CN118056008A - 病毒载体生产系统 - Google Patents

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CN118056008A CN202280031062.1A CN202280031062A CN118056008A CN 118056008 A CN118056008 A CN 118056008A CN 202280031062 A CN202280031062 A CN 202280031062A CN 118056008 A CN118056008 A CN 118056008A
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L·克鲁特
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Abstract

本披露至少部分地提供了一种用于生产高滴度慢病毒载体和用于生产携带目的转基因的慢病毒颗粒并且在令人满意的安全性条件下进行的方法。本披露还至少部分地提供了例如从细胞培养物中纯化这种慢病毒颗粒的方法。本披露还提供了慢病毒制剂的配制品，这些慢病毒制剂在纯化、储存和基因转移事件期间保持该病毒载体的结构完整性。

Description

病毒载体生产系统
相关申请
本申请要求2021年4月27日提交的美国临时申请63/180,423的优先权，该申请的全部内容通过引用特此并入。
背景技术
病毒在将核酸递送到特定细胞类型方面非常有效，同时通常避免被感染的宿主免疫系统检测到。这些特征使某些病毒成为具有吸引力的候选物，作为用于在基因疗法中使用的基因递送媒介物。
可用于基因疗法应用的病毒载体包括慢病毒载体。此类载体包括源自人类免疫缺陷病毒-1(HIV-1)的重构病毒载体系统，并且能够将目的基因引入动物和人类原代细胞或细胞系中。慢病毒载体介导的基因表达可用于实现连续和稳定的蛋白质生产，因为目的基因已整合到宿主细胞的基因组中，因此在细胞分裂时被复制。慢病毒载体可以有效地转导非分裂细胞以及那些在细胞周期中积极进展的细胞。慢病毒载体介导的目的基因慢性表达可能发生的组织和细胞包括大脑、肝脏、肌肉细胞、视网膜、造血干细胞、骨髓间充质干细胞和巨噬细胞等。
慢病毒载体的大规模生产受到一些挑战的阻碍，如病毒产量的低滴度和载体的低稳定性。此外，慢病毒载体在纯化过程中容易失活，这可能导致载体制备的最终质量和功效降低，进一步为大规模生产纯化的慢病毒载体造成了另一个障碍。因此，仍然需要大规模生产高滴度慢病毒载体的方法以及保持载体稳定性的大规模纯化过程和配制缓冲液。
发明内容
本披露至少部分地提供了一种用于生产携带目的转基因的高滴度慢病毒载体并且在令人满意的安全性条件下进行的方法。本披露还至少部分地提供了例如从细胞培养物中纯化此类慢病毒颗粒的方法。本披露还提供了慢病毒制剂的配制品，这些慢病毒制剂在纯化、储存和基因转移事件(例如，离体基因转移)期间保持病毒载体的结构完整性。
在一些方面，本披露提供了一种制造慢病毒载体的方法，该方法包括：
a)提供多个哺乳动物(例如，人)细胞，
b)使多个哺乳动物细胞与以下接触：
i)-AAV转染试剂，和
ii)编码治疗效应物例如治疗蛋白(例如，CAR)和足够的用于包装到病毒颗粒中的LTR序列的核酸，以及任选地编码慢病毒包装蛋白、慢病毒包膜蛋白的核酸，并且
在允许将核酸引入至少细胞的亚群中的条件下；以及
c)在适合产生慢病毒载体的条件下培养细胞。
在某些实施例中，当多个哺乳动物细胞处于50L培养物中时，产生的每ml培养物的转导单位数量不小于在其他方面类似的100ml培养物中每ml培养物的转导单位数量的50％、60％、70％或80％。
在某些实施例中，当在实例5中描述的条件下使用时，该方法产生至少1x107或3x107或至少1x108个转导单位。
在某些实施例中，该方法产生等于或小于1188:1、953:1和1800:1PP(物理颗粒):IP(感染性颗粒)的比率。
在某些实施例中，哺乳动物细胞是293细胞，例如，Expi293F细胞。
在某些实施例中，以0.3-0.6μl-AAV/百万细胞(例如，约0.4μl/百万细胞)的浓度使用/>-AAV。
在某些实施例中，以0.3-0.6μg核酸/百万细胞(例如，约0.4μg/百万细胞)的浓度使用核酸。
在某些实施例中，用于转染的-AAV:DNA的比率为1:0.5至1:2，例如，约1:1(其中任选地用于转染的DNA包含编码治疗效应物的DNA、编码一种或多种逆转录病毒包装蛋白的DNA和编码逆转录病毒包膜蛋白的DNA)。
在某些实施例中，-AAV转染试剂与核酸复合。
在一些实施例中，该方法进一步包括在步骤b)之前将-AAV转染试剂与核酸混合。
在某些实施例中，转染试剂和核酸的复合体积在约1％和约15％之间，例如，约1％和约10％(例如，约5％-7.5％或7.5％-10％)。
在一些实施例中，复合体积为3％-7％、4％-6％或约5％。
在某些实施例中，将-AAV转染试剂和核酸孵育足够的时间以允许发生复合，例如，约10-90分钟，例如，15-60分钟，例如，15-30、30-45或45-60分钟。
在一些方面，本披露提供了一种制造慢病毒载体的方法，该方法包括：
a)在高于约6.9或约6.9-7.3，例如约7.0-7.1的pH下培养多个哺乳动物(例如，人)细胞；
b)继步骤a)之后，将培养物的pH调节至约6.0-6.8，例如，6.6-6.8，例如，约6.7；
c)继步骤b)之后，使培养物与转染试剂和DNA接触。
在某些实施例中，转染试剂包括-AAV转染试剂。
在一些实施例中，DNA编码一种或多种逆转录病毒包装蛋白、逆转录病毒包膜蛋白、和治疗效应物例如治疗蛋白(例如，CAR)。
在一些实施例中，a)包括培养细胞约2-4天，例如，约3天。
在某些实施例中，该方法进一步包括在步骤b)和c)之间培养细胞的另外的步骤。
在一些实施例中，该方法进一步包括在步骤c)之后培养细胞的另外的步骤。
在一些实施例中，步骤b)包括将pH降低约0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9或1。
在某些实施例中，在步骤a)之前，将多个哺乳动物细胞以0.1x106个细胞/mL和0.3x106个细胞/mL之间(例如，约0.15x106个细胞/mL或约0.2x106个细胞/mL)的最终体积接种在培养基中(例如，FreeStyleTM培养基)。
在一些实施例中，在步骤a)之前50和80小时之间(例如，约55小时、约60小时、约65小时、约70小时、约72小时、约75小时或约80小时)接种多个哺乳动物细胞。
在某些实施例中，在适合于允许细胞生长和扩增至转染时适合的细胞密度(例如，在约1.0x106个细胞/mL和约3.0x106个细胞/mL之间(例如，在1.5x106个细胞/mL和2.5x106个细胞/mL之间))的条件下培养多个哺乳动物细胞。
在一些方面，本披露提供了一种制造慢病毒载体的方法，该方法包括：
a)提供包含慢病毒载体和至少一种杂质的组合物(例如，其中组合物包含澄清的细胞收获物或滤液)，以及
b)使组合物与精氨酸或其盐接触。
在某些实施例中，以下一项或多项：
i)精氨酸的浓度为约25-50mM(约50mM)、50-100mM(例如，约75mM)、100-200mM(例如，约150mM)或200-400(例如，约300)mM精氨酸；或
ii)与其他方面类似的组合物相比，精氨酸的浓度足以使慢病毒载体的转导单位水平增加约10％-300％、20％-180％、30％-160％、50％-150％、75％-125％或约100％，例如在根据实例7的测定中；
iii)在步骤b)之后，组合物显示每ml的总颗粒浓度小于400,000、300,000、200,000或100,000，如通过微流成像测量的，例如，在实例10中描述的测定中，其中任选地颗粒包含聚集的慢病毒；
iv)在步骤b)之后，组合物显示每ml≥10μm的颗粒浓度小于约5,000、4,500、4,000、3,500、3,000或2,500，如通过微流成像测量的，例如，在实例10中描述的测定中，其中任选地颗粒包含聚集的慢病毒；
v)在步骤b)之后，组合物显示每ml≥25μm的颗粒浓度小于约500、400、300或200，如通过微流成像测量的，例如，在实例10中描述的测定中，其中任选地颗粒包含聚集的慢病毒；
vi)在步骤b)之后，与不添加精氨酸或其盐的其他方面类似的滤液相比，组合物显示出慢病毒载体的聚集降低；
vii)慢病毒载体的转导单位的回收率比没有添加精氨酸的其他方面类似的对照高例如至少约10％、20％、50％、100％或200％，例如，如在根据实例7的测定中测量的。
在一些实施例中，b)包括使组合物与包含精氨酸和缓冲液的溶液接触，其中任选地缓冲液是PIPES，其中任选地PIPES在溶液中的浓度为约10mM至约50mM，例如，约20mM。在某些实施例中，溶液的pH为约6.0至约7.0，例如，约6.5。
在一些实施例中，溶液进一步包含盐，其中任选地盐选自由氯化钠、氯化镁和氯化钙组成的组，例如，氯化钠。
在一些实施例中，盐以约25-150mM，例如50-100mM，例如约75mM的浓度存在于溶液中。
在某些实施例中，在溶液中盐的pH为约6.5。
在一些实施例中，溶液进一步包含碳水化合物，例如，非还原性碳水化合物，例如，蔗糖或海藻糖。
在某些实施例中，碳水化合物以每体积所述溶液约1重量％至约10重量％，例如每体积溶液约2重量％至约5重量％、每体积溶液约2.5重量％的浓度存在于溶液中。
在某些实施例中，碳水化合物以约30-150mM(约73mM)或150-300(例如，约220)mM的浓度存在于溶液中。
在一些实施例中，溶液进一步包含溶液的NaCl(例如约25-150mM，例如50-100mM，例如约75mM)和蔗糖(例如约30-150mM，例如约73的mM，或例如约150-300mM，例如约220mM，或约2.5重量％/体积)中的一者或两者。
在一些实施例中，溶液包含20mM PIPES、75mM氯化钠和2.5重量％蔗糖/体积的溶液，并且其中溶液的pH为约6.5。在某些实施例中，溶液包含约20mM PIPES、约75mM氯化钠和约2.5重量％蔗糖/体积的溶液，其中溶液的pH为约6.5。
在某些实施例中，溶液包含20mM PIPES、75mM氯化钠和73mM蔗糖，并且其中溶液的pH为约6.5。在某些实施例中，溶液包含约20mM PIPES、约75mM氯化钠和约73mM蔗糖，并且其中溶液的pH为约6.5。
在一些实施例中，溶液包含20mM PIPES、75mM氯化钠和220mM蔗糖，并且其中溶液的pH为约6.5。在一些实施例中，溶液包含约20mM PIPES、约75mM氯化钠和约220mM蔗糖，并且其中溶液的pH为约6.5。
在一些实施例中，溶液进一步包含20mM PIPES、75mM精氨酸例如精氨酸-HCl，并且其中溶液的pH为约6.5。在一些实施例中，溶液进一步包含约20mM PIPES、约75mM精氨酸例如精氨酸-HCl，并且其中溶液的pH为约6.5。
在一些实施例中，所述溶液的重量摩尔渗透压浓度为约270mOsm/kg至约330mOsm/kg，例如，约275mOsm/kg至约300mOsm/k，例如，约285mOsm/kg。
在某些实施例中，该方法进一步包括：c)进行纯化步骤，例如，对b)的组合物的过滤步骤，从而产生包含慢病毒载体的半纯化的组合物。
在某些实施例中，该方法进一步包括在步骤c)之后，使半纯化的组合物与精氨酸或其盐接触。
在一些实施例中，精氨酸封装慢病毒载体。
在某些实施例中，精氨酸稳定慢病毒载体。
在一些实施例中，杂质包括蛋白质(例如，宿主细胞蛋白质)、核酸(例如，宿主细胞核酸)、碳水化合物(例如，宿主细胞碳水化合物)、脂质、酶、盐、缓冲液或其任何组合。
在某些实施例中，转染时的细胞密度在约1.0x106个细胞/mL和约3.0x106个细胞/mL之间(例如，1.5x106个细胞/mL和2.5x106个细胞/mL之间)。
在一些实施例中，在转染时细胞的活力是或评估为至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)。
在某些实施例中，在转染时或大约转染时(例如，在转染前30分钟内)测量细胞的活力。
在一些实施例中，该方法用于具有两种或更多种核酸(例如，两种或更多种质粒，例如，两种质粒、三种质粒、四种质粒或五种质粒)的过程。
在一些方面，本披露提供了一种制造慢病毒载体的方法，该方法包括：
a)提供人细胞(例如，293细胞)群体；
b)将编码逆转录病毒包装蛋白、逆转录病毒包膜蛋白、和治疗效应物例如治疗蛋白(例如，CAR)的核酸引入细胞中，
c)在步骤b)后约6-40、10-40、10-30或约20小时的时间使细胞与苯佐那酶接触；以及
d)在适合产生慢病毒载体的条件下培养细胞。
在一些方面，本披露提供了一种制造慢病毒载体的方法，该方法包括：
a)提供人细胞(例如，293细胞)群体；
b)将编码逆转录病毒包装蛋白、逆转录病毒包膜蛋白、和治疗效应物例如治疗蛋白(例如，CAR)的核酸引入细胞中，
c)使细胞与苯佐那酶接触；
d)在适合产生慢病毒载体的条件下培养细胞；
e)在步骤c)后6-10小时、10-20小时、20-30小时、30-40小时或40-50小时从细胞中收获慢病毒载体。
在一些方面，本披露提供了一种制造慢病毒载体的方法，该方法包括：
a)提供多个哺乳动物(例如，人)细胞，其中该多个细胞(例如，其中该细胞是成纤维细胞，例如，胚肾成纤维细胞，例如，Expi293F细胞)，其中该细胞包含编码一种或多种逆转录病毒包装蛋白、逆转录病毒包膜蛋白、和治疗效应物例如治疗蛋白(例如，CAR)的核酸(例如，DNA)，
b)在适合产生慢病毒载体的条件下培养细胞。
在一些方面，本披露提供了一种水性组合物，水性组合物包含慢病毒载体、精氨酸、1,4-哌嗪二乙磺酸(PIPES)缓冲液和盐。
在某些实施例中，水性组合物中的精氨酸浓度为约25-50mM(约50mM)、50-100mM(例如，约75mM)、100-200mM(例如，约150mM)或200-400(例如，约300)mM精氨酸，其中任选地PIPES水性组合物的浓度为约10mM至约50mM，例如，约例如20mM。
在一些实施例中，水性组合物的pH为约6.0至约7.0，例如，约6.5。
在某些实施例中，水性组合物进一步包含盐，其中任选地盐选自由氯化钠、氯化镁和氯化钙组成的组。
在一些实施例中，盐是氯化钠(NaCl)。
在某些实施例中，水性组合物中的盐为约25mM至约150mM，例如，约50mM至约75mM。
在一些实施例中，水性组合物包含20mM PIPES和75mM氯化钠，并且其中水性组合物的pH为约6.5。
在某些实施例中，水性组合物进一步包含碳水化合物，例如，非还原性碳水化合物，例如，蔗糖或海藻糖。
在一些实施例中，碳水化合物以每体积所述溶液约1重量％至约10重量％，例如每体积水性组合物约2重量％至约5重量％、每体积水性组合物约2.5重量％的浓度存在于水性组合物中。
在一个实施例中，碳水化合物以约30-150mM(约73mM)或150-300(例如，约220)mM的浓度存在于水性组合物中。
在一些实施例中，水性组合物包含水性组合物的NaCl(例如约25-150mM，例如50-100mM，例如约75mM)和蔗糖(例如约30-150mM，例如约73的mM，或例如约150-300mM，例如约220mM，或约2.5重量％/体积)中的一者或两者。
在一个实施例中，水性组合物包含20mM PIPES、75mM氯化钠和2.5重量％的蔗糖/体积的水性组合物，并且其中水性组合物的pH为约6.5。
在某些实施例中，水性组合物包含20mM PIPES、75mM氯化钠和73mM蔗糖，并且其中水性组合物的pH为约6.5。
在一个实施例中，水性组合物包含20mM PIPES、75mM氯化钠和220mM蔗糖，并且其中水性组合物的pH为约6.5。
在某些实施例中，所述水性组合物的重量摩尔渗透压浓度为约270mOsm/kg至约330mOsm/kg，例如，约275mOsm/kg至约300mOsm/k，例如，约285mOsm/kg。
在一个实施例中，前述权利要求中任一项的慢病毒载体以约3x108TU/mL至约5x108TU/mL的浓度存在。
在某些实施例中，水性组合物不含选自由以下组成的组的一种或多种蛋白质：人血清白蛋白(HSA)、重组人血清白蛋白(rHSA)、牛血清白蛋白(BSA)和脂蛋白。
在一个实施例中，慢病毒载体包含转基因，例如，编码蛋白质，例如，包含嵌合抗原受体(CAR)的蛋白质的转基因。
在某些实施例中，所述CAR在N-末端至C-末端的方向上包含抗原结合结构域、跨膜结构域和一个或多个细胞信号传导结构域。
在一些实施例中，所述信号传导结构域包含一个或多个初级信号传导结构域和/或一个或多个共刺激信号传导结构域。
在某些实施例中，所述一个或多个初级信号传导结构域中的一个包含CD3-ζ刺激结构域。
在一些实施例中，所述共刺激信号传导结构域中的一个或多个包含选自共刺激蛋白的细胞内结构域，该共刺激蛋白选自由以下组成的组：OX40、CD27、CD28、CDS、ICAM-1、LFA-1(CD11a/CD18)、ICOS(CD278)、4-1BB(CD137)、CDS、ICAM-1、GITR、BAFFR、HVEM(LIGHTR)、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、NKp44、NKp30、NKp46、CD160、CD19、CD4、CD8α、CD8β、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、ITGA4、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、LFA-1、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、NKG2D、NKG2C、TNFR2、TRANCE/RANKL、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(Tactile)、CEACAM1、CRTAM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CD100(SEMA4D)、CD69、SLAMF6(NTB-A、Ly108)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、LAT、GADS、SLP-76、PAG/Cbp、CD19a、和特异性地结合CD83的配体，例如，4-1BB(CD137)共刺激结构域或CD28共刺激结构域。
在一些实施例中，所述共刺激信号传导结构域中的一个或多个包含选自共刺激蛋白的细胞内结构域，该共刺激蛋白选自由以下组成的组：CD27、CD28、4-1BB(CD137)、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、与CD83特异性地结合的配体、CDS、ICAM-1、GITR、BAFFR、HVEM(LIGHTR)、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、CD160、CD19、CD4、CD8α、CD8β、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、ITGA4、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、LFA-1、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、TNFR2、TRANCE/RANKL、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(Tactile)、CEACAM1、CRTAM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CD100(SEMA4D)、CD69、SLAMF6(NTB-A、Ly108)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、LAT、GADS、SLP-76、PAG/Cbp、NKp44、NKp30、NKp46或NKG2D。
在某些实施例中，所述抗原结合结构域是scFv。
在一些实施例中，所述抗原结合结构域与选自下组的抗原结合，该组由以下组成：CD19；CD123；CD22；CD30；CD171；CS-1；C型凝集素样分子-1，CD33；表皮生长因子受体变体III(EGFRvlll)；神经节苷脂G2(GD2)；神经节苷脂GD3；TNF受体家族成员B细胞成熟(BCMA)；Tn抗原((Tn Ag)或(GalNAca-Ser/Thr))；前列腺特异性膜抗原(PSMA)；受体酪氨酸激酶样孤儿受体1(ROR1)；Fms样酪氨酸激酶3(FLT3)；肿瘤相关糖蛋白72(TAG72)；CD38；CD44v6；癌胚抗原(CEA)；上皮细胞粘附分子(EPCAM)；B7H3(CD276)；KIT(CD1 17)；白细胞介素-13受体亚基α-2；间皮素；白细胞介素1 1受体α(IL-1 1Ra)；前列腺干细胞抗原(PSCA)；蛋白酶丝氨酸21；血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)；Lewis(Y)抗原；CD24；血小板来源的生长因子受体β(PDGFR-β)；阶段特异性胚胎抗原-4(SSEA-4)；CD20；叶酸受体α；受体酪氨酸蛋白激酶ERBB2(Her2/neu)；黏蛋白1，细胞表面相关蛋白(MUC1)；表皮生长因子受体(EGFR)；神经细胞粘附分子(NCAM)；前列腺酶；前列腺酸性磷酸酶(PAP)；突变的延伸因子2(ELF2M)；肝配蛋白B2；成纤维细胞活化蛋白α(FAP)；胰岛素样生长因子1受体(IGF-I受体)，碳酸酐酶IX(CAIX)；蛋白酶体(前体(Prosome)，巨蛋白因子(Macropain))亚基，β型，9(LMP2)；糖蛋白100(gp100)；由断裂点簇集区(BCR)和Abelson鼠白血病病毒致癌基因同源物1(Abl)组成的致癌基因融合蛋白(bcr-abl)；酪氨酸酶；肝配蛋白A型受体2(EphA2)；岩藻糖基GM1；唾液酸Lewis粘附分子(sLe)；神经节苷脂GM3；转谷氨酰胺酶5(TGS5)；高分子量-黑素瘤相关抗原(HMWMAA)；o-乙酰基-GD2神经节苷脂(OAcGD2)；叶酸受体β；肿瘤内皮标记1(TEM1/CD248)；肿瘤内皮标记7相关蛋白(TEM7R)；密封蛋白6(CLDN6)；促甲状腺激素受体(TSHR)；G蛋白偶联受体C类5组，成员D(GPRC5D)；染色体X开放阅读框61(CXORF61)；CD97；CD179a；间变性淋巴瘤激酶(ALK)；聚唾液酸；胎盘特异性1(PLAC1)；globoH糖基神经酰胺(GloboH)的六糖部分；乳腺分化抗原(NY-BR-1)；尿溶蛋白2(UPK2)；甲型肝炎病毒细胞受体1(HAVCR1)；肾上腺素受体β3(ADRB3)；泛连接蛋白3(PANX3)；G蛋白偶联受体20(GPR20)；淋巴细胞抗原6复合物，基因座K 9(LY6K)；嗅觉受体51E2(OR51 E2)；TCRγ替代性阅读框蛋白(TARP)；肾母细胞瘤蛋白(WT1)；癌/睾丸抗原1(NY-ESO-1)；癌/睾丸抗原2(LAGE-1a)；黑素瘤相关抗原1(MAGE-A1)；ETS易位变异基因6，位于染色体12p上(ETV6-AML)；精子蛋白17(SPA17)；X抗原家族，成员1A(XAGE1)；血管生成素结合细胞表面受体2(Tie 2)；黑素瘤癌睾丸抗原-1(MAD-CT-1)；黑素瘤癌睾丸抗原-2(MAD-CT-2)；Fos相关抗原1；肿瘤蛋白p53(p53)；p53突变体；前列腺特异性蛋白(prostein)；存活蛋白(surviving)；端粒酶；前列腺癌肿瘤抗原-1、T细胞1识别的黑素瘤抗原；大鼠肉瘤(Ras)突变体；人端粒酶逆转录酶(hTERT)；肉瘤易位断点；黑素瘤细胞凋亡抑制剂(ML-IAP)；ERG(跨膜蛋白酶、丝氨酸2(TMPRSS2)ETS融合基因)；N-乙酰葡糖胺基转移酶V(NA17)；配对盒蛋白Pax-3(PAX3)；雄激素受体；细胞周期蛋白B1；v-myc禽类骨髓细胞瘤病毒致癌基因神经母细胞瘤来源同源物(MYCN)；Ras同源物家族成员C(RhoC)；酪氨酸酶相关蛋白2(TRP-2)；细胞色素P450 1B1(CYP1B1)；CCCTC-结合因子(锌指蛋白)样，T细胞3识别的鳞状细胞癌抗原(SART3)；配对盒蛋白Pax-5(PAX5)；前顶体蛋白结合蛋白sp32(OY-TES1)；淋巴细胞特异性蛋白酪氨酸激酶(LCK)；激酶锚蛋白4(AKAP-4)；滑膜肉瘤，X断点2(SSX2)；晚期糖基化终产物受体(RAGE-1)；肾遍在蛋白1(RU1)；肾遍在蛋白2(RU2)；豆荚蛋白；人乳头状瘤病毒E6(HPV E6)；人乳头状瘤病毒E7(HPV E7)；肠羧酸酯酶；突变的热休克蛋白70-2(mut hsp70-2)；CD79a；CD79b；CD72；白细胞相关的免疫球蛋白样受体1(LAIR1)；IgA受体的Fc片段(FCAR或CD89)；白细胞免疫球蛋白样受体亚家族A成员2(LILRA2)；CD300分子样家族成员f(CD300LF)；C型凝集素结构域家族12成员A(CLEC12A)；骨髓基质细胞抗原2(BST2)；含EGF样模块的粘蛋白样激素受体样2(EMR2)；淋巴细胞抗原75(LY75)；磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(GPC3)；Fc受体样5(FCRL5)；和免疫球蛋白λ样多肽1(IGLL1)，例如，与CD19、CD22、间皮素或CD123结合。
在某些实施例中，所述CAR包含抗CD19抗体或其片段、4-1BB(CD137)跨膜结构域和CD3-ζ信号结构域。
在一些实施例中，慢病毒载体包含第二转基因，例如，编码第二蛋白质，例如，包含第二嵌合抗原受体(CAR)的第二蛋白质的第二转基因。
在一个方面，本披露提供了一种制造慢病毒载体的方法，该方法包括：
a)提供人细胞(例如，293细胞)群体；
b)将编码逆转录病毒包装蛋白、逆转录病毒包膜蛋白、和治疗效应物例如治疗蛋白(例如，CAR)的核酸引入细胞中，
c)在步骤b)后约2-6(例如，约3)、4-10(例如，约6)、6-40、10-40、10-30(例如，约24)或约20小时的时间使细胞与苯佐那酶接触；以及
d)在适合产生慢病毒载体的条件下培养细胞。
在某些实施例中，在从细胞中收获慢病毒载体之前6-10小时、10-20小时、20-30小时、30-40小时或40-50小时添加苯佐那酶。
在一个方面，本披露提供了一种制造慢病毒载体的方法，该方法包括：
a)提供人细胞(例如，293细胞)群体；
b)将编码逆转录病毒包装蛋白、逆转录病毒包膜蛋白、和治疗效应物例如治疗蛋白(例如，CAR)的核酸引入细胞中，
c)使细胞与苯佐那酶接触(例如，步骤b后3-24小时)；
d)在适合产生慢病毒载体的条件下培养细胞；
e)在步骤c)后6-10小时、10-20小时、20-30小时、30-40小时或40-50小时从细胞中收获慢病毒载体。
在一些实施例中，苯佐那酶的浓度为约10-40U/mL，例如，20-30U/mL，例如，约25U/mL。
在某些实施例中，苯佐那酶的浓度为约3-60U/mL、3-10U/mL、3-7U/mL、4-6U/mL或约5U/mL。
在一个实施例中，苯佐那酶的浓度为5-50、5-15、15-25或25-50U/mL。
在某些实施例中，该方法进一步包括在步骤c)之前，使苯佐那酶与例如约1-5mM、1-3mM或约2mM的MgCl2接触。
在一个方面，本披露提供了一种制造慢病毒载体的方法，该方法包括：
a)提供多个哺乳动物(例如，人)细胞，其中该多个哺乳动物细胞不包含SV40大T抗原(例如，其中该细胞是成纤维细胞，例如，胚肾成纤维细胞，例如，Expi293F细胞)，其中该多个哺乳动物细胞包含编码一种或多种逆转录病毒包装蛋白、逆转录病毒包膜蛋白、和治疗效应物例如治疗蛋白(例如，CAR)的核酸(例如，DNA)，
b)在适合产生慢病毒载体的条件下培养细胞。
在某些实施例中，a)包括将核酸引入到多个哺乳动物细胞中。
在一些实施例中，该方法进一步包括将慢病毒载体与多个哺乳动物细胞至少部分地分离。
在一个实施例中，一种或多种逆转录病毒包装蛋白包含慢病毒gag、慢病毒pol或慢病毒rev或其任何组合。
在某些实施例中，逆转录病毒包膜蛋白包含VSV-G。
在一些方面，本披露提供了一种慢病毒载体制剂，该制剂包含：
多个慢病毒载体，该多个慢病毒载体包含：
a)编码治疗效应物例如治疗蛋白(例如，CAR)的慢病毒基因组，和
b)包封慢病毒基因组的包膜(其中任选地包膜包含VSV-G)；
其中该制剂包含至少5x107、1x108、1x109或1x1010个转导单位；
其中该制剂包含少于90％的SV40大T抗原或少于10μg/ml、1μg/ml的编码SV40大T抗原的核酸(例如，DNA)。
在一些实施例中，多个慢病毒载体包含至少1x109、2x109、5x109、或1x1010、2x1010、5x1010、1x1011、2x1011、5x101或1x1012个细胞。
在某些实施例中，多个哺乳动物细胞处于至少5、10、20、50、100、200或500L的培养体积中。
在一个实施例中，包括在无血清培养基中培养多个哺乳动物细胞。
在某些实施例中，多个哺乳动物细胞悬浮生长。
在一些实施例中，CAR包含CD19 CAR(例如，人源化CD19 CAR，例如，如WO2014153270 A1中所述。
在某些实施例中，CAR包含双重CAR(例如，人源化CD19-CD22CAR，例如，如WO2016164731 A2中所述。
在一些实施例中，编码CAR的核酸进一步编码shRNA，例如，如WO 2017049166 A中所述。
在一个实施例中，慢病毒载体在不存在血清的情况下培养的细胞中产生。
在某些实施例中，慢病毒载体的特征在于如通过动态光散射(DLS)测量的流体动力学半径为100±25nm。
在某些实施例中，慢病毒载体在25℃至55℃(例如，26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃、41℃、42℃、43℃、44℃、45℃、46℃、47℃、48℃、49℃、50℃、51℃、52℃、53℃、54℃或55℃)的温度范围内保持100±25nm的所述流体动力学半径。
在一些实施例中，慢病毒载体的特征在于10％至25％(例如，10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％或25％)的多分散性。
在一个实施例中，慢病毒载体在25℃至55℃(例如，26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃、41℃、42℃、43℃、44℃、45℃、46℃、47℃、48℃、49℃、50℃、51℃、52℃、53℃、54℃或55℃)的温度范围内保持10％至25％(例如，10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％或25％)的所述多分散性。
在某些实施例中，慢病毒载体在3个冷冻/解冻循环后，相对于在所述冷冻/解冻循环之前所述水性组合物中的所述慢病毒载体的浓度，保持约70％至约100％(例如，约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约97％或约100％)的浓度，其中每个所述冷冻/解冻循环包括冷冻所述水性组合物并且随后允许所述水性组合物在室温下解冻。
在一些实施例中，在6-10个所述冷冻/解冻循环后，例如，在6-9个所述冷冻/解冻循环后，慢病毒载体保持约70％至约100％(例如，约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约95％、约97％或约100％)的所述浓度。
在一些方面，本披露提供了一种水性组合物，其包含慢病毒载体，选自由磷酸盐缓冲液、柠檬酸钠缓冲液、2-(N-吗啉代)乙磺酸(MES)缓冲液、3-吗啉丙烷-1-磺酸(MOPS)缓冲液组成的组的缓冲液，以及盐。
在一些实施例中，所述盐选自由氯化钠、氯化镁和氯化钙组成的组。
在一个实施例中，所述水性组合物进一步包含选自由蔗糖和海藻糖组成的组的非还原性碳水化合物。
在一些方面，本披露提供了用于生产大量病毒载体(例如，慢病毒载体)的可规模化过程，例如，用于预防、诊断、免疫治疗或治疗用途。这些过程可以使用悬浮细胞(例如，HEK293细胞，例如，Expi293F细胞)进行。在一些实施例中，基本上所有的悬浮细胞不表达大T抗原，例如，SV40 T抗原。在一些实施例中，该过程可以使用生物反应器进行。
在一些方面，本披露提供了用于生产具有高病毒滴度或高病毒产率中的一者或两者的大量病毒载体(例如，慢病毒载体)的高度可重复的有效可规模化过程。
在一些方面，本披露提供了用于纯化具有高病毒滴度或高病毒产率中的一者或两者的大量病毒载体(例如，慢病毒)的高度可重复的有效可规模化过程。
在另一方面，本披露提供了用于在纯化过程中稳定病毒载体例如慢病毒载体的组合物和方法。
附图说明
图1A显示使用Expi293F细胞的LV生产率为约1.5E7 TU/mL，使用HEK293T/17细胞的LV生产率为约3.9E7 TU/mL，并且使用Expi293F细胞获得的PP/IP比率为约1900，相比之下，使用HEK293T/17细胞获得的PP/IP比率为约1000。
图1B显示了在每次传代时观察到的细胞密度在两种细胞系之间是可比的(约3x106个细胞/mL)。
图1C显示Expi293F和HEK293T/17细胞在培养中都显示出高活力(>90％)。
图2A显示转染试剂-AAV显著增加Expi293F细胞的LV生产率，从1.9倍到2.8倍，取决于目的基因。
图2B显示当-AAV在不同培养体积中用作转染试剂时，Expi293F细胞的LV生产率持续且稳健地增加。
图3显示了使用不同量的DNA进行转染获得的慢病毒量。该实验中最高的病毒产量和最低的PP/IP是用0.4μg DNA/1E6细胞获得的。
图4显示了用两种不同的慢病毒载体获得的慢病毒量，其中在转染前将pH转变为6.7会诱导生产率增加约3倍。使用了2.5L规模的生物反应器。
图5显示了在两种生产系统中使用不同CAR构建体的对比慢病毒生产率：(i)Expi293F细胞，使用-AAV作为转染试剂，和(ii)HEK293T细胞，使用/>作为转染试剂。
图6显示在精氨酸存在下，与样品进行超滤时的对照运行相比，过滤过程时间从244分钟降低到145分钟。
图7显示在TFF之前添加精氨酸将后续过程的载体回收率从约40％改进到80％以上。
图8显示当在两个过滤步骤之前实施精氨酸掺加时，载体回收率进一步增加。
图9显示添加精氨酸以浓度依赖的方式降低了颗粒计数和尺寸。
图10是显示在用不同浓度的苯佐那酶和不同添加时间的情况下收获时感染性LVV的生产率(TU/mL-TU测定)和PP/IP比率(物理颗粒/感染性颗粒)的条形图。
图11是显示在用不同浓度的苯佐那酶和不同添加时间收获时的DNA量(ng/1E+7TU)的条形图。
图12是显示在用不同浓度的苯佐那酶和不同添加时间收获时的DNA量(ng/mL)的条形图。
图13是显示在用不同孵育时间和复合体积的情况下收获时感染性LVV的生产率(TU/mL-TU测定)和PP/IP比率(物理颗粒/感染性颗粒)的条形图。
图14是显示在用不同孵育时间的情况下收获时感染性LVV的生产率(TU/mL-TU测定)和PP/IP比率(物理颗粒/感染性颗粒)的条形图。
图15是显示在LVV过程期间50L规模(n＝4)下的细胞密度和活力的条形图。
图16是显示在不同规模下在2种不同产物(C1和I1)的情况下感染性LVV(TU/mL-TU测定)的生产率的条形图。
具体实施方式
本披露至少部分地基于一种用于生产携带目的转基因的高滴度慢病毒载体并且在令人满意的安全性条件下进行的方法。本披露还至少部分地提供了例如从细胞培养物中纯化这种慢病毒颗粒的方法。本披露还提供了慢病毒制剂的配制品，这些慢病毒制剂在离体纯化、储存和基因转移事件期间保持病毒载体的结构完整性。
定义
除非另外声明，否则如本文所用的以下术语和短语意在具有以下意思。
如本文所用，单数形式“一个或一种(a或an)”包括复数指示物，除非另外指示。
除非上下文另外明确指明，否则术语“或”在本文中意指术语“和/或”并且可与术语“和/或”互换使用。
“约”和“大约”通常意指在给定测量的性质或精度的情况下测量的量的可接受的误差度。示例性误差度在给定值或值范围的20％内，典型地在10％内，并且更典型地在5％内。
术语“氨基酸”是指天然存在的、合成的和非天然的氨基酸，以及以类似于天然存在氨基酸的方式发挥作用的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。天然存在的氨基酸是由遗传密码编码的那些氨基酸，以及后来修饰的那些氨基酸，例如，羟脯氨酸、γ-羧基谷氨酸和O-邻磷酸丝氨酸。氨基酸类似物是指与天然存在的氨基酸具有相同基本化学结构(即与氢、羧基基团、氨基基团和R基团结合的α-碳)的化合物，例如，高丝氨酸、正亮氨酸、甲硫氨酸亚砜、甲硫氨酸甲基锍。此类类似物具有经修饰的R基团(例如，正亮氨酸)或经修饰的肽骨架，但保留与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构。氨基酸模拟物是指具有如下结构的化合物，该结构与氨基酸的一般化学结构不同但是以与天然存在的氨基酸类似的方式起作用。
如本文所用，术语“缓冲液”是指弱酸及其缀合碱或弱碱及其缀合酸的混合物。例如，如本文所用，“1,4-哌嗪二乙磺酸缓冲液”是指包含1,4-哌嗪二乙磺酸和1,4-哌嗪二乙磺酸阴离子(例如，1,4-哌嗪二乙磺酸钠)的混合物。同样，如本文所用的“柠檬酸钠缓冲液”是指包括柠檬酸钠及其缀合酸柠檬酸的混合物。由于弱酸与其缀合碱之间建立的化学平衡，含有缓冲液的溶液在向溶液中添加少量酸或碱时可抵抗pH的突然变化。
如本文所用，术语“结合结构域”或“抗体分子”是指包含至少一个免疫球蛋白可变结构域序列的蛋白质，例如，免疫球蛋白链或其片段。术语“结合结构域”或“抗体分子”涵盖抗体和抗体片段。在一些实施例中，抗体分子是多特异性抗体分子，例如，其包含多个免疫球蛋白可变结构域序列，其中该多个中的第一免疫球蛋白可变结构域序列对第一表位具有结合特异性并且该多个中的第二免疫球蛋白可变结构域序列对第二表位具有结合特异性。在一些实施例中，多特异性抗体分子是双特异性抗体分子。双特异性抗体对不多于两种抗原具有特异性。双特异性抗体分子的特征在于具有对第一表位的结合特异性的第一免疫球蛋白可变结构域序列、和具有对第二表位的结合特异性的第二免疫球蛋白可变结构域序列。
术语“抗体重链”是指抗体分子中天然存在的构象中存在的两种类型多肽链中较大的一种，并且通常决定抗体所属的类别。
术语“抗体轻链”是指抗体分子中天然存在的构象中存在的两种类型多肽链中较小的一种。κ(kappa)和λ(lambda)轻链是指两种主要的抗体轻链同种型。
如本文所用，术语“抗原结合片段”是指抗体的一个或多个部分，该一个或多个部分保留与抗原的表位特异性地相互作用(例如，通过结合、空间位阻、稳定/去稳定、空间分布)的能力。结合片段的实例包括但不限于单链Fv(scFv)、骆驼抗体、二硫键连接的Fv(sdFv)、Fab片段、F(ab')片段，一种由VL、VH、CL和CH1结构域组成的单价片段；F(ab)2片段，包含在铰链区通过二硫桥连接的两个Fab片段的二价片段；由VH和CH1结构域组成的Fd片段；由抗体的单臂的VL和VH结构域组成的Fv片段；由VH结构域组成的dAb片段(Ward等人,Nature[自然]341:544-546,1989)；和分离的互补性决定区(CDR)或抗体的其他表位结合片段。
包含抗体或其抗体片段的所述的CAR的部分可以多种形式存在，其中抗原结合结构域表达为连续多肽链的一部分，包括例如单结构域抗体片段(sdAb)、单链抗体(scFv)、人源化抗体或双特异性抗体(Harlow等人,1999,Using Antibodies:A Laboratory Manual[使用抗体：实验室手册],Cold Spring Harbor Laboratory Press[冷泉港实验室出版社],纽约；Harlow等人,1989,Antibodies:A Laboratory Manual[抗体：实验室手册],ColdSpring Harbor[冷泉港],纽约；Houston等人,1988,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]85:5879-5883；Bird等人,1988,Science[科学]242:423-426)。在一些方面，CAR组合物的抗原结合结构域包含抗体片段。在另一个方面，CAR包含含有scFv的抗体片段。给定CDR的精确氨基酸序列边界可以使用许多众所周知的方案中的任一种来确定，这些方案包括由以下文献描述的那些：Kabat等人(1991),“Sequences of Proteins ofImmunological Interest”[具有免疫学重要性的蛋白序列]，第5版，美国国立卫生研究院，公共卫生事业部，马里兰州贝塞斯达市(“卡巴特(Kabat)”编号方案)；Al-Lazikani等人,(1997)JMB 273,927-948(“乔西亚(Chothia)”编号方案)或其组合。
此外，虽然Fv片段的两个结构域VL和VH是由单独的基因编码的，但是可以使用重组方法将这两个结构域通过能够使它们形成为单条蛋白质链的合成接头来相连，其中VL区和VH区配对形成单价分子(被称为单链Fv(“scFv”)；参见例如，Bird等人,Science[科学]242:423-426,1988；和Huston等人Proc.Natl.Acad.Sci.[美国国家科学院院刊]85:5879-5883,1988)。术语“抗原结合片段”也意在涵盖此类单链抗体。这些抗原结合片段是使用本领域的技术人员已知的常规技术获得的，并且以与完整抗体相同的方式针对效用来筛选片段。
术语“嵌合抗原受体”或可替代地“CAR”是指重组多肽构建体，该重组多肽构建体至少包含细胞外抗原结合结构域、跨膜结构域和包含源自如下定义的刺激分子的功能性信号传导结构域的胞质信号传导结构域(本文还称为“细胞内信号传导结构域”)。在一些实施例中，CAR多肽构建体中的结构域在同一多肽链中，例如，包含嵌合融合蛋白。在一些实施例中，例如，如在RCAR中所提供，CAR多肽构建体中的结构域彼此不连续，例如在不同的多肽链中。
在一些方面，胞质信号传导结构域包含初级信号传导结构域(例如，CD3-ζ的初级信号传导结构域)。在一些方面，胞质信号传导结构域进一步包含源自如下定义的至少一种共刺激分子的一个或多个功能性信号传导结构域。在一些方面，共刺激分子选自41BB(即，CD137)、CD27、ICOS和/或CD28。在一些方面，CAR包含嵌合融合蛋白(其包含细胞外抗原识别结构域)、跨膜结构域和细胞内信号传导结构域(其包含源自刺激分子的功能信号传导结构域)。在一些方面，CAR包含嵌合融合蛋白(其包含细胞外抗原识别结构域)、跨膜结构域和细胞内信号传导结构域(其包含源自共刺激分子的功能信号传导结构域和源自刺激分子的功能信号传导结构域)。在一些方面，CAR包含嵌合融合蛋白(其包含细胞外抗原识别结构域)、跨膜结构域和细胞内信号传导结构域(其包含源自一种或多种共刺激分子的两个功能信号传导结构域和源自刺激分子的功能信号传导结构域)。在一些方面，CAR包含嵌合融合蛋白(其包含细胞外抗原识别结构域)、跨膜结构域和细胞内信号传导结构域(其包含源自一种或多种共刺激分子的至少两个功能信号传导结构域和源自刺激分子的功能信号传导结构域)。在一些方面，CAR包含CAR融合蛋白的氨基-末端(N-term)的任选的前导序列。在一些方面，CAR进一步包含在细胞外抗原识别结构域的N末端的前导序列，其中前导序列任选地在细胞加工和CAR定位至细胞膜期间从抗原识别结构域(例如，scFv)切割。
包含靶向特定肿瘤标志物X的抗原结合结构域(例如，scFv(单结构域抗体)或TCR(例如，TCRα结合结构域或TCRβ结合结构域))的CAR(其中X可以是如本文所述的肿瘤标志物)也称为XCAR。例如，包含靶向BCMA的抗原结合结构域的CAR被称为BCMACAR。CAR可以在任何细胞中表达，例如，如本文所述的免疫效应细胞(例如，T细胞或NK细胞)。
术语“信号传导结构域”是指蛋白质的功能性部分，其通过在细胞内传递信息以通过产生第二信使或通过响应于此类信使而用作效应子，经由定义的信号传导途径调控细胞活性起作用。术语“刺激分子”是指由免疫细胞(例如，T细胞、NK细胞、B细胞)表达的分子，其提供以针对免疫细胞信号传导通路的至少一些方面的刺激方式调节免疫细胞活化的一个或多个细胞质信号传导序列。在一些方面，信号是初级信号，初级信号通过例如TCR/CD3复合物与载有肽的MHC分子的结合而启动，并且导致了介导T细胞应答，包括但不限于增殖、活化、分化等。以刺激方式起作用的初级胞质信号传导序列(也称为“初级信号传导结构域”)可以含有被称为基于免疫受体酪氨酸的活化基序或ITAM的信号传导基序。在本发明中特别有用的含有ITAM的细胞质信号传导序列的实例包括但不限于源自CD3ζ、常见FcRγ(FCER1G)、FcγRIIa、FcRβ(FcεR1b)、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD79a、CD79b、DAP10和DAP12的那些。在某些CAR中，本发明的任何一种或多种CAR中的细胞内信号传导结构域包含细胞内信号传导序列，例如，CD3-ζ的初级信号传导序列。在本发明的特定CAR中，CD3-ζ的初级信号传导序列是人序列，或来自非人物种(例如，小鼠、啮齿动物、猴子、猿等)的等同残基。
如本文所用，术语“细胞内信号传导结构域”是指分子的细胞内部分。细胞内信号传导结构域产生信号，信号促进含有CAR的细胞(例如，CART细胞)的免疫效应子功能。免疫效应子功能的实例，例如，在CART细胞中，包括细胞溶解活性和辅助活性(包括分泌细胞因子)。
在一些实施例中，细胞内信号传导结构域可以包含初级细胞内信号传导结构域。示例性初级细胞内信号传导结构域包含源自负责初级刺激或抗原依赖性模拟的分子的那些。在一些实施例中，细胞内信号传导结构域可以包含共刺激细胞内结构域。示例性共刺激细胞内信号传导结构域包含源自负责共刺激信号或抗原非依赖性刺激的分子的那些。例如，在CART的情况下，初级细胞内信号传导结构域可以包括T细胞受体的胞质序列，并且共刺激细胞内信号传导结构域可以包括来自共受体或共刺激分子的胞质序列。
初级细胞内信号传导结构域可以包含被称为基于免疫受体酪氨酸的活化基序或ITAM的信号传导基序。含有初级细胞质信号传导序列的ITAM的实例包括但不限于源自CD3ζ、常见FcRγ(FCER1G)、FcγRIIa、FcRβ(FcεR1b)、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD79a、CD79b、DAP10和DAP12的那些。
术语“ζ”或可替代地“ζ链”、“CD3-ζ”或“TCR-ζ”是指CD247。Swiss-Prot登录号P20963提供了示例性的人CD3ζ氨基酸序列。“ζ刺激结构域”或可替代地“CD3-ζ刺激结构域”或“TCR-ζ刺激结构域”是指CD3-ζ或其变体的刺激结构域(例如，具有突变(例如，点突变)、片段、插入或缺失的分子)。在一些实施例中，ζ的胞质结构域包含GenBank登录号BAG36664.1或其变体的残基52至164(例如，具有突变(例如，点突变)、片段、插入或缺失的分子)。可替代地或另外地，术语“ζ”或可替代地“ζ链”、“CD3-ζ”(或“CD3ζ、CD3ζ或CD3z)或“TCR-ζ”被定义为以GenBank登录号BAG36664.1提供的蛋白质或来自非人物种例如，小鼠、啮齿动物、猴子、猿等的等效残基，并且“ζ刺激结构域”或可替代地“CD3-ζ刺激结构域”或“TCR-ζ刺激结构域”被定义为来自ζ链的细胞质结构域的氨基酸残基或其功能衍生物，其足以在功能上传递T细胞活化所必需的初始信号。在一些方面，ζ的细胞质结构域包含GenBank登录号BAG36664.1的残基52至164或是其功能性直向同源物的来自非人物种(例如，小鼠、啮齿动物、猴、猿等)的等效残基。
术语“共刺激分子”是指T细胞上与共刺激配体特异性结合、从而介导T细胞的共刺激应答(如但不限于增殖)的同源结合配偶体。共刺激分子是除抗原受体或其配体之外的细胞表面分子，CD3ζ、常见FcRγ(FCER1G)、FcγRIIa、FcRβ(FcεR1b)、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD79a、CD79b、DAP10和DAP12有助于有效的免疫反应。共刺激分子包括但不限于MHC I类分子、BTLA和Toll配体受体、以及OX40、CD27、CD28、CDS、ICAM-1、LFA-1(CD11a/CD18)、ICOS(CD278)、以及4-1BB(CD137)。此类共刺激分子的其他实例包括CDS、ICAM-1、GITR、BAFFR、HVEM(LIGHTR)、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、NKp44、NKp30、NKp46、CD160、CD19、CD4、CD8α、CD8β、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、ITGA4、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、LFA-1、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、NKG2D、NKG2C、TNFR2、TRANCE/RANKL、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(Tactile)、CEACAM1、CRTAM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CD100(SEMA4D)、CD69、SLAMF6(NTB-A、Ly108)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、LAT、GADS、SLP-76、PAG/Cbp、CD19a、和特异性地结合CD83的配体。
共刺激细胞内信号传导结构域可以是共刺激分子的细胞内部分。共刺激分子可以在以下蛋白质家族中表示：TNF受体蛋白、免疫球蛋白样蛋白、细胞因子受体、整联蛋白、信号传导淋巴细胞活化分子(SLAM蛋白)和活化型NK细胞受体。此类分子的实例包括CD27、CD28、4-1BB(CD137)、OX40、GITR、CD30、CD40、ICOS、BAFFR、HVEM、ICAM-1、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CDS、CD7、CD287、LIGHT、NKG2C、NKG2D、SLAMF7、NKp80、NKp30、NKp44、NKp46、CD160、B7-H3、以及与CD83特异性地结合的配体等。
细胞内信号传导结构域可以包含衍生它的分子的整个细胞内部分或整个天然细胞内信号传导结构域，或其功能片段或衍生物。
“互补性决定结构域”或“互补决定区”(“CDR”)可互换地是指VL和VH的高变区。CDR是抗体链的靶蛋白结合位点，结合位点携带针对这种靶蛋白的特异性。每种人VL或VH中存在三个CDR(CDR1-3，从N末端顺序编号)，构成约15％-20％的可变结构域。CDR在结构上与靶蛋白的表位互补并因此直接负责结合特异性。剩余的VL或VH区段(所谓的框架区)表现出较少的氨基酸序列变异(Kuby,Immunology[免疫学],第4版,第4章,弗里曼出版公司(W.H.Freeman&Co.),纽约,2000)。
CDR和框架区的位置可以使用本领域熟知的各种定义确定，例如，卡巴特、乔西亚、国际免疫遗传学数据库(IMGT)(在互联网以下网址：www.imgt.org/)和AbM(参见例如，Johnson等人,Nucleic Acids Res.[核酸研究],29:205-206(2001)；Chothia和Lesk,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志],196:901-917(1987)；Chothia等人,Nature[自然],342:877-883(1989)；Chothia等人,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志],227:799-817(1992)；Al-Lazikani等人,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志],273:927-748(1997))。抗原结合位点的定义还在以下文献中描述：Ruiz等人,Nucleic Acids Res.[核酸研究],28:219–221(2000)；和Lefranc,M.P.,Nucleic Acids Res.[核酸研究],29:207-209(2001)；MacCallum等人,J.Mol.Biol.[分子生物学杂志],262:732-745(1996)；和Martin等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊],86:9268–9272(1989)；Martin等人,Methods Enzymol.[酶学方法],203:121–153(1991)；和Rees等人,见Sternberg M.J.E.(编辑),Protein Structure Prediction[蛋白质结构预测],Oxford University Press[牛津大学出版社],牛津,141-172(1996)。
如本文所用，术语“污染多核苷酸”是指非源自慢病毒载体的多核苷酸。污染多核苷酸可包括例如源自产生慢病毒载体的细胞的非慢病毒多核苷酸，如不包括在转基因或慢病毒载体的其他组分中的染色体哺乳动物DNA(例如，人DNA)。
“源自”(当所述术语在本文中使用时)表示第一分子和第二分子之间的关系。它通常是指第一分子和第二分子之间的结构相似性，并不暗示或包括对源自第二分子的第一分子的过程或来源的限制。例如，在源自CD3ζ分子的细胞内信号传导结构域的情况下，细胞内信号传导结构域保留足够的CD3ζ结构，这样使得其具有所需的功能，即在适当条件下产生信号的能力。它没有暗示或包括对产生细胞内信号传导结构域的特定过程的限制，例如，它并不意指为了提供细胞内信号传导结构域，必须从CD3ζ序列开始并删除不需要的序列，或强加突变，以到达细胞内信号传导结构域。
如本文所用，术语“冷冻/解冻循环”是指将液体混合物(如水溶液或悬浮液)暴露于等于或低于其冰点的温度，直到混合物被冷冻，随后在高于其冰点的温度下解冻混合物。可以例如通过将混合物置于温度为约-80℃至约-20℃的环境中来进行冷冻步骤。混合物可以在解冻前保持冷冻，例如，一或多天、数周、数月或数年的时间。可以通过将混合物暴露于温度为约2℃至约8℃的条件下，或通过将混合物储存在室温(例如，实验室的环境温度，或约25℃)下进行解冻步骤。可替代地，可以使用水浴(例如，在37℃)进行解冻。
如本文所用，术语“流体动力学半径”是指溶液中的颗粒的表观半径(Rh，单位为nm)，如从颗粒的扩散特性推断的。病毒颗粒的流体动力学半径是决定病毒颗粒在水溶液中的扩散速率以及颗粒在大分子凝胶中迁移的能力的一个因素。病毒颗粒的流体动力学半径部分取决于颗粒的每个组分的质量和分子结构，以及它的水合状态。用于确定病毒颗粒的流体动力学半径的方法在本领域中是本领域熟知的并且包括使用动态光散射和尺寸排阻色谱。
如本文所用，术语“非还原性碳水化合物”是指不以与醛的化学平衡状态存在的碳水化合物，因此缺乏被过渡金属阳离子(如银(Ag+)和铜(Cu2+))氧化成羧酸的能力。示例性非还原性碳水化合物包括但不限于二糖如蔗糖、海藻糖和帕拉金醇，三糖如棉子糖和松三糖，以及四糖如水苏糖。非还原性碳水化合物此外包括单糖衍生物如山梨糖醇、甘露糖醇、赤藓糖醇和木糖醇，二糖衍生物如乳糖醇和麦芽糖醇，醛糖酸及其内酯如葡糖酸、葡糖酸γ-内酯、糖醛酸及其内酯如利巴拉酸、阿拉伯糖酸和半乳糖二酸，糖醛酸如葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸和亚甲醛酸，酯衍生物如海藻糖八醋酸盐、蔗糖八醋酸盐和纤维二糖八醋酸盐，以及其中羟基为O-烷基化的醚衍生物。非还原性碳水化合物包括具有D或L立体化学取向的碳水化合物。
如本文所用，术语“重量摩尔渗透压浓度(osmolality)”是指在水溶液中溶解的溶质颗粒的渗透压的量度。溶质粒子既包括离子也包括非离子分子。重量摩尔渗透压浓度表示为溶解在1kg溶剂(即水)中的渗透活性颗粒(即渗透压摩尔)的浓度。重量摩尔渗透压浓度在本文中以每1kg水的毫渗透压摩尔(mOsm/kg)单位表示。
如本文所用，术语“每体积重量百分比”或“％w/v”表示单一组分相对于包含组分的混合物的总体积的重量百分比(以克计)。例如，总体积为8ml中的500mg组分为6.25％w/v，并且总体积为5ml中的500mg组分为10％w/v。
如本文所用，术语“多分散性”是指样品中颗粒(如慢病毒颗粒)尺寸的均一性程度。较高的多分散性表示较低的均一性，较低的多分散性表示较高水平的均一性。例如，当均一性水平很高时，可以认为慢病毒颗粒接近相同的大小，并且因此是单分散的。如本领域普通技术人员将理解的，随着多分散性减少，均一性水平增加。因此，较低的多分散性表示较高的均一性水平。例如，具有15％多分散性的配制品比具有10％多分散性的配制品具有更低的均一性。当均一性水平低时，可以认为颗粒群体包含显著不同的尺寸，因此是多分散的。
如本文所用，术语任何疾病或障碍的“预防(prevent、preventing或prevention)”是指疾病或障碍的预防性治疗；或延迟疾病或障碍的发作或进展。
如本文所用，术语“识别”是指发现其表位并与之相互作用(例如，结合)的抗体或其抗原结合片段，无论该表位是否为线性或构象的。术语“表位”是指抗原上与本披露的抗体或抗原结合片段特异性结合的位点。表位可以从连续氨基酸或因蛋白质的立体折叠而并置的非连续氨基酸中形成。从连续氨基酸形成的表位一般在暴露于变性溶剂时保留，而因立体折叠形成的表位用变性溶剂处理时一般丧失。表位典型地包含至少3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13，14或15个处于独特空间构象的氨基酸。确定表位的空间构象的方法包括本领域中的技术，例如，x射线结晶学和二维核磁共振(参见，例如Epitope Mapping Protocolsin Methods in Molecular Biology[分子生物学中的方法中的表位映射协议],第66卷,G.E.Morris编辑(1996))。
如本文所用，术语“逆转录病毒包装蛋白”是指源自逆转录病毒或其变体的蛋白质，其有助于将核酸(例如，病毒基因组)包装到包膜中。示例性逆转录病毒包装蛋白包括gag、pol和rev，例如，慢病毒gag、pol和rev，例如，野生型蛋白或其变体，例如，具有至少80％、90％或95％序列同一性的序列。在一些实施例中，将一种或多种逆转录病毒包装蛋白作为多蛋白提供。
如本文所用，术语“逆转录病毒包膜蛋白”是指源自逆转录病毒或其变体的蛋白质，可以将其组装进核酸(例如，病毒基因组)周围的包膜中。示例性逆转录病毒包膜蛋白是env，例如，野生型或其变体。在一些实施例中，逆转录病毒包膜蛋白是慢病毒包膜蛋白，例如，野生型或其变体。在一些实施例中，逆转录病毒包膜蛋白是VSV-G，例如，野生型或变体。在一些实施例中，逆转录病毒蛋白是假型的。在一些实施例中，逆转录病毒包膜蛋白来自与要包装的核酸的一个或多个逆转录病毒包装蛋白或LTR不同的病毒。
如本文所用，短语“特异性结合”和“结合”是指结合反应，反应确定了在异质群体中的蛋白质和其他生物分子(例如，通过具有特殊性的配体认识到的蛋白质和其他生物分子)中的特定蛋白质的存在。特异性结合蛋白质的配体(例如，蛋白质、蛋白聚糖或糖胺聚糖)将以小于500nM的KD结合蛋白质。例如，特异性结合蛋白质的配体将以高达500nM的KD(例如，1pM和500nM之间)结合蛋白质。不表现出与蛋白质或其结构域的特异性结合的配体对于该特定蛋白质或其结构域将表现出大于500nM的KD(例如，大于600nm、700nM、800nM、900nM、1μΜ、100μΜ、500μΜ或1mM)。可以使用多种测定格式来确定配体对特定蛋白质的亲和力。例如，固相ELISA测定通常用于识别特异性结合靶蛋白的配体。参见，例如，Harlow&Lane,Antibodies,ALaboratory Manual[抗体，实验室手册],Cold Spring Harbor Press[冷泉港实验室出版社],纽约(1988)和Harlow&Lane,Using Antibodies,ALaboratoryManual[使用抗体，实验室手册],Cold Spring Harbor Press[冷泉港实验室出版社],纽约(1999)，以获取描述测定格式和可用于确定特定蛋白质结合的条件。
术语“受试者”包括人类和非人类动物。非人类动物包括所有脊椎动物，例如，哺乳动物和非哺乳动物如非人类灵长类、绵羊、狗、牛、鸡、两栖动物和爬行动物。除非在指出时，否则术语“患者”或“受试者”在本文中可互换地使用。
如本文所用，术语“治疗效应物”是指在有效水平上可以对受试者产生治疗作用的分子(例如，RNA或多肽)。
术语“治疗上可接受的量”或“治疗有效剂量”可互换地指足以实现所期望结果(即，肿瘤尺寸减小、抑制肿瘤生长、防止转移、抑制或防止病毒、细菌、真菌或寄生虫感染)的量。在一些实施例中，治疗上可接受的量不诱导或不引起不期望的副作用。在一些实施例中，治疗上可接受的量诱导或引起副作用，但仅是由医疗服务提供者就患者的状况而言可接受的那些。可以通过首先施用低剂量并且随后递增地增加剂量直至实现所期望效果来确定治疗上可接受的量。“预防有效剂量”和“治疗有效剂量”可以在一些实施例中分别防止疾病症状的发作或导致严重程度的减轻，这些疾病症状包括与癌症有关的症状。
如本文所用的术语“转染”是指将DNA引入真核细胞。转染可以通过多种手段来完成，包括但不限于磷酸钙-DNA共沉淀、DEAE-葡聚糖介导的转染、聚布伦介导的转染、电穿孔、微量注射、脂质体融合、脂质体感染、原生质体融合、逆转录病毒感染和基因枪。
如本文所用，术语任何疾病或障碍的“治疗(treat、treating或treatment)”在一个实施例中，是指减轻疾病或障碍(即，减慢或停滞或减少疾病或其至少一种临床症状的发展)。在另一实施例中，“治疗(treat、treating、或treatment)”是指缓解或减轻至少一种身体参数，包括不能被患者辨别的那些。在又另一个实施例中，“治疗(treat、treating或treatment)”是指在身体上(例如，可辨别的症状的稳定化)、在生理上(例如，身体参数的稳定化)或二者调节疾病或障碍。
如本文所用，术语“病毒滴度”是指感染性载体颗粒的数量或“转导单位”，这导致给定的核酸序列从颗粒中转移到靶细胞中。病毒滴度可以通过功能分析来测量，如Xiao等人,Exp.Neurobiol.[实验神经生物学]144:1 13-124,1997,或Fisher等人,J.Virol.[病毒学杂志]70:520-532,1996中所述的测定，两者的披露内容都是通过引用以其全文并入本文。可替代地，病毒滴度可以通过确定已整合到宿主细胞基因组中的病毒DNA的量来测量，例如，使用本领域已知的聚合酶链式反应(PCR)技术。
如本文所用，术语“病毒载体”是指具有将核酸分子引入宿主的能力的病毒颗粒。携带一种或多种外源基因的病毒载体通常借助使用特定细胞系的包装质粒通过病毒包装而包装成感染性病毒颗粒。感染性病毒颗粒感染细胞以实现外源基因的表达。“重组”病毒载体是指通过基因重组技术构建的病毒载体。可以使用任何合适的方法构建重组病毒载体，如通过用编码病毒基因组的核酸转导或转染包装细胞系并且随后分离新包装的病毒颗粒。可以理解，重组技术可以在病毒载体本身生产的上游阶段进行。例如，可以使用重组技术来生产质粒，然后可以更大规模地生产质粒，最后可以将质粒引入细胞系中进行包装以生产病毒载体。
术语“慢病毒载体”是指源自慢病毒基因组的至少一部分的载体，例如，包括如下提供的自失活慢病毒载体：Milone等人,Mol.Ther.[分子疗法]17(8):1453–1464(2009)。可以在临床中使用的慢病毒载体的其他实例包括但不限于例如来自牛津生物医药公司(Oxford BioMedica)的基因递送技术、来自Lentigen公司的LENTIMAXTM载体系统等。非临床类型的慢病毒载体也是可得的并且是本领域技术人员已知的。
生产慢病毒的方法
本披露尤其提供了用于制造慢病毒载体的改进方法。可以使用以下一般步骤。首先，可以培养宿主细胞。在本文标题为“宿主细胞”的章节中更详细地描述了示例性类型的宿主细胞，如缺乏大T抗原的人细胞。如本文实例1中所述，与包含大T抗原的宿主细胞相比，缺乏大T抗原的宿主细胞可导致制造优势。
在一些实施例中，为了产生大量细胞，宿主细胞在依次更大的容器(例如，生物反应器)中培养直到产生足够大量的细胞。
一旦获得足够数量的宿主细胞，就可以将所需核酸引入宿主细胞。这些核酸可以通过转染引入，例如，使用-AAV转染试剂，例如，如本文标题为“转染”的章节中所述。/>-AAV转染试剂的益处在本文的实例2和3中进行了描述。转染的核酸可以包括待包装的病毒基因组，其中病毒基因组包括目的治疗基因和足够的用于包装到病毒颗粒中的LTR序列。可引入宿主细胞中的另外的核酸包括促进包装的质粒，例如，编码病毒gag、pol、env和rev的质粒。在一些实施例中，培养基的pH可以在转染之前向下转变，例如，从约7.1到约6.7，例如，如本文标题为“培养条件和转染条件”的章节和本文实例4中所述。然后细胞开始产生慢病毒。
转染后，可以将核酸酶如苯佐那酶添加到培养基中，例如，如标题为“培养基”的章节和本文实例5中所述。不希望受理论束缚，在一些实施例中，细胞培养基是最终慢病毒制剂污染核酸的来源，例如，培养基可含有来自裂解宿主细胞的宿主细胞DNA。因此，向细胞培养基中添加苯佐那酶可降解污染核酸，从而改进慢病毒的纯化。
接下来，可以从宿主细胞培养物中收获慢病毒以开始纯化慢病毒。在一些实施例中，慢病毒的收获包括将上清液或细胞培养基与细胞分离。在一些实施例中，在澄清之前不裂解细胞。在一些实施例中，可以裂解细胞，并且可以澄清裂解物。
从细胞培养基或细胞裂解物中纯化慢病毒通常涉及几个连续的纯化步骤。纯化步骤可以包括过滤(例如，超滤)和色谱步骤。在一些实施例中，可以在纯化过程中添加精氨酸，例如，在过滤步骤或色谱步骤之前或之后。例如，在标题为“纯化”的章节和本文的实例8-12中描述了精氨酸的添加。不希望受理论束缚，在一些实施例中，精氨酸稳定慢病毒载体和/或降低它们的聚集。
纯化的慢病毒可用于多种应用。例如，慢病毒可用于将基因递送至离体细胞，例如，从单采样品中的免疫效应细胞生成CART细胞。作为另一个实例，可以将慢病毒施用于受试者，以将基因原位递送至受试者的细胞。例如，慢病毒可用于体内CART。在一些实施例中，慢病毒适用于在人类受试者中施用，例如，编码CAR的慢病毒可以施用于受试者，从而允许将编码CAR的核酸引入受试者体内的免疫效应细胞中。
天然存在的慢病毒是逆转录病毒科的一个病毒属，其特征在于潜伏期长。慢病毒通常可以将大量遗传信息递送到宿主细胞的DNA中。慢病毒的实例包括HIV(人类免疫缺陷病毒；包括HIV 1型和HIV 2型)，人类获得性免疫缺陷综合征(AIDS)的病原体；导致绵羊脑炎(visna)或肺炎(maedi)的visna-maedi、导致山羊免疫缺陷、关节炎和脑病的山羊关节炎-脑炎病毒；马传染性贫血病毒，可导致马自身免疫性溶血性贫血和脑病；猫免疫缺陷病毒(FIV)，它会导致猫的免疫缺陷；牛免疫缺陷病毒(BIV)，它会导致牛的淋巴结肿大、淋巴细胞增多和可能的中枢神经系统感染；和猿免疫缺陷病毒(SIV)，它会导致亚人类灵长类动物的免疫缺陷和脑病。由这些病毒引起的疾病具有潜伏期长、病程长的特点。通常，病毒潜伏地感染单核细胞和巨噬细胞，然后它们会传播到其他细胞。HIV、FIV和SIV也很容易感染T淋巴细胞(即，T细胞)。
转基因
在一些实施例中，本文披露的慢病毒或慢病毒载体可包括核酸，例如，转基因，如编码蛋白质的转基因。该核酸可以包含转基因，例如，如本文标题为“转基因”的章节中所述。转基因可以与启动子序列有效连接。核酸还可包含一个或多个(例如，两个)LTR序列。不希望受理论束缚，LTR可促进转基因和启动子插入宿主细胞基因组。LTR序列可包含野生型慢病毒LTR序列或其变体。例如，3'LTR可包含使病毒在整合后自失活的缺失。此外，5'LTR可以是嵌合LTR。在一些实施例中，转基因可以整合到靶细胞的染色体DNA中。
示例性转基因包括编码嵌合抗原受体(CAR)的那些。CAR可包括几个结构域，如抗原结合结构域、跨膜结构域和一个或多个信号传导结构域。在这些情况下，信号传导结构域可以含有一个或多个初级信号传导结构域(如CD3-ζ刺激结构域)和/或一个或多个共刺激信号传导结构域(如CD27、CD28、4-1BB(CD137)、OX40、GITR、CD30、CD40、ICOS、BAFFR、HVEM、ICAM-1、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CDS、CD7、CD287、LIGHT、NKG2C、NKG2D、SLAMF7、NKp80、NKp30、NKp44、NKp46、CD160、B7-H3或与CD83特异性结合的配体。
在一些实施例中，转基因，例如，包括CAR的转基因，可以编码结合特定靶蛋白或碳水化合物的抗原结合结构域(如scFv)。示例性抗原包括CD19、CD123、CD22、CD30、CD171、CS-1、C型凝集素样分子-1、CD33、表皮生长因子受体变体III(EGFRvlll)、神经节苷脂G2(GD2)、神经节苷脂GD3、TNF受体家族成员B细胞成熟(BCMA)、Tn抗原((Tn Ag)或(GalNAca-Ser/Thr))、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、受体酪氨酸激酶样孤儿受体1(ROR1)、Fms样酪氨酸激酶3(FLT3)、肿瘤相关糖蛋白72(TAG 72)、CD38、CD44v6、癌胚抗原(CEA)、上皮细胞粘附分子(EPCAM)、B7H3(CD276)、KIT(CD1 17)、白细胞介素-13受体亚基α-2、间皮素、白细胞介素1 1受体α(IL-1 1Ra)、前列腺干细胞抗原(PSCA)、蛋白酶丝氨酸21、血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)、Lewis(Y)抗原、CD24、血小板来源的生长因子受体β(PDGFR-β)、阶段特异性胚胎抗原-4(SSEA-4)、CD20、叶酸受体α、受体酪氨酸蛋白激酶ERBB2(Her2/neu)、黏蛋白1、细胞表面相关蛋白(MUC1)、表皮生长因子受体(EGFR)、神经细胞粘附分子(NCAM)、前列腺酶、前列腺酸性磷酸酶(PAP)、突变的延伸因子2(ELF2M)、肝配蛋白B2、成纤维细胞活化蛋白α(FAP)、胰岛素样生长因子1受体(IGF-I受体)、碳酸酐酶IX(CAIX)、蛋白酶体(前体，巨蛋白因子)亚基、β型、9(LMP2)、糖蛋白1 00(gp100)、由断裂点簇集区(BCR)和阿贝尔森(Abelson)鼠白血病病毒致癌基因同源物1(Abl)组成的致癌基因融合蛋白(bcr-abl)、酪氨酸酶、肝配蛋白A型受体2(EphA2)、岩藻糖基GM1、唾液酸Lewis粘附分子(sLe)、神经节苷脂GM3、转谷氨酰胺酶5(TGS5)、高分子量-黑素瘤相关抗原(HMWMAA)、o-乙酰基-GD2神经节苷脂(OAcGD2)、叶酸受体β、肿瘤内皮标记1(TEM1/CD248)、肿瘤内皮标记7相关蛋白(TEM7R)、密封蛋白6(CLDN6)、促甲状腺激素受体(TSHR)、G蛋白偶联受体C类5组、成员D(GPRC5D)、染色体X可读框61(CXORF61)、CD97、CD179a、间变性淋巴瘤激酶(ALK)、聚唾液酸、胎盘特异性1(PLAC1)、globoH糖基神经酰胺(GloboH)的六糖部分、乳腺分化抗原(NY-BR-1)、尿溶蛋白2(UPK2)、甲型肝炎病毒细胞受体1(HAVCR1)、肾上腺素受体β3(ADRB3)、泛连接蛋白3(PANX3)、G蛋白偶联受体20(GPR20)、淋巴细胞抗原6复合物、基因座K 9(LY6K)、嗅觉受体51E2(OR51 E2)、TCRγ替代性阅读框蛋白(TARP)、肾母细胞瘤蛋白(WT1)、癌/睾丸抗原1(NY-ESO-1)、癌/睾丸抗原2(LAGE-1a)、黑素瘤相关抗原1(MAGE-A1)、ETS易位变异基因6、位于染色体12p上(ETV6-AML)、精子蛋白17(SPA17)、X抗原家族、成员1A(XAGE1)、血管生成素结合细胞表面受体2(Tie2)、黑素瘤癌睾丸抗原-1(MAD-CT-1)、黑素瘤癌睾丸抗原-2(MAD-CT-2)、Fos相关抗原1、肿瘤蛋白p53(p53)、p53突变体、前列腺特异性蛋白、存活蛋白、端粒酶、前列腺癌肿瘤抗原-1、T细胞1识别的黑素瘤抗原、大鼠肉瘤(Ras)突变体、人端粒酶逆转录酶(hTERT)、肉瘤易位断点、黑素瘤细胞凋亡抑制剂(ML-IAP)、ERG(跨膜蛋白酶、丝氨酸2(TMPRSS2)ETS融合基因)、N-乙酰葡糖胺基转移酶V(NA17)、配对盒蛋白Pax-3(PAX3)、雄激素受体、细胞周期蛋白B1、v-myc禽类骨髓细胞瘤病毒致癌基因神经母细胞瘤来源同源物(MYCN)、Ras同源物家族成员C(RhoC)、酪氨酸酶相关蛋白2(TRP-2)、细胞色素P450 1B1(CYP1 B1)、CCCTC结合因子(锌指蛋白)样、T细胞3识别的鳞状细胞癌抗原(SART3)、配对盒蛋白Pax-5(PAX5)、前顶体蛋白结合蛋白sp32(OY-TES1)、淋巴细胞特异性蛋白酪氨酸激酶(LCK)、激酶锚蛋白4(AKAP-4)、滑膜肉瘤，X断点2(SSX2)、晚期糖基化终产物受体(RAGE-1)、肾遍在蛋白1(RU1)、肾遍在蛋白2(RU2)、天冬酰胺内肽酶、人乳头状瘤病毒E6(HPV E6)、人乳头状瘤病毒E7(HPV E7)、肠羧酸酯酶、突变的热休克蛋白70-2(mut hsp70-2)、CD79a、CD79b、CD72、白细胞相关的免疫球蛋白样受体1(LAIR1)、IgA受体的Fc片段(FCAR或CD89)、白细胞免疫球蛋白样受体亚家族A成员2(LILRA2)、CD300分子样家族成员f(CD300LF)、C型凝集素结构域家族12成员A(CLEC12A)、骨髓基质细胞抗原2(BST2)、含EGF样模块的粘蛋白样激素受体样2(EMR2)、淋巴细胞抗原75(LY75)、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(GPC3)、Fc受体样5(FCRL5)以及免疫球蛋白λ样多肽1(IGLL1)。
在一些实施例中，本文所述的慢病毒载体包含多于一个转基因，例如，编码第一CAR例如CD19 CAR的第一转基因和编码第二CAR例如CD22 CAR的第二转基因。
在一些实施例中，本文所述的双重CAR慢病毒载体编码两种不同的CAR，例如，CD19CAR和CD22 CAR。在一些实施例中，两个CAR是单个开放阅读框的一部分并且被蛋白酶切割位点例如自切割位点例如P2A位点分开。在一些实施例中，开放阅读框从N-末端至C-末端编码第一前导序列、第一scFv(例如，其结合CD22)、任选地第一铰链结构域、第一跨膜结构域、第一共刺激结构域(例如，4-1BB)、第一初级信号传导结构域(例如，CD3-ζ)、蛋白酶切割位点(例如，P2A)、第二前导序列、第二scFv(例如，其结合CD19)、任选地第二铰链结构域、第二跨膜结构域、第二共刺激结构域(例如，4-1BB)和第二初级信号传导结构域(例如，CD3-ζ)。在一些实施例中，第一和第二前导序列具有相同的序列。在一些实施例中，第一和第二铰链结构域具有相同的序列。在一些实施例中，第一和第二跨膜结构域具有相同的序列。在一些实施例中，第一和第二共刺激结构域具有相同的序列。在一些实施例中，第一和第二初级信号传导结构域具有相同的序列。
提供可以由本文所述的转基因编码的另外的CAR，例如，在本文标题为“CAR靶点”的章节中。
在一些实施例中，本文所述的慢病毒载体编码靶向免疫效应细胞中的核酸的siRNA或shRNA。例如，siRNA或shRNA可以靶向编码TCR和/或HLA的核酸和/或T细胞中的抑制分子(例如，PD1、PD-L1、PD-L2、CTLA4、TIM3、CEACAM(例如，CEACAM-1、CEACAM-3和/或CEACAM-5)、LAG3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4、CD80、CD86、B7-H3(CD276)、B7-H4(VTCN1)、HVEM(TNFRSF14或CD270)、KIR、A2aR、MHC I类、MHC II类、GAL9、腺苷、和TGFβ)。siRNA和shRNA的表达系统以及示例性shRNA描述于例如，2015年3月13日提交的国际申请WO2015/142675的第649和650段中，所述申请通过引用以其全文并入。这些核酸也可以被靶向，例如，使用CRISPER系统、锌指核酸酶或TALEN。免疫效应细胞对于待治疗的受试者可以是自体的或同种异体的。
在一些实施例中，本文所述的慢病毒载体包含或编码一种或多种甲基胞嘧啶双加氧酶基因(例如，Tet1、Tet2或Tet3)的抑制剂。还考虑了使用此类组合物和方法来增加工程细胞(例如，经基因修饰的抗原特异性T细胞，例如，CAR T细胞)的功能活性。虽然不受理论束缚，但Tet基因的单个等位基因(例如，Tet1、Tet2或Tet3)的破坏会导致5-羟甲基胞嘧啶的总水平减少，这与增强增殖、调节效应细胞因子产生和脱粒有关，从而增加CAR T细胞的增殖和/或功能。在一些实施例中，所述细胞中Tet2的表达和/或功能已经降低或消除。
在一些实施例中，Tet1、Tet2和/或Tet3的抑制剂是对Tet1、Tet2、Tet3或编码所述siRNA或shRNA的核酸有特异性的siRNA或shRNA。在一些实施例中，siRNA或shRNA包含与Tet2 mRNA的序列互补的序列，例如，包含在WO 2017/049166的表4中列出的shRNA的靶序列，该申请通过引用以其全文并入本文，包括表4。在一些实施例中，Tet1、Tet2和/或Tet3的抑制剂是(1)靶向编码Tet1、Tet2和/或Tet3的基因或其调节元件例如Tet2或其调节元件内的一个或多个位点的基因编辑系统；(2)编码所述基因编辑系统的一种或多种组分的核酸；或(3)其组合。在一些实施例中，基因编辑系统选自由以下组成的组：CRISPR/Cas9系统、锌指核酸酶系统、TALEN系统和大范围核酸酶系统。
在一些实施例中，本文所述的慢病毒载体包含转基因，例如，编码嵌合抗原受体(CAR)的转基因，并且进一步包含靶向免疫效应细胞中的核酸的siRNA或shRNA。
慢病毒载体的特征
在一些实施例中，慢病毒载体的特征在于如通过动态光散射(DLS)测量的流体动力学半径为100±25nm。例如，慢病毒载体可以在25℃至55℃的温度范围内保持100±25nm的流体动力学半径。
在一些实施例中，慢病毒载体的特征在于10％至25％的多分散性。例如，慢病毒载体可以在25℃至55℃的温度范围内保持10％至25％的多分散性。
在一些实施例中，相对于在冷冻/解冻循环之前水性组合物中的慢病毒载体的浓度，慢病毒载体在3、6或9个冷冻/解冻循环后保持约70％至约100％的浓度，其中每个冷冻/解冻循环包括冷冻水性组合物并且随后允许水性组合物在室温下解冻。
在一些实施例中，使用本文披露的任何方法或配制品制备、纯化或储存的慢病毒可具有较低的载体拷贝数(VCN)，例如，与未通过本文所述方法或配制品生产、纯化或储存的慢病毒相比，例如，当在1的MOI下测试时，VCN低至少5％、至少10％、至少20％、至少30％、至少50％、至少60％。
慢病毒载体包装系统
包装系统可用于将核酸，例如，编码转基因的RNA包装到慢病毒载体中。因此，本文所述的系统和方法可以包含，例如，慢病毒包装系统，其包含至少一种适于产生慢病毒载体的质粒，例如，任选地包含转基因的慢病毒载体。可用于产生慢病毒载体的各种慢病毒组分是本领域已知的。参见例如Zufferey等人,1997,Nat.Biotechnol.[自然生物技术]15:871-875和Dull等人,1998,J.Virol.[病毒学杂志]72(11):8463-8471。适用于生产慢病毒载体的不同功能可以在包含一种或多种核酸(例如，质粒)，例如，至少一种、两种、三种或四种质粒的慢病毒包装系统中提供给宿主细胞，其中一种质粒编码逆转录病毒包膜蛋白(Env质粒)，一种质粒编码一种或多种逆转录病毒包装蛋白，例如，Gag和Pol蛋白(包装质粒或Gag-Pol质粒)，一种质粒编码慢病毒Rev蛋白(Rev质粒)和一种或多种包含至少一种目的转基因(TOI)表达盒的质粒。在一些实施例中，慢病毒包装系统进一步包含，或本文所述的方法包括使用至少一种、两种、三种或四种质粒。在一些实施例中，慢病毒包装系统进一步包含，或本文所述的方法包括使用第五质粒。在某些实施例中，本文所述的方法包括将五质粒转染到宿主细胞中，其中第五质粒不编码慢病毒载体包装系统的蛋白质。在一些实施例中，慢病毒包装系统包含一种或多种核酸(例如，质粒)，例如，五种质粒，其中一种质粒编码表达载体，一种质粒编码Tat(例如，pcDNATat)，一种质粒编码Rev蛋白(例如，pHCMV-Rev)，一种质粒编码gagpol(例如，pHCMV-gagpol)，并且一种质粒编码VSV-G(例如，pVSVG)，例如，如Rout-Pitt等人,JBiol.Methods[生物学方法杂志]5(2):1-9,2018)中所述。在一些实施例中，质粒可以包含双重基因表达盒，例如，双顺反子盒，例如，编码两个目的转基因的双顺反子构建体。在一些实施例中，第一目的转基因编码第一CAR，例如，CD19 CAR，并且第二目的转基因编码第二CAR，例如，CD22 CAR。在一些实施例中，逆转录病毒包装蛋白源自慢病毒，例如，慢病毒包装蛋白，例如，慢病毒gag和pol蛋白。在一些实施例中，慢病毒gag蛋白是野生型慢病毒gag蛋白，并且在其他实施例中，它相对于野生型序列具有一个或多个序列修饰。在一些实施例中，慢病毒pol蛋白是野生型慢病毒pol蛋白，并且在其他实施例中，它相对于野生型序列具有一个或多个序列修饰。在一些实施例中，rev蛋白是野生型rev蛋白，并且在其他实施例中，它相对于野生型序列具有一个或多个序列修饰。在一些实施例中，慢病毒载体可以是假型载体，其包含经修饰的包膜蛋白，例如，源自不同病毒的包膜蛋白或嵌合包膜蛋白，例如，Env质粒可以编码VSV-G Env蛋白，例如，野生型VSV-G蛋白或经修饰的变体。
在一些实施例中，使用以下生成慢病毒载体：包含pMDLgpRRE、pRSV-Rev和pMD.G质粒的包装系统(Dull等人,同上)，但使用卡那霉素抗性标记，例如，赋予卡那霉素和新霉素抗性的标记，例如，新霉素磷酸转移酶II，而不是氨苄青霉素基因。
在一些实施例中，本文所述的系统包含转移载体，所述转移载体包含卡那霉素抗性标记，例如，赋予对卡那霉素和新霉素两者的抗性的标记，例如，新霉素磷酸转移酶II，例如，代替氨苄青霉素基因。在一些实施例中，转移载体包含来自例如如WO 2017087861 A或Milone等人,Mol.Ther.[分子治疗]17(8):1453-1464,2009中披露的pELPS构建体的序列，其中每一个都通过引用以其全文并入本文。在一些实施例中，治疗蛋白在自失活转移载体上编码，载体包含慢病毒5'LTR(例如，截短的慢病毒5'LTR)、慢病毒3'LTR、cPPT和WPRE中的一个或多个，例如，全部。在一些实施例中，转移载体缺少以下中的一种或多种，例如，全部：在细菌中具有活性的启动子(例如，缺乏所有的T7启动子、T3启动子和lac启动子)、M13引物结合位点(例如，同时缺乏M13正向引物结合位点和M13反向引物结合位点)、噬菌体起源(例如，f1 ori)和荧光蛋白编码基因(例如，GFP，例如，EGFP)。在一些实施例中，转移载体缺乏CAP结合位点和lac操纵子。在一些实施例中，转移载体包含如WO 2017087861中披露的pELPS构建体，除了转移载体缺少T7启动子、M13正向引物结合位点、f1 ori、CAP结合位点、IPTG诱导型启动子、lac操纵子、M13反向引物结合位点、T3启动子和EGFP，其中任选地转移载体编码治疗蛋白，例如，CAR。在一个实施例中，转移载体具有以下一个或多个特性：(a)比其他方面类似的对照转移载体更稳定，(b)导致细胞毒性低于其他方面类似的对照转移载体，或(c)当整合到靶细胞中时导致较低的载体拷贝数(VCN)，例如，如本文所述。在一些实施例中，对照转移载体包含T7启动子、M13正向引物结合位点、f1 ori、CAP结合位点、IPTG诱导型启动子、lac操纵子、M13反向引物结合位点和T3启动子。
在一些实施例中，基因表达盒编码蛋白质，例如，嵌合抗原受体(CAR)。在一些实施例中，基因表达盒编码两种蛋白质，例如，第一CAR和第二CAR。适用于基因表达盒的示例性转基因在本披露中进行了描述。
转染
在一些实施例中，将用于产生慢病毒载体的不同功能通过转染(例如瞬时或稳定转染)提供给适用于生产慢病毒载体的慢病毒包装系统的多个宿主细胞，例如，哺乳动物细胞，例如，HEK293细胞，例如，Expi293F细胞(例如，在无血清条件下悬浮生长的多个Expi293F细胞)。在一些实施例中，转染了至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％的宿主细胞(例如，HEK293细胞，例如，Expi293F细胞)。转染或感染的方法是本领域技术人员熟知的。在一些实施例中，每百万个细胞提供至少0.3μg、至少0.4μg、至少0.5μg、至少0.6μg、至少0.7μg、至少0.8μg、至少0.9μg或至少1.0μg的慢病毒包装系统用于转染。在一些实施例中，使用转染试剂来转染宿主细胞，例如，哺乳动物细胞，例如，HEK293细胞，例如，Expi293F细胞。在一些实施例中，使用转染试剂。转染试剂是本领域熟知的并且可从商业供应商处获得。转染试剂的实例包括但不限于LipofectamineTM(英杰公司(Invitrogen))、Polifectamine、LentiTran(傲锐基因公司(Origene))、(Polyplus)、/>-AAV(Polyplus)和/>(普洛麦格公司(Promega))。在一些实施例中，转染试剂例如/>-AAV以每百万个细胞0.1μl、0.2μl、0.3μl、0.4μl、0.5μl、0.6μl、0.7μl、0.8μl、0.9μl或1.0μl的水平使用。在一些实施例中，包装系统和转染试剂，例如/>-AAV以约1:0.5、1:0.75、1:1、1:1.5或1:2或它们之间的任何范围的比率使用，用于转染。
在一些实施例中，转染试剂包括-AAV转染试剂。/>-AAV可以例如从Polyplus(850bd Sébastien Brant,67400Illkirch,法国；美洲大道1251号3楼,纽约；美国纽约10020)获得。/>-AAV是一种基于化学的无动物转染试剂。
在一些实施例中，在转染时，细胞(例如，Expi293F细胞)的密度为约0.5x106个细胞/mL-1x107个细胞/mL、1x106个细胞/mL-6x106个细胞/mL、1x106个细胞/mL-5x106个细胞/mL、1.50x106个细胞/mL-2.50x106个细胞/mL、2.0x106个细胞/mL-3.0x106个细胞/mL、2.0x106个细胞/mL-2.5x106个细胞/mL。在一些实施例中，在转染时，细胞群体具有至少约80％、90％或95％的活力。
在一些实施例中，转染后PP/IP(物理颗粒/感染性颗粒)比率小于500、700、900、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900、2000。
宿主细胞
适用于表达病毒载体，例如，慢病毒载体，例如，本文披露的慢病毒载体的任何宿主细胞可用于实施本文披露的方法。在一些实施例中，合适宿主细胞是真核细胞，例如，哺乳动物细胞。在一些实施例中，哺乳动物细胞可以是经基因修饰的哺乳动物细胞，用于表达病毒，例如，慢病毒，例如，慢病毒载体或目的慢病毒。许多哺乳动物细胞系是病毒重组表达的合适宿主细胞。哺乳动物宿主细胞系包括，例如，COS、PER.C6、TM4、VERO、MDCK、BRL-3A、W138、Hep G2、MMT、MRC 5、FS4、CHO、293T、A431、3T3、CV-1、C3H10T1/2、Colo205、HEK293、HeLa、L细胞、BHK、HL-60、FRhL-2、U937、HaK、Jurkat细胞、Rat2、BaF3、32D、FDCP-1、PC12、M1x、鼠骨髓瘤(例如，SP2/0和NS0)和C2C12细胞，以及转化的灵长类细胞系、杂交瘤、正常二倍体细胞和源自原代组织和原代外植体体外培养的细胞株。在一些实施例中，宿主细胞是HEK293细胞，包括源自HEK293细胞的细胞，例如，293F细胞，例如，Expi293F细胞。在一些实施例中，培养物中至少80％、至少85％、至少90％、至少90％、至少95％的宿主细胞表达大T抗原，例如，多瘤病毒大T抗原，例如，SV40大T抗原，例如，突变SV40大T抗原。在一些实施例中，培养物中至少99％、至少98％、至少97％、至少96％、至少95％的宿主细胞不表达大T细胞抗原。在一些实施例中，宿主细胞适合悬浮生长。
培养过程
本文所述的细胞系可以在允许产生具有高滴度的慢病毒载体颗粒的条件下培养。真核细胞，例如，哺乳动物细胞，例如，HEK293细胞，例如，Expi293F细胞可以作为如下进行培养：在整个批量(bulk)培养物中自由悬浮生长的非锚定依赖性细胞；或需要附着在固体基质上以进行繁殖的锚定依赖性细胞(例如，作为单层)。
在一些实施例中，微载体系统可用于适应细胞生长。在一些实施例中，微载体系统可包含悬浮培养物，例如，大规模悬浮培养物。悬浮培养可以在开放或封闭系统中操作，例如，分批或分批补料封闭系统。在一些实施例中，不添加营养物，并且在培养期间不去除废产物。在一些实施例中，尽管细胞、产物、副产物和包括有毒代谢物在内的废产物没有被去除，但将营养物连续地供给到系统中以延长生长周期。在一些实施例中，培养系统可以是开放的，例如，连续系统，例如，灌注系统或恒化器系统。在一些实施例中，系统可以包括一个或多个细胞保留装置。细胞保留装置可以包括例如微载体、细网旋转过滤器、中空纤维、平板膜过滤器、沉降管、超声细胞保留装置等。在一些实施例中，生物反应器中的细胞浓度高于从生物反应器收获的上清液中存在的细胞浓度。在一些实施例中，生物反应器中的细胞浓度与从生物反应器收获的上清液基本相同。
在连续发酵过程中，通常将确定的培养基连续添加到生物反应器中，同时去除等量的培养体积以回收产品。连续培养通常以恒定的细胞密度将细胞保持在对数生长期。连续或半连续培养方法允许调节影响细胞生长或终产物浓度的一个因素或任意数量的因素。例如，一种方法可能会限制碳源并且允许所有其他参数来调节新陈代谢。在某些系统中，许多影响生长的因素可能会不断改变，而通过培养基浊度测量的细胞浓度保持恒定。连续系统通常保持稳态生长，并且因此细胞生长速率通常与由于培养基从培养物中抽出而导致的细胞损失相平衡。为连续培养过程调节营养物和生长因子的方法是已知的，并且本领域已知多种方法。
在一些实施例中，悬浮细胞的培养物仅包含处于悬浮状态的细胞。在一些实施例中，悬浮细胞培养物可包含少量(例如，少于1％)粘附(例如，瞬时)到表面的细胞。
“细胞培养物”可以指细胞的任何体外培养物。该术语包括连续细胞系(例如，具有永生表型)、原代细胞培养物、有限细胞系(例如，非转化细胞)和任何其他体外维持的细胞群。
在一些实施例中，本文所述的系统或方法利用包装细胞或包装细胞系来产生病毒载体。细胞系可以用用于产生慢病毒载体的元件(例如逆转录病毒包装蛋白和逆转录病毒包膜蛋白)稳定转染。通常，此类包装细胞含有一种或多种能够表达病毒蛋白(如gag、pol和env)的表达盒，但表达盒不含有包装信号。包装细胞可以是体外培养的细胞。包装细胞系可用于产生慢病毒颗粒的生产细胞系，例如，通过提供至少一种包含至少一种目的转基因(TOI)表达盒的质粒。在一些实施例中，生产细胞瞬时表达编码治疗效应物并包含足够LTR序列的质粒(例如，转移质粒)，以允许将包含一个或多个LTR的RNA包装到病毒载体中。在一些实施例中，生产细胞系稳定地表达了编码治疗效应物并且包含足够LTR序列的表达盒，以允许将包含一个或多个LTR的RNA包装到病毒载体中。
培养基
可以使用任何合适的培养基(例如，在本披露的条件下支持细胞的生长和维持)来培养真核细胞，例如，哺乳动物细胞，例如，HEK293细胞，例如，Expi293F细胞。术语“细胞培养基”和“培养基”(或简单地“培养基”)是指用于使真核细胞(例如，哺乳动物细胞，例如，HEK293细胞，例如，Expi293F细胞)生长的营养溶液，通常提供来自以下一个或多个类别的至少一个组分：(1)促进培养基的重量摩尔渗透压浓度的盐(例如，钠、钾、镁、钙等)；(2)能源，通常以碳水化合物如葡萄糖的形式；(3)所有必需的氨基酸，并且通常是二十种氨基酸的基本集；(4)在低浓度下需要的维生素和/或其他有机化合物；和(5)痕量元素，其中痕量元素定义为通常在非常低浓度(通常在微摩尔范围内)下需要的无机化合物。这种培养基的组成在本领域中是已知的(例如，参见Mather,J.P.,等人(1999)“Culture media,animalcells,large scale production,[培养基，动物细胞，大规模生产]”Encyclopedia ofBioprocess Technology:Fermentation,Biocatalysis,and Bioseparation[生物加工技术百科全书：发酵、生物催化和生物分离]，第2:777-785卷，通过引用以其全文特此并入本文)。营养溶液可任选地补充来自以下任一类别的一种或多种组分：(a)动物血清；(b)激素和其他生长因子诸如像胰岛素、转铁蛋白和表皮生长因子；和(c)植物、酵母和/或组织的水解物，包括其蛋白质水解物。
在一些实施例中，培养基可能包括血清，例如，胎牛血清(FBS)。在一些实施例中，培养基不含血清。在一些实施例中，培养基是化学定义的，例如，培养基缺乏动物来源的组分。如本文所用，“动物来源的”组分是完整动物中产生的任何组分(诸如像从血清中分离并纯化的蛋白质)，或使用完整动物中产生的组分(诸如像通过使用从动物分离并且纯化的酶来水解植物原料制备的氨基酸)。相比之下，如下的蛋白质不是“动物来源的”组分，其具有动物蛋白序列(即，在动物中具有基因组起源)，但在细胞培养中是使用缺乏在完整动物中生产或分离和纯化的组分的培养基在体外产生的(诸如像在重组酵母或细菌细胞中或已建立的连续真核生细胞系，无论是否重组)。
化学定义的培养基是所有组分都具有已知化学结构的培养基。化学成分确定的培养基可从商业供应商处获得，如例如，西格玛公司(Sigma)、赛默飞世尔公司(ThermoFisher)、英杰公司(Invitrogen)、JRH Biosciences和Gibco。在一些实施例中，培养基是FreeStyleTM293表达培养基。在一些实施例中，可以使用浓缩血清，例如，含有比通常需要和通常提供给正在生长的培养物更高浓度的营养物的培养基。在一些实施例中，培养基可含有源自本领域已知的任何来源或方法的一种或多种氨基酸。
在一些实施例中，可以在培养基中添加酶，例如，核酸酶，例如，核酸内切酶，例如，重组核酸内切酶，例如，在一些实施例中，添加至少2U/ml、至少5U/ml、至少7U/ml、至少10U/ml、至少15U/ml、至少20U/ml、至少25U/ml、至少25U/ml、至少30U/ml、至少35U/ml、至少40U/ml、至少45U/ml、至少50U/ml、至少55U/ml或至少60U/ml的在一些实施例中，添加在2U/mL和10U/mL之间、在10U/mL和20U/mL之间、在20U/mL和30U/mL之间、在30U/mL和40U/mL之间、在40U/mL和50U/mL之间或在50U/mL和60U/mL之间的/>在一些实施例中，在转染宿主细胞例如Expi293F细胞后约5-40、10-40、10-30、20-30或约20小时或约24小时的时间后添加/>在一些实施例中，在转染宿主细胞后20-30小时(例如，约24小时)以3-7U/mL(例如，约5U/mL)的浓度添加苯佐那酶。在一些实施例中，在转染宿主细胞后1-5小时(例如，约3小时)以3-7U/mL(例如约5U/mL)的浓度添加苯佐那酶。在一些实施例中，在转染宿主细胞后4-8小时(例如，约6小时)以3-7U/mL(例如约5U/mL)的浓度添加苯佐那酶。在一些实施例中，在转染宿主细胞后1-5小时(例如，约3小时)以12-18U/mL(例如约15U/mL)的浓度添加苯佐那酶。在一些实施例中，在转染宿主细胞后4-8小时(例如，约6小时)以12-18U/mL(例如约15U/mL)的浓度添加苯佐那酶。在一些实施例中，在转染宿主细胞后20-30小时(例如，约24小时)以12-18U/mL(例如约15U/mL)的浓度添加苯佐那酶。在一些实施例中，在转染宿主细胞后1-5小时(例如，约3小时)以20-30U/mL(例如约25U/mL)的浓度添加苯佐那酶。在一些实施例中，在转染宿主细胞后4-8小时(例如，约6小时)以20-30U/mL(例如约25U/mL)的浓度添加苯佐那酶。在一些实施例中，在转染宿主细胞后20-30小时(例如，约24小时)以20-30U/mL(例如约25U/mL)的浓度添加苯佐那酶。在一些实施例中，在转染宿主细胞后1-5小时(例如，约3小时)以40-60U/mL(例如约50U/mL)的浓度添加苯佐那酶。在一些实施例中，在转染宿主细胞后4-8小时(例如，约6小时)以40-60U/mL(例如约50U/mL)的浓度添加苯佐那酶。在一些实施例中，在转染宿主细胞后20-30小时(例如，约24小时)以40-60U/mL(例如约50U/mL)的浓度添加苯佐那酶。在一些实施例中，在转染宿主细胞后约3小时以5U/mL的浓度添加苯佐那酶。在一些实施例中，在转染宿主细胞后约3小时以15U/mL的浓度添加苯佐那酶。在一些实施例中，在转染宿主细胞后约3小时以25U/mL的浓度添加苯佐那酶。在一些实施例中，在转染宿主细胞后约3小时以50U/mL的浓度添加苯佐那酶。在一些实施例中，在转染宿主细胞后约6小时以5U/mL的浓度添加苯佐那酶。在一些实施例中，在转染宿主细胞后约6小时以15U/mL的浓度添加苯佐那酶。在一些实施例中，在转染宿主细胞后约6小时以25U/mL的浓度添加苯佐那酶。在一些实施例中，在转染宿主细胞后约6小时以50U/mL的浓度添加苯佐那酶。在一些实施例中，在转染宿主细胞后约24小时以5U/mL的浓度添加苯佐那酶。在一些实施例中，在转染宿主细胞后约24小时以15U/mL的浓度添加苯佐那酶。在一些实施例中，在转染宿主细胞后约24小时以25U/mL的浓度添加苯佐那酶。在一些实施例中，在转染宿主细胞后约24小时以50U/mL的浓度添加苯佐那酶。在一些实施例中，将盐，例如，MgCl2添加到/>中，例如，以约1-5mM、1-3mM或约2mM的浓度。在一些实施例中，本文披露的方法可包括在生产和/或纯化过程中添加/>
在一些实施例中，可以将化合物添加到培养基中以影响培养物生长，例如，抑制增殖、诱导分化和诱导或抑制基因表达。在一些实施例中，化合物是丁酸钠。在一些实施例中，本文所述的细胞培养基包含丁酸钠。
培养条件和转染条件
培养条件可以包括适合维持细胞(例如，处于静止或增殖状态)的任何培养条件。例如，培养条件可以包括若干参数，包括但不限于温度、氧含量、营养物含量(例如，葡萄糖含量)、pH(例如，增加或减少pH)、搅拌水平(例如，每分钟转数)、气流速率(例如，空气、氧气、氮气)、氧化还原电位、细胞密度(例如，光密度)、细胞活力等。培养条件的变化可以包括一个或多个培养参数的改变、修改或转变。例如，可以通过增加或减少温度、增加或减少pH(例如，添加或去除酸、碱或二氧化碳)、增加或减少氧含量(例如，引入空气、氧气、二氧化碳、氮)、增加或减少气压(例如，通过引入空气、氧气、二氧化碳、氮气)、增加或减少搅拌和/或添加或去除营养物(例如，一种或多种糖或糖源、生物质、维生素等)、增加或减少培养物和烧瓶体积的比率或前述的组合来改变培养条件。在一些实施例中，在培养期间的某个时间，例如，在转染之前，引入培养条件的变化，例如，增加或减少pH。在一些实施例中，在用慢病毒包装系统转染之前，修改pH，例如，调节至约6.0-6.8，例如，6.2-6.8，例如，6.4-6.8，例如，6.7-6.75。
培养体积和培养单元
本披露的方法可以在小细胞培养中进行，例如，以实验室规模进行，或在大规模培养中进行，例如，以工业规模进行。方法可以在适当的培养单元中进行，例如，培养瓶或生物反应器。生物反应器可以是任何尺寸，只要它可用于培养细胞，例如，哺乳动物细胞。在一些实施例中，本披露的方法是高度可规模化的，例如，多个哺乳动物细胞在扩展培养物中(例如，至少1L、至少2L、至少5L、至少10L、至少15L、至少20L)，产生的每ml培养物的转导单位数量不少于在其他方面类似的小规模培养物(例如，100ml、200ml，例如，300ml、400ml、500ml)中每ml培养物的转导单位数量的30％、40％、50％、60％、70％或80％。在一些实施例中，规模培养(即，培养体积大于50L)并且可能特别适合在对培养条件进行最小修改的情况下从小型实验室规模培养(例如，10L)扩大到生产规模培养(例如，50L和更大)。培养单元的内部条件，包括但不限于pH、pO2和温度，通常在培养期间进行控制。生产培养单元是指用于产生多肽、病毒和/或任何其他目的产品的最终培养单元。大规模生产培养单元的体积一般大于约50升，并且可以为约100、约200、约300、约500、约800、约1000、约2500、约5000、约8000、约10,000、约12,0000L或更多、或任何中间体积。合适的培养单元或生产培养单元可以由适合于在本文考虑的培养条件下保持悬浮在培养基中的细胞培养物并且有助于哺乳动物细胞例如HEK293细胞，例如Expi293F细胞生长和活力的任何材料组成(即，由其构成)。合适材料的实例包括但不限于玻璃、塑料和/或金属。在一些实施例中，一种或多种材料不干扰、或不显著或基本不干扰所需产物例如慢病毒载体的表达和/或稳定性。
在一些实施例中，细胞培养过程在多于一个不同的培养单元中进行，如使用一个或多个种子培养单元，随后使用生产培养单元。在一些实施例中，过程涉及将繁殖的种子培养物从一个或多个种子培养单元转移到大型生产单元。在一些实施例中，将细胞扩增至生产培养单元和生产阶段可在一个物理培养单元中完成，例如，可将细胞扩增至最终生产规模并将过程切换至生产条件。在培养期结束时收获用过的培养基，用于慢病毒或慢病毒载体的下游加工。在一些实施例中，可在转染后24小时、48小时、72小时、96小时或120小时后收集收获物。
在一些实施例中，下游加工包括慢病毒的纯化、配制和/或长期储存。在一些实施例中，在培养期结束时收集的病毒收获物包含慢病毒，其浓度为例如约5x106个转导单位/毫升(TU/mL)至约7x107TU/mL(例如，5x106TU/mL、5.5x106TU/mL、6x106TU/mL、6.5x106TU/mL、7x106TU/mL、7.5x106TU/mL、8x106TU/mL、8.5x106TU/mL、9x106TU/mL、9.5x106TU/mL、1x107TU/mL、1.5x107TU/mL、2x107TU/mL、2.5x107TU/mL、3x107TU/mL、3.5x107TU/mL、4x107TU/mL、4.5x107TU/mL、5x107TU/mL、5.5x107TU/mL、6x107TU/mL、6.5x107TU/mL或7x107TU/mL)。在一些实施例中，在培养期结束时收集的病毒收获物包含慢病毒，其浓度为至少5x106TU/mL、5.5x106TU/mL、6x106TU/mL、6.5x106TU/mL、7x106TU/mL、7.5x106TU/mL、8x106TU/mL、8.5x106TU/mL、9x106TU/mL、9.5x106TU/mL、1x107TU/mL、1.5x107TU/mL、2x107TU/mL、2.5x107TU/mL、3x107TU/mL、3.5x107TU/mL、4x107TU/mL、4.5x107TU/mL、5x107TU/mL、5.5x107TU/mL、6x107TU/mL、6.5x107TU/mL或7x107TU/mL。在一些实施例中，在培养期结束时收集的病毒收获物包含慢病毒，其浓度为5x106TU/mL-6x106TU/mL、6x106TU/mL-7x106TU/mL、7x106TU/mL-8x106TU/mL、8x106TU/mL-9x106TU/mL、9x106TU/mL-1x107TU/mL、1x107TU/mL-2x107TU/mL、2x107TU/mL-3x107TU/mL、3x107TU/mL-4x107TU/mL、4x107TU/mL-5x107TU/mL、5x107TU/mL-6x107TU/mL、6x107TU/mL-7x107TU/mL。
纯化方法包括过滤和色谱法
在一些方面，本披露提供了用于以改进的效率纯化慢病毒载体的过程，例如，从而回收更高量的慢病毒载体。在一些实施例中，纯化过程中的至少一个步骤包括在进一步纯化(例如离心、过滤或色谱法)之前，将试剂(例如，氨基酸或其盐，例如，精氨酸或其盐，例如，精氨酸-HCl)添加到纯化中间组合物(在完成纯化之前包含缓冲液的中间组合物)，以改进纯化过程。在一些实施例中，过滤可指但不限于流动过滤、深度过滤、切向流动过滤。在一些实施例中，色谱可包括但不限于尺寸排阻色谱、亲和色谱、疏水相互作用色谱、离子交换色谱。
在一些实施例中，根据本文所述方法产生的慢病毒载体具有以下一种或多种特性：符合GMP指南，无菌，基本上不含污染物，适用于制药，适用于人类受试者施用，或适用于人类细胞的离体治疗。
在本文所述方法的一些实施例中，溶液或悬浮液经受半透膜(过滤)，该半透膜保留较大颗粒，例如，病毒颗粒，同时允许溶剂和小溶质分子通过。在一些实施例中，本文所述的方法使用过滤器去除和交换盐、糖和非水溶剂，从结合物种中分离游离物，去除低分子量材料，和/或引起离子和/或pH环境的快速变化。过滤步骤可用于增加溶液或悬浮液中载体的浓度。在一些实施例中，过滤步骤用于增加收获时慢病毒颗粒的浓度。在一些实施例中，本文所述的方法利用过程、技术或技术组合，包含顺序或同时的过滤步骤(例如，微滤、超滤、纳滤和渗滤中的一个或多个)。在一些实施例中，使用平板膜或中空纤维进行过滤。在一些实施例中，使用约0.1-0.5巴(例如，约0.1、0.2、0.3、0.4或0.5巴)的平均跨膜压力进行过滤。在一些实施例中，使用4-100L/m2，例如，约4-10、10-20、20-30、30-40、40-50、50-60、60-70、70-80或80-90的负载进行过滤。在本披露的某些实施例中，过滤步骤用于交换与本披露有关的各种缓冲液，任选地与色谱法或其他纯化步骤组合，还任选地从病毒产量中去除杂质。
可以使用过滤技术，如上述和本领域已知的过滤技术，以产生基本上不含从中制备慢病毒载体的微生物和细胞(例如，哺乳动物细胞，例如，HEK293细胞，例如，Expi293F细胞)的慢病毒制剂。此外，或可替代地，本披露的慢病毒载体制剂可以用核酸酶处理，以制备基本上不受污染的多核苷酸的制剂(例如，来自产生慢病毒载体的细胞的非慢病毒多核苷酸，如染色体哺乳动物DNA、人类DNA、RNA或不包括在慢病毒转基因内的其他多核苷酸)。
缓冲液，例如，用于纯化
各种缓冲液，例如，包含用于病毒载体纯化的缓冲剂的缓冲剂的水性组合物是本领域已知的并且可以包括但不限于磺酸基缓冲液，例如，基于1,4-哌嗪二乙磺酸(PIPES)的缓冲液(PIPES缓冲液)、多元醇缓冲液、tris缓冲液、磷酸盐缓冲液、醋酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液。在一些实施例中，与本文披露的纯化过程相关使用的缓冲液是磺酸基缓冲液，例如，PIPES缓冲液。在一些实施例中，PIPES缓冲液可包含缓冲剂，例如，浓度为约10mM至约50mM、约15mM至约40mM、约20mM至约30mM，例如，约20mM的PIPES。
在一些实施例中，缓冲液可进一步包含盐，例如，氯化钠(NaCl)、氯化镁(MgCl2)或氯化钙(CaCl2)或其任何组合。盐可以例如以约1mM至约1M的浓度存在于水性慢病毒制剂中(例如，1mM、2mM、3mM、4mM、5mM、6mM、7mM、8mM、9mM、10mM、15mM、20mM、25mM、30mM、35mM、40mM、45mM、50mM、55mM、60mM、65mM、70mM、75mM、80mM、85mM、90mM、100mM、125mM、150mM、175mM、200mM、225mM、250mM、275mM、300mM、325mM、350mM、375mM、400mM、450mM、475mM、500mM、525mM、575mM、600mM、625mM、650mM、675mM、700mM、725mM、750mM、775mM、800mM、825mM、850mM、875mM、900mM、925mM、950mM、957mM或1M)。在一些实施例中，盐的浓度为约25mM至约250mM、约50mM至约75mM、约50mM至约200mM、或约100mM至约150mM(例如，25mM、30mM、35mM、40mM、45mM、50mM、55mM、60mM、65mM、70mM、75mM、80mM、85mM、90mM、100mM、125mM或150mM)。在一些实施例中，根据需要，盐的浓度可以是50mM或75mM。
在一些实施例中，缓冲液还可包含碳水化合物，例如，非还原性碳水化合物，例如，蔗糖或海藻糖。在一些实施例中，碳水化合物例如蔗糖以约30mM至约300mM、约40mM至约275mM、约50mM至约250mM、约60mM至约240mM、约70mM至约220mM、约30mM至150mm或约150-300mM的浓度存在。在一些实施例中，缓冲液，例如，PIPES缓冲液，例如，过滤缓冲液、交换缓冲液包含浓度为约50mM至约80mM，例如，约73mM的蔗糖。在一些实施例中，缓冲液，例如，PIPES缓冲液，例如，配制缓冲液、储存缓冲液包含浓度为约200mM至250mM，例如约220mM的蔗糖。
在一些实施例中，碳水化合物的浓度可为，例如，水性慢病毒制剂的每体积重量(w/v)约1％至约10％、约2.5％至约10％、或约2.5％至约5％。例如，碳水化合物，如本文所述的非还原性碳水化合物，可以以1％w/v、1.5％w/v、2％w/v、2.5％w/v、3％w/v、3.5％w/v、4％w/v、4.5％w/v、5％w/v、5.5％w/v、6％w/v、6.5％w/v、7％w/v、7.5％w/v、8％w/v、8.5％w/v、9％w/v、9.5％w/v或10％w/v的浓度存在于水性慢病毒制剂中。在一些实施例中，碳水化合物，如本文所述的非还原性碳水化合物，可以以至少1％w/v、1.5％w/v、2％w/v、2.5％w/v、3％w/v、3.5％w/v、4％w/v、4.5％w/v、5％w/v、5.5％w/v、6％w/v、6.5％w/v、7％w/v、7.5％w/v、8％w/v、8.5％w/v、9％w/v、9.5％w/v或10％w/v的浓度存在于水性慢病毒制剂中。在一些实施例中，碳水化合物，如本文所述的非还原性碳水化合物，可以以1％w/v-2％w/v、2％w/v-3％w/v、3％w/v-4％w/v、4％w/v-5％w/v、5％w/v-6％w/v、6％w/v-7％w/v、7％w/v-8％w/v、8％w/v-9％w/v、9％w/v-10％w/v的浓度存在于水性慢病毒制剂中。
在一些实施例中，缓冲液进一步包含例如，精氨酸或其盐，例如，精氨酸-HCl。在一些实施例中，药剂，例如，精氨酸或其盐，例如，精氨酸一盐酸盐(精氨酸-HCl)以约25-50mM(例如，约50mM)、50-100mM(例如，约75mM)、100-200mM(例如，约150mM)或200-400(例如，约300)mM的浓度添加。在一些实施例中，至少一种缓冲液，例如，用于病毒纯化(例如，使用本文披露的过程的慢病毒纯化)的PIPES缓冲液包含精氨酸，例如，精氨酸-HCl。
在一些实施例中，本文披露的纯化过程中使用的缓冲液的pH为约5.0至约8.0，例如，6.0至约7.0(例如，6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9或7.0)，例如，约6.5。
在一些实施例中，PIPES缓冲液可用作交换缓冲液、过滤缓冲液、配制缓冲液和/或储存缓冲液中的一种或多种。在一些实施例中，PIPES、NaCl和蔗糖的浓度比在PIPES过滤缓冲液、PIPES交换缓冲液、PIPES配制缓冲液和PIPES储存缓冲液中是不同的。在一些实施例中，PIPES、NaCl和蔗糖的浓度比在PIPES过滤缓冲液、PIPES交换缓冲液、PIPES配制缓冲液和PIPES储存缓冲液中是相同的。在一些实施例中，PIPES、NaCl和蔗糖的浓度比在PIPES交换缓冲液和PIPES过滤缓冲液中是相同的。在一些实施例中，PIPES、NaCl、蔗糖和任选的精氨酸例如精氨酸-HCl的浓度比在PIPES配制缓冲液和PIPES储存缓冲液中是相同的。
精氨酸掺加
在一些实施例中，将精氨酸例如精氨酸-HCl在纯化过程中添加到细胞培养收获物中。在一些实施例中，将精氨酸例如精氨酸-HCl在纯化过程中添加到包含缓冲液例如PIPES缓冲液或PIPES缓冲液的纯化中间组合物中。在一些实施例中，将精氨酸例如精氨酸-HCl添加到不包含精氨酸的PIPES缓冲液中。在一些实施例中，将精氨酸例如精氨酸-HCl添加到包含精氨酸的PIPES缓冲液中。在一些实施例中，药剂，例如，精氨酸或其盐，例如，精氨酸一氯化物(精氨酸-HCl)以约25-50mM(例如，约50mM)、50-100mM(例如，约75mM)、100-200mM(例如，约150mM)或200-400(例如，约300)mM的浓度添加。
在一些实施例中，载体回收率(例如，慢病毒转导单位的量)在包含纯化步骤的纯化过程中增加，纯化步骤包括将精氨酸添加到纯化中间组合物中，相对于不包括向纯化中间组合物中添加精氨酸的纯化步骤的纯化过程，其含量高约10％-300％、20％-180％、30％-160％、50％-150％、75％-125％或约100％。在一些实施例中，精氨酸的添加减少了纯化的过程时间。在一些实施例中，当纯化包括将例如精氨酸或其盐(例如，精氨酸-HCl)添加到纯化中间组合物中时，与不包括向纯化中间组合物中添加精氨酸的其他方面类似的纯化过程相比，该纯化的过程时间改进了至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％或至少50％。在一些实施例中，添加精氨酸或其盐(例如，精氨酸-HCl)和随后的纯化步骤后的纯化中间组合物显示每ml的总颗粒浓度小于400,000、300,000、200,000或100,000，如通过微流成像测量的。不希望受理论束缚，在一些实施例中，微流成像基本上不检测单个慢病毒颗粒(例如，感染性病毒颗粒)，而是检测包含聚集体的较大颗粒，例如，非功能性病毒的聚集体。在一些实施例中，在添加精氨酸或其盐(例如，精氨酸-HCl)和随后的纯化步骤后的纯化中间组合物显示以下≥10μm/ml的颗粒的浓度小于约5,000、4,500、4,000、3,500、3,000或2,500，如通过微流成像测量的。在一些实施例中，添加精氨酸或其盐(例如，精氨酸-HCl)和随后的纯化步骤后的纯化中间组合物显示≥25μm/ml的浓度小于500、400、300或200，如通过微流成像测量的。在一些实施例中，降低聚集体降低了在给定时间点过滤膜的堵塞。在一些实施例中，精氨酸稳定慢病毒颗粒。
在一些实施例中，纯化的慢病毒组合物包含浓度为例如约1x107个转导单位/毫升(TU/mL)至约7x107TU/mL(例如，1x107TU/mL、1.5x107TU/mL、2x107TU/mL、2.5x107TU/mL、3x107TU/mL、3.5x107TU/mL、4x107TU/mL、4.5x107TU/mL、5x107TU/mL、5.5x107TU/mL、6x107TU/mL、6.5x107TU/mL或7x107TU/mL)的慢病毒载体。
用于慢病毒储存的水性组合物
在一些实施例中，本披露提供了制剂，例如水性混合物，例如，水溶液或悬浮液，例如，包含本文所述慢病毒载体和缓冲液(例如，配制缓冲液或储存缓冲液，例如，PIPES缓冲液，例如，包含精氨酸(例如，精氨酸-HCl)的PIPES缓冲液)的水性组合物。在一些实施例中，包含配制缓冲液或储存缓冲液(例如，PIPES缓冲液，例如，包含精氨酸(例如，精氨酸-HCl)的PIPES缓冲液)的慢病毒制剂相对于含有常规慢病毒配制缓冲液(如HEPES)的慢病毒制剂表现出改进的生物学特性。如WO 2017087861 A1中所披露的，这些改进的生物学特性包括在温度和盐浓度范围内提高的抗聚集性。在一些实施例中，PIPES缓冲液在生理和升高的温度(如42℃和50℃)下显示出改进的转导能力，以及在多个冷冻/解冻循环期间对感染性损失的更大抵抗力。与本披露的慢病毒制剂结合使用的其他缓冲液包括组氨酸缓冲液、磷酸盐缓冲液、柠檬酸钠缓冲液、MES缓冲液和MOPS缓冲液。本披露的慢病毒制剂可以任选地包括盐，如氯化钠，并且可以任选地含有碳水化合物，如非还原性碳水化合物。
在一些实施例中，PIPES配制缓冲液和/或储存缓冲液可包含缓冲剂，例如，浓度为约10mM至约50mM、约15mM至约40mM、约20mM至约30mM，例如约20mM的PIPES。慢病毒载体制剂可以任选地包括盐，如氯化钠、氯化镁或氯化钙。盐可以例如以约1mM至约1M的浓度存在于水性慢病毒制剂中(例如，1mM、2mM、3mM、4mM、5mM、6mM、7mM、8mM、9mM、10mM、15mM、20mM、25mM、30mM、35mM、40mM、45mM、50mM、55mM、60mM、65mM、70mM、75mM、80mM、85mM、90mM、100mM、125mM、150mM、175mM、200mM、225mM、250mM、275mM、300mM、325mM、350mM、375mM、400mM、450mM、475mM、500mM、525mM、575mM、600mM、625mM、650mM、675mM、700mM、725mM、750mM、775mM、800mM、825mM、850mM、875mM、900mM、925mM、950mM、957mM或1M)。在一些实施例中，盐的浓度为至少约1mM、2mM、3mM、4mM、5mM、6mM、7mM、8mM、9mM、10mM、15mM、20mM、25mM、30mM、35mM、40mM、45mM、50mM、55mM、60mM、65mM、70mM、75mM、80mM、85mM、90mM、100mM、125mM、150mM、175mM、200mM、225mM、250mM、275mM、300mM、325mM、350mM、375mM、400mM、450mM、475mM、500mM、525mM、575mM、600mM、625mM、650mM、675mM、700mM、725mM、750mM、775mM、800mM、825mM、850mM、875mM、900mM、925mM、950mM、957mM或1M。在一些实施例中，盐的浓度为1-2mM、2-3mM、3-4mM、4-5mM、5-6mM、6-7mM、7-8mM、8-9mM、9-10mM、10-15mM、15-20mM、20-25mM、25-30mM、30-35mM、35-40mM、40-45mM、45-50mM、50-55mM、55-60mM、60-65mM、65-70mM、70-75mM、75-80mM、80-85mM、85-90mM、90-100mM、100-125mM、125-150mM、150-175mM、175-200mM、200-225mM、225-250mM、250-275mM、275-300mM、300-325mM、325-350mM、350-375mM、375-400mM、400-450mM、450-475mM、475-500mM、500-525mM、525-575mM、575-600mM、600-625mM、625-650mM、650-675mM、675-700mM、700-725mM、725-750mM、750-775mM、775-800mM、800-825mM、825-850mM、850-875mM、875-900mM、900-925mM、925-950mM、950-975mM或957mM-1M。在一些实施例中，盐的浓度为约25mM至约250mM、约50mM至约75mM、约50mM至约200mM、或约100mM至约150mM(例如，25mM、30mM、35mM、40mM、45mM、50mM、55mM、60mM、65mM、70mM、75mM、80mM、85mM、90mM、100mM、125mM或150mM)。在一些实施例中，根据需要，盐的浓度可以是50mM或75mM。
本披露的慢病毒载体制剂可以任选地含有碳水化合物，如本文所述的非还原性碳水化合物。示例性非还原性碳水化合物包括蔗糖和海藻糖等。当包括在慢病毒载体制剂中时，碳水化合物的浓度可为，例如，水性慢病毒制剂的每体积重量(w/v)约1％至约10％、约2.5％至约10％、或约2.5％至约5％。例如，碳水化合物，如本文所述的非还原性碳水化合物，可以以1％w/v、1.5％w/v、2％w/v、2.5％w/v、3％w/v、3.5％w/v、4％w/v、4.5％w/v、5％w/v、5.5％w/v、6％w/v、6.5％w/v、7％w/v、7.5％w/v、8％w/v、8.5％w/v、9％w/v、9.5％w/v或10％w/v的浓度存在于水性慢病毒制剂中。
本披露的慢病毒载体制剂可包含氨基酸或其盐；如丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、缬氨酸或其盐。当包括在慢病毒载体制剂中时，氨基酸例如精氨酸-HCl可以以约25-50mM(例如，约50mM)、50-100mM(例如，约75mM)、100-200mM(例如，约150mM)或200-400(例如，约300)mM的浓度存在。在一些实施例中，本文披露的慢病毒载体制剂可包含多于一种氨基酸或其盐，例如，精氨酸或其盐和组氨酸或其盐。
本文所述的慢病毒载体制剂可表现出例如，约5.0至约8.0，例如，6.0至约7.0(例如，6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9或7.0)的pH。在一些实施例中，慢病毒载体制剂的pH为6.5。
在一些实施例中，PIPES配制缓冲液和PIPES储存缓冲液包含相同的组成，例如，相同浓度的PIPES、NaCl、蔗糖、和任选的精氨酸例如精氨酸-HCl。在一些实施例中，PIPES配制缓冲液和PIPES储存缓冲液包含不同的组成，例如，不同浓度的PIPES、NaCl、蔗糖、和任选的精氨酸例如精氨酸-HCl。
慢病毒载体可以以一定浓度范围存在于本披露的慢病毒制剂中。例如，慢病毒载体可以以例如约1x107个转导单位/毫升(TU/mL)至约1x109TU/mL(例如，1x107TU/mL、2x107TU/mL、3x107TU/mL、4x107TU/mL、5x107TU/mL、6x107TU/mL、7x107TU/mL、8x107TU/mL、9x107TU/mL、1x108TU/mL、1.5x108TU/mL、2x108TU/mL、2.5x108TU/mL、3x108TU/mL、3.5x108TU/mL、4x108TU/mL、4.5x108TU/mL、5x108TU/mL、5.5x108TU/mL、6x108TU/mL、6.5x108TU/mL、7x108TU/mL、7.5x108TU/mL、8x108TU/mL、8.5x108TU/mL、9x108TU/mL、9.5x108TU/mL或1x109TU/mL)的浓度存在于慢病毒制剂中。需要时，慢病毒制剂可含有浓度为约3x108TU/mL至约5x108TU/mL(例如，3x108TU/mL、3.5x108TU/mL、4x108TU/mL、4.5x108TU/mL或5x108TU/mL)的慢病毒载体。
本披露还提供了水性组合物，其各自包含慢病毒载体，选自由磷酸盐缓冲液、柠檬酸钠缓冲液、2-(N-吗啉代)乙磺酸(MES)缓冲液、3-吗啉丙烷-1-磺酸(MOPS)缓冲液组成的组的缓冲液，以及盐(例如，氯化钠、氯化镁或氯化钙)。这些组合物可进一步包括碳水化合物，例如，非还原性碳水化合物(例如，蔗糖或海藻糖)。
在一些实施例中，水性组合物，例如，包含本文所述的慢病毒载体的水性组合物在低温下例如在10℃下、在6℃下、在4℃下、在0℃下、在-10℃下、在-20℃下、在-30℃下、在-40℃下、在-50℃下、在-60℃下、在-70℃下、在-80℃下或在-90℃下储存一段时间，例如，约20分钟、40分钟、60分钟、1.5小时、2小时、5小时、10小时、15小时、20小时、1天、2天、3天、4天、5天、7天、10天、12天、14天、16天、18天、20天、21天或25天。在一些实施例中，水性组合物储存在低于10℃、6℃、4℃、0℃、-10℃、-20℃、-30℃、-40℃、-50℃、-60℃、-70℃、-80℃或-90℃。在一些实施例中，在冷冻条件下纯化后立即将储存在PIPES储存缓冲液中的纯化的慢病毒样品储存在-80℃下。在一些实施例中，因此储存的慢病毒制剂可以在使用前解冻并重新冷冻(例如，冷冻-解冻循环)。在一些实施例中，如本文所披露制备和储存的慢病毒制剂可以进行至少1、至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9个冷冻-解冻循环，没有任何明显稳定性和/或感染性的明显损失。在一些实施例中，与从未经历过冷冻-解冻循环的慢病毒制剂相比，该制剂显示不超过0.5％、超过1％、超过2％、超过3％、超过4％、超过5％、超过10％、超过15％、超过20％、超过25％、超过30％、超过40％、超过50％、超过60％、超过70％或超过80％的稳定性和/或感染性损失。
在一些实施例中，本文所披露的慢病毒制剂可以在4℃的冷藏条件下储存一段时间，例如，约20分钟、40分钟、60分钟、1.5小时、2小时、5小时、10小时、15小时、20小时、1天、2天、3天、4天、5天、7天、10天、12天、14天、16天、18天、20天、21天或25天。在一些实施例中，本文所披露的慢病毒制剂可以在-80℃的冷冻状态中储存一段时间，例如，约20分钟、40分钟、60分钟、1.5小时、2小时、5小时、10小时、15小时、20小时、1天、2天、3天、4天、5天、7天、10天、12天、14天、16天、18天、20天、21天或25天。在一些实施例中，与从未冷冻的慢病毒相比，如本文所披露(例如，储存在冷冻条件下)的慢病毒制剂显示出至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少98％、至少99％或100％的感染性。在一些实施例中，在经历多于1个(例如，2、3、4、5、6、7、8或9个)冷冻-解冻循环后，慢病毒制剂损失不超过0.5％、不超过1％、不超过2％、不超过5％、不超过7％、不超过10％、不超过15％、不超过20％、不超过25％、不超过30％、不超过40％、不超过50％、不超过60％、不超过70％、不超过80％的感染性损失。在一些实施例中，与从未冷冻的慢病毒相比，如本文所披露(例如，储存在冷冻条件下)的慢病毒制剂是至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少92％、至少95％、至少98％、至少99％或100％稳定的。在一些实施例中，在冷冻至少5小时、至少12小时、至少18小时、至少1天、至少2天、至少3天、至少5天、至少7天后使用慢病毒制剂以改进载体整合。
本披露进一步包括通过干燥或冻干本文所述的水性组合物制备的干燥或冻干组合物，以及通过在本文所述的缓冲液(或用于施用的另一种标准媒介物)中重构此类干燥或冻干组合物制备的水性组合物)。
CAR靶标
本文所述的是病毒载体以转导免疫效应细胞(例如，T细胞、NK细胞)，这些免疫效应细胞被工程改造为含有一种或多种嵌合抗原受体(CAR)，该一种或多种CAR将免疫效应细胞引导至不希望的细胞(例如，癌细胞)。这通过CAR上的抗原结合结构域实现，抗原结合结构域对癌症相关抗原具有特异性。CAR可以靶向的两类癌症相关抗原(肿瘤抗原)是：(1)在癌细胞表面上表达的癌症相关抗原；和(2)本身在细胞内的癌症相关抗原，然而，这种抗原(肽)的片段通过MHC(主要组织相容性复合物)呈递在癌细胞的表面上。
在一些实施例中，肿瘤抗原选自以下中的一种或多种：CD19；CD123；CD22；CD30；CD171；CS-1(也称为CD2亚群1、CRACC、SLAMF7、CD319、以及19A24)；C型凝集素样分子-1(CLL-1或CLECL1)；CD33；表皮生长因子受体变体III(EGFRvIII)；神经节苷脂G2(GD2)；神经节苷脂GD3(aNeu5Ac(2-8)aNeu5Ac(2-3)bDGalp(1-4)bDGlcp(1-1)Cer)；TNF受体家族成员B细胞成熟(BCMA)；Tn抗原((Tn Ag)或(GalNAcα-Ser/Thr))；前列腺特异性膜抗原(PSMA)；受体酪氨酸激酶样孤儿受体1(ROR1)；Fms样酪氨酸激酶3(FLT3)；肿瘤相关糖蛋白72(TAG72)；CD38；CD44v6；癌胚抗原(CEA)；上皮细胞粘附分子(EPCAM)；B7H3(CD276)；KIT(CD117)；白细胞介素-13受体亚基α-2(IL-13Ra2或CD213A2)；间皮素；白细胞介素11受体α(IL-11Ra)；前列腺干细胞抗原(PSCA)；蛋白酶丝氨酸21(睾蛋白或PRSS21)；血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)；Lewis(Y)抗原；CD24；血小板来源的生长因子受体β(PDGFR-β)；阶段特异性胚胎抗原-4(SSEA-4)；CD20；叶酸受体α；受体酪氨酸蛋白激酶ERBB2(Her2/neu)；黏蛋白1，细胞表面相关蛋白(MUC1)；表皮生长因子受体(EGFR)；神经细胞粘附分子(NCAM)；前列腺酶；前列腺酸性磷酸酶(PAP)；突变的延伸因子2(ELF2M)；肝配蛋白B2；成纤维细胞活化蛋白α(FAP)；胰岛素样生长因子1受体(IGF-I受体)，碳酸酐酶IX(CAIX)；蛋白酶体(前体，巨蛋白因子)亚基，β型，9(LMP2)；糖蛋白100(gp100)；由断裂点簇集区(BCR)和Abelson鼠白血病病毒致癌基因同源物1(Abl)组成的致癌基因融合蛋白(bcr-abl)；酪氨酸酶；肝配蛋白A型受体2(EphA2)；岩藻糖基GM1；唾液酸Lewis粘附分子(sLe)；神经节苷脂GM3(aNeu5Ac(2-3)bDGalp(1-4)bDGlcp(1-1)Cer)；转谷氨酰胺酶5(TGS5)；高分子量-黑素瘤相关抗原(HMWMAA)；o-乙酰基-GD2神经节苷脂(OAcGD2)；叶酸受体β；肿瘤内皮标记1(TEM1/CD248)；肿瘤内皮标记7相关蛋白(TEM7R)；密封蛋白6(CLDN6)；促甲状腺激素受体(TSHR)；G蛋白偶联受体C类5组，成员D(GPRC5D)；染色体X开放阅读框61(CXORF61)；CD97；CD179a；间变性淋巴瘤激酶(ALK)；聚唾液酸；胎盘特异性1(PLAC1)；globoH糖基神经酰胺(GloboH)的六糖部分；乳腺分化抗原(NY-BR-1)；尿溶蛋白2(UPK2)；甲型肝炎病毒细胞受体1(HAVCR1)；肾上腺素受体β3(ADRB3)；泛连接蛋白3(PANX3)；G蛋白偶联受体20(GPR20)；淋巴细胞抗原6复合物，基因座K 9(LY6K)；嗅觉受体51E2(OR51E2)；TCRγ替代性阅读框蛋白(TARP)；肾母细胞瘤蛋白(WT1)；癌/睾丸抗原1(NY-ESO-1)；癌/睾丸抗原2(LAGE-1a)；黑素瘤相关抗原1(MAGE-A1)；ETS易位变异基因6，位于染色体12p上(ETV6-AML)；精子蛋白17(SPA17)；X抗原家族，成员1A(XAGE1)；血管生成素结合细胞表面受体2(Tie2)；黑素瘤癌睾丸抗原-1(MAD-CT-1)；黑素瘤癌睾丸抗原-2(MAD-CT-2)；Fos相关抗原1；肿瘤蛋白p53(p53)；p53突变体；前列腺特异性蛋白；存活蛋白；端粒酶；前列腺癌肿瘤抗原-1(PCTA-1或半乳糖蛋白8)、T细胞1识别的黑素瘤抗原(MelanA或MART1)；大鼠肉瘤(Ras)突变体；人端粒酶逆转录酶(hTERT)；肉瘤易位断点；黑素瘤细胞凋亡抑制剂(ML-IAP)；ERG(跨膜蛋白酶、丝氨酸2(TMPRSS2)ETS融合基因)；N-乙酰葡糖胺基转移酶V(NA17)；配对盒蛋白Pax-3(PAX3)；雄激素受体；细胞周期蛋白B1；v-myc禽类骨髓细胞瘤病毒致癌基因神经母细胞瘤来源同源物(MYCN)；Ras同源物家族成员C(RhoC)；酪氨酸酶相关蛋白2(TRP-2)；细胞色素P450 1B1(CYP1B1)；CCCTC-结合因子(锌指蛋白)样(BORIS或印记位点调节因子样蛋白(Brother of the Regulator ofImprinted Sites))，T细胞3识别的鳞状细胞癌抗原(SART3)；配对盒蛋白Pax-5(PAX5)；前顶体蛋白结合蛋白sp32(OY-TES1)；淋巴细胞特异性蛋白酪氨酸激酶(LCK)；激酶锚蛋白4(AKAP-4)；滑膜肉瘤，X断点2(SSX2)；晚期糖基化终产物受体(RAGE-1)；肾遍在蛋白1(RU1)；肾遍在蛋白2(RU2)；豆荚蛋白；人乳头状瘤病毒E6(HPV E6)；人乳头状瘤病毒E7(HPV E7)；肠羧酸酯酶；突变的热休克蛋白70-2(mut hsp70-2)；CD79a；CD79b；CD72；白细胞相关的免疫球蛋白样受体1(LAIR1)；IgA受体的Fc片段(FCAR或CD89)；白细胞免疫球蛋白样受体亚家族A成员2(LILRA2)；CD300分子样家族成员f(CD300LF)；C型凝集素结构域家族12成员A(CLEC12A)；骨髓基质细胞抗原2(BST2)；含EGF样模块的粘蛋白样激素受体样2(EMR2)；淋巴细胞抗原75(LY75)；磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(GPC3)；Fc受体样5(FCRL5)；以及免疫球蛋白λ样多肽1(IGLL1)。
本文所述的CAR可以包含与支持肿瘤的抗原(例如，如本文所述的支持肿瘤的抗原)结合的抗原结合结构域(例如，抗体或抗体片段，TCR或TCR片段)。在一些实施例中，支持肿瘤的抗原是存在于基质细胞或骨髓源性遏制细胞(MDSC)上的抗原。基质细胞可以分泌生长因子以促进微环境中的细胞分裂。MDSC细胞可以抑制T细胞增殖和活化。不希望受理论束缚，在一些实施例中，表达CAR的细胞破坏支持肿瘤的细胞，从而间接地抑制肿瘤生长或存活。
在实施例中，基质细胞抗原选自以下中的一种或多种：骨髓基质细胞抗原2(BST2)、成纤维细胞活化蛋白(FAP)和腱生蛋白。在一个实施例中，FAP特异性抗体是西罗珠单抗，与西罗珠单抗竞争结合、或具有与西罗珠单抗相同的CDR。在实施例中，MDSC抗原选自以下中的一种或多种：CD33、CD11b、C14、CD15和CD66b。因此，在一些实施例中，支持肿瘤的抗原选自以下中的一种或多种：骨髓基质细胞抗原2(BST2)、成纤维细胞活化蛋白(FAP)或腱生蛋白、CD33、CD11b、C14、CD15、以及CD66b。
CD19
非限制性示例性肿瘤抗原是CD19。结合CD19的CAR是本领域已知的。例如，可以根据本披露使用WO 2012/079000和WO 2014/153270中披露的那些。可以根据本披露使用本领域任何已知的CD19 CAR，例如，任何已知的CD19 CAR的CD19抗原结合结构域。例如，LG-740；CD19 CAR描述于以下中：美国专利号8,399,645；美国专利号7,446,190；Xu等人,LeukLymphoma.[白血病淋巴瘤]2013 54(2):255-260(2012)；Cruz等人,Blood[血液]122(17):2965-2973(2013)；Brentjens等人,Blood[血液]118(18):4817-4828(2011)；Kochenderfer等人,Blood[血液]116(20):4099-102(2010)；Kochenderfer等人,Blood[血液]122(25):4129-39(2013)；以及16th Annu Meet Am Soc Gen Cell Ther(ASGCT)[美国基因与细胞治疗学会(ASGCT)第16届年度会议](5月15-18日，盐湖城)2013,文摘10。
非限制性的示例性CD19 CAR包括本文所述的CD19 CAR、或描述于以下中的抗CD19CAR：Xu等人Blood[血液]123.24(2014):3750-9；Kochenderfer等人Blood[血液],122.25(2013):4129-39；Cruz等人Blood[血液]122.17(2013):2965-73、NCT00586391、NCT01087294、NCT02456350、NCT00840853、NCT02659943、NCT02650999、NCT02640209、NCT01747486、NCT02546739、NCT02656147、NCT02772198、NCT00709033、NCT02081937、NCT00924326、NCT02735083、NCT02794246、NCT02746952、NCT01593696、NCT02134262、NCT01853631、NCT02443831、NCT02277522、NCT02348216、NCT02614066、NCT02030834、NCT02624258、NCT02625480、NCT02030847、NCT02644655、NCT02349698、NCT02813837、NCT02050347、NCT01683279、NCT02529813、NCT02537977、NCT02799550、NCT02672501、NCT02819583、NCT02028455、NCT01840566、NCT01318317、NCT01864889、NCT02706405、NCT01475058、NCT01430390、NCT02146924、NCT02051257、NCT02431988、NCT01815749、NCT02153580、NCT01865617、NCT02208362、NCT02685670、NCT02535364、NCT02631044、NCT02728882、NCT02735291、NCT01860937、NCT02822326、NCT02737085、NCT02465983、NCT02132624、NCT02782351、NCT01493453、NCT02652910、NCT02247609、NCT01029366、NCT01626495、NCT02721407、NCT01044069、NCT00422383、NCT01680991、NCT02794961或NCT02456207，这些文献各自通过引用以其全文并入本文。
在一些实施例中，抗原结合结构域结合CD19并且具有与描述于Nicholson等人Mol.Immun.[分子免疫学]34(16-17):1157-1165(1997)中的FMC63 scFv片段相同或相似的结合特异性。在一些实施例中，抗原结合结构域结合CD19并且包括在Nicholson等人Mol.Immun.[分子免疫学]34(16-17):1157-1165(1997)中描述的scFv片段。
在一些实施例中，抗原结合结构域(例如，人源化抗原结合结构域)结合CD19并且包含来自WO 2014/153270(通过引用并入本文)的表3的序列。WO 2014/153270还描述了测定各种CAR构建体的结合和功效的方法。
对于临床环境，鼠CD19抗体的人源化可以是所希望的，其中小鼠特异性残基在接受CART19治疗(即，用CAR19构建体转导的T细胞治疗)的患者中可以诱导人-抗-小鼠抗原(HAMA)应答。人源化CD19CAR序列的产生、表征和功效描述于国际申请WO 2014/153270中，将文献通过引用以其全文并入本文，包括实例1-5(第115-159页)。
在一些实施例中，抗原结合结构域包含WO 2012/079000(通过引用并入本文)中提供的CAR19构建体的亲本小鼠scFv序列。在一些实施例中，抗原结合结构域结合CD19并且包含WO 2012/079000中描述的scFv。
在一些实施例中，CD19 CAR包含在WO 2012/079000中作为SEQ ID NO:12提供的融合多肽序列，其提供特异性结合至人CD19的鼠源scFv片段。
在一些实施例中，CD19 CAR包含在WO 2012/079000中作为SEQ ID NO:12提供的氨基酸序列。
在一些实施例中，CD19 CAR包含氨基酸序列：
diqmtqttsslsaslgdrvtiscrasqdiskylnwyqqkpdgtvklliyhtsrlhsgvpsrfsgsgsgtdysltisnleqediatyfcqqgntlpytfgggtkleitggggsggggsggggsevklqesgpglvapsqslsvtctvsgvslpdygvswirqpprkglewlgviwgsettyynsalksrltiikdnsksqvflkmnslqtddtaiyycakhyyyggsyamdywgqgtsvtvsstttpaprpptpaptiasqplslrpeacrpaaggavhtrgldfacdiyiwaplagtcgvlllslvitlyckrgrkkllyifkqpfmrpvqttqeedgcscrfpeeeeggcelrvkfsrsadapaykqgqnqlynelnlgrreeydvldkrrgrdpemggkprrknpqeglynelqkdkmaeayseigmkgerrrgkghdglyqglstatkdtydalhmqalppr(SEQ ID NO:757)、或与其基本上同源的序列。
在一些实施例中，CD19 CAR包含氨基酸序列：
eivmtqspatlslspgeratlscrasqdiskylnwyqqkpgqaprlliyhtsrlhsgiparfsgsgsgtdytltisslqpedfavyfcqqgntlpytfgqgtkleikggggsggggsggggsqvqlqesgpglvkpsetlsltctvsgvslpdygvswirqppgkglewigviwgsettyyqsslksrvtiskdnsknqvslklssvtaadtavyycakhyyyggsyamdywgqgtlvtvss(SEQ ID NO:758)
在一些实施例中，CD19 CAR是人源化的CD19 CAR，其包含氨基酸序列：
eivmtqspatlslspgeratlscrasqdiskylnwyqqkpgqaprlliyhtsrlhsgiparfsgsgsgtdytltisslqpedfavyfcqqgntlpytfgqgtkleikggggsggggsggggsqvqlqesgpglvkpsetlsltctvsgvslpdygvswirqppgkglewigviwgsettyyqsslksrvtiskdnsknqvslklssvtaadtavyycakhyyyggsyamdywgqgtlvtvsstttpaprpptpaptiasqplslrpeacrpaaggavhtrgldfacdiyiwaplagtcgvlllslvitlyckrgrkkllyifkqpfmrpvqttqeedgcscrfpeeeeggcelrvkfsrsadapaykqgqnqlynelnlgrreeydvldkrrgrdpemggkprrknpqeglynelqkdkmaeayseigmkgerrrgkghdglyqglstatkdtydalhmqalppr(SEQ ID NO:759)
在一些实施例中，CD19 CAR包含序列，例如，披露于以下表1中的CDR、VH、VL、scFv、或完整CAR序列，或与其具有至少80％、85％、90％、95％或99％同一性的序列。
表1.示例性抗CD19分子的氨基酸和核酸序列
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示例性CD19 CAR A
在一些实施例中，CD19 CAR包含FMC63单克隆抗体来源的单链可变片段(scFv)的结合结构域、IgG4铰链区、CD28跨膜结构域、4-1BB(CD137)共刺激结构域和CD3ζ活化结构域。在一些实施例中，CD19CAR由表25的核苷酸序列或具有至少80％、85％、90％、95％、97％或100％或不超过20、15、10、8、5、4、3、2或1个变异的核苷酸序列编码。在一些实施例中，CD19 CAR包含由表25的核苷酸序列或具有至少80％、85％、90％、95％、97％或100％或不超过20、15、10、8、5、4、3、2或1个变异的核苷酸序列编码的多肽。在一些实施例中，CD19 CAR包含表25的多肽序列或具有至少80％、85％、90％、95％、97％或100％或不超过20、15、10、8、5、4、3、2或1个变异的多肽序列。在一些实施例中，CD19 CAR包含表25的序列的重链CDR1-3和轻链CDR1-3。在一些实施例中，CD19 CAR包含根据卡巴特的表25的序列的重链CDR1-3和轻链CDR1-3。在一些实施例中，CD19 CAR包含根据乔西亚的表25的序列的重链CDR1-3和轻链CDR1-3。在一些实施例中，CD19CAR包含表25的序列的重链CDR1-3。在一些实施例中，CD19CAR包含根据卡巴特的表25的序列的重链CDR1-3。在一些实施例中，CD19CAR包含根据乔西亚的表25的序列的重链CDR1-3。在一些实施例中，CD19 CAR包含表25的序列的轻链CDR1-3。在一些实施例中，CD19CAR包含根据卡巴特的表25的序列的轻链CDR1-3。在一些实施例中，CD19 CAR包含根据乔西亚的表25的序列的轻链CDR1-3。
表25：示例性CD19 CAR的氨基酸和核酸序列
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示例性CD19 CAR B
在一些实施例中，CD19 CAR包含与CD28和CD3-ζ共刺激结构域连接的鼠抗CD19单链可变片段(scFv)。在某些实施例中，抗CD19单链变量片段包含FMC63抗体(例如，Nicholson等人,Molecular Immunology[分子免疫学],34(16-17):1157-1165,1997中描述的抗体；将这些文献的全部内容通过引用并入本文)。在一些实施例中，CD19 CAR由表26的核苷酸序列或具有至少80％、85％、90％、95％、97％或100％或不超过20、15、10、8、5、4、3、2或1个变异的核苷酸序列编码。在一些实施例中，CD19 CAR包含由表26的核苷酸序列或具有至少80％、85％、90％、95％、97％或100％或不超过20、15、10、8、5、4、3、2或1个变异的核苷酸序列编码的多肽。在一些实施例中，CD19 CAR包含表26的多肽序列或具有至少80％、85％、90％、95％、97％或100％或不超过20、15、10、8、5、4、3、2或1个变异的多肽序列。在一些实施例中，CD19 CAR包含表26的序列的重链CDR1-3和轻链CDR1-3。在一些实施例中，CD19CAR包含根据卡巴特的表26的序列的重链CDR1-3和轻链CDR1-3。在一些实施例中，CD19 CAR包含根据乔西亚的表26的序列的重链CDR1-3和轻链CDR1-3。在一些实施例中，CD19CAR包含表26的序列的重链CDR1-3。在一些实施例中，CD19 CAR包含根据卡巴特的表26的序列的重链CDR1-3。在一些实施例中，CD19CAR包含根据乔西亚的表26的序列的重链CDR1-3。在一些实施例中，CD19 CAR包含表26的序列的轻链CDR1-3。在一些实施例中，CD19CAR包含根据卡巴特的表26的序列的轻链CDR1-3。在一些实施例中，CD19 CAR包含根据乔西亚的表26的序列的轻链CDR1-3。
表26：示例性CD19 CAR的氨基酸和核酸序列
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示例性CD19 CAR C
在一些实施例中，CD19 CAR包含与CD28和CD3-ζ共刺激结构域连接的鼠抗CD19单链可变片段(scFv)。在一些实施例中，CD19 CAR由表27的核苷酸序列或具有至少80％、85％、90％、95％、97％或100％或不超过20、15、10、8、5、4、3、2或1个变异的核苷酸序列编码。在一些实施例中，CD19 CAR包含由表27的核苷酸序列或具有至少80％、85％、90％、95％、97％或100％或不超过20、15、10、8、5、4、3、2或1个变异的核苷酸序列编码的多肽。在一些实施例中，CD19 CAR包含表27的多肽序列或具有至少80％、85％、90％、95％、97％或100％或不超过20、15、10、8、5、4、3、2或1个变异的多肽序列。在一些实施例中，CD19 CAR包含表27的序列的重链CDR1-3和轻链CDR1-3。在一些实施例中，CD19 CAR包含根据卡巴特的表27的序列的重链CDR1-3和轻链CDR1-3。在一些实施例中，CD19 CAR包含根据乔西亚的表27的序列的重链CDR1-3和轻链CDR1-3。在一些实施例中，CD19CAR包含表27的序列的重链CDR1-3。在一些实施例中，CD19 CAR包含根据卡巴特的表27的序列的重链CDR1-3。在一些实施例中，CD19CAR包含根据乔西亚的表27的序列的重链CDR1-3。在一些实施例中，CD19 CAR包含表27的序列的轻链CDR1-3。在一些实施例中，CD19CAR包含根据卡巴特的表27的序列的轻链CDR1-3。在一些实施例中，CD19 CAR包含根据乔西亚的表27的序列的轻链CDR1-3。
表27：示例性CD19 CAR的氨基酸和核酸序列
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示例性CD19 CAR F
在一些实施例中，CD19 CAR由表27的核苷酸序列或具有至少80％、85％、90％、95％、97％或100％或不超过20、15、10、8、5、4、3、2或1个变异的核苷酸序列编码。在一些实施例中，CD19 CAR包含由表34的核苷酸序列或具有至少80％、85％、90％、95％、97％或100％或不超过20、15、10、8、5、4、3、2或1个变异的核苷酸序列编码的多肽。在一些实施例中，CD19 CAR包含表34的多肽序列或具有至少80％、85％、90％、95％、97％或100％或不超过20、15、10、8、5、4、3、2或1个变异的多肽序列。在一些实施例中，CD19 CAR包含表34的序列的重链CDR1-3和轻链CDR1-3。在一些实施例中，CD19 CAR包含根据卡巴特的表34的序列的重链CDR1-3和轻链CDR1-3。在一些实施例中，CD19 CAR包含根据乔西亚的表34的序列的重链CDR1-3和轻链CDR1-3。在一些实施例中，CD19 CAR包含表34的序列的重链CDR1-3。在一些实施例中，CD19 CAR包含根据卡巴特的表34的序列的重链CDR1-3。在一些实施例中，CD19CAR包含根据乔西亚的表34的序列的重链CDR1-3。在一些实施例中，CD19 CAR包含表34的序列的轻链CDR1-3。在一些实施例中，CD19 CAR包含根据卡巴特的表34的序列的轻链CDR1-3。在一些实施例中，CD19 CAR包含根据乔西亚的表34的序列的轻链CDR1-3。
表34：示例性CD19 CAR的氨基酸和核酸序列
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示例性CD19-CD20 CAR G
在一些实施例中，CD19 CAR是双特异性CAR。在某些实施例中，CD19双特异性CAR包含靶向CD19的轻链可变结构域和靶向不同靶点(例如，CD20)的重链可变结构域。在一些实施例中，双特异性car是抗CD19和抗CD20 CAR。在一些实施例中，双特异性CAR由表35的核苷酸序列或具有至少80％、85％、90％、95％、97％或100％或不超过20、15、10、8、5、4、3、2或1个变异的核苷酸序列编码。在一些实施例中，双特异性CAR包含由表35的核苷酸序列或具有至少80％、85％、90％、95％、97％或100％或不超过20、15、10、8、5、4、3、2或1个变异的核苷酸序列编码的多肽。在一些实施例中，双特异性CAR包含表35的多肽序列或具有至少80％、85％、90％、95％、97％或100％或不超过20、15、10、8、5、4、3、2或1个变异的多肽序列。在一些实施例中，双特异性CAR包含表35的序列的重链CDR1-3和轻链CDR1-3。在一些实施例中，双特异性CAR包含根据卡巴特的表35的序列的重链CDR1-3和轻链CDR1-3。在一些实施例中，双特异性CAR包含根据乔西亚的表35的序列的重链CDR1-3和轻链CDR1-3。在一些实施例中，双特异性CAR包含表35的序列的重链CDR1-3。在一些实施例中，双特异性CAR包含根据卡巴特的表35的序列的重链CDR1-3。在一些实施例中，双特异性CAR包含根据乔西亚的表35的序列的重链CDR1-3。在一些实施例中，双特异性CAR包含表35的序列的轻链CDR1-3。在一些实施例中，双特异性CAR包含根据卡巴特的表35的序列的轻链CDR1-3。在一些实施例中，双特异性CAR包含根据乔西亚的表35的序列的轻链CDR1-3。
表35：示例性CD19 CAR的氨基酸和核酸序列
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BCMA
非限制性示例性肿瘤抗原是BCMA。结合BCMA的CAR是本领域已知的。例如，可以根据本披露使用WO 2016/014565或WO 2019/241426披露的那些。可以根据本披露使用本领域任何已知的BCMACAR，例如，任何已知的BCMACAR的BCMA抗原结合结构域。例如，WO 2016/014565中披露的BCMA-1、BCMA-2、BCMA-3、BCMA-4、BCMA-5、BCMA-6、BCMA-7、BCMA-8,BCMA-9、BCMA-10、BCMA-11、BCMA-12、BCMA-13、BCMA-14、BCMA-15、149362、149363、149364、149365、149366、149367、149368、149369、BCMA_EBB-C1978-A4、BCMA_EBB-C1978-G1、BCMA_EBB-C1979-C1、BCMA_EBB-C1978-C7、BCMA_EBB-C1978-D10、BCMA_EBB-C1979-C12、BCMA_EBB-C1980-G4、BCMA_EBB-C1980-D2、BCMA_EBB-C1978-A10、BCMA_EBB-C1978-D4、BCMA_EBB-C1980-A2、BCMA_EBB-C1981-C3、BCMA_EBB-C1978-G4、A7D12.2、C11D5.3、C12A3.2或C13F12.1。
在一些实施例中，BCMACAR包含披露于WO 2016/014565中的BCMA-1、BCMA-2、BCMA-3、BCMA-4、BCMA-5、BCMA-6、BCMA-7、BCMA-8、BCMA-9、BCMA-10、BCMA-11、BCMA-12、BCMA-13、BCMA-14、BCMA-15、149362、149363、149364、149365、149366、149367、149368、149369、BCMA_EBB-C1978-A4、BCMA_EBB-C1978-G1、BCMA_EBB-C1979-C1、BCMA_EBB-C1978-C7、BCMA_EBB-C1978-D10、BCMA_EBB-C1979-C12、BCMA_EBB-C1980-G4、BCMA_EBB-C1980-D2、BCMA_EBB-C1978-A10、BCMA_EBB-C1978-D4、BCMA_EBB-C1980-A2、BCMA_EBB-C1981-C3、BCMA_EBB-C1978-G4、A7D12.2、C11D5.3、C12A3.2、或C13F12.1的一种或多种CDR、VH、VL、scFv、或全长序列、或基本上(例如，95％-99％)与其相同的序列。
结合BCMA的示例性抗原结合结构域披露于WO2012/0163805、WO 2017/021450、WO2017/011804、WO 2017/025038、WO 2016/090327、WO 2016/130598、WO 2016/210293、WO2016/090320、WO 2016/014789、WO 2016/094304、WO 2016/154055、WO 2015/166073、WO2015/188119、WO 2015/158671、US 9,243,058、US 8,920,776、US 9,273,141、US 7,083,785、US 9,034,324、US 2007/0049735、US 2015/0284467、US 2015/0051266、US 2015/0344844、US 2016/0131655、US 2016/0297884、US 2016/0297885、US 2017/0051308、US2017/0051252、WO 2016/020332、WO 2016/087531、WO 2016/079177、WO 2015/172800、WO2017/008169、US 9,340,621、US 2013/0273055、US 2016/0176973、US 2015/0368351、US2017/0051068、US 2016/0368988、和US 2015/0232557中，将其通过引用以其全文并入本文。在一些实施例中，其中披露的一个或多个BCMA抗原结合结构域的抗原结合结构域。
在一些实施例中，抗原结合结构域包含人抗体或结合BCMA的人抗体片段。在一些实施例中，抗原结合结构域包含本文(例如，表2-14中)的人抗BCMA结合结构域的一个或多个(例如，全部三个)LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3，和/或本文(例如，表2-14中)的人抗BCMA结合结构域的一个或多个(例如，全部三个)HC CDR1、HC CDR2和HC CDR3。在一些实施例中，人抗BCMA结合结构域包含本文(例如，表2、表6和表10中)的人VL和/或本文(例如，表2、表6和表10中)的人VH。在一些实施例中，抗原结合结构域是scFv，scFv包含表2、表6和表10的氨基酸序列的VL和VH。在一些实施例中，抗原结合结构域(例如，scFv)包含：VL，所述VL包含具有表2、表6和表10中提供的氨基酸序列的至少一个、两个或三个修饰(例如，取代，例如，保守取代)但不超过30个、20个或10个修饰(例如，取代，例如，保守取代)的氨基酸序列，或与表2、6和10的氨基酸序列具有95％-99％的同一性的序列；和/或VH，所述VH包含具有表2、表6和表10中提供的氨基酸序列的至少一个、两个或三个修饰(例如，取代，例如，保守取代)但不超过30个、20个或10个修饰(例如，取代，例如，保守取代)的氨基酸序列，或与表2、6和10的氨基酸序列具有95％-99％的同一性的序列。
在某些实施例中，本文所述的抗原结合结构域包括：
(1)选自以下中的一个、两个或三个轻链(LC)CDR：
(i)SEQ ID NO:54的LC CDR1、SEQ ID NO:55的LC CDR2和SEQ ID NO:56的LCCDR3；和/或
(2)选自以下中的一者的一个、两个或三个重链(HC)CDR：
(i)SEQ ID NO:44的HC CDR1、SEQ ID NO:45的HC CDR2和SEQ ID NO:84的HCCDR3；(ii)SEQ ID NO:44的HC CDR1、SEQ ID NO:45的HC CDR2和SEQ ID NO:46的HC CDR3；(iii)SEQ ID NO:44的HC CDR1、SEQ ID NO:45的HC CDR2和SEQ ID NO:68的HC CDR3；或(iv)SEQ ID NO:44的HC CDR1、SEQ ID NO:45的HC CDR2和SEQ ID NO:76的HC CDR3。
在某些实施例中，本文所述的抗原结合结构域包括：
(1)选自以下中的一者的一个、两个或三个轻链(LC)CDR：
(i)SEQ ID NO:95的LC CDR1、SEQ ID NO:131的LC CDR2和SEQ ID NO:132的LCCDR3；(ii)SEQ ID NO:95的LC CDR1、SEQ ID NO:96的LC CDR2和SEQ ID NO:97的LC CDR3；(iii)SEQ ID NO:95的LC CDR1、SEQ ID NO:114的LC CDR2和SEQ ID NO:115的LC CDR3；或(iv)SEQ ID NO:95的LC CDR1、SEQ ID NO:114的LC CDR2和SEQ ID NO:97的LC CDR3；和/或
(2)选自以下中的一者的一个、两个或三个重链(HC)CDR：
(i)SEQ ID NO:86的HC CDR1、SEQ ID NO:130的HC CDR2和SEQ ID NO:88的HCCDR3；(ii)SEQ ID NO:86的HC CDR1、SEQ ID NO:87的HC CDR2和SEQ ID NO:88的HC CDR3；或(iii)SEQ ID NO:86的HC CDR1、SEQ ID NO:109的HC CDR2和SEQ ID NO:88的HC CDR3。
在某些实施例中，本文所述的抗原结合结构域包括：
(1)选自以下中的一者的一个、两个或三个轻链(LC)CDR：
(i)SEQ ID NO:147的LC CDR1、SEQ ID NO:182的LC CDR2和SEQ ID NO:183的LCCDR3；(ii)SEQ ID NO:147的LC CDR1、SEQ ID NO:148的LC CDR2和SEQ ID NO:149的LCCDR3；或(iii)SEQ ID NO:147的LC CDR1、SEQ ID NO:170的LC CDR2和SEQ ID NO:171的LCCDR3；和/或
(2)选自以下中的一者的一个、两个或三个重链(HC)CDR：
(i)SEQ ID NO:179的HC CDR1、SEQ ID NO:180的HC CDR2和SEQ ID NO:181的HCCDR3；(ii)SEQ ID NO:137的HC CDR1、SEQ ID NO:138的HC CDR2和SEQ ID NO:139的HCCDR3；或(iii)SEQ ID NO:160的HC CDR1、SEQ ID NO:161的HC CDR2和SEQ ID NO:162的HCCDR3。
在一些实施例中，HC CDR1、HC CDR2、HC CDR3、LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3分别包含SEQ ID NO:44、45、84、54、55和56的氨基酸序列。在一些实施例中，HC CDR1、HC CDR2、HCCDR3、LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3分别包含SEQ ID NO:44、45、46、54、55和56的氨基酸序列。在一些实施例中，HC CDR1、HC CDR2、HC CDR3、LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3分别包含SEQID NO:44、45、68、54、55和56的氨基酸序列。在一些实施例中，HC CDR1、HC CDR2、HC CDR3、LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3分别包含SEQ ID NO:44、45、76、54、55和56的氨基酸序列。
在一些实施例中，HC CDR1、HC CDR2、HC CDR3、LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3分别包含SEQ ID NO:47、48、84、57、58和59的氨基酸序列。在一些实施例中，HC CDR1、HC CDR2、HCCDR3、LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3分别包含SEQ ID NO:47、48、46、57、58和59的氨基酸序列。在一些实施例中，HC CDR1、HC CDR2、HC CDR3、LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3分别包含SEQID NO:47、48、68、57、58和59的氨基酸序列。在一些实施例中，HC CDR1、HC CDR2、HC CDR3、LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3分别包含SEQ ID NO:47、48、76、57、58和59的氨基酸序列。
在一些实施例中，HC CDR1、HC CDR2、HC CDR3、LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3分别包含SEQ ID NO:49、50、85、60、58和56的氨基酸序列。在一些实施例中，HC CDR1、HC CDR2、HCCDR3、LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3分别包含SEQ ID NO:49、50、51、60、58和56的氨基酸序列。在一些实施例中，HC CDR1、HC CDR2、HC CDR3、LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3分别包含SEQID NO:49、50、69、60、58和56的氨基酸序列。在一些实施例中，HC CDR1、HC CDR2、HC CDR3、LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3分别包含SEQ ID NO:49、50、77、60、58和56的氨基酸序列。
在一些实施例中，BCMACAR包含序列，例如披露于表2-14中的CDR、VH、VL、scFv、或完整CAR序列，或与其具有至少80％、85％、90％、95％或99％同一性的序列。
表2.示例性PALLAS来源的抗BCMA分子的氨基酸和核酸序列
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表3.示例性PALLAS来源的抗BCMA分子的卡巴特CDR
表4.示例性PALLAS来源的抗BCMA分子的乔西亚CDR
表5.示例性PALLAS来源的抗BCMA分子的IMGT CDR
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表6.示例性B细胞来源的抗BCMA分子的氨基酸和核酸序列
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表7.示例性B细胞来源的抗BCMA分子的卡巴特CDR
表8.示例性B细胞来源的抗BCMA分子的乔西亚CDR
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表9.示例性B细胞来源的抗BCMA分子的IMGT CDR
表14.基于PI61的示例性抗BCMA分子的氨基酸和核酸序列
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表10.示例性杂交瘤来源的抗BCMA分子的氨基酸和核酸序列
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表11.示例性杂交瘤来源的抗BCMA分子的卡巴特CDR
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表12.示例性杂交瘤来源的抗BCMA分子的乔西亚CDR
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表13.示例性杂交瘤来源的抗BCMA分子的IMGT CDR
在一些实施例中，使用来自WO 2012/0163805(将该文献的内容通过引用以其全文特此并入)的VH和VL序列产生BCMACAR。在一些实施例中，可以使用来自WO 2019/241426(将该文献的内容通过引用以其全文特此并入)的CDR、VH、VL、scFv或完整CAR序列产生BCMACAR。
示例性BCMACAR D
在一些实施例中，BCMACAR包含用于识别B细胞成熟抗原(BCMA)的小鼠细胞外单链可变片段(scFv)，随后是与CD137(4-1BB)和CD3ζ链的T细胞胞质信号传导结构域串联融合的人类CD8α铰链和跨膜结构域。BCMACAR D与表达BCMA的靶细胞的结合导致CD3ζ和4-1BB结构域引发的信号传导以及随后的CAR阳性T细胞活化。BCMACAR D的抗原特异性活化导致CAR阳性T细胞增殖、细胞因子分泌以及随后表达BCMA的细胞的细胞溶解杀死。在一些实施例中，BCMACAR由表28的核苷酸序列或具有至少80％、85％、90％、95％、97％或100％或不超过20、15、10、8、5、4、3、2或1个变异的核苷酸序列编码。在一些实施例中，BCMACAR包含由表28的核苷酸序列或具有至少80％、85％、90％、95％、97％或100％或不超过20、15、10、8、5、4、3、2或1个变异的核苷酸序列编码的多肽。在一些实施例中，BCMACAR包含表28的多肽序列或具有至少80％、85％、90％、95％、97％或100％或不超过20、15、10、8、5、4、3、2或1个变异的多肽序列。在一些实施例中，BCMACAR包含表28的序列的重链CDR1-3和轻链CDR1-3。在一些实施例中，BCMACAR包含根据卡巴特的表28的序列的重链CDR1-3和轻链CDR1-3。在一些实施例中，BCMACAR包含根据乔西亚的表28的序列的重链CDR1-3和轻链CDR1-3。在一些实施例中，BCMACAR包含表28的序列的重链CDR1-3。在一些实施例中，BCMACAR包含根据卡巴特的表28的序列的重链CDR1-3。在一些实施例中，BCMACAR包含根据乔西亚的表28的序列的重链CDR1-3。在一些实施例中，BCMACAR包含表28的序列的轻链CDR1-3。在一些实施例中，BCMACAR包含根据卡巴特的表28的序列的轻链CDR1-3。在一些实施例中，BCMACAR包含根据乔西亚的表28的序列的轻链CDR1-3。
表28.示例性BCMACAR的氨基酸序列
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示例性BCMACAR E
在一些实施例中，BCMACAR包含与4-1BB共刺激域和CD3-ζ信号传导结构域连接的两个单结构域抗体。在一些实施例中，本文所述的嵌合抗原受体包含多肽，该多肽包含：(a)细胞外抗原结合结构域，其包含第一抗BCMA单结构域抗体(sdAb)和第二抗BCMA sdAb。在一些实施例中，第一和第二抗BCMA抗体各自独立地是VhH结构域。在某些实施例中，第一抗BCMA sdAb包含如在包含SEQ ID NO:377的氨基酸序列的VhH结构域或具有至少80％、85％、90％、95％、97％或100％或不超过20、15、10、8、5、4、3、2或1个变异的肽序列中列出的CDR1、CDR2和CDR3。在某些实施例中，第二抗BCMA sdAb包含如在包含SEQ ID NO:381的氨基酸序列的VhH结构域或具有至少80％、85％、90％、95％、97％或100％或不超过20、15、10、8、5、4、3、2或1个变异的肽序列中列出的CDR1、CDR2和CDR3。在某些实施例中，BCMA CAR是美国专利号11,186,647中描述的任何BCMACAR，其全部内容通过引用并入本文。在一些实施例中，CD19 CAR由表29的核苷酸序列或具有至少80％、85％、90％、95％、97％或100％或不超过20、15、10、8、5、4、3、2或1个变异的核苷酸序列编码。在一些实施例中，CD19CAR包含由表29的核苷酸序列或具有至少80％、85％、90％、95％、97％或100％或不超过20、15、10、8、5、4、3、2或1个变异的核苷酸序列编码的多肽。在一些实施例中，CD19 CAR包含表29的多肽序列或具有至少80％、85％、90％、95％、97％或100％或不超过20、15、10、8、5、4、3、2或1个变异的多肽序列。在一些实施例中，BCMACAR包含表29的序列的重链CDR1-3和轻链CDR1-3。在一些实施例中，BCMA CAR包含根据卡巴特的表29的序列的重链CDR1-3和轻链CDR1-3。在一些实施例中，BCMACAR包含根据乔西亚的表29的序列的重链CDR1-3和轻链CDR1-3。在一些实施例中，BCMACAR包含表29的序列的重链CDR1-3。在一些实施例中，BCMACAR包含根据卡巴特的表29的序列的重链CDR1-3。在一些实施例中，BCMACAR包含根据乔西亚的表29的序列的重链CDR1-3。在一些实施例中，BCMACAR包含表29的序列的轻链CDR1-3。在一些实施例中，BCMACAR包含根据卡巴特的表29的序列的轻链CDR1-3。在一些实施例中，BCMACAR包含根据乔西亚的表29的序列的轻链CDR1-3。
表29.示例性BCMACAR D的氨基酸和核酸序列
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其他示例性靶标
另外的非限制性示例性肿瘤抗原包括CD20、CD22、EGFR、CD123和CLL-1。
结合CD20的CAR是本领域已知的。例如，可以根据本披露使用通过引用并入本文的WO 2018/067992或WO 2016/164731中披露的那些。可以根据本披露使用本领域任何已知的CD20 CAR，例如，任何已知的CD20 CAR的CD20抗原结合结构域。示例性的结合CD20的序列或CD20 CAR序列披露于例如WO 2018/067992(通过引用并入本文)的表1-5。在一些实施例中，CD20 CAR包含在WO 2018/067992或WO2016/164731(两者通过引用并入本文)中披露的CD20CAR的CDR、可变区、scFv或全长序列。在一些实施例中，CD20 CAR包含序列，例如，披露于下表23中的CDR、VH、VL、scFv、或完整CAR序列，或与其具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列。
结合CD20的示例性抗原结合结构域描述于WO 2016/164731和WO 2018/067992(通过引用并入本文)中。在一些实施例中，其中披露的一个或多个CD20抗原结合结构域的抗原结合结构域。
结合CD22的示例性抗原结合结构域描述于WO 2016/164731和WO 2018/067992(通过引用并入本文)中。
在一些实施例中，抗原结合结构域包含表15中列出的任何重链结合结构域氨基酸序列的HC CDR1、HC CDR2和HC CDR3。在实施例中，抗原结合结构域进一步包含LC CDR1、LCCDR2和LC CDR3。在实施例中，抗原结合结构域包含表16中列出的LC CDR1、LC CDR2和LCCDR3氨基酸序列。
在一些实施例中，抗原结合结构域包含表16中列出的任何轻链结合结构域氨基酸序列的LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3中的一个、两个或全部，以及表15中列出的任何重链结合结构域氨基酸序列的HC CDR1、HC CDR2和HC CDR3中的一个、两个或全部。
结合EGFRvIII的示例性抗原结合结构域描述于WO 2014/130657中。
结合CD123的示例性抗原结合结构域描述于WO 2014/130635和WO 2016/028896(通过引用并入本文)中。
在一些实施例中，抗原结合结构域包含来自WO 2014/130635(通过引用并入本文)的表1-2的序列。
在一些实施例中，抗原结合结构域包含来自WO 2016/028896(通过引用并入本文)的表2、6和9的序列。
结合CLL-1的示例性抗原结合结构域在WO 2016/014535(通过引用并入本文)中披露。
在一些实施例中，抗原结合结构域包含一个、两个、三个(例如，全部三个)重链CDR，HC CDR1、HC CDR2和HC CDR3，这些重链CDR来自本文所述的抗体(例如，描述于通过引用并入本文的WO 2015/142675、US-2015-0283178-A1、US-2016-0046724-A1、US 2014/0322212 A1、US 2016/0068601 A1、US 2016/0051651 A1、US 2016/0096892 A1、US 2014/0322275 A1、或WO 2015/090230中的抗体)，和/或一个、两个、三个(例如，全部三个)轻链CDR，LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3，这些轻链CDR来自本文所述的抗体(例如，描述于通过引用并入本文的WO 2015/142675、US-2015-0283178-A1、US-2016-0046724-A1、US 2014/0322212 A1、US 2016/0068601 A1、US 2016/0051651 A1、US 2016/0096892 A1、US 2014/0322275 A1或WO 2015/090230中的抗体)。在一些实施例中，抗原结合结构域包含上文列出抗体的重链可变区和/或可变轻链区。
在实施例中，抗原结合结构域是WO 2015/142675、US-2015-0283178-A1、US-2016-0046724-A1、US 2014/0322212 A1、US 2016/0068601 A1、US 2016/0051651 A1、US 2016/0096892 A1、US 2014/0322275 A1或WO 2015/090230(通过引用并入本文)中描述的抗原结合结构域。
可以使用表达CAR的细胞靶向的示例性靶抗原包括但不限于CD19、CD123、EGFRvIII、CD33、间皮素、BCMA和GFRα-4等等，描述于例如WO 2014/153270、WO 2014/130635、WO 2016/028896、WO 2014/130657、WO 2016/014576、WO 2015/090230、WO 2016/014565、WO 2016/014535、和WO 2016/025880(其各自通过引用以其全文并入本文)中。
在一些实施例中，本文所述的任何CAR(例如，CD19、CD123、EGFRvIII、CD33、间皮素、BCMA和GFRα-4中的任一个)的抗原结合结构域包含来自上文列出抗体的一个、两个、三个(例如，全部三个)重链CDR，HC CDR1、HC CDR2和HC CDR3，和/或来自上文列出抗原结合结构域的一个、两个、三个(例如，全部三个)轻链CDR，LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3。在一些实施例中，抗原结合结构域包含上文列出或描述抗体的重链可变区和/或可变轻链区。
在一些实施例中，抗原结合结构域包含来自上文列出的抗体的一个、两个、三个(例如，全部三个)重链CDR(HC CDR1、HC CDR2和HC CDR3)，和/或来自上文列出的抗体的一个、两个、三个(例如，全部三个)轻链CDR(LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3)。在一些实施例中，抗原结合结构域包含上文列出或描述抗体的重链可变区和/或可变轻链区。
表23.示例性抗CD20分子的氨基酸序列
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结合CD22的CAR是本领域已知的。例如，可以根据本披露使用WO 2018/067992或WO2016/164731中披露的那些。可以根据本披露使用本领域任何已知的CD22 CAR，例如，任何已知的CD22 CAR的CD22抗原结合结构域。
示例性CD22结合序列或CD22 CAR序列披露于，例如，WO 2016164731的表6A、6B、7A、7B、7C、8A、8B、9A、9B、10A和10B以及WO 2018067992的表6-10中。在一些实施例中，CD22CAR序列包含WO 2018067992或WO 2016164731中披露的CD22 CAR的CDR、可变区、scFv或全长序列。
在实施例中，CAR包含结合CD22的抗原结合结构域(CD22 CAR)。在一些实施例中，抗原结合结构域靶向人CD22。在一些实施例中，抗原结合结构域包含如本文所述的单链Fv序列。
人CD22 CAR的序列在如下提供。在一些实施例中，人CD22 CAR是CAR22-65。
人CD22 CAR scFv序列
EVQLQQSGPGLVKPSQTLSLTCAISGDSMLSNSDTWNWIRQSPSRGLEWLGRTYHRSTWYDDYASSVRGRVSINVDTSKNQYSLQLNAVTPEDTGVYYCARVRLQDGNSWSDAFDVWGQGTMVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQSALTQPASASGSPGQSVTISCTGTSSDVGGYNYVSWYQQHPGKAPKLMIYDVSNRPSGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCSSYTSSSTLYVFGTGTQLTVL(SEQ ID NO:753)
人CD22 CAR重链可变区
EVQLQQSGPGLVKPSQTLSLTCAISGDSMLSNSDTWNWIRQSPSRGLEWLGRTYHRSTWYDDYASSVRGRVSINVDTSKNQYSLQLNAVTPEDTGVYYCARVRLQDGNSWSDAFDVWGQGTMVTVSS(SEQ ID NO:754)
人CD22 CAR轻链可变区
QSALTQPASASGSPGQSVTISCTGTSSDVGGYNYVSWYQQHPGKAPKLMIYDVSNRPSGVSNRFSGSKSGNTASLTISGLQAEDEADYYCSSYTSSSTLYVFGTGTQLTVL(SEQ ID NO 755)
在一些实施例中，CD22 CAR包含序列，例如，披露于下表15-16和表24中的CDR、VH、VL、scFv、或完整CAR序列，或与其具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的序列。
表15.CD22 CAR的重链可变结构域CDR(CAR22-65)
表16.CD22 CAR的轻链可变结构域CDR(CAR22-65)。表中的LC CDR序列在卡巴特或组合定义下具有相同的序列。
表24.示例性抗CD22分子的氨基酸序列
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结合EGFR的CAR是本领域已知的。例如，可以根据本披露使用通过引用并入本文的WO 2014/130657中披露的那些。可以根据本披露使用本领域任何已知的EGFR CAR，例如，任何已知的EGFR CAR的EGFR抗原结合结构域。示例性的EGFRvIIICAR可以包括WO 2014/130657(通过引用并入本文)，例如，WO 2014/130657的表2中披露的CDR、可变区、scFv或全长CAR序列。
结合CD123的CAR是本领域已知的。例如，可以根据本披露使用WO 2014/130635或WO 2016/028896中披露的那些。可以根据本披露使用本领域任何已知的CD123 CAR，例如，任何已知的CD123 CAR的CD123抗原结合结构域。例如，WO 2014/130635中披露的CAR1至CAR8；或WO 2016/028896中披露的CAR123-1至CAR123-4和hzCAR123-1至hzCAR123-32。编码CD123 CAR分子和抗原结合结构域的氨基酸序列和核苷酸序列(例如，包含根据卡巴特或乔西亚的一个、两个、三个VH CDR；和一个、两个、三个VL CDR)在WO 2014/130635和WO 2016/028896中指定。结合CLL-1的CAR是本领域已知的。例如，在US2016/0051651A1(通过引用并入本文)中披露的那些。可以根据本披露使用本领域任何已知的CLL-1CAR，例如，任何已知的CLL-1CAR的CLL-1抗原结合结构域。
在一些实施例中，CAR包含根据WO 2016/014535(通过引用并入本文)的表2的CLL-1CAR或抗原结合结构域。编码CLL-1CAR分子和抗原结合结构域的氨基酸序列和核苷酸序列(例如，包含根据卡巴特或乔西亚的一个、两个、三个VH CDR；和一个、两个、三个VL CDR)在WO 2016/014535中指定。
结合CD33的CAR是本领域已知的。例如，可以根据本披露使用通过引用并入本文的US 2016/0096892 A1和WO 2016/014576中披露的那些。可以根据本披露使用本领域任何已知的CD33 CAR，例如，任何已知的CD33 CAR的CD33抗原结合结构域。例如，可以根据本披露使用WO 2016/014576中披露的CAR33-1至CAR33-9。
在一些实施例中，CAR包含根据WO 2016/014576(通过引用并入本文)的表2或9的CD33 CAR或抗原结合结构域。编码CD33 CAR分子和抗原结合结构域的氨基酸序列和核苷酸序列(例如，包含根据卡巴特或乔西亚的一个、两个、三个VH CDR；和一个、两个、三个VLCDR)在WO 2016/014576中指定。
在一个实施例中，针对CD33的抗原结合结构域是描述于，例如，以下中的抗体的抗原结合部分(例如，CDR)：Bross等人,Clin Cancer Res[临床癌症研究]7(6):1490-1496(2001)(吉妥珠单抗奥佐米星,hP67.6)；Caron等人,Cancer Res[癌症研究]52(24):6761-6767(1992)(林妥珠单抗，HuM195)；Lapusan等人,Invest New Drugs[新药物研究]30(3):1121-1131(2012)(AVE9633)；Aigner等人,Leukemia[白血病]27(5):1107-1115(2013)(AMG330，CD33 BiTE)；Dutour等人,Adv hematol[血液学进展]2012:683065(2012)；以及Pizzitola等人,Leukemia[白血病]doi:10.1038/Lue.2014.62(2014)。在一个实施例中，针对CD33的抗原结合结构域是描述于WO/2016/014576中的抗体、抗原结合片段或CAR的抗原结合部分(例如，CDR)。
在一个实施例中，针对GD2的抗原结合结构域是描述于例如以下中的抗体的抗原结合部分(例如，CDR)：Mujoo等人,Cancer Res[癌症研究]47(4):1098-1104(1987)；Cheung等人,Cancer Res[癌症研究]45(6):2642-2649(1985)，Cheung等人,J Clin Oncol[临床肿瘤学杂志]5(9):1430-1440(1987)，Cheung等人,J Clin Oncol[临床肿瘤学杂志]16(9):3053-3060(1998)，Handgretinger等人,Cancer Immunol Immunother[癌症免疫学和免疫疗法]35(3):199-204(1992)。在一些实施例中，针对GD2的抗原结合结构域是选自以下的抗体的抗原结合部分：mAb 14.18、14G2a、ch14.18、hu14.18、3F8、hu3F8、3G6、8B6、60C3、10B8、ME36.1、和8H9，参见例如WO 2012033885、WO 2013040371、WO 2013192294、WO 2013061273、WO 2013123061、WO 2013074916、和WO 201385552。在一些实施例中，针对GD2的抗原结合结构域是描述于以下中的抗体的抗原结合部分，美国公开号：20100150910或PCT公开号：WO2011160119。
在一个实施例中，针对Tn抗原的抗原结合结构域是描述于例如以下中的抗体的抗原结合部分(例如CDR)：US 8,440,798；Brooks等人,PNAS[美国国家科学院院刊]107(22):10056-10061(2010)；以及Stone等人,OncoImmunology[肿瘤免疫学]1(6):863-873(2012)。
在一个实施例中，针对PSMA的抗原结合结构域是描述于例如以下中的抗体的抗原结合部分(例如，CDR)：Parker等人,Protein Expr Purif[蛋白表达与纯化]89(2):136-145(2013),US 20110268656(J591 ScFv)；Frigerio等人,European J Cancer[欧洲癌症杂志]49(9):2223-2232(2013)(scFvD2B)；WO 2006125481(mAbs 3/A12，3/E7和3/F11)和单链抗体片段(scFv A5和D7)。
在一个实施例中，针对ROR1的抗原结合结构域是描述于例如以下中的抗体的抗原结合部分(例如，CDR)：Hudecek等人,Clin Cancer Res[临床癌症研究]19(12):3153-3164(2013)；WO 2011159847；和US 20130101607。
在一个实施例中，针对FLT3的抗原结合结构域是描述于例如WO 2011076922、US5777084、EP 0754230、US 20090297529中的抗体以及若干种商业目录抗体(R&D公司，电子生物科学公司(ebiosciences)，艾博抗公司(Abcam))的抗原结合部分(例如，CDR)。
在一个实施例中，针对TAG72的抗原结合结构域是以下抗体的抗原结合部分(例如，CDR)：描述于例如Hombach等人,Gastroenterology[肠胃病学]113(4):1163-1170(1997)中的抗体；和Abcam ab691。
在一个实施例中，针对FAP的抗原结合结构域是以下抗体的抗原结合部分(例如，CDR)：描述于例如Ostermann等人,Clinical Cancer Research[临床癌症研究]14:4584-4592(2008)(FAP5)，美国专利公开号2009/0304718中的抗体；西罗珠单抗(参见例如，Hofheinz等人,Oncology Research and Treatment[肿瘤学研究和治疗]26(1),2003)；和Tran等人,J Exp Med[实验医学杂志]210(6):1125-1135(2013)。
在一个实施例中，针对CD38的抗原结合结构域是以下抗体的抗原结合部分(例如，CDR)：达雷木单抗(daratumumab)(参见例如，Groen等人,Blood[血液]116(21):1261-1262(2010)；MOR202(参见例如，US 8,263,746)；或描述于US 8,362,211中的抗体。
在一个实施例中，针对CD44v6的抗原结合结构域是描述于例如Casucci等人,Blood[血液]122(20):3461-3472(2013)中的抗体的抗原结合部分(例如，CDR)。
在一个实施例中，针对CEA的抗原结合结构域是描述于例如Chmielewski等人,Gastoenterology[肠胃病学]143(4):1095-1107(2012)中的抗体的抗原结合部分(例如，CDR)。
在一个实施例中，针对EPCAM的抗原结合结构域是选自以下的抗体的抗原结合部分(例如，CDR)：MT110、EpCAM-CD3双特异性Ab(参见例如clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT00635596)；依决洛单抗；3622W94；ING-1；和阿德木单抗(MT201)。
在一个实施例中，针对PRSS21的抗原结合结构域是描述于以下中的抗体的抗原结合部分(例如，CDR)：美国专利号：8,080,650。
在一个实施例中，针对B7H3的抗原结合结构域是抗体MGA271(宏观基因公司(Macrogenics))的抗原结合部分(例如，CDR)。
在一个实施例中，针对KIT的抗原结合结构域是描述于例如US 7915391、US20120288506中的抗体和若干种商业目录抗体的抗原结合部分(例如，CDR)。
在一个实施例中，针对IL-13Ra2的抗原结合结构域是描述于例如WO 2008/146911、WO 2004087758中的抗体、若干种商业目录抗体和WO 2004087758中的抗体的抗原结合部分(例如，CDR)。
在一个实施例中，针对CD30的抗原结合结构域是描述于例如US 7090843B1和EP0805871中的抗体的抗原结合部分(例如，CDR)。
在一个实施例中，针对GD3的抗原结合结构域是描述于例如以下中的抗体的抗原结合部分(例如，CDR)：US 7253263；US 8,207,308；US 20120276046；EP1013761；WO2005035577；以及US 6437098。
在一个实施例中，针对CD171的抗原结合结构域是描述于例如Hong等人,JImmunother[免疫疗法杂志]37(2):93-104(2014)中的抗体的抗原结合部分(例如，CDR)。
在一个实施例中，针对IL-11Ra的抗原结合结构域是可从艾博抗公司(目录号ab55262)或罗福斯生物制剂公司(Novus Biologicals)(目录号EPR5446)获得的抗体的抗原结合部分(例如，CDR)。在另一个实施例中，针对IL-11Ra的抗原结合结构域是肽，参见例如，Huang等人,Cancer Res[癌症研究]72(1):271-281(2012)。
在一个实施例中，针对PSCA的抗原结合结构域是描述于例如以下中的抗体的抗原结合部分(例如，CDR)：Morgenroth等人,Prostate[前列腺]67(10):1121-1131(2007)(scFv7F5)；Nejatollahi等人,J of Oncology[肿瘤学杂志]2013(2013)，文章ID 839831(scFvC5-II)；和美国专利公开号20090311181。
在一个实施例中，针对VEGFR2的抗原结合结构域是描述于例如Chinnasamy等人,JClin Invest[临床研究杂志]120(11):3953-3968(2010)中的抗体的抗原结合部分(例如，CDR)。
在一个实施例中，针对LewisY的抗原结合结构域是描述于例如以下中的抗体的抗原结合部分(例如，CDR)：Kelly等人,Cancer Biother Radiopharm[癌症生物治疗和放射性药物]23(4):411-423(2008)(hu3S193Ab(scFvs))；Dolezal等人,Protein Engineering[蛋白质工程]16(1):47-56(2003)(NC10 scFv)。
在一个实施例中，针对CD24的抗原结合结构域是描述于例如Maliar等人,Gastroenterology[肠胃病学]143(5):1375-1384(2012)中的抗体的抗原结合部分(例如，CDR)。
在一个实施例中，针对PDGFR-β的抗原结合结构域是抗体Abcam ab32570的抗原结合部分(例如，CDR)。
在一个实施例中，针对SSEA-4的抗原结合结构域是抗体MC813(Cell Signaling公司)或其他市售抗体的抗原结合部分(例如，CDR)。
在一个实施例中，针对CD20的抗原结合结构域是抗体利妥昔单抗、奥法木单抗、奥瑞珠单抗、维妥珠单抗或GA101的抗原结合部分(例如，CDR)；或描述于WO 2016/164731中的抗体。
在一个实施例中，针对叶酸受体α的抗原结合结构域是抗体IMGN853或描述于以下中的抗体的抗原结合部分(例如，CDR)：US 20120009181；US 4851332,LK26:US 5952484。
在一个实施例中，针对ERBB2(Her2/neu)的抗原结合结构域是抗体曲妥珠单抗或帕妥珠单抗的抗原结合部分(例如，CDR)。
在一个实施例中，针对MUC1的抗原结合结构域是抗体SAR566658的抗原结合部分(例如，CDR)。
在一个实施例中，针对EGFR的抗原结合结构域是抗体西妥昔单抗、帕尼单抗、扎妥木单抗、尼妥珠单抗或马妥珠单抗的抗原结合部分(例如，CDR)。
在一个实施例中，针对NCAM的抗原结合结构域是以下抗体的抗原结合部分(例如，CDR)：抗体克隆2-2B：MAB5324(EMD密理博公司(EMD Millipore))。
在一个实施例中，针对肝配蛋白B2的抗原结合结构域是描述于例如Abengozar等人,Blood[血液]119(19):4565-4576(2012)中的抗体的抗原结合部分(例如，CDR)。
在一个实施例中，针对IGF-I受体的抗原结合结构域是描述于例如以下中的抗体的抗原结合部分(例如，CDR)：US 8344112 B2；EP 2322550A1；WO 2006/138315、或PCT/US2006/022995。
在一个实施例中，针对CAIX的抗原结合结构域是抗体克隆303123(R&D系统公司(R&D Systems)的抗原结合部分(例如，CDR)。
在一个实施例中，针对LMP2的抗原结合结构域是描述于例如US 7,410,640或US20050129701中的抗体的抗原结合部分(例如，CDR)。
在一个实施例中，针对gp100的抗原结合结构域是抗体HMB45、NKIβB、或描述于WO2013165940或US 20130295007中的抗体的抗原结合部分(例如，CDR)
在一个实施例中，针对酪氨酸酶的抗原结合结构域是描述于例如以下中的抗体的抗原结合部分(例如，CDR)：US 5843674；或US 19950504048。
在一个实施例中，针对EphA2的抗原结合结构域是描述于例如Yu等人,Mol Ther[分子疗法]22(1):102-111(2014)中的抗体的抗原结合部分(例如，CDR)。
在一个实施例中，针对GD3的抗原结合结构域是描述于例如以下中的抗体的抗原结合部分(例如，CDR)：US 7253263；US 8,207,308；US 20120276046；EP1013761 A3；20120276046；WO 2005035577；或US 6437098。
在一个实施例中，针对岩藻糖基GM1的抗原结合结构域是描述于例如以下中的抗体的抗原结合部分(例如，CDR)：US 20100297138；或WO 2007/067992。
在一个实施例中，针对sLe的抗原结合结构域是抗体G193(对于lewis Y)的抗原结合部分(例如，CDR)，参见Scott AM等人,Cancer Res[癌症研究]60:3254-61(2000)，也如Neeson等人,J Immunol[免疫学杂志]2013年5月190(会议摘要补充)177.10中所述的。
在一个实施例中，针对GM3的抗原结合结构域是抗体CA 2523449(mAb 14F7)的抗原结合部分(例如，CDR)。
在一个实施例中，针对HMWMAA的抗原结合结构域是描述于例如以下中的抗体的抗原结合部分(例如，CDR)：Kmiecik等人,Oncoimmunology[肿瘤免疫学]3(1):e27185(2014)(PMID:24575382)(mAb9.2.27)；US6528481；WO 2010033866；或US 20140004124。
在一个实施例中，针对o-乙酰基-GD2的抗原结合结构域是抗体8B6的抗原结合部分(例如，CDR)。
在一个实施例中，针对TEM1/CD248的抗原结合结构域是描述于例如以下中的抗体的抗原结合部分(例如，CDR)：Marty等人,Cancer Lett[癌症快报]235(2):298-308(2006)；Zhao等人,J Immunol Methods[免疫法杂志]363(2):221-232(2011)。
在一个实施例中，针对CLDN6的抗原结合结构域是抗体IMAB027(咖尼米德制药公司(Ganymed Pharmaceuticals))的抗原结合部分(例如，CDR)，参见例如clinicaltrial.gov/show/NCT02054351。
在一个实施例中，针对TSHR的抗原结合结构域是描述于例如以下中的抗体的抗原结合部分(例如，CDR)：US 8,603,466；US 8,501,415；或US 8,309,693。
在一个实施例中，针对GPRC5D的抗原结合结构域是以下抗体的抗原结合部分(例如，CDR)：抗体FAB6300A(R&D系统公司)；或LS-A4180(莱仕邦生物科技公司(LifespanBiosciences))。
在一个实施例中，针对CD97的抗原结合结构域是描述于例如以下中的抗体的抗原结合部分(例如CDR)：US 6,846,911；de Groot等人,JImmunol[免疫学杂志]183(6):4127-4134(2009)；或来自R&D:MAB3734的抗体。
在一个实施例中，针对ALK的抗原结合结构域是描述于，例如，Mino-Kenudson等人,Clin Cancer Res[临床癌症研究]16(5):1561-1571(2010)中的抗体的抗原结合部分(例如CDR)。
在一个实施例中，针对聚唾液酸的抗原结合结构域是描述于，例如，Nagae等人,JBiol Chem[生物化学杂志]288(47):33784-33796(2013)中的抗体的抗原结合部分(例如，CDR)。
在一个实施例中，针对PLAC1的抗原结合结构域是描述于以下中的抗体的抗原结合部分(例如，CDR)：例如，Ghods等人,Biotechnol Appl Biochem[生物化学生物技术应用]2013doi:10.1002/bab.1177。
在一个实施例中，针对GloboH的抗原结合结构域是以下抗体的抗原结合部分：抗体VK9；或描述于，例如，Kudryashov V等人,Glycoconj J.[糖缀合物杂志]15(3):243-9(1998)，Lou等人,Proc Natl Acad Sci USA[美国国家科学院院刊]111(7):2482-2487(2014)中的抗体；MBr1:Bremer E-G等人J Biol Chem[生物化学杂志]259:14773–14777(1984)。
在一个实施例中，针对NY-BR-1的抗原结合结构域是描述于，例如，Jager等人,Appl Immunohistochem Mol Morphol[应用免疫组织化学分子形态学]15(1):77-83(2007)中的抗体的抗原结合部分(例如，CDR)。
在一个实施例中，针对WT-1的抗原结合结构域是描述于以下中的抗体的抗原结合部分(例如，CDR)：例如，Dao等人,Sci Transl Med[科学转化医学]5(176):176ra33(2013)；或WO 2012/135854。
在一个实施例中，针对MAGE-A1的抗原结合结构域是描述于，例如，Willemsen等人,J Immunol[免疫学杂志]174(12):7853-7858(2005)(TCR样scFv)中的抗体的抗原结合部分(例如，CDR)。
在一个实施例中，针对sperm蛋白17的抗原结合结构域是描述于，例如，以下中的抗体的抗原结合部分(例如，CDR)：Song等人,Target Oncol[靶标肿瘤学]2013年8月14日(PMID:23943313)；Song等人,Med Oncol[医学肿瘤学]29(4):2923-2931(2012)。
在一个实施例中，针对Tie 2的抗原结合结构域是抗体AB33(细胞信号传导技术公司(Cell Signaling Technology))的抗原结合部分(例如，CDR)。
在一个实施例中，针对MAD-CT-2的抗原结合结构域是描述于，例如，以下中的抗体的抗原结合部分(例如，CDR)：PMID:2450952；US 7635753。
在一个实施例中，针对Fos相关抗原1的抗原结合结构域是抗体12F9(罗福斯生物制剂公司)的抗原结合部分(例如，CDR)。
在一个实施例中，针对MelanA/MART1的抗原结合结构域是描述于以下中的抗体的抗原结合部分(例如，CDR)：EP 2514766 A2；或US 7,749,719。
在一个实施例中，针对肉瘤易位断点的抗原结合结构域是描述于，例如，Luo等人,EMBO Mol.Med.[EMBO分子医学]4(6):453-461(2012)中的抗体的抗原结合部分(例如，CDR)。
在一个实施例中，针对TRP-2的抗原结合结构域是描述于，例如，Wang等人,J ExpMed.[实验医学杂志]184(6):2207-16(1996)中的抗体的抗原结合部分(例如，CDR)。
在一个实施例中，针对CYP1B1的抗原结合结构域是描述于，例如，Maecker等人,Blood[血液]102(9):3287-3294(2003)中的抗体的抗原结合部分(例如，CDR)。
在一个实施例中，针对RAGE-1的抗原结合结构域是抗体MAB5328(EMD密理博公司)的抗原结合部分(例如，CDR)。
在一个实施例中，针对人端粒酶逆转录酶的抗原结合结构域是以下抗体的抗原结合部分(例如，CDR)：抗体目录号：LS-B95-100(莱仕邦生物科技公司)
在一个实施例中，针对肠道羧基酯酶的抗原结合结构域是以下抗体的抗原结合部分(例如，CDR)：抗体4F12：目录号：LS-B6190-50(莱仕邦生物科技公司)。
在一个实施例中，针对mut hsp70-2的抗原结合结构域是以下抗体的抗原结合部分(例如，CDR)：抗体(莱仕邦生物科技公司：单克隆:目录号：LS-C133261-100(莱仕邦生物科技公司)。
在一个实施例中，针对CD79a的抗原结合结构域是以下抗体的抗原结合部分(例如，CDR)：可从艾博抗公司获得的抗体抗CD79a抗体[HM47/A9](ab3121)；可从细胞信号传导技术公司获得的抗体CD79A抗体号3351；或产生自兔的、可从西格玛奥德里奇公司(SigmaAldrich)获得的抗体HPA017748-抗CD79A抗体。
在一个实施例中，针对CD79b的抗原结合结构域是以下抗体的抗原结合部分(例如，CDR)：抗体维汀-珀拉妥珠单抗(polatuzumab vedotin)(抗CD79b)(描述于Dornan等人,“Therapeutic potential of an anti-CD79bantibody-drug conjugate,anti-CD79b-vc-MMAE,for the treatment of non-Hodgkin lymphoma[抗CD79b抗体-药物偶联物抗CD79b-vc-MMAE用于治疗非霍奇金淋巴瘤的治疗潜力]”Blood[血液].2009年9月24日；114(13):2721-9.doi:10.1182/blood-2009-02-205500.Epub 2009年7月24日中)，或双特异性抗体抗CD79b/CD3(描述于“4507Pre-Clinical Characterization of T Cell-DependentBispecific Antibody Anti-CD79b/CD3As a Potential Therapy for B CellMalignancies[4507T细胞依赖性双特异性抗体抗CD79b/CD3的临床前表征作为B细胞恶性肿瘤的潜在疗法]”Abstracts of 56th ASH Annual Meeting and Exposition[第56届ASH年会和博览会摘要],加利福尼亚州旧金山2014年12月6日至9日中)。
在一个实施例中，针对CD72的抗原结合结构域是以下抗体的抗原结合部分(例如，CDR)：抗体J3-109(描述于Myers和Uckun,“An anti-CD72 immunotoxin against therapy-refractory B-lineage acute lymphoblastic leukemia[抗CD72免疫毒素抗治疗难治性B谱系急性淋巴母细胞白血病].”)Leuk Lymphoma[白血病淋巴瘤].1995年6月；18(1-2):119-22中)或抗CD72(10D6.8.1，mIgG1)(描述于Polson等人,“Antibody-Drug Conjugatesfor the Treatment of Non-Hodgkin'sLymphoma:Target and Linker-Drug Selection[用于治疗非霍奇金淋巴瘤的抗体-药物缀合物：靶标和接头-药物选择]”Cancer Res[癌症研究]2009年3月15日69；2358。
在一个实施例中，针对LAIR1的抗原结合结构域是以下抗体的抗原结合部分(例如，CDR)：可从ProSpec公司获得的抗体ANT-301LAIR1抗体；或可从百进生物科技公司获得的抗人CD305(LAIR1)抗体。
在一个实施例中，针对FCAR的抗原结合结构域是可从Sino Biological公司获得的抗体CD89/FCAR抗体(目录号10414-H08H)的抗原结合部分(例如，CDR)。
在一个实施例中，针对LILRA2的抗原结合结构域是可从亚诺法公司(Abnova)获得的抗体LILRA2单克隆抗体(M17)(克隆3C7)，或可从莱仕邦生物科技公司获得的小鼠抗LILRA2抗体(单克隆(2D7))的抗原结合部分(例如，CDR)。
在一个实施例中，针对CD300LF的抗原结合结构域是可从百进生物科技公司获得的抗体小鼠抗CMRF35样分子1抗体(单克隆[UP-D2])；或可从R&D系统公司获得的大鼠抗CMRF35样分子1抗体(单克隆[234903])的抗原结合部分(例如，CDR)。
在一个实施例中，针对CLEC12A的抗原结合结构域是以下抗体的抗原结合部分(例如，CDR)：抗体双特异性T细胞衔接器(BiTE)scFv-抗体和ADC(描述于Noordhuis等人,“Targeting of CLEC12A In Acute Myeloid Leukemia by Antibody-Drug-Conjugatesand Bispecific CLL-1xCD3 BiTE Antibody[通过抗体-药物-缀合物和双特异性CLL-1xCD3 BiTE抗体靶向急性骨髓性白血病中的CLEC12A]”53rd ASH Annual Meeting andExposition[第53届ASH年会和博览会],2011年12月10日至13日中)，以及MCLA-117(梅鲁斯公司(Merus))。
在一个实施例中，针对BST2(也称为CD317)的抗原结合结构域是可从抗体在线(Antibodies-Online)获得的抗体小鼠抗CD317抗体(单克隆[3H4])或可从R&D系统公司获得的小鼠抗CD317抗体(单克隆[696739])的抗原结合部分(例如，CDR)。
在一个实施例中，针对EMR2(也称为CD312)的抗原结合结构域是可从莱仕邦生物科技公司获得的抗体小鼠抗CD312抗体(单克隆[LS-B8033])或可从R&D系统公司获得的小鼠抗CD312抗体(单克隆[494025])的抗原结合部分(例如，CDR)。
在一个实施例中，针对LY75的抗原结合结构域是可从EMD密理博公司获得的抗体小鼠抗淋巴细胞抗原75抗体(单克隆[HD30])或可从生命科技公司(Life Technologies)获得的小鼠抗淋巴细胞抗原75抗体(单克隆[A15797])的抗原结合部分(例如，CDR)。
在一个实施例中，针对GPC3的抗原结合结构域是以下抗体的抗原结合部分(例如CDR)：抗体hGC33(描述于Nakano K,Ishiguro T,Konishi H等人.Generation of ahumanized anti-glypican 3antibody by CDR grafting and stability optimization.[通过CDR移植和稳定性优化产生人源化抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体]Anticancer Drugs.[抗癌药物]2010年11月；21(10):907–916)，或MDX-1414、HN3或YP7(这三种抗体都描述于Feng等人,“Glypican-3antibodies:a new therapeutic target for liver cancer.[磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3抗体：肝癌的新治疗靶标]”FEBS Lett.[欧洲生化学会联合会快报]2014年1月21日；588(2):377-82。
在一个实施例中，针对FCRL5的抗原结合结构域是描述于以下中的抗FcRL5抗体的抗原结合部分(例如，CDR)：Elkins等人,“FcRL5 as a target of antibody-drugconjugates for the treatment of multiple myeloma[FcRL5作为抗体-药物缀合物的靶标用于治疗多发性骨髓瘤]”Mol Cancer Ther.[分子癌症治疗学]2012年10月；11(10):2222-32。在一个实施例中，针对FCRL5的抗原结合结构域是描述于以下中的抗FcRL5抗体的抗原结合部分(例如，CDR)：例如，WO 2001/038490、WO/2005/117986、WO 2006/039238、WO2006/076691、WO 2010/114940、WO 2010/120561、或WO 2014/210064。
在一个实施例中，针对IGLL1的抗原结合结构域是以下抗体的抗原结合部分(例如，CDR)：可从Lifespan Biosciences公司获得的抗体小鼠抗免疫球蛋白λ样多肽1，单克隆[AT1G4]；可从BioLegend公司获得的小鼠抗免疫球蛋白λ样多肽1抗体，单克隆[HSL11]。
在一个实施例中，抗原结合结构域包含来自上文列出的抗体的一个、两个、三个(例如，全部三个)重链CDR(HC CDR1、HC CDR2和HC CDR3)，和/或来自上文列出的抗体的一个、两个、三个(例如，全部三个)轻链CDR(LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3)。在一个实施例中，抗原结合结构域包含上文列出抗体的重链可变区和/或可变轻链区。
在另一方面，抗原结合结构域包含人源化抗体或抗体片段。在一些方面，非人抗体是人源化的，其中抗体的特定序列或区域被修饰以增加与在人中天然产生的抗体或其片段的相似度。在一方面，抗原结合结构域是人源化的。
结合间皮素的CAR是本领域已知的。例如，WO 2015090230和WO 2017112741(通过引用并入本文，例如，WO 2017112741的表2、3、4和5)中披露的结合人间皮素的那些。可以根据本披露使用本领域任何已知的间皮素CAR，例如，任何已知的间皮素CAR的间皮素抗原结合结构域。
结合GFRα-4的CAR是本领域已知的。例如，可以根据本披露使用WO 2016/025880中披露的那些。可以根据本披露使用本领域任何已知的GFRα-4CAR，例如，任何已知的GFRα-4CAR的GFRα-4抗原结合结构域。编码GFRα-4CAR分子和抗原结合结构域的氨基酸序列和核苷酸序列(例如，包含根据卡巴特或乔西亚的一个、两个、三个VH CDR；和一个、两个、三个VLCDR)在WO 2016/025880中指定。
抗原结合结构域结构
在一些实施例中，编码的CAR分子的抗原结合结构域包含抗体、抗体片段、scFv、Fv、Fab、(Fab’)2、单结构域抗体(SDAB)、VH或VL结构域、骆驼科VHH结构域或双功能(例如，双特异性)杂合抗体(例如，Lanzavecchia等人,Eur.J.Immunol.[欧洲免疫学杂志]17,105(1987))。
在一些情况下，可以根据本领域已知的方法制备scFv(参见例如，Bird等人,(1988)Science[科学]242:423-426和Huston等人,(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]85:5879-5883)。可以通过使用柔性多肽接头将VH和VL区连接在一起来产生ScFv分子。scFv分子包含具有优化的长度和/或氨基酸组成的接头(例如，Ser-Gly接头)。接头长度可以极大地影响scFv的可变区如何折叠和相互作用。事实上，如果采用短多肽接头(例如，在5-10个氨基酸之间)，则可以防止链内折叠。还需要链间折叠以将两个可变区组合在一起以形成功能性表位结合位点。对于接头取向和大小的实例，参见例如，Hollinger等人1993Proc Natl Acad.Sci.U.S.A.[美国国家科学院院刊]90:6444-6448，美国专利申请公开号2005/0100543、2005/0175606、2007/0014794，以及PCT公开号WO 2006/020258和WO 2007/024715(将其通过引用并入本文)。
scFv可以在其VL与VH区之间包含具有至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、或更多个氨基酸残基的接头。接头序列可以包含任何天然存在的氨基酸。在一些实施例中，接头序列包含氨基酸甘氨酸和丝氨酸。在另一个实施例中，接头序列包含多组甘氨酸和丝氨酸重复序列，如(Gly4Ser)n，其中n是等于或大于1的正整数(SEQ ID NO:22)。在一些实施例中，接头可以是(Gly4Ser)4(SEQ ID NO:29)或(Gly4Ser)3(SEQ ID NO:30)。接头长度的变化可以保留或增强活性，从而在活性研究中产生优异的功效。
在另一方面，抗原结合结构域是T细胞受体(“TCR”)或其片段，例如，单链TCR(scTCR)。用于制备此类TCR的方法是本领域中已知的。参见例如Willemsen RA等人,GeneTherapy[基因疗法]7:1369–1377(2000)；Zhang T等人,Cancer Gene Ther[癌症基因疗法]11:487–496(2004)；Aggen等人,Gene Ther.[基因疗法]19(4):365-74(2012)(将参考文献以其全文并入本文)。例如，scTCR可以工程改造为含有来自通过接头(例如，柔性肽)连接的T细胞克隆的Vα和Vβ基因。此途径对于本身在细胞内的与癌症相关的靶标非常有用，然而，这种抗原(肽)的片段通过MHC呈递在癌细胞的表面上。
在某些实施例中，编码的抗原结合结构域具有10-4M至10-8M的结合亲和力KD。
在一些实施例中，编码的CAR分子包含如下抗原结合结构域，抗原结合结构域对靶抗原的结合亲和力KD为10-4M至10-8M，例如，10-5M至10-7M，例如，10-6M或10-7M。在一些实施例中，抗原结合结构域的结合亲和力比参考抗体(例如，本文所述的抗体)的结合亲和力低至少5倍、10倍、20倍、30倍、50倍、100倍或1,000倍。在一些实施例中，编码的抗原结合结构域的结合亲和力比参考抗体(例如，抗原结合结构域所来源的抗体)的结合亲和力低至少5倍。在一些方面，此类抗体片段是功能性的，因为它们提供生物学应答，生物学应答可以包括但不限于免疫应答的活化、起源于其靶抗原的信号转导的抑制、激酶活性的抑制等，如熟练技术人员所理解的那样。
在一些方面，CAR的抗原结合结构域是scFv抗体片段，该scFv抗体片段与它所来源的scFv的鼠序列相比是人源化的。
在一些方面，本文所述的CAR的抗原结合结构域(例如，scFv)由核酸分子编码，该核酸分子的序列已进行密码子优化以在哺乳动物细胞中表达。在一些方面，整个CAR构建体由核酸分子编码，所述核酸分子的整个序列已进行密码子优化以在哺乳动物细胞中表达。密码子优化是指如下发现：在编码DNA中同义密码子(即编码相同氨基酸的密码子)的出现频率在不同物种中有偏差。这种密码子简并性允许相同的多肽由各种核苷酸序列编码。多种密码子优化方法是本领域中已知的，并且包括例如在至少美国专利号5,786,464和6,114,148中披露的方法。
特异性抗原抗体对是本领域已知的。抗原抗体对及其组分的非限制性示例性实施例在本文以上标题为靶标的章节中及以下提供。
双特异性CAR
在某些实施例中，抗原结合结构域是双特异性或多特异性分子(例如，多特异性抗体分子)。在一些实施例中，多特异性抗体分子是双特异性抗体分子。双特异性抗体对不多于两种抗原具有特异性。双特异性抗体分子的特征在于具有对第一表位的结合特异性的第一免疫球蛋白可变结构域序列、和具有对第二表位的结合特异性的第二免疫球蛋白可变结构域序列。在一些实施例中，第一和第二表位在相同抗原，例如，相同蛋白质(或多聚体蛋白质的亚单位)上。在一些实施例中，第一表位和第二表位重叠。在一些实施例中，第一表位和第二表位不重叠。在一些实施例中，第一表位和第二表位在不同的抗原，例如，不同的蛋白质(或多聚体蛋白质的不同亚基)上。在一些实施例中，双特异性抗体分子包含对第一表位具有结合特异性的重链可变结构域序列和轻链可变结构域序列以及对第二表位具有结合特异性的重链可变结构域序列和轻链可变结构域序列。在一些实施例中，双特异性抗体分子包含对第一表位具有结合特异性的半抗体和对第二表位具有结合特异性的半抗体。在一些实施例中，双特异性抗体分子包含对第一表位具有结合特异性的半抗体或其片段，以及对第二表位具有结合特异性的半抗体或其片段。在一些实施例中，双特异性抗体分子包含对第一表位具有结合特异性的scFv或其片段，以及对第二表位具有结合特异性的scFv或其片段。
在一些实施例中，抗体分子是多特异性(例如，双特异性或三特异性)抗体分子。此类分子包括双特异性融合蛋白，例如，含有两个scFv(它们之间具有亲水性螺旋肽接头)和一个完全恒定区的表达构建体，如例如在US 5637481中所描述；具有连接的VL和VH链(它们进一步用肽间隔区连接至抗体铰链区和CH3区)的微型抗体构建体，其可以二聚化形成双特异性/多价分子，如例如在US 5837821所述；VH结构域(或家族成员中的VL结构域)的串，其通过肽键与C-末端的可交联基团连接，这些可交联基团进一步与VL结构域相关联以形成一系列FV(或scFv)，如例如在US 5864019中所述；以及具有经肽接头连接的VH和VL结构域两者的单链结合多肽通过非共价或化学交联组合成多价结构，以使用scFV或双体抗体类型形式形成例如同二价、异二价、三价和四价结构，如例如在US 5869620中所述。上述引用的申请的内容通过引用以其全文并入本文。
在双特异性抗体分子的每个抗体或抗体片段(例如，scFv)内，VH可以在VL的上游或下游。在一些实施例中，上游抗体或抗体片段(例如，scFv)在其VL(VL1)上游布置有其VH(VH1)，并且下游抗体或抗体片段(例如，scFv)在其VH(VH2)上游布置有其VL(VL2)，使得整个双特异性抗体分子具有布置VH1-VL1-VL2-VH2。在其他实施例中，上游抗体或抗体片段(例如，scFv)在其VH(VH1)上游布置有其VL(VL1)，并且下游抗体或抗体片段(例如，scFv)在其VL(VL2)上游布置有其VH(VH2)，使得整个双特异性抗体分子具有布置VL1-VH1-VH2-VL2。任选地，如果构建体被布置为VH1-VL1-VL2-VH2则接头设置在两个抗体或抗体片段(例如，scFv)之间，例如VL1与VL2之间，如果构建体被布置为VL1-VH1-VH2-VL2则接头设置在VH1与VH2之间。接头可以是如本文所述的接头，例如，(Gly4-Ser)n接头，其中n是1、2、3、4、5、或6，优选4(SEQ ID NO:691)。一般来说，两个scFv之间的接头应足够长以避免两个scFv的结构域之间的错配。任选地，接头设置在第一scFv的VL与VH之间。任选地，接头设置在第二scFv的VL与VH之间。在具有多个接头的构建体中，接头中的任何两个或更多个可以相同或不同。因此，在一些实施例中，双特异性CAR在如本文描述的布置中包含VL、VH和任选一个或多个接头。
跨膜结构域
关于跨膜结构域，在各种实施例中，本文所述的嵌合分子(例如，CAR)可以被设计成包含附接至嵌合分子的细胞外结构域的跨膜结构域。跨膜结构域可以包括与跨膜区相邻的一个或多个另外的氨基酸，例如，与跨膜来源的蛋白质的细胞外区域相关的一个或多个氨基酸(例如，细胞外区域的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10至15个氨基酸)和/或与跨膜蛋白来源的蛋白质的细胞内区域相关的一个或多个另外的氨基酸(例如，细胞内区域的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10多至15个氨基酸)。在一些方面，跨膜结构域与嵌合蛋白(例如，CAR)的其他结构域中的一个缔合，例如，在一些实施例中，跨膜结构域可以来自信号传导结构域、共刺激结构域或铰链结构域所来源的相同蛋白质。在另一个方面，跨膜结构域不源自嵌合蛋白(例如，CAR)的任何其他结构域所来源的相同蛋白质。在一些情况下，可以选择或通过氨基酸置换修饰跨膜结构域，以避免此类域与相同或不同表面膜蛋白的跨膜结构域结合，例如，以最小化与受体复合物的其他成员的相互作用。在一些方面，跨膜结构域能够与表达CAR的细胞的细胞表面上的另一种CAR同源二聚化。在不同的方面，可以修饰或取代跨膜结构域的氨基酸序列，以便最小化与存在于相同表达CAR的细胞中的天然结合配偶体的结合结构域的相互作用。
跨膜结构域可以源自天然来源或来自重组来源。在来源是天然的情况下，结构域可以源自任何膜结合或跨膜蛋白。在一些方面，每当CAR结合靶标时，跨膜结构域能够将信号传导至一个或多个细胞内结构域。在本发明中特别使用的跨膜结构域可以至少包括例如T细胞受体的α、β或ζ链、CD28、CD27、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154的一个或多个跨膜区。在一些实施例中，跨膜结构域可以至少包含以下中的一个或多个跨膜区：例如，KIRDS2、OX40、CD2、CD27、LFA-1(CD11a、CD18)、ICOS(CD278)、4-1BB(CD137)、GITR、CD40、BAFFR、HVEM(LIGHTR)、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、NKp44、NKp30、NKp46、CD160、CD19、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、ITGA1、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、LFA-1、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、TNFR2、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(Tactile)、CEACAM1、CRTAM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CD100(SEMA4D)、SLAMF6(NTB-A、Ly108)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、PAG/Cbp、NKG2D或NKG2C。
在一些情况下，跨膜结构域可以通过铰链(例如，来自人蛋白质的铰链)附接到CAR的细胞外区域(例如，CAR的抗原结合结构域)。例如，在一些实施例中，铰链可以是人Ig(免疫球蛋白)铰链(例如，IgG4铰链、IgD铰链)、GS接头(例如，本文所述的GS接头)、KIR2DS2铰链或CD8a铰链。在一些实施例中，铰链或间隔区包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列(例如，由其组成)。在一些方面，跨膜结构域包含SEQ ID NO:12的跨膜结构域(例如，由其组成)。
在一些实施例中，编码的跨膜结构域包含具有SEQ ID NO:12的氨基酸序列的至少一个、两个或三个修饰、但不超过20、10或5个修饰的CD8跨膜结构域的氨基酸序列，或与SEQID NO:12的氨基酸序列具有95％-99％同一性的序列。在一些实施例中，编码的跨膜结构域包含SEQ ID NO:12的序列。
在其他实施例中，编码CAR的核酸分子包含CD8跨膜结构域的核苷酸序列，例如，包含SEQ ID NO:13的序列，或其具有95％-99％同一性的序列。
在一些实施例中，编码的抗原结合结构域通过铰链区与跨膜结构域连接。在一些实施例中，编码的铰链区包含CD8铰链的氨基酸序列，例如，SEQ ID NO:4；或IgG4绞链的氨基酸序列，例如，SEQ ID NO:6，或与SEQ ID NO:4或6具有95％-99％同一性的序列。在其他实施例中，编码铰链区的核酸序列包含分别对应于CD8铰链或IgG4铰链的SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:7的序列，或与SEQ ID NO:5或7具有95％-99％同一性的序列。
在一些方面，铰链或间隔区包含IgG4铰链。例如，在一些实施例中，铰链或间隔区包含氨基酸序列ESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGKM(SEQ ID NO:6)的铰链。在一些实施例中，铰链或间隔区包含由GAGAGCAAGTACGGCCCTCCCTGCCCCCCTTGCCCTGCCCCCGAGTTCCTGGGCGGACCCAGCGTGTTCCTGTTCCCCCCCAAGCCCAAGGACACCCTGATGATCAGCCGGACCCCCGAGGTGACCTGTGTGGTGGTGGACGTGTCCCAGGAGGACCCCGAGGTCCAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCCCGGGAGGAGCAGTTCAATAGCACCTACCGGGTGGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGACTGGCTGAACGGCAAGGAATACAAGTGTAAGGTGTCCAACAAGGGCCTGCCCAGCAGCATCGAGAAAACCATCAGCAAGGCCAAGGGCCAGCCTCGGGAGCCCCAGGTGTACACCCTGCCCCCTAGCCAAGAGGAGATGACCAAGAACCAGGTGTCCCTGACCTGCCTGGTGAAGGGCTTCTACCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACCACCCCCCCTGTGCTGGACAGCGACGGCAGCTTCTTCCTGTACAGCCGGCTGACCGTGGACAAGAGCCGGTGGCAGGAGGGCAACGTCTTTAGCTGCTCCGTGATGCACGAGGCCCTGCACAACCACTACACCCAGAAGAGCCTGAGCCTGTCCCTGGGCAAGATG(SEQ ID NO:7)的核苷酸序列编码的铰链。
在一些方面，铰链或间隔区包含IgD铰链。例如，在一些实施例中，铰链或间隔区包含氨基酸序列RWPESPKAQASSVPTAQPQAEGSLAKATTAPATTRNTGRGGEEKKKEKEKEEQEERETKTPECPSHTQPLGVYLLTPAVQDLWLRDKATFTCFVVGSDLKDAHLTWEVAGKVPTGGVEEGLLERHSNGSQSQHSRLTLPRSLWNAGTSVTCTLNHPSLPPQRLMALREPAAQAPVKLSLNLLASSDPPEAASWLLCEVSGFSPPNILLMWLEDQREVNTSGFAPARPPPQPGSTTFWAWSVLRVPAPPSPQPATYTCVVSHEDSRTLLNASRSLEVSYVTDH(SEQ ID NO:8)的铰链。在一些实施例中，铰链或间隔区包含由AGGTGGCCCGAAAGTCCCAAGGCCCA GGCATCTAGTGTTCCTACTGCACAGCCCCAGGCAGAAGGCAGCCTAGCCAAAGCTACTACTGCACCTGCCACTACGCGCAATACTGGCCGTGGCGGGGAGGAGAAGAAAAAGGAGAAAGAGAAAGAAGAACAGGAAGAGAGGGAGACCAAGACCCCTGAATGTCCATCCCATACCCAGCCGCTGGGCGTCTATCTCTTGACTCCCGCAGTACAGGACTTGTGGCTTAGAGATAAGGCCACCTTTACATGTTTCGTCGTGGGCTCTGACCTGAAGGATGCCCATTTGACTTGGGAGGTTGCCGGAAAGGTACCCACAGGGGGGGTTGAGGAAGGGTTGCTGGAGCGCCATTCCAATGGCTCTCAGAGCCAGCACTCAAGACTCACCCTTCCGAGATCCCTGTGGAACGCCGGGACCTCTGTCACATGTACTCTAAATCATCCTAGCCTGCCCCCACAGCGTCTGATGGCCCTTAGAGAGCCAGCCGCCCAGGCACCAGTTAAGCTTAGCCTGAATCTGCTCGCCAGTAGTGATCCCCCAGAGGCCGCCAGCTGGCTCTTATGCGAAGTGTCCGGCTTTAGCCCGCCCAACATCTTGCTCATGTGGCTGGAGGACCAGCGAGAAGTGAACACCAGCGGCTTCGCTCCAGCCCGGCCCCCACCCCAGCCGGGTTCTACCACATTCTGGGCCTGGAGTGTCTTAAGGGTCCCAGCACCACCTAGCCCCCAGCCAGCCACATACACCTGTGTTGTGTCCCATGAAGATAGCAGGACCCTGCTAAATGCTTCTAGGAGTCTGGAGGTTTCCTACGTGACTGACCATT(SEQ ID NO:9)的核苷酸序列编码的铰链。
在一些方面，跨膜结构域可以是重组的，在这种情况下其将主要包含疏水性残基，如亮氨酸和缬氨酸。在一些方面，可以在重组跨膜结构域的每个末端处发现苯丙氨酸、色氨酸和缬氨酸的三联体。
任选地，长度在2与10个氨基酸之间的短的寡肽或多肽接头可以在CAR的跨膜结构域与胞质区域之间形成键联。甘氨酸-丝氨酸双联体提供特别适合的接头。例如，在一些方面，接头包含GGGGSGGGGS(SEQ ID NO:10)的氨基酸序列。在一些实施例中，接头由GGTGGCGGAGGTTCTGGAGGTGGAGGTTCC(SEQ ID NO:11)的核苷酸序列编码。在一些实施例中，接头包含GGGGS的氨基酸序列(SEQ ID NO:877)。在一些实施例中，接头由SEQ ID NO:876的核苷酸序列编码。
在一些方面，铰链或间隔区包含KIR2DS2铰链。
信号传导结构域
在具有细胞内信号传导结构域的本发明实施例中，这种结构域可以含有例如初级信号传导结构域和/或共刺激信号传导结构域中的一个或多个。在一些实施例中，细胞内信号传导结构域包含编码初级信号传导结构域的序列。在一些实施例中，细胞内信号传导结构域包含共刺激信号传导结构域。在一些实施例中，细胞内信号传导结构域包含初级信号传导结构域和共刺激信号传导结构域。
本发明的CAR的胞质部分内的细胞内信号传导序列可以按随机或指定的顺序彼此连接。任选地，短的寡肽或多肽接头，例如，长度在2与10个氨基酸之间(例如，2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸)可以形成细胞内信号传导序列之间的键联。在一些实施例中，甘氨酸-丝氨酸双联体可以用作适合的接头。在一些实施例中，单个氨基酸(例如，丙氨酸、甘氨酸)可以用作适合的接头。
在一些方面，细胞内信号传导结构域被设计成包含两个或更多个(例如，2、3、4、5、或更多个)共刺激信号传导结构域。在一些实施例中，两个或更多个(例如，2、3、4、5、或更多个)共刺激信号传导结构域通过接头分子(例如，本文描述的接头分子)分开。在一些实施例中，细胞内信号传导结构域包含两个共刺激信号传导结构域。在一些实施例中，接头分子是甘氨酸残基。在一些实施例中，接头是丙氨酸残基。
初级信号传导结构域
初级信号传导结构域以刺激方式或以抑制性方式调控TCR复合物的初级活化。以刺激方式起作用的初级细胞内信号传导结构域可以含有被称为基于免疫受体酪氨酸的活化基序或ITAM的信号传导基序。在CAR中，此类结构域用于相同目的。
含有在本发明中特别使用的初级细胞内信号传导结构域的ITAM的实例包括以下的那些：ζ、/>FcRγ/>FcRβ/>CD3γ、CD3δ、CD3ε/>CD79a、CD79b、DAP10、以及DAP12。在一些实施例中，本发明的CAR包含细胞内信号传导结构域，例如，CD3-ζ的初级信号传导结构域。
在一些实施例中，编码的初级信号传导结构域包含CD3ζ的功能性信号传导结构域。编码的CD3ζ初级信号传导结构域可以包含具有SEQ ID NO:18或SEQ ID NO:20的氨基酸序列的至少一个、两个或三个修饰、但不超过20、10或5个修饰的氨基酸序列，或与SEQ IDNO:18或SEQ ID NO:20的氨基酸序列具有95％-99％同一性的序列。在一些实施例中，编码的初级信号传导结构域包含SEQ ID NO:18或SEQ ID NO:20的序列。在其他实施例中，编码初级信号传导结构域的核酸序列包含SEQ ID NO:19或SEQ ID NO:21的序列，或其具有95％-99％同一性的序列。
共刺激信号传导结构域
在一些实施例中，编码的细胞内信号传导结构域包含共刺激信号传导结构域。例如，细胞内信号传导结构域可以包含初级信号传导结构域和共刺激信号传导结构域。在一些实施例中，编码的共刺激信号传导结构域包含选自以下中的一种或多种的蛋白质的功能性信号传导结构域：CD27、CD28、4-1BB(CD137)、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3、与CD83特异性地结合的配体、CDS、ICAM-1、GITR、BAFFR、HVEM(LIGHTR)、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、CD160、CD19、CD4、CD8α、CD8β、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、ITGA4、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、LFA-1、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、TNFR2、TRANCE/RANKL、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(Tactile)、CEACAM1、CRTAM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CD100(SEMA4D)、CD69、SLAMF6(NTB-A、Ly108)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、LAT、GADS、SLP-76、PAG/Cbp、NKp44、NKp30、NKp46、以及NKG2D。
在一些实施例中，编码的共刺激信号传导结构域包含具有SEQ ID NO:14或SEQ IDNO:16的氨基酸序列的至少一个、两个或三个修饰、但不超过20、10或5个修饰的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:16的氨基酸序列具有95％-99％同一性的序列。在一些实施例中，编码的共刺激信号传导结构域包含SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:16的序列。在其他实施例中，编码共刺激信号传导结构域的核酸序列包含SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:17的序列，或其具有95％-99％同一性的序列。
在其他实施例中，编码的细胞内结构域包含SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:16的序列，和SEQ ID NO:18或SEQ ID NO:20的序列，其中包含细胞内信号传导结构域的序列在同一框架中表达并且表达为单个多肽链。
在一些实施例中，编码细胞内信号传导结构域的核酸序列包含SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:17的序列，或其具有95％-99％同一性的序列；以及SEQ ID NO:19或SEQ ID NO:21的序列，或其具有95％-99％同一性的序列。
在一些实施例中，核酸分子进一步编码前导序列。在一些实施例中，前导序列包含SEQ ID NO:2的序列。
在一些方面，细胞内信号传导结构域被设计成包含CD3-ζ的信号传导结构域和CD28的信号传导结构域。在一些方面，细胞内信号传导结构域被设计成包含CD3-ζ的信号传导结构域和4-1BB的信号传导结构域。在一些方面，4-1BB的信号传导结构域是SEQ ID NO:14的信号传导结构域。在一些方面，CD3-ζ的信号传导结构域是SEQ ID NO:18的信号传导结构域。
在一些方面，细胞内信号传导结构域被设计成包含CD3-ζ的信号传导结构域和CD27的信号传导结构域。在一些方面，CD27的信号传导结构域包含QRRKYRSNKGESPVEPAEPCRYSCPREEEGSTIPIQEDY RKPEPACSP(SEQ ID NO:16)的氨基酸序列。在一些方面，CD27的信号传导结构域由AGGAGTAAGAGGAGCAGGCTCCTGCACAGTGACTACATGAACATGACTCCCCGCCGCCCCGGGCCCACCCGCAAGCATTACCAGCCCTATGCCCCACCACGCGACTTCGCAGCCTATCGCTCC(SEQ ID NO:17)的核酸序列编码。
抑制性结构域
在一些实施例中，载体包含编码CAR(例如，本文描述的CAR)的核酸序列，和编码包含以下的抑制性分子的核酸序列：inhKIR胞质结构域；跨膜结构域，例如，KIR跨膜结构域；和抑制剂胞质结构域，例如，ITIM结构域，例如，inhKIR ITIM结构域。在一些实施例中，抑制性分子是天然存在的inhKIR，或与天然存在的inhKIR共有至少50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％或99％同源性或相差不超过1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15或20个残基的序列。
在一些实施例中，编码抑制性分子的核酸序列包含：SLAM家族胞质结构域；跨膜结构域，例如，SLAM家族跨膜结构域；和抑制剂胞质结构域，例如，SLAM家族结构域，例如，SLAM家族ITIM结构域。在一些实施例中，抑制性分子是天然存在的SLAM家族成员，或与天然存在的SLAM家族成员共有至少50％、60％、70％、80％、85％、90％、95％或99％同源性或相差不超过1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15或20个残基的序列。
在一些实施例中，载体是体外转录的载体，例如，转录本文描述的核酸分子的RNA的载体。在一些实施例中，载体中的核酸序列进一步包含聚(A)尾，例如，聚A尾。在一些实施例中，载体中的核酸序列进一步包含3'UTR，例如，本文描述的3'UTR，例如，包含源自人β-球蛋白的3'UTR的至少一个重复。在一些实施例中，载体中的核酸序列进一步包含启动子，例如，T2A启动子。
启动子
在一些实施例中，载体进一步包含启动子。在一些实施例中，启动子选自EF-1启动子、CMV IE基因启动子、EF-1α启动子、泛素C启动子或磷酸甘油酸激酶(PGK)启动子。在一些实施例中，启动子是EF-1启动子。在一些实施例中，EF-1启动子包含SEQ ID NO:1的序列。
在本发明的一些方面，可以使用任何数量的本领域技术人员已知的技术(如FicollTM分离)从自受试者收集的血液单位获得免疫效应细胞，例如，T细胞。在一些方面，通过单采术获得来自个体的循环血液的细胞。单采术产物典型地含有淋巴细胞，包括T细胞、单核细胞、粒细胞、B细胞、其他有核白细胞、红细胞和血小板。在一些方面，可以洗涤通过单采术收集的细胞以去除血浆部分，并且任选地将细胞悬浮在缓冲液或培养基中以用于后续加工步骤。在一些实施例中，用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤细胞。在一个替代性实施例中，洗涤溶液缺少钙并且可能缺少镁，或者可能缺少许多(如果不是全部)二价阳离子。
表17：CAR的各种组分的序列(aa-氨基酸，na-编码相应蛋白质的核酸)
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制造方法
可以在例如CAR-T细胞的体外制造中使用本文所述的慢病毒载体(例如，使用本文描述的方法)。
本文披露的CART可以通过本领域中任何已知的方法离体制造。例如，可以使用WO2012/079000或WO 2020/047452中描述的方法(均通过引用并入本文)。本文披露的CART还可以通过本领域中任何已知的方法在体内制造。例如，在WO 2020/176397(通过引用并入本文)中披露的方法。免疫效应细胞(例如，T细胞或NK细胞)可以表达一个CAR或两个或更多个CAR。
在一些实施例中，本文披露的方法可以在不到24小时内制造经工程化以表达一种或多种CAR的免疫效应细胞。不希望受理论束缚，本文提供的方法在制造过程中保留T细胞的未分化表型，如初始T细胞。这些具有未分化表型的表达CAR的细胞在输注后可在体内持续更长时间和/或更好地扩增。在一些实施例中，与通过传统的制造过程(例如，如使用scRNA-seq测量)产生的CART细胞相比，由本文提供的制造方法产生的CART细胞包含更高百分比的干细胞记忆T细胞。
在一些实施例中，通过本文提供的制造方法产生的CART细胞包含比通过传统制造过程产生的CART细胞更高百分比的效应T细胞，例如，使用scRNA-seq测量。在一些实施例中，与通过传统制造过程(例如，如使用scRNA-seq测量)产生的CART细胞相比，通过本文提供的制造方法产生的CART细胞更好地保持T细胞的刚性。在一些实施例中，通过本文提供的制造方法产生的CART细胞显示出比通过传统制造工艺产生的CART细胞更低的缺氧水平，例如，使用scRNA-seq测量。在一些实施例中，通过本文提供的制造方法产生的CART细胞显示出比通过传统制造过程产生的CART细胞更低水平的自噬，例如，使用scRNA-seq测量。在一些实施例中，免疫效应细胞被工程化以包含编码本文所披露的一个或多个CAR的核酸分子。
在一些实施例中，本文披露的方法不涉及使用珠，例如(例如，CD3/CD28/>)，并且不涉及去珠步骤。在一些实施例中，通过本文披露的方法制造的CART细胞可以以最小的离体扩增施用于受试者，例如，小于1天、小于12小时、小于8小时、小于6小时、小于4小时、小于3小时、小于2小时、小于1小时、或没有离体扩张。因此，本文描述的方法提供了制备改进的表达CAR的细胞产物的快速制造过程，细胞产物用于治疗受试者的疾病。
在一些实施例中，本披露提供了制备表达嵌合抗原受体(CAR)的细胞(例如，T细胞)群体的方法，这些方法包括：(i)使细胞(例如，T细胞，例如，从冷冻或新鲜的白细胞单采产物中分离的T细胞)群体与刺激CD3/TCR复合物的药剂和/或与刺激细胞表面上共刺激分子的药剂接触；(ii)使细胞(例如，T细胞)群体与编码CAR的核酸分子(例如，DNA或RNA分子)接触，从而提供包含核酸分子的细胞(例如，T细胞)群体；和(iii)收获细胞(例如，T细胞)群体用于储存(例如，在冷冻保存培养基中重新配制细胞群体)或施用，其中：(a)步骤(ii)与步骤(i)一起进行，或在步骤(i)开始后不晚于20小时(例如，在步骤(i)开始后不晚于12、13、14、15、16、17、或18小时，例如，在步骤(i)开始后不晚于18小时)进行，并且步骤(iii)在步骤(i)开始后不晚于26小时(例如，在步骤(i)开始后不晚于22、23、或24小时，例如，在步骤(i)开始后不晚于24小时)进行；(b)步骤(ii)与步骤(i)一起进行，或在步骤(i)开始后不晚于20小时(例如，在步骤(i)开始后不晚于12、13、14、15、16、17、或18小时，例如，在步骤(i)开始后不晚于18小时)进行，并且步骤(iii)在步骤(ii)开始后不晚于30小时(例如，在步骤(ii)开始后不晚于22、23、24、25、26、27、28、29、或30小时)进行；或(c)例如如通过活细胞数目进行评估，与步骤(i)开始时的细胞群体相比，来自步骤(iii)的细胞群体不扩增，或扩增不超过5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、或40％，例如不超过10％。在一些实施例中，步骤(ii)中的核酸分子是DNA分子。在一些实施例中，步骤(ii)中的核酸分子是RNA分子。在一些实施例中，步骤(ii)中的核酸分子在病毒载体(例如，选自慢病毒载体、腺病毒载体、或逆转录病毒载体的病毒载体)上。在一些实施例中，步骤(ii)中的核酸分子在非病毒载体上。在一些实施例中，步骤(ii)中的核酸分子在质粒上。在一些实施例中，步骤(ii)中的核酸分子不在任何载体上。在一些实施例中，步骤(ii)包括用一种或多种包含编码一种或多种CAR的核酸分子的病毒载体转导细胞(例如，T细胞)群体。
在一些实施例中，从受试者的单采样品(例如，白细胞单采样品)收集细胞(例如，T细胞)群体。
在一些实施例中，从受试者收集的单采样品(例如，白细胞单采样品)并作为冷冻样品(例如，冷冻保存的样品)运输至细胞制造设施。然后解冻冷冻的单采样品，并且从单采样品中选择T细胞(例如，CD4+T细胞和/或CD8+T细胞)，例如，使用细胞分选机(例如， 装置)。然后使用本文所述的活化过程接种所选择的T细胞(例如，CD4+T细胞和/或CD8+T细胞)用于CART制造。在一些实施例中，选择的T细胞(例如，CD4+T细胞和/或CD8+T细胞)在接种用于CART制造之前经历一轮或多轮冷冻-解冻。
在一些实施例中，从受试者收集的单采样品(例如，白细胞单采样品)并作为新鲜产品(例如，不冷冻的样品)运输至细胞制造设施。从单采样品中选择T细胞(例如，CD4+T细胞和/或CD 8+T细胞)，例如，使用细胞分选机(例如，装置)。然后使用本文所述的活化过程接种所选择的T细胞(例如，CD4+T细胞和/或CD8+T细胞)用于CART制造。在一些实施例中，选择的T细胞(例如，CD4+T细胞和/或CD8+T细胞)在接种用于CART制造之前经历一轮或多轮冷冻-解冻。
在一些实施例中，从受试者收集单采样品(例如，白细胞单采样品)。从单采样品中选择T细胞(例如，CD4+T细胞和/或CD8+T细胞)，例如，使用细胞分选机(例如，装置)。然后将选择的T细胞(例如，CD4+T细胞和/或CD8+T细胞)作为冷冻样品(例如，冷冻保存的样品)运输至细胞制造设施。随后解冻所选择的T细胞(例如，CD4+T细胞和/或CD8+T细胞)并使用本文所述的活化过程接种用于CART制造。
在一些实施例中，使细胞(例如，T细胞)与抗CD3和抗CD28抗体接触例如12小时，随后用编码CAR(例如，一种或多种CAR)的载体(例如，慢病毒载体)(例如，一种或多种载体)转导。培养开始后24小时，洗涤细胞，并配制用于储存或施用。
不希望受理论束缚，简短的CD3和CD28刺激可以促进自我更新T细胞的有效转导。与传统的CART制造方法相比，本文提供的活化过程不涉及延长的离体扩增。与细胞因子过程类似，本文提供的活化过程还在CART制造期间保留未分化的T细胞。
在一些实施例中，使细胞群体与刺激CD3/TCR复合物的药剂和/或刺激细胞表面上的共刺激分子的药剂接触。
在一些实施例中，刺激CD3/TCR复合物的药剂是刺激CD3的药剂。在一些实施例中，刺激共刺激分子的药剂是刺激CD28、ICOS、CD27、HVEM、LIGHT、CD40、4-1BB、0X40、DR3、GITR、CD30、TIM1、CD2、CD226、或其任何组合的药剂。在一些实施例中，刺激共刺激分子的药剂是刺激CD28的药剂。在一些实施例中，刺激CD3/TCR复合物的药剂选自抗体(例如，单结构域抗体(例如，重链可变结构域抗体)、肽体、Fab片段、或scFv)、小分子、或配体(例如，天然存在的配体、重组配体、或嵌合配体)。在一些实施例中，刺激CD3/TCR复合物的药剂是抗体。在一些实施例中，刺激CD3/TCR复合物的药剂是抗-CD3抗体。在一些实施例中，刺激共刺激分子的药剂选自抗体(例如，单结构域抗体(例如，重链可变结构域抗体)、肽体、Fab片段、或scFv)、小分子、或配体(例如，天然存在的配体、重组配体、或嵌合配体)。在一些实施例中，刺激共刺激分子的药剂是抗体。在一些实施例中，刺激共刺激分子的药剂是抗CD28抗体。在一些实施例中，刺激CD3/TCR复合物的药剂或刺激共刺激分子的药剂不包含珠。在一些实施例中，刺激CD3/TCR复合物的药剂包含与胶体聚合物纳米基质共价附接的抗CD3抗体。在一些实施例中，刺激共刺激分子的药剂包含与胶体聚合物纳米基质共价附接的抗CD28抗体。在一些实施例中，刺激CD3/TCR复合物的药剂和刺激共刺激分子的药剂包含T细胞TransActTM。
在一些实施例中，基质包含聚合物或由其组成，例如，可生物降解或生物相容的惰性材料，例如，其对细胞无毒。在一些实施例中，基质由亲水性聚合物链组成，由于链的水合作用，其在水溶液中获得最大的移动性。在一些实施例中，移动基质可以是胶原蛋白、纯化的蛋白质、纯化的肽、多糖、糖胺聚糖或细胞外基质组合物。多糖可包括例如纤维素醚、淀粉、阿拉伯树胶、琼脂糖、葡聚糖、壳聚糖、透明质酸、果胶、黄原胶、瓜尔胶或海藻酸盐。其他聚合物可包括聚酯、聚醚、聚丙烯酸酯、聚丙烯酰胺、聚胺、聚乙烯亚胺、聚季铵盐聚合物、聚磷腈、聚乙烯醇、聚乙酸乙烯酯、聚乙烯吡咯烷酮、嵌段共聚物或聚氨酯。在一些实施例中，移动基质是葡聚糖的聚合物。
在一些实施例中，使细胞群体与编码CAR(例如一种或多种CAR)的核酸分子(例如一种或多种核酸分子)接触。在一些实施例中，将细胞群体用编码CAR(例如一种或多种CAR)的DNA分子(例如一种或多种DNA分子)转导。
在一些实施例中，在两种核酸分子(例如，慢病毒载体)共转导的情况下，核酸分子各自编码本文披露的CAR，可以按不同的感染复数(MOI)将含有编码CAR的核酸分子的每种载体添加至反应混合物(例如，含有细胞群体)。
不希望受理论束缚，据信在一些实施例中，针对含有编码不同CAR分子的核酸分子的载体，使用不同的MOI可能会影响细胞群体的最终组成。例如，在编码一个CAR的慢病毒载体和编码另一个靶向不同靶点的CAR共同转导的情况下，可以使用不同的MOI来最大化优选单CART细胞和双CART细胞的百分比，同时导致更少的不需要的单CART细胞和未经转导的细胞。
可以基于许多因素(包括但不限于病毒载体批次的特性，有待转导的细胞的特性以及转导效率)来调整或确定针对每种载体所使用的精确MOI。在一些实施例中，使细胞群体与编码一种或多种CAR的一种或多种核酸分子接触，同时使细胞群体与刺激CD3/TCR复合物的药剂和/或刺激上述细胞的表面上的共刺激分子的药剂接触。在一些实施例中，在细胞群体与刺激CD3/TCR复合物的药剂和/或刺激上述细胞的表面上的共刺激分子的药剂接触开始后不迟于30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1、或0.5小时，使细胞群体与编码一种或多种CAR的一种或多种核酸分子接触。在一些实施例中，在细胞群体与刺激CD3/TCR复合物的药剂和/或刺激上述细胞的表面上的共刺激分子的药剂接触开始后不迟于20小时，使细胞群体与编码一种或多种CAR的一种或多种核酸分子接触。在一些实施例中，在细胞群体与刺激CD3/TCR复合物的药剂和/或刺激上述细胞的表面上的共刺激分子的药剂接触开始后不迟于19小时，使细胞群体与编码一种或多种CAR的一种或多种核酸分子接触。在一些实施例中，在细胞群体与刺激CD3/TCR复合物的药剂和/或刺激上述细胞的表面上的共刺激分子的药剂接触开始后不迟于18小时，使细胞群体与编码一种或多种CAR的一种或多种核酸分子接触。在一些实施例中，在细胞群体与刺激CD3/TCR复合物的药剂和/或刺激上述细胞的表面上的共刺激分子的药剂接触开始后不迟于17小时，使细胞群体与编码一种或多种CAR的一种或多种核酸分子接触。
在一些实施例中，在细胞群体与刺激CD3/TCR复合物的药剂和/或刺激上述细胞的表面上的共刺激分子的药剂接触开始后不迟于16小时，使细胞群体与编码一种或多种CAR的一种或多种核酸分子接触。在一些实施例中，在细胞群体与刺激CD3/TCR复合物的药剂和/或刺激上述细胞的表面上的共刺激分子的药剂接触开始后不迟于15小时，使细胞群体与编码一种或多种CAR的一种或多种核酸分子接触。在一些实施例中，在细胞群体与刺激CD3/TCR复合物的药剂和/或刺激上述细胞的表面上的共刺激分子的药剂接触开始后不迟于14小时，使细胞群体与编码一种或多种CAR的一种或多种核酸分子接触。在一些实施例中，在细胞群体与刺激CD3/TCR复合物的药剂和/或刺激上述细胞的表面上的共刺激分子的药剂接触开始后不迟于14小时，使细胞群体与编码一种或多种CAR的一种或多种核酸分子接触。在一些实施例中，在细胞群体与刺激CD3/TCR复合物的药剂和/或刺激上述细胞的表面上的共刺激分子的药剂接触开始后不迟于13小时，使细胞群体与编码一种或多种CAR的一种或多种核酸分子接触。在一些实施例中，在细胞群体与刺激CD3/TCR复合物的药剂和/或刺激上述细胞的表面上的共刺激分子的药剂接触开始后不迟于12小时，使细胞群体与编码一种或多种CAR的一种或多种核酸分子接触。在一些实施例中，在细胞群体与刺激CD3/TCR复合物的药剂和/或刺激上述细胞的表面上的共刺激分子的药剂接触开始后不迟于11小时，使细胞群体与编码一种或多种CAR的一种或多种核酸分子接触。在一些实施例中，在细胞群体与刺激CD3/TCR复合物的药剂和/或刺激上述细胞的表面上的共刺激分子的药剂接触开始后不迟于10小时，使细胞群体与编码一种或多种CAR的一种或多种核酸分子接触。在一些实施例中，在细胞群体与刺激CD3/TCR复合物的药剂和/或刺激上述细胞的表面上的共刺激分子的药剂接触开始后不迟于9小时，使细胞群体与编码一种或多种CAR的一种或多种核酸分子接触。在一些实施例中，在细胞群体与刺激CD3/TCR复合物的药剂和/或刺激上述细胞的表面上的共刺激分子的药剂接触开始后不迟于8小时，使细胞群体与编码一种或多种CAR的一种或多种核酸分子接触。在一些实施例中，在细胞群体与刺激CD3/TCR复合物的药剂和/或刺激上述细胞的表面上的共刺激分子的药剂接触开始后不迟于7小时，使细胞群体与编码一种或多种CAR的一种或多种核酸分子接触。在一些实施例中，在细胞群体与刺激CD3/TCR复合物的药剂和/或刺激上述细胞的表面上的共刺激分子的药剂接触开始后不迟于6小时，使细胞群体与编码一种或多种CAR的一种或多种核酸分子接触。在一些实施例中，在细胞群体与刺激CD3/TCR复合物的药剂和/或刺激上述细胞的表面上的共刺激分子的药剂接触开始后不迟于5小时，使细胞群体与编码一种或多种CAR的一种或多种核酸分子接触。在一些实施例中，在细胞群体与刺激CD3/TCR复合物的药剂和/或刺激上述细胞的表面上的共刺激分子的药剂接触开始后不迟于4小时，使细胞群体与编码一种或多种CAR的一种或多种核酸分子接触。在一些实施例中，在细胞群体与刺激CD3/TCR复合物的药剂和/或刺激上述细胞的表面上的共刺激分子的药剂接触开始后不迟于3小时，使细胞群体与编码一种或多种CAR的一种或多种核酸分子接触。在一些实施例中，在细胞群体与刺激CD3/TCR复合物的药剂和/或刺激上述细胞的表面上的共刺激分子的药剂接触开始后不迟于2小时，使细胞群体与编码一种或多种CAR的一种或多种核酸分子接触。在一些实施例中，在细胞群体与刺激CD3/TCR复合物的药剂和/或刺激上述细胞的表面上的共刺激分子的药剂接触开始后不迟于1小时，使细胞群体与编码一种或多种CAR的一种或多种核酸分子接触。在一些实施例中，在细胞群体与刺激CD3/TCR复合物的药剂和/或刺激上述细胞的表面上的共刺激分子的药剂接触开始后不迟于30分钟，使细胞群体与编码一种或多种CAR的一种或多种核酸分子接触。
在一些实施例中，收获细胞群体用于储存或施用。
在一些实施例中，在细胞群体与刺激CD3/TCR复合物的药剂和/或刺激上述细胞的表面上的共刺激分子的药剂接触开始后不迟于72、60、48、36、32、31、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、或18小时，收获细胞群体用于储存或施用。在一些实施例中，在细胞群体与刺激CD3/TCR复合物的药剂和/或刺激上述细胞的表面上的共刺激分子的药剂接触开始后不迟于26小时，收获细胞群体用于储存或施用。在一些实施例中，在细胞群体与刺激CD3/TCR复合物的药剂和/或刺激上述细胞的表面上的共刺激分子的药剂接触开始后不迟于25小时，收获细胞群体用于储存或施用。在一些实施例中，在细胞群体与刺激CD3/TCR复合物的药剂和/或刺激上述细胞的表面上的共刺激分子的药剂接触开始后不迟于24小时，收获细胞群体用于储存或施用。在一些实施例中，在细胞群体与刺激CD3/TCR复合物的药剂和/或刺激上述细胞的表面上的共刺激分子的药剂接触开始后不迟于23小时，收获细胞群体用于储存或施用。在一些实施例中，在细胞群体与刺激CD3/TCR复合物的药剂和/或刺激上述细胞的表面上的共刺激分子的药剂接触开始后不迟于22小时，收获细胞群体用于储存或施用。
在一些实施例中，细胞群体不是离体扩增的。
在一些实施例中，例如，如通过活细胞数目进行评估，与在细胞群体与刺激CD3/TCR复合物的药剂和/或刺激上述细胞的表面上的共刺激分子的药剂接触之前的细胞群体相比，该细胞群体扩增不超过5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、或60％。在一些实施例中，例如，如通过活细胞数目进行评估，与在细胞群体与刺激CD3/TCR复合物的药剂和/或刺激上述细胞的表面上的共刺激分子的药剂接触之前的细胞群体相比，该细胞群体扩增不超过5％。在一些实施例中，例如，如通过活细胞数目进行评估，与在细胞群体与刺激CD3/TCR复合物的药剂和/或刺激上述细胞的表面上的共刺激分子的药剂接触之前的细胞群体相比，该细胞群体扩增不超过10％。在一些实施例中，例如，如通过活细胞数目进行评估，与在细胞群体与刺激CD3/TCR复合物的药剂和/或刺激上述细胞的表面上的共刺激分子的药剂接触之前的细胞群体相比，该细胞群体扩增不超过15％。在一些实施例中，例如，如通过活细胞数目进行评估，与在细胞群体与刺激CD3/TCR复合物的药剂和/或刺激上述细胞的表面上的共刺激分子的药剂接触之前的细胞群体相比，该细胞群体扩增不超过20％。在一些实施例中，例如，如通过活细胞数目进行评估，与在细胞群体与刺激CD3/TCR复合物的药剂和/或刺激上述细胞的表面上的共刺激分子的药剂接触之前的细胞群体相比，该细胞群体扩增不超过25％。在一些实施例中，例如，如通过活细胞数目进行评估，与在细胞群体与刺激CD3/TCR复合物的药剂和/或刺激上述细胞的表面上的共刺激分子的药剂接触之前的细胞群体相比，该细胞群体扩增不超过30％。在一些实施例中，例如，如通过活细胞数目进行评估，与在细胞群体与刺激CD3/TCR复合物的药剂和/或刺激上述细胞的表面上的共刺激分子的药剂接触之前的细胞群体相比，该细胞群体扩增不超过35％。在一些实施例中，例如，如通过活细胞数目进行评估，与在细胞群体与刺激CD3/TCR复合物的药剂和/或刺激上述细胞的表面上的共刺激分子的药剂接触之前的细胞群体相比，该细胞群体扩增不超过40％。
在一些实施例中，例如，如通过活细胞数目进行评估，与在细胞群体与一种或多种如上的细胞因子接触之前的细胞群体相比，该细胞群体扩增不超过1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、6、7、8、9、10、11、12、16、20、24、36、或48小时。
在一些实施例中，活化过程在无血清细胞培养基中进行。在一些实施例中，活化过程在包含一种或多种选自以下的细胞因子的细胞培养基中进行：IL-2、IL-15(例如，hetIL-15(IL15/sIL-15Ra))、或IL-6(例如，IL-6/sIL-6Ra)。在一些实施例中，hetIL-15包含NWVNVISDLKKIEDLIQSMHIDATLYTESDVHPSCKVTAMKCFLLELQVISLESGDASIHDTVENLIILANNSLSSNGNVTESGCKECEELEEKNIKEFLQSFVHIVQMFINTSITCPPPMSVEHADIWVKSYSLYSRERYICNSGFKRKAGTSSLTECVLNKATNVAHWTTPSLKCIRDPALVHQRPAPPSTVTTAGVTPQPESLSPSGKEPAASSPSSNNTAATTAAIVPGSQLMPSKSPSTGTTEISSHESSHGTPSQTTAKNWELTASASHQPPGVYPQG(SEQ ID NO:309)的氨基酸序列。在一些实施例中，hetIL-15包含与SEQ ID NO:309具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、95％、或99％同一性的氨基酸序列。
在一些实施例中，活化过程在包含LSD1抑制剂的细胞培养基中进行。
在一些实施例中，活化过程在包含MALT1抑制剂的细胞培养基中进行。在一些实施例中，无血清细胞培养基包含血清替代物。在一些实施例中，血清替代物是CTSTM免疫细胞血清替代物(ICSR)。在一些实施例中，ICSR的水平可以是，例如，高达5％，例如，约1％、2％、3％、4％或5％。不希望受理论束缚，使用细胞培养基，例如，表21或表25中所示的快速培养基(Rapid Media)，包含ICSR，例如，2％ ICSR，可以改进本文所述制造过程中的细胞活力。
在一些实施例中，本披露提供了制备表达嵌合抗原受体(CAR)的细胞(例如，T细胞)群体的方法，这些方法包括：(a)提供从受试者收集的单采样品(例如，新鲜或冷冻保存的白细胞单采样品)；(b)从单采样品中选择T细胞(例如，使用阴性选择、阳性选择或无珠选择)；(c)将分离的T细胞接种，例如，1x106至1x107个细胞/mL；(d)使T细胞与刺激T细胞的药剂接触，例如，刺激CD3/TCR复合物的药剂和/或刺激细胞表面上的共刺激分子的药剂(例如，使T细胞与抗CD3和/或抗CD28抗体接触，例如，使T细胞与TransAct接触)；(e)使T细胞与编码一种或多种CAR的一种或多种核酸分子(例如，DNA或RNA分子)接触(例如，使T细胞与包含编码一种或多种CAR的一种或多种核酸分子接触)例如，6-48小时，例如，20-28小时；以及(f)洗涤和收获T细胞用于储存(例如，在冷冻保存培养基中重新配制T细胞)或施用。在一些实施例中，步骤(f)在步骤(d)或(e)开始后不迟于30小时进行，例如，在步骤(d)或(e)开始后不迟于22、23、24、25、26、27、28、29、或30小时。
在一些实施例中，本文提供了通过本文所述的任何制造过程制备的细胞(例如，免疫效应细胞，例如，T细胞或NK细胞)群体。
在一些实施例中，在制造过程结束时(例如，在细胞因子过程或本文所述的活化过程结束时)细胞群体中初始细胞(例如，初始T细胞，例如，CD45RA+CD45RO-CCR7+T细胞)的百分比，与制造过程开始时(例如，在细胞因子过程或本文所述的活化过程开始时)细胞群体中初始细胞(例如，初始T细胞，例如，CD45RA+CD45RO-CCR7+细胞)的百分比相比，(1)相同，(2)相差例如不超过4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、或15％，或(3)增加例如至少5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、或25％。在一些实施例中，与通过除持续，例如，超过26小时(例如，持续超过5、6、7、8、9、10、11、或12天)或涉及在体外扩增细胞群体，例如，超过3天(例如，在体外扩增细胞群体3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、或15天)外其他方面类似的方法制造的细胞相比，制造过程结束时(例如，在细胞因子过程或本文所述的活化过程结束时)的细胞群体显示较高百分比的初始细胞，例如，初始T细胞，如CD45RA+CD45RO-CCR7+T细胞(例如，至少高5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、或50％)。
在一些实施例中，在制造过程结束时(例如，在细胞因子过程或本文所述的活化过程结束时)细胞群体中初始细胞，例如，初始T细胞，例如，CD45RA+CD45RO-CCR7+T细胞)的百分比不少于20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、或60％。
在一些实施例中，在制造过程结束时(例如，在细胞因子过程或本文所述的活化过程结束时)细胞群体中的中枢记忆细胞(例如，中枢记忆T细胞，例如，CD95+中枢记忆T细胞)的百分比，与制造过程开始时(例如，在细胞因子过程或本文所述的活化过程开始时)细胞群体中的中枢记忆细胞(例如，中枢记忆T细胞，例如，CD95+中枢记忆T细胞)的百分比相比，(1)相同，(2)相差例如不超过4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、或15％，或(3)减少例如至少5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、或25％。在一些实施例中，与通过除持续，例如，超过26小时(例如，持续超过5、6、7、8、9、10、11、或12天)或涉及在体外扩增细胞群体，例如，超过3天(例如，在体外扩增细胞群体3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、或15天)外其他方面类似的方法制造的细胞相比，制造过程结束时(例如，在细胞因子过程或本文所述的活化过程结束时)的细胞群体显示较低百分比的中枢记忆细胞，例如，中枢记忆T细胞，如CD95+中枢记忆T细胞(例如，至少低5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、或50％)。
在一些实施例中，在制造过程结束时(例如，在细胞因子过程或本文所述的活化过程结束时)细胞群体中的中枢记忆细胞，例如，中枢记忆T细胞，例如，CD95+中枢记忆T细胞的百分比不超过40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、或80％。
在一些实施例中，与通过除持续，例如，超过26小时(例如，持续超过5、6、7、8、9、10、11、或12天)或涉及在体外扩增细胞群体，例如，超过3天(例如，在体外扩增细胞群体3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、或15天)外其他方面类似的方法制造的细胞相比，制造过程结束时(例如，在细胞因子过程或本文所述的活化过程结束时)的细胞群体在体内施用后持续更长时间或以更高水平上扩增(例如，至少高20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、或90％)。
在一些实施例中，在制造过程开始前(例如，在细胞因子过程或本文所述的活化过程开始前)，已经富集了用于表达IL6R的细胞(例如，IL6Ra和/或I L6 Kb阳性的细胞)的细胞群体。在一些实施例中，在制造过程开始时(例如，在细胞因子过程或本文所述的活化过程开始时)，细胞群体包括例如不少于30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、或80％的表达IL6R的细胞(例如，IL6Ra和/或I L6Kb阳性的细胞)。
体外CAR-T制造
可以在例如CAR-T细胞的体外制造中使用本文所述的慢病毒载体(例如，使用本文描述的方法)。
在一些实施例中，例如，通过本文所述的方法对转导了本文所述的病毒载体的细胞进行扩增。在一些实施例中，使细胞在培养物中扩增数小时(例如，约2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、18、21小时)至约14天(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14天)的一段时间。在一些实施例中，使细胞扩增4至9天的一段时间。在一些实施例中，使细胞扩增8天或更少(例如，7、6或5天)的一段时间。在一些实施例中，使细胞在培养物中扩增5天，并且所得细胞比在相同培养条件下在培养物中扩增9天的相同细胞更有效。效力可以例如通过各种T细胞功能来定义，例如增殖、靶细胞杀伤、细胞因子产生、活化、迁移、或其组合。在一些实施例中，与在相同培养条件下在培养物中扩增9天的相同细胞相比，扩增5天的细胞在抗原刺激后显示细胞倍增的至少一倍、两倍、三倍或四倍增加。在一些实施例中，使细胞在培养物中扩增5天，并且与在相同培养条件下在培养物中扩增9天的相同细胞相比，所得细胞表现出更高的促炎性细胞因子产生(例如，IFN-γ和/或GM-CSF水平)。在一些实施例中，与在相同培养条件下在培养物中扩增9天的相同细胞相比，扩增5天的细胞显示促炎性细胞因子产生(例如，IFN-γ和/或GM-CSF水平)的至少一倍、二倍、三倍、四倍、五倍、十倍或更多倍增加(pg/ml)。
在不存在钙的情况下的初始活化步骤可以导致放大的活化。如本领域普通技术人员将容易理解的，洗涤步骤可以通过本领域技术人员已知的方法完成，如通过根据制造商的说明使用半自动“流通”离心机(例如，Cobe 2991细胞处理器、Baxter CytoMate、或Haemonetics Cell Saver5)。在洗涤后，可以将细胞重悬于多种生物相容性缓冲液中，例如，像无Ca、无Mg的PBS、勃脈力A、或者含有或不含缓冲液的其他盐溶液。可替代地，可以除去单采样品中不希望的组分，并将细胞直接重悬于培养基中。
应当认识到，本申请的体外方法可利用包含5％或更少(例如2％)的人AB血清的培养基条件，并使用已知的培养基条件和组合物，例如描述于以下的那些：Smith等人,“Exvivo expansion of human T cells for adoptive immunotherapy using the novelXeno-free CTS Immune Cell Serum Replacement[使用新型无Xeno CTS免疫细胞血清替代物进行过继免疫治疗的人T细胞的离体扩增]”Clinical&Translational Immunology[临床和移植免疫学](2015)4,e31；doi:10.1038/cti.2014.31。
在一些方面，通过例如通过PERCOLLTM梯度离心或通过逆流离心淘洗来裂解红细胞和耗减单核细胞，从外周血淋巴细胞分离T细胞。分离的T细胞可进一步用于本文所述的方法。
本文所述的方法可以包括，例如，使用例如(例如，本文所述的)阴性选择技术选择免疫效应细胞(例如，T细胞)的特定亚群，该亚群是T调节性细胞耗减的群体，CD25+耗减的细胞。优选地，T调节性耗减的细胞群体含有少于30％、25％、20％、15％、10％、5％、4％、3％、2％、1％的CD25+细胞。
在一些实施例中，使用抗CD25抗体或其片段或CD25结合配体(IL-2)从群中去除调节性T细胞，例如，CD25+T细胞。在一些实施例中，将抗CD25抗体或其片段、或CD25结合配体与底物(例如，珠)缀合、或以其他方式包被在底物(例如，珠)上。在一些实施例中，抗CD25抗体或其片段与本文所述的底物缀合。
在一些实施例中，使用来自MiltenyiTM的CD25耗减药剂从群体除去T调节性细胞(例如，CD25+T细胞)。在一些实施例中，细胞与CD25耗减药剂的比率是1×107个细胞比20μL、或1x107个细胞比15μL、或1x107个细胞比10μL、或1x107个细胞比5μL、或1x107个细胞比2.5μL、或1x107个细胞比1.25μL。在一些实施例中，例如，对于T调节性细胞(例如，CD25+)耗减，使用大于5亿个细胞/ml。在另外的方面，使用600、700、800、或900百万个细胞/ml的细胞浓度。
在一些实施例中，有待耗减的免疫效应细胞群体包括约6x109个CD25+T细胞。在其他方面，有待耗减的免疫效应细胞群体包括约1x109至1x1010个CD25+T细胞，以及其间的任何整数值。在一些实施例中，所得群体T调节性耗减的细胞具有2x109个T调节性细胞(例如，CD25+细胞)或更少(例如，1x109个、5x108个、1x108个、5x107个、1x107个或更少的CD25+细胞)。
在一些实施例中，使用具有耗减管组(诸如像管162-01)的CliniMAC系统从群体除去T调节性细胞(例如，CD25+细胞)。在一些实施例中，将CliniMAC系统在耗减设置(诸如像DEPLETION2.1)上运行。
不希望受特定理论的束缚，在单采术之前或在制造表达CAR的细胞产物期间减少受试者中免疫细胞的阴性调节剂水平(例如，减少不需要的免疫细胞(例如，TREG细胞)的数量)可以降低受试者复发的风险。例如，耗减TREG细胞的方法是本领域已知的。减少TREG细胞的方法包括但不限于环磷酰胺、抗GITR抗体(本文所述的抗GITR抗体)、CD25耗减、及其组合。
在一些实施例中，制造方法包括在制造表达CAR的细胞之前降低(例如，耗减)TREG细胞的数量。例如，制造方法包括使样品(例如，单采样品)与抗GITR抗体和/或抗CD25抗体(或其片段、或CD25结合配体)接触，例如，以在制造表达CAR的细胞(例如，T细胞、NK细胞)产物之前耗减TREG细胞。
在一些实施例中，在收集用于表达CAR的细胞产物制造的细胞之前，用一种或多种减少TREG细胞的疗法预先治疗受试者，从而降低受试者对表达CAR的细胞治疗复发的风险。在一些实施例中，减少TREG细胞的方法包括但不限于向受试者施用环磷酰胺、抗GITR抗体、CD25耗减、或其组合中的一种或多种。施用环磷酰胺、抗GITR抗体、CD25耗减、或其组合中的一种或多种可以在输注表达CAR的细胞产物之前、期间、或之后发生。
在一些实施例中，在收集用于表达CAR的细胞产物制造的细胞之前，用环磷酰胺预先治疗受试者，从而降低受试者对表达CAR的细胞治疗复发的风险。在一些实施例中，在收集用于表达CAR的细胞产物制造的细胞之前，用抗GITR抗体预先治疗受试者，从而降低受试者对表达CAR的细胞治疗复发的风险。
在一些实施例中，有待除去的细胞群体既不是调节性T细胞、或肿瘤细胞，也不是以其他方式对CART细胞的扩增和/或功能产生负面影响的细胞(例如表达CD14、CD11b、CD33、CD15、或由潜在免疫抑制细胞表达的其他标志的细胞)。在一些实施例中，设想将此类细胞与调节性T细胞和/或肿瘤细胞并行去除，或在所述耗减之后，或以另一种顺序去除。
本文所述的方法可以包括多于一个的选择步骤，例如，多于一个的耗减步骤。可以例如用针对阴性选择的细胞特有的表面标志物的抗体组合来完成通过阴性选择富集T细胞群体。一种方法是通过负磁性免疫吸附或流式细胞术进行细胞分选和/或选择，负磁性免疫吸附或流式细胞术使用针对存在于阴性选择的细胞上的细胞表面标志物的单克隆抗体的混合物。例如，为了通过阴性选择富集CD4+细胞，单克隆抗体混合物可以包括针对CD14、CD20、CD11b、CD16、HLA-DR、和CD8的抗体。
本文所述的方法可进一步包括从表达肿瘤抗原(例如，不包含CD25的肿瘤抗原，例如，CD19、CD30、CD38、CD123、CD20、CD14或CD11b)的群体除去细胞，从而提供T调节性耗减的(例如，CD25+耗减的)和肿瘤抗原耗减的细胞群体，该细胞群体适于表达CAR(例如，本文所述的CAR)。在一些实施例中，将表达肿瘤抗原的细胞与T调节性，例如，CD25+细胞同时除去。例如，抗CD25抗体或其片段、和抗肿瘤抗原抗体或其片段可以附接至可以用于除去细胞、或抗CD25抗体或其片段、或抗肿瘤抗原抗体或其片段的同一底物(例如，珠)，可以附接至分开的珠(其混合物可以用于除去细胞)。在其他实施例中，T调节性细胞(例如，CD25+细胞)的除去和表达肿瘤抗原的细胞的除去是连续的，并且可以，例如，以任何顺序发生。
还提供了包括以下的方法：从表达检查点抑制剂(例如，本文所述的检查点抑制剂)的群体除去细胞(例如，PD1+细胞、LAG3+细胞、和TIM3+细胞中的一种或多种)，从而提供T调节性耗减的(例如，CD25+耗减的)细胞和检查点抑制剂耗减的细胞(例如PD1+、LAG3+和/或TIM3+耗减的细胞)的群体。示例性检查点抑制剂包括B7-H1、B7-1、CD160、P1H、2B4、PD1、TIM3、CEACAM(例如CEACAM-1、CEACAM-3和/或CEACAM-5)、LAG3、TIGIT、CTLA-4、BTLA和LAIR1。在一些实施例中，将表达检查点抑制剂的细胞与T调节性，例如，CD25+细胞同时除去。例如，抗CD25抗体或其片段、和抗检查点抑制剂抗体或其片段可以附接至可以用于除去细胞、或抗CD25抗体或其片段、和抗检查点抑制剂抗体或其片段的同一珠，可以附接至分开的珠(其混合物可以用于除去细胞)。在其他实施例中，T调节性细胞(例如，CD25+细胞)的除去和表达检查点抑制剂的细胞的除去是连续的，并且可以，例如，以任何顺序发生。
本文所述的方法可以包括阳性选择步骤。例如，可以通过与抗CD3/抗CD28(例如，3x28)缀合的珠(如M-450 CD3/CD28T)孵育足以阳性选择所希望的T细胞的时间段来分离T细胞。在一些实施例中，时间段是约30分钟。在另外的实施例中，时间段的范围为从30分钟至36小时或更长以及其间的所有整数值。在另外的实施例中，时间段是至少1、2、3、4、5、或6小时。在又另一个实施例中，时间段是10至24小时，例如24小时。与其他细胞类型相比，在存在较少T细胞的任何情况下，如从肿瘤组织或免疫受损个体分离肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)，可以使用更长的孵育时间来分离T细胞。此外，使用更长的孵育时间可以增加CD8+T细胞捕获的效率。因此，通过简单地缩短或延长使T细胞与CD3/CD28珠结合的时间和/或通过增加或减少珠与T细胞的比率(如本文进一步描述的)，可以在培养起始时或在过程期间的其他时间点优先地选择或针对T细胞亚群。此外，通过增加或减少抗CD3和/或抗CD28抗体在珠或其他表面上的比率，可以在培养起始时或在其他希望的时间点优先地选择或针对T细胞亚群。在一些实施例中，可以选择表达以下中的一种或多种的T细胞群体：IFN-γ、TNFα、IL-17A、IL-2、IL-3、IL-4、GM-CSF、IL-10、IL-13、颗粒酶B、和穿孔素、或其他适当的分子(例如，其他细胞因子)。筛选细胞表达的方法可以通过例如PCT公开号：WO 2013/126712。
为了通过阳性或阴性选择分离希望的细胞群体，可以改变细胞和表面(例如，颗粒(如珠))的浓度。在一些方面，可能希望显著减小其中珠和细胞混合在一起的体积(例如，增加细胞的浓度)，以确保细胞和珠的最大接触。例如，在一些方面，使用100亿个细胞/ml、90亿/ml、80亿/ml、70亿/ml、60亿/ml或50亿/ml的浓度。在一些方面，使用10亿个细胞/ml的浓度。在又一些方面，使用0.75、0.8、0.85、0.9、0.95、或1亿个细胞/ml的细胞浓度。在另外的方面，可以使用125或150百万个细胞/ml的浓度。
使用高浓度可以导致细胞产量增加、细胞活化和细胞扩增。此外，使用高细胞浓度允许更有效地捕获可能弱表达目的靶抗原的细胞(如CD28阴性T细胞)，或来自存在许多肿瘤细胞的样品(例如，白血病的血、肿瘤组织等)的细胞。此类细胞群体可能具有治疗价值，并且是希望获得的。例如，使用高浓度的细胞允许更有效地选择通常具有较弱CD28表达的CD8+T细胞。
在一些实施例中，可能希望使用较低的细胞浓度。通过显著稀释T细胞和表面(例如，颗粒如珠)的混合物，使颗粒与细胞之间的相互作用最小化。这选择了表达大量有待结合颗粒的所希望抗原的细胞。例如，CD4+T细胞表达较高水平的CD28，并且在稀释浓度下比CD8+T细胞更有效地捕获。在一些方面，所使用的细胞浓度是5x106/ml。在其他方面，所使用的浓度可以是从约1x105/ml至1x106/ml，以及其间的任何整数值。
在其他方面，可以将这些细胞在旋转器上以不同的速度在2℃-10℃或室温下孵育不同的时间长度。
用于刺激的T细胞也可以在洗涤步骤后冷冻。不希望受理论束缚，冷冻和后续解冻步骤通过除去细胞群体中的粒细胞和一定程度的单核细胞来提供更均匀的产物。在除去血浆和血小板的洗涤步骤之后，可以将细胞悬浮在冷冻溶液中。虽然许多冷冻溶液和参数是本领域已知的并且在这种情况下将是有用的，但一种方法涉及使用含有20％ DMSO和8％人血清白蛋白的PBS，或含有10％葡聚糖40和5％葡萄糖、20％人血清白蛋白和7.5％ DMSO的培养基，或含有31.25％勃脈力-A、31.25％葡萄糖5％、0.45％ NaCl、10％葡聚糖40和5％葡萄糖、20％人血清白蛋白和7.5％ DMSO的培养基，或含有例如Hespan和勃脈力-A的其他适合的细胞冷冻培养基，然后将细胞以每分钟1°的速率冷冻至-80℃并储存在液氮储罐的气相中。可以使用其他控制冷冻的方法以及在-20℃或液氮中立即不受控制的冷冻。
在一些方面，如本文所述将冷冻保存的细胞解冻和洗涤，并允许在使用本发明的方法活化之前在室温静置一小时。
在本发明的上下文中还考虑了在可能需要如本文描述的扩增细胞之前的时间段从受试者收集血液样品或单采术产物。因此，可以在任何必要的时间点收集有待扩增的细胞来源，并且可以分离和冷冻所希望的细胞(如T细胞)以便以后在免疫效应细胞疗法中用于任何数量将受益于免疫效应细胞疗法(如本文描述的那些)的疾病或病症。在一些方面，血液样品或单采术取自基本健康的受试者。在一些方面，血液样品或单采术取自基本健康的受试者，受试者处于发展疾病的风险中，但尚未患发展疾病，并且将目的细胞分离并冷冻供以后使用。在一些方面，T细胞可以扩增、冷冻，并在以后使用。在一些方面，在诊断如本文所述的特定疾病之后但在任何治疗之前不久从患者收集样品。在另外的方面，在任何数量的相关治疗模式之前，从受试者的血液样品或单采术分离细胞，这些相关治疗模式包括但不限于用以下进行治疗：药剂(如那他珠单抗(natalizumab)、依法珠单抗、抗病毒剂)、化疗、放射、免疫遏制剂(如环孢菌素、硫唑嘌呤、甲氨蝶呤、霉酚酸酯、和FK506)、抗体或其他免疫清除剂(如CAMPATH、抗CD3抗体、环磷酰胺、氟达拉滨(fludarabine)、环孢菌素、FK506、雷帕霉素、霉酚酸、类固醇、FR901228)和照射。
在本发明的另一个方面，在治疗后直接从患者获得T细胞使得受试者具有功能性T细胞。在这点上，已观察到在某些癌症治疗(特别是使用破坏免疫系统的药物的治疗)之后，在患者通常将从治疗恢复期间治疗后不久，所获得的T细胞的质量因其离体扩增的能力可能是最佳或改进的。同样地，在使用本文描述的方法进行离体操作之后，这些细胞可以处于优选的状态以增强植入和体内扩增。因此，在本发明的上下文中，预期在恢复期期间收集血细胞，包括T细胞、树突细胞或造血谱系的其他细胞。此外，在一些方面，动员(例如，用GM-CSF动员)和调整方案可以用于在受试者中产生病症，其中特定细胞类型的再增殖、再循环、再生、和/或扩增是有利的，尤其是在疗法后确定的时间窗口。说明性细胞类型包括免疫系统的T细胞、B细胞、树突细胞和其他细胞。
在一些实施例中，T细胞群体是甘油二酯激酶(DGK)缺陷型。DGK缺陷型细胞包括不表达DGK RNA、或蛋白质、或具有降低或抑制的DGK活性的细胞。DGK缺陷型细胞可以通过遗传方法产生，例如，施用RNA干扰剂(例如，siRNA、shRNA、miRNA)以降低或预防DGK表达。可替代地，可以通过用本文所述的DGK抑制剂处理产生DGK缺陷型细胞。
在一些实施例中，T细胞群体是Ikaros缺陷型。Ikaros缺陷型细胞包括不表达Ikaros RNA、或蛋白质、或具有降低或抑制的Ikaros活性的细胞，Ikaros缺陷型细胞可以通过遗传方法产生，例如施用RNA干扰剂(例如，siRNA、shRNA、miRNA)以降低或预防Ikaros表达。可替代地，可以通过用Ikaros抑制剂(例如，来那度胺(lenalidomide))处理产生Ikaros缺陷型细胞。
在实施例中，T细胞群体是DGK缺陷型且Ikaros缺陷型的，例如，不表达DGK和Ikaros，或者具有降低或抑制的DGK和Ikaros活性。可以通过本文所述的任何方法产生此类DGK和Ikaros缺陷型细胞。在一些实施例中，从受试者获得NK细胞。在另一个实施例中，NK细胞是NK细胞系，例如，NK-92细胞系(Conkwest公司)。在特定的示例性方面，受试者可以经历白细胞单采术，其中离体收集、富集、或耗减白细胞以选择和/或分离目的细胞(例如，T细胞)。
这些T细胞分离物可以通过本文描述的方法扩增。有需要的受试者可以随后经历使用高剂量化疗的标准治疗，随后进行外周血干细胞移植。在某些方面，在移植之后或与之同时，受试者接受通过本发明的方法制备的扩增的CAR T细胞的输注。在另外的方面，在手术之前或之后施用扩增的细胞。
另外的表达的药剂
增强CAR活性的药剂的共表达
在本文考虑的实施例中，应理解，另外的药剂可以被编码在上文描述的载体中。因此，以下关于表达CAR的细胞描述这些药剂。
在另一个实施例中，本文描述的表达CAR的免疫效应细胞可以进一步表达另一种药剂，例如，增强表达CAR的细胞的活性的药剂。例如，在一些实施例中，药剂可以是对抑制性分子进行抑制的药剂。抑制性分子的实例包括例如，如本文描述的PD-1、PD-L1、CTLA-4、TIM-3、CEACAM(例如，CEACAM-1、CEACAM-3和/或CEACAM-5)、LAG-3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4和TGFRβ。在一些实施例中，对抑制性分子进行抑制的药剂包含第一多肽(例如，抑制性分子)，第一多肽与向细胞提供阳性信号的第二多肽(例如，本文描述的细胞内信号传导结构域)相关联。在一些实施例中，药剂包含例如抑制性分子(如PD-1、PD-L1、CTLA-4、TIM-3、CEACAM(例如，CEACAM-1、CEACAM-3和/或CEACAM-5)、LAG-3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4或TGFRβ、或这些中的任一者的片段)的第一多肽，和第二多肽，该第二多肽是本文描述的细胞内信号传导结构域(例如，包含共刺激结构域(例如，41BB、CD27或CD28，例如如本文描述)和/或初级信号传导结构域(例如，本文描述的CD3ζ信号传导结构域)。在一些实施例中，药剂包含PD-1的第一多肽或其片段，和本文描述的细胞内信号传导结构域(例如，本文描述的CD28、CD27、OX40或4-IBB信号传导结构域和/或本文描述的CD3ζ信号传导结构域)的第二多肽。
第二CAR的共表达
在一些实施例中，本文所述的表达CAR的细胞可进一步包含第二CAR，例如，包含不同的抗原结合结构域(例如，针对相同的靶标(例如，CD19)或不同的靶标(例如，除CD19以外的靶标，例如，本文所述的靶标))的第二CAR。
在一些实施例中，本文所述的表达CAR的细胞，例如，使用本文所述的方法制造的表达CAR的细胞，包含(i)编码结合BCMA的第一CAR的第一核酸分子和(ii)编码结合CD19的第二个CAR的第二核酸分子。在一些实施例中，第一CAR包含抗BCMA结合结构域、第一跨膜结构域和第一细胞内信号传导结构域，其中抗BCMA结合结构域包含重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)，重链可变区包含重链互补决定区1(HC CDR1)、重链互补决定区2(HC CDR2)和重链互补决定区3(HC CDR3)，并且轻链可变区包含轻链互补决定区1(LC CDR1)、轻链互补决定区2(LC CDR2)和轻链互补决定区3(LC CDR3)，其中HC CDR1、HC CDR2、HC CDR3、LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3分别包含SEQ ID NO:86、87、88、95、96和97的氨基酸序列。在一些实施例中，第二CAR包含抗CD19结合结构域、第二跨膜结构域和第二细胞内信号传导结构域，其中抗CD19结合结构域包含VH和VL，VH包含HC CDR1、HC CDR2和HC CDR3，并且VL包含LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3，其中HC CDR1、HC CDR2、HC CDR3、LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3分别包含SEQ ID NO:760、687、762、763、764和765的氨基酸序列。在一些实施例中，(i)抗BCMA结合结构域的VH和VL分别包含SEQ ID NO:93和102的氨基酸序列。在一些实施例中，抗CD19结合结构域的VH和VL分别包含SEQ ID NO:250A和251A的氨基酸序列。在一些实施例中，抗BCMA结合结构域包含SEQ ID NO:105的氨基酸序列。在一些实施例中，抗CD19结合结构域包含SEQID NO:758的氨基酸序列。在一些实施例中，第一CAR包含SEQ ID NO:107的氨基酸序列。在一些实施例中，第二CAR包含SEQ ID NO:225的氨基酸序列。
在一些实施例中，本文所述的表达CAR的细胞，例如，使用本文所述的方法制造的表达CAR的细胞，包含(i)编码结合CD22的第一CAR的第一核酸分子和(ii)编码结合CD19的第二个CAR的第二核酸分子。在一些实施例中，CD22 CAR包含CD22抗原结合结构域和第一跨膜结构域；第一共刺激信号传导结构域；和/或第一初级信号传导结构域。在一些实施例中，CD19 CAR包含CD19抗原结合结构域和第二跨膜结构域；第二共刺激信号传导结构域；和/或第二初级信号传导结构域。
在一些实施例中，CD22抗原结合结构域包含本文所述的CD22结合结构域的一个或多个(例如，全部三个)轻链互补决定区1(LC CDR1)、轻链互补决定区2(LC CDR2)和轻链互补决定区3(LC CDR3)，例如，在表15、16、30、31、或32中；和/或本文(例如，在表15、16、30、31或32中)所述的CD22结合结构域的一个或多个(例如，全部三个)重链互补决定区1(HCCDR1)、重链互补决定区2(HC CDR2)和重链互补决定区3(HC CDR3)。在一个实施例中，CD22抗原结合结构域包含本文所述的CD22结合结构域的LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3，例如，在表15、16、30、31或32中；和/或本文(例如，在表15、16、30、31或32中)所述的CD22结合结构域的HC CDR1、HC CDR2和HC CDR3。在一些实施例中，CD19抗原结合结构域包含：本文所述的CD19结合结构域的一个或多个(例如，全部三个)LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3，例如，表1、30、31或32中的；和/或本文所述的CD19结合结构域的一个或多个(例如，全部三个)HCCDR1、HC CDR2和HC CDR3，例如，表1、30、31或32中的。在一些实施例中，CD19抗原结合结构域包含本文所述的CD19结合结构域的LC CDR1、LC CDR2和LC CDR3，例如，在表1、30、31和32中；和/或本文(例如在表1、30、31、和32中)所述的CD19结合结构域的HC CDR1、HC CDR2和HCCDR3。
在一些实施例中，CD22抗原结合结构域(例如，scFv)包含本文所述的CD22结合结构域的轻链可变(VL)区，例如，在表30或32中；和/或本文(例如，在表30或32中)所述的CD22结合结构域的重链可变(VH)区。在一些实施例中，CD22抗原结合结构域包含VL区，VL区包含具有表30或32中提供的CD22 VL区序列的至少一个、两个或三个修饰(例如，取代)但不超过30、20或10个修饰(例如，取代)的氨基酸序列。在一些实施例中，CD22抗原结合结构域包含含有表30或32中提供的氨基酸序列、或与前述序列中任一者具有至少约80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、或99％序列同一性的序列的VL区。在一些实施例中，CD22抗原结合结构域包含VH区，VH区包含具有表30或32中提供的CD22 VH区序列的至少一个、两个或三个修饰(例如，取代)但不超过30、20或10个修饰(例如，取代)的氨基酸序列。在一些实施例中，CD22抗原结合结构域包含含有表30或32中提供的CD22VH区序列的氨基酸序列、或与前述序列中任一者具有至少约80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、或99％序列同一性的序列的VH区。在一些实施例中，CD19抗原结合结构域(例如，scFv)包含本文所述的CD19结合结构域的VL区，例如，在表1、30、或32中；和/或本文(例如，在表1、30、或32中)所述的CD19结合结构域的VH区。在一些实施例中，CD19抗原结合结构域包含VL区，VL区包含具有表1、30、或32中提供的CD19 VL区序列的至少一个、两个或三个修饰(例如，取代)但不超过30、20或10个修饰(例如，取代)的氨基酸序列。在一些实施例中，CD19抗原结合结构域包含含有表1、30、或32中提供的CD19 VL区序列的氨基酸序列、或与前述序列中任一者具有至少约80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、或99％序列同一性的序列的VL区。在一些实施例中，CD19抗原结合结构域包含VH区，VH区包含具有表1、30、或32中提供的CD19 VH区序列的至少一个、两个或三个修饰(例如，取代)但不超过30、20或10个修饰(例如，取代)的氨基酸序列。在一些实施例中，CD19抗原结合结构域包含含有表1、30、或32中提供的CD19 VH区序列的氨基酸序列、或与前述序列中任一者具有至少约80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、或99％序列同一性的序列的VH区。
在一些实施例中，CD22抗原结合包含scFv，scFv包含具有表30或32中提供的CD22scFv序列的至少一个、两个或三个修饰(例如，取代)但不超过30、20或10个修饰(例如，取代)的氨基酸序列。在一些实施例中，CD22抗原结合包含含有表30或32中提供的CD22 scFv序列的氨基酸序列、或与前述序列中任一者具有至少约80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、或99％序列同一性的序列的scFv。在一些实施例中，CD19抗原结合结构域包含scFv，scFv包含具有表1、30、或32中提供的CD19 scFv序列的至少一个、两个或三个修饰(例如，取代)但不超过30、20或10个修饰(例如，取代)的氨基酸序列。在一些实施例中，CD19抗原结合结构域包含含有表1、30、或32中提供的CD19scFv区序列的氨基酸序列、或与前述序列中任一者具有至少约80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％、或99％序列同一性的序列的scFv。
在一些实施例中，CD22 CAR分子和/或CD19 CAR分子包含另外的组分，例如，包含表33中提供的氨基酸序列、或与前述序列中任一者具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％或99％序列同一性的序列的信号肽、铰链、跨膜结构域、共刺激信号传导结构域和/或第一初级信号传导结构域、P2A位点和/或接头；或由表33中提供的核苷酸序列，或与前述序列中任一者具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、92％、95％、97％、98％或99％序列同一性的序列编码的前述组分。
表30中提供了CAR分子的示例性核苷酸和氨基酸序列，所述CAR分子例如包含(i)结合CD22的第一CAR，和(ii)结合CD19的第二CAR的本文所述的双重CAR分子。
表30：双重和串联CD19-CD22 CAR序列
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表31中提供了本披露的双重CAR的CD22和CD19 CDR(例如，包含(i)结合CD22的第一CAR，和(ii)结合CD19的第二CAR的双重CAR分子)。
表31：CD22和CD19 CDR序列
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表32提供了本文披露的双重CAR或串联CAR的CD19和CD22结合结构域的核苷酸和氨基酸序列，例如，双重CAR或串联CAR，其包含(i)结合CD22的第一CAR和(ii)结合CD19的第二CAR。
表32：CD19和CD22结合结构域
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表33提供了另外的CAR组分(例如，信号肽、接头和P2A位点)的核苷酸和氨基酸序列，其可用于CAR分子，例如，本文所述的双重CAR分子(例如，包含(i)结合CD22的第一CAR，和(ii)结合CD19的第二CAR的双重CAR分子)。
表33：另外的CAR组分
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在一些实施例中，本文描述的表达CAR的免疫效应细胞可进一步包含第二CAR，例如，包含例如针对相同靶标(例如，上述靶标)或不同靶标的不同抗原结合结构域的第二CAR。在一些实施例中，第二CAR包含针对在与第一CAR的靶标相同的癌细胞类型上表达的靶标的抗原结合结构域。在一些实施例中，表达CAR的免疫效应细胞包含靶向第一抗原并且包含具有共刺激信号传导结构域但不具有初级信号传导结构域的细胞内信号传导结构域的第一CAR，以及靶向第二不同的抗原并且包含具有初级信号传导结构域但不具有共刺激信号传导结构域的细胞内信号传导结构域的第二CAR。虽然不希望受理论束缚，但是将共刺激信号传导结构域(例如，4-1BB、CD28、CD27或OX-40)置于第一CAR上，并且将初级信号传导结构域(例如，CD3ζ)置于第二CAR上可以将CAR活性限制于表达两种靶标的细胞。在一些实施例中，表达CAR的免疫效应细胞包含第一CAR，第一CAR包含靶向例如上述靶标的抗原结合结构域、跨膜结构域和共刺激结构域；和第二CAR，第二CAR靶向除由第一CAR靶向的抗原以外的抗原(例如，在与第一靶标相同的癌细胞类型上表达的抗原)并且包含抗原结合结构域、跨膜结构域和初级信号传导结构域。在另一个实施例中，表达CAR的免疫效应细胞包含第一CAR，第一CAR包含靶向例如上述靶标的抗原结合结构域、跨膜结构域和初级信号传导结构域；和第二CAR，第二CAR靶向除由第一CAR靶向的抗原以外的抗原(例如，在与第一靶标相同的癌细胞类型上表达的抗原)并且包含针对抗原的抗原结合结构域、跨膜结构域和共刺激信号传导结构域。
在一些实施例中，表达CAR的免疫效应细胞包含本文描述的CAR(例如，针对上述靶标的CAR)和抑制性CAR。在一些实施例中，抑制性CAR包含结合在正常细胞而非癌细胞(例如也表达靶标的正常细胞)上发现的抗原的抗原结合结构域。在一些实施例中，抑制性CAR包含抑制性分子的抗原结合结构域、跨膜结构域和细胞内结构域。例如，抑制性CAR的细胞内结构域可以是PD1、PD-L1、CTLA-4、TIM-3、CEACAM(例如，CEACAM-1、CEACAM-3和/或CEACAM-5)、LAG-3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4或TGFRβ的细胞内结构域。
在一些实施例中，免疫效应细胞(例如，T细胞、NK细胞)包含第一CAR，第一CAR包含结合至如本文描述的肿瘤抗原的抗原结合结构域；和第二CAR，第二CAR包含PD1细胞外结构域或其片段。
在一些实施例中，细胞进一步包含如上的抑制性分子。
在一些实施例中，细胞中的第二CAR是抑制性CAR，其中抑制性CAR包含抑制性分子的抗原结合结构域、跨膜结构域和细胞内结构域。抑制性分子可以选自以下中的一个或多个：PD1、PD-L1、CTLA-4、TIM-3、LAG-3、VISTA、BTLA、TIGIT、LAIR1、CD160、2B4、TGFRβ、CEACAM-1、CEACAM-3、和CEACAM-5。在一些实施例中，第二CAR分子包含PD1的细胞外结构域或其片段。
在实施例中，细胞中的第二CAR分子进一步包含细胞内信号传导结构域，细胞内信号传导结构域包含初级信号传导结构域和/或细胞内信号传导结构域。
在其他实施例中，细胞中的细胞内信号传导结构域包含含有CD3ζ的功能性结构域的初级信号传导结构域和含有4-1BB的功能性结构域的共刺激信号传导结构域。
在一些实施例中，第一CAR分子的抗原结合结构域包含scFv，并且第二CAR分子的抗原结合结构域不包含scFv。例如，第一CAR分子的抗原结合结构域包含scFv，并且第二CAR分子的抗原结合结构域包含骆驼科VHH结构域。
CAR的构象
在本文考虑的实施例中，应理解，一个或多个CAR的构象可以被本文以上描述的载体调节。因此，以下关于表达CAR的细胞描述这些构象。
分离的CAR
在一些实施例中，表达CAR的细胞使用分离的CAR。分离的CAR方法更详细地描述于公开WO 2014/055442和WO 2014/055657中。简言之，分离的CAR系统包含表达具有第一抗原结合结构域和共刺激结构域(例如41BB)的第一CAR的细胞，并且细胞还表达具有第二抗原结合结构域和细胞内信号传导结构域(例如CD3ζ)的第二CAR。当细胞遇到第一抗原时，共刺激结构域被活化，并且细胞增殖。当细胞遇到第二抗原时，细胞内信号传导结构域被活化并且开始细胞杀伤活性。因此，表达CAR的细胞仅在两种抗原都存在下完全活化。
多重CAR
在一些方面，本文描述的表达CAR的细胞可进一步包含第二CAR，例如，包含例如针对相同靶标或不同靶标(例如，除本文描述的癌症相关抗原或本文描述的不同癌症相关抗原的靶标)的不同抗原结合结构域的第二CAR。在一些实施例中，第二CAR包含针对在与癌症相关抗原相同的癌细胞类型上表达的靶标的抗原结合结构域。在一些实施例中，表达CAR的细胞包含靶向第一抗原并且包含具有共刺激信号传导结构域但不具有初级信号传导结构域的细胞内信号传导结构域的第一CAR，以及靶向第二不同的抗原并且包含具有初级信号传导结构域但不具有共刺激信号传导结构域的细胞内信号传导结构域的第二CAR。虽然不希望受理论束缚，但是将共刺激信号传导结构域(例如，4-1BB、CD28、CD27或OX-40)置于第一CAR上，并将初级信号传导结构域(例如CD3ζ)置于第二CAR上可以将CAR活性限制于表达两种靶标的细胞。在一些实施例中，表达CAR的细胞包含第一癌症相关抗原CAR，第一癌症相关抗原CAR包含结合本文描述的靶抗原的抗原结合结构域、跨膜结构域和共刺激结构域；和第二CAR，第二CAR靶向不同靶抗原(例如，在与第一靶抗原相同的癌细胞类型上表达的抗原)并且包含抗原结合结构域、跨膜结构域和初级信号传导结构域。在另一个实施例中，表达CAR的细胞包含第一CAR，第一CAR包含结合本文描述的靶抗原的抗原结合结构域、跨膜结构域和初级信号传导结构域；和第二CAR，第二CAR靶向除第一靶抗原以外的抗原(例如，在与第一靶抗原相同的癌细胞类型上表达的抗原)并且包含针对抗原的抗原结合结构域、跨膜结构域和共刺激信号传导结构域。
在一些实施例中，本披露提供了第一和第二CAR，其中所述第一CAR、所述第二CAR之一的抗原结合结构域不包含可变轻结构域和可变重结构域。在一些实施例中，所述第一CAR、所述第二CAR中的一者的抗原结合结构域是scFv，而另一者不是scFv。在一些实施例中，所述第一CAR、所述第二CAR中的一者的抗原结合结构域包含单个VH结构域，例如，骆驼科、鲨鱼、或七鳃鳗单个VH结构域，或源自人或小鼠序列的单个VH结构域。在一些实施例中，所述第一CAR、所述第二CAR中的一者的抗原结合结构域包含纳米抗体。在一些实施例中，所述第一CAR、所述第二CAR中的一者的抗原结合结构域包含骆驼科VHH结构域。
一旦执行了本文所述的方法，各种测定可用于评估适当的体外和动物模型中的以下活性，例如，抗原刺激后扩增T细胞的能力，在没有重新刺激的情况下维持T细胞扩增的能力以及抗癌活性。评估本发明的CAR的作用的测定是本领域技术人员已知的，并在下文中进行总体描述。
原代T细胞中CAR表达的蛋白质印迹分析可用于检测单体和二聚体的存在。参见例如，Milone等人,Molecular Therapy[分子疗法]17(8):1453-1464(2009)。非常简单地，表达CAR的T细胞(CD4+和CD8+T细胞的1:1混合物)在体外扩增超过10天，随后在还原条件下进行裂解和SDS-PAGE。使用针对TCR-ζ链的抗体通过蛋白质印迹来检测含有全长TCR-ζ胞质结构域和内源性TCR-ζ链的CAR。相同的T细胞亚群用于在非还原条件下的SDS-PAGE分析，以允许评估共价二聚体的形成。
可以通过流式细胞术测量抗原刺激后CAR+T细胞的体外扩增。
还可以测量在没有再刺激的情况下持续的CAR+T细胞扩增。参见例如，Milone等人,Molecular Therapy[分子疗法]17(8):1453-1464(2009)。简而言之，在第0天用αCD3/αCD28包被的磁珠刺激，以及在第1天用指示的CAR转导后，使用Coulter Multisizer III粒子计数器、Nexcelom Cellometer Vision或Millipore Scepter在培养的第8天测量平均T细胞体积(fl)。
动物模型也可用于测量CART活性。例如，可以使用异种移植模型，所述异种移植模型使用人本文描述的癌症相关抗原特异性CAR+T细胞来治疗免疫缺陷小鼠中的初级人前-BALL。参见例如，Milone等人,Molecular Therapy[分子疗法]17(8):1453-1464(2009)。
可以评估剂量依赖性CAR治疗应答。参见例如，Milone等人,Molecular Therapy[分子疗法]17(8):1453-1464(2009)。例如，在第21天用CAR T细胞、相同数量的模拟转导的T细胞或无T细胞注射的小鼠中建立白血病之后35-70天获得外周血。将来自每组的小鼠随机放血以确定外周血如本文描述的癌症相关抗原+ALL胚细胞计数，并且然后在第35天和第49天处死。在第57天和第70天评价剩余的动物。
先前已经描述了细胞增殖和细胞因子产生的评估，例如在Milone等人,MolecularTherapy[分子疗法]17(8):1453-1464(2009)中。可通过标准51Cr释放测定来评估细胞毒性。参见例如，Milone等人,Molecular Therapy[分子疗法]17(8):1453-1464(2009)。
成像技术可用于评估荷肿瘤的动物模型中CAR的特定运输和增殖。例如，Barrett等人,Human Gene Therapy[人基因疗法]22:1575-1586(2011)中已经描述了此类测定。
其他测定，包括本文实例部分中描述的那些测定以及本领域中已知的那些测定也可以用于评价本文描述的CAR。
提供了以下实例，以进一步说明本披露的一些实施例，但并非旨在限制本披露的范围；通过它们的示例性性质将理解，可以可替代地使用本领域技术人员已知的其他程序、方法或技术。
实例
提出以下实例是以向本领域普通技术人员提供如何使用、制备和评估本文所述的组合物和方法的描述，并且旨在纯粹作为本披露的示例而不是旨在限制本披露的范围。
实例1：Expi293F细胞作为支持性LV生产系统
目前大多数LV载体生产方法涉及HEK293T细胞，其包含SV40 T抗原。在该领域中，生产细胞中存在SV40 T抗原通常被认为有利于载体生产。此外，与缺乏SV40 T抗原的HEK293细胞相比，HEK293T细胞显示出增加的细胞生长和转染效率。该实验评估了缺乏SV40T抗原的细胞系Expi293F细胞作为支持性LV产生系统，以最小化安全性问题。如本实例所示，缺乏大T抗原的细胞显示出令人满意的慢病毒载体产量和纯度。本文测试的细胞也是有益的，因为它们降低了可能导致复制能力慢病毒(RCL)的重组事件的可能性，从而降低了病毒复制和在不希望的基因座处插入宿主DNA的风险。获得商业Expi293FTM细胞(ThermoFisher-目录#A14527-批次#1994635)。将Expi293F细胞系的慢病毒生产率与慢病毒载体在HEK293T细胞系中的生产率进行比较。将Expi293FTM细胞和HEK293T悬浮细胞以0.15E6个细胞/mL的浓度接种在SF 250mL烧瓶中的FreeStyleTM培养基中，并且在150rpm下培养3天。经过三天的细胞生长和扩增，用编码人源化CD19 CAR(C1)的模型GOI质粒转染细胞。将0.4μg DNA/E6细胞与(0.4μL/1E6细胞)混合，并允许形成转染复合物。将转染复合物直接添加到细胞培养物中。转染后24小时，将丁酸钠和具有MgCl2(2mM终浓度)的25U/mL苯佐那酶添加到培养基中。感染后48小时收获细胞用于分析目的。使用TU测定和ELISA测定和比较每种细胞系的慢病毒生产率。
分析方法：通过TU测定和p24 ELISA两种不同的方法分析样品，以提供功能效价(测量能够整合到细胞中的病毒粒子总数)，并且通过PP/IP比率(物理颗粒/感染性颗粒)评估生产质量，该比率是与降低细胞毒性和增加细胞转导效率有关的重要参数。该比率表示与总病毒颗粒相比具有感染性的病毒颗粒的百分比(物理滴度)。
功能滴度：TU测定：转导单位测定基于HEK293-T细胞的转导，随后提取基因组DNA，并通过在双链qPCR中扩增载体特异性序列(慢病毒WPRE元件)和管家基因(已知每个人类细胞存在两个拷贝的白蛋白序列)来量化病毒拷贝。在标准化和与接种的细胞数量相关联后，计算转导单位的浓度，即能够将其基因组递送到靶细胞中随后整合到宿主细胞基因组中的感染性病毒颗粒。
p24酶联免疫吸附测定(Elisa)：该方法通过检测所有物理颗粒(无论是否有功能(即未成熟形式、空颗粒))以及上清液中的游离p24蛋白提供了有效LVV浓度的近似值。通过测量慢病毒衣壳蛋白p24的p24Elisa对物理滴度(慢病毒颗粒(LP)/mL)进行量化。使用HIV-1p24 ELISA试剂盒直接在慢病毒上清液中检测p24核心抗原。此Elisa测量了与慢病毒颗粒(LP/mL)的量成正比的p24浓度(pg/mL)。
该实验显示HEK293T/17细胞的LV生产率为约3.9E7 TU/mL。Expi293F细胞产生令人满意的LV生产率(约1.5E7 TU/mL)(图1A)。观察到更高的PP/IP比率(约1882)，这可能突出Expi293F细胞的组装效率降低。在每次传代时观察到的细胞密度在两种细胞系之间是可比的(约3x106个细胞/mL)(图1B)。发现两种细胞系的群体倍增时间略有不同：HEK293T/17细胞大约19h，并且Expi293F 21h(图1B)。两种细胞系在培养中均显示>90％的活力(图1C)。启动了进一步的开发以优化Expi293F性能。
实例2：评估各种转染试剂在增加慢病毒生产率方面的作用
将Expi293FTM细胞接种在一个SF 250mL烧瓶中，以达到高于0.15E6个细胞/mL的最终密度。将细胞以0.15E6个细胞/mL的浓度接种在SF 250mL烧瓶中的FreeStyleTM培养基中，并且在150rpm下培养3天。经过三天的细胞生长和扩增后，将细胞用3种不同的模型CAR构建体(包含人源化CD19 CAR(C1)、CD19-CD22 CAR双重Car(I1)或包含人源化CAR和Tet2 shRNA(M1))转染。或/>-AAV用作转染试剂。将每个构建体的0.4μg DNA/E6细胞与/>(0.4μL/1E6细胞)或/>-AAV(0.4μL/1E6细胞)混合，并允许形成转染复合物。将转染复合物直接添加到细胞培养物中。转染后24小时，将具有MgCl2(2mM终浓度)的25U/mL苯佐那酶添加到每种培养基中。感染后48小时收获细胞用于分析目的。使用TU测定和Elisa确定每个细胞系的慢病毒生产率并进行比较。与/>试剂相比，转染试剂/>-AAV显著增加Expi293F细胞的LV生产率，从1.9倍到2.8倍，取决于目的基因(图2A)。在大规模生产中保留了生产率的提高(图2B和表1)。
表1：批量收获物中慢病毒生产率的原始数据
此外，当用-AAV转染构建体时，观察到降低的PP/IP比率，突出了更好的转染效率。
实例3：确定用于更高病毒生产的适合DNA量
此实例描述了确定用于转染的DNA量以增加病毒产量。
将Expi293FTM细胞解冻并且接种在一个SF 250mL烧瓶中，以达到高于0.15E6个细胞/mL的最终密度。将细胞以0.15E6个细胞/mL的浓度接种在SF 250mL烧瓶中的FreeStyleTM293表达培养基中，并且在150rpm下培养3天。常规培养细胞以达到适合接种50L培养物的量。将Expi293F细胞接种在FreeStyleTM培养基中的一次性搅拌罐生物反应器中，并达到适合的细胞密度(1.50x106个细胞/mL-2.50x106个细胞/mL)。细胞的活力被评估为≥90％。接种后72小时进行转染。将0.3μgDNA/E6细胞、0.4μg DNA/E6细胞、0.5μg DNA/E6或0.6μg DNA/E6细胞与FectoVIR-在Opti-MEMTMI降低的血清培养基(5％wv)中以1:1比率混合并孵育30分钟以形成转染复合物。将转染复合物直接添加到细胞培养物中。转染后20小时，将具有MgCl2(2mM终浓度)的25U/mL苯佐那酶添加到培养基中。转染48小时后收获含有慢病毒载体颗粒的条件培养基。
数据显示，使用0.4μg DNA/1E6细胞可获得最高的病毒产量(图3)。此外，使用0.4μg DNA/1E6细胞获得的病毒产量高于供应商推荐的使用1μg DNA/1E6细胞获得的病毒产量(数据未显示)。
实例4：确定转染前培养基pH的修改对慢病毒生产率的影响
该实例表明，将培养基的pH从7.1降低到6.7±0.05可以增加慢病毒的生产率。
将Expi293FTM细胞解冻并且接种在一个SF250mL中，以达到高于0.15E6个细胞/mL的最终密度。细胞在标准培养条件下培养四天，并且扩大规模以达到适合接种2.5L培养物的量。FreeStyleTM培养基是一种化学成分明确、无血清和无蛋白质的培养基，用作培养基。
经过三天的细胞生长和扩增，在转染时达到了在开发过程中定义的合适细胞密度(1.50x106个细胞/mL-2.50x106个细胞/mL)。细胞的活力被评估为≥90％。接种后72小时进行转染。在细胞生长和扩增三天后，用3种模型构建体(C1、I1和M1)转染细胞。转染前，将pH设定值从7.1修改为6.7±0.05。在达到这个新设定点后进行转染。将细胞用转染复合物转染，转染复合物是通过将每个构建体的0.4μg DNA/E6细胞与-AAV试剂(0.4μL/1E6细胞)混合并孵育而获得的。转染后24小时，将具有MgCl2(2mM终浓度)的25U/mL苯佐那酶添加到每种培养基中。感染后48小时收获细胞用于分析目的。使用TU测定和Elisa确定每个细胞系的慢病毒生产率并进行比较。
数据显示，当转染前pH转变为6.7时，两种构建体的慢病毒生产率增加了约3倍(图4)。相比之下，另一项研究表明，在该过程的早期(接种时)将pH降低至6.7会对细胞生长产生负面影响并减慢生产过程(数据未显示)。因此，该实验表明，仔细定时降低pH会产生高细胞生长和更高的LV生产率。
实例5：慢病毒产生
所有载体生产和细胞培养均使用源自293F细胞系的Expi293FTM人胚肾(HEK)细胞以及使用HEK293T细胞进行。
将一瓶Expi293FTM细胞解冻并且接种到一个SF250mL烧瓶中，以达到高于0.15E6个细胞/mL的最终密度。使用FreeStyleTM培养基在标准培养条件下培养细胞四天，然后扩大规模以达到接种50L搅拌罐生物反应器所需的细胞量。
将Expi293F细胞以0.2x106个细胞/mL±0.025接种在一次性搅拌罐生物反应器FreeStyleTM培养基中，最终体积为47L。经过三天的细胞生长和扩增，在转染时达到了在开发过程中定义的合适细胞密度(1.50x106个细胞/mL-2.50x106个细胞/mL)。细胞的活力被评估为≥90％。接种后72小时进行转染。转染前，将pH设定值从7.1修改为6.7±0.05。在达到这个新设定点后进行转染。
Expi293F细胞的瞬时转染是用四种不同的质粒(其由三种辅助质粒和一种转移(GOI)质粒组成)实现：
(i)编码水疱性口炎病毒(VSV-g)包膜糖蛋白的质粒，
(ii)编码结构蛋白和病毒酶的质粒，
(iii)编码转录后调节因子(Rev)的质粒，和
(iv)含有转基因和病毒RNA生产、加工和包装所需的最小顺式作用序列的转移质粒。
-AAV(Ref 120-100，Polyplus)用作转染试剂。将0.4μgDNA/E6细胞与FectorVIR-/>(0.4μL/1E6细胞)在Opti-MEMTMI降低的血清培养基(5％wv)中混合并孵育30分钟以形成转染复合物。将转染复合物直接添加到细胞培养物中。转染后20小时，将具有MgCl2(2mM终浓度)的25U/mL苯佐那酶添加到培养基中。转染48小时后收获含有慢病毒载体颗粒的条件培养基。如实例1所述进行TU测定和p24 ELISA。
数据显示，与在根据实例1的对照条件下获得的约1.5E7 TU/mL相比，实例2至4中描述的条件的应用将Expi293F细胞中的慢病毒生产率增加至C1的3E7 TU/mL。发现I1的批量收获物的慢病毒生产率为1.5E7TU/mL。图5显示了在以下两种生产系统中使用C1和I1构建体的对比慢病毒生产率：(i)Expi293F细胞，使用-AAV作为转染试剂，和(ii)HEK293T细胞，使用/>作为转染试剂。
实例6：在各种实验设置中添加精氨酸可改进过滤过程时间
使用C1作为模型载体进行过滤以获得澄清的收获物。为了测试精氨酸作为稳定剂的效果，在含有慢病毒载体的起始材料中掺加1M精氨酸-HCl以达到50mM的最终精氨酸浓度。澄清的收获物用作未处理的对照。
使用PIPES配制缓冲液(20mM PIPES、75mM NaCl、73mM蔗糖，pH 6.5)对澄清的收获样品进行过滤，以浓缩和重新缓冲慢病毒载体溶液。从过滤橇(filtration skid)中回收浓缩和重新缓冲的慢病毒载体溶液，并且用滞留体积的PIPES过滤缓冲液冲洗系统。
第一滤液中HEK-293T细胞转导单位(TU)滴度的测定按照实例1所述的生物分析测试方法进行。如实例1所述，通过酶联免疫吸附测定(ELISA)来确定p24。数据显示，在精氨酸存在下，与样品进行超滤时的对照运行相比，过程时间从244分钟降低到145分钟(图6)。总之，精氨酸(50mM终浓度)的添加将过程时间改进了约40％。
实例7：精氨酸的存在改进了过滤过程中的载体回收率
该实验描述了添加精氨酸对后续过滤步骤的载体回收率的影响。
制备澄清的收获物并掺加50mM精氨酸。未经处理的澄清的收获物用作对照。两种样品均使用200mL澄清的收获物。含有精氨酸的澄清收获物中的载体浓度为4.8E+06TU/mL，而对照澄清收获样品中的起始浓度为9.5E+06TU/mL。根据本领域技术人员已知的病毒纯化程序过滤和浓缩澄清的收获物。
含有精氨酸的样品的最终体积为22.3mL，并且载体浓度为3.7E+07TU/mL，导致载体回收率为85％，而不含精氨酸的对照样品的最终体积为20.5mL，并且载体浓度为3.7E+07TU/mL，导致载体回收率仅为40％(图7)。
实例8：在对样品进行过滤试验后对澄清的收获物进行进一步纯化
该实验描述了澄清的收获物的进一步纯化程序。澄清的收获物掺加1M精氨酸-HCl以达到50mM的最终精氨酸浓度。使用如实例6中所述对样品进行过滤以获得第一纯化中间体。使用50U/mL对样品进行苯佐那酶处理。使用PIPES交换缓冲液进行色谱法以平衡和洗涤柱子。
将色谱法后获得的纯化中间体(第一滤液)掺加1M精氨酸-HCl至最终浓度为75mM精氨酸，并使用PIPES配制缓冲液进行过滤。收集第二次的滤液用于进一步分析。
实例9：在存在精氨酸的情况下，慢病毒下游过程中的两个过滤步骤均可实现稳健的高载体回收率
该实验描述了当在过滤步骤之前实施精氨酸掺加时，载体回收率进一步增加。
该下游过程用于纯化使用Expi293F细胞系生产的M1构建体和RCV构建体。使用产品M1的不同载体构建体，在滤液1和滤液2之前添加75mM精氨酸测试了一系列载体浓度以及多个构建体。
对于滤液1，使用平均起始体积3168mL(范围：3031-3224mL)，平均TU滴度7.5E+06TU/mL(范围：4.3E+06-1.2E+07TU/mL)。浓缩过滤后，回收的滤液1截留物的平均体积为564mL(范围：526-611mL)，并且TU滴度为3.6E+07TU/mL(范围：1.9E+07-5.7E+07TU/mL)。因此，总的浓缩因子为约5.6，并且以转导单位计的载体回收率为平均85％(图8)。
对于滤液2，使用平均起始体积559mL(范围：522-592mL)，平均TU滴度2.6E+07TU/mL(范围：1.5E+07-4.1E+07TU/mL)。浓缩过滤后，回收的滤液2截留物的平均体积为46.3mL(范围：24.3-74.4mL)，并且TU滴度为3.4E+08TU/mL(范围：1.3E+08-1.0E+09TU/mL)。因此，总的浓缩因子为约13.5(范围：7.5-22.6)，并且以转导单位计的载体回收率为平均87％(图8)。
实例10：精氨酸以浓度依赖性方式降低聚集体的存在
该实例描述了精氨酸对聚集体存在的影响。
根据实例8在完成纯化后取出滤液2样品并如下处理：(1)将一个样品与0.825M精氨酸混合以达到150mM的最终精氨酸浓度。(2)将另一个样品与等量的2.475mM精氨酸混合以达到300mM的最终浓度。(3)用等量的PIPES配制缓冲液处理对照样品，以保持最终精氨酸浓度为75mM(类似于实例9中获得的滤液2)，并解释通过将精氨酸添加到其他两个样品中引起的稀释。通过微流成像(MFI)分析样品的亚可见颗粒。
发现精氨酸的存在以浓度依赖性方式降低颗粒计数和尺寸(图9)。添加精氨酸似乎使慢病毒颗粒具有抗聚集性。总之，发现精氨酸是纯化慢病毒载体的合适稳定剂，以改进纯化过程中的慢病毒载体产量。
实例11：苯佐那酶的存在减少了DNA杂质
该实例描述了苯佐纳酶对DNA杂质的影响。
如实例5所述在250mL SF下进行慢病毒生产，除了a)苯佐那酶添加时间的变化；和/或b)苯佐那酶量的变化。在实例5中，在24HPT以24U/mL的浓度添加苯佐那酶。对于第一批LVV(C1)，实验包括在3HPT和24HPT时以5U/mL、15U/mL、25U/mL和50U/mL改变苯佐那酶的添加，如在表12a)中所见。
表12a.苯佐那酶添加(粗体：对照条件)
如图10所示，苯佐那酶对感染性LVV的生产率(TU/mL-TU测定)没有影响，收获时显示在2.9E+7-4.3E+7TU/mL之间，或显示在用不同浓度的苯佐那酶和不同添加时间的情况下收获时的PP/IP(物理颗粒/感染性颗粒)比率。然而，在转染后添加苯佐那酶后，总DNA量显著减少(图11)。这些结果通过第二批LVV生产(C1)另外在6HPT时添加苯佐那酶得到进一步证实(表12b；图12)。
表12b.苯佐那酶添加(粗体：对照条件)
这些数据表明，以不同浓度和时间添加苯佐那酶不会影响感染性LVV的生产率，但会显著减少可能影响产生的DNA杂质浓度。
实例12：孵育时间和复合体积
这个实例描述了孵育时间和复合体积的影响。
如实例5所述在250mL SF下进行慢病毒生产，除了a)孵育时间的变化；和/或b)复合体积的变化。在实例5中，使用-AAV(Ref120-100，Polyplus)用作转染试剂。将0.4μg DNA/E6细胞与FectorVIR-/>(0.4μL/1E6细胞)在Opti-MEMTMI降低的血清培养基(5％wv)中混合并孵育30分钟以形成转染复合物(C1)。在该实例中，在15、30、45和60分钟孵育时，复合体积从5％wv、7.5％wv和10％wv各不相同(表13a)
表13a.复合变量实验设计(粗体：对照)
如图13所示，随着复合体积的增加，对转染效率没有积极影响。此外，在5％的复合体积和15-60分钟范围的孵育下观察到类似的LLV生产率(收获时约2E+7TU/mL)。在10、15、20、30、45和60分钟使用含LVV(I1)的双重CAR生产第二批LVV进一步证实了5％复合体积的这些结果(图14)。
这些数据表明，不同的孵育时间和复合体积不会影响感染性LVV的生产率，但会显示转染复合物在孵育期间的稳定性。
实例13：过程的稳健性
此实例展示了具有两种不同构建体(C1和I1)的不同规模的生产过程的稳健性。
慢病毒生产如实例5所述进行，只是生产规模有所改变。首先，图15显示了构建体I1在50L规模的搅拌罐生物反应器中的细胞生长。为了进一步测试不同构建体的稳健性，图16显示了使用两种不同构建体(C1和I1)在四种不同规模(50L、2.6L、2.5L摇瓶(SF)和100mLSF)下的过程稳健性。
例如，这些数据表明，该过程在不同构建体的情况下在多个规模中具有可重复性和稳健性并且可用于生产许多不同的LVV。
通过引用并入
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等同物
本文引用的每一个专利、专利申请和出版物的披露内容通过引用以其全文特此并入本文。虽然已经参照具体方面披露了本发明，但是本领域其他技术人员可以在不偏离本发明的真实精神以及范围的情况下设想本发明的其他方面以及变化。所附权利要求旨在理解为包括所有这类方面以及等同变化。

Claims (104)

1.一种制造慢病毒载体的方法，所述方法包括：
a)提供多个哺乳动物(例如，人)细胞，
b)使所述多个哺乳动物细胞与以下接触：
i)-AAV转染试剂，和
ii)编码治疗效应物例如治疗蛋白(例如，CAR)和足够的用于包装到病毒颗粒中的LTR序列的核酸，以及任选地编码慢病毒包装蛋白、慢病毒包膜蛋白的核酸，并且
在允许将所述核酸引入至少所述细胞的亚群中的条件下；以及
c)在适合产生所述慢病毒载体的条件下培养所述细胞。
2.如权利要求1所述的方法，当所述多个哺乳动物细胞处于50L培养物中时，所述方法产生的每ml培养物的转导单位数量不小于在其他方面类似的100ml培养物中每ml培养物的转导单位数量的50％、60％、70％或80％。
3.如权利要求1或2所述的方法，当在实例5中描述的条件下使用时，所述方法产生至少1x 107或3x 107或至少1x 108个转导单位。
4.如权利要求1-3中任一项所述的方法，所述方法产生等于或小于1188:1、953:1和1800:1PP(物理颗粒):IP(感染性颗粒)的比率。
5.如权利要求1或2所述的方法，其中所述哺乳动物细胞是293细胞，例如，Expi293F细胞。
6.如权利要求1-5中任一项所述的方法，其中以0.3-0.6μl-AAV/百万细胞，例如约0.4μl/百万细胞的浓度使用所述/>-AAV。
7.如权利要求1-6中任一项所述的方法，其中以0.3-0.6μg核酸/百万细胞，例如约0.4μg/百万细胞的浓度使用所述核酸。
8.如权利要求1-7中任一项所述的方法，其中用于转染的-AAV:DNA的比率为1:0.5至1:2，例如，约1:1(其中任选地用于转染的所述DNA包含编码所述治疗效应物的DNA、编码一种或多种逆转录病毒包装蛋白的DNA和编码逆转录病毒包膜蛋白的DNA)。
9.如权利要求1-8中任一项所述的方法，其中所述-AAV转染试剂与所述核酸复合。
10.如权利要求1-9中任一项所述的方法，所述方法进一步包括在步骤b)之前将所述-AAV转染试剂与所述核酸混合。
11.如权利要求9或10所述的方法，其中所述转染试剂和所述核酸的复合体积在约1％和约15％之间，例如，约1％和约10％(例如，约5％-7.5％或7.5％-10％)。
12.如权利要求11所述的方法，其中所述复合体积为3％-7％、4％-6％或约5％。
13.如权利要求10-12中任一项所述的方法，其中将所述-AAV转染试剂和所述核酸孵育足够的时间以允许发生复合，例如，约10-90分钟，例如，15-60分钟，例如，15-30、30-45或45-60分钟。
14.一种制造慢病毒载体的方法，所述方法包括：
a)在高于约6.9或约6.9-7.3，例如约7.0-7.1的pH下培养多个哺乳动物(例如，人)细胞；
b)继步骤a)之后，将所述培养物的pH调节至约6.0-6.8，例如，6.6-6.8，例如，约6.7；
c)继步骤b)之后，使所述培养物与转染试剂和DNA接触。
15.如权利要求14所述的方法，其中所述转染试剂包括-AAV转染试剂。
16.如权利要求14或15所述的方法，其中所述DNA编码一种或多种逆转录病毒包装蛋白、逆转录病毒包膜蛋白、和治疗效应物例如治疗蛋白(例如，CAR)。
17.如权利要求14-16中任一项所述的方法，其中a)包括培养所述细胞约2-4天，例如，约3天。
18.如权利要求14-17中任一项所述的方法，所述方法进一步包括在步骤b)和c)之间培养所述细胞的另外的步骤。
19.如权利要求14-18中任一项所述的方法，所述方法进一步包括在步骤c)之后培养所述细胞的另外的步骤。
20.如权利要求14-19中任一项所述的方法，其中步骤b)包括将所述pH降低约0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9或1。
21.如权利要求1-20中任一项所述的方法，其中在步骤a)之前，将所述多个哺乳动物细胞以0.1x106个细胞/mL和0.3x106个细胞/mL之间(例如，约0.15x106个细胞/mL或约0.2x106个细胞/mL)以最终体积接种在培养基中(例如，FreeStyleTM培养基)。
22.如权利要求21所述的方法，其中在步骤a)之前50和80小时之间(例如，约55小时、约60小时、约65小时、约70小时、约72小时、约75小时或约80小时)接种所述多个哺乳动物细胞。
23.如步骤21或22所述的方法，其中在适合于允许细胞生长和扩增至转染时适合的细胞密度(例如，在约1.0x106个细胞/mL和约3.0x106个细胞/mL之间(例如，在1.5x106个细胞/mL和2.5x106个细胞/mL之间))的条件下培养所述多个哺乳动物细胞。
24.一种制造慢病毒载体的方法，所述方法包括：
a)提供包含所述慢病毒载体和至少一种杂质的组合物(例如，其中所述组合物包含澄清的细胞收获物或滤液)，以及
b)使所述组合物与精氨酸或其盐接触。
25.如权利要求24所述的方法，其中以下一项或多项：
i)所述精氨酸的浓度为约25-50mM(约50mM)、50-100mM(例如，约75mM)、100-200mM(例如，约150mM)或200-400(例如，约300)mM精氨酸；或
ii)与其他方面类似的组合物相比，所述精氨酸的浓度足以使所述慢病毒载体的转导单位水平增加约10％-300％、20％-180％、30％-160％、50％-150％、75％-125％或约100％，例如在根据实例7的测定中；
iii)在步骤b)之后，所述组合物显示每ml的总颗粒浓度小于400,000、300,000、200,000或100,000，如通过微流成像测量的，例如，在实例10中描述的测定中，其中任选地所述颗粒包含聚集的慢病毒；
iv)在步骤b)之后，所述组合物显示每ml≥10μm的颗粒浓度小于约5,000、4,500、4,000、3,500、3,000或2,500，如通过微流成像测量的，例如，在实例10中描述的测定中，其中任选地所述颗粒包含聚集的慢病毒；
v)在步骤b)之后，所述组合物显示每ml≥25μm的颗粒浓度小于约500、400、300或200，如通过微流成像测量的，例如，在实例10中描述的测定中，其中任选地所述颗粒包含聚集的慢病毒；
vi)在步骤b)之后，与不添加所述精氨酸或其盐的其他方面类似的滤液相比，所述组合物显示出所述慢病毒载体的聚集降低；
vii)所述慢病毒载体的转导单位的回收率比没有添加精氨酸的其他方面类似的对照高例如至少约10％、20％、50％、100％或200％，例如，如在根据实例7的测定中测量的。
26.如权利要求24或25所述的方法，其中b)包括使所述组合物与包含所述精氨酸和缓冲液的溶液接触，其中任选地所述缓冲液是PIPES，其中任选地所述PIPES在所述溶液中的浓度为约10mM至约50mM，例如，约20mM。
27.如权利要求26所述的方法，其中所述溶液的pH为约6.0至约7.0，例如，约6.5。
28.如权利要求26或27所述的方法，其中所述溶液进一步包含盐，其中任选地所述盐选自由氯化钠、氯化镁和氯化钙组成的组，例如，氯化钠。
29.如权利要求28所述的方法，其中所述盐以约25-150mM，例如50-100mM，例如约75mM的浓度存在于所述溶液中。
30.如权利要求28或29所述的方法，其中在所述溶液中所述盐的pH为约6.5。
31.如权利要求26-30中任一项所述的方法，其中所述溶液进一步包含碳水化合物，例如，非还原性碳水化合物，例如，蔗糖或海藻糖。
32.如权利要求31所述的方法，其中所述碳水化合物以每体积所述溶液约1重量％至约10重量％，例如每体积所述溶液约2重量％至约5重量％、每体积所述溶液约2.5重量％的浓度存在于所述溶液中。
33.如权利要求31或32所述的方法，其中所述碳水化合物以约30-150mM(约73mM)或150-300(例如，约220)mM的浓度存在于所述溶液中。
34.如权利要求26-33中任一项所述的方法，其中所述溶液进一步包含所述溶液的NaCl(例如约25-150mM，例如50-100mM，例如约75mM)和蔗糖(例如约30-150mM，例如约73mM，或例如约150-300mM，例如约220mM，或约2.5重量％/体积)中的一者或两者。
35.如权利要求26所述的方法，其中所述溶液包含20mM PIPES、75mM氯化钠和2.5重量％蔗糖/体积所述溶液，并且其中所述溶液的pH为约6.5。
36.如权利要求26所述的方法，其中所述溶液包含20mM PIPES、75mM氯化钠和73mM蔗糖，并且其中所述溶液的pH为约6.5。
37.如权利要求26所述的方法，其中所述溶液包含20mM PIPES、75mM氯化钠和220mM蔗糖，并且其中所述溶液的pH为约6.5。
38.如权利要求26所述的方法，其中所述溶液进一步包含20mM PIPES、75mM精氨酸例如精氨酸-HCl，并且其中所述溶液的pH为约6.5。
39.如权利要求26-38中任一项所述的方法，其中所述溶液的重量摩尔渗透压浓度为约270mOsm/kg至约330mOsm/kg，例如，约275mOsm/kg至约300mOsm/k，例如，约285mOsm/kg。
40.如权利要求26-39中任一项所述的方法，所述方法进一步包括：c)进行纯化步骤，例如，对b)的所述组合物的过滤步骤，从而产生包含所述慢病毒载体的半纯化的组合物。
41.如权利要求40所述的方法，所述方法进一步包括在步骤c)之后，使所述半纯化的组合物与精氨酸或其盐接触。
42.如权利要求24-41中任一项所述的方法，其中所述精氨酸封装所述慢病毒载体。
43.如权利要求24-42中任一项所述的方法，其中所述精氨酸稳定所述慢病毒载体。
44.如权利要求24-43中任一项所述的方法，其中所述杂质包括蛋白质(例如，宿主细胞蛋白质)、核酸(例如，宿主细胞核酸)、碳水化合物(例如，宿主细胞碳水化合物)、脂质、酶、盐、缓冲液或其任何组合。
45.如权利要求1-44中任一项所述的方法，其中转染时的所述细胞密度在约1.0x 106个细胞/mL和约3.0x 106个细胞/mL之间(例如，1.5x 106个细胞/mL和2.5x 106个细胞/mL之间)。
46.如权利要求1-45中任一项所述的方法，其中在转染时所述细胞的活力是或评估为至少90％(例如，91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)。
47.如权利要求46所述的方法，其中在转染时或大约转染时(例如，在转染前30分钟内)测量所述细胞的活力。
48.如权利要求1-47中任一项所述的方法，其中所述方法用于具有两种或更多种核酸(例如，两种或更多种质粒，例如，两种质粒、三种质粒、四种质粒或五种质粒)的过程。
49.一种水性组合物，所述水性组合物包含慢病毒载体、精氨酸、1,4-哌嗪二乙磺酸(PIPES)缓冲液和盐。
50.如权利要求49所述的水性组合物，其中所述水性组合物中的精氨酸的浓度为约25-50mM(约50mM)、50-100mM(例如，约75mM)、100-200mM(例如，约150mM)或200-400(例如，约300)mM精氨酸，其中任选地所述PIPES水性组合物的浓度为约10mM至约50mM，例如，约例如20mM。
51.如权利要求49或50所述的水性组合物，其中所述水性组合物的pH为约6.0至约7.0，例如，约6.5。
52.如权利要求49-51中任一项所述的水性组合物，其中所述水性组合物进一步包含盐，其中任选地所述盐选自由氯化钠、氯化镁和氯化钙组成的组。
53.如权利要求49-52中任一项所述的水性组合物，其中所述盐是氯化钠(NaCl)。
54.如权利要求49-53中任一项所述的水性组合物，其中所述水性组合物中的盐为约25mM至约150mM，例如，约50mM至约75mM。
55.如权利要求49-54中任一项所述的水性组合物，其中所述水性组合物包含20mMPIPES和75mM氯化钠，并且其中所述水性组合物的pH为约6.5。
56.如权利要求49-55中任一项所述的水性组合物，其中所述水性组合物进一步包含碳水化合物，例如，非还原性碳水化合物，例如，蔗糖或海藻糖。
57.如权利要求49-56中任一项所述的水性组合物，其中所述碳水化合物以每体积所述溶液约1重量％至约10重量％，例如每体积所述水性组合物约2重量％至约5重量％、每体积所述水性组合物约2.5重量％的浓度存在于所述水性组合物中。
58.如权利要求49-57中任一项所述的水性组合物，其中所述碳水化合物以约30-150mM(约73mM)或150-300(例如，约220)mM的浓度存在于所述水性组合物中。
59.如权利要求49-58中任一项所述的水性组合物，其中所述水性组合物包含所述水性组合物的NaCl(例如约25-150mM，例如50-100mM，例如约75mM)和蔗糖(例如约30-150mM，例如约73mM，或例如约150-300mM，例如约220mM，或约2.5重量％/体积)中的一者或两者。
60.如权利要求49-59中任一项所述的水性组合物，其中所述水性组合物包含20mMPIPES、75mM氯化钠和2.5重量％蔗糖/体积所述水性组合物，并且其中所述水性组合物的pH为约6.5。
61.如权利要求49-60中任一项所述的水性组合物，其中所述水性组合物包含20mMPIPES、75mM氯化钠和73mM蔗糖，并且其中所述水性组合物的pH为约6.5。
62.如权利要求49-61中任一项所述的水性组合物，其中所述水性组合物包含20mMPIPES、75mM氯化钠和220mM蔗糖，并且其中所述水性组合物的pH为约6.5。
63.如权利要求49-62中任一项所述的水性组合物，其中所述水性组合物的重量摩尔渗透压浓度为约270mOsm/kg至约330mOsm/kg，例如，约275mOsm/kg至约300mOsm/k，例如，约285mOsm/kg。
64.如权利要求49-63中任一项所述的水性组合物，其中如任一前述权利要求所述的慢病毒载体以约3x 108TU/mL至约5x 108TU/mL的浓度存在。
65.如权利要求49-64中任一项所述的水性组合物，所述水性组合物不含选自由以下组成的组的一种或多种蛋白质：人血清白蛋白(HSA)、重组人血清白蛋白(rHSA)、牛血清白蛋白(BSA)和脂蛋白。
66.如前述权利要求中任一项所述的慢病毒载体，其中慢病毒载体包含转基因，例如，编码蛋白质，例如，包含嵌合抗原受体(CAR)的蛋白质的转基因。
67.如前述权利要求中任一项所述的慢病毒载体，其中所述CAR在N-末端至C-末端的方向上包含抗原结合结构域、跨膜结构域和一个或多个信号传导结构域。
68.如前述权利要求中任一项所述的慢病毒载体，其中所述信号传导结构域包含一个或多个初级信号传导结构域和/或一个或多个共刺激信号传导结构域。
69.如前述权利要求中任一项所述的慢病毒载体，其中所述一个或多个初级信号传导结构域中的一个包含CD3-ζ刺激结构域。
70.如前述权利要求中任一项所述的慢病毒载体，其中所述共刺激信号传导结构域中的一个或多个包含选自共刺激蛋白的细胞内结构域，所述共刺激蛋白选自由以下组成的组：OX40、CD27、CD28、CDS、ICAM-1、LFA-1(CD11a/CD18)、ICOS(CD278)、4-1BB(CD137)、CDS、ICAM-1、GITR、BAFFR、HVEM(LIGHTR)、SLAMF7、NKp80(KLRF1)、NKp44、NKp30、NKp46、CD160、CD19、CD4、CD8α、CD8β、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、ITGA4、VLA1、CD49a、ITGA4、IA4、CD49D、ITGA6、VLA-6、CD49f、ITGAD、CD11d、ITGAE、CD103、ITGAL、CD11a、LFA-1、ITGAM、CD11b、ITGAX、CD11c、ITGB1、CD29、ITGB2、CD18、LFA-1、ITGB7、NKG2D、NKG2C、TNFR2、TRANCE/RANKL、DNAM1(CD226)、SLAMF4(CD244、2B4)、CD84、CD96(Tactile)、CEACAM1、CRTAM、Ly9(CD229)、CD160(BY55)、PSGL1、CD100(SEMA4D)、CD69、SLAMF6(NTB-A、Ly108)、SLAM(SLAMF1、CD150、IPO-3)、BLAME(SLAMF8)、SELPLG(CD162)、LTBR、LAT、GADS、SLP-76、PAG/Cbp、CD19a、和特异性地结合CD83的配体，例如，4-1BB(CD137)共刺激结构域或CD28共刺激结构域。
71.如前述权利要求中任一项所述的慢病毒载体，其中所述抗原结合结构域是scFv。
72.如前述权利要求中任一项所述的慢病毒载体，其中所述抗原结合结构域与选自下组的抗原结合，该组由以下组成：CD19；CD123；CD22；CD30；CD171；CS-1；C型凝集素样分子-1，CD33；表皮生长因子受体变体III(EGFRvlll)；神经节苷脂G2(GD2)；神经节苷脂GD3；TNF受体家族成员B细胞成熟(BCMA)；Tn抗原((Tn Ag)或(GalNAca-Ser/Thr))；前列腺特异性膜抗原(PSMA)；受体酪氨酸激酶样孤儿受体1(ROR1)；Fms样酪氨酸激酶3(FLT3)；肿瘤相关糖蛋白72(TAG72)；CD38；CD44v6；癌胚抗原(CEA)；上皮细胞粘附分子(EPCAM)；B7H3(CD276)；KIT(CD1 17)；白细胞介素-13受体亚基α-2；间皮素；白细胞介素1 1受体α(IL-1 1Ra)；前列腺干细胞抗原(PSCA)；蛋白酶丝氨酸21；血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)；Lewis(Y)抗原；CD24；血小板来源的生长因子受体β(PDGFR-β)；阶段特异性胚胎抗原-4(SSEA-4)；CD20；叶酸受体α；受体酪氨酸蛋白激酶ERBB2(Her2/neu)；黏蛋白1，细胞表面相关蛋白(MUC1)；表皮生长因子受体(EGFR)；神经细胞粘附分子(NCAM)；前列腺酶；前列腺酸性磷酸酶(PAP)；突变的延伸因子2(ELF2M)；肝配蛋白B2；成纤维细胞活化蛋白α(FAP)；胰岛素样生长因子1受体(IGF-I受体)，碳酸酐酶IX(CAIX)；蛋白酶体(前体，巨蛋白因子)亚基，β型，9(LMP2)；糖蛋白100(gp100)；由断裂点簇集区(BCR)和Abelson鼠白血病病毒致癌基因同源物1(Abl)组成的致癌基因融合蛋白(bcr-abl)；酪氨酸酶；肝配蛋白A型受体2(EphA2)；岩藻糖基GM1；唾液酸Lewis粘附分子(sLe)；神经节苷脂GM3；转谷氨酰胺酶5(TGS5)；高分子量-黑素瘤相关抗原(HMWMAA)；o-乙酰基-GD2神经节苷脂(OAcGD2)；叶酸受体β；肿瘤内皮标记1(TEM1/CD248)；肿瘤内皮标记7相关蛋白(TEM7R)；密封蛋白6(CLDN6)；促甲状腺激素受体(TSHR)；G蛋白偶联受体C类5组，成员D(GPRC5D)；染色体X开放阅读框61(CXORF61)；CD97；CD179a；间变性淋巴瘤激酶(ALK)；聚唾液酸；胎盘特异性1(PLAC1)；globoH糖基神经酰胺(GloboH)的六糖部分；乳腺分化抗原(NY-BR-1)；尿溶蛋白2(UPK2)；甲型肝炎病毒细胞受体1(HAVCR1)；肾上腺素受体β3(ADRB3)；泛连接蛋白3(PANX3)；G蛋白偶联受体20(GPR20)；淋巴细胞抗原6复合物，基因座K 9(LY6K)；嗅觉受体51E2(OR51 E2)；TCRγ替代性阅读框蛋白(TARP)；肾母细胞瘤蛋白(WT1)；癌/睾丸抗原1(NY-ESO-1)；癌/睾丸抗原2(LAGE-1a)；黑素瘤相关抗原1(MAGE-A1)；ETS易位变异基因6，位于染色体12p上(ETV6-AML)；精子蛋白17(SPA17)；X抗原家族，成员1A(XAGE1)；血管生成素结合细胞表面受体2(Tie 2)；黑素瘤癌睾丸抗原-1(MAD-CT-1)；黑素瘤癌睾丸抗原-2(MAD-CT-2)；Fos相关抗原1；肿瘤蛋白p53(p53)；p53突变体；前列腺特异性蛋白；存活蛋白；端粒酶；前列腺癌肿瘤抗原-1、T细胞1识别的黑素瘤抗原；大鼠肉瘤(Ras)突变体；人端粒酶逆转录酶(hTERT)；肉瘤易位断点；黑素瘤细胞凋亡抑制剂(ML-IAP)；ERG(跨膜蛋白酶、丝氨酸2(TMPRSS2)ETS融合基因)；N-乙酰葡糖胺基转移酶V(NA17)；配对盒蛋白Pax-3(PAX3)；雄激素受体；细胞周期蛋白B1；v-myc禽类骨髓细胞瘤病毒致癌基因神经母细胞瘤来源同源物(MYCN)；Ras同源物家族成员C(RhoC)；酪氨酸酶相关蛋白2(TRP-2)；细胞色素P450 1B1(CYP1B1)；CCCTC-结合因子(锌指蛋白)样，T细胞3识别的鳞状细胞癌抗原(SART3)；配对盒蛋白Pax-5(PAX5)；前顶体蛋白结合蛋白sp32(OY-TES1)；淋巴细胞特异性蛋白酪氨酸激酶(LCK)；激酶锚蛋白4(AKAP-4)；滑膜肉瘤，X断点2(SSX2)；晚期糖基化终产物受体(RAGE-1)；肾遍在蛋白1(RU1)；肾遍在蛋白2(RU2)；豆荚蛋白；人乳头状瘤病毒E6(HPV E6)；人乳头状瘤病毒E7(HPV E7)；肠羧酸酯酶；突变的热休克蛋白70-2(muthsp70-2)；CD79a；CD79b；CD72；白细胞相关的免疫球蛋白样受体1(LAIR1)；IgA受体的Fc片段(FCAR或CD89)；白细胞免疫球蛋白样受体亚家族A成员2(LILRA2)；CD300分子样家族成员f(CD300LF)；C型凝集素结构域家族12成员A(CLEC12A)；骨髓基质细胞抗原2(BST2)；含EGF样模块的粘蛋白样激素受体样2(EMR2)；淋巴细胞抗原75(LY75)；磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(GPC3)；Fc受体样5(FCRL5)；和免疫球蛋白λ样多肽1(IGLL1)，例如，与CD19、CD22、间皮素或CD123结合。
73.如前述权利要求中任一项所述的慢病毒载体，其中所述CAR包含抗CD19抗体或其片段、4-1BB(CD137)跨膜结构域和CD3-ζ信号传导结构域。
74.如前述权利要求中任一项所述的慢病毒载体，所述慢病毒载体包含第二转基因，例如，编码第二蛋白质，例如，包含第二嵌合抗原受体(CAR)的第二蛋白质的第二转基因。
75.一种制造慢病毒载体的方法，所述方法包括：
a)提供人细胞(例如，293细胞)群体；
b)将编码逆转录病毒包装蛋白、逆转录病毒包膜蛋白、和治疗效应物例如治疗蛋白(例如，CAR)的核酸引入所述细胞中，
c)在步骤b)后约2-6(例如，约3)、4-10(例如，约6)、6-40、10-40、10-30(例如，约24)或约20小时的时间使所述细胞与苯佐那酶接触；以及
d)在适合产生所述慢病毒载体的条件下培养所述细胞。
76.如权利要求75所述的方法，其中在从所述细胞中收获慢病毒载体之前6-10小时、10-20小时、20-30小时、30-40小时或40-50小时添加苯佐那酶。
77.一种制造慢病毒载体的方法，所述方法包括：
a)提供人细胞(例如，293细胞)群体；
b)将编码逆转录病毒包装蛋白、逆转录病毒包膜蛋白、和治疗效应物例如治疗蛋白(例如，CAR)的核酸引入所述细胞中，
c)使所述细胞与苯佐那酶接触(例如，步骤b后3-24小时)；
d)在适合产生所述慢病毒载体的条件下培养所述细胞；
e)在步骤c)后6-10小时、10-20小时、20-30小时、30-40小时或40-50小时从细胞中收获所述慢病毒载体。
78.如权利要求75-77中任一项所述的方法，其中苯佐那酶的浓度为约10-40U/mL，例如，20-30U/mL，例如，约25U/mL。
79.如权利要求75-78中任一项所述的方法，其中苯佐那酶的浓度为约3-60U/mL、3-10U/mL、3-7U/mL、4-6U/mL或约5U/mL。
80.如权利要求75-79中任一项所述的方法，其中所述苯佐那酶的浓度为5-50、5-15、15-25或25-50U/mL。
81.如权利要求75-80中任一项所述的方法，所述方法进一步包括在步骤c)之前，使所述苯佐那酶与例如约1-5mM、1-3mM或约2mM的MgCl2接触。
82.一种制造慢病毒载体的方法，所述方法包括：
a)提供多个哺乳动物(例如，人)细胞，其中所述多个哺乳动物细胞不包含SV40大T抗原(例如，其中所述细胞是成纤维细胞，例如，胚肾成纤维细胞，例如，Expi293F细胞)，其中所述多个哺乳动物细胞包含编码一种或多种逆转录病毒包装蛋白、逆转录病毒包膜蛋白、和治疗效应物例如治疗蛋白(例如，CAR)的核酸(例如，DNA)，
b)在适合产生所述慢病毒载体的条件下培养所述细胞。
83.如权利要求82所述的方法，其中a)包括将所述核酸引入所述多个哺乳动物细胞中。
84.如权利要求75-83中任一项所述的方法，所述方法进一步包括将所述慢病毒载体与所述多个哺乳动物细胞至少部分地分离。
85.如权利要求83或84所述的方法，其中所述一种或多种逆转录病毒包装蛋白包含慢病毒gag、慢病毒pol或慢病毒rev或其任何组合。
86.如权利要求83-85中任一项所述的方法，其中所述逆转录病毒包膜蛋白包含VSV-G。
87.一种慢病毒载体制剂，所述慢病毒载体制剂包含：
多个慢病毒载体，所述多个慢病毒载体包含：
a)编码治疗效应物例如治疗蛋白(例如，CAR)的慢病毒基因组，和
b)包封所述慢病毒基因组的包膜(其中任选地所述包膜包含VSV-G)；
其中所述制剂包含至少5x 107、1x 108、1x 109或1x 1010个转导单位；
其中所述制剂包含少于10μg/ml或少于1μg/ml的编码SV40大T抗原的核酸(例如，DNA)。
88.如权利要求83-87中任一项所述的方法，其中所述多个慢病毒载体包含至少1x 109、2x 109、5x 109、或1x 1010、2x 1010、5x 1010、1x 1011、2x 1011、5x 101或1x 1012个所述细胞。
89.如权利要求83-88中任一项所述的方法，其中所述多个哺乳动物细胞处于至少5、10、20、50、100、200或500L的培养体积中。
90.如权利要求83-89中任一项所述的方法，所述方法包括在无血清培养基中培养所述多个哺乳动物细胞。
91.如权利要求83-90中任一项所述的方法，其中所述多个哺乳动物细胞悬浮生长。
92.如权利要求83-91中任一项所述的方法，其中所述CAR包含CD19 CAR(例如，人源化CD19 CAR，例如，如WO 2014153270A1中所述)。
93.如权利要求83-91中任一项所述的方法，其中所述CAR包含双重CAR(例如，人源化CD19-CD22 CAR，例如，如WO 2016164731A2中所述)。
94.如权利要求83-91中任一项所述的方法，其中编码CAR的所述核酸进一步编码shRNA，例如，如WO 2017049166A中所述。
95.如权利要求83-94中任一项所述的方法，其中所述慢病毒载体在不存在血清的情况下培养的细胞中产生。
96.如前述权利要求中任一项所述的方法或组合物，其中所述慢病毒载体的特征在于如通过动态光散射(DLS)测量的流体动力学半径为100±25nm。
97.如前述权利要求中任一项所述的方法或组合物，其中所述慢病毒载体在25℃至55℃的温度范围内保持100±25nm的所述流体动力学半径。
98.如前述权利要求中任一项所述的方法或组合物，其中所述慢病毒载体的特征在于10％至25％的多分散性。
99.如前述权利要求中任一项所述的方法或组合物，其中所述慢病毒载体在25℃至55℃的温度范围内保持10％至25％的所述多分散性。
100.如前述权利要求中任一项所述的方法或组合物，其中所述慢病毒载体在3个冷冻/解冻循环后，相对于在所述冷冻/解冻循环之前所述水性组合物中的所述慢病毒载体的浓度，保持约70％至约100％的浓度，其中每个所述冷冻/解冻循环包括冷冻所述水性组合物并且随后允许所述水性组合物在室温下解冻。
101.如前述权利要求中任一项所述的方法或组合物，其中在6-10个所述冷冻/解冻循环后，例如，在6-9个所述冷冻/解冻循环后，所述慢病毒载体保持约70％至约100％的所述浓度。
102.一种水性组合物，所述水性组合物包含慢病毒载体，选自由磷酸盐缓冲液、柠檬酸钠缓冲液、2-(N-吗啉代)乙磺酸(MES)缓冲液、3-吗啉丙烷-1-磺酸(MOPS)缓冲液组成的组的缓冲液，以及盐。
103.如权利要求102所述的水性组合物，其中所述盐选自由氯化钠、氯化镁和氯化钙组成的组。
104.如权利要求101或103所述的水性组合物，其中所述水性组合物进一步包含选自由蔗糖和海藻糖组成的组的非还原性碳水化合物。
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Family Cites Families (142)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR901228A (fr) 1943-01-16 1945-07-20 Deutsche Edelstahlwerke Ag Système d'aimant à entrefer annulaire
US4851332A (en) 1985-04-01 1989-07-25 Sloan-Kettering Institute For Cancer Research Choriocarcinoma monoclonal antibodies and antibody panels
US5869620A (en) 1986-09-02 1999-02-09 Enzon, Inc. Multivalent antigen-binding proteins
GB9012995D0 (en) 1990-06-11 1990-08-01 Celltech Ltd Multivalent antigen-binding proteins
US5637481A (en) 1993-02-01 1997-06-10 Bristol-Myers Squibb Company Expression vectors encoding bispecific fusion proteins and methods of producing biologically active bispecific fusion proteins in a mammalian cell
AU669124B2 (en) 1991-09-18 1996-05-30 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Process for producing humanized chimera antibody
US5646253A (en) 1994-03-08 1997-07-08 Memorial Sloan-Kettering Cancer Center Recombinant human anti-LK26 antibodies
US5837821A (en) 1992-11-04 1998-11-17 City Of Hope Antibody construct
EP0679660A4 (en) 1993-11-16 2000-08-16 Pola Chem Ind Inc MONOCLONAL ANTIBODY AGAINST HUMAN TYROSINASE
US5635388A (en) 1994-04-04 1997-06-03 Genentech, Inc. Agonist antibodies against the flk2/flt3 receptor and uses thereof
JPH10505481A (ja) 1994-04-22 1998-06-02 アメリカ合衆国 メラノーマ抗原
US5786464C1 (en) 1994-09-19 2012-04-24 Gen Hospital Corp Overexpression of mammalian and viral proteins
ES2141467T5 (es) 1995-01-18 2006-07-16 Roche Diagnostics Gmbh Anticuerpos anti-cd30 que evitan la escision proteolitica y liberacion del antigeno cd30 fijado a la membrana.
US5731168A (en) 1995-03-01 1998-03-24 Genentech, Inc. Method for making heteromultimeric polypeptides
DE19608769C1 (de) 1996-03-07 1997-04-10 Univ Eberhard Karls Antikörper BV10A4H2
US6114148C1 (en) 1996-09-20 2012-05-01 Gen Hospital Corp High level expression of proteins
AU5158098A (en) 1996-10-25 1998-05-15 Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services, The Methods and compositions for inhibiting inflammation and angiogenesis compri sing a mammalian CD97 alpha subunit
US6803448B1 (en) 1998-07-22 2004-10-12 Vanderbilt University GBS toxin receptor
US6528481B1 (en) 1999-02-16 2003-03-04 The Burnam Institute NG2/HM proteoglycan-binding peptides that home to angiogenic vasculature and related methods
MXPA02001665A (es) 1999-08-17 2003-07-14 Biogen Inc Receptor de baff (bcma) como agente inmunorregulador.
CA2386197A1 (en) 1999-09-30 2001-04-05 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Complementarity determining region-grafted antibody against ganglioside gd3 and derivative of antibody against ganglioside gd3
EP2363403B1 (en) 1999-11-29 2016-04-20 The Trustees of Columbia University in the City of New York Isolation of five novel genes coding for new fc receptors-type melanoma involved in the pathogenesis of lymphoma/melanoma
US20040002068A1 (en) 2000-03-01 2004-01-01 Corixa Corporation Compositions and methods for the detection, diagnosis and therapy of hematological malignancies
US7090843B1 (en) 2000-11-28 2006-08-15 Seattle Genetics, Inc. Recombinant anti-CD30 antibodies and uses thereof
WO2002066516A2 (en) 2001-02-20 2002-08-29 Zymogenetics, Inc. Antibodies that bind both bcma and taci
CN1294148C (zh) 2001-04-11 2007-01-10 中国科学院遗传与发育生物学研究所 环状单链三特异抗体
CN1622958B (zh) 2001-08-23 2013-04-03 Rsr有限公司 促甲状腺素(tsh)受体的表位区域、其用途和针对该区域的抗体
AU2002351239A1 (en) 2001-12-04 2003-06-17 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Antibody to latent membrane proteins and uses thereof
US7446190B2 (en) 2002-05-28 2008-11-04 Sloan-Kettering Institute For Cancer Research Nucleic acids encoding chimeric T cell receptors
US7091029B2 (en) * 2002-09-23 2006-08-15 Applied Genetics Technologies Corporation High titer recombinant AAV production
JP4744147B2 (ja) 2002-11-26 2011-08-10 ベー・エル・アー・ハー・エム・エス・ゲーエムベーハー アフィニティー精製抗体を用いた甲状腺刺激ホルモン受容体自己抗体の同定
WO2004087758A2 (en) 2003-03-26 2004-10-14 Neopharm, Inc. Il 13 receptor alpha 2 antibody and methods of use
MXPA05014030A (es) 2003-06-27 2007-02-13 Diadexus Inc Composiciones de anticuerpo pro 104 y metodos de uso.
EP1638510B1 (en) 2003-07-01 2015-09-02 Immunomedics, Inc. Multivalent carriers of bi-specific antibodies
WO2005035577A1 (ja) 2003-10-08 2005-04-21 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. ガングリオシドｇｄ３に特異的に結合する抗体組成物
US7435596B2 (en) 2004-11-04 2008-10-14 St. Jude Children's Research Hospital, Inc. Modified cell line and method for expansion of NK cell
SI2511297T1 (sl) 2004-02-06 2015-07-31 Morphosys Ag Proti -CD38 humana protitelesa in njihova uporaba
EP2286844A3 (en) 2004-06-01 2012-08-22 Genentech, Inc. Antibody-drug conjugates and methods
JP2008512352A (ja) 2004-07-17 2008-04-24 イムクローン システムズ インコーポレイティド 新規な四価の二重特異性抗体
US7999077B2 (en) 2004-09-30 2011-08-16 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services IRTA2 antibodies and methods of use
MY146381A (en) 2004-12-22 2012-08-15 Amgen Inc Compositions and methods relating relating to anti-igf-1 receptor antibodies
US20080247944A1 (en) 2005-01-12 2008-10-09 Robert Graziano Irta-2 Antibodies and Their Uses
EP1726650A1 (en) 2005-05-27 2006-11-29 Universitätsklinikum Freiburg Monoclonal antibodies and single chain antibody fragments against cell-surface prostate specific membrane antigen
AU2006259536A1 (en) 2005-06-15 2006-12-28 Schering Corporation Anti-IGF1R antibody formulations
BRPI0615026A8 (pt) 2005-08-19 2018-03-06 Abbott Lab imunoglobulina de domínio variável duplo e seus usos
AU2006321554B2 (en) 2005-12-08 2012-08-02 E. R. Squibb & Sons, L.L.C. Human monoclonal antibodies to Fucosyl-GM1 and methods for using anti-Fucosyl-GM1
EP1806365A1 (en) 2006-01-05 2007-07-11 Boehringer Ingelheim International GmbH Antibody molecules specific for fibroblast activation protein and immunoconjugates containing them
US8940871B2 (en) 2006-03-20 2015-01-27 The Regents Of The University Of California Engineered anti-prostate stem cell antigen (PSCA) antibodies for cancer targeting
JP5165672B2 (ja) 2006-03-29 2013-03-21 キングス カレッジ ロンドン Ｔｓｈｒに対するアゴニスト抗体
TWI395754B (zh) 2006-04-24 2013-05-11 Amgen Inc 人類化之ｃ-ｋｉｔ抗體
JP2010505775A (ja) 2006-10-04 2010-02-25 クーベンハヴンス・ユニヴェルシテット Ｍｕｃ１に対する癌特異的な免疫反応の産生及び癌特異的ｍｕｃ１抗体
FR2906808B1 (fr) 2006-10-10 2012-10-05 Univ Nantes Utilisation d'anticorps monoclonaux specifiques de la forme o-acetylee du ganglioside gd2 dans le traitement de certains cancers
WO2008101234A2 (en) 2007-02-16 2008-08-21 Sloan-Kettering Institute For Cancer Research Anti ganglioside gd3 antibodies and uses thereof
WO2008103645A2 (en) 2007-02-19 2008-08-28 Wisconsin Alumni Research Foundation Prostate cancer and melanoma antigens
AU2008234530B2 (en) 2007-03-29 2013-03-28 Technion Research & Development Foundation Ltd. Antibodies, methods and kits for diagnosing and treating melanoma
JP2010190572A (ja) 2007-06-01 2010-09-02 Sapporo Medical Univ ＩＬ１３Ｒａ２に対する抗体およびこれを含む診断・治療薬
WO2009017679A2 (en) 2007-07-31 2009-02-05 Merck & Co., Inc. Igf-1r specific antibodies useful in the detection and diagnosis of cellular proliferative disorders
AR071891A1 (es) 2008-05-30 2010-07-21 Imclone Llc Anticuerpos humanos anti-flt3 (receptor tirosina cinasa 3 tipo fms humano)
AU2009293007B2 (en) 2008-09-19 2015-10-08 University Of Pittsburgh-Of The Commonwealth System Of Higher Education Monoclonal antibodies for cspg4 for the diagnosis and treatment of basal breast carcinoma
ES2593583T3 (es) 2009-03-10 2016-12-09 Biogen Ma Inc. Anticuerpos anti-BCMA
US8466260B2 (en) 2009-04-01 2013-06-18 Genentech, Inc. Anti-FcRH5 antibodies and immunoconjugates and methods of use
MX2011010265A (es) 2009-04-01 2011-10-11 Genentech Inc Anticuerpos anti-fcrh5 e inmunoconjugados y metodos de uso.
EP2506876B1 (en) 2009-12-02 2016-10-12 Imaginab, Inc. J591 minibodies and cys-diabodies for targeting human prostate specific membrane antigen (psma) and methods for their use
US9023996B2 (en) 2009-12-23 2015-05-05 Synimmune Gmbh Anti-FLT3 antibodies
CN103037900B (zh) 2010-02-24 2016-04-06 伊缪诺金公司 叶酸受体1抗体与免疫缀合物以及其用途
WO2011159847A2 (en) 2010-06-15 2011-12-22 The Regents Of The University Of California Receptor tyrosine kinase-like orphan receptor 1 (ror1) single chain fv antibody fragment conjugates and methods of use thereof
NZ603581A (en) 2010-06-19 2015-05-29 Sloan Kettering Inst Cancer Anti-gd2 antibodies
WO2012033885A1 (en) 2010-09-08 2012-03-15 Baylor College Of Medicine Immunotherapy of cancer using genetically engineered gd2-specific t cells
US20130273055A1 (en) 2010-11-16 2013-10-17 Eric Borges Agents and methods for treating diseases that correlate with bcma expression
BR122021026169B1 (pt) 2010-12-09 2023-12-12 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Uso de uma célula
JOP20210044A1 (ar) 2010-12-30 2017-06-16 Takeda Pharmaceuticals Co الأجسام المضادة لـ cd38
AU2012236068A1 (en) 2011-04-01 2013-10-17 Eureka Therapeutics, Inc. T cell receptor-like antibodies specific for a WT1 peptide presented by HLA-A2
US20130101599A1 (en) 2011-04-21 2013-04-25 Boehringer Ingelheim International Gmbh Bcma-based stratification and therapy for multiple myeloma patients
AR086044A1 (es) 2011-05-12 2013-11-13 Imclone Llc Anticuerpos que se unen especificamente a un dominio extracelular de c-kit y usos de los mismos
DK3415531T3 (da) 2011-05-27 2023-09-18 Glaxo Group Ltd Bcma (cd269/tnfrsf17)-bindende proteiner
UA112434C2 (uk) 2011-05-27 2016-09-12 Ґлаксо Ґруп Лімітед Антигензв'язувальний білок, який специфічно зв'язується з всма
EP2755487B1 (en) 2011-09-16 2018-12-19 Baylor College Of Medicine Targeting the tumor microenvironment using manipulated nkt cells
ITMO20110270A1 (it) 2011-10-25 2013-04-26 Sara Caldrer Una cellula effettrice modificata per il trattamento di neoplasie esprimenti il disialonganglioside gd2
TWI679212B (zh) 2011-11-15 2019-12-11 美商安進股份有限公司 針對ｂｃｍａ之e3以及ｃｄ３的結合分子
WO2013074916A1 (en) 2011-11-18 2013-05-23 Board Of Regents, The University Of Texas System Car+ t cells genetically modified to eliminate expression of t- cell receptor and/or hla
US9439768B2 (en) 2011-12-08 2016-09-13 Imds Llc Glenoid vault fixation
EP2814846B1 (en) 2012-02-13 2020-01-08 Seattle Children's Hospital d/b/a Seattle Children's Research Institute Bispecific chimeric antigen receptors and therapeutic uses thereof
EA201491572A1 (ru) 2012-02-22 2014-12-30 Дзе Трастиз Оф Дзе Юниверсити Оф Пенсильвания Композиции и способы получения устойчивой популяции t-клеток, используемых для лечения злокачественного новообразования
EP2836239A1 (en) 2012-04-11 2015-02-18 The United States of America, as Represented By the Secretary, Department of Health and Human Services Chimeric antigen receptors targeting b-cell maturation antigen
CA2870545A1 (en) 2012-04-20 2013-10-24 Emergent Product Development Seattle, Llc Cd3 binding polypeptides
CA2867824A1 (en) 2012-05-01 2013-11-07 Genentech, Inc. Anti-pmel17 antibodies and immunoconjugates
WO2013192294A1 (en) 2012-06-20 2013-12-27 Boston 3T Biotechnologies, Inc. Cellular therapies for treating and preventing cancers and other immune system disorders
AR092745A1 (es) 2012-10-01 2015-04-29 Univ Pennsylvania Composiciones que comprenden un dominio de union anti-fap y metodos para hacer blanco en celulas estromales para el tratamiento del cancer
WO2014055657A1 (en) 2012-10-05 2014-04-10 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Use of a trans-signaling approach in chimeric antigen receptors
EP2914628A1 (en) 2012-11-01 2015-09-09 Max-Delbrück-Centrum für Molekulare Medizin An antibody that binds cd269 (bcma) suitable for use in the treatment of plasma cell diseases such as multiple myeloma and autoimmune diseases
US9243058B2 (en) 2012-12-07 2016-01-26 Amgen, Inc. BCMA antigen binding proteins
WO2014122144A1 (en) 2013-02-05 2014-08-14 Engmab Ag BISPECIFIC ANTIBODIES AGAINST CD3ε AND BCMA
RU2708032C2 (ru) 2013-02-20 2019-12-03 Новартис Аг ЛЕЧЕНИЕ РАКА С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ХИМЕРНОГО АНТИГЕНСПЕЦИФИЧЕСКОГО РЕЦЕПТОРА НА ОСНОВЕ ГУМАНИЗИРОВАННОГО АНТИТЕЛА ПРОТИВ EGFRvIII
WO2014130635A1 (en) 2013-02-20 2014-08-28 Novartis Ag Effective targeting of primary human leukemia using anti-cd123 chimeric antigen receptor engineered t cells
AR095374A1 (es) 2013-03-15 2015-10-14 Amgen Res (Munich) Gmbh Moléculas de unión para bcma y cd3
UY35468A (es) 2013-03-16 2014-10-31 Novartis Ag Tratamiento de cáncer utilizando un receptor quimérico de antígeno anti-cd19
WO2015172800A1 (en) 2014-05-12 2015-11-19 Numab Ag Novel multispecific molecules and novel treatment methods based on such multispecific molecules
AR096687A1 (es) 2013-06-24 2016-01-27 Genentech Inc Anticuerpos anti-fcrh5
CA3225453A1 (en) 2013-12-19 2015-06-25 Novartis Ag Human mesothelin chimeric antigen receptors and uses thereof
CA2937938A1 (en) 2014-02-04 2015-08-13 Kite Pharma, Inc. Methods for producing autologous t cells useful to treat b cell malignancies and other cancers and compositions thereof
JP2017513818A (ja) 2014-03-15 2017-06-01 ノバルティス アーゲー キメラ抗原受容体を使用する癌の処置
HUE054588T2 (hu) 2014-04-07 2021-09-28 Novartis Ag Rák kezelése CD19 elleni, kiméra antigénreceptor alkalmazásával
CA2945620C (en) 2014-04-14 2022-12-06 Cellectis Bcma (cd269) specific chimeric antigen receptors for cancer immunotherapy
EP3998278A1 (en) 2014-04-25 2022-05-18 2seventy bio, Inc. Mnd promoter chimeric antigen receptors
PL3134095T3 (pl) 2014-04-25 2020-10-19 Bluebird Bio, Inc. Ulepszone sposoby produkcji komórek do adoptywnych terapii komórkowych
JP6755805B2 (ja) 2014-04-30 2020-09-16 マックス−デルブリュック−ツェントルム フューア モレキュラーレ メディツィン イン デア ヘルムホルツ−ゲマインシャフト Ｃｄ２６９（ｂｃｍａ）に対するヒト化抗体
EP3828265A1 (en) 2014-06-06 2021-06-02 Bluebird Bio, Inc. Improved t cell compositions
MY181834A (en) 2014-07-21 2021-01-08 Novartis Ag Treatment of cancer using humanized anti-bcma chimeric antigen receptor
CA2955154C (en) 2014-07-21 2023-10-31 Novartis Ag Treatment of cancer using a cd33 chimeric antigen receptor
AR101829A1 (es) 2014-07-21 2017-01-18 Novartis Ag Tratamiento de cáncer utilizando un receptor quimérico de antígeno cll-1
RU2747457C2 (ru) 2014-07-24 2021-05-05 Блубёрд Био, Инк. Химерные антигенные рецепторы к bcma
EP2982692A1 (en) 2014-08-04 2016-02-10 EngMab AG Bispecific antibodies against CD3epsilon and BCMA
CA2958200A1 (en) 2014-08-14 2016-02-18 Novartis Ag Treatment of cancer using a gfr alpha-4 chimeric antigen receptor
PL3183268T3 (pl) 2014-08-19 2020-09-07 Novartis Ag Chimeryczny receptor antygenowy (CAR) anty-CD123 do zastosowania w leczeniu nowotworu złośliwego
EP3023437A1 (en) 2014-11-20 2016-05-25 EngMab AG Bispecific antibodies against CD3epsilon and BCMA
EP3029068A1 (en) 2014-12-03 2016-06-08 EngMab AG Bispecific antibodies against CD3epsilon and BCMA for use in the treatment of diseases
EP3872094A3 (en) 2014-12-05 2021-12-08 Memorial Sloan Kettering Cancer Center Antibodies targeting b-cell maturation antigen and methods of use
AU2015357526B2 (en) 2014-12-05 2022-03-17 Eureka Therapeutics, Inc. Chimeric antigen receptors targeting B-cell maturation antigen and uses thereof
PT3628687T (pt) 2014-12-12 2021-10-20 Bluebird Bio Inc Recetores do antigénio quimérico bcma
US10647778B2 (en) 2015-02-09 2020-05-12 University Of Florida Research Foundation, Incorporated Bi-specific chimeric antigen receptor and uses thereof
US20180094280A1 (en) 2015-03-20 2018-04-05 Bluebird Bio, Inc. Vector formulations
EP4056588A1 (en) 2015-04-08 2022-09-14 Novartis AG Cd20 therapies, cd22 therapies, and combination therapies with a cd19 chimeric antigen receptor (car)- expressing cell
DK3283106T3 (da) 2015-04-13 2022-01-10 Pfizer Terapeutiske antistoffer og anvendelser deraf
BR112017019914A2 (pt) 2015-04-13 2018-06-19 Pfizer receptores de antígenos quiméricos direcionados para antígeno de amadurecimento de células b
CA2990177A1 (en) 2015-06-25 2016-12-29 Icell Gene Therapeutics Llc Chimeric antigen receptors (cars), compositions and methods thereof
WO2017010874A1 (en) 2015-07-10 2017-01-19 Merus N.V. Human cd3 binding antibody
CA2991799A1 (en) 2015-07-15 2017-01-19 Zymeworks Inc. Drug-conjugated bi-specific antigen-binding constructs
MA42895A (fr) 2015-07-15 2018-05-23 Juno Therapeutics Inc Cellules modifiées pour thérapie cellulaire adoptive
EA036975B1 (ru) 2015-08-03 2021-01-21 Энгмаб Сарл Моноклональные антитела против bcma
CN105384825B (zh) 2015-08-11 2018-06-01 南京传奇生物科技有限公司 一种基于单域抗体的双特异性嵌合抗原受体及其应用
AU2016308567B2 (en) 2015-08-17 2022-10-27 Janssen Biotech, Inc. Anti-BCMA antibodies, bispecific antigen binding molecules that bind BCMA and CD3, and uses thereof
MX2018003353A (es) 2015-09-17 2018-09-17 Novartis Ag Terapias con celulas cart con una eficacia mejorada.
CA3005125A1 (en) 2015-11-19 2017-05-26 Novartis Ag Buffers for stabilization of lentiviral preparations
EP3384015A4 (en) * 2015-12-01 2019-05-29 Spark Therapeutics, Inc. SCALABLE PROCESS FOR THE PREPARATION OF A RECOMBINANT ADENO ASSOCIATED VIRAL VECTOR IN A SERUM-FREE SUSPENSION CELL CULTURE SYSTEM SUITABLE FOR THE CLINICAL APPLICATION
JP7082055B2 (ja) 2015-12-22 2022-06-07 ノバルティス アーゲー 抗癌治療における組み合わせ使用のためのメソテリンキメラ抗原受容体（ｃａｒ）およびｐｄ－ｌ１阻害剤に対する抗体
WO2017112948A1 (en) * 2015-12-24 2017-06-29 University Of Florida Research Foundation, Inc. Improved aav production using suspension adapted cells
CN117866991A (zh) 2016-10-07 2024-04-12 诺华股份有限公司 用于治疗癌症的嵌合抗原受体
JP2020524498A (ja) * 2017-06-07 2020-08-20 スパーク セラピューティクス インコーポレイテッドＳｐａｒｋ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ， Ｉｎｃ． 細胞トランスフェクション及び／又はｒＡＡＶベクター産生の改善のための増強剤
AU2019284911A1 (en) 2018-06-13 2020-12-17 Novartis Ag BCMA chimeric antigen receptors and uses thereof
SG11202101825QA (en) 2018-08-31 2021-03-30 Novartis Ag Methods of making chimeric antigen receptor-expressing cells
SG11202107825WA (en) 2019-02-25 2021-09-29 Novartis Ag Mesoporous silica particles compositions for viral delivery
BR112021026832A2 (pt) * 2019-07-02 2022-05-10 Hutchinson Fred Cancer Res Vetores ad35 recombinantes e aprimoramentos da terapia gênica relacionada

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