ES2842899T3 - Tampones para la estabilización de preparaciones lentivirales - Google Patents

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Abstract

Una composición acuosa que comprende un vector lentiviral, un tampón de ácido 1,4-piperazina dietano sulfónico (PIPES) y una sal.

Description

DESCRIPCIÓN
Tampones para la estabilización de preparaciones lentivirales
Campo de la invención
[0001] La invención se refiere a preparaciones lentivirales que exhiben capacidades de transducción y estabilidad de almacenamiento mejoradas, así como a procedimientos de expresión génica heteróloga en células diana.
Antecedentes de la invención
[0002] Con los avances en las tecnologías de terapia génica, el uso de vectores virales terapéuticos representa un paradigma cada vez más eficaz para el tratamiento de enfermedades humanas. Entre los vectores virales disponibles para aplicaciones de terapia génica se encuentran los vectores lentivirales. Dichos vectores incluyen sistemas de vectores virales reconstruidos derivados del virus de inmunodeficiencia humana-1 (VIH-1) y son capaces de introducir un gen de interés en células o líneas celulares primarias animales y humanas. Los genomas de vectores lentivirales incluyen una cadena codificante de ARN, que se transcribe inversamente en ADN al ingresar al citoplasma de una célula hospedadora mediante una transcriptasa inversa viral para formar un complejo de preintegración de ADN. Este complejo se transporta al núcleo de la célula hospedadora, donde una porción del ADN viral se integra posteriormente en el genoma de la célula hospedadora. El ADN integrado puede a continuación transcribirse en ARN, tal como ARNm que codifica proteínas, que, en última instancia, puede exportarse al citoplasma para la expresión posterior de una proteína de interés.
[0003] La expresión génica mediada por vectores lentivirales puede usarse para lograr una producción continua y estable de proteína, porque el gen de interés se ha integrado en el genoma de una célula hospedadora y, por lo tanto, se replica al dividir la célula. Los vectores lentivirales pueden infectar eficazmente las células que no se dividen, así como aquellas que progresan activamente a través del ciclo celular. Por el contrario, otros vectores virales, tales como vectores adenovirales, vectores virales adenoasociados y vectores retrovirales clásicos, solo son capaces de infectar células que se dividen. Los tejidos y células en los que puede producirse la expresión crónica mediada por vectores lentivirales de un gen de interés incluyen el cerebro, el hígado, las células musculares, la retina, las células madre hematopoyéticas, las células madre mesenquimales de la médula ósea y los macrófagos, entre otros.
[0004] La producción de vectores lentivirales se ha visto obstaculizada por varios desafíos, uno de los cuales es la baja estabilidad de los vectores. La operación de fabricación de vectores lentivirales incluye varias etapas: producción, purificación, almacenamiento y aplicación de transferencia génica (Carmo y col., J. Gene Med. 11:670-678, 2009). Los vectores lentivirales son susceptibles a la inactivación durante estos procedimientos, lo que puede contribuir a disminuir la calidad final y la eficacia de la preparación del vector. En estudios previos, se ha demostrado que un mecanismo por el cual los vectores virales son inactivados es por la pérdida de la capacidad viral para realizar la transcripción inversa (Carmo y col. Hum. Gene Ther. 20:1168-76, 2009; y Carmo y col., J. Gene Med. 10:383-391, 2008). Además, sigue habiendo una necesidad de procedimientos para estabilizar las preparaciones de vectores lentivirales a fin de evitar la agregación irreversible que puede ir acompañada de la pérdida de infectividad. Además, durante la purificación de vectores lentivirales, los componentes estabilizantes se eliminan de la preparación lentiviral, lo que puede hacer que el vector se vuelva cada vez más inestable. Por lo tanto, también hay una necesidad de formulaciones lentivirales que preserven la estabilidad del vector durante todo el procedimiento de purificación.
[0005] Durante la purificación y el almacenamiento, los vectores a menudo se almacenan a 4°C (Rodrigues y col., J. Biotechnol. 127:520-541, 2007). Se ha informado que los vectores lentivirales tienen una necesidad adicional de componentes estabilizantes, como la albúmina sérica humana (HSA) (Carmo y col., J. Gene Med. 11:670-678, 2009). Esto contrasta fuertemente con los gamma-retrovirus, donde la simple adición de proteínas exógenas devuelve la estabilidad comparable al sobrenadante de cultivo celular. Las lipoproteínas son estructuras complejas compuestas por varios lípidos, incluyendo colesterol, fosfolípidos y proteínas (Olson, J. Nutr. 128:S439- S443, 1998). Actúan como transportadores de lípidos en la sangre junto con la HSA. Es posible que una estructura de lipoproteína-HSA forme una disposición protectora alrededor de la membrana de vectores lentivirales (Carmo y col., J. Gene Med. 11:670-678, 2009). Como también se sabe que la albúmina se asocia estrechamente con las superficies celulares (Dziarski y col., J. Biol. Chem. 269:20431-20436, 1994), estos complejos lipoproteína/HSA pueden asociarse con la membrana del vector, que es similar a una membrana celular. Esta asociación puede proporcionar protección a su estructura y prevenir cambios conformacionales de manera más eficiente que la HSA sola.
[0006] Con el fin de garantizar la estabilidad durante el almacenamiento, soluciones madre de vectores virales infecciosos se han almacenado comúnmente a bajas temperaturas (por ejemplo, a -80°C) debido a su complejidad. Se ha sugerido que los virus encapsulados con lípidos sobreviven bien a temperaturas inferiores a -60°C, y que el almacenamiento a -20°C o 4°C solo debe usarse si "la retención de la infectividad del virus no es esencial" (Gould y col., Mol. Biotechnol. 13:57-66, 1999). Otras investigaciones han concluido que ciertos vectores virales deben almacenarse a -70°C o menos para retener la infectividad (Harper, Virology Ed. BIOS Scientific Publishers Limited, Oxford, Reino Unido, 1993). Típicamente, las preparaciones de vectores lentivirales contienen proteínas codificadas por el genoma viral, que incluyen proteínas de encapsulamiento incrustadas en una membrana bicapa lipídica. A bajas temperaturas, la proteína puede ser susceptible a la desnaturalización y la bicapa lipídica puede ser propensa a la pérdida de integridad estructural. Por lo tanto, existe una necesidad de formulaciones lentivirales capaces de aumentar la estabilidad de una preparación de vector viral a una temperatura baja, durante períodos prolongados de tiempo.
[0007] Los vectores lentivirales a menudo se mantienen a estas bajas temperaturas para el almacenamiento a largo plazo, ya que la congelación y descongelación iterativa de vectores virales puede conducir a una pérdida de capacidad de transducción. Como tal, sigue habiendo una necesidad de preparaciones lentivirales que retengan la infectividad después de someterse a múltiples ciclos de congelación/descongelación.
[0008] Además de la estabilidad durante la purificación y el almacenamiento, un vector lentiviral útil para aplicaciones ex vivo, tal como terapia celular del receptor quimérico de antígeno T (CART), conservará deseablemente la estabilidad a temperaturas fisiológicamente relevantes, tal como 37°C, la temperatura a la que los vectores lentivirales pueden incubarse con células hospedadoras para promover la transducción. Por lo tanto, también existe una necesidad de preparaciones lentivirales que mantengan la integridad estructural del vector viral durante los eventos de transferencia génica ex vivo.
[0009] Además de las consideraciones biológicas mencionadas anteriormente, las preparaciones de vectores lentivirales que preservan la estabilidad del vector viral pueden ser útiles adicionalmente desde una perspectiva comercial. Cuando un vector lentiviral recombinante se almacena a bajas temperaturas durante períodos de tiempo excesivos o cuando el vector recombinante se somete a múltiples ciclos de congelación/descongelación durante el uso experimental u operaciones de fabricación, la actividad biológica disminuye significativamente. Esto conduce a una menor recuperación de partículas infecciosas, lo que aumenta aún más el costo de los productos (COG, de Cost Of Goods). Además, una mayor susceptibilidad de las partículas vectoriales a perder actividad puede conducir a resultados inexactos en estudios preclínicos o clínicos. Para un entorno clínico, el uso de un dispositivo de almacenamiento de temperatura ultrabaja (por ejemplo, -60°C o menos) es una carga de costos adicional y plantea un desafío logístico en hospitales y otras instalaciones con punto de atención a pacientes. Generalmente, se espera que estas instalaciones tengan un aparato de congelación ultrabaja para administrar el tratamiento. Por lo tanto, sigue habiendo una necesidad de preparaciones de vectores lentivirales recombinantes que preserven la estabilidad del vector para promover operaciones de fabricación eficientes y procedimientos viables de almacenamiento a bajas temperaturas.
[0010] Tiscornia y col. (2006), Nature Protocols;1(1):241-245 se refiere a protocolos para la producción de vectores lentivirales.
[0011] Salmon y col. (2007), Current Protocols in Human Genetics;54:12.10.1-12.10.24 también se refiere a protocolos para la producción de vectores lentivirales.
[0012] Kutner y col. (2009), Nature Protocols;4(4):495-505 se refiere a protocolos para generar vectores lentivirales pseudotipados.
[0013] Cribbs y col. (2013), BMC Biotechnology;13(1):98 se refiere a la producción y concentración de vectores lentivirales y transducción de células T humanas.
[0014] US 2015/056696 A1 se refiere a una preparación de vector lentiviral recombinante.
[0015] WO 2015/097650 A1 se refiere a procedimientos para fabricar partículas de vector lentiviral liofilizadas.
[0016] Schweizer y col. (2010), Current Gene Therapy; 10(6):474-486 se refiere a la producción a gran escala de vectores lentivirales.
Resumen de la invención
[0017] Con base en la descripción en esta invención, las reivindicaciones adjuntas definen la presente invención.
[0018] La invención proporciona composiciones acuosas que incluyen cada una un vector lentiviral, un tampón de ácido 1,4-piperazinadi-etanosulfónico (PIPES) y una sal.
[0019] En diversas realizaciones, el tampón PIPES está presente a una concentración de alrededor de 10 a alrededor de 50 mM (por ejemplo, alrededor de 20 mM); el pH de la composición acuosa es de alrededor de 6,0 a alrededor de 7,0 (por ejemplo, alrededor de 6,5); y/o la sal se selecciona del grupo que consiste en cloruro de sodio, cloruro de magnesio y cloruro de calcio. La concentración de la sal en las composiciones acuosas puede ser, por ejemplo, de alrededor de 25 mM a alrededor de 150 mM (por ejemplo, alrededor de 50 mM o alrededor de 75 mM).
En realizaciones particulares, las composiciones acuosas incluyen un vector lentiviral, PIPES 20 mM y cloruro de sodio 75 mM, y tienen un pH de alrededor de 6,5.
[0020] Las composiciones acuosas pueden incluir además un carbohidrato, por ejemplo, un carbohidrato no reductor, por ejemplo, sacarosa o trehalosa. En diversas realizaciones, el carbohidrato está presente a una concentración de alrededor de 1% a alrededor de 10% (por ejemplo, de alrededor de 2% a alrededor de 5%, o alrededor de 2,5%) en peso por volumen de la composición acuosa. En realizaciones particulares, las composiciones acuosas incluyen un vector lentiviral, PIPES 20 mM, cloruro de sodio 75 mM y sacarosa al 2,5% en peso por volumen de la composición acuosa, y la composición acuosa tiene un pH de alrededor de 6,5.
[0021] En diversas realizaciones, la osmolalidad de las composiciones acuosas es de alrededor de 270 mOsm/kg a alrededor de 330 mOsm/kg (por ejemplo, de alrededor de 275 mOsm/kg a alrededor de 300 mOsm/kg, o alrededor de 285 mOsm/kg), y/o el vector lentiviral está presente a una concentración de alrededor de 2 x 108 unidades de transducción por mililitro (TU/mL) a alrededor de 1 x 109 TU/mL (por ejemplo, alrededor de 3 x 108 TU/mL a alrededor de 5 x 108 TU/mL).
[0022] Los vectores lentivirales pueden ser virus de inmunodeficiencia humana recombinantes (por ejemplo, VIH-1) y, opcionalmente, pueden incluir una proteína G del virus de la estomatitis vesicular (VSV-G) (por ejemplo, presente en la superficie de los vectores lentivirales). Además, los vectores lentivirales pueden incluir uno o más transgenes, que incluyen, por ejemplo, transgenes que codifican proteínas (por ejemplo, uno o más receptores quiméricos de antígeno (CAR)).
[0023] En diversas realizaciones, cada uno de los CAR incluye, en una dirección de extremo N a extremo C, un dominio de unión al antígeno, un dominio transmembrana y uno o más dominios de señalización. Los dominios de señalización pueden incluir uno o más dominios de señalización primarios (por ejemplo, un dominio estimulador CD3-zeta) y/o uno o más dominios de señalización coestimuladores (por ejemplo, un dominio intracelular seleccionado de una proteína coestimuladora seleccionada del grupo que consiste en CD27, CD28, 4-1BB (CD137), OX40, GITR, CD30, CD40, ICOS, BAFFR, HVEM, ICAM-1, antígeno 1 asociado a la función linfocitaria (LFA-1), CD2, CDS, CD7, CD287, LIGHT, NKG2C, NKG2D, SLAMF7, NKp80, NKp30, NKp44, NKp46, CD160, B7-H3 y un ligando que se une específicamente con CD83).
[0024] El dominio de unión al antígeno de los CAR puede ser opcionalmente o incluir un scFv. Además, el dominio de unión al antígeno puede unirse opcionalmente a un antígeno seleccionado del grupo que consiste en CD19; CD123; CD22; CD30; CD171; CS-1; molécula 1 semejante a lectina de tipo C, CD33; variante III del receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFRvIII); gangliósido G2 (GD2); gangliósido GD3; maduración de células B del miembro de la familia del receptor TNF (BCMA); antígeno Tn ((Tn Ag) o (GalNAca-Ser/Thr)); antígeno de membrana específico de la próstata (PSMA); receptor 1 huérfano tipo tirosina quinasa (ROR1); Tirosina Quinasa 3 similar a Fms (FLT3); Glicoproteína 72 asociada a tumor (TAG72); CD38; CD44v6; Antígeno carcinoembrionario (CEA); Molécula de adhesión de células epiteliales (EPCAM); B7H3 (CD276); KIT (CD117); Subunidad alfa-2 del receptor de interleucina-13; mesotelina; Receptor alfa de interleucina 11 (IL-11Ra); Antígeno de células madre de próstata (PSCA); Proteasa Serina 21; Receptor 2 del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGFR2); Antígeno de Lewis(Y); CD24; Receptor beta del factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGFR-beta); Antígeno 4 específico de la etapa embrionaria (SSEA-4); CD20; receptor de folato alfa; receptor de tirosina-proteína quinasa ERBB2 (Her2/neu); Mucina 1, asociada a la superficie celular (MUC1); receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR); molécula de adhesión celular neural (NCAM); Prostasa; fosfatasa ácida prostática (PAP); factor de elongación 2 mutado (ELF2M); efrina B2; proteína de activación de fibroblastos alfa (FAP); receptor del factor de crecimiento similar a la insulina 1 (receptor IGF-I), anhidrasa carbónica IX (CAIX); subunidad Proteasoma (Prosoma, Macropaina), Tipo Beta, 9 (LMP2); glicoproteína 100 (gp100); proteína de fusión oncogénica que consiste en región de clúster de punto de ruptura (BCR) y homólogo oncogénico viral de leucemia murina de Abelson 1 (Abl) (bcr-abl); tirosinasa; receptor de eprina tipo A 2 (EphA2); Fucosil GM1; molécula de adhesión de sialil de Lewis (sLe); gangliósido GM3; transglutaminasa 5 (TGS5); antígeno asociado a melanoma de alto peso molecular (HMWMAA); gangliósido o-acetil-GD2 (OAcGD2); receptor de folato beta; marcador endotelial tumoral 1 (TEM1/CD248); marcador endotelial tumoral relacionado con 7 (TEM7R); claudina 6 (CLDN6); receptor de hormona estimulante de la tiroides (TSHR); receptor acoplado a proteína G clase C grupo 5, miembro D (GPRC5D); marco de lectura abierto del cromosoma X 61 (CXORF61); CD97; CD179a; Quinasa de linfoma anaplásico (ALK); ácido polisálico; específico de placenta 1 (PLAC1); porción de hexasacárido de glicoceramida globoH (GloboH); antígeno de diferenciación de glándula mamaria (NY-BR-1); uroplaquina 2 (UPK2); receptor celular del virus de la hepatitis A 1 (HAVCR1); adrenoceptor beta 3 (ADRB3); pannexina 3 (PANX3); receptor acoplado a proteína G 20 (GPR20); complejo de antígeno linfocitario 6, locus K 9 (LY6K); receptor olfativo 51 E2 (OR51E2); proteína de marco de lectura alternativa TCR Gamma (TARP); proteína tumoral de Wilms (WT1); antígeno 1 de cáncer/testículo (NY-ESO-1); antígeno 2 de cáncer/testículo (LAGE- 1a); antígeno 1 asociado a melanoma (MAGE-A1); gen 6 de variante de translocación ETS, ubicado en el cromosoma 12p (ETV6-AML); proteína 17 de esperma (SPA17); Familia del antígeno X, Miembro 1A (XAGE1); receptor de superficie celular de unión a angiopoyetina 2 (Tie 2); antígeno testicular de cáncer de melanoma 1 (MAD-CT-1); antígeno testicular de cáncer de melanoma 2 (MAD-CT-2); antígeno relacionado con Fos 1; proteína tumoral p53 (p53); mutante p53; prosteína; sobreviviente; telomerasa; antígeno tumoral de carcinoma de próstata 1, antígeno de melanoma reconocido por células T 1; mutante de sarcoma de rata (Ras); transcriptasa inversa de telomerasa humana (hTERT); puntos de ruptura de la translocación del sarcoma; inhibidor de apóptosis de melanoma (ML-IAP); ERG (proteasa transmembrana, gen de fusión ETS de serina 2 (TMPRSS2)); N-acetil glucosaminil-transferasa V (NA17); proteína de caja emparejada Pax-3 (PAX3); receptor de andrógeno; ciclina B1; homólogo derivado del neuroblastoma oncogénico viral de mielocitomatosis aviar v-myc (MYCN); Miembro C de la familia homóloga a Ras (RhoC); proteína relacionada con tirosinasa 2 (TRP-2); citocromo fP4501B1 (CYP1B1); factor de unión a CCCTC (proteína de dedos de zinc)similar al antígeno de carcinoma de células escamosas reconocido por células T 3 (SART3); proteína de caja emparejada Pax-5 (PAX5); proteína de unión a proacrosina sp32 (OY-TES1); proteína tirosina quinasa específica de linfocitos (LCK); proteína de anclaje a quinasa A 4 (AKAP-4); sarcoma sinovial, punto de ruptura X 2 (SSX2); receptor de productos finales de glicación avanzada (RAGE-1); ubicua renal 1 (RU1); ubicua renal 2 (RU2); legumaína; virus del papiloma humano E6 (HPV E6); virus del papiloma humano E7 (HPV E7); carboxil esterasa intestinal; proteína de choque térmico 70-2 mutada (mut hsp70-2); CD79a; CD79b; CD72; receptor similar a inmunoglobulina asociado a leucocitos 1 (LAIR1); fragmento Fc del receptor IgA (FCAR o CD89); miembro 2 de la subfamilia A del receptor similar a inmunoglobulina de leucocitos (LILRA2); miembro f de familia de moléculas similares a CD300 f (CD300LF); miembro A de la familia de dominios de lectina C 12 (CLEC12A); antígeno de células estromales de médula ósea 2 (BST2); módulo similar a EGF que contiene hormona similar a mucina 2 (EMR2); antígeno linfocítico 75 (YL75); Glipican-3 (GPC3); Fc similar a receptor 5 (FCRL5); y polipéptido tipo lambda de inmunoglobulina 1 (IGLL1).
[0025] En realizaciones particulares, el dominio de unión al antígeno se une a CD19, mesotelina o CD123. En una realización particular adicional, el CAR incluye un anticuerpo anti-CD19 o un fragmento de este, un dominio transmembrana 4-1BB (CD137) y un dominio de señalización CD3-zeta.
[0026] En diversas realizaciones, las composiciones acuosas están libres de una o más (por ejemplo, todas) proteínas, por ejemplo, una o más (por ejemplo, todas) de las proteínas seleccionadas del grupo que consiste en albúmina sérica humana (HSA), albúmina sérica humana recombinante (rHSA), albúmina sérica bovina (BSA) y una lipoproteína; y/o los vectores lentivirales se producen en células cultivadas en ausencia de suero.
[0027] En determinadas realizaciones, los vectores lentivirales se caracterizan por un radio hidrodinámico de 100 6 25 nm medido mediante dispersión dinámica de luz (DLS). Por ejemplo, los vectores lentivirales pueden mantener un radio hidrodinámico de 100625 nm dentro de un intervalo de temperatura de 25°C a 55°C.
[0028] En determinadas realizaciones, los vectores lentivirales se caracterizan por una polidispersidad de 10% a 25%. Por ejemplo, los vectores lentivirales pueden mantener una polidispersidad de 10% a 25% dentro de un intervalo de temperatura de 25°C a 55°C.
[0029] En diversas realizaciones, los vectores lentivirales mantienen una concentración después de 3, 6 o 9 ciclos de congelación/descongelación de alrededor de 70% a alrededor de 100% con respecto a la concentración del vector lentiviral en la composición acuosa antes de los ciclos de congelación/descongelación, donde cada uno de los ciclos de congelación/descongelación incluye congelar la composición acuosa y posteriormente permitir que la composición acuosa se descongele a temperatura ambiente.
[0030] La descripción también proporciona composiciones acuosas que incluyen cada una un vector lentiviral, un tampón seleccionado del grupo que consiste en un tampón de fosfato, un tampón de citrato de sodio, un tampón de ácido 2-(N-morfolino) etanosulfónico (MES), un tampón de ácido 3-morfolinopropano-1-sulfónico (MOPS) y una sal (por ejemplo, cloruro de sodio, cloruro de magnesio o cloruro de calcio). Estas composiciones pueden incluir además un carbohidrato, por ejemplo, un carbohidrato no reductor (por ejemplo, sacarosa o trehalosa).
[0031] La descripción incluye además composiciones secas o liofilizadas, que se preparan secando o liofilizando las composiciones acuosas descritas en esta invención, así como composiciones acuosas que se preparan reconstituyendo dichas composiciones secas o liofilizadas en un tampón descrito en esta invención (u otro vehículo estándar para administración).
[0032] También se incluyen en la descripción procedimientos para purificar vectores lentivirales. En estos procedimientos, una composición acuosa como se describe en esta invención se pasa a través de un filtro, produciendo así una composición acuosa que está sustancialmente libre de microorganismos. En varios casos, el filtro incluye una pluralidad de poros, por ejemplo, poros que tienen un diámetro de alrededor de 0,2 pm. En varios casos, una composición acuosa que está sustancialmente libre de microorganismos incluye el vector lentiviral a una concentración de alrededor de 80% con respecto a la concentración del vector lentiviral en la composición acuosa antes del contacto.
[0033] La descripción también proporciona procedimientos para purificar vectores lentivirales, que incluyen (a) poner en contacto una composición acuosa como se describe en esta invención con un material que incluye una pluralidad de partículas; y (b) separar sustancias que fluyen a través del material de sustancias que permanecen dentro del material, produciendo así una composición acuosa que está enriquecida con el vector lentiviral.
[0034] Además, la descripción proporciona procedimientos para purificar vectores lentivirales, que incluyen poner en contacto una composición acuosa como se describe en esta invención con una nucleasa, produciendo así una composición acuosa que está sustancialmente libre de polinucleótidos contaminantes.
[0035] También se proporcionan en la descripción procedimientos para expresar uno o más transgenes en una célula, que incluyen poner en contacto la célula con una composición acuosa como se describe en esta invención. En varios casos, la célula es una célula de mamífero (por ejemplo, una célula T, tal como una célula T humana). En casos específicos, la célula es una célula 293T, una célula T Jurkat o una célula T humana primaria.
[0036] La descripción también incluye kits que incluyen una composición acuosa como se describe en esta invención y opcionalmente un prospecto, por ejemplo, un prospecto que instruye a un usuario del kit para expresar un transgén en una célula según un procedimiento como se describe en esta invención. Los kits opcionalmente pueden incluir además uno o más reactivos que se pueden utilizar para cultivar una célula como se describe en esta invención.
[0037] La descripción incluye además el uso de una composición acuosa como se describe en esta invención en procedimientos para administrar un vector viral, que opcionalmente incluye un transgén, en una célula de un sujeto, donde el procedimiento implica administrar la composición al sujeto. Los procedimientos para prevenir o tratar enfermedades o afecciones, por ejemplo, como se describe en esta invención, y/o administrar transgenes (por ejemplo, genes que codifican CAR), por ejemplo, como se describe en esta invención, también se incluyen en la descripción, y pueden implicar la administración de las composiciones descritas en esta invención.
Definiciones
[0038] Tal como se usa en esta invención, el término "alrededor de" se refiere a un valor que está dentro del 10% por encima o por debajo del valor que se describe. Por ejemplo, un valor de "alrededor de 50 mM" denota una concentración de 45 mM a 55 mM.
[0039] Tal como se usa en esta invención, el término "tampón" se refiere a una mezcla de un ácido débil y su base conjugada o una base débil y su ácido conjugado. Por ejemplo, tal como se usa en esta invención, un "tampón de ácido 1,4-piperazina dietano sulfónico" se refiere a una mezcla que incluye ácido 1,4-piperazina dietano sulfónico y el anión de 1,4-piperazina dietano sulfonato (por ejemplo, 1,4-piperazina dietano sulfonato de sodio). Asimismo, un "tampón de citrato de sodio", tal como se usa en esta invención, se refiere a una mezcla que incluye citrato de sodio, así como su ácido conjugado, ácido cítrico. Debido al equilibrio químico que se establece entre un ácido débil y su base conjugada, una solución que contiene un tampón resiste cambios bruscos en el pH tras la adición de pequeñas cantidades de ácido o base a la solución.
[0040] Tal como se usa en esta invención, el término "polinucleótido contaminante" se refiere a un polinucleótido que no se deriva de un vector lentiviral. Los polinucleótidos contaminantes pueden incluir, por ejemplo, polinucleótidos no lentivirales derivados de una célula en la que se produjo el vector lentiviral, tal como ADN de mamífero cromosómico (por ejemplo, ADN humano) que no se incluye dentro de un transgén u otro componente de un vector lentiviral.
[0041] Tal como se usa en esta invención, el término "ciclo de congelación/descongelación" se refiere a la exposición de una mezcla líquida, tal como una solución o suspensión acuosa, a una temperatura en o menor que su punto de congelación hasta que la mezcla se congela, seguido de descongelar la mezcla a una temperatura mayor que su punto de congelación. La etapa de congelación se puede realizar, por ejemplo, colocando la mezcla en un entorno en el que la temperatura es de alrededor de - 80°C a alrededor de -20°C. La mezcla puede permanecer congelada, por ejemplo, durante un período de uno o más días, semanas, meses o años antes de descongelarse. La etapa de descongelación se puede realizar exponiendo la mezcla a condiciones en las que la temperatura es de alrededor de 2°C a alrededor de 8°C, o almacenando la mezcla a temperatura ambiente (por ejemplo, la temperatura ambiente de un laboratorio, o alrededor de 25°C). Alternativamente, el descongelamiento puede llevarse a cabo mediante el uso de un baño de agua (por ejemplo, a 37°C).
[0042] Tal como se usa en esta invención, el término "radio hidrodinámico" se refiere al radio aparente (Rh en nm) de una partícula en una solución tal como se infiere de las características de difusión de la partícula. El radio hidrodinámico de una partícula viral es un factor que dicta la velocidad de difusión de la partícula viral en solución acuosa, así como la capacidad de la partícula para migrar en geles de macromoléculas. El radio hidrodinámico de una partícula viral está determinado en parte por la masa y la estructura molecular de cada uno de los componentes de la partícula, así como su estado de hidratación. Los procedimientos para determinar el radio hidrodinámico de una partícula viral son bien conocidos en la técnica e incluyen el uso de dispersión dinámica de luz y cromatografía de exclusión por tamaño.
[0043] Tal como se usa en esta invención, el término "carbohidrato no reductor" se refiere a un carbohidrato que no existe en un estado de equilibrio químico con un aldehído y, por lo tanto, carece de la capacidad de oxidarse a un ácido carboxílico por cationes de metales de transición, tales como plata (Ag+) y cobre (Cu2+). Carbohidratos no reductores ejemplares incluyen, de modo no taxativo, disacáridos tales como sacarosa, trehalosa y palatinitol, trisacáridos tales como rafinosa y melezitosa, así como tetrasacáridos tales como estaquiosa. Los carbohidratos no reductores incluyen adicionalmente derivados de monosacáridos tales como sorbitol, manitol, eritritol y xilitol, derivados de disacáridos tales como lacitol y maltitol, ácidos aldónicos y sus lactonas tales como ácido glucónico, ácido glucónico Y-lactona, ácidos aldáricos y sus lactonas tales como ácido ribaraico, ácido arabinárico y ácido galactárico, ácidos urónicos tales como ácido glucurónico, ácido galaccurónico y ácido itianurónico, derivados de ésteres tales como octaacetato de trehalosa, octaacetato de sacarosa y octaacetato de celobiosa y derivados de éter en los que los grupos hidroxilo están alquilados con O. Los carbohidratos no reductores incluyen aquellos que tienen una orientación estereoquímica D o L.
[0044] Tal como se usa en esta invención, el término "osmolalidad" se refiere a una medida de la presión osmótica de partículas de soluto disueltas en una solución acuosa. Las partículas de soluto incluyen tanto iones como moléculas no ionizadas. La osmolalidad se expresa como la concentración de partículas osmóticamente activas (es decir, osmoles) disueltas en 1 kg de disolvente (es decir, agua). La osmolalidad se expresa en esta invención en unidades de miliosmoles por 1 kg de agua (mOsm/kg).
[0045] Tal como se usa en esta invención, el término "porcentaje en peso por volumen" o "% p/v" denota el porcentaje en peso (en gramos) de un solo componente con respecto al volumen total de la mezcla que contiene el componente. Por ejemplo, 500 mg de un componente en un volumen total de 8 ml es 6,25% p/v, y 500 mg de un componente en un volumen total de 5 ml es 10% p/v.
[0046] Tal como se usa en esta invención, el término "polidispersidad" se refiere al grado de homogeneidad de los tamaños de partículas, tales como partículas lentivirales, dentro de una muestra. Una polidispersidad más alta indica menos homogeneidad y una polidispersidad más baja indica un nivel más alto de homogeneidad. Por ejemplo, cuando el nivel de homogeneidad es alto, se puede considerar que las partículas lentivirales se acercan a tamaños idénticos y, por lo tanto, son monodispersas. Como entenderá un experto en la materia, a medida que la polidispersidad disminuye, el nivel de homogeneidad aumenta. Como tal, una polidispersidad inferior indica un mayor nivel de homogeneidad. Por ejemplo, una formulación con 15% de polidispersidad tiene menos homogeneidad que una formulación con 10% de polidispersidad. Cuando el nivel de homogeneidad es bajo, se puede considerar que la población de partículas contiene tamaños significativamente diferentes y, por lo tanto, es polidispersa.
[0047] Tal como se usa en esta invención, el término "scFv" se refiere a un anticuerpo Fv de cadena simple en el que los dominios variables de la cadena pesada y la cadena ligera de un anticuerpo se han unido para formar una cadena. Los fragmentos scFv contienen una cadena polipeptídica única que incluye la región variable de una cadena ligera de anticuerpo (VL) (por ejemplo, CDR-L1, CDR-L2 y/o CDR-L3) y la región variable de una cadena pesada de anticuerpo (VH) (por ejemplo, CDR-H1, CDR-H2 y/o CDR-H3) separada por un enlazador. El enlazador que une las regiones VL y VH de un fragmento scFv puede ser un enlazador peptídico compuesto de aminoácidos proteinogénicos. Se pueden utilizar enlazadores alternativos para aumentar la resistencia del fragmento scFv a la degradación proteolítica (por ejemplo, enlazadores que contienen aminoácidos D), para mejorar la solubilidad del fragmento scFv (por ejemplo, enlazadores hidrofílicos tales como enlazadores que contienen polietilenglicol o polipéptidos que contienen residuos de glicina y serina repetitivos), para mejorar la estabilidad biofísica de la molécula (por ejemplo, un enlazador que contiene residuos de cisteína que forman enlaces disulfuro intramoleculares o intermoleculares) o para atenuar la inmunogenicidad del fragmento scFv (por ejemplo, enlazadores que contienen sitios de glicosilación). Las moléculas de ScFv son conocidas en la técnica y se describen, por ejemplo, en la patente EE. UU. N° 5.892.019; Flo y col. (Gene 77:51, 1989); Bird y col. (Science 242:423, 1988); Pantoliano y col. (Biochemistry 30:10117, 1991); Milenic y col. (Cancer Research 51:6363, 1991); y Takkinen y col. (Protein Engineering 4:837, 1991). Los dominios VL y VH de una molécula scFv pueden derivarse de una o más moléculas de anticuerpo. Un experto en la materia también entenderá que las regiones variables de las moléculas de scFv de la descripción pueden modificarse de manera que varían en secuencia de aminoácidos de la molécula de anticuerpo de la que se derivaron. Por ejemplo, en un aspecto, se pueden realizar sustituciones de nucleótidos o aminoácidos que conducen a sustituciones o cambios conservadores en los residuos de aminoácidos (por ejemplo, en CDR y/o residuos marco). De manera alternativa o adicional, se realizan mutaciones en los residuos de aminoácidos de CDR para optimizar la unión al antígeno utilizando técnicas reconocidas en la materia. Los fragmentos ScFv se describen, por ejemplo, en WO 2011/084714.
[0048] Tal como se usan en esta invención, las frases "se une específicamente" y "se une" se refieren a una reacción de unión que es determinante de la presencia de una proteína particular en una población heterogénea de proteínas y otras moléculas biológicas que se reconoce, por ejemplo, por un ligando con particularidad. Un ligando (por ejemplo, una proteína, proteoglicano o glicosaminoglicano) que se une específicamente a una proteína se unirá a la proteína con una Kd inferior a 500 nM. Por ejemplo, un ligando que se une específicamente a una proteína se unirá a la proteína con una Kd de hasta 500 nM (por ejemplo, entre 1 pM y 500 nM). Un ligando que no exhibe unión específica a una proteína o un dominio de esta exhibirá una Kd mayor que 500 nM (por ejemplo, mayor que 600 nm, 700 nM, 800 nM, 900 nM, 1 |j M, 100 |j M, 500 |j M o 1 mM) para esa proteína particular o dominio de esta. Se puede usar una variedad de formatos de ensayo para determinar la afinidad de un ligando por una proteína específica. Por ejemplo, los ensayos ELISA de fase sólida se utilizan rutinariamente para identificar ligandos que se unen específicamente a una proteína diana. Véase, por ejemplo, Harlow & Lane, Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Nueva York (1988) y Harlow & Lane, Using Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Nueva York (1999), para una descripción de los formatos y condiciones de ensayo que se pueden usar para determinar la unión específica a proteínas.
[0049] Tal como se usa en esta invención, el término "transgén" puede referirse a una secuencia de ácidos nucleicos que codifica una proteína o producto de ARN funcional que no se expresa naturalmente en la célula en la que se va a introducir el transgén. Alternativamente, un transgén puede ser homólogo a un gen endógeno de la célula en la que se va a introducir el transgén, pero está diseñado para insertarse en el genoma de la célula diana para alterar el genoma de la célula en la que se inserta. Por ejemplo, un transgén puede ser homólogo a un gen endógeno de una célula diana, pero debe insertarse en una posición dentro del genoma de la célula diana que difiera de la posición del gen de origen natural.
[0050] Tal como se usa en esta invención, el término "proteína G del virus de la estomatitis vesicular" o "proteína VSV-G" se refiere a un polipéptido aislado que tiene una homología sustancial con la proteína G del virus de la estomatitis vesicular. Un polipéptido tiene una homología sustancial con la proteína VSV-G, por ejemplo, si exhibe las propiedades de fusión de membrana de la proteína VSV-G de tipo natural. Una proteína VSV-G puede ser, por ejemplo, la proteína VSV-G de longitud completa o un polipéptido que contiene fragmentos de esta, siempre y cuando el polipéptido conserve la capacidad de asociarse con partículas de lípidos de ácido nucleico y facilite la transfección.
[0051] Tal como se usa en esta invención, el término "titulación viral" se refiere a la cantidad de partículas vectoriales infecciosas, o "unidades transductoras", que dan como resultado la producción de un producto transgénico en una célula diana. La titulación viral se puede medir mediante un ensayo funcional, tal como un ensayo descrito en Xiao y col., Exp. Neurobiol. 144:113-124, 1997, o Fisher y col., J. Virol. 70:520-532, 1996.
[0052] De manera alternativa, la titulación viral se puede medir determinando la cantidad de ADN viral que se ha integrado en un genoma de célula hospedadora, por ejemplo, usando técnicas de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) conocidas en la técnica.
[0053] Tal como se usa en esta invención, el término "vector viral" se refiere a una partícula viral que tiene la capacidad de introducir una molécula de ácido nucleico en un hospedador. Los "vectores lentivirales" incluyen vectores virales que incluyen secuencias derivadas del VIH-1. Un vector lentiviral que transporta uno o más genes exógenos se empaqueta en una partícula de virus infecciosa a través del empaque de virus con la ayuda de plásmidos de empaque usando líneas celulares específicas. La partícula del virus infeccioso infecta una célula para lograr la expresión del gen exógeno. Un vector viral "recombinante" se refiere a un vector viral construido por tecnologías recombinantes génicas. Se puede construir un vector viral de recombinación usando procedimientos conocidos en la técnica, tal como transducir una línea celular de empaque con un ácido nucleico que codifica el genoma viral y posteriormente aislar partículas virales recién empaquetadas.
Breve descripción de las figuras
[0054]
La Figura 1 es un diagrama de flujo que ilustra estrategias para la identificación de tampones capaces de estabilizar las preparaciones lentivirales. Una estrategia escalonada (izquierda) para la identificación del tampón implica realizar ensayos de estabilidad, tal como dispersión dinámica de luz (DLS), y determinar la titulación lentiviral (en unidades de transducción, TU) en células transducidas con vectores lentivirales, opcionalmente después de uno o más ciclos de congelación/descongelación (F/T), con el fin de muestrear un amplio intervalo de condiciones de tampón, sal y pH y seleccionar gradualmente para condiciones que promuevan de manera óptima la estabilidad de almacenamiento y la capacidad de transducción. En una estrategia paralela (derecha), varias condiciones de preparación lentiviral se muestrean simultáneamente, y las condiciones que más eficazmente previenen la agregación lentiviral y preservan la infectividad se eligen posteriormente, por ejemplo, para aplicaciones de células T receptoras de antígeno quimérico (CART).
La Figura 2 es una gráfica que muestra la titulación lentiviral (en TU/mL) de células transducidas con preparaciones lentivirales que contienen varios tampones y sales y que exhiben un intervalo de valores de pH de 6,0 a 8,0. La Figura 3 es una serie de gráficos que ilustran diferentes distribuciones de radio hidrodinámico. Una distribución monodispersa monomodal (parte superior) se caracteriza por una sola especie que es probable que sea un monómero lentiviral. Una distribución polidispersa monomodal (media) típicamente indica múltiples especies que a menudo no pueden resolverse mediante dispersión dinámica de la luz, y puede ser una manifestación de una mayor presencia de partículas lentivirales agregadas con respecto a una distribución monodispersa monomodal. Una distribución polimodal polidispersa (parte inferior) indica múltiples especies agregadas de partículas lentivirales que pueden resolverse mediante dispersión dinámica de la luz.
La Figura 4 es una serie de gráficos que demuestran el efecto de un aumento de temperatura en el radio hidrodinámico y la polidispersidad de preparaciones lentivirales que contienen un tampón de histidina.
La Figura 5 es una serie de gráficos que demuestran el efecto de un aumento de temperatura en el radio hidrodinámico y la polidispersidad de preparaciones lentivirales que contienen un tampón de PIPES.
La Figura 6 es una serie de gráficos que demuestran el efecto de un aumento de la temperatura en el radio hidrodinámico y la polidispersidad de preparaciones lentivirales que contienen un tampón de citrato de sodio. La Figura 7 es una serie de gráficos que demuestran el efecto de un aumento de temperatura en el radio hidrodinámico y la polidispersidad de preparaciones lentivirales que contienen un tampón de HEPES.
La Figura 8 es una serie de gráficos que demuestran el efecto de un aumento de temperatura en el radio hidrodinámico y la polidispersidad de preparaciones lentivirales que contienen un tampón de MOPS.
La Figura 9 es una serie de gráficos que demuestran el efecto de un aumento de temperatura en el radio hidrodinámico y la polidispersidad de preparaciones lentivirales que contienen un tampón de MES.
La Figura 10 es una serie de gráficos que demuestran el efecto de un aumento de temperatura en el radio hidrodinámico y la polidispersidad de preparaciones lentivirales que contienen un tampón de fosfato.
La Figura 11 es una serie de gráficos que demuestran el efecto de un aumento de temperatura en el radio hidrodinámico y la polidispersidad de preparaciones lentivirales que contienen un tampón de ácido 3-[4-(2-hidroxietil)piperazin-1 -il]propano-1 -sulfónico (HEPP).
La Figura 12 es una serie de gráficos que demuestran el efecto de un aumento de temperatura en el radio hidrodinámico y la polidispersidad de preparaciones lentivirales que contienen un tampón de 2-amino-2-hidroximetil-propano-1,3-diol (Tris).
La Figura 13 es una serie de gráficos que demuestran el efecto de los cambios en el pH y la concentración de cloruro de sodio en los radios hidrodinámicos de preparaciones lentivirales que contienen tampones de histidina (superior, izquierda), citrato (superior, medio), MOPS (superior, derecha), PIPES (inferior, izquierda), HEPES (inferior, medio) o MES (inferior, derecha). Las condiciones resaltadas con una estrella designan valores de pH y concentraciones de sal que dan como resultado la titulación lentiviral más alta en los experimentos de transducción realizados a temperaturas elevadas (ver, por ejemplo, las Figuras 15 y 16).
La Figura 14 es una serie de gráficos que demuestran el efecto de los cambios en el pH y la concentración de cloruro de sodio en los radios hidrodinámicos de preparaciones lentivirales que contienen tampones de fosfato (izquierda), HEPP (medio) y Tris (derecha). Las condiciones resaltadas con una estrella designan valores de pH y concentraciones de sal que dan como resultado la titulación lentiviral más alta en los experimentos de transducción realizados a temperaturas elevadas (ver, por ejemplo, las Figuras 17 y 18).
La Figura 15 es una serie de gráficos que demuestran el efecto de los cambios en el pH y la concentración de cloruro de sodio en la capacidad de transducción de preparaciones lentivirales que contienen un tampón de histidina (parte superior) o PIPES (parte inferior) a temperaturas elevadas de 42°C (como se indica por "TU42" y 50°C (como se indica por "TU50"). Los valores de TU42 y TU50 mostrados denotan la titulación lentiviral de las células transducidas con la preparación lentiviral indicada a la temperatura indicada, expresada como un porcentaje de la titulación lentiviral de las células transducidas con la preparación lentiviral indicada a 37°C.
La Figura 16 es una serie de gráficos que demuestran el efecto de los cambios en el pH y la concentración de cloruro de sodio en la capacidad de transducción de preparaciones lentivirales que contienen un tampón de citrato (parte superior) o HEPES (parte inferior) a temperaturas elevadas de 42°C (como se indica por "TU42" y 50°C (como se indica por "TU50"). Los valores de TU42 y TU50 mostrados denotan la titulación lentiviral de las células transducidas con la preparación lentiviral indicada a la temperatura indicada, expresada como un porcentaje de la titulación lentiviral de las células transducidas con la preparación lentiviral indicada a 37°C.
La Figura 17 es una serie de gráficos que demuestran el efecto de los cambios en el pH y la concentración de cloruro de sodio en la capacidad de transducción de preparaciones lentivirales que contienen un tampón MOPS (parte superior) o un tampón MES (parte inferior) a temperaturas elevadas de 42°C (como se indica por "TU42" y 50°C (como se indica por "TU50"). Los valores de TU42 y TU50 mostrados denotan la titulación lentiviral de las células transducidas con la preparación lentiviral indicada a la temperatura indicada, expresado como un porcentaje de la titulación lentiviral de las células transducidas con la preparación lentiviral indicada a 37°C.
La Figura 18 es una serie de gráficos que demuestran el efecto de los cambios en el pH y la concentración de cloruro de sodio en la capacidad de transducción de preparaciones lentivirales que contienen un tampón de fosfato (parte superior) o HEPP (parte inferior) a temperaturas elevadas de 42°C (como se indica por "TU42" y 50°C (como se indica por "TU50"). Los valores de TU42 y TU50 mostrados denotan la titulación lentiviral de las células transducidas con la preparación lentiviral indicada a la temperatura indicada, expresada como un porcentaje de la titulación lentiviral de las células transducidas con la preparación lentiviral indicada a 37°C.
La Figura 19 es una serie de gráficos que demuestran el efecto de los cambios en el pH y la concentración de cloruro de sodio en la capacidad de transducción de preparaciones lentivirales que contienen un tampón Tris a temperaturas elevadas de 42°C (como se indica por "TU42" y 50°C (como se indica por "TU50"). Los valores de TU42 y TU50 mostrados denotan la titulación lentiviral de las células transducidas con la preparación lentiviral indicada a la temperatura indicada, expresada como un porcentaje de la titulación lentiviral de las células transducidas con la preparación lentiviral indicada a 37°C.
La Figura 20 es una gráfica que muestra la capacidad de varias preparaciones de vectores lentivirales para mantener la infectividad en ausencia de un carbohidrato después de 3 (izquierda), 6 (centro) o 9 (derecha) ciclos de congelación/descongelación. La infectividad se mide como la cantidad de unidades transductoras del vector lentiviral presentes en cada preparación después del número correspondiente de ciclos de congelación/descongelación como porcentaje de la cantidad de unidades transductoras presentes en la preparación del vector lentiviral antes del primer procedimiento de congelación/descongelación.
La Figura 21 es una gráfica que muestra las infectividades relativas de las preparaciones del vector lentiviral analizadas en ausencia de un carbohidrato después de 3, 6 o 9 ciclos de congelación/descongelación. La infectividad se mide como la cantidad de unidades transductoras del vector lentiviral presentes en cada preparación después del número correspondiente de ciclos de congelación/descongelación como porcentaje de la cantidad de unidades transductoras presentes en la preparación del vector lentiviral antes del primer procedimiento de congelación/descongelación.
La Figura 22 es una tabla que muestra las infectividades relativas de las preparaciones de vectores lentivirales analizadas en ausencia de un carbohidrato después de 3, 6 o 9 ciclos de congelación/descongelación. La infectividad se mide como la cantidad de unidades transductoras del vector lentiviral presentes en cada preparación después del número correspondiente de ciclos de congelación/descongelación como porcentaje de la cantidad de unidades transductoras presentes en la preparación del vector lentiviral antes del primer procedimiento de congelación/descongelación.
La Figura 23 es una tabla que muestra las infectividades relativas de preparaciones de vectores lentivirales seleccionadas en ausencia de un carbohidrato después de 3, 6 o 9 ciclos de congelación/descongelación. La infectividad se mide como la cantidad de unidades transductoras del vector lentiviral presentes en cada preparación después del número correspondiente de ciclos de congelación/descongelación como porcentaje de la cantidad de unidades transductoras presentes en la preparación del vector lentiviral antes del primer procedimiento de congelación/descongelación.
La Figura 24 es una gráfica que muestra la capacidad de preparaciones de vectores lentivirales analizadas para mantener la infectividad en presencia de un carbohidrato después de 3, 6 o 9 ciclos de congelación/descongelación. La infectividad se mide como la cantidad de unidades transductoras del vector lentiviral presentes en cada preparación después del número correspondiente de ciclos de congelación/descongelación como porcentaje de la cantidad de unidades transductoras presentes en la preparación del vector lentiviral antes del primer procedimiento de congelación/descongelación.
La Figura 25 es una tabla que muestra las infectividades relativas de preparaciones de vectores lentivirales analizadas en presencia de un carbohidrato después de 3, 6 o 9 ciclos de congelación/descongelación. La infectividad se mide como la cantidad de unidades transductoras del vector lentiviral presentes en cada preparación después del número correspondiente de ciclos de congelación/descongelación como porcentaje de la cantidad de unidades transductoras presentes en la preparación del vector lentiviral antes del primer procedimiento de congelación/descongelación.
La Figura 26 es una tabla que muestra las infectividades relativas de preparaciones de vectores lentivirales seleccionadas en presencia de un carbohidrato después de 3, 6 o 9 ciclos de congelación/descongelación. La infectividad se mide como la cantidad de unidades transductoras del vector lentiviral presentes en cada preparación después del número correspondiente de ciclos de congelación/descongelación como porcentaje de la cantidad de unidades transductoras presentes en la preparación del vector lentiviral antes del primer procedimiento de congelación/descongelación.
La Figura 27 es una tabla que muestra las infectividades relativas de preparaciones lentivirales seleccionadas en células T primarias. Los detalles con respecto a la medición de la titulación lentiviral se proporcionan en el Ejemplo 7, a continuación.
La Figura 28 es una tabla que compara la estabilidad de un vector lentiviral en tampones de PIPES, de HEPES y de histidina, según se evalúa por el grado de agregación, actividad a alta temperatura, estabilidad de congelacióndescongelación y transducción de linfocitos T primarios.
La Figura 29 es una tabla que muestra los niveles de titulación de lentivirus (%TU) mantenidos después de la purificación en las condiciones indicadas, usando tampón de PIPES, histidina o HEPES.
La Figura 30 es una tabla que muestra el mantenimiento de la titulación de dos vectores lentivirales diferentes (1 y 2) purificados en un tampón basado en PIPES.
La Figura 31 muestra el análisis de dispersión de luz dinámica (DLS) del estado de agregación de un vector lentiviral (vector 1).
La Figura 32 muestra el análisis de dispersión de luz dinámica (DLS) del estado de agregación de un vector lentiviral (vector 2).
La Figura 33 es una gráfica que muestra la estabilidad de un vector lentiviral (vector 2) después de 0, 7, 14 y 21 días a 4°C.
La Figura 34 es una gráfica que muestra la estabilidad de un vector lentiviral (vector 2) después de 1, 3, 6 y 9 ciclos de congelación-descongelación.
Descripción detallada
[0055] La presente invención se basa en el descubrimiento de que las preparaciones lentivirales que contienen un tampón PIPES exhiben propiedades biológicas mejoradas con respecto a las preparaciones lentivirales que contienen un tampón de formulación lentiviral convencional, tal como HEPES. Estas características biológicas mejoradas incluyen resistencia elevada a la agregación a través de un intervalo de temperaturas y concentraciones de sal, capacidad de transducción mejorada a temperaturas fisiológicas y elevadas (tales como 42°C y 50°C) y mayor resistencia a la pérdida de infectividad durante múltiples ciclos de congelación/descongelación. Otros tampones útiles junto con las preparaciones lentivirales de la descripción incluyen tampones de fosfato, tampones de citrato de sodio, tampones MES y tampones MOPS. Las preparaciones lentivirales de la descripción pueden incluir opcionalmente una sal, tal como cloruro de sodio, y pueden contener opcionalmente un carbohidrato, tal como un carbohidrato no reductor (véase más adelante). Tal como se describe en esta invención, los vectores lentivirales para su uso con las composiciones y procedimientos de la invención pueden incluir un transgén, por ejemplo, un gen que codifica proteínas diseñado para la integración en el ADN cromosómico de una célula hospedadora. Además, las preparaciones lentivirales descritas en esta invención se pueden usar junto con técnicas de purificación, tales como procedimientos de filtración y cromatografía, con el fin de purificar vectores lentivirales con una recuperación mejorada. Los procedimientos de la invención también abarcan procedimientos para la transducción de células hospedadoras, tales como células de mamífero (por ejemplo, células T humanas).
Componentes de preparación lentiviral
[0056] Las preparaciones de vectores lentivirales de la descripción pueden incluir una variedad de componentes, tales como una o más sales y/o carbohidratos. Sorprendentemente, las preparaciones de vectores lentivirales descritas en esta invención no requieren un componente de proteína añadido para promover la estabilidad viral. Por lo tanto, cada una de las composiciones descritas en esta invención puede caracterizarse opcionalmente por carecer de componentes de proteína añadidos. Se han probado varios tipos diferentes de albúmina para determinar su capacidad de promover la estabilidad de vectores lentivirales (por ejemplo, albúmina de suero bovino (BSA), albúmina de suero humano (HAS) y HSA recombinante (rH-SA)). rHSA, por ejemplo, a menudo se ha incorporado en preparaciones lentivirales, ya que se produce en levaduras modificadas genéticamente y, por lo tanto, proporciona un mayor nivel de seguridad ya que no es de origen animal (Chuang y col., Pharm. Res. 19:569-577, 2002). Mediante el uso de la presente invención, se pueden evitar HSA y componentes proteicos similares en preparaciones de vectores lentivirales, ya que estas pueden interferir con la caracterización analítica de vectores. La presente invención es única en parte debido a la capacidad de los tampones descritos en esta invención de impartir estabilidad a vectores lentivirales en ausencia de componentes de proteína añadidos. Tal como se demuestra, por ejemplo, en la Figura 2­
19, los tampones descritos en esta invención pueden prevenir la agregación viral, promover una capacidad de transducción mejorada y preservar la infectividad después de múltiples ciclos de congelación/descongelación. Las composiciones descritas en esta invención también pueden caracterizarse opcionalmente como que incluyen o carecen de componentes de carbohidratos añadidos.
[0057] Las preparaciones vectoriales lentivirales de la invención pueden ser mezclas acuosas, tales como soluciones o suspensiones acuosas. Las preparaciones de vectores lentivirales pueden incluir opcionalmente una sal, tal como cloruro de sodio, cloruro de magnesio o cloruro de calcio. La sal puede estar presente, por ejemplo, a una concentración de alrededor de 1 mM a alrededor de 1 M en la preparación lentiviral acuosa (por ejemplo, 1 mM, 2 mM,
3 mM, 4 mM, 5 mM, 6 mM, 7 mM, 8 mM, 9 mM, 10 mM, 15 mM, 20 mM, 25 mM, 30 mM, 35 mM, 40 mM, 45 mM, 50 mM, 55 mM, 60 mM, 65 mM, 70 mM, 75 mM, 80 mM, 85 mM, 90 mM, 100 mM, 125 mM, 150 mM, 175 mM, 200 mM, 225 mM, 250 mM, 275 mM, 300 mM, 325 mM, 350 mM, 375 mM, 400 mM, 450 mM, 475 mM, 500 mM, 525 mM, mM, 600 mM, 625 mM, 650 mM, 675 mM, 700 mM, 725 mM, 750 mM, 775 mM, 800 mM, 825 mM, 850 mM, 875 mM, 900 mM, 925 mM, 950 mM, 957 mM o 1 M). En algunas realizaciones, la concentración de sal es de alrededor de 25 mM a alrededor de 250 mM, alrededor de 50 mM a alrededor de 75 mM, alrededor de 50 mM a alrededor de 200 mM
o alrededor de 100 mM a alrededor de 150 mM (por ejemplo, 25 mM, 30 mM, 35 mM, 40 mM, 45 mM, 50 mM, 55 mM,
60 mM, 65 mM, 70 mM, 75 mM, 80 mM, 85 mM, 90 mM, 100 mM, 125 mM o 150 mM). En algunas realizaciones, la concentración de sal puede ser 50 mM o 75 mM, según se desee.
[0058] Las preparaciones de vectores lentivirales descritas en esta invención pueden presentar un pH, por ejemplo, de alrededor de 5,0 a alrededor de 8,0, por ejemplo, de 6,0 a alrededor de 7,0 (por ejemplo, 6,0, 6,1,6,2, 6,3,
6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9 o 7,0). En algunas realizaciones, el pH de la preparación del vector lentiviral es 6,5.
[0059] Una preparación de vector lentiviral de la invención puede contener opcionalmente un carbohidrato, tal como un carbohidrato no reductor tal como se describe en esta invención. Carbohidratos no reductores ejemplares incluyen sacarosa y trehalosa, entre otros. Cuando se incluye en una preparación de vector lentiviral, un carbohidrato puede estar presente a una concentración de, por ejemplo, de alrededor de 1% a alrededor de 10%, de alrededor de
2,5% a alrededor de 10% o de alrededor de 2,5% a alrededor de 5% en peso por volumen (p/v) de la preparación lentiviral acuosa. Por ejemplo, un carbohidrato, tal como un carbohidrato no reductor descrito en esta invención, puede estar presente dentro de una preparación lentiviral acuosa a una concentración de 1% p/v, 1,5% p/v, 2% p/v, 2,5%
p/v, 3% p/v, 3,5% p/v, 4% p/v, 4,5% p/v, 5% p/v, 5,5% p/v, 6% p/v, 6,5% p/v, 7% p/v, 7,5% p/v, 8% p/v, 8,5% p/v, 9%
p/v, 9,5% p/v o 10% p/v.
[0060] Un vector lentiviral puede estar presente dentro de una preparación lentiviral de la invención dentro de un intervalo de concentraciones. Por ejemplo, un vector lentiviral puede estar presente dentro de una preparación lentiviral a una concentración de, por ejemplo, de alrededor de 2 x 108 unidades de transducción por mililitro (TU/mL) a alrededor de 1 x 109 TU/mL (por ejemplo, 2 x 108 TU/mL, 2,5 x 108 TU/mL, 3 x 108 TU/mL, 3,5 x 108 TU/mL, 4 x 108 TU/mL, 4,5 x 108 TU/mL, 5 x 108 TU/mL, 5,5 x 108 TU/mL, 6 x 108 TU/mL, 6,5 x 108 TU/mL, 7 x 108 TU/mL, 7,5 x 108 TU/mL, 8 x 108 TU/mL, 8,5 x 108 TU/mL, 9 x 108 TU/mL, 9,5 x 108 TU/mL o 1 x 109 TU/mL). Cuando es deseable, una preparación lentiviral puede contener un vector lentiviral a una concentración de alrededor de 3 x 108 TU/mL a alrededor de 5 x 108 TU/mL (por ejemplo, 3 x 108 TU/mL, 3,5 x 108 TU/mL, 4 x 108 TU/mL, 4,5 x 108 TU/mL o 5 x 108 TU/mL).
Expresión transgénica
[0061] Los vectores lentivirales para su uso con las composiciones y procedimientos de la invención pueden incluir un transgén, tal como un transgén que codifica proteínas diseñado para la integración en el ADN cromosómico de una célula diana. Transgenes ejemplares incluyen aquellos que codifican un receptor quimérico de antígeno (CAR). El CAR puede incluir varios dominios, tal como un dominio de unión al antígeno, un dominio transmembrana y uno o más dominios de señalización. En estos casos, los dominios de señalización pueden contener uno o más dominios de señalización primarios (tal como un dominio estimulador CD3-zeta) y/o uno o más dominios de señalización coestimuladores (tal como CD27, CD28, 4-1BB (CD137), OX40, GITR, CD30, CD40, ICOS, BAFFR, HVEM, ICAM-1, antígeno 1 asociado a la función linfocitaria (LFA-1), CD2, CDS, CD7, CD287, LIGHT, NKG2C, NKG2D, SLAMF7, NKp80, NKp30, NKp44, NKp46, CD160, B7-H3 o un ligando que se une específicamente con CD83.
[0062] En determinados casos, el transgén puede incluir un dominio de unión al antígeno (tal como un scFv) que se une a una proteína diana o carbohidrato particular. Antígenos ejemplares incluyen CD19, CD123, CD22, CD30, CD171, CS-1, molécula 1 similar a lectina de tipo C, CD33, variante III del receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFRvIII), gangliósido G2 (GD2), gangliósido GD3, maduración de células B del miembro de la familia de receptores TNF (BCMA), antígeno Tn ((Tn Ag) o (Gal NAca-Ser/Thr)), antígeno de membrana específico de próstata (PSMA), receptor 1 huérfano similar a tirosina quinasa (ROR1), tirosina quinasa 3 similar a Fms (FLT3), glicoproteína 72 asociada a tumor (TAG72), CD38, CD44v6, antígeno carcinoembrionario (CEA), molécula de adhesión de células epiteliales (EPCa M), B7H3 (CD276), KIT (CD117), subunidad alfa-2 del receptor de interleucina-13, mesotelina, receptor alfa de interleucina 11 (IL-11Ra), antígeno de células madre de la próstata (PSCA), Proteasa Serina 21, receptor 2 del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGFR2), antígeno de Lewis(Y), CD24, receptor beta de factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGFR-beta), antígeno embrionario específico de etapa 4 (SSEA-4), CD20, receptor alfa de folato, receptor tirosina-proteína quinasa ERBB2 (Her2/neu), mucina 1, superficie celular asociada (MUC1), receptor de factor de crecimiento epidérmico (EGFR), molécula de adhesión de células neurales (NCAM), prostasa, fosfatasa ácida prostática (PAP), factor de elongación 2 mutado (ELF2M), efrina B2, proteína de activación de fibroblastos alfa (FAP), receptor del factor de crecimiento similar a la insulina 1 (receptor IGF-I), anhidrasa carbónica IX (CAIX), subunidad Proteasoma (Prosoma, Macropaina), tipo beta, 9 (LMP2), glicoproteína 100 (gp100), proteína de fusión oncogénica que consiste en región de clúster de punto de ruptura (BCR) y homólogo oncogénico viral 1 de leucemia murina de Abelson (Abl) (bcr-abl), tirosinasa, receptor 2 de efrina tipo A (EphA2), Fucosil GM1, molécula de adhesión de sialil de Lewis (sLe), gangliósido GM3, transglutaminasa 5 (TGS5), antígeno asociado a melanoma de alto peso molecular (HMWMAA), gangliósido o-acetil-GD2 (OAcGD2), receptor de folato beta, marcador endotelial tumoral 1 (TEM1/CD248), marcador endotelial tumoral 7 relacionado (TEM7R), claudina 6 (CLDN6), receptor hormonal de estimulación tiroidea (TSHR), receptor acoplado a proteína G clase C grupo 5, miembro D (GPRC5D), marco de lectura abierto del cromosoma X 61 (CXORF61), CD97, CD179a, linfoma quinasa anaplásico (ALK), ácido polisálico, específico de la placenta 1 (PLAC1), porción de hexasacárido de glicoceramida globoH (Glo- boH), antígeno de diferenciación de glándula mamaria (NY-BR-1), uroplakina 2 (UPK2), receptor celular del virus de hepatitis A 1 (HAVCR1), adrenoreceptor beta 3 (ADRB3), pannexina 3 (Pa Nx 3), receptor acoplado a proteína G 20 (GPR20), complejo de antígeno linfocitario 6, locus K 9 (LY6K), receptor olfativo 51 E2 (OR51E2), proteína de marco de lectura alternativa TCR Gamma (TARP), proteína tumoral de Wilms (WT1), antígeno de cáncer/testículo 1 (NY-ESO-1), antígeno de cáncer/testículo 2 (LAGE-1a), antígeno asociado a melanoma 1 (MAGE-A1), gen variable de translocación ETS 6, ubicado en el cromosoma 12p (ETV6-AML), proteína espermática 17 (SPA17), familia de antígenos X, miembro 1A (XAGE1), receptor de superficie celular de unión a angiopoietina 2 (Tie 2), antígeno testicular de cáncer melanoma 1 (MAD-CT-1), antígeno testicular de cáncer melanoma 2 (MAD-CT-2), antígeno relacionado con Fos 1, proteína tumoral p53 (p53), mutante p53, prosteina, sobreviviente, telomerasa, antígeno tumoral de carcinoma de próstata 1, antígeno de melanoma reconocido por células T 1, mutante de sarcoma de rata (Ras), transcriptasa inversa de telomerasa humana (hTERT), puntos de ruptura de translocación de sarcoma, inhibidor de melanoma de apóptosis (ML-IAP), ERG (proteasa transmembrana, gen de fusión ETS de serina 2 (TMPRSS2)), N- Acetil glucosaminiltransferasa V (NA17), proteína de caja emparejada Pax-3 (PAX3), receptor de andrógeno, ciclina B1, homólogo derivado del neuroblastoma oncogénico viral de mielocitomatosis aviar v-mic (MYCN), miembro de la familia homóloga Ras C (RhoC), proteína relacionada con tirosinasa 2 (TRP- 2), citocromo P450 1B1 (CYP1B1), factor de unión a CCCTC semejante a (proteína de dedo de zinc), antígeno de carcinoma de células escamosas reconocido por células T 3 (SART3), proteína de caja emparejada Pax-5 (PAX5), proteína de unión a proacrosina sp32 (OY-TES1), proteína tirosina quinasa específica de linfocitos (LCK), proteína de anclaje de quinasa A 4 (AKAP-4), sarcoma sinovial, punto de ruptura X 2 (SSX2), receptor para productos finales de glicemia avanzada (RAGE-1), ubicuo renal 1 (RU1), ubicuo renal 2 (RU2), legumaína, virus del papiloma humano E6 (HPV E6), virus del papiloma humano E7 (HPV E7), carboxil esterasa intestinal, proteína de choque térmico 70-2 mutada (mut hsp70-2), CD79a, CD79b, CD72, receptor similar a inmunoglobulina asociado a leucocitos 1 (LAIR1), fragmento Fc de receptor IgA (FCAR o CD89), miembro 2 de subfamilia A del receptor similar a inmunoglobulina de leucocitos (LILRA2), miembro f de familia semejante a molécula CD300 (CD300LF), miembro A de familia 12 del dominio de lectina tipo C (CLEC12A), antígeno 2 de células estromales de médula ósea (BST2), módulo similar a EGF que contiene hormona similar a mucina 2 (EMR2), antígeno linfocítico 75 (LY75), glicano-3 (GPC3), receptor similar a Fc 5 (FCR5) y polipéptido similar a inmunoglobulina lambda1 (IGLL1).
Procedimientos de purificación de vectores lentivirales
[0063] Los procedimientos de la invención incluyen procedimientos para purificar vectores lentivirales con eficiencia mejorada, por ejemplo, de modo que se recuperen cantidades más altas de vector lentiviral con respecto a la purificación de preparaciones lentivirales que contienen tampones convencionales (por ejemplo, HEPES). Por ejemplo, las preparaciones de vectores lentivirales descritas en esta invención se pueden purificar mediante filtración (por ejemplo, microfiltración o ultrafiltración) y/o mediante cromatografía (por ejemplo, cromatografía de exclusión por tamaño) con recuperación lentiviral elevada. Las técnicas de filtración, tales como las descritas anteriormente y conocidas en la técnica, se pueden utilizar para producir preparaciones lentivirales que están sustancialmente libres de microorganismos y células (por ejemplo, células de mamífero) a partir de las cuales se prepara el vector lentiviral. Adicional o alternativamente, las preparaciones de vector lentiviral de la invención se pueden tratar con nucleasas para producir una preparación sustancialmente libre de polinucleótidos contaminantes (por ejemplo, polinucleótidos no lentivirales derivados de la célula en la que se produjo el vector lentiviral, tal como ADN de mamífero cromosómico, ADN humano, ARN u otros polinucleótidos que no se incluyen dentro del transgén lentiviral).
Ejemplos
[0064] Los siguientes ejemplos se presentan con el fin de proporcionar a los expertos en la materia una descripción de cómo las composiciones y procedimientos descritos en esta invención pueden usarse, realizarse y evaluarse, y están destinados a ser puramente ejemplares de la descripción.
Ejemplo 1. Producción de vectores lentivirales en cu ltivo celular libre de suero
[0065] Se generaron un vector de transferencia génica GFP, un vector de empaque, un vector de expresión rev y un vector de expresión VSV-G. El vector de transferencia génica contiene elementos cPPT y WPRE. En mayor detalle, el vector lentiviral utilizado en el estudio fue la construcción de transferencia autoinactivante pELPS-EGFP, que se basa en la construcción de transferencia de pRRL (Dull y col., J. Virol. 72(11):8463-8471, 1998). pELPS-EGFP se construyó usando pELPS-19- BBz (Milone y col., Mol. Ther. 17(8):1453-1464, 2009) mediante la sustitución del transgén CAR con EGFP. Lentivirus se produjo utilizando un sistema de empaque de tercera generación que consiste en plásmidos pMDLgpRRE, pRSV-Rev y pMD.G (Dull y col., supra), donde el gen de resistencia a la ampicilina fue sustituido por neomicina fosfotransferasa II resistente a la kanamicina.
[0066] La producción viral se realiza a escala de 10 litros. Los reactivos necesarios para generar 10 litros de sobrenadante se describen a continuación. Se sembraron células Expi293F (Life Technologies) a una densidad celular de 5-6x106 células/ml con 96% de viabilidad, que contenían medio Freestyle (Life Technologies) sin suero. Se añadieron 12,5 ml de PEIpro (Polyplus) a 0,25 litros de medio y se añadieron lentamente a la mezcla de plásmidos (12,8 mg de plásmidos en 0,25 litros). Después de 15 minutos de incubación, la mezcla de transfección de 0,5 litros se divide entre matraces de 2 x 5 litros con la adición de otros 2,25 litros de medio FreeStyle por matraz. Después de 24 horas de incubación, las células se centrifugaron a 2000 RPM durante 5 minutos y se descartó el sobrenadante. A esto le sigue la adición de medio de pH 6 (medio FreeStyle, pH ajustado) con 8 mM de butirato de sodio (Sigma). A las 48 horas de transfección, las células se centrifugaron a 2000 rpm durante 5 minutos, y el sobrenadante se guardó para purificación (Cosecha 1). Se añadieron otros 2,5 litros de medio pH 6,0 a cada uno de los matraces de agitación para incubación en un agitador giratorio (incubadora Infors HT, velocidad de agitación 100 RPM, CO2 al 8%, 37°C). La segunda cosecha (cosecha 2) se recogió a las 72 horas, seguida de centrifugación a baja velocidad. Las cosechas de 48 y 72 horas se agruparon y procesaron para purificación adicional. El material parcialmente mezclado se almacenó a 4°C, si necesario.
[0067] Para un medio de 2 x 2,5 litros, se utilizaron 6 |jg de vector de transferencia génica GFP, 3 |jg del vector de empaque, 3 jg del vector de expresión rev y 0,75 jg del vector de expresión VSVG. Una vez que se añade la mezcla de transfección a las células, se agitaron cuidadosamente los matraces de agitación para lograr una mezcla uniforme. Esto es seguido por la incubación de células como se describió anteriormente.
Ejemplo 2. Purificación de vectores lentivirales producidos en cu ltivo celular libre de suero
[0068] La cosecha parcialmente centrifugada de 48 y 72 horas se pasó a través de tres filtros de grado diferencial, filtro de vidrio de 5 micras (GE Healthcare), filtro de polipropileno de 1,2 micras (Sartorius) y filtro de poliétersulfona de 0,6/0,2 micras (GE Healthcare). El tren de filtración elimina células productoras, desechos celulares y orgánulos. Esto es seguido por filtración de flujo tangencial usando 500 membranas de fibra hueca MWCO (GE Healthcare) para una concentración de 100 veces de sobrenadante que contiene virus. El tratamiento con benzonasa (EMD-Milli-poro) se realizó a temperatura ambiente durante 30 minutos con 50 unidades/ml seguido de centrifugación a 3000 RPM durante 20 minutos. Un gránulo blanco es visible, pero hay una pérdida mínima (< 5%) de partículas de virus en el sobrenadante. Se realiza una cromatografía de exclusión por tamaño utilizando PIPES y otros tampones (que muestran una alta estabilidad de los vectores descritos en esta descripción), que sigue a la filtración estéril utilizando filtros de 0,2 micras (EMD Milli-poro).
Ejemplo 3. Preparación de muestra para detección de alto rendimiento de la estabilidad de preparaciones lentivirales
[0069] Las placas de desalación por centrifugación ZEBA™ (7K MWCO, Life Technologies) se intercambiaron en tampón 4 veces con 250 |jl de tampones y sales específicos. Se cargaron 100 |jl de solución madre de virus en cada pocillo seguido de centrifugación a 1000 x g durante 2 minutos. No se observó pérdida de volumen después del intercambio de tampón. Se utilizaron 20-100 j l para cada uno de los análisis (estudios de DLS, infectividad y congelación/descongelación). Para estudiar el efecto de la temperatura sobre la infectividad de los vectores, se llevó a cabo un choque de temperatura en placas de PCR de pared delgada de 96 pocillos en un Ciclador Térmico de Toque C-1000 (intervalo de 25 a 55°C durante una hora).
Ejemplo 4. Análisis de agregación lentiviral mediante dispersión dinámica de la luz en detecciones de alto rendim iento
[0070] Se pipetearon 20 j l de vector lentiviral recombinante purificado (106 -107 TU/ml) en una placa de 384 pocillos (base de poliestireno negro, placa hidrofílica, Greiner Bio). La placa se centrifugó para eliminar las burbujas de aire atrapadas a 2000 RPM durante 3 minutos a temperatura ambiente, seguido de sellado con sello Microseal 'B' (Bio-Rad). Esto se colocó en el lector de placas DynaPro (Wyatt Technology Corporation, CA, EE. UU.) equipado con un láser de 830 nm y un módulo de control de temperatura. El software Dynamics® (Versión 7.1.8.93, Wyatt Technology Corporation) se utilizó para la adquisición y análisis programado de datos. Se tomaron cinco mediciones de 5 segundos para cada pocillo. Se midió una única placa de 384 pocillos sellada a 25°C, seguida de incubación a 37°C durante 2 horas, y se midió como se describe. El mismo procedimiento se repitió para 42°C, 50°C y 55°C. El análisis de regularización se realizó utilizando algoritmo incluido con el software DynamicsR. El corte de la función de correlación superior e inferior fue de 0,5 y 1 x 106 js , respectivamente. El radio hidrodinámico del pico lentiviral se asignó como 50-200 nm.
Ejemplo 5. Determinación de titu lación lentiviral en detecciones de alto rendimiento
[0071] La titulación del vector lentiviral incluye una titulación funcional calculada por la cantidad de células que expresan la proteína GFP codificada por el gen transportado (TU/ml). Las células HEK293T se sembraron a una densidad determinada (2x104/pocillo) en una placa de 96 pocillos (Corning, fondo plano) a un volumen de 50 j l de medio D-MEM (Life Technologies) que contenía 10% de suero fetal bovino (Life Technologies) y 8 jg/m l de polibreno (EMD Millipore). El virus estándar de GFP diluido y las muestras se prepararon en DMEM completo y se añadieron (50 j l ) a las células.
[0072] Se prepararon diluciones en serie de 10 veces de soluciones de virus en una serie de diluciones con DMEM como diluyente. Las placas de 96 pocillos se incubaron en una incubadora de CO2 a 37°C durante 72 horas. Las células se trataron con tripsina seguida de la adición de 200 j l de DMEM completo. La placa se centrifugó a 1000 RPM durante 10 minutos y el medio se intercambió con 200 j l de tampón de flujo autoM-ACS (Miltenyi Biotec). A esto le siguió el análisis de GFP realizado en Guava Viacount (e Md Millipore). El recuento celular y la salud de las células no transducidas se monitorearon en el momento de la cosecha.
Ejemplo 6. Análisis de la estabilidad lentiviral después de ciclos repetitivos de congelación/descongelación
[0073] Para abordar la pérdida de infectividad con ciclos repetidos de congelación/descongelación, se congelaron pequeñas alícuotas (~100 j l) de vectores lentivirales a -80°C durante 20 minutos, seguido de un descongelamiento lento a temperatura ambiente durante 20 minutos (lo que representa un peor escenario). Los ciclos de congelación/descongelación se realizaron durante 3, 6, 9 ciclos y la actividad del vector se comparó con el control. El análisis de tendencias se realizó utilizando Spotfire donde un alto valor significa la preservación de la actividad de los vectores lentivirales.
Ejemplo 7. Determinación de la titu lación lentiviral en células T primarias
[0074] Viales que contenían PBMC de tres donantes sanos se descongelaron, centrifugaron y resuspendieron en medio Ex-Vivo (Lonza) complementado con suero AB humano al 2% (Access) e IL-2 (Prometheus Ther.). Las células se contaron y sembraron a una densidad de 1,6 x 106 células/ml en 100 jL en duplicados para cada donante. Se lavaron perlas anti-CD3/CD28 (Life Technologies) en medio simple Ex-vivo y se agregaron a una densidad final de perlas de 4,8 x 105 perlas/pocillo. Las células se colocaron en incubadora a 37° C a 5% de CO2.
[0075] Se descongelaron alícuotas de vectores lentivirales a temperatura ambiente y se prepararon diluciones en serie en una forma de dilución 1:3 en medio Ex-Vivo. Las alícuotas vectoriales utilizadas fueron GFP (solución madre 26Sept14, JDG, 250 jL ), Lentigen (Lentigen Corp, hCART019, LN0127-0214-064) y cuatro formulaciones diferentes de un vector GFP de la siguiente manera: AD1 (His 20 mM, NaCl 100 mM, sacarosa al 2,5% pH6,5), AD2 (Citrato 20 mM, NaCl 75 mM, sacarosa al 2,5% pH 6,5), AD3 (HEPES 20 mM, NaCl 75 mM, sacarosa al 2,5%, pH 7) y AD4 (PIPES 20 mM, NaCl 75 mM, sacarosa al 2,5%, pH 6,5).
[0076] Las células se dividieron 1:3 el día 3 al resuspender las células y agregar 60 jL de suspensión celular en 120 jL de medio simple Ex-vivo en pocillos correspondientes de placa nueva. Las células se devolvieron a la incubadora. Las células se dividieron nuevamente el día 5 en 1:2 en placas nuevas (90 pL de células en 110 pL de medio simple Ex-Vivo) y se volvieron a la incubadora.
[0077] Se agruparon las células de cada placa; se eliminaron las perlas en una alícuota colocando la suspensión celular en el imán y tomando sobrenadante y contando con la solución de Guava Viacount a una dilución 1:l0. A continuación, se centrifugaron 200 pL de células a 1000 rpm durante 5 minutos a 20°C y se resuspendieron en 200 pL de tampón AutoMacs (Miltenyi), se transfirieron a una nueva placa de 96 pocillos de fondo en U y se midieron por fluorescencia GFP usando el instrumento Guava (Millipore). Se calculó el porcentaje de células transducidas con GFP. Las células transducidas con Lentigen Vector se centrifugaron a 1000 rpm durante 5 minutos a 20°C y se tiñeron usando una mezcla de tampón AutoMacs y anticuerpo anti-idiotipo marcado con PE a una dilución 1:160 (con un pocillo sin manchar). La preparación se dejó en la oscuridad a temperatura ambiente y se lavó dos veces en 200 pL de tampón AutoMacs. Las células se resuspendieron en 200 pL de tampón AutoMacs y se monitorearon usando instrumento Guava. Los titulaciones como TU/mL para GFP y Lentigen se calcularon en función de la fórmula: Células a D0* (% células transducidas/100)/volumen de virus (mL).
Ejemplo 8. Resumen de resultados experimentales - Estudios de estabilidad
[0078] Los estudios de detección se llevaron a cabo utilizando una estrategia paralela (Fig. 1) para identificar condiciones que se pueden usar para estabilizar vectores lentivirales. La estabilidad de un vector lentiviral comercialmente disponible (Lentigen) se evaluó en un tampón de detección, pH y condiciones de sal variables, como se indica en la Fig. 2. El vector lentiviral se incubó durante la noche (alrededor de 18 horas) a temperatura ambiente (alrededor de 25°C). La estabilidad se determinó mediante la evaluación de la titulación (TU/ml) utilizando el procedimiento descrito en el Ejemplo 5 anterior. El tampón de PIPES con NaCl estabilizó el vector casi en la misma medida que la formulación de control (Formulación de Lentigen), que puede incluir excipientes además de componentes de tampón y sal. El vector lentiviral utilizado en este experimento fue CAR19 LV de Lentigen. Todos los demás estudios descritos en este ejemplo utilizaron el GFP-LV descrito en el Ejemplo 1 anterior.
[0079] Se determinaron distribuciones de radio hidrodinámicas de diversas formulaciones para evaluar los niveles de agregación vectorial de lentivirus (Fig. 3), utilizando procedimientos descritos en el Ejemplo 4, anterior.
[0080] La Figura 4 muestra que el tampón de histidina (histidina 20 mM, NaCl 50-150 mM, pH 6,0, 6,5 y 7,0) tiene una tendencia muy baja para la agregación del vector lentiviral con aumento de temperatura (monitoreado por el cambio en Rh). La Fig. 5 muestra que el vector lentiviral en PIPES 20 mM, pH 6,5 con concentraciones de NaCl que varían de 50-150 mM, no mostró tendencia a la agregación a todas las temperaturas (con la excepción de NaCl 100 mM a 55°C). Además, el vector lentiviral en PIPES 20 mM, pH 7,0 con NaCl que varía de 50-150 mM, mostró tendencias de agregación a temperaturas de 42-55°C. La Figura 6 muestra que el tampón de citrato (citrato 20 mM, NaCl 50-150 mM, pH 6,0, 6,5) tiene una tendencia muy baja para la agregación del vector lentiviral con aumentos de temperatura (monitoreado por el cambio en Rh). La Fig. 7 muestra que el tampón HEPES (HEPES 20 mM, NaCl 50­ 150 mM, pH 7,0, 7,5 y 8,0) tiene grandes propensiones de agregación a pH 7,5 y 8,0, mientras que pH 7,0 preserva el virus monomérico a diferentes temperaturas. La Figura 8 muestra que el tampón MOPS (MOPS 20 mM, NaCl 50­ 150 mM, pH 6,5, 7,0 y 7,5) tiene una alta propensión de agregación a pH 6,5 y 7,0 a NaCl 50 mM y todas las condiciones a pH 7,5. Solo MOPS 20 mM, NaCl 75 mM, pH 6,5 muestra agregación a temperatura alta (55°C, que es significativamente alta ya que el virus nunca estaría expuesto a tal temperatura en una situación real). La Figura 9 muestra que el tampón MES (MES 20 mM, NaCl 50-150, pH 6,0 y 6,5) tiene una baja propensión de agregación del vector lentivirus en estas condiciones. La Figura 10 muestra que el tampón de fosfato (fosfato 20 mM, NaCl 50-150 mM, pH 6,5, 7,0, 7,5, 8,0) tiene una baja propensión de agregación del vector de lentivirus a pH 6,5; todas las demás condiciones de pH tienen una mayor propensión de agregación. La Figura 11 muestra que para el tampón de HEPP (HEPP 20 mM, NaCl 50-150 mM, pH 7,5 y 8,0), todas las condiciones promueven la agregación de Lv (excepto a 25°C). La Figura 12 muestra que para el tampón de Tris (Tris 20 mM, NaCl 50-150 mM, pH 7,5 y 8,0), todas las condiciones promueven la agregación de LV (excepto a 25°C).
[0081] Estos resultados muestran que se puede obtener una estabilidad mejorada de un vector lentiviral en tampones de histidina, citrato, MOPS, PIPES y MES. Se utilizó DLS para medir el radio hidrodinámico de las partículas lentivirales. Debido a que DLS es un ensayo semicuantitativo, nos basamos en el análisis de tendencias sobre la agregación a diferentes temperaturas (baja a alta).
[0082] Se llevó a cabo un análisis adicional para determinar la robustez de Rh en diferentes condiciones de amortiguación (Figuras 13-19). Los análisis incluyeron DLS (véase, por ejemplo, el Ejemplo 4 anterior) y determinación de la titulación (véase el Ejemplo 5 anterior). La Figura 13 muestra que los tampones de histidina, citrato, MOPS, PIPES, HEPES y MES promueven selectivamente la estabilidad al vector lentiviral en monómeros estabilizantes, según lo evaluado únicamente por DLS. La Figura 14 muestra que los tampones basados en fosfato, HEPP y Tris no ofrecen ninguna acción protectora de la agregación a alta temperatura, según lo evaluado únicamente por d Ls .
[0083] Las Figuras 15-19 muestran los resultados de estudios en los que se analizan juntos dos criterios (protección contra la agregación y protección contra la pérdida de infectividad a altas temperaturas). La Figura 15 muestra que los tampones de histidina y PIPES proporcionan estabilidad incluso a altas temperaturas para preservar la infectividad (con combinaciones únicas de pH y sal). La Figura 16 muestra que el tampón de citrato proporciona protección contra la pérdida de infectividad en comparación con HEPES a altas temperaturas, mientras que la Figura 17 muestra que los tampones de MOPS y MES proporcionan protección contra la pérdida de infectividad a altas temperaturas. La Figura 18 muestra que el tampón de fosfato proporciona protección contra la pérdida de infectividad en comparación con HEPP a altas temperaturas, mientras que la Figura 19 muestra que el tampón de Tris no proporciona protección contra la pérdida de infectividad a altas temperaturas. Estos resultados muestran que los tampones seleccionados (por ejemplo, histidina, PIPES, citrato, etc.) tienen efectos estabilizadores significativos para preservar la infectividad y los monómeros, según lo determinado por dos técnicas analíticas ortogonales.
[0084] Se llevaron a cabo estudios de congelación para evaluar aún más la estabilidad. Los procedimientos utilizados se describen en el Ejemplo 6 anterior. La Figura 20 muestra el número de condiciones en las que los vectores lentivirales sobrevivieron a tres, seis y nueve ciclos de congelación-descongelación, con una retención de titulación superior al 65%. La Fig. 21 muestra que la cinética de inactivación de vectores lentivirales de los ciclos de congelacióndescongelación tercero, sexto y noveno diferenciaron tampones que proporcionan alta o baja estabilidad para los vectores. El análisis de los datos (véase, por ejemplo, la Figura 22) identificó cinco condiciones en las que los vectores lentivirales sobrevivieron nueve ciclos de congelación-descongelación con una retención de titulación superior al 65%. Los detalles de estas condiciones se exponen en la Fig. 23.
[0085] Se llevaron a cabo estudios adicionales para evaluar los efectos de incluir un carbohidrato, sacarosa, en el mantenimiento de la estabilidad después de múltiples ciclos de congelación-descongelación. Se emplearon los procedimientos del Ejemplo 6 anterior para estos experimentos. Para los tampones a base de citrato, HEPES y PIPES, no hay pérdida de actividad de vectores de lentivirus, en comparación con el tampón de histidina, que muestra alrededor de 20% de pérdida de actividad después del noveno ciclo de congelación-descongelación (ver Figuras 24 y 25). Ejemplos de condiciones de tampón estabilizante seleccionadas con carbohidratos se muestran en la Figura 26.
[0086] Las titulaciones virales se evaluaron en células T primarias, utilizando los procedimientos descritos en el Ejemplo 7 anterior. Los resultados se exponen en la Fig. 27. Se descubrió que tampones de PIPES y citrato proporcionan una titulación muy alta en células primarias, lo que muestra una transducción eficiente en células. HEPES y tampones de histidina también proporcionaron titulaciones altos. Todas las condiciones identificadas superaron al vector comercial adquirido de Lentigen Corp. (formulación comercial, desconocido).
[0087] En la Figura 28 se expone una comparación de determinados resultados de los estudios de estabilidad utilizando tampones de PIPES, HEPES e histidina. Los resultados de agregación muestran un aumento en el radio hidrodinámico del vector de lentivirus en función de la temperatura, según lo medido por DLS. Se muestran los valores medios con un pH específico (con NaCl 50-150 mM). La actividad del vector de lentivirus a alta temperatura se evaluó en células 293T. Los valores a 50°C se compararon con los valores a 25°C. Se muestran los valores medios con un pH específico (con NaCl 50-150 mM). La actividad de un vector de lentivirus en células 293T después del noveno ciclo de congelación-descongelación se muestra como un ejemplo para indicar la estabilidad del vector de lentivirus (>100% de actividad que significa sin pérdida de actividad; el ensayo es variable como un ensayo in vivo). La actividad del vector de lentivirus en células T primarias se muestra como una prueba adicional para la capacidad de transducción. El vector lentiviral en tampón de PIPES fue capaz de transfectar ~ 25% y ~ 35% más células T primarias, en comparación con el vector lentiviral en tampón de HEPES e histidina, respectivamente. Por lo tanto, el tampón de PIPES proporciona una alternativa a la formulación estándar basada en HEPES porque, por ejemplo, los vectores lentivirales son más estables en el tampón de PIPES. Además, los vectores lentivirales en tampón de PIPES fueron capaces de transfectar ~ 20-25% más células T primarias en comparación con tampones de HEPES e histidina
Ejemplo 9. Purificación de vectores lentivirales en tampones de PIPES, histidina y HEPES
[0088] Los vectores lentivirales se produjeron y purificaron utilizando los procedimientos descritos en los Ejemplos 1 y 2 anteriores. Se lleva a cabo una etapa de purificación post cromatográfica, que implica el paso a través de un filtro de 0,2 micras, para mantener la esterilidad. Como la baja recuperación puede resultar de la purificación, debido a la agregación, se probaron diferentes tampones para identificar las condiciones que dan como resultado una recuperación óptima. Como se muestra en la Fig. 29, el tampón de PIPES mostró una mejor recuperación, en comparación con los tampones de HEPES e histidina.
Ejemplo 10. Estabilización de vectores lentivirales adicionales
[0089] Como se señaló anteriormente, los estudios llevados a cabo anteriormente se realizaron utilizando vectores lentivirales de GFP (excepto por los estudios de estabilidad ilustrados en la Fig. 2, como se indicó anteriormente). Se llevaron a cabo experimentos adicionales, que muestran que un tampón basado en PIPES (PIPES 20 mM, pH 6,5, NaCl 75 mM, sacarosa al 2,5%) es eficaz para estabilizar dos vectores lentivirales adicionales (vectores 1 y 2) que expresan un transgén diferente.
[0090] Se purificaron dos vectores lentivirales, presentes en un tampón basado en PIPES (PIPES 20 mM, pH 6,5, NaCI 75 mM, sacarosa al 2,5%) utilizando un procedimiento que incluye las etapas de microfiltración, filtración de flujo tangencial (TFF), tratamiento con benzonasa, centrifugación, cromatografía de exclusión por tamaño (SEC) y filtración estéril. Las muestras se obtuvieron del retenido de TFF y se mantuvieron durante 4 días a -80°C o 4°C. Además, las muestras se obtuvieron del eluido por SEC y se mantuvieron durante 3 días a -80°C o 4°C. Las titulaciones virales se obtuvieron de las muestras antes y después de los períodos de retención. Ambos vectores fueron estables en el tampón de PIPES durante la purificación. Como se muestra en la Fig. 30, no se encontraron cambios significativos en la actividad, según lo medido por determinaciones de titulación, durante el almacenamiento a corto plazo de las muestras de TFF y SEC a -80°C o 4°C.
[0091] Se utilizó dispersión de luz dinámica para evaluar el estado de agregación de los vectores almacenados en tampón de PIPES (PIp Es 20 mM, pH 6,5, NaCl 75 mM, sacarosa al 2,5%). Como se muestra en las Figuras 31 y 32, se encontró que ambos vectores eran monoméricos en la formulación PIPES a 25°C, con el d, nm determinado siendo alrededor de 140 nm. Los procedimientos utilizados son como se describe en el Ejemplo 4, anterior.
[0092] La estabilidad del vector purificado 2 se evaluó después del almacenamiento en tampón de PIPES (PIPES 20 mM, pH 6,5, NaCl 75 mM, sacarosa al 2,5%) a 4°C durante tres semanas. Tal como se muestra en la Figura 33, este vector mantiene una alta estabilidad en estas condiciones, tal como se mide mediante la determinación de titulaciones en células 293T, así como el porcentaje de actividad restante en comparación con un control (4°C, Día 0; la primera barra en la Figura 33, actividad de control se toma como 100%). Las barras del eje x muestran actividades en los días 14 y 21, respectivamente (expresadas como porcentaje vs. control).
[0093] En estudios adicionales, se evaluó la estabilidad de congelación-descongelación del vector 2 en tampón de PIpES (PIPES 20 mM, pH 6,5, NaCl 75 mM, sacarosa al 2,5%) (véase el Ejemplo 6, anterior, para procedimientos). Tal como se muestra en la Figura 34, este vector mantiene una alta estabilidad después de múltiples ciclos de congelación-descongelación (se llevaron a cabo hasta 9 ciclos), tal como se midió mediante la determinación de titulaciones en células 293T, así como el porcentaje de actividad restante en comparación con un control (titulación después de 1 ciclo de congelación-descongelación, ya que la muestra lentiviral purificada se almacena a -80°C inmediatamente después de la purificación). La actividad de la muestra de control se toma como 100%, representada en la primera barra en la Figura 34. Las barras del eje x muestran actividades residuales (en porcentaje) después de 3, 6 y 9 ciclos de congelación-descongelación (expresados como porcentaje vs. control).

Claims (18)

REIVINDICACIONES
1. Una composición acuosa que comprende un vector lentiviral, un tampón de ácido 1,4-piperazina dietano sulfónico (PIPES) y una sal.
2. La composición acuosa de la reivindicación 1, donde
(a) dicho tampón de PIPES está presente a una concentración de alrededor de 10 mM a alrededor de 50 mM, por ejemplo, alrededor de 20 mM;
(b) el pH de dicha composición acuosa es de alrededor de 6,0 a alrededor de 7,0, por ejemplo, alrededor de 6,5; (c) dicha sal se selecciona del grupo que consiste en cloruro de sodio, cloruro de magnesio y cloruro de calcio, por ejemplo, dicha sal es cloruro de sodio;
(d) la concentración de dicha sal en dicha composición acuosa es de aproximadamente 25 mM a aproximadamente 150 mM, por ejemplo, aproximadamente 50 mM o aproximadamente 75 mM; y/o
(e) dicha composición acuosa comprende PIPES 20 mM y cloruro de sodio 75 mM, y donde dicha composición acuosa tiene un pH de alrededor de 6,5.
3. La composición acuosa de la reivindicación 1 o 2, donde
(a) dicha composición acuosa comprende además un carbohidrato, opcionalmente donde dicho carbohidrato es
(i) un carbohidrato no reductor, por ejemplo, un carbohidrato no reductor seleccionado del grupo que consiste en sacarosa y trehalosa; y/o
(ii) presente en una concentración de alrededor de 1% a alrededor de 10%, alrededor de 2% a alrededor de 5% o alrededor de 2,5% en peso por volumen de dicha composición acuosa;
(b) dicha composición acuosa comprende PIPES 20 mM, cloruro de sodio 75 mM y sacarosa al 2,5% en peso por volumen de dicha composición acuosa, y donde dicha composición acuosa tiene un pH de alrededor de 6,5; y/o (c) la osmolalidad de dicha composición acuosa es de aproximadamente 270 mOsm/kg a aproximadamente 330 mOsm/kg, aproximadamente 275 mOsm/kg a aproximadamente 300 mOsm/kg o aproximadamente 285 mOsm/kg.
4. La composición acuosa de cualquiera de las reivindicaciones 1-3, donde dicho vector lentiviral
(a) está presente a una concentración de alrededor de 2 x 1078 unidades de transducción por mililitro (TU/mL) a alrededor de 1 x 109 TU/mL, por ejemplo, de alrededor de 3 x 108 TU/mL a alrededor de 5 x 108 TU/mL;
(b) es un virus de inmunodeficiencia humana recombinante; y/o
(c) comprende la proteína G del virus de la estomatitis vesicular (VSV-G), opcionalmente donde dicha proteína VSV-G está presente en la superficie de dicho vector lentiviral.
5. La composición acuosa de cualquiera de las reivindicaciones 1-4, donde dicho vector lentiviral comprende un transgén, opcionalmente donde dicho transgén codifica una proteína.
6. La composición acuosa de la reivindicación 5, donde dicha proteína comprende un receptor de antígeno quimérico (CAR), opcionalmente donde dicho CAR comprende, en una dirección de extremo N a extremo C, un dominio de unión a antígeno, un dominio transmembrana y uno o más dominios de señalización.
7. La composición acuosa de la reivindicación 6, donde dichos dominios de señalización comprenden uno o más dominios de señalización primarios y/o uno o más dominios de señalización coestimuladores, opcionalmente donde
(a) uno de dichos uno o más dominios de señalización primarios comprende un dominio estimulador CD3-zeta; y/o (b) uno o más de dichos dominios de señalización coestimuladores comprenden un dominio intracelular seleccionado de una proteína coestimuladora seleccionada del grupo que consiste en CD27, CD28, 4-1BB (CD137), OX40, GITR, CD30, CD40, ICOS, BAFFR, HVEM, ICAM-1, antígeno 1 asociado a la función de los linfocitos (LFA-1), CD2, CDS, CD7, CD287, LIGHT, NKG2C, NKG2D, SLAMF7, NKp80, NKp30, NKp44, NKp46, CD160, B7-H3 y ligando que se une específicamente con CD83, p. ej., dicho uno o más de dichos dominios de señalización coestimuladores comprende el dominio coestimulador 4-1BB (CD137) y/o el dominio coestimulador CD28.
8. La composición acuosa de la reivindicación 6 o 7, donde
(a) dicho dominio de unión a antígeno es un scFv;
(b) dicho dominio de unión al antígeno se une opcionalmente a un antígeno seleccionado del grupo que consiste en CD19; CD123; CD22; CD30; CD171; CS-1; molécula 1 semejante a lectina de tipo C, CD33; variante III del receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFRvIII); gangliósido G2 (GD2); gangliósido GD3; maduración de células B del miembro de la familia del receptor TNF (BC BC); antígeno Tn ((Tn Ag) o (GalNAca- Ser/Thr)); antígeno de membrana específico de la próstata (PSMA); receptor 1 huérfano tipo tirosina quinasa (ROR1); Tirosina Quinasa 3 similar a Fms (FLT3); Glicoproteína 72 asociada a tumor (TAG72); CD38; CD44v6; Antígeno carcinoembrionario (CEA); Molécula de adhesión de células epiteliales (EPCAM); B7H3 (CD276); KIT (CD117); Subunidad alfa-2 del receptor de interleucina-13; mesotelina; Receptor alfa de interleucina 11 (IL-11Ra); Antígeno de células madre de próstata (PSCA); Proteasa Serina 21; Receptor 2 del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGFR2); Antígeno de Lewis(Y); CD24; Receptor beta del factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGFR-beta); Antígeno 4 específico de la etapa embrionaria (SSEA-4); CD20; receptor de folato alfa; receptor de tirosina-proteína quinasa ERBB2 (Her2/neu); Mucina 1, asociada a la superficie celular (MUC1); receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR); molécula de adhesión celular neural (NCAM); Prostasa; fosfatasa ácida prostética (PAP); factor de elongación 2 mutado (ELF2M); efrina B2; proteína de activación de fibroblastos alfa (FAP); receptor del factor de crecimiento similar a la insulina 1 (receptor IGF-I), anhidrasa carbónica IX (CAIX); subunidad Proteasoma (Prosoma, Macropaina), Tipo Beta, 9 (LMP2); glicoproteína 100 (gp100); proteína de fusión oncogénica que consiste en región de clúster de punto de ruptura (BCR) y homólogo oncogénico viral de leucemia murina de Abelson 1 (Abl) (bcr-abl); tirosinasa; receptor de eprina tipo A 2 (EphA2); Fucosil GM1; molécula de adhesión de sialil de Lewis (sLe); gangliósido GM3; transglutaminasa 5 (TGS5); antígeno asociado a melanoma de alto peso molecular (HMWMAA); gangliósido o-acetil-GD2 (OAcGD2); receptor de folato beta; marcador endotelial tumoral 1 (TEM1/CD248); marcador endotelial tumoral relacionado con 7 (TEM7R); claudina 6 (CLDN6); receptor de hormona estimulante de la tiroides (TSHR); receptor acoplado a proteína G clase C grupo 5, miembro D (GPRC5D); marco de lectura abierto del cromosoma X 61 (CXORF61); CD97; CD179a; Quinasa de linfoma anaplásico (ALK); ácido polisálico; específico de placenta 1 (PLAC1); porción de hexasacárido de glicoceramida globoH (GloboH); antígeno de diferenciación de glándula mamaria (NY-BR-1); uroplaquina 2 (UPK2); receptor celular del virus de la hepatitis A 1 (HAVCR1); adrenoceptor beta 3 (a Dr B3); pannexina 3 (PANX3); receptor acoplado a proteína G 20 (GPR20); complejo de antígeno linfocitario 6, locus K 9 (LY6K); receptor olfativo 51E2 (OR51E2); proteína de marco de lectura alternativa TCR Gamma (TARP); proteína tumoral de Wilms (WT1); antígeno 1 de cáncer/testículo (NY-ESO-1); antígeno 2 de cáncer/testículo (LA- GE -1a); antígeno 1 asociado a melanoma (MAGE-A1); gen 6 de variante de translocación ETS, ubicado en el cromosoma 12p (ETV6-AML); proteína 17 de esperma (SPA17); Familia del antígeno X, Miembro 1A (XAGE1); receptor de superficie celular de unión a angiopoyetina 2 (Tie 2); antígeno testicular de cáncer de melanoma 1 (MAD-CT-1); antígeno testicular de cáncer de melanoma 2 (MAD-CT-2); antígeno relacionado con Fos 1; proteína tumoral p53 (p53); mutante p53; prosteina; sobreviviente; telomerasa; antígeno tumoral de carcinoma de próstata 1, antígeno de melanoma reconocido por células T 1; mutante de sarcoma de rata (Ras); transcriptasa inversa de telomerasa humana (hTERT); puntos de ruptura de la translocación del sarcoma; inhibidor de apóptosis de melanoma (ML-IAP); ERG (proteasa transmembrana, gen de fusión ETS de serina 2 (TMPRSS2)); N-acetil glucosaminil-transferasa V (NA17); proteína de caja emparejada Pax-3 (PAX3); receptor de andrógeno; ciclina B1; homólogo derivado del neuroblastoma oncogénico viral de mielocitomatosis aviar v-myc (MYCN); Miembro C de la familia homóloga a Ras (RhoC); proteína relacionada con tirosinasa 2 (TRP-2); citocromo fP450 1B1 (CYP1B1); factor de unión a CCCTC (proteína de dedos de zinc)similar al antígeno de carcinoma de células escamosas reconocido por células T 3 (SART3); proteína de caja emparejada Pax-5 (PAX5); proteína de unión a proacrosina sp32 (OY t ES1); proteína tirosina quinasa específica de linfocitos (LCK); proteína de anclaje a quinasa A 4 (AKAP- 4); sarcoma sinovial, punto de ruptura X 2 (SSX2); receptor de productos finales de glicación avanzada (RAGE-1); ubicua renal 1 (RU1); ubicua renal 2 (RU2); legumaína; virus del papiloma humano E6 (HPV E6); virus del papiloma humano E7 (HPV E7); carboxil esterasa intestinal; proteína de choque térmico 70-2 mutada (mut hsp70-2); CD79a; CD79b; CD72; receptor similar a inmunoglobulina asociado a leucocitos 1 (LAIR1); fragmento Fc del receptor IgA (FCAR o CD89); miembro 2 de la subfamilia A del receptor similar a inmunoglobulina de leucocitos (LILRA2); miembro f de familia de moléculas similares a CD300 f (CD300LF); miembro A de la familia de dominios de lectina C 12 (CLEC12A); antígeno de células estromales de médula ósea 2 (BST2); módulo similar a EGF que contiene hormona similar a mucina 2 (EMR2); antígeno linfocítico 75 (YL75); Glipican-3 (GPC3); Fc similar a receptor 5 (FCRL5); y polipéptido tipo lambda de inmunoglobulina 1 (IGLL1), p.ej., donde dicho dominio de unión a antígeno se une a CD19, mesotelina o CD123; y/o
(c) dicho c Ar comprende un anticuerpo anti-CD19 o un fragmento de este, un dominio transmembrana 4-1BB (CD137) y un dominio de señalización CD3-zeta.
9. La composición acuosa de cualquiera de las reivindicaciones 1-8, donde
(a) dicha composición acuosa está libre de una o más proteínas seleccionadas del grupo que consiste en albúmina sérica humana (HSA), albúmina sérica humana recombinante (rHSA), albúmina sérica bovina (BSA) y una lipoproteína, p. ej., dicha composición acuosa está libre de HSA, rHSA, BSA y lipoproteínas; y/o
(b) dicho vector lentiviral se produce en células cultivadas en ausencia de suero.
10. La composición acuosa de cualquiera de las reivindicaciones 1-9, donde dicho vector lentiviral
(a) se caracteriza por un radio hidrodinámico de 100 ± 25 nm medido mediante dispersión dinámica de luz (DLS), opcionalmente, donde dicho vector lentiviral mantiene dicho radio hidrodinámico de 100 ± 25 nm dentro de un intervalo de temperatura de 25°C a 55°C;
(b) se caracteriza por una polidispersidad de 10% a 25%, opcionalmente donde dicho vector lentiviral mantiene dicha polidispersidad de 10% a 25% dentro de un intervalo de temperatura de 25°C a 55°C; y/o
(c) mantiene una concentración después de 3 ciclos de congelación/descongelación de alrededor de 70% a alrededor de 100% con respecto a la concentración de dicho vector lentiviral en dicha composición acuosa antes de dichos ciclos de congelación/descongelación, donde cada uno de dichos ciclos de congelación/descongelación comprende congelar dicha composición acuosa y posteriormente permitir que dicha composición acuosa se descongele a temperatura ambiente, opcionalmente donde dicho vector lentiviral mantiene dicha concentración de alrededor de 70% a alrededor de 100% después de 6 de dichos ciclos de congelación/descongelación, por ejemplo, después de 9 de dichos ciclos de congelación/descongelación.
11. Un procedimiento para purificar un vector lentiviral, donde dicho procedimiento comprende pasar la composición acuosa de cualquiera de las reivindicaciones 1-10 a través de un filtro, produciendo así una composición acuosa que está sustancialmente libre de microorganismos.
12. El procedimiento de la reivindicación 11, donde
(a) dicho filtro comprende una pluralidad de poros, y donde dichos poros tienen un diámetro de alrededor de 0,2 |jm; y/o
(b) dicha composición acuosa que está sustancialmente libre de microorganismos comprende dicho vector lentiviral a una concentración de alrededor del 80% con respecto a la concentración de dicho vector lentiviral en dicha composición acuosa antes de dicho contacto.
13. Un procedimiento para purificar un vector lentiviral, donde dicho procedimiento comprende poner en contacto la composición acuosa de cualquiera de las reivindicaciones 1-10 con:
(i) un material que comprende una pluralidad de partículas, donde dicho procedimiento comprende además separar sustancias que fluyen a través de dicho material de sustancias que permanecen dentro de dicho material, produciendo así una composición acuosa que está enriquecida con dicho vector lentiviral; o
(ii) una nucleasa, produciendo así una composición acuosa que está sustancialmente libre de polinucleótidos contaminantes.
14. Un procedimiento para expresar un transgén en una célula, donde dicho procedimiento comprende poner en contacto dicha célula con la composición acuosa de cualquiera de las reivindicaciones 1-10, donde el procedimiento no es un procedimiento para el tratamiento del cuerpo humano o animal mediante cirugía o terapia.
15. El procedimiento de la reivindicación 14, donde dicha célula es una célula de mamífero, opcionalmente donde dicha célula de mamífero es una célula 293T o una célula T, por ejemplo, una célula T humana tal como una célula T Jurkat o una célula T humana primaria.
16. Un kit que comprende la composición acuosa de cualquiera de las reivindicaciones 1-10 y un prospecto.
17. El kit de la reivindicación 16, donde dicho prospecto indica a un usuario de dicho kit que exprese un transgén en una célula según el procedimiento de la reivindicación 14 o 15, opcionalmente donde dicho kit comprende además un reactivo que se puede usar para cultivar la célula.
18. Una composición acuosa de cualquiera de las reivindicaciones 1-10, para su uso en un procedimiento para tratar o prevenir una enfermedad en un sujeto mediante la administración de un vector viral, que opcionalmente comprende un transgén, en una célula del sujeto, donde el procedimiento comprende administrar la composición al sujeto.
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