JP7221049B2 - レンチウイルス調製物の安定化のための緩衝液 - Google Patents
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Description
本明細書で用いられる「約」という用語は、記載される値の大小10%以内にある値を指す。例えば、「約50mM」の値は、45mM~55mMの濃度を表す。
本発明のレンチウイルスベクター調製物は、様々な成分、例えば、1つまたは複数の塩および/または炭水化物を含んでもよい。驚くべきことに、本明細書に記載のレンチウイルスベクター調製物は、ウイルス安定性を高めるためのタンパク質成分の添加を必要としない。本明細書に記載の組成物は、ゆえに、各々任意に、タンパク質成分の添加がないものとして特徴づけることができる。多くの異なるタイプのアルブミン(例えば、ウシ血清アルブミン(BSA)、ヒト血清アルブミン(HAS)および組換えHSA(rHSA))に関し、レンチウイルスベクターの安定性を高める能力を試験した。例えば、rHSAは、それが動物起源でなく、遺伝子組換え酵母において産生され、ゆえに安全性のレベルが高いため、レンチウイルス調製物にしばしば組み込まれている(Chuang et al., Pharm. Res. 19:569-577, 2002)。これらはベクターの分析的特徴解析を妨げ得るため、本発明を用いることにより、HSAおよび類似のタンパク質成分を、レンチウイルスベクター調製物から除外することができる。本明細書に記載の緩衝液が、タンパク質成分の添加を要せずにレンチウイルスベクターに安定性を付与する能力を発揮するという意味においても、本発明は特有なものである。例えば、図2~19で実証されるように、本明細書に記載の緩衝液はウイルスの凝集を防止し、形質導入能力を強化し、複数回の凍結/融解サイクルの後の感染性を保持することができる。本明細書に記載の組成物はまた、任意に、炭水化物成分の添加があるもの、またはないものとして特徴づけることができる。
本発明の組成物および方法に用いられるレンチウイルスベクターは、導入遺伝子、例えば、標的細胞の染色体DNAへの組込み用に設計されたタンパク質コーディング用導入遺伝子を含んでもよい。典型的な導入遺伝子としては、キメラ抗原受容体(CAR)をコードするものが挙げられる。CARは、幾つかのドメイン、例えば、抗原結合ドメイン、膜貫通ドメインおよび1つまたは複数のシグナリングドメイン)を含んでもよい。これらの場合、シグナリングドメインは、1つもしくは複数の一次シグナリングドメイン(例えば、CD3-ゼータ刺激性ドメイン)および/または1つもしくは複数の共刺激性のシグナリングドメイン(例えば、CD27、CD28、4-1BB(CD137)、OX40、GITR、CD30、CD40、ICOS、BAFFR、HVEM、ICAM-1、リンパ球機能関連抗原-1(LFA-1)、CD2、CDS、CD7、CD287、LIGHT、NKG2C、NKG2D、SLAMF7、NKp80、NKp30、NKp44、NKp46、CD160、B7-H3、またはCD83と特異的に結合するリガンド)を含んでもよい。
本発明の方法には、効率が改善されたレンチウイルスベクターを精製する方法が含まれるので、例えば、従来の緩衝液(例えば、HEPES)を含むレンチウイルス調製物の精製と比較し、レンチウイルスベクターの高収量での回収が可能となる。例えば、本明細書に記載のレンチウイルスベクター調製物は、濾過(例えば、マイクロフィルトレーションまたは限外濾過)によって、および/または、レンチウイルスの高率での回収能を有するクロマトグラフィー(例えば、サイズ排除クロマトグラフィー)により精製できる。例えば上記のような、当技術分野で公知の濾過技術を用いることにより、レンチウイルスベクターが調製される場としての微生物および細胞(例えば、哺乳動物細胞)を実質的に含まないレンチウイルス調製物を製造することが可能となる。それに加え、またはその代わりに、本発明のレンチウイルスベクター調製物をヌクレアーゼで処理することにより、(例えば、レンチウイルスベクターが製造された細胞に由来する非レンチウイルス性のポリヌクレオチド(例えば、哺乳動物の染色体DNA、ヒトDNA、RNAまたはレンチウイルスの導入遺伝子内に含まれない他のポリヌクレオチドなどの)混入ポリヌクレオチドを実質的に含まない調製物を製造することが可能となる。
無血清細胞培養液におけるレンチウイルスベクターの製造
GFP遺伝子導入ベクター、パッケージングベクター、rev発現ベクターおよびVSV-G発現ベクターを構築した。遺伝子導入ベクターは、cPPTおよびWPRE要素を含む。更に詳細には、本研究で使用するレンチウイルスベクターは、自己不活性化導入構築物pELPS-EGFPであり、pRRL導入構築物(Dull et al., J. Virol. 72(11):8463-8471, 1998)をベースとするものである。pELPS-19-BBz(Milone et al., Mol. Ther. 17(8):1453-1464, 2009)を用い、CAR導入遺伝子をEGFPに置換することにより、pELPS-EGFPを構築した。pMDLgpRRE、pRSV-RevおよびpMD.Gプラスミドからなる第三世代包装システム(Dullら、上記)を用いてレンチウイルスを製造した。その際、アンピシリン耐性遺伝子をカナマイシン耐性ネオマイシンホスホトランスフェラーゼIIで置換した。
無血清細胞培養液において製造されたレンチウイルスベクターの精製
48および72時間目の部分的な遠心分離後の回収物を、3段階の異なるフィルター、すなわち5ミクロンのガラスフィルター(GE Healthcare社)、1.2ミクロンのポリプロピレンフィルター(Sartorius社)および0.6/0.2ミクロンのポリエーテルスルホンフィルター(GE Healthcare社)で濾過する。それらの一連の濾過により、プロデューサー細胞、細胞残渣およびオルガネラを除去する。次に、500MWCO中空糸膜(GE Healthcare社)を用いるタンジェンシャルフロー濾過を行い、ウイルスを含む上清を100倍濃縮する。室温で30分間、50単位/mLでベンゾナーゼ(EMD-Millipore社)処理を行い、次に20分間3000rpmで遠心分離する。白いペレットが観察されるが、ウイルス粒子のわずかな損失(<5%)が上清中に存在する。PIPESおよび他の緩衝液(本発明に記載のベクターへの高い安定性を示す)を使用し、サイズ排除クロマトグラフィーを実施し、次に0.2ミクロンフィルター(EMDMillipore社)を用いた濾過滅菌を行う。
レンチウイルス調製物の安定性のハイスループットスクリーニング用のサンプル調製
ZEBA(商標)回転脱塩プレート(7KのMWCO、Life Technologies社)を、250μLの特定の緩衝液および塩により4回バッファー交換した。ウイルス原液100μLを各ウェルにロードし、次に2分間1000×gで遠心分離した。バッファー交換後のボリュームの喪失は観察されない。20~100μLを用い、各分析(DLS、感染性および凍結/融解試験)に供した。ベクターの感染性に対する温度の効果を試験するため、C-1000 Touch Thermal Cyclerの96ウェル薄壁PCRプレートにおいて、温度ショック(25~55℃の範囲で1時間)を実施した。
ハイスループットスクリーニングにおける、動的光散乱によるレンチウイルスの凝集の分析
精製された組換えレンチウイルスベクター(106~107TU/mL)20μLを、384ウェルプレート(黒色ポリスチレンベース、親水性プレート、Greiner Bio社)にピペットで添加した。室温で3分間、2000rpmでプレートを遠心分離し、封入された気泡を除去し、次にMicroseal「B」シール(Bio-Rad社)でシールする。830nmのレーザーおよび温度調節モジュールを装備するDynaProプレートリーダー(Wyatt Technology社、CA、米国)に設置する。Dynamics(登録商標)ソフトウェア(バージョン7.1.8.93、Wyatt Technology社)を用い、計画的にデータ収集および分析を行った。各ウェルにつき、5秒間の測定を5回行った。単一のシールされた384ウェルプレートを25℃で測定し、次に37℃で2時間インキュベートし、記載されるように測定する。同じ手順を、42℃、50℃および55℃で繰り返す。Dynamics(登録商標)ソフトウェアに装備されるアルゴリズムを使用し、正則化分析を行った。相関関数における上下のカットオフ値を、それぞれ0.5および1×106μsとした。レンチウイルスのピークの流体力学半径を50~200nmとして割り当てる。
ハイスループットスクリーニングにおけるレンチウイルスタイターの測定
レンチウイルスベクターのタイターは、保持される遺伝子によりコードされるGFPタンパク質を発現する細胞数により算出される関数的タイターを含む(TU/mL)。10%ウシ胎児血清(Life Technologies社)および8μg/mL Polybrene(EMD Millipore社)を含むD-MEM培地(Life Technologies社)50μLの体積のHEK293T細胞を、96ウェルプレート(Corning社、平底)に所定の密度(2×104/ウェル)で播種した。GFPスタンダードウイルスおよびサンプルの希釈液を完全DMEM培地において調製し、細胞に添加する(50μL)。
凍結/融解サイクルの反復後のレンチウイルスの安定性の分析
凍結/融解サイクルの反復による感染性の喪失に対処するため、レンチウイルスベクターの小アリコート(約100μL)を-80℃で20分間凍結させ、次に20分間室温で徐々に融解させた(最悪のケースシナリオを表す)。凍結/融解サイクルを3、6および9サイクル行い、ベクター活性を対照と比較する。Spotfireを使用しトレンド分析を行う。高い値はレンチウイルスベクターの活性が保持されていることを示す。
初代T細胞におけるレンチウイルスタイターの測定
3人の健常なドナー由来のPBMC入りのバイアルを融解し、遠心分離し、2%ヒトAB血清(Access社)およびIL-2(Prometheus Ther社)を補充したX-Vivo培地(Lonza社)中に再懸濁した。細胞を計数し、ドナー毎に100μLの1.6×106細胞/mLの密度で播種する操作を2回行った。抗CD3/CD28ビーズ(Life Technologies社)をX-vivo Simple Mediumで洗浄し、最終ビーズ密度が4.8×105ビーズ/ウェルになるように添加した。細胞を37℃、5%CO2のインキュベーター内に置いた。
実験結果の要約-安定性試験
並列アプローチ(図1)を用いてスクリーニング試験を行い、レンチウイルスベクターの安定化に使用できる条件を同定した。図2に示す、緩衝液、pHおよび塩条件を変化させたスクリーニングにおいて、市販のレンチウイルスベクター(Lentigen社)の安定性を評価した。レンチウイルスベクターを室温(約25℃)で一晩(約18時間)インキュベートした。上記実施例5に記載の方法を用いたタイター(TU/ml)の評価により、安定性を測定した。NaClを含むPIPES緩衝液は、対照製剤(Lentigen製剤)とほとんど同程度にベクターを安定化させ、それは緩衝液および塩成分に加えて賦形剤を含んでもよい。本実験において使用したレンチウイルスベクターは、Lentigen社製のCAR19 LVとした。本実施例に記載の他の全ての試験では、上記実施例1に記載のGFP-LVを使用した。
PIPES、ヒスチジンおよびHEPES緩衝液中のレンチウイルスベクターの精製
上記実施例1および2に記載の方法を用いて、レンチウイルスベクターを製造し、精製した。クロマトグラフィー後の精製ステップにおいて、0.2ミクロンのフィルターに通し、無菌性を維持した。凝集による、精製の際の回収率低下が生じ得るため、異なる緩衝液を試験し、最適な回収条件を同定した。図29に示すように、HEPESおよびヒスチジン緩衝液と比較し、PIPES緩衝液はより良好な回収率を示した。
更なるレンチウイルスベクターの安定化
上記のように、以上で行った試験では、GFPレンチウイルスベクター(上記のように、図2に図解された安定性試験を除く)を使用した。更なる実験を行い、異なる導入遺伝子を発現する更に2つのレンチウイルスベクター(ベクター1および2)の安定化において、PIPESベースの緩衝液(20mM PIPES、pH6.5、75mM NaCl、2.5%スクロース)が効果的であることを示した。
本明細書に記載の全ての刊行物、特許および特許出願は、あたかもそれぞれ独立の刊行物または特許出願が具体的かつ個別的に参照により組み込まれる旨示されたのと同程度に、参照により本明細書に組み込まれる。
本発明は、以下の態様を提供し得る。
[1]
レンチウイルスベクターと、1,4-ピペラジンジエタンスルホン酸(PIPES)緩衝液と、塩とを含む水性組成物。
[2]
前記PIPES緩衝液が、約10mM~約50mMの濃度で存在する、上記[1]に記載の水性組成物。
[3]
前記PIPES緩衝液が、約20mMの濃度で存在する、上記[2]に記載の水性組成物。
[4]
pHが約6.0~約7.0である、上記[1]から[3]のいずれかに記載の水性組成物。
[5]
pHが約6.5である、上記[4]に記載の水性組成物。
[6]
前記塩が、塩化ナトリウム、塩化マグネシウムおよび塩化カルシウムからなる群から選択される、上記[1]から[5]のいずれかに記載の水性組成物。
[7]
前記塩が塩化ナトリウムである、上記[6]に記載の水性組成物。
[8]
前記塩の濃度が約25mM~約150mMである、上記[1]から[7]のいずれかに記載の水性組成物。
[9]
前記塩の濃度が約50mMである、上記[8]に記載の水性組成物。
[10]
前記塩の濃度が約75mMである、上記[8]に記載の水性組成物。
[11]
20mM PIPESおよび75mM塩化ナトリウムを含み、約6.5のpHを有する、上記[1]から[10]のいずれかに記載の水性組成物。
[12]
炭水化物を更に含む、上記[1]から[11]のいずれかに記載の水性組成物。
[13]
前記炭水化物が非還元炭水化物である、上記[12]に記載の水性組成物。
[14]
前記非還元炭水化物が、スクロースおよびトレハロースからなる群から選択される、上記[13]に記載の水性組成物。
[15]
前記炭水化物が、前記水性組成物の体積当たりの重量で約1%~約10%の濃度で存在する、上記[12]から[14]のいずれかに記載の水性組成物。
[16]
前記炭水化物が、前記水性組成物の体積当たりの重量で約2%~約5%の濃度で存在する、上記[15]に記載の水性組成物。
[17]
前記炭水化物が、前記水性組成物の体積当たりの重量で約2.5%の濃度で存在する、上記[16]に記載の水性組成物。
[18]
20mM PIPESと、75mM塩化ナトリウムと、前記水性組成物の体積当たりの重量で2.5%のスクロースとを含み、約6.5のpHを有する、上記[12]から[17]のいずれかに記載の水性組成物。
[19]
モル浸透圧濃度が、約270mOsm/kg~約330mOsm/kgである、上記[1]から[18]のいずれかに記載の水性組成物。
[20]
モル浸透圧濃度が、約275mOsm/kg~約300mOsm/kgである、上記[19]に記載の水性組成物。
[21]
モル浸透圧濃度が約285mOsm/kgである、上記[20]に記載の水性組成物。
[22]
前記レンチウイルスベクターが、約2×10 8 TU/mL(1ミリリットル当たりの形質導入単位)~約1×10 9 TU/mLの濃度で存在する、上記[1]から[21]のいずれかに記載の水性組成物。
[23]
前記レンチウイルスベクターが、約3×10 8 TU/mL~約5×10 8 TU/mLの濃度で存在する、上記[22]に記載の水性組成物
[24]
前記レンチウイルスベクターが組換えヒト免疫不全ウイルスである、上記[1]から[23]のいずれかに記載の水性組成物。
[25]
前記レンチウイルスベクターが、水疱性口内炎ウイルスG(VSV-G)タンパク質を含む、上記[1]から[24]のいずれかに記載の水性組成物。
[26]
前記VSV-Gタンパク質が、前記レンチウイルスベクターの表面に存在する、上記[25]に記載の水性組成物。
[27]
前記レンチウイルスベクターが導入遺伝子を含む、上記[1]から[26]のいずれかに記載の水性組成物。
[28]
前記導入遺伝子がタンパク質をコードする、上記[27]に記載の水性組成物。
[29]
前記タンパク質がキメラ抗原受容体(CAR)を含む、上記[28]に記載の水性組成物。
[30]
前記CARが、N末端からC末端方向に、抗原結合ドメイン、膜貫通ドメインおよび1つまたは複数のシグナリングドメインを含む、上記[29]に記載の水性組成物。
[31]
前記シグナリングドメインが、1つまたは複数の一次シグナリングドメインを含む、上記[30]に記載の水性組成物。
[32]
前記シグナリングドメインが、1つまたは複数の共刺激シグナリングドメインを含む、上記[30]または[31]に記載の水性組成物。
[33]
前記1つまたは複数の一次シグナリングドメインの1つが、CD3-ゼータ刺激性ドメインを含む、上記[31]に記載の水性組成物。
[34]
前記共刺激シグナリングドメインの1つまたは複数が、CD27、CD28、4-1BB(CD137)、OX40、GITR、CD30、CD40、ICOS、BAFFR、HVEM、ICAM-1、リンパ球機能関連抗原-1(LFA-1)、CD2、CDS、CD7、CD287、LIGHT、NKG2C、NKG2D、SLAMF7、NKp80、NKp30、NKp44、NKp46、CD160、B7-H3、およびCD83と特異的に結合するリガンドからなる群から選択される共刺激タンパク質から選択される細胞内ドメインを含む、上記[32]または[33]に記載の水性組成物。
[35]
前記共刺激シグナリングドメインの前記1つまたは複数が、4-1BB(CD137)共刺激ドメインを含む、上記[34]に記載の水性組成物。
[36]
前記共刺激ドメインの前記1つまたは複数がCD28共刺激ドメインを含む、上記[34]または[35]に記載の水性組成物。
[37]
前記抗原結合ドメインがscFvである、上記[30]から[36]のいずれかに記載の水性組成物。
[38]
前記抗原結合ドメインが、CD19;CD123;CD22;CD30;CD171;CS-1;C型レクチン様分子-1;CD33;表皮増殖因子受容体変異体III(EGFRvIII);ガングリオシドG2(GD2);ガングリオシドGD3;TNF受容体ファミリーメンバーB細胞成熟(BCMA);Tn抗原((Tn Ag)または(GalNAcα-Ser/Thr));前立腺特異的膜抗原(PSMA);受容体チロシンキナーゼ様オーファン受容体1(ROR1);Fms様チロシンキナーゼ3(FLT3);腫瘍関連糖タンパク質72(TAG72);CD38;CD44v6;癌胎児性抗原(CEA);上皮細胞接着分子(EPCAM);B7H3(CD276);KIT(CD117);インターロイキン-13受容体サブユニットアルファ-2;メソテリン(mesothelin);インターロイキン11受容体アルファ(IL-11Ra);前立腺幹細胞抗原(PSCA);プロテアーゼセリン21;血管内皮増殖因子受容体2(VEGFR2);ルイス(Y)抗原;CD24;血小板由来増殖因子受容体ベータ(PDGFR-ベータ);ステージ特異的胎児抗原-4(SSEA-4);CD20;葉酸受容体アルファ;受容体チロシン-プロテインキナーゼERBB2(Her2/neu);ムチン1、細胞表面会合(MUC1);表皮増殖因子受容体(EGFR);神経細胞接着分子(NCAM);プロスターゼ;前立腺酸性ホスファターゼ(PAP);延長因子2変異型(ELF2M);エフリンB2;線維芽細胞活性化タンパク質アルファ(FAP);インスリン様増殖因子1受容体(IGF-I受容体);炭酸脱水酵素IX(CAIX);プロテアソーム(プロソーム、マクロペイン)サブユニット、ベータ型、9(LMP2);糖タンパク質100(gp100);切断点クラスター領域(BCR)およびアベルソンマウス白血病ウイルス癌遺伝子ホモログ1(Abl)からなる癌遺伝子融合タンパク質(bcr-abl);チロシナーゼ;エフリンA型受容体2(EphA2);フコシルGM1;シアリルルイス接着分子(sLe);ガングリオシドGM3;トランスグルタミナーゼ5(TGS5);高分子量黒色腫関連抗原(HMWMAA);o-アセチル-GD2ガングリオシド(OAcGD2);葉酸受容体ベータ;腫瘍内皮マーカー1(TEM1/CD248);腫瘍内皮マーカー7関連(TEM7R);クラウディン(claudin)6(CLDN6);甲状腺刺激ホルモン受容体(TSHR);Gタンパク質共役受容体クラスCグループ5、メンバーD(GPRC5D);染色体Xオープンリーディングフレーム61(CXORF61);CD97;CD179a;未分化リンパ腫キナーゼ(ALK);ポリシアル酸;胎盤特異的1(PLAC1);グロボ(globo)Hグリコセラミド(GloboH)の六糖部分;乳腺分化抗原(NY-BR-1);ウロプラキン(uroplakin)2(UPK2);A型肝炎ウイルス細胞受容体1(HAVCR1);アドレナリン受容体ベータ3(ADRB3);パンネキシン3(PANX3);Gタンパク質共役受容体20(GPR20);リンパ球抗原6複合体、座K9(LY6K);嗅覚受容体51E2(OR51E2);TCRガンマ代替リーディングフレームタンパク質(TARP);ウィルムス腫瘍タンパク質(WT1);がん/精巣抗原1(NY-ESO-1);がん/精巣抗原2(LAGE-1a);黒色腫関連抗原1(MAGE-A1);ETS転座変異体遺伝子6、染色体12p上に位置(ETV6-AML);精子タンパク質17(SPA17);X抗原ファミリー、メンバー1A(XAGE1);アンギオポエチン結合性細胞表面受容体2(Tie2);黒色腫がん精巣抗原-1(MAD-CT-1);黒色腫がん精巣抗原-2(MAD-CT-2);Fos関連抗原1;腫瘍タンパク質p53(p53);p53突然変異体;プロステイン;サバイビン(surviving);テロメラーゼ;前立腺癌腫瘍抗原-1、T細胞により認識される黒色腫抗原1;ラット肉腫(Ras)突然変異体;ヒトテロメラーゼ逆転写酵素(hTERT);肉腫転座切断点;アポトーシスの黒色腫阻害因子(ML-IAP);ERG(膜貫通プロテアーゼ、セリン2(TMPRSS2)ETS融合遺伝子);N-アセチルグルコサミニル-トランスフェラーゼV(NA17);ペアードボックスタンパク質Pax-3(PAX3);アンドロゲン受容体;サイクリンB1;v-mycトリ骨髄球腫症ウイルス癌遺伝子神経芽腫由来ホモログ(MYCN);RasホモログファミリーメンバーC(RhoC);チロシナーゼ関連タンパク質2(TRP-2);チトクロームP450 1B1(CYP1B1);CCCTC結合因子(ジンクフィンガータンパク質)様、T細胞により認識される扁平上皮細胞癌抗原3(SART3);ペアードボックスタンパク質Pax-5(PAX5);プロアクロシン結合タンパク質sp32(OY-TES1);リンパ球特異的タンパク質チロシンキナーゼ(LCK);Aキナーゼアンカータンパク質4(AKAP-4);滑膜肉腫、X切断点2(SSX2);終末糖化産物受容体(RAGE-1);腎臓ユビキタス1(RU1);腎臓ユビキタス2(RU2);レグメイン(legumain);ヒトパピローマウイルスE6(HPV E6);ヒトパピローマウイルスE7(HPV E7);腸カルボキシルエステラーゼ;熱ショックタンパク質70-2突然変異型(mut hsp70-2);CD79a;CD79b;CD72;白血球関連免疫グロブリン様受容体1(LAIR1);IgA受容体(FCARまたはCD89)のFc断片;白血球免疫グロブリン様受容体サブファミリーAメンバー2(LILRA2);CD300分子様ファミリーメンバーf(CD300LF);C型レクチンドメインファミリー12メンバーA(CLEC12A);骨髄間質細胞抗原2(BST2);EGF様モジュール含有ムチン様ホルモン受容体様2(EMR2);リンパ球抗原75(LY75);グリピカン-3(GPC3);Fc受容体様5(FCRL5);および免疫グロブリンラムダ様ポリペプチド1(IGLL1)からなる群から選択される抗原に結合する、上記[30]から[37]のいずれかに記載の水性組成物。
[39]
前記抗原結合ドメインが、CD19、メソテリンまたはCD123と結合する、上記[38]に記載の水性組成物。
[40]
前記CARが、抗CD19抗体またはその断片、4-1BB(CD137)膜貫通ドメインおよびCD3-ゼータシグナリングドメインを含む、上記[29]から[39]のいずれかに記載の水性組成物。
[41]
ヒト血清アルブミン(HSA)、組換えヒト血清アルブミン(rHSA)、ウシ血清アルブミン(BSA)およびリポタンパク質からなる群から選択される1つまたは複数のタンパク質を含まない、上記[1]から[40]のいずれかに記載の水性組成物。
[42]
HSA、rHSA、BSAおよびリポタンパク質を含まない、上記[41]に記載の水性組成物。
[43]
前記レンチウイルスベクターが、血清の非存在下で培養された細胞において産生される、上記[1]から[42]のいずれかに記載の水性組成物。
[44]
前記レンチウイルスベクターが、動的光散乱(DLS)で測定したとき、100±25nmの流体力学半径により特徴づけられる、上記[1]から[43]のいずれかに記載の水性組成物。
[45]
前記レンチウイルスベクターが、25℃~55℃の温度範囲内で、100±25nmの前記流体力学半径を維持する、上記[44]に記載の水性組成物。
[46]
前記レンチウイルスベクターが、10%~25%の多分散性により特徴づけられる、上記[1]から[45]のいずれかに記載の水性組成物。
[47]
前記レンチウイルスベクターが、25℃~55℃の温度範囲内で、10%~25%の前記多分散性を維持する、上記[46]に記載の水性組成物。
[48]
前記レンチウイルスベクターの3回の凍結/融解サイクルの後の濃度が、前記凍結/融解サイクル前の前記水性組成物中の前記レンチウイルスベクターの濃度に対して約70%~約100%で維持され、前記凍結/融解サイクルがそれぞれ、前記水性組成物を凍結させ、その後前記水性組成物を室温で融解させることを含む、上記[1]から[47]のいずれかに記載の水性組成物。
[49]
前記レンチウイルスベクターが、6回の前記凍結/融解サイクルの後、約70%~約100%の前記濃度を維持する、上記[48]に記載の水性組成物。
[50]
前記レンチウイルスベクターが、9回の前記凍結/融解サイクルの後、約70%~約100%後の前記濃度を維持する、上記[49]に記載の水性組成物。
[51]
レンチウイルスベクターと、リン酸塩緩衝液、クエン酸ナトリウム緩衝液、2-(N-モルホリノ)エタンスルホン酸(MES)緩衝液、3-モルホリノプロパン-1-スルホン酸(MOPS)緩衝液からなる群から選択される緩衝液と、塩とを含む水性組成物。
[52]
前記塩が、塩化ナトリウム、塩化マグネシウムおよび塩化カルシウムからなる群から選択される、上記[51]に記載の水性組成物。
[53]
スクロースおよびトレハロースからなる群から選択される非還元炭水化物を更に含む、上記[51]または[52]に記載の水性組成物。
[54]
レンチウイルスベクターを精製する方法であって、上記[1]から[53]のいずれかに記載の水性組成物をフィルターに通すことにより、微生物を実質的に含まない水性組成物を生成することを含む方法。
[55]
前記フィルターが複数の孔を含み、前記孔が約0.2μmの直径を有する、上記[54]に記載の方法。
[56]
前記微生物を実質的に含まない水性組成物が、前記接触より前の前記水性組成物中の前記レンチウイルスベクターの濃度に対して約80%の濃度で前記レンチウイルスベクターを含む、上記[55]に記載の方法。
[57]
レンチウイルスベクターを精製する方法であって、
a.上記[1]から[53]のいずれかに記載の水性組成物を、複数の粒子を含む材料と接触させることと、
b.前記材料中を流れた物質を、前記材料内に残留する物質から分離することにより、前記レンチウイルスベクターが富化された水性組成物を生成することと、
を含む方法。
[58]
レンチウイルスベクターを精製する方法であって、上記[1]から[53]のいずれかに記載の水性組成物をヌクレアーゼと接触させることにより、混入ポリヌクレオチドを実質的に含まない水性組成物を生成することを含む方法。
[59]
細胞において導入遺伝子を発現させる方法であって、前記細胞を上記[1]から[53]のいずれかに記載の水性組成物と接触させることを含む方法。
[60]
前記細胞が哺乳動物細胞である、上記[59]に記載の方法。
[61]
前記哺乳動物細胞がT細胞である、上記[60]に記載の方法。
[62]
前記T細胞がヒトT細胞である、上記[61]に記載の方法。
[63]
前記ヒトT細胞が、293T細胞、Jurkat T細胞または初代ヒトT細胞である、上記[62]に記載の方法。
[64]
上記[1]から[53]のいずれかに記載の水性組成物と、添付文書とを含むキット。
[65]
前記添付文書が、前記キットのユーザーに、上記[59]~[63]のいずれかに記載の方法に従って細胞において導入遺伝子を発現させるよう指示するものである、上記[64]に記載のキット。
[66]
上記[65]に記載の細胞の培養に使用できる試薬を更に含む、上記[65]に記載のキット。
[67]
導入遺伝子を任意に含むウイルスベクターを対象の細胞に送達する方法における、上記[1]から[53]のいずれかに記載の水性組成物の使用であって、前記方法が、前記対象に前記組成物を投与することを含む、使用。
Claims (55)
- レンチウイルスベクターと、1,4-ピペラジンジエタンスルホン酸(PIPES)緩衝液と、塩とを含む水性組成物であって、
前記レンチウイルスベクターが、キメラ抗原受容体(CAR)をコードする導入遺伝子を含み、前記水性組成物のpHが約6.0~約7.0であり、前記塩が、塩化ナトリウム、塩化マグネシウムおよび塩化カルシウムからなる群から選択され、前記水性組成物中の前記塩の濃度が約25mM~約150mMである、
水性組成物。 - 前記PIPES緩衝液が、約10mM~約50mMの濃度で存在する、請求項1に記載の水性組成物。
- 前記PIPES緩衝液が、約20mMの濃度で存在する、請求項1に記載の水性組成物。
- pHが約6.5である、請求項1から3のいずれか一項に記載の水性組成物。
- 前記塩が塩化ナトリウムである、請求項1から4のいずれか一項に記載の水性組成物。
- 前記塩の濃度が約50mMである、請求項1から5のいずれか一項に記載の水性組成物。
- 前記塩の濃度が約75mMである、請求項1から5のいずれか一項に記載の水性組成物。
- 20mM PIPESおよび75mM塩化ナトリウムを含み、約6.5のpHを有する、請求項1から7のいずれか一項に記載の水性組成物。
- 炭水化物を更に含む、請求項1から8のいずれか一項に記載の水性組成物。
- 前記炭水化物が非還元炭水化物である、請求項9に記載の水性組成物。
- 前記非還元炭水化物が、スクロースおよびトレハロースからなる群から選択される、請求項10に記載の水性組成物。
- 前記炭水化物が、前記水性組成物の体積当たりの重量で約1%~約10%の濃度で存在する、請求項9から11のいずれか一項に記載の水性組成物。
- 前記炭水化物が、前記水性組成物の体積当たりの重量で約2%~約5%の濃度で存在する、請求項12に記載の水性組成物。
- 前記炭水化物が、前記水性組成物の体積当たりの重量で約2.5%の濃度で存在する、請求項13に記載の水性組成物。
- 20mM PIPESと、75mM塩化ナトリウムと、前記水性組成物の体積当たりの重量で2.5%のスクロースとを含み、約6.5のpHを有する、請求項9から14のいずれか一項に記載の水性組成物。
- モル浸透圧濃度が、約270mOsm/kg~約330mOsm/kgである、請求項1から15のいずれか一項に記載の水性組成物。
- モル浸透圧濃度が、約275mOsm/kg~約300mOsm/kgである、請求項16に記載の水性組成物。
- モル浸透圧濃度が約285mOsm/kgである、請求項17に記載の水性組成物。
- 前記レンチウイルスベクターが、約2×108TU/mL(1ミリリットル当たりの形質導入単位)~約1×109TU/mLの濃度で存在する、請求項1から18のいずれか一項に記載の水性組成物。
- 前記レンチウイルスベクターが、約3×108TU/mL~約5×108TU/mLの濃度で存在する、請求項19に記載の水性組成物。
- 前記レンチウイルスベクターが組換えヒト免疫不全ウイルスである、請求項1から20のいずれか一項に記載の水性組成物。
- 前記レンチウイルスベクターが、水疱性口内炎ウイルスG(VSV-G)タンパク質を含む、請求項1から21のいずれか一項に記載の水性組成物。
- 前記VSV-Gタンパク質が、前記レンチウイルスベクターの表面に存在する、請求項22に記載の水性組成物。
- 前記CARが、N末端からC末端方向に、抗原結合ドメイン、膜貫通ドメインおよび1つまたは複数のシグナリングドメインを含む、請求項1に記載の水性組成物。
- 前記シグナリングドメインが、1つまたは複数の一次シグナリングドメインを含む、請求項24に記載の水性組成物。
- 前記シグナリングドメインが、1つまたは複数の共刺激シグナリングドメインを含む、請求項24または25に記載の水性組成物。
- 前記1つまたは複数の一次シグナリングドメインの1つが、CD3-ゼータ刺激性ドメインを含む、請求項25に記載の水性組成物。
- 前記共刺激シグナリングドメインの1つまたは複数が、CD27、CD28、4-1BB(CD137)、OX40、GITR、CD30、CD40、ICOS、BAFFR、HVEM、ICAM-1、リンパ球機能関連抗原-1(LFA-1)、CD2、CDS、CD7、CD287、LIGHT、NKG2C、NKG2D、SLAMF7、NKp80、NKp30、NKp44、NKp46、CD160、B7-H3、およびCD83と特異的に結合するリガンドからなる群から選択される共刺激タンパク質から選択される細胞内ドメインを含む、請求項26に記載の水性組成物。
- 前記共刺激シグナリングドメインの前記1つまたは複数が、4-1BB(CD137)共刺激ドメインを含む、請求項28に記載の水性組成物。
- 前記共刺激ドメインの前記1つまたは複数がCD28共刺激ドメインを含む、請求項28または29に記載の水性組成物。
- 前記抗原結合ドメインがscFvである、請求項24から30のいずれか一項に記載の水性組成物。
- 前記抗原結合ドメインが、CD19;CD123;CD22;CD30;CD171;CS-1;C型レクチン様分子-1;CD33;表皮増殖因子受容体変異体III(EGFRvIII);ガングリオシドG2(GD2);ガングリオシドGD3;TNF受容体ファミリーメンバーB細胞成熟(BCMA);Tn抗原((Tn Ag)または(GalNAcα-Ser/Thr));前立腺特異的膜抗原(PSMA);受容体チロシンキナーゼ様オーファン受容体1(ROR1);Fms様チロシンキナーゼ3(FLT3);腫瘍関連糖タンパク質72(TAG72);CD38;CD44v6;癌胎児性抗原(CEA);上皮細胞接着分子(EPCAM);B7H3(CD276);KIT(CD117);インターロイキン-13受容体サブユニットアルファ-2;メソテリン(mesothelin);インターロイキン11受容体アルファ(IL-11Ra);前立腺幹細胞抗原(PSCA);プロテアーゼセリン21;血管内皮増殖因子受容体2(VEGFR2);ルイス(Y)抗原;CD24;血小板由来増殖因子受容体ベータ(PDGFR-ベータ);ステージ特異的胎児抗原-4(SSEA-4);CD20;葉酸受容体アルファ;受容体チロシン-プロテインキナーゼERBB2(Her2/neu);ムチン1、細胞表面会合(MUC1);表皮増殖因子受容体(EGFR);神経細胞接着分子(NCAM);プロスターゼ;前立腺酸性ホスファターゼ(PAP);延長因子2変異型(ELF2M);エフリンB2;線維芽細胞活性化タンパク質アルファ(FAP);インスリン様増殖因子1受容体(IGF-I受容体);炭酸脱水酵素IX(CAIX);プロテアソーム(プロソーム、マクロペイン)サブユニット、ベータ型、9(LMP2);糖タンパク質100(gp100);切断点クラスター領域(BCR)およびアベルソンマウス白血病ウイルス癌遺伝子ホモログ1(Abl)からなる癌遺伝子融合タンパク質(bcr-abl);チロシナーゼ;エフリンA型受容体2(EphA2);フコシルGM1;シアリルルイス接着分子(sLe);ガングリオシドGM3;トランスグルタミナーゼ5(TGS5);高分子量黒色腫関連抗原(HMWMAA);o-アセチル-GD2ガングリオシド(OAcGD2);葉酸受容体ベータ;腫瘍内皮マーカー1(TEM1/CD248);腫瘍内皮マーカー7関連(TEM7R);クラウディン(claudin)6(CLDN6);甲状腺刺激ホルモン受容体(TSHR);Gタンパク質共役受容体クラスCグループ5、メンバーD(GPRC5D);染色体Xオープンリーディングフレーム61(CXORF61);CD97;CD179a;未分化リンパ腫キナーゼ(ALK);ポリシアル酸;胎盤特異的1(PLAC1);グロボ(globo)Hグリコセラミド(GloboH)の六糖部分;乳腺分化抗原(NY-BR-1);ウロプラキン(uroplakin)2(UPK2);A型肝炎ウイルス細胞受容体1(HAVCR1);アドレナリン受容体ベータ3(ADRB3);パンネキシン3(PANX3);Gタンパク質共役受容体20(GPR20);リンパ球抗原6複合体、座K9(LY6K);嗅覚受容体51E2(OR51E2);TCRガンマ代替リーディングフレームタンパク質(TARP);ウィルムス腫瘍タンパク質(WT1);がん/精巣抗原1(NY-ESO-1);がん/精巣抗原2(LAGE-1a);黒色腫関連抗原1(MAGE-A1);ETS転座変異体遺伝子6、染色体12p上に位置(ETV6-AML);精子タンパク質17(SPA17);X抗原ファミリー、メンバー1A(XAGE1);アンギオポエチン結合性細胞表面受容体2(Tie2);黒色腫がん精巣抗原-1(MAD-CT-1);黒色腫がん精巣抗原-2(MAD-CT-2);Fos関連抗原1;腫瘍タンパク質p53(p53);p53突然変異体;プロステイン;サバイビン(surviving);テロメラーゼ;前立腺癌腫瘍抗原-1、T細胞により認識される黒色腫抗原1;ラット肉腫(Ras)突然変異体;ヒトテロメラーゼ逆転写酵素(hTERT);肉腫転座切断点;アポトーシスの黒色腫阻害因子(ML-IAP);ERG(膜貫通プロテアーゼ、セリン2(TMPRSS2)ETS融合遺伝子);N-アセチルグルコサミニル-トランスフェラーゼV(NA17);ペアードボックスタンパク質Pax-3(PAX3);アンドロゲン受容体;サイクリンB1;v-mycトリ骨髄球腫症ウイルス癌遺伝子神経芽腫由来ホモログ(MYCN);RasホモログファミリーメンバーC(RhoC);チロシナーゼ関連タンパク質2(TRP-2);チトクロームP450 1B1(CYP1B1);CCCTC結合因子(ジンクフィンガータンパク質)様、T細胞により認識される扁平上皮細胞癌抗原3(SART3);ペアードボックスタンパク質Pax-5(PAX5);プロアクロシン結合タンパク質sp32(OY-TES1);リンパ球特異的タンパク質チロシンキナーゼ(LCK);Aキナーゼアンカータンパク質4(AKAP-4);滑膜肉腫、X切断点2(SSX2);終末糖化産物受容体(RAGE-1);腎臓ユビキタス1(RU1);腎臓ユビキタス2(RU2);レグメイン(legumain);ヒトパピローマウイルスE6(HPV E6);ヒトパピローマウイルスE7(HPV E7);腸カルボキシルエステラーゼ;熱ショックタンパク質70-2突然変異型(mut hsp70-2);CD79a;CD79b;CD72;白血球関連免疫グロブリン様受容体1(LAIR1);IgA受容体(FCARまたはCD89)のFc断片;白血球免疫グロブリン様受容体サブファミリーAメンバー2(LILRA2);CD300分子様ファミリーメンバーf(CD300LF);C型レクチンドメインファミリー12メンバーA(CLEC12A);骨髄間質細胞抗原2(BST2);EGF様モジュール含有ムチン様ホルモン受容体様2(EMR2);リンパ球抗原75(LY75);グリピカン-3(GPC3);Fc受容体様5(FCRL5);および免疫グロブリンラムダ様ポリペプチド1(IGLL1)からなる群から選択される抗原に結合する、請求項24から31のいずれか一項に記載の水性組成物。
- 前記抗原結合ドメインが、CD19、メソテリンまたはCD123と結合する、請求項32に記載の水性組成物。
- 前記CARが、抗CD19抗体またはその断片、4-1BB(CD137)膜貫通ドメインおよびCD3-ゼータシグナリングドメインを含む、請求項1~33のいずれか一項に記載の水性組成物。
- ヒト血清アルブミン(HSA)、組換えヒト血清アルブミン(rHSA)、ウシ血清アルブミン(BSA)およびリポタンパク質からなる群から選択される1つまたは複数のタンパク質を含まない、請求項1から34のいずれか一項に記載の水性組成物。
- HSA、rHSA、BSAおよびリポタンパク質を含まない、請求項35に記載の水性組成物。
- 前記レンチウイルスベクターが、血清の非存在下で培養された細胞において産生される、請求項1から36のいずれか一項に記載の水性組成物。
- 前記レンチウイルスベクターが、動的光散乱(DLS)で測定したとき、100±25nmの流体力学半径により特徴づけられる、請求項1から37のいずれか一項に記載の水性組成物。
- 前記レンチウイルスベクターが、25℃~55℃の温度範囲内で、100±25nmの前記流体力学半径を維持する、請求項38に記載の水性組成物。
- 前記レンチウイルスベクターが、10%~25%の多分散性により特徴づけられる、請求項1から39のいずれか一項に記載の水性組成物。
- 前記レンチウイルスベクターが、25℃~55℃の温度範囲内で、10%~25%の前記多分散性を維持する、請求項40に記載の水性組成物。
- 前記レンチウイルスベクターの3回の凍結/融解サイクルの後の濃度が、前記凍結/融解サイクル前の前記水性組成物中の前記レンチウイルスベクターの濃度に対して約70%~約100%で維持され、前記凍結/融解サイクルがそれぞれ、前記水性組成物を凍結させ、その後前記水性組成物を室温で融解させることを含む、請求項1から41のいずれか一項に記載の水性組成物。
- 前記レンチウイルスベクターが、6回の前記凍結/融解サイクルの後、約70%~約100%の前記濃度を維持する、請求項42に記載の水性組成物。
- 前記レンチウイルスベクターが、9回の前記凍結/融解サイクルの後、約70%~約100%の前記濃度を維持する、請求項43に記載の水性組成物。
- レンチウイルスベクターを精製する方法であって、
a.請求項1から44のいずれか一項に記載の水性組成物を、複数の粒子を含む材料と接触させることと、
b.前記材料中を流れた物質を、前記材料内に残留する物質から分離することにより、前記レンチウイルスベクターが富化された水性組成物を生成することと、
を含む方法。 - レンチウイルスベクターを精製する方法であって、請求項1から44のいずれか一項に記載の水性組成物をヌクレアーゼと接触させることにより、混入ポリヌクレオチドを実質的に含まない水性組成物を生成することを含む方法。
- 細胞において導入遺伝子を発現させる方法であって、前記細胞を請求項1から44のいずれか一項に記載の水性組成物と接触させることを含む方法。
- 前記細胞が哺乳動物細胞である、請求項47に記載の方法。
- 前記哺乳動物細胞がT細胞である、請求項48に記載の方法。
- 前記T細胞がヒトT細胞である、請求項49に記載の方法。
- 前記ヒトT細胞が、293T細胞、Jurkat T細胞または初代ヒトT細胞である、請求項50に記載の方法。
- 請求項1から44のいずれか一項に記載の水性組成物と、添付文書とを含むキット。
- 前記添付文書が、前記キットのユーザーに、請求項47~51のいずれか一項に記載の方法に従って細胞において導入遺伝子を発現させるよう指示するものである、請求項52に記載のキット。
- 前記細胞の培養に使用できる試薬を更に含む、請求項53に記載のキット。
- ウイルスベクターを対象の細胞に送達する方法に使用するための、請求項1から44のいずれか一項に記載の水性組成物であって、
前記ウイルスベクターが、キメラ抗原受容体(CAR)をコードする導入遺伝子を含む前記レンチウイルスベクターであり、
前記方法が、前記対象に前記組成物を投与することを含む、水性組成物。
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C11 | Written invitation by the commissioner to file amendments |
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A911 | Transfer to examiner for re-examination before appeal (zenchi) |
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C21 | Notice of transfer of a case for reconsideration by examiners before appeal proceedings |
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A912 | Re-examination (zenchi) completed and case transferred to appeal board |
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C211 | Notice of termination of reconsideration by examiners before appeal proceedings |
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C22 | Notice of designation (change) of administrative judge |
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C22 | Notice of designation (change) of administrative judge |
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C23 | Notice of termination of proceedings |
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C03 | Trial/appeal decision taken |
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C30A | Notification sent |
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A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
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R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
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