc、60cc、70cc、80cc、90cc或100cc的血液抽取中进行活化。不被理论所束缚，利用这样的多份血液抽取/多个再输注方案可用于选出某些T细胞群。
对象组合物的施用可以以任何方便的方式进行，包括通过喷雾法、注射、吞咽、输液、植入或移植。本文描述的组合物可被皮下、皮内、瘤内、结内、脊髓内、肌肉内、通过静脉内(i.v.)注射或腹膜内施用给患者。在一个实施方式中，本发明的T细胞组合物通过皮内或皮下注射被施用给患者。在另一个实施方式中，本发明的T细胞组合物优选地通过i.v.或i.p.注射施用。T细胞的组合物可被直接注入肿瘤、淋巴结或感染位置。
在本发明的某些实施方式中，利用本文描述的方法或本领域已知的其它将T细胞扩展至治疗性水平的方法活化和扩展的细胞，与任何数量的相关治疗形式结合(例如，之前、同时或之后)施用给患者，所述治疗形式包括但不限于用以下试剂进行治疗：例如抗病毒疗法、西多福韦和白细胞介素-2、阿糖胞苷(也称为ARA-C)或对MS患者的那他珠单抗疗法或对牛皮癣患者的厄法珠单抗疗法或对PML患者的其它疗法。在进一步的实施方式中，本发明的T细胞可与以下结合使用：化疗、辐射、免疫抑制剂——例如，环孢菌素、硫唑嘌呤、甲氨喋呤、麦考酚酯和FK506，抗体或其它免疫烧蚀剂例如CAM PATH、抗-CD3抗体或其它抗体疗法、细胞毒素、氟达拉滨、环孢菌素、FK506、雷帕霉素、麦考酚酸、类固醇类、FR901228、细胞因子和照射。这些药物抑制钙依赖性磷酸酶——钙调磷酸酶(环孢菌素和FK506)或抑制对生长因子诱导的信号传导重要的p70S6激酶(雷帕霉素)(Liu等,Cell 66:807-815,1991；Henderson等,Immun.73:316-321,1991；Bierer等,Curr.Opin,Tmmun.5:763-773,1993)。在进一步的实施方式中，本发明的细胞组合物与骨髓移植、利用化疗剂例如氟达拉滨、外部光束放射治疗(XRT)、环磷酰胺或抗体例如OKT3或CAMPATH的T细胞烧蚀治疗结合(例如，之前、同时或之后)施用给患者。在另一个实施方式中，本发明的细胞组合物在B-细胞烧蚀疗法例如与CD20反应的试剂例如Rituxan后进行施用。例如，在一个实施方式中，对象可经历高剂量化疗的标准治疗，之后进行外周血干细胞移植。在某些实施方式中，在移植后，对象接受本发明的扩展的免疫细胞的注入。在额外的实施方式中，扩展的细胞在外科手术前或外科手术后施用。
施用给患者的以上治疗的剂量将随着治疗病症的精确属性和治疗的接受者而变化。人施用的剂量比例可根据本领域接受的实践实施。例如，CAMPATH的剂量对于成人患者将通常在1至大约100mg的范围，通常每天施用，持续1和30天之间的时期。尽管在一些实例中可使用上至40mg每天的较大剂量(美国专利号6,120,766中描述)，但优选的日剂量为1至10mg每天。
实验实施例
本发明通过参考以下实验实施例进一步详细地描述。这些实施例仅出于说明性的目的提供，并不意欲为限制性的，除非另有规定。因此，本发明决不应被解释为限于以下实施例，而是应被解释为包括由于本文提供的教导变得显而易见的任何和全部的变化。
没有进一步的描述，相信利用先前的描述和以下的说明性实施例，本领域技术人员可制造和利用本发明的化合物，并实践请求保护的方法。以下工作实施例因此具体指出本发明的优选实施方式，并不解释为以任何方式限制本公开的剩余部分。
实施例1：污染物分析
转导以表达目的用于向受试人施用的嵌合抗原受体(CAR)的淋巴细胞被分析以检测和量化在转导过程期间引入的可能的污染物。
一般的实验室说明
研究样本处理、冷冻和实验室分析在良好的制造实践或良好的实验室实践的原则，以及建立的SOP和/或用于样本接收、处理、冷冻和分析的方案下进行。
载体生产
CD19-BB-z转基因(GeMCRIS 0607-793)如所述设计和构建(Milone等,2009,Mol Ther.17:1453-1464)。慢病毒载体如所述根据目前良好的制造实践，利用Lentigen公司的三质粒生产方法生产(Zufferey等,1997,Nature biotechnol 15:871-875)。设计自失活慢病毒载体(GeMCRIS 0607-793)，其经历了如以前报道的临床前安全性测试(Milone等,2009,Mol Ther,17:1453-64)。T-细胞制备的方法也已经在以前进行了描述(Porter等,2006,Blood,107:1325-31)。
CART-19T细胞的制备
自体T细胞被工程改造以表达对CD19具有特异性的细胞外单链抗体(scFv)。细胞外scFv可改变转导的T细胞对表达CD19的细胞的特异性，后者是一种在恶性细胞的表面上和正常B细胞上表达受限制的分子。除了CD19scFv之外，细胞还被转导以表达由TCRζ链或者由4-1BB和TCRζ信号传导模块组成的串联信号传导结构域中任一个组成的细胞内信号传导分子。scFv源自小鼠单克隆抗体，并因此包含小鼠序列，并且信号传导结构域完全是天然人序列。CART-19T细胞通过由单采血液成分术分离T细胞并使用慢病毒载体技术制造(Dropulic等,2006,Human Gene Therapy,17:577-88；Naldini等,1996,Science,272:263-7；Dull等,1998,J Virol,72:8463-71)，以将scFv∶TCRζ∶4-1BB引入CD4和CD8T细胞。在一些患者中，将对照scFv∶TCRζ∶引入一部分细胞，用于竞争性再群体化实验。这些受体是“普遍的”，因为它们以MHC-非依赖性方式结合抗原，因此，一种受体构建体可用于治疗具有CD19抗原-阳性肿瘤的患者群体。
CAR构建体在宾夕法尼亚大学研发，并且临床级载体在Lentigen公司制造。CART-19细胞根据图2显示的方法在宾夕法尼亚大学的临床细胞和疫苗生产设施(Clinical Cell and Vaccine Production Facility)中制造。在细胞培养结束时，细胞被冷藏在难溶的冷冻培养基(cryomedia)。
T细胞存活
使用台盼蓝不相容试验(使用0.4％台盼蓝染色剂(Gibco BRL目录号15250-061)加培养基或稀释剂和Bright-Line血细胞计数器(Hausser Scientific Company))或7-AAD以测定活细胞的百分比(使用BD ViaProbe(目录号555815，BD Biosciences Pharmingen)和流式细胞仪)，来测定转导后的T细胞存活。
T细胞特性
使用细胞染色和流式细胞仪测定表达或不表达在本文别处描述的特定T细胞标记的转导细胞的百分比。
转导效率
使用流式细胞仪、定量PCR或流式细胞仪和定量PCR两者测定T细胞的转导效率。
内毒素的存在和量
使用凝胶实验(gel clot assay)评估转导T细胞培养物中内毒素的存在。
3.1.1Endosafe PTS-动态读取器
Charles River Laboratories，
3.1.2PTS记录器软件
3.1.3一次性抑制(Disposable Inhibition)/增大筒(EnhancementCartrifge)
Charles River/目录号PTS220
3.1.4一次性LAL筒测试筒(Disposable LAL cartridge TestCartrifges)(0.01-1.0/mL)和各批次的分析证书(C of A)
Charles River/目录号PTS2001F
3.1.5一次性LAL筒测试筒(Disposable LAL cartridge TestCartrifges)(0.005-0.5EU/mL)和各批次的分析证书
Charles River/目录号PTS20005F
显色端点测定——在分光光度计上读取
3.1.6终止试剂(Stop Reagent)：20％w/v冰醋酸
目录号BP2401-212，Fisher Scientific,Pittsburgh,PA
电话：1-800-766-7000
3.1.7鲎变形细胞溶解物试验试剂盒(Limulus Amebocyte LysateTest Kit)
目录号50-648U(300个试验)或50-647U(120个试验)，Cambrex8830Biggs Ford Road,Walkersville,MD 21793
电话：800-654-4452，分机：7822，传真：301-845-2924
3.1.7.1大肠杆菌内毒素
3.1.7.2显色底物
3.1.7.3显色鲎变形细胞溶解物(LAL)
3.1.7.4LAL试剂水(LAL Reagent Water)(只有120个试验试剂盒)
3.1.8LAL试剂水(LAL Reagent Water)
目录号W50-640，Cambrex,8830Biggs Ford Road,Walkersville,MD21793
电话：800-654-4452，传真：301-845-2924
显色动态测定——在分光光度计上读取
3.1.9终止试剂(Stop Reagent)：20％w/v冰醋酸
目录号BP2401-212，Fisher Scientific
3.1.10鲎变形细胞溶解物(LAL)动态-QCL内毒素检测试剂盒(Limulus Amebocyte Lysate(LAL)Kinetic-QCL Endotoxin Assay Kit)
目录号50-650U(192个试验)，Lonza/Cambrex
3.1.10.1大肠杆菌内毒素
3.1.10.2动态-QCL试剂(LAL/显色底物的混合物)
LAL试剂水
凝胶实验
4.1.1鲎变形细胞溶解物多个试验(Multi-test Limulus AmebocyteLysate)，Plus 200个试验0.125EU/mL灵敏度
目录号N294-125，Lonza
4.1.1.10.125EU/mL灵敏度的鲎变形细胞溶解物(LAL)
4.1.1.1.14×50次测试瓶装(5.2mL/瓶)
4.1.1.2大肠杆菌内毒素O55∶B5，10ng/瓶，冻干的，对照标准内毒素(CSE)
4.1.1.2.1注意：以EU/mL为单位的CSE效价在分析证明上有详细说明。COA不再提供有试剂盒。
4.1.1.2.2为获取分析证明，登陆http://www.lonzabio.com/2506.html，输入位于试剂盒正面的产品标签上的目录号和批号。
4.1.2LAL试剂，0.125EU/mL的溶解物灵敏度(Charles RiverLaboratories，目录号R11012)
4.1.2.112个装
4.1.3对照标准内毒素10ng/瓶(Charles River Laboratories，目录号E120)
4.1.3.16个装
4.1.4LAL试剂水(LRW)，30mL/瓶
目录号W130，Charles River Laboratories
支原体的存在和量
使用mycoalert实验评估转导T细胞培养物中支原体的存在。
3.1.11MycoAlert支原体检测试剂盒(MycoAlert MycoplasmaDetection Kit)(Lonza，目录号LT07-318)——100个试验
3.1.12MycoAlert实验对照系列(MycoAlert Assay Control Set)(Lonza目录号LT07-518)
3.1.1396孔不透明白底微型板(Corning Incorporated目录号3912)Corning Incorporated Life Sciences 45Nagog Park,Acton MA 01720
电话：1-978-635-2200，传真：1-978-635-2476
在光度计上读取。
MycoProbe支原体ELISA(MycoProbe Mycoplasma ELISA)：
http://www.rndsystem.com/pdf/CUL001B.pdf
具有复制能力的慢病毒(RCL)的存在和量
使用PCR实验评估VSV-G和HIVgag，并使用ELISA评估p24来评估转导T细胞培养物中RCL的存在。
p24的存在和量
使用ELISA实验评估转导T细胞培养物中p24的存在。
5.1.1PerkinElmer HIV-1p24ELISA试剂盒
目录号NEK050(1×96-孔板)
NEK050A(2×96-孔板)
NEK050B(5×96-孔板)
PerkinElmer,Inc,940Winter Street,Waltham,Massachusetts 02451,
电话：800-762-4000
VSV-G核酸的存在和量
使用定量PCR实验评估转导T细胞培养物中VSV-G核酸的存在，所述定量PCR实验使用在标准ABI扩增条件下特异性扩增和检测VSV-G序列的引物/探针组合。已经建立了使用上述引物定量VSV-GDNA的合格的QPCR实验。该合格的实验利用从带有质粒pC1-VSV-G的PBMC中分离的基因组DNA生成的标准曲线，所述质粒包含VSV-G基因序列；该标准曲线在1×106-10个拷贝VSV-G/100ng PBMC的范围。对于每个最终产品，在三重反应中，使用大约200ng从产品中分离的基因组DNA，评估残留的VSV-G DNA的存在。在校正和标准化输入DNA的量后，残留的VSV-G质粒的量从标准曲线测定，并被报告为VSV-G质粒拷贝/微克基因组DNA。每个额外的包装质粒(LIST)的污染质粒核酸的存在可以以这种方式使用对在包装步骤中使用的每个质粒特异性的引物/探针组合而进行测定(VSVG、Gag pol、P24、pRSV.rev)。
细菌的存在和量
通过使用来自转导T细胞培养物的物质而尝试培养细菌来评估转导T细胞培养物中细菌的存在。BACTEC实验用于测试细菌污染。BACTEC培养瓶支持普通需氧微生物的生长，并且其由包含1-3ml的培养基的无菌注射器接种。使用BACTEC 9050仪器进行生长的检测，其测量随时间推移CO2浓度的增大。该实验依据SOP 0361在CVPF进行，所述SOP 0361提供在本文的其它地方。在CVPF实验室，该测试的灵敏度还没有被确认，但公布的研究表明BACTEC比CFR方法更灵敏、检测时间更快、更少倾向于假阳性结果(Khuu等,2004和2006)。
真菌的存在和量
通过使用来自转导T细胞培养物的物质而尝试培养细菌来评估转导T细胞培养物中真菌的存在。在HUP临床微生物学实验室，使用基于Gorman,1967的配方的萨布罗氏脑心浸液琼脂(Sabouraud BrainHeart Infusion Agar)进行真菌污染物的测试。培养基被优化以提高真菌复苏，并还包含多种抗菌剂以阻止可与真菌生长竞争的细菌的生长。培养基被划线接种。培养物随后培养14天以测定阴性。该实验的灵敏度没有被临床微生物学实验室测定。该实验的阳性对照包括三种真菌：皮炎芽生菌、白色念珠菌和须疮癣菌，其应当生长以指明可行的培养基。为监控抗菌剂的效价，对照平板被接种大肠杆菌，并且应当观察到部分至完全抑制。
储存
包含CART-19-转导T细胞的袋(10至100ml容量)被储存在血库条件下的监控的-135℃冰箱中。注入袋被储存在冰箱中直到需要。
细胞解冻
在试验药房中记录细胞后，冷冻细胞在干冰中被运送至对象床边。使用维持在36℃至38℃的水浴，一次一袋，在床边解冻细胞。轻轻地按摩袋直到细胞刚好解冻。应当没有冻块留在容器中。
施用/注入
注入在化疗完成后1至2天开始。第一次注入的日子，患者具有差异的CBC，并且评估CD3、CD4和CD8计数，这是由于给予的化疗部分地诱导淋巴细胞减少。不希望被任何具体的理论所束缚，人们认为最初的2.5-5×109个CART-19细胞的i.v.剂量对该方案是最佳的。因为在健康成年人体内有大约1×1012个T细胞，提出的总剂量等同于T细胞总体重的大约0.5％(Roederer,1995,Nat Med,1:621-7；Macallan等,2003,Eur J Immunol,33:2316-26)。在第0天(10％)、第1天(30％)和第2天(60％)使用分次计量(split dose)施用第一剂量。对象在隔离室接受注入。如本文别处所述，细胞在患者的床边被解冻。解冻的细胞以能承受的尽可能快的注入速率被给予，以使得注入的持续时间是大约10-15分钟。转导T细胞穿过带有三通阀的18号无乳胶Y-型输血器，以大约10mL至20mL每分钟的流速，通过快速静脉内注入而被施用。注入的持续时间是大约15分钟。一或两袋的CART-19修饰的细胞在冰上递送，并且细胞在冷的时候施用给对象。对象接收CART-19细胞的混合物中，为了便于混合，施用细胞同时使用Y-适配器(adapter)。如本文别处所述，对象被输液和术前用药。在施加剂量前，在注入结束时和自那以后的1小时每15分钟，评估对象的生命体征和完成脉搏血氧定量法，且直到这些是稳定的和符合要求。用于基准线CART-19水平测定的血样在注入前和注入后20分钟被获得。经历来自患者前面的细胞减少性化疗的毒性的患者使得其注入安排延期直到这些毒性被解决。有必要延期T细胞注入的具体毒性包括：1)肺的：需要辅助供氧以保持大于95％的饱和度或在胸部X光上存在进展的放射影像异常；2)心脏的：新的心律失常不受医疗管理控制。3)需要增压器支持的低血压。4)主动性感染：在T细胞注入的48小时内细菌、真菌或病毒的阳性血液培养物。在第一次注入前以及随后的每次注入后两小时，收集钾和尿酸的血清样本。
本文引用的每个和每一个专利、专利申请和公布的公开内容全部在此通过引用以其全文并入本文。虽然本发明已经参考具体的实施方式被公开，但显然在不偏离本发明的真实精神和范围的情况下，本发明的其它实施方式和变化可被其它的本领域技术人员想到。附带的权利要求意欲被解释为包括所有这样的实施方式和等同变化。

Claims (14)

1.分析基因修饰的T细胞以检测污染物的方法，其中所述基因修饰的T细胞包括编码嵌合抗原受体(CAR)的核酸，其中所述CAR包括抗原结合结构域、跨膜结构域、共刺激信号传导区和信号传导结构域。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述基因修饰的T细胞通过用慢病毒载体转导而被基因修饰。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述污染物是选自内毒素、支原体、具有复制能力的慢病毒(RCL)、p24、VSV-G核酸、HIV gag、残留的抗-CD3/抗-CD28包被的珠、小鼠抗体、混合的人血清、牛血清白蛋白、牛血清、培养基组分、载体包装细胞或质粒组分、细菌和真菌中的至少一种。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述细菌是选自粪产碱菌、白色念珠菌、大肠杆菌、流感嗜血杆菌、脑膜炎双球菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌和酿脓链球菌A群中的至少一种。
5.根据权利要求1所述的方法，其中所述信号传导结构域是CD3ζ信号传导结构域。
6.根据权利要求1所述的方法，其中所述抗原结合结构域是抗体或其抗原结合片段。
7.根据权利要求6所述的方法，其中所述抗原结合片段是Fab或scFv。
8.根据权利要求1所述的方法，其中所述抗原结合结构域结合肿瘤抗原。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述肿瘤抗原与血液学恶性肿瘤相关。
10.根据权利要求8所述的方法，其中所述肿瘤抗原与实体瘤相关。
11.根据权利要求8所述的方法，其中所述肿瘤抗原选自CD19、CD20、CD22、ROR1、间皮素、CD33/IL3Ra、c-Met、PSMA、糖脂F77、EGFRvIII、GD-2、NY-ESO-1 TCR、MAGE A3 TCR和其任何组合。
12.根据权利要求1所述的方法，其中所述共刺激信号传导区包括选自CD27、CD28、4-1BB、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、与CD83特异性结合的配体和其任何组合的共刺激分子的胞内结构域。
13.根据权利要求1所述的方法，其中因为所述污染物的鉴定和定量，所述基因修饰的T细胞不被施用给受试人。
14.根据权利要求1所述的方法，其中因为与相应的对照水平相比所述污染物的量过多，所述基因修饰的T细胞不被施用给受试人。
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